BR102013006411A2 - Processo para a obtenção de uma composição de igg através de tratamento térmico - Google Patents

Abstract

Processo para a obtenção de uma composição de igg através de tratamento térmico. A presente invenção refere-se a um novo processo para a obtenção de uma composição de igg a partir de uma solução de igg purificada parcialmente a partir de plasma humano, no qual por aplicação de tratamento térmico intermediário e sem usar reagentes para a precipitação de agregados / polímeros de alto peso molecular e/ou proteínas é obtida eliminação virtuamente total dos polímeros de igg gerados durante o processo. Além disso, este processo oferece alta produtividade, menores custos de produção e é fácil de implementar em comparação com os processos da técnica conhecida. Além disto, usando este processo é conferida estabilidade ao produto final em líquido.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO PARA A OBTENÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO DE IgG ATRAVÉS DE TRATAMENTO TÉRMICO".

DESCRIÇÃO

Esta invenção se refere a um novo processo para a obtenção de uma composição de IgG a partir de uma solução de IgG purificada parcial-mente-partir de plasma humano,_no .quaLpor etapa de aplicação de trata-mento térmico intermediário e sem usar reagentes para a precipitação de agregados / polímeros de alto peso molecular e/ou proteínas é obtida eliminação quase total dos polímeros de IgG gerados durante o processo. Além disso, o processo oferece alta produtividade, menores custos de produção e implementação mais fácil em comparação com os processos da técnica anterior. Além disso, é conferida estabilidade para o produto final em líquido através do uso deste processo. A imunoglobulina G (IgG) é o isótipo da imunoglobulina mais a-bundante no soro humano (8 a 16 mg/ml), compreendendo cerca de 80% de todas as imunoglobulinas. A IgG é indicada para o tratamento de várias doenças tais como imunodeficiência primária, em particular hipogamaglobuli-nemia e agamaglobulinemia congênita, púrpura trombocitopênica idiopática, como um adjuvante no tratamento da Doença de Kawasaki e no transplante da medula óssea, hipogamaglobulinemia associada com leucemia linfocítica crônica como parte do tratamento de infecção por HIV em pacientes pediátricos, entre outras.

Atualmente há alta demanda por imunoglobulina G (IgG) a qual é polivalente com um amplo.espectro de anticorpos humanos e tem funcionalidade total (capacidade neutralizante, opsonização, vida média conservada), com moléculas intactas (integrida\de do fragmento Fc cristalizável) e uma distribuição normal de subclasses de IgG idêntica ou equivalente ao plasma natural, especialmente para as subclasses minoritárias (lgG3 e lgG4).

As vias para a administração terapêutica da IgG podem ser in-travenosa, subcutânea e intramuscular, e além disto pode ser administrada por outras vias menos convencionais tais como as vias oral, por inalação ou tópica. Não obstante a administração intravenosa oferecer as indicações terapêuticas mais úteis, quer para o tratamento de imunodeficiências primárias ou para imunodeficiência comum variável (déficit de subclasses de IgG e IgA) (Espanol, T. "Prímary immunodeficiencies" (Imunodeficiências primárias).-EharmaceuticaLPolicy and Law 2009; _1_1_(4).:_277=283).,. imunodeficiências secundárias ou adquiridas (por exemplo infecção por vírus tais como cytomegalovirus, herpes zoster, imunodeficiência humana) e doenças de uma origem autoimune (púrpura trombocitopênica, Síndrome de Kawasaki, por exemplo) (Koski, C. "Immunoglobulin use in management of inflamma-tory neuropathy (Utilização de imunoglobulina no manejo da neuropatia in-flamatória). Pharmaceutical Policy e Law 2009; 11(4): 307-315).

Idealmente IgG para utilização intravenosa (IGIV) deve ser formulada com uma alta concentração em líquido e preferencialmente deve ser capaz de ser armazenada até cerca de 30°C de modo a facilitar a conservação do produto e infusão imediata.

Foi descrito que de modo a reduzir possíveis reações de intolerância à IgG é necessário que a imunoglobulina A (IgA) e a imunoglobulina M (IgM), bem como aglutininas dos grupos sanguíneos, devem estar ausentes, ou em uma quantidade indetectável. Além disso é essencial que o produto deve ser virtualmente livre de qualquer atividade enzimática, tanto através da presença de plasmina ou plasminogênio, ou precalicreína, ou seus ativadores, quininas ou quininogênio, ou fatores de coagulação tais como fator XI / fator Xla, entre outros.

Por outro lado a origem humana do plasma de partida para a obtenção de IgG polivalente torna necessário reduzir o risco de infecção através da transmissão de vírus ou patógenos para um mínimo. Conforme descrito por Fernandes et al. (Patente Espanhola No. ES 500121) e Hirao, Y. et al. (Patente Européia No. EP 196761 e Patente Européia No. EP 253313), o tratamento térmico de IgG em solução (líquida), ou pasteurização, pode ser realizada de modo eficaz na presença de protetores contra a-desnaturação da IgG (por exemplo, sacarose, sorbitol, aminoácidos). Para este fim a temperatura da solução é aumentada até uma temperatura de cerca de 60°C por no mínimo algumas 10 horas, ativando ou atenuando os patógenos mais perigosos. Estes patógenos podem ter uma camada lipídica tais como o vírus da imunodeficiência humana (HIV), o vírus da hepatite C (HCV) e o vírus da hepatite B (HBV), ou ser naked (sem camada lipídica), tais como polioví-rus^o vírus da hepatite A (HAV)-e parvovírus, entre outros (Uernura Y. et al. __ "Inactivation and elimination of viruses during the fractionation of an intrave-nous immunoglobulin preparatiorí' (Inativação e eliminação de vírus durante o fracionamento de uma preparação de imunoglobulina intravenosa). Vox Sang. 1989; 56: 155-161). Não obstante, a pasteurização, mesmo na presença de estabili-zantes e sob as melhores condições de processo, resulta inevitavelmente na formação de agregados irreversíveis de proteínas de alto peso molecular tais como polímeros de IgG e/ou polímeros de outras proteínas acompanhantes, em maior ou menor proporção dependendo da pureza da IgG de partida (Hi-rao, Y. et al., acima; e Ristol, P. et al. Patente Européia No. EP 1225180 e Patente Espanhola No. ES 2091161).

Durante a década de 1960 a 1970 a presença de agregados irreversíveis de alto peso molecular conhecidos como polímeros de IgG foi associada com o consumo de complemento para a ativação dos mesmos (atividade anticomplemento, ACA) durante a administração intravenosa de IgG, e este fenômeno foi ligado a graves reações de intolerância ou de anafi-laxia observadas (Barandum, S. et al. Vox Sang. 7: 157-174, 1962). Por este motivo as autoridades de saúde regularam o conteúdo máximo de polímeros em IGIV, ou formas moleculares maiores do que dímeros, para um limite de 3% (Eur.Ph. Monograph 6.3; e CMP Core SPC for normal immunoglobulin for intravenous administration: CPMP/BPWG/859/95 rev.2). Esta consideração é especialmente importante para uma formulação líquida porque o limite de 3% também deve ser mantido até a data de expiração para o produto. Portanto deve ser obtida uma ausência virtualmente total destes polímeros de IgG, tanto depois da pasteurização quanto no produto final obtido, de modo a assegurar que o produto não venha a deteriorar a longo prazo e a assegurar a máxima temperatura de armazenamento possível.

Atualmente a maioria da IgG líquida disponível no mercado e formulada com aminoácidos deve manter um pH ácido de modo a evitar a agregação (Uemura, Y. "Dissociation of aggregated IgG and denaturation of monomeric IgG by acid treatment (Dissociação de IgG agregada e desnatu-ração de IgG monomérica-por tratamento ácido). Tohoku J. Exp. Med.,1983; _ 141: 337-349), preferencialmente entre um pH de 4,0 a 5,0 (Tenold, R. et al. US-4396608) e em uma temperatura de 2 a 8°C se forem estabilizadas com 0,2 M ou 0,25 M de glicina, tais como as conhecidas pelos nomes comerciais de Gamunex ® (Grifols SA, Espanha), Kiovig® ou Gammagard® Liquid (ambos da Baxter, Estados Unidos), ou até 25°C caso estabilizadas com 0,25 M de prolina, tal como Privigen® (CSL Behring, Alemanha), de modo a minimizar a agregação molecular durante o armazenamento (Jolles, S. et al. "Clinicai uses of intravenous immunoglobulin” (Aplicações clínicas de imunoglobu-lina intravenosa). Clin. Exp. Immunol. 2005 October; 142(1): 1-11; Hooper, J.A. "Intravenous immunoglobulins: evolution of commercial IVIG preparati-ons" (Imunoglobulinas intravenosas: evolução de preparações comerciais de IVIG). Immunol Allergy Clin. North Am. 2008; 28(4): 765-778).

Foi demonstrado que um pH excessiva mente ácido durante um longo período de exposição favorece a fragmentação da IgG, por exemplo em um pH de 4,5 ou abaixo e em uma temperatura relativamente elevada, por exemplo a 30°C (Vermeer, A. et al. "Thermal stability of immunoglobulin: Unfolding and aggregation of a multi-domain protein" (Estabilidade térmica da imunoglobulina: Desdobramento e agregação de uma proteína multido-mínio). Biophys. J. 2000; 78: 394-404; Shukla, A. et al. "Strategies to ad-dress aggregation during protein A chromatography’' (Estratégias para tratar agregação durante cromatografia de proteína A). Bioprocess International, May 2005). Deste modo, por exemplo, foi reportado na literatura que 10% das composições de IGIV formuladas com L-prolina em um pH de 4,8 ± 0,2 sjão suficientemente estáveis com respeito à agregação molecular, porém se observa uma tendência a fragmentação com o tempo de exposição. Deste modo em uma temperatura de 25°C, os fragmentos montam em média a 3,9% depois de 36 meses (Cramer, M. et al. "Stability over 36 months of a new liquid 10% polyclonal immunoglobulin product (IgProlO, Privigen®) sta-bilised with L-proline" (Estabilidade durante 36 meses de um novo produto líquido de imunoglobulina policlonal a 10% (IgProlO, Privigen®) estabilizada com L-prolina), Vox Sang. 2009. DOI: 10.1111/j. 1423-0410.2008.01143.x). ------- —Foi-descrito-que-a-formulaçãO-daJgG_com_polióis_ctu_poli-aJcoóis,___ por exemplo com maltose e sorbitol, evita a agregação (Katakam, M. et al.: Aggregation of proteins and its prevention by carbohydrate excipients: Albu-mins e globulin (Agregação de proteínas e sua prevenção por excipientes de carboidratos: Albuminas e globulina). J. Pharm. Pharmacol. 1995; 47: 103-107) e devido a esta propriedade soluções de IgG que são estáveis até 25°C (com 10% de maltose, nome comercial Octagam®) e até 30° (com 5% de sorbitol, nome comercial Flebogamma® DIF) foram formuladas em um faixa de pH ligeiramente ácido entre 5,0 e 6,0 (Hirao, Y. et al., patente européia No. EP-278422).

No entanto a presença de alguns açúcares ou derivados em formulações de IgG tem sido questionada nos últimos anos (Szenczi, A .et al.: The effect of solvent environment on formation and stability of human polyclonal in solution. (O efeito de ambiente solvente sobre a formação e a estabilidade de policlonal humano em solução.) Biologicals, 2006; 34(1): 5-14), uma vez que alguns casos de grave falência renal foram associados com a infusão de preparações de IgG contendo sacarose. Outras desvantagens que podem ser apresentadas por algumas composições de imunoglobulina com açúcares particulares (sacarose) e algumas altas concentrações de polióis (10% de maltose) é a capacidade relativa para aumentar a viscosidade sanguínea ao infundir as soluções, isto sendo ligado a alguns casos muito graves de trombose intravascular e enfarte agudo do miocárdio onde há doença prévia ou o paciente está correndo risco (Radosevich, M. e Bur-nouf, T. "íntravenous immunoglobulin G: Trends in production methods, qua-lity control and quality assurance (Imunoglobulina G intravenosa: Tendências em métodos de produção, controle de qualidade e garantia-de-qualidade) Vox Sang., 2009; 1-17; Katz, U. e Shoenfeld, Y.: Review: intravenous immu-noglobulin therapy and thromboembolic complications (Revisão: terapia com imunoglobulina intravenosa e complicações tromboembólicas). Lupus, 2005; 14(10): 802-808).

Também foi detectado que alguns produtos comerciais de IGIV contêm enzimas de pró-coagulação ativas, remanescentes de seu processo de~purificação;-as-quais-têm-um aeentuado-efeito4romboembólicoL(TEE), _ foi comprovada uma associação entre TEE e a presença de fatores Xl/XIa e/ou outros fatores de pró-coagulação (por exemplo, calicreína ou semelhantes). A eliminação da capacidade tromboembólica é um imperativo o qual deve ser satisfeito para infusões de IGIV, com garantias máximas de tolerância e segurança.

Sem estarem associados a qualquer teoria em particular os presentes inventores acreditam que as principais diferenças entre as IGIV atualmente comercializadas podem ser atribuídas não somente à formulação (aminoácidos, açúcares e polióis, e pH) mas também ao processo para a obtenção da IgG, o qual vai afetar as condições finais de conservação para o produto em líquido (temperatura-tempo), por exemplo de modo a evitar a a-gregação e a fragmentação durante o armazenamento, entre outras características. Esta dependência entre a estabilidade de formulações líquidas de IgG e seu processo de purificação foi observada por outros autores (Cramer, M. et aí. acima).

Esta invenção, portanto, proporciona um processo para a obtenção de uma preparação de IgG que supera os problemas do estado da arte previamente mencionados. O processo de acordo com esta invenção se inicia com um material contendo IgG purificada por meio de métodos convencionais, o qual é adicionalmente purificado por tratamento térmico, também conhecido como pasteurização, sob condições específicas de agentes esta-bilizantes, concentração de proteína, condutividade, pH e concentrações de reagentes residuais das etapas de precipitação prévias que tornam possível reduzir as impurezas de enzimas proteolíticas e proteínas. Esta redução nas impurezas ê enzimas ocorre durante este tratamento e/ou durante uma eta- pa subsequente à adsorção seletiva das proteínas agregadas, porém em qualquer caso estas duas etapas são usadas exclusivamente como uma purificação final sem a introdução de técnicas de separação usando precipitação. A técnica anterior inclui a utilização em escala industrial de uma combinação de precipitação de agregados / polímeros e separações croma-tográficas, tal eomo-deserito—por-exemplo,-por-Coval,-I—(Patenteados Estar dos Unidos No. US-4093606 e Patente dos Estados Unidos No. US-4165370) e Uemura, Y. et al. (Patente Espanhola No. ES 506679 e Patente Européia NO. EP 246579), as quais descrevem processos de precipitação usando polietileno glicol (PEG), um método fracamente seletivo o qual provoca alta recuperação de perdas de monômero / dímero de IgG (coprecipita-ção), a qual varia muito de acordo com o processo usado. Por exemplo, se for realizado tratamento térmico em uma solução de IgG que não tenha sido suficientemente purificada, a recuperação de IgG (monômero / dímero) normalmente serpa entre 70 e 80% (Uemura, Y. et al. acima). No caso de soluções de IgG purificada podem ser obtidos melhores resultados de recuperação, com 80 a 90%, porém para isto é necessário usar técnicas de separação complexas tais como microfiltração de fluxo tangencial (TFF), conforme descrito na arte anterior (Ristol, P. et al., acima). No entanto o processo de TFF está associado com um alto consumo de reagentes de precipitação (PEG), estabilizante (sorbitol) e água para injeção, e uma série de operações de limpeza - sanitização as quais devem ser consideradas quando o equipamento é necessariamente reusado. Além de ser associado com um longo tempo de processo, pode ser difícil de manipular, os custos associados para consumíveis e/ou energia são elevados e a recuperação de monômeros / dímeros de IgG é sempre de menos de 90%.

Os presentes autores desenvolveram um processo através do qual o uso de reagentes para a precipitação de agregados / polímeros de alto peso molecular e/ou proteínas conforme descrito na arte anterior foram dispensados com, e surpreendentemente obtiveram eliminação virtualmente total dos polímeros gerados; com alta produtividade, menores custos de pro- dução e fácil implementação em comparação com os processos na arte anterior. Além disso, através do uso deste processo, foi obtida estabilidade para o produto final em líquido, preferencialmente formulado na presença de aminoácidos ou polialcoóis, e pode ser mantido em líquido por no mínimo 1 ano em uma temperatura de entre 2 e 30°C e um pH de 4,6 ou superior e até 5,8. ____________Eortanto_estaJnYençãQ_se_refere_a_uffLprQcesso_para_ajQbtenção_ de uma composição de IgG a partir de uma solução de IgG purificada parcialmente a partir do plasma humano o qual compreende as etapas de: a) diafiltração da solução de IgG purificada parcialmente; b) estabilização da solução obtida na etapa a); c) tratamento com calor da solução obtida na etapa b); d) seletivamente adsorção dos agregados e/ou polímeros de alto peso molecular da solução tratada com calor na etapa c) através de croma-tografia catiônica; e e) diafiltração e formulação da solução obtida na etapa d).

Através do uso deste processo é obtida uma redução significativa no teor de agregados / polímeros de alto peso molecular, isto é, os agregados / polímeros superiores ao dímero de IgG e outras proteínas instáveis, dando origem a uma solução a qual contém essencialmente monômeros / dímeros de IgG que podem ser formulados em um meio ligeiramente ácido, e podem ser mantidos em um líquido em temperatura ambiente sem sinais notáveis de instabilidade, em conformidade com as especificações estabelecidas para sua utilização preferencialmente intravenosa, ou subcutânea ou intramuscular.

Preferencialmente o processo de acordo com esta invenção é realizado iniciando a partir de uma solução de IgG purificada de plasma humano tendo um teor de IgG de mais de 95% com respeito às proteínas totais e mais preferencialmente mais de 97%, conforme determinado por eletrofo-rese em acetato de celulose, tinção de amido preto (starch black tinctiori), e quantificado densitometricamente, de acordo com o método descrito na ”Farmacopéia-Européia-(EuropeanPharmacopoeia).------------------------------- Como materiais de partida esta patente considera o uso de frações ricas em IgG (separadas a partir do fracionamento de plasma humano de modo a obter albumina por métodos convencionais conhecidos na arte), seguido por sua purificação apropriada para iniciar o processo de acordo com a invenção.

Até o momento o fracionamento a frio de plasma com etanol, com- base no*método 6 de Cohn (Cohn,E. J.eLa/. Separationinto_Fractions of the Protein and Lipoprotein Components (Separação em Frações dos Componentes de Proteínas e Lipoproteínas). J. Am. Chem. Soc. 1946; 68: 459-475) para separar uma fração rica em IgG continua principalmente em uso, e em uma escala industrial. Esta fração (Fr-ll+lll) ou equivalente (Fr-l+ll+lll), a qual contém a maior parte (> 90%) da IgG e do plasma, de pureza variável (normalmente entre 35 e 65% de IgG em relação às outras proteínas), deve ser purificada mais extensivamente através de precipitações com etanol conhecidas como método 9 de Cohn-Oncley (Oncley, J.L. et al.: The separation of the antibodies, isoagglutinins, prothrombin, plasminogen and beta-1 lipoprotein into subfractions of human plasma (A separação dos anticorpos, isoagjutininas, protrombina, plasminogênio e lipoproteína beta-1 em subfrações de plasma humano). J. Am. Soc. 1949; 71: 541-550) até ser obtida uma fração de imunoglobulina concentrada (Fr-ll, ou sobrenadante da Fr-lll concentrada). Outra alternativa viável é usar o método de Kistler-Nistchmann (Kistler, P. e Nitschmann, Hs. Large Scale Production of Human Plasma Fractions (Produção em Larga Escala de Frações de Plasma Humano). Vox Sang. 1962; 7: 414-424) até o precipitado A (ou precipitado equivalente A+l), e em seguida purificar este de modo a obter o precipitado de GG, ou para o sobrenadante concentrado (ultrafiltrado) do precipitado B.

Usando ambos os procedimentos de precipitação com etanol é possível obter uma solução de IgG (a partir de sobrenadante de Fr-lll, Fr-l+lll, Fr-ll, GG precipitado ou sobrenadante do precipitado B) a qual está em conformidade com as características de pureza mínima de >95% de IgG (a-través de eletroforese sobre acetato de celulose) e preferencialmente >97% ~de lgG; o que é requerido de modo a que possa ser usada como um material- de partida no processo de acordo com a invenção. Isto converte a IgG a qual é aceitável para a via intramuscular ou subcutânea em uma preparação a qual é tolerável para a via intravenosa.

Em qualquer caso, atualmente são usadas outras combinações preferenciais para aumentar a pureza do material de partida (por exemplo, Fr-ll+lll ou precipitado A), por exemplo, por precipitação da maior parte dos eontaminantes-e/ou-sua-adsorção-sobre resinas aniônicas_e/ou. adsoryentes _ inorgânicos (polietileno glicol, ácido octanóico, cromatografia de permuta iô-nica, bentonita, perlita). Os documentos Ristol, P. et al. EP-1225180; Lebing, W. et al. Patente Européia No. EP-0893450; Teschner, W. et al.: A new li-quid, intravenous immunoglobulin product (10% IGIV) highly purified by a state-of-the-art process (Um novo produto líquido de imunoglobulina intravenosa (10% de IGIV) altamente purificada por um processo no estado da arte). Vox sang. 2007; 92(1): 42-55 se referem a processos válidos para purificação através de precipitação com etanol, PEG ou ácido octanóico, combinada com cromatografia de permuta iônica para aumentar a pureza de uma fração de IgG intermediária (por exemplo Fr-ll+lll) até >95% de IgG, e preferencialmente >97% de IgG antes de proseguir para o tratamento de purificação na patente. A diafiltração na etapa a do processo de acordo com esta invenção é realizada com o objetivo de que a concentração de componentes indesejáveis derivados a partir de um processo de purificação de IgG de rotina seja reduzida abaixo de valores de concentração os quais podem afetar o processo de acordo com esta invenção. Por exemplo, um componente indesejável é etanol, e através desta etapa de diafiltração (a) isto deve ser reduzido até uma concentração de menos de 0,5% (em peso / volume), preferencialmente menos de 0,1%. Se outros reagentes de precipitação não desnatu-rados tais como PEG, ácidos octanoico, detergentes não iônicos compatíveis ou qualquer mistura dos mesmos estiverem presentes, a concentração destes também deve ser reduzida para menos de 2% (em peso / volume) e em qualquer caso até não darem origem a mais de 3% de polímero depois da etapa c). - Além disso, nesta etapa de diafiltraçãó a solução de partida de IgG pode ser ajustada para uma força iônica cuja condutividade é menos de 1 mS/cm, e o pH pode ser ajustado para entre 4,0 e 5,5, preferencialmente em ambos os casos. Pode ser realizada diafiltraçãó com água para injeção ou preferencialmente com uma solução tampão de baixa força iônica tal como uma solução a < 5 mM de ácido acético ou solução de acetato de sódio ajustada para pH 4T0 a-SvO-Gom-álcali ou ácido diluído_______________ A etapa de diafiltraçãó (a) é realizada preferencialmente em modo de fluxo tangencial através de membranas de ultrafiltração, de, por e-xemplo, poliéter sulfona ou equivalentes, usando um corte molecular entre 10 kDa e 100 kDa. Beneficamente no processo de acordo com esta invenção, a etapa de diafiltraçãó (a) também serve para concentrar como proteínas até uma concentração de não mais de 5% (em peso / volume), preferencialmente entre 2% e 4% (em peso / volume).

Uma vez que a solução da etapa (a) tenha sido obtido, esta é estabilizada, por exemplo através da adição de sorbitol como um agente es-tabilizante até uma concentração máxima de 50% (em peso / peso), preferencialmente entre 30% e 35% por peso. Além disso, o pH é ajustado para entre 4,2 e 6,0, preferencialmente entre pH 4,6 e 5,2 através da adição de ácido (por exemplo ácido clorídrico ou ácido acético) ou álcali (por exemplo hidróxido de sódio) em uma maneira a qual é conhecida na arte. O tratamento com calor ou aquecimento da solução na etapa (c) do processo de acordo com esta invenção é um procedimento especial conhecido também como pasteurização, e é realizado em uma temperatura de entre 55°C e 63°C por um tempo de entre 1 e 24 horas. Embora a solução possa ser tratada com calor em qualquer temperatura e por qualquer tempo dentro das faixas mencionadas acima, o tratamento com calor é realizada preferencialmente em 60 ± 1°C por 10 a 11 horas. Em qualquer caso não mais de 3% de polímeros / agregados de alto peso molecular, e preferencialmente entre 1% e 2%, devem ser produzidos. Do mesmo modo a atividade proteolítica devida à possível presença de fatores pró-coagulantes, por e-xemplõ, fator Xl/XIa ou outras proteases, medida cromogenicamente para diferentes substratos (S-2302, S-2288 e S-2238) conforme descrito na arte (vide o Exemplo 3) é reduzida no mínimo 5 vezes em comparação com seus teores iniciais.

Subsequentemente a solução é resfriada, preferencialmente entre 18°C a 30°C e diluída, preferencialmente com no mínimo 33% (por peso) de água para injeção, ou mais preferencialmente com solução tampão contendo umsal compatível (por exemplo,-acetato de sódio, _fosfato,_citrato ou _ semelhantes) em uma concentração de preferencialmente <20 mM. Uma vez diluída a solução contém uma concentração de sorbitol > 5% por peso, e uma concentração de proteína > 5 mg/ml. Um sal compatível totalmente io-nizável, preferencialmente cloreto de sódio, como sólido ou em solução concentrada, por exemplo, 3 M (mol/litro) é acrescentado a esta solução até ser obtira uma solução de cloreto de sódio de entre 0,20 M (mol/litro) e 0,50 M (mol/litro), preferencialmente entre 0,25 M (mol/litro) e 0,40 M (mol/litro). Caso necessário o pH pode ser ajustado de novo para entre 4,2 e 5,5, e preferencialmente entre 4,5 e 5,0, por meio da adição de preferencialmente ácido clorídrico ou acético diluído e/ou hidróxido de sódio. A solução condicionada na maneira descrita acima, isto é, depois de diluição, ajuste da concentração salina e do pH, a qual contém um máximo de 5% de dímeros, é injetada em uma coluna de cromatografia contendo resinas de forte perfusão por permuta catiônica tendo no mínimo um dos grupamentos sulfônicos catiônicos (sulfonila, sulfônico ou sulfopropila: grupamentos S, HS, SP) ligados de modo covalente a uma matriz de perfusão insolúvel sintética e virtualmente incompressível compreendendo partículas rígidas de polimetacrilato ou poliestireno, e preferencialmente compreendendo uma matriz ou um suporte de partículas de poliestireno, polivinil benzeno de entre 20 a 100 pm. A resina pode ser comprimida em uma coluna de fluxo axial cilíndrico de diâmetro apropriado para compressão, ocupando preferencialmente entre uns 5 a 20 cm de altura de resina, ou comprimida em uma coluna de fluxo radial com um trajeto {path) de entre preferencialmente 10 a 15 cm. Em ambos os casos no mínimo 1 litro e preferen-cialmente entre 1 e 10 litros desta resina são usados para cada kg de IgG (a seco) que tenha de ser purificado, o que é equivalente a uma carga de entre 100 e 1000 mg de IgG/ml de gel. Preferencialmente a quantidade de resina comprimida na coluna usada é entre 2 e 5 litros por kg de IgG (equivalente a uma carga de 200 a 500 mg de IgG/ml de gel). Antes de injetar o produto a coluna é equilibrada com uma solução tampão contendo preferencialmente acetato de sódio entre cerca de 5 e 50 mM (milimolar) e mais preferencialmente 10-mM-(milimol/litro)-e-uma concentração^de cloreto de sódio (se for este o sal escolhido acrescentado ao produto) a qual é cerca de igual ou e-quivalente à do produto. O fluxo de injeção preferencial é de não mais de 50 volumes de coluna / hora, e mais preferencialmente entre 5 — 30 volumes de coluna / hora, a temperatura preferencial sendo de 18°C a 30°C. Os monô-meros / dímeros de IgG passam livremente através da coluna, mais de 90% do monômeros totais mais dímeros aplicados sendo recuperados no efluente (a adsorção é <10% de monômeros / dímeros), e preferencialmente é obtida uma recuperação de >93%, este efluente sendo recuperado em um conjunto (pool) até um volume apropriado.

Simultaneamente os agregados / polímeros são capturados pelas resinas até uma quantidade de >85% de seu teor inicial, a qual é equivalente a uma redução de mais de 5 vezes, preferencialmente uma redução >95% (>20 vezes) do teor inicial no material originário do tratamento térmico, com <0,3% de polímeros e preferencialmente <0,1% ou <0,06% sendo encontrados (não adsorvidos) no pool de efluentes da coluna. Do mesmo modo aumentando convenientemente a carga na coluna e aplicando pós-lavagem, por exemplo, com no mínimo dois volumes de coluna de uma solução igual ou equivalente à usada para equilibrar a coluna, a recuperação de monômeros / dímeros ainda pode ser aumentada mais preferencialmente até >95%. Deste modo podem ser obtidas recuperações de >95%, reinjetando a fração de regeneração dentro da mesma coluna, convenientemente diluída e ajustada para as condições usadas na carga inicial ou de menos força iônica. Injeção por gradiente decrescente, conforme já indicado, também estimula a recuperação de monômeros / dímeros de IgG e uma pessoa versada na arte pôde facilmente obter uma recuperação do produto >95% deste modo ou usando um processo similar. Para fazer isto a carga é iniciada com uma concentração salina máxima de acordo com o pH de modo a minimizar fenômenos de superadsorção nos primeiros volumes aplicados, aumentando progressivamente a capacidade da resina à medida que a força iônica diminui, até o volume de carga ser completado. Por exemplo, pode ser usado preferencialmente um gradiente decrescente de até 15% entre a concentração salina-do produto selecionado-no início da~carga-em.comparaçãQ_çom_a_ concentração salina ao final do mesma.

Opcionalmente, o processo de acordo com esta invenção pode compreender um ou mais entre tratamentos de inativação / eliminação viral complementando o tratamento térmico da solução. Entre os tratamentos de inativação viral os quais podem ser usados no processo de acordo com a invenção estão incubação em pH ácido (por exemplo pH 3,8 a 4,2 me 37 ± 2°C durante entre 4 a 24 horas na presença ou ausência de pepsina, ou detergentes não iônicos tais como Pluronic, Triton, Tween e semelhantes); tratamento com um solvente orgânico de fosfato de alquila (0,3% de fosfato de tri-n-butila ou TNBP); detergentes (1% Triton X-100 ou Triton X-45) (Neurath et ai Patente dos Estados Unidos No. US-514375), preferencialmente ajustando a solução de IgG para pH 4,2 a 6,0 e a temperatura para 4 a 30°C, incubando por 1 a 12 horas, e mais preferencialmente algumas 6 horas em 25 ± 2°C; e nanofiltração por membrana de retenção viral (celulose regenerada, polieter sulfona, fluoreto de polivinilideno), ou através de fluxo tangencial ou através de fluxo terminal, sob a forma de um cassete ou sanduíche (superfície lisa), cartucho (dobrado, folha, discos) ou fibra oca, preferencialmente através de uma medida de poro <50 nm, aproximadamente entre 10 a 50 nm e preferencialmente entre alguns 15 a 35 nm e preferencialmente 20 ± 2 nm de medida de poro, com nanofiltração terminal. Estas etapas de inativação / eliminação podem ser realizadas antes ou depois da etapa de tratamento térmico, exceto quando se usa nanofiltração, onde é preferencial que devem ser usadas antes do tratamento térmico.

Uma vez que a etapa (d) do processo de acordo com esta invenção tenha sido completada a solução obtida é diafiltrada com água para injeção ou preferencialmente com uma solução tampão de baixa força iônica a qual pode conter, por exemplo, < 5 mM de ácido acético em um pH de 4,0 a 5,5, e opcionalmente estabilizantes ou excipientes para a formulação final. A diafiltração final é realizada por fluxo tangencial através de membranas de ultrafiltração de polietersulfona ou equivalente, usando um corte molecular preferencialmente entre 10 kDa e 100 kDa, e mais preferencialmente entre 30 kDa-e-50-kDa^ Depois de-um~número-apropriado_de_voíumes_de cliafiltra^ ção para reduzir a concentração salina, preferencialmente para uma condu-tividade de <2 mS/cm, a proteína é preferencialmente concentrada em concentrações nominaois de 5%, 10%, 16% ou 20%, ou qualquer outra concentração intermediária entre cerca de 5% e 22% (em peso / volume). A solução é preferencialmente estabilizada através da adição de um poliaácool (poliol) ou aminoácidos. Em qualquer caso a osmolalidade da solução resultante será >240 mOsm/kg, e cerca de isotônica. Preferencialmente o pH é ajustado para 5,2 ± 0,6 e é feita uma verificação para assegurar que se situe entre 4,6 e 5,8, reajustando com ácido diluído ou álcali caso necessário. A solução ajustada é filtrada esterilmente através de uma membrana absoluta de 0,2 pm de medida de poro em uma maneira conhecida na arte. A solução líquida obtida é introduzida assepticamente dentro de recipientes apropriados e submetida a incubação (quarentena) de não menos de 14 dias a 25 ± 5°C, preferencial mente de modo a observar qualquer sinal de instabilidade ou contaminação em cada unidade introduzida individual. O produto contido é armazeando sob as mesmas condições que para a quarentena (temperatura ambiente de 25 ± 5°C) ou em uma câmara fria (5 ± 3°C). O produto obtido por meio do processo de acordo com esta invenção permanece estável (essencialmente inalterável) por no mínimo 1 ano em uma temperatura de entre 2 a 30°C sem apresentar quaisquer sinais que revelem degradação quer em suas características físicas (aspecto, cor, turva-ção, sedimentos, partículas ou fibras) ou em seus parâmetros analíticos de especificação de acordo por exemplo a European Pharmacopoeia (Farma-copéia Européia) (agregados de alto peso molecular, fragmentos, atividade anticomplemento ou ACA, ativador de pré-calicreína ou PKA, subclasses de IgG, etc.)· Esta invenção é descrita e maiores detalhes abaixo com referência aos exemplos. No entanto, não se pretende que estes exemplos restrinjam o âmbito técnico desta invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1. — ----------Iniciando-com uma mistura-de-plasma^humano, çonge]a_do_ade- quado para fracionamento, este foi crioprecipitado em uma temperatura entre 0 e 4°C. O crioprecipitado foi separado por centrifugação de fluxo contínuo (centrífuga Westfalia) na mesma temperatura de crioprecipitação. O so-brenadante foi processado de acordo com o método 6 de fracionamento de Cohn (Cohn et ai, acima) usando etanol a frio até ser obtido Fr-ll+lll. A pasta obtida ou precipitada (Fr-ll+lll) foi separada por filtração por pressão e congelada a <20°C. Em seguida Fr-ll+lll foi processado pelo método 9 de fracionamento de Cohn-Oncley (Oncley, J. et al., acima) até ser obtido Fr-ll. O Fr-ll obtido foi armazenado a <20°C. O Fr-ll foi suspendido em uma solução isotônica de glicina e cloreto de sódio e ajustado para cerca de pH neutro. A solução foi tratada com adsorventes inorgânicos, separada por centrifugação (centrífuga RI NA) e em seguida clarificada em um filtro de profundidade de poro <0,5 pm. O filtrado foi ajustado para um pH entre 5,5 e 6,0 usando 0,5 M de HCI e ultrafiltrado através de membranas de polissulfona tendo um corte molecular nominal de 10 kDa. O volume foi primeiro reduzido e sem seguida a diafiltração foi iniciada em volume constante com água para injeção em 2 a 8°C. No completamento disto o equipamento de ultrafiltração foi pós-lavado e a solução foi ajustada para uma densidade ótica (a 280 nm) de 60 ± 5 AU (unidades de absorção) de proteína. Sorbitol sólido foi acrescentado em uma quantidade de 0,5 kg para cada kg da solução presente e depois de dissolução o pH da solução foi ajustado para 5,5 ± 0,5 usando 0,5 M de HCI.

Em seguida, foi realizado tratamento térmico da solução em um recipiente termostático recirculando o fluido de aquecimento através da camisa em um modo tal que a temperatura do produto foi aumentada até entre 60 e 61 °C e aí mantida por 10 a 11 horas. Em seguida a solução foi resfriada até 2 a 8°C.

Os resultados obtidos para a média de 3 lotes separados são mostrados na Tabela 1.

Tabela 1 Os resultados acima mostram o efeito da purificação anterior de Fr-ll+ll! (suspensão de Frll >97% por eletroforese) e redução de agentes desnaturantes (etanol) sobre a agregação durante tratamento térmico, com somente 1,58% de polímeros, tornando possível a subsequente adsorção por resinas catiônicas sintéticas.

Exemplo 2 Iniciando com um pool de plasma humano, o processo foi o mesmo conforme descrito para o Exemplo 1 até ser obtido Fr-ll+lll (teste a) e continuou até Fr-ll (teste b). De modo a estabelecer o efeito de purificação, bem como a presença de agentes desnaturantes na polimerização durante o tratamento térmico, o procedimento foi como se segue: a) O Fr-ll+lll foi suspendido em água para injeção em 2 a 8°C em uma proporção de 1:3,5 por peso, e depois de uma suspensão homogênea ter sido obtido o pH foi aumentado para 5,25 ± 0,25 com 0,5 M de HCI. Em seguida isto foi centrifugado em um decanter (força centrífuga entre 200 g a 1000 g) produzindo uma suspensão clarificada. b) Fr-ll foi processado como no Exemplo 1 até ser obtida uma solução clarificada por um Filtro de profundidade.

Cada uma das soluções acima foi estabilizada através da adição de sorbitol sólido em uma quantidade de 0,5 kg por kg de soberenadante de partida. Depois do sorbitol ter sido dissolvido, o pH foi ajustado para 5,5 ± 0,5 caso necessário. Cada solução foi aquecida até 60 a 61 °C por 10 a 11 horas. Em seguida foi resfriada até 2 a 8°C.

Os resultados obtidos a partir do produto pasteurizado nos tes-tes a) e b), em comparação eom-o Exemplo-1, são mostrados na_Tabel^2.

Tabela 2 Os resultados dos testes a) e b) demonstram o efeito da pureza da IgG de partida e a necessidade de obter valores >97%. Por outro lado, comparando o teste b) com o processo no Exemplo 1 é óbvio o efeito do e-tanol residual originário do fracionamento do etanol e a necessidade de eliminação. Portanto se deduz que somente as condições no Exemplo 1 seriam aceitáveis para o processo de acordo com a invenção.

Exemplo 3 O plasma foi fracionado do mesmo modo que no Exemplo 1 tanto quanto Fr-ll+lll, e este material foi purificado com PEG ou resinas de per-muta aniônica até ser obtido um produto suficientemente puro.

As mesmas condições de processo conforme descrito na descrição de patente europeia No. EP 1225180 foram aplicadas para esta purificação inicial de Fr-ll+lll. Em mais detalhes, neste exemplo Fr-ll+lll foi suspendido em solução aquosa contendo sorbitol, fosfato dissódio e ácido acético até toda a IgG ter sido efetivamente dissolvida. As principais proteínas coe-xistentes foram precipitadas por meio da adição de até 4% de PEG. Depois disto adsorventes inorgânicos e coadjuvante de filtração foram acrescenta- dos. Antes de separar o precipitado por filtração por pressão (filtros de pressão de celulose) o pH foi reajustado para 5,0 ± 0,5. A pasta foi separada e o pool de filtrado foi coletado. A injeção foi em uma coluna de cromatografia contendo resinas de permuta do tipo aniônica DEAE-Sepharose® (Amer-sham Biosciences, Sécia) depois de ajuste do pH e filtração por gradiente de clarificação até <0,5 pm logo antes de ingressar na coluna. Todo o efluente obtido durante a-earga-do produto contendo IgG-purificada foi jcoLetado._ O efluente acima foi ajustado para pH 4,4 ± 0,2 com 0,5 M de HCI e ultrafiltrado através de membranas de polissulfona tendo um corte molecular nominal de 100 kDa. Inicialmente o volume foi reduzido umas 4 vezes para produzir uma concentração de 2% de proteína e em seguida diafiltração em volume constante com 4 volumes de água para injeção com 4 mM de á-cido acético (milimol/litro) e 5% de sorbitol ajustado para pH 4,2 ± 0,2 com 0,5 M de NaOH foi iniciado em 2 a 8°C. No completamento disto o equipamento de ultrafiltração foi pós-lavado produzindo uma solução de uma densidade ótica (a 280 nm) de 55 ± 5 AU de proteína. Em seguida 0,5 M de HCI foi acrescentado até um pH de 4,0 ±0,1 seguido por incubação em 37 ± 1°C por 4 horas.

Sorbitol sólido foi em seguida acrescentado em uma quantidade de 0,43 kg para cada kg da presente solução (33% em peso / peso), e depois de ter dissolvido, o pH da solução foi ajustado para 4,9 ±0,1 com 0,5 M de NaOH.

Foi realizado tratamento térmico em um recipiente termostático recirculando o fluido de aquecimento através da camisa em um modo tal que a temperatura do produto foi aumentada até 60 a 61 °C e aí mantida por 10 a 11 horas. Em seguida a solução foi resfriada até 2 a 8°C. Os resultados da composição analítica para o monitoramento do processo são mostrados na Tabela 3.

Tabela 3 n.d.: não determinado Os resultados na Tabela 3 indicam que um teor de PEG residual de 0,8% não afeta o grau de polimerização durante o tratamento térmico (1,5% de polímeros). Do mesmo modo esta polimerização não é afetada pelo método de purificação usado previamente, quer usando etanol somente ou etanol + PEG + cromatografia aniônica (vide o Exemplos 1 e 2), contanto que a pureza obtida seja da mesma ordem (>97% de IgG).

Do mesmo modo foram realizadas determinações analíticas sobre diferentes substratos cromogênicos sobre outros lotes em uma escala do preparativo processada do mesmo modo conforme descrito previamente neste Exemplo 3 de modo a avaliar as etapas que têm a capacidade de ina-tivar enzimas proteolíticas, essencialmente procoagulantes. Os substratos S-2302, S-2288 e S-2238 (específicos para fatores de coagulação para o complexo de pró-trombina, trombina, plasminogênio/plasmina, FXI/FXIa, FXII, PKA, etc.) foram usados com base na técnica descrita de acordo com o estado da arte, calculando o gradienté da cinética da reação cromogênica em unidades de absorção da densidade ótica (O.D.) por minuto (min) em relação à concentração de proteína aplicada (g/ml). A proporção (O.D./min)/(g/ml) nas etapas antes e depois da pasteurização é mostrada na Tabela 4.

Tabela 4 Será visto a partir dos resultados na Tabela 4 que sob as condições específicas do processo pasteurização de, a atividade proteolítica (essencialmente fatores pró-coagulantes) pode ser reduzida mais de 5 vezes em comparação com o teor inicial (solução ultrafiltrada) de acordo com os valores obtidos com os três substratos cromogênicos diferentes usados.

Exemplo 4 3 lotes de produção diferentes processados no mesmo modo como no Exemplo 3 até ser obtida uma solução pasteurizada para cada um estavam disponíveis. Cada solução foi diluída umas 4 vezes com solução a 10 mM (milimol/litro) de acetato de sódio em uns 20 a 25°C para obter umas 10 AU de densidade ótica (a 280 nm), e uma concentração de sorbitol de 8% por peso, adicionando a quantidade de NaCI requerida para trazer o produto para uma concentração final de 0,4 M (mol/litro). A solução foi ajustada para pH 4,5 através da adição de HCI diluído (0,1 Ma 0,5 M). A solução foi injetada em uma coluna de forte cromatografia ca-tiônica de poliestireno (POROS HS® 50 pm, Applied Biosystems, Estados Unidos), de uns 8 ml em volume (altura de 10 cm x 0,8 cm2 de seção transversal). A coluna foi equilibrada com uns 10 volumes de coluna de uma solução tampão "ã 10 mM de solução de acetato de sódio em um pH e em uma concentração de NaCI iguais aos do produto sendo carregado. O produto foi injetado em um fluxo de uns 20 volumes de coluna / hora, com todo o efluente da coluna a partir do início da injeção sendo coletado. A amostra do efluente em um volume fixo de 16 volumes de coluna correspondente a uma carga de uns 155 mg de IgG/ml de gel foi obtida, a proteína sendo determinada por densidade ótica (a 280 nm) e o teor de polímero por HPLC de modo -a-ealeular a-%-de recuperação-deJgG -(monômeros_/_dímeros)de^ redução em polímeros obtidos. A Tabela 5 mostra os resultados obtidos.

Tabela 5 n.d.: não determinado De modo consistente com os resultados anteriores, foi obtida uma redução muito significativa e consistente no teor de polímeros, de entre 94% e 95%, e um teor final de entre 0,09 e 0,15 foi obtido para um teor de polímeros inicial de entre 1,8% e 2,15%. Por outro lado deve ser notada a recuperação de IgG (monômero / dímero) de 96%, junto com uma capacidade de carga excedendo 100 mg de IgG/ml de gel e um tempo de processo de menos de 2 horas (equilibração e carga).

Exemplo 5 O processo usado foi o mesmo que no Exemplo 4, porém foram investigadas a capacidade de carga em diferentes volumes de injeção sob as condições estabelecidas no Exemplo 4. Amostras de efluente para diferentes volumes aplicados foram colhidas, determinando a proteína por densidade ótica (á 280 nm) e o teor de polímeros por HPLC para calcular a % de recuperação de IgG (monômeros/dímeros) e a % de redução em polímeros obtida para diferentes valores de carga (mg de IgG/ml de gel). Os resultados são mostrados na Tabela 6.

Tabela 6 Os resultados demonstram muito significativamente que valores de carga de 360 mg de IgG/ml de gel podem ser obtidos sob condições de fluxo normal de até 20 volumes de coluna por hora com máxima recuperação de IgG, mantendo a capacidade de reduzir os polímeros abaixo de 0,3% do limite até 50 volumes de coluna aplicados em um modo sustentado. O tempo do processo para a carga utilizada não excedeu 3 horas.

Exemplo 6 De modo a saber o alcance operacional da concentração de NaCI em um pH estabelecido de 4,5 e a otimizar a eliminação de polímero maximizando a recuperação de IgG, o procedimento foi como no Exemplo 4, porém foram estudadas diferentes concentrações de NaCI entre 0,35 e 0,425 M, amostrando o efluente da coluna em 2 CV, 25 CV e 50 CV para determinar a proteína por densidade ótica (a 280 nm) e os polímeros por H-PLC, para calcular a % de recuperação de proteína e a redução de polímeros. Os resultados obtidos são mostrados na Tabela 7. "abela7 __________________________________________________ n.d.: não determinado A Tabela 8 mostra os resultados da recuperação de IgG e a redução em polímeros no efluente para o máximo valor de carga aplicada final (50 CV).

Tabela 8 n.d.: não determinado Os resultados acima demonstram que sob as melhores condições de concentração de NaCI a redução em polímeros não é reduzida aumentando a carga aplicada até 50 CV (ou 360 mg de IgG/ml de gel). Do mesmo modo foi estabelecido que a faixa de 0,40 M a 0,35 M de NaCI pode ser usada para obter uma capacidade de carga máxima com um teor de polímero mínimo (de <0,06% a 0,31%) e uma recuperação dé IgG (monômero / dímero) de entre 90,8% e 94,2%.

Os melhores resultados são obtidos em um pH de 4,5, uma concentração de NaCI de 0,375 M, com uma concentração de 10 AU por O.D. (a 280 nm) e um fluxo de injeção de 20 CV/h. Foi demonstrado que o polímero residual é <0,06% (duplicata do teste) a 50 CV (360 nm de IgG/ml de gel) com uma recuperação de IgG de 93,2% a 94,2%. O tempo do processo não excedeu 3 horas. ------------------------------------- Exemplo 7 De modo a descobrir a faixa de pH na qual pode ser usada uma concentração de NaCI estável de 0,35 M, e para otimizar a eliminação de polímeros minimizando a recuperação de IgG, foi usado um procedimento como no Exemplo 4, estudando uma faixa de pH entre 4,5 e 5,0, e foram obtidas amostras do efluente da coluna ao fim de 2 CV, 21 a 25 CV e 50 CV para determinar a proteína po9r Densidade Ótica (a 280 nm) e os polímeros por HPLC, e para calcular a % de recuperação de proteína e a redução em polímeros. Os resultados são mostrados na Tabela 9.

Tabela 9 n.d.: não determinado A Tabela 10 mostra os resultados do cálculo da recuperação de IgG e da redução em polímeros no efluente no máximo valor de carga aplicada final (50 CV), e a redução em polímeros no efluente em metade da carga máxima (cerca de 25 CV).

Tabela 10 (*) Determinada no efluente a 21 CV; n.d.: não determinado.

Os resultados acima demonstram a forte dependência entre o pH e NaCI para efetiva redução em polímeros com mínima perda de IgG. Em uma concentração de 0,35 M de NaCI o pH mais apropriado dentro da faixa testada foi considerado cerca de entre 4,76 e 4,50, de modo que o polímero residual foi entre < 0,06% - 0,24% (aplicando 21 a 50 CV) e a recuperação de IgG foi entre 90,8% e 94,3%. O tempo do processo foi entre 2 e 4 horas.

Exemplo 8 O procedimento foi o mesmo que no Exemplo 6, porém foi estabelecido um pH de entre 4,85 e 4,88 de modo a investigar as melhores condições de concentração de NaCI entre 0,1 M e 0,4 M. Os resultados são mostrados na Tabela 11.

Tabela 11 n.d.: não determinado A Tabela 12 mostra os resultados do cálculo da recuperação de IgG e da redução em polímeros no efluente no máximo valor de carga aplicada final (50 CV).

Tabela 12 n.d.: não determinado Os resultados acima mostram que o processo é viável em pH 4,85 a 4,88 dentro da faixa de 0,325 M a 0,275 M de NaCI para uma capacidade de carga máxima (50 volumes de coluna, ou 360 mg de IgG/ml de gel), com um teor de polímero residual mínimo (<0,06% a 0,17%) e recuperação de IgG (monômero / dímero) de entre 92,5% e 94,9%. Os melhores resultados foram obtidos com uma concentração de NaCI de 0,3 M, com a qual fo- ram obtidos uma recuperação de 93,7% e um polímero residual máximo de 0,13% no efluente. Na menor concentração de NaCI de 0,1 M os polímeros foram reduzidos completamente, porém a recuperação de IgG foi de menos de 90%.

Comparando os resultados neste Exemplo 8 e os resultados no Exemplo 6 a forte dependência entre pH e NaCI é evidente, e estes parâmetros têm de ser ajustados dentro de uma faixa apropriada para obter ótimos valores de redução de polímero e de recuperação de IgG. Os exemplos acima demonstram que são obtidos os resultados desejados no que se refere a polímero residual <0,3% e redução >85%, e recuperação de IgG (monômero / dímero) >90% entre pH 4,5 e pH 4,9 com uma concentração de NaCI de 0,275 M a 0,4 M.

Exemplo 9 A finalidade deste teste foi avaliar a capacidade de carga de resinas POROS HS® (Applied Biosystems, Estados Unidos) ao usar um processo de cromatografia convencional, o qual implica adsorção de toda a IgG para subsequente elutriação, seguida por comparação dos resultados obtidos com as modalidades prévias da invenção. O processo de cromatografia convencional foi realizado sob condições para adsorção de IgG total até saturação das resinas, em diferentes fluxos de injeção.

Iniciando a partir de um lote de produção processado do mesmo modo que no Exemplo 3 até a obtenção de uma solução pasteurizada, a solução foi diluída com umas 4 vezes de solução a 10 mM (milimol/litro) de a-cetato de sódio em uns 20 a 25°C de modo a proporcionar umas 10 AU de densidade ótica (a 280 nm) com cerca de 8% (em peso / peso) de sorbitol. A solução foi ajustada para pH 4,5 através da adição de HCI diluído (0,1 Ma 0,5 M). A injeção foi dentro de uma coluna de cromatografia catiônica de forte resina sintética de poliestireno (POROS HS® 50 pm, Applied Biosystems, Estados Unidos) de uns 4 ml de volume (altura de 4 cm e seção cruzada de 1 cm2. A coluna foi equilibrada com uns 10 volumes de coluna de uma solução tampão a 10 mM de acetato de sódio em um pH de 4,5. O pro- duto foi injetado em diferentes fluxos de carga de entre 5 e 20 volumes de coluna / hora. Amostras do efluente de coluna foram tomadas de injeção inicial para diferentes volumes de coluna determinando a proteína por O.D. (280 nm) de modo a calcular a capacidade de carga máxima sob condições de fluxo dinâmico em um valor de proteína aproximado de 5% na solução —injetãdãTOs resultados obtidos são mostrados na TabêlãT3~ Tabela 13 A partir dos resultados se deduziu que a máxima capacidade das resinas usadas para adsorção total da IgG sob as melhores condições dinâmicas de fluxo em um processo de cromatografia convencional deve ser encontrada em torno de 60 mg de IgG por ml de resina, e permanece virtualmente inalterada sobre os fluxos de injeção estudados de 5 a 20 CV/h. Considerando que este resultado é muito distante (umas 6 vezes menor) dos >360 mg de IgG/ml de gel obtido nos Exemplos 6 e 8 aplicando as condições de processo de acordo com esta invenção, está demonstrado que a produtividade do processo de acordo com esta invenção é muito superior ao da cromatografia convencional descrita na técnica anterior.

Exemplo 10 Neste exemplo o teste foi planejado de modo a determinar a resolução cromatográfica (separação de polímeros) e a recuperação de IgG sob plenas condições de ciclo cromatográfico (carga, lavagem e elutriação) com adsorção total da IgG (cromatografia convencional), e para comparar os resultados obtidos com os exemplos prévios do processo de acordo com a invenção. O procedimento foi o mesmo que no Exemplo 9, porém uma quantidade inicial de solução de IgG equivalente a 80% de sua capacidade máxima (uns 50 mg de IgG/ml de gel) em um fluxo de uns 5 CV/h foi injetada dentro da coluna. Depois de todo o o produto ter sido carregado foi realizada pós-lavagem com uns 8 CV de solução tampão igual à solução equilibrada inicial compreendendo 10 nM de acetato de sódio em pH 4,5. A IgG foi em seguida elutriada aplicando um gradiente de concentração de NaCI de 0 a 1 M (mol/litro) contendo 0,5 M de glicina em pH 4, em total de uns 25 CV. A IgG^elLJtnãdãTfõi^cõletãda em frações para análise das proteínas subsequen-te (O.D. a 280 nm) e análise da distribuição molecular (HPLC). Os resultados são mostrados na Tabela 14.

Tabela 14 n.d.: não determinado De acordo com os resultados acima foi demonstrado que para uma carga de 50 m de IgG/ml de gel é obtida uma recuperação máxima de 64% de IgG (monômero / dímero) para um teor de polímero <0,06%, a maior parte da IgG misturada com polímero não recuperável sendo encontrada na fração de cauda e no segundo pico de elutriação. Este valor de recuperação não é comparável com os obtidos nos exemplos prévios nos quais o processo de acordo com esta invenção é aplicado, no qual é demonstrada eliminação satisfatória de polímero e uma recuperação de mais de 90% de IgG.

Exemplo 11 Um teste adicional foi projetado para estudar os limites de pH e a força iônica (NaCI) os quais podem ser usados e para saber o efeito da concentração de IgG na carga. Vários testes foram realizados com IgG pasteurizada originária de diferentes lotes de produção processados do mesmo modo que no E-xemplo 3. Não obstante em um dos testes foi usada diluição de 4 vezes (para O.D. a 280 nm =10 AU), e o remanescente com diluições de 1,5 a 2 ve-zes (para OTD. a 280 nm = 20 a 23 AU), aproximadamente, usando solução a 10 mM de acetato de sódio, e para cada uma destas o NaCI requerido para obter a concentração final desejada entre 0,275 M e 0,45 M foi acrescentado, ajustando para um pH final de 4,2 e 5,5 respectivamente. Estes ajustes de pH foram realizados usando ácido acético diluído. As soluções ajustadas foram injetadas dentro de uma coluna POROS® HS 50 (Applied Biosystems, Estados Unidos) em ciclos independentes conforme descrito no Exemplo 4, porém neste caso usando entre cerca de 150 e 750 mg de IgG/ml de gel nos testes realizados. O teor de polímeros e dímeros (%) foram determinados por H-PLC e foi determinada a recuperação de IgG (%)para diferentes valores de carga. Os valores obtidos são mostrados na Tabela 15. N.D.: não detectado n.d.: não determinado Com base em diferentes lotes pasteurizados tendo um teor de polímero inicial equivalente a e menor do que 3% foi demonstrado que para qualquer valor de ajuste dentro dos limites explorados neste exemplo (pH 4,2 a 5,5 e NaCI a 0,20 a 0,45 M) é possível adsorver polímeros seletiva-mente até valores entre <0,06% a 0,12%, equivalentes a reduções de entre 93% e >98%, e recuperações de IgG em excesso de 80% (91,0 a 99,5% obtidos entre pH 4,2 e 5,0). Do mesmo modo deve ser salientado que a capacidade de carga e a eficiência da coluna não são diminuídas à medida que a concentração de proteína na solução do produto aumenta até um de valor de O.D. a 280 nm de 23 AU equivalente a 14,7 a 16,5 mg de IgG/ml, com cargas de 580 a 590 mg de IgG/ml de gel sendo obtidas. No entanto, na extremidade superior da faixa de pH (pH 5,5) a solução salina deve ser aprecia-velmente reduzida (de 0,45 M a 0,2 M) de modo a obter uma redução significativa em polímeros. Do mesmo modo é observada uma menor capacidade de carga do que em menores valores de pH, porque quando são usados 403 mg de IgG/ml de gel é medido um maior teor de polímero, a redução neste sendo de somente 86%. Este efeito pode ser atribuído à presença de uma maior quantidade de moléculas de dímeros presentes em pH 5,5, cuja proporção aumenta com o pH, em comparação com pH 4,2.

Exemplo 12 A partir dos Exemplos anteriores 6, 8 e 11 uma fórmula empírica (1) foi determinada para a resina de perfusão de poliestireno POROS®-HS 50 a partir da qual é possível estabelecer com maior precisão a concentração de NaCI necessária de modo a obter os resultados esperados para polímero final e recuperação em função do pH usado. A expressão: (1) [NaCI] = 0,24 + (5,2 — pH)/5 = 1,28 = 0,2 x pH proporciona em torno dos valores esperados dentro da faixa de pH estabelecida (pH 4,2 a 5,5) para a resina estudada. Com base nos dados nos exemplos, para um polímero final preferencialmente <0,1% e uma recuperação de não menos de 90% as concentrações de NaCI requeridas em diferente pH (valor observado e valor calculado de acordo com a fórmula) são mostradas na Tabela 16.

Tabela 16 Os resultados na Tabela 16 mostram uma boa correlação linear entre os valores observados e os valores calculados de acordo com a fórmula, inclusive em valores extremos de pH.

Exemplo 13 Plasma foi processado do mesmo modo como no Exemplo 1 para obter uma solução de IgG polivalente purificada (pureza >97% de IgG) por fracionamento por etanol (de acordo com o método de Cohn-Oncley). O Fr-ll obtido foi diafiltrado através de membranas de 10 kDa até 60 AU e em seguida pasteurizado (10 a 11 horas em 60 a 61 °C) na presença de 33% de d-sorbitol (em peso / peso) e um pH de 5,5 ± 0,5. A solução pasteurizada foi diluída cerca de 4 vezes com solução a 10 mM de acetato de sódio em pH 4,85 de modo que a densidade ótica a 280 nm mudou de 42,8 AU para 10,7 AU e NaCI foi acrescentado até ser obtira uma concentração final de 0,275 moles por litro de solução, ajustando o pH para 4,85 usando 0,1 M de HCI. A proporção de polímero determinada por HPLC foi de 0,88%. Imediatamente depois disso este foi injetado em uma coluna com resinas de permuta catiô-nica de poliestireno (50 pm POROS-HS®) e um volume de 8,0 ml (seção transversal de 0,8 cm2 x altura de 10 cm) com um fluxo de cerca de uns 20 CV/hora. Amostras do efluente da coluna foram obtidas em diferentes volumes de carga aplicada(CV) e para o pool final, determinando a distribuição molecular (polímeros de alto peso molecular) por HPLÇ e a redjjção obtida.. . Os valores encontrados são mostrados na Tabela 17.

Tabela 17 Os resultados obtidos mostram que com as melhores condições do processo de adsorçâo é possível reter todos os polímeros (até <0,06%) formados na pasteurização da IgG previamente purificados por fracionamen-to por etanol com uma alta carga de injeção (385 mg de IgG/ml de resina).

Exemplo 14 Este teste foi designado para determinar a viabilidade do processo quando diferentes etapas de purificação são incorporadas em uma única etapa. Foi decidido determinar se a adsorçâo de polímero pode ser combinada com uma etapa de tratamento opcional anterior com solvente-detergente e subsequente adsorçâo destes reagentes.

De modo a fazer isto Fr-ll+lll foi o material de partida e foi processado do mesmo modo que no Exemplo 3 para obter uma solução pasteurizada em volume. Esta solução foi diluída até uma O.D. a 280 nm de 28 ± 1 AU (cerca de 2% de proteína) e uma solução concentrada (x 10 vezes) de solução de solvente-detergente compreendendo tri-n-butil fosfato e Triton X-100 foi acrescentada de modo a obter concentrações finais de 0,3 ± 0,1% e 1,0 ± 0,3% respectivamente. A temperatura da solução foi aumentada para 25 ± 2°C e homogeneizada por uns 30 minutos. Em seguida foi transferida para outro vaso adequado de modo a ser incubada por umas 6 horas a 25 ± 2°C. Depois do tratamento a solução foi diluída uns 10% com solução a 100 mM de acetato de sódio e a 2,75 M de NaCI de modo que as concentrações finais foram 1/10 partes das acrescentadas e a concentração de proteína foi de 16,5 mg/ml. O pH da solução foi ajustado para 4,85 ± 0,05 com 0,1 M de HCI, caso necessário, produzindo um volume de 167 ml.

Antes disto uma coluna de volume de 17,5 ml e altura de 10 cm de resina hidrofóbica (hidrocarboneto C8) e uma matriz com grupamentos de silanol (SDR-HyperD® da Pall, Estados Unidos) e outra coluna de resinas catiônicas POROS-HS® (50 pm, Applied Biosystems, Estados Unidos) de volume de 8,0 ml foram condicionadas. As duas colunas foram conectadas em série de tal modo que a primeira (SDR-HyperD®) alimentou a segunda (POROS-HS®) e estas foram condicionadas por escoamento através de uma solução de equilibração compreendendo 10 mM de acetato de sódio, 0,275 M de NaCI em um pH de 4,85 ± 0,05 em um fluxo equivalente a 6 CV/h e 13 CV/h para a primeira e a segunda colunas respectivamente. A solução de IgG (167 mi) preparada previamente foi injetada dentro da primeira coluna SDR-HyperD® e o efluente da última foi alimentado para a segunda coluna POROS-HS®. Os valores de carga calculados para cada coluna foram: 1) 167 ml/17,5 ml = 9,5 CV para a coluna SDR-HyperD®; 2) 167 ml/8,0 ml = 21 CV para a coluna POROS-HS®. O fluxo de injeção do início ao fim do processo foi de 6 e 13 CV/h para a primeira e a segunda colunas respectivamente. Ao final da carga foi realizada pós-lavagem com uns 2 CV de solução equilibrada, coletando todo o efluente das colunas em um pool.

Os resultados para distribuição molecular (HPLC) e proteína (por O.D. a 280 nm) para cada etapa estão resumidos na Tabela 18.

Tabela 18 Os resultados acima mostram que o processo de adsorção de polímero pode ser perfeitamente incorporado e realizado simultaneamente com outras etapas do processo, em consequência do que ojempo total é______ reduzido, junto com o consumo de reagentes em condicionamento anterior e lavaaem subseauente.

Exemplo 15 A capacidade de retenção de polímeros de diferentes resinas catiônicas disponíveis comercialmente foi testadas para obter a melhor separação possível com respeito a monômeros / dímeros de IgG. De modo a fazer isto foram comparadas matrizes de resinas de diferentes origens, especialmente acrílica (Toyopearl®) contra agarose (Sepharose®). As resinas foram comprimidas em colunas de 1,75 cm2 de seção cruzada com uma altura comprimida de 100 mm (XK16® da GE-Healthcare) com as resinas GigaCap Toyopearl-S 650® e SP-Sepharose XL® cada. O material de partida foi uma mistura de diferentes lotes de solução de IgG pasteurizada tratada como no Exemplo 3, à qual NaCI foi a-crescentado até 0,275 M e 0,20 M, ajustando o pH para 4,85 ± 0,05 com 0,1 M de HCI caso necessário. As soluções tiveram uma concentração de proteína de umas 22 AU e até 50 CV foram injetados em um fluxo de uns 15 CV/h dentro de colunas as quais tinham sido preparadas e condicionadas com as mesmas concentrações de NaCI e pH que a solução de IgG em teste.

Os resultados de recuperação de polímero obtidos para diferentes volumes de coluna usados em comparação com o inicial são mostrados na Tabela 19.

Tabela 19 A recuperação de proteína total variou de 98% a 100% para resina SP-Sepharose XL, e de 90 a 100% para GigaCap-S 650M (uns 98% a 10 CVe 0,2 M de NaCI).

Os resultados acima mostram que resinas catiônicas acrílicas (do tipo GigaCap-S® 650M) como POROS-HS® (poliestireno catiônico) são capazes de reter seletivamente o polímero formado por pasteurização de IgG com a capacidade de reduzir o polímero presente para 85% (15% de recuperação) para uma carga de proteína de 158 mg/ml de gel e uma recuperação de proteína total de 98%. Obviamente, o resultado obtido pode ser o-timizado em relação ao pH (reduzindo este), aumentando a capacidade de carga para obter por exemplo uns 25 CV (396 mg de proteína/ml de gel).

Descobriu-se que as resinas de matrizes não sintéticas do tipo agarose (Sepharose XL) não têm capacidade de resolução suficiente para separar polímeros de monômeros / dímeros de IgG sob as condições explícitas para adsorção seletiva do precedente no efluente de carga.

Do mesmo modo será visto que as condições mais apropriadas de pH e concentração de NaCI são específicas para o tipo de resina de per-fusão sintética usada. Deste modo para uma resina acrílica do tipo GigaCap-S® 650M em pH 4,85 não mais de 0,2 M de NaCI são necessários, ao passo que 0,3 M de NaCI seriam necessários para resina POROS-HS® 50 pm. É evidente que uma pessoa versada na técnica pode descobrir a relação mais apropriada entre pH e concentração de NaCI para cada tipo de resina de perfusão sintética.

Exemplo 16 A escalabilidade do processo nas etapas até o produto final formulado e concentrado como IGIV com 10% de proteína foi em seguida verificada, examinando as características da composição do produto.

Um recipiente de plasma de mais de 1000 litros foi fracionada com etanol de modo a obter Fr-ll+lll e a purificação foi continuada até ser obtida uma solução em volume pasteurizada conforme descrito no Exemplo 3. 6,34 kg da solução pasteurizada acima (equivalente a uns 26,2 litros de plasma de partida), foram tomados depois diluição com água para injeção até uma densidade ótica de 27,98 AU (280 nm) e uma condutividade de 0,26 mS/cm, verificando que seu pH foi 4,65. Ulns 0,70 kg de solução concentrada (x 10 vezes) de 3% de tri-n-butil fosfato e 10% Triton X-100 foram acrescentados durante uns 5 a 10 min com vigorosa agitação. O pH foi ajustado para 4,79 pela adição de 0,1 M de NaOH. 7,04 kg de solução foram obtidos e foram incubados em temperatura ambiente (18 a 25°C) por ate 6 horas. O teor de tri-n-butil fosfato foi determinado por cromatografia gasosa como sendo de 0,28% (2800 ppm).

Em seguida solução a 1,5 M de NaCI contendo 10 mM de acetato de sódio em pH 4,85 foi acrescentado para atingir uma concentração final de NaCI de 0,275 Μ. O pH resultante foi de 4,81. Em seguida 6930,9 g da solução foram obtidos e injetados dentro de uma coluna de 140 mm de diâmetro contendo 770 ml de resinas SDR-HyperD® (da Rali), a altura da resina sendo de 50 mm. Foi realizada injeção em temperatura ambiente e em um fluxo equivalente de 6,1 CV/hora, de tal modo que toda a solução foi carregada em menos de 2 horas. A proporção de carga total resultante foi de 9 CV (6,93 kg/0,770 L = 9,0 CV). Em seguida foi realizada uma pós-lavagem usando 3 CV de solução a 0,275 M de NaCI e a 10 mM de acetato de sódio em pH 4,85. Foram obtidos 6,93 kg de efluente da coluna recuperado durante injeção da solução do produto, o phl sendo de 4,82 e a condutividade de 16,75 mS/cm. O teor de tri-n-butil fosfato foi <5 ppm determinado analitica-mente por cromatografia gasosa. 5,772 kg do efluente acima foram tomados e injetados dentro de uma coluna de 222 ml de resinas POROS HS® (50 pm), o diâmetro de coluna sendo de 50 mm e a altura do leito de 113 mm. A solução foi injetada dentro da coluna em temperatura ambiente com um fluxo de cerca de uns 10 CV/hora de modo que o processo durou umas 2,5 horas. Todo o efluente das colunas obtido durante a carga do produto foi coletado e combinado com 1 CV de pós-lavagem com solução a 0,275 M de NaCI, a 10 mM de acetato de sódio e 17% de sorbitol (em peso / peso) em pH 4,85. 5,776 kg do pool de efluente da coluna recuperado durante injeção da solução de produto fo- ram obtidos, a densidade ótica sendo de 18,508 AU (280 nm), o pH sendo de 4,84 e a condutividade sendo de 16,95 mS/cm. O recipiente de efluente acima foi clarificado por filtração através de 0,1 pm e foi em seguida nanofiltrado em série com um gradiente de poro de 35 nm (Planova® 35N) + 20 nm (Planova® 20N). Quando a nanofiltração do produto estava completa, este foi pós-lavado com um volume equivalente a 5% do volume recuperado da mesma solução pós-lavagem usada na coluna POROS HS®, o tempo total do processo sendo de umas 18 horas. A quantidade de nanofiltrado obtida foi de 6,797 kg, o pH foi de 4,83, a turva-ção foi de 2,71 NTU e a condutividade foi de 17,1 nS/cm. A solução nanofiltrada foi ultrafiltrada através de uma membrana de polietersulfona tendo um corte molecular nominal de 100 kDa. O produto foi primeiro concentrado 3,3 vezes, a partir de uma densidade ótica de 14,4 AU (280 nm) até cerca de 50 ± 10 AU (280 nm), e em seguida foi diafiltrado em volume constante com cerca de 7 volumes de solução de diálise compreendendo 2 mM de ácido acético ajustado para pH 4,2 ± 0,2 com NaOH. Depois de verificar a condutividade (220 ps/cm) foi acrescentada uma quantidade suficiente de solução concentrada a 33% de sorbitol para trazer a concentração final de sorbitol para cerca de 5% (em peso / volume). Finalmente foi concentrada umas 3,5 vezes para obter uma densidade ótica de 140 ± 5 AU (280 nm), equivalente a uns 10% de proteína, e o pH foi ajustado para 5,25 ± 0,25 com 0,1 M de NaOH. Foram obtidos 552,1 g de solução em um pH final de 5,26, com uma turvação de 5,45 NTU e uma condutividade de 1,18 ms/cm. Esta solução foi filtrada através de 0,22 pm e dosada dentro de frascos, com o pH sendo de 5,34, a osmolalidade de 330 mOsm/kg, a turvação de 4,62 NTU e a condutividade de 1,34 mS/cm. O tempo do processo para esta etapa foi de 9,5 horas.

Os frascos medidos foram mantidos a 5 ± 3°C e 25 ± 2°C por mais de 15 dias sem apresentarem quaisquer sinais de gelificação, ou turvação ou sedimentação, alterações na cor ou o aparecimento de fibras ou partículas visíveis. A Tabela 20 mostra os resultados para polímeros, dímero, mo- nômero e frações nas diferentes etapas do processo de aquisição total.

Tabela 20 ______________________________________________________ A partir dos resultados acima é evidente que o controle do teor de dímero (<5%), o qual é obtido conforme ilustrado previamente nos exemplos anteriores através de ajuste do pH e da concentração salina, no produto antes da coluna POROS (no efluente Pasteurizado e de SDR) torna possível excelente adsorção do polímero presente (<0.06%), minimizando as perdas de dímero de IgG (2,6% no efluente de SDR e 1,9% no efluente POROS).

Conclui-se que o processo global para a obtenção de IGIV, incorporando a etapa de eliminação dos agregados / polímeros com o tratamento com SD e sua separação, junto com nanofiltração, diafiltração e formulação final é totalmente viável e escalonável, sendo obtidos excelentes valores para o produto final em relação ao teor de polímero (<0,06%) e frações (0,1%).

Exemplo 17 O produto obtido (10% de IGIV) no Exemplo 16, introduzido dentro de frascos de vidro de 20 ml a 10 ml por frasco, selados hermeticamente com uma rolha de borracha de butila de 20 mm 0 foram armazenados em temperatura ambiente (25±5°C), protegidos contra a luz, por 12 meses. Depois de um tempo o qual foi estabelecido como sendo de cerca de 1 ano os frascos foram inspecionados visualmente (aspecto físico) e os parâmetros mais representativos de estabilidade foram determinados analiticamente. Os valores obtidos no início (t = 0) e no fim do armazenamento (t = 1 ano) são mostrados na Tabeja 21. Do mesmo jriodo, os valores normais obtidos errL uma escala industrial usando o estado da arte (Patente Espanhola No. ES-9nninnim^ tamhém são incluídos.

Tabela 21 n.e.: não estabelecido; Eur.Ph.: Farmacopéia Européia No que diz respeito ao aspecto visual, foi visto que não houve deterioração nas amostras tanto em consequência da presença de partículas (fibras, coágulos ou sedimentos), ou turvação (transparente) ou coloração (incolor). Conclui-se que o produto obtido foi armazenado essencialmente inalterado (polímeros, enzimas tais como PKA, ACA, etc.) por 1 ano em uma temperatura ambiente de 25 ± 5°C, o produto em conformidade com os valores determinados na Farmacopéia Européia (Eur. Ph.).

Exemplo 18 Um lote foi processado em uma medida de escala de preparação equivalente ao Exemplo 16 com somente uma alteração na ordem da sequência das etapas de inativação viral, de tal modo que foi realizado tratamento com SD sobre o material diafiltrado inicial e em seguida estes rea-gentes foram adsorvidos com resinas SDR-HyperD®, e em seguida o resto _das_etapas_do -processo_necessárias_para_obter_o_produto_de_acordo .com_a___ invenção, isto é, pasteurização na presença de sorbitol e a captura de agre- naHnç mr»lf»n ilar<=»« nsanHn Hf» rw=>rfi i<;ãn POROS HS fnram re*a\Í7a- das do mesmo modo que no Exemplo 16. Finalmente, o produto obtido, estabilizado com 5% de sorbitol, foi aumentado até a concentração de 10% de proteína de IGIV, esterilizado por filtração e introduzido dentro de frascos de vidro de 20 ml. Os frascos selados hermeticamente com uma rolha de borracha de butila foram armazenados em uma câmara fria em 5 ± 3°C por cerca de 1 ano e em seguida foram determinados os parâmetros mais significativos para estabilidade, inclusive inspeção visual,. Os resultados obtidos no início (t = 0) e depois do armazenamento (t = cerca de 1 ano), junto com as especificações da Farmacopéia Européia são mostrados na Tabela 22. Tabela 22 n.e.: não estabelecido; Eur.Ph.: Farmacopéia Européia No que diz respeito ao aspecto físico visual, foi visto que não houve deterioração nas amostras através da presença de partículas (fibras, coágulos ou sedimentos), ou turvação (transparente) ou coloração (incolor). O produto obtido foi armazenado essencialmente inalterado (por exemplo, polímeros / fragmentos e enzimas proteolíticas tais como PKA) por mais de -cerca de 1 ano em uma temperatura de 5 ± 3°C, o produto-em conformidade com os valores especificados na Farmacopéia Européia (Eur. Ph., European arma^nnnciia'!

Claims (32)

1. Processo para a obtenção de uma composição de IgG a partir de uma solução de IgG purificada parcialmente a partir de plasma humano compreendendo as etapas de: a) diafiltração da solução de IgG purificada parcialmente; b) estabilização da solução obtida na etapa a); c) tratamento térmico da solução obtida na etapa b); d) seletivamente adsorção de agregados e/ou polímeros de alto peso molecular da solução tratada com calor na etapa c) através de cro-matografia catiônica; e e) diafiltração e formulação da solução obtida na etapa d).

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido processo é realizado iniciando com uma solução de IgG purificada de plasma humano tendo um teor de IgG de mais de 95% em relação às proteínas totais.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o referido processo é realizado iniciando com uma solução de IgG purificada de plasma humano tendo um teor de IgG de mais de 97% em relação às proteínas totais.

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a etapa de diafiltração (a) é realizada até a concentração de etanol ser menos de 0,5% (em peso / volume), preferencialmente menos de 0,1% (em peso / volume).

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a etapa de diafiltração (a) é realizada até a concentração de reagentes de precipitação não desnaturados tais como PEG, ácido octanóico, detergentes não iônicos compatíveis ou qualquer mistura dos mesmos ser menos de 2% (em peso / volume) e em qualquer caso não vai dar origem a mais de 3% de polímero depois da etapa c).

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a etapa de diafiltração (a) é realizada até a força iônica da solução de partida de IgG ser menos de 1 mS/cm.

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o valor do pH ao final da etapa (a) está dentro da faixa de 4,2 a 6,0.

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a etapa de diafiltração (a) é realizada com água para injeção ou com uma solução tampão de baixa força iônica.

9. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que uma solução tampão de baixa força iônica é uma solução a < 5 mM de ácido acético ou acetato de sódio, tendo um pH entre 4,0 e 5,0.

10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a etapa de diafiltração (a) é realizada em modo de fluxo tangencial através de membranas tendo um corte molecular entre 10 kDa e 100 kDa.

11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que na etapa de diafiltração (a) as proteínas são concentradas até uma concentração não superior a alguns 5% (em peso / volume), preferencialmente entre 2% e 4% (em peso / volume).

12. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que sorbitol é usado como um agente esta-bilizante na etapa de estabilização (b).

13. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a concentração de sorbitol usada na etapa de estabilização (b) é menos de 50% (peso / peso), e preferencialmente é entre 30% e 35% por peso.

14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o pH é ajustado para entre 4,6 e 5,2 na etapa de estabilização (b).

15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o tratamento térmico (etapa c) é realizado em uma temperatura entre 55°C e 63°C, durante um tempo de entre 1 e 24 horas.

16. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o tratamento térmico (etapa c) é realizado em uma temperatura de 60 ± 1°C, por 10 a 11 horas.

17. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que uma etapa de adsorção seletiva é realizada em uma coluna de forte cromatografia de permuta catiônica.

18. Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a resina de forte permuta catiônica compreende no mínimo um dos grupamentos de sulfona catiônica tais como grupamentos sulfonila, sulfônicos, ou sulfopropila ligados de modo covalente a uma matriz de perfu-são sintética insolúvel compreendendo polimetacrilato ou poliestireno cuja medida de partícula varia entre 20 e 100 pm.

19. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que na etapa de adsorção selecionada o fluxo de injeção é de 5 a 30 volumes de coluna / hora.

20. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que cloreto de sódio é acrescentado à solução tratada com calor na etapa c) até uma concentração final de entre 0,2 e 0,5 M (mol/litro).

21. Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que depois da adição de cloreto de sódio o pH da solução na etapa c) é ajustado para entre 4,2 e 5,5.

22. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que na etapa de adsorção seletiva entre 1 e 10 litros de resina são usados para cada kg de IgG (a seco) necessitando de purificação, o qual é equivalente a uma carga de entre 100 e 1000 mg de IgG/ml de resina.

23. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que na etapa de adsorção seletiva é realizada elutriação usando um gradiente de salina decrescente.

24. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que o processo compreende no mínimo uma etapa de tratamento adicional de inativação / eliminação viral.

25. Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que as etapas de tratamentos adicionais de inativação / eliminação viral são realizadas antes ou depois da etapa de tratamento térmico.

26. Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a etapa de tratamento adicional de inativação / eliminação viral é realizada por incubação em pH ácido na presença ou ausência de pepsina, ou por tratamento com detergentes não iônicos, solventes iônicos ou por nanofiltração.

27. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de que a etapa de diafiltração (e) é realizada com água para injeção ou com uma solução tampão de baixa força iônica.

28. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que na etapa de diafiltração (e) são acrescentados estabilizantes para a formulação final.

29. Processo de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o pH da formulação final é entre 4,6 e 5,8.

30. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado pelo fato de que a etapa de diafiltração (e) é realizada no modo de fluxo tangencial através de membranas tendo um corte molecular entre 10 kDa e 100 kDa.

31. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que na etapa de diafiltração (e) as proteínas são concentradas até um valor de entre 5% e 22% (em peso / volume).

32. Invenção, em quaisquer formas de suas concretizações ou em qualquer categoria aplicável de reivindicação, por exemplo, de produto ou de processo ou uso englobadas pela matéria inicialmente descrita, revelada ou ilustrada no pedido de patente.