BR102015003310A2 - method of lymph node metastatic cell detection in patients with head and neck squamous cell carcinoma and use of micrornas as markers - Google Patents
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Abstract
método de detecção de células metastáticas em linfonodos de pacientes com carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço e uso de micrornas como marcadores. a presente invenção tem como objetivo um teste para o diagnóstico de metástase cervical em pacientes com cecp através da avaliação do nível de expressão dos micrornas mir-203 e mir-205. o teste pode ser aplicado em amostras coletadas utilizando-se várias abordagens em diferentes momentos, como no pré-tratamento através do diagnóstico utilizando biópsias de paaf, no intra-operatório através de biópsia do linfonodo sentinela e após a cirurgia como uma ferramenta auxiliar para a avaliação histopatológica de linfonodos ressecados durante a cirurgia, ajudando na escolha do tratamento destes pacientes desde o tratamento inicial até a terapia adjuvante.Method of detecting metastatic cells in lymph nodes of patients with head and neck squamous cell carcinoma and use of micrornas as markers. The present invention aims at a test for the diagnosis of cervical metastasis in patients with CPB by assessing the expression level of the micrornas mir-203 and mir-205. The test can be applied to samples collected using various approaches at different times, such as pre-treatment through diagnosis using paaf biopsies, intraoperatively through sentinel lymph node biopsy and after surgery as an auxiliary tool for histopathological evaluation of resected lymph nodes during surgery, helping to choose the treatment of these patients from initial treatment to adjuvant therapy.
Description
Relatório Descritivo de Patente de Privilégio de Invenção para "Método de detecção de células metastáticas em tinfonodos de pacientes com careinoma epídermóide de cabeça e pescoço e uso de microRNAs como marcadores” Campo da Invenção [001] A presente patente de privilégio de invenção pertence ao campo do diagnóstico e avaliação da extensão da doença neoplásica, por meio de marcadores. Mais especifrcamente foram utilizados microRNAs como marcadores para detecção de células metastáticas em cortes de linfonodos e linfonodos inteiros obtidos a partir de ressecção cirúrgica, além de biópsias colhidas de tinfonodos através de punções aspirativas por agulha fina (PAAF) de pacientes com careinoma epidermóide de cabeça e pescoço (CECP).Patent Descriptive Report of the Invention for "Method of Detecting Metastatic Cells in Nymph Nodes of Patients with Head and Neck Epidermoid Careinoma and Use of MicroRNAs as Markers" Field of the Invention [001] of the diagnosis and evaluation of the extent of neoplastic disease by means of markers.More specifically, microRNAs were used as markers for detection of metastatic cells in lymph node sections and entire lymph nodes obtained from surgical resection, as well as biopsies collected from lymph nodes through punctures. fine needle aspiration (FNA) of patients with epidermoid head and neck careinoma (CPEC).
Histórico da Invenção [002] A presença de doença metastãtica em linfonodos cervicais de pacientes com CECP é um dos determinantes mais importantes na escolha da terapia e na determinação do prognóstico.Background of the Invention The presence of metastatic disease in cervical lymph nodes of patients with CPBP is one of the most important determinants in the choice of therapy and the determination of prognosis.
[003] O adequada estadiamento de metástases em linfonodos regionais é crítico para a resposta ao tratamento e o sucesso do controle loco-regionaí da doença. O estadiamento clinico realizado na rotina nem sempre é eficiente, pois pode não se detectar metástases ocultas e a avaliação patológica pós-cirúrgica dos linfonodos ressecados por hematoxiiína & eosina (H&E) não é sensível na detecção de pequenos depósitos nrietastátícos. O correio estadiamento influencia diretamente na sobrevida global dos pacientes, dessa forma, é imperativo o uso de marcadores de diagnóstico e técnicas que possibilitem uma detecção rápida e precisa de celuías metastáticas em nódulos íinfáticos cervicais de forma a guiar os médicos na escolha da terapia mais adequada para os pacientes.Proper staging of regional lymph node metastases is critical to the response to treatment and the success of locoregional control of the disease. Routine clinical staging is not always efficient, as hidden metastases may not be detected, and postoperative pathological evaluation of hematoxyin & eosin (H&E) resected lymph nodes is not sensitive in detecting small nrietastatic deposits. Staging mail directly influences the overall survival of patients, so it is imperative to use diagnostic markers and techniques that enable rapid and accurate detection of metastatic cellumas in cervical lymph nodes to guide physicians in choosing the most appropriate therapy. for the patients.
[004] Os MicroRNAs são candidatos promissores para marcadores de diagnóstico uma vez que: desempenham papel em muitas vias envolvidas em metástase tumoral; são relatados como tendo expressão tumor e tecido especifica; sua expressão é avaliada usando a técnica sensível e rápida de qRT-PCR e são adequados para serem avaliadas em tecido incluído em parafina, biópsias baseadas em punção e fluidos corporais.MicroRNAs are promising candidates for diagnostic markers as they: play a role in many pathways involved in tumor metastasis; are reported to have tumor and tissue specific expression; Their expression is evaluated using the sensitive and rapid qRT-PCR technique and is suitable for evaluation on paraffin-embedded tissue, puncture-based biopsies and body fluids.
[005] Os microRNAs sáo pequenas moléculas de RN A não-codtficantes de aproximadamente 22 nucleotídeos, com papel importante em virtualmente todas as vias biológicas em mamíferos e outros organismos multiceiulares. Da mesma forma, estas moléculas influenciam diversos processos relevantes ao câncer como proliferação, apoptose, controle do ciclo celular, diferenciação, migração e metabolismo (Bartel, 2009; Fabian e Sonenberg 2012; SajandLai, 2011). Atualmente, mais de 1400 microRNAs humanos foram identificados (Griffiths-Jones, 2010}. ilustrando o enorme potencial destas moléculas na regulação da expressão gênica, com estimativas de que cerca de 60% de todos os mRNAs estejam sob o controle de microRNAs {Bartel, 2009).MicroRNAs are small non-coding NR A molecules of approximately 22 nucleotides, playing an important role in virtually all biological pathways in mammals and other multiceular organisms. Similarly, these molecules influence various cancer-relevant processes such as proliferation, apoptosis, cell cycle control, differentiation, migration, and metabolism (Bartel, 2009; Fabian and Sonenberg 2012; SajandLai, 2011). Currently, more than 1400 human microRNAs have been identified (Griffiths-Jones, 2010), illustrating the enormous potential of these molecules in regulating gene expression, with estimates that about 60% of all mRNAs are under the control of microRNAs. 2009).
[006] Estima-se que cada microRNA possa controlar a expressão de diversos mRNAs e que um mRNA possa ser alvo de múltiplos microRNAs desta forma, a expressão aberrante de um únioo microRNA afeta diversos transcritos e influencia vias de sinalização associadas ao câncer.It is estimated that each microRNA can control the expression of several mRNAs and that one mRNA can be targeted by multiple microRNAs thus aberrant expression of a single microRNA affects several transcripts and influences cancer-associated signaling pathways.
[007] Tumores geralmente apresentam níveis reduzidos de microRNAs maduros (Lu et al. 2005) como consequência de perdas genéticas silenciamento epigenético, defeitos em sua biogênese ou repressão transcricional (Chang et al., 2008). Diversos estudos têm mostrado perfis distintos de expressão de microRNA entre amostras normais e tumorais e também variações entre tipos tumorais diferentes (Lu et al., 2005; Volinia et al. 2006), atribuindo a estas moléculas um papel relevante na tumorigênese (Esquela-Kerscherand Slack. 2006. Hammond. 2007).[007] Tumors usually have reduced levels of mature microRNAs (Lu et al. 2005) as a consequence of genetic losses epigenetic silencing, defects in their biogenesis or transcriptional repression (Chang et al., 2008). Several studies have shown distinct microRNA expression profiles between normal and tumor samples and also variations between different tumor types (Lu et al., 2005; Volinia et al. 2006), giving these molecules a relevant role in tumorigenesis (Esquela-Kerscherand Slack, 2006. Hammond, 2007).
[008] Dessa forma, diversas publicação mencionam o uso de microRNAs para o diagnóstico de diversas doenças e até mesmo na terapia do câncer, mas como será visto em nenhuma delas houve o aprofundamento no estudo dos microRNAs miR-203 e rmR-205 na detecção de células metastáticas em linfonodos de pacientes com caranoma epidermóide de cabeça e pescoço.Thus, several publications mention the use of microRNAs for the diagnosis of various diseases and even in cancer therapy, but as will be seen in none of them there was a deepening in the study of miR-203 and rmR-205 microRNAs in the detection of metastatic cells in lymph nodes of patients with head and neck squamous cell caranoma.
Est^daJÇécníca [009] O documento de patente W02G10/109511 descreve o microRNA miR199b~5p com a finalidade de terapia anít-cancer e um kit de diagnóstico do estágio histopatológico de tumores para a detecção de rnetástases em amostras biológicas de meduloblastoma, iinfoma carcinoma de coion e de mama através da detecção de SEQ ID NO 1 (revelada no referido documento) e de pelo menos um dos genes de um painel em células tumorais. A presente invenção se distancia do documento acima citado, uma vez que o objeto aqui ensinado tem como objetivo a utilização de marcadores de diagnóstico para identificar lesões metastáticas em linfonodos Ambos os marcadores rmR-203 e rmR-205 são capazes de detectar a presença de metástases em ünfonodos afetados com alta sensibilidade, acurácia e especificidade, principalmente ao serem avaliados em amostras de biópsias obtidas a partir de punções aspírativas dos lintonodos Ou seja, a utilização de peio menos 1 dos marcadores (miR-203 e miR-205) já é suficiente para o diagnóstico com alta acurácia de lesões metastáticas. No documento WO 2010/109511 A1 é necessário a avaliação de diversos marcadores, além disso, o refendo documento avalia amostras de tumores primários, já na presente invenção são avaliadas amostras de linfonodos.[009] Patent Document W02G10 / 109511 describes the miR199b ~ 5p microRNA for anti-cancer therapy and a tumor histopathological stage diagnostic kit for the detection of retastases in biological samples of medulloblastoma, carcinoma lymphoma of cation and breast by detecting SEQ ID NO 1 (disclosed herein) and at least one of the panel genes in tumor cells. The present invention departs from the above cited document, since the object taught herein aims to use diagnostic markers to identify lymph node metastatic lesions. Both rmR-203 and rmR-205 markers are capable of detecting the presence of metastases. in affected lymph nodes with high sensitivity, accuracy and specificity, especially when evaluated in biopsy specimens obtained from lymph node aspiration punctures. That is, the use of at least one of the markers (miR-203 and miR-205) is sufficient for the highly accurate diagnosis of metastatic lesions. WO 2010/109511 A1 requires the evaluation of various markers, furthermore, that document evaluates primary tumor samples, whereas in the present invention lymph node samples are evaluated.
[010] O documento US 2012/0309638 descreve marcadores úteis para determinar o risco de desenvolvimento de metástases á distância em indivíduos portadores de câncer de pulmão. Para que o risco seja determinado, o nível de expressão de um painel de seis marcadores precisa ser determinado. Na invenção aqui descrita são utilizados marcadores de diagnóstico, já no documento US 2012/0309638 objetiva-se a predição de risco. Além disso, o documento de patente avalia amostras de tumores primários, já a presente invenção avalia amostras de línfonodo Ainda no documento de patente US 2012/0309638 é necessária a avaliação de seis marcadores.[010] US 2012/0309638 describes markers useful for determining the risk of developing distant metastases in individuals with lung cancer. For risk to be determined, the expression level of a six-marker panel must be determined. Diagnostic markers are used in the invention described herein, whereas US 2012/0309638 aims at predicting risk. In addition, the patent document evaluates primary tumor samples, whereas the present invention evaluates lymph node samples. Still in US patent document 2012/0309638 the evaluation of six markers is required.
[011] O documento de patente WO 2008/125883 descreve marcadores úteis em determinar o prognóstico e o melhor regime terapêutico a ser utilizado em indivíduos portadores de câncer de colo uterino a partir da análise do nível de expressão da proteína DROSHA em amostras íumorais e de biópsias.WO 2008/125883 describes markers useful in determining the prognosis and the best therapeutic regimen to be used in cervical cancer individuals by analyzing the level of DROSHA protein expression in tumor samples and biopsies.
[012] O documento de patente WG20101083464 descreve marcadores baseados na expressão de microRNAs úteis no diagnóstico de lesões displásicas de colo uterino. A expressão diferencial destes marcadores é capaz de identificar lesões displásicas com potencial maligno em células de coiouterino. No referido documento, para que o diagnóstico seja realizado, um ou inúmeros microRNAs devem ser avaliados. Na presente invenção, a utilização de um dos marcadores miR-203 ou miR-205 já é suficiente para o diagnóstico com alta acurãcia de lesões metastáticas através da técnica rápida e sensível de PCR quantitativa. Além disso, avaliação de marcadores por técnicas de hibridização costuma ser mais laboriosa.WG20101083464 describes markers based on the expression of microRNAs useful in the diagnosis of dysplastic cervical lesions. Differential expression of these markers is capable of identifying dysplastic lesions with malignant potential in coiouterin cells. In that document, for the diagnosis to be made, one or many microRNAs must be evaluated. In the present invention, the use of one of the miR-203 or miR-205 markers is already sufficient for the high accuracy diagnosis of metastatic lesions by the rapid and sensitive quantitative PCR technique. In addition, marker evaluation by hybridization techniques is often more laborious.
[013] O Documento de patente WO 2011/014980 descreve marcadores úteis para o diagnóstico e escolha do tratamento de lesões displásicas e malignas de colo uterino e marcadores de prognóstico para a sobrevtda de indivíduos com câncer e/ou displasia no colo uterino, de acordo com o nível de expressão de microRNAs avaliados em amostras de colo uterino, linfonodo, sangue ou soro de pacientes com displasia ou neoplasia de colo de útero. Esse documento também descreve a utilização do microRNA miR-133b como marcador de detecçáo de câncer colorretal, carcinoma epidermóide de língua, esôfago e adenocarcinoma de pâncreas em amostras de tecido, linfonodo, sangue ou soro destes tumores. Entretanto, na invenção aqui descrita foram utilizados marcadores de diagnóstico de tesões metastáiicas em linfonodos de pacientes com CECP, já no documento WO 2011/014980 são avaliados tecido, sangue, linfonodo ou soro de pacientes com díspiasia ou neopíasia de colo uterino Além disso, na presente invenção são avaliadas a expressão dos microRNAs miR-203 e miR-205 em amostras cie linfonodo, possíveis sítios de metástases regionais de pacientes com carcinomas epidermóides de cabeça e pescoço O documento de patente WO 2011/014980 A1 avalia o uso somente do microRNA míR-133b em detectar céiulas tumorais em linfonodos de pacientes com CE de língua. Embora o miR-203 seja citado como um dos microRNAs cuja expressão diferencial é capaz de detectar lesões displásicas ou neoplásicas de coto uterino, nada fora antecipado para CECP.[013] Patent Document WO 2011/014980 describes markers useful for the diagnosis and treatment choice of uterine cervical dysplastic and malignant lesions and prognostic markers for the survival of individuals with cervical cancer and / or dysplasia, according to with the level of expression of microRNAs evaluated in cervical, lymph node, blood or serum samples from patients with cervical dysplasia or neoplasia. This document also describes the use of the miR-133b microRNA as a marker for detecting colorectal cancer, tongue squamous cell carcinoma, esophagus and pancreatic adenocarcinoma in tissue, lymph node, blood or serum samples from these tumors. However, in the invention described here, diagnostic markers of metastatic lymph nodes were used in lymph nodes of patients with CPB, whereas in WO 2011/014980 tissue, blood, lymph node or serum of patients with dyspiasia or cervical neoplasias are evaluated. The expression of miR-203 and miR-205 microRNAs in lymph node samples, possible sites of regional metastases of patients with head and neck squamous cell carcinoma WO 2011/014980 A1 evaluates the use of the miR microRNA only -133b in detecting tumor cells in lymph nodes of patients with tongue CE. Although miR-203 is cited as one of the microRNAs whose differential expression is capable of detecting uterine stump dysplastic or neoplastic lesions, nothing had been anticipated for CECP.
[014] Além dos documentos de patentes, a literatura científica nos ensina que a família do miR-200 é composta pelos microRNAs que formam os clusters rmR-200b~200a-429 e miR-200c-141 que são codificados na forma de transcritos policrstrônicos (Bracken et ai , 2008; Xia et ai., 2010) Os membros da família miR-200 tem como alvo ZEB1 e ZEB2, impedindo que estes fatores inibam a expressão de E-cadenna A manutenção de níveis altos de E-cadenna impede a diferenciação celular, evitando a promoção da migração e invasão da célula via EMT (Adam et ai., 2009; Korpat et ai., 2008).In addition to patent documents, the scientific literature teaches us that the miR-200 family is composed of the microRNAs that form the rmR-200b ~ 200a-429 and miR-200c-141 clusters that are encoded in the form of polychronic transcripts. (Bracken et al, 2008; Xia et al., 2010) The miR-200 family members target ZEB1 and ZEB2, preventing these factors from inhibiting E-cadenna expression. Maintaining high levels of E-cadenna prevents cell differentiation, preventing the promotion of cell migration and invasion via EMT (Adam et al., 2009; Korpat et al., 2008).
[015] Assim como os rmcroRNAs da família míR-200, os microRNAs rruR-203 e miR-205 também são reguladores importantes do processo de transição epitélio-mesênquima, sendo responsáveis pela manutenção do fenótipo epiteiiai. Recentemente, o miR-203 também foi associado a esta plasticidade eptte!»al {Moes et ai., 2012). Este microRNA, localizado no cromossomo 14, tem como alvo SNAI1, outro conhecido repressor transcricíonal da E-caderina. O miR-203 já foi observado hipoexpresso em linhagens ceíulares de câncer de mama e de próstata, contribuindo, assim, para a migração e invasão de células tumorais (Moes et al , 2012) Este microRNA também apresenta expressão diferenciada entre tumores primários e metastáticos (Baffa et ai., 2009) e sua hipoexpressão mostrou-se associada à progressão de lesões displásicas para tumores de esôfago fWu et aí., 2013).Like the miR-200 family rmcroRNAs, the rruR-203 and miR-205 microRNAs are also important regulators of the epithelial-mesenchymal transition process and are responsible for maintaining the epithelial phenotype. Recently, miR-203 has also been associated with this positive plasticity (Moes et al., 2012). This microRNA, located on chromosome 14, targets SNAI1, another known E-cadherin transcriptional repressor. MiR-203 has been observed hypoexpressed in breast and prostate cancer cell lines, thus contributing to the migration and invasion of tumor cells (Moes et al, 2012). This microRNA also presents differentiated expression between primary and metastatic tumors ( Baffa et al., 2009) and its hypoexpression was associated with the progression of dysplastic lesions to esophageal tumors (Wu et al., 2013).
[016] O míR-205 encontra-se no cromossomo 1 e tem como alvo ZEB2, modulando a invasão e migração celular {Gregory et ai., 2008a), Em linhagens celulares de esôfago, a expressão deste microRNA é alta, mas, ao se tornar invasiva e migratória, via EMT, estas células tem a expressão do miR-205 diminuída (Matsushima et al, 2011). Este microRNA foi descrito como hipoexpresso em câncer de próstata e esta hipoexpressão mostrou correlação com o tamanho dos tumores, maior escore de Gleason, ocorrência de metãstases e menor sobrevida global (Hagman et al., 2013; Verdoodt et ai., 2013). Este microRNA também mostrou-se hipoexpresso em câncer de mama (Baffa et ai., 2009) e de bexiga (Wiktund et al., 2011a).The mR-205 is found on chromosome 1 and targets ZEB2, modulating cell invasion and migration (Gregory et al., 2008a). In esophageal cell lines, the expression of this microRNA is high, but at become invasive and migratory via EMT, these cells have decreased miR-205 expression (Matsushima et al, 2011). This microRNA has been described as hypoexpressed in prostate cancer and this hypoexpression has been correlated with tumor size, higher Gleason score, metastasis occurrence and shorter overall survival (Hagman et al., 2013; Verdoodt et al., 2013). This microRNA was also hypoexpressed in breast (Baffa et al., 2009) and bladder cancer (Wiktund et al., 2011a).
[017] Apesar do importante papel destes microRNAs na carcínogênese de diversos tumores, especificamente com relação ao processo de formação de metástases, poucos trabalhos avaliaram sua expressão em CECP. {018] Um estudo identificou que a expressão deste microRNA é restrita a epitéfio escamoso e analisou a expressão deste microRNA em 8 amostras de linfonodos de pacientes com CECP portando macrometástases, encontrando elevada expressão em relação a linfonodos nâo-metastéticos (Fletcher et ai., 2008), Kozaki e colaboradores (Kozaki et ai., 2008) observaram uma associação entre a hipoexpressão de miR-203 e a hipermetilação deste microRNA em amostras de CECP.[017] Despite the important role of these microRNAs in the carcinogenesis of various tumors, specifically in relation to the process of metastasis formation, few studies have evaluated their expression in CECP. {018] One study identified that the expression of this microRNA is restricted to squamous epithelium and analyzed the expression of this microRNA in 8 lymph node samples of patients with CPBM carrying macrometastases, finding high expression in relation to nonmetastatic lymph nodes (Fletcher et al., 2008), Kozaki et al. (Kozaki et al., 2008) observed an association between miR-203 hypoexpression and hypermethylation of this microRNA in CECP samples.
[019] Como pode ser verificado diversos documentos de patentes e publicações científicas têm expiorado o papel dos microRNAs corno marcadores, mas em nenhum deles foi antecipado o método de detecção de células metastãtícas em linfonodos de pacientes com carcinorna epidenmôide de cabeça e pescoço que será a seguir revelado Sumário da invenção [020j A presente invenção tem como objetivo um teste para o diagnóstico de metástase cervícai em pacientes com CECP através da avaliação do nível de expressão dos microRNAs miR-203 e miR-205 O teste pode ser aplicado em amostras coletadas utilizando-se várias abordagens em diferentes momentos, como no pré-tratamento através do diagnóstico utilizando biópsias de PAAF, no sntra-operatório através de biópsia do linfonodo sentinela e após a cirurgia como uma ferramenta auxiliar para a avaliação histopatofógíca de linfonodos ressecados durante a cirurgia, ajudando na escolha do tratamento destes pacientes desde o tratamento inicial até a terapia adjuvante [021] Mais especificamente a presente invenção ensina um método de detecção de metástases utilizando linfonodos inteiros ou partes de linfonodos ressecados durante a cirurgia e amostras coletadas por punções aspirativas por agulha fina (PAAF) de linfonodos de pacientes com CECP. utilizando para essa detecção os microRNAs míR~203 e miR-205.As can be seen several patent documents and scientific publications have enhanced the role of microRNAs as markers, but none of them anticipated the method of detecting metastatic cells in lymph nodes of patients with head and neck squamous cell carcinoma. SUMMARY OF THE INVENTION The present invention aims at a test for the diagnosis of cervical metastasis in patients with CPB by assessing the level of expression of miR-203 and miR-205 microRNAs. The test can be applied to samples collected using various approaches are taken at different times, such as pre-treatment through diagnosis using FNAB biopsies, intra-operative through sentinel lymph node biopsy, and after surgery as an auxiliary tool for histopathophic evaluation of resected lymph nodes during surgery, helping to choose the treatment of these patients from the Initial treatment until adjuvant therapy More specifically, the present invention teaches a method of detecting metastases using whole lymph nodes or parts of lymph nodes resected during surgery and samples collected by lymph node fine needle aspiration (FNA) from patients with CPB. . using for this detection the microRNAs miR ~ 203 and miR-205.
Descrição Detalhada da invenção Obtenção do material para análise molecular [022] A presente invenção descreve a análise da expressão dos microRNAs miR-203 e rmR-205 como método de diagnóstico de metástases em amostras de linfonodos obtidas a partir de carurgia e amostras de biópsia por punção aspirativa de linfonodos de pacientes com CECP.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Obtaining Molecular Analysis Material The present invention describes the analysis of miR-203 and rmR-205 microRNA expression as a method of diagnosing metastasis in lymph node samples obtained from surgery and biopsy samples by lymph node aspiration puncture in patients with CPB.
[023] Na análise de rotina de amostras de linfonodo obtidas a partir do esvaziamento cervícai, ou seja. da ressecção cirúrgica dos linfonodos cervicais deste paciente, todos os linfonodos ressecados são processados, incluídos em parafina e avaliados no Departamento de Patologia de cada serviço. A avaliação histopatológica de rotina ocorre da seguinte forma, após a inclusão em parafina os blocos contendo os linfonodos a serem avaliados são submetidos a cortes no seu eixo central e as lâminas contendo os cortes são submetidas a coloração por hematoxilina & eosina e avaliadas por um patologista para confirmação do diagnóstico através da caracterização dos componentes celulares presentes nos cortes A presente invenção traz a possibilidade de avaliar cortes distribuídos ao longo do linfonodo ou oe avaliar o linfonodo inteiro a partir de técnicas moleculares. Assim, blocos de parafina contendo os linfonodos ressecados são submetidos a cortes em diversos níveis ou a cortes em toda a extensão do bloco, refletindo a análise do imfonodo inteiro. Estes cortes são coletados em tubos coletores, ou colocados em lâminas. Para a extração do material a partir de laminas, a região de interesse precisa ser raspada com a ajuda de um bisturi ou agulha e adicionada a um tubo coletor. De forma alternativa, a extração também pode ser feita a partir de material fresco, ou seja, fragmentos ou linfonodos inteiros ressecados são coletados em criotubos (tubos resistentes ao armazenamento a baixas temperaturas) e armazenados a temperaturas inferiores a -80 °C até o momento da extração O RNA avaliado pela análise molecular é obtido através do processamento destes materiais coletados [024] Para a avaliação das amostras de biópsias a partir de punção, linfonodos cervicais suspeitos de pacientes com CECP são puncionados utilizando-se um cítoaspirador oe Valerí de acordo com a rotina dos ambulatórios de punção O material coletado é utilizado na confecção de lâminas de esfregaço que são coradas com H&E e avaliadas por um citopatofogista para determinação do diagnóstico através da caracterização dos componentes celulares presentes na lâmina. A presente invenção traz a possibilidade de avaliar o restante do material coletado que permanece na agulha após a preparação das lâminas de esfregaço, por técnicas moleculares. Assim, a agulha coletora conectada à seringa deve ser lavada em solução contendo EDTA e cioreto de sódio e o material coletado deve ser congelado em nitrogênio líquido e armazenado em uftrafreezer a temperaturas inferiores a -8G°C até o momento da extração do RNA[023] In routine analysis of lymph node samples obtained from neck dissection, ie. Upon surgical resection of this patient's cervical lymph nodes, all resected lymph nodes are processed, embedded in paraffin and evaluated at the Pathology Department of each service. Routine histopathological evaluation is as follows, after paraffin embedding the blocks containing the lymph nodes to be evaluated are cut in their central axis and the slides containing the cut are stained with hematoxylin & eosin and evaluated by a pathologist. for confirmation of the diagnosis by characterizing the cellular components present in the sections The present invention provides the possibility of evaluating sections distributed throughout the lymph node or the evaluation of the entire lymph node by molecular techniques. Thus, paraffin blocks containing the resected lymph nodes are cut at various levels or cut along the entire length of the block, reflecting the analysis of the entire imode. These cuts are collected in collecting tubes, or placed on slides. For extraction of material from blades, the region of interest needs to be scraped off with the help of a scalpel or needle and added to a collecting tube. Alternatively, extraction can also be done from fresh material, ie, dried out whole fragments or lymph nodes are collected in cryotubes (low temperature storage resistant tubes) and stored at temperatures below -80 ° C so far. Extraction RNA assessed by molecular analysis is obtained by processing these collected materials [024] For the evaluation of biopsy specimens from puncture, suspected cervical lymph nodes from patients with CPB are punctured using an o and Valerí scintigraphy according to routine of puncture outpatient clinics The material collected is used in the preparation of smear slides that are stained with H&E and evaluated by a cytopathopogist to determine the diagnosis by characterizing the cellular components present in the slide. The present invention provides the possibility to evaluate the remaining collected material that remains in the needle after preparation of the smear slides by molecular techniques. Thus, the collecting needle connected to the syringe should be washed in a solution containing EDTA and sodium cyioride and the collected material should be frozen in liquid nitrogen and stored in a freezer at temperatures below -8 ° C until RNA extraction.
Extração de RNA e Síntese de cDNARNA Extraction and cDNA Synthesis
[025] A extração do RNA a partir de fragmentos ou linfonodos inteiros congelados a fresco ou ainda linfonodos incluídos em parafina deve ser realizada utilizando protocolos e kits específicos para a obtenção de RNA total seguindo as recomendações do fabricante De forma gerai, para as amostras frescas estes protaooios/krts iniciam com o processamento desta amostra utilizando um homogeneizador de tecido. Para as amostras incluídas em parafina é realizado um passo de remoção da parafina (desparafinização) dos cortes contendo as amostras de interesse, utilizando reagentes como o Xilol. A extração de ácidos nucléicos ocorre através de digestão com proteinase K (peptidase responsável por degradar proteínas celulares) e detergentes (que irão degradar lipídeos). Em seguida, amostras são tratadas com DNase e purificadas utilizando-se reagentes químicos e!ou colunas que permitem a obtenção de RNA total iivre de contaminações por DNA proteínas e reagentes químicos O RNA total obtido deve ser armazenado em freezer a temperatura inferior a -8Q°C até o momento de utilização.[025] RNA extraction from fresh frozen whole or paraffin embedded lymph nodes or fragments should be performed using specific protocols and kits for obtaining total RNA following manufacturer's recommendations. Generally for fresh samples These protons / krts start with processing this sample using a tissue homogenizer. For paraffin-embedded samples a paraffin removal (deparaffinization) step is performed from the sections containing the samples of interest using reagents such as Xylol. The extraction of nucleic acids occurs through digestion with proteinase K (peptidase responsible for degrading cellular proteins) and detergents (which will degrade lipids). Samples are then treated with DNase and purified using chemical reagents and columns that allow free total RNA to be obtained from DNA contamination. Proteins and chemical reagents The total RNA obtained should be stored in a freezer below -8 ° C. ° C until time of use.
[026] Para a extração do RNA das amostras de PAAF, devem ser utilizados reagentes específicos para a extração de RNA que contenham feno! e isotiocianato de guanidina, [027] Após a obtenção do RNA total extraído a partir das amostras a serem analisadas, esse deve ser quantificado e cerca de 10 nanogramas deve ser utilizado na reação de transcrição reversa (RT). Esta reação se baseia na síntese de uma fita de DNA complementar (cONA) ao RNA de interesse. Na presente invenção, para que possa ser diagnosticada a presença ou não de metástases, é necessária a síntese de cDNA dos RN As endógenos U6 e U47 e dos micro RN As de interesse miR-203 e miR-205 Ou seja, para cada amostra a ser avaliada são necessárias 4 reações de RT.[026] For RNA extraction from FNAB samples, hay-specific RNA extraction reagents must be used! and guanidine isothiocyanate, [027] After obtaining the total RNA extracted from the samples to be analyzed, this should be quantified and about 10 nanograms should be used in the reverse transcription reaction (RT). This reaction is based on the synthesis of a complementary DNA strand (cONA) to the RNA of interest. In the present invention, in order to be able to diagnose the presence or absence of metastases, the cDNA synthesis of endogenous U6 and U47 and microRNs of interest miR-203 and miR-205 is required. To be evaluated 4 RT reactions are required.
[028] Para as reações de RT, são utilizados primers específicos para cada microRNA ou RNA endógeno e a enzima transcriptase reversa, além de outros reagent.es necessários para a reação.[028] For RT reactions specific primers are used for each endogenous microRNA or RNA and the reverse transcriptase enzyme, as well as other reagents required for the reaction.
Expressão dos mícroRNAs [029] A presente invenção descreve a utilização da detecção do nível de expressão dos mícroRNAs miR-203 e miR-205 como ferramenta de diagnóstico de metástases em linfonodos de pacientes com CECP A avaliação do nível de expressão dos mícroRNAs nas amostras de RNA total obtidas a partir de amostras de linfonodos ressecados cirurgicamente e de PAAF de linfonodos suspeitos deve ser feita utilizando análises de PCR em tempo Real Diversos equipamentos estão disponíveis e podem ser utilizados para a realização destas análises.MicronRNA Expression The present invention describes the use of miR-203 and miR-205 micronRNA level detection as a diagnostic tool for lymph node metastasis of patients with CPEC. Total RNA obtained from surgically resected lymph node and FNA samples from suspected lymph nodes should be performed using real-time PCR analysis. Several equipment is available and can be used to perform these analyzes.
[030] Para cada amostra a ser avaliada, deve ser feita uma reação de PCR por microRNA ou RNA endógeno, ou seja, são 4 reações de PCR em tempo real para cada amostra. {031 ] Para as reações de PCR, é necessária a adição de reagentes e de primem e sondas específicos para a amplificação do cDNA obtido através da referida reação de transcrição reversa A$ reações devem ser realizadas em tnplicata em um equipamento de PCR em tempo real, que utiliza ciclagens de temperaturas por períodos específicos para a reação de amplificação (de acordo com o recomendado para os reagentes, primem e sondas utilizados) e é capaz de detectar a presença do cDNA de interesse e fornecer dados que permitem a quantificação da expressão destes nas amostras avaliadas, [032] Para cada amostra avaliada, quando há a presença do micnoRNA de interesse, os primers e sonda são capazes de se ligar ao microRNA e iniciar a amplificação. Neste caso, ocorre a formação de uma curva de amplificação que permite a quantificação da expressão através da determinação para cada amostra de um valor de Ct (Threshold Cycie) ou seja, do cicio da PCR no qual a fluorescência gerada atinge um ponto pré-estabelecido (threshold) da fase logarítmica da reação Quando a amostra não contém o microRNA de interesse, os primers e sonda não se ligam e a reação de amplificação não ocorre.[030] For each sample to be evaluated, a microRNA or endogenous RNA PCR reaction should be performed, ie there are 4 real-time PCR reactions for each sample. {031] For PCR reactions, the addition of specific reagents and primers and probes for the amplification of cDNA obtained by said reverse transcription reaction is required. The reactions should be performed in a replicate on a real time PCR equipment. , which uses temperature cycling for specific periods for the amplification reaction (as recommended for the reagents, primers and probes used) and is able to detect the presence of the cDNA of interest and provide data to quantify their expression. [032] For each sample evaluated, when there is the presence of micnoRNA of interest, the primers and probe are capable of binding to the microRNA and initiating amplification. In this case, an amplification curve occurs which allows the expression to be quantified by determining for each sample a value of Ct (Threshold Cycie) ie the PCR cycle at which the generated fluorescence reaches a predetermined point. (threshold) of the log phase of the reaction When the sample does not contain the microRNA of interest, the primers and probe do not turn on and the amplification reaction does not occur.
[033] Para a análise dos dados de expressão obtidos de cada microRNA nas amostras de linfonodos e de PAAF de linfonodos suspeitas, deve ser utilizado o método 2~ílAct ou método comparativo de Ct. Este método se baseia na normalização da expressão dos micro RN As de interesse (neste caso, miR-203 e miR-205) pela expressão de RNAs normalizadores (U6 e U47) na mesma amostra biológica, e as mudanças na expressão dos microRNAs são calculadas baseadas nas diferenças entre amostras referência e amostras experimentais. Para a presente invenção, o grupo referência utilizado foi composto por amostras de línfonodos não metastátioos.[033] For the analysis of expression data obtained from each microRNA in lymph node and FNA samples from suspected lymph nodes, the 2-βAct method or Ct comparative method should be used. This method is based on the normalization of microRN As expression of interest (in this case miR-203 and miR-205) by the expression of normalizing RNAs (U6 and U47) in the same biological sample, and changes in microRNA expression are calculated. based on the differences between reference samples and experimental samples. For the present invention, the reference group used was composed of non-metastatic lymph node samples.
[034] Desta forma, o vaior inferido à ACt equivale ã diferença entre o valor das médias dos Cts dos microRNAs de interesse. míR-203 e miR-205 (Ct,miR. 203> e Ct!míR,205), respectivamente). e o valor da média dos Cts dos RNAs normalízadores U6 e U47 (Ct<u6) e Ct,uM7) respectivamente) obtidos através da avaliação da expressão destes marcadores nas amostras suspeitas (no caso, línfonodos e PAAF de línfonodos suspeitos) e do grupo de amostras referência (línfonodos não metastátioos).Thus, the value inferred from the ACt is equivalent to the difference between the mean value of the Cts of the microRNAs of interest. miR-203 and miR-205 (Ct, miR. 203, and Ct! miR, 205), respectively). and the mean Cts value of the normalizing RNAs U6 and U47 (Ct <u6) and Ct, uM7) respectively) obtained by evaluating the expression of these markers in the suspect samples (in this case, lymph nodes and PAF of suspect lymph nodes) and the group. reference samples (non-metastatic lymph nodes).
[035] Para as amostras suspeitas: /\C t(rnsR-'203 amostrai “ Ot(míR.2G3 amostra) ~ [Ct(U6 amostre) + C%U4? emoetta)](2 ^Ct(miR-205 amostra) “ C-t^ntiR-SOS amostra) “ [Ct(ua ajnosife) + Ct{U47 amostrajJ/2 [036] Os valores de ACt para as amostras referência foram obtidos a partir da análise de línfonodos não meiasiáncos e paaronizou-se que os vaiore* adequados a serem utilizados nos càlcuios são os seguintes: ACt(m»R-j?o3 referência) -1:1,15654-3, ΔCt(miR·205 referencia) = 10,68-8-645.[035] For suspect samples: / \ C t (rnsR-'203 sample “Ot (mR.2G3 sample) ~ [Ct (U6 sample) + C% U4? Emoetta)] (2 ^ Ct (miR-205 sample ) “Ct ^ nTIR-SOS sample” “[Ct (ua ajnosife) + Ct {U47 samplejJ / 2 [036] The ACt values for the reference samples were obtained from the analysis of non-half-alignal lymph nodes and it was standardized that the Suitable values for use in the calculations are as follows: ACt (m »Rj? o3 reference) -1: 1.15654-3, ΔCt (miR · 205 reference) = 10.68-8-645.
[037] Já o cálcuio AACt envolve a subtração entre o valor de ACtomostrai de cada amostra experimentai (no caso. línfonodos e PAAF de línfonodos suspeitos) e o valor médio de AC Vencia) do grupo de amostras referência (línfonodos não metastáticos), ou seja, ACt,,,,^.^ referência) =11 156545; ACtfmiR-205 referência) = 10,688645., [038] Para miR-203: AâCt(msR-203) = AGt(m,R.203amo^ra)'- ACt|miR-203 referência) AACt(miR-203) = áCt(m(R-203 amostra) “ 11 »156545 [039] Para miR-205: AACt{miR.205) = ^Ct(miR,20S amostra) * ACt(mjR_205 referência) AACt<miR-205) = ACt(mtR-205 amostra) ~ 10,688645 [040] Assim, os valores de Cí já normalizados dos microRNAs msR-203 e miR-205 obtidos após reação de PCR em tempo real nas amostras suspeitas será sempre comparado ao valor de Ct normalizado de um grupo de linfonodos não-metastáticos já avaliados previamente utilizado como referência O resultado é expresso em fold-change ou o número de vezes o qual a expressão do microRNA de interesse está aumentada nas amostras suspeitas em relação ao grupo de amostras referências.[037] Calculating AACt involves subtracting between the ACtomostrum value of each experimental sample (in this case lymph nodes and FNA of suspect lymph nodes) and the mean value of AC Vencia) from the reference sample group (non-metastatic lymph nodes), or (ACt ,,,, ^. ^ reference) = 11 156545; ACtfmiR-205 reference) = 10.688645., For miR-203: AâCt (msR-203) = AGt (m, R.203amera) '- ACt | miR-203 reference) AACt (miR-203 ) = ΔCt (m (R-203 sample) “11» 156545 [039] For miR-205: AACt (miR.205) = ^ Ct (miR, 20S sample) * ACt (mjR_205 reference) AACt <miR-205) = ACt (mtR-205 sample) ~ 10.688645 [040] Thus, the already normalized Ci values of msR-203 and miR-205 microRNAs obtained after real time PCR reaction in the suspect samples will always be compared to the Ct value normalized from a previously evaluated non-metastatic lymph node group used as reference The result is expressed as fold-change or the number of times that the expression of the microRNA of interest is increased in the suspect samples relative to the reference sample group.
[041] Para as amostras de iinfonodo (incluídas em parafina ou frescas) deve ser utilizado um valor de corte de 2 vezes para considerar uma amostra positiva para a presença de células metastáticas, ou seja, um vaíor de expressão de pelo menos 2 vezes, significa que o Iinfonodo suspeito avaliado contém células metastáticas Para as amostras de PAAF, deve-se utilizar um corte de 10 vezes para considerar uma amostra metastática.[041] For iinfonode samples (embedded in paraffin or fresh) a cut-off value of 2-fold should be used to consider a positive sample for metastatic cells, ie at least 2-fold expression value, means that the evaluated suspicious lymph node contains metastatic cells For FNAB samples, a 10-fold cutoff should be used to consider a metastatic sample.
[042] Estes valores de corte foram validados após diversos cálculos estatísticos de sensibilidade, especificidade, acurácia e construção de curvas ROC e determinação do valor de AUC (área abaixo da curva), que comprovaram que sua utilização era adequada para a correta classificação de amostras de linfonodo ou de PAAF de linfonodos em metastáficas e não metastátícas. Para que uma amostra seja considerada metastática, basta que o valor de fold-change de peto menos um dos microRNAs (miR-203 ou miR-205) esteja acima do corte de 2 vezes para as amostras de linfonodo ou 10 vezes para as amostras de punçâo das fiau ras |Q43J Figura 1 - Representação esquemática do processamento dos linfonodos em cones para análise mosecuiar. A) 3 a 5 cortes de 5 a 10 pm são realizados e coletados a cada 50 prn; B) Cortes de 5 a 10 pm são realizadas por toda a extensão do linfonodo e coletados.[042] These cut-off values were validated following various statistical calculations of sensitivity, specificity, accuracy and construction of ROC curves and determination of AUC value (area below the curve), which proved that their use was adequate for the correct classification of samples. lymph node or lymph node FNA in metastatic and non-metastatic. For a sample to be considered metastatic, it is sufficient that the fold-change value of minus one of the microRNAs (miR-203 or miR-205) is above the 2-fold cut for lymph node samples or 10 times for the lymph node samples. Fig. 1 - Schematic representation of lymph node processing in cones for mosquito analysis. A) 3 to 5 cuts from 5 to 10 pm are made and collected every 50 prn; B) Cuts from 5 to 10 pm are performed over the entire lymph node and collected.
Exemplo Processamento do material para análise molecular (044] Para o processamento das amostras de linfonodo incluídas em parafina é possível a avaliação de cortes ou do linfonodo inteiro. Para a análise de cortes, uma opção é submeter o bloco (1) a 3 a 5 cortes histológícos (2) seriados de 5 a 10 pm de espessura, distribuídos em aproximadamente 6 níveis com intervalos de 50 pm de distância (3) Já para a análise do linfonodo inteiro, todo o bloco (4) pode ser submetido a cortes de 5 a 10 pm (5). Em ambos os casos, os cortes obtidos são coletados em tubos de 1,5 ml para posterior extração [045] Para a coleta das amostras de biópsia por punção, a agulha coletora conectada à seringa pode ser lavada em 100 a 400μΙ de solução contendo EDTA e cloreto de sódio, A solução de coleta pode ser preparada da segu»nte forma: preencher um tubo de coleta de sangue contendo EDTA com cloreto de sódio (soro fisiológico) 0 9% , misturar utilizando um agitador de tubos tipo vortex e preparar alíquotas de 100 a 400μΙ da solução de coleta em criotubos [tubos resistentes ao armazenamento a baixas temperaturas). O material coletado é congelado em nitrogênio líquido e armazenado em ultrafreezer a temperaturas inferiores a ~8G°C até o momento da extração do RNA.Example Molecular Analysis Material Processing (044] For the processing of paraffin-embedded lymph node samples it is possible to evaluate sections or the entire lymph node.For sections analysis, one option is to subject block (1) to 3 to 5. 5 to 10 pm thick histological sections (2), distributed in approximately 6 levels at 50 pm intervals (3) For whole lymph node analysis, the entire block (4) can be subjected to 5-second sections. at 10 pm (5) In both cases, the obtained sections are collected in 1.5 ml tubes for further extraction [045] For the collection of biopsy samples by puncture, the collecting needle connected to the syringe can be washed in 100 to 400μΙ of solution containing EDTA and sodium chloride. The collection solution can be prepared as follows: fill a blood collection tube containing EDTA with 0 9% sodium chloride (saline), mix using a stirrer of tubes ti vortex and prepare 100 to 400μΙ aliquots of the cryotube collection solution (low temperature storage tubes). The collected material is frozen in liquid nitrogen and stored in an ultrafreezer at temperatures below ~ 8G ° C until RNA extraction.
Extração de RNA e Síntese de cDNARNA Extraction and cDNA Synthesis
[046] Para a realização da presente invenção sugere-se a utilização do kit Recoverail Total Nucleic Aad Isolation de acordo com as recomendações do fabricante para a extração de RNA a partir de matenal parafinado A única modificação deve ser feita na fase de desparafinização para o material obtido a partir do linfonodo inteiro Por conta da grande quantidade de parafina nestas amostras, 3 lavagens com Xilol [ao invés de apenas uma, conforme recomendando no kit) Para a extração e purificação do RNA, qualquer outro kit capaz de extrair RNA tots! de amostras incluídas em paratfina pode ser utilizado, sempre seguindo as recomendações do fabricante.[046] For the purpose of the present invention, it is suggested to use the Recoverail Total Nucleic Aad Isolation kit according to the manufacturer's recommendations for extraction of RNA from paraffin material. The only modification should be made at the dewaxing stage for the material obtained from the entire lymph node Due to the large amount of paraffin in these samples, 3 xylol washes [instead of just one, as recommended in the kit) For RNA extraction and purification, any other kit capable of extracting RNA tots! Samples included in paratfine may be used, always following the manufacturer's recommendations.
[047] Para a extração de RNA a partir das amostras de PAAF, o reagente Trizoi LS pode ser utilizado com algumas modificações. Este reagente foi escolhido por ter sido formulado especificamente para a obtenção de RNA a partir de amostras líquidas. No entanto, outros reagentes com mesma composição também podem ser utilizados. A extração iniciou-se com a adição de Tnzol LS ao tubo contendo o matenal da punção, homogeneização em agitador vortex e incubação a temperatura ambiente. Em seguida foi adicionado clorofórmio, o material foi homogeneizado e incubado à temperatura ambiente. Os tubos foram então centrifugados e a fase aquosa sobrenadante contendo o RNA foi transferida para um novo tubo ao qual foi adicionado acetato de sódio à concentração 3M e pH 5.2, glicogênío à concentração de 20mg/mí e isopropanoi. O material foi precipitado a -20°C e centrifugado para recuperação do peilet. O sobrenadante foi descartado por inversão e α peilet foi lavado com etanol 70% gelado. Após nova centrifugação, o sobrenadante foi descartado e o peilet foi seco à temperatura ambiente por 15 a 20 minutos. O peilet foi ressuspendido em água livre de RNase, e o RNA total obtido foi armazenado a -80° C.[047] For RNA extraction from FNAB samples, Trizoi LS reagent may be used with some modifications. This reagent was chosen because it was specifically formulated to obtain RNA from liquid samples. However, other reagents of the same composition may also be used. Extraction began by adding Tnzol LS to the tube containing the puncture material, vortexing and homogenization at room temperature. Then chloroform was added, the material was homogenized and incubated at room temperature. The tubes were then centrifuged and the supernatant aqueous phase containing RNA was transferred to a new tube to which sodium acetate was added at 3M concentration and pH 5.2, glycogen at 20mg / ml concentration and isopropane. The material was precipitated at -20 ° C and centrifuged for recovery of the peilet. The supernatant was discarded by inversion and α peilet was washed with 70% ice cold ethanol. After further centrifugation, the supernatant was discarded and the peilet was dried at room temperature for 15 to 20 minutes. The peilet was resuspended in RNase free water, and the total RNA obtained was stored at -80 ° C.
[048} Diversos kits estão comercialmente disponíveis para a fase de síntese do cDNA Na presente invenção esta reação foi realizada utilizando o kit Taqman microRNA Kit e ensaios TaqMan MicroRNA Assays que contém sequências de primers específicas para a reação de transcrição reversa dos microRNAs miR-203 e miR-205 e para os RNA endógenos U6 e U47.Several kits are commercially available for the cDNA synthesis phase. In the present invention this reaction was performed using the Taqman microRNA Kit and TaqMan MicroRNA Assays which contain specific primer sequences for miR-203 reverse transcription reaction. and miR-205 and for endogenous RNAs U6 and U47.
Expressão dos microRNAs [049] Diversas opções de reagentes, primers e sondas para a detecção dos microRNAs miR-203 e miR-205 e dos RNAs endógenos U6 e U47 por PCR em tempo Real estão comercialmente disponíveis. Na presente invenção estas reações foram feitas utilizando-se o TaqMan Universal PCR Master Mix 2X. solução que contém todos os reagentes necessários para a reação de amplificação {como DNA polimerase, tampão. magnésio, desoxirribonucleotídeos) e os ensaios TaqMan MtcroRNA Assay 20X que contêm prímers e sonda específicos para cada um dos microRNAs e RNAs avaliados.MicroRNA Expression Several reagent, primer, and probe options for detection of miR-203 and miR-205 microRNAs and endogenous U6 and U47 RNAs by Real Time PCR are commercially available. In the present invention these reactions were performed using TaqMan Universal PCR Master Mix 2X. solution containing all reagents required for the amplification reaction (such as DNA polymerase, buffer). magnesium, deoxyribonucleotides) and the TaqMan MtcroRNA Assay 20X assays that contain specific primers and probes for each of the evaluated microRNAs and RNAs.
[050] Os exemplos acima não devem ser interpretados como um limitante para invenção, servindo apenas para ilustrar a forma preferível de realização da invenção. O alcance da proteção da invenção será interpretado com base nas reivindicações descritas a seguir.[050] The above examples are not to be construed as limiting the invention, but merely to illustrate the preferred embodiment of the invention. The scope of the protection of the invention will be interpreted based on the claims described below.
Claims (20)
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|---|---|---|---|
| BR102015003310A BR102015003310A2 (en) | 2015-02-13 | 2015-02-13 | method of lymph node metastatic cell detection in patients with head and neck squamous cell carcinoma and use of micrornas as markers |
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