BR0215394B1 - Composição compreendendo polissacarídeos deriváveis de aloe vera, extrato NAG-25, extrato ultrafiltrado de aloe, seus processos de preparação, suas formas de dosagens, e seus usos - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI- ÇÃO COMPREENDENDO POLISSACARÍDEOS DERIVÁVEIS DE ALOE

VERA, EXTRATO NAG-25, EXTRATO ULTRAFILTRADO DE ALOE, SEUS

PROCESSOS DE PREPARAÇÃO, SUAS FORMAS DE DOSAGENS, E SEUS USOS". A presente invenção se refere a uma composição de matéria compreendendo polissacarídeos deriváveis de Aloe vera e um método para preparar a referida composição de matéria, um extrato de planta ou animal compreendendo a referida composição da matéria e um método para prepa- rar o referido extrato de planta ou animal e a aplicação destes como suple- mento alimentar, em cuidado pessoal e em uso farmacêutico.

Aloe é um membro da família do lírio compreendendo mais de duzentas espécies de Aloe. Aloe barbadensis Miller ou Aloe Curacao é ge- ralmente reconhecida como a "aloe verdadeira" por causa de seu amplo uso e poder de cicatrização mais eficaz. Aloe vera contém duas fontes líquidas principais, um látex amarelo (exsudato) e o gel claro (mucilagem). A geléia mucilaginosa das células parenquimatosas da planta é referida como gel de Aloe vera. O gel de Aloe vera é cerca de 98,5% de água em peso. Mais do que 60% do sólido total são preparados de polissacarídeos de origem de carboidrato.

Desde os dias mais antigos da história registrada, o ser humano tem feito uso de todas as folhas, exudatos e géis frescos obtidos de Aloe vera, porque é responsável por uma ampla faixa de atividades biológicas incluindo atividades antibacterianas, antivirais e antiinflamatórias. Foi a me- dicina tradicional de muitas culturas e usada inter alia para lepra, queimadu- ras e condições alérgicas. Outras espécies de Aloe com poder de cicatriza- ção são, por exemplo, Aloe arborescens, Aloe vahombe, Aloe ferox e Aloe saponaria.

Na literatura, muitos polissacarídeos diferentes mencionados como sendo responsáveis pelas referidas atividades biológicas foram descri- tos. Por exemplo na Patente dos Estados Unidos 4.861.761, um método de uma etapa para a preparação de um polissacarídeo terapeuticamente ativo puro chamado Aloeferon com um peso molecular de cerca de 70 kD foi des- crito.

Na Patente dos Estados Unidos 5.118.673, as referidas ativida- des biológicas são atribuídas por Acemannan, um polissacarídeo extraído do gel de Aloe vera compreendendo moléculas de manose que são de cerca de 91% O-acetilado. Além da manose, outro componente de glicosila isto é ga- lactose, está presente em uma relação de cerca de 20 : 1. O peso molecular é em média cerca de 1000 kD. Este polímero não tóxico é também referido por ser eficaz na supressão de tumores.

Entretanto, recentemente, Nirmal Pugh e outro descreveu no Journal of Agricultural Food Chemistry, 49, 1030 - 1034 (2001) um polissaca- rídeo de alto peso molecular de Aloe vera com potente atividade imunoesti- muladora. O peso molecular deve ser relatado 4000 - 5000 kD. Os compo- nentes de glicosila principais são glicose (37,2%), galactose (23,9%), mano- se (19,5%), e arabinose (10,3%). É estabelecido que embora este polissaca- rídeo compreenda apenas 0,015% do peso seco original, sua atividade bio- lógica neste ensaio é inteiramente responsável pela atividade no sumo de Aloe cru. É proposto que a atividade imunoestimuladora muito mais baixa de acemannan seja devido a uma substância muito potente (mais provavelmen- te polissacarídeo Aloeride) que esta presente em quantidades de traço como um "contaminante".

Portanto, até agora não foi estabelecido com toda a certeza que a fração de Aloe vera causa a atividade biológica da referida planta. Um ob- jetivo da presente invenção é isolar uma nova composição de matéria deri- vável de Aloe vera ou um extrato de planta e animal que é adequado como suplemento alimentar ou em alimentos dietéticos, em cuidados pessoais ou em cosméticos, ou em uso farmacêutico, especialmente para impedir a ade- são de microorganismos em tecidos. Outro objetivo da invenção é fornecer processos pelos quais uma composição de matéria ou extrato pode ser iso- lado.

Foi constatado que uma nova fração de polissacarídeo negati- vamente carregado isolada de Aloe vera e principalmente compreendendo manose mostrou uma atividade biológica surpreendentemente mais alta do que o correspondente não carregado ou apenas frações de polissacarídeo fracamente carregado, cujas frações não ligam-se a uma coluna positiva- mente carregada. Esta atividade biológica mais alta foi constatada por sub- frações com todos os pesos moleculares aparentes. A presente invenção fornece uma tal composição de matéria compreendendo polissacarídeos deriváveis de Aloe vera com as seguintes características: a) o polissacarídeo compreende 70 - 90% de D-manose com uma ampla faixa entre 60 - 100%, 30 - 10% de D-glicose com uma ampla faixa entre 40 - 0% e 0 - 10% de outros monossacarídeos, b) os polissacarí- deos são negativamente carregados e c) os polissacarídeos ligam-se a uma coluna positivamente carregada. Com a segunda faixa mais ampla indicada é pretendido que um polissacarídeo com uma porcentagem em peso de mo- nossacarídeos indicados dentro de amplas faixas pertença ao escopo da invenção, porém aqueles com uma porcentagem em peso dentro de peque- nas faixas são preferidos. Todas as porcentagens relacionando-se em uma composição de matéria referem-se às porcentagens em peso.

Preferivelmente, na referida composição de matéria, os polissa- carídeos tem um peso molecular médio de cerca de 100 - 300 kD. Entretan- to, como também outras subfrações com um peso molecular médio ou de 10 - 50 kD, ou 50- 100 kD ou mais alto do que 300 kD mostram uma atividade biológica considerável, estas subfrações também formam um aspecto da presente invenção. Preferivelmente, a relação de D-manose e D-glicose nos referidos polissacarídeos está dentro da faixa de cerca de 5 a 20, preferivel- mente 7-10. A presente invenção também fornece um processo para prepa- rar a referida composição da matéria pelas seguintes etapas do processo: a) subfracionamento de um extrato de planta ou animal, por exemplo um extrato de Aloe ou Aloe vera em duas frações, uma com um peso molecular aparente de > + 5 kD, designada subfração I e uma com um peso molecular aparente de < + 5 kD. b) passagem da subfração I em uma coluna positivamente car- regada como por exemplo uma coluna de DEAE-Sepharose, uma coluna de DEAE-Sephadex ou uma coluna de DEAE-celulose. c) eluição da parte da subtração I ligada à referida coluna com uma solução de sal, por exemplo com uma solução de cloreto de sódio re- sultando em subtração l-Di d) dessalgação e ultrafiltração de l-Di, por exemplo por meio de uma membrana PM 10 sob pressão de nitrogênio, para concentrar l-Di em cerca de 0,1 do volume original do extrato de Aloe vera. e) opcionalmente preparação de subfrações de l-Di com pesos moleculares aparentes desejados de > 300 kD, 100 - 300 kD, 50 - 100 kD e 10-50 kD, particularmente por ultrafiltração seqüencial em uma membrana XM-300, XM-100, XM-50 e finalmente PM-10 ou por FPLC preparativa em uma coluna de Superose.

Preferivelmente, uma etapa de pré-filtração é realizada antes da etapa de processo "a" em uma coluna de Sephadex G-25.

Em um artigo de A. Femenia e outro, Carbohydrate Polymers 39, 109 - 117 (1999), também extratos de Aloe vera foram descritos, entretanto os referidos extratos não são também fracionados e não são também sepa- rados com a ajuda de uma coluna positivamente carregada. A presente invenção também fornece como uma substância adequada um extrato de planta ou animal, especialmente um extrato de Aloe, mais especialmente sendo um extrato de Aloe vera, indicado como extrato NAG-25 (nenhuma afinidade para Sephadex G-25), que compreende a composição da matéria como definida acima em uma concentração de 5 - 10, especialmente 8 vezes mais alta e de compostos com baixo peso mole- cular de cerca de 2 vezes mais baixo do que os extratos conhecidos na téc- nica. Geralmente um tal extrato NAG-25 de animal ou planta (a ser entendi- do como extrato NAG-25 de planta ou NAG-25 de animal) será uma seiva.

De acordo com outro aspecto da invenção, um processo foi for- necido para preparar um tal extrato NAG-25 de planta ou animal por purifica- ção do extrato de animal ou planta não tratado correspondente em uma co- luna G-25 de Sephadex para remover materiais com afinidade para a referi- da coluna, Por "correspondente" é significado as mesmas espécies de planta ou animal. Um tal extrato NAG-25 compreende todos os compostos molecu- lares elevados, sem qualquer afinidade para a matriz de polissacarídeo da coluna positivamente carregada usada, porém também compostos com bai- xo peso molecular menor do que os esperados. Se necessário, o extrato re- sultante é também concentrado por um fator de 5 a 50 pela remoção da água resultante no extrato NAG-25 de planta ou animal de acordo com a presente invenção, também indicado com 2QRide. Geralmente, se o com- posto de partida for um pó seco por vaporização, uma solução concentrada pode ser obtida começando-se em um baixo volume de água, caso em que nenhuma etapa de concentração é necessária.

Preferivelmente, se uma planta é usada para preparar a compo- sição de matéria ou o extrato NAG-25 de acordo com a invenção, está é uma planta Aloe, especialmente Aloe vera. Entretanto, um extrato contendo os polissacarídeos negativamente carregados pode também ser ganho de outras plantas. Polissacarídeos biologicamente ativos foram encontrados em Vaccinnium macrocarpon (Cranberry), Panax ginseng, Plantago, Echinacea, Garcínia, Arnica, Angélica, Hibiscus, Glycyrrhiza, Morinda etc. Se um animal for usado, especialmente peixes e lesmas são adequados. Entretanto, além dos extratos de plantas e animais também os extratos de organismos inferio- res tipo scaweed, esponjas e cogumelos devem ser considerados para este pedido de patente como pertencendo ao escopo da invenção. Portanto, para este pedido de patente, a expressão planta e animal também compreendem organismos inferiores.

De acordo ainda com um outro aspecto da invenção, um extrato de Aloe, especialmente um extrato de Aloe vera é fornecido, o qual foi ultra- filtrado preferivelmente com um método de fluxo cruzado em uma membrana para preparar subfrações com um peso molecular aparente desejado como indicado acima, porém com ambos os polissacarídeos carregados e não car- regados, ligando e não ligando em uma coluna positivamente carregada. Da mesma forma este extrato ultrafiltrado de Aloe compreende os novos polis- sacarídeos negativamente carregados de acordo com a invenção. Preferi- velmente, os referidos polissacarídeos carregados e não carregados são também separados em polissacarídeos carregados e não carregados pas- sando em filtros carregados, dos quais os polissacarídeos carregados são indicados com 2QRide.

Os novos polissacarídeos negativamente carregados, os extra- tos NAG-25 de animal ou planta e o extrato ultrafiltrado de Aloe compreen- dendo uma alta porcentagem dos referidos polissacarídeos negativamente carregados de acordo com a invenção aqui descrita tem uma alta atividade biológica e podem ser aplicados como suplemento alimentar ou em alimen- tos dietéticos, por exemplo para prevenir a adesão de bactérias, particular- mente na camada mucosa do epitélio gástrico humano. Além disso, os refe- ridos polissacarídeos negativamente carregados, os extratos NAG-25 de planta ou animal e os extratos de ultrafiltro de Aloe compreendendo os mesmos podem ser aplicados para cuidado pessoal e uso cosmético para prevenir infecções de microorganismos nocivos e prejudiciais, por exemplo no cuidado dental como em pasta de dentes para impedir a gengivite e cárie.

Além disso, os polissacarídeos carregados e os referidos extratos compre- endendo os mesmos podem provavelmente adequadamente ser aplicados em líquidos por exemplo para proteger as lentes oculares, em sprays e tôni- cos, e em gotas, cremes e géis para cuidar da pele, cabelo, olhos e ouvidos.

Finalmente, os referidos polissacarídeos e os referidos extratos compreen- dendo os mesmos devem ser aplicados em uso farmacêutico, especialmente como um medicamento ou adjuvantes em uma composição farmacêutica para prevenir ou curar infecções com microorganismos infecciosos tipo vírus, fungos e bactérias ou na prevenção e cicatrização de inflamações, e prova- velmente na imunoterapia e na cicatrização do ferimento. Uma infecção com quatro das referidas bactérias, as bactérias Heliobacter pylori, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus mutans e Streptococcus sanguis, pode particu- larmente ser combatida pelos polissacarídeos.

Em todo este pedido de patente, todas as porcentagens relacio- nando a uma composição da matéria se referem às porcentagens em peso.

Além disso, por "correspondente" entende-se como material de partida as mesmas espécies de planta ou animal como o extrato resultante. Além dis- so, a menos que de outra maneira indicado, por "extrato" entende-se extrato por água. A infecção do estômago por Helicobacter pylori é uma das infec- ções bacterianas mais comuns do mundo. Uma minoria dos indivíduos infec- tados desenvolve uma doença gastroduodenal associada com a referida bactéria. Exemplos destas são o desenvolvimento da doença de úlcera pép- tica, linfomas do tecido linfóide associados com mucosa de gastrite atrófica ou crônica e câncer gástrico. A adesão de Helicobacter pylori à mucosa está limitada à superfície apical das células epiteliais da mucosa e às células ali- nhando as depressões gástricas, particularmente na parte da base do estô- mago. Adesinas diferentes foram encontradas para mediar esta ligação, por reconhecimento de proteínas ou glicoconjugados específicos, isto é muci- nas, presentes na superfície celular eucariótica (D. Ilver e outro, Science 279. 373 - 377 (1998)). Portanto, pelo menos parte da adesão de Helicobac- ter pylori parece ser dependente de glicoconjugado. Entretanto, até agora a eficácia de um extrato NAG-25 de planta ou NAG-25 de animal, como por exemplo um extrato de Aloe ou um extrato de Aloe de ultrafiltração contendo polissacarídeos negativamente carregados de acordo com a invenção para combater uma infecção com Helicobacter pylori não foi em parte alguma descrita.

Em um ensaio ELISA estabelecido mostrou-se que os extratos de Aloe vera poderíam inibir a adesão de preparações de adesinas de Heli- cobacter pylori em mucinas salivares de fato. Portanto, foi determinado in- vestigar quais os componentes no extrato são responsáveis para a inibição.

Subfrações ativas de géis de Aloe vera foram obtidas por uma combinação de precipitação, peneiração molecular e cromatografia de permuta de ânion e foram caracterizados com referência ao peso molecular e composição de açúcar e mostraram ser novos. A presente invenção é ilustrada pelas seguintes figuras com as legendas: Figura 1: Eluição da fração ligada de 200 ml de fração AV-15 (a fração > 5 kD de NAG AV-15) de uma coluna de DEAE-Sepharose com um gradiente de NaCI de 0 - 2 M de NaCI. O eixo Y representa a concentração de NaCI (M) bem como a absorvência em 215 nm; o eixo X representa o vo- lume de eluição. Zero ml representa o ponto de partida do gradiente de NaCI de 0 - 3,0 M que foi aplicado depois da coleção da fração AV-D0 não ligada por DEAE seguido por lavagem da coluna com 2 volumes de coluna de água Milli-Q.

Figura 2: Inibição da aderência de mucina em camada S de He- licobacter pylori por extratos de Aloe vera de várias fontes com muc, controle positivo contendo apenas mucina AV, co-incubação de mucina com uma faixa de diluição de 2-16 vezes do extrato de Aloe vera AV-3 e AV-4 1:1 de produtos de Aloe Gel; AV-B, AV-D, AV-E e AV-F são fontes de Aloe vera comercialmente disponíveis concentradas 40, 10, 5 e 2,5 vezes respectivamente Valores de absorvência A490nm por cavidade em duplo, para mu- cina em quatro.

Figura 3: Inibição da subfração de 100 - 300 kD da fração carre- gada l-Di de um extrato de Aloe vera com muc, controle positivo contendo apenas mucina AV-2, um produto de Aloe-Gel de 1:1 em concentrações diferen- tes Valores de absorvência A490nm por cavidade em duplo, para mu- cina em quatro.

Figura 4: Inibição de aderência de Helicobacter pylori rotulada por FITC em fatias de antro-humano por subfrações de extrato de Aloe vera AV-5 com a. visão regular b. fatia consecutiva incubada com Helicobacter pylori rotulada por FITC e fração total I c. fatia consecutiva incubada com Helicobacter pylori rotulada por FITC e fração l-D0, idêntica com controles sem subfrações de Aloe vera.

As seguintes abreviações usadas em todo este pedido de paten- te tem o significado: DEAE = dietilaminoetila FITC = 5-isotiocianato de fluoresceína HPAEC-PAD = cromatografia de permuta de íon de alto pH com detecção amperométrica pulsada BCA = ácido bicincronínico ELISA = imunoensaio ligado por enzima A490nm = absorvência em 490 nm NMR = ressonância magnética nucléica A fração de ligação de DEAE pode ser isolada da fração I > 5 kD de cromatografia de NAG-25 AV-15 por cromatografia de DEAE-Sepharose, DEAE-celulose e DEAE-Sephacel sob eluição com 0,5 ou 1 M de NaCI. Isto é exemplificado pelo gradiente de NaCI na Figura 1 para a eluição da fração de ligação de DEAE de 200 ml de fração I de AV-15. Adesão não específica à matriz de polissacarídeo é improvável uma vez que a fração de NAG-25 e não o gel de Aloe é usada como o material de partida para a o subfraciona- mento. Portanto, a eluição dependente de NaCI confirma que a ligação de DEAE é causada por uma carga negativa nas moléculas. As proteínas ou peptídeos estiveram abaixo dos níveis detectáveis. A análise de açúcar reve- lou que o ácido galacturônico está presente em pequenas quantidades, po- rém este açúcar mostrou também estar presente na fração D0 de não ligação (resultados não mostrados). Desse modo, a natureza molecular da carga negativa não é ainda conhecida.

Todos os extratos de Aloe vera disponíveis inibiram a interação com as mucinas de uma maneira dependente de dose quando eles foram co-incubados com uma concentração fixa de mucina, observe Figura 2. As variações em atividade inibidora refletem diferenças em composições de extratos em dependência de fonte ou condições de cultura da planta Aloe vera porém não alteram severamente a atividade biológica proporcional das várias subfrações. Aparentemente, um componente de Aloe vera ou compo- nentes de Aloe vera compete com mucina para a ligação à preparação de adesina de Helicobacter pylori. A maioria da atividade inibidora dos extratos de Aloe vera pare- cem residir em uma subtração, I, com um peso molecular de pelo menos 5 kD, de acordo com seu comportamento em cromatografia Sephadex G-25.

Outros estudos foram focalizados sobre esta fração carregada por causa de sua alta atividade. A atividade de carboidrato e cromatografia de permeação analítica em uma coluna de Superdex HR-200 revelou que os polissacarí- deos foram os componentes principais. A composição de açúcar depende do extrato de Aloe vera porém qualquer extrato consiste em homo e hetero po- límeros de manose e glicose. A grandeza da atividade inibidora pode ser retida e eluída espe- cificamente com NaCI das colunas de permuta de ânion. A cromatografia de DEAE-Sepharose foi aplicada para isolar esta fração de polissacarídeo apa- rentemente negativamente carregado, indicada com fração l-Di. Ultrafiltra- ção seqüencial foi empregada para obter subfrações com pesos moleculares aparentes de > 300 kD, 100 - 300 kD, 50 - 100 kD e de 10 - 50 kD. Estas subfrações foram também preparadas para os componentes que não liga- ram a DEAE-Sepharose indicada com fração l-D0. Todas as subfrações pa- recem conter de 90% ou particularmente de 95% ou mais homo ou hetero polímeros de manose e glicose, dos quais as polimanoses formam os com- ponentes principais como resumidos na tabela 1 aqui abaixo. O restante compreende galactose e vários açúcares não identificados (não mostrados na tabela).

Como mostrado na tabela 1, as atividades inibidoras das frações de ligação de DEAE são consideravelmente maiores do que as subfrações de não ligação do extrato de Aloe vera. A subfração de 100 - 300 kD de l-Di expressa a atividade inibidora mais alta (82%), embora no ensaio por cavi- dade, viz. 12,5 od, apenas uma pequena quantidade de polissacarídeo de Aloe vera está presente, nl. 0,325 <xg de manose e 0,045 <xg de glicose. Isto representa cerca de 9,3 nM de polissacarídeo no volume final de 200 od as- sumindo um peso molecular médio de 200 kD. A inibição é dependente de dose e 50% da inibição é alcançada em uma concentração mais baixa de 10 vezes de cerca de 0,03 ocg de manose por cavidade ou cerca de 0,9 nM de polissacarídeo, observe Figura 3. A quantidade muito baixa da composição da matéria recuperou na fração de ligação de DEAE de > 300 kD é também muito ativa por pmol de polimanose quando os pesos moleculares altos fo- ram levados em conta. As outras duas frações de ligação de DEAE mostram uma atividade específica muito mais baixa porém ainda mais alta do que nas subfrações correspondentes de l-D0 de não ligação de DEAE. Notavelmente, nenhuma atividade inibidora foi detectável para os polissacarídeos presentes na fração l-D0 com pesos moleculares > 300 kD.

Tabela 1 Atividade inibidora de subfrações l-D0 e l-Di sobre a aderência de H. pylori As subfrações do extrato de Aloe vera AV-2 (observe Materiais) são preparados por ultrafiltração seqüencial começando de 25 ml do referido extrato AV-2. O volume de cada subfração é ajustado para 12,5 ml. Os da- dos são com base nos valores em duplo obtidos por quantidades iguais (12,5 od) de cada fração e são expressos relativos à absorvência avaliada nas cavidades de controle contendo apenas mucina. A atividade inibidora de 12,5 od do extrato AV-2 original com 813 ocg de glicose/ml e 325 ocg de mano- se /ml, viz. 286 nM de polissacarídeo, foi de 76%. A inibição da ligação de Helicobacter pylori em mucosa gástrica foi demonstrada por incubação de fatias seqüenciais da mucosa de antro- humano com Helicobacter pylori rotulada por FITC na ausência e presença de subfrações de Aloe vera. Como no estudo de Boren e outro, Science, 262, 1892 - 1895 (1993), a ligação seletiva de células de Helicobacter pylori rotulada por FITC foi observada apenas nos revestimentos mucosais do an- tro, observe figuras 4a e 4c. A co-incubação de Helicobacter pylori rotulada por FITC com a fração de peso total I, viz. Frações l-D0 e l-Di de um extrato de Aloe vera inibiu fortemente a aderência das bactérias à mucosa (observe figura 4b) que está em contraste agudo com a ausência de inibição quando a subfração l-D0 foi sozinha co-incubada. Isto é outra forte indicação que a atividade inibidora reside na fração negativamente carregada.

Um padrão de inibição comparável foi encontrado para Helico- bacter pylori rotulada por Syto-13 onde Syto-13 é uma mancha fluorescente verde aplicando duas concentrações diferentes das subfrações de Aloe vera de acordo com a invenção em placas de multicavidade rotuladas por MUC5.

Em um artigo de Van den Brink e outro, Gut 46, 601 - 607 (2000), "H. pylori co localizes with MUC-5AC in the human stomach" foi descrito que H. pylori no estômago liga-se a uma mucina específica presente na parte do antro do estômago. Portanto, o efeito das subfrações de Aloe vera em mucina salivar similar em um sistema de ensaio in vitro pode ser usado como um modelo para a ligação específica de mucina de H. pylori ao epitélio do estômago.

Os resultados são mostrados nas tabelas 2 e 3.

Tabela 2 Atividade inibidora da subfração l-Di de um extrato de AV sobre a aderência de H. pylori Tabela 3 Atividade inibidora da subfração l-Di de um extrato de AV sobre a aderência de H. pylori Da mesma maneira, o efeito da aderência de uma subfração de Aloe vera de acordo com a invenção em duas cepas rotuladas por Syto-13 de P. aeruginosa foi testado em placas de multicavidade rotuladas por MUC5. A quantidade das bactérias ligadas às placas foi dependente da quantidade de MUC-5 revestida. Os resultados são dados na tabela 4 e ta- bela 5, respectivamente.

Tabela 4 Atividade inibidora da subfração l-Di de um extrato de AV sobre a aderência de P. aeruginosa Tabela 5 Atividade inibidora da subfração l-Di de um extrato de AV sobre a aderência de Pseudomonas aeruginosa Da mesma maneira, o efeito da aderência de uma subfração de Aloe vera de acordo com a invenção em uma cepa rotulada por Syto-13 de Streptococcus mutans e em uma cepa rotulada por Syto-13 de Streptococ- cus sanguis foi testado em saliva enriquecida com aglutinina revestida às placas. A quantidade das bactérias ligadas às placas foi dependente da quantidade de MUC-5 revestida. Os resultados são dados na tabela 6 e ta- bela 7, respectivamente.

Tabela 6 Atividade inibidora da subfração l-Di de um extrato de AV sobre a aderência de Streptococcus mutans Tabela 7 Atividade inibidora da subfração l-Di de um extrato de AV sobre a aderência de Streptococcus sanguis Será avaliado pela pessoa versada na técnica que os polissaca- rídeos antiadesivos de acordo com a invenção são antiinfectantes contra todos os microorganismos que invadem a superfície do tecido hospedeiro que são exemplificados pelas bactérias Helicobacter pylori, Pseudomonas aeruginosa, Streptomyces mutans e sanguis como mencionadas acima. Ex- ceto das bactérias, a invasão é um fenótipo comum em células de câncer, leucócitos, parasitas, bactérias e viroses envolvendo a adesão de célula- célula, adesão de célula-matriz, proteólise e motilidade. Estas atividades são reguladas pelo discurso cruzado entre invasores e hospedeiro. A adesão de microorganismos à superfície do tecido hospedeiro é freqüentemente a pri- meira etapa em patogênese. Cada vez mais a população de paciente torna- se altamente suscetível à morbidez e mortalidade associadas com os pató- genos resistentes à droga. A inibição da adesão é portanto uma importante propriedade de novos antiinfectantes.

Os polissacarídeos de acordo com a invenção reduzem a carga de biopelícula. Isto é devido a uma redução na adesão de Gram negativas e provavelmente também de bactérias Gram positivas às células. Além disso, os referidos polissacarídeos também interferem com os processos de viro- ses, fungos, flagelados e outros parasitas e pode, ser parte de uma terapia para tratar ou prevenir afecções e doenças do corpo inteiro de ambos os humanos, animais e possivelmente plantas. Os referidos polissacarídeos que consistem em monossacarídeos simples espera-se que não sejam tóxi- cos igualmente em aplicações orais, tópicas, injetáveis e sistêmicas.

Relacionando-se a aplicação dos polissacarídeos negativamente carregados ou extratos NAG-25 animais ou de planta compreendendo os referidos polissacarídeos de acordo com a presente invenção em forma oral, todas as formas de dosagem adequadas aplicáveis tal como fluidos injetá- veis ou veículos opcionalmente compreendendo excipientes adequados tal como um produto de celulose como por exemplo uma sílica ou celulose mi- crocristalina ou microfina, desintegrantes como por exemplo amidos modifi- cados, carbóxi metil celulose sódica ou pirrolidona de poli vinila reticulada, opcionalmente lubrificantes e opcionalmente agentes adoçantes tipo sabores e aromas, formam um aspecto da presente invenção. Da mesma forma, ou- tras formas de dosagens orais como cápsulas e xaropes opcionais junta- mente com excipientes adequados compreendendo os polissacarídeos da presente invenção formam um aspecto desta. Entretanto, as referidas for- mas de dosagens orais podem também ser aplicadas como um medicamen- to na prevenção ou cicatrização de uma infecção com microorganismos in- fecciosos ou na prevenção e cicatrização de inflamações. Além disso, da mesma forma, as formas de dosagens tópicas como cremes ou géis formam um aspecto da presente invenção, especialmente no campo de cuidado pes- soal ou para uso cosmético.

Exemplos de afecções, infecções e doenças que podem ser pre- venidas e tratadas pelos polissacarídeos antiadesivos da presente invenção são além disso aqueles causados por microorganismos que invadem o trato gastrointestinal como o estômago por exemplo Helicobacter pylori aqueles de: pele, causada por - Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermitis que são patógenos comuns, por exemplo em hospitais -viroses tal como vírus da herpes associado com sarcoma de Kaposi, vírus da herpes simples - fungos tal como candida sp., Blastomyces dermatidis; adesão à pele também inclui a adesão em células endoteliais microvasculares dérmi- cas olhos, causado por - Staphylococcus epidermitis que desempenha um importante papel na patogênese de algumas formas de endoftalmite ocorrendo depois da cirurgia de catarata - Moraxella bovis como a fonte de keratoconjunctivitis bovina in- fecciosa ouvido, nariz e garganta, causado por - Staphylococcus aureus que adere à pele e tecidos mucosos - bactérias envolvidas em Otite média e infecções nasofaringeais tal como Haemophilus influenza, Streptococcus pneumoniae e Moraxella catarrhalis a cavidade oral, onde a biopelícula da placa dental desempenha um papel fundamental no progresso das doenças dentais e os polissacarí- deos são de grande importância na ecologia da biopelícula, causada por - bactérias envolvidas em cáries tal como Streptococcus sobri- nus como cepa acariogênica, Streptococcus mutans, Streptococcus saliva- rius, Streptococcus gordonii e Actinomyces viscosus, Actinobacillus actino- mycetemcomitans - bactérias periodontopatogênicas tais como Porphyromonas gingivalis e Streptococcus salivarius, Streptococcus oralis, Fusobacterium nucleatum e Prevotella intermedia - todos spirochetes orais são classificados no gênero Trepone- ma, tais como denticola, pectinovorum, socranskiie vincentii, - Mycoplasma salivarium - microorganismos envolvidos em polipose - microorganismos envolvidos em Sinusitis o trato urogenital, causado por - Uropathogenic Escherichia coli gram-negativa que adere aos tecidos do trato urogenital - Mycoplasma genitalium - Trichomonas vaginalis - Espécies de Candida - Adesão de Neisseria gonorrhoeae ao epitélio oviductal - Treponema pallidum que está envolvida em perivasculitis, anormalidades na célula endotelial que são aspectos histopatológicos proe- minentes da sífilis e várias lesões cutâneas que são os aspectos clínicos principais da sífilis - Escherichia coli - Espécies de Citrobacter o intestino, causado por - Espécies de Salmonella por exemplo Salmonella typherium - Proteus mirabilis - Espécies de Clostridium, por exemplo difficile, perfringens, bi- fermentans - Espécies de Shigella, por exemplo flexneri - Espécies de Mycoplasma, por exemplo gallisepticum - Espécies de Enterococcus - Bacteroides fragilis - Espécies de Bacillus - Listeria monocytogenes - Vírus da Hepatitis A - Campilobacter jejuni - Salmonella typhimurium - Yersina enterocolitica e Yersina pseudotuberculosis - Aeromonas veronii biovar sóbria - Erwinia chrysanthemi que é um patógeno de planta modelo que tem o potencial de parasitar hospedeiros mamíferos bem como plantas o trato respiratório causado por - Pseudomonas aeruginosa, um patógeno facultativo gram- negativo dos brônquios e o pulmão bem como cístico em pacientes com fibrose - Klebsiella pneumoniae - Espécies de Bordetella, pertussis, parapertussis e bronchisep- tica - bactérias do gênero Legionella são parasitas intracelulares e patógenos humanos principais - o vírus sincicial respiratório (RSV) que causa infecção no trato respiratório potencialmente mais baixa em criança - Mycoplasma pneumoniae - Rhinovirus que potencializa a indução de mudanças pró- asmáticas - Cryptococcus neoformans que usualmente ocorre nos pul- mões, e está envolvida nas interações entre leveduras e células epiteliais alveolares - Espécies de Streptococcus tal como pyogenes ou gordonii - Escherichia pneumoniae, um importante patógeno respiratório - o complexo de Burkhoideria cepacia que consiste em pelo me- nos cinco genomovars bacterianos bem documentados, cada dos quais foi isolada do esputo de diferentes pacientes com fibrose cística - Mannheimia (Pasteurella) haemolytica que é um dos mais im- portantes patógenos respiratórios dos ruminantes domésticos e causa sérias erupções de pneumonia aguda em bodes e bezerros, cordeiros em desen- volvimento e desmamados, neonatais. É também uma importante causa de pneumonia em animais adultos. -Vírus Rhinotracheitis, vírus parainfluenza-3 ou vírus sincicial respiratório bovino que predispõe animais a infecção M. hemolítica os órgãos, sangue, linfa e o sistema linfático, causados por - Staphylococcus aureus em endocarditis bacteriana, - Streptococcus sanguis em endocarditis bacteriana, - Staphylococcus epidermidis em endocarditis bacteriana, - Bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, tal como S. aureus e E. coliem infecção intravascular - Coxsackievirus - Rotavírus - Murine cytomegalovirus - Adenovirus - Neisseria meningitides - Chlamydia pneumoniae -Bactérias Wolbachia relacionadas com Rickettsiales Gram- negativas, em pessoas infectadas por Onchocerca volvulus - Doença de Lyme espiroqueta Borrelia burgdorferi - Coxiella burnetii, o agente da febre Q - Acholeplasma laidlawii -invasão intracelular é um importante aspecto da doença de Carrion causada por Bartonella Bacilliformis. Ambas as fases de tecido e hemáticas da doença envolvem a ligação inicial do organismo em células endoteliais e eritrócitos. - Paracoccidioides Brasiliensis, um fungo dimórfico conhecido para produzir doença sistêmica invasiva em humanos.

Portanto, de acordo com a invenção, uma composição de maté- ria compreendendo polissacarídeos negativamente carregados, opcional- mente presentes em um extrato NAG-25 de animal ou de planta ou um ex- trato ultrafiltrado de Aloe de acordo com a invenção, que pode eficazmente ser aplicada para a prevenção e tratamento de infecções com microorganis- mos, presumivelmente por prevenção da adesão dos referidos microorga- nismos. A referida composição ou extrato NAG-25 em um extrato ultrafiltrado de Aloe pode ser aplicada como suplemento de alimento e em alimento die- tético, em cuidado pessoal e em uso cosmético, e em uso farmacêutico. A presente invenção será exemplificada também pelos seguintes exemplos que não devem ser considerados como restringentes do escopo da invenção de qualquer maneira.

Materiais e Métodos Materiais: Colunas de poliestireno disponíveis com volumes de leito máxi- mos de 2 ml, foram obtidas de Pierce, Rockford, Ireland. Colunas de Sephadex G-25 Fine, DEAE-Sepharose, de dessalgação de 5 ml de fluxo rápido e colunas MonoQ HR 5/5 de 1 ml e Superose 200 HJR 10/30 foram adquiridas de Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden. As unidades de filtração de 10 ml e 50 ml bem como uma faixa de membranas de ultrafil- tração foram obtidas de Amicon Corp., Lexington, USA e Millipore, Bedford, USA. As colunas Carbopac TM MA1 e PA1 analítica (4 x 250 mm) em com- binação com uma coluna Carbopac TM Aminotrap Guard (10 x 32 mm) e um sistema HPAEC-PAD foram obtidas de Dionex, Sunnydale, CA, USA. As placas de microtítulo de cavidades 96 de base plana de ligação elevada Flu- orotrac 600 foram obtidas de Greiner, Frickenhausen, Alemanha. Mucina salivar humana de peso molecular elevado bem como anticorpos monoclo- nais anti-humano de camundongo (MabF2) contra mucina salivar foi gentil- mente fornecida pelo Dr. E. Veerman, Department of Oral Biochemistry, AC- TA, Amsterdam. Salina humana enriquecida com aglutinina foi uma doação em espécie do Dr. A. J. M. Ligtenberg, Department Oral Biochemistry, ACTA, Amsterdam. IgM e IgG anti-camundongo de bode rotulados por peroxidase da raiz-forte foram obtidos de American Qualex, San Clemente, CA, U.S.A.. 5-lsotiocianato de fluoresceína (FITC) foi obtido de Sigma, St Louis, MO, U.S.A.. A mancha de ácido nucléico fluorescente verde Syto-3 foi obtida de sondas Moleculares (Leiden, The Netherlands) como uma solução de 5 mM em dimetilsulfóxido. Os açúcares padrões usados para análise de car- boidrato foram de fontes comerciais e de grau analítico.

Extratos de aloe Vera: Os extratos de aloe vera (AV-1 a AV-7, AV-15, AV-16 e AV-A a AV-F) foram fornecidos por Bioclin B. V. (Delft, the Netherlands) e originados de várias fontes comerciais. AV-A, AV-3 e AV-4 compreendem extrato de Aloe Vera e gel em uma relação de 1 : 1, AV-B e AV-D são concentrados de fontes comerciais com um fator 40 e 10, respectivamente. O extrato AV-2 contém 813 e 325 <xg de glicose e manose respectivamente. AV-16 foi pre- parado por ultrafiltração da seiva filtrada do produto de filete de gel interno de Aloe Vera como também descrito, com um método de contra fluxo em uma membrana de fibra oca com um corte de 30 kD, seguido por concentra- ção de 10x. AV-5, AV-6, AV-7 e AV-E foram recebidos como pós liofilizados, AV-F e AV-17 como um pó secado por vaporização.

Todos esses produtos foram produtos de filete de gel interno de Aloe. Estes filetes de gel foram preparados como descrito na patente CA N°. 1305475. Os processos de liofilização e secagem por vaporização são co- nhecidos pelos versados na técnica; os detalhes diferem-se quanto às várias fontes.

Os extratos e pós foram armazenados congelados diretamente após o recebimento; nos intervalos, os pós e extratos ressolubilizados dos experimentos foram mantidos a 4°C durante não mais do que um mês. Os extratos foram obtidos a partir de folhas tiradas de Aloe barbendensis Miller.

Uma mistura a 2% de componentes de estabilização, consistindo em ácido ascórbico, benzoato de sódio, sorbato de potássio, tocoferol, álcool de etila, ácido cítrico e sorbitol, foi adicionada diretamente após a colheita na planta- ção. Algumas preparações foram recebidas como pós liofilizados os quais foram reconstituídos pela adição de água milliQ ao volume desejado. Uma preparação crua de Acemannan foi gentilmente fornecida por Dr. R. Zar- zycki, Carrington Laboratories Inc. (Irving, TX).

Subfracionamento de extratos de Aloe vera: 50 - 150 ml de extratos de Aloe vera e pós reconstituídos foram centrifugados durante 45 minutos a 15.000 Xg a 15°C. O pélete foi descarta- do e o sobrenadante foi filtrado em uma membrana de 0,2 οατι. Na rotina, a solução clara resultante foi opcionalmente filtrada em um volume de leito pequeno (1 ml por 5 ml) de Sephadex G-25 para remover componentes de Aloe vera que tiveram afinidade para este material (Fração III, da mesma forma indicada como extrato de Aloe vera NAG-25, observado abaixo). Fra- ção I (peso em mol. aparente > + 5 kD) e II (peso em mol aparente < + 5 kD) foram preparadas por FPLC (Âcta Explorer 10S, Amersham / Pharmacia, Uppsala, Sweden) em duas colunas de dessalgação de 5 ml acopladas (Pharmacia) que foram eluídas com água milli-Q em uma taxa de fluxo de 5 ml / min; a absorvência foi registrada em vários comprimentos de onda entre 190 e 280 nm. Isto foi executado pela injeção repetida automatizada de vo- lumes de 0,5 ml do extrato resultante e separação e coleta das duas frações sobre a base de alterações na condutividade, empregando AKTA Explorer 10S. A Fração II foi liofilizada e subseqüentemente solubilizada em água milliQ a 0,1 do volume original do extrato e foi armazenada a -20°C até o uso. A Fração I foi passada em uma coluna de DEAE-Sepharose (preparada em água milliQ; volume de leito de 10 ml por 50 ml de extrato original) e la- vada com 2 volumes de coluna de água milliQ para coletar as frações não retardadas (l-D0) e fracamente retardadas (l-Dw). Os materiais ligados (l-Di) foram eluídos com 1 volume de coluna de 0,5 M de NaCI em água milliQ. A

Fração l-D0 foi concentrada a 0,1 do volume original do extrato de Aloe vera por ultrafiltração, sob pressão de nitrogênio, através de uma membrana PM10 usando uma unidade de filtração de 10 ou 50 ml. A Fração l-Di foi dessalgada pelo procedimento anteriormente descrito e subseqüentemente foi concentrada a 0,1 do peso original do extrato de Aloe vera por ultrafiltra- ção em um filtro com PM-10. Em alguns experimentos, as subfrações com pesos moleculares aparentes de > 300, 100 - 300, 50 - 100 e 10 - 50 kD fo- ram preparados a partir de Frações l-D0 e l-Di por ultrafiltração seqüencial, respectivamente, em uma XM-300, XM-100, XM-50 e finalmente uma mem- brana PM-10. Alternativamente, as subfrações comparáveis foram prepara- das por FPLC preparativa em uma Superose 200 FIR 10/30. Cada subfração foi lavada três vezes adicionando-se água milliQ a 10 vezes o volume final obtido; a primeira lavagem foi adicionada à fração subseqüente antes da filtração no próximo filtro. Todas as frações foram armazenadas em alíquo- tas a - 20°C até o próximo uso.

Extrato de Aloe vera NAG-25: 10 gramas de extrato secado por vaporização de Aloe vera se- cado por vaporização originando a partir de 2 litros de extrato de Aloe vera foram solubilizados em 200 ml de água Milli-Q e passados em uma coluna Sephadex G-25 (5 cm de largura e 10 cm de altura; preparada em água Milli-Q; taxa de fluxo de 7,5 ml / min) para remover materiais que tem afini- dade para a matriz de Sephadex G-25 e reduz o teor de moléculas de baixo peso molecular. A coluna é subseqüentemente lavada com água Milli-Q e o extrato de Aloe vera NAG-25 é coletado com o eluído de 60-310 ml.

Bactérias e extratos bacterianos: H. pylori tipo silvestre (ATCC 43504) foi desenvolvida sob condi- ções microaerofNicas em placas de ágar-sangue DENT como descrito por F.namavar e outros, Infection Immunity, 66, 444 - 447 (1998)]. Os extratos de Helicobacter pylori contendo as adesinas da membrana externa, a assim chamada camada S, foram preparados a partir de culturas bacterianas con- fluentes de duas ou mais placas ágar. As bactérias foram suspensas em 0,15 M de NaCI, vortexadas durante 1 minuto, e centrifugadas durante 30 minutos a 5000 Xg. O sobrenadante contendo o extrato bacteriano foi arma- zenado a -80°C após a determinação da concentração de proteína por en- saio de proteína de BCA (Pierce, Rockford, USA). H. pylori rotulada por FITC foi preparada por incubação de bactérias em 1 ml de 0,2 M de tampão de carbonato (pH 8,0) contendo 0,1 mg / ml de FITC durante 15 minutos no es- curo em albumina (PBST-BSA), as células foram suspensas no mesmo tam- pão em uma densidade em 0,13 - 0,20 A6oonm de unidades e foram armaze- nadas em alíquotas de 0,1 ml até serem usadas.

As culturas bacterianas de cepas de Psuedomonas aeruginosa PA025 e PA14 foram obtidas a partir do Department of Medicai Microbiology, VU medicai centre e de Streptococus mutans e Streptococus sanguis foram obtidas a partir do Department Oral Biochemistry, ACTA, Amsterdam. No caso das bactérias terem sido usadas em um ensaio de inibição fluorescen- te, as bactérias foram suspensas e diluídas em 100 mM de acetato de sódio (pH 5), contendo 0,5% de Tween-20 em uma absorvência final em 700 nm de 0,1. As bactérias foram rotuladas fluorescentes pela adição de Syto-13 (1 : 500 ν/ν).

Ensaio de inibição fluorescente 600 placas Fluotrac foram revestidas com uma faixa de diluição de mucina salivar (para H. pylori e Pseudonomas aeruginosa) ou saliva hu- mana enriquecida com aglutinina (para Streptococus mutans e Streptococus sanguis) em tampão de revestimento (0,1 M de carbonato de sódio (pH 9,6)).

As placas foram incubadas durante a noite a 4°C e subseqüentemente lava- das 4 vezes com PBS-0,1% de Tween-20 (tampão de lavagem). As bacté- rias rotuladas por Syto-13 (50 od_) foram adicionadas às cavidades, seguido por 50 od_ de uma diluição de amostra de l-Di de Aloe vera ou água (controle positivo). As cavidades sem mucina revestida serviram com um controle ne- gativo. Após a incubação durante 1 hora a 37°C, as placas foram lavadas com tampão de lavagem. A fluorescência foi avaliada com Fluostar Galaxy, comprimento de onda de excitação e de emissão e foram respectivamente 485 e 520 nm.

Análise de monossacarídeo: A análise de monossacarídeos foi executada por cromatografia de troca iônica de pH elevado com detecção amperométrica pulsada (HPA- EC-PAD) em uma coluna Carbopack TM MAI após a hidrólise das frações durante 4 h em 2 M de ácido trifluoroacético a 100°C. A coluna foi eluída com 0,2 M de NaOFI em uma taxa de fluxo de 0,4 ml / min. e foi calibrada com uma mistura de açúcares padrões.

Exemplo 1 Inibição de aderência de H. pylorià mucina salivar A inibição da ligação H. pylori de adesina humana à mucina sali- var humana por extratos de Aloe vera ou subfrações foi estudada por um ELISA estabelecido (observe F. Navamar e outros, anteriormente indicado), no qual placas de microtítulo revestidas com uma preparação de cama S de Helicobacter pylori (100 d / cavidade; 10 - 20 <xg de proteína / ml; 16h a 4°C; PBS de tampão de lavagem (pH 7,5)-0,1% de Tween 20 (v/v) (PBST)) em duplicata com mucina salivar humana na presença e ausência de faixas de diluição de extratos de Aloe vera ou frações durante 2 h a 37°C. O volume total das misturas de incubação foi 100 od, que foi composto de 50 od de mu- cina salivar (0,2 - 0,5 <xg / ml) e 50 od de uma diluição de amostra de Aloe vera igualmente em 50 mM de acetato de sódio -150 mM de NaCI - 0,5% de Tween 20 (pH 5,0). F2 de anticorpo monoclonal, reconhecendo os grupos de sulfo-Lewis expressados na mucina salivar, e anticorpos anti-camundongo de bode rotulados por peroxidase foram usados para detecção da quantida- de de mucina ligada após serem lavados com PBST no princípio, por exem- plo, por E. Veerman e outros, Glycobiology 7, 737 (1997).

As amostras foram testadas em duplicatas em uma faixa de di- luição de 2 vezes. A atividade inibidora foi expressa como diminuição em porcentagem de A490 nm relativa às cavidades de controle contendo apenas mucina após correção para ausência de reagente (Reagent blank). Os resul- tados são dados nas figuras 2 e 3 e na tabela 1. Como anteriormente des- crito, as atividades inibidoras das frações de ligação de DEAE são muito mais elevadas do que das frações de não ligação. A partir desta fração de ligação de DEAE, a subfração de 100 - 300 kD expressa a atividade inibidora superior (82%).

Exemplo 2 Inibição da aderência de H. pylorià mucosa gástrica A aderência de bactérias rotuladas por FITC às seções do antro gástrico foi determinada de acordo com Borèn e outros, observe acima. Fati- as seqüenciais de seis οατι de antro gástrico humano, derivadas de tecido normal e de pacientes com tecido metaplástico e levemente e moderada- mente inflamado foram fornecidas pelo Department of Pathology. As fatias seqüenciais foram desparafinizadas em xileno (10 min, enxaguando 3 ve- zes), seguido por lavagem 3 vezes durante 5 min. em etanol, reidratação em água milliQ vagarosamente fluindo e lavagem 3 vezes durante 5 minutos em PBS. Um círculo foi desenhado em volta das fatias com uma caneta de PAP PA03 (Diagnostics BV, Uithoorn, The Netherlands) seguido por incubação com 0,1 ml de PBST-BSA sob condições de umidade, durante pelo menos uma hora a 4°C. Finalmente, o tampão foi substituído por 0,1 ml de bactérias rotuladas por FITC mais ou menos (controle positivo) uma faixa de diluição extrato de AV-5 ou subtração em PBST-BSA. As fatias foram incubadas du- rante 1 hora no escuro. As bactérias não ligadas foram removidas lavando- se 6 vezes com PBST-BSA em uma tabela de rotação. Finalmente, PBS em glicerol (1 : 1 v/v) foi aplicada às seções antes de sela-las com um vidro de cobertura para microscopia de fluorescência usando um microscópio Nikon Eclipse (Uvikon, Bunnik, The Netherlands), com uma câmera digital Nikon DxM 1200 e o programa de controle da câmera Nikon ACT-1.

Os resultados são dados na figura 4. Os controles sem subtra- ções de Aloe vera foram idênticos à placa c (não mostrado). Como anterior- mente descrito, a fração I de peso total de um extrato de Aloe vera fortemen- te inibiu a aderência de bactérias à mucosa (observe a figura 4b) ao mesmo tempo que esta inibição foi reduzida a quase zero quando a fração descar- regada sozinha é co-incubada com as bactérias rotuladas por FITC.

Exemplo 3 Inibição da aderência de H. pylori em placas de multicavidade rotuladas por MUC5 No ensaio de inibição fluorescente, bactérias de vida, das quais o DNA foi rotulado com a tintura fluorescente Syto-13, são incubadas na presença ou ausência de uma preparação de l-Di de A. vera em uma placa de cavidade 96 revestida com as diluições indicadas de MUC-5 de mucina salivar ou saliva enriquecida com aglutina. Em cada cavidade a mesma quantidade de bactérias rotuladas com Syto 13 estava presente. Por experi- mento, todas as quantidades continham a mesma quantidade da preparação de A. vera no caso de co-incubação com bactérias. Todos os ensaios foram executados em duplicata.

Os experimentos típicos são mostrados nas tabelas 2 e 3. A ex- tensão da ligação de Helicobacter pylori de vida às cavidades foi claramente dependente da quantidade de MUC-5 revestida presente sobre as cavida- des. A co-incubação com a preparação de l-Di inibiu a ligação de Helicobac- ter pylori à MUC-5 em uma maneira dependente da concentração. A inibição aumentou quando a quantidade de MUC-5 diminuiu (Experimento 1) e da mesma forma quando mais l-Di foi adicionado (Experimento 2). A quantida- de de material em 0,01 ml de l-Di presente nas cavidades foi derivada de 0,02 g de pó de AV-17 (correspondente a 10 - 20 ml de gel de A. vera origi- nal).

Exemplo 4 Inibição da aderência de Pseudomonas aeruginosa rotulada por Syto-13 em placas de multicavidade rotulada por MUC-5 Os efeitos de uma preparação de l-Di de AV-16 foram testados em duas cepas de P. aeruginosa, P.aeruginosa PA025 e P. aeruginosa PA14. A quantidade de material em 0,01 ml de fração l-Di de AV-16 foi deri- vada de 2,5 ml de AV-16. A quantidade de bactérias ligadas às placas foi dependente da quantidade de MUC-5 revestida. Os resultados foram dados na tabela 4 e 5, respectivamente. A co-incubação com 0,01 ml de l-Di de AV-16 resultou em uma forte inibição da ligação das bactérias. O estudo pi- loto sugere que a inibição é concentração dependente desde que a inibição aumentou quando a quantidade de MUC-5 revestida diminuiu.

Exemplo 5 Inibição da aderência de S. sanguis e S. mutans rotuladas por Syto-13 em saliva enriquecida por aglutinina revestida às placas Os efeitos de uma preparação de l-Di de AV-16 foram testados em duas cepas de Streptoccocus mutans e Streptococcus sanguis. A quan- tidade de bactérias ligadas às placas foi dependente da quantidade de saliva enriquecida por aglutinina revestidas às placas. A co-incubação com 0,01 ml de AV-16-D1 resultou em uma forte inibição da ligação das bactérias. A quantidade de material em 0,01 ml de AV-16-D1 foi derivada de 2,5 ml de Aloe vera 16.

Claims (25)

1. Composição de matéria em forma isolada, caracterizada pelo fato de que compreende polissacarídeos deriváveis de Aloe vera com as seguintes características: (a) o polissacarídeo compreende 60 - 100% de D-manose, 40 - 0% de D-glicose e 0 -10% de outros monossacarídeos (b) os polissacarídeos são negativamente carregados (c) os polissacarídeos ligam-se a uma coluna positivamente car- regada (d) o peso molecular médio é maior do que 50 kD.

2. Composição de matéria em forma isolada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende polissacarídeos deriváveis de Aloe vera com as seguintes características: (a) o polissacarídeo compreende 70 - 90% de D-manose, 30 - 10% de D-glicose e 0 -10% de outros monossacarídeos (b) os polissacarídeos são negativamente carregados (c) os polissacarídeos ligam-se a uma coluna positivamente car- regada

3. Composição de matéria, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que os referidos polissacarídeos têm um peso molecular médio de 100-300 kD.

4. Composição de matéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que os referidos polissacarí- deos compreendem D-manose e D-glicose em uma relação de uma faixa de 5 a 20.

5. Processo para preparar uma composição da matéria, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelas se- guintes etapas do processo: (a) subfracionamento de um extrato de Aloe vera em duas fra- ções, uma com um peso molecular aparente de > + 5 kD, designado subfra- ção I, e uma com um peso molecular aparente de < + 5 kD (b) passagem da subfração I através de uma coluna positiva- mente carregada (c) eluição de parte da subtração I ligada à referida coluna com uma solução de sal, resultando na subtração l-Di (d) dessalinização e ultrafiltração de l-Di (e) opcionalmente, preparação de subtrações de l-Di com pesos moleculares aparentes desejados de > 300 kD, 100 - 300 kD e 50 - 100 kD.

6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pela aplicação de uma etapa de pré-purificação antes da etapa a do processo, através de uma coluna G-25 de Sephadex, para remover materiais com afi- nidade para a referida coluna.

7. Processo de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pela aplicação de uma coluna de DEAE-Sephadex ou DEAE-Sepharose du- rante a etapa b do processo.

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado pela aplicação de ultrafiltração seqüencial ou FPLC prepara- tiva, através de uma coluna de Superose.

9. Extrato NAG-25 de animal ou planta, caracterizado pelo fato de que compreende uma composição de matéria, como definida em qual- quer uma das reivindicações 1 a 4.

10. Extrato NAG-25 de planta de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a planta é Aloe.

11. Extrato NAG-25 de planta de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a Aloe é Aloe vera.

12. Processo para preparar um extrato NAG-25 de animal ou planta, como definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracteri- zado pela aplicação de uma etapa de purificação de um extrato não tratado correspondente através de uma coluna de Sepharose G-25, para remover materiais com afinidade para a referida coluna.

13. Extrato ultrafiltrado de Aloe, caracterizado pelo fato de que compreende uma composição de matéria, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

14. Processo para preparar um extrato ultrafiltrado de Aloe, co- mo definido na reivindicação 13, caracterizado pela aplicação de ultrafiltra- ção no extrato de Aloe correspondente.

15. Uso de uma composição de matéria selecionada de uma ou mais das seguintes: composição de matéria, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou extrato NAG-25 de animal ou planta, como definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 11, ou um extrato ultrafiltrado de Aloe, como definido na reivindicação 13, o referido uso sendo caracterizado pelo fato de que é como su- plemento alimentar ou em alimentos dietéticos.

16. Uso de uma composição de matéria selecionada de uma ou mais das seguintes: composição de matéria, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou extrato NAG-25 de animal ou planta, como definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 10, ou um extrato ultrafiltrado de Aloe, como definido na reivindicação 13, o referido uso sendo caracterizado pelo fato de que é para cui- dado pessoal ou em cosméticos.

17. Uso de uma composição de matéria selecionada de uma ou mais das seguintes: composição de matéria, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou extrato NAG-25 de animal ou planta, como definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 10, ou um extrato ultrafiltrado de Aloe, como definido na reivindicação 13, o referido uso sendo caracterizado pelo fato de que é no cuidado farmacêutico.

18. Uso de uma composição de matéria, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizado pelo fato de que é para uma ou mais das seguintes aplicações: como meios antibacterianos, antivi- rais e antiinflamatórios.

19. Uso de uma composição de matéria, de acordo com a reivin- dicação 18, caracterizado pelo fato de que é para prevenir ou curar uma in- fecção com qualquer um de fungos, viroses e bactérias de microorganismos.

20. Uso de uma composição de matéria, de acordo com a reivin- dicação 19, caracterizado pelo fato de que é para prevenir uma infecção com uma ou mais das bactérias selecionadas do grupo consistindo em Helicobac- ter pylori, Pseudomonas aeruginosa, Streptococus mutans e Streptococus sanguis.

21. Uso de uma composição de matéria, de acordo com a reivin- dicação 17, caracterizado pelo fato de que é como um medicamento na pre- venção ou cura de uma infecção com microorganismos infecciosos ou na prevenção ou cura de inflamações.

22. Forma de dosagem oral como um comprimido, cápsula ou xarope, caracterizada pelo fato de que compreende uma composição de ma- téria escolhida de uma ou mais das seguintes: composição de matéria, como definida em qualquer uma dentre as reivindicações 1 a 4, ou um extrato NAG-25 de animal ou planta, como definido em qualquer uma dentre as reivindicações 9 a 11, ou um extrato ultrafiltrado de Aloe, como definido na reivindicação 13, e, opcionalmente, excipientes.

23. Forma de dosagem tópica como um creme ou gel, caracteri- zada pelo fato de que compreende uma composição de matéria escolhida de uma ou mais das seguintes: composição de matéria, como definida em qualquer uma dentre as reivindicações 1 a 4, ou um extrato NAG-25 de animal ou planta, como definido em qualquer uma dentre as reivindicações 9 a 11, ou um extrato ultrafiltrado de Aloe, como definido na reivindicação 13 e, opcionalmente, excipientes.

24. Forma de dosagem injetável como um líquido de injeção, ca- racterizada pelo fato de que compreende uma composição de matéria esco- lhida de uma ou mais das seguintes: composição de matéria, como definida em qualquer uma dentre as reivindicações 1 a 4, ou um extrato NAG-25 de animal ou planta, como definido em qualquer uma dentre as reivindicações 9 a 11, ou um extrato ultrafiltrado de Aloe, como definido na reivindicação 13 e, opcionalmente, excipientes.

25. Uso de uma forma de dosagem, como definida em qualquer uma das reivindicações 22 a 24, caracterizado pelo fato de que é para a fa- bricação de um medicamento para inibir, prevenir ou reverter a aderência de um microorganismo em uma membrana de célula em um organismo vivo.