BG67480B1

BG67480B1 - Устройство за диференциално броене на микрочастици в биологични течности

Info

Publication number: BG67480B1
Application number: BG113017A
Authority: BG
Inventors: Диньо ДИНЕВ; Атанасов Динев Диньо
Original assignee: "Милкотроник" Оод
Priority date: 2019-10-30
Filing date: 2019-10-30
Publication date: 2022-12-15
Also published as: WO2021081607A1; BG113017A

Abstract

Изобретението се отнася до устройство за диференциално броене на биологични клетки, суспендирани в течност, което може да се използва, като флуоресцентна автоматизирана система за броене на клетки и може да намери приложение при броене и диференциране на микрочастици в биологични течности като мляко, кръв, урина, включително различаване на клетки от други частици, както и на различни видове клетки в сурови млечни проби. Устройството се състои от корпус, в който са разположени обектив, под който е поместен чип с микрофлуидни камери, в които е поместена проба от биологична течност, подлежаща на изследване, заснемаща CCD или CMOS камера, преброяваща част и механизъм за осово преместване на пробата, при което към пробата е насочен осветител, а в обектива (2) са разположени оптичен филтър и най-малко една течна леща (7). Чипът (4) е изпълнен като CD базиран чип, с кръгла форма, по която са оформени микрофлуидни камери (19), разположени по периферията на чипа (4), свързан със задвижващ двигател (22), при което осветителят (3) е най-малко един и е ориентиран под ъгъл, а преброяващата част е изпълнена като микропроцесор (23), свързан с генератор (8), управляващ течните лещи (7).

Description

Настоящото изобретение се отнася до устройство за броене на биологични клетки, суспендирани в течност, което може да използва, като флуоресцентна автоматизирана система за броене на клетки и може да намери приложение при броене и диференциране на микрочастици в биологични течности като мляко, кръв, урина, включително различаване на клетки от други частици, както и на различни видове клетки в сурови млечни проби.

Предшестващо състояние на техниката

Сред много параметри, определящи качеството на млякото, броят на бактериалните (ВСС) и на соматичните клетки (SCC) са от изключително значение, тъй като те оказват значително влияние върху качеството на млечните продукти, като едновременно с това предоставят актуална информация за здравословното състояние на кравите.

Общият брой на соматични клетки (SCC) е признат показател за здравето на кравите и качеството на млякото. Соматични клетки са бели кръвни клетки, известни като левкоцити (лимфоцити, гранулоцити, моноцити и макрофаги) и произхождат от вимето на животното, като броят им зависи от клетъчната имунна защита. Броят на тези клетки може да се увеличи в отговор на бактериални инфекции, които могат да причинят мастит. Именно по тази причина преброяването на соматични клетки, диференциалното броене и идентификацията на левкоцити в млякото е от съществено значение за диагнозата на мастит. SCC е показател за наличието на инфекция и възпаление на млечната жлеза на млечните крави, наречена мастит.

Обикновено мляко от здрави крави има соматични клетки по-малко от 100,000 клетки/ml, стойности по-високи от 300,000 клетки/ ml показват заразени крави, а стойности над 1,000,000 клетки/ ml са типичен показател за болни крави. Граничната стойност за консумация от човека или за по нататъшна преработка в хранителни продукти за консумация от човека, е под 400,000 клетки/ ml в Европа, но може да бъде по-висока в САЩ. Като цяло, крави с SCC по-висок от 300,000 клетки/ ml се разглеждат като заразени (Smith, KL, в стандарти за соматични клетки в млякото: физиологични и Уредба (1996), Международната федерация на млечен мастит, Бюлетин Септември, стр. 7).

За да се оцени качеството на млякото е необходимо да се използват апарати, които позволяват да се извърши надеждно и точно броене на соматични клетки. През последните години са разработени преносими автоматични анализатори, по-специално флуоресцентни образни цитометри, на базата на директен микроскопски флуоресцентен метод за броене на соматични клетки, като по -известни устройства за такъв анализ са ADAM SCC, използващ цифрова технология за целите на броене и анализ; NucleoCounter SCC 100 Chemometec; DCC на DeLaval; и флуоресцентни устройства, базирани на проточна цитометрия: Somacount 150 Bentley инструменти; SomascopeTM на Delta Instruments, FossoMatic 4000TM на Foss Electric).

Споменатите проточни автоматични анализатори се основават на монохромна флуоресценция и определят само общият брой на клетките. При тях пробата на потока минава през много малък диаметър, което позволява преминаване само на една клетка и прилагане на преброяването (Gunasekera Т. S. и др. 2003 г., Фън W. и др. 2004 г.). При споменатите анализатори, като маркери се използват флуоресцентни багрила: етидиев бромид, пропидиев йодид и DAPI (Gonzalo В. et al 2004, Wallen СА сътр 1982).

Пробите се вземат от индивидуални животни във фермите и се изпращат в централизирани лаборатории оборудвани с проточни цитометри за изброяване на общия брой соматични клетки.

Скъпите анализи са свързани основно с наличните в момента технологии и автоматични анализаторни апарати, които са конструирани на базата на оптични или електрически измервания.

Известни са апарати, при които се извършват оптични измервания, като за целта е необходимо първоначално, преди анализа, клетките да бъдат маркирани, поради което обикновено тези апарати използват скъпи химически реагенти или са предназначени за еднократна употреба.

Известни са също така апарати, които работят на принципа на електрически измервания, при които резултатът се получава чрез измерване на съпротивление, при което наличието на други клетъчни млечни частици пречи и по тази причина те трябва да бъдат отстранени чрез прилагане на няколко етапа на центрофугиране. Именно поради това, такива устройства не могат да бъдат използвани директно, на място, при млекопроизводителя и се правят много усилия за опростяване на методите и намаляване на разходите за анализ.

Известни са и се използват в практиката електронни инструменти, каквито са така наречените Coulter броячи, които могат да броят клетки и да ги определят по размер. Тъй като суровото мляко съдържа много частици, предимно мастни глобули с размер подобен на левкоцитите (5-10 μm), тези инструменти не осигуряват надеждно клетъчно броене, тъй като тези частици са повече от соматичните клетки и силно затрудняват точното измерване. Следователно, тези частици трябва да бъдат отделени от соматичните клетки преди измерването. Това се постига чрез центрофугиране, при което клетките се утаяват и мастните глобули се отделят от супернатантата.

Значителен брой методи са разработени за диференциално определяне на клетки с помощта на специфични антитела, които обаче имат приложение в областта на хуманната медицина, по -специално при обработване на кръвни проби. Тези методи дават много по-добра селективност и чувствителност на измерване, която се дължи на специфична имунна реакция антитяло-антиген. Herzenberg и Loken са разработили метод за преброяване на клетките с помощта на моноклонални антитела (Herzenberg Loken et all. 1976 & 1977), който се нарича двуцветна имунофлуоресценция.

Известни са множество апарати и патенти, базирани на образна цитометрия, за броене и диференциране на микрочастици в биологични течности, като мляко, кръв, урина и др. Например патент US 6919960 В2. Тези апарати използват микрофлуидни камери или слайдове, например патент US 4513438 за пробата и флуоресцентен микроскоп за заснемане на изображенията чрез CCD или CMOS сензор на микрочастиците. С помощта на процесорни устройства се извършва анализ на изображенията, броене и диференциране на микрочастиците в изследваната проба например патент US 4513438 А

При използване на няколко осветителя, обикновено е нужно периодично да се променя емисионния филтър в оста на обектива, за да осигури преминаване на нужната дължина на вълната до сензора. Филтърните блокове могат да се заменят ръчно или с помощта на механично устройство, което сменя филтрите в обектива, и което най-често се управлява по електронен начин, както това е описано и показано на фигура 7 в патентна публикация US 9046489 B2.

Освен това част от тези апарати заснемат само едно изображение от пробата, а това води до нисък коефициент на вариация. Коефициентът на вариация, според разпределението на Поасон, зависи от броя на изброените частици в пробата. За проби с ниско съдържание на частици, под 10000 в ml кръв, (например при пациенти със СПИН) или за силно разредени проби заснемането на едно, две или три изображения върху различни места на пробата, (както е описано в US 20120223260 и US 20120314092) не е достатъчно за получаването на приемливи коефициенти на вариация. Следователно, за получаването на измерване с повисока степен на точност, е подходящо да се извърши заснемане на по-голям брой полета от пробата, като за целта чипът с изследваната проба трябва да се премества.

В известните устройства се използват оптични системи, които имат дълбочина на фокуса от 20-100 μm, при което, ако пробата излиза от този диапазон, заснемането на изображение на фокус не е възможно. Едновременно с това, при оптимална дълбочина на микрофлуидната камера в рамките на 50 μm и по-малко, е необходимо да се използва система за фокусиране. В зависимост от конкретното изпълнение на устройството е възможно да се използват системи с ръчно или механично фокусиране, като в последните се използват микродвигатели или ръчни системи. Недостатък на механичните системи за фокусиране, осигуряващи необходимата микронна прецизност, е тяхната висока стойност.

Известно е, че коефициентът на вариации зависи, според разпределението на Поасон, от броя на преброени частици. При големи увеличения, например 10 пъти, сканираният обем проба пред обектива е недостатъчен за достигане на необходимия коефициент на вариация. При тази ситуация е необходимо да се увеличи броят на заснетите полета. Това води до неприемливо нарастване на времето за анализ. От друга страна, при морфологичен анализ на клетките и/или двуцветно диференциално броене на левкоцити, например в кръв или мляко, трябва да се използва оптично увеличение 10 или повече.

Когато е нужно прецизно броене с нисък коефициент на вариация, без диференциране, подходящо е да се използва увеличение от 1 до 4 пъти. Обикновено познатите системи използват заменяеми оптични обективи с фиксирано увеличение или скъпи механични системи за зум.

Известна е патентна публикация US 20120223260, отнасяща се до метод и система за определяне на частици в течна проба, при които се заснема само едно поле от пробата, като при такива системи практически отсъства необходимост от автофокусиране на изображението. В случай че при изследване на пробата тя трябва да се премества, това автоматично изисква фокусиране на изображението. При преместване на чипа с пробата чрез XY маса е задължително да е предвидено фокусиране на изображението поради факта, че при преместването на чипа с пробата се наблюдава натрупване на грешка по оста Z, която се формира от грешка при преместване на XY масата и грешка от деформиране на пластмасовите микрофлуидни чипове, като грешката най-често надвишава 100 мкм по оста Z, което от своя страна води до неточност на броенето на клетките.

Пример на XY маса за предвижване на последователни подрегиони на пробата пред обектива на микроскопа се съдържат в патентна публикация US 7327901B2.

Известна е патентна публикация US 7411680 B2 (CN 100520374 С), в която е описано устройство за броене на микрочастици, състоящо се от: източник на светлина; чип, съдържащ проба с микрочастици; обектив на микроскоп, микрофлуидна камера, заснемаща CCD камера, преброяваща част и механизъм за преместване на позицията на чипа. Преместването на чипа с пробата се извършва чрез маса, която е с възможност за преместване по осите XY чрез винтов или друг механизъм. Недостатък на описаното устройство е недостатъчната точност на броене на микрочастиците, която се дължи на отсъствието на техническа възможност за фокусиране на изображението, в резултат на което при придвижването на масата по XY се формира грешка, която допълнително се увеличава от деформирането на пластмасовите микрофлуидни чипове, при което споменатите грешки се натрупват като грешката по оста Z, която често надвишава 100 микрометра по оста Z.

С помощта на споменатият винтов механизъм позицията на чипа се премества на предварително определени координати, през предварително определен интервал от време, за да може дадена област от чипа, която се намира в непосредствена близост до заснеманият район, да бъде изместена до точката, където пада светлината от източникът на светлина и е в обхвата на полезрението на обектива. По този начин отделните подобласти в чипа се заснемат еднократно, последователно, като се изчислява броят на микро частици във всяка (подзона) подобласт и впоследствие се сумират, за да се изчисли общия брой на микрочастици в дадена проба.

Описаният метод за последователно наблюдение или заснемане само на една снимка и последващо изчисляване на броя на микрочастиците в отделните последователни полета и в пробата, като цяло е известен и детайлно разкрит в приетите и прилагани като задължителен стандарт ISO 133666 методики за използване на Неубайер камера.

Такъв метод на заснемане и броене на микрочастици е разкрит още и в патентна публикация RU 2147123 C1 по-специално в първа независима претенция, където са описани в последователност операциите, които се извършват за целите на изброяване на макрочастици, съдържащи се в едно заснето поле, като част от основната претенция с приоритетна дата 1998 г. и в описанието на патент US 4513438 A „Automated microscopy system and method for locating and re-locating objects in an image”.

Описаните методи на заснемане и броене на частиците освен, че са известни, също така се свързват с недостатъци, които се изразяват основно в недостатъчна точност на броенето на микрочастиците поради следното: както вече беше изложено, методът за заснемане на единични последователни изображения от пробата не осигурява необходимите условия за точно изброяване на микрочастиците, тъй като при отсъствие на механична система за фокус, единично заснетото изображение, при използване на механизъм за преместването на полимерни чипове по XY, не е на фокус, съответно не позволява качествено и точно изброяване. Към тази базисна неточност е правилно да се добавят присъщите отклонения от фокалната равнина - над 100 pm, в резултат на което изброяването и анализирането на микрочастиците, особено в разтвор е силно затруднено или компрометирано от гледна точка на точност на изброяването.

Освен това при броене на микрочастици в течни среди с различни коефициенти на пречупване и фиксирано механично фокусно разстояние е установено, че фокуса се променя при промяна на средата. В резултат на това при последователни единични заснети полета от пробата, част от тях са „извън” фокус, което затруднява или компрометира изброяването. Например при броене на соматични клетки в пълномаслено мляко, коефициент на пречупване е 1.460 при 633 nm, а при броене на дрожди на бирена мая във воден разтвор коефициентът на пречупване е 1.340.

Друг недостатък на изброяването при използване на известните устройства и прилагане на описаните вече методи е свързан с вида на използваните флуоресцентни багрила. При едновременно използване на две или повече флуоресцентни багрила с различна емисия (например FITC-530 nm за първото багрило и Propidium Iodide - 620 nm за второто багрило) за маркиране на биологичните микрочастици в течни или изсушени монослойни проби, ако частиците светещи с дължина на вълната 530 nm са на фокус, то тези светещи с дължина на вълната 620 nm не са фокусирани поради хроматичните аберации в обектива и в резултат на това изброяването на клетките в голяма част от единично заснетите образи на последователни полета от пробата ще са компрометирани за броене.

При друго вариантно изпълнение на описаният апарат се заснемат повече изображения, като микрофлуидна камера с изследваната проба се придвижва пред обектива на микроскопа, а за целите на заснемане на по-голям обем проба придвижването се извършва посредством подвижна по XY маса.

Осъществяване преместване на пробата с микрочастици посредством преместване по XY маса е известно още и от патент RU 2147123 С1, и от патент US 4513438.

Известното устройство за броене на микрочастици от патента US 7411680 B2 (CN 100520374 С) има редица конструктивни недостатъци, които не позволяват да се постигне точно измерване и изброяване на микрочастиците поради следното: дори и при много прецизно изпълнение на механизмите за преместване на чипа, повърхността на XY масата има отклонение спрямо обектива над 10 pm, което заедно с технологичната кривина на микрофлуидния чип определя отклонение, което обикновено надвишава 50 pm. Такова отклонение от равнината на обектива води до изображение, което не е «на фокус» и влияе на софтуерното броене на микрочастиците, като снижава значително прецизността. В коментираното тук устройство не е предвиден механизъм за фокусиране на изображението.

Друг недостатък на известното устройство, описано в US 7411680 (CN 100520374 С) е свързан с взаимното разположение на някои от съществените елементи, а именно, че осветителят е разположен пред обектива и зад микрофлуидната камера. Такова взаимно разположение на осветителя спрямо другите елементи преопределя недостатък като този, че устройството трябва задължително да използва микрофлуиден чип, съставен от две прозрачни повърхности.

Осветяването на пробата е от особена важност за активирането на флуорохромите в пробата. В патентните публикации US 7411680 В2, US 6970246 В2, US 20110211058 A1 са показани различни методи на осветяване на пробата с лампи или LED, а в патента US 2015/0053872 А1 е описан LED осветител с повишена мощност чрез мултиплициране на няколко светодиодни кристала. Описан е още и метод за осъществяване на равномерно осветяване на обекта чрез поставяне на два масива микролещи и поляризаторен филтър между тях. Такива осветители имат недостатъка, че е много трудно светлината да се фокусира върху обекта в петно по малко от 4 mm. При по високи увеличения на обектива, например над 5 пъти, наблюдаваното поле е под 1 mm и голяма част от светлината не се използва за активиране на флуорохромите в пробата. Лазерните осветители могат да фокусират светлината в много по-малки петна, например 100 pm и да колимират светлината с една единствена асферична леща до необходимия диаметър, например 5 mm. Така цялата енергия на източника на светлина може да се използва за активиране на флуорохромното багрило в полезрението на флуоресцентния микроскоп. Големия избор на дължини на вълната и мощности на съвременните диодни лазери, позволява да се избере най-подходящата дължина на вълната за избрания флуорохром. Лазерните диоди имат много тясна ивица на излъчване, само от няколко нанометра, което позволява да се използват без скъп, тънкослоен абсорбционен филтър, като по този начин се постига допълнително поевтиняване на осветителя в сравнение с базираните на LED системи. Лазерните осветители имат и един голям недостатък, затрудняващ използването им, като осветители в образните флуоресцентни микроскопски системи, а именно “speckle pattern” ефект. Върху плоскостта на пробата осветителното петно не е хомогенно. При увеличение се забелязват светли и тъмни петна, като неравномерното осветяване води до намалена емисия на обектите или техните части попаднали в петната с ниска осветеност.

Подходящо е да се обърне внимание на обстоятелството, че за целите на получаване на качествено изображение при тази конфигурация на осветител и обектив трябва да се използва микрофлуидна камера, която е прозрачна за дължината на възбуждащия осветител. Използването на микрофлуидни камери, изпълнени с две прозрачни повърхности значително увеличава стойността на консуматива, тъй като за слепването на споменатите прозрачни повърхности се използват скъпи, сложни и ненадеждни методи за слепване, обикновено чрез лепене с течни или сухи лепила, каквито са описани в патентни публикации US 20040145805 A1, US 20120223260 A1, US 7842157 В2 и US8808642 B2.

Друг недостатък на известното устройство за броене на микрочастици е свързан отново с описаното вече взаимно разположение на елементите, както и с вида им. Така например при попадане на част от емитираната светлина в равнината на обектива с ъгъл 90^o, съответно попадането и през филтъра на CCD или CMOS матрица, съотношението сигнал-шум драстично намалява. Като се има предвид факта, че някои от флуоресцентните багрила, като например масово използвания пропидиум йодид, имат висока собствена флуоресценция в разтвор, това предопределя недобро качество на заснемането, съответно силно затруднява последващата софтуерна обработка на изображението.

Известните устройства за диференциално броене се използват и при анализ и броене на проби, при което е необходимо прецизно изброяване на маларийните плазмодии, развиващи се във вътрешността на червените кръвни клетки или залепени на тяхната повърхност, когато в устройството се използва флуоресцентен микроскоп. В такива случаи е желателно фиксиране на червените кръвни телца, особено при големи времена на експозиция на CMOS камера.

Известна е патентна публикация US 10093957 В2, в която е описан метод за формиране на монослой еритроцити на дъното на микрофлуидна камера посредством гравитационно утаяване на еритроцитите със скорост 1 pm/s. Тази скорост на утаяване не е достатъчна особено при микрофлуидни камери с дебелина над 100 pm и води до забавяне на броенето при висок брой проби.

Допълнително се усложнява конструктивното изпълнение на устройството, свързано и с използваната за преместване на изследваната проба XY маса. За да се осигури преминаването на светлината през XY масата и чипа, трябва да се освободи цялата заснемана площ под микрофлуидния чип. При необходимост от осветяване с няколко осветителя, с различна дължина на вълната такова преместване е особено сложно за изпълнение от техническа гледна точка, включително и заради необходимостта да се постигне компактна по размери конструкция на устройството

Техническа същност на изобретението

Описаното до тук известно ниво на техниката в разглежданата област, показва необходимост да се предложи широкоспектърно устройство за диференциално броене на микрочастици в биологични течности, което да осигурява висока степен на точност на броене на микрочастиците, както и детайлно анализиране на различни проби съдържащи биологични микрочастици - мляко, ферментируеми течности, кръв, сперма и др., включително диференциално броене на биологични микрочастици, като соматични клетки в мляко, левкоцити в кръвта, телесни клетки, алги и дрожди. Устройството трябва да е технологично, изградено от евтини и достъпни елементи, чието взаимно разполагане да позволява оптимизиране качествата на оптичната система по отношение на автофокусиране и увеличаване на изображението, което е от съществено значение при заснемането, броенето и анализа на различни по вид и състав биологични течности, както и да използва чип, чието преместване гарантира точно позициониране на образец от пробата спрямо обектива и камерите за заснемане.

Задачата се решава с устройство за диференциално броене на микро частици в биологични течности, състоящо се от корпус, в който са разположени: обектив, под който е поместен чип с микрофлуидни камери, в които е поместена проба от биологична течност, подлежаща на изследване, заснемаща CCD или CMOS камера, преброяваща част и механизъм за преместване на пробата, при което към пробата е насочен осветител.

Съгласно изобретението, в обектива са разположени оптичен филтър и най-малко една течна леща, а чипът е изпълнен като CD базиран чип, с кръгла форма, по която са оформени микрофлуидни камери, разположени по периферията на чипа, който е свързан директно със задвижващ двигател, при което осветителят е най-малко един и е разположен над равнината, в която е разположен CD базираният чип, като е ориентиран под ъгъл така, че да осигурява ъгъл на осветяване с минимално отражение, а преброяващата част е изпълнена, като микропроцесор, свързан и с генератор, управляващ течните лещи.

Съгласно едно предпочитано вариантно изпълнение на устройството съгласно изобретението, оптичната система включва три флуоресцентни тънкослойни филтъра, разположени последователно един след друг в оста на оптичния микроскоп, като всеки от тях свързан със стъпков двигател, осигуряващ завъртане на флуоресцентните тънкослойни филтри от 0-90^o.

Съгласно едно вариантно изпълнение на устройството, в горната част на обектива са разположени една под друга две течни лещи, а в долният край на обектива е разположена една течна леща, при което между горно разположените течни лещи и долно разположената течни лещи е монтиран оптичен филтър и обектив, включващ две ахроматични лещи.

За предпочитане е оптичният филтър да е еднолентов или многолентов оптичен филтър.

Течната леща е свързана с генератор с променливо стъпаловидно напрежение от 0-70 V и честота 1 kHz.

Осветителят се състои от последователно разположени един пред друг източник на светлина, колимираща леща, лентов оптичен филтър и фокусираща леща.

За предпочитане е в качеството на източник на светлина да се използва LED, например Luxeon, или диодно лазерен източник на светлина.

Съгласно едно вариантно изпълнение на устройството, в качеството на източник на светлина се използва лазерен осветител, разположен под ъгъл спрямо пробата.

За предпочитане е да се използва въртящ се дифузьор, изпълнен във формата на диск, разположен на пътя на кохерентното лазерно излъчване, като дифузьора е разположен преди или след колимиращата асферична леща.

Съгласно едно предпочитано изпълнение CD базираният чип се състои от горна част, изпълнена от РММА полимер, с оптически прозрачна повърхност и долна, непрозрачна част, изпълнена от черен ABS полимер. Двата елемента са оформени и свързани чрез лазерно заваряване така, че след свързването им чрез заваряване, с дължина на вълната на лазера 800-1050 nm, в пространството между тях се образуват микрофлуидни канали 15 с височина 50 pm, в които е поместена смес от проба от биологична течност, флуоресцентни багрила или флуоресцентно маркирани антитела.

Съгласно едно вариантно изпълнение CD базираният чип се състои от две части, съответно горна с прозрачна повърхност и долна с непрозрачна повърхност, при което между повърхностите на споменатите две части се формират смесителни камери. Споменатите смесителни камери са запълнени с проба, обект на изследване и сухи флуоресцентни багрила и/или флуоресцентно маркирани антитела, при което смесителните камери са свързани чрез хидрофобни канали с микрофлуидна камера, a CD базираният чип е монтиран към въртяща се ос, свързана със задвижващ двигател.

Задвижващият двигател за предпочитане е стъпков двигател и е свързан директно със CD базирания чип.

Съгласно друго вариантно изпълнение на CD базираният чип, в изследваната проба с кръв се добавя натриев нитрит или натриев дитионит, при което CD базираната микрофлуидна камера 4 с пробата разредена кръв се разполага върху неодимов магнит 37 (фиг.16).

Устройството работи ефективно и при използване на чип с правоъгълна форма, съставен от две части, съответно горна прозрачна част и долна непрозрачна част. Двата елемента са оформени и свързани чрез лазерно заваряване така, че след свързването им в пространството между тях се образуват камери с височина 50 μm, в които се пипетира смес от проба от биологична течност, флуоресцентни багрила или флуоресцентно маркирани антитела. Правоъгълният чип е поместен върху подвижна XY маса, разположена под осветителите и обектива, в който са монтирани многолентов оптичен филтър и течна леща.

Устройството за диференциално броене на микрочастици в биологични течности, съгласно изобретението, се отличава с компактна конструкция, като взаимното разполагане на елементите позволява точно измерване и анализ на микрочастиците в обработваните проби. Използват се елементи с високо качество и ниска стойност, в резултат на което се получава апарат, който осигурява технически възможности за получаване на качествени изображения при заснемане и обработване на проби. За подобряване на качеството на изображението се използват течни лещи, с малки размери, като са разположени в обектива на микроскопа по начин, по който осигуряват едновременно фокусиране и увеличение на изображението.

Същевременно, управлението на течната леща позволява времето за автофокус да е от порядъка на милисекунди. Размерът на течната леща позволява още и да се вгражда и при конструирането на мобилни и «ханд хелд» уреди за измерване на малки частици.

В предложеното устройство се използва принципно нов и различен модел чип със CD базирани микрофлуидни камери, чието позициониране пред обектива за заснемането на изображение зависи само от точността на изработка на микрофлуидната камера, което от своя страна автоматично води до намаляване изискванията към автофокусиращата система. Едновременно с това значително е опростено позиционирането на микрофлуидната камера пред обектива - само чрез завъртане на CD базираният чип, като само в определени случаи се налага минимално преместване по оста X, което може да се извърши с достъпни технически средства, например: мини стъпков двигател NEMA8 за въртящата се ос и мини-серво двигател DS-5001HV по оста X, като този начин на преместване на X оста може да осигури преместване до 10 mm.

При реализиране на вариантното изпълнение с използване на три въртящи се последователно разположени тънкослойни филтъра се създават условия да се постигне регулирано пропускане в диапазона от 440 nm до 660 nm, със стъпка 2 nm. Такова дискретно регулиране на полосата на пропускане на флуоресцентната емисия позволява прецизно настройване на съотношението сигнал/шум на изображението на клетките в система за многоцветно флуоресцентно маркиране с различни по емитирана дължина флуорохроми и няколко LED или лазерни излъчвателя с различни дължини на вълната, което е по-контрастно в сравнение с използване на неоптимален филтър за емисията за избраното флуорохром. Контрастното изображение облекчава софтуерния анализ на флуоресцентните изображения.

Качеството на работа на устройството за диференциално броене допълнително се подобрява при използването на лазерен осветител, разположен под ъгъл спрямо пробата. При правилно избрана скорост на въртене на въртящият се дифузьор се осигурява висока хомогенност на осветеност.

Пояснение на приложените фигури

По-нататък ще бъде описано едно примерно изпълнение на устройство за диференциално броене на микрочастици в биологични течности, което е представено с помощта на придружаващите описанието чертежи, където:

Фигура 1 - външен вид на устройството съгласно изобретението;

Фигура 2 - принципна схема на устройство съгласно изобретението, с частичен изглед на CD базиран чип с микрофлуидни камери;

Фигура 3 - схема на устройството с частичен изглед на CD базиран чип, със смесителни и микрофлуидни камери;

Фигура 4 - схема на устройството съгласно изобретението с правоъгълен чип, с горна прозрачна повърхност и долна непрозрачна повърхност.

Фигура 5 - аксонометричен изглед на CD базиран чип с микрофлуидни камери; Фигура 6 - напречен разрез на CD базиран чип от фигура 5;

Фигура 7 - аксонометричен изглед на вариантно изпълнение на CD базиран чип с микрофлуидни камери;

Фигура 7а - аксонометричен изглед на CD базиран чип от фигура 7 с разполагане на пробата при завъртане на стъпковия двигател;

Фигура 7б - аксонометричен изглед на CD базиран чип със запълнени микрофлуидни камери за заснемане на пробата;

Фигура 8 - схематичен изглед отпред на устройството, с монтирана в обектива течна леща за автофокусиране;

Фигура 9 - принципна схема на устройство съгласно изобретението, с две допълнителни течни лещи, подходящо за едновременно сканиране на голям обем проба 10 мкл., т. е. проби с < 10000 клетки на ml и диференциално морфологично измерване;

Фигура 10а - примерно изпълнение на устройство съгласно изобретението, използващо мембранно проникващо багрило и приложимо за броене на живи/мъртви клетки в една проба;

Фигура 10б - примерно изпълнение на устройство съгласно изобретението, използващо BO-PR03 и FITC багрило и приложимо за броене на живи/мъртви клетки в една проба;

Фигура 11 - примерно изпълнение на устройство, приложимо за диференциално броене на соматични клетки в мляко, с един осветител и дихроично цветоотделително огледало в обектива;

Фигура 12 - представя общ вид на “Hand Held” вариант на устройство съгласно изобретението;

Фигура 13 - представя схематично устройството от фигура 12;

Фигура 14а, б, в - представя графично изобразяване на резултати от изследване на пробата и визуализирането им върху дисплей на устройството;

Фигура 15 - представя равнината за 3D последователно заснемане;

Фигура 16 - представя вариантно изпълнение на устройство съгласно изобретението, с използване на CD чип, поставен върху неодимов магнит;

Фигура 17 - представя вариантно изпълнение на оптичната система на устройство съгласно изобретението, с три флуоресцентни тънкослойни филтъра;

Фигура 18 - представя изображение на осветено поле на водна проба с флуоресцеин, без въртящ се дифузьор;

Фигура 19 - представя изображение на осветено поле на водна проба с флуоресцеин, след преминаване на лазерна светлина през въртящ се дифузьор;

Фигура 20 - представя изображение на осветено поле на водна проба с флуоресцеин, след преминаване на лазерна светлина.

Списък на позициите

- корпус

- обектив

- осветител

- микрофлуиден чип (CD базиран чип) ’ - правоъгълен микрофлуиден чип

- проба от биологичен материал

- оптичен филтър

- течна леща (още 7’, 7”)

- генератор променливо напрежение

- източник на светлина

- колимираща леща

- оптичен лентов филтър

- фокусираща леща

- горен прозрачен елемент на чип

- долен, непрозрачен елемент на чип

- микрофлуидни канали

- фруоресцентни багрила (още сухи флуор, багрила)

- смесителна камера

- хидрофобни канали

- микрофлуидни камери

- допълнителен отвор

- въртяща се ос

- задвижващ двигател (задвижващ стъпков двигател)

- микропроцесорно устройство

- дихроично огледало

- захранващ модул

- дисплей

- външно базиран миникомпютър

- мобилни комуникационни устройства

- мини PC

- лазерен излъчвател на светлина

- стъпков двигател

- дифузор, оформен като диск

- колимираща асферична леща

- стъпков двигател на филтри

- тънкослойни фруоресциращи филтри

- еритроцити в кръвната проба

- неодимов магнит

Примери за изпълнение на изобретението

Едно примерно изпълнение на устройството съгласно изобретението е представено по-детайлно, като описаното конструктивно решение не ограничава използването и на други технически елементи, които имат подобно конструктивно оформяне и еквивалентно функционално въздействие, при което цялостната компановка на устройството ще запази идеята и духа на изобретението.

Устройството за диференциално броене на микрочастици в биологични течности се състои от корпус 1, в който са разположени един под друг вертикално ориентиран микроскоп с обектив 2, странично на който е монтирана система от два осветителя 3, разположени под ъгъл, над равнината, в която е разположен микрофлуиден чип 4, съдържащ проба 5 от биологичен материал. Микрофлуидният чип 4 е изпълнен като CD базиран чип, като е възможно използването и на правоъгълен чип 4’.

Обективът 2 е изпълнен с оптичен филтър 6, за предпочитане еднолентов тънкослоен филтър и разположена в долната му част течна леща 7, захранвана и управлявана от генератор с променливо напрежение 8, за предпочитане от 0-70 V и честота 1 kHz. Чрез вградената и управлявана чрез генератора 8 течна леща 7 обективът 2 осъществява автофокусиране с дълбочина 1 mm, като времето за автофокусиране е много кратко, в рамките на милисекунди.

При едно вариантно изпълнение на устройството, в обективът 2 са предвидени допълнително две течни лещи 7’, 7”, (фиг. 9) разположени една под друга в горната част на обектива 2. Такова конструктивно решение на обектива 2, с общо три течни лещи 7, 7’, 7” осигурява възможност за променливо регулируемо увеличение и автофокус в диапазона от 1 до 10 пъти, например 2 пъти увеличение (фиг. 9) и 10 пъти увеличение (фиг. 9) и е подходящо да се прилага в устройства при броене и диференциране на проби с малък брой клетки в ml.

Както вече беше изложено по-горе, осветителите 3 са разположени странично на обектива 2 и са ориентирани така, че да осигуряват ъгъл на осветяване, осигуряващ минимално отражение на възбуждащата светлина, например близък до ъгъла на Брустер. Всеки осветител 3 се състои от последователно разположени източник на светлина 9 тип LED например Luxeon и/или диоден лазер 30, Mitsubishi 658 nm колимираща леща 10 и/или асферична леща 33, оптичен лентов филтър 11 и фокусираща леща 12.

Описаната компановка на устройството позволява разполагането на повече от един осветител, като е възможно алтернативно да се използват диодно лазерни източници на светлина, каквито са необходими и подходящи при многоцветно флуоресцентно заснемане, например при диференциално броене на биологични микрочастици, като соматични клетки в мляко, левкоцити в кръвта, телесни клетки и дрожди. Разполагането на осветителя 3 над равнината, в която е разположен CD базираният чип 4 осигурява гарантирано голяма част от светлина да се насочи и попадне през горно разположеният прозрачен елемент 13 на микрофлуидния CD чип 4 върху пробата 5 и само много малка част от отразената от повърхността на горният елемент 13 светлина да премине през течната леща 7, през обектива 2 и да попадне в заснемащите камери 2а CCD или CMOS1 сензор.

При едно вариантно изпълнение на устройството е подходящо да се използва лазерен осветител, който е разположен под ъгъл спрямо изследваната проба. Лазерните осветители могат да фокусират светлината в много по-малки петна, например 100 мкм и да колимират светлината с една единствена асферична леща 33 (фиг. 16) до необходимия диаметър, например 5 mm. Ефективността на излъчваната лазерна светлина значително се подобрява, ако е предвидено да премине през въртящ се дифузьор 32, изпълнен във формата на диск и разположен преди или след колимиращата асферична леща 33 (фиг. 17/). За предпочитане е дифузьорът да е изработен от РЕТ фолио Luminit, върху което са оформени дифракционен релеф, дифузиращ преминаващата светлина под различен ъгъл от 2 до 100^o.

Дифузьорът е монтиран на оста на миниатюрен DC или стъпков мотор 31, например Nidec 2 phase 4 Wire micro stepper motor. Скоростта на въртене се избира според диаметъра на дифузьора и скоростта на експозицията на CMOS камерата (2а), която се използва за формиране на изображението, като в случая е подходяща скорост 700 об/min. На фигура 18 е показано изображение на осветеното поле на водна проба с флуоресцеин, без използване на въртящ се дифузьор, а на фигура 19 е показано изображение на същото поле, след преминаване на лазерната светлина през въртящ се дифузьор.

Ясно се вижда високата хомогенност на осветеността след преминаването на лазерната светлина през въртящия се дифузьор.

Под осветителят 3 е разположен CD базиран микрофлуиден чип 4, който съдържа проба 5 с микрочастици, подлежащи на изследване.

Съгласно едно предпочитано изпълнение на устройството чипът 4 се състои от две части, съответно горно разположен елемент с прозрачна повърхност 13, изпълнена от РММА полимер, с оптически прозрачна повърхност и долно разположен елемент 14, за предпочитане непрозрачен, изпълнен от черен ABS полимер. Двата елемента 13 и 14 са свързани помежду си чрез лазерно заваряване на двете повърхности, за предпочитане с дължина на вълната на лазера 1050 nm и осево приложена притискаща сила. Двата елемента 13 и 14 са оформени така, че след свързването им чрез заваряване, в пространството между двата елемента се образуват микрофлуидни канали 15 с височина до 50 pm, в които се пипетират предварително смесена проба 5, съдържаща флуоресцентни багрила 16, например сухи флуоресцентни багрила и/или флуоресцентно маркирани антитела. Описаният CD чип 4 е подходящ за анализ на различни проби, съдържащи биологични микрочастици - мляко, ферментируеми течности, кръв, сперма и др.

В едно друго вариантно изпълнение на устройството за диференциално броене може да се използва чип 4, чието конструктивно изпълнение е представено по-детайлно на фигури 7, 7а, 7б. Чипът 4 представлява CD базиран чип, съставен от два елемента, съответно с горна повърхност 13 и долна повърхност 14, като между повърхностите им са оформени смесителни камери 17, съдържащи сухи флуоресцентни багрила, в които се пипетира пробата 5. Смесителните камери 17 са свързани чрез хидрофобни канали 18 с микрофлуидна камера 19 за заснемане на образец от пробата 5. Микрофлуидната камера 19 е изпълнена с допълнителен отвор 20, предназначен за освобождаване на въздуха, съдържащ се в камерата 19, при запълването й с изтласканата от центробежните сили течна проба 5.

CD базираният чип 4 е поставен върху въртяща се ос 21 (фиг. 9) и е свързан със задвижващ двигател 22, за предпочитане стъпков двигател, като при завъртането му образецът на пробата 5 се премества пред повърхнината на обектива 2. Стъпковият двигател 22 е свързан с микропроцесорно устройство 23, в чиято памет са въведени данни и координати, определящи преместването на пробата 5, като в нея се записва и заснетото изображение на пробата 5.

В едно вариантно изпълнение на устройството за диференциално броене може да се използва чип 4’ (фиг. 4), с правоъгълна форма, съставен от две части, съответно горна прозрачна част 13’ и долна непрозрачна част 14’, като между повърхностите им са оформени микрофлуидни камери, съдържащи сухи флуоресцентни багрила 16, в които се пипетира пробата 5.

Правоъгълният чип 4’ е поместен и се премества за заснемане на пробата чрез XY маса, която е разположена под осветителите 3 и обектива 2, в който са монтирани многолентов оптичен филтър 6 и течна леща 7.

За целите на по-прецизното изброяване, в зависимост от обработваните проби, например мляко, понякога е необходимо първоначално да се отделят мастните клъбца и соматичните клетки в пробата чрез центруфугиране. За целта е подходящо, като задвижващ двигател, да се използва миниатюрен стъпков двигател, например тип Р310 Disc Magnet High Speed Step Motor, чиито технически характеристики ги определят като високоскоростни стъпкови двигатели, със скорост на въртене до 20000 об/min, в сравнение с конвенционалните стъпкови двигатели, които достигат скорост на въртене до 1000 об/min. CD базираният чип 4 се монтира върху ротора на стъпковия двигател 22, с непрозрачната повърхност 14 от горната му страна. Заедно със защитния непрозрачен борд околната светлина се изолира от обектива и по такъв начин устройството може да бъде изпълнено без горен защитен капак. В такава конфугирация на устройството за диференциално броене, при анализ на проби от мляко, първоначално пробата се центрофугира с над 10000 об/min, в резултат на което се отделят мастните клъбца и соматичните клетки, след което стъпковия двигател се превключва на по-ниска скорост, например 200-300 об/min, при което пробата се позиционира пред обектива, за да се заснеме супернатантата.

На фигури 10а, 10б е представено едно примерно изпълнение на устройство за диференциално броене на клетки в биологични течности, чиято конструкция съответства на описаната до тук компановка на устройството, което е подходящо да се използва за броене на живи и мъртви клетки в една проба на биологични течности съдържащи клетки. В обектива 2 се използва двулентов тънкослоен оптичен филтър 6, за предпочитане тип Semrock FF01-527/645-25, а странично на обектива 2, под ъгъл са разположени два осветителя 3, със светлинен източник тип LED LUXEON 475 nm (фиг. 10а) и оптичен лентов филтър 11, с параметри 470/30, както и алтернативно светлинен източник 9 тип LED LUXEON 565 nm, с оптичен лентов филтър 11, с параметри 560/30 (фиг. 10б), за двуцветно багрене.

В пробата 5 се използва мембрано проникващо багрило 16 FITC оцветяващо ДНК на живи и мъртви клетки 5а (фиг. 10а) 10 и BO-PR03 багрило 16 ДНК само на мъртви клетки 5b (фиг. 10б).

На фигура 16 е представено едно изпълнение на устройството за диференциално броене на клетки в биологична проба, например кръвна проба, като за целите на успешно изброяване на маларийните плазмодии с флуоресцентния микроскоп, развиващи се във вътрешността на червените кръвни клетки или залепени на тяхната повърхност е необходимо да се формира монослой на дъното на микрофлуидния чип 4. Фиксирането на червените кръвни телца на дъното е желателно особено при по големи времена на експозиция на CMOS камерата 2а. Ускоряване на утаяването на еритроцитите 36 се осъществява чрез превръщане на еритроцитите в парамагнитни клетки. Това става чрез окисление на клетъчния им оксихемоглобин до метхемоглобин с натриев нитрит или, когато клетките се обработят с изотоничен натриев дитионит хемоглобинът се превръща в деоксигенирана редуцирана форма и клетките стават парамагнитни.

Когато пробата 5 в смесителната камера 17 е с кръв, се добавя натриев нитрит или натриев дитионит, при което CD базираната микрофлуидна камера 4 с пробата разредена кръв се разполага върху неодимов магнит 37.

Клетките се обработват с натриев нитрит, хемоглобинът се окислява до метхемоглобин и клетките стават парамагнитни. CD базираната микрофлуидна камера 4 с пробата разредена кръв се слага върху неодимов магнит 37, който ускорява утаяването на еритроцитите 36 към дъното на микрофлуидната камера 4 и те образуват монослой. В нормалните червени кръвни клетки хемоглобинът е в окислена форма, съдържа Fe²⁺ йони и червените клетки са диамагнитни. Третирането на червените кръвни клетки се осъществява лесно, като кръвната проба се смесва с 5 mМ разтвор на NaNO2 в съотношение 1:40 (v/v) за окисляване на хемоглобина в червените кръвни клетки и превръщането му в парамагнитна форма. При тази обработка с NaNO2 феро-йони (Fe²⁺) в хемоглобина се превръщат във фери (Fe³⁺) йони. Парамагнитните клетки ускорено могат да бъдат утаени чрез магнитно поле. При прилагане на високо градиентно магнитно поле, създадено от неодимовият магнит 37, еритроцитите от горните слоеве на разредена 1:5 кръв намиращи се максимално на 50 μm от долната повърхност на микрофлуидната камера, изработена от прозрачен материал 14 (РММА) се придвижват със скорост 3-4 μm/s към дъното на камерата и образуват монослой. Достигайки до дъното на микрофлуидната камера 14, положително заредените парамагнитни еритроцити, образуват йонна връзка с отрицателния повърхностен заряд на полимера, в резултат на което остават фиксирани на дъното на микрофлуидната камера дори и след премахване на магнитното поле.

На фигура 11 e представено едно примерно изпълнение на устройство, което е подходящо да бъде използвано за диференциално броене на соматични клетки в мляко и е особено изгодно в случаите, когато клетките се преместват междувременно от брауновото движение в течността. Устройството е конфигурирано по-специално за използване на изследвания, при които се определя съотношението между неутрофили и лимфоцити в мляко или кръв. Обективът 2 е изпълнен с един оптичен филтър 6, разположен в горната му част и една течна леща 7, разположена в долната част на обектива 2. В близост до оптичния филтър 6 и под него, в оста на обектива 2 е монтирано под ъгъл дихроично цветоотделително огледало 24, а перпендикулярно на оста на обектива 2 е разположена втора камера 2а, например CCD или CMOS сензор. Странично на обектива 2 е разположен един осветител 3, снабден с източник на светлина с дължина на вълната 675 nm, тип LED LUXEON 675. В CD чипа 4 се използва флуоресцентно багрило акредин оранж, което оцветява ДНК и РНК на живи и мъртви клетки 5а, като се използва само една дължина на вълната за възбуждане, а емисиите за ДНК и РНК са с различни дължини на вълната. При осветяване на клетките 5b от пробата 5, с дължина на вълната 675 nm, свързаното с ДНК (DNA) в ядрото багрило “акредин оранж” има зелена емисия 530 nm, а свързано с РНК (RNA) в цитоплазмата на клетките 5b емитира с дължина на вълната 620 nm с червена светлина.

По този начин, с описаната по-горе конфигурация на устройството, без използване на скъпи подвижни механични устройства, могат да се правят едновременно две снимки на пробата с различна дължина на вълната. Впоследствие снимките се обединяват от процесорното устройство 23, а чрез използването на програмното осигуряване, на база на интензитета и съотношението на зелената и червена емисия се извършва диференциране на клетките.

В зависимост от вида на изследваните биологични течности, както и от необходимостта от бързо и точно изследване, възможно е да се реализира „Ханд Хелд” вариант на устройството за диференциално броене съгласно изобретението, което по същество представлява образен цитометър, каквото е показано на фигури 12, 13. В долната част на корпуса 1 е разположен захранващ модул 25 на устройството, което е изпълнено с батерийно захранване. В корпуса 1 са разположени още обектив 2, тип SUNEX-M12x0,5, като е подходящо да се използва течна леща тип Arctic 16F, с увеличение Х4, което позволява да се конфигурира реверсиран обектив 2, за CCD или CMOS камера с автофокус. Този обектив е специално проектиран, с възможност да събира светлина от значителни по големина ъгли, като съдържа до 6 асферични стъклени миниатюрни лещи, непоказани на фигурите, позволяващи да работят с мегапикселови сензори, с големи диагонали, в резултат на което обектива 2 има пространствена разделителна способност около 2 pm, при минимални аберации.

Устройството за диференциално броене съгласно изобретението може да бъде изпълнено и с една подобрена оптична система, по-подробно представена на фигура 17. Съгласно това вариантно изпълнение, на мястото на конвенционалният емисионен филтър, в оста на оптичния микроскоп са монтирани последователно три флуоресцентни, тънкослойни филтъра 35’, 35”, 35’”, за предпочитане тип VersaChrome Edge™ Tunable Longpass Filters, като всеки от филтрите е свързан със стъпков двигател 34, при което филтрите 35’, 35”, 35”’ могат да се завъртат от 0 до 90^o. Заместването на емисионният филтър с настройваеми филтри позволява да се постигне по-добро регулиране на полосата на пропускане, например със стъпка 2 nm. Така например е установено, че при завъртане от 0 до 60^o, полосата на пропускане се премества към синия спектър и при ъгъл 60^o фронта на пропускане е 12% по малък от този при 0^o. Тоест при 0^o емисионния филтър ще пропуска зелената светлина над 505 nm, а при 60^o синята светлина след 442 nm. Така чрез завъртане на флуоресцентните тънкослойни филтри 35’ - 35’”, в диапазона от 0 до 60^o полосата на пропускане може да се регулира със стъпка 2 nm.

Описаното ханд хелд устройство (цитометър) може да работи в автономен режим, като автофокусирането, осигурявано чрез течната леща 7, позиционирането, управлението на лазерния диоден осветител 30 Mitsubishi 658 nm, изпълнен с оптичен лентов филтър 6, асферична колимираща леща 33, Nidec 2 phase 4 wire micro srepper motor и се управляват от микропроцесорното устройство 23, като след обработката на изображенията резултатът се извежда на дисплей 26. Цитометърът е снабден още и със стандартни комуникационни изводи (USB), непоказани на фигурите, (фиг. 12), чрез които устройството може да бъде свързано с външно базиран миникомпютър 27, със специално разработена програма за управление работата на устройството, включително графична обработка и визуализиране на резултатите от анализа на обработваните проби 5. Посредством описаните интерфейси, устройството може да се управлява дистанционно, чрез мобилни комуникационни устройства (смартфон, таблет, базирани на Windows или Android), на които е инсталирана управляваща програма (Фиг. 14 а, б, в,), като цялата информация е достъпна онлайн, в облачна услуга. Програмното осигуряване на устройството позволява обработване на изображенията получени от заснемащите камери CMOS или CCD, при което се определя броя на биологични микрочастици (соматични клетки в мляко, левкоцити в кръвта, телесни клетки, червени кръвни телца, и дрожди) - в ml, както и се извършва оценка на размера частиците и графичното им разпределение. Използвайки метода на диференциално броене и оценка на размерите може да се определя и броят локални максимуми в интензивността на изображението, както и бинаризация на изображението чрез локален хистограмен анализ. Последното се прави с цел повишаване на отношението сигнал/шум чрез елиминиране на неравномерностите на фона по цялото изображение.

Устройството за диференциално броене съгласно изобретението се използва по следният начин: приготвя се CD базирания чип 4, с образец от пробата 5, която подлежи на изследване. Със задействането на стъпковия двигател 22, пробата 5 се смесва с флуоресцентните багрила, като при повишаване на оборотите на стъпковият двигател 22 до 500-1000 об/min, върху смесената с флуоресцентни багрила 16 проба 5 действа центробежна сила. В резултат течната проба 5 (фиг. 7а) преодолява съпротивлението на хидрофобния канал 18 (фиг. 7а) и попада в микрофлуидната камера 19 (фиг. 7б), при което през допълнителния отвор 20 се освобождава изтласкания от преместването на пробата 5 въздух. Последователно, чрез въртене със стъпковия двигател 22, пробата 5 се премества пред обектива 2, по точно определени координати, предварително въведени в паметта на микропроцесорното устройство 23, като позицията за заснемане на изображението на пробата 5 не се измества или отклонява спрямо обектива 2.

В този случай разстоянието на микрочастиците от пробата 5 до обектива 2 зависи в голяма степен от точността на изработка на микрофлуидната камера 19, в резултат на което значително се намаляват изискванията към автофокусиращата система. Едновременно с това се увеличава драстично съотношението сигнал-шум, решаващо за откриване и софтуерно изброяване на слабо светещи микрочастици от пробата. За целите на точно изброяване на микрочастиците в една подобласт се извършва заснемане на повече от една снимка, като се избира една от тях, която е най -добре фокусирана и изброяването се извършва върху това избрано изображение, след което се извършва преместване и подобно заснемане на следващата подобласт, като избраните за броене изображения се записват в паметта на устройството.

Както вече беше изложено, броенето на частици от единични заснети образи на последователни полета от проба, премествана с XY или въртяща се ос пред оста на обектива се извършва при условията на един значително по-точен начин на сканиране на проба, премествана от XY маса или премествана от въртяща се ос пред оста на обектива, с последващо изброяване и анализиране на проба, съдържаща микрочастици, което излагаме в последователност: въвеждането на високоскоростна течна леща в главната оптична ос позволява пробата, съдържаща се в микрофлуидните канали на CD базиран микрофлуидни камери или конвенционални правоъгълни микрофлуидни камери да се поставя в носача на устройството осъществяващо преместването, представляващо XY преместване или директно куплирана ос на стъпков двигател. При това положение, по предварително зададени координати пред оста на обектива 2, се извършва позициониране на първото анализирано поле от пробата 5, при което се заснема поредица от снимки, при използване на един емисионен осветител, например 5 снимки над предварително зададената при калибровката на устройството плоскост на образа (фиг. 15) и 5 снимки под очакваната плоскост на образа, като за препоръчване е да се избере дистанция между плоскостите 0.05 mm, като по този начин образа по оста Z се сканира на равноотдалечени интервали (фиг. 15).

Получените снимки се обработват от микропроцесорното устройство, като се избира една снимка, на която микрочастиците са «на фокус». След това частиците се изброяват и/или анализират морфологично. Ако при анализа се изясни, че образът (изображението) е компрометиран например от въздушни мехури заемащи голяма част от изображението, заснетото поле се изключва от последващото преброяване или анализ, а резултатът се записва в паметта на устройството.

Едновременно с това, при използване на две флуоресцентни багрила с различна емисиона дължина на вълната, например FITC-530 и TO-PRO3-660 nm, първо се прави поредица от 5 снимки с LED излъчвателя на 470 nm или, лазерен диоден излъчвател 470 nm, намира се снимката с фокусирани частици с емисия 530 nm, която се запомня за последващо изброяване.

След това се прави същото с LED излъчвател 630 nm, като в края на този етап се получават две снимки на полето от пробата, които се запомнят в паметта за обработване. След завършване на заснемането на споменатите снимки, придвижващия механизъм премества пробата на следващото поле за заснемане, като процедурата се повтаря до края на предварително зададената последователност на преместване за сканиране на пробата. След завършването на сканирането средния брой на микрочастиците в пробата се изчислява по формула, например формулата от ISO 13366, като сбора от числото на частиците в отделните полета на пробата се дели на броя на изброените полета и се изчислява за 1 ml, например при броене на соматични клетки в мляко.

Приложение на изобретението

Едно вариантно мобилно изпълнение на цитометъра е подходящо да се използва от фермери директно във фермата, например за целите на откриване на доклиничен мастит, чрез броене на соматични клетки в млякото.

Друго приложение на мобилния вариант на устройството е в телемедицината, по-специално в неотложната медицинска помощ, когато е необходимо на място, при пациента, да се преброят и диференцират левкоцитите в кръвта. Поради ниската цена, батерийното захранване и възможността за използване от неквалифициран персонал е особено удобен за приложение в страните, където се извършват голям брой изследвания и диагностициране на болести, като СПИН. Такъв апарат е особено необходим за използване в полеви условия, доколкото може да сканира кръвна проба до 10 μΐ, като при такива изследвания на кръвта левкоцитите намаляват до 500 бр/ml. Резултатите могат да бъдат наблюдавани дистанционно от специалист, намиращ се във всяка точка на земята, с възможност за бързо и точно определяне на диагноза. Устройството може да намери приложение и в центровете за приемане на кръв, където обикновено първо се приема кръвта, а после се изпраща за изследване в централизирани лаборатории. При вземане на 20 μΐ. кръв от пръст на донора, пробата може да се изследва на място, съответно веднага да се прецени дали даден пациент е годен за кръводарител.

Claims

Патентни претенции

1. Устройство за диференциално броене на микро частици в биологични течности, състоящо се от корпус, в който са разположени обектив, под който е поместен чип с микрофлуидни камери, в които е поместена проба от биологична течност, подлежаща на изследване, заснемаща CCD или CMOS камера, преброяваща част и механизъм за осово преместване на пробата, при което към пробата е насочен осветител, при броене на частици или при диференциално броене, характеризиращ се с това, че в обектива (2) са разположени оптичен филтър (6) и най-малко една течна леща (7), а чипът (4) е изпълнен като CD базиран чип, с кръгла форма, по която са оформени микрофлуидни камери (19), разположени по периферията на чипа (4), който е свързан директно със задвижващ двигател (22), при което осветителят (3) е най-малко един и е разположен над равнината, в която е разположен CD базираният чип (4), като е ориентиран под ъгъл, а преброяващата част е изпълнена, като микропроцесор (23), свързан с генератор (8), управляващ течните лещи (7).
2. Устройство съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че в горната част на обектива (2) са разположени една под друга две течни лещи (7, 7’), а в долният край на обектива (2) е разположена една течна леща (7), при което между горно разположените течни лещи (7’, 7”) и долно разположената течна леща (7) е монтиран оптичният филтър (6) и обектива (2).
3. Устройство съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че оптичният филтър (6) е многолентов филтър.
4. Устройство съгласно претенция 1, характеризиращо се с това, че течната леща (7) се захранва с генератор (8) с променливо стъпаловидно напрежение от 0-70 V и честота 1 kHz.
5. Устройство съгласно претенция 1, характеризиращо се с това, че осветителят (3) се състои от последователно разположени един пред друг източник на светлина (9), колимираща леща (10) и оптичен лентов филтър (11) и фокусираща леща (12).
6. Устройство съгласно претенция 5, характеризиращо се с това, че източникът на светлина (9) е LED или диодно лазерен източник на светлина.
7. Устройство съгласно претенция 6, характеризиращо се с това, източникът на светлина е лазер, чиято излъчвана светлина е насочена към въртящ се дифузьор (32), монтиран на оста на стъпков двигател (31) и изпълнен във формата на диск с повърхностен дифракционен релеф, при което дифузьора (32) е разположен преди или след колимиращата асферична леща (33).
8. Устройство съгласно претенция 7, характеризиращо се с това, че дифузьорът да е изработен от РЕТ фолио Luminit, като дифракционният релеф дифузира преминаващата светлина под ъгъл от 2 - 100^o.
9. Устройство съгласно претенция 1, характеризиращо се с това, че CD базираният чип (4) се състои от горно разположен елемент (13), изпълнен от РММА полимер, с оптически прозрачна повърхност и долно разположен елемент, непрозрачен (14), изпълнен от черен ABS полимер, като двата елемента (13) и (14) са оформени така, че в пространството между двата елемента се образуват микрофлуидни канали (15) с височина 50 μm, в които е поместена смес от проба (5) и флуоресцентни багрила (16).
10. Устройство съгласно претенция 1, характеризиращо се с това, че се използва правоъгълен чип (4’), с правоъгълна форма, съставен от две части, съответно горна прозрачна част (13’) и долна непрозрачна част (14’), като между повърхностите им са оформени камери, съдържащи сухи флуоресцентни багрила (16), в които е поместена проба от биологична течност (5), при което правоъгълният чип (4’) е поместен върху подвижна XY маса, разположена под осветителите (3) и обектива (2), в който са монтирани многолентов оптичен филтър (6) и течна леща (7).
11. Устройство съгласно претенция 1, характеризиращо се с това, че се използва правоъгълен чип (4’), с правоъгълна форма, съставен от две части, съответно горна прозрачна част (13’) и долна непрозрачна част (14’), като между повърхностите им са оформени камери, съдържащи сухи флуоресцентни багрила (16), в които се пипетира пробата (5), при което правоъгълният чип (4’) е поместен върху подвижна XY маса, разположена под осветителите (3) и обектива (2), в който са монтирани последователно три флуоресцентни тънкослойни филтъра (35’, 35”, 35’”), всеки свързан със стъпко двигател (34) и течна леща (7).
12. Устройство съгласно претенция 1, характеризиращо се с това, че се използва CD базиран чип (4), съставен от две части, съответно горна прозрачна част (13’) и долна непрозрачна част (14’), като между повърхностите им са оформени камери, съдържащи сухи флуоресцентни багрила (16), в които се пипетира пробата (5), при което CD базиран чип (4’) е поместен върху стъпков мотор, разположена под или над осветителите (3) и обектива (2), в който са монтирани последователно три флуоресцентни тънкослойни филтъра (35’, 35”, 35”’), всеки свързан със стъпков двигател (34) и течна леща (7).
13. Устройство съгласно претенция 1, характеризиращо се с това, че CD базираният чип (4) се състои от две части, съответно с горна прозрачна повърхност (13), и долна част с непрозрачна повърхност (14), като двата елемента (13) и (14) са оформени така, че след свързването им чрез заваряване, с дължина на вълната на лазера 800-1050 nm, в пространството между двата елемента са оформени смесителни камери (17) запълнени с проба (5) и сухи флуоресцентни багрила (16), при което смесителните камери (17) са свързани чрез хидрофобни канали (18) с микрофлуидна камера 19, a CD базираният чип (4) е монтиран към въртяща се ос (21), свързана със задвижващ двигател (22).
14. Устройство съгласно претенция 9, характеризиращо се с това, че пробата в CD базираната микрофлуидна камера (4) се разполага върху неодимов магнит (37).
15. Устройство съгласно претенция 1 и 4, характеризиращо се с това, че задвижващият двигател е стъпков двигател (22), свързан директно със CD базирания чип (4).
16. Устройство съгласно претенции 1 и 4, характеризиращо се с това, че задвижващият двигател е високоскоростен дисков стъпков двигател (22), като CD базирания чип (4) е монтиран върху ротора на стъпковия двигател (22), с непрозрачната повърхности (14) от горната му страна.