BG62348B2 - Vaccination by specific t-cellular populations against diseases as a result of pathogenous responses - Google Patents

Abstract

The invention relates to vaccines and vaccination devices ofa host by which specific T-cellular determined pathologies areprevented or controlled. The vaccine is made of a polypeptide theamino acid sequence of which corresponds to segment of aT-cellular receptor (TCR) found on the surface of the pathogenousT-cells. It is applied on the host in a manner causing immunerespons which is directed against the TCR of the pathogenousT-cells. The immune response fully regulates or destroys thepathogenous T-cells and in this way eliminates the pathogenesis ofthe diseases. The invention also relates to means for thedetermination of the suitable amino acid sequence for such avaccine.12 claims

Description

Област на техникатаTechnical field

Изобретението се отнася до имунната система, по-специално до методи за модифициране на патогенни имунни отговори.The invention relates to the immune system, in particular to methods for modifying pathogenic immune responses.

Предшестващо състояние на техникатаBACKGROUND OF THE INVENTION

Висшите организми се характеризират с имунна система, която ги защитава от инвазия на потенциално вредни вещества или микроорганизми. Когато вещество, наречено антиген, проникне в тялото и е разпознато като чуждо, имунната система реагира и с антитялообусловен отговор, и с клетъчнообусловен отговор. Клетки на имунната система, наречени В-лимфоцити или В-клетки, продуцират антитела, които специфично разпознават и се свързват с чуждото вещество. Други лимфоцити, наречени Т-лимфоцити или Т-клетки, едновременно осъществяват и регулират клетъчнообусловения отговор, водещ евентуално до отстраняването на антигена.Higher organisms are characterized by an immune system that protects them from the invasion of potentially harmful substances or microorganisms. When a substance called an antigen penetrates the body and is recognized as foreign, the immune system responds with both an antibody response and a cellular response. Immune system cells called B lymphocytes or B cells produce antibodies that specifically recognize and bind to a foreign substance. Other lymphocytes, called T lymphocytes or T cells, simultaneously carry out and regulate the cellular response, possibly leading to the removal of the antigen.

Различни Т-клетки са включени в клетъчнообусловения отговор. Някои възбуждат специфични В-клетъчни клонове към пролиферация и продуциране на антитела, специфични за антигена. Други разпознават и разрушават клетки с чужди антигени на повърхността си. Някои Т-клетки регулират отговора или като стимулират, или чрез супресия на други клетки.Different T cells are involved in the cellular response. Some excite specific B-cell clones for the proliferation and production of antigen-specific antibodies. Others recognize and destroy cells with foreign antigens on their surface. Some T cells regulate the response either by stimulating or suppressing other cells.

Макар че нормалната имунна система е добре регулирана, грешки в имунния отговор не са обичайни. В някои случаи имунната система функционира несвойствено и реагира към компонент на гостоприемника, както ако той в действителност би бил чужд. Резултатът от такъв отговор е автоимунно заболяване, при което имунната система на гостоприемника атакува собствената тъкан на гостоприемника. Т-клетките като първични регулатори на имунната система директно или индиректно предизвикват такива автоимунни патологии.Although the normal immune system is well regulated, errors in the immune response are not common. In some cases, the immune system functions abnormally and responds to a host component as if it were actually foreign. The result of such a response is an autoimmune disease in which the host immune system attacks the host's own tissue. T cells as primary regulators of the immune system directly or indirectly cause such autoimmune pathologies.

За много болести се приема, че са резултат от автоимунни механизми. Известни между тях са ревматоидният артрит, системният лупус еритематозус, мултиплената склероза, диабет тип I, миастеният гравис и пемфигус вулгарис. Автоимунните болести засягат милиони хора по света и загубите от тези заболявания, изразени като действителни разходи за лечение и загуба на трудоспособност, се измерват в милиарди долари годишно.Many diseases are thought to result from autoimmune mechanisms. Known among them are rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, multiple sclerosis, type I diabetes, myasthenia gravis and pemphigus vulgaris. Autoimmune diseases affect millions of people worldwide, and losses from these diseases, expressed as actual costs for treatment and disability, are measured in billions of dollars annually.

Понастоящем не е известно ефективно лечение на такива автоимунни патологии. Обикновено само симптомите могат да се лекуват, докато болестта продължава да прогресира, често причинявайки тежко изтощение или смърт.No effective treatment for such autoimmune pathologies is currently known. Usually, only the symptoms can be treated as the disease continues to progress, often causing severe exhaustion or death.

В други случаи лимфоцитите се репликират по неподходящ начин и без контрол. Такава репликация води до раково образувание, известно като лимфома. Когато нерегулираните лимфоцити са от Т-клетъчен тип, туморите се определят като Т-клетьчни лимфоми. Както при други злокачествени образувания Т-клетъчните лимфоми са трудни за ефективно лечение.In other cases, the lymphocytes replicate inappropriately and without control. Such replication leads to a cancer known as lymphoma. When unregulated lymphocytes are of T-cell type, tumors are defined as T-cell lymphomas. As with other malignancies, T-cell lymphomas are difficult to treat effectively.

Следователно, съществува дълготрайна необходимост от ефективни средства за лечение или подобряване на Т-клетъчно медиирани патологии. Такова лечение би трябвало да контролира идеално несвойствения Т-клетъчен отговор, вместо да намалява симптомите. Изобретението удовлетворява тази необходимост, като осигурява свързаните с това предимства.Therefore, there is a long-term need for effective agents for treating or ameliorating T-cell-mediated pathologies. Such treatment should ideally control the non-peculiar T-cell response rather than reduce the symptoms. The invention satisfies this need by providing related advantages.

Техническа същност на изобретениетоSUMMARY OF THE INVENTION

Изобретението се отнася до ваксини и средства за ваксиниране на бозайник, така че да се предотвратят или да се контролират специфичните Т-клетъчно медиирани патологии. Ваксината е съставена от Т-клетъчни рецептори (TCR) или техни фрагменти, отговарящи на TCR, намиращи се на повърхността на Т-клетките, медииращи патологията. Алтернативно, ваксината може да бъде пептид, съответстващ на последователности на TCR, характерни за Т-клетките, обуславящи посочените патологии.The invention relates to vaccines and mammalian vaccine agents so as to prevent or control specific T-cell-mediated pathologies. The vaccine is composed of T-cell receptors (TCRs) or fragments thereof corresponding to TCRs located on the surface of the T-cells mediating the pathology. Alternatively, the vaccine may be a peptide corresponding to the TCR sequences characteristic of the T cells underlying the pathologies.

В допълнение, изобретението осигурява ваксини за лечение на нерегулирано размножаване на Т-клетки. Ваксината е съставена от TCR или фрагменти от същия, отговарящи на TCR, намиращ се на повърхността на нерегу лираните Т-клетки. Алтернативно, ваксината може да бъде пептид, отговарящ на последователностите на TCR, характерни за нерегулирано размножаващите се Т-клетки.In addition, the invention provides vaccines for the treatment of unregulated T-cell propagation. The vaccine is composed of TCRs or fragments thereof corresponding to a TCR located on the surface of unregulated T cells. Alternatively, the vaccine may be a peptide corresponding to the TCR sequences characteristic of unregulated T cells.

Осигурени са също средства за определяне на подходящи аминокиселинни последователности за такива ваксини. Ваксината се прилага на бозайника по такъв начин, че да предизвика имунен отговор, насочен срещу TCR на Т-клетките, медииращи патологията. Този имунен отговор напълно регулира или унищожава патогенните Т-клетки, като по такъв начин отстранява патогенезата на болестта.Means are also provided to determine suitable amino acid sequences for such vaccines. The vaccine is administered to the mammal in such a way as to elicit an immune response directed against TCR of the T cells mediating the pathology. This immune response completely regulates or destroys pathogenic T cells, thereby eliminating the pathogenesis of the disease.

Изобретението се отнася до ваксини и тяхното използване за предотвратяване или подобряване на Т-клетъчно медиирани патологии като автоимунни болести и Т-клетъчни лимфоми. Ваксинирането осигурява специфично и поддържано лечение, което избягва проблемите, свързани с други възможни подходи на терапия.The invention relates to vaccines and their use for preventing or ameliorating T-cell-mediated pathologies such as autoimmune diseases and T-cell lymphomas. Vaccination provides specific and sustained treatment that avoids problems associated with other possible treatment approaches.

Както се използва тук, терминът “Т-клетъчнообусловена патология” се отнася до всяко състояние, при което несвойствен Т-клетъчен отговор е компонент на патологията. Терминът включва както болести с пряко посредничество на Т-клетки, така и тези, като миастения гравис, които се характеризират главно с увреждане, дължащо се на свързването на антитела, но също рефлектира в несвойствен Т-клетъчен отговор, който съдейства за произвеждането на тези антитела.As used herein, the term " T-cell pathology " refers to any condition in which an unusual T-cell response is a component of the pathology. The term includes both T-cell mediated diseases and those such as myasthenia gravis, which are characterized mainly by damage due to antibody binding but also reflected in an unusual T-cell response that contributes to the production of these antibodies.

Както се използва тук, понятието “съответстващ на”, когато се отнася до връзката между пептиди съгласно изобретението и последователностите на TCR, означава, че пептидът има аминокиселинна последователност, която е достатъчно хомоложна на TCR последователността, за да стимулира ефективен регулиращ отговор срещу патогенните Т-клетки. Пептидната последователност обаче не е нужно да бъде идентична на TCR последователността, както е показано в примерите 2 и 3.As used herein, the term "corresponding to" when referring to the link between peptides of the invention and TCR sequences means that the peptide has an amino acid sequence that is sufficiently homologous to the TCR sequence to stimulate an effective regulatory response against pathogenic T cells. However, the peptide sequence need not be identical to the TCR sequence as shown in Examples 2 and 3.

Имунната система е първичната биологична защита на гостоприемника (самият той) срещу потенциално вредни агенти (не самият той). Тези вредни агенти могат да бъдат патогени, като бактерии или вируси, модифицирани собствени клетки, включително инфектирани с вирус клетки, туморни клетки или други анормални клетки на гостоприемника. Най-общо тези мишени на имунната система се означават като антигени. Разпознаването на един антиген от имунната система бързо мобилизира имунните механизми за унищожаване на този антиген, като по такъв начин се запазва неприкосновеността на средата на гостоприемника.The immune system is the primary biological protection of the host (he himself) against potentially harmful agents (not himself). These harmful agents can be pathogens, such as bacteria or viruses, modified own cells, including virus-infected cells, tumor cells or other abnormal host cells. Generally, these immune system targets are referred to as antigens. The recognition of an antigen by the immune system quickly mobilizes the immune mechanisms to destroy that antigen, thus preserving the inviolability of the host environment.

Главните прояви на антиген-специфичния имунен отговор са хуморалния имунитет (обусловен от антителата) и клетъчния имунитет (обусловен от клетките). Всеки от тези имунологични механизми се иницира чрез активиране на хелперни (CD4+) Т-клетки. Тези CD4+ Т-клетки на свой ред стимулират Вклетки, отговорни за синтеза на антитела чрез свързване на антигена, за пролиферацията и секрецията на тези антитела. Тези секретирани антитела се свързват към антигена и улесняват разрушаването му по други имунни механизми. По подобен начин CD4+ Т-клетките осигуряват стимулаторни сигнали за цитотоксичните (CD8+) Т-клетки, които разпознават и разрушават клетъчните мишени, например инфектирани с вирус клетки на гостоприемника. Така активирането на CD4+ Тклетките е най-ранното събитие при стимулирането на имунния отговор. Следователно, изработването на механизми, лежащи в основата за антиген-специфичното активиране на CD4+ Т-клетките, е решаващо във всеки опит да се модифицира избирателно имунологична функция.The main manifestations of the antigen-specific immune response are humoral immunity (mediated by antibodies) and cellular immunity (mediated by cells). Each of these immunological mechanisms is initiated by the activation of helper (CD4 +) T cells. These CD4 + T cells in turn stimulate the cells responsible for antibody synthesis by antigen binding, for the proliferation and secretion of these antibodies. These secreted antibodies bind to the antigen and facilitate its destruction by other immune mechanisms. Similarly, CD4 + T cells provide stimulating signals for cytotoxic (CD8 +) T cells that recognize and destroy cellular targets, such as virus-infected host cells. Thus, activation of CD4 + cells is the earliest event in stimulating the immune response. Therefore, the elaboration of the mechanisms underlying the antigen-specific activation of CD4 + T cells is crucial in any attempt to modify selectively immunological function.

Т-клетките дължат своята антигенна специфичност на Т-клетъчния рецептор (TCR), който се намира на повърхността на клетката. TCR е хетеродимерен гликопротеин, съставен от две полипептидни вериги, всяка с молекулно тегло от приблизително 45 kD. Идентифицирани са две форми на TCR. Едната е съставена от алфа-верига и бета-верига, докато втората се състои от гама-верига и делтаверига. Всяка от тези четири TCR полипептидни вериги е кодирана с определен генетичен локус, съдържащ мултиплени прекъснати генни сегменти. Те включват променливи (V) области от гениите сегменти, област на свързване (J) на гениите сегменти и константна (С) област от гениите сегменти. Бета- и делта-веригите съдържат допълнителен елемент, наречен сегмент на различие (D). (Тъй като D сегменти се намират само в някои от генетичните локуси и полипептиди, по-нататъшните позовавания тук на D сегменти и елементи ще бъ дат в скоби, за да се посочи включването на тези области само в подходящи TCR вериги. Така V(D)J се отнася или до VDJ последователности на вериги, които имат D област, или се отнасят до VJ последователности на вериги, на които липсват D области).T cells owe their antigen specificity to the T cell receptor (TCR), which is located on the surface of the cell. TCR is a heterodimeric glycoprotein composed of two polypeptide chains, each with a molecular weight of approximately 45 kD. Two forms of TCR have been identified. One is made up of an alpha chain and a beta chain, while the other consists of a gamma chain and a delta chain. Each of these four TCR polypeptide chains is encoded by a specific genetic locus containing multiple interrupted gene segments. These include variable (V) regions of genius segments, binding region (J) of genius segments, and constant (C) region of genius segments. Beta and delta chains contain an additional element called a difference segment (D). (Because D segments are located only in some of the genetic loci and polypeptides, further references here to D segments and elements will be given in brackets to indicate inclusion of these regions only in appropriate TCR chains. Thus V (D ) J either refers to VDJ sequences of chains that have a D region or refers to VJ sequences of chains that lack a D region).

При узряването на лимфоцита единични V, (D) и J генни сегменти се преподреждат така, че да образуват функционален ген, определящ аминокиселинната последователност на TCR, експресиран от тази клетка. Тъй като обединението от V, (D) и J гените, които могат да бъдат преподреждани, е многочленно и тъй като индивидуалните членове на тези обединения могат да бъдат преподреждани във фактически всяка комбинация, пълният TCR репертоар е високо разнообразен и способен специфично да разпознава и да свързва голям брой от антигени, на които може да бъде изложен един организъм. Обаче отделната Т-клетка има само една TCR молекула и тази TCR молекула в голяма степен, ако не единствено, определя антигенната специфичност на тази Т-клетка.As the lymphocyte matures, the single V, (D) and J gene segments are rearranged to form a functional gene that determines the amino acid sequence of TCR expressed by that cell. Because the association of V, (D) and J genes that can be rearranged is polynomial, and since the individual members of these associations can be rearranged in virtually any combination, the complete TCR repertoire is highly diverse and able to specifically recognize and to bind a large number of antigens to which an organism may be exposed. However, a single T cell has only one TCR molecule, and this TCR molecule largely, if not solely, determines the antigenic specificity of that T cell.

Т-клетъчни патологии с автоимунна етиологияT-cell pathologies with autoimmune etiology

Животински модели са допринесли значително за разбирането на имунологичните механизми на автоимунните болести. Един такъв животински модел, експериментален алергичен енцефаломиелит (ЕАЕ), е автоимунно заболяване на централната нервна система, което може да се предизвика у мишки и плъхове чрез имунизиране с базичния протеин на миелина (БПМ). Болестта се характеризира клинично с парализа и умерено отслабване и хистологично с периваскуларна моноядрена клетъчна инфилтрация на паренхима на централната нервна система. Патогенезата е медиирана от Т-клетки със специфичност за БПМ. Мултиплени клонове от БПМ-специфични Т-клетки са изолирани от животни, страдащи от ЕАЕ, и се развиват в непрекъсната култура. След стимулиране in vitro с БПМ тези Т-клетъчни клонове силно индуцират ЕАЕ, когато са прехвърлени в здрави гостоприемници. Важно е, че тези индуциращи ЕАЕ Т-клетки са специфични не само за същия антиген (БПМ), но също обикновено и за единствен епитоп на този антиген. Тези наблюдения сочат, че редките популации от автоагресивни Т-клетки са отговорни за патогенезата на ЕАЕ.Animal models have contributed significantly to the understanding of the immunological mechanisms of autoimmune diseases. One such animal model, Experimental Allergic Encephalomyelitis (EAE), is an autoimmune disease of the central nervous system that can be induced in mice and rats by immunization with the basic myelin protein (BPM). The disease is characterized clinically by paralysis and moderate attenuation and histologically by perivascular mononuclear cellular infiltration of the parenchyma of the central nervous system. The pathogenesis is mediated by T cells with specificity for BPM. Multiple clones of BPM-specific T-cells are isolated from EAE animals and develop in continuous culture. After in vitro stimulation with BPM, these T cell clones strongly induce EAE when transferred to healthy hosts. Importantly, these EAE-inducing T cells are specific not only to the same antigen (BPM) but also generally to a single epitope of that antigen. These observations indicate that rare autoaggressive T-cell populations are responsible for the pathogenesis of EAE.

Анализът на TCR от ЕАЕ-индуциращи Т-клетки показва намалена разнородност на структурата на тези свързани със заболявания рецептори. В един анализ на 33 БПМреактивни Т-клетки са използвани само две алфа-вериги от V областта на генния сегмент и единичен алфа-верижен J генен сегмент. Подобно ограничаване на използването на бета-верижния TCR ген също се наблюдава в тази Т-клетьчна популация. Установени са само два сегмента от бета-верижната V област и два сегмента от J областта. По-важно е, че приблизително 80% от Т-клетъчните клонове имат идентични аминокиселинни последователности в областта на бета-верижното V-D-J свързване. Тези открития потвърждават схващането за обща TCR структура между Т-клетките с подобни антигенни специфичности и сочат, че TCR е ефективна мишена за имунотерапевтични стратегии, целящи елиминирането на патогенезата на ЕАЕ.TCR analysis of EAE-inducing T cells showed reduced heterogeneity of the structure of these disease-related receptors. Only two alpha chains from the V region of the gene segment and a single alpha chain J gene segment were used in one analysis of 33 BPMreactive T cells. Similar restriction on the use of the beta-chain TCR gene has also been observed in this T-cell population. Only two segments of the beta chain V region and two segments of the J region were identified. More importantly, approximately 80% of the T-cell clones have identical amino acid sequences in the region of beta-chain V-D-J binding. These findings support the notion of a common TCR structure among T cells with similar antigenic specificities and indicate that TCR is an effective target for immunotherapeutic strategies aimed at eliminating the pathogenesis of EAE.

Правени са различни опити да се използва антигенната специфичност на автоагресивните Т-клетки за намиране стратегия за лечение на ЕАЕ. Например, използвано е пасивно въвеждане на моноклонални антитела, специфични за TCR, представени в ЕАЕ-индуциращите Т-клетки. В модел на ЕАЕ у мишки инфузията на моноклонално антитяло, специфично за V_p 8, главната бета-верига от V областта на гена, използвана от БПМ-специфични Т-клетки, намалява податливостта на мишките към последващо индуциране на ЕАЕ. (Acha-Orbea et al., Cell 54:263-273 (1988) и Urban et al., Cell 54:577-592 (1988). Подобна защита е показана при плъхове с ЕАЕ с моноклонално антитяло, реагиращо с неидентифицирана идиотипна детерминанта на TCR върху БПМ специфични Т-клетки (Burns et al., J. Exp. Med. 169:27-39 (1989). Докато пасивната терапия c антитела изглежда, че има известен подобряващ ефект върху чувствителността към ЕАЕ, тя създава редица потенциални проблеми. Постигнатата защита е преходна, като с това изисква повтарящо се прилагане на антитела. Многократното вливане на антитела увеличава шансовете гостоприемникът да установи имунен отговор към прилаганото антитяло, по-специално, ако е предизвикан у хетерогенни организми. По-нататък антитяло отговорът спрямо патогенен Т-клетъчен клон представлява само един елемент от пълния имунен отговор и пренебрегва потенциалните възможности на клетъчния имунитет при разрешаването на автореактивността.Various attempts have been made to use the antigenic specificity of autoaggressive T cells to find a strategy for the treatment of EAE. For example, passive administration of TCR-specific monoclonal antibodies represented in EAE-inducing T cells was used. In a model of EAE in mice, infusion of a monoclonal antibody specific for V _p 8, the major beta strand of the V region of the gene used by BMP-specific T cells, reduces the susceptibility of mice to subsequent induction of EAE. (Acha-Orbea et al., Cell 54: 263-273 (1988) and Urban et al., Cell 54: 577-592 (1988). Similar protection has been shown in rats with EAE with a monoclonal antibody reacting with an unidentified idiotype determinant of TCR on BPM specific T cells (Burns et al., J. Exp. Med. 169: 27-39 (1989). While passive antibody therapy appears to have some enhancing effect on EAE sensitivity, it creates a number of potential The protection achieved is transient, thus requiring repeated administration of antibodies. In addition, the antibody response to a pathogenic T-cell clone represents only one element of the complete immune response and ignores the potential of cellular immunity in resolving autoreactivity.

Ролята на клетъчния имунитет за намаляване на активността на автоагресивните Тклетки при ЕАЕ е изследвана и са подсказани потенциални терапии. По подобен на пасивния имунитет подход регулаторните Т-клетки са получени ex vivo и са приложени отново за имунотерапия. Например Sun et al., Nature, 332:843-845 (1988) са изолирани напоследък CD8+ Т-клетъчен клон от оздравяващи плъхове, у които е индуцирана ЕАЕ чрез адоптивен трансфер от БПМ-специфична CD4+ Т-клетъчна линия. Така CD8+ Т-клетъчният клон показа цитолитична активност in vitro за CD4+ Т-клетките, използвани за индуциране на болестта. Нещо повече, адоптивният трансфер на този CTL клон намалява чувствителността на плъховете реципиенти към последващо въздействие с БПМ. Lider et al., (Science, 239: 181-183 (1988)) са изолирани също CD8+ Тклетьчен клон със супресивна активност за ЕАЕ индуциращи Т-клетки. Този CD8+ клон е изолиран от плъхове, ваксинирани с атенюирани болестотворни Т-клетъчни клонове, и тъй като те не показват цитолитична активност in vitro, биха могли да супресират БПМуправляваната пролиферация на ЕАЕ-индуциращите Т-клетки. Макар че тези изследвания сочат, че CD8+ Т-клетките могат да регулират напълно ЕАЕ, трудно е да се потвърди главната роля на тези селекционирани CD8+ Т-клетъчни линии в дългосрочната резистентност на оздравели плъхове, тъй като Sedgwick et al., (Eur. J. Immunol., 18:495-502 (1988)) ясно показват, че изчерпването на CD8+ клетките с моноклонални антитела не въздейства върху болестния процес или възстановяването.The role of cellular immunity in reducing the activity of autoaggressive T cells in EAE has been investigated and potential therapies have been suggested. In a similar passive immunity approach, regulatory T cells were obtained ex vivo and reapplied for immunotherapy. For example, Sun et al., Nature, 332: 843-845 (1988) have recently isolated a CD8 + T-cell clone from healing rats that has been induced by EAE through adaptive transfer from a BPM-specific CD4 + T-cell line. Thus, the CD8 + T-cell clone showed cytolytic activity in vitro for CD4 + T-cells used to induce the disease. Moreover, the adaptive transfer of this CTL clone reduced the susceptibility of the recipient rats to subsequent exposure to BPM. Lider et al., (Science, 239: 181-183 (1988)) also isolated a CD8 + T cell clone with suppressive activity for EAE-inducing T cells. This CD8 + clone is isolated from rats vaccinated with attenuated pathogenic T-cell clones, and since they do not show cytolytic activity in vitro, they could suppress PDM-driven proliferation of EAE-inducing T cells. Although these studies suggest that CD8 + T cells can completely regulate EAE, it is difficult to confirm the major role of these selected CD8 + T cell lines in long-term resistance in healthy rats, as Sedgwick et al. (Eur. J Immunol., 18: 495-502 (1988)) clearly show that depletion of CD8 + cells with monoclonal antibodies does not affect the disease process or recovery.

В експериментите на Sun et al. и Lider et al., описани по-горе, прилагането на съществуващите регулаторни Т-клетки преодолява главната пречка на пасивната антитяло терапия. То позволява регулиращ отговор in vivo с удължено времетраене. Това обаче изисква in vitro култивиране с атенюирани болестотворни Т-клетки за развитие на клонове от такива регулаторни Т-клетки, което е скъп и трудоемък процес. Освен това, в популации като човешките МНС, които не са идентични за различните индивиди, прави това високо индивидуализирана терапевтична стратегия.In the experiments of Sun et al. and Lider et al., described above, administration of existing regulatory T cells overcomes the major obstacle to passive antibody therapy. It allows for an in vivo regulatory response of prolonged duration. However, this requires in vitro cultivation with attenuated disease-causing T cells to develop clones of such regulatory T cells, which is a costly and time-consuming process. In addition, in populations such as human MHCs that are not identical across individuals, this makes a highly individualized therapeutic strategy.

Регулаторните клонове трябва да се получат за всеки пациент поотделно и тогава да се прилагат повторно на този пациент, за да се избегне потенциалната реакция на трансплантат срещу гостоприемник.Regulatory clones should be obtained for each patient individually and then reapplied to that patient to avoid potential transplant response to the host.

Директно ваксиниране с атенюирани болестотворни Т-клетъчни клонове също е използвано за терапия на ЕАЕ. БПМ-специфични Т-клетки, способни да предават болестта, са атенюирани чрез γ-облъчване или химично фиксиране и се използват за ваксиниране на плъхове. В някои случаи ваксинираните животни показват резистентност при последващи опити за предизвикване на ЕАЕ (Lider et al., supra; виж Cohen and Weiner, Immunol. Today 9:332-335 (1988) за обзори). Ефективността на такива ваксини обаче е непостоянна и степента на защита много варира. Т-клетките съдържат множество различни антигени, които предизвикват имунен отговор, когато цялата клетка е въведена като ваксина. Този феномен е показан от Offner et al., (J. Neuroimmunol., 21:13-22 (1989), който показва, че имунизацията с цели Т-клетки увеличава отговора от забавен тип свръхчувствителност (DTH), както е измерено по подуването на ухото за тези Т-клетки по степен на нарастване, съответно на нарастване броят на ваксиниранията. Все пак, положителни DTH отговори са открити и в предпазените, и в непредпазените животни. Плъховете отговарят по подобен начин на ваксиниране с енцефалитогенни Т-клетки и контролни Т-клетки. Обратно, ваксинирането с PPD-специфични Т-клетки от PPDспецифични Т-клетъчни линии индуцира DTH към ваксинираните клетки, както и към енцефалитогенния клон, дори когато не се наблюдава предпазване. Подобен отговор на ваксинирани плъхове и към болестотворни и към контролни клетки, както количествено се определя по забавения тип свръхчувствителност (измерване на клетъчномедииран имунитет), сочи, че многобройни антигени върху тези Тклетки са индуцирали имунните отговори. Така ваксинирането с атенюирани Т-клетки страда от липса на специфичност за предпазния антиген върху повърхността на Т-клетката, както и от променлива индукция на имунитет към този антиген. Като възможност за лечение на болести у човека ваксинирането с атенюирани Т-клетки е съпроводено със същата трудоемкост и нужда от индивидуализирана терапия, както е отбелязано по-горе за инфузия с CD8+ клетки.Direct vaccination with attenuated disease-causing T-cell clones has also been used to treat EAE. BPM-specific T cells capable of transmitting the disease are attenuated by γ-irradiation or chemical fixation and used for vaccination in rats. In some cases, vaccinated animals show resistance in subsequent attempts to induce EAE (Lider et al., Supra; see Cohen and Weiner, Immunol. Today 9: 332-335 (1988) for reviews). However, the efficacy of such vaccines is not constant and the degree of protection varies greatly. T cells contain many different antigens that elicit an immune response when the whole cell is introduced as a vaccine. This phenomenon has been demonstrated by Offner et al., (J. Neuroimmunol., 21: 13-22 (1989), which shows that immunization with whole T cells increases the delayed hypersensitivity (DTH) response as measured by swelling however, positive DTH responses were found in both the protected and unprotected animals. The rats responded similarly to vaccination with encephalitogenic T cells and controls. T-cells Conversely, vaccination with PPD-specific T cells from PPD-specific T-cells lines induce DTH to the vaccinated cells as well as to the encephalitogenic clone, even when no protection is observed.A similar response in vaccinated rats to both disease and control cells, as quantified by delayed type of hypersensitivity (measurement of cell mediated immunity) that multiple antigens on these cells have induced immune responses, thus vaccination with attenuated T cells suffers from a lack of specificity of the protective antigen on the surface of the T cell as well as from variable induction of immunity to this antigen. As an opportunity to treat human diseases, vaccination with attenuated T cells is accompanied by the same laboriousness and need for individualized therapy as noted above for infusion with CD8 + cells.

Изобретението предлага ефективен метод за имунотерапия на Т-клетъчно медиирани патологии, включително автоимунни заболявания, с който се избягват много от проблемите, свързани с по-рано посочените методи на лечение. Чрез ваксиниране, за разлика от пасивното прилагане на хетероложни антитела, собствената имунна система на гостоприемника се мобилизира да потиска автоагресивните Т-клетки. Така супресията е постоянна и може да включи всеки и всички имунологични механизми за осъществяване на тази супресия. Този многостранен отговор е по-ефективен, отколкото едноплановата супресия, постигната чрез пасивно прилагане на моноклонални антитела или производни на налични регулаторни Т-клетъчни клонове.The invention provides an effective method of immunotherapy for T-cell-mediated pathologies, including autoimmune diseases, which avoids many of the problems associated with the previously mentioned methods of treatment. By vaccination, unlike passive administration of heterologous antibodies, the host's own immune system is mobilized to suppress autoaggressive T cells. Thus, suppression is permanent and may involve any and all immunological mechanisms to effect this suppression. This multifaceted response is more effective than unilateral suppression achieved by passive administration of monoclonal antibodies or derivatives of available regulatory T-cell clones.

Доколкото се отнасят до автоимунните заболявания, ваксините от изобретението съдържат TCR от Т-клетки, медииращи автоимунни болести. Ваксините могат да бъдат изцяло TCR, по същество пречистени от Т-клетъчни клонове, индивидуални Т-клетъчни рецепторни вериги, например алфа, бета и пр., или части от такива вериги самостоятелно или в комбинация. Ваксините могат да бъдат хомогенни, например единичен пептид, или могат да бъдат съставени от повече от един пептид, всеки от които съответства на част от TCR. “По същество чист” означава, че TCR по същество е свободен от други биохимични остатъци, с които той нормално е свързан в природата. Алтернативно, ваксините обхващат пептиди с различна дължина, съответстващи на TCR или на части от тях. Пептидите могат да се произведат синтетично или рекомбинантно, със средства, добре познати на специалистите от областта. За предпочитане пептидните ваксини отговарят на областите от TCR, които отличават този TCR от други непатогенни TCR. Такива специфични области са за предпочитане локализирани в V областта (тите) на съответните TCR полипептидни вериги. Повече се предпочита пептидът да съответства на къса последователност, имаща V(D)J връзка, ограничавайки по такъв начин имунния отговор единствено до тези Т-клетки, които носят тази единична детерминанта.Inasmuch as they relate to autoimmune diseases, the vaccines of the invention contain TCRs from T cells mediating autoimmune diseases. The vaccines may be fully TCR, substantially purified from T-cell clones, individual T-cell receptor chains, e.g., alpha, beta, etc., or portions of such chains alone or in combination. Vaccines may be homogeneous, for example a single peptide, or may be composed of more than one peptide, each corresponding to a portion of a TCR. "Essentially pure" means that TCR is essentially free from other biochemical residues to which it is normally associated in nature. Alternatively, vaccines comprise peptides of different lengths corresponding to TCRs or portions thereof. The peptides can be produced synthetically or recombinantly, with agents well known to those skilled in the art. Preferably, the peptide vaccines correspond to regions of TCR that distinguish this TCR from other non-pathogenic TCRs. Such specific regions are preferably located in the V region (s) of the respective TCR polypeptide chains. More preferably, the peptide corresponds to a short sequence having a V (D) J bond, thus limiting the immune response to only those T cells that carry this single determinant.

Ваксините се прилагат на гостоприемник, проявяващ или при риск да прояви автоиму нен отговор. Точно определената клинична диагноза на специфично автоимунно заболяване оправдава прилагането на релевантни специфични за заболяването TCR ваксини. Профилактични приложения са оправдани при болести, при които автоимунните механизми предшестват началото на открита клинична картина на заболяването, например диабет тип I. По такъв начин индивидът с фамилна история на заболяването и с предразположение за риск при надеждни прогностични индикатори може да се третира профилактично за предотвратяване на автоимунните механизми преди проявяването им.Vaccines are administered to a host who is or is at risk of an autoimmune response. The well-defined clinical diagnosis of a specific autoimmune disease justifies the administration of relevant disease-specific TCR vaccines. Prophylactic applications are justified in diseases in which autoimmune mechanisms precede the onset of an open clinical picture of the disease, such as type I. Diabetes so that an individual with a family history of the disease and at risk for reliable prognostic indicators can be treated prophylactically for prevention of autoimmune mechanisms prior to their manifestation.

TCR ваксините могат да се прилагат в много възможни готови форми във фармакологично допустими среди. В случай на къс пептид пептидът може да се конюгира с носител като KLH, за да се увеличи неговата имуногенност. Ваксината може да се прилага заедно с адювант, много от които са известни на специалистите от областта. След началната имунизация с ваксината може да се направи второ инжектиране. Ваксините се прилагат по обичайни методи, в дозировки, които са достатъчни да възбудят имунологичен отговор, който може лесно да се определи от специалистите от областта.TCR vaccines can be administered in many possible formulations in pharmacologically acceptable media. In the case of a short peptide, the peptide can be conjugated to a carrier such as KLH to increase its immunogenicity. The vaccine can be administered with an adjuvant, many of which are known to those skilled in the art. After the initial immunization with the vaccine, a second injection can be made. Vaccines are administered by conventional methods in dosages sufficient to elicit an immunological response that can be readily determined by one of ordinary skill in the art.

Подходящите пептиди за използване за имунизация могат да се определят както следва. Предизвикващи болестта Т-клетъчни клонове, реагиращи с антигените мишени, се изолират от засегнати индивиди. Такива Тклетки могат да се получат от мястото на активна автоагресивна активност като лезия в случай на пемфигус вулгарис, ЦНС в случай на мултиплена склероза или миастения гравис или синовиалната течност или тъкан в случай на ревматоиден артрит. След това TCR гените от тези автоагресивни Т-клетки се секвенират. Полипептидите, съответстващи на TCR или на части от тях, които са селективно представени от болестотворните Т-клетки, съответни на непатогенните Т-клетки, могат след това да се селекционират като ваксини и да се изработят и използват, както е описано погоре.Suitable peptides for use for immunization can be determined as follows. Disease-inducing T-cell clones that respond to target antigens are isolated from the affected individuals. Such T cells may be derived from the site of active autoaggressive activity such as a lesion in the case of pemphigus vulgaris, CNS in the case of multiple sclerosis or myasthenia gravis or synovial fluid or tissue in the case of rheumatoid arthritis. The TCR genes from these autoaggressive T cells are then sequenced. Polypeptides corresponding to TCRs or portions thereof that are selectively represented by pathogenic T-cells corresponding to non-pathogenic T-cells can then be selected as vaccines and constructed and used as described above.

Т-клетъчни патологии със злокачествена етиологияT-cell pathologies with malignant etiology

За да се илюстрира полезността на TCR ваксинирането, са обсъдени автоимунните заболявания. Обаче Т-клетъчната лимфома е друга Т-клетъчна патология, която може да бъде податлива към този тип лечение. Приложение на тази технология в лечението на Т-лимфома се провежда по фактически идентичен начин. В един важен аспект, обаче, тази технология е по-лесно приложима към Тклетъчни пролиферативни заболявания, докато изолирането на патогенни Т-клетки е полесно осъществимо. След като веднъж са изолирани клоновете, технологията се прилага по описания по-горе начин. Специфично TCR гените на Т-лимфомите се секвенират, подходящите области от тези TCR се идентифицират и използват като ваксини. Ваксините могат да съдържат единичен или множество пептиди и могат да се прилагат във форми със или без адюванти по обичайни начини.In order to illustrate the utility of TCR vaccination, autoimmune diseases are discussed. However, T-cell lymphoma is another T-cell pathology that may be susceptible to this type of treatment. The application of this technology in the treatment of T-lymphoma is practically identical. In one important aspect, however, this technology is more readily applicable to T cell proliferative diseases, whereas the isolation of pathogenic T cells is useful. Once the clones have been isolated, the technology is applied as described above. Specifically, TCR genes of T lymphomas are sequenced, appropriate regions of these TCRs are identified and used as vaccines. Vaccines may contain single or multiple peptides and may be administered in forms with or without adjuvants in the usual manner.

Следващите примери илюстрират изобретението, без да го ограничават.The following examples illustrate the invention without limitation.

Пример 1. Модел на ЕАЕ у плъховеExample 1. Model of EAE in rats

Женски плъхове порода Lewis (Charles River Laboratories, Raleigh-Durham, N.C.) ce имунизират във всяка задна лапа с 50 pg базичен протеин на миелина от морско свинче, емулгиран в пълен адювант на Freund. Първите признаци на заболяването се наблюдават обикновено 9-11 дни след имунизацията. Тежестта на заболяването се отчита по триточкова скала, както следва: 1 - отпусната опашка; 2 = отслабване на задния крак; 3 = парализа на задния крак. След протичане на болестта от приблизително 4 до 6 дни повечето от плъховете се възстановяват спонтанно и не се поддават на последващо предизвикване на ЕАЕ.Lewis female rats (Charles River Laboratories, Raleigh-Durham, N.C.) will be immunized in each hind paw with 50 pg guinea pig basic protein emulsified in complete Freund adjuvant. The first signs of the disease are usually seen 9-11 days after immunization. The severity of the disease is recorded on a three-point scale as follows: 1 - loosened tail; 2 = weakening of the hind leg; 3 = paralysis of the hind leg. After approximately 4 to 6 days, most of the rats recover spontaneously and do not respond to subsequent EAE challenge.

Пример 2. Селекция и приготвяне на ваксинитеExample 2. Selection and preparation of vaccines

Ваксинирането се провежда с Т-клетъчен рецепторен пептид, чиято последователност е изведена от ДНК последователността на Т-клетъчно рецепторния бета верижен ген, преобладаващ у ЕАЕ-индуциращите Т-клетки на SJ/L мишки. ДНК последователността е тази, посочена от Urban et al., supra, която е включена тук за справка. Пептид с девет аминокиселини, имащ последователността на VDJ връзката от TCR бета-верига от мишка, се синтезира по методи, известни на специалистите от областта. Последователността на този пеп тид е: SGDAGGGYE. (Аминокиселините са представени с конвенционалния еднобуквен код). Еквивалентната последователност у плъхове е известно, че е: SSD-SSNTE (Burns et al., J. Exp. Med. 169:27-39 (1989). Пептидът се изсолва чрез колонна хроматография на Sephadex G-25 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.J.) в 0,1 M оцетна киселина и разтворителят след това се отстранява в два цикъла на лиофилизация. Част от пептида се конюгира с кейхолов прозрачен хемоцианин keyhole limpet hemocyanin - KLH, c глутаралдехид в съотношение от 7,5 mg пептид за mg KLH. Полученият конюгат се диализира с фосфатен буферен разтвор на натриев хлорид (PBS).Vaccination is carried out with a T-cell receptor peptide whose sequence is derived from the DNA sequence of the T-cell receptor beta chain gene predominant in EAE-inducing T cells of SJ / L mice. The DNA sequence is that indicated by Urban et al., Supra, which is incorporated herein by reference. A nine amino acid peptide having the VDJ sequence of the mouse TCR beta chain is synthesized by methods known to those skilled in the art. The sequence of this peptide is: SGDAGGGYE. (Amino acids are represented by the conventional one-letter code). The equivalent sequence in rats is known to be: SSD-SSNTE (Burns et al., J. Exp. Med. 169: 27-39 (1989). The peptide is salted by Sephadex G-25 column chromatography (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) in 0.1 M acetic acid and the solvent is then removed in two cycles of lyophilization Part of the peptide is conjugated to keyhole limpet hemocyanin - KLH keyhole limpet hemocyanin - KLH, with glutaraldehyde in a ratio of 7.5 mg peptide per mg KLH The resulting conjugate was dialyzed with phosphate buffered sodium chloride (PBS).

Пример 3. Ваксиниране срещу ЕАЕExample 3. Vaccination against EAE

Ваксините, използвани в тези изследвания, се състоят от свободен VDJ пептид, а също и VDJ пептид, конюгиран с KLH. Те се разтварят в PBS и се емулгират с равни обеми или от (1) непълен адювант на Freund (IFA), или (2) пълен адювант на Freund (CFA), приготвени чрез суспендиране на 10 mg/ml топлинно унищожени сухи Mycobacterium tuberculosis H37ra (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) в IFA. Емулсиите се прилагат на женски плъхове порода Lewis, на възраст 8-12 седмици, в краен обем от 100 μΐ на животно (50 μΐ във всяка от задните лапи). Прилагат се по 5 pg на плъх от неконюгирания VDJ пептид. KLHVDJ конюгатът се прилага в дози, еквивалентни на 10 pg KLH на плъх. 29 дни по-късно на всеки плъх се въвежда в предните лапи 50 pg базичен протеин на миелина от морско свинче в пълен адювант на Freund. Животните се контролират ежедневно, като се започне от 9-я ден за клинични признаци на ЕАЕ и се отчитат, както е описано по-горе. Резултатите са представени в таблица 1. Както може да се види, у ваксинираните индивиди не само има намаляване на случаите на заболяване, но и в тези, които са прихванали болестта, тежестта на заболяването се намалява и/или настъпването се забавя. Степента на защита варира с формата на ваксината, като тези включващи CFA като адювант, показват по-голяма степен на защита.The vaccines used in these studies consist of the free VDJ peptide and also the KLD conjugated VDJ peptide. They are dissolved in PBS and emulsified in equal volumes either by (1) incomplete Freund adjuvant (IFA) or (2) Freund complete adjuvant (CFA) prepared by suspending 10 mg / ml of heat-cured dry Mycobacterium tuberculosis H37ra (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) At IFA. The emulsions were administered to female rats of the Lewis breed, 8-12 weeks old, in a final volume of 100 μΐ per animal (50 μΐ in each of the hind paws). 5 pg per rat of unconjugated VDJ peptide were administered. The KLHVDJ conjugate was administered at doses equivalent to 10 pg KLH per rat. 29 days later, in each rat, 50 pg guinea pig basic protein of guinea pig was introduced into the forepaws in complete Freund's adjuvant. Animals were monitored daily starting from day 9 for clinical signs of EAE and counted as described above. The results are presented in Table 1. As can be seen, vaccinated individuals not only have a reduction in the incidence of the disease, but in those who have taken the disease, the severity of the disease is reduced and / or delayed. The degree of protection varies with the form of the vaccine, and those incorporating CFA as adjuvant show a greater degree of protection.

Таблица 1Table 1

Дни след въвежданеDays after introduction

Живот но Nt Life but Nt Ваксиниран© (адювант) Vaccinated © (adjuvant) 10 10 11 11 12 12 13 13 14 14 15 15 16 16 17 17 18 18 1 1 VDJ (IFA) VDJ (IFA) 2 2 3 3 3 3 3 3 2 2 V V 1 1 3 3 3 3 3 3 2 2 3 3 я me - - 3 3 3 3 3 3 2 2 4 4 VDJ (CFA) VDJ (CFA) - - - - 1 1 1 1 1 1 - - 5 5 - - - - - - - - • • • • 6 6 V V - - 1 1 3 3 3 3 3 3 2 2 7 7 KLH-VDJ (CFA) KLH-VDJ (CFA) - - 1 1 3 3 2 2 - - 8 8 N N - - - - 1 1 1 1 1 1 1 1 9 9 - - - - - - - - • • 10 10 KLH-VDJ (IFA) KLH-VDJ (IFA) 1 1 3 3 3 3 2 2 2 2 1 1 • • 11 11 • • - - 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 2 12 12 я me - - 1 1 3 3 3 3 3 3 3 3 • • 13 13 без without 1 1 3 3 3 3 3 3 3 3 1 1 • • 14 14 * * - - 1 1 3 3 3 3 3 3 1 1 - - - - 15 15 я me 1 1 3 3 3 3 3 3 1 1 и and - - - - - -

Отчитане:Reporting:

- : никакви симптоми-: no symptoms

1) : отпускане на опашката1): Release the tail

2) : отслабване на задния крак2): weakening of the hind leg

3) : парализа на задния крак3): hind limb paralysis

Въпреки че изобретението е описано с позоваване на предпочитано изпълнение, могат да се направят различни модификации, без да се излиза от същността му. Съобразно това изобретението е ограничено само от патентните претенции.Although the invention has been described with reference to a preferred embodiment, various modifications may be made without departing from its nature. Accordingly, the invention is limited only by the claims.

Claims (12)

Патентни претенцииClaims 1. По същество чист, едноверижен пептид, съдържащ аминокиселинна последователност от Т-клетъчен рецептор, намиращ се на повърхността на автоагресивни Т-клетки, обуславящи патология, който пептид индуцира имунен отговор срещу автоагресивните Тклетки така, че да се намали тежестта на посочената патология.1. A substantially pure, single-stranded peptide comprising an amino acid sequence from a T-cell receptor located on the surface of pathologic auto-aggressive T cells, which peptide induces an immune response against auto-aggressive T cells so as to reduce the severity of said pathology. 2. Пептид съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че има аминокиселинна последователност, получена от последователност от променливата област на Т-клетьчна рецепторна полипептидна верига.A peptide according to claim 1, characterized in that it has an amino acid sequence derived from a sequence from the variable region of a T-cell receptor polypeptide chain. 3. Пептид съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че има аминокиселинна последователност, получена от V (D) J връзката на Т-клетъчната рецепторна полипептидна верига.A peptide according to claim 1, characterized in that it has an amino acid sequence derived from the V (D) J junction of the T cell receptor polypeptide chain. 4. Пептид съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че съдържа аминокиселинна последователност SGDAGGGYE.The peptide according to claim 3, characterized in that it contains the amino acid sequence SGDAGGGYE. 5. Състав, характеризиращ се с това, че съдържа пептид съгласно която и да е от претенциите 1, 2, 3 или 4.A composition comprising a peptide according to any one of claims 1, 2, 3 or 4. 6. Състав съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че съдържа допълнително адювант.Composition according to claim 5, characterized in that it further comprises an adjuvant. 7. Състав съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че съдържа повече от един по същество чист, имуногенен едноверижен пептид, получен от неконстантните области на различни Т-клетъчни рецепторни полипептидни вериги.Composition according to claim 5, characterized in that it contains more than one substantially pure, immunogenic single-stranded peptide derived from the non-constant regions of different T-cell receptor polypeptide chains. 8. Състав съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че едноверижният пептид е конюгиран с носител.Composition according to claim 5, characterized in that the single-stranded peptide is conjugated to a carrier. 9. Метод за намаляване тежестта на патология, обусловена от автоагресивни Тклетки, имащи намалена Т-клетъчна рецеп8 торна разнородност при бозайници, характеризиращ се с това, че се прилага състав съгласно претенция 5.9. A method of reducing the severity of a pathology caused by autoaggressive T cells having a reduced T-cell receptor heterogeneity in a mammal, wherein the composition of claim 5 is administered. 10. Метод съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че съставът се прилага повече от един път.10. The method of claim 9, wherein the composition is administered more than once. 11. Метод съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че съставът се прилага във форми, включващи адювант.A method according to claim 9, wherein the composition is administered in forms comprising an adjuvant. 12. Метод за намаляване тежестта на патология, обусловена от автоагресивни Тклетки, имащи намалена Т-клетъчна рецепторна разнородност при животни, характери5 зиращ се с това, че се прилага състав съгласно претенция 7.A method for reducing the severity of a pathology caused by autoaggressive T cells having reduced T-cell receptor heterogeneity in animals, characterized in that the composition of claim 7 is administered.