BR0318114B1 - Vacinação ou imunização utilizando um regime de iniciação-reforço - Google Patents

Vacinação ou imunização utilizando um regime de iniciação-reforço Download PDF

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Description

Estas referências dos pedidos de patentes que correspondem ao Pedido de Patente U.S. Número de Série que será atribuído (número refe- rência do agente 454313-3154.4) que é depositado concorrentemente com o mesmo. O pedido de patente anterior e todos os documentos citados aqui ou durante sua execução ("documentos de pedidos de patentes citados") e to- dos os documentos citados ou referidos nos documentos de pedidos de pa- tentes citados e todos os documentos citados ou referidos aqui ("documen- tos citados aqui") e todos os documentos citados e referidos aqui nos docu- mentos citados, junto com quaisquer instruções do fabricante, descrições, especificações de produtos e folhetos de produtos para quaisquer produtos mencionados aqui ou em qualquer documento incorporado como referência aqui, são incorporados aqui através da mesma como referência e podem ser empregados na prática da invenção.
CAMPO DA INVENçãO A presente invenção refere-se a métodos de vacinação ou de imunização de bovinos, vantajosamente tais métodos que envolvem um re- gime de iniciação-reforço, assim como vacinas ou composições imunológi- cas ou imunogênicas, tais com as vacinas ou composições imunogênicas ou imunoiógicas de DNA, que podem ser utilizadas em tais métodos.
ANTECEDENTES
As moléculas de ácido desoxirribonucléico (DNA) foram utiliza- das para a vacinação (Wolf e outros Science 1990. 247.1465-1468). Este tipo de vacinação induz imunidade celular e humoral após a transfecção in vivo de células do indivíduo que será vacinado com moléculas de DNA ou RNA que codificam proteínas imunologicamente ativas.
Uma vacina ou uma composição imunogênica ou imunológica de DNA é composta de pelo menos um plasmídeo que pode ser expresso peía maquinária celular do indivíduo que será vacinado ou inoculado e de um veí- culo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A seqüência de nucleotí- deos deste plasmídeo codifica, inter alia, um ou mais imunógenos, tais como proteínas ou glicoproteínas capazes de induzir, no indivíduo que será vaci- nado ou inoculado, uma resposta imunológica celular (mobilização dos linfó- citos T) e uma resposta imunológica humoral (estímulo da produção de anti- corpos direcionados especificamente contra o imunógeno) (Davis H.L. Cur- rent Opinion Biotech. 1997.8.635-640).
Um imunógeno ou os imunógenos derivados de um agente pa- togênico podem não ser suficientemente eficientes para a indução de uma resposta imunológica ótima ou protetora no animal que será vacinado ou inoculado. Portanto, pode ser algumas vezes útil aumentar a resposta imu- nológica. Várias vias de administração para as vacinas de DNA foram propostas (intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutânea, intrader- mal, por mucosa e similares). Vários meios de administração também foram propostos, por exemplo, partículas de ouro revestidas com DNA e projetadas de forma que penetrem nas células da pele do indivíduo que será vacinado (Tang e outros Nature 1992. 356. 152-154) e injetores líquidos a jato que tornam possível transfectar tanto células da pele quanto células de tecidos subjacentes (Furth e outros Analytical Bioch. 1992.205.365-368).
Compostos químicos foram utilizados para a transfecção in vitro do DNA: A/ - iipídeos catiônicos, BI - os polímeros, tais como, por exemplo, SuperFect® (molécu- las de dendrímeros ativadas, produzidas pela Qiagen; Xu e outros Mol. Ge- net. Metab. 1998.64.193-197) e Cl - os agentes bioquímicos, tais como, por exemplo, toxinas, por exemplo, toxinas da cólera.
Os Iipídeos catiônicos podem ser divididos em quatro subgrupos. 1) Os Iipídeos catiônicos que contêm sais de amônio quaterná- rio, tais como, por exemplo, DOTMA (dioleoiloxipropiltrimetilamônio, produzi- do pela Gibco sob o nome Lipofectine), DOTAP (trimetil-2,3-(octadec-9- eneoilóxi)-1-propanoamônio; Gregoriadis e outros FEBS Letters 1997. 402. 107-110), DMRIE (N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis (tetradecilóxi)-l- propanoamônio; WO-A-9634109), DLRIE (N-{2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3- bis (dodecilóxi)-l -propanoamônio; Felgner e outros Ann. N Y Acad. Sei. 1995.772.126-139).
Estes lipídeos catiônicos que contêm sais de amônio quaternário podem ser combinados ou de outra foram com um lipídeo neutro adicional, tal como DOPC (dioleoil-fosfatidileolina) ou DOPE (dioleilfosfatidiletanolami- na) (J.P. Behr, Bioconjugate Chemistry 1994.5.382-389). 2) As lipoaminas, tais como, por exemplo, DOGS (dioctadecila- midoglicilespermina, produzida pela Promega sob o nome Transfectam; Ab- dallah e outros Biol. Cell. 1995. 85. 1-7), DC-Chol (dimetilaminoetano- carbamoil-colesterol; Gao e Huang, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. 179. 280-285), BGSC (bis-guanidina-espermidina-colesterol), BGTC (bis- guanidina-trencolesterol) (Vigneron e outros Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1996. 93. 9682-9686). 3) Os lipídeos catiônicos que contêm sais de amônio quaternário e lipoaminas, tais como, por exemplo, DOSPA (pentacloridrato de N,N- dimetil-N-(2-(esperminacarboxamido)etil)-2,3-bis-(dioleoilóxi)-1 -propanoimí- dio), comercializado pela Gibco sob o nome LipofectAmina®; Hawley-Nelson e outros Focus 1993.15. 73-79), GAP-DLRIE (N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil- 2,3-bis (dodecilóxi)-l -propanoamônio; Wheeler e outros Proc. Natl. Acad.
Sei. USA 1996. 93. 11454-11459; Norman e outros Vaccine 1997. 15. 801 - 803). E, 4) Os lipídeos que contêm sais de amidina, tais, como, por e- xemplo, ADPDE, ADODE (Ruysschaert e outros Biochem. Biophys. Res.
Commun. 1994.203.1622-1628).
Alguns destes compostos foram utilizados na formulação de va- cinas de DNA com mais do que resultados atenuados. O conhecimento no campo da transfecção in vitro é garantir a não capacidade de transposição para a vacinação com DNA, na qual o objetivo é garantir uma resposta imu- nológica vantajosamente ótima e protetora. Os efeitos negativos da indução de uma resposta imunológica, por exemplo, uma resposta imunológica prote- tora, foram observados até mesmo com compostos conhecidos por promo- verem transfecção in vitro. E, alguns compostos químicos são tóxicos em doses altas para as células transfectadas.
No trabalho de Etchart (Etchart e outros J. Gen. Virol. 1997. 78. 1577-1580), o uso de DOTAP não teve um efeito adjuvante durante a admi- nistração da vacina de DNA pela via intranasal, enquanto que teve um efeito adjuvante através da via oral. O DOTAP também foi utilizado nas vacinas de DNA que codificam a hemaglutinina (HA) do vírus influenza no modelo de camundongos que receberam administração através da via intranasal (Ban e outros Vaccine 1997.15.811-813), mas a adição de DOTAP inibiu a respos- ta imunológica. O uso de DC-Chol ou de DOTAP/DOPE nas vacinas de DNA que codificam a proteína de superfície do vírus da hepatite B (S) em camun- dongos que receberam administração através da via intramuscular tornou possível aumentar a resposta de anticorpos, enquanto que o uso de Lipofec- tina (ou DOTMA) não aumentou esta resposta (Gregoriadis e outros FEBS
Letters 1997. 402. 107-110). O DC-Chol/DOPE também foi utilizado em va- cinas de DNA contra o vírus da imunodeficiência humana (HIV, proteína Env) em camundongos, com administração através da via intramuscular in- duzindo uma resposta imunológica mais eficiente, enquanto que a adminis- tração através da via subcutânea ou intradermal não aumentou a mesma (Ishii e outros AIDS Res. Hum. Retro. 1997. 13. 1421-1428). Claramente, muitos fatores, incluindo a via de administração, atuam no fato de um com- posto ser eficiente em aumentar a resposta imunológica. A adição de certas citocinas, tais como as ínterleucinas ou os interferons, podem tornar possível aumentar a resposta imunológica inducida pelas vacinas de DNA. Cada citocina ativa uma reação que é específica à citocina e orienta a resposta imunológica para um grau maior ou menor em direção a uma resposta celular ou em direção a uma resposta humoral (Pas- quini e outros Immunol. Cell. Biol. 1997. 75. 397-401; Kim e outros J. Interfe- ron Citokine Res. 1999. 19. 77-84). Os efeitos adjuvantes de uma citocina obtida de uma certa espécie não são necessariamente os mesmos se o con- texto imunológico variar; por exemplo, se uma citocina de uma espécie for administrada a uma outra espécie, por exemplo, em um sistema imunológico heterólogo. A adição da citocina pode também não ter efeito adjuvante ou pode até mesmo resultar em uma inversão do efeito buscado, o que significa dizer uma redução ou uma inibição da resposta imunológica. Assim, uma vacina de DNA que codifica uma cadeia única de uma imunoglobulina fundi- da com o GM-CSF não aumenta a resposta imunológica, enquanto que a administração direta desta proteína de fusão a camundongos é eficiente, da mesma maneira que a administração de uma proteína de fusão que consiste em Fv e da citocina IL-1 beta ou a administração de uma vacina de DNA que compreende a última proteína de fusão {Hakim e outros J. Immunol. 1996. 157.5503-5511). O uso de plasmídeos que co-expressam a citocina IL-2 e a proteína do envelope do vírus da hepatite B em uma conformação fundida ou não fundida resulta em um aumento nas respostas imunológicas humo- rais e celulares (Chow e outros J. Virol. 1997. 71.169-78). Entretanto, o uso de um plasmídeo bicistrônico que codifica a glicoproteína gp120 do vírus humano da imunodeficiência adquirida (HIV-1) e a citocina IL-2 induziram uma resposta imunológica específica anti-gp120 inferior à obtida através do uso de um plasmídeo monocistrônico que codifica somente a gp120 (Barou- ch e outros J. Immunol 1998.161.1875-1882). A co-injeção, em camundon- gos, de dois vetores de expressão, um codificando a glicoproteína G do vírus da raiva, a outra o GM-CSF murino estimula a atividade dos linfócitos B e T, enquanto que a co-injeção com um plasmídeo que codifica o interferon gama (no lugar do GM-CSF murino) resulta em um decréscimo na resposta imuno- lógica (Xiang e outros Immunity 1995. 2. 129-135). Assim, o fato de uma ci- tocina aumentar uma resposta imunológica depende de vários fatores.
Certas modificações nos antígenos, tais como deleções de parte da seqüência de nucleotídeos que codifica o antígeno, inserções de um fragmento de DNA na seqüência de nucleotídeos que codifica o antígeno ou em regiões não traduzidas a montante ou a jusante, também podem aumen- tar a eficiência das vacinas de DNA, por exemplo, aumentando o nível de expressão do antígeno ou a sua apresentação.
Entretanto, na prática, as manipulações nas seqüências de nu- cleotídeos que codificam o antígeno podem realizar uma redução ou a perda da atividade imunológica inicial. Assim, a deleção do domínio transmembra- na do gene que codifica o antígeno G do vírus da raiva reduzia o nível de proteção induzido no modelo de camundongo após a administração através da via intramuscular de uma vacina de DNA que codifica este antígeno modi- ficado (Xiang e outros Virol. 1995. 209. 569). A deleção do domínio trans- membrana do gene que codifica a glicoproteína gD do herpesvírus bovino (BHV) não tornou possível aumentar a resposta de anticorpos e induziu so- mente uma proteção parcial nos bovinos vacinados através da via intramus- cular (van Drunen Little-van den Hurk e outros J. Gen. Virol. 1998. 79. 831- 839). As respostas imunológicas humorais e celulares e a proteção conferida são idênticas nos porquinhos-da-índia desafiados após terem sido imuniza- dos com o auxílio de uma vacina de DNA que codifica a glicoproteína GP do vírus Ebola ou de uma vacina de DNA que codifica esta glicoproteína GP, mas em uma forma secretada (Xu e outros Nature Medicine 1998.4.37-42). A inserção da seqüência sinal do ativador de plasminogênio de tecido humano (tPA) no gene que codifica o antígeno Pf332 da malária não tornou possível aumentar a resposta de anticorpos em camundongos vaci- nados através da via intramuscular (Haddad e outros FEMS 1997.18.193- 202). A adição, em fase, de uma seqüência tPA ao gene que codifica o antí- geno VP7 do rotavírus murino também não tornou possível aumentar a res- posta de anticorpos em camundongos vacinados através da via intradermal, enquanto a proteína de fusão consistindo no antígeno VP4 e de tPA permitiu este aumento, mas sem induzir uma proteção eficiente (Choi e outros Viro- logy 1998.250.230-240).
Consequentemente, o fato de uma modificação em uma se- qüência de nucleotídeos ser útil depende de muitos fatores e as modifica- ções realizadas na seqüência de nucleotídeos de um antígeno não podem, em geral, ser diretamente transpostas a um outro antígeno, porque os antí- genos nem sempre possuem os mesmos arranjos estruturais.
Além disso, seria desejável melhorar ou aumentar os métodos de vacinação ou de imunização, por exemplo, a vacinação ou a imunização de bovinos; e, seria desejável fornecer métodos de vacinação ou de imuni- zação envolvendo um regime de iniciação-reforço, assim como vacinas ou composições imunológicas ou imunogênicas, tais como vacinas ou composi- ções imunogênicas ou imunológicas de DNA, que podem ser utilizadas em tais métodos.
OBJETIVOS E SUMÁRIO DA INVENçãO
Foi descoberto que a vacinação ou a imunização com DNA de animais que podem receber vacinação ou imunização com DNA, por exem- plo, mamíferos, aves, répteis, vantajosamente bovinos (por exemplo, vacas, bezerros, touros, gado, búfalo "beefalo" e similares), pode ser melhorada através da um regime de vacinação ou de imunização; por exemplo, a admi- nistração de uma ou mais vacinas ou composições imunológicas ou imuno- gênicas de DNA com um "iniciador" e depois disso a administração de uma ou mais subunidades (por exemplo, preparação(ões) de antígeno(s), de i- munógeno(s) ou de epítopo(s) - "subunidade(s)1' do agente patogênico) e/ou da vacina ou composições imunológicas ou imunogênicas do agente pato- gênico inativado e/ou do agente patogênico atenuado e/ou de um vetor re- combinante ou modificado, por exemplo, vírus, bactérias ou leveduras, da vacina ou composições imunogênicas ou imunológicas (que contêm o vetor de expressão in vivo, por exemplo, um vírus, uma bactéria, uma levedura modificada ou recombinante ou outro vetor de expressão). O regime de iniciação-reforço de acordo com a invenção pode ser utilizado em animais de qualquer idade, vantajosamente animais jovens (por exemplo, animais que possuem anticorpos maternos detectáveis e/ou estão mamando ou sendo amamentados ou amamentados no peito, tal co- mo um bezerro jovem - um bezerro que possui anticorpos maternos detec- táveis e/ou está mamando ou sendo amamentado ou amamentado no peito), animais pré-adultos (animais que são mais velhos que um animal jovem, mas ainda não atingiu a maturidade ou a fase adulta ou uma idade para cru- zar ou se reproduzir), animais adultos (por exemplo, animais que estão em uma idade de cruzar ou de se reproduzir ou estão além de tal período na vida) e é vantajoso empregar o regime de iniciação-reforço em fêmeas pre- nhas ou em fêmeas antes de darem à luz ou da inseminação. O regime de iniciação-reforço é especialmente vantajoso para a prática em um animal jovem, por exemplo, um bovino ou um bezerro jovem, uma vez que permite a vacinação ou a imunização em uma idade precoce, por exemplo, a primeira administração no regime de iniciação-reforço ou a iniciação pode ser feita a um animal jovem que pode estar com uma idade em que o animal jovem possui anticorpos maternos. Uma outra vantagem deste regime é que pode fornecer um grau de segurança para as fêmeas prenhas, por exemplo, vacas, presentes na mesma localização ou em pro- ximidade íntima à do jovem ou de um com outro, por exemplo, na mesma fazenda ou que compartilham uma área comum de pasto.
Assim, a invenção fornece um método de imunização ou de va- cinação de iniciação-reforço vantajosamente praticado em bovinos contra um ou mais agentes patogênicos de bovinos e o método pode ser praticado em um animal jovem, tal como um bezerro jovem, por exemplo, no qual a iniciação é feita em um momento que o animal jovem possui anticorpos ma- ternos contra o agente patogênico bovino, com o reforço vantajosamente em um momento quando os anticorpos maternos podem estar minguando ou diminuindo ou normalmente ausentes, tal como durante um período de tem- po após a alimentação ao peito. O agente patogênico bovino contra o qual o regime de iniciação- reforço pode ser empregado inclui: o vírus sincicial respiratório bovino (BRSV), o vírus parainfluenza do tipo 3 bovino (bPI-3), o herpesvírus bovino do tipo 1 (BHV-1) (responsável pela rinotraqueite bovina infecciosa (IBR)), vírus de doença na mucosa e pestivírus do tipo 1 ou do tipo 2 bovino (vírus da diarréia viral bovina ou BVDV-1 e BVDV-2)). Vantajosamente, o regime de iniciação-reforço da invenção é praticado contra o BRSV. A invenção compreende ainda as composições e os kits que in- cluem uma ou mais vacinas ou composições imunogênicas ou imunológicas de DNA que podem ser utilizadas no regime de iniciação-reforço da inven- ção e que tornam possível a obtenção de uma proteção imunológica maior ou vantajosamente eficiente e/ou protetora no gado, que compreende pelo menos uma valência selecionada do grupo que consiste nos BRSV, bPI-3, BHV-1 e BVDV (que compreendem pelo menos um plasmídeo que contém e expressa uma molécula de ácido nucléico que codifica pelo menos um imu- nógeno, um antígeno ou um epítopo de BRSV, bPI-3, BHV-1 ou BVDV).
Conseqüentemente, a invenção também envolve kits para a rea- lização de um regime de iniciação-reforço que compreende ou que consiste essencialmente em uma vacina ou composição imunológica ou imunogênica de iniciação e uma vacina ou composições imunológicas ou imunogênicas de reforço, em recipientes separados, opcionalmente com instruções para a mistura e/ou a administração. A invenção fornece um método de imunização ou de vacinação de iniciação-reforço de um bovino (por exemplo, vaca, touro, bezerro) contra pelo menos um agente patogênico bovino que compreende a administração ao bovino de uma vacina ou composição imunológica ou imunogênica de DNA de iniciação que compreende molécula(s) de ácido nucléico que codifi- ca(m) e expressa(m) in vivo um(ou mais) imunógeno(s), antígeno(s) ou epí- topo(s) proveniente(s) do agente patogênico e depois disso a administração de uma vacina ou composição imunogênica ou imunológica de reforço que apresenta ao sistema imunológico do bovino o mesmo imunógeno, antígeno ou epítopo. A vacina ou a composição imunogênica ou imunológica de refor- ço é vantajosamente diferente da vacina ou da composição imunogênica ou imunológica de DNA. Por exemplo, a vacina ou a composição imunogênica ou imunológica de reforço pode ser um agente patogênico inativado e/ou um agente patogênico atenuado e/ou uma subunidade (vantajosamente o antí- geno, o imunógeno e/ou o epítopo expresso pela vacina ou composição i- munogênica ou imunológica de DNA) e/ou um vetor recombinante ou modifi- cado, por exemplo, um vírus, uma vacina ou uma composição imunogênica ou imunológica. Um vetor recombinante ou modificado é vantajosamente um vetor de expressão in vivo, tal como uma bactéria, uma levedura, um vírus modificado, por exemplo, poxvírus, adenovírus, herpesvírus, compreenden- do molécula(s) de ácido nucléico que codifica(m) ou expressa(m) in vivo o(s) imunógeno(s), o(s) antígeno(s) ou o{s) epítopo(s) provenientes do agente patogênico expresso pela vacina ou composição imunogênica ou imunológi- ca de DNA. O reforço é vantajosamente realizado com uma vacina ou com- posição imunogênica ou imunológica ou com uma vacina ou composição imunogênica ou imunológica que compreende um vetor viral ativo recombi- nante, taí como um poxvírus recombinante, que compreende molécula(s) de ácido nucléico que codifica(m) e expressa(m) in vivo o(s) imunógeno{s), o(s) antígeno(s) ou o(s) epítopo(s) do agente patogênico expresso pela vacina ou a composição imunogênica ou imunológica de DNA. Assim, é vantajoso que o reforço compreenda o imunógeno, o antígeno ou o epítopo expresso pela vacina ou composição imunogênica ou imunológica de DNA ou expresse in vivo o mesmo imunógeno, antígeno ou epítopo expresso pela vacina ou composição imunogênica ou imunológica de DNA.
Os termos "composição imunogênica" e "composição imunológi- ca" e "composição imunogênica ou imunológica" cobrem qualquer composi- ção que ativa uma resposta imunológica contra o agente patogênico alvo; por exemplo, após a administração ou a injeção no bovino, ativa uma res- posta imunológica contra o agente patogênico alvo. Os termos "composição vacinai" e "vacina" e "composição de vacina" cobrem qualquer composição que induza uma resposta imunológica protetora contra o agente patogênico alvo ou que proteja de forma eficiente contra o agente patogênico; por e- xemplo, após a administração ou a injeção no bovino, ativa uma resposta imunológica protetora contra o agente patogênico alvo ou forneça proteção eficiente contra o agente patogênico. Além disso, embora o texto fale de "i- munógeno, antígeno ou epítopo", um imunógeno pode ser um antígeno ou um epítopo de um antígeno. O termo de "iniciação-reforço" se refere às administrações su- cessivas de dois tipos diferentes de vacina ou de composições imunogêni- cas ou imunológicas que possuem pelo menos um imunógeno, um antígeno ou um epítopo em comum. A administração de iniciação (iniciação) é a ad- ministração de um primeiro tipo de vacina ou de composição imunogênica ou imunológica e pode compreender uma, duas ou mais administrações. A ad- ministração de reforço é a administração de um segundo tipo de vacina ou de composição imunogênica ou imunológica e pode compreender uma, duas ou mais administrações e, por exemplo, pode compreender ou consistir es- senciaimente em administrações anuais.
Assim, a invenção compreende a administração a um bovino de uma composição de iniciação que compreende uma vacina ou uma compo- sição imunogênica ou imunológica de DNA contra um agente patogênico bovino que compreende pelo menos um plasmídeo que contém e expressa em uma célula hospedeira de bovino uma seqüência de nucleotídeos que codifica um imunógeno, um antígeno ou um epítopo do agente patogênico bovino e depois disso uma composição de reforço que compreende o agente patogênico bovino na forma de um agente patogênico inativado ou o agente patogênico bovino na forma de um agente patogênico atenuado ou o imunó- geno, o antígeno ou o epítopo expresso pela vacina ou composição imuno- gênica ou imunológica de DNA ou um vetor recombinante ou modificado, por exemplo, vírus, tal como um herpesvírus, adenovírus ou poxvírus recombi- nante ou modificado (vantajosamente poxvírus, tal como um vírus vaccinia, canaripox ou fowlpox) que contém e expressa em uma célula hospedeira de bovino uma seqüência de nucleotídeos que codifica o imunógeno, o antíge- no ou o epítopo do agente patogênico bovino expresso pela vacina ou com- posição imunogênica ou imunológica de DNA. O agente patogênico bovino pode ser BRSV, bPI-3, BHV-1 ou BVDV. A vacina ou composição imunogênica de DNA pode conter um lipídeo catiônico contendo um sal de amônio quaternário, da fórmula em que Ri é um radical alifático linear saturado ou insaturado que possui 12 até 18 átomos de carbono, R2 é um radical alifático que contém 2 ou 3 áto- mos de carbono e X é um grupo hidroxila ou amina. Vantajosamente, este composto é DMRIE (N-(2-hidroxietíl)-N,N-dimetil-2,3-bis (tetradecilóxi)-l- propanamônio). Este composto pode ser combinado com um lipídeo neutro, tal como, DOPE (dioleoil-fosfatidil-etanolamina). Quando o composto for DMRIE e o iipídeo neutro for DOPE e estes estiverem combinados, formam DMRiE-DOPE.
Alternativamente ou adicionalmente, a vacina ou a composição imunogênica de DNA pode conter o GM-CSF bovino ou um vetor de expres- são que contém e expressa em uma célula hospedeira de bovino uma se- qüência de nucleotídeos que codifica o GM-CSF bovino. O vetor de expres- são que contém e expressa o GM-CSF bovino pode ser um plasmídeo ou um vetor recombinante ou modificado tal como um vírus, uma bactéria, uma levedura recombinante ou modificada. O plasmídeo na vacina ou composi- ção imunogênica de DNA que expressa o imunógeno, o antígeno ou o epíto- po do agente patogênico bovino também pode expressar o GM-CSF bovino.
Ainda mais alternativamente ou adicionalmente, na vacina ou composição imunogênica de DNA, a seqüência de nucleotídeos que codifica o imunógeno, o antígeno ou o epítopo do agente patogênico bovino pode ter deletado uma parte que codifica um domínio transmembrana.
Ainda mais alternativamente ou adicionalmente, o plasmídeo na vacina ou composição imunogênica de DNA pode conter ainda e expressar em uma célula hospedeira de bovino uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência sinal tPA heteróloga tal como tPA humana e/ou um íntron estabilizador, tal como o íntron II do gene da beta-globina de coelhos.
Vantajosamente, o agente patogênico bovino é BRSV; por e- xemplo, o imunógeno pode ser BRSV F ou G ou N. Ainda mais vantajosa- mente, o imunógeno é BRSV F ou G, modificado através da substituição da seqüência sinal do BRSV F e/ou do G por uma seqüência sinal de tPA hu- mana e/ou através da deleção do domínio transmembrana e/ou da cauda citoplasmática. O código da proteína F também pode conter uma deleção de nucleotídeos a montante do domínio transmembrana e correspondente a 1 e até 92 aminoácidos.
Assim, a vacina ou composição imunogênica de DNA pode compreender um primeiro plasmídeo que contém e expressa em uma célula hospedeira de bovino uma seqüência de nucleotídeos que codifica BRSV F, modificada através da substituição da seqüência sinal do BRSV F por uma seqüência sinal de tPA humana e da deieção do domínio transmembrana e da parte C-terminal contígua (cauda citoplasmática) opcionalmente também pela deieção da região a montante descrita anteriormente; e um segundo plasmídeo que contém e expressa em uma célula hospedeira de bovino uma seqüência de nucleotídeos que codifica o BRSV N e/ou o BRSV G, modifi- cada através da substituição da seqüência sinal do BRSV G por uma se- qüência sinal de tPA humana e da deieção do domínio transmembrana e da parte C-terminal contígua (cauda citoplasmática); e em que o lipídeo catiôni- co está presente, por exemplo, DMRIE e o lipídeo neutro também está pre- sente, por exemplo, DOPE, por exemplo, através do qual a vacina ou a composição imunogênica compreende DMRIE-DOPE. Esta vacina ou com- posição imunogênica de DNA pode ainda compreender o GM-CSF bovino ou um vetor de expressão (por exemplo, plasmídeo) que contém e expressa em uma célula hospedeira de bovino uma seqüência de nucleotídeos que codifi- ca o GM-CSF bovino. Adicionalmente ou alternativamente, a vacina ou a composição imunogênica de DNA pode conter um plasmídeo que expressa todos estes imunógenos de BRSV "otimizados" e vantajosamente contém ainda o lipídeo catiônico presente, por exemplo, DMRIE e o lipídeo neutro presente, por exemplo, DOPE, por exemplo, através dos quais a vacina ou a composição imunogênica de DNA compreende DMRIE-DOPE; e, esta vaci- na ou composição imunogênica de DNA pode compreender ainda o GM- CSF bovino ou um vetor de expressão (por exemplo, plasmídeo) que contém e expressa em uma célula hospedeira de bovino uma seqüência de nucleo- tídeos que codifica o GM-CSF bovino.
Na prática da invenção, o agente patogênico bovino pode ser o agente patogênico bovino BHV-1 e o imunógeno pode ser BHV-1 gB e/ou BHV-1 gC e/ou BHV-1 gD. O imunógeno pode ser BHV-1 gB, modificado através da substituição da seqüência sinal de BHV-1 gB por uma seqüência sinal de tPA humana e/ou através da deieção do domínio transmembrana e/ou do BHV-1 gC, modificado através da substituição da seqüência sinal de BHV-1 gC por uma seqüência sinal de tPA humana e/ou através da deleção do domínio transmembrana e/ou do BHV-1 gD, modificado através da substi- tuição da seqüência sinal de BHV-1 gD por uma seqüência sinal de tPA hu- mana e/ou através da deleção do domínio transmembrana.
Assim, a vacina ou composição imunogênica de DNA pode compreender um primeiro plasmídeo que contém e expressa em uma célula hospedeira de bovino uma seqüência de nucleotídeos que codifica o BHV-1 gB, modificado através da substituição da seqüência sinal de BHV-1 gB por uma seqüência sinal de tPA humana e da deleção do domínio transmembra- na e da parte C-terminal contígua; um segundo plasmídeo que contém e ex- pressa em uma célula hospedeira de bovino uma seqüência de nucleotídeos que codifica o BHV-1 gC, modificado através da substituição da seqüência sinal de BHV-1 gC por uma seqüência sinal de tPA humana e da deleção do domínio transmembrana e da parte C-terminal contígua; um terceiro plasmí- deo que contém e expressa em uma célula hospedeira de bovino uma se- qüência de nucleotídeos que codifica o BHV-1 gD, modificado através da substituição da seqüência sinal de BHV-1 gD por uma seqüência sinal de tPA humana e da deleção do domínio transmembrana e da parte C-terminal contígua; e em que o lipídeo catiônico está presente, por exemplo, DMRIE e o lipídeo neutro está presente, por exemplo, DOPE, por exemplo, através dos quais a vacina ou a composição imunogênica de DNA compreende D- MRIE-DOPE. Esta vacina ou composição imunogênica de DNA pode ainda compreender o GM-CSF bovino ou um vetor de expressão (por exemplo, plasmídeo) que contém e expressa em uma célula hospedeira de bovino uma seqüência de nucleotídeos que codifica o GM-CSF bovino. Adicional- mente ou alternativamente, a vacina ou a composição imunogênica de DNA pode conter um plasmídeo que expressa todos estes imunógenos BHV-1 "otimizados" e vantajosamente contém ainda o lipídeo catiônico presente, por exemplo, DMRIE e o lipídeo neutro presente, por exemplo, DOPE, por exemplo, através dos quais a vacina ou a composição imunogênica de DNA compreende DMRIE-DOPE; e, esta vacina ou composição imunogênica de DNA pode compreender ainda o GM-CSF bovino ou um vetor de expressão (por exemplo, plasmídeo) que contém e expressa em uma célula hospedeira de bovino uma seqüência de nucleotídeos que codifica o GM-CSF bovino.
Na prática da invenção o agente patogênico bovino pode ser o BVDV e o imunógeno, a proteína EO (gp48) e/ou a proteína E2 (gp53). As- sim, a vacina ou a composição imunogênica ou imunológica de DNA pode compreender uma{ou mais) seqüência(s) de nucleotídeos que codifica(m) as proteínas BVDV EO e/ou E2. O imunógeno pode ser BVDV EO, modificado por ser codificado por um ácido nucléico no qual foi inserido o código de uma seqüência sinal, por exemplo, uma seqüência sinal de tPA humana e/ou no qual foi inserido um íntron tal como o íntron II da beta-globina de coelho e/ou BVDV E2 modificado por ser codificado por um ácido nucléico no quai foi inserido o código de uma seqüência sinal, por exemplo, uma seqüência sinal de tPA humana e/ou que foi deletada da mesma que codifica o domínio transmembrana de E2 e/ou a cauda citoplasmática e/ou no qual foi inserido um íntron tal como o íntron II da beta-globina de coelho.
Assim, a vacina ou a composição imunogênica de DNA pode compreender um primeiro plasmídeo que contém e expressa em uma célula hospedeira de bovino uma seqüência de nucleotídeos que codifica BVDV
EO, modificado por conter uma seqüência sinal de tPA humana e o íntron II da beta-globina de coelho; e um segundo plasmídeo que contém e expressa em uma célula hospedeira de bovino uma seqüência de nucleotídeos que codifica BVDV E2, modificado contendo uma seqüência sinal de tPA humana e o íntron II da beta-globina de coelho e a deleção do domínio transmembra- na e da cauda citoplasmática; e em que o lipídeo catiônico está presente, por exemplo, DMRIE e o lipídeo neutro está presente, por exemplo, DOPE, por exemplo, através dos quais a vacina ou a composição imunogênica de DNA compreende DMRIE-DOPE. Esta vacina ou composição imunogênica de DNA pode ainda compreender o GM-CSF bovino ou um vetor de expres- são (por exemplo, plasmídeo) que contém e expressa em uma célula hospe- deira de bovino uma seqüência de nucleotídeos que codifica o GM-CSF bo- vino. Adicionalmente ou alternativamente, a vacina ou a composição imuno- gênica de DNA pode conter um plasmídeo que expressa todos estes imunó- genos de BVDV "otimizados" e vantajosamente conter ainda o lipídeo catiô- nico presente, por exemplo, DMRIE e o lipídeo neutro presente, por exem- plo, DOPE, por exemplo, através dos quais a vacina ou a composição imu- nogênica de DNA compreende DMRIE-DOPE; e, esta vacina ou composição imunogênica de DNA pode ainda compreender o GM-CSF bovino ou um ve- tor de expressão (por exemplo, plasmídeo) que contém e expressa em uma célula hospedeira de bovino uma seqüência de nucleotídeos que codifica o GM-CSF bovino. Como há tipos diferentes de BVDV, a saber, BVDV-1 e BVDV-2, a EO e a E2 podem ser provenientes de qualquer um ou de ambos os tipos de BVDV. Assim, as vacinas ou composição imunogênicas de DNA de BVDV da invenção podem conter um plasmídeo ou plasmídeos contendo e expressando moléculas de ácidos nucléicos de BVDV-1 ou de BVDV-2 ou tanto de BVDV-1 quanto de BVDV-2. Conseqüentemente, a composição an- terior "de dois plasmídeos" pode ser uma composição "de quatro plasmí- deos" para se direcionar a ambos os tipos de BVDV. Assim, a invenção compreende uma mistura de plasmídeos. A mistura pode compreender pelo menos dois plasmídeos de expressão, cada um expressando um imunógeno diferente (EO ou E2) e/ou obtida de um tipo diferente de BVDV (BVDV-1 ou BVDV-2), tal como uma mistura feita de quatro plasmídeos que expressam BVDV-1 EO, BVDV-1 E2, BVDV-2 EO e BVDV-2 E2.
Na prática da invenção, o agente patogênico bovino pode ser o bPI-3; por exemplo, o imunógeno pode ser bPI-3 F ou HN. Ainda mais vanta- josamente, o imunógeno é bPI-3 F ou HN, modificado através da substitui- ção da seqüência sinal de bPI-3F e/ou de HN por uma seqüência sinal de tPA humana e/ou através da deleção do domínio transmembrana e/ou da cauda citoplasmática e/ou através da inserção na molécula de ácido nucléico que codifica o mesmo de um íntron, tal como o íntron II da beta-globina de coelho.
Assim, a vacina ou a composição imunogênica de DNA pode compreender um primeiro plasmídeo que contém e expressa em uma célula hospedeira de bovino uma seqüência de nucleotídeos que codifica bPI-3 F, modificado através da inserção do íntron II da beta-globina de coelho, da substituição da seqüência sinal de bPI-3 F por uma sequência sinal de tPA humana e da deleção do domínio transmembrana e da cauda citoplasmática; e um segundo plasmídeo que contém e expressa em uma célula hospedeira de bovino uma seqüência de nucleotídeos que codifica bPI-3 HN, modificado através da inserção do íntron II da beta-globina de coelho, da substituição da seqüência sinal de bPI-3 HN por uma seqüência sinal de tPA humana e da deleção do domínio transmembrana e da cauda citoplasmática; e em que o lipídeo catiônico está presente, por exemplo, DMRIE e o lipídeo neutro tam- bém está presente, por exemplo, DOPE, por exemplo, através dos quais a vacina ou a composição imunogênica compreende DMRIE-DOPE. Esta va- cina ou composição imunogênica de DNA pode compreender ainda o GM- CSF bovino ou um vetor de expressão (por exemplo, plasmídeo) que contém e expressa em uma célula hospedeira de bovino uma seqüência de nucleo- tídeos que codifica o GM-CSF bovino. Adicionalmente ou alternativamente, a vacina ou a composição imunogênica de DNA pode conter um plasmídeo que expressa todos estes imunógenos de bPI-3 "otimizados" e vantajosa- mente contém ainda o lipídeo catiônico presente, por exemplo, DMRIE e o lipídeo neutro presente, por exemplo, DOPE, por exemplo, através dos quais a vacina ou a composição imunogênica de DNA compreende DMRIE-DOPE; e, esta vacina ou composição imunogênica de DNA pode compreender ain- da o GM-CSF bovino ou um vetor de expressão (por exemplo, plasmídeo) que contém e expressa em uma célula hospedeira de bovino uma seqüência de nucleotídeos que codifica o GM-CSF bovino. E, em geral, os plasmídeos de DNA para vacinas ou composi- ções imunogênicas ou imunológicas de DNA e as vacinas ou composições imunogênicas ou imunológicas de DNA empregadas na "iniciação" do méto- do de iniciação-reforço contido aqui podem ser como na Patente U.S. N° 6.376.473 e nos Pedidos de Patentes U.S. N~ de Série 10/085.519, 09/766.442, 09/760.574, 60/193.126, 09/232.468, 09/232.469 e 09/232.279 e no pedido de patente Francês N° 00 00798, depositado em 21 de janeiro de 2000.
Estas e outras modalidades são descritas ou são óbvias partido da e abrangidas pela Descrição Detalhada a seguir.
BREVE DESCRIçãO DOS DESENHOS A Descrição Detalhada a seguir, fornecida com a finalidade de exemplo e não pretendida como limitante da invenção a modalidades espe- cíficas descritas, pode ser entendida em associação com as Figuras em a- nexo, incorporadas aqui como referência, em que: A Figura 1 mostra o plasmídeo pVR1012; A Figura 2 mostra o plasmídeo pAB110; A Figura 3 mostra um gráfico que representa a evolução da tem- peratura retal após o desafio de acordo com o exemplo 11; A Figura 4 mostra um gráfico que representa a taxa respiratória após o desafio de acordo com o exemplo 11; A Figura 5 mostra um gráfico que representa os escores clínicos após o desafio de acordo com o exemplo 11; A Figura 6 mostra um gráfico que representa os escores de le- são pulmonar após o desafio de acordo com o exemplo 11; A Figura 7 mostra um gráfico que representa a excreção viral após o desafio de acordo com o exemplo 11; e, A Figura 8 mostra um gráfico que representa a resposta de célu- las T de memória de IFNV+ específica a BRSV após o desafio de acordo com o exemplo 11.
Listagem de seqüências: SEQ ID NQ1: oligonucleotídeo PB326 SEQ ID Na 2: oligonucleotídeo PB329 SEQ ID N2 3: oligonucleotídeo SB090 SEQ ID N2 4: oligonucleotídeo SB091 SEQ ID N2 5: oligonucleotídeo LF001 SEQ ID N2 6: oligonucleotídeo LF002 SEQ ID N2 7: oligonucleotídeo PB234 SEQ ID N2 8: oligonucleotídeo PB235 SEQ ID N2 9: oligonucleotídeo PB511 SEQ ID Ns 10: oligonucleotídeo PB512 SEQID N211: oiigonucleotídeo SB221 SEQID N2 12: oiigonucleotídeo SB222 SEQ ID N213: oiigonucleotídeo PB507 SEQ ID N214: oiigonucleotídeo PB508 SEQ ID N215: oiigonucleotídeo PB513 SEQ ID N216: oiigonucleotídeo PB514 SEQ ID N217: oiigonucleotídeo SB223 SEQ ID N218: oiigonucleotídeo SB224 SEQ ID N219: oiigonucleotídeo PB497 SEQ ID N2 20: oiigonucleotídeo PB498 SEQ ID N2 21: oiigonucleotídeo SB225 SEQ ID N222: oiigonucleotídeo SB226 SEQ ID N223: oiigonucleotídeo SB210 SEQ ID N2 24: oiigonucleotídeo SB211 SEQ ID N2 25: oiigonucleotídeo SB212 SEQ ID N2 26: oiigonucleotídeo SB220 SEQ ID N2 27: oiigonucleotídeo SB213 SEQ ID N3 28: oiigonucleotídeo SB214 SEQ ID N2 29: oiigonucleotídeo SB215 SEQ ID N3 30: oiigonucleotídeo SB216 SEQ ID N2 31: oiigonucleotídeo LF05O SEQ ID N2 32: oiigonucleotídeo LF051 SEQ ID N2 33: oiigonucleotídeo LF052 SEQ ID N2 34: oiigonucleotídeo LF053 SEQ ID N2 35: oiigonucleotídeo LF039 SEQ ID N2 36: oiigonucleotídeo LF040 SEQ ID N2 37: oiigonucleotídeo LF041 SEQ ID N2 38: oiigonucleotídeo LF042 SEQ ID N2 39: oiigonucleotídeo LF043 SEQ ID N2 40: oiigonucleotídeo LF044 SEQ ID N2 41: oiigonucleotídeo LF045 SEQ ID N2 42: oiigonucleotídeo LF046 SEQ ID N- 43: oligonucleotídeo LF064 SEQ ID N9 44: oligonucleotídeo LF065 SEQ ID N945: oligonucleotídeo LF066 SEQ ID N- 46: oligonucleotídeo LF067 SEQ ID Ns47: oligonucleotídeo LF047 SEQ ID Ne 48: oligonucleotídeo LF048 SEQ ID N9 49: oligonucleotídeo LF058 SEQ ID N9 50: oligonucleotídeo LF059 SEQ ID N- 51: oligonucleotídeo LF060 SEQ ID N9 52: oligonucleotídeo LF061 SEQ ID N9 53: oligonucleotídeo LF062 SEQ ID N9 54: oligonucleotídeo LF063 SEQ ID N9 55: oligonucleotídeo LF054 SEQ ID N9 56: oligonucleotídeo LF055 SEQ ID N9 57: oligonucleotídeo FC129 SEQ ID N9 58: oligonucleotídeo FC13G SEQ ID N9 59: oligonucleotídeo FC131 DESCRIçãO DETALHADA
Como discutido aqui, a invenção envolve um método de inicia- ção-reforço que é vantajosamente praticado em bovinos, tais como bezerros jovens que podem ter anticorpos maternos contra o agente patogênico con- tra o qual a imunização ou a vacinação está direcionada.
A vacina ou a composição imunológica ou imunogênica de DNA pode ser administrada ao animal jovem, bezerro; em que um "animal jovem" ou "bezerro jovem” é um bezerro desde o nascimento até e incluindo 12 se- manas de idade, tal como desde o nascimento até e incluindo 6 semanas de idade, vantajosamente desde o nascimento até e incluindo 4 semanas de idade, por exemplo, desde o nascimento até e incluindo 3 semanas de ida- de. A administração de reforço vantajosamente pode ser realizada desde aproximadamente 2 semanas até aproximadamente 5 meses após a administração de iniciação, tal como desde aproximadamente 3 até 6 sema- nas após a administração de iniciação e vantajosamente aproximadamente 4 semanas após a administração de iniciação. Uma segunda administração da vacina ou da composição imunológica ou imunogênica de reforço pode ocor- rer, tal quando os bezerros são transferidos para as unidades de abate.
A vacina ou a composição imunogênica ou imunológica de DNA compreende, como um ingrediente ativo, um plasmídeo que compreende uma molécula de ácido nucléico que codifica um imunógeno, um antígeno ou um epítopo de um agente patogênico, vantajosamente um agente patogêni- co bovino. O termo plasmídeo cobre uma unidade de transcrição de DNA que compreende uma polisseqüência de nucleotídeos que compreende a seqüência da molécula de ácido nucléico que será expressa e os elementos necessários para a expressão in vivo. A forma de plasmídeo circular, super- enrolada ou diferente, está dentro do âmbito da invenção. A forma linear também se encaixa dentro do âmbito desta invenção.
Cada plasmídeo compreende um promotor, para a expressão da molécula de ácido nucléico que codifica o imunógeno, o antígeno ou o epíto- po e assim, a molécula de ácido nucléico que codifica o imunógeno, o antí- geno ou o epítopo fica ligada de forma operacional a ou sob o controle do promotor. Vantajosamente, o promotor é um promotor eucariótico, ainda mais vantajosamente um promotor forte, tal como um promotor eucariótico forte, por exemplo, um promotor incial de citomegalovírus CMV-IE, de ori- gem humana ou murina ou opcionalmente de uma outra origem tal como murina, de rato ou de porquinho-da-índia. Os subfragmentos funcionais des- tes promotores, isto é, as partes destes promotores que mantêm uma ativi- dade promotora adequada, estão incluídas dentro da presente invenção, por exemplo, os promotores CMV-IE truncados de acordo com a W098/00166 ou a Patente U.S. N- 6.156.567 podem ser utilizados na prática da invenção.
Um promotor na prática da invenção inclui conseqüentemente derivados e subfragmentos de um promotor de comprimento completo que mantêm uma atividade promotora adequada e conseqüentemente funcionam como um promotor, vantajosamente promovendo uma atividade substancialmente si- milar àquela do promotor real ou de comprimento completo do qual o deriva- do ou o subfragmento é derivado, por exemplo, afim à atividade dos promo- tores CMV-IE truncados da Patente U.S. N° 6.156.567 à atividade dos pro- motores CMV-IE de comprimento completo. Assim, um promotor CMV-IE na prática da invenção pode compreender ou consistir essencialmente em ou consistir na parte promotora do promotor de comprimento completo e/ou da parte intensificadora do promotor de comprimento completo, assim como derivados e subfragmentos.
De forma mais geral, o promotor pode ter origem viral ou origem celular. Como um promotor viral sem ser o do CMV-IE, o promotor pode ser o promotor inicial ou tardio do SV40 ou o promotor LTR do vírus de Sarcoma de Rous. O promotor pode ainda ser um promotor proveniente de um agente patogênico bovino, por exemplo, proveniente do agente patogênico do qual uma molécula de ácido nucléico que codifica o antígeno, o imunógeno ou o epítopo é derivado, por exemplo, o promotor específico a uma molécula de ácido nucléico que codifica o antígeno, o imunógeno ou o epítopo. Um pro- motor celular que pode ser empregado na prática da invenção é um promo- tor de um gene do citoesqueleto, tal como, por exemplo, o promotor da des- mina ou alternativamente o promotor da actina. Quando vários genes estive- rem presentes no mesmo plasmídeo, podem ser fornecidos na mesma uni- dade de transcrição ou em várias unidades diferentes. O(s) plasmídeo(s) nas vacinas ou nas composições imunogêni- cas ou imunológicas de DNA estão em um veículo ou em um excipiente a- ceitável na veterinária. Em geral, o veículo ou o excipiente (Remingtorís Pharmaceutical Sciences, por E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15â Edição, 1975) pode ser qualquer fluido injetável usual tal como á- gua, solução salina fisiológica, solução equilibrada de sais, dextrose aquosa, glicerol ou similares. Conseqüentemente, as vacinas ou as composições-i- munogênicas ou imunológicas de DNA podem conter vantajosamente um veículo ou um excipiente aceitável na veterinária.
As vacinas ou as composições imunogênicas ou imunológicas de DNA de acordo com a invenção podem ainda sofrer a adição de adjuvan- tes, isto é, podem conter um adjuvante. Os exemplos de adjuvantes incluem em que Ri é um radical alifático linear saturado ou insaturado que possui 12 até 18 átomos de carbono, R2 é um outro radicai alifático que compreende 2 ou 3 átomos de carbono e X um grupo hidroxila ou amina.
Vantajosamente, este iipídeo catiônico é DMRIE (N-(2- hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis (tetradecilóxl)-l-propanamônio; WO-A- 9634109). O Iipídeo catiônico pode ser combinado com um Iipídeo neutro, tal como, DOPE (dioleoil-fosfatidil-etanolamina). DMRIE e DOPE formam DMRIE-DOPE.
Vantajosamente, 0 piasmídeo é misturado com 0 Iipídeo catiôni- co imediatamente antes do uso e é ainda mais vantajoso, antes de sua ad- ministração ao animal, permitir que a mistura dessa maneira forme um com- plexo, por exemplo, para assentar após a mistura durante um período que varia de aproximadamente 10 até aproximadamente 60 minutos, tal como aproximadamente 30 minutos.
Quando 0 Iipídeo neutro, por exemplo, DOPE, estiver presente, a proporção molar de Iipídeo catiônico : Iipídeo neutro, por exemplo, DMRI- E:DOPE, varia vantajosamente de aproximadamente 95:5 até aproximada- mente 5:95 e é ainda mais vantajosamente de aproximadamente 1:1. grupos CpG não metilados (Klinman D. M. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 2879-2883, 1996; WO 98/16247) ou hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, óxido de alumínio ("Vaccine Design, The subunit and adjuvant approach," Pharmaceutical Biotechnology, vol. 6, Editado por Micheal F.
Powell e Mark J. Newman, 1995, Plenum Press Nova York). Os adjuvantes vantajosamente empregados na prática da invenção são os lipídeos catiôni- cos, tais como aqueles que contêm um sal de amônio quaternário da fórmu- la: A proporção em peso do adjuvante plasmídeo : lipídeo catiônico, por exemplo, DMRIE ou lipídeo catiônico-lipídeo neutro, por exemplo, D- MRIE-DOPE, pode variar de aproximadamente 50:1 até aproximadamente 1:10, em tal como de aproximadamente 10:1 até aproximadamente 1:5, van- tajosamente de aproximadamente 1:1 até aproximadamente 1:2.
As vacinas ou as composições imunogênicas ou imunológicas de DNA de acordo com a invenção podem ser formuladas com um liposso- mo, na presença ou não de um adjuvante como descrito anteriormente.
Adicionalmente ou alternativamente, as vacinas ou as composi- ções imunogênicas ou imunológicas de DNA da invenção contêm o GM-CSF (fator estimulador de colônias de granulócitos macrófagos; Clark S.C. e ou- tros Science 1987. 230.1229; Grant S.M. e outros Drugs 1992. 53. 516) ou um vetor de expressão que expressa assim o GM-CSF, com o "vetor de ex- pressão" incluindo o plasmídeo que expressa o antígeno, o imunógeno ou o epítopo do agente patogênico bovino. Assim, à vacina ou à composição i- munogênica ou imunológica de DNA é adicionado o GM-CSF ou um vetor que expressa o GM-CSF, por exemplo, adicionado a vacinas ou composi- ções imunogênicas ou imunológicas sem adjuvantes ou com adjuvantes e/ou formuladas com lipossomos; ou, o plasmídeo de DNA que expressa o antí- geno, o imunógeno ou o epítopo do agente patogênico bovino é construído de forma que também expresse o GM-CSF. Se um vetor de expressão esti- ver fornecendo o GM-CSF, uma seqüência de ácido nucléico que codifica o GM-CSF está no vetor de expressão sob condições que permitam a sua ex- pressão in vivo (por exemplo, está ligada de forma operacional a um promo- tor adequado). Vantajosamente, o vetor de expressão que expressa o GM- CSF é um plasmídeo, por exemplo, o plasmídeo que contém uma seqüência de nucleotídeos que codifica o(s) imunógeno(s)-de interesse (que codifica o antígeno, o imunógeno ou o epítopo bovino) ou um outro plasmídeo. O GM- CSF é vantajosamente o GM-CSF bovino (Maliszewski e outros, Molec. Im- munol., 1988, 25, 843-850).
Nas vacinas ou nas composições imunogênicas ou imunológicas de acordo com a invenção, por exemplo, nas vacinas ou nas composições imunogênicas ou imunológicas sem adjuvantes ou com adjuvantes e/ou for- muladas com lipossomos, contendo ou não o GM-CSF ou um vetor de ex- pressão que expressa o GM-CSF, a(s) seqüência(s) de nucleotídeos que codifica(m) o imunógeno está(ão) em uma forma otimizada ou modificada.
Entende-se que a otimização signifique qualquer modificação de uma se- qüência de nucleotídeos que se manifesta pelo menos em um nível maior de expressão desta sequência de nucleotídeos e/ou por um aumento na estabi- lidade do RNA mensageiro que codifica este antígeno e/ou através da se- creção ativada deste antígeno no meio extracelular e que pode ter como uma conseqüência direta ou indireta um aumento na resposta imunológica induzida.
Na presente invenção, a otimização da(s) seqüência(s) de nu- cleotídeos que codifica(m) o imunógeno pode consistir na deleção do frag- mento de uma seqüência de nucleotídeos que codifica o domínio transmem- brana do imunógeno (sendo entendido que a deleção significa a deleção completa ou uma deleção parcial ou uma interrupção suficiente para que o domínio transmembrana não mais ou substancialmente não mais, seja fun- cional, de forma que tal deleção de uma seqüência de nucleotídeos que co- difica o domínio transmembrana possa incluir a interrupção da seqüência codificadora) e/ou a adição, em quadro, de uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência sinal de tPA heteróloga (ao agente patogênico) de forma que a seqüência sinal humana de tPA (Montgomery e outros Cell.
Mol. Bíol. 1997. 43. 285-292; Harris e outros Mol. Biol. Med 1986. 3. 279- 292) e/ou na inserção de um íntron estabilizador, vantajosamente a montan- te da molécula de ácido nucléico (que codifica o imunógeno, o antígeno ou o epítopo) que será expressa, tal como o íntron II ou beta-globina de coelho. A deleção do fragmento de DNA que codifica o domínio transmembrana do antígeno de interesse promove a secreção, no meio extracelular, dos antí- genos truncados dessa forma e assim aumenta a probabilidade dos antíge- nos entrarem em contato com as células do sistema imunológico. A inserção de uma seqüência de nucleotídeos que codifica o sinal de tPA facilita a ca- pacidade de tradução do RNA mensageiro ao qual o sinal de tPA está iigado e assim aumenta o nível de expressão deste RNA mensageiro e, portanto, a produção de antígenos. O sinal de tPA também desempenha uma função na secreção do antígeno sintetizado. Outras seqüências de nucleotídeos que codificam os peptídeos sinais podem ser utilizadas, tais como aquelas para o peptídeo sinal da melitina obtido de abelhas (Sisk W.P. e outros, 1994, J.
Viroi., 68, 766-775). A inserção de um íntron estabiíizador em uma molécula de ácido nucléico que codifica o antígeno de interesse evita os processa- mentos aberrantes de seu RNA mensageiro e mantém a integridade física do último.
Vantajosamente, o sinal de tPA tem origem humana. Uma se- quência de nucleotídeos do sinal de tPA humano é acessível partindo do banco de dados GenBank sob o número de acesso NM_000930. Vantajo- samente, o íntron é o íntron II do gene da beta-globina de coelho (van Ooyen e outros Science 1979. 206. 337-344), cuja seqüência de nucleotídeos é a- cessível partindo do banco de dados GenBank sob o número de acesso V00882 e denominada como referência sob o íntron N- 2.
Em uma modalidade, a presente invenção envolve a vacinação ou a imunização contra o vírus síncicial respiratório bovino (BRSV). O vírus BRSV é um Paramixovírus, também um membro da fa- mília Paramyxoviridae (Baker e outros, Vet. Clin. North Am. Food Anim.
Pract., 1997,13,425-454).
As seqüências de nucleotídeos que codificam a glicoproteína F, a proteína N e a glicoproteína G são conhecidas e podem ser acessadas no banco de dados GenBank respectivamente sob os números de acesso Y17970, M35076 e U33539. A acina ou a composição imunogênica ou imu- nológica de DNA utilizada no regime de iniciação-reforço contra o BRSV po- de assim compreender a(s) seqüência(s) de nucleotídeos que codifica(m) as proteínas F, N e/ou G.
As seqüências de nucleotídeos e os antígenos codificados par- tindo das mesmas podem ser modificados. Isto pode ser realizado através da substituição, de uma seqüência "sinal", tal como a seqüência sinal de tPA humano, pela seqüência sinal da proteína F do BRSV e/ou pela glicoproteína de envelope G do BRSV e/ou através da deleção do fragmento de DNA que codifica o domínio transmembrana de F e/ou de G. A deleção do fragmento de DNA que codifica o domínio transmembrana de uma destas proteínas é vantajosamente acompanhada pela deleção da cauda citoplasmática. É pos- sível aumentar o nível de expressão da glicoproteína F deletando adicional- mente uma seqüência de nucleotídeos a montante do domínio transmem- brana e que corresponde a 1 e até 92 aminoácidos.
Vantajosamente, a vacina ou a composição imunogênica ou i- munológica de DNA contra o BRSV compreende a seqüência de nucleotí- deos que codifica a proteína F ou a seqüência de nucleotídeos que codifica a proteína N ou as seqüências de nucleotídeos que codificam a proteína F e a proteína N.
Em uma modalidade particular, a vacina ou a composição imu- nogênica ou imunológica de DNA compreende as seqüências de nucleotí- deos que codificam a proteína F, em que a seqüência de nucleotídeos que codifica a proteína F está modificada. Esta modificação é escolhida entre: i. a substituição, da seqüência ''sinal" por uma seqüência sinal heteróloga, tal como a de tPA de origem humana, ii. a deleção do fragmento de DNA que codifica o domínio trans- membrana de F e vantajosamente da cauda citoplasmática, iii. a deleção do fragmento de DNA que codifica o domínio transmembrana, da cauda citoplasmática e da região a montante descrita anteriormente, iv. a substituição, da seqüência "sinal" por uma seqüência sinal heteróloga, tal como a de tPA de origem humana e a deleção do fragmento de DNA que codifica o domínio transmembrana de F e vantajosamente da cauda citoplasmática ou v. a substituição, da seqüência "sinal" por uma seqüência sinal heteróloga, tal como a de tPA de origem humana e a deleção do fragmento de DNA que codifica o domínio transmembrana de F, da cauda citoplasmáti- ca e da região a montante descrita anteriormente.
Em uma segunda modalidade, a vacina ou a composição imu- nogênica ou imunológica de DNA compreende as sequências de nucleotí- deos que codificam a proteína F e a proteína N, qualquer plasmídeo que contém ambas as seqüências de nucleotídeos ou dois plasmídeos separa- dos, um contendo a seqüência de nucleotídeos que codifica a proteína F e um contendo a seqüência de nucleotídeos que codifica a proteína N.
Em uma terceira modalidade, a vacina ou a composição imuno- gênica ou imunológica de DNA compreende as seqüências de nucleotídeos que codificam a proteína F e a proteína N, qualquer plasmídeo contendo ambas as seqüências de nucleotídeos ou dois plasmídeos separados, um contendo a seqüência de nucleotídeos que codifica a proteína F e um con- tendo a seqüência de nucleotídeos que codifica a proteína N, em que a se- qüência de nucleotídeos que codifica a proteína F é modificada como descri- to anteriormente, com a modificação sendo escolhida entre as descritas sob os parágrafos i até v.
As seqüências de nucleotídeos que codificam os antígenos do BRSV que podem ser utilizados na presente invenção e vários constructos de vetores de expressão são fornecidos aqui, por exemplo, nos exemplos em anexo e em FR-A1-2751229, tais como nos Exemplos 9 e 10 e nas Figu- ras 5 e 6 (ver também a Patente U.S. NQ 6.376.473 e o Pedido de Patente U.S. N- de Série 10/085.519).
A vacina ou a composição imunogênica ou imunológica de DNA contra o BRSV como descrito anteriormente pode vantajosamente incluir um veículo ou um excipiente aceitável na veterinária de acordo com a discussão acima da invenção.
A vacina ou a composição imunogênica ou imunológica de DNA contra o BRSV como descrito anteriormente também pode compreender um adjuvante de acordo com a discussão anterior da invenção, vantajosamente DMRIE, ainda mais vantajosamente, DMRIE-DOPE.
A vacina ou a composição imunogênica ou imunológica de DNA contra o BRSV como descrito anteriormente, com adjuvante ou não, pode compreender o GM-CSF ou um vetor de expressão, vantajosamente um plasmídeo, que expressa o GM-CSF, com o GM-CSF sendo vantajosamente o GM-CSF bovino. A adição do GM-CSF bovino pode ser realizada através da in- corporação do polipeptídeo do GM-CSF bovino na composição vacinai ou imunogênica ou imunológica ou vantajosamente através da inserção de uma seqüência de nucleotídeos que codifica o GM-CSF bovino em um vetor de expressão in vivo, tal como um plasmídeo. A seqüência de nucleotídeos que codifica o GM-CSF pode ser inserida em um segundo plasmídeo de expres- são (por exemplo, pLF1032 Exemplo 8), diferente daquele (ou daqueles) no(s) qual(is) o(s) gene(s) que codifica(m) o(s) antígeno(s) do BRSV es- tá(ão) inserido(s).
Uma seqüência de nucleotídeos que codifica o GM-CSF bovino pode ser acessada partindo do banco de dados GenBank sob o número de acesso U22385.
Vantajosamente, de acordo com a invenção, a vacina ou a com- posição imunogênica ou imunológica de DNA contra o BRSV, que pode ser formulada com DMRIE-DOPE, é composta de um plasmídeo de expressão (por exemplo, pSB108 Exemplo 4.1.2) que codifica o antígeno F do BRSV otimizado através da deleção do fragmento de uma seqüência de nucleotí- deos de F que codifica o domínio transmembrana e a cauda citoplasmática, opcionalmente ainda com a deleção da região a montante descrita anterior- mente (por exemplo, pPB449 Exemplo 4.1.4) e de um segundo plasmídeo de expressão (por exemplo, pFC123 Exemplo 4.3) que codifica a proteína N nativa de BRSV.
Em uma outra modalidade, a presente invenção se refere à va- cinação ou à imunização contra o vírus paraínfluenza bovino do tipo 3 (bPI- 3). O vírus bPI-3 é um Paramyxovirus, também um membro da fa- mília Paramyxoviridae (Tsai e outros, Infect. Immun., 1975,11, 783-803).
As seqüências de nucleotídeos que codificam as proteínas he- maglutinina e neuraminidase (HN) e a proteína de fusão (F) do bPI-3 são conhecidas e podem ser acessadas partindo do banco de dados GenBank sob o número de acesso U31671. A vacina ou a composição imunogênica ou imunológica de DNA contra o bPI-3 pode assim compreender um plasmí- deo de DNA que compreende a(s) seqüência(s) de nucleotídeo(s) que codi- fica(m) as proteínas HN e/ou F.
A vacina ou a composição imunogênica ou imunológica de DNA contra o bPI-3 como descrito anteriormente vantajosamente contém um veí- culo ou um excipiente aceitável na veterinária de acordo com a discussão anterior da invenção.
A vacina ou a composição imunogênica ou imunoíógíca de DNA contra o bPI-3 como descrito anteriormente pode compreender um adjuvante de acordo com a discussão anterior da invenção, tal como DMRIE, vantajo- samente DMRIE-DOPE.
Estas modalidades podem ainda opcionalmente incluir (1) a adi- ção do GM-CSF ou de um vetor de expressão, vantajosamente um plasmí- deo, que expressa o GM-CSF ou (2) a otimização de pelo menos um antíge- no do bPI-3 ou (3) a adição do GM-CSF ou de um vetor de expressão, van- tajosamente um plasmídeo, que expressa o GM-CSF e a otimização de pelo menos um antígeno do bPI-3. O GM-CSF é vantajosamente o GM-CSF bo- vino. A adição do GM-CSF pode ser realizada como é descrito para o BRSV e na discussão anterior da invenção. A otimização dos antígenos derivados do bPI-3 é realizada atra- vés da substituição, de uma sequência "sinal", por exemplo, através da substituição de uma seqüência sinal do antígeno do bPI-3 por uma sequên- cia sinal heteróloga, tal como a seqüência sinal de tPA humano, por exem- plo, a substituição da seqüência sinal da hemaglutinina-neuraminidase (HN) do bPI-3 e/ou da proteína de fusão (F) do bPI-3 pela seqüência sinal do tPA humano e/ou através da deleção do fragmento de DNA que codifica o domí- nio transmembrana da HN e/ou da F e/ou através da inserção de um íntron, tal como o íntron II da beta-globina de coelho, vantajosamente a montante da seqüência de nucleotídeos que codifica HN e/ou F. A deleção do frag- mento de DNA que codifica o domínio transmembrana de uma destas prote- ínas é vantajosamente acompanhada pela deleção da cauda citoplasmática. A vacina ou a composição imunogênica ou imunológica de DNA contra o bPI-3 de acordo com a invenção pode, portanto, codificar e expressar um único antígeno otimizado de PI-3 (HN ou F) ou ambos (HN e F).
As seqüências de nucleotídeos que codificam os antígenos do que podem ser utilizadas na presente invenção e vários constructos vetoriais de expressão são fornecidos aqui, por exemplo, nos exemplos em anexo e em FR-A1 -2751229, tais como nos Exemplos 14 e 15 e nas Figuras 10 e 11 (ver também a Patente U.S. N- 6.376.473 e o Pedido de Patente U.S. N- de Série 10/085.519).
Vantajosamente, de acordo com a invenção, a vacina ou a com- posição imunogênica ou imunológica de DNA contra o bPI-3 compreende DMRIE-DOPE e é composta de um plasmídeo de expressão (por exemplo, pLF1025 Exemplo 7.1.2) que codifica o antígeno de HN do bPI-3 otimizado pela inserção da sequência sinal de tPA humano no lugar da seqüência sinal da HN, através da deleção do fragmento da seqüência de nucleotídeos da HN que codifica o domínio transmembrana e da cauda citoplasmática e atra- vés da inserção do íntron II do gene da beta-globina de coelho a montante da HN e de um segundo plasmídeo de expressão (por exemplo, pLF1027 Exemplo 7.2.2) que codifica o antígeno F do bPI-3 otimizado pela inserção da seqüência sinal de tPA humano no lugar da seqüência sinal de F, através da deleção do fragmento de uma seqüência de nucleotídeos que codifica o domínio transmembrana de F e a cauda citoplasmática e através da inserção do íntron II do gene da beta-globina de coelho a montante de F.
Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece a vaci- nação ou a imunização contra a rinotraqueíte infecciosa bovina (IBR). O vírus responsável pela rinotraqueíte infecciosa bovina é um herpesvírus bovino do tipo 1 (BHV-1), um membro da família Alphaherpesvi- rinae (Babiuk L.A. e outros, 1996, Vet. Microbiol., 53, 31-42). As seqüências de nucleotídeos que codificam as glicoproteínas gB, gC e gD são conheci- das e podem ser acessadas partindo do banco de dados GenBank sob o número de acesso AJ004801. A vacina ou a composição imunogênica ou imunológica de DNA contra o BHV-1 pode assim compreender um plasmí- deo ou plasmídeos de DNA que compreendem a(s) seqüência(s) de núcleo- tídeos que codifica(m) as proteínas gB, gC e/ou gD.
A vacina ou a composição imunogênica ou imunológica de DNA contra o BHV-1 como descrito anteriormente vantajosamente contém um veículo ou um excipiente aceitável na veterinária de acordo com a discussão anterior da invenção.
A vacina ou a composição imunogênica ou imunológica de DNA contra o BHV-1 como descrito anteriormente pode compreender um adjuvan- te de acordo com a discussão anterior da invenção, tal como DMRIE, vanta- josamente DMRIE-DOPE.
Opcionalmente, estas modalidades podem ainda incluir opcio- nalmente (1) a adição do GM-CSF ou de um vetor de expressão, vantajosa- mente um plasmídeo, que expressa o GM-CSF ou (2) a otimização de pelo menos um antígeno do BHV-1 ou (3) a adição do GM-CSF bovino ou de um vetor de expressão, vantajosamente um plasmídeo, que expressa o GM- CSF e a otimização de pelo menos um antígeno de BHV-1. O GM-CSF é vantajosamente o GM-CSF bovino. A adição do GM-CSF pode ser realizada como descrito para o BRSV e na discussão geral anterior da invenção. A otimização dos antígenos derivados do BHV-1 é realizada a- través da substituição, de uma seqüência "sinal'1 de um antígeno do BHV-1 por uma seqüência "sinal" heteróloga, por exemplo, a seqüência sinal de tPA humano (número de acesso do GenBank NM_000930); por exemplo, da substituição da seqüência do peptídeo sinal da glicoproteina gB e/ou da gli- coproteína gC e/ou da glicoproteina gD pela seqüência sinal de tPA humano; e/ou através da deleção do fragmento de DNA que codifica o domínio trans- membrana de gB e/ou de gC e/ou de gD. A deleção do fragmento de DNA que codifica o domínio transmembrana de uma dessas glicoproteínas é van- tajosamente acompanhada pela deleção da cauda citoplasmática. A vacina ou a composição imunogênica ou imunológica de DNA contra o BHV-1 de acordo com a invenção pode, portanto, codificar e expressar um único antí- geno otimizado do BHV-1 (gB, gC ou gD) ou dois dos mesmos ou todos os três, por exemplo, gB otimizado, gC otimizado e gD otimizado.
As seqüências de nucleotídeos que codificam os antígenos do BHV-1 que podem ser utilizadas na presente invenção e vários constructos de vetores de expressão são fornecidos aqui, por exemplo, nos exemplos em anexo e em FR-A1-2751229, tais como nos Exemplos 7 e 8 e nas Figu- ras 3 e 4 (ver também a Patente U.S. N- 6.376.473 e o Pedido de Patente U.S. N- de Série 10/085.519).
Vantajosamente, de acordo com a invenção, a vacina ou a com- posição imunogênica ou imunológica de DNA contra o BHV-1 é formulada com DMRIE-DOPE e é composta de um plasmídeo de expressão (por e- xemplo, pPB281, Exemplo 3.1.2) que codifica o antígeno gB do BHV-1 otimi- zado através da deleção do fragmento da seqüência de nucleotídeos que codifica o domínio transmembrana e a cauda citoplasmática, de um segundo plasmídeo de expressão (por exemplo, pPB292, Exemplo 3.2,2) que codifica o antígeno gC do BHV-1 otimizado através da deleção do fragmento da se- qüência de nucleotídeos que codifica o domínio transmembrana e a cauda citoplasmática e de um terceiro plasmídeo de expressão (por exemplo, pPB284, Exemplo 3.3.2) que codifica o antígeno gD do BHV-1 otimizado a- través da deleção do fragmento da seqüência de nucleotídeos que codifica o domínio transmembrana e a cauda citoplasmática.
Ainda em uma outra modalidade, a presente invenção fornece a vacinação ou a imunização contra o BVDV. O vírus BVDV é um pestivírus da família Flavivirídae. É univer- salmente distribuído em populações de bovinos e se manifesta através de más-formações fetais, abortos ou sintomas respiratórios (doença de muco- sa) e entéricos (diarréia viral bovina) clínicos.
Os vírus BVDVs podem ser distinguidos através da gravidade dos sinais clínicos e foram formados dois grupos, os BVDVs do tipo 1 (sinais clínicos não evidentes ou suaves) e os do tipo 2 (sinais clínicos agudos, he- morragia, alta morbidez, alta mortalidade) (Dean H.J. e Leyh R., 1999, Vac- cine, 17,1117-1124).
Quando um tipo de BVDV não é especificado claramente, en- tende-se que este seja do tipo 1 ou do tipo 2. O BVDV é um vírus de RNA de filamento simples envelopado composto de um único gene que codifica uma poliproteína que, após a diva- gem, fornece várias proteínas bem individualizadas, por exemplo, a proteína EO (gp48) e a proteína E2 (gp53) (Vassilev V.B. e outros, 1997, J. Virol., 71, 471-478).
As seqüências de nucleotídeos que codificam as poliproteínas E0-E2 são conhecidas e podem ser acessadas no banco de dados do Gen- Bank sob o número de acesso M96687 para o BVDV-1 e AF145967 para o BVDV-2. A vacina ou a composição imunogênica ou imunológica de DNA contra o BVDV pode assim compreender um plasmídeo ou plasmídeos de DNA contendo a(s) seqüência(s) de nucleotídeos que codifica(m) as proteí- nas EO e/ou E2, A vacina ou a composição imunogênica ou imunológica de DNA contra o BVDV como descrito anteriormente contém vantajosamente um veí- culo ou um excipiente aceitável na veterinária de acordo com a discussão anterior da invenção.
A vacina ou a composição imunogênica ou imunológica de DNA contra o BVDV como descrito anteriormente pode compreender um adjuvan- te de acordo com a discussão anterior da invenção, tal como DMRIE, vanta- josamente DMRIE-DOPE.
Estas duas modalidades podem ainda incluir (1) a adição do GM-CSF bovino ou de um vetor de expressão, vantajosamente um plasmí- deo que expressa o GM-CSF ou (2) a otimização de pelo menos um antíge- no do BVDV ou (3) a adição do GM-CSF bovino ou de um vetor de expres- são, vantajosamente um plasmídeo que expressa o GM-CSF e a otimização de pelo menos um antígeno do BVDV. O GM-CSF é vantajosamente o GM- CSF bovino. A adição do GM-CSF pode ser realizada como é descrito para o BRSV e como descrito na discussão geral anterior da invenção. A otimização dos antígenos derivados do BVDV é realizada a- través da adição de uma seqüência "sinal", tal como uma seqüência sinal heteróloga, vantajosamente a seqüência sinal de tPA humano, vantajosa- mente a montante de uma seqüência de nucleotídeos que codifica a proteína EO do BVDV e/ou a proteína E2 do BVDV e/ou através da deleção do frag- mento de DNA que codifica o domínio transmembrana da E2 e/ou através da inserção de um íntron, tal como o íntron II da beta-globina de coelho, vanta- josamente a montante de uma seqüência de nucleotídeos que codifica EO
e/ou E2. A vacina ou a composição imunogênica ou imunológica de DNA contra o BVDV de acordo com a invenção pode, portanto, codificar e expres- sar um antígeno do BVDV otimizado isolado (EO ou E2) ou ambos (EO e E2).
As seqüências de nucleotídeos que codificam os antígenos do BVDV que podem ser utilizadas na presente invenção e vários constructos de vetores de expressão são fornecidos aqui, por exemplo, nos exemplos em anexo e em FR-A1 -2751229, tal como no Exemplo 13 e na Figura 9 (ver ainda a Patente Ü.S. Ne 6.376.473 e o pedido de Patente U.S. NQ de Série 10/085.519).
Vantajosamente, de acordo com a invenção, a vacina ou a com- posição imunogênica ou imunológica de DNA contra o BVDV é formulada com DMRIE-DOPE e é composta de um plasmídeo de expressão (por e- xemplo, pLF1029 Exemplo 5.1.2, pLF1031 Exemplo 6.2.2) que codifica o Antígeno da EO do BVDV otimizado através da inserção da seqüência sinal de tPA humano a montante da EO e através da inserção do íntron II do gene da beta-globina de coelho a montante de EO e de um segundo plasmídeo de expressão (por exemplo, pLF1021 Exemplo 5.2.2, pLF1023 Exemplo 6.1.2) que codifica o antígeno da E2 do BVDV otimizado através da inserção da seqüência sinal de tPA humano a montante da E2, através da deleção do fragmento de uma seqüência de nucleotídeos que codifica o domínio trans- membrana da E2 e a cauda citoplasmática e através da inserção do íntron II do gene da beta-globina de coelho a montante da E2.
Uma mistura de plasmídeos pode ser vantajosamente produzida e empregada na prática da invenção, por exemplo, a vacina ou a composi- ção imunogênica ou imunológica de DNA pode compreender uma mistura de plasmídeos. A mistura pode compreender pelo menos dois plasmídeos de expressão, cada um expressando um imunógeno diferente (EO ou E2) e/ou obtidos de um tipo diferente do BVDV (BVDV-1 ou BVDV-2). Uma mistura pode compreender quatro plasmídeos: um que expressa a EO do BVDV-1, um que expressa a E2 do BVDV-1, um que expressa a EO do BVDV-2 e uma que expressa a E2 do BVDV-2.
Em uma modalidade, o reforço é feito com uma vacina ou com- posição imunogênica ou imunológica inativada ou atenuada ou de uma su- bunidade. As vacinas inativadas ou atenuadas ou de uma subunidade estão disponíveis para o versado na técnica (por exemplo, ver Ellis e outros, J. Am.
Vet. Med. Assoe., 2001, 218(12), 1973-1980 para o BRSV; Patente GB NQ 1.131.851 para o bPI-3; Patente U.S. Ns 5.676.951 e Pedido de Patente Pu- blicada U.S. Ne 2002/0187929 para o BHV; Patente U.S. N- 6.291.228 para o BVDV). Em adição, pode-se utilizar quaisquer vacinas inativadas ou ate- nuadas ou de subunidade comerciais, como BAR VAC® RS (Boehringer) para o BRSV, VIROBOV H® (Merial) para o bPI-3, IFFAVAX® I.B.R, (Merial) para o BHV, BOVILIS BVD® (Intervet) ou MUCOBOVIN® (Merial) para o BVDV.
Vantajosamente, a vacina ou a composição imunogênica ou i- munológica inativada ou atenuada ou de subunidade compreende um adju- vante, por exemplo, um adjuvante como discutido aqui.
Em uma outra modalidade, o reforço é feito com uma vacina ou composição imunogênica ou imunológica recombinante que compreende um vetor de expressão in vivo, tal como um poxvírus, um adenovírus ou um her- pesvírus. O vetor de expressão compreende e expressa uma seqüência de nucleotídeos que codifica um imunógeno de um agente patogênico bovi- no tal como o BRSV, o bPI-3, o BHV-1 e o BVDV. O vetor compreende e expressa pelo menos um imunógeno em comum com a vacina ou a compo- sição imunogênica ou imunológica de DNA. Para estes imunógenos e as seqüências de nucleotídeos correspondentes que codificam estes imunóge- nos, é feita uma referência na descrição contida aqui em relação à vacina ou à composição imunogênica ou imunológica de DNA. As seqüências de nu- cleotídeos podem também ser modificadas e melhoradas como descrito a- qui.
Os exemplos não limitantes específicos incluem poxvírus re- combinante, inciuindo avipoxvírus, tal como canaripoxvírus (Patente U.S. N2 5.505.941) e vírus vaccinia (Patente U.S. Ns 4.603.112), tal como vírus vac- cinia atenuado como o NYVAC (ver a Patente U.S. N2 5.494.807) ou o vírus Vaccinia Ankara Modificado (MVA, Stickl H. e Hochstein-Mintzel V., Munch.
Med. Wschr. 113:1149-1153,1971; Sutter G. e outros, Proc, Natl.Acad. Sei. U.S.A. 89: 10847-10851,1992; Carroll M. W. e outros, Vaccine 15(4): 387- 394, 1997; Stittelaar K. J. e outros, J. Virol. 74(9): 4236-4243, 2000; Sutter G. e outros, Vaccine 12(11): 1032-1040, 1994). Quando os avipoxvírus são utilizados, os dovepoxvírus, os canaripoxvírus (Patente U.S. N- 5.756.103) e os fowlpoxvírus (Patente U.S. N2 5.766.599) podem ser empregados, tais como os canaripoxvírus atenuados e os fowlpoxvírus atenuados, por exem- plo, ALVAC e TROVAC. Para os vetores recombinantes de canaripoxvírus, os sítios de inserção podem ser os ORFs C3, C5 ou C6. Quando o vetor de expressão é um poxvírus, o polinucleotídeo heterólogo pode ser inserido sob o controle de um promotor específico para poxvírus, tal como o promotor do vírus vaccinia de 7.5kDa (Cochran e outros, J. Virology 54: 30-35,1985), o promotor I3L do vírus vaccinia (Riviere e outros, J. Virology 66: 3424-3434, 1992), o promotor HA do vírus vaccinia (Shida, Virology 150:451-457,1986), o promotor ATI de cowpoxvírus (Funahashi e outros, J. Gen. Virol. 69: 35-47, 1988), o promotor H6 do vírus vaccinia (Taylor e outros, Vacina 6: 504-508, 1988; Guo e outros, J. Virol. 63: 4189-4198,1989; Perkus e outros, 1 Virol. 63:3829-3836,1989).
Outros vetores virais úteis incluem vetores de herpesvírus ou de adenovírus. Os exemplos não limítantes específicos incluem o herpesvírus bovino (BHV) ou o adenovírus bovino (BAV) como um vetor (por exemplo, ver o Pedido de Patente Européia Publicada N- EP 0.663.403; Pedido de Patente PCT Publicado N2 WO 98/59063). Para o BHV, os sítios de inserção podem ser o gene da timidina quinase, no gE ou no gl (ver o Pedido de Pa- tente PCT Publicado N2 WO 92/21751). Para o BAV, os sítios de inserção podem ser na região E2 ou na região E4 (ver a Patente U.S. Ns 6.451.319;
Patente U.S. N2 6.319.716). Nos vetores BHV ou BAV, o inserto (a molécula de ácido nucléico heteróloga que codifica o imunógeno, o antígeno ou o epí- topo de interesse, por exemplo, de um agente patogênico bovino, tal como o que é expresso pela vacina ou pela composição imunogênica de DNA) está, em geral, sob o controle de (ou ligado de forma operacional a) um promotor. O promotor pode ter origem viral ou celular. O promotor inicial do citomega- lovírus (CMV) (Promotor CMV-IE), incluindo o promotor e o intensificador, pode ser utilizado. O promotor CMV-IE pode ter origem humana ou murina ou opcionalmente outra origem tal como de rato ou de porquinho-da-índia (ver EP 0260148; EP 0323597; WO 89/01036; Pasieau e outros, Gene 38: 227-232,1985; Boshart M. e outros, Celi 41: 521-530, 1985); ver também a discussão acima (em relação a promotores para uso em plasmídeos de DNA). Os fragmentos funcionais do promotor CMV-IE também podem ser utilizados (WO 98/00166); ver também a discussão acima (em relação a pro- motores para uso em plasmídeos de DNA). O promotor inicial ou tardio do vírus SV40 e o promotor LTR do vírus de Sarcoma de Rous também podem ser utilizados. Outros promotores incluem, mas não estão limitados a um promotor do gene de citoesqueleto, tal como o promotor da desmina (Kwissa M, e outros, Vaccine 18(22): 2337-2344, 2000) ou o promotor da actina (Mi- yazaki J. e outros, Gene 79(2): 269-277,1989). Vantajosamente, o promotor é um Promotor CMV-IE. A vacina ou composição imunogênica ou imunológica inativada ou atenuada ou de subunidade ou a vacina ou a composição imunogênica ou imunológica recombinante pode ser suplementada com um adjuvante tal como fMLP (N-formil-metionil-leucil-fenilalanina; Patente U.S. NQ 6.017.537) e/ou um polímero de ácido acrílico ou de ácido metacrílico e/ou um co- polímero do anidrido maléico e de derivado de alquenila. Os polímeros de ácido acrílico ou de ácido metacrílico podem ser reticulados, por exemplo, com ésteres de polialquenila de açúcares ou de poliálcoois. Estes compos- tos são conhecidos sob o termo "carbômero" (Pharmeuropa, Vol. 8, N- 2, junho de 1996). Um versado na técnica pode também se referir à Patente U.S. Ns 2.909.462 (incorporada como referência) que discute tais polímeros acrílicos reticulados com um composto polihidroxilado contendo pelo menos 3 grupos hidroxila: em uma modalidade, um composto polihidroxilado não contém mais de 8 grupos hidroxila; em uma outra modalidade, os átomos de hidrogênio de pelo menos 3 hidroxilas não-substituídos por radicais alifáticos insaturados de pelo menos 2 átomos de carbono; em outras modalidades, os radicais contêm de aproximadamente 2 até aproximadamente 4 átomos de carbono, por exemplo, grupos viniia, alila e outros grupos insaturados de forma etilênica. Os radicais insaturados podem por si só conter outros substi- tuintes, tal como metila. Os produtos vendidos sob o nome Carbopol® (No- veon Inc., Ohio, EUA) são particularmente adequados para uso como um adjuvante. São reticulados com uma alil sacarose ou com alilpentaeritritol, aos quais se faz menção aos produtos Carbopol® 974P, 934P e 971P.
Como para os co-polímeros de anidrido maléico e de derivado de alquenila, se faz referência dos produtos EMA® (Monsanto) que são co- polímeros de anidrido maléico e de etiieno, que podem ser lineares ou reticu- iados, por exemplo, reticulados com o éter divinílico. Ainda, pode-se fazer referência a J. Fields e outros, Nature 186:778-780,1960 (incorporado aqui como referência). Geralmente, os polímeros de ácido acrílico ou de ácido metacrílico, tais como os carbômeros e os co-polímeros de anidrido maléico e de derivado de alquenila, tais como os produtos EMA®, são formados de unidades baseadas na fórmula a seguir: em que: - R1 e R2, que podem ser idênticos ou diferentes, representam H ou CH3, - x = 0 ou 1, vantajosamente, x = 1, - y = 1 ou 2, com x + y = 2.
Para os produtos EMA®, x = 0 e y = 2. Para os carbômeros, x = y = i A dissolução destes polímeros em água leva a uma solução áci- da, que é neutralizada até o pH fisiológico, com a finalidade de fornecer a solução adjuvante na qual a composição ímunogênica ou a própria vacina é incorporada. Os grupos carboxila do polímero estão então parcialmente na forma COO'.
Vantajosamente, uma solução de adjuvante, por exemplo, um carbômero, é preparada em água destilada, por exemplo, na presença de um sal tal como o cloreto de sódio; a solução obtida está em pH ácido. Esta solução estoque é diluída através da adição da mesma na quantidade dese- jada (para a obtenção da concentração final desejada) ou uma parte subs- tancial da mesma, de água contendo sal tal como NaCI, vantajosamente em solução salina fisiológica (NaCL 9 g/L) tudo de uma vez ou em várias partes com neutralização concomitante ou subsequente (pH 7,3 até 7,4). A solução estoque é neutralizada com uma base tal como NaOH. Esta soiução de ad- juvante em pH fisiológico é usada como está para a mistura com a composi- ção ímunogênica ou com a vacina, que pode ser especialmente armazenada na forma seca por congelamento, líquida ou congelada, A concentração polimérica na composição final de vacina pode ser de aproximadamente 0,01% até aproximadamente 1,5% p/v. A composi- ção final de vacina pode ser de aproximadamente 0,05 até aproximadamen- te 1% p/v. A composição final de vacina pode ser de aproximadamente 0,1 até aproximadamente 0,4% p/v. A vacina ou a composição Ímunogênica ou imunológica recom- binante inativada ou atenuada ou de subunidade também pode ser formula- da na forma de uma emulsão de óleo-em-água. A emulsão de óleo-em-água pode ser baseada, por exemplo, no óleo de parafina leve líquido (do tipo da European Pharmacopea); no óleo isoprenóide tal como escalano, escaleno, EICOSANE® ou tetratetracontano; no óleo resultante da oligomerização de alceno(s), por exemplo, isobuteno ou deceno; ésteres de ácidos ou de álco- ois contendo um grupo alquila linear, tais como óleos vegetais, oleato de etila, di(caprilato/caprato) de propileno glicol, tri(caprilato/caprato) de glicerila ou dioleato de propileno glicol; ésteres de ácidos ou álcoois graxos ramifica- dos, por exemplo, ésteres do ácido isoesteárico. O óleo é vantajosamente utilizado em combinação com emulsificantes para formar a emulsão. Os e- mulsificantes podem ser tensoativos não iônicos, tais como ésteres de sorbi- tano, manida (por exemplo, oleato de anidromanitoi), glicerol, poliglicerol, propileno glicol e ácido oléico, isoesteárico, ricinoléico ou hidroxiesteárico, que são opcionalmente blocos co-poiiméricos etoxilados e de polioxipropile- no-polioxietileno, tais como os produtos Pluronic®, por exemplo, L121. Em um exemplo não iimitante específico, o óleo é fornecido em uma quantidade entre aproximadamente 1 e aproximadamente 60%. O óleo pode estar em uma quantidade entre aproximadamente 5 e aproximadamente 30%. O adju- vante pode ser uma mistura de emulsificante(s), agente formador de micelas e óleo tal como o que está disponível sob o nome Provax® (IDEC Pharma- ceuticals, São Diego, CA). O plasmídeo de DNA, o vetor inativado ou atenuado ou de su- bunidade ou de expressão, por exemplo, viral, de acordo com esta descrição pode ser preservado e/ou conservado e armazenado na forma líquida, por exemplo, à baixa temperatura, por exemplo, a aproximadamente 5°C ou na forma liofilizada ou seca por congelamento, por exemplo, na presença de um estabilizante. A secagem por congelamento pode ser feita de acordo com procedimentos de secagem por congelamento padronizados bem conheci- dos. Os estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis podem ser SPGA (sa- carose fosfato glutamato albumina) (Bovarnik e outros, J. Bacteríology 59:509,1950), carboidratos (por exemplo, sorbitol, manitol, lactose, sacaro- se, glicose, dextran, trehalose), glutamato de sódio (Tsvetkov T e outros, Cryojb/o/ogy 20(3):318-23,1983; Israeli Ee outros, Cryobíology 30(5):519-23, 1993), proteínas tal como a peptona, a albumina ou a caseína, agentes que contêm proteínas tal como leite desnatado (Mills CK e outros, Cryobíology 25(2):148-52, 1988; Wolff E e outros, Cryobíology 27(5):569-75, 1990) e tampões (por exemplo, tampão fosfato, tampão fosfato de metal alcalino).
Um adjuvante e/ou um veículo ou um excipiente pode ser utilizado para tor- nar solúvel as preparações secas por congelamento.
Um outro aspecto da presente invenção é o uso de plasmídeos que contêm e que expressam in vivo em um bovino pelo menos um imunó- geno de um agente patogênico bovino, por exemplo, BRSV, bPI-3, BHV-1 ou BVDV, para a preparação de uma vacina de DNA, por exemplo, para uso em um método de inicração-reforço da invenção e/ou para um kit para um méto- do de iniciação-reforço da invenção e/ou para induzir uma resposta imunoló- gica em um bovino jovem, por exemplo, um bezerro, que possui ou pode possuir anticorpos maternos contra o agente patogênico bovino.
Vantajosamente, a vacina de DNA deve ser administrada (e é administrada) ao animal jovem (bovino) desde o nascimento até e incíuindo aproximadamente 12 semanas de idade, tal como desde o nascimento até e incluindo 6 semanas de idade, por exemplo, desde o nascimento até e inclu- indo 4 semanas de idade, por exemplo, desde o nascimento até e incluindo 3 semanas de idade.
Mais vantajosamente, pretende-se que a vacina de DNA induza (e induz) uma resposta imunológica de iniciação específica para o imunóge- no expresso ou uma "resposta imunológica induzida peio DNA" (tal resposta de células T de memória de gama-interferon+ (IFNr+) específica para o imu- nógeno expresso), que pode sofrer reforço (pode ser reforçada), por uma administração subsequente (reforço) de uma vacina ou um vetor recombi- nante ou modificado inativado ou atenuado ou de subunidade (por exemplo, viral, bacteriano), vacina ou composição imunogênica que compreende um vetor, por exemplo, vetor viral, tal como um poxvírus recombinante ativo, que contém e que expressa in vivo pelo menos o(s) mesmo(s) imunógeno(s), antígeno(s) ou epítopo(s) que é(são) expresso(s) pela vacina de DNA. A administração de reforço pode ser feita desde aproximada- mente 2 semanas até aproximadamente 5 meses após a administração de iniciação, tal como desde aproximadamente 3 até aproximadamente 6 se- manas após a administração de iniciação e vantajosamente aproximada- mente 4 semanas após a administração de iniciação. Uma segunda adminis- tração da vacina ou composição imunológica ou imunogênica de reforço po- de ocorrer, por exemplo, quando o bezerro for transferido para uma unidade de abate.
Em um outro aspecto, a presente invenção envolve o uso de um agente patogênico bovino (que inclui um fragmento do mesmo), tal como BRSV, bPI-3, BHV-1 ou BVDV, para a preparação de uma vacina de inicia- ção baseada em plasmídeos (vacina ou composição imunogênica ou imuno- lógica de DNA) que contêm e que expressam in vivo em um bovino (por e- xemplo, vaca, touro, bezerro, gado) uma molécula de ácido nucléico que codifica pelo menos um imunógeno, um antígeno ou um epítopo do agente patogênico e para a preparação de uma segunda vacina (uma vacina ou uma composição imunogênica ou imunológica de reforço) que compreende o agente patogênico em uma forma inativada ou em uma forma atenuada ou em que a segunda vacina compreende uma subunidade (proteína, antígeno, imunógeno ou epítopo isolado) do agente patogênico ou em que a segunda vacina compreende um vetor de expressão recombinante ou modificado (por exemplo, um vetor viral ou bacteriano ou de levedura), tal como um poxvírus, um adenovírus ou um herpesvírus recombinante ativo, vantajosamente um poxvírus, que contém e expressa in vivo a(s) molécula(s) de ácido nucléico que codifica(m) pelo menos o{s) imunógeno(s), o(s) antígeno(s) ou o(s) epí- topo(s) do agente patogênico, incluindo tal(is) imunógeno(s), antígeno(s) ou epítopo(s) expresso(s) pela vacina baseada em plasmídeos. Aqui, "o uso de um agente patogênico" abrange o uso do agente patogênico para clonar a seqüência de nucleotídeos que codifica o imunógeno, o antígeno ou o epíto- po, assim como o uso do agente patogênico para isolar do mesmo o imunó- geno, o antígeno ou o epítopo (por exemplo, para a subunidade ou para a seqüência do mesmo para atingir uma seqüência codificadora, portanto, pa- ra a preparação do plasmídeo de DNA ou do vetor de expressão recombi- nante ou modificado), assim como o uso do agente patogênico para preparar a vacina ou a composição imunogênica inativada ou atenuada. Assim, um outro aspecto da presente invenção é o uso de uma seqüência de nucleotí- deos que codifica pelo menos um imunógeno, um antígeno ou um epítopo de um agente patogênico bovino, tal como BRSV, bPI-3, BHV-1 ou BVDV, para a preparação da vacina de iniciação baseada no plasmídeo (vacina ou composição imunogênica ou imunológica de DNA) e/ou a segunda vacina (ou composição imunogênica ou imunológica) que contém o vetor de ex- pressão modificado ou recombinante. A vacina ou a composição imunogêni- ca de subunidade, inativada ou atenuada contém vantajosamente o imunó- geno, o antígeno ou o epítopo expresso pela vacina ou pela composição i- munogênica ou imunológica de DNA; e, o vetor de expressão recombinante ou modificado expressa vantajosamente o imunógeno, o antígeno ou o epí- topo expresso pela vacina ou pela composição imunogênica ou imunológica de DNA. Pretende-se que a vacina baseada em plasmídeos seja administra- da primeiro a um bovino (tal como a um bezerro jovem que possui ou pode possuir anticorpos maternos contra o agente patogênico bovino) e pretende- se que a vacina de vetor de expressão inativada ou atenuada ou de subuni- dade ou recombinante ou modificada seja administrada após a vacina de DNA ao mesmo bovino, para reforçar a resposta imunológica contra o imu- nógeno, o antígeno ou o epítopo (por exemplo, no momento que a vacina de vetor de expressão inativada ou atenuada ou de subunidade ou recombinan- te ou modificada for administrada, o bezerro desenvolveu uma resposta imu- nológica de iniciação específica contra o(s) imunógeno(s), o(s) antígeno(s) ou o(s) epítopo(s), de forma que uma resposta imunológica da vacina de DNA específica ou uma resposta imunológica "induzida pela vacina de DNA" contra o(s) imunógeno(s), o(s) antígeno(s) ou o(s) epítopo(s), por exemplo, a resposta de células T de memória de IFNt+ específica para o imunógeno, o antígeno ou o epítopo expresso; e a vacina de vetor de expressão inativada ou atenuada ou de subunidade ou recombinante ou modificada induza uma resposta imunológica contra o agente patogênico bovino incluindo contra pelo menos um do(s) imunógeno(s), antígeno(s) ou epítopo(s) expresso(s) pela vacina de DNA).
Conseqüentemente, um outro aspecto da presente invenção é o uso de um agente patogênico bovino, tal como BRSV, bPI-3, BHV-1 ou BVDV, para preparar uma vacina ou composição imunogênica inativada ou atenuada ou de subunidade para vacinar ou imunizar um bovino contra o agente patogênico, em que o bovino (por exemplo, um bezerro jovem que possui ou pode possuir anticorpos maternos contra o agente patogênico bo- vino) foi previamente imunizado com uma vacina de DNA que expressa in vivo pelo menos um imunógeno, um antígeno ou um epítopo do mesmo a- gente patogênico e desenvolveu uma resposta imunológica de iniciação es- pecífica contra o(s) imunógeno(s), antígeno(s) ou epítopo(s), tal como a res- posta imunológica "induzida pela vacina de DNA", mais vantajosamente a resposta celular de células T de memória de IFNy+ específica para o imunó- geno, o antígeno ou o epítopo expresso.
Similarmente, um outro aspecto da presente invenção é o uso de um vetor de expressão recombinante ou modificado, por exemplo, um vetor viral, tal como um vetor de poxvírus, que compreende e expressa in vivo pe- lo menos uma seqüència de nucleotídeos que codifica pelo menos um imu- nógeno, um antígeno ou um epítopo de um agente patogênico bovino, tal como BRSV, bPI-3, BHV-1 ou BVDV, para preparar uma vacina ou composi- ção imunogênica de vetor de expressão recombinante ou modificado (por exemplo, um vetor recombinante ou modificado ativo) para vacinar um bovi- no contra o agente patogênico, em que o bovino (tal como um bezerro jovem que possui ou pode possuir anticorpos maternos contra o agente patogênico bovino) foi previamente imunizado com uma vacina de DNA que expressa in vivo pelo menos o(s) imunógeno(s), antígeno(s) ou epítopo(s) e desenvolveu uma resposta imunológica de iniciação contra o(s) imunógeno(s), antíge- no(s) ou epítopo(s), tal como a resposta imunológica "induzida pela vacina de DNA", mais vantajosamente, a resposta celular de células T de memória de IFNy+ específica para o imunógeno, o antígeno ou o epítopo expresso. A vacina de DNA é vantajosamente administrada ao animal jo- vem (bovino) desde o nascimento até e incluindo aproximadamente 12 se- manas de idade, tal como desde o nascimento até e incluindo aproximada- mente 6 semanas de idade, por exemplo, desde o nascimento até e incluin- do 4 semanas de idade, por exemplo, desde o nascimento até e incluindo 3 semanas de idade. Pretende-se que vacina ou a composição imunogênica de vetor de expressão inativada ou atenuada ou de subunidade ou recombi- nante ou modificada seja administrada desde aproximadamente 2 semanas até aproximadamente 5 meses após a administração de iniciação, tal como desde aproximadamente 3 até 6 semanas depois e vantajosamente aproxi- madamertte 4 semanas depois. Uma segunda administração da vacina ou da composição imunológica ou imunogênica de reforço pode ocorrer, tal co- mo quando o bezerro é transferido para uma unidade de abate. A vacina ou a composição imunogênica de vetor de expressão inativada ou recombinante ou modificada é vantajosamente empregada na prática da invenção. A vacina ou a composição imunogênica de vetor de ex- pressão inativada ou atenuada ou de subunidade ou recombinante ou modi- ficada pode ser como descrito aqui e pode vantajosamente compreender um adjuvante. Para evitar repetição, é geralmente mencionado que a discussão em outro momento nesta descrição pode ser aplicada aos aspectos de "uso" da invenção contidos aqui. O método e os usos da invenção podem combinar a imunização ou a vacinação contra mais de um agente patogênico bovino e os métodos e os usos da invenção podem abranger qualquer imunização ou vacinação de combinação contra 2, 3 ou 4 dos agentes patogênicos particulares mencio- nados aqui. Isto pode ser realizado através da administração concomitante ou sucessiva das vacinas ou da composição imunogênica ou imunológica contra os agentes patogênicos. Isto pode envolver ainda misturas dos imu- nógenos ou das vacinas da composição imunogênica ou imunológica cor- respondente. Isto pode ainda envolver plasmídeos ou vetores que compre- endem e que expressam moléculas de ácido nucléico que codificam os imu- nógenos, os antígenos ou os epítopos de dois ou mais ou vários agentes patogênicos. Conseqüentemente, um outro aspecto da invenção é constituí- do de vacinas ou composições imunogênicas ou imunológicas multivalentes de DNA.
Ainda um outro aspecto da invenção é um kit que contém uma primeira vacina ou composição imunogênica ou imunológica que compreen- de a vacina ou a composição imunogênica ou imunológica de DNA de acor- do com a invenção e uma segunda vacina ou composição imunogênica ou imunológica que compreende uma vacina ou composição imunogênica ou imunológica inativada, ativa atenuada, de subunidade, vantajosamente inati- vada ou uma vacina ou composição imunogênica ou imunológica de vetor de expressão in vivo recombinante ou modificada, em que a subunidade con- tém um imunógeno ou um antígeno ou um epítopo expresso pela primeira vacina e a vacina ou a composição imunogênica ou imunológica de vetor modificada expressa um imunógeno, um antígeno ou um epítopo expresso pela primeira vacina e a vacina ou a composição imunogênica ou imunológi- ca atenuada expressa ou apresenta um imunógeno, um antígeno ou um epí- topo expresso pela primeira vacina e a vacina ou a composição imunogênica ou imunológica inativada apresenta um imunógeno, um antígeno ou um epí- topo expresso pela primeira vacina. A(s) vacina(s) ou a(s) composição(ões) está(ão) vantajosamente em recipientes separados. Os recipientes separa- dos podem ser embalados juntos. O kit pode conter instruções para a admi- nistração de iniciação-reforço de acordo com a invenção. A quantidade de DNA utilizada nas vacinas e nas composições de acordo com a presente invenção está vantajosamente entre aproxima- damente 1 pg e aproximadamente 1000 pg e tal como entre aproximada- mente 50 pg e aproximadamente 500 pg, para um certo plasmídeo. As pes- soas versadas na técnica possuem a competência necessária para definir precisamente a dose eficiente de DNA que deve ser utilizada para cada pro- tocolo de vacinação, partindo desta descrição e do conhecimento na técnica.
Os volumes de dose podem estar entre aproximadamente 0,2 e aproximadamente 5 mL, vantajosamente entre aproximadamente 1 e apro- ximadamente 3 mL.
As vacinas e as composições de DNA de acordo com a invenção podem ser administradas, no contexto do método de vacinação da invenção, através de várias vias de administração propostas na técnica para a vacina- ção de polinucleotídeos e através de técnicas conhecidas de administração.
De acordo com um modo da invenção, as vacinas ou as compo- sições de DNA de acordo com a invenção são administradas através da via intramuscular, da via subcutânea ou com o auxílio de um injetor sem agulha tal como o Biojector 2000 (Bioject inc., Portland OR, EUA), vantajosamente através da via intradermal. Para maiores detalhes sobre a administração a um bovino através da via intradermal utilizando um injetor sem agulha, pode- se fazer referência à US-A-6.451.770.
Para a administração de reforço com uma vacina ou composição imunogênica ou imunológica de vetor de expressão in vivo recombinante ou modificada (por exemplo, um vírus recombinante tal como uma composição de herpesvírus, adenovírus ou poxvírus recombinante, vantajosamente uma composição de poxvírus recombinante, tal como uma composição de vírus vaccinia, avipox, canaripox, fowlpox recombinante, vantajosamente uma composição de ALVAC, TROVAC ou NYCAC), a via de administração pode ser intradermal (ID), intramuscular (IM), subcutânea (SC), intravenosa, oral ou nasal. Esta administração pode ser feita com uma seringa e uma agulha ou com um injetor sem agulha. A dosagem é vantajosamente de aproxima- damente 103 ufp até aproximadamente 109 ufp por vetor recombinante.
Quando o vetor for um canaripoxvírus, a dosagem é vantajosamente de a- proximadamente 105 ufp até aproximadamente 109 ufp, por exemplo, de a- proximadamente 106 ufp até aproximadamente 107 ufp. O volume de doses do injetor sem agulha podería estar entre aproximadamente 0,1 mL e apro- ximadamente 0,5 mL, por exemplo, aproximadamente 0,25 mL. Para a inje- ção com uma seringa e uma agulha, os volumes vantajosamente podem ser de aproximadamente 0,5 até aproximadamente 5 mL, por exemplo, aproxi- madamente 1 até aproximadamente 3 mL. A dosagem pode ser como men- cionado aqui.
Para a administração de reforço com uma vacina ou composi- ções imunogênicas ou imunológicas inativadas, atenuadas ou de subunida- de, a via de administração pode ser intradermal (ID), intramuscular (IM), subcutânea (SC), intravenosa, oral ou nasal. Esta administração pode ser feita com uma seringa e uma agulha ou com um injetor sem agulha. O volu- me das doses do injetor sem agulha vantajosamente pode estar entre apro- ximadamente 0,1 mL e aproximadamente 0,5 mL, por exemplo, aproxima- damente 0,25 mL. Para a injeção com uma seringa e uma agulha, os volu- mes vantajosamente podem ser de aproximadamente 0,5 até aproximada- mente 5 mL, por exemplo, de aproximadamente 1 até aproximadamente 3 mL. A invenção será agora descrita e ilustrada adicionalmente atra- vés dos exemplos não limitantes a seguir.
EXEMPLOS
Para cada um dos agentes patogênicos considerados, cada ge- ne que codifica os antígenos principais (forma nativa e forma modificada) foi o objetivo de uma construção particular em um plasmídeo de expressão em eucariotos. As formas secretadas dos antígenos foram obtidas através da deleção dos fragmentos dos genes que codificam os domínios transmem- branas e citoplasmáticos. Em todos os casos, os domínios transmembranas das proteínas foram identificados com base nos perfis de hidropatia (em MacVetor 6.5) das seqüências de proteínas correspondentes.
Exemplo 1: Métodos de biologia molecular 1.1 Extração do DNA qenômico viral As suspensões virais foram tratadas com a proteinase K (100 mg/mL finais) na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS) (0,5% final) durante 2 horas a 37°C. O DNA viral foi então extraído com o auxílio de uma mistura de fenol/clorofórmio e então precipitado com dois volumes de etanol absoluto a -20°C durante 16 horas e então centrifugado a 10.000 g durante 15 minutos a 4°C. Os péletes de DNA foram secos e então coletados em um volume mínimo de água ultrapura esterilizada. 1.2 Isolamento do RNA qenômico viral O RNA genômico de cada vírus foi extraído utilizando a técnica de "tiocianato de guanidínio/fenol-clorofórmio" descrita por P. Chomczynski e N. Sacchi (Anal. Biochem. 1987.162.156-159). 1.3 Técnicas de biologia molecular Todas as construções de plasmídeos foram realizadas utilizando as técnicas de biologia molecular padronizadas descritas por Sambrook e outros (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2â Edição. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova York, 1989). Todos os frag- mentos de restrição utilizados para a presente invenção foram isolados com o auxílio do kit "Geneclean" (BIO101 Inc., La Jolla, CA). Para todos os cons- tructos, os fragmentos de DNA clonados, assim como as junções com o ve- tor de expressão, foram seqüenciados através do método de Sanger (Sam- brook e outros, 1989).
1.4 PCR e RT-PCR
Os oligonucleotídeos específicos aos genes ou aos fragmentos de genes clonados foram sintetizados, alguns dos quais contendo, em al- guns casos, em sua extremidade 5’, sítios de restrição que facilitam a clona- gem dos fragmentos amplificados. As reações de transcrição inversa (RT) e a reação em cadeia da polimerase (PCR) foram realizadas de acordo com técnicas padronizadas (Sambrook e outros, 1989). 1.5 Purificação de plasmídeos em grande escala A produção, nas escala de aproximadamente dez mg, de plas- mídeos purificados que entram nas composições vacinais foi realizada atra- vés do método de gradiente de cloreto de césio - brometo de etídio (Sam- brook e outros, 1989).
Exemplo 2: Constructos plasmideais básicos O plasmídeo de expressão eucariótica pVR1020 (C.J. Luke e outros J. of Infectíous Diseases, 1997,175, 95-97), derivado do plasmídeo pVR1012 (Figura N°1, Figura 1 e Exemplo 7 da WO-A-9803199), contém a fase codificadora da sequência sinal do ativador de plasminogênio de tecido humano (tPA).
Um plasmídeo pVR1020 é modificado através da digestão com BamHI-BglII e da inserção de uma seqüência que contém vários sítios de clonagem (BamHI, Notl, EcoRI, Xbal, Pmll, Pstl, Bglll) e resultante do pare- amento dos oligonucleotídeos a seguir: PB326 (40 mer)(SEQ ID N° 1) 5'GATCTGCAGCACGTGTCTAGAGGATATCGAATTCGCGGCC 3' e PB329 (40 mer) (SEQ ID NQ 2) 5'GATCCGCGGCCGCGAATTCGATATCCTCTAGACACGTGCT 3'. O vetor obtido dessa forma, que possui um tamanho de aproxi- madamente 5105 pares de bases (ou pb), é chamado de pAB110 (Figura N° 2). 0 íntron II do gene da β-globina de coelhos é clonado no pCRIl (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) após a produção do fragmento de DNA cor- respondente através da PCR com o auxílio dos oligonucleotídeos a seguir: SB090 (20 mer) (SEQ ID N2 3) 5' TTGGGGACCCTTGATTGTTC 3' e SB091 (21 mer) (SEQ ID Na 4) 5' CTGTAGGAAAAAGAAGAAGGC 3' utilizando como molde o DNA genômico das células sangüíneas periféricas de coelhos. O plasmídeo resultante é denominado de pNS050. O plasmídeo de expressão pAB110 é modificado através da in- trodução da sequência do íntron II do gene da globina de coelho no sítio Sall situado a montante do ATG do peptídeo sinal do ativador de plasminogênio de tecido (tPA). A seqüência do íntron II do gene da globina de coelho é am- plificada através da reação em cadeia da polimerase (PCR) partindo do plasmídeo pNS050 utilizando o par de oligonucleotídeos: LF001 (30 mer) (SEQ ID N2 5) 5' CTCCATGTCGACTTGGGGACCCTTGATTGT 3’ e LF002 (30 mer) (SEQ ID N2 6) 5’ CTCCATGTCGACCTGTAGGAAAAAGAAGAA 3'. O produto da PCR (573 pares de bases ou pb) é digerido com Sall e clonado no plasmídeo pAB110 linearizado previamente com Sall, para gerar o plasmídeo pLF999 de aproximadamente 5678 pb.
Exemplo 3: Plasmídeos que codificamm as várias formas dos antíaenos do herpesvírus bovino do tipo 1 (BHV-1) Os fragmentos de DNA viral contendo os genes gB, gC e gD da cepa B901 do BHV-1 são isolados através da digestão do genoma viral com várias enzimas de restrição, separando os mesmo através de eletroforese em gel de agarose e da análise dos mesmos por Southern blotting com o auxílio de sondas que correspondem aos fragmentos dos genes gB, gC e gD da cepa ST do BHV-1 (Leung-Tack P. e outros, Virology, 1994, 199, 409- 421). A cepa Colorado do BHV-1 [Cooper] (ATCC número VR-864) também pode ser utilizada. Os fragmentos identificados dessa maneira são clonados no vetor pBluescript SK+ (Stratagene, La Jolla, CA, EUA) e ficam na origem das clonagens dos três genes no vetor de expressão pVR1012. 3.1 Plasmídeos que codificamm as várias formas do qB do BHV-1 3.1.1 pPB28Q: Gene qB (forma nativa) clonado no vetor pVR1012 Dois fragmentos Xhol-Xhol contendo as partes 5' e 3' do gene gB do BHV-1 são identificados por Southern blotting e clonados no vetor p- Bluescript SK+ (Stratagene, La Jolla, CA, EUA) previamente digerido com Xhol. Os plasmídeos obtidos dessa forma são denominados de pPB128 e pPB117, respectivamente. O plasmídeo pPB128, que contém o fragmento 5' do gene gB, é digerido com Notl e Xhol, gerando um fragmento de 1708 pb (fragmento A). O plasmídeo pPB117, que contém a parte 3' do gene gB, é dige- rido com Xhol e Stul, gerando um fragmento de 1345 pb. O último fragmento é clonado no vetor pBluescript KS+ (Stratagene, La Jolla, CA, EUA) previa- mente digerido com EcoRV e Xhol. O plasmídeo resultante é chamado de pPB279.0 plasmídeo pPB279 é então digerido com Xhol e BamHI, gerando um fragmento de DNA de 1413 pb (fragmento B).
Os fragmentos A e B são então clonados em um vetor pBlues- cript KS+ digerido com Notl e BamHI, gerando o plasmídeo pPB278 (apro- ximadamente 6063 pb) e permitindo a reconstituição do gene gB do BHV-1. O vetor pPB278 serve então como molde durante uma reação da PCR realizada com os oligonucleotídeos a seguir: PB234 (30 mer) (SEQID N- 7) 5' πβΤΌΟΑΟΑΤΘβΟϊβΟΤΟβΟββΟβθΤΟΟΤΘ 3' e PB235 (21 mer) (SEQ ID Ns 8) 5' GCAGGGCAGCGGCTAGCGCGG 3’. O produto da PCR (146 pb) é então digerido com as enzimas de restrição Sall e Nhel. O plasmídeo pPB278 é digerido com Nhel e BamHI. O fragmen- to de 2728 pb obtido dessa forma e o fragmento da PCR digerido previamen- te são ligados no vetor pVR1012 (Exemplo 2) previamente digerido com Sall e BamHI, gerando assim o plasmídeo pPB280, que possui um tamanho de aproximadamente 7742 pb. O gene gB do BHV-1 codifica uma proteína de 933 aminoácidos. 3.1.2 pPB281: gene qB (forma AÍTM-Cter]) clonado no vetor pVR1Q12 A forma truncada (deletada em relação aos seus domínios transmembrana (TM) e carbóxi-terminaI (Cter)) do gene gB do BHV-1 é obti- da através da ligação no plasmídeo pVR1012 (Exemplo 2) pré-digerido com Sall e BamHI, tanto um fragmento que possui um tamanho de 2234 pb obti- do após a digestão com Sall-Pvull do plasmídeo pPB280 (Exemplo 3.1.1) quanto um fragmento de 56 pb obtido através do pareamento dos oligonu- cleotídeos a seguir: PB511 (52 mer)(SEQ ID N2 9) 5'CTGCACGAGCTCCGGTTCTACGACATTGACCGCGTGGTCA AGACGGACTGAG 3' e PB512 (57 mer)(SEQ ID N210) 5'GATCCTCAGTCCGTCTTGACCACGCGGTCAATGTCGTAGA ACCGGAGCTCGTGCAG 3'. O plasmídeo gerado dessa forma possui um tamanho de apro- ximadamente 7154 pb e é chamado de pPB281. O gene gB truncado do BHV-1 codifica uma proteína de 759 aminoácidos. 3.1.3 pSB115: gene aB (forma tPA AÍTM-Cter)) clonado no vetor pAB 110 A forma tPA AjTM-Cter] do gene gB do BHV-1 é amplificada pela PCR partindo do molde pPB281 (Exemplo 3.1.2) e com o auxílio dos inicia- dores a seguir: SB221 (39 mer)(SEQ ID N-11) 5' AAAATTTCGATATCCGCCGCGGGGCGACCGGCGACAACG 3'e SB222 (33 mer) (SEQ ID NQ12) 5' GGAAGATCTTCAGTCCGTCTTGACCACGCGGTC 3' O produto da amplificação (2088 pb) é digerido com as enzimas EcoRV e Bglll e clonado no vetor pAB110 (Exemplo 2) previamente digerido com EcoRV e Bglll, gerando o plasmídeo pSB115, que possui um tamanho de aproximadamente 7154 pb. A forma tPA A[TM-Cter] do gene gB codifica uma glicoproteína de 729 aminoácidos, contendo o domínio extracelular da glicoproteína gB do BHV-1. 3.2. Plasmídeos que codificam as várias formas do qC do BHV-1 3.2.1 pPB264: gene qC (forma nativa) clonado no vetor pVR1012 Um fragmento BamHI-Hindlll de 3,5 kb contendo o gene gC completo do BHV-1 é identificado por Southern blotting e clonado no vetor pBluescript SK+. O plasmídeo obtido dessa forma é chamado de pPB287. O plasmídeo pPB287 é então digerido com Ncol-BssSI. Um fragmento de digestão que possui um tamanho de 1492 pb é obtido. É ligado com um fragmento sintétco de DNA obtido através do pareamento dos oligo- nucelotides a seguir: PB507 (37 mer) (SEQ ID NQ13) 5TCGTGCCTGCGGCGCAAGGCCCGGGCGCGCCTGTAGT 3' e PB508 (37 mer) (SEQ ID Νθ 14) 5’CTAGACTACAGGCGCGCCCGGGCXnGCGCCGCAGGC 3\ no plasmídeo pLitmus 28 (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA, EUA) pré-digerido com Ncol e Xbal, gerando o plasmídeo intermediário pPB290. O fragmento de 1554 pb derivado da digestão do pPB290 com Pstl e Xbal é clonado no vetor pVR1012 (Exemplo 2) previamente digerido com Pstl e Xbal, gerando assim o plasmídeo pPB264, que possui um tama- nho de aproximadamente 6427 pb. O gene gC do BHV-1 codifica uma prote- ína de 508 aminoácidos. 3.2.2 pPB292: gene qC (forma ΔίΤΜ-Cterl) clonado no vetor PVR1012 A forma truncada do gene gC do BHV-1 é obtida através da liga- ção dos três fragmentos de DNA a seguir no vetor pVR1012 (Exemplo 2) previamente digerido com Pstl e Xbal: (a) um fragmento de 1035 pb derivado da digestão do pPB264 (Exemplo 3.2.1) com Pstl e Xhol, (b) um fragmento de 350 pb derivado da digestão do pPB264 com Xhol e Bani e (c) um fragmento sintético de 43 pb resultante do pareamento dos oligonucleotídeos PB513 e PB514.
Estes oligonucleotídeos são os seguintes: PB513 (43 mer) (SEQ ID NQ15) 5'GCACCGCTGCCCGAGTTCTCCGCGACCGCCACGTAC- GACTAGT 3' e PB514 (43 mer) (SEQ ID Ne 16) 5' CTAGACTAGTCGTACGTGGCGGTCGCGGAGAACTCGGG- CAGCG 3'. O plasmídeo que possui um tamanho de aproximadamente 6305 pb obtido dessa forma é chamado de pPB292. O gene gC truncado do BHV- 1 codifica uma proteína de 466 aminoácidos. 3.2.3 pSB116: gene aC (forma tPA ΔΓΤΜ-Cterl) clonado no vetor pAB110 A forma tPA A[TM-Cter] do gene gC do BHV-1 é amplificada pela PCR partindo do molde pPB292 (Exemplo 3.2.2) e com o auxílio dos inicia- dores a seguir: SB223 (39 mer) (SEQ ID N-17) 5'AAAATTTCGATATCCCGGCGGGGGCTCGCCGAGGAGGCG 3' e SB224 (32 mer) (SEQ ID Ne 18) 5' GGAAGATCTCTAGTCGTACGTGGCGGTCGCGG 3' O produto da amplificação (1362 pb) é digerido com as enzimas EcoRV e Bglll e clonado no vetor pAB110 (Exemplo 2) previamente digerido com EcoRV e Bglll, gerando o plasmídeo pSB116, que possui um tamanho de aproximadamente 6404 pb. A forma tPA A[TM-Cter] do gene gC codifica uma glicoproteína de 479 aminoácidos, contendo o domínio extraceluiar da glicoproteína GC doBHV-1. 3.3 Plasmídeos que codificam as várias formas de qD do BHV-1 3.3.1 pPB148: aD aene (forma nativa) clonado no vetor pVR1012 Um fragmento Xhol-Xhol de 5 kb contendo o gene gD do BHV-1 é identificado por Southern blotting e clonado no vetor pBluescript SK+ pré- digerido com Xhol, gerando o plasmídeo pPB147.
Um fragmento de 325 pb derivado da digestão do pPB147 com Ndel e BsrBI e um fragmento de 943 pb derivado da digestão do pPB147 com Ndel e Styl são então ligados no vetor pVR1012 (Exemplo 2) pré- digerido com EcoRV e Xbal, gerando assim o plasmídeo pPB148, que pos- sui um tamanho de aproximadamente 6171 pb. O gene gD do BHV-1 codifi- ca uma proteína de 417 aminoácidos. 3.3.2 pPB284: qD gene (forma A[TM-Cter1) clonado no vetor pVR1Q12 O gene gD truncado do BHV-1 é obtido partindo de um fragmen- to obtido após a amplificação pela PCR realizada no DNA genômico da cepa B901 do vírus BHV-1 previamente digerido com Pstl e Xbal e com o auxílio do par de iniciadores a seguir: PB497 (33 mer) (SEQ ID Na 19) 5' TTTCTGCAGATGCAAGGGCCGACATTGGCCGTG 3' e PB498 (31 mer) (SEQ ID N5 20) 5' TTTCTAGATTAGGGCGTAGCGGGGGCGGGCG 3'.
Este fragmento da PCR é então clonado no plasmídeo pVR1012 (Exemplo 2) previamente digerido com Pstl e Xbal, gerando o plasmídeo pPB284, que possui um tamanho de aproximadamente 5943 pb. O gene gD truncado do BHV-1 codifica uma proteína de 355 aminoácidos. 3.3.3 pSB117: qD gene (forma tPA AfTM-CterP clonado no vetor pAB1 10 A forma tPA AfTM-Cter] do gene gD do BHV-1 é amplificada pela PCR partindo do molde pPB284 (Exemplo 3.3.2) e com o auxílio dos inicia- dores a seguir: SB225 (39 mer) (SEQ ID NQ 21) 5' AAAATTTCGATATCCCCCGCGCCGCGGGTGACGGTATAC 3'e SB226 (33 mer) (SEQ ID Na 22) 5' GGAAGATCTTTAGGGCGTAGCGGGGGCGGGCGG 3'. O produto da amplificação (1029 pb) é digerido com as enzimas EcoRV e Bglll e clonado no vetor pAB110 (Exemplo 2) previamente digerido com EcoRV e Bglll, gerando o plasmídeo pSB117, que possui um tamanho de aproximadamente 6071 pb. A forma tPA A[TM-Cter] do gene gD codifica uma glicoproteína de 368 aminoácidos, contendo o domínio extraceluíar da gíicoproteína gD do BHV-1.
Exemplo 4: Plasmídeos que codificam as várias formas dos antíqenos do vírus sincicial respiratório bovino (BRSV) Os genes que codificam os antígenos F e G do vírus BRSV são obtidos através da RT-PCR partindo do RNA viral da cepa Snook (Thomas e outros Research em Vet. Science, 1982, 33, 170-182). A cepa BRSV A 51908 (ATCC número VR-794) também pode ser utilizada.
4.1 Plasmídeos que codificam as várias formas do BRSV-F 4.1.1 pSB107: aene F (forma nativa) clonado no vetor pVR1012 O gene F da cepa Snook do BRSV é amplificado através da RT- PCR utilizando o RNA viral como molde e com o auxílio dos iniciadores a seguir: SB210 (34 mer) (SEQID N- 23) 5' AAATTTTCTGCAGATGGCGACAACAGCCATGAGG 3' e SB211 (35 mer) (SEQ ID Νθ 24) 5’ TTAAGGATCCTCATTTACTAAAGGAAAGATTGTTG 3'. O produto da amplificação, que possui um tamanho de 1739 pb, é digerido com as enzimas Pstl e BamFII e clonado no vetor pVR1012 (E- xemplo 2) previamente digerido com Pstl e BamHI, gerando assim o plasmí- deo pSB107, que possui um tamanho de aproximadamente 6583 pb. O gene F do vírus BRSV codifica uma proteína de 574 aminoá- cidos. 4.1.2 pSB1Q8: gene F (forma AÍTM-Cterl) clonado no vetor pVR1012 A forma truncada do gene F da cepa Snook do BRSV é amplifi- cada através da RT-PCR utilizando o RNA viral como molde e com o auxílio dos iniciadores a seguir: SB210 (SEQ ID N°23)e SB212 (39 mer) (SEQ ID NQ 25) 5' AATTTTGGATCCTCATGTGGTGGATTTTCCTACATCTAC 3'. 0 produto da amplificação (1581 pb) é digerido com as enzimas Pstl e BamHI e clonado no vetor pVR1012 (Exemplo 2) previamente digerido com Pstl e BamHI, gerando o plasmídeo pSB108, que possui um tamanho de aproximadamente 6430 pb. A forma truncada do gene F codifica uma glicoproteína de 523 aminoácidos, contendo o domínio extracelular da glicoproteína F do BRSV. 4.1.3 pSB114: gene F (forma tPA AfTM-Cterl) clonado no vetor pAB110 A forma tPA A[TM-Cter] do gene F da cepa Snook do BRSV é amplificado através da RT-PCR utilizando o RNA viral como molde e com o auxílio dos iniciadores a seguir: SB212 (SEQ ID N° 25) e SB220 (38 mer) (SEQ ID Na 26) 5' AAAATTCACGTGAACATAACAGAAGAATmATCAATC 3’. O produto da amplificação (1516 pb) é digerido com as enzimas Pmll e Bglli e clonado no vetor pAB110 (Exemplo 2) previamente digerido com Pmll e Bglli, gerando o plasmídeo pSB114, que possui um tamanho de aproximadamente 6572 pb. A forma tPA A[TM-Cter] do gene F codifica uma glicoproteína de 535 aminoácidos, contendo o domínio extracelular da glicoproteína F do BRSV. 4.1.4 pPB449: gene F (forma de deleção grande AfTM-Cterl) clonado no ve- tor oVR1012 A forma truncada do gene F da cepa Snook do BRSV é amplifi- cada através da RT-PCR utilizando o RNA viral como molde e com o auxílio dos iniciadores a seguir: SB210 (SEQ ID N2 23) e FC129 (39 mer) (SEQ ID Ne 57) 5' ΑΑΓΠ7 GG AT CCT CAG ATT CCACGATTTTTATT AG AAGC 3'. O produto da amplificação (1305 pb) é digerido com as enzimas Pstl e BamHI e clonado no vetor pVR1012 (Exemplo 2) previamente digerido com Pstl e BamHI, gerando o plasmídeo pPB449, que possui um tamanho de aproximadamente 6150 pb. A forma truncada do gene F codifica uma glicoproteína de 431 aminoácidos, contendo o domínio extracelular da glicoproteína F do BRSV.
4.2 Plasmídeos que codificam as várias formas do BRSV-G
No caso da proteína G do BRSV (glicoproteína do tipo II), a se- qüência sinal e a seqüência transmembrana são indistinguíveis, requerendo a adição de uma seqüência sinal a montante da seqüência que corresponde ao domínio extracelular durante a deleção do domínio transmembrana. O plasmídeo pAB110 (Exemplo 2) é utilizado para a construção dos plasmídeos contendo as formas truncadas do gene que codifica a prote- ína G do BRSV. 4.2.1 pSB109: gene G (forma nativa) clonado no vetor pVR1012 O gene G da cepa Snook do BRSV é amplificado através da RT- PCR utilizando o RNA viral como molde e com o auxílio dos iniciadores a seguir: SB213 (32 mer) (SEQID N9 27) 5' ACGCGTCGACATGTCCAACCATACCCATCATC 3' e SB214 (38 mer) (SEQ ID N5 28) 5' TTAAAAT CTAG ATTAG AT CTGTGTAGTT G ATT G ATTT G 3'. O produto da amplificação (784 pb) é digerido com as enzimas Sall e Xbal e clonado no vetor pVR1012 (Exemplo 2) previamente digerido com Sall e Xbal, gerando o plasmídeo pSB109, que possui um tamanho de aproximadamente 5661 pb. O gene G do BRSV codifica uma glicoproteína de 257 aminoáci- dos. 4.2.2 pSB110: gene G (forma tPA AfTM-Cterl) clonado no vetor pAB110 A forma truncada do gene G da cepa Snook do BRSV é amplifi- cada através da RT-PCR utilizando o RNA viral como molde e com o auxílio dos iniciadores a seguir: SB215 (33 mer) (SEQ ID N- 29) 5' TTTTAAGGATCCGCTAAAGCCAAGCCCACATCC 3’ e SB216 (33 mer) (SEQ !DN930) 5' nAAAATCTAGATTAGATCTGTGTAGTTGATTG 3'. 0 produto da amplificação (666 pb) é digerido com as enzimas BamHI e Xbal e clonado no vetor pAB110 (Exemplo 2) previamente digerido com BamHI e Xbal, gerando o plasmídeo pSB110, que possui um tamanho de aproximadamente 5660 pb. A forma tPA A[TM-Cter] do gene G do vírus BRSV codifica uma glicoproteína de 218 aminoácidos, contendo o domínio extracelular da glico- proteína G, mas precedida pela sequência sinal do ativador de plasminogê- nio de tecido. 4.3 pFC123: gene N fforma nativa) clonado no vetor PVR1012 O gene N do BRSV é amplificado através da RT-PCR utilizando o RNA viral como molde e com o auxílio dos iniciadores a seguir: FC130 (34 mer) (SEQID N° 58) 5’ AAATmGTCGACATGGCTCTTAGCAAGGTCAAA 3' e FC131 (35 mer) (SEQ ID N^59) 5’ TTAAGGATCCTCACAGTTCCACATCATTGTCTTTG 3’. O produto da amplificação, que possui um tamanho de 1199 pb, é digerido com as enzimas Sall e BamHI e clonado no vetor pVR1012 (E- xemplo 2) previamente digerido com Sall e BamHI, gerando assim o plasmí- deo pFC123, que possui um tamanho de aproximadamente 6057 pb. O gene N do vírus BRSV codifica uma proteína de nucleocapsí- deo de 391 aminoácidos.
Exemplo 5: Plasmídeos que codificam as várias formas dos antíqenos do vírus da diarréia viral bovina do tipo 1 (BVD-1) Os genes que codificam os antígenos E0 (glicoproteína de 48 kDa ou gp48) e E2 (gp53) dos vírus BVDV do tipo 1 são obtidos através da RT-PCR partindo do RNA viral da cepa Qsloss (L. De Moerlooze e outros J.
Gen. Virol. 1993,74,1433-1438; A. Renard e outros, DNA, 1985,4,439-438;
A. Renard e outros Ann. Rech. Vet., 1987, 18, 121-125). As cepas NADL (ATCC VR-534) ou Nova York (ATCC VR-524) também podem ser utiliza- das. 5.1 Plasmídeos que codificam as várias formas de EQ da cepa Qsloss do BVDV do tipo 1 5.1.1 pLF1028: gene EO (forma nativa) clonado no vetor PVR1012 O DNA complementar (cDNA) do gene EO da cepa Osloss é sin- tetizado partindo do RNA viral correspondente com o auxílio do iniciador LF051 e amplificado através da reação da PCR com o auxílio do par de oli- gonucleotídeos a seguir: LF050 (36 mer) (SEQ ID Ne 31) 5' CATACCGTCGACATGAAGAAACTAGAGAAAGCCCTG 3' e LF051 (40 mer) (SEQ ID Ne 32) 5' CATACCGGATCCTCAGGCTGCATATGCCCCAAACCATGTC 3'. O fragmento de DNA de aproximadamente 765 pb obtido através da digestão do produto da PCR com Sall e BamHI é ligado com um fragmen- to de 4866 pb resultante da digestão do pVR1012 (Exemplo 2) com Sall e BamHI com a finalidade de gerar o plasmideo pLF1028 (aproximadamente 5636 pb). O gene EO da cepa Osloss do BVDV-1 codifica uma proteína de 252 aminoácidos.
Um códon ATG é introduzido na seqüência do oligonucleotídeo LF050 de forma a permitir o início da tradução do polipeptídeo EO corres- pondente. 5.1.2 pLF1029: gene EO, forma (β-alobina tPA-EO) clonada no vetor pLF999. O gene EO é sintetizado através de uma reação da PCR partindo do molde de pLF1028 (Exemplo 5.1.1) e com o auxílio do par de oligonucleo- tídeos a seguir: LF052 (39 mer) (SEQ ID N° 33) 5' CATGACGCGGCCGCTATGAAGAAACTAGAGAAAGCCCTG 3' e LF053 (40 mer) (SEQ ID Ns 34) 5’ CATGACAGATCTTTAGGCTGCATATGCCCCAAACCATGTC 3’. O fragmento de DNA de aproximadamente 770 pb obtido através da digestão do produto da PCR com Notl e Bgíll é ligado com um fragmento de 5642 pb resultante da digestão de pLF999 (Exemplo 2) com Notl e Bglll com a finalidade de gerar o plasmídeo pl_F1029 (aproximadamente 6417 pb). O gene EO da cepa Osloss do BVDV-1 modificado dessa forma (β-globina tPA-EO) codifica uma proteína de 283 aminoácidos. 5.2 Plasmídeos que codificam as várias formas de E2 da cepa Osloss do BVDV do tipo 1 5.2.1 pLF102Q: gene E2 (forma nativa) clonado no vetor pVR1012 O cDNA do gene E2 da cepa Osloss é sintetizado partindo do RNA viral correspondente com o auxílio do iniciador LF040 e amplificado através de uma reação da PCR com o auxílio do par de oligonucleotídeos a seguir: LF039 (33 mer)(SEQIDNe35) 5' CATGACGTCGACATGACGACTACTGCATTCCTG 3’ e LF040 (36 mer)(SEQ ID N° 36) 5' CATGACAGATCTTCAACGTCCCGAGGTCATTTGTTC 3'. O fragmento de DNA de 1235 pb obtido através da digestão do produto da PCR com Sall e Bglll é ligado com um fragmento de 4860 pb re- sultante da digestão de pVR1012 (Exemplo 2) com Sall e Bglll com a finali- dade de gerar o plasmídeo pLF1020 (aproximadamente 6100 pb). O gene E2 da cepa Osloss do BVDV-1 codifica uma proteína de 409 aminoácidos.
Um códon ATG é introduzido na seqüência do oligonucleotídeo LF039 de forma a permitir o início da tradução do polipeptídeo E2 recombi- nante correspondente. 5.2.2 pLF1021: E2 gene, forma (β-qlobin tPA-E2.AfTM+CterP clonado no vetor pl_F999. Ο E2 gene deletado para sua transmembrana e domínio carbóxi- terminal é sintetizado através de uma reação da PCR do molde pLF1020 (Exemplo 5.2.1) e com o auxílio do par de oligonucleotídeos a seguir: LF041 (36 mer) (SEQ ID NO 37) 5' CATGACGCGGCCGCTATGACGACTACTGCATTCCTG 3’ e LF042 (35 mer) (SEQID NO 38) 5' CATGACAGATCTCAAGCGAAGTAATCCCGGTGGTG 3. O fragmento de DNA of 1132 pb obtido através da digestão do produto da PCR com Notl e Bglll é ligado com um fragmento de 5642 pb resultante da digestão de pLF999 (Exemplo 2) com Notl e Bglll com a finali- dade de gerar o plasmídeo pLF1021 (aproximadamente 6779 pb). Ο E2 gene da cepa Osloss do BVDV-1 modificado dessa forma (β-globin tPA-E2 ,A[TM+Cter]) codifica uma proteína de 404 aminoácidos.
Exemplo 6: Plasmídeos que codificam as várias formas de antíqenos do ví- rus da diarréia viral bovino tipo 2 (BVDV-21 Os genes que codificam o antígeno da E2 (gp53) do vírus BVDV tipo 2 são obtidos por RT-PCR do RNA viral da cepa 890 (J.F. Ridpath e S.R. Bolin, Virology, 1995, 212, 36-46). A cepa Q140 pode também ser usa- da e pode ser obtida do Quebec Ministry of Agriculture, Fisheries e Food, Armand-Frappier Institute (P. Tijssen e outros, Virology, 1996,217,356-361).
As cepas 1373 e 296 podem também ser usadas (J.F. Ridpath, BVDV Rese- arch Project, National Animal Disease Center, 2300 Dayton Avenue, Ames, USA). 6.1 Plasmídeos que codificam as várias formas de E2 do tipo 2 - cepa 890 6.1.1. pLF1022: E2 gene (forma nativa) clonado no vetor pVR1012 O cDNA do gene E2 da cepa 890 é sintetizado partindo do RNA viral correspondente com o auxílio do iniciador LF044 amplificado através de uma reação da PCR com o auxílio do par de oligonucleotídeos a seguir: LF043 (36 mer) (SEQ ID NO 39) 127 5 10 15 20 25 30 5' ACTGTATCTAGAATGACCACCA- CAGCTTTCCTAATC 3’ e LF044 (39 mer) (SEQ ID NO 40) 5' ACT GTAAG AT CTTTAAGTATT CACT CCAGC ACCCATAGC 3'. O fragmento de DNA de aproximadamente 1240 pb obtido atra- vés da digestão do produto da PCR com Xbal e Bglll é ligado com um frag- mento de 4891 pb resultante da digestão de pVR1012 (Exemplo 2) com Xbal e Bglll com a finalidade de gerar o plasmídeo pLF1022 (aproximadamente 6136 pb). 0 gene E2 da cepa 890 do BVDV-2 codifica uma proteína de 410 aminoácidos.
Um códon ATG é introduzido na sequência do oligonucleotídeo LF043 de forma a permitir o início da tradução do poíipeptídeo E2 recombi- nante correspondente. 6.1.2 pLF1023: gene E2, forma (β-qlobin tPA-E2 AfTM+Cterl), clonado no vetor pLF999 O gene E2 deletado em relação aos seus domínios transmem- brana e carbóxi-terminal é sintetizado através de uma reação da PCR par- tindo do molde de pLF1022 (Exemplo 6.2.1) e com o auxílio do par de oligo- nucleotídeos a seguir: LF045 (41 mer) (SEQID N- 41) 5' CATGACGCGGCCGCCCTATGACCACCACAGCTTTCC- TAATC 3’ e LF046 (36 mer) (SEQ ID N° 42) 5' CATGACAGATCTTTATATGAACTCTGAGAAGTAGTC 3’. O fragmento de DNA de aproximadamente 1140 pb obtido atra- vés da digestão do produto da PCR com Notl e Bglll é ligado com um frag- mento de 5642 pb resultante da digestão de pLF999 (Exemplo 2) com Notl e Bglll com a finalidade de gerar o plasmídeo pLF1023 (aproximadamente 6787 pb). O gene E2 da cepa 890 do BVDV-2 modificado dessa forma (β- globin tPA-E2 A[TM+Cter]) codifica uma proteína de 405 aminoácidos. 6.2 Plasmídeos que codificam as várias formas de E0 da cepa 890 do tipo 2 6.2.1 pLF 1030: gene E0 (forma nativa) clonado no vetor pVR1012 O cDNA do gene E0 da cepa 890 é sintetizado partindo do RNA viral correspondente com o auxílio do iniciador LF065 e amplificado através de uma reação da PCR com o auxílio do par de oligonucleotídeos a seguir: LF064 (39 mer) (SEQ ID NQ43) 5’ CATACCGTCGACATGAGAAAGAAAnGGAGAAGGCACTG3'e LF065 (39 mer) (SEQ ID Ne44) 5' CATACCGGATCCTCATGCTGCATGAGCACCAAACCATGC 3'. 0 fragmento de DNA de aproximadamente 768 pb obtido através da digestão do produto da PCR com Sall e BamHI é ligado com um fragmen- to de 4866 pb resultante da digestão de pVR1012 (Exemplo 2) com Sall e BamHI com a finalidade de gerar o plasmídeo pl_F1030 (aproximadamente 5639 pb). O gene E0 da cepa 890 do BVDV-2 codifica uma proteína de 253 aminoácidos.
Um códon ATG é introduzido na seqüência do oligonucleotídeo LF064 de forma a permitir o início da tradução do polipeptídeo E0 recombi- nante correspondente. 6.2.2 pLF1031: gene E0, forma φ-qlobin tPA-EO), clonado no vetor pLF999. O gene E0 é sintetizado através de uma reação da PCR partindo do molde de pLF1030 (Exemplo 6.2.1.) e com o auxílio do par de oligonucle- otídeos a seguir: LF066 (42 mer) (SEQ ID N° 45) 5' CATGACGCGGCCGCTATGAGAAAGAAATTGGAGAAGG- CACTG 3' e LF067 (39 mer) (SEQ ID N° 46) 5' CATACCAGATCTTCATGCTGCATGAGCACCAAACCATGC 3’. O fragmento de DNA de aproximadamente 770 pb obtido através da digestão do produto da PCR com Notl e Bglll é ligado com um fragmento de 5642 pb resultante da digestão de pLF999 (Exemplo 2) com Notl e Bglll com a finalidade de gerar o plasmídeo pLF1031 (aproximadamente 6417 pb). O gene E0 da linhagem 890 do BVDV-2 modificado dessa forma (β-globin tPA-EO) codifica uma proteína de 283 aminoácidos.
Exemplo 7: Plasmídeos que codificam as várias formas dos antíaenos do vírus parainfluenza bovino do tipo 3 (bPI-3) Os genes que codificam os antígenos da hemaglutinina- neuraminidase (HN) e de fusão (F) antígenos do vírus bPI-3 são obtidos a- través da RT-PCR partindo do RNA viral da cepa Reisinger SF-4 (acessível na ATCC sob o número VR-281). 7.1 Plasmídeos que codificam as várias formas de HN da cepa SF-4 do bPI- 3 7.1.1 PLF1024: gene HN (forma nativa) clonado no vetor pVR1012 O cDNA do gene HN da linhagem SF-4 é sintetizado partindo do RNA viral correspondente com o auxílio do iniciador LF048 e amplificado através de uma reação da PCR com o auxílio do par de oligonucleotídeos a seguir: LF047 (39 mer) (SEQID N° 47) 5' CATATCGTCGACATGGAATATTGGAAACACACAAACAGC 3' e LF048 (38 mer) (SEQ ID Ns 48) 5' CATGACGATATCTAGCTGCAGTmTCGGAACTTCTGT 3'. O fragmento de DNA de 1726 pb obtido através da digestão do produto da PCR com Sall e EcoRV é ligado com um fragmento de 4896 pb resultante da digestão de pVR1012 (Exemplo 2) com Sall e EcoRV com a finalidade de gerar o plasmídeo pLF1024 (aproximadamente 6619 pb). O gene HN do bPI-3 codifica uma proteína de 572 aminoácidos. 7.1.2 pl_F1025: gene HN, forma (β-qlobin tPA-E2 A[TM]). clonado no vetor PLF999 O gene HN deletado em relação ao seu domínio transmembrana é sintetizado através de uma reação da PCR partindo do molde de pLF1024 (Exemplo 7.1.1) com o auxílio do par de oligonucleotídeos a seguir: LF058 (33 mer) (SEQ ID NQ 49) 5’ CATACTGCGGCCGCTTTAATTCAAGAGAACAAT 3' e LF059 (35 mer) (SEQ ID Ne 50) 5’ CATATCGATATCTAGCTGCAGTTTTTCGGAACTTC 3'. O fragmento de DNA de 1566 pb obtido através da digestão do produto da PCR com Notl e EcoRV é ligado com um fragmento de 5663 pb resultante da digestão de pLF999 (Exemplo 2) com Notl e EcoRV com a fi- nalidade de gerar o plasmídeo pLF1025 (aproximadamente 7229 pb). O gene HN do bPI-3 modificado dessa forma (β-globin tPA-E2 Δ[ΤΜ]) codifica uma proteína de 548 aminoácidos. 7.2 Plasmídeos que codificam as várias formas de F da cepa SF-4 do bPI-3 7.2.1 pLF1026: gene F (forma nativa) clonado no vetor PVR1012 O cDNA do gene F da cepa SF-4 é sintetizado partindo do RNA viral correspondente com o auxílio do iniciador LF061 e amplificado através de uma reação da PCR com o auxílio do par de oligonucleotídeos a seguir: LF060 (36 mer) (SEQ ID N- 51) 5' CATATCGTCGACATGATCATCACAAACACAATCATA 3' e LF061 (36 mer) (SEQ ID N° 52) 5' CATG ACCAGAT CTTATT GTCTATTT GTCAGTATATA 3’. O fragmento de DNA de 1628 pb obtido através da digestão do produto da PCR com Sall e Bglll é ligado com um fragmento de 4860 pb re- sultante da digestão de pVR1012 (Exemplo 2) com Sall e Bglll com a finali- dade de gerar o plasmídeo pLF1026 (aproximadamente 6488 pb). O gene F do bPI-3 codifica uma proteína de 550 aminoácidos. 7.2.2 pLF1027: gene F, forma (β-qlobin tPA-F AfTM+Cterl). clonado no vetor PLF999 O gene F deletado em relação aos seus domínios transmembra- na e C-terminal é sintetizado através de uma reação da PCR partindo do molde de pLR1026 (Exemplo 7.2.1) e com o auxílio do par de oligonucleotí- deos a seguir: LF062 (42 mer) (SEQ ID N° 53) 5’ CATACTGCGGCCGCTCAAATAGACATAACAAAACTG- CAACGT 3’ e LF063 (41 mer) (SEQ ID NQ 54) 5' C ATATCG AT AT CTAT GCACTAGATT G ATACCAACTTCCA AC 3'. O fragmento de DNA de 1434 pb obtido através da digestão do produto da PCR com Notl e EcoRV é ligado com um fragmento de 5663 pb resultante da digestão de pLF999 (Exemplo 2) com Notl e EcoRV com a fi- nalidade de gerar o plasmídeo pLF1027 (aproximadamente 7097 pb).
O gene F do bPI-3 modificado dessa forma (β-globin tPA-F A[TM+Cter]) codifica uma proteína de 504 aminoácidos.
Exemplo 8: Plasmídeo que codifica o GM-CSF bovino O cDNA do gene do GM-CSF bovino é sintetizado partindo do RNA celular das células mononucleadas sangüíneas bovinas com o auxílio do iniciador LF065 e amplificado através de uma reação da PCR com o auxí- lio do par de oligonucleotídeos a seguir: LF054 (36 mer) (SEQ ID N2 55) 5' CATAT CGTCG ACAT GTG G CTGC AG AACCT G CTT CT C 3' e LF055 (34 mer) (SEQ ID N5 56) 5' CATGACCAGATCTTCACTTCTGGGCTGGTTCCCA 3'. O fragmento de DNA de 437 pb obtido através da digestão do produto da PCR com Sall e Bglll é ligado com um fragmento de 4860 pb re- sultante da digestão de pVR1012 (Exemplo 2) com Sall e Bglll com a finali- dade de gerar o plasmídeo pLF1032 (aproximadamente 5297 pb). O gene GM-CSF bovino codifica uma proteína de 143 aminoácidos.
Exemplo 9: Formulação dos plasmídeos vacinais A solução de DNA contendo um ou mais plasmídeos de acordo com os Exemplos 3 até 8 é concentrada através da precipitação etanólica como descrito em Sambrook e outros (1989). O pélete de DNA é coletado em uma solução de NaCI a 0,9% de forma a se obter uma concentração de 1 mg/mL. Uma solução de DMRIE-DOPE a 0,75 mM é preparada coletando o produto da liofilização de DMRIE-DOPE com um volume apropriado de H2O esterilizada. A formação de complexos de DNA plasmideal - lipídeos é con- seguida através da diluição, em partes iguais, a solução de DMRIE-DOPE a 0,75 mM com a solução de DNA a 1 mg/mL em NaCI a 0,9%. A solução de DNA é gradualmente introduzida, com 0 auxílio de uma agulha de 26G fen- dida, junto à parede do frasco contendo a solução de lipídeo catiônico de forma a evitar a formação de espuma. A agitação suave é realizada assim que as duas soluções forem misturadas. Uma composição compreendendo 0,375 mM de DMRIE-DOPE e 500 pg/mL do plasmídeo é finalmente obtida. É desejável que todas as soluções utilizadas estejam à tempera- tura ambiente para todas as operações descritas anteriormente. É permitido que a formação do complexo DNA/DMRIE-DOPE ocorra à temperatura am- biente durante 30 minutos antes da imunização dos animais.
Exemplo 10: Imunização de bovinos contra o BHV-1 12 bovinos são separados aleatoriamente em 3 grupos de 4. O Grupo 1 constitui o grupo de animais de controle.
Uma mistura de plasmídeos vacinais pPB281 (que codifica gB do BHV-1 em uma forma AfíM-Cter], Exemplo 3.1.2), pPB292 (que codifica GC do BHV-1 em uma forma A[TM-Cter], Exemplo 3.2.2) e pPB284 (que co- difica gD do BHV-1 em uma forma A[TM-Cter], Exemplo 3.3.2) é administra- da aos animais do Grupo 2. A mesma mistura que a do Grupo 2, mas formulada com D- MRIE-DOPE como descrito no Exemplo 15, é administrada aos animais do Grupo 3.
Uma injeção de 10 mL, através da via intramuscular, é realizada em cada bovino com o auxílio de seringas equipadas com agulha e é repeti- da 21 dias depois. A massa total de cada plasmídeo utilizado durante cada imunização é de 1500 pg.
Os versados na técnica possuem a competência necessária pa- ra ajustar o volume e a concentração de acordo com a dose de plasmídeo requerida. O monitoramento da resposta sorológica induzida pelas duas misturas de plasmídeos vacinais que expressam os antígenos gB, gC e gD do BHV-1 é realizado ao longo de um período de 35 dias após a primeira vacinação.
Exemplo 11: Imunização de inicíação-reforço de bovinos contra o BRSV
Os plasmídeos vacinais, que codificam F do BRSV na forma de uma deleção grande A[TM-Cter] e em uma forma A[TM-Cter] e que codificam N do BRSV, foram concentrados através da precipitação etanólica como descrito em Sambrook e outros (1989). O pélete de DNA foi coletado em uma solução de NaCI a 1,8% de forma a se obter uma concentração de 1,6 mg/mL. Uma solução de DMRIE-DOPE a 1,2 mM foi preparada coletando um produto da liofilízação de DMRIE-DOPE com um volume apropriado de H2O esterilizada. A formação de complexos de DNA plasmideal - iipídeos foi con- seguida misturando, em partes iguais, a solução de DMRIE-DOPE a 1,2 mM com a solução de DNA a 1,6 mg/mL em NaCI a 1,8%. A solução de DNA foi introduzida gradualmente, com 0 auxílio de uma agulha de 26 G fendida, junto à parede do frasco contedo a solução de lipídeo catiônico de forma a evitar a formação de espuma. A agitação suave foi realizada assim que as duas soluções foram misturadas. Uma composição que compreende 0,6 mM de DMRIE-DOPE e 800 pg/mL de plasmídeo foi finalmente obtida. É desejável que todas as soluções utilizadas estejam à tempera- tura ambiente para todas as operações descritas anteriormente. É permitido que a formação do complexo DNA/DMRIE-DOPE ocorra à temperatura am- biente durante 30 minutos antes da imunização dos animais. O BRSV (cepa 375, depositada antes na American Type Culture Collection (ATCC) sob 0 número de acesso # VR-1339) foi inativado com β- propiolactona e formulado com Carbopol® 974P (Noveon Inc.) (20% v/v, 15 g/L de uma solução de Carbopol) para ter uma concentração final de Carbo- pol de 3 mg/mL. 20 bovinos, de 3 até 4 semanas de idade, foram separados alea- toriamente em 4 grupos de 5 animais. 0 Grupo 1 constitui o grupo dos animais de controle (sem qual- quer vacinação).
Para a imunização de iniciação, a vacina de DNA formulada com DMRIE-DOPE foi administrada aos animais do Grupo 2 e do Grupo 3 atra- vés da via intramuscular, 2 mL por dose, com uma seringa e uma agulha. A
quantidade total de plasmídeos utilizada para a imunização foi de 1600 pg. A vacina inativada formulada com Carbopol foi administrada aos animais do Grupo 4 através da via intramuscular, 5 mL por dose, com uma seringa e uma agulha. 28 dias depois, foi feita uma imunização de reforço. A vacina de DNA formulada com DMRIE-DOPE foi administrada aos animais do Grupo 2 através da via intramuscular, 2 mL por dose, com uma seringa e uma agu- lha. A quantidade total de plasmídeos utilizada para a imunização foi de 1600 pg. A vacina inativada formulada com Carbopol foi administrada aos animais do Grupo 3 e do Grupo 4 através da via intramuscular, 5 mL por do- se, com uma seringa e uma agulha.
Todos os animais foram desafiados no 193e dia com o agente patogênico BRSV (cepa Snook; Taylor G. e outros, J Gen Virol 1998, 79(7), 1759-67) a aproximadamente 4,5 Iog10 CCID5o/ml. 10 ml da suspensão do inóculo foram inoculados de forma intranasal a cada um dos bezerros borri- fando para uma dose infecciosa total por bezerro de aproximadamente 105,5 CCID50. O monitoramento das temperaturas retais, das taxas respirató- rias, dos escores clínicos, dos escores de lesão pulmonar, das excreções virais e da resposta de células T de memória de IFNY+ específica ao BRSV foi realizado ao longo de um período de 10 dias após 0 desafio.
Os resultados das temperaturas retais são apresentados em °C na Figura 3.
Todos os bezerros apresentavam hipertermia após 0 desafio. O
Grupo 3 (DNA/inativado) apresentava um pico de temperatura média mais precocemente no decorrer do tempo do que 0 outro grupo e a temperatura retal era significativamente menor (p = 0,001) quando comparada com à do 0 escore para a mortalidade ou para a eutanásia por razão ética é8.
Os resultados dos escores clínicos são apresentados na Figura 5.
Todos os bezerros apresentaram hiperpnéia moderada a grave após o desafio. Todos os bezerros estavam pelo menos prostados ou parci- almente anoréxicos alguns dias durante a fase de desafio. Havia uma varia- ção considerável na gravidade dos sinais, mesmo dentro dos grupos. Por exemplo, no grupo 4, um animal foi gravemente afetado (falecido no D8) e seu escore clínico global (GSS = escore total da fase de desafio) conta com mais de 50% do GSS total para o grupo. A situação é ainda mais intrigante no grupo 3. Grupo em que o GSS de um bezerro representa aproximada- mente 2/3 do GSS total para o grupo 3.
Todos os bezerros (encontrados mortos ou que sofreram euta- násia) foram submetidos à necrópsia. Um exame macroscópico do aparelho respiratório profundo foi realizado e os lados dorsais e ventrais dos pulmões foram observados em relação a lesões pulmonares. O tamanho das lesões foi estimado para cada lobo pulmonar (ambos os lados), como uma porcen- tagem do lobo afetado (superfície afetada/superfície total), para calcular um controle durante o período de D4-D10.
Os resultados das taxas respiratórias (respiração por minuto) são apresentados na Figura 4. O Grupo 3 apresentava na média um pico de taxa respiratória menor e mais precoce do que os outros grupos, Para este grupo, foi obser- vada uma taxa respiratória inferior (p = 0,06) quando comparada com a dos controles. escore do lobo como a seguir: Escore do lobo = (índice de equilíbrio do lobo) * (escore dorsal + escore ventral)/2. O índice de equilíbrio dos lobos representa a importância relativa dos lobos pulmonares e é: Para o lobo cranial direito e o lobo craniano médio: 0,11 Para o lobo caudal médio direito: 0,07 Para o lobo caudal direito: 0,35 Para o lobo craniano esquerdo: 0,05 Para o lobo médio esquerdo: 0,06 Para o lobo caudal esquerdo: 0,32 e para o lobo ázigo: 0,04. O escore de lesão pulmonar de cada bezerro foi determinado através da adição de todos os escores de lobo.
Os resultados dos escores de iesão pulmonar são apresentados na Figura 6.
De interesse particular, no grupo 3, 4/5 dos bezerros possuíam menos de 7,5% de lesões pulmonares enquanto que o restante dos bezerros possuía quase 100% de lesões pulmonares.
Os resultados da excreção viral por esfregaços nasais são apre- sentados na Figura 7. A cepa de desafio do BRSV foi detectada em animais de todos os grupos, entretanto em um nível variável, os controles possuindo o nível mais alto de excreção. Quando comparada a dos controles, a excreção total (soma do título de excreção diária em Iog10) era significativamente menor apenas no grupo 3.
As células mononucleares sangüíneas periféricas bovinas inicia- das in vivo (PBMCs) foram tiradas de amostras de sangue coletadas nos dias 36 e 92 após a vacinação e 10 dias após o desafio.
As PBMCs do dia 36 foram reestimuladas ex vivo com células dendríticas autólogas infectadas com um poxvírus recombinante que ex- pressa a proteína F do BRSV ou com o poxvírus original como controle.
As PBMCs do dia 92 e 10 dias após o desafio foram reestimula- das ex vivo diretamente com o BRSV ativo multiplicado em células VERO (cepa 375, de aproximadamente 6,0 Iog10 CCID5o/mL até aproximadamente 6,4 Iog10 CCID5o/mL). Como controle, as PBMCs foram infectadas de forma simulada por um lisado de células VERO.
As freqüências das células T específicas ao antígeno foram de- terminadas através do número de células secretando IFNY em um ensaio de "spot" quantitativo imunológico ligado à enzima (ELISPOT) (Lavai F. e ou- tros, Vet. Immunol. Immunopathol., 2002, 90(3-4), 191-201). Utilizando esta abordagem as estratégias vacinais podem ser classificadas em relação a sua capacidade de iniciar células T de IFNr+ especificas ao vírus.
As respostas de células T de memória de IFNy+ específicas ao BRSV são apresentadas na Figura 8.
Em contraste com o ponto de tempo do dia 36, quando os resul- tados mudaram para a resposta secundária de células T efetoras, a análise do dia 92 revelou a resposta de células T de memória (2 meses após a se- gunda injeção). Parecia que os bezerros com um bom nível de resposta de células T de memória específicas eram encontrados principalmente no grupo 3 (bezerros vacinados com a iniciação-reforço com DNA/inativado).
De forma interessante, os bezerros do grupo 3 que exibiram coe- rentemente uma resposta de células T de memória IFNT+ específica ao BRSV, seja qual for o ponto de tempo analisado, são os bezerros nos quais uma proteção significativa foi observada. A invenção será descrita adicionalmente pelos parágrafos nume- rados a seguir: 1. Uso de um plasmídeo que contém e que expressa in vivo em um bovino tal como o gado pelo menos um imunógeno proveniente de um agente patogênico bovino, selecionado de BRSV, bPI-3, BHV-1 e BVDV, para a preparação de uma vacina de DNA pretendida para induzir uma res- posta imunológica em bovinos jovens tais como bezerros que possuem ou podem possuir anticorpos maternos contra o dito agente patogênico bovino. 2. Uso de acordo com o parágrafo 1, em que é pretendido que a vacina de DNA seja administrada ao animal ou bovino jovem desde o nasci- mento até e incluindo 12 semanas de idade, tal como desde o nascimento até e incluindo 6 semanas de idade, tal como desde o nascimento até e in- cluindo 4 semanas de idade e especialmente desde o nascimento até e in- cluindo 3 semanas de idade. 3. Uso de acordo com o parágrafo 1 ou 2, em que é pretendido que a dita vacina de DNA induza uma resposta imunológica de iniciação, tal como com uma resposta de células T de memória de IFNY+ específica para o imunógeno expresso, cuja resposta imunológica de iniciação pode ser refor- çada através de uma administração subseqüente de uma vacina inativada ou uma vacina recombinante ativa que compreende um vetor viral, tal como um poxvírus recombinante ativo, que contém e que expressa in vivo pelo menos o(s) mesmo(s) imunógeno(s) que os expressos por uma a vacina de DNA. 4. Uso de um agente patogênico bovino, selecionado de BRSV, bPI-3, BHV-1 e BVDV, para a preparação de uma vacina de DNA de inicia- ção que compreende um plasmídeo que contém e que expressa in vivo em um bovino tal como o gado pelo menos um imunógeno do dito agente pato- gênico e para a preparação de uma segunda vacina que compreende o dito agente patogênico sob uma forma inativada, em que é pretendido que a va- cina de DNA seja administrada a um bovino tal como o primeiro gado, tal como a um bezerro jovem que possui ou pode possuir anticorpos maternos contra o dito agente patogênico bovino e é pretendido que a vacina inativada seja administrada após a vacina de DNA e ao mesmo bovino tal como o ga- do tal como o bezerro jovem, para reforçar a resposta imunológica contra o dito imunógeno. 5. Uso de acordo com o parágrafo 4, em que é pretendido que a vacina de DNA induza no bovino tal como o gado, tal como o bezerro, uma resposta imunológica contra o{s) dito(s) imunógeno(s), tal como a resposta de células T de memória de interferon gama+ específica para o imunógeno expresso. 6. Uso de acordo com o parágrafo 4 ou 5, em que é pretendido que a vacina de DNA seja administrada ao animal ou ao bovino jovem desde o nascimento até e incluindo 12 semanas de idade, tal como desde o nasci- mento até e incluindo 6 semanas de idade, tal como desde o nascimento até e incluindo 4 semanas de idade e especialmente desde o nascimento até e incluindo 3 semanas de idade. 7. Uso de acordo com o parágrafo 4, 5 ou 6, em que é pretendi- do que a vacina inativada seja administrada desde aproximadamente 2 se- manas até aproximadamente 5 meses após a administração de iniciação, tal como desde aproximadamente 3 até 6 semanas depois e tal como aproxi- madamente 4 semanas após a vacina de DNA ter sido administrada. 8. Uso de uma seqüência de nucleotídeos que codifica pelo me- nos um imunógeno proveniente de um agente patogênico bovino, seleciona- do de BRSV, bPI-3, BHV-1 e BVDV, para a preparação de uma vacina de DNA de iniciação que compreende um plasmídeo que contém e que expres- sa in vivo o dito imunógeno e para a preparação de uma segunda vacina que compreende um vetor viral recombinante ativo, tal como um poxvírus recom- binante ativo, que contém e que expressa in vivo pelo menos o(s) dito(s) i- munógeno(s), em que é pretendido que a vacina de DNA seja administrada primeiro a um bovino, tal como a um bezerro jovem que possui ou pode pos- suir anticorpos maternos contra o dito agente patogênico bovino e é preten- dido que a vacina baseada no vetor viral seja administrada após a vacina de DNA e ao mesmo bovino tal como o bezerro, para reforçar a resposta imuno- lógica contra o dito imunógeno. 9. Uso de acordo com o parágrafo 8, em que é pretendido que a vacina de DNA induza uma resposta imunológica induzida pela vacina de DNA contra o(s) dito(s) imunógeno(s), tal como a resposta de células T de memória de IFNY+ específica para o imunógeno expresso. 10. Uso de acordo com o parágrafo 8 ou 9, em que é pretendido que a vacina de DNA seja administrada ao animal ou ao bovino jovem desde o nascimento até e incluindo 12 semanas de idade, tal como desde o nasci- mento até e incluindo 6 semanas de idade, tal como desde o nascimento até e incluindo 4 semanas de idade e especialmente desde o nascimento até e incluindo 3 semanas de idade. 11. Uso de acordo com o parágrafo 8,9 ou 10, em que é preten- dido que a vacina baseada no vetor viral ativo seja administrada desde apro- ximadamente 2 semanas até aproximadamente 5 meses após a administra- ção de iniciação, tai como desde aproximadamente 3 até 6 semanas depois e tal como aproximadamente 4 semanas após a vacina de DNA ter sido ad- ministrada. 12. Uso de um agente patogênico bovino, selecionado de BRSV, bPI-3, BHV-1 e BVDV, para preparar uma vacina inativada pretendida para vacinar um bovino contra o dito agente patogênico, em que o bovino, tal co- mo um bezerro jovem que possui ou pode possuir anticorpos maternos con- tra o dito agente patogênico bovino, foi previamente imunizado com a vacina de DNA que expressa in vivo pelo menos um imunógeno proveniente do mesmo agente patogênico e desenvolveu uma resposta imunológica induzi- da pela vacina de DNA de iniciação específica, tal como a resposta de célu- las T de memória de IFNY+ específica para o imunógeno expresso. 13. Uso de acordo com o parágrafo 12, em que é pretendido que a vacina inativada seja administrada desde aproximadamente 2 semanas até aproximadamente 5 meses, tal como desde aproximadamente 3 até 6 se- manas e tal como aproximadamente 4 semanas após o bovino ter sido ad- ministrado com a vacina de DNA. 14. Uso de um vetor recombinante viral, tal como um vetor de poxvírus, que compreende e que expressa in vivo pelo menos uma seqüên- cia de nucleotídeos que codifica pelo menos um imunógeno proveniente de um agente patogênico bovino, selecionado de BRSV, bPI-3, BHV-1 e BVDV, para preparar uma vacina recombinante ativa pretendida para vacinar um bovino contra o agente patogênico, em que o bovino, tal como um bezerro jovem que possui ou pode possuir anticorpos maternos contra o dito agente patogênico bovino, foi previamente imunizado com a vacina de DNA que expressa in vivo peto menos o(s) mesmo{s) imunógeno(s), desenvolveu uma resposta imunológica induzida pela vacina de DNA de iniciação, tal como a resposta de células T de memória de IFNY+ específica para o imunógeno expresso. 15. Uso de acordo com o parágrafo 14, em que é pretendido que a vacina baseada no vetor viral ativo seja administrada aproximadamente 2 semanas até aproximadamente 5 meses, tal como desde aproximadamente 3 até 6 semanas e tal como aproximadamente 4 semanas depois do bovino ter sido administrado com a vacina de DNA. 16. Método de vacinação de iniciação-reforço de um bovino tal como o gado contra pelo menos um agente patogênico bovino, em que o bovino ou o gado é primeiro administrado com uma vacina de DNA de inicia- ção que compreende e que expressa in vivo um imunógeno do dito agente patogênico e então sofre reforço com um segundo tipo de vacina que apre- senta o mesmo imunógeno. 17. Método de acordo com o parágrafo 16, em que o reforço é feito com uma vacina inativada. 18. Método de acordo com o parágrafo 16, em que o reforço é feito com uma vacina que compreende um vetor viral ativo recombinante, tal como um poxvírus recombinante, que compreende e que expressa in vivo o dito imunógeno. 19. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 16 até 18, em que a vacina de DNA é administrada a um bezerro jovem que pode possuir anticorpos maternos contra o agente patogênico contra o qual a i- munização ou a vacinação é direcionada. 20. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 16 até 19, em que a vacina de DNA é administrada ao animal ou ao bovino jovem desde o nascimento até e incluindo 12 semanas de idade, tal como desde o nascimento até e incluindo 6 semanas de idade, tal como desde o nascimen- to até e incluindo 4 semanas de idade e especialmente desde o nascimento até e incluindo 3 semanas de idade. 21. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 16 até 20, em que a administração de reforço é feita desde aproximadamente 2 semanas até aproximadamente 5 meses após a administração de iniciação, tal como desde aproximadamente 3 até 6 semanas depois e tal como apro- ximadamente 4 semanas depois. 22. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 16 até 21, em que uma segunda administração da vacina de reforço é feita, tal co- mo quando o bovino ou os bezerros são transferidos para as unidades de abate. 23. Método de vacinação de iniciação-reforço de um gado contra pelo menos um agente patogênico bovino, que compreende a administração primeiro a um bovino tal como o gado de uma vacina de DNA de iniciação que compreende uma seqüência de nucleotídeos que codifica e que expres- sa in vivo um imunógeno do dito agente patogênico e então a administração de um segundo tipo de vacina que apresenta o mesmo imunógeno, por e- xemplo, uma vacina de vetor viral ativo inativada, atenuada, de subunidade ou recombinante, vantajosamente uma vacina inativada ou um vetor viral ativo recombinante, tal como um poxvirus recombinante, que compreende e que expressa in vivo o dito imunógeno. O método pode ser aplicado a um bezerro jovem que pode possuir anticorpos maternos contra o agente pato- gênico contra o qual a imunização ou a vacinação é direcionada. * ★ * Tendo assim descrito em detalhes as modalidades preferidas da presente invenção, deve ser entendido que a invenção definida pelas reivin- dicações em anexo não devem ser limitadas a detalhes particulares apre- sentados na descrição anterior uma vez que muitas variações evidentes das mesmas são possíveis sem sair do espírito ou do âmbito da presente inven- ção. <110> Merial <120> Vacinação ou imunização utilizando um regime de iniciação- reforço <130 454313-3154.4WO <160 59 <170 Patentln versão 3.2 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 1 gatctgcagc acgtgtctag aggatatcga attcgcggcc 40 <210> 2 <211 > 40 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 2 gatccgcggc cgcgaattcg atatcctcta gacacgtgct 40 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 3 ttggggaccc ttgattgttc 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 4 ctgtaggaaa aagaagaagg c 21 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 5 ctccatgtcg acttggggac ccttgattgt 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 6 ctccatgtcg acctgtagga aaaagaagaa 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 7 ttgtcgacat ggccgctcgc ggcggtgctg 30 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220 <223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400 8 gcagggcagc ggctagcgcg g 21 <210> 9 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 9 ctgcacgagc tccggttcta cgacattgac cgcgtggtca agacggadg ag 52 <210 10 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 10 gatcctcagt ccgtcttgac cacgcggtca atgtcgtaga accggagctc gtgcag 56 <210 11 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 11 aaaatttcga tatccgccgc ggggcgaccg gcgacaacg 39 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220 <223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400 12 ggaagatctt cagtccgtct tgaccacgcg gtc 33 <210> 13 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 13 tcgtgcctgc ggcgcaaggc ccgggcgcgc ctgtagt 37 <210 14 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 14ctagactaca ggcgcgcccg ggccttgcgc cgcaggc 37 <210> 15 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220 <223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 15gcaccgctgc ccgagttctc cgcgaccgcc acgtacgact agt 43 <210> 16 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400 16 ctagactagt cgtacgtggc ggtcgcggag aactcgggca gcg 43 <210> 17 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220 <223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 17 aaaatttcga tatcccggcg ggggctcgcc gaggaggcg 39 <210> 18 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220 <223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 18 ggaagatctc tagtcgtacg tggcggtcgc gg 32 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 19 tttctgcaga tgcaagggcc gacattggcc gtg 33 <210 20 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> olígonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 20 tttctagatt agggcgtagc gggggcgggc g 31 <210> 21 <211> 39 <212> DNA <213> Artificiai <220>
<223> olígonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 21 aaaatttcga tatcccccgc gccgcgggtg acggtatac 39 <210> 22 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> olígonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 22 ggaagatctt tagggcgtag cgggggcggg cgg 33 <210> 23 <211 > 34 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> olígonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 23 aaattttctg cagatggcga caacagccat gagg 34 <210> 24 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400 24 ttaaggatcc tcatttacta aaggaaagat tgttg 35 <210> 25 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 25 aattttggat cctcatgtgg tggattttcc tacatctac 39 <210> 26 <211> 38 <212> DNA <213> Artificia! <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 26 aaaattcacg tgaacataac agaagaattt tatcaatc 38 <210> 27 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 27 acgcgtcgac atgtccaacc atacccatca tc 32 <210> 28 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 28 ttaaaatcta gattagatct gtgtagttga ttgatttg 38 <210> 29 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400 29 ttttaaggat ccgctaaagc caagcccaca tcc 33 <210> 30 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 30 ttaaaatcta gattagatct gtgtagttga ttg 33 <210> 31 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 31 cataccgtcg acatgaagaa actagagaaa gccctg 36 <210> 32 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 32 cataccggat cctcaggctg catatgcccc aaaccatgtc 40 <210> 33 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 33 catgacgcgg ccgctatgaa gaaactagag aaagccctg 39 <210> 34 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 34 catgacagat ctttaggctg catatgcccc aaaccatgtc 40 <210> 35 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 35 catgacgtcg acatgacgac tactgcattc ctg 33 <210> 36 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220 <223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400 36 catgacagat cttcaacgtc ccgaggtcat ttgttc 36 <210> 37 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 37 catgacgcgg ccgctatgac gactactgca ttcctg 36 <210> 38 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 38 catgacagat ctcaagcgaa gtaatcccgg tggtg 35 <210> 39 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 39 actgtatcta gaatgaccac cacagctttc ctaatc 36 <210> 40 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400 40 actgtaagat ctttaagtat tcactccagc acccatagc 39 <210> 41 <211> 41 <212> DNA <213> Artificia! <220 <223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 41 catgacgcgg ccgccctatg accaccacag ctttcctaat c 41 <210> 42 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 42 catgacagat ctttatatga actctgagaa gtagtc 36 <210 43 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 43 cataccgtcg acatgagaaa gaaattggag aaggcactg 39 <210> 44 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220 <223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400 44 cataccggat cctcatgctg catgagcacc aaaccatgc 39 <210> 45 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 45 catgacgcgg ccgctatgag aaagaaattg gagaaggcac tg 42 <210> 46 <211> 39 <212> DNA <213> Artificia! <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 46 cataccagat cttcatgctg catgagcacc aaaccatgc 39 <210> 47 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 47 catatcgtcg acatggaata ttggaaacac acaaacagc 39 <210> 48 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 48 catgacgata tctagctgca gtttttcgga acttctgt 38 <210> 49 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 49 catactgcgg ccgctttaat tcaagagaac aat 33 <210> 50 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 50 catatcgata tctagctgca gtttttcgga acttc 35 <210> 51 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 51 catatcgtcg acatgatcat cacaaacaca atcata 36 <210> 52 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220 <223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400 52 catgaccaga tcttattgtc tatttgtcag tatata 36 <210> 53 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 53 catactgcgg ccgctcaaat agacataaca aaactgcaac gt 42 <210> 54 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 54 catatcgata tctatgcact agattgatac caacttccaa c 41 <210> 55 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 55 catatcgtcg acatgtggct gcagaacctg cttctc 36 <210> 56 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 56 catgaccaga tcttcacttc tgggctggtt ccca 34 <210> 57 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 57 aattttggat cctcagattc cacgattttt attagaagc 39 <210> 58 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 58 aaattttgtc gacatggctc ttagcaaggt caaa 34 <210> 59 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> oligonucleotídeo como iniciador para PCR <400> 59 ttaaggatcc tcacagttcc acatcattgt ctttg 35 1 12

Claims (8)

1. Kit para a realização de um processo de vacinação de iniciação - reforço contra um agente patogênico bovino caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma primeira, vacina de iniciação, em que a primeira, vacina de iniciação compreende uma vacina de DNA que compreende molécula(s) de ácido nucléico que codifica (m) e expressa (m) in vivo em um bovino pelo menos um imunógeno proveniente do agente patogênico bovino, em que o imunógeno é BRSV F ou BRSV N ou um epitopo dos mesmos ou combinações dos mesmos, e (b) uma segunda, vacina de reforço, em que a segunda, vacina de reforço contra o agente patogênico bovino é diferente da primeira, vacina de iniciação, mas contém ou expressa pelo menos um imunógeno do agente patogênico bovino que é o mesmo imunógeno do agente patogênico bovino expresso pela primeira, vacina de iniciação, em que a segunda, vacina de reforço é um patógeno inativado em que o patógeno é o virus sincicial respiratório bovino (BRSV); em que (a) e (b) estão em recipientes separados, opcionalmente com instruções para administração ou uso; e em que o patógeno bovino é o virus sincicial respiratório bovino (BRSV).
2. Kit, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que (a) e (b) estão em recipientes separados na mesma embalagem.
3. Uso, de um plasmideo que contém e expressa in vivo em um bovino tal como o gado pelo menos um imunógeno de um agente patogênico bovino selecionado de BRSV, bPI-3 e BVDV, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma vacina de DNA pretendida para induzir uma resposta imunológica em bovinos jovens que possuem ou podem possuir anticorpos maternos contra o dito agente patogênico bovino.
4. Uso, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que é pretendido que a dita vacina de DNA induza uma resposta imunológica de iniciação, tal como com uma resposta de células T de memória de IFNy + especifica para o imunógeno expresso, cuja resposta imunológica de iniciação pode receber um reforço através da administração subsequente de uma vacina inativada ou uma vacina recombinante viva que compreende um vetor viral, tal como um poxvirus recombinante ativo, que contém e expressa in vivo pelo menos o(s) mesmo (s) imunógeno (s) que é(são) expresso(s) pela vacina de DNA.
5. Uso de um agente patogênico bovino selecionado de BRSV, bPI-3 e BVDV, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma vacina de DNA de iniciação que compreende um plasmideo que contém e expressa in vivo em um bovino tal como o gado pelo menos um imunógeno do dito agente patogênico e para a preparação de uma segunda vacina que compreende o dito agente patogênico sob uma forma inativada, em que é pretendido que a vacina de DNA seja administrada primeiro a um bovino tal como o gado, tal como a um bezerro jovem que possui ou pode possuir anticorpos maternos contra o dito agente patogênico bovino e é pretendido que a vacina inativada seja administrada após a vacina de DNA e ao mesmo bovino tal como o gado tal como o bezerro novo, para reforçar a resposta imunológica contra o dito imunógeno.
6. Uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que é pretendido que a vacina de DNA induza no bovino tal como o gado, tal como o bezerro, uma resposta imunológica contra o(s) dito(s) imunógeno(s) , tal como a resposta de células T de memória de interferon gama+ especifica para o imunógeno expresso.
7. Uso de uma sequência de nucleotideos que codifica pelo menos um imunógeno de um agente patogênico bovino selecionado de BRSV, bPI-3 e BVDV, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma vacina de DNA de iniciação que compreende um plasmideo que contém e que expressa in vivo o dito imunógeno e para a preparação de uma segunda primeiro a am> bovino, taJ como a um bezerro jovem que possui ou pode possuir anticorpos Miemos contra o dito agente patogênico bovino e é pretendido que a vacina com e ao mesmo bovino ta) como o bezerro, para reforçar a
8. Uso, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato cie que é pretendido que a vacina de 3SSV, b1-3 e SVDV, caracterizado pelo fato da ser pata preparar uina vacina inativada pretendida perra vacinar um bovino contra o dito agente patogênico, em que o bovino, anticorpos reatemos contra o dito agente patogênico bovino, pela vacina de DNA de iniciação específica, tal como a resposta de células T de memória de iFNv * espefcfica para o imunõgeno expresso. preparar uma vacina inatívada pretendida para vacinar um de Ρ1ΊΛ de iniciação especifica, tal como a resposta de
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