BG67422B1 - Polyzwitterion hydrogels for dressings for chronic and necrotic wound treatment - Google Patents

Abstract

The invention relates to polyzwitterion hydrogels for dressings for treatment of chronic and necrotic wounds, including heavily exuding wounds. The developed dressings from polyzwitterion hydrogel or two-layer ones with a top layer of chitosan and an inner layer from polyzwitterion hydrogel simultaneously (a) have ultra low bioadhesion and antibiofilm-forming properties (b) show the so-called anti-poly electric effect - they swell more in saline compared to when in water, including wound exudate, (c) show antibacterial properties, and (d) have proteolytic activity due to an enzyme with proteolytic action immobilized therein to decompose the necrotic tissue and find application in pharmacy and medicine.

Description

Област на техникатаField of technology

Изобретението се отнася до полицвитерйонни хидрогелове за превръзки за лечение на хронични и некротични рани и намира приложение във фармацията и медицината.The invention relates to polyviterione hydrogels for dressings for the treatment of chronic and necrotic wounds and finds application in pharmacy and medicine.

Предшестващо състояние на техникатаBACKGROUND OF THE INVENTION

Загубата на тъкан от кожата при изгаряния, травми, диабет и др. води до образуването на рани. Възстановяването й е резултат от сложни процеси, с участието на клетките, извънклетъчната матрица и разтворими медиатори (растежни фактори и др.). В същото време влагата, топлината и хранителната среда, заедно с пониженото функциониране на имунната система в раната, благоприятстват образуването на некротична тъкан, която е идеална среда за бактериален растеж.Loss of skin tissue from burns, injuries, diabetes and more. leads to the formation of wounds. Its recovery is the result of complex processes, involving cells, extracellular matrix and soluble mediators (growth factors, etc.). At the same time, moisture, heat and nutrient medium, together with the reduced functioning of the immune system in the wound, promote the formation of necrotic tissue, which is an ideal environment for bacterial growth.

Съществуват различни превръзки за рани, разработени, за да защитят раната от бактериални инфекции и други негативни въздействия, или да подпомогнат регенерирането на наранената тъкан. Традиционните превръзки от марля предпазват донякъде раната от бактерии, но тази защита се губи при намокряне. При изсъхване на раната, те залепват за нея, което причинява болка и дискомфорт при смяна на превръзките и нарушава естествения процес на зарастване. Разработени са превръзки за рани, съставени от горен слой, предотвратяващ проникването на бактерии и долен слой, който абсорбира ексудата. Превръзките поемащи ексудата от раната, обаче, имат склонност да развиват бактерии вътре в тях, които впоследствие образуват биофилм. Това налага разработването на превръзки за рани, които имат локален антимикробиален ефект, постигнат най-често чрез отделяне на гермицидни съединения. Такива превръзки са например съдържащите сребро. Обаче, тяхната ефективност е поставена под въпрос, тъй като локално прилаганото сребро може да забави заздравяването на раните, поради токсично действие спрямо регнериращите кератиноцити [Punjataewakupt А., Napavichayanun S., Aramwit Р., The downside of antimicrobial agents for wound healing. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases, 2019, 38 (1), 39-54; Szmyd R., Goralczyk A.G., Skalniak L., Cierniak A., Lipert B., Filon F.L., CroseraM., Borowczyk J., Laczna E., Drukala J., Klein A., Jura J. Effect of silver nanoparticles on human primary keratinocytes. Biol Chem 2013, 394(1):113-123]. Когато обаче, бактериите образуват биофилм, се налага използването на превръзки с антибиотици, а е известно, че за да бъдат унищожени бактерии в биофилм са необходими концентрации на антибиотици в хиляди пъти повисоки, отколкото за свободно движещи се бактерии. Едновременно с това, всеизвестен е проблемът с антибиотичната резистентност на голям брой щамове бактерии, който допълнително намалява шансовете за борба с бактериална инфекция. Посочените недостатъци се преодоляват с настоящето изобретение, тъй като полицвитерйонните хидрогелове, поради своята хидрофилност абсорбират ексудата на раната, а поради слабата си биоадхезивност, не създават условия за (не позволяват) образуване на биофилм, т. е. развитието на бактерии. Това не налага включването на гермицидни съединения, като по този начин напълно се избягват страничните нежелани ефекти от тяхното приложение. Нещо повече, не се стига до етап на включване на антибиотично лечение, поради факта че полицвитерйонните хидрогелове не позволяват формирането на бактериални биофилими, т. е. имат антибиофилм образуваща активност. В допълнение, полицвитерйонният хидрогел поддържа необходимата влага за нормалното зарастване на тъканта, не залепва за нея, което би позволило лесна и щадяща пациента смяна на превръзката.There are various wound dressings designed to protect the wound from bacterial infections and other adverse effects, or to help regenerate injured tissue. Traditional gauze bandages protect the wound to some extent from bacteria, but this protection is lost when wet. When the wound dries, they stick to it, which causes pain and discomfort when changing dressings and disrupts the natural healing process. Wound dressings have been developed, consisting of an upper layer that prevents the penetration of bacteria and a lower layer that absorbs the exudate. However, dressings that absorb the exudate from the wound tend to grow bacteria inside them, which subsequently form a biofilm. This necessitates the development of wound dressings, which have a local antimicrobial effect, most often achieved by the release of germicidal compounds. Such dressings are, for example, those containing silver. However, their effectiveness has been questioned, as topically applied silver may delay wound healing due to its toxic effect on regenerating keratinocytes [Punjataewakupt A., Napavichayanun S., Aramwit R., The downside of antimicrobial agents for wound healing. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases, 2019, 38 (1), 39-54; Szmyd R., Goralczyk AG, Skalniak L., Cierniak A., Lipert B., Filon F.L., CroseraM., Borowczyk J., Laczna E., Drukala J., Klein A., Jura J. Effect of silver nanoparticles on human primary keratinocytes. Biol Chem 2013, 394 (1): 113-123]. However, when bacteria form a biofilm, the use of antibiotic dressings is required, and it is known that in order to kill bacteria in a biofilm, concentrations of antibiotics thousands of times higher are required than for free-moving bacteria. At the same time, the problem of antibiotic resistance to a large number of bacterial strains is well known, which further reduces the chances of fighting a bacterial infection. These disadvantages are overcome by the present invention, because polyviterione hydrogels, due to their hydrophilicity absorb the exudate of the wound, and due to their low bioadhesion, do not create conditions for (prevent) the formation of biofilm, ie the development of bacteria. This does not require the inclusion of germicidal compounds, thus completely avoiding the side effects of their application. Moreover, it does not reach the stage of including antibiotic treatment due to the fact that polysviterion hydrogels do not allow the formation of bacterial biofilms, ie they have antibiofilm-forming activity. In addition, the polyviterion hydrogel maintains the necessary moisture for normal tissue healing, does not stick to it, which would allow easy and patient-friendly changing of the dressing.

Нормалното зарастване на една рана протича, когато тя е добре изчистена от некротична тъкан. Затова са създадени препарати за рани, съдържащи протеолитични ензими, които разграждат само некротичната тъкан, без да засягат здравите клетки. Такива са продуктите под формата на гелове и мази създадени от екип на проф. Недков и достъпни в момента на пазара [I. Topalov, G. Fichev, Р. Nedkov „Treatment of purulent, necrotic and atonic wounds with necrolytin“ Comptes rendus de I'Academie bulgare des Sciences, 54 127-130 (2000)]. Тези продукти могат лесно да бъдат отмити, особено когато са нанесени върху обилно ексудиращи рани, или нежелано механично отстранени, което изисква специално внимание от страна на пациента при тяхното прилагане и създава допълнително неудобство, като същевременно се намалява техния лечебен ефект. За разлика от препаратите за мазане, хидрогелът на основата на омрежени полицвитерйони представлява нетечлив и еластичен материал, който може да е основа за механично стабилна превръзка. Такава превръзка не тече, не се отмива, не се разрушава лесно при движение и не се налагат специални грижи от страна на пациента, когато трябва да се прилага.Normal wound healing occurs when it is well cleared of necrotic tissue. Therefore, wound preparations containing proteolytic enzymes have been developed that break down only necrotic tissue without affecting healthy cells. Such are the products in the form of gels and ointments created by a team of Prof. Nedkov and currently available on the market [I. Topalov, G. Fichev, R. Nedkov “Treatment of purulent, necrotic and atonic wounds with necrolytin” Comptes rendus de I'Academie bulgare des Sciences, 54 127-130 (2000)]. These products can be easily washed away, especially when applied to copiously exuding wounds, or unwanted mechanically removed, which requires special attention from the patient when applying them and creates additional inconvenience while reducing their healing effect. Unlike lubricants, crosslinked polyviterion hydrogels are non-flowing and elastic materials that can be the basis for a mechanically stable dressing. Such a bandage does not leak, does not wash off, does not break easily when moving and does not require special care by the patient when it should be applied.

Полицвитерйоните (ПЦЙ) са полимери, които се характеризират с ултра ниска протеинова адсорбция. ПЦЙ съдържат мономерни звена с ковалентно свързани положително и отрицателно натоварени групи. В зависимост от вида на функционалните групи, носещи заряд, те биват поликарбоксибетаини (ПКБ), полифосфобетаини (ПФБ) и полисулфобетаини (ПСБ). ПКБ имат най-ниската измерена досега за биоматериал протеинова адсорбция - по-ниска от 0.3 ng/cm², като по този начин надминават златния стандарт до този момент - полиетиленгликола (ПЕГ) [Z. Zhang, H. Vaisocherova, G. Cheng, W. Yang, H. Xue, S. Jiang „Nonfouling Behavior of Polycarboxybetaine-Grafted Surfaces: Structural and Environmental Effects Biomacromolecules 9, 2686-2692 (2008)]. Освен изключително ниската биоадхезивност, ПЦЙ проявяват т. нар.Polyviterions (PCs) are polymers that are characterized by ultra-low protein adsorption. PCIs contain monomer units with covalently linked positively and negatively charged groups. Depending on the type of functional groups carrying the charge, they are polycarboxybetaines (PCBs), polyphosphobetaines (PFBs) and polysulfobetaines (PSBs). PCBs have the lowest protein adsorption measured so far for a biomaterial - less than 0.3 ng / cm ² , thus exceeding the gold standard so far - polyethylene glycol (PEG) [Z. Zhang, H. Vaisocherova, G. Cheng, W. Yang, H. Xue, S. Jiang „Nonfouling Behavior of Polycarboxybetaine-Grafted Surfaces: Structural and Environmental Effects Biomacromolecules 9, 2686-2692 (2008)]. In addition to extremely low bioadhesiveness, PCYs show the so-called.

антиполиелектролитен ефект, т. е. набъбват по-силно в солеви разтвори, отколкото в чиста вода. Тези качества определят тяхната био-съвместимост и ги правят изключително подходящи за разработване на превръзки за рани. Показано е, че електроовлакнен ПСБ е устойчив на бактериална адхезия при изпитания с грам отрицателните Р. aeruginosa и грам положителните S. epidermidis и е потенциален материал за антимикробни превръзки [R. Lalani, L. Liu „Electrospun Zwitterionic Poly (Sulfobetaine Methacrylate) for Nonadherent, Superabsorbent, and Antimicrobial Wound Dressing Applications“ Biomacromolecules 13, 1853-1863 (2012)].antiepolyelectrolytic effect, ie swell more in saline solutions than in pure water. These properties determine their biocompatibility and make them extremely suitable for the development of wound dressings. Electrofiber PSB has been shown to be resistant to bacterial adhesion in gram-negative P. aeruginosa and gram-positive S. epidermidis tests and is a potential material for antimicrobial dressings [R. Lalani, L. Liu “Electrospun Zwitterionic Poly (Sulfobetaine Methacrylate) for Nonadherent, Superabsorbent, and Antimicrobial Wound Dressing Applications” Biomacromolecules 13, 1853-1863 (2012)].

Установено е, че съполимерен филм от ПКБ и полибутилметакрилат (ПБМА) ускорява заздравяването на рани, като ефектът му е сравним с този на препарати, съдържащи основен фибробластен растежен фактор, поливинилпиролидон-йоден комплекс, депротеинизиран хемодиализат от телешка кръв или витамин Е [ S. Fujishita, С. Inaba, S Tada, М. Gemmei-Ide, Н. Kitano, Y. Saruwatari „Effect of Zwitterionic Polymers on Wound Healing“ Biol. Pharm. Bull. 31, 2309-2315 (2008)]. In vivo изследване на модел на рана третирана с модифицирана с ПЦЙ мембрана от поли(тетрафлуороетилен) показва, че раната зараства за 14 дни, като хистологията на възстановената кожа е близка до тази на нормална кожа [J.-F. Jhong, A. Venault, С.-С. Hou, S.-H. Chen, Т.-С. Wei, J. Zheng, J. Huang, Y. Chang „Surface Zwitterionization of Expanded Poly (tetrafluoroethylene) Membranes via Atmospheric Plasma-Induced Polymerization for Enhanced Skin WoundIt was found that a copolymer film of PCBs and polybutyl methacrylate (PBMA) accelerates wound healing, and its effect is comparable to that of preparations containing basic fibroblast growth factor, polyvinylpyrrolidone-iodine complex, deproteinized hemodialysate vitamin E. Fujishita, S. Inaba, S Tada, M. Gemmei-Ide, N. Kitano, Y. Saruwatari “Effect of Zwitterionic Polymers on Wound Healing” Biol. Pharm. Bull. 31, 2309-2315 (2008)]. An in vivo study of a PCI-modified wound model with a poly (tetrafluoroethylene) membrane showed that the wound healed in 14 days, with the histology of the restored skin close to that of normal skin [J.-F. Jhong, A. Venault, S.-S. Hou, S.-H. Chen, T.-S. Wei, J. Zheng, J. Huang, Y. Chang „Surface Zwitterionization of Expanded Poly (tetrafluoroethylene) Membranes via Atmospheric Plasma-Induced Polymerization for Enhanced Skin Wound

Healing“ ACS Appl. Mater. Interfaces 5, 6732-6742 (2013)]. Модифицирането на филма от поли (тетрафлуороетилен) с ПСБ повишава хидрофилните свойства на повърхността и способността му да задържа влага. Определен е капацитетът на хидратация на филма 10.3 mg/cm² Макар и значителен, поради ограничението влагата да се сорбира само от повърхностния слой на превръзката, тези материали не са подходящи за обилно ексудиращи рани. С настоящето изобретение този недостатък е преодолян с възможността водата, съответно раневият ексудат да се абсорбират в целия обем на хидрогела. За сравнение техният капацитет на хидратация е 4-5 пъти по-висок за съпоставима по дебелина превръзка. В допълнение хидрогелът е 3D обект и количеството погълната вода, съответно ексудат, може да се контролира с дебелината на филма, вида на ПЦЙ, гъстотата на омрежване. Например 1 сm³ от суха мрежа от ПКБ поглъща и задържа над 1500 mg вода и 5 пъти повече солеви разтвор. Този голям капацитет за поглъщане на водни разтвори определя ПЦЙ хидрогелове, като подходящи материали за превръзки за лечение на хронични рани. Абсорбирайки ексудата на раната, хидрогелът понижава количеството на металопротеазите в раната, чието високо съдържание е причина за хронифицирането на раната. Така, чрез понижаване количеството на металопротеазите без да се инхибира тяхната активност, превръзката създава благоприятни условия за възстановителните процеси на тъканта.Healing “ACS Appl. Mater. Interfaces 5, 6732-6742 (2013)]. Modification of the poly (tetrafluoroethylene) film with PSB increases the hydrophilic properties of the surface and its ability to retain moisture. The hydration capacity of the film was determined to be 10.3 mg / cm ² . With the present invention this disadvantage is overcome by the possibility of water, respectively the wound exudate to be absorbed in the whole volume of the hydrogel. In comparison, their hydration capacity is 4-5 times higher for a comparable thickness bandage. In addition, the hydrogel is a 3D object and the amount of water absorbed, respectively exudate, can be controlled by the thickness of the film, the type of PCJ, the density of crosslinking. For example, 1 cm ³ of dry PCB network absorbs and retains over 1500 mg of water and 5 times more saline. This high absorption capacity of aqueous solutions defines PCJ hydrogels as suitable dressing materials for the treatment of chronic wounds. By absorbing the wound exudate, the hydrogel reduces the amount of metalloproteases in the wound, the high content of which is the reason for the chronicity of the wound. Thus, by reducing the amount of metalloproteases without inhibiting their activity, the dressing creates favorable conditions for the regenerative processes of the tissue.

Хитозанът е природен полизахарид, който притежава противогъбични и антимикробни свойства, както и пропускливост към кислорода - характеристики, които го правят подходящ и изследван материал за лечение на различни видове рани [Chitosan: А potential biopolymer for wound management. Banoa I., Arshad M., Yasin T., Ghauri M. A., Younus M. International Journal of Biological Macromolecules 102 (2017) 380-383].Chitosan is a natural polysaccharide that has antifungal and antimicrobial properties, as well as oxygen permeability - characteristics that make it a suitable and researched material for the treatment of various types of wounds [Chitosan: A potential biopolymer for wound management. Banoa I., Arshad M., Yasin T., Ghauri M. A., Younus M. International Journal of Biological Macromolecules 102 (2017) 380-383].

Третирането c терапевтични протеини е атрактивен подход за лечение на различни болести. Протеините обаче, често са нестабилни във физиологични условия, което намалява бионаличността и активността им и налага използване на по-високи дози. Присаждането на полимери към протеините се използва често, за да се увеличи стабилността на протеина [Peptide and Protein Delivery, Chris Van der Walle, 2011 Elsevier Inc. Chapter 11. Stefano Salmaso, Paolo Caliceti „Peptide and Protein Bioconjugation: A Useful Tool to Improve the Biological Performance of Biotech Drugs“]. Конюгирането на протеини c ПКБ, подобрява стабилността им съизмеримо с ефекта на ПЕГ, като конюгатите запазват и дори увеличават активността си [A. J. Keefe, S. Jiang „Poly (zwitterionic) protein conjugates offer increased stability without sacrificing binding affinity or bioactivity“ Nature Chemistry, 4, 59-63 (2012)]. ПФБ също са използвани за конюгиране на протеини, например за интерферон [A. Lewis, Y. Tang, S. Brocchini, J. Choi, A. Godwin ,,Poly (2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine) for Protein Conjugation“ Bioconjugate Chem. 19, 2144-2155 (2008)]. Конюгиране на протеини със сулфобетаини досега не е съобщено.Therapeutic protein treatment is an attractive approach to the treatment of various diseases. However, proteins are often unstable under physiological conditions, which reduces their bioavailability and activity and requires the use of higher doses. Protein grafting is often used to increase protein stability [Peptide and Protein Delivery, Chris Van der Walle, 2011 Elsevier Inc. Chapter 11. Stefano Salmaso, Paolo Caliceti “Peptide and Protein Bioconjugation: A Useful Tool to Improve the Biological Performance of Biotech Drugs”]. Conjugation of proteins with PCBs improves their stability commensurate with the effect of PEG, as the conjugates retain and even increase their activity [A. J. Keefe, S. Jiang “Poly (zwitterionic) protein conjugates offer increased stability without sacrificing binding affinity or bioactivity” Nature Chemistry, 4, 59-63 (2012)]. PFBs have also been used to conjugate proteins, such as interferon [A. Lewis, Y. Tang, S. Brocchini, J. Choi, A. Godwin ,, Poly (2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine) for Protein Conjugation “Bioconjugate Chem. 19, 2144-2155 (2008)]. Conjugation of proteins with sulfobetaines has not been reported to date.

Силиконова суха емулсия с имобилизирана серин протеаза от групата на субтилизина е разработена за ензимно почистване на рани, която се оказва по-ефективна от известните до момента ензимни мехлеми [Richard Bott; James Crissman, Csilla Kollar, Mae Saldajeno, Grant Ganshaw, Xavier Thomas, Thomas H. Lane, Paal Klykken, Jeffrey M. Davidson, Lillian B. Nanney, A silicone-based controlled-release device for accelerated proteolytic debridement of wounds. Wound Rep Reg (2007) 15 227-235]. Тя е включена в матрица от поли (винилов алкохол) и полученият композитен материал е поставен на адхезивен носител. Под действие на ексудата в раната, поли (виниловият алкохол) се разтваря и в рамките на 8 h освобождава в раната силиконова емулсия на серин протеазата. По този начин, се осигурява ензимното почистване на моделни рани върху кожа на свиня. Тези превръзки, обаче, не осигуряват абсорбция на раневия ексудат, като авторите не коментират тяхното действие при обилно ексудиращи рани, където поради голямото количество течност, силиконовата емсулсия с протеаза би се разтворила много по-бързо и аналогично на геловете за мазане, това би довело до отмиване на активния компонент-серин протеазата.Silicone dry emulsion with immobilized serine protease from the subtilisin group has been developed for enzymatic wound cleansing, which has proven to be more effective than known enzyme ointments [Richard Bott; James Crissman, Csilla Kollar, Mae Saldajeno, Grant Ganshaw, Xavier Thomas, Thomas H. Lane, Paal Klykken, Jeffrey M. Davidson, Lillian B. Nanney, A silicone-based controlled-release device for accelerated proteolytic debridement of wounds. Wound Rep Reg (2007) 15 227-235]. It is included in a matrix of poly (vinyl alcohol) and the resulting composite material is placed on an adhesive carrier. Under the action of the exudate in the wound, poly (vinyl alcohol) dissolves and within 8 hours releases into the wound silicone emulsion of serine protease. In this way, the enzymatic cleaning of model wounds on pig skin is ensured. However, these dressings do not provide absorption of wound exudate, and the authors do not comment on their action in abundantly exuding wounds, where due to the large amount of fluid, silicone emulsion with protease would dissolve much faster and similar to lubricating gels, this would until the active ingredient serine protease is washed away.

В ЕР 0194647 В1 е разкрита биосъвместима, оклузивна или полуоклузивна хирургична адхезивна лента с ниска пропускливост на влага и съдържаща ензим в прахообразна форма и сребърен сулфадиазин, устойчива на стерилизация и съхранение при температури под 40°С. В сравнение с предлаганите в настоящото изобретение полицвитерйонни хидрогелове, тя отново не може да абсорбира раневия ексудат. При прекалено сухи рани (например от изгаряне) е необходимо специално третиране с вода на раната, за да може лентата да започне да освобождава протеазата.EP 0194647 B1 discloses a biocompatible, occlusive or semi-occlusive surgical adhesive tape with low moisture permeability and containing enzyme in powder form and silver sulfadiazine, resistant to sterilization and storage at temperatures below 40 ° C. Compared to the polyviterione hydrogels of the present invention, it is again unable to absorb wound exudate. Excessively dry wounds (such as burns) require special water treatment of the wound so that the band can begin to release the protease.

В литературата не са известни за лечение на хронични рани превръзки от полицвитерйонен хидрогел или двуслойни такива с горен слой от хитозан и вътрешен от полицвитерйонен хидрогел, които едновременно (а) да са с ултра ниска биоадхезия и антибиофилм образуващи свойства, (б) да проявяват т. нар. антиполиелектролитен ефект, т. е. да абсорбират по-големи количества солеви разтвори, вкл. раневи ексудат, отколкото вода, (в) да проявяват антибактериални свойства, и (г) да имат протеолитична активност, дължаща се на имобилизиран в тях ензим с протеолитично действие за разграждане на некротичната тъкан.There are no known in the literature for the treatment of chronic wounds polycythene hydrogel dressings or two-layer ones with a top layer of chitosan and an inner layer of polyviterion hydrogel, which (a) have ultra-low bioadhesion and antibiofilm-forming properties, (b) exhibit so-called anti-polyelectrolyte effect, ie to absorb larger amounts of saline solutions, incl. wound exudate than water, (c) exhibit antibacterial properties, and (d) have proteolytic activity due to an immobilized enzyme with proteolytic action to degrade necrotic tissue.

Описание на изобретениетоDescription of the invention

Задачата на настоящото изобретение е разработването на полицвитерйонни хидрогелове за превръзки за лечение на хронични и некротични рани, включително обилно ексудиращи рани, които да притежават необходимите свойства, а именно: свойството да набъбват по-силно в солеви разтвори и телесни течности, отколкото в чиста вода, т. е. да абсорбират обилно отделящ се ексудат от раната; изключително ниска биоадхезивност, т. е. да не позволяват образуването на бактериален биофилм, което може да се подсили с антибактериалните свойства на втори слой от хитозанов хидрогел, като същевременно притежават и протеолитична активност, дължаща се на включените в състава на полицвитерйонния хидрогел ензими с протеолитично действие, целящи разграждане на некротичната тъкан на хронични рани. В допълнение, хидрогелът осигурява дифузия на газовете, а механичните му свойства (модул на еластичност) са много близки до тези на кожата, което създава допълнителен комфорт за пациентите и допринася за нормалното заздравяване на раната.It is an object of the present invention to provide polyviterion hydrogels for dressings for the treatment of chronic and necrotic wounds, including abundantly exuding wounds, which have the necessary properties, namely: the ability to swell more in saline and body fluids than in pure water. , i.e. to absorb abundantly exudate exudate from the wound; Extremely low bioadhesiveness, ie not to allow the formation of bacterial biofilm, which can be enhanced by the antibacterial properties of the second layer of chitosan hydrogel, while having proteolytic activity due to included in the composition of polyviterion hydrogel enzymes with proteolites action aimed at breaking down the necrotic tissue of chronic wounds. In addition, the hydrogel provides diffusion of gases, and its mechanical properties (modulus of elasticity) are very close to those of the skin, which creates additional comfort for patients and contributes to the normal healing of the wound.

Разработени са еднослойни полицвитерйонни хидрогелове и двуслойни полицвитерйонни/хитозанови хидрогелове за превръзки за лечение на хронични и/или обилно ексудиращи рани, които са решение на поставената задача.One-layer polyviterion hydrogels and two-layer polyviterione / chitosan hydrogels have been developed for dressings for the treatment of chronic and / or abundantly exuding wounds, which are a solution to the problem.

Хидрогеловете от омрежени полицвитерйони с имобилизирана протеаза предлагат комплекс от функционалности и са подходящи за разработване на превръзки за лечение на хронични и/или обилно ексудиращи рани. Включеният ензим с протеолитично действие, имобилизиран в порите на хидрогела или по неговата повърхност, разгражда некротичната тъкан и улеснява процесите на възстановяване на тъканта без да бъде отмит от раневите течности. Полицвитерйонната мрежа поглъща ексудата, като тя може да поеме надHydrogels from crosslinked polyviterions with immobilized protease offer a complex of functionalities and are suitable for the development of dressings for the treatment of chronic and / or abundantly exuding wounds. The included enzyme with proteolytic action, immobilized in the pores of the hydrogel or on its surface, breaks down necrotic tissue and facilitates the process of tissue repair without being washed away by wound fluids. The polysviter network absorbs the exudate, and it can take over

300 пъти повече ексудат, отколкото е собственото тегло на сухата мембрана. Набъбналата мрежа поддържа необходимата влага за възстановяване на нарушената тъкан, което в комбинация с ниската биоадхезивност на хидрогела не позволява образуването на биофилм от бактерии и предпазва раната от бактериална инфекция, а добавянето на втори слой отхитозан усилва антибактериалната активност на превръзката. С това отпада необходимостта от антибиотично или друг вид гермицидно лечение. Ниската биоадхезия на полицвитерйонния хидрогел предотвратява залепването на превръзката към тъканта, което заедно с механичната здравина и еластичните й свойства, близки до тези на кожата, допринасят за комфорта на пациента по време на третиране на раната и при отстраняване/смяна на превръзката.300 times more exudate than the dry weight of the dry membrane. The swollen network maintains the necessary moisture to repair damaged tissue, which in combination with the low bioadhesion of the hydrogel prevents the formation of a biofilm of bacteria and protects the wound from bacterial infection, and the addition of a second layer of chitosan enhances the antibacterial activity of the dressing. This eliminates the need for antibiotic or other germicidal treatment. The low bioadhesion of the polyviterione hydrogel prevents the dressing from sticking to the tissue, which together with the mechanical strength and its elastic properties close to those of the skin contribute to the patient's comfort during wound treatment and removal / replacement of the dressing.

Разработените полицвитерйонни хидрогелове са еднослойни или двуслойни, с компоненти и структура, представени схематично на фигура 1, фигура 2, фигура 3, фигура 4, фигура 5 и фигура 6.The developed polyviterione hydrogels are single-layer or double-layer, with components and structure shown schematically in Figure 1, Figure 2, Figure 3, Figure 4, Figure 5 and Figure 6.

Предмет на изобретението са следните хидрогелове:The subject of the invention are the following hydrogels:

Еднослоен хидрогел, изграден от полицвитерйонна мрежа от поли (сулфобетаин метакрилат) (ПСБМА) и омрежващи сегменти от полиетиленгликол диакрилат (ПЕГДА) с молекулна маса 575 g/mol, като съдържанието на ПЕГДА е в граници от 0.2 тегл. % до 8.2 тегл. %. Съдържанието на водата в хидрогела варира от 10 тегл. % до 67 тегл. %.A single layer hydrogel composed of a polyviterite network of poly (sulfobetaine methacrylate) (PSBMA) and crosslinking segments of polyethylene glycol diacrylate (PEGDA) with a molecular weight of 575 g / mol, the content of PEGDA is in the range of 0.2 wt. % to 8.2 wt. %. The water content in the hydrogel varies from 10 wt. % up to 67 wt. %.

Еднослоен хидрогел, изграден от полицвитерйонна мрежа от поли (карбоксибетаин метакрилат) (ПКБМА) с омрежващи сегменти от полиетиленгликол диакрилат (ПЕГДА) с молекулна маса 575 g/mol, като съдържанието на ПЕГДА е в граници от 7.5 тегл. % до 17.6 тегл. %. Съдържанието на водата в хидрогела варира от 10 тегл. % до 90 тегл. %.A single layer hydrogel composed of a polyviterite network of poly (carboxybetaine methacrylate) (PCBMA) with crosslinking segments of polyethylene glycol diacrylate (PEGDA) with a molecular weight of 575 g / mol, the content of PEGDA is in the range of 7.5 wt. % to 17.6 wt. %. The water content in the hydrogel varies from 10 wt. % up to 90 wt. %.

Еднослоен хидрогел, изграден от полицвитерйонна мрежа от (ПСБМА) и омрежващи сегменти от полиетиленгликол диакрилат (ПЕГДА) с молекулна маса 575 g/mol, като съдържанието на ПЕГДА е в граници от 0.2 тегл. % до 8.2 тегл. %. В порите на мрежата е включена протеаза Субтилизин в количества от 10 mg/g до 87 mg/g, отнесени спрямо теглото на сухата мрежа. Съдържанието на водата в хидрогела варира от 10 тегл. % до 67 тегл. %.A single layer hydrogel composed of a polyviterite network of (PSBMA) and crosslinking segments of polyethylene glycol diacrylate (PEGDA) with a molecular weight of 575 g / mol, the content of PEGDA is in the range of 0.2 wt. % to 8.2 wt. %. Subtilisin protease is included in the pores of the network in amounts from 10 mg / g to 87 mg / g, based on the weight of the dry network. The water content in the hydrogel varies from 10 wt. % up to 67 wt. %.

Еднослоен хидрогел, изграден от полицвитерйонна мрежа от поли (карбоксибетаин метакрилат) (ПКБМА) с омрежващи сегменти от ПЕГДА с молекулна маса 575 g/mol, като съдържанието на ПЕГДА е в граници от 7.5 тегл. % до 17.6 тегл. %. В порите на мрежата е включена протеаза Субтилизин в количества от 10 mg/g до 106 mg/g, отнесени спрямо теглото на сухата мрежа. Съдържанието на водата в хидрогела варира от 10 тегл. % до 90 тегл. %.A single layer hydrogel composed of a polyviterite network of poly (carboxybetaine methacrylate) (PCBMA) with crosslinking segments of PEGDA with a molecular weight of 575 g / mol, the content of PEGDA is in the range of 7.5 wt. % to 17.6 wt. %. Subtilisin protease is included in the pores of the network in amounts from 10 mg / g to 106 mg / g, based on the weight of the dry network. The water content in the hydrogel varies from 10 wt. % up to 90 wt. %.

Еднослоен хидрогел, изграден от полицвитерйонна мрежа от поли (сулфобетаин метакрилат) (ПСБМА) и омрежващи сегменти от полиетиленгликол диакрилат (ПЕГДА) с молекулна маса 575 g/mol, като съдържанието на ПЕГДА е в граници от 0.2 тегл. % до 8.2 тегл. %. На повърхността на хидрогела е имобилизирана протеаза - Субтилизин с присадени вериги от ПСБМА с молекулна маса от 8000 g/mol до 12 000 g/mol. Имобилизирането се осъществява чрез физично свързване, т. е. взаимодействие между цвитерйонните остатъци на присадения към ензима ПСБМА и същите от хидрогела. Количеството имобилизиран ензим е от 0.4 mg/cm² до 0.8 mg/cm². Съдържанието на водата в хидрогела варира от 10 тегл. % до 60 тегл. %.A single layer hydrogel composed of a polyviterite network of poly (sulfobetaine methacrylate) (PSBMA) and crosslinking segments of polyethylene glycol diacrylate (PEGDA) with a molecular weight of 575 g / mol, the content of PEGDA is in the range of 0.2 wt. % to 8.2 wt. %. On the surface of the hydrogel is immobilized protease - Subtilisin with grafted chains of PSBMA with a molecular weight of 8000 g / mol to 12,000 g / mol. Immobilization is carried out by physical binding, ie the interaction between the zwitterionic residues of the PSBMA enzyme graft and the same from the hydrogel. The amount of immobilized enzyme is from 0.4 mg / cm ² to 0.8 mg / cm ² . The water content in the hydrogel varies from 10 wt. % up to 60 wt. %.

Полицвитерйонен двуслоен хидрогел, изграден от горен слой, който не е в контакт с раната и долен слой, предназначен да бъде в контакт с наранената тъкан. Горният слой е от неомрежен или омрежен хитозан с добавен поли (етилен оксид) в количества до 20 тегл. %. Долният слой е полицвитерйонен хидрогел от ПСБМА и омрежващи сегменти от ПЕГДА с молекулна маса 575 g/mol и съдържание в граници от 0.2 тегл. % до 8.2 тегл. % или от ПКБМА с омрежващи сегменти от ПЕГДА с молекулна маса 575 g/mol и съдържание в граници от 7.5 тегл. % до 17.6 тегл. %. В порите на полицвитерйонния хидрогел е включена протеаза Субтилизин в количества от 10 mg/g до 87 mg/g или от 10 mg/g до 106 mg/g, отнесени спрямо теглото на сухата мрежа съответно от ПСБМА или ПКБМА. Двата слоя са в тегловни съотношения горен : долен слой от 5:95 до 30:70. Съдържанието на водата в хидрогела варира от 10 тегл. % до 66 тегл. %, съответно от 10 тегл. % до 89 тегл. %.Polyviterionic two-layer hydrogel composed of an upper layer that is not in contact with the wound and a lower layer designed to be in contact with the injured tissue. The upper layer is of non-crosslinked or crosslinked chitosan with added poly (ethylene oxide) in amounts up to 20 wt. %. The lower layer is a polysviterion hydrogel of PSBMA and crosslinking segments of PEGDA with a molecular weight of 575 g / mol and a content in the range of 0.2 wt. % to 8.2 wt. % or of PKBMA with crosslinking segments of PEGDA with a molecular weight of 575 g / mol and a content in the range of 7.5 wt. % to 17.6 wt. %. Subtilisin protease is included in the pores of the polyviterion hydrogel in amounts of 10 mg / g to 87 mg / g or 10 mg / g to 106 mg / g, based on the weight of the dry network, respectively, of PSBMA or PCBMA. The two layers are in weight ratios upper: lower layer from 5:95 to 30:70. The water content in the hydrogel varies from 10 wt. % up to 66 wt. %, respectively of 10 wt. % up to 89 wt. %.

Полицвитерйонен двуслоен хидрогел, изграден от горен слой, който не е в контакт с раната и долен слой, предназначен да бъде в контакт с наранената тъкан. Горният слой е от неомрежен или омрежен хитозан с добавен поли (етилен оксид) в количества до 20 тегл. %. Долният слой е полицвитерйонен хидрогел от ПСБМА и омрежващи сегменти от ПЕГДА с молекулна маса 575 g/mol и съдържание от 0.2 тегл. % до 8.2 тегл.%. На повърхността на долния слой е имобилизирана протеаза Субтилизин с присадени вериги от ПСБМА с молекулна маса от 8000 g/mol до 12 000 g/mol. Имобилизирането се осъществява чрез физично взаимодействие между цвитерйонните остатъци на присадения към ензима ПСБМА и същите от хидрогела. Количеството имобилизиран ензим е от 0.4 mg/cm² до 0.8 mg/cm². Двата слоя са в тегловни съотношения горен : долен слой от 5:95 до 30:70. Съдържанието на водата в хидрогела варира от 10 тегл. % до 60 тегл. %.Polyviterionic two-layer hydrogel composed of an upper layer that is not in contact with the wound and a lower layer designed to be in contact with the injured tissue. The upper layer is of non-crosslinked or crosslinked chitosan with added poly (ethylene oxide) in amounts up to 20 wt. %. The lower layer is a polyviterione hydrogel of PSBMA and crosslinking segments of PEGDA with a molecular weight of 575 g / mol and a content of 0.2 wt. % to 8.2 wt.%. On the surface of the lower layer is immobilized protease Subtilisin with grafted chains of PSBMA with a molecular weight of 8000 g / mol to 12,000 g / mol. Immobilization is performed by physical interaction between the zwitterionic residues of the PSBMA enzyme graft and the same from the hydrogel. The amount of immobilized enzyme is from 0.4 mg / cm ² to 0.8 mg / cm ² . The two layers are in weight ratios upper: lower layer from 5:95 to 30:70. The water content in the hydrogel varies from 10 wt. % up to 60 wt. %.

За разработването на полицвитерйонните хидрогелове за превръзки за лечение на хронични и обилно ексудиращи рани са синтезирани поли (сулфобетаин метакрилат) ни и поли (каброксибетаин метакрилат) ни мрежи, като за целта са използвани съответните мономери и омрежващ агент полиетиленгликол диакрилат (ПЕГДА) с молекулна маса 575 g/mol. Получаването на мрежа от ПСБМА се извършва във водна среда при температура 60°С, инициатор K2S2O8 (0.1 mol. %) и ПЕГДА в количество от 0.1 mol % до 4.0 mol % спрямо мономера СБМА.Poly (sulfobetaine methacrylate) and poly (cabroxybetaine methacrylate) nets have been synthesized for the development of polyviterione hydrogels for dressings for the treatment of chronic and abundantly exuding wounds, using the appropriate monomers and crosslinking agent polyethylene glycol molecule. 575 g / mol. The preparation of the PSBMA network was performed in an aqueous medium at 60 ° C, initiator K2S2O8 (0.1 mol.%) And PEGDA in an amount of 0.1 mol% to 4.0 mol% relative to the SBMA monomer.

Мрежата от ПКБМА е получена в смесен разтворител етилен гликол/етанол/вода (3:1:1 обемни части), при температура 60°С, инициатор натриев метабисулфит (0.664 mol %) и амониев персулфат (1.445 mol %). Количеството на ПЕГДА варира от 3.0 mol % до 7.0 mol %.The PCBMA network was prepared in ethylene glycol / ethanol / water mixed solvent (3: 1: 1 by volume) at 60 ° C, sodium metabisulfite initiator (0.664 mol%) and ammonium persulfate (1.445 mol%). The amount of PEGDA varies from 3.0 mol% to 7.0 mol%.

Получен е двуслоен хидрогел изграден от първи слой от неомрежен или омрежен хитозан с добавен поли (етилен оксид) в количества от 0 тегл. % до 20 тегл. %. Омрежването на хитозана се извършва с омрежващи агенти, известни в литературата [Reddy, N., Reddy, R., Jiang, Q. Crosslinking biopolymers for biomedical applications. Trends in Biotechnology. 2015, 33 (6), 362-369] - епихлорохидрин, етиленгликолдиглицидилов етер, глутаров алдехид, в количества от 1 тегл. % до 10 тегл. %. Вторият слой е от мрежа от ПСБМА или ПКБМА, получена както е описано по-горе.A two-layer hydrogel consisting of a first layer of non-crosslinked or crosslinked chitosan with added poly (ethylene oxide) in amounts of 0 wt. % up to 20 wt. %. Chitosan crosslinking is performed with crosslinking agents known in the literature [Reddy, N., Reddy, R., Jiang, Q. Crosslinking biopolymers for biomedical applications. Trends in Biotechnology. 2015, 33 (6), 362-369] - epichlorohydrin, ethylene glycol diglycidyl ether, glutaraldehyde, in amounts of 1 wt. % up to 10 wt. %. The second layer is from a network of PSBMA or PCBMA, prepared as described above.

Получени са ПСБМА с молекулна маса в интервала 8000 g/mol ^ 12000 g/mol и крайни реакционноспособни групи - цикличен карбонат (ПСБМА-1) и сукцинимиден активен естер (ПСБМА-2) чрез полимеризация с пренос на атом на СБМА в присъствие на инициаторите, съответно 2-оксо-1,3-диоксолан-4 ил-(метил-2-бромо-2-метилпропаноат) или на К-сукцинимидил-(метил-2-бромо-2-метилпропаноат), катализатор CuBr и лиганд 2,2'-дипиридил в трифлуоретанол при 60°С за 14 h.PSBMA with a molecular weight in the range of 8000 g / mol ^ 12000 g / mol and final reactive groups - cyclic carbonate (PSBMA-1) and succinimide active ester (PSBMA-2) were obtained by polymerization by transfer of an SBMA atom in the presence of the initiators , respectively, 2-oxo-1,3-dioxolan-4 yl- (methyl-2-bromo-2-methylpropanoate) or N-succinimidyl- (methyl-2-bromo-2-methylpropanoate), CuBr catalyst and ligand 2, 2'-dipyridyl in trifluoroethanol at 60 ° C for 14 hours.

Получен е модифициран с линеен ПСБМА субтилизин. Модификацията на субтилизина със синтетичните полицвитерйони, описани по-горе, е извършена в разтвор на глицерин при 25°С, като са получени два конюгата субтилизин - ПСБМА-1 и субтилизин - ПСБМА-2, с присадени средно по една верига ПСБМА.Subtilisin-modified linear PSBMA was obtained. The modification of subtilisin with the synthetic polyviterions described above was performed in glycerol solution at 25 ° C to give two conjugates of subtilisin - PSBMA-1 and subtilisin - PSBMA-2, with an average of one PSBMA chain grafted.

Равновесната степен на набъбване на синтезираните ПСБМА полицвитерйонни мрежи във вода и воден разтвор на натриев хлорид с концентрация от 0.1 М до 5.0 М е определена посредством гравиметричен анализ. За образуваните по този начин полицвитерйонни хидрогелове, е определен модулът им на еластичност при съответна равновесна степен на набъбване във вода посредством контактната теория на Херц. Определена е микротвърдостта по Викерс на сухите полицвитерйонни мрежи.The equilibrium degree of swelling of the synthesized PSBMA polyviterite networks in water and aqueous sodium chloride solution with a concentration of 0.1 M to 5.0 M was determined by gravimetric analysis. For the polyvitertion hydrogels formed in this way, their modulus of elasticity at a corresponding equilibrium degree of swelling in water is determined by the Hertz contact theory. The Vickers microhardness of the dry polyviterite nets was determined.

В полицвитерйонните хидрогелове на основата на ПСБМА и ПКБМА и омрежени с ПЕГДА с молекулна маса 575 g/mol и съдържание съответно от 0.2 тегл. % до 8.2 тегл. % или от 7.5 тегл. % до 17.6 тегл. %, е включен ензимът Субтилизин при концентрация на ензимния разтвор от 0.813 mg/ml и при температура 4°С. След това е определена активността на имобилизирания в полицвитерйонните хидрогелове Субтилизин върху субстрат казеин.In the polysviterion hydrogels based on PSBMA and PKBMA and cross-linked with PEGDA with a molecular weight of 575 g / mol and a content of 0.2 wt. % to 8.2 wt. % or from 7.5 wt. % to 17.6 wt. %, the enzyme Subtilisin was included at an enzyme solution concentration of 0.813 mg / ml and at a temperature of 4 ° C. The activity of subtilisin immobilized in the polysviterion hydrogels on the casein substrate was then determined.

Определена е ензимната активност на двата конюгата субтилизин - ПСБМА-1 и субтилизин - ПСБМА2, като е използван същият субстрат.The enzymatic activity of the two conjugates subtilisin - PSBMA-1 and subtilisin - PSBMA2 was determined using the same substrate.

Направено е изследване на цитотоксичността на мрежите от ПСБМА и са изследвани цитологичните изменения при клетки, инкубирани с полицвитерйонни хидрогелове. Установено е, че тези хидрогелове са нецитотоксични, като клетъчната жизнеспособност в присъствието на ПСБМА хидрогелове е дори по-голяма от тази на клетките от контролната проба, където няма полицвитерйонни хидрогелове. Установено е също, че ПЕГДА не оказва влияние върху клетъчната жизнеспособност.The cytotoxicity of PSBMA networks was studied and the cytological changes in cells incubated with polysviterion hydrogels were studied. These hydrogels were found to be non-cytotoxic, and cell viability in the presence of PSBMA hydrogels was even greater than that of cells in the control sample, where there were no polysviterionic hydrogels. It has also been found that PEGDA does not affect cell viability.

Равновесната степен на набъбване на синтезираните ПСБМА полицвитерйонни мрежи във вода и воден разтвор на натриев хлорид с концентрация от 0.1 М до 5.0 М варира от 200% до 2300%, като зависи както от количеството на омрежващите сегменти, така и от концентрацията на солевия разтвор. Измереният модул на еластичност на ПСБМА полицвитерйонни хидрогелове е между 1 кРа и 3 кРа, т. е. в областта от модула на еластичност, измерен in vivo за човешка кожа [С. Pailler-Mattei, S. Вее, Н. Zahouani „In vivo measurements of the elastic mechanical properties of human skin by indentation tests“ Medical Engineering & Physics 30 (2008) 599606]. Изследвана е температурната зависимост на способността на ПСБМА полицвитерйонни мрежи да поглъщат вода (в температурния интервал 20-90°С). Изследвано е набъбването на същите мрежи в разтвор на Кокубо при 37°С с цел имитация на условията в човешкия организъм. Изследвани са реологичните свойства на ПСБМА хидрогелове в тяхната равновесна степен на набъбване във вода, като тези измервания доказват механичната стабилност и здравина на така получените хидрогелове.The equilibrium degree of swelling of the synthesized PSBMA polyviterite networks in water and aqueous sodium chloride solution with a concentration of 0.1 M to 5.0 M varies from 200% to 2300%, depending on both the amount of crosslinking segments and the concentration of saline. The measured modulus of elasticity of PSBMA polyviterion hydrogels is between 1 kPa and 3 kPa, ie in the region of the modulus of elasticity measured in vivo for human skin [C. Pailler-Mattei, S. Vee, N. Zahouani “In vivo measurements of the elastic mechanical properties of human skin by indentation tests” Medical Engineering & Physics 30 (2008) 599606]. The temperature dependence of the ability of PSBMA polyviterion networks to absorb water (in the temperature range 20-90 ° C) was studied. The swelling of the same networks in Kokubo's solution at 37 ° C was studied in order to simulate the conditions in the human body. The rheological properties of PSBMA hydrogels in their equilibrium degree of swelling in water have been studied, and these measurements prove the mechanical stability and strength of the hydrogels thus obtained.

Равновесната степен на набъбване на синтезираните ПКБМА полицвитерйонни мрежи във вода и в разтвори на натриев хлорид с концентрация от 0.1 М до 5.0 М е определена гравиметрично. Степента на набъбване се променя от 200% до 1000%, като зависи от както от количеството на омрежващи сегменти, така и от концентрацията на солта в разтвора. Изследвана е кинетиката на набъбване във вода на ПКБМА полицвитерйонни мрежи, посредством гравиметричен анализ. За образуваните по този начин ПКБМА полицвитерйонни хидрогелове, е определен модулът им на еластичност при съответна равновесна степен на набъбване, посредством контактната теория на Херц, като той отново е в областта от 1 до 5 кРа, т. е. отново напълно съответства на модула на еластичност измерен in vivo за човешка кожа. Изледвана е pH зависимостта на способността на ПКБМА полицвитерйонни мрежи да набъбват в интервала рН = 2 до 10. Изследвани са реологичните свойства на ПКБМА хидрогелове в тяхната равновесна степен на набъбване във вода, като тези измервания доказват механичната стабилност и здравина на така получените хидрогелове.The equilibrium degree of swelling of the synthesized PCBMA polyviterite networks in water and in sodium chloride solutions with a concentration of 0.1 M to 5.0 M was determined gravimetrically. The degree of swelling varies from 200% to 1000%, depending on both the amount of crosslinking segments and the salt concentration in the solution. The kinetics of swelling in water of PCBMA polyviterite networks was studied by gravimetric analysis. For the PKBMA polycviterion hydrogels thus formed, their modulus of elasticity at a corresponding equilibrium degree of swelling was determined by the Hertz contact theory, again in the range of 1 to 5 kPa, ie again fully corresponding to the modulus of swelling. elasticity measured in vivo for human skin. The pH dependence of the ability of PKBMA polyviterion networks to swell in the range pH = 2 to 10 was studied.

При сравнение на равновесната степен на набъбване на синтезираните полицвитерйонни мрежи във вода е установено, че способността за набъбване на ПКБМА е неколкократно по-голяма от тази на ПСБМА, докато това не е така в разтвор на натриев хлорид. Причината в разликата в поведението на двата вида мрежи в солевите разтвори е силно изразената склонност на ПСБМА да образува цвитерйонни клъстери, които играят ролята на физична мрежа и които се разпадат в солеви разтвори, а не в чиста вода. В резултат, ПСБМА има по-силно изразена склонност да набъбва в солевите разтвори, отколкото ПКБМА. Известно е, също така, че модулът на еластичност на мрежите е пропорционален на броя на физическите и/или химическите връзки в тях. При това е налице връзка между равновесното съотношение на набъбване и модулите на еластичността на синтезираните полицвитерйонни мрежи.When comparing the equilibrium swelling of the synthesized polyviterite networks in water, it was found that the swelling capacity of PCBMA is several times higher than that of PSBMA, while this is not the case in sodium chloride solution. The reason for the difference in the behavior of the two types of networks in saline solutions is the strong tendency of PSBMA to form zwitterionic clusters, which play the role of a physical network and which decompose in saline solutions and not in pure water. As a result, PSBMA has a more pronounced tendency to swell in saline solutions than PCBMA. It is also known that the modulus of elasticity of nets is proportional to the number of physical and / or chemical bonds in them. There is a relationship between the equilibrium swelling ratio and the modulus of elasticity of the synthesized polyviterite networks.

Установена е зависимост между броя на физическите и/или химическите връзки в полицвитерйонните мрежи и микротвърдостта. Колкото повече са връзките в мрежите, толкова по-голяма е и микротвърдостта. Микротвърдостта на ПСБМА намалява при повишаване на концентрацията на ПЕГДА до 8.2 тегл. %, докато микротвърдостта на ПКБМА се увеличава с нарастването на концентрацията на ПЕГДА от 7.5 тегл. % до 17.6 тегл. %.A relationship has been established between the number of physical and / or chemical bonds in polyviter nets and microhardness. The more connections in the networks, the greater the microhardness. The microhardness of PSBMA decreases with increasing PEGDA concentration to 8.2 wt. %, while the microhardness of PCBMA increases with increasing PEGDA concentration of 7.5 wt. % to 17.6 wt. %.

Наблюдаваните зависимости при полицвитерйонните мрежи показват, че концентрацията на ПЕГДА повлиява свойствата на мрежите, като при мрежата от ПСБМА модулът на еластичност и микротвърдостта се понижават, поради разпадане на физическите връзки на мрежата и повишаване на хидрофилността й, а при мрежата от ПКБМА ефектът е противоположен - нарастването на гъстотата на химическото омрежване води до увеличаване на еластичността и микротвърдостта й. В този смисъл концентрацията на ПЕГДА се използва за контрол на свойствата на полицвитерйонните мрежи и фина настройка на свойствата на полицвитерйонните хидрогелове в качеството им на матрици за имобилизиране на ензими.The observed dependences in the polyviterite networks show that the concentration of PEGDA affects the properties of the networks. - Increasing the density of chemical crosslinking leads to an increase in its elasticity and microhardness. In this sense, the concentration of PEGDA is used to control the properties of polyviterite networks and fine-tune the properties of polyviterion hydrogels as immobilization matrices.

За придаване на протеолитични свойства на полицвитерйонните хидрогелове за превръзки за лечение на хронични и обилно ексудиращи рани, в получените съгласно горното описание полицвитерйонни хидрогелове се включва протеолитичният ензим субтилизин. Методът, по който ензимът се имобилизира в полицвитерйонния хидрогел е физично включване, поради неговата лесна изпълнимост и факта, че не променя присъщите на ензима свойства, нито се използват химически превръщания. По този начин се формира полицвитерйонен хидрогел за превръзки за лечение на хронични и/или некротични рани, при който субтилизинът е разположен в порите на хидрогеловете от ПСБМА или ПКБМА. Концентрацията на ПЕГДА, използван за омрежването на ПСБМА или ПКБМА, не оказва съществено влияние на включването на субтилизина в хидрогеловете, ако за това е предоставено достатъчно време, като например за имобилизирането в ПСБМА хидрогелове са достатъчни 48 h за постигане на равновесно ензимно включване с ефективност 45-50%. За постигане на равновесно ензимно включване в хидрогелове от ПКБМА са необходими 66 h, като се постига ефективност от 55-60%. Повишеното време и по-високата ефективност на натоварване на ензима в ПКБМА хидрогел е свързано със свойството му да набъбва повече, както беше описано по-горе.To impart proteolytic properties to polyviterion hydrogels for dressings for the treatment of chronic and profusely exuding wounds, the proteolytic enzyme subtilisin is included in the polyviterion hydrogels obtained as described above. The method by which the enzyme is immobilized in the polysviterion hydrogel is physical incorporation, due to its easy feasibility and the fact that it does not change the properties inherent in the enzyme, nor does it use chemical transformations. Thus, a polyviterion hydrogel for dressings for the treatment of chronic and / or necrotic wounds is formed, in which subtilisin is located in the pores of the hydrogels of PSBMA or PCBMA. The concentration of PEGDA used for crosslinking of PSBMA or PCBMA does not significantly affect the incorporation of subtilisin into hydrogels if sufficient time is allowed, such as 48 h for immobilization in PSBMA hydrogels to achieve equilibrium efficient enzymatic incorporation efficiency. 45-50%. 66 hours are required to achieve equilibrium enzymatic incorporation into PCBMA hydrogels, achieving an efficiency of 55-60%. The increased time and higher loading efficiency of the enzyme in PCBMA hydrogel is related to its ability to swell more, as described above.

Имобилизирането на субтилизин в полицвитерйонния хидрогел спомага ензимът да остане активен през цялото време, докато превръзката е приложена върху раната. Ензимът имобилизиран в ПКБМА запазва своята активност след включването му в хидрогела, която постепенно намалява от 100% до 50% след 6 цикъла на прилагане. Поради по-малката равновесна степен на набъбване ензимът включен в ПСБМА проявява 60% от активността на неимобилизирания ензим, която спада до 30% на 6-тия цикъл.The immobilization of subtilisin in the polysviterion hydrogel helps the enzyme to remain active at all times while the dressing is applied to the wound. The enzyme immobilized in PCBMA retains its activity after its incorporation into the hydrogel, which gradually decreases from 100% to 50% after 6 cycles of administration. Due to the lower equilibrium level of swelling, the enzyme involved in PSBMA exhibits 60% of the activity of the non-immobilized enzyme, which decreases to 30% of the 6th cycle.

Модифицирането на субтилизина с полисулфобетаинови вериги с крайни циклични карбонатни (ПСБМА-1) или със сукцинимидестерни групи (ПСБМА-2) се осъществява чрез взаимодействие на аминогрупи от ензима и крайните реакционни групи на полисулфобетаина с образуване съответно на уретанова или амидна връзка. Присадени са средно по една верига ПСБМА на молекула субтилизин. След модификацията конюгатите субтилизин-ПСБМА-1 и субтилизин-ПСБМА-2 запазват съответно 56% и 67% от активността на немодифицирания субтилизин, измерени върху субстрат казеин. Имобилизирането на конюгатите се осъществява, като върху мрежа от ПСБМА се прикапва разтвор на конюгата във физиологичен разтвор. Модифицираният субтилизин се имобилизира върху повърхността на хидрогела от ПСБМА чрез цвитерйонни клъстери, образувани между мрежата и присадения към ензима ПСБМА.The modification of subtilisin with polysulphobetaine chains with terminal cyclic carbonate (PSBMA-1) or succinimidester groups (PSBMA-2) is carried out by the interaction of amino groups of the enzyme and the terminal reaction groups of polysulphobetaine with the formation of urea or urea. On average, one PSBMA chain per subtilisin molecule was transplanted. After modification, the conjugates subtilisin-PSBMA-1 and subtilisin-PSBMA-2 retain 56% and 67% of the activity of unmodified subtilisin, measured on the casein substrate, respectively. Immobilization of the conjugates is performed by adding a solution of the conjugate in saline to a network of PSBMA. The modified subtilisin is immobilized on the surface of the PSBMA hydrogel by zwitterionic clusters formed between the network and the PSBMA enzyme graft.

Тъй като превръзките се прилагат непосредствено върху раната и имат директен контакт с клетките, както на здравите, така и на наранените тъкани, установената липса на цитотоксичност на полицвитерйонните хидрогелове е от съществено значение за ефективността на превръзките. Установено е, че жизнеспособността на миши ембрионални фибробласти (клетъчна линия L929) инкубирани с ПСБМА е равна и по-висока от тази на контролата. Липсата на цитотоксичност е доказана и от тестове с човешки фибробласти, като е доказана преживяемост на клетките около 80% при инкубирането им с ПСБМА и 80-90% при инкубирането им с ПКБМА.Because dressings are applied directly to the wound and have direct contact with the cells of both healthy and injured tissues, the established lack of cytotoxicity of polyviterione hydrogels is essential for the effectiveness of dressings. The viability of murine embryonic fibroblasts (L929 cell line) incubated with PSBMA was found to be equal to and higher than that of the control. The lack of cytotoxicity has also been demonstrated by human fibroblast tests, with cell survival of about 80% when incubated with PSBMA and 80-90% when incubated with PCBMA.

Микроскопско изследване установява, че посяти клетки от миши фибробласти клетъчна линия L929 имат ниска биоадхезия към хидрогела от ПСБМА, което обуславя слабото им прилепване и лесно отмиване от повърхността на хидрогела. При това, те не променят формата си и остават кръгли, за разлика от същите клетки, посяти върху дъното на ямки в 48-ямкова плака, които адхезират и променят формата си на типичната за адхезирали фибробласти вретеновидна форма. Това е важно свойство, което е от значение за по-лесното отстраняване на превръзката, когато се налага тя да бъде сменена или когато не е необходима повече за третиране на раната.Microscopic examination revealed that seeded cells from murine fibroblasts of the L929 cell line had low bioadhesion to the PSBMA hydrogel, which led to their poor adhesion and easy leaching from the hydrogel surface. However, they do not change their shape and remain round, unlike the same cells seeded at the bottom of the wells in a 48-well plate, which adhere and change their shape to the typical spindle-shaped fibroblasts. This is an important feature that is important for easier removal of the dressing when it needs to be replaced or when it is no longer needed to treat the wound.

В резултат на направените анализи е установено, че разработените полицвитерйонни хидрогелове с имобилизиран субтилизин, притежават характеристики, които ги правят подходящи материали за превръзки за рани, които се отличават със способността да попиват ексудата на раните, като същевременно се осъществява ензимно разграждане на некротичната тъкан и предпазване на раната от инфекции, т. е. превръзки със значително ускорен и високо ефективен лечебен ефект.As a result of the analyzes, it was found that the developed polyviterion hydrogels with immobilized subtilisin have characteristics that make them suitable materials for wound dressings, which are characterized by the ability to absorb wound exudate, while enzymatic degradation of necrotic tissue and protection of the wound from infections, ie dressings with significantly accelerated and highly effective healing effect.

Пояснение на приложените фигуриExplanation of the attached figures

Фигурите от 1 до 6 показват схематично структурата и вида на компонентите, изграждащи полицвитерйонните хидрогеловеFigures 1 to 6 show schematically the structure and type of components that make up the polyviterion hydrogels.

Фигура 1. Еднослоен хидрогел от омрежен ПКБМАFigure 1. Single layer hydrogel from crosslinked PCBMA

Където:Where:

- Позиция 1: Верига от ПКБМА- Position 1: PCBMA chain

- Позиция 2: Омрежващ сегмент от ПЕГДА- Position 2: PEGDA cross-linking segment

Фигура 2. Еднослоен хидрогел от омрежен ПСБМА, съдържащ Субтилизин в порите на хидрогелаFigure 2. Single layer hydrogel of crosslinked PSBMA containing Subtilisin in the pores of the hydrogel

Където:Where:

- Позиция 2: Омрежващ сегмент от ПЕГДА- Position 2: PEGDA cross-linking segment

- Позиция 3: Верига от ПСБМА- Position 3: PSBMA chain

- Позиция 4: Субтилизин- Position 4: Subtilisin

Фигура 3. Еднослоен хидрогел от омрежен ПКБМА, съдържащ Субтилизин в порите на хидрогелаFigure 3. Single layer hydrogel of crosslinked PCBMA containing Subtilisin in the pores of the hydrogel

Където:Where:

- Позиция 1: Верига от ПКБМА- Position 1: PCBMA chain

- Позиция 2: Омрежващ сегмент от ПЕГДА- Position 2: PEGDA cross-linking segment

- Позиция 4: Субтилизин- Position 4: Subtilisin

Фигура 4. Еднослоен хидрогел от омрежен ПСБМА с повърхностно имобилизиран Субтилизин с присаден ПСБМАFigure 4. Single layer hydrogel of crosslinked PSBMA with surface immobilized Subtilisin with grafted PSBMA

Където:Where:

- Позиция 2: Омрежващ сегмент от ПЕГДА- Position 2: PEGDA cross-linking segment

- Позиция 3: Верига от ПСБМА- Position 3: PSBMA chain

- Позиция 5: Имобилизиран към повърхността Субтилизин с присадена ПСБМА верига- Heading 5: Immobilized to the surface Subtilisin with grafted PSBMA chain

Фигура 5. Двуслоен хидрогел отхитозанов слой и полицвитерйонен слойFigure 5. Two-layer hydrogel otchitosan layer and polyviterion layer

Където:Where:

- Позиция 6: Хитозанов слой- Position 6: Chitosan layer

- Позиция 7: Полицвитерйонен хидрогел, съдържащ Субтилизин в порите на хидрогела- Heading 7: Polyviterion hydrogel containing subtilisin in hydrogel pores

Фигура 6. Двуслоен хидрогел от хитозанов слой и слой от полицвитерйонен хидрогел от ПСБМА с повърхностно имобилизиран Субтилизин с присаден ПСБМАFigure 6. Two-layer hydrogel of chitosan layer and layer of polyviterione hydrogel of PSBMA with surface immobilized Subtilisin with grafted PSBMA

Където:Where:

- Позиция 2: Омрежващ сегмент от ПЕГДА- Position 2: PEGDA cross-linking segment

- Позиция 3: Верига от ПСБМА- Position 3: PSBMA chain

- Позиция 5: Имобилизиран към повърхността Субтилизин с присадена ПСБМА верига- Heading 5: Immobilized to the surface Subtilisin with grafted PSBMA chain

Позиция 6: Хитозанов слойPosition 6: Chitosan layer

Фигура 7. Светлинна микроскопия на миши ембрионални фибробласти (клетъчна линия L929), инкубирани на дъното на 48-ямкова плака за 72 h (Microscope Olympus СК40, CAM 2800-ХР), ляв образ увеличение 20 пъти (20х) и десен образ увеличение 40 пъти (40х).Figure 7. Light microscopy of murine embryonic fibroblasts (L929 cell line) incubated at the bottom of a 48-well plate for 72 h (Microscope Olympus SK40, CAM 2800-XP), left image magnification 20 times (20x) and right image magnification 40 times (40x).

Фигура 8. Светлинна микроскопия на миши ембрионални фибробласти (клетъчна линия L929), инкубирани на ПСБМА хидрогел омрежен с 0.2 тегл. % ПЕГДА (А) и ПСБМА хидрогел омрежен с 1 тегл. % ПЕГДА (Б) (Microscope Olympus СК40, САМ 2800-ХР, 20х).Figure 8. Light microscopy of murine embryonic fibroblasts (L929 cell line) incubated on a 0.2 wt PSBMA hydrogel crosslinked. % PEGDA (A) and PSBMA hydrogel crosslinked with 1 wt. % PEGDA (B) (Microscope Olympus SK40, SAM 2800-XP, 20x).

Примери за изпълнение на изобретениетоExamples of the invention

Представените примери не изчерпват възможните примерни изпълнения.The presented examples do not exhaust the possible exemplary embodiments.

Пример 1Example 1

Полицвитерйонен хидрогел от омрежен ПСБМАPolysviterion hydrogel from crosslinked PSBMA

Поли (сулфобетаин метакрилат) (ПСБМА), омрежен с полиетиленгликол диакрилат (ПЕГДА) с молекулна маса 575 g/mol и съдържание на омрежващите сегменти от ПЕГДА 2 тегл. %, със съдържание на вода в хидрогела 52 тегл. %.Poly (sulfobetaine methacrylate) (PSBMA), crosslinked with polyethylene glycol diacrylate (PEGDA) with a molecular weight of 575 g / mol and a content of crosslinking segments of PEGDA 2 wt. %, with a water content in the hydrogel of 52 wt. %.

Пример 2Example 2

Полицвитерйонен хидрогел от омрежен ПКБМАPolysviterion hydrogel from cross-linked PCBMA

Поли (карбоксибетаин метакрилат) (ПКБМА), омрежен с полиетиленгликол диакрилат (ПЕГДА) с молекулна маса 575 g/mol и съдържание на омрежващите сегменти от ПЕГДА 15 тегл. % със съдържание на вода в хидрогела 84 тегл. %.Poly (carboxybetaine methacrylate) (PCBMA), crosslinked with polyethylene glycol diacrylate (PEGDA) with a molecular weight of 575 g / mol and a content of crosslinking segments of PEGDA 15 wt. % with water content in the hydrogel 84 wt. %.

Пример 3Example 3

Полицвитерйонен хидрогел от омрежен ПСБМА, съдържащ субтилизин.Polysviterionic crosslinked PSBMA hydrogel containing subtilisin.

Поли (сулфобетаин метакрилат) (ПСБМА), омрежен с полиетиленгликол диакрилат (ПЕГДА) с молекулна маса 575 g/mol и съдържание на омрежващите сегменти от ПЕГДА 2 тегл. %, вода в хидрогела 52 тегл. % и съдържание на имобилизирана протеаза Субтилизин 66 mg/g отнесени спрямо теглото на сухата мрежа.Poly (sulfobetaine methacrylate) (PSBMA), crosslinked with polyethylene glycol diacrylate (PEGDA) with a molecular weight of 575 g / mol and a content of crosslinking segments of PEGDA 2 wt. %, water in the hydrogel 52 wt. % and content of immobilized protease Subtilisin 66 mg / g relative to dry weight.

Пример 4Example 4

Полицвитерйонен хидрогел от омрежен ПКБМА, съдържащ субтилизин.Polysviterionic hydrogel of crosslinked PCBMA containing subtilisin.

Поли (карбоксибетаин метакрилат) (ПКБМА), омрежен с полиетиленгликол диакрилат (ПЕГДА) с молекулна маса 575 g/mol и съдържание на омрежващите сегменти от ПЕГДА 15 тегл. %, вода в хидрогела 84 тегл. % и съдържание на имобилизирана протеаза Субтилизин 104 mg/g отнесени спрямо теглото на сухата мрежа.Poly (carboxybetaine methacrylate) (PCBMA), crosslinked with polyethylene glycol diacrylate (PEGDA) with a molecular weight of 575 g / mol and a content of crosslinking segments of PEGDA 15 wt. %, water in the hydrogel 84 wt. % and content of immobilized protease Subtilisin 104 mg / g relative to dry weight.

Пример 5Example 5

Полицвитерйонен хидрогел от омрежен ПСБМА, съдържащ модифициран субтилизин на повърхността на хидрогелаPolysviterionic crosslinked PSBMA hydrogel containing modified subtilisin on the surface of the hydrogel

Поли (сулфобетаин метакрилат) (ПСБМА), омрежен с полиетиленгликол диакрилат (ПЕГДА) с молекулна маса 575 g/mol и съдържание на омрежващите сегменти от ПЕГДА 3 тегл. %, вода в хидрогела 55 тегл. % и съдържание на имобилизиран на повърхността на хидрогела Субтилизин 0.8 mg/cm², който е модифициран с присадени вериги от ПСБМА с молекулна маса от 10 500 g/mol.Poly (sulfobetaine methacrylate) (PSBMA), crosslinked with polyethylene glycol diacrylate (PEGDA) with a molecular weight of 575 g / mol and a content of crosslinking segments of PEGDA 3 wt. %, water in the hydrogel 55 wt. % and content of immobilized on the surface of the hydrogel Subtilisin 0.8 mg / cm ² , which is modified with grafted chains of PSBMA with a molecular weight of 10 500 g / mol.

Пример 6Example 6

Полицвитерйонен двуслоен хидрогел от омрежен ПСБМА и хитозан, съдържащ субтилизин.Polysviterionic bilayer hydrogel of crosslinked PSBMA and chitosan containing subtilisin.

Двуслойният хидрогел е изграден от горен слой, който не е в контакт с раната и долен слой, предназначен да е в контакт с наранената тъкан. Горният слой е от неомрежен или омрежен хитозан и поли (етилен оксид) (ПЕО) в тегловно съотношение хитозан: ПЕО = 9:1. Долният слой е полицвитерйонен хидрогел от ПСБМА омрежен с ПЕГДА с молекулна маса 575 g/mol и съдържание на омрежващите сегменти 2 тегл. %. Долният слой съдържа включена протеаза Субтилизин 66 mg/g отнесени спрямо теглото на сухата мрежа от ПСБМА. Общо съдържание на вода в хидрогела 52 тегл. %. Двата слоя са в тегловни съотношения горен : долен слой от 15:85.The bilayer hydrogel is composed of an upper layer that is not in contact with the wound and a lower layer designed to be in contact with the injured tissue. The upper layer is of non-crosslinked or crosslinked chitosan and poly (ethylene oxide) (PEO) in a weight ratio of chitosan: PEO = 9: 1. The lower layer is a polysviterion hydrogel of PSBMA crosslinked with PEGDA with a molecular weight of 575 g / mol and a content of crosslinking segments of 2 wt. %. The lower layer contains included protease Subtilisin 66 mg / g relative to the dry weight of PSBMA. Total water content in the hydrogel 52 wt. %. The two layers have an upper: lower layer weight ratio of 15:85.

Пример 7Example 7

Полицвитерйонен двуслоен хидрогел от омрежен ПКБМА и хитозан, съдържащ субтилизин.Polyviterionic bilayer hydrogel of cross-linked PCBMA and chitosan containing subtilisin.

Двуслойният хидрогел е изграден от горен слой, който не е в контакт с раната и долен слой, предназначен да е в контакт с наранената тъкан. Горният слой е от неомрежен или омрежен хитозан и поли (етилен оксид) (ПЕО) в тегловно отношение хитозан: ПЕО=9:1. Долният слой е полицвитерйонен хидрогел от ПКБМА омрежен с ПЕГДА с молекулна маса 575 g/mol и съдържание на омрежващите сегменти 15 тегл. %. Долният слой съдържа включена протеаза Субтилизин 104 mg/g отнесени спрямо теглото на сухата мрежа от ПКБМА. Общо съдържание на вода в хидрогела 83 тегл. %. Двата слоя са в тегловни отношения горен: ПЦЙ слой от 15:85.The bilayer hydrogel is composed of an upper layer that is not in contact with the wound and a lower layer designed to be in contact with the injured tissue. The upper layer is of non-crosslinked or crosslinked chitosan and poly (ethylene oxide) (PEO) by weight chitosan: PEO = 9: 1. The lower layer is a polyviterione hydrogel of PKBMA crosslinked with PEGDA with a molecular weight of 575 g / mol and a content of crosslinking segments of 15 wt. %. The lower layer contains the included protease Subtilisin 104 mg / g relative to the weight of the dry network of PCBMA. Total water content in the hydrogel 83 wt. %. The two layers are in the upper weight ratio: PCJ layer of 15:85.

Пример 8Example 8

Полицвитерйонен двуслоен хидрогел от омрежен ПСБМА и хитозан, съдържащ модифициран субтилизин на повърхността на долния цвитерйионен слой.Polyviterionic bilayer hydrogel of crosslinked PSBMA and chitosan containing modified subtilisin on the surface of the lower zwitterionic layer.

Двуслойният хидрогел е изграден от горен слой, който не е в контакт с раната и долен слой, предназначен да е в контакт с наранената тъкан. Горният слой е от неомрежен или омрежен хитозан и поли (етилен оксид) (ПЕО) в тегловно отношение хитозан: ПЕО = 9:1.The bilayer hydrogel is composed of an upper layer that is not in contact with the wound and a lower layer designed to be in contact with the injured tissue. The upper layer is of non-crosslinked or crosslinked chitosan and poly (ethylene oxide) (PEO) by weight chitosan: PEO = 9: 1.

Долният слой е полицвитерйонен хидрогел от ПСБМА омрежен с ПЕГДА с молекулна маса 575 g/mol и съдържание на омрежващите сегменти 3 тегл. %. На повърхността на долния слой, която не граничи с хитозановия слой, е имобилизирана протеаза Субтилизин с присадени вериги от ПСБМА с молекулна маса от 10 500 g/mol. Съдържание на имобилизирания субтилизин е 0.8 mg/cm². Общо съдържание на вода в хидрогела 52 тегл. %. Двата слоя са в тегловни отношения горен : долен слой от 15:85.The lower layer is a polysviterion hydrogel of PSBMA crosslinked with PEGDA with a molecular weight of 575 g / mol and a content of crosslinking segments of 3 wt. %. On the surface of the lower layer, which does not border the chitosan layer, is immobilized protease Subtilisin with grafted chains of PSBMA with a molecular weight of 10,500 g / mol. The content of immobilized subtilisin is 0.8 mg / cm ² . Total water content in the hydrogel 52 wt. %. The two layers have an upper: lower layer weight ratio of 15:85.

Пример 9Example 9

Получаване на хидрогел от ПСБМАPreparation of hydrogel from PSBMA

[2-(Метакрилоилокси)етил]-диметил(3-сулфопропил) амониев хидроксид (от групата на сулфобетаините, СБМА) се разтваря в дестилирана вода за получаване на 1М разтвор, към който се добавя и ПЕГДА (1 mol % по отношение на мономера СБМА). Полимеризацията на омрежване се инициира с калиев персулфат (K2S2Os, 0.1 mol. %) и се провежда при 60°С в продължение на 6 h. Получената мрежа се потапя в голям обем на дестилирана вода за 2 седмици и водата се сменя ежедневно, за да се отстранят нереагиралите мономер и[2- (Methacryloyloxy) ethyl] -dimethyl (3-sulfopropyl) ammonium hydroxide (sulfobetaine group, SBMA) was dissolved in distilled water to give a 1M solution, to which was added PEGDA (1 mol% monomer). SBMA). Crosslinking polymerization was initiated with potassium persulfate (K 2 S 2 O 5, 0.1 mol.%) And carried out at 60 ° C for 6 h. The resulting mesh is immersed in a large volume of distilled water for 2 weeks and the water is changed daily to remove unreacted monomer and

ПЕГДА. Промивните води се проверяват с UV спектроскопия, за да се гарантира, че мрежата е пречистена. Сухата мрежа се поставя във вода до равновесно набъбване. По този начин се получава мрежа за полицвитерйонен хидрогел със състав разкрит в Пример 1.PEGDA. The wash water is checked by UV spectroscopy to ensure that the network is purified. The dry mesh is placed in water until equilibrium swelling. In this way, a polyviterione hydrogel network with the composition disclosed in Example 1 was obtained.

Пример 10Example 10

Получаване на хидрогел от ПКБМА.Preparation of hydrogel from PCBMA.

Мономерът карбоксибетаин метакрилат (КБМА) се разтваря в смесен разтворител от етилен гликол/етанол/вода (в обемни отнощения 3: 1: 1) за получаване на разтвор с концентрация 1М. Добавя се ПЕГДА 6 mol % по отношение на мономера СБМА. Полимеризацията се инициира от смесен инициатор, състоящ се от 0.664 mol % натриев метабисулфит (Na₂S₂O₅) и 1.445 mol % амониев персулфат, (NH4)₂S₂O₈ и се провежда при 60°С за 15 h. След това мрежата се потапя в голям обем на дестилирана вода за 2 седмици и водата се сменя ежедневно, за да се отстранят остатъците от нереагиралите мономер и омрежващ агент. Промивните води се проверяват с UV спектрометър, за да се гарантира, че мрежата е пречистена. Сухата мрежа се поставя във вода до равновесно набъбване. По този начин се получава полицвитерйонен хидрогел със състав разкрит в Пример 2.The carboxybetaine methacrylate (KBMA) monomer was dissolved in a mixed solvent of ethylene glycol / ethanol / water (3: 1: 1 by volume) to give a 1M solution. PEGDA 6 mol% relative to SBMA monomer was added. The polymerization was initiated by a mixed initiator consisting of 0.664 mol% sodium metabisulfite (Na ₂ S ₂ O ₅ ) and 1,445 mol% ammonium persulfate, (NH4) ₂ S ₂ O ₈ and carried out at 60 ° C for 15 h. The mesh is then immersed in a large volume of distilled water for 2 weeks and the water is changed daily to remove residual unreacted monomer and crosslinking agent. The wash water is checked with a UV spectrometer to ensure that the network is purified. The dry mesh is placed in water until equilibrium swelling. Thus, a polyviterion hydrogel with the composition disclosed in Example 2 was obtained.

Пример 11Example 11

Синтез на конюгат субтилизин-ПСБМА.Synthesis of subtilisin-PSBMA conjugate.

Субтилизин и ПСБМА-1 или ПСБМА-2 в тегловно отношение 1:2 се разтварят в глицерин и се разбъркват в продължение на 2 дни при стайна температура. След това разтворът се диализира срещу физиологичен разтвор за отстраняване на нереагиралия полимер.Subtilisin and PSBMA-1 or PSBMA-2 in a weight ratio of 1: 2 were dissolved in glycerol and stirred for 2 days at room temperature. The solution is then dialyzed against saline to remove unreacted polymer.

Пример 12Example 12

Определяне на равновесна степен на набъбване.Determination of equilibrium degree of swelling.

Равновесната степен на набъбване (EDS) на мрежите от полицвитерйони е определена гравиметрично. За тази цел, дискове с дефиниран размер от сухи полимерни мрежи се претеглят (Wo) и след това се потапят в дестилирана вода при температура 20°С, Теглото на набъбналите дисковете се измерва в продължение на няколко дни до достигане на равновесна постоянна стойност (We). За определяне на равновесната степен на набъбване по уравнение (1) се използват стойностите за Wo и We за най-малко три диска от всяка проба и се осредняват.The equilibrium swelling (EDS) of polyviterion networks is determined gravimetrically. For this purpose, disks with a defined size of dry polymer nets are weighed (Wo) and then immersed in distilled water at a temperature of 20 ° C. The weight of the swollen disks is measured for several days until an equilibrium constant value is reached (We ). To determine the equilibrium degree of swelling according to equation (1), the values of Wo and We for at least three disks of each sample are used and averaged.

EDS = [(We-Wo)/Wo] x 100 (1)EDS = [We-Wo / Wo] x 100 (1)

Пример 13Example 13

Имобилизиране на субтилизин в хидрогела.Immobilization of subtilisin in the hydrogel.

Дискообразни образци с определен размер от двете мрежи ПСБМА или ПКБМА се инкубират в разтвор на ензима с концентрация 0.813 mg /ml при 4°С. Абсорбцията на ензимния разтвор, в който се извършва натоварването, се измерва на 24-ия, 48-ия и 66-ия час след потапянето на полимерните проби. Ефективността на ензимното натоварване (ЕЕН) за всеки цвитерйонен хидрогел се изчислява по формулата:Disc specimens of a certain size from both PSBMA or PCBMA networks were incubated in the enzyme solution at a concentration of 0.813 mg / ml at 4 ° C. The absorption of the enzyme solution in which the loading is performed is measured on the 24th, 48th and 66th hour after immersion of the polymer samples. The enzyme loading efficiency (SES) for each zwitterionic hydrogel is calculated by the formula:

ЕЕН = [(mo - mt) / mo] * 100 (2) където m0 е количеството на ензима в изходния разтвор и mt е количеството на ензима в разтвора след време t от потапянето на мрежата в разтвора.SES = (mo - mt) / mo] * 100 (2) where m0 is the amount of enzyme in the stock solution and mt is the amount of enzyme in the solution after time t from immersion of the network in the solution.

Пример 14Example 14

Абсорбция на колагеназа от ПКБМА хидрогелове.Absorption of collagenase by PCBMA hydrogels.

Суха полицвитерйонна мрежа ПКБМА (30 mg) се потапя в 600 pL разтвор на колагеназа (1 mg/mL) във фосфатен буфер с pH 7.4 при 37°С в продължение на 72 h. След това, 30 pL от инкубирания разтвор се смесват с 270 pL Comassie Brilliant Blue G (комплект Bradford®). Сместа се оставя при стайна температура за 5 min и след това се измерва абсорбцията на разтвора при 595 nm. За всяка проба се провеждат три независими измервания и резултатите се осредняват. Количеството на колагеназата в разтвора преди и след инкубиране с ПКБМА хидрогела се получава чрез използване на калибрационна крива, получена с говежди серумен албумин с уравнение Y = 0,637х - 0.078 (R = 0.9987). След това се изчислява процента на абсорбираната колагеназа (ЕА) от ПКБМА мрежата, като се използва уравнението:Dry polyviterite mesh PCBMA (30 mg) was immersed in 600 pL of collagenase solution (1 mg / mL) in phosphate buffer pH 7.4 at 37 ° C for 72 h. Then, 30 pL of the incubated solution was mixed with 270 pL of Comassie Brilliant Blue G (Bradford® kit). The mixture was left at room temperature for 5 minutes and then the absorbance of the solution was measured at 595 nm. Three independent measurements were performed for each sample and the results were averaged. The amount of collagenase in the solution before and after incubation with PCBMA hydrogel was obtained using a calibration curve obtained from bovine serum albumin with the equation Y = 0.637x - 0.078 (R = 0.9987). The percentage of absorbed collagenase (EA) from the PCBMA network is then calculated using the equation:

ЕА = ((mo - mt) / mo) * 100 където mo е концентрацията на колагеназата в изходния разтвор (1 mg/mL), a mt е остатъчната концентрация на ензима, измерена след 72 h инкубация с хидрогела. В зависимост от степента на омрежване, ПКБМА хидрогеловете абсорбират между 30 и 40% от колагеназата в изходния разтвор. Тези стойности демонстрират потенциала на ПКБМА хидрогеловете физически да отстраняват от хроничните рани колагеназата - един от ензимите, които са с прекалено висока концентрация в хроничните рани.EA = ((mo - mt) / mo) * 100 where mo is the collagenase concentration in the stock solution (1 mg / mL) and mt is the residual enzyme concentration measured after 72 hours of hydrogel incubation. Depending on the degree of crosslinking, PCBMA hydrogels absorb between 30 and 40% of the collagenase in the stock solution. These values demonstrate the potential of PCBMA hydrogels to physically remove collagenase from chronic wounds, one of the enzymes that is too high in chronic wounds.

Аналогични резултати са получени след провеждане на същия експеримент с хидрогелове на ПСБМА, като те проявяват способност да абсорбират отново от 30 до 40% от колагеназата в изходния разтвор. Тези стойности демонстрират потенциала на ПСБМА хидрогеловете физически да отстраняват колагеназа от хроничните рани.Similar results were obtained after conducting the same experiment with PSBMA hydrogels, which showed the ability to reabsorb 30 to 40% of the collagenase in the stock solution. These values demonstrate the potential of PSBMA hydrogels to physically remove collagenase from chronic wounds.

Пример 15Example 15

In vitro определяне на способността на ПКБМА хидрогелове да инхибират активността на колагеназа.In vitro determination of the ability of PCBMA hydrogels to inhibit collagenase activity.

С флуоресцентен анализ е определена инхибиращата активност на ПКБМА хидрогеловете спрямо колагеназа, използвайки EnzCheck ™ желатиназа/колагеназен комплект. Сухи мрежи от ПКБМА (30 mg) се инкубират в 600 pl 32 U/ml разтвор на колагеназа при 37°С. След 24 h, 100 pL от колагеназния разтвор се смесват с 80 pL фосфатен буфер. Анализът на активността на колагеназата се инициира чрез добавяне на 20 pL от желатинов субстрат (250 pg/mL) и последващо измерване на флуоресценцията на получения разтвор при 528 nm. Всички измервания се извършват трикратно. Резултатите се изразяват, като процент от остатъчната активност на колагеназата, инкубирана с ПКБМА хидрогел в сравнение с контролен разтвор на колагеназа, която не е била инкубирана с ПСБМА хидрогел. Резултатите показват, че колагеназата запазва 70% от своята активност след инкубиране с ПКБМА хидрогелове. Този резултат показва, че полицвитерйонният хидрогел не инхибира активността на колагеназата, което е от полза за заздравяването на хронични рани, в които колагеназата е неотменна част от процеса на ремоделиране.The inhibitory activity of PCBMA hydrogels against collagenase was determined by fluorescence analysis using EnzCheck ™ gelatinase / collagenase kit. Dry webs of PCBMA (30 mg) were incubated in 600 μl of 32 U / ml collagenase solution at 37 ° C. After 24 h, 100 pL of collagenase solution was mixed with 80 pL of phosphate buffer. Collagenase activity assay was initiated by the addition of 20 μL of gelatin substrate (250 pg / mL) and subsequent measurement of the fluorescence of the resulting solution at 528 nm. All measurements are performed three times. The results are expressed as a percentage of the residual activity of collagenase incubated with PCBMA hydrogel compared to a control solution of collagenase that was not incubated with PSBMA hydrogel. The results show that collagenase retains 70% of its activity after incubation with PCBMA hydrogels. This result shows that the polysviterion hydrogel does not inhibit collagenase activity, which is beneficial for the healing of chronic wounds in which collagenase is an integral part of the remodeling process.

Аналогични резултати са получени след провеждане на същия експеримент с хидрогелове на ПСБМА, като колагеназата запазва почти 100% от своята активност след инкубиране с ПСБМА хидрогелове. Тези стойности демонстрират потенциала на ПСБМА хидрогеловете физически да отстраняват колагеназа от хроничните рани без да променят нейната ензимна активност, която е необходима в процеса на зарастване на раните.Similar results were obtained after conducting the same experiment with PSBMA hydrogels, with collagenase retaining almost 100% of its activity after incubation with PSBMA hydrogels. These values demonstrate the potential of PSBMA hydrogels to physically remove collagenase from chronic wounds without altering its enzymatic activity, which is required in the wound healing process.

Пример 16Example 16

Ех vivo определяне на способността на ПКБМА хидрогелове да инхибират активността на колагеназа в раневи ексудати.Ex vivo determination of the ability of PCBMA hydrogels to inhibit collagenase activity in wound exudates.

Ранният ексудат се извлича от UrgoClean превръзка на пациент с хронична рана на крака. За тази цел 1 g проба от превръзката се потапя в 5 mL дестилирана вода в продължение на 15 min. След това превръзката се отстранява и сместа се разбърква за 2 min и се центрофугира за 5 min при 10 000 rpm. Утайката се изважда и течността се центрофугира отново при същите условия. Екстрахираният ексудат се съхранява при 4°С, докато се използва за самото определяне.Early exudate is extracted from a UrgoClean dressing of a patient with a chronic leg wound. For this purpose, 1 g of the dressing sample is immersed in 5 mL of distilled water for 15 minutes. The dressing was then removed and the mixture was stirred for 2 minutes and centrifuged for 5 minutes at 10,000 rpm. The precipitate is removed and the liquid is centrifuged again under the same conditions. The extracted exudate was stored at 4 ° C while used for the determination.

Ефективността на инхибирането на колагеназа в реалния раневи ексудат от ПКБМА хидрогелове е тествана с раневи ексудат разреден 8 пъти. Сухи ПКБМА мрежи с форма на диск (30 mg) се инкубират в 600 pL ексудат при 37°С в продължение на 24 h. След това 100 pL от инкубирания разтвор се смесват с 80 pL фосфатен буфер с pH 6.5. Проба раневи ексудат, без добавян в нея ПКБМА хидрогел, се използва като контрола. Остатъчната активност на колагеназата се определя след добавяне на 20 pL от желатинов субстрат (250 pg/mL) и проследяване на флуоресценцията вследствие протичането на реакцията при 493/528 nm. Всички измервания се извършват трикратно.The effectiveness of collagenase inhibition in real wound exudate by PCBMA hydrogels was tested with wound exudate diluted 8 times. Dry disk-shaped PCBMA nets (30 mg) were incubated in 600 μL of exudate at 37 ° C for 24 h. Then 100 μL of the incubated solution was mixed with 80 μL of phosphate buffer pH 6.5. A sample of wound exudate, without added PCBMA hydrogel, was used as a control. Residual collagenase activity was determined after adding 20 μL of gelatin substrate (250 pg / mL) and monitoring the fluorescence due to the reaction at 493/528 nm. All measurements are performed three times.

Резултатите напълно съвпадат с резултатите от in vitro експеримента, описан в пример 14, като показват, че колагеназата от раневия ексудат запазва 70% от своята активност след инкубиране с ПКБМА хидрогелове, което е от полза за заздравяването на хроничните рани, в които колагеназата е неотменна част от процеса на ремоделиране.The results are in complete agreement with the results of the in vitro experiment described in Example 14, showing that wound exudate collagenase retains 70% of its activity after incubation with PCBMA hydrogels, which is beneficial for the healing of chronic wounds in which collagenase is irreversible. part of the remodeling process.

Резултатите от ех vivo определянето на способността на ПСБМА хидрогелове да инхибират активността на колагеназа в раневи ексудати отново съвпадат с резултатите получени от in vitro тестовете, т. е. колагеназата от раневия ексудат запазва почти на 100% своята активност след инкубиране с ПСБМА хидрогел.The results of the ex vivo determination of the ability of PSBMA hydrogels to inhibit collagenase activity in wound exudates again coincide with the results obtained from in vitro tests, ie collagenase from wound exudate retains almost 100% of its activity after incubation with PSBMA hydrogel.

Пример 17Example 17

Оценка на цитотоксичността на хидрогелове от ПКБМА.Assessment of cytotoxicity of PCBMA hydrogels.

За оценка на цитотоксичността на ПКБМА хидрогелове се използват човешки фибробласти. Клетъчните култури са поддържани при 37°С под 5% СО2 атмосфера в DMEM (Dulbecco's Modified Eaglе Medium) среда. Културалната среда се сменя всеки ден. Клетките се събират, като се използва разтвор на трипсин-ЕДТА, засяват се при плътност 2х10⁴ клетки/ямка в стерилна 24-ямкова полистиренова плоча. 24 h по-късно ПКБМА хидрогелове (30 mg) и силиконова проба (положителна контрола) се инкубират заедно с клетките и се оставят за още 24 h при 37°С под 5% СО₂ атмосфера. След това клетките се промиват двукратно с фосфатен буфер и се смесват с 500 pl 10% (v / v) AlamarBlue реагент в DMEM. Получените разтвори се оставят при 37°С в продължение на 4 h. Накрая се измерва тяхната абсорбция при 570 nm. Относителната жизнеспособност на клетките BJ5ta (%) се определя след инкубиране с ПКБМА хидрогел, в сравнение с жизнеспособността на клетката, когато се инкубира с контролата силикон и DMEM. Всички резултати се отчитат, като средни стойности на три независими измервания.Human fibroblasts are used to assess the cytotoxicity of PCBMA hydrogels. Cell cultures were maintained at 37 ° C below 5% CO2 atmosphere in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) medium. The cultural environment changes every day. Cells were harvested using trypsin-EDTA solution, seeded at 2x10 ⁴ cells / well in a sterile 24-well polystyrene plate. 24 h later PCBMA hydrogels (30 mg) and silicone sample (positive control) were incubated with the cells and left for an additional 24 h at 37 ° C under 5% CO ₂ atmosphere. The cells were then washed twice with phosphate buffer and mixed with 500 μl of 10% (v / v) AlamarBlue reagent in DMEM. The resulting solutions were left at 37 ° C for 4 hours. Finally, their absorbance at 570 nm was measured. The relative viability of BJ5ta cells (%) was determined after incubation with PCBMA hydrogel, compared to cell viability when incubated with the control silicone and DMEM. All results are reported as averages of three independent measurements.

Резултатите показват, че между 80 и 90% от фибробластните клетки преживяват след инкубация с ПКБМА хидрогелове, т. е. последните не са цитотоксични.The results show that between 80 and 90% of fibroblast cells survive incubation with PCBMA hydrogels, ie the latter are not cytotoxic.

Аналогични тестове с ПСБМА хидрогелове показват, че преживяемостта на човешки фибробласти след инкубация с ПСБМА хидрогелове е между 70 и 90% в зависимост от степента на омрежване на ПСБМА хидрогела. Така отново, ПСБМА се класифицират като не-цитотксични материали.Similar tests with PSBMA hydrogels show that the survival of human fibroblasts after incubation with PSBMA hydrogels is between 70 and 90% depending on the degree of crosslinking of PSBMA hydrogel. Thus, again, PSBMAs are classified as non-cytotoxic materials.

Пример 18Example 18

Определяне на цитотоксичността на ПСБМА хидрогелове с миши фибробласти. Ефектът на ПСБМА хидрогелове върху клетъчната жизнеспособност и пролиферация се изследва и чрез МТТ тест (тиазолил синьо тетразолиев бромид). За тази цел, като моделни системи са използвани миши ембрионални фибробласти (постоянни клетъчни линии BALB/ с 3Т3 и L929). Клетките се отглеждат като монослойни култури в DMEM среда, допълнена съответно с 10% фетален говежди серум, 100 U/mL пеницилин и 100 pg/mL стрептомицин при 37°С във влажен СО2 инкубатор. Клетките се отделят, като се използва смес от 0.05% трипсин и 0.02% EDTA.Determination of cytotoxicity of PSBMA hydrogels with mouse fibroblasts. The effect of PSBMA hydrogels on cell viability and proliferation was also investigated by the MTT test (thiazolyl blue tetrazolium bromide). For this purpose, mouse embryonic fibroblasts (BALB / 3T3 and L929 constant cell lines) were used as model systems. Cells were grown as monolayer cultures in DMEM medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 100 U / mL penicillin and 100 pg / mL streptomycin at 37 ° C in a humidified CO2 incubator, respectively. Cells were isolated using a mixture of 0.05% trypsin and 0.02% EDTA.

МТТ тестът се провежда, като сухите ПСБМА мрежи първо набъбват в стерилна дестилирана вода в продължение на 48 h и след това се поставят в DMEM среда в продължение на няколко часа. След това те се нарязват на малки еднородни парчета (дискове) и се прехвърлят върху 48-ямкова плака за тъканна култура, където се стерилизират чрез ултравиолетово лъчение за 1 h. Клетъчна суспензия с плътност от 5 х 10³ клетки за mL се добавя към всяка ямка. Хидрогеловете, засяти с клетки, се поддържат при 37°С под 5% СО₂ за 24 и 48 h. След това клетките внимателно се отстраняват чрез промиване няколко пъти с фосфатен буфер (рН = 7.2). Накрая всеки хидрогел е инкубиран с разтвор на тиазолил синьо тетразолиев бромид в DMEM (5 mg в 10 mL DMEM) за 3 h при 37°С под 5% въглероден диоксид и 95% въздух (СО2 инкубатор), последвано от екстракция със смес от абсолютен етанол.The MTT test was performed by first swelling the dry PSBMA nets in sterile distilled water for 48 hours and then placing them in DMEM medium for several hours. They are then cut into small homogeneous pieces (discs) and transferred to a 48-well tissue culture plate, where they are sterilized by ultraviolet radiation for 1 hour. A cell suspension with a density of 5 x 10 ³ cells per mL was added to each well. Cell-seeded hydrogels were maintained at 37 ° C below 5% CO ₂ for 24 and 48 hours. The cells were then carefully removed by washing several times with phosphate buffer (pH = 7.2). Finally, each hydrogel was incubated with a solution of thiazolyl blue tetrazolium bromide in DMEM (5 mg in 10 mL DMEM) for 3 h at 37 ° C below 5% carbon dioxide and 95% air (CO2 incubator), followed by extraction with a mixture of absolute ethanol.

Резултатите показват, че ПСБМА са не-цитотоксични, тъй като преживяемостта на мишите фибробласти е най-малко 100%, а достига и до 120%, което е знак за пролиферация на клетките върху ПСБМА хидрогелове.The results show that PSBMA are non-cytotoxic, as the survival of mouse fibroblasts is at least 100% and up to 120%, which is a sign of cell proliferation on PSBMA hydrogels.

Пример 19Example 19

Оценка на цитопатологичните промени в миши фибробластни клетки, инкубирани с ПСБМА хидрогелове.Evaluation of cytopathological changes in murine fibroblast cells incubated with PSBMA hydrogels.

Два ПСБМА хидрогелове със съдържание на омрежващите ПЕГДА сегменти 0.2 тегл. % и 1.0 тегл. % са инкубирани в среда от клетки върху стерилни покривни плочи в 6-ямкови плаки. Клетки в ямки, несъдържащи ПСБМА хидрогелове служат като контроли. След 24 h и 48 h инкубация, покривните пликове се отстраняват и способността на хидрогеловете да индуцират цитопатологични промени се оценяват с помощта на метод за двойно оцветяване с акридин оранжево (АО) и пропидиев йодид (PI) и метода на Папенхайм (May - Grunwald-Giemsa) съгласно стандартната процедура. Клетките са изследвани с микроскоп Olympus СК40, САМ 2800-ХР.Two PSBMA hydrogels with a content of crosslinking PEGDA segments 0.2 wt. % and 1.0 wt. % were incubated in cell medium on sterile cover plates in 6-well plates. Cells in wells that do not contain PSBMA hydrogels serve as controls. After 24 h and 48 h of incubation, the cover bags were removed and the ability of the hydrogels to induce cytopathological changes was assessed using the double staining method with acridine orange (AO) and propidium iodide (PI) and the Papenheim method (May - Grunwald- Giemsa) according to standard procedure. The cells were examined with an Olympus SC40 microscope, CAM 2800-XP.

Чрез светлинна микроскопия се охарактеризират: (i) миши ембрионални фибробласти (клетъчна линия L929), инкубирани на дъното на 48-ямкова плака (фигура 7) и (ii) L929 клетки, инкубирани върху ПСБМА хидрогелове с различна степен на омрежване (фигура 8).Light microscopy characterized: (i) murine embryonic fibroblasts (L929 cell line) incubated at the base of a 48-well plate (Figure 7) and (ii) L929 cells incubated on PSBMA hydrogels with varying degrees of crosslinking (Figure 8). .

Микроскопските изображения ясно показват способността на клетките да се прилепят върху повърхността на ямките и да образуват монослоеве. Клетките отгледани на дъното на 48-ямковите плаки, имат продълговата форма на вретена, която е характерна за фибробластите и образуват плътни монослоеве поради добрата им адхезия към повърхността на плочата (фигура 7). За разлика от тях, клетките, отгледани върху повърхностите на двата ПСБМА хидрогела (фигура 8), не се разпростират по повърхността им и имат кръгла форма, като образуват по-скоро клъстери, отколкото монослоеве. Склонността на клетките да пролиферират в клъстери означава, че хидрогеловете не провокират клетъчна смърт. От друга страна, не се образуват монослоеве от клетки, което показва по-слаба клетъчна адхезия спрямо хидрогеловете, в сравнение тази към повърхността на плочата. Клетъчният монослой, прикрепен към повърхността на плочата с 48 гнезда, трудно се отстранява - 4-5 min продължително третиране с разтвор, съдържащ EDTA и трипсин, докато клетките прикрепени към повърхността на хидрогеловете, се измиват лесно.Microscopic images clearly show the ability of cells to adhere to the surface of the wells and form monolayers. The cells grown at the bottom of the 48-well plates have the elongated spindle shape that is characteristic of fibroblasts and form dense monolayers due to their good adhesion to the plate surface (Figure 7). In contrast, cells grown on the surfaces of the two PSBMA hydrogels (Figure 8) did not spread on their surface and were round in shape, forming clusters rather than monolayers. The tendency of cells to proliferate in clusters means that hydrogels do not provoke cell death. On the other hand, no monolayers of cells are formed, which shows less cellular adhesion to hydrogels than to the surface of the plate. The cell monolayer attached to the surface of the 48-well plate is difficult to remove - 4-5 minutes of prolonged treatment with a solution containing EDTA and trypsin, while the cells attached to the surface of the hydrogels are easily washed.

Пример 20Example 20

Определяне на ензимната активност на протеазата, натоварена в ПСБМА хидрогелове.Determination of the enzymatic activity of the protease loaded in PSBMA hydrogels.

Определянето се извършва в 0.06 М Tris буфер с pH 7.4. Като субстрат се използва казеинов разтвор, получен при разтваряне на 3 g казеин в 100 ml буфер. Като утаител за прекратяване на ензимната реакция и утаяване на големите казеинови пептиди се използва 0.5М НС1О₄.The determination is performed in 0.06 M Tris buffer with pH 7.4. A casein solution obtained by dissolving 3 g of casein in 100 ml of buffer was used as a substrate. 0.5M HClO ₄ was used as precipitant to stop the enzymatic reaction and precipitate large casein peptides.

За всяко измерване бяха използвани три епруветки. В епруветка 1 се провежда реакцията между ензима (под формата на ликьор, т. е. в чисто състояние или натоварен в ПСБМА хидрогел, пример 1) и субстрата натриев казеинат. В епруветка 2 и епруветка 3 са поставени по 3 ml утаител за да се фиксират началото и края на ензимната реакция. В епруветка 1 се смесват 2.5 ml казеинов разтвор, 1.5 ml Tris буфер и 1 ml ензимен ликьор, съдържащ 45,6 pl от ензима. Това е „контролата, в която се измерва активността на ензима в разтвор. Всички епруветки се потапят във водна баня при 37,5 ± 0,2°С. За да се фиксират началото на ензимната реакция, след първата минута на инкубиране, проба от 2 ml се изтегля от епруветка 1 и се излива в епруветка 2. След 31-та минута на инкубация, втора проба от 2 ml се изважда от епруветка 1 и се излива в епруветка 3. След центрофугиране при 2000 rpm за 10 min супернатантите на тръбите 2 и 3 се измерват при 275 nm. Ензимната активност се изчислява, като се използва следното уравнение:Three tubes were used for each measurement. In test tube 1, the reaction is carried out between the enzyme (in the form of a liqueur, i.e. in pure state or loaded with PSBMA hydrogel, example 1) and the substrate sodium caseinate. 3 ml of precipitator were placed in tube 2 and tube 3 to fix the beginning and end of the enzymatic reaction. In tube 1, mix 2.5 ml of casein solution, 1.5 ml of Tris buffer and 1 ml of enzyme liqueur containing 45.6 μl of the enzyme. This is the 'control in which the activity of the enzyme in solution is measured. All tubes were immersed in a water bath at 37.5 ± 0.2 ° C. To fix the onset of the enzymatic reaction, after the first minute of incubation, a 2 ml sample is withdrawn from tube 1 and poured into tube 2. After the 31st minute of incubation, a second 2 ml sample is removed from tube 1 and is poured into tube 3. After centrifugation at 2000 rpm for 10 minutes, the supernatants of tubes 2 and 3 are measured at 275 nm. The enzyme activity is calculated using the following equation:

А= 3,156. ΔΕ275 където А е активността на ензима в СТА единици на ml, ΔΕ275 е разликата между абсорбцията, отчетена след 31-та минута и след първата минута от началото на ензимната реакция.A = 3.156. ΔΕ275 where A is the activity of the enzyme in CTA units per ml, ΔΕ275 is the difference between the absorbance recorded after 31 minutes and after the first minute from the beginning of the enzymatic reaction.

Имерването на активността на ензима, натоварен в ПСБМА хидрогеловете се определя по същия начин, с тази разлика, че в епруветка 1 вместо чист ензим се слага хидрогел, натоварен с еквивалентно количество ензим.The measurement of the activity of the enzyme loaded in the PSBMA hydrogels is determined in the same way, with the difference that in tube 1 instead of pure enzyme a hydrogel loaded with an equivalent amount of enzyme is placed.

Резултатите показват, че натоварването на субтилизна в ПСБМА хидрогелове води до 60% активност на натоварения ензим в сравнение с ензима в ратвор. Натоварването в ПКБМА запазва ензимната активност на 100%. Разликата се дължи на различното поведение на двата типа полицвитерйонни хидрогелове във вода. ПСБМА, поради по-силно изразената си склонност да формира физична мрежа, не позволява толкова лесно на казеиновите макромолекули да навлязат в него, а оттам ензимното действие не е толкова ефективно. ПКБМА, не формира допълнителни диполни клъстери (физична мрежа) и казеинът без проблем навлиза в гела където и протича част от ензимната реакция. Така, натоварването на субтилизина в ПКБМА хидрогелове не повлиява тяхната ензимна активност.The results show that the loading of subtilis in PSBMA hydrogels leads to 60% activity of the loaded enzyme compared to the enzyme in solution. The load in PKBMA keeps the enzyme activity at 100%. The difference is due to the different behavior of the two types of polysviterion hydrogels in water. PSBMA, due to its stronger tendency to form a physical network, does not allow casein macromolecules to enter it so easily, and therefore the enzymatic action is not so effective. PCBMA does not form additional dipole clusters (physical network) and casein easily enters the gel where part of the enzymatic reaction takes place. Thus, the loading of subtilisin in PCBMA hydrogels does not affect their enzymatic activity.

Claims (2)

Полицвитерйонен хидрогел за превръзки за лечение на хронични и некротични рани, характеризиращ се с това, че представлява еднослоен хидрогел, изграден от полицвитерйонна мрежа от поли (сулфобетаин метакрилат) и омрежващи сегменти от полиетиленгликол диакрилат с молекулна маса 575 g/mol, като съдържанието на полиетиленгликол диакрилат е в граници от 0.2 тегл. % до 8.2 тегл. %, а количеството на водата в хидрогела варира от 10 тегл. % до 67 тегл. %Polyviterion hydrogel for dressings for the treatment of chronic and necrotic wounds, characterized in that it is a single layer hydrogel composed of a polyviterion network of poly (sulfobetaine methacrylate) and crosslinking segments of polyethylene glycol diacrylate with a molecular weight of 575 g / molecular weight diacrylate is in the range of 0.2 wt. % to 8.2 wt. %, and the amount of water in the hydrogel varies from 10 wt. % up to 67 wt. % Полицвитерйонен хидрогел за превръзки за лечение на хронични и некротични рани, характеризиращ се с това, че представлява еднослоен хидрогел, изграден от полицвитерйонна мрежа от поли (карбоксибетаин метакрилат) и омрежващи сегменти от полиетиленгликол диакрилат с молекулна маса 575 g/mol, като съдържанието на полиетиленгликол диакрилат е в граници от 7.5 тегл. % до 17.6 тегл. %, а количеството на водата в хидрогела варира от 10 тегл. % до 90 тегл. %Polyviterion hydrogel for dressings for the treatment of chronic and necrotic wounds, characterized in that it is a single layer hydrogel composed of a polyviterion network of poly (carboxybetaine methacrylate) and crosslinking segments of polyethylene glycol diacrylate with a molecular weight of molecular weight of 575 g / diacrylate is in the range of 7.5 wt. % to 17.6 wt. %, and the amount of water in the hydrogel varies from 10 wt. % up to 90 wt. %