BG107210A

BG107210A - Soluble ctla4 mutant molecules and uses thereof

Info

Publication number: BG107210A
Application number: BG107210A
Authority: BG
Inventors: Robert Peach; Joseph NAEMURA; Peter Linsley; Jurgen Bajorath
Original assignee: Bristol-Myers Squibb Company
Priority date: 2000-05-26
Filing date: 2002-10-22
Publication date: 2003-06-30
Also published as: BG65928B1; NZ522031A

Abstract

The present invention provides soluble CTLA4 mutant molecules which bind with greater avidity to the CD80 and/or CD86 antigen than wild type CTLA4 or non-mutated CTLA4lg. The soluble CTLA4 molecules have a first amino acid sequence comprising the extracellular domain of CTLA4, where certain amino residues within the S25-R33 region and M97-G107 region are mutated. The mutant molecules of the invention may also include a second amino acid sequence which increases the solubility of the mutant molecule. 66 claims

Description

ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТАTECHNICAL FIELD

Настоящето изобретение се отнася до разтворими CTLA4 молекули, които са мутирали от див тип CTLA4, да задържат способността да се свързват към CD80 и/или CD86.The present invention relates to soluble CTLA4 molecules that have mutated wild-type CTLA4 to retain the ability to bind to CD80 and / or CD86.

ПРЕДШЕСТВУВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТАBACKGROUND OF THE INVENTION

Антиген-неспецифични междумолекулни взаимодействия между Т-лимфоцити и антиген-представящи клетки (APCs) генерират Т клетъчни костимулаторни сигнали, които генерират Т клетъчни отговори към антиген (Jenkins and Johnson (1993) Curr. Opin. Immunol. 5:361-367). Костимулаторните сигнали определят величината на Т клетъчните отговори към антигена, и дали този отговор активира, или инактивира следващите отговори към антигена (Mueller et al. (1989) Annu. Rev. Immunol. 7: 445-480).Antigen-nonspecific intermolecular interactions between T lymphocytes and antigen presenting cells (APCs) generate T cell costimulatory signals that generate T cell responses to the antigen (Jenkins and Johnson (1993) Curr. Opin. Immunol. 5: 361-367). Costimulatory signals determine the magnitude of T cell responses to the antigen, and whether this response activates or inactivates subsequent responses to the antigen (Mueller et al. (1989) Annu. Rev. Immunol. 7: 445-480).

T клетъчно активиране в отсъствието на костимулиране води до несполучлив, или anergic Т клетъчен отговор (Schwartz, R. Н. (1992) Cell 71:1065-1068). Един ключов костимулаторен сигнал се осигурява чрез взаимодействие на Т клетъчния повърхностен рецептор CD28 с В7 свързани молекули на антиген представящи клетки (например, също така известни като С В7-1 и В7-2, или CD80 и CD86, съответно) (Р. Linsley and J.T cell activation in the absence of costimulation results in an unsuccessful or anergic T cell response (Schwartz, R. H. (1992) Cell 71: 1065-1068). One key costimulatory signal is provided by the interaction of the T cell surface receptor CD28 with B7-linked antigen presenting molecule cells (e.g., also known as C B7-1 and B7-2, or CD80 and CD86, respectively) (P. Linsley and J.

Ledbetter (1993) Annu. Rev. Immunol. 11:191-212).Ledbetter (1993) Annu. Rev. Immunol. 11: 191-212).

Молекулата, известна сега като CD80 (В7-1) е описана оригинално като асоцииран с човешка В клетка активационен антиген (Yokochi, Т et al. (1981) J. Immunol. 128:823-827; Freeman, G. J. et al. (1989) J. Immunol 143:2714-2722), и в последствие идентифициран като противорецептор за свързани с Т клетки молекули CD28 и CTLA4 (Linsley, Р., et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5031-5035; Linsley, P. S. et al. (1991a) J. Exp. Med. 173:721-730; Linsley, P. S. et al. (1991b) J. Exp. Med. 174:561-570).The molecule now known as CD80 (B7-1) has been described originally as being associated with a human B cell activating antigen (Yokochi, T et al. (1981) J. Immunol. 128: 823-827; Freeman, GJ et al. (1989) J. Immunol 143: 2714-2722), and subsequently identified as a counterreceptor for T cell-bound CD28 and CTLA4 molecules (Linsley, P., et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5031 -5035; Linsley, PS et al. (1991a) J. Exp. Med. 173: 721-730; Linsley, PS et al. (1991b) J. Exp. Med. 174: 561-570).

В последно време, друг противорецептор за CTLA4 е идентифициран с антиген представящи клетки (Azuma, N. et al. (1993) Nature 366:76-79; Freeman (1993a) Science 262:909-911; Freeman, G. J. et al. (1993b) J. Exp. Med. 178:2185-2192; Hathcock, K. L. S., et al. (1994) J. Exp. Med. 180:631-640; Lenschow, D. J. et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1105411058; Ravi-Wolf, Z., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11182-11186; Wu, Y. et al. (1993) J. Exp. Med. 178:1789-1793;). Тази молекула, известна сега като CD86 (Caux, С., et al. (1994)Recently, another antireceptor for CTLA4 has been identified with antigen presenting cells (Azuma, N. et al. (1993) Nature 366: 76-79; Freeman (1993a) Science 262: 909-911; Freeman, GJ et al. ( 1993b) J. Exp Med 178: 2185-2192; Hathcock, KLS, et al. (1994) J. Exp Med 180: 631-640; Lenschow, DJ et al., (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90: 1105411058; Ravi-Wolf, Z., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11182-11186; Wu, Y. et al. (1993) J. Exp. Med 178: 1789-1793;). This molecule, now known as CD86 (Caux, C., et al. (1994)

J. Exp. Med. 180:1841-1848), но също така наричана B7-0 (Azuma et al., (1993), supra), или B7-2 (Freeman et al., (1993a), supra), споделя приблизително 25 % идентичност на последователност с CD80 в неговата извънклетъчна област (Azuma et al., (1993), supra; Freeman et al., (1993a), supra, (1993b), supra). СО86-трансфектирани клетки изстрелват СО28-медиирани Тклетъчни отговори (Azuma et al., (1993), supra; Freeman et al., (1993a), supra, (1993b), supra).J. Exp. Med. 180: 1841-1848), but also called B7-0 (Azuma et al., (1993), supra), or B7-2 (Freeman et al., (1993a), supra), shares approximately 25% identity of sequence with CD80 in its extracellular region (Azuma et al., (1993), supra; Freeman et al., (1993a), supra, (1993b), supra). CD86-transfected cells shoot CD28-mediated cellular responses (Azuma et al., (1993), supra; Freeman et al., (1993a), supra, (1993b), supra).

Сравнения на експресирането на CD80 и на CD86 са били предмет на няколко изследвания (Azuma et al., (1993), supra; W Hathcock, et al. (1994) supra; Larsen, C. P., et al. (1994) J.Comparisons of CD80 and CD86 expression have been the subject of several studies (Azuma et al., (1993), supra; W Hathcock, et al. (1994) supra; Larsen, C. P., et al. (1994) J.

Immunol. 152:5208-5219; Stack, R. M., et al., (1994) J. Immunol. 152:5723-5733). Последни данни сочат, че експресирането на CD80 и на CD86 се регулират разделно, и подсказва, че експресията на CD86 има тензенцията да предшества експресията на CD80 по време на имунен отговор.Immunol. 152: 5208-5219; Stack, R. M., et al., (1994) J. Immunol. 152: 5723-5733). Recent data indicate that CD80 and CD86 expression are regulated separately and suggest that CD86 expression tends to pre-express CD80 expression during an immune response.

Разтворими форми на CD28 и CTLA4 са конструирани чрез сливане на променливи (у)-подобни извънклетъчни домени на CD28 и CTLA4 към имуноглобулин (lg) константни домени, което води до CD28lg и CTLA4lg. CTLA4lg свързва и CD80 ^ч* позитивни и CD86 позитивни клетки по-здраво отколкотоSoluble forms of CD28 and CTLA4 are constructed by fusion of variable (y) -like extracellular domains of CD28 and CTLA4 to immunoglobulin (Ig) constant domains, resulting in CD28Ig and CTLA4Ig. CTLA4Ig binds both CD80 ^h * positive and CD86 positive cells more strongly than

CD28lg (Linsley, Р. et al. (1994) Immunity 1:793-80). Много T клетъчно-зависими отговори се блокират чрез CTLA4lg и in vitro и in vivo. (Linsley, et al., (1991b), supra; Linsley, P. S. et al., (1992a) Science 257:792-795; Linsley, P. S. et al., (1992b), J. Exp. Med. 176:1595-1604; Lenschow, D. J. et al. (1992), Science 257:789-792; Tan, P. et al., (1992) J. Exp. Med. 177:165-173; Turka, L. A., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11102-11105).CD28lg (Linsley, R. et al. (1994) Immunity 1: 793-80). Many T cell-dependent responses are blocked by CTLA4Ig both in vitro and in vivo. (Linsley, et al., (1991b), supra; Linsley, PS et al., (1992a) Science 257: 792-795; Linsley, PS et al., (1992b), J. Exp. Med. 176: 1595 -1604; Lenschow, DJ et al. (1992), Science 257: 789-792; Tan, P. et al., (1992) J. Exp. Med. 177: 165-173; Turka, LA, (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 11102-11105).

Peach et al., (J. Exp. Med. (1994) 180:2049-2058) идентифицираха области в CTLA4 извънклетъчния домен, които са важниPeach et al., (J. Exp. Med. (1994) 180: 2049-2058) identified regions in the CTLA4 extracellular domain that are important

за здравото свързване към CD80. Специфично, хексапептиден мотив (MYPPPY (SEQ ID NO: 9)) в определящата комплементарността област 3 (СОРЗ)-подобна област, е идентифицирана като напълно запазена във всички CD28 и CTLA4 членове на фамилията. Аланин сканираща мутагенеза посредством MYPPPY (SEQ ID N0:9) мотив в CTLA4 и при избрани участъци в CD28lg, намалява или премахва свързването с CD80.for a healthy connection to the CD80. Specifically, a hexapeptide motif (MYPPPY (SEQ ID NO: 9)) in the complementarity-determining region 3 (COP3) -like region has been identified as fully conserved in all CD28 and CTLA4 members of the family. Alanine scanning mutagenesis using the MYPPPY (SEQ ID NO: 9) motif in CTLA4 and at selected sites in CD28lg, reduces or eliminates binding to CD80.

Конструирани са също химерни молекули, разменящи хомоложни области от CTLA4 и CD28. Молекули HS4, HS4-A и HS4В са конструирани чрез присадка на CDRS-подобни области от CTLA4, които също включват една крайна карбокси част, които са удължени за да включват някои не съхранени аминокиселинни остатъци върху CD28lg. Тези хомоложни мутанти показват поголяма свързваща склонност към CD80 отколкото към CD28lg.Chimeric molecules are also constructed to exchange homologous regions of CTLA4 and CD28. The HS4, HS4-A, and HS4B molecules are constructed by grafting into CDRS-like regions of CTLA4, which also include one terminal carboxy moiety, which is elongated to include some non-conserved amino acid residues on CD28lg. These homologous mutants show a greater binding tendency to CD80 than to CD28lg.

В друга група химерни хомоложни мутанти, CDR1подобната област на CTLA4, която не е съхранена в CD28 и се предсказва, че е пространствено съседна на СОРЗ-подобната област, е присадена в HS4 и HS4-A. Тези химерни хомоложни мутантни молекули (обозначени HS7 и HS8) показват дори поголяма склонност за свързване с CD80 отколкото с CD28lg.In another group of chimeric homologous mutants, the CDR1-like region of CTLA4, which is not stored in CD28 and is predicted to be spatially adjacent to the COP3-like region, is grafted into HS4 and HS4-A. These chimeric homologous mutant molecules (designated HS7 and HS8) show an even greater tendency to bind to CD80 than to CD28Ig.

Създадени са също химерни хомоложни мутантни молекули чрез присадка в HS7 и HS8 СОР2-подобната област на CTLA4, но тази комбинация не подобрява по-нататък готовността за свързване с CD80. Така, MYPPPY мотивът на CTLA4 и CD28 е определен като критичен за свързване с CD80, но не-съхранени аминокиселинни остатъци в CDR1- и CDRS-подобните области на CTLA4 също са отговорни за повишената готовност за свързване на CTLA4 с CD80.Chimeric homologous mutant molecules have also been created by grafting into the HS7 and HS8 COP2-like region of CTLA4, but this combination does not further improve the CD80 binding readiness. Thus, the MYPPPY motif of CTLA4 and CD28 has been identified as critical for binding to CD80, but non-conserved amino acid residues in the CDR1 and CDRS-like regions of CTLA4 are also responsible for the increased readiness for binding of CTLA4 to CD80.

CTLA4lg е показал, че свързва ефективно CDSO-асоциирано Т клетъчно ко-стимулиране, но не е така ефективен при блокиране на СО86-асоциирани отговори. Разтворими CTLA4 мутантни молекули, по-специално тези, които имат по-висока готовност за CD86, отколкото див тип CTLA4, са конструирани като възможно по-добре способни да блокират прайминга на антиген специфично активирани клетки, отколкото CTLA4lg.CTLA4Ig has been shown to bind effective CDSO-associated T cell co-stimulation but is not as effective at blocking CD86-associated responses. Soluble CTLA4 mutant molecules, in particular those having a higher CD86 readiness than wild-type CTLA4, have been engineered to be better able to block the priming of antigen by specifically activated cells than CTLA4Ig.

Остава необходимостта от подобряване на CTLA4 молекули, за да се осигурят по-добри фармацевтични състави за имунна супресия и лечение на рак, отколкото известните преди С това разтворими форми на CTLA4.There remains a need to improve CTLA4 molecules to provide better pharmaceutical compositions for immune suppression and treatment of cancer than previously known soluble forms of CTLA4.

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТОSUMMARY OF THE INVENTION

Съгласно всичко това, изобретението предоставя разтворими CTLA4 мутантни молекули, които свързват CD80 и/или CD86. Мутантните молекули съгласно изобретението включват тези, които могат да разпознават и да свързват било CD80, било CD86, или и двата. Съгласно някои варианти за изпълнение на изобретението, мутантните молекули, свързват CD80 и/или CD86 с по-голяма готовност, отколкото CTLA4.Accordingly, the invention provides soluble CTLA4 mutant molecules that bind CD80 and / or CD86. The mutant molecules of the invention include those that can recognize and bind either CD80, or CD86, or both. In some embodiments, the mutant molecules bind CD80 and / or CD86 more readily than CTLA4.

Един пример за CTLA4 мутантна молекула е L104EA29Ylg (фигура 7), както се описва тук. Друг пример за CTLA4 мутантна молекула е L104Elg (фигура 8), както се описва тук. L104EA29Ylg и L104Elg свързват CD80 и CD86 с по-голяма склонност, отколкото CTLA4lg.One example of a CTLA4 mutant molecule is L104EA29Ylg (Figure 7) as described herein. Another example of a CTLA4 mutant molecule is L104Elg (Figure 8) as described herein. L104EA29Ylg and L104Elg bind CD80 and CD86 with greater propensity than CTLA4lg.

КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ФИГУРИТЕBRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

Фигура 1 показва изследване на равновесие на свързване на L104EA29Ylg и L104Elg, и див тип CTLA4lg към CD86lg.Figure 1 shows a binding equilibrium study of L104EA29Ylg and L104Elg, and wild-type CTLA4lg to CD86lg.

Фигури 2А & 2В илюстрират данни от FACS изследвания, показващи свързване на L104EA29Ylg, L104Elg и CTLA4lg с човешки CD80- или СО86-трансфекгирани СНО клетки, както е описано в Пример 2, по-долу.Figures 2A & 2B illustrate data from FACS assays showing binding of L104EA29Ylg, L104Elg and CTLA4lg to human CD80- or CD86-transfected CHO cells, as described in Example 2, below.

Фигури ЗА & ЗВ представят инхибиране пролиферацията на CDeO-положителни и СО86-положителни СНО клетки, както е описано в Пример 2, по-долу.Figures 3A and 3B represent the inhibition of the proliferation of CDeO-positive and CD86-positive CHO cells, as described in Example 2, below.

Фигури 4А & 4В показват, че L104EA29Ylg е по-ефективен от CTLA4lg при инхибиране пролиферацията на първично и вторично ало-стимулирани Т клетки, както е описано в Пример 2, подолу.Figures 4A and 4B show that L104EA29Ylg is more effective than CTLA4lg in inhibiting the proliferation of primary and secondary allo-stimulated T cells, as described in Example 2, infra.

Фигури 5А-С илюстрират, че L104EA29Ylg е по-ефективен от CTLA4lg при инхибиране IL-2 (Фиг. 5А), IL-4 (Фиг. 5В) и γ-интерферон (Фиг. 5С) цитокин продукцията на ало-стимулирани човешки Т клетки, както е описано в Пример 2, по-долу.Figures 5A-C illustrate that L104EA29Ylg is more effective than CTLA4lg in inhibiting IL-2 (Fig. 5A), IL-4 (Fig. 5B) and γ-interferon (Fig. 5C) cytokine production of allo-stimulated human T cells as described in Example 2, below.

Фигура 6 демонстрира, че L104EA29Ylg е по-ефективен от CTI_A4lg при инхибиране пролиферацията на фитохемаглутинин(РНА) стимулирани маймунски Т клетки, както е описано в Пример 2, по-долу.Figure 6 demonstrates that L104EA29Ylg is more effective than CTI_A4lg in inhibiting the proliferation of phytohaemagglutinin (PHA) stimulated monkey T cells, as described in Example 2, below.

Фигура 7 представя нукпеотидна и аминокиселинна последователност (SEQ ID NOS: 3 и 4, съответно) на CTLA4 мутантна молекула (L104EA29Ylg), съдържаща сигнален пептид; мутиран извънклетъчен домен на CTLA4, започващ при метионин в позиция +1 и завършващ при аспаргинова киселина в позиция +124, или започващ при аланин в позиция -1 и завършващ при аспаргинова киселина в позиция +124; и една lg област, както е описано в Пример 1, по-долу.Figure 7 represents the nucleotide and amino acid sequence (SEQ ID NOS: 3 and 4, respectively) of a CTLA4 mutant molecule (L104EA29Ylg) containing a signal peptide; a mutated extracellular domain of CTLA4 starting at methionine at position +1 and ending at aspartic acid at position +124, or starting at alanine at position -1 and ending at aspartic acid at position +124; and an Ig region as described in Example 1, below.

Фигура 8 представя нуклеотидна и аминокиселинна последователност (SEQ ID NOS: 5 и 6, съответно) на CTLA4 мутантна молекула (L104Elg) съдржаща сигнален пептид; мутиран извънклетъчен домен на CTLA4Figure 8 represents the nucleotide and amino acid sequence (SEQ ID NOS: 5 and 6, respectively) of a CTLA4 mutant molecule (L104Elg) containing a signal peptide; CTLA4 mutant extracellular domain

започващ при метионин в позиция +1 и завършващ при аспаргинова киселина в позиция +124, или започващ при аланин в позиция -1 и завършващ при аспаргинова киселина в позиция +124; и една lg област, както е описано в Пример 1, по-долу.starting at methionine at position +1 and ending at aspartic acid at position +124, or starting at alanine at position -1 and ending at aspartic acid at position +124; and an Ig region as described in Example 1, below.

Фигура 9 представя нуклеотидна и аминокиселинна последователност (SEQ ID NOS: 7 и 8, съответно) на CTLA4lg, съдържаща сигнален пептид; див тип аминокиселинна последователност на извънклетъчния домен на CTLA4, започваща при метоинин в позиция +1 до аспаргинова киселина в позиция +124, или започваща при аланин в позиция -1 до аспаргинова киселина в позиция +124; и една lg област.Figure 9 represents the nucleotide and amino acid sequence (SEQ ID NOS: 7 and 8, respectively) of CTLA4Ig containing a signal peptide; wild-type amino acid sequence of the extracellular domain of CTLA4 starting at methoinin at position +1 to aspartic acid at position +124, or starting at alanine at position -1 to aspartic acid at position +124; and one lg area.

Фигури 10А-С са SDS гел (Фиг. 10А) за CTI_A4lg (ивица 1), L104Elg (ивица 2) и L104EA29Ylg (ивица 3); гелово проникваща хроматография на CTLA4lg (Фиг. 10В) и L104EA29Ylg (Фиг. 10С).Figures 10A-C are SDS gel (Fig. 10A) for CTI_A4lg (lane 1), L104Elg (lane 2) and L104EA29Ylg (lane 3); gel penetration chromatography of CTLA4Ig (Fig. 10B) and L104EA29Ylg (Fig. 10C).

Фигура 11 илюстрира лентова диаграма (лява страна) на CTLA4 извънклетъчно lg V-подобно нагъване, генерирано от структурата в разтвор, определена с NMR спектроскопия. Дясната страна на фиг. 11 показва разширен изглед на S25-R33 областта и MYPPPY (SEQ ID NO: 9) областта, показващ местоположението и ориентация на странична верига на мутации повишаващи готовността, L104 и А29.Figure 11 illustrates a band diagram (left side) of CTLA4 extracellular Ig-V folding generated by the structure in solution as determined by NMR spectroscopy. The right side of FIG. 11 shows an expanded view of the S25-R33 region and the MYPPPY (SEQ ID NO: 9) region, showing the location and orientation of a side chain of mutation-enhancing mutations, L104 and A29.

Фигура 12 изобразява схематична диаграма на вектор, piLNLEA29Y, притежаващ L104EA29Ylg инсерт.Figure 12 depicts a schematic diagram of a vector, piLNLEA29Y having an L104EA29Ylg insert.

ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТОDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

ДЕФИНИЦИИDEFINITIONS

Така като се използват в това описание, следните думи или фрази имат специфични значения.As used in this description, the following words or phrases have specific meanings.

Така, както се използува тук “див тип CTLA4” има амино киселинна последователност от естествен произход, пълна дължина на CTLA4 (U. S. Patent Nos. 5,434,131, 5,844,095, 5,851,795), или неговия извънклетъчен домен, който свързва CD80 и/или CD86, и/или интерферира с CD80 и/или CD86, като свързва техните лиганди. Съгласно по-специални варианти за изпълнение, извънклетъчният домен на див тип CTLA4 започва с метионин на позиция +1, и завършва при аспарагинова киселина на позиция +124, или извънклетъчният домен на див тип CTLA4 започва с аланин на позиция -1 и завършващ при аспарагинова киселина на позиция +124. Див тип CTLA4 е повърхностен клетъчен протеин, имащ N-терминален извънклетъчен домен, трансмембранен домен, и С-терминален цитоплазмен домен. Извънклетъчният домен се свързва към насочени антигени, такива като CD80 и CD86. В клетка, срещаща се в природата, див тип CTLA4 протеин се транслира като незрял полипептид, който включва сигнален пептид на N-терминалния край. Незрелият полипептид претърпява пост-транслационно преобразуване, което включва разцепване и отнемане на сигналния пептид, за да се генерира продукт от CTLA4 разцепване, имащ ново-генериран N-терминален край, който се различава от N-терминалния край в незрялата форма. Специалистите в областта на техниката ще преценят, че могат да се появат допълнително пост-транслационно преобразуване, което отнема една, или повече от амино киселините от новогенерирания N-терминален край на продукта от CTLA4 разцепване. Зрялата форма на CTLA4 молекулата включва извънклетъчния домен на CTLA4, или която и да е негова част, която се свързва към CD80 и/или CD86.As used herein, "wild-type CTLA4" has a full-length amino acid sequence of CTLA4 (US Patent Nos. 5,434,131, 5,844,095, 5,851,795), or an extracellular domain that binds CD80 and / or CD86, and / or interfere with CD80 and / or CD86 by binding their ligands. According to more specific embodiments, the extracellular domain of wild-type CTLA4 begins with methionine at position +1 and ends at aspartic acid at position +124, or the extracellular domain of wild-type CTLA4 begins with alanine at position -1 and ending at asparagine acid at position +124. Wild-type CTLA4 is a cell surface protein having an N-terminal extracellular domain, a transmembrane domain, and a C-terminal cytoplasmic domain. The extracellular domain binds to targeted antigens such as CD80 and CD86. In a naturally occurring cell, wild-type CTLA4 protein is translated as an immature polypeptide that includes the N-terminal end peptide signal peptide. The immature polypeptide undergoes a post-translational transformation that involves cleavage and withdrawal of the signal peptide to generate a CTLA4 cleavage product having a newly generated N-terminal end that differs from the N-terminal end in the immature form. Those of skill in the art will appreciate that additional post-translational transformation may occur that takes one or more of the amino acids from the newly generated N-terminal end of the CTLA4 cleavage product. The mature form of the CTLA4 molecule includes the extracellular domain of CTLA4, or any part thereof, that binds to CD80 and / or CD86.

s “CTLA4lg” е разтворим слят протеин, включващ един извънклетъчен домен на див тип CTLA4, или част от него, който свързва CD80 и/или CD86, присъединен с една Ig опашка. Поспециален вариант на изпълнение включва извънклетъчния домен на див тип CTLA4, започващ при метионин в позиция +1 и завършващ при аспаргинова киселина в позиция +124; или започващ при аланин в позиция - 1 при аспаргинова киселина в позиция +124; свързващ аминокиселинен остатък глутамин в позиция +125; и една имуноглобулинова част обхващаща глутаминова киселина в позиция С +126, чрез лизин в позиция +357 (Фигура 9; SEQ ID NO: 8).s "CTLA4lg" is a soluble fusion protein comprising an extracellular domain of wild-type CTLA4, or a portion thereof, that binds CD80 and / or CD86 attached to an Ig tail. A particular embodiment includes the extracellular domain of the wild-type CTLA4, beginning at methionine at position +1 and ending at aspartic acid at position +124; or starting at alanine at position - 1 for aspartic acid at position +124; a glutamine binding amino acid residue at position +125; and an immunoglobulin moiety comprising glutamic acid at position C +126 via lysine at position +357 (Figure 9; SEQ ID NO: 8).

Така както се използва тук, “слят протеин” се дефинира като една или повече аминокиселинни последователности, които са свързани заедно, като са използвани добре известни методи в тази област, както е описано в U.S. Pat.No. 5,434,131 или 5,637,481. При това свързаните аминокиселинни последователности образуват един слят протеин.As used herein, "fusion protein" is defined as one or more amino acid sequences that are linked together using well known methods in the art, as described in U.S. Pat. Pat.No. No. 5,434,131 or 5,637,481. The linked amino acid sequences form a fusion protein.

Така както се използва тук, “CTLA4 мутантна молекула” е молекула, която може да бъде пълноверижен CTLA4 или част от него (производни или фрагменти), които имат една мутация или множествени мутации в CTLA4 (предпочитано в извънклетъчния домен на CTLA4), така че тя е сходна, но не е идентична с дивия тип CTLA4 молекула. CTLA4 мутантни молекули свързват или CD80 или CD86, или и двата. Мутантни CTLA4 молекули могат да включват една биологично или химично активна не-СТ1_А4 молекула в тях или прикачена към тях. Мутантните молекули могат да бъдат разтворими (т.е. циркулиращи) или прикрепени към повърхност. CTLA4 мутантни молекули могат да включват целия извънклетъчен домен на CTLA4 или част от него, например фрагменти или производни. Мутантните молекули CTLA4 могат да са получени синтетично, или рекомбинантно.As used herein, a "CTLA4 mutant molecule" is a molecule that can be a full-chain CTLA4 or part of it (derivatives or fragments) that have a single mutation or multiple mutations in CTLA4 (preferably in the extracellular domain of CTLA4), so it is similar but not identical to the wild-type CTLA4 molecule. CTLA4 mutant molecules bind either CD80 or CD86 or both. Mutant CTLA4 molecules can include or attach to a biologically or chemically active non-CT1_A4 molecule in them. The mutant molecules may be soluble (i.e. circulating) or attached to the surface. CTLA4 mutant molecules may include the entire extracellular domain of CTLA4 or a portion thereof, for example fragments or derivatives. CTLA4 mutant molecules can be synthetically or recombinantly produced.

Така, както се използува тук, терминът “мутация” е промяна в нуклеотидната, или в амино киселинната последователност на див-тип полипептид. В този случай, има промяна в извънклетъчния домен на див тип CTLA4. Промяната може да е промяна на амино киселина, което включва замествания, елиминирания, добавяния, или окастряния. Мутантната молекула може да има една, или повече мутации. Мутации в нуклеотидна последователност могат да доведат до, или могат да не доведат до мутация в амино киселинната последователност, което се разбира добре в областта на техниката. В този смисъл, някои нуклеотидни кодони кодират същата амино киселина. Примерите включват нуклеотидни кодони CGU, CGG, CGC, и CGA кодиращи амино киселината, аргинин (R); или кодони GAU и GAC кодиращи амино киселината, аспарагинова киселина (D). Така, протеинът може да се кодира от една, или от повече молекули нуклеинова киселина, които се различават в тяхната специфична нуклеотидна последователност, но все пак кодират молекули протеин, имащи идентични последователности. Последователността кодираща амино киселинна е както следва:As used herein, the term "mutation" is a change in the nucleotide or amino acid sequence of a wild-type polypeptide. In this case, there is a change in the extracellular domain of wild-type CTLA4. The change may be a change in an amino acid that includes substitutions, eliminations, additions, or prunes. The mutant molecule may have one or more mutations. Mutations in the nucleotide sequence may or may not lead to a mutation in the amino acid sequence that is well understood in the art. In this sense, some nucleotide codons encode the same amino acid. Examples include the nucleotide codons CGU, CGG, CGC, and CGA encoding the amino acid, arginine (R); or GAU and GAC codons encoding the amino acid, aspartic acid (D). Thus, the protein may be encoded by one or more nucleic acid molecules that differ in their specific nucleotide sequence, but still encode protein molecules having identical sequences. The amino acid coding sequence is as follows:

Амино Amino Символ Symbol Знак с Sign with Кодони Codons киселина acid една буква one letter Аланин Alanine AI AI А A GCU, GCC, GCA, GCG GCU, GCC, GCA, GCG Цистеин Cysteine Cys Cys С P UGU, UGC UGU, UGC Аспарагинова Asparagine Asp Asp D D GAU, GAC GAU, GAC

киселинаacid

Глутаминова Glutamine GLU GLU E E GAA GAG GAA GAG Киселина Фенилаланин Acid Phenylalanine Phe Phe F F UUU, UUC UUU, UUC Глицин Glycine Gly Gly G Mr GGU, GGC, GGA, GGG GGU, GGC, GGA, GGG Хистидин Histidine His His H H CAU, CAC CAU, CAC Изолевцин Isoleucine lie lie I I AUU, AUC, AUA AUU, AUC, AUA Лизин Lysine Lys Lys K K AAA, AAG AAA, AAG Левцин Levcin Leu Leu L L UUA, UUG, CUU, CUC, UUA, UUG, CUU, CUC, Метионин Methionine Met Met M M CUA, CUG AUG CUA, CUG AUG Аспаргин Asparagine Asn Asn N N AAU, AAC AAU, AAC Пролин Proline Pro Pro P P CCU, CCC, CCA, CCG CCU, CCC, CCA, CCG Глутамин Glutamine Gin Gin Q Q CAA, CAG CAA, CAG Аргинин Arginine Arg Arg R R CGU, CGC, CGA, CGG CGU, CGC, CGA, CGG Серин Serine Ser Sir S S AGA, AGG UCU, UCC, UCA, ACG AGA, AGG UCU, UCC, UCA, ACG Треонин Threonine Thr Thr T T AGU, AGC ACU, ACC, ACA, ACG AGU, AGC ACU, ACC, ACA, ACG Валин Valine Val Val V V GUU, GUC, GUA, GUG GUU, GUC, GUA, GUG Триптофан Tryptophan Trp Trp w w UGG UGG Тирозин Tyrosine Tyr Tyr Y Y UAU, UAC UAU, UAC

Както се използва тук “извънклетъчният домен на CTLA4” е част от CTLA4, който разпознава и свързва CD80 и/или CD86. Например, извънклетъчен домен на CTLA4 включва метионин в позиция +1 до аспаргинова киселина в позиция +124 (Фигура 9, SEQ ID N0:8 ). Алтернативно, извънклетъчният домен на CTLA4 включва аланин в позиция - 1 до аспаргинова киселина в позиция +124 (Фигура 9; SEQ ID N0:8). Извънклетъчният домен включва фрагменти, или производни на CTLA4, които свързват CD80 и/или CD86.As used herein, the "extracellular domain of CTLA4" is part of CTLA4 that recognizes and binds CD80 and / or CD86. For example, the extracellular domain of CTLA4 includes methionine at position +1 to aspartic acid at position +124 (Figure 9, SEQ ID NO: 8). Alternatively, the extracellular domain of CTLA4 includes alanine at position-1 to aspartic acid at position +124 (Figure 9; SEQ ID NO: 8). The extracellular domain includes fragments or derivatives of CTLA4 that bind CD80 and / or CD86.

Както се използува тук “не-СТ1_А4 протеин последователност”, или “молекула не-СТ1_А4” се дефинира като която и да е молекула, която не свързва CD80 и/или CD86, и не интерферира със свързването на CTLA4 до неговата мишена. Един пример включва, но не се ограничава от, имуноглобулин (Ig) константна област, или част от нея. За предпочитане, Ig константната област е човешка, или маймунска Ig константна област, например, човешки С(гама)1, включващ СН2 и СНЗ области. Ig константната област може да е мутирала, за да редуцира нейните ефекторни функции (U. S. Patent Nos: 5,637,481; и 6,132,992).As used herein, a "non-CT1_A4 protein sequence" or "non-CT1_A4 molecule" is defined as any molecule that does not bind CD80 and / or CD86, and does not interfere with the binding of CTLA4 to its target. One example includes, but is not limited to, an immunoglobulin (Ig) constant region, or a portion thereof. Preferably, the Ig constant region is a human or monkey Ig constant region, for example, a human C (gamma) 1 comprising CH2 and CH3 regions. The Ig constant region may have been mutated to reduce its effector functions (U. S. Patent Nos: 5,637,481; and 6,132,992).

Както се използува тук “фрагмент от CTLA4 мутантна молекула” е част от CTLA4 мутантна молекула, за предпочитане извънклетъчния домен на CTLA4, или част от него, която разпознава и свързва неговата мишена, например, CD80 и/или CD86.As used herein, a "fragment of a CTLA4 mutant molecule" is part of a CTLA4 mutant molecule, preferably an extracellular domain of CTLA4, or a part of it that recognizes and binds its target, for example, CD80 and / or CD86.

Както се използува тук “производно на CTLA4 мутантна молекула” е молекула, която ангажира най-малко със 70% сходство на последователност и функции подобни на извънклетъчен домен на CTLA4, тоест, тя разпознава и свързва CD80 и/или CD86.As used herein, a "derivative of a CTLA4 mutant molecule" is a molecule that engages at least 70% sequence similarity and functions similar to the extracellular domain of CTLA4, that is, it recognizes and binds CD80 and / or CD86.

Както се използува тук “част от CTLA4 молекула” включва фрагменти и производни на CTLA4 молекула, които свързват CD80 и/или CD86.As used herein, a "portion of a CTLA4 molecule" includes fragments and derivatives of a CTLA4 molecule that bind CD80 and / or CD86.

С цел по-пълно да се разбере описаното тук изобретение, правят се следните описания.In order to better understand the invention described herein, the following descriptions are made.

СЪСТАВИ СЪГЛАСНО ИЗОБРЕТЕНИЕТОMAKE IT IN ACCORDANCE WITH THE INVENTION

Настоящето изобретение предоставя разтворими CTLA4 молекули, които разпознават и свързват CD80 и/или CD86. В някои изпълнения, разтворимите CTLA4 мутанти имат по-голяма склонност към CD80 и/или CD86 в сравнение с CTLA4lg.The present invention provides soluble CTLA4 molecules that recognize and bind CD80 and / or CD86. In some embodiments, soluble CTLA4 mutants have a greater tendency for CD80 and / or CD86 than CTLA4Ig.

Примери за CTLA4 мутантни молекули включват L104EA29Ylg (Фигура 7; SEQ ID NOS: 3 и 4). Аминокиселинната последователност на L104EA29Ylg може да започва при аланин в аминокиселинна позиция -1 и да завършва при лизин в аминокиселинна позиция +357. По избор, аминокиселинната последователност на L104EA29Ylg може да започва при метионин в аминокиселинна позиция +1 и да завършва при лизин в аминокиселинна позиция +357. CTLA4 частта от L104EA29Ylg обхваща метионин в аминокиселинна позиция +1 чрез аспарагинова киселина в аминокиселинна позиция +124. L104EA29Ylg включва свързващ аминокиселинен остатък глутамин в позиция +125 и имуноглобулинова част, обхващаща глугаминова киселина в позиция +126 до лизин в позиция +357 (Фигура 7; SEQ ID N0:4) L104EA29Ylg се свързва с приблизително 2-кратно по-голяма склонност, отколкото див тип CTLA4lg (тук по-долу обозначен като CTLA4lg) с CD80 и приблизително 4-кратно с по-голяма склонност с CD86. Това по-силно свързване води до това, че L104EA29Ylg става по-чувствителен, отколкото CTLA4lg при блокиране на имунни отговори.Examples of CTLA4 mutant molecules include L104EA29Ylg (Figure 7; SEQ ID NOS: 3 and 4). The amino acid sequence of L104EA29Ylg may start at alanine at amino acid position -1 and end at lysine at amino acid position +357. Optionally, the amino acid sequence of L104EA29Ylg may start at methionine at amino acid position +1 and end at lysine at amino acid position +357. The CTLA4 portion of L104EA29Ylg encompasses methionine at amino acid position +1 via aspartic acid at amino acid position +124. L104EA29Ylg includes a glutamine binding amino acid residue at position +125 and an immunoglobulin moiety comprising glugamic acid at position +126 to lysine at position +357 (Figure 7; SEQ ID NO: 4) L104EA29Ylg binds approximately 2-fold more than wild-type CTLA4Ig (hereinafter referred to as CTLA4Ig) with CD80 and approximately 4-fold more likely to have CD86. This stronger binding causes the L104EA29Ylg to become more sensitive than CTLA4lg when blocking immune responses.

CTLA4 мутантни молекули съдържат най-малко извънклетъчния домен на CTLA4, или части от него, които свързват CD80 и/или CD86. Извънклетъчната част на CTLA4 мутантна молекула съдържа аминокиселинна последователност, започваща с метионин в позиция +1 до аспаргинова киселина в позиция +124(Фигура 7 (SEQ ID N0:4) или Фигура 8 (SEQ ID N0:6)). По избор, извънклетъчната част на CTLA4 може да включва аминокиселинна последователност започваща с аланин в позиция 1 до аспарагинова киселина в позиция +124 (Фигура 7 (SEQ ID N0:4) или Фигура 8 (SEQ ID N0:6)).CTLA4 mutant molecules contain at least the extracellular domain of CTLA4, or portions thereof, that bind CD80 and / or CD86. The extracellular portion of the CTLA4 mutant molecule contains an amino acid sequence starting with methionine at position +1 to aspartic acid at position +124 (Figure 7 (SEQ ID NO: 4) or Figure 8 (SEQ ID NO: 6)). Optionally, the extracellular portion of CTLA4 may include an amino acid sequence starting with alanine at position 1 to aspartic acid at position +124 (Figure 7 (SEQ ID NO: 4) or Figure 8 (SEQ ID NO: 6)).

В едно изпълнение, разтворимата CTLA4 молекула е слят белтък, съдържащ извънклетъчния домен на CTLA4, притежаващ една или повече мутации в една област на аминокиселинна последователност, започващ със серин при +25 и завършващ с аргинин при +33 (S25-R33). Например, аланин в позиция +29 на див тип CTLA4 може да бъде заменен с тирозин (кодони: UAU, UAC). По избор, аланин може да бъде заменен с левцин (кодони: UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG), фенилаланин (кодони: UUU, UUC), триптофан (кодон: UGG), или треонин (кодони: ACU, АСС, АСА, ACG). Както специалистите в тази област ще разберат, урацил (U) нуклеотида от РНК последователността съответства на тимидин (Т) нуклеотида на ДНК последователността.In one embodiment, the soluble CTLA4 molecule is a fusion protein containing the extracellular domain of CTLA4 having one or more mutations in one region of an amino acid sequence beginning with serine at +25 and ending with arginine at +33 (S25-R33). For example, alanine at position +29 of wild-type CTLA4 can be replaced by tyrosine (codons: UAU, UAC). Optionally, alanine can be replaced by leucine (codons: UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG), phenylalanine (codons: UUU, UUC), tryptophan (codon: UGG), or threonine (codons: ACU, ACC , ACA, ACG). As those skilled in the art will understand, the uracil (U) nucleotide of the RNA sequence corresponds to the thymidine (T) nucleotide of the DNA sequence.

В друго изпълнение, разтворимата CTLA4 молекула е слят протеин, съдържащ извънклетъчния домен на CTLA4, включващ една или повече мутации във, или близо до област на аминокиселинна последователност, започваща с метионин при +97 и завършваща с глицин при +107 (M97-G107). Например, левцин в позиция +104 на див тип CTLA4 може да бъде заменен с глутаминова киселина (кодони: GAA, GAG). CTLA4 мутантна молекула, съдържаща тази замяна, е обозначена тук като L104Elg (Фигура 8; SEQ ID NOS: 5 и 6).In another embodiment, the soluble CTLA4 molecule is a fusion protein containing the extracellular domain of CTLA4 comprising one or more mutations in or near an amino acid sequence region beginning with methionine at +97 and ending with glycine at +107 (M97-G107) . For example, leucine at position +104 of wild-type CTLA4 may be replaced by glutamic acid (codons: GAA, GAG). The CTLA4 mutant molecule containing this replacement is referred to herein as L104Elg (Figure 8; SEQ ID NOS: 5 and 6).

В друго изпълнение, разтворимата CTLA4 мутантна молекула е слят протеин, включващ извънклетъчния домен на CTLA4 , притежаващ една или повече мутации в S25-R33 и M97-G107 областите. Например, в едно изпълнение, CTLA4 мутантна молекула включва тирозин в позиция +29 вместо аланин; и глутаминова киселина в позиция +104 вместо левцин. CTLA4 мутантна молекула, притежаваща тези замествания е обозначена тук като L104EA29Ylg (Фигура 7; SEQ ID N0: 3 и 4). Молекулата нуклеинова киселина, която кодира L104EA29Ylg се съдържа в pD16L104EA29Ylg и е депозирана на 19 юни 2000 г. с American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Mansas, VA 20110-2209 (ATCC No. PTA-2104). PD16 L104EA29Ylg C векторът е производно на pcDNA3 вектор (INVITROGEN).In another embodiment, the soluble CTLA4 mutant molecule is a fusion protein comprising the extracellular domain of CTLA4 having one or more mutations in the S25-R33 and M97-G107 regions. For example, in one embodiment, a CTLA4 mutant molecule includes tyrosine at position +29 instead of alanine; and glutamic acid at position +104 instead of leucine. The CTLA4 mutant molecule having these substitutions is referred to herein as L104EA29Ylg (Figure 7; SEQ ID NO: 3 and 4). The nucleic acid molecule encoding L104EA29Ylg is contained in pD16L104EA29Ylg and deposited on June 19, 2000 with the American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Mansas, VA 20110-2209 (ATCC No. PTA-2104). The PD16 L104EA29Ylg C vector is a derivative of the pcDNA3 vector (INVITROGEN).

Изобретението, освен това, предоставя разтворима CTLA4 мутантна молекула, съдържаща един извънклетъчен домен на CTLA4 мутант, както е показано във Фигура 7 (SEQ ID NOS: 3 и 4) или Фигура 8 (SEQ ID NOS: 5 и 6), или негова(и) част(и) и един остатък, който променя разтворимостта, афинитета и/или валентността на CTLA4 мутантната молекула.The invention further provides a soluble CTLA4 mutant molecule comprising an extracellular domain of a CTLA4 mutant, as shown in Figure 7 (SEQ ID NOS: 3 and 4) or Figure 8 (SEQ ID NOS: 5 and 6), or ( i) part (s) and one residue that alters the solubility, affinity and / or valence of the CTLA4 mutant molecule.

Съгласно практическо използване на изобретението, остатъкът може да бъде имуноглобулинова константна област или част от нея. За използване in vivo, се предпочита имуноглобулиновата константна област да не предизвиква вредни имунни отговори у индивида. Например, в клинични протоколи, може да се предпочита мутантни молекули да включват човешки или маймунски имуноглобулинови константни области. Пример за подходяща област на имуноглобулин е човешки С (гамма)1, включваща прикачените СН2 и СНЗ области. Възможни са други изотипове. Освен това възможни са други имуноглобулин константни области (предпочитано други слаби или не-имуногенни имуноглобулинови константни области).According to practical use of the invention, the residue may be an immunoglobulin constant region or part thereof. For use in vivo, it is preferred that the immunoglobulin constant region does not elicit deleterious immune responses in the individual. For example, in clinical protocols, it may be preferable for mutant molecules to include human or monkey immunoglobulin constant regions. An example of a suitable immunoglobulin region is human C (gamma) 1, including the attached CH2 and CH3 regions. Other isotypes are possible. In addition, other immunoglobulin constant regions (preferably other weak or non-immunogenic immunoglobulin constant regions) are possible.

Други остатъци включват полипептидни опашки. Примерите за разтворими опашки включват, но не се ограничават до, /*”Other residues include polypeptide tails. Examples of soluble tails include, but are not limited to, / * ”

WW

J**· p97 молекулата, env gp120 молекула, E7 молекула и ova молекула (Dash, B., et al. (1994) J.Gen.Virol. 75:1389-97; Ikeda, T. et al. (1994) Gene 138:193-6; Falk, K. et al. (1993) Cell.lmmunol. 150:447-52; Fujisaka, K. et al. (1994) Virology 204:789-93). Възможни са други молекули за използване като опашки (Gerard, С. et al. (1994) Neuroscience 62:721-739; Byrn, R. et al. J.Virol. (1989) 63:4370-4375; Smith, D. et al., (1987) Science 238:1704-1707; Lasky, L., (1996) Science 233:209-212).J ** · p97 molecule, env gp120 molecule, E7 molecule and this molecule (Dash, B., et al. (1994) J. Gen. Virol. 75: 1389-97; Ikeda, T. et al. (1994) Gene 138: 193-6; Falk, K. et al. (1993) Cell. Immunol. 150: 447-52; Fujisaka, K. et al. (1994) Virology 204: 789-93). Other molecules are available for use as tails (Gerard, C. et al. (1994) Neuroscience 62: 721-739; Byrn, R. et al. J. Virol. (1989) 63: 4370-4375; Smith, D. et al., (1987) Science 238: 1704-1707; Lasky, L., (1996) Science 233: 209-212).

Изобретението, освен това, предоставя разтворими мутантни CTLA4lg слети белтъци, преимуществено по-реактивни с CD80 и/или CD86 антиген, в сравнение с див тип CTLA4. Един пример е L104EA29Ylg, както е показано във Фигура 7(SEQ ID NOS.3 и 4).The invention further provides soluble mutant CTLA4Ig fusion proteins, predominantly more reactive with CD80 and / or CD86 antigen, than wild-type CTLA4. One example is L104EA29Ylg, as shown in Figure 7 (SEQ ID NOS.3 and 4).

В друго изпълнение, разтворимата CTLA4 мутантна молекула включва присъединен аминокиселинен остатък, който е разположен между CTLA4 частта и имуноглобулиновата част. Присъединената аминокиселина може да бъде всяка аминокиселина, включително глутамин. Присъединената аминокиселина може да бъде въведена с молекулярни или синтетични методи, които са известни в тази област.In another embodiment, the soluble CTLA4 mutant molecule comprises an attached amino acid residue that is located between the CTLA4 moiety and the immunoglobulin moiety. The amino acid attached can be any amino acid, including glutamine. The attached amino acid can be introduced by molecular or synthetic methods known in the art.

В друго изпълнение, разтворимата CTLA4 мутантна молекула включва имуноглобулиновата част (например, прикачени, СН2 и СНЗ домени), където някои или всички от цистеиновите остатъци, в прикачения домен на имуноглобулиновата част, са заместени със серин, например цистеините в позиции +130, +136 или +139 (Фигура 7 (SEQ ID N0:4) или Фигура 8 (SEQ ID NO: 6)). Мутантната молекула може също да включва пролина в позиция +148 заместен с един серин, както е показано във Фигура 7 (SEQ ID N0:4) или 8 (SEQ ID N0: 6).In another embodiment, the soluble CTLA4 mutant molecule comprises an immunoglobulin moiety (e.g., attached, CH2 and CH3 domains), where some or all of the cysteine residues, in the immunoglobulin moiety attached domain, are replaced by serine, e.g., cysteines at positions +130, + 136 or +139 (Figure 7 (SEQ ID NO: 4) or Figure 8 (SEQ ID NO: 6)). The mutant molecule may also include proline at position +148 substituted with one serine, as shown in Figure 7 (SEQ ID NO: 4) or 8 (SEQ ID NO: 6).

Разтворимата CTLA4 мутантна молекула може да включва сигнална пептидна последователност, свързани с N-терминалния край на извънклетъчния домен на CTLA4 частта от мутантната молекула. Сигналният пептид може да бъде която и да е последователност, която би дала възможност за секретиране на мутантната молекула, включително сигналният пептид на онкостатин М (Malik, et al., (1989) Molec. Cell. Biol. 9:28472853), r.r CD5 (Jones, N. H. et al., (1986) Nature 323:346-349), или сигналният пептид от който и да е извънклетъчен протеин.The soluble CTLA4 mutant molecule may include a signal peptide sequence associated with the N-terminal end of the extracellular domain of the CTLA4 portion of the mutant molecule. The signal peptide can be any sequence that would allow secretion of the mutant molecule, including the oncostatin M signal peptide (Malik, et al., (1989) Molec. Cell. Biol. 9: 28472853), rr CD5 (Jones, NH et al., (1986) Nature 323: 346-349), or the signal peptide of any extracellular protein.

Мутантна молекула може да включва сигналния пептид на w онкостатин М, свързан към N-терминалния край на извънклетъчния домен на CTLA4, и човешката имуноглобулинова молекула (например, hinge, СН2, и СНЗ), свързани към С-терминалния край на извънклетъчния домен на CTLA4. Тази молекула включва сигналния пептид на онкостатин М, обхващащ амино киселинна последователност, имаща метионин на позиция -26 до аланин на позиция -1, CTLA4 частта, обхващаща амино киселинна последователност, имаща метионин на позиция +1, до аспарагинова киселина на позиция +124, присъединен амино киселинен остатък глутамин на позиция +125, и ^v имуноглобулиновата част, обхващаща амино киселинна последователност, имаща глутаминова киселина на позиция +126, до лизин на позиция +357.A mutant molecule may include the signal peptide of w oncostatin M bound to the N-terminal end of the extracellular domain of CTLA4, and a human immunoglobulin molecule (e.g., hinge, CH2, and CH3) bound to the C-terminal end of the extracellular domain of CTLA4 . This molecule includes the oncostatin M signal peptide comprising an amino acid sequence having methionine at position -26 to alanine at position -1, a CTLA4 moiety comprising an amino acid sequence having methionine at position +1 to aspartic acid at position +124. an attached amino acid glutamine residue at position +125, and a ^v immunoglobulin moiety comprising an amino acid sequence having glutamic acid at position +126 to lysine at position +357.

Разтворимата CTLA4 мутантна молекула съгласно изобретението може да се получи посредством молекулярни, или химически синтетични методи. Молекулярните методи могат да включват следните етапи: въвеждане на подходяща клетка гостоприемник с молекула нуклеинова киселина, която експресира и кодира разтворима CTLA4 мутантна молекула; култивиране на така вкараната клетка гостоприемник при условия, които дават възможност на клетката гостоприемник да експресира мутантни молекули; и изолиране на експресираните мутантни молекули. Частта от сигналния пептид на мутантната молекула дава възможност на белтъчните молекули да бъдат експресирани по клетъчната повърхност и да бъдат секретирани от клетката гостоприемник. Транслираните мутантни молекули могат да претърпят пост-транслационнна модификация, включваща разцепване на сигналния пептид, за получаване на зрял протеин, притежаващ CTLA4 и имуноглобулиновите части. Разцепването може да се появи след аланин в позиция -1, което има за резултат зряла мутантна молекула, съдържаща метионин в позиция +1 като първата аминокиселина (Фигура 7 (SEQ ID NO: 4) или 8 (SEQ ID NO:The soluble CTLA4 mutant molecule of the invention can be prepared by molecular or chemical synthetic methods. Molecular methods may include the following steps: introducing a suitable host cell with a nucleic acid molecule that expresses and encodes a soluble CTLA4 mutant molecule; culturing the host cell thus inserted under conditions that enable the host cell to express mutant molecules; and isolating the expressed mutant molecules. The portion of the signal peptide of the mutant molecule enables the protein molecules to be expressed on the cell surface and to be secreted by the host cell. The translated mutant molecules may undergo post-translational modification, including cleavage of the signal peptide, to produce a mature protein having CTLA4 and immunoglobulin moieties. The cleavage may occur after alanine at position -1, which results in a mature mutant molecule containing methionine at position +1 as the first amino acid (Figure 7 (SEQ ID NO: 4) or 8 (SEQ ID NO:

6)). Алтернативно, разцепването може да се появи след метионина в позиция -2, което има за резултат зряла мутантна молекула, съдържаща аланин в позиция -1, като първата аминокиселина.6)). Alternatively, cleavage may occur after methionine at position -2, which results in a mature mutant molecule containing alanine at position -1, such as the first amino acid.

Едно предпочитано изпълнение е, разтворима CTLA4 мутантна молекула, притежаваща извънклетъчен домен на човешки CTLA4, свързан с цялата или част от човешка имуноглобулинова молекула (например, прикачени, СН2 и СНЗ). Тази предпочитана молекула включва CTLA4 частта на разтворимата молекула, обхващаща аминокиселинна последователност, притежаваща метионин в позиция +1 до аспаргинова киселина в позиция +124, един присъединен аминокиселинен остатък глутамин в позиция +125, и имуноглобулиновата част обхващаща глутаминова киселина в позиция +126 до лизин в позиция +357. Частта притежаваща извънклетъчния домен на CTLA4 е мутирана така че аланин в позиция +29 е заменен с тирозин и левцин в позиция +104 е заменен с глутаминова к-на. Имуноглобулиновата част на мутантната молекула може да бъде мутирана, така че цистеините в позиции +130, +136 и +139 са заместени със серин и пролинът в позиция+148 е заместен със серин. Тази мутантна молекула е обозначена тук като L104EA29Ylg (Фигура 7 (SEQ ID NOS: 3 и 4)).One preferred embodiment is a soluble CTLA4 mutant molecule having an extracellular domain of human CTLA4 bound to all or part of a human immunoglobulin molecule (e.g., attached, CH2 and CH3). This preferred molecule comprises the CTLA4 moiety of the soluble molecule comprising an amino acid sequence having methionine at position +1 to aspartic acid at position +124, an attached amino acid glutamine residue at position +125, and immunoglobulin glutinic moiety126 in position +357. The portion having the extracellular domain of CTLA4 is mutated such that alanine at position +29 is replaced by tyrosine and leucine at position +104 is replaced by glutamine k-na. The immunoglobulin portion of the mutant molecule may be mutated such that the cysteines at positions +130, +136, and +139 are substituted with serine and the proline at position + 148 is replaced with serine. This mutant molecule is referred to herein as L104EA29Ylg (Figure 7 (SEQ ID NOS: 3 and 4)).

Друго изпълнение на L104EA29Ylg е мутантна молекула, включваща аминокиселинна последователност, притежаваща аланин в позция -1 до аспаргинова киселина в позиция +124, един присъединен аминокиселинен остатък глутамин в позиция +125 и имуноглобулинова част обхващаща глутаминова киселина в позиция +126 (например, +126 до лизин в позиция +357). Частта притежаваща извънклетъчния домен на CTLA4 е мутирана така, че аланин в позиция +29 е заместен с тирозин; и левцин в позиция +104 е заместен с глутаминова киселина. Имуноглобулиновата част на мутантната молекула е мутирана така, че цистеините в позиции +130, +136 и +139 са заместени със серин и пролинът в позиция +148 е заместен със серин. Тази мутантна молекула тук е обозначена като L104EA29Ylg (Фигура 7 (SEQ D NOS: 3 и 4)). След като сигналната последователност е разцепена, L104EA29Ylg може да започва или с метионин в позиция +1, или да започва с аланин в позиция -1.Another embodiment of L104EA29Ylg is a mutant molecule comprising an amino acid sequence having alanine at position -1 to aspartic acid at position +124, one attached amino acid glutamine residue at position +125 and an immunoglobulin moiety comprising glutamic acid6, 12 to lysine at position +357). The portion having the extracellular domain of CTLA4 is mutated such that the alanine at position +29 is replaced by tyrosine; and leucine at position +104 is substituted with glutamic acid. The immunoglobulin portion of the mutant molecule is mutated such that the cysteines at positions +130, +136, and +139 are substituted with serine and the proline at position +148 is replaced with serine. This mutant molecule is here designated L104EA29Ylg (Figure 7 (SEQ D NOS: 3 and 4)). After the signal sequence has been cleaved, L104EA29Ylg can start either with methionine at position +1 or start with alanine at position -1.

Друга мутантна молекула на изобретението е разтворима CTLA4 мутантна молекула, съдържаща извънклетъчния домен на човешки CTLA4, свързан с човешката имуноглобулинова молекула (например, прикачени, СН2 и СНЗ). Тази молекула включва частта от аминокиселинната послеователност кодираща CTLA4, започваща с метионин в позиция +1 до аспаргинова киселина в позиция +124, присъединен аминокиселинен остатък глутамин в позиция +125 и имуноглобулинова част, обхващаща една аминокиселинна последователност, притежаваща глутаминова киселина в позиция +126 до лизин в позиция +357. Частта, притежаваща извънклетъчния домен на CTLA4 е мутирана, така че левцин в позиция +104 е заместен с глутаминова киселина. Прикачената част на мутантната молекула е мутирана, така че цистеините в позиции +130, +136 и +139 са заместени със серин, и пролинът в позиция +148 е заместен със серин. Тази мутантна молекула е обозначена тук като L104Elg (Фигура 8 (SEQ ID NOS: 5 иAnother mutant molecule of the invention is a soluble CTLA4 mutant molecule comprising the extracellular domain of human CTLA4 bound to the human immunoglobulin molecule (e.g., attached, CH2 and CH3). This molecule includes the portion of the amino acid sequence encoding CTLA4 starting with methionine at position +1 to aspartic acid at position +124, the attached amino acid glutamine residue at position +125, and an immunoglobulin moiety comprising one amino acid sequence6 having acidic acid6 sequence lysine at +357. The portion having the extracellular domain of CTLA4 is mutated so that leucine at position +104 is replaced by glutamic acid. The attachment of the mutant molecule is mutated so that the cysteines at positions +130, +136 and +139 are replaced by serine, and the proline at position +148 is replaced by serine. This mutant molecule is referred to herein as L104Elg (Figure 8 (SEQ ID NOS: 5 and

6))·6)) ·

Алтернативно, едно изпълнение на L104Eig е разтворима CTLA4 мутантна молекула, притежаваща извънклетъчен домен на човешки CTLA4, свързан с човешка имуноглобулинова молекула (например, прикачени, СН2 и СНЗ). Тази предпочитана молекула включва CTLA4 частта, обхващаща аминокиселинна последователност, започваща с аланин в позиция -1 до аспаргинова киселина в позиция +124, присъединен аминокиселинен остатък глутамин в позиция +126 до лизин в позиция +357. Частта притежаваща извънклетъчния домен на CTLA4 е мутирана, така че левцин в позиция +104 е заместен с глутаминова киселина. Прикачената част на мутантната молекула е мутирана, така че цистеините в позиции +130, +136 и +139, са заместени със серин и пролинът в позиция +148 е заместен със серин. Тази мутантна молекула е обозначена тук като L104Elg (Фигура 8(SEQ ID NOS: 5 иб)).Alternatively, one embodiment of L104Eig is a soluble CTLA4 mutant molecule having an extracellular domain of human CTLA4 bound to a human immunoglobulin molecule (e.g., attached, CH2 and CH3). This preferred molecule comprises the CTLA4 moiety comprising an amino acid sequence starting with alanine at position -1 to aspartic acid at position +124, an attached amino acid glutamine residue at position +126 to lysine at position +357. The portion having the extracellular domain of CTLA4 is mutated so that leucine at position +104 is replaced by glutamic acid. The attachment of the mutant molecule is mutated so that the cysteines at positions +130, +136 and +139 are replaced by serine and the proline at position +148 is replaced by serine. This mutant molecule is referred to herein as L104Elg (Figure 8 (SEQ ID NOS: 5b)).

Също така, изобретението предоставя разтворима CTLA4 мутантна молекула, притежаваща: (а) първа аминокиселинна последователност на мембранен гликопротеин, например, CD28, CD86, CD80, CD40 и др39, който блокира Т клетъчна пролиферация, слята до втора аминокиселинна последователност; (Ь) втората аминокиселинна последователност, която е фрагмент от извънклетъчния домен на мутантен CTLA4, който блокира Т клетъчна пролиферация, като например, молекула на аминокиселина, съдържаща метионин в позиция +1 до аспаргинова киселина в позиция +124 (Фигура 7 (SEQ ID NO: 4) или 8 (SEQ ID N0:6); и (с) трета аминокиселинна последователност, която действа като идентификационна опашка или повишава разтворимостта на молекулата. Например, третата аминокиселинна последователност може да се състои в основни линии от аминокиселините остатъци на прикачените, СН2 и СНЗ области на не-имуногенната имуноглобулинова молекула. Примери за подходящи имуноглобулинови молекули включват, но не се ограничават до, човешки или маймунски имуноглобулин, например С(гамма)1. Възможни са също други изотипове.The invention also provides a soluble CTLA4 mutant molecule having: (a) a first amino acid sequence of a membrane glycoprotein, for example, CD28, CD86, CD80, CD40, etc.39, which blocks T cell proliferation, fused to a second amino acid sequence; (B) the second amino acid sequence, which is a fragment of the extracellular domain of a mutant CTLA4 that blocks T cell proliferation, such as, for example, an amino acid molecule containing methionine at position +1 to aspartic acid at position +124 (Figure 7 (SEQ ID NO : 4) or 8 (SEQ ID NO: 6); and (c) a third amino acid sequence that acts as an identification tail or enhances the solubility of the molecule, for example, the third amino acid sequence may consist essentially of the amino acid residues of the attached, P H2 and CH3 regions of a non-immunogenic immunoglobulin molecule Examples of suitable immunoglobulin molecules include, but are not limited to, human or monkey immunoglobulin, for example C (gamma) 1. Other isotypes are also possible.

Изобретението предоставя също така молекули нуклеинова киселина, съдържаща нуклеотидни последователности кодиращи аминокиселинните последователности, съответстващи на разтворимите CTLA4 мутантни молекули на изобретението. В едно изпълнение, молекулата нуклеинова киселина е ДНК (например, кДНК) или неин хибрид. Алтернативно, молекулите нуклеинова киселина са РНК или нейни хибриди.The invention also provides nucleic acid molecules comprising nucleotide sequences encoding amino acid sequences corresponding to the soluble CTLA4 mutant molecules of the invention. In one embodiment, the nucleic acid molecule is DNA (e.g., cDNA) or a hybrid thereof. Alternatively, the nucleic acid molecules are RNA or its hybrids.

Освен това, изобретението предоставя вектор, който съдържа нуклеотидните последователности на изобретението. Предоставя се също така, векторна система гостоприемник. Векторната система гостоприемник съдържа вектора на изобретението в подходяща клетка гостоприемник. Примерите за подходящи клетки гостоприемници включват, но не се ограничават до, прокариотни и еукриотни клетки.In addition, the invention provides a vector that contains the nucleotide sequences of the invention. A vector host system is also provided. The host vector system comprises the vector of the invention in a suitable host cell. Examples of suitable host cells include, but are not limited to, prokaryotic and eukriotic cells.

Изобретението включва фармацевтични състави за използване при лечението на заболявания на имунната система, съдържащи фармацевтично ефективни количества разтворими CTLA4 мутантни молекули. Съгласно някои варианти за изпълнение на изобретението, заболявания на имунната система са медиирани от взаимодействие на CD28- и/или СТ1_А4-положителна клетка с CD80 и/или CD86 положителни клетки. Разтворимите CTLA4 мутантни молекули предпочитано са CTLA4 молекули, притежаващи една или повече мутации в извънклетъчния домен на CTLA4. Фармацевтичният състав може да включва разтворими CTLA4 мутантни белтъчни молекули и/или молекули нуклеинова киселина, и/или вектори, кодиращи молекулите. В предпочитани изпълнения, разтворимите CTLA4 мутантни молекули имат аминокиселинната последователност на извънклетъчния домен на CTLA4 както е показано във Фигури 7 (SEQ ID NO: 4) или 8(SEQ ID N0:6) (L104EA29Y или L104E, съответно). Още по-предпочитано, разтворимата CTLA4 мутантна молекула е L104EA29Ylg както е представено тук. Съставите могат допълнително да включват други терапевтични агенти, включително, но не ограничено до, лекарствени токсини, ензими, антитела или конюгати.The invention includes pharmaceutical compositions for use in the treatment of diseases of the immune system containing pharmaceutically effective amounts of soluble CTLA4 mutant molecules. According to some embodiments of the invention, diseases of the immune system are mediated by the interaction of a CD28- and / or CT1_A4-positive cell with CD80 and / or CD86-positive cells. Soluble CTLA4 mutant molecules are preferably CTLA4 molecules having one or more mutations in the extracellular domain of CTLA4. The pharmaceutical composition may include soluble CTLA4 mutant protein and / or nucleic acid molecules, and / or vectors encoding the molecules. In preferred embodiments, soluble CTLA4 mutant molecules have the amino acid sequence of the extracellular domain of CTLA4 as shown in Figures 7 (SEQ ID NO: 4) or 8 (SEQ ID NO: 6) (L104EA29Y or L104E, respectively). More preferably, the soluble CTLA4 mutant molecule is L104EA29Ylg as presented here. The compositions may further include other therapeutic agents, including, but not limited to, drug toxins, enzymes, antibodies, or conjugates.

Фармацевтичните състави също предпочитано включват подходящи носители и адюванти, които включват някакъв материал, който когато се комбинира с молекулата на изобретението (например, разтворима CTLA4 мутантна молекула, като L104EA29Y или L104E), запазва активността на молекулата и не е реактивен за имунната система на индивида. Примери на подходящи носители и адюванти включват, но не се ограничават до, човешки серум албумин; йонообменници; алуминиев диоксид; лецитин; буфериращи вещества, като фосфати; глицин; сорбинова киселина; калиев сорбат; и соли или електролити, като протамин сулфат. Други примери включват някои от стандартните фармацевтични носители, катоPharmaceutical compositions also preferably include suitable carriers and adjuvants that include any material which, when combined with the molecule of the invention (e.g., a soluble CTLA4 mutant molecule, such as L104EA29Y or L104E), preserves the activity of the molecule and is not reactive to the individual's immune system . Examples of suitable carriers and adjuvants include, but are not limited to, human serum albumin; ion exchangers; aluminum dioxide; lecithin; buffering agents such as phosphates; glycine; sorbic acid; potassium sorbate; and salts or electrolytes, such as protamine sulfate. Other examples include some of the standard pharmaceutical carriers, such as

буфериран с фосфат физиологичен разтвор; вода; емулсии, такива като масло/вода; и различни видове овлажняващи средства. Други носители могат, също така, да включват стерилни разтвори; таблетки, включително таблетки с покритие и капсули. Характерно, такива носители съдържат инертни пълнители, такива като нишесте, мляко, захар, някои видове глина, желатин, стеаринова киселина, или нейни соли, магнезиев, или калциев стеарат, талк, растителни мазнини, или масла, смоли, гликоли, или други известни инертни пълнители. Такива носители могат, също така, да включват добавки за подобряване на вкуса и оцветители, или други съставни части. От състави, съдържащи такива носители, се изготвят лекарствени форми чрез добре известни конвенционални методи. Такива състави могат да се изготвят като лекарствени форми в състава на различни липидни състави, такива като, например, липозоми, така както и в различни полимерни състави, такива като полимерни микросфери.phosphate buffered saline; water; emulsions such as oil / water; and various types of moisturizers. Other carriers may also include sterile solutions; tablets, including coated tablets and capsules. Typically, such carriers contain excipients such as starch, milk, sugar, certain types of clay, gelatin, stearic acid or its salts, magnesium or calcium stearate, talc, vegetable fats or oils, resins, glycols, or other known aggregates. Such carriers may also include flavoring additives and coloring agents or other constituents. Compositions containing such carriers are formulated using well known conventional methods. Such compositions may be formulated in the formulation of various lipid compositions, such as, for example, liposomes, as well as in various polymeric compositions, such as polymeric microspheres.

Фармацевтичните състави съгласно изобретението могат да се прилагат, като се използуват конвенционални начини на приложение, включително, но без да се ограничават от, интравенозно (i. ν.) приложение, интраперитонеално (i. р.) приложение, интрамускулно (i. m.) приложение, подкожно приложение, орално приложение, приложение като супозитории, или като локален контакт, или имплантиране на устройство със забавено освобождаване, такова като миниосмотична помпа, върху субекта.The pharmaceutical compositions of the invention may be administered using conventional routes of administration, including but not limited to, intravenous (i. Ν.) Administration, intraperitoneal (i. P.) Administration, intramuscular (im) administration, subcutaneous administration, oral administration, administration as suppositories, or as topical contact, or implantation of a sustained-release device, such as a mini-osmotic pump, onto the subject.

Фармацевтичните състави съгласно изобретението могат да бъдат в разнообразни единични форми за еднократно приложение, които включват, но без да се ограничават от, течни разтвори, или суспензии, таблетки, пилюли, прахове, супозитории, полимерни микрокапсули, или микровезикули, липозоми, и инжектируеми, или инфузионни разтвори. Предпочитаната форма зависи от начина на приложение, и от терапевтичното използуване.The pharmaceutical compositions of the invention may be in a variety of single unit dosage forms, which include, but are not limited to, liquid solutions or suspensions, tablets, pills, powders, suppositories, polymeric microcapsules, or microvesicles, liposomes, and injectables, or infusion solutions. The preferred formulation depends on the route of administration and the therapeutic use.

Най-ефективният начин на приложение и режим на дозиране за съставите съгласно това изобретение зависи от това колко тежко е заболяването, и от курса на болестта, от здравето на пациента, от отговора на пациента към лечението, и от преценката на лекуващия лекар. Съгласно това, дозиранията на съставите трябва да се титруват спрямо индивидуалния пациент.The most effective route of administration and dosage regimen for the compositions of this invention depends on the severity of the disease and the course of the disease, the health of the patient, the patient's response to treatment, and the judgment of the treating physician. Accordingly, dosages of the compositions should be titrated to the individual patient.

Разтворимите CTLA4 мутантни молекули могат да се прилагат върху субект в количество, и в продължение на време (например продължителността на времето и/или колко пъти във времето), достатъчно, за да блокира В7 (например, CD80 и/или CD86) молекули от свързване към техните съответни лиганди, у субекта. Блокирането на ендогенно В7/лиганд свързване, и с това инхибиране на взаимодействие между В-7 позитивни клетки (например, CD80- и/или СО86-позитивни клетки) с CD28- и CTLA4- позитивни клетки. Дозирането на терапевтично средство зависи от много фактори, включително, но без да се ограничават от, от вида на засегнатата тъкан, от вида на автоимунното заболяване, което трябва да се лекува, от това колко тежко е заболяването, от здравето на субекта, и от отговора на субекта към лечението със средствата. Имайки предвид всичко това, дозиранията на средствата могат да варират, в зависимост от субекта и от начина на приложение. Разтворимите CTLA4 мутантни молекули могат да се прилагат в количество между 0,1 и 20,0 mg/kg тегло на пациента/ден, за предпочитане между 0,5 и 10,0 mg/kg/ден. Приложението на фармацевтични състави съгласно изобретението може да се осъществи през различни интервали от време. Съгласно един вариант за изпълнение, фармацевтичния състав съгласно изобретението може да се прилага през един, или през повече часа. Освен това, приложението може да се повтори, в зависимост от това колко тежко е заболяването, така както и в зависимост от други фактори, както се разбира от специалистите в областта на техниката.Soluble CTLA4 mutant molecules can be administered to a subject in an amount, and over time (e.g., time duration and / or number of times in time), sufficient to block B7 (e.g., CD80 and / or CD86) binding molecules to their respective ligands, in the subject. Blockade of endogenous B7 / ligand binding, and thereby inhibit the interaction between B-7 positive cells (e.g., CD80- and / or CD86-positive cells) with CD28- and CTLA4-positive cells. The dosage of a therapeutic agent depends on many factors, including, but not limited to, the type of tissue affected, the type of autoimmune disease to be treated, how severe the disease is, the subject's health, and the health of the subject. the subject's response to treatment with the means. With all this in mind, the dosages of the agents may vary, depending on the subject and the route of administration. Soluble CTLA4 mutant molecules can be administered in an amount of between 0.1 and 20.0 mg / kg patient weight / day, preferably between 0.5 and 10.0 mg / kg / day. The administration of the pharmaceutical compositions according to the invention can take place at different intervals. In one embodiment, the pharmaceutical composition of the invention may be administered over one or more hours. In addition, administration may be repeated, depending on how severe the disease is, as well as depending on other factors, as understood by those skilled in the art.

Освен това, изобретението предоставя методи за получаване на протеин, които се състоят в прорастване на векторна система гостоприемник съгласно изобретението, така че да се продуцира протеина в гостоприемника, и да се покрие така продуцирания протеин.In addition, the invention provides methods for producing a protein, which consists in sprouting a vector host system according to the invention so as to produce the protein in the host, and to cover the protein thus produced.

Също така, изобретението предоставя методи за регулиране на функционално взаимодействия на CTLA4- и CD28-noзитивни Т клетки с CD80- и/или CD86- позитивни клетки. Методите се състоят в контактуване на CD80- и/или СО86-позитивните клетки с разтворима CTLA4 мутантна молекула съгласно изобретението, така че да се образува CTLA4/CD80 и/или мутантни CTLA4/CD86 комплекси, комплексите интерферират с реакция на ендогенен CTLA4 антиген с CD80 и/или CD86, и/или комплексите интерферират с реакция на ендогенен CD28 антиген с CD80 и/или CD86. Съгласно един вариант за изпълнение, разтворимата CTLA4 мутантна молекула е слят протеин, който съдържа най-малко част от извънклетъчния домен на мутантен CTLA4. Съгласно друг вариант за изпълнение на изобретението, разтворимата CTLA4 мутантна молекула съдържа: първа амино киселинна последователност, имаща метионин на позиция +1, до аспарагинова киселина на позиция +124, включваща най-малко една мутация; и втора амино киселинна последователност, включваща прикачените СН2 и СНЗ области на човешки имуноглобулин гамма 1 молекула (Фигура 7 (SEQ ID NO: 4) или Фигура 8 (SEQ ID N0:6)).The invention also provides methods for regulating the functional interactions of CTLA4- and CD28-positive T cells with CD80- and / or CD86-positive cells. The methods consist of contacting CD80- and / or CD86-positive cells with a soluble CTLA4 mutant molecule according to the invention to form CTLA4 / CD80 and / or mutant CTLA4 / CD86 complexes, the complexes interfering with the reaction of an endogenous CTLA4 antigen with CD80 and / or CD86, and / or the complexes interfere with the reaction of an endogenous CD28 antigen with CD80 and / or CD86. In one embodiment, the soluble CTLA4 mutant molecule is a fusion protein that contains at least a portion of the extracellular domain of the mutant CTLA4. According to another embodiment of the invention, the soluble CTLA4 mutant molecule comprises: a first amino acid sequence having methionine at position +1 to aspartic acid at position +124 comprising at least one mutation; and a second amino acid sequence comprising the attached CH2 and CH3 regions of a human immunoglobulin gamma 1 molecule (Figure 7 (SEQ ID NO: 4) or Figure 8 (SEQ ID NO: 6)).

Съгласно практиката на изобретението, CD80- или CD86положителни клетки са поставени в контакт с фрагменти или производни на разтворимите CTLA4 мутантни молекули на изобретението. Алтернативно, разтворимата CTLA4 мутантна молекула е CD28lg/CTI_A4lg слят протеин, притежаващ пърза аминокиселинна последователност, съответстваща на част от ^w извънклетъчния домен на CD28 рецептор, слят с втора аминокиселинна последователност, съответстваща на част от извънклетъчния домен на CTLA4 мутантен рецептор и трета аминокиселинна последователност, съответстваща на прикачените СН2 и СНЗ области на човешки имуноглобулин С-гамма-1.According to the practice of the invention, CD80- or CD86positive cells are contacted with fragments or derivatives of the soluble CTLA4 mutant molecules of the invention. Alternatively, the soluble CTLA4 mutant molecule is a CD28lg / CTI_A4lg fusion protein having a slit amino acid sequence corresponding to a portion of the ^w extracellular domain of a CD28 receptor fused to a second amino acid sequence corresponding to a portion of the extracellular domain of the CT4 receptor amino acid sequence corresponding to the attached CH2 and CH3 regions of human immunoglobulin C-gamma-1.

Очаква се разтворимите CTLA4 мутантни молекули да проявят инхибиторни свойства in vivo. При условия, където Т клетка/АРС клетка взаимодействия, например, Т клетка/В клетка взаимодействия, се появяват в резултат на контакт между Т клетки и АРС клетки, свързване на въведени CTLA4 мутантни молекули да - взаимодействат с CD80- и /или СО86-положителни клетки, например В клетки, може да интерферира, т.е. да инхибира, Т клетка/АРС клетка взаимодействията, което води до регулиране на имунните отговори.Soluble CTLA4 mutant molecules are expected to exhibit inhibitory properties in vivo. Under conditions where T cell / APC cell interactions, e.g., T cell / B cell interactions, result from contact between T cells and APC cells, binding of introduced CTLA4 mutant molecules to - interacting with CD80- and / or CO86- positive cells, for example B cells, may interfere, i. e. to inhibit T cell / APC cell interactions, leading to regulation of immune responses.

Изобретението предоставя методи за низходяща регулация на имунните отговори. Низходяща регулация на имунните отговори с разтворими CTLA4 мутантни молекули може да бъде чрез инхибиране или блокиране на имунния отговор, който е в развитие или може да включва предотвратяване индукцията на имунен отговор. Разтворимите CTLA4 молекули на изобретението могат да инхибират функциите на Т клетки, такива като пролифериране на Т лимфоцити и секретиране на цитокини, чрез подтискане Т клетъчни отговори, или чрез индуциране на специфичен толеранс в Т клетки, или и чрез двете.The invention provides methods for down-regulation of immune responses. Down-regulation of immune responses by soluble CTLA4 mutant molecules may be through inhibition or blocking of an immune response that is in development or may include preventing the induction of an immune response. The soluble CTLA4 molecules of the invention can inhibit T cell functions, such as T lymphocyte proliferation and cytokine secretion, by suppressing T cell responses, or by inducing specific tolerance in T cells, or both.

Настоящето изобретение също така предоставя методи за лечение на заболявания на имунната система, и индуциране на толеранс. Съгласно по-специални варианти за изпълнение на изобретението, заболяванията на имунната система се медиират от взаимодействия на CD28- и/или СТ1_А4-позитивни клетки с CD80/CD86 позитивни клетки. Съгласно друг вариант, инхибират се Т клетъчни взаимодействия. Заболяванията на имунната система включват, но без да се ограничават от, автоимунни заболявания, имунопролиферативни заболявания, и смущения свързани с присаждания. Тези методи се състоят в приложение върху субект на разтворими CTLA4 мутантни молекули съгласно изобретението, за да регулират взаимодействия Т клетки с CD80- и/или CD86- позитивните клетки. Алтернативно, хибрид на CTLA4 мутант, имащ мембранен гликопротеин, прикрепен към CTLA4 мутантна молекула може да бъде приложен. Примерите за заболявания свързани с присаждане включват graft versus host заболяване (GVHD) (например, такива, които могат да са в резултат от трансплантиране на костен мозък, или в индуциране на толерантност), имунни заболявания, асоциирани с отхвърляне на присадени трансплантанти, хронично отхвърляне, и тъканни, или клетъчни ало-, или ксенографти, включващо твърди органи, кожа, islets, мускули, хепатоцити, неврони. Примерите за имунопролиферативни заболявания включват, но без да се ограничават от, псориазис; Т клетъчна лимфома; Т клетъчна остра лимфобластна левкемия; тестикуларна ангиоцентрична Т клетъчна лимфома;The present invention also provides methods of treating diseases of the immune system and inducing tolerance. According to more specific embodiments of the invention, diseases of the immune system are mediated by interactions of CD28- and / or CT1-A4-positive cells with CD80 / CD86 positive cells. In another embodiment, T cell interactions are inhibited. Immune system diseases include, but are not limited to, autoimmune diseases, immunoproliferative diseases, and graft-related disorders. These methods consist of administering to a subject soluble CTLA4 mutant molecules of the invention to regulate the interactions of T cells with CD80- and / or CD86-positive cells. Alternatively, a hybrid of a CTLA4 mutant having a membrane glycoprotein attached to a CTLA4 mutant molecule may be administered. Examples of graft-related diseases include graft versus host disease (GVHD) (e.g., those that may result from bone marrow transplantation or inducing tolerance), immune diseases associated with graft rejection, chronic rejection , and tissue or cell allo- or xenografts including solids, skin, islets, muscles, hepatocytes, neurons. Examples of immunoproliferative diseases include, but are not limited to, psoriasis; T cell lymphoma; T cell acute lymphoblastic leukemia; testicular angiocentric T cell lymphoma;

доброкачествен лимфоцитен ангиит; и автоимунни заболявания като лупус (например, lupus erythematosus, lupus nephritis), Hashimoto’s тиреоидит, първичен микседем, болест на Graves, пернициозна анемия, автоимунен атрофичен гастрит, болест на Addison, диабет (например, инсулин зависим захарен диабет, тип I захарен диабет), good pasture’s синдром, myasthenia gravis, pemphigus, болест на Crohn, офталмия симпатика, автоимунен увеит, множествена склероза, автоимунна хемолитична анемия, идиопатична тромбоцитопения, първична билиарна цироза, хроничен хепатит,язвен колит, Sjogren's синдром, ревматични заболявания (например, ревматоиден артрит) полимиозит, склеродермия и смесено заболяване на съединителната тъкан.benign lymphocytic angitis; and autoimmune diseases such as lupus (eg, lupus erythematosus, lupus nephritis), Hashimoto's thyroiditis, primary myxedema, Graves disease, pernicious anemia, autoimmune atrophic gastritis, Addison's disease, diabetes (eg, insulin-dependent diabetes mellitus) , good pasture's syndrome, myasthenia gravis, pemphigus, Crohn's disease, sympathetic ophthalmia, autoimmune uveitis, multiple sclerosis, autoimmune hemolytic anemia, idiopathic thrombocytopenia, primary biliary cirrhosis, chronic hepatitis, ulcerative colitis, ulcerative colitis all three) polymyositis, scleroderma, and mixed connective tissue disease.

Настоящето изобретение предоставя също метод за инхибиране отхвърлянето от индивида на присадката на орган и/или на тъканен трансплантат. Обикновено, при гьканни трансплантати, отхвърлянето на присадката се започва чрез нейното разпознаване като чужда от Т клетки, последвано от имунен отговор, който разрушава присадката. Разтворимите CTLA4 мутантни молекули на това изобретение, чрез инхибиране Т лимфоцитната пролиферация я* и/или секреция на цитокин, могат да доведат до намаляване на тъканната деструкция и индуциране на антиген-специфична Т клетъчна имуносупресия, което може да има за резултат продължително приемане на присадката без да е необходима обща имуносупресия. Освен това, разтворимите CTLA4 мутантни молекули на изобретението могат да бъдат въведени с други фармацевтични препарати, включително, но не ограничено до, кортикостеро-иди, циклоспорин, rapamycicn, mycophenolate, mofetil, azathioprine, tacrolismus, basiliximab, и/или други биологични препарати.The present invention also provides a method of inhibiting the rejection by an individual of an organ graft and / or tissue graft. Typically, in grafted grafts, graft rejection begins by recognizing it as alien to T cells, followed by an immune response that destroys the graft. The soluble CTLA4 mutant molecules of this invention, by inhibiting T lymphocyte proliferation * and / or cytokine secretion, can reduce tissue destruction and induce antigen-specific T cell immunosuppression, which may result in prolonged graft uptake without general immunosuppression required. In addition, the soluble CTLA4 mutant molecules of the invention may be introduced with other pharmaceutical preparations, including, but not limited to, corticosteroids, cyclosporin, rapamycic, mycophenolate, mofetil, azathioprine, tacrolismus, basiliximab, and / or other biological agents.

Настоящето изобретение предоставя също методи за инхибиране реакцията на присадката срещу приемника у даден индивид. Този метод се характеризира с това, че на индивида се въвежда разтворима CTLA4 мутантна молекула на изобретението, самостоятелно или заедно със следните допълнителни лиганди, реактивни с IL-2, IL-4 или γ-интерферон. Например, разтворима CTLA4 мутантна молекула на изобретението, може да бъде въведена у приемник на костно-мозъчен трансплантат, за инхибиране алореактивността на донорни Т клетки. Алтернативно, донорни Т клетки в присадка на костен мозък, могат да бъдат направени толерантни спрямо алоантигени на реципиента ex vivo, преди трансплантацията.The present invention also provides methods for inhibiting the graft response against a host in an individual. This method is characterized in that the individual is administered a soluble CTLA4 mutant molecule of the invention, alone or together with the following additional ligands reactive with IL-2, IL-4 or γ-interferon. For example, a soluble CTLA4 mutant molecule of the invention may be introduced into a bone marrow transplant recipient to inhibit the alloreactivity of donor T cells. Alternatively, bone marrow graft donor T cells may be made tolerant to alloantigens of the recipient ex vivo prior to transplantation.

Инхибиране на Т клетъчни отговори чрез разтворими CTLA4 мутантни молекули могат да бъдат използвани за лечение на автоимунни разстройства. Много автоимунни разстройства са резултат на неподходящо активиране на Т клетки, които са реактивни срещу автоантигени и които спомагат за продуцирането на цитокини и автоантитела, които участват в патологията на заболяването. Въвеждането на разтворима CTLA4 мутантна молекула у индивид, страдащ от, или предразположен към автоимунно разстройство, може да предотврати активирането на автореактивни Т клетки и може да намали, или да елиминира симптомите на заболяването. Този метод може също да включва въвеждане у даден индивид на разтворима CTLA4 мутантна молекула на изобратанието, самостоятелно или заедно с други допълнителни лиганди, реактивни с IL-2, IL-4 или γ-интерферон.Inhibition of T cell responses by soluble CTLA4 mutant molecules can be used to treat autoimmune disorders. Many autoimmune disorders are the result of inappropriate activation of T cells that are reactive against autoantigens and that contribute to the production of cytokines and autoantibodies that are involved in the pathology of the disease. Administration of a soluble CTLA4 mutant molecule to an individual suffering from, or predisposed to, an autoimmune disorder may prevent the activation of autoreactive T cells and may reduce or eliminate the symptoms of the disease. This method may also include the administration to an individual of a soluble CTLA4 mutant molecule of the invention, alone or together with other additional ligands reactive with IL-2, IL-4 or γ-interferon.

Освен това изобретението обхваща използуването на разтворимите CTLA4 мутантни молекули заедно с други имуносупресори, например, циклоспорин (виж Mathiesen, in: “Prolonged Survival and Vascularisation of Xenografted Human Glioblastoma Cells in the Central Nervous System of Cyclosporin ATreated Rats” (1989) Cancer Lett., 44:151-156), преднизон, азатиоприн, и метотрексат (R. Kandschumacher “Chapter 53” Drugs Used for Immunosuppression” pages 1264-1276). Други имуносупресори са възможни. Например, за лечението на ревматоиден артрит, разтворими CTLA4 мутантни молекули могат да се прилагат с фармацевтични препарати, включително, но без да се ограничават от, кортикостероиди, нектероидни противовъзпалителни лекарства/Сох-2 инхибитори, метотрексат, хидроксихлорокин, сулфасалазоприн, златни соли, етанерсепт, инфликсимаб, анакинра, азатиоприн, и/или други подобни анти-TNF биологични препарати. За лечението на системен еритематозен лупус, разтворими CTLA4 мутантни молекули могат да се прилагат с фармацевтични препарати, включително, но без да се ограничават от, кортикостероиди, цитоксан, азатиоприн, хидроксихлорокин, микофенолат мофетил, и/или други биологични препарати. Освен това, за лечението на мултиплена склероза, разтворими CTLA4 мутантни молекули могат да се прилагат с фармацевтични препарати, включително, но без да се ограничават от, кортикостероиди, интерферон бетаla, интерферон бета-1Ь, глатирамер ацетат, митоксантрон хидрохлорид, и/или други биологични препарати.In addition, the invention encompasses the use of soluble CTLA4 mutant molecules together with other immunosuppressants, for example, cyclosporin (see Mathiesen, in: "Prolonged Survival and Vascularization of Xenografted Human Glioblastoma Cells in the Central Nervous System of Cyclosporin ATreated Cancer"). , 44: 151-156), prednisone, azathioprine, and methotrexate (R. Kandschumacher "Chapter 53" Drugs Used for Immunosuppression "pages 1264-1276). Other immunosuppressants are possible. For example, for the treatment of rheumatoid arthritis, soluble CTLA4 mutant molecules may be administered with pharmaceuticals, including but not limited to, corticosteroids, non-steroidal anti-inflammatory drugs / Cox-2 inhibitors, methotrexate, hydroxychlorozipine, sulphonosil, sulphite , infliximab, anakinra, azathioprine, and / or other similar anti-TNF biological agents. For the treatment of systemic lupus erythematosus, soluble CTLA4 mutant molecules may be administered with pharmaceutical preparations including, but not limited to, corticosteroids, cytoxan, azathioprine, hydroxychloroquine, mycophenolate mofetil, and / or other biological agents. In addition, for the treatment of multiple sclerosis, soluble CTLA4 mutant molecules may be administered with pharmaceutical preparations, including but not limited to, corticosteroids, interferon beta-1, interferon beta-1b, glatiramer acetate, mitoxantrone hydrochloride, and / or other hydrochloride. biological preparations.

Разтворими CTLA4 мутантни молекули (за предпочитане L104EA29Ylg ) могат също така да се използуват в комбинация с едно, или с повече от следващите средства, за регулиране на имунен отговор: разтворим др39 (известен също така като CD40 лиганд (CD40L), CD154, Т-ВАМ, TRAP), разтворим CD29, разтворим CD40, разтворим CD80, разтворим CD80, разтворим CD80, разтворим CD80, разтворим CD86, разтворим CD28, разтворим CD56, разтворим Thy-1, разтворим CD3, разтворим TCR, разтворим VLA-4, разтворим VCAM-1, разтворим LECAM1, разтворим ELAM-1, разтворим CD44, антитела реактивни с др39, антитела реактивни с CD40, антитела реактивни с В7, антитела реактивни с CD28, антитела реактивни с LFA-1, антитела реактивни с LFA-2, антитела реактивни с IL-2, антитела реактивни с IL-12, антитела реактивни с IFN-гама, антитела реактивни с CD2, антитела реактивни с CD48, антитела реактивни с ICAM (например, ICAM-2), антитела реактивни CTLA4, антитела реактивни с Thy-1, антитела реактивни с CD56, антитела реактивни с CD3, антитела реактивни с CD29, антитела реактивни с TCR, антитела реактивни с VLA-4, антитела реактивни с VCAM-1, антитела реактивни с LECAM-1, антитела реактивни с ELAM-1, антитела реактивни с CD44. Съгласно някои варианти за изпълнение на изобретението, се предпочитат моноклонални антитела. Съгласно други варианти за изпълнение на изобретението, предпочитат се фрагменти антитела. Както специалистите в областта на техниката добре разбират, комбинирането може да включва разтворимите CTLA4 мутантни молекули съгласно изобретението и едно друго имуносупресоращо средство, разтворимите CTLA4 мутантни молекули с две други имуносупресорни средства, разтворимите CTLA4 мутантни молекули с три други имуносупресорни средства, и т. н. Определянето на оптималната комбинация и дозирания може да се определи и да се оптимизира, използувайки методи, добре известни в областта на техниката.Soluble CTLA4 mutant molecules (preferably L104EA29Ylg) can also be used in combination with one or more of the following agents to regulate the immune response: soluble gp39 (also known as CD40 ligand (CD40L), CD154, T- YOU (TRAP), soluble CD29, soluble CD40, soluble CD80, soluble CD80, soluble CD80, soluble CD86, soluble CD28, soluble CD56, soluble CD3, soluble CD3, soluble TCR, soluble VLA-4, soluble VCAM -1, soluble LECAM1, soluble ELAM-1, soluble CD44, antibodies reactive with gp39, antibodies reactive with CD40, antibodies re B7-active, CD28-reactive antibodies, LFA-1 reactive antibodies, LFA-2 reactive antibodies, IL-2 reactive antibodies, IL-12 reactive antibodies, IFN-gamma reactive antibodies, CD2 antibodies CD48-reactive, ICAM-reactive antibodies (eg, ICAM-2), CTLA4-reactive antibodies, Thy-1 reactive antibodies, CD56-reactive antibodies, CD29-reactive antibodies, TCR-reactive antibodies, VLA-4, antibodies reactive with VCAM-1, antibodies reactive with LECAM-1, antibodies reactive with ELAM-1, antibodies reactive with CD44. According to some embodiments of the invention, monoclonal antibodies are preferred. In other embodiments, antibody fragments are preferred. As is well understood by one of ordinary skill in the art, the combination may include soluble CTLA4 mutant molecules of the invention and another immunosuppressant, soluble CTLA4 mutant molecules with two other immunosuppressant agents, soluble CTLA4 mutant molecules with three other immunosuppressant agents. The determination of the optimal combination and dosage can be determined and optimized using methods well known in the art.

Някои специфични комбинации включват следните: L104EA29Yig и CD80 mAbs; L104EA29Yig и CD86 mAbs; L104EA29Yig и gp39 mAbs; L104EA29Yig и CD40 mAbs; L104EA29Yig и CD28 mAbs; L104EA29Yig, CD80 и CD86 mAbs и gp39; L104EA29Yig, CD80 и CD86 и CD40 mAbs; и L104EA29Yig, анти-LFAI mAb, и анти- gp39 mAb. Специфичен пример за gp39 mAb e MR1. Други комбинации ще се оценят лесно, и ще се разберат от лекарите специалисти в областта на техниката.Some specific combinations include the following: L104EA29Yig and CD80 mAbs; L104EA29Yig and CD86 mAbs; L104EA29Yig and gp39 mAbs; L104EA29Yig and CD40 mAbs; L104EA29Yig and CD28 mAbs; L104EA29Yig, CD80 and CD86 mAbs and gp39; L104EA29Yig, CD80 and CD86 and CD40 mAbs; and L104EA29Yig, anti-LFAI mAb, and anti-gp39 mAb. A specific example of gp39 mAb is MR1. Other combinations will be readily appreciated and understood by physicians skilled in the art.

Разтворимите CTLA4 мутантни молекули съгласно изобретението, например, L104EA29Y, могат да се прилагат като единствена съставна част, или заедно с други лекарства в имунорегулиращи режими, или с други противо-възпалителни средства, например, за лечението, или за предотвратяването на ало-, или ксенографт остро, или хронично отхвърляне, или възпаление, или автоимунни разстройства, или за да се индуцира толерантност. Например, те могат да се използуват в комбинация с инхибитори на калциневрин, например цикпоспорин А, или FK506; с имуносупресорен макролид, например, рапамицин, или негово производно; например, 40-0-(2хидрокси)етил-рапамицин, средство завръщащо левкоцити, например, FTY720, или негов аналог; кортикостероиди; циклофосфамид; азатиопрен; метотрексат; лефлуномид, или негов аналот; мизорибин; микофенолова киселина; микофенолат мофетил; 15-деоксиспергуалин, или негов аналог; имуносупресорни моноклонални антитела, например, монокпонални антитела към левкоцит рецептори, например, МНС, CD2, CD3, CD4, CD 11a/CD18, CD7, CD25, CD27, В7, CD40, CD45, CD58, CD137, ICOS, CD150, (SLAM), 0X40, 4-1ВВ, или други лиганди; или други имуносупресорни съединения, например, CTLA4/ CD28lg, или други инхибитори на адхезията на молекули, например, mAbs, или инхибитори с ниско молекулно тегло, включително LFA-1 антагонисти, антагонисти на Селектин и VLA-4 антагонисти. Съединенията са особено полезни в комбинация със съединение, което интерферира с CD40 и негови лиганди, например, антитела за CD40 и антитела за CD40-L, например, в описаните по-горе индикации, например, индикацията за толеранс.The soluble CTLA4 mutant molecules of the invention, for example, L104EA29Y, can be administered as a single component, or together with other drugs in immunoregulatory regimens, or with other anti-inflammatory agents, for example, for the treatment or prevention of allo- or xenograft acute, or chronic rejection, or inflammation, or autoimmune disorders, or to induce tolerance. For example, they may be used in combination with calcineurin inhibitors, for example cycsposporin A or FK506; with an immunosuppressive macrolide, for example, rapamycin, or a derivative thereof; for example, 40-0- (2hydroxy) ethyl-rapamycin, a leukocyte-returning agent, e.g., FTY720, or an analogue thereof; corticosteroids; cyclophosphamide; azathioprene; methotrexate; leflunomide, or an analogue thereof; misoribine; mycophenolic acid; mycophenolate mofetil; 15-deoxypergualin, or an analogue thereof; immunosuppressive monoclonal antibodies, e.g., monoclonal antibodies to leukocyte receptors, e.g., MHC, CD2, CD3, CD4, CD 11a / CD18, CD7, CD25, CD27, B7, CD40, CD45, CD58, CD137, ICOS, CD150, (SLAM) , 0X40, 4-1BB, or other ligands; or other immunosuppressive compounds, for example, CTLA4 / CD28lg, or other molecule adhesion inhibitors, e.g., mAbs, or low molecular weight inhibitors, including LFA-1 antagonists, selectin antagonists, and VLA-4 antagonists. The compounds are particularly useful in combination with a compound that interferes with CD40 and its ligands, for example, antibodies to CD40 and antibodies to CD40-L, for example, in the indications described above, for example, the tolerance indication.

Където разтворимите CTLA4 мутантни молекули съгласно изобретението се прилагат заедно с други имуносупресорна/имуномодулаторна, или противовъзпълителна терапия, например, както е специфицирано по-горе, дозиранията на едновременно-прилаганото имуносупресорно, имуномодулаторно, или противо-възпълително съединение ще зависят много, разбира се, от вида на едновременно-използуваното лекарство, например, дали то е стероид, или цикпоспорин, от специфичното лекарство, което се прилага, от състоянието, което се лекува, и така нататък.Where soluble CTLA4 mutant molecules of the invention are administered in conjunction with other immunosuppressive / immunomodulatory or anti-inflammatory therapies, for example, as specified above, dosages of concomitantly administered immunosuppressant, immunomodulatory, or anti-inflammatory, of the type of concomitant drug used, for example, whether it is a steroid or cycsposporin, of the specific drug being administered, of the condition being treated, and so on.

Като се има предвид посоченото по-горе, настоящето изобретение предоставя, съгласно друг аспект, методи, както се дефинира по-горе, които се състоят в едновременно-приложение, например, съпътсвуващо, или последователно, на терапевтично ефективно количество от разтворими CTLA4 мутантни молекули съгласно изобретението, L104EA29Yig, в свободна форма, или под формата на фармацевтично приемлива сол, и второ лекарствено вещество, като посоченото второ лекарствено вещество да бъде имуносупресорно, имуномодулаторно, или противо-възпълително лекарствено средство, например, както се посочва по-горе. Освен това, предоставят се терапевтични комбинации, например, кит (набор), например, за използуване съгласно който и да е метод, както се дефинира по-горе, съдържащ L104EA29Yig, в свободна форма, или под формата на фармацевтично приемлива сол, което да се използува съпътствуващо, или последователно с най-малко един фармацевтичен състав, съдържащ имуносупресорно, имуномодулаторно, или противо-възпълително лекарствено средство. Наборът може да съдържа инструкции за неговото приложение.In view of the foregoing, the present invention provides, in another aspect, methods as defined above, which consist in the simultaneous administration, for example, of concomitantly or sequentially, a therapeutically effective amount of soluble CTLA4 mutant molecules according to the invention, L104EA29Yig, in free form or in the form of a pharmaceutically acceptable salt, and a second drug substance, said second drug substance being immunosuppressive, immunomodulatory or anti-inflammatory drug means, for example, as indicated above. In addition, therapeutic combinations are provided, for example, a kit, for example, for use according to any method, as defined above, containing L104EA29Yig, in free form or in the form of a pharmaceutically acceptable salt, which a concomitant or sequential use of at least one pharmaceutical composition comprising an immunosuppressive, immunomodulatory, or anti-inflammatory drug is used. The kit may contain instructions for its application.

МЕТОДИ ЗА ПРОДУЦИРАНЕ НА МОЛЕКУЛИТЕ СЪГЛАСНО ИЗОБРЕТЕНИЕТОMETHODS FOR PRODUCING MOLECULES ACCORDING TO THE INVENTION

Експресиране на CTLA4 мутантни молекули може да бъде в прокариотни клетки. Прокариотите най-често се представят чрез различни бактериални щамове. Бактериите могат да бъдат грам положителни, или грам отрицателни. Характерно, грам-отрицателни бактерии, такива като Е. coli се предпочитат. Други микробиални щамове могат също така да се използуват.Expression of CTLA4 mutant molecules may be in prokaryotic cells. Prokaryotes are most commonly represented by various bacterial strains. Bacteria can be gram positive or gram negative. Typically, gram-negative bacteria such as E. coli are preferred. Other microbial strains may also be used.

Последователности, кодиращи CTLA4 мутантни молекули могат да се инсерират във вектор, предназначен за експресиране на чужди последователности в прокариотни клетки, такива като Е. coli. Тези вектори могат да включват обичайно използувани прокариотни контролни последователности, които са дефинирани тук че включват промотори за иницииране на транскрибиране, по избор с оператор, заедно с последователности на сайт свързване на рибозоми, включват такива обичайно използувани промотори като бета-лактамазата (пеницилиназа) и лактоза (lac) промоторна система (Chang, et al., (1977) Nature 198:1056), промоторната система на триптофан (trp) (Goeddel, et al., (1980) Nucleic Acids Res. 8:4057) и производния на ламбда Pl промотор, и N-ген рибозом свързващ сайт (Shimatake, et al., (1981) Nature 292:128).Sequences encoding CTLA4 mutant molecules can be inserted into a vector designed to express foreign sequences in prokaryotic cells such as E. coli. These vectors may include commonly used prokaryotic control sequences, which are defined herein to include promoters for transcriptional initiation, optionally by operator, together with ribosome binding site sequences, include such commonly used promoters as beta-lactamase (penicillinase) and lactose (lac) promoter system (Chang, et al., (1977) Nature 198: 1056), tryptophan (trp) promoter system (Goeddel, et al., (1980) Nucleic Acids Res. 8: 4057) and derivatives of lambda Pl promoter, and the N-gene ribosome binding site (Shimatake, et al., (1981) Nature 292 : 128).

Такива експресиращи вектори трябва също така да включват начала на репликация и избираеми маркери, такива като бета-лактамаза, или неомицин фосфотрансферазен ген, придаващ резистентност към антибиотици, така че векторите могат да реплицират в бактерии, и клетки, осъществяващи плазмидии, могат да се избират всеки път когано са прорастнали в присъствие на антибиотици, такива като ампицилин, или канамицин.Such expression vectors should also include initiation of replication and selectable markers such as beta-lactamase or a neomycin phosphotransferase gene conferring antibiotic resistance so that the vectors can replicate in bacteria, and plasmid-producing cells can each time they have sprouted in the presence of antibiotics such as ampicillin or kanamycin.

Експресионният плазмид може да се внесе в прокариотни клетки посредством различни стандартни методи, включително, но без да се ограничават от, CaCI₂-shock (Cohen, (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110, и Sambrook et al.(eds.), “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Press, (1989)) и електопорация.The expression plasmid can be introduced into prokaryotic cells by a variety of standard methods, including, but not limited to, CaCI ₂ -shock (Cohen, (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2110, and Sambrook et al. (eds., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," 2 ^nd Edition, Cold Spring Harbor Press, (1989)) and electroporation.

Съгласно практиката на изобретението, еукариотни клетки също са подходящи клетки гостоприемници. Примерите за еукариотни клетки включват които и да са животински клетки, първични, или имортализирани, дрожди (например, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pomb, и Pichia pastoris), и растителни клетки. Миелома, COS и СНО клетки са примери за животински клетки, които могат да се използуват като гостоприемници. По-специално СНО клетки включват, но без да се ограничават от, DG44 (Chasin, et al., 1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12:555-556; Kolkekar 1997 Biochemistry 36:10901), CHO-K1 (ATCC No. CCL-61), CHO-K1 Tet-Om клетъчна линия (Clontech), СНО обозначен ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), СНО клон 13 (GEIMG, Genova, IT), СНО клон B (GEIMG, Genova, IT), CHO-K1/SF обозначен ECACC 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), и RR-CHOK1 обозначен ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK). Примерните растителни клетки включват тютюневи (цяло растение, клетъчна култура, или калус), царевични, соеви, и оризови клетки. Царевични, соеви, и оризови семена също са приемливи.According to the practice of the invention, eukaryotic cells are also suitable host cells. Examples of eukaryotic cells include any animal cells, primary or immortalized, yeast (e.g., Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pomb, and Pichia pastoris), and plant cells. Myeloma, COS and CHO cells are examples of animal cells that can be used as hosts. In particular, CHO cells include, but are not limited to, DG44 (Chasin, et al., 1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12: 555-556; Kolkekar 1997 Biochemistry 36: 10901), CHO-K1 (ATCC No. CCL-61), CHO-K1 Tet-Om Cell Line (Clontech), CHO designated ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), CHO clone 13 (GEIMG, Genova, IT), CHO clone B (GEIMG, Genova, IT), CHO-K1 / SF is ECACC 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), and RR-CHOK1 is ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK). Exemplary plant cells include tobacco (whole plant, cell culture, or callus), corn, soybean, and rice cells. Corn, soybean, and rice seeds are also acceptable.

Последователности от нуклеинови киселини кодиращи CTLA4 мутантни молекули могат също така да се инсерират във вектор, предназначен за експресиране на чужди последователности в еукариотен гостоприемник. Регулаторният елемент на вектора може да варира в зависимост с специфичния еукариотен гостоприемник.Nucleic acid sequences encoding CTLA4 mutant molecules may also be inserted into a vector intended to express foreign sequences in a eukaryotic host. The regulatory element of the vector may vary depending on the specific eukaryotic host.

Обичайно използувани еукариотни контролни последоС вателности за използуване в експресиращи вектори включват промотори и контролни последователности, съвместими с клетки на бозайници, такива като, например, CMV промотор (CDM8 вектор) и авиан саркома вирус (ASV) (πΙ_Ν вектор). Други обичайно използувани промотори включват ранни и късни промотори от Simian Virus 40 (SV40) (Fiers, et al., (1973) Nature 273:113), или други вирусни промотори, такива като тези, производни на полиома, Adenfvirus 2, и вируса на говежда папилома. Един индуцируем промотор, такъв като hMTII (Karin, et al., (1982) Nature 199:797-802) може също така да се използува.Commonly used eukaryotic control sequences for use in expression vectors include promoters and control sequences compatible with mammalian cells such as, for example, CMV promoter (CDM8 vector) and avian sarcoma virus (ASV) (πΙ_Ν vector). Other commonly used promoters include early and late promoters of Simian Virus 40 (SV40) (Fiers, et al., (1973) Nature 273: 113), or other viral promoters, such as those derived from polio, Adenfvirus 2, and the virus of bovine papilloma. An inducible promoter such as hMTII (Karin, et al., (1982) Nature 199: 797-802) may also be used.

Вектори за експресиране CTLA4 мутантни молекули в еукариоти също така могат да пренасяг последователности, наречени енхансерни области. Те са важни за оптимизиране на генното експресиране, и са намерени или по посока на, или upstream, или downstream на промотора.Vectors for expression of CTLA4 mutant molecules in eukaryotes may also exceed sequences called enhancer regions. They are important for optimizing gene expression, and are found either in the direction of either upstream or downstream of the promoter.

Примерите за експресиращи вектори за еукариотни клетки гостоприемници включват, но без да се ограничават от, вектори за клетки гостоприемници от бозайници (например, BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2,pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV1,pRc/RSV, pSFV1 (Life Technologies); pVPakc вектори, pCMV вектори, pSG5 вектори (Stratagene)), вектори на ретровируси (например, pFB вектори (Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogen), или техни модифицирани форми, вектори на аденовируси; вектори на адено-асоциирани вируси, вектори на бакуловирус, вектори от дрожди (например, pESC вектори (Stratagene)).Examples of expression vectors for eukaryotic host cells include, but are not limited to, mammalian host cell vectors (e.g., BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc / CMV1. pRc / RSV, pSFV1 (Life Technologies); pVPakc vectors, pCMV vectors, pSG5 vectors (Stratagene)), retrovirus vectors (e.g., pFB vectors (Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogen), or modified forms thereof, vectors adenoviruses; adeno-associated virus vectors, baculovirus vectors, yeast vectors (e.g., pESC vectors (Stratagene)).

Последователности на нуклеинови киселини кодиращи CTLA4 мутантни молекули могат да се интегрират в генома на еукариотна клетка гостоприемник, и да се реплицират като репликати на генома на гостоприемника. Алтернативно, вектор С пренасящ CTLA4 мутантни молекули може да съдържа начало на репликация, позволяващи екстрахромозомална репликация.Nucleic acid sequences encoding CTLA4 mutant molecules can be integrated into the genome of a eukaryotic host cell, and replicated as replicates of the host genome. Alternatively, a vector C carrying CTLA4 mutant molecules may comprise initiation of replication allowing extrachromosomal replication.

За експресиране на последователности от нуклеинови киселини в Saccharomyces cerevisiae, първоизточник на репликация от ендогенния дрождев плазмид, може да се използува 2μ кръг. (Broach, (1983) Meth. Enz. 101:307). Алтернативно, могат да се използуват последователности от генома на дрожди, способни да предизвикат автономна репликация (виж, например, Stinchcomb et al., (1979) Nature 282:39); Tscemper et al., (1980) Gene 10:157; и Clarke et al., (1983) Meth. Enz. 101:300).A 2μ round may be used to express nucleic acid sequences in Saccharomyces cerevisiae, a source of replication from an endogenous yeast plasmid. (Broach, (1983) Meth. Enz. 101: 307). Alternatively, yeast genome sequences capable of eliciting autonomous replication may be used (see, e.g., Stinchcomb et al., (1979) Nature 282: 39); Tscemper et al., (1980) Gene 10: 157; and Clarke et al., (1983) Meth. Enz. 101: 300).

Контролни последователности за транскрибирането на вектори от дрожди включват промотори за синтезирането на гликолитични ензими (Hess et al., (1968) J. Adv. Enzime Reg. 7:149; Holland et al., (1978) Biochemistry 17:4900. Други промотори, известни в областта на техниката включват CMV промотора, предоставен в CDM8 вектора (Toyama and Okayama, (1990) FEBS 268:217-221); промоторът за 3-фосфоглицерат киназа (Hitzeman et al., (1980) J. Biol. Chem. 255:2073), и тези за други гликолитични ензими.Control sequences for the transcription of yeast vectors include promoters for the synthesis of glycolytic enzymes (Hess et al., (1968) J. Adv. Enzime Reg. 7: 149; Holland et al., (1978) Biochemistry 17: 4900. Other promoters known in the art include the CMV promoter provided in the CDM8 vector (Toyama and Okayama, (1990) FEBS 268: 217-221); the 3-phosphoglycerate kinase promoter (Hitzeman et al., (1980) J. Biol. Chem 255: 2073), and those for other glycolytic enzymes.

Други промотори са индуцируеми, понеже те могат да се регулиратпосредством стимули от околната среда, или култивационната среда на клетките. Тези индуцируеми промотори включват такива, от гените на протеини от топлинен шок, алкохол дехидрогеназа 2, изоцитохром С, кисела фосфатаза, ензими, асоциирани с азотния катаболизъм, и ензими, отговорни за използуване на малтоза и галактоза.Other promoters are inducible because they can be regulated by environmental stimuli or cell culture. These inducible promoters include those from the heat shock protein genes, alcohol dehydrogenase 2, isocytochrome C, acid phosphatase, enzymes associated with nitric catabolism, and enzymes responsible for the use of maltose and galactose.

Регулаторни последователности могат, също така да се намират на 3’-я край на кодиращите последователности. Тези последователности могат да действуват като стабилизират информационна РНК. Такива терминатори се намират на 3’-ата нетранслирана област, след кодиращите последователности в накои гени, получени от дрожди и от бозайници.Regulatory sequences may also be located at the 3rd end of the coding sequences. These sequences can act to stabilize RNA. Such terminators are located in the 3rd untranslated region, following the coding sequences in some genes derived from yeast and mammals.

Примерните вектори за растения и растителни клетки включват, но без да се ограничават от, Agrobacterium Tj плазмиди, вируса на зелевата мозайка (CaMV), и вируса на златистата мозайка по доматите (TGMV).Exemplary vectors for plants and plant cells include, but are not limited to, Agrobacterium Tj plasmids, cabbage mosaic virus (CaMV), and tomato mosaic virus (TGMV).

Общите аспекти на трансформациите на системата от клетки гостоприемници от бозайници са описани от Axel (U. S. Patent No. 4,399,216 issued Aug. 16, 1983). Клетки на бозайник могат да се транформират чрез методи, включително, но без да се ограничават от, трансфектиране в присъствието на калциев фосфат, микроинжектиране, електопорация, или посредством трансдукция с вирусни вектори.General aspects of transformations of the mammalian host cell system have been described by Axel (U. S. Patent No. 4,399,216 issued Aug. 16, 1983). Mammalian cells may be transformed by methods, including, but not limited to, transfection in the presence of calcium phosphate, microinjection, electroporation, or by viral vector transduction.

Методи за въвеждане на чужда ДНК последователности в растителни и дрождеви геноми включват (1) механични методи, такива като микроинжектиране на ДНК в единични клетки, или протопласти, обработване на клетки във вортекс апарат със стъклени перли в присъствие на ДНК, или бомбардиране на волфрамови, или златни сфери, покрити с ДНК в клетки, или протопласти; (2) въвеждане на ДНК, като клетъчни мембрани се правят пропускливи за макромолекули чрез обработване с полиетилен гликол, или като се подлагат на действието на високо волтажни електрически пулсации (електропорация); (3) използуването на липозоми (съдържащи сДНК), които се сливат с клетъчните мембрани.Methods for introducing foreign DNA sequences into plant and yeast genomes include (1) mechanical methods such as microinjection of DNA into single cells or protoplasts, treatment of cells in a glass bead vortex apparatus in the presence of DNA, or bombardment of tungsten, or gold spheres coated with DNA in cells or protoplasts; (2) introducing DNA by making cell membranes permeable to macromolecules by treatment with polyethylene glycol or by subjecting them to high-voltage electrical ripples (electroporation); (3) the use of liposomes (cDNA containing) that fuse with the cell membranes.

Експресиране на CTLA4 мутантни молекули може да се открие чрез методи, известни в областта на техниката. Например, мутантните молекули могат да се открият чрез оцветяване на SDS-PAGE гелове по Coomassie и имуноблотинг, използувайки антитела, които свързват CTLA4. Възстановяването на протеина може да се осъществи, като се използуват стандартни начини за пречистване на протеин, например, афинитетна хроматография, или йонно-обменна хроматография, за да се получи в основни линии чист продукт (R. Scopes in “Protein Purification, Principles Practice”, Third Edition, Springer-Verlag (1994)).Expression of CTLA4 mutant molecules can be detected by methods known in the art. For example, mutant molecules can be detected by staining CoSassie SDS-PAGE gels and immunoblotting using antibodies that bind CTLA4. Protein recovery can be accomplished using standard methods of protein purification, for example, affinity chromatography or ion exchange chromatography, to obtain essentially pure product (R. Scopes in “Protein Purification, Principles Practice” , Third Edition, Springer-Verlag (1994).

Изобретението също така предоставя разтворими CTLA4 мутантни молекули, продуцирани тук по-горе.The invention also provides soluble CTLA4 mutant molecules produced herein above.

МУТАГЕНЕЗИС НА БАЗАТА НА CTLA4lg КОДОНCTLA4lg CODON BASED MUTAGENESIS

Съгласно един вариант за изпълнение на изобретението, сйат-насочен мутагенезис и нова скринираща процедура се използуват, за да се идентифицират няколко мутации във извънклетъчния домен на CTLA4, който подобрява склонността към свързване към CD86. Съгласно този вариант за изпълнение, мутации се осъществяват в остатъци в областите на извънклетъчния домен на CTLA4 от серин 25 до аргинин 33, С’ верига (аланин 49 и треонин 51), F веригата (лизин 93, глутаминова киселина 95 и левцин 96), и в областта от метионин 97 до тирозин 102, тирозин 103 до глицин 107 и в G веригата на позиции глутамин 111, тирозин 113 и изолевцин 115. Тези сайтове се избират на базата на изследвания на химерните CD28/ CTLA4 сляти протеини (Peach et al., Exp. Med., 1994, 180:2049-2058), и на утвърдяващия модел, чиито страничните вериги на амино киселинния остатък са изложени на разтворител, и липсата от идентичност на амино киселинния остатък, или хомология на някои позиции между CD28 и CTLA4. Също така, всеки остатък, който е много близо пространсвено (5 до 20 ангстрьомни единици) до идентифицираните остатъци се смята като част от настоящето изобретение.According to one embodiment of the invention, siat-directed mutagenesis and a novel screening procedure are used to identify several mutations in the extracellular domain of CTLA4 that enhance the propensity for binding to CD86. According to this embodiment, mutations are made in residues in regions of the extracellular domain of CTLA4 from serine 25 to arginine 33, C 'chain (alanine 49 and threonine 51), F chain (lysine 93, glutamic acid 95 and leucine 96). and in the methionine 97 to tyrosine 102, tyrosine 103 to glycine 107 and G chain positions of glutamine 111, tyrosine 113 and isoleucine 115. These sites are selected based on studies of chimeric CD28 / CTLA4 fusion proteins (Peach et al. , Exp. Med., 1994, 180: 2049-2058), and of the validation model, whose side chains of the amino acid residue are exposed solvents, and the lack of amino acid residue identity, or homology at some positions between CD28 and CTLA4. Also, any residue that is very close in space (5 to 20 angstrom units) to the identified residues is considered to be part of the present invention.

За синтезирането и за скринирането на разтворими CTLA4 мутантни молекули с променен афинитет към CD80 или CD86, есе приема дву-степенна стратегия. Експериментите най-напред установяват генериране на библиотека от мутации на специфичния кодон на една извънклетъчна част от CTLA4, и след това скринирането им чрез BIAcore анализ, за да се идентифицират мутантите с променена реактивност към CD80, или CD86. Системата за изследване Biacore (Pharmacia, Piscatway, N.J.) използува детекторна система на повърхностен резонанс на плазмон, която в основни линии включва ковалентно свързване било на CD80lg, било на CD86lg към декстран-покрит сензорен чип, който се намира в детектора. След това изпитателната молекула може да се инжектира в камера, съдържаща сензорния чип, и количеството комплементарен протеин, който се свързва, може да се оцени на базата на промяната в молекулната маса, която физически е асоциирана с декстран-. покритата страна сензорния чип; промяната в молекулната маса може да се измери посредством детекторната система.For the synthesis and screening of soluble CTLA4 mutant molecules with altered affinity for CD80 or CD86, the essay adopts a two-step strategy. The experiments first established the generation of a library of mutations of the specific codon of an extracellular portion of CTLA4, and then screened them by BIAcore analysis to identify mutants with altered reactivity to CD80 or CD86. The Biacore assay system (Pharmacia, Piscatway, N.J.) utilizes a plasmon surface resonance detector system that basically involves covalent binding of either CD80lg or CD86lg to a dextran-coated sensor chip located in the detector. The test molecule can then be injected into a chamber containing the sensor chip, and the amount of complementary protein that binds can be estimated based on the change in the molecular weight that is physically associated with dextran-. the sensor side covered chip; the change in molecular weight can be measured by the detector system.

ПРЕДИМСТВА НА ИЗОБРЕТЕНИЕТОADVANTAGES OF THE INVENTION

Тъй като свързването на CTLA4 към CD80 и CD86 се характеризира с голяма “on” скорост и голяма скорост (“off’) на дисоцииране, и понеже CTLA4lg-CD86 комплексите се дисоциират приблизително 5- до 8-пъти по-бързо, отколкото CTLA4lgCD80 комплексите, резонно е, че забавянето на скоростта на дисоцииране на CTLA4lg от CD80 и/или CD86 би довело до молекули с по-мощни имуносупресорни свойства. Така, разтворими CTLA4 мутантни молекули, имащи по-висока активност към CD80- или CD86- позитивни клетки, в сравнение с див тип CTLA4, или не-мутирали форми на CTLA4lg, се приемат да блокират праймирането на антиген специфично активирани клетки с по-голяма резултатност, отколкото див тип CTLA4, или не-мутирали форми на CTLA4lg.Because the binding of CTLA4 to CD80 and CD86 is characterized by a high on-rate and a high “off” rate of dissociation, and because the CTLA4Ig-CD86 complexes dissociate approximately 5 to 8 times faster than the CTLA4IgCD80 complexes , it is reasonable that slowing the rate of dissociation of CTLA4lg from CD80 and / or CD86 would lead to molecules with more potent immunosuppressive properties. Thus, soluble CTLA4 mutant molecules having higher activity against CD80- or CD86-positive cells than wild-type CTLA4 or non-mutated forms of CTLA4lg are accepted to block the antigen-specific activation of cells with greater activity results than wild-type CTLA4, or non-mutated forms of CTLA4lg.

Освен това, продуцирането на CTI_A4lg струва много скъпо. Мутантните молекули CTLA4lg с висока склонност, имащи по-високи имуносупресорни свойства, могат да се използуват в клиниката, в значително по-ниски дози, отколкото не-мутирали CTI_A4lg, за постигане на подобни нива на имуносупресиране. Така, разтворими CTLA4 мутантни молекули, например, L104EA29Yig, могат да имат много скъпа ефективност.In addition, producing CTI_A4lg is very expensive. High-prone CTLA4lg mutant molecules with higher immunosuppressive properties can be used in the clinic at significantly lower doses than non-mutated CTI_A4lg to achieve similar levels of immunosuppression. Thus, soluble CTLA4 mutant molecules, for example, L104EA29Yig, can have very expensive efficiencies.

Следващите примери са представени, за да илюстрират настоящето изобретение, и да подпомогнат специалистите в областта на техниката при получаването, и при използуването на същите. Примерите не ограничават по никакъв начин обхвата на изобретението.The following examples are presented to illustrate the present invention and to assist those skilled in the art in the preparation and use thereof. The examples do not in any way limit the scope of the invention.

ПРИМЕРИEXAMPLES

Пример 1Example 1

Този пример дава описание на методите, използвани за създаване на нуклеотидни последователности, кодиращи разтворимите CTLA4 мутантни молекули на изобретението. Създаден е мутант с единичен сайт L104Elg и е тестиран за кинетика на свързване с CD80 и/или CD86. L104Elg нуклеотидната последователност е използвана като матрица за създаване на дву-сайтова г* мутантна CTLA4 последователност, L104EA29Ylg, която е тестирана за кинетика на свързване с CD80 и/или CD86.This example describes the methods used to create nucleotide sequences encoding the soluble CTLA4 mutant molecules of the invention. A single site mutant L104Elg was created and tested for kinetics of binding to CD80 and / or CD86. The L104Elg nucleotide sequence was used as a template to create a two-site r * mutant CTLA4 sequence, L104EA29Ylg, which was tested for binding kinetics to CD80 and / or CD86.

Мутагенеза на базата на CTLA4lg кодон:Mutagenesis based on CTLA4lg codon:

Създадена е стратегия за мутагенеза и скрининг за идентифициране на CTLA4lg молекули, които имат по-бавна скорост на дисоциация (“off’ скорости) в сравнение с CD80 и/или CD86 молекули. Създадени са мутантни нуклеотидни последователности с единичен сайт като е използван CTLA4lg (U.S. Patent Nos: 5,844,095; 5,851,795; и 5,851,796; ATCC ключов No.68629) като матрица. Мутагенни олигонуклеотидни PCR праймери са планирни за случайна мутагенеза на специфичен кДНК кодон, като се допуска всяка база в позиции 1 и 2 на кодона, но само гуанин или тимидин в позиция 3 (XXG/T; също известен като NNG/T). По този начин, специфичен кодон, кодиращ аминокиселина, може да бъде случайно мутиран да кодира всяка от 20-те аминокиселини. В това отношение, XXG/T мутагенеза дава 32 потенциални кодона, кодиращи всяка от 20-те аминокиселини. PCR продукти, кодиращи мутации в непосредствена близост до -M97-G107 на CTLA4lg (виж Фигура 7 (SEQ ID NOS:3 и 4) или 8 (SEQ ID NOS: 5 и 6)), са хидролизирани със Sacl/Xbal и са субклонирани в подобен отрязък CTLA4lgTtLN (известен още като piLN) екстпресионен вектор. Този метод е използван за създаване на единичен-сайт CTLA4 мутантната молекулаИ04Е1д (Фигура 8 (SEQ ID NOS: 5 и 6).A mutagenesis and screening strategy has been developed to identify CTLA4lg molecules that have slower dissociation rates (“off” rates) than CD80 and / or CD86 molecules. Single-site mutant nucleotide sequences were created using CTLA4Ig (U.S. Patent Nos: 5,844,095; 5,851,795; and 5,851,796; ATCC key No.68629) as a template. Mutagenic oligonucleotide PCR primers are scheduled for random mutagenesis of a specific cDNA codon, allowing each base at codon positions 1 and 2, but only guanine or thymidine at position 3 (XXG / T; also known as NNG / T). Thus, a specific codon encoding an amino acid can be randomly mutated to encode each of the 20 amino acids. In this regard, XXG / T mutagenesis yields 32 potential codons encoding each of the 20 amino acids. PCR products encoding mutations in close proximity to CTLA4lg -M97-G107 (see Figure 7 (SEQ ID NOS: 3 and 4) or 8 (SEQ ID NOS: 5 and 6)) were hydrolyzed with Sacl / Xbal and subcloned in a similar section CTLA4IgTtLN (also known as piLN) expression vector. This method was used to create a single-site CTLA4 mutant molecule IV04E1g (Figure 8 (SEQ ID NOS: 5 and 6).

За мутагенеза в близост до S25-R33 на CTLA4lg, един тих Nhel сайт най-напред е въведен от 5’ края на тази бримка, с PCR праймер-насочена мутагенеза. PCR продукти са хидролизирани с Nhel/Xbal и са субклонирани в подобно срязани CTLA4lg или L104Eig експресионни вектори. Този метод е използван за създаване на ^w двоен сайт CTLA4 мутантна молекула L104EA29Ylg (Фигура 7; SEQ ID NOS: 3 и 4). По-специално, молекулата нуклеинова киселина, кодираща единичен-сайт CTLA4 мутантната молекула, L104Elg, е използвана като матрица за създаване на двоен-сайт CTLA4 мутантната молекула, L104EA29Ylg. Векторът piLN, притежаващ L104EA29Ylg е представен във Фигура 12.For mutagenesis near CT254gg S25-R33, a silent Nhel site was first introduced at the 5 'end of this loop, by PCR primer-directed mutagenesis. PCR products were hydrolyzed with Nhel / Xbal and subcloned into similarly cut CTLA4Ig or L104Eig expression vectors. This method was used to create the ^w double site CTLA4 mutant molecule L104EA29Ylg (Figure 7; SEQ ID NOS: 3 and 4). In particular, the nucleic acid molecule encoding a single-site CTLA4 mutant molecule, L104Elg, was used as a template to create a double-site CTLA4 mutant molecule, L104EA29Ylg. The piLN vector having L104EA29Ylg is presented in Figure 12.

Пример 2Example 2

Следващото дава описание на скрининг методите, използвани за идентифициране на единичен- и двоен-сайт CTLA4 полипептиди, експресирани от конструктите, описани в Пример 1, които проявяват по-висока свързваща склонност за CD80 и CD86 антигени, в сравнение с не-мутираните CTLA4lg молекули.The following describes the screening methods used to identify single- and double-site CTLA4 polypeptides expressed by the constructs described in Example 1 that exhibit a higher binding tendency for CD80 and CD86 antigens than non-mutated CTLA4Ig molecules .

Настоящи in vitro и in vivo проучвания показват, че CTLA4lg сам по себе си не е способен напълно да блокира праймирането на антиген специфично активирани Т клетки. Проучвания in vitro с CTLA4lg и или моноклонално антитяло, специфично за CD80, или CD86 измеримо инхибиране на Т клетъчна пролиферация показват, че анти-CDeo моноклонално антитяло не увеличава CTLA4lg инхибиране. Обаче, анти- CD86 моноклонално антитяло увеличава CTLA4lg инхибирането, което показва, че CTLA4lg не е така ефективно за блокиране на CD86 взаимодействията. Тези данни подчертават по-ранните заключения направени от Linsley et al. (Immunity, (1994), 1:793-801), показвайки инхибиране на С080-медиирани клетъчни отговори, изискващи приблизително 100 пъти по-ниски CTLA4lg концентрации, отколкото за СО86-медиирани отговори. На базата на тези заключения, предполага се, че разтворими CTLA4 мутантни молекули, имащи по-голяма склонност за CD86, отколкото див тип CTLA4 трябва да са по-способни да блокират прайминга на антиген специфично активирани клетки, отколкото CTLA4lg.Current in vitro and in vivo studies indicate that CTLA4Ig alone is not capable of completely blocking the antigen priming of specifically activated T cells. In vitro studies with CTLA4Ig and either a CD80-specific monoclonal antibody or CD86 measurable inhibition of T cell proliferation show that anti-CDeo monoclonal antibody does not increase CTLA4Ig inhibition. However, anti-CD86 monoclonal antibody increases CTLA4lg inhibition, indicating that CTLA4lg is not as effective for blocking CD86 interactions. These data underscore earlier findings by Linsley et al. (Immunity, (1994), 1: 793-801), showing inhibition of CD80-mediated cellular responses requiring approximately 100-fold lower CTLA4Ig concentrations than for CD86-mediated responses. Based on these findings, it is suggested that soluble CTLA4 mutant molecules having a greater propensity for CD86 than wild-type CTLA4 should be more capable of blocking the priming of antigen by specifically activated cells than CTLA4Ig.

Към този край, разтворимите CTLA4 мутантни молекули, описани в пример 1 по-горе се скринират, използувайки процедура на скриниране за идентифициране на няколко мутации в извънклетъчния домен на CTLA4, който подобрява склонността за свързване за CD80 и CD86. Тази стратегия на скриниране предоставя ефективен метод за директно идентифициране на мутанти с очевидно ниски “off” скорости без необходимостта от пречистване на протеина, или количествено определяне тъй като “off” скоростното определяне е независимо от концентрация (O’Scannessy et al., (1993) Anal. Biochem., 212:457-468).To this end, the soluble CTLA4 mutant molecules described in Example 1 above were screened using a screening procedure to identify several mutations in the extracellular domain of CTLA4 that enhanced the binding propensity for CD80 and CD86. This screening strategy provides an effective method of directly identifying mutants with apparently low off-speeds without the need for protein purification, or quantification since off-speed determination is concentration-independent (O'Scannessy et al., (1993 Anal. Biochem. 212: 457-468).

COS клетки се трансфектират c индивидуален miniprep пречистен c плазмидна ДНК и разпространен в продължение на няколко дни. Три дневна културална среда се прилага върху BIAcor биосензорни чипове (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden) покрити c разтворим CD80lg, или CD86lg. Специфичното свързване и дисоцииране на мутантни протеини се измерва чрез повърхностен резонанс на плазмон (O’Shannessy, D. J., (1993) Anal. Biochem. 212:457-468). Всички експерименти се провеждат с BIAcor™, или BIAcor™ 2000 биосензори при 25°С. Лиганди се обездвижват със сензорни чипове NCM5 чисти за анализ (Pharmacia), използувайки стандартно М-етил-№-(диметиламинопропил) карбодиимидИ-хидроксисукцинимид свързване (Johnson, В., et al. (1991) Anal. Biochem. 198: 268-277; Khilko,COS cells were transfected with individual miniprep purified with plasmid DNA and spread over several days. Three day culture medium was applied to BIAcor biosensor chips (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden) coated with soluble CD80Ig or CD86Ig. Specific binding and dissociation of mutant proteins is measured by plasmon surface resonance (O'Shannessy, D. J., (1993) Anal. Biochem. 212: 457-468). All experiments were performed with BIAcor ™ or BIAcor ™ 2000 biosensors at 25 ° C. Ligands are immobilized with NCM5 pure assay chips (Pharmacia) using standard N-ethyl-N- (dimethylaminopropyl) carbodiimide-hydroxysuccinimide binding (Johnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198: 268-277 ; Khilko,

S. N., etal. (1993) J. Biol. Chem 268:5425-15434).S. N., etal. (1993) J. Biol. Chem 268: 5425-15434).

Метод на скриниранеScreening method

COS клетки, прорастнали в 24 ямкава блюда с тъканна култура се трансфектират влеменно с ДНК кодиращ мутант CTLA4lg. Културална среда, съдържаща секретиран разтворим мутант CTLA4lg се събира 3 дена по-късно.COS cells grown in 24 well tissue culture dishes were transiently transfected with the DNA coding mutant CTLA4lg. A culture medium containing secreted soluble CTLA4lg mutant was harvested 3 days later.

Кондиционирана COS клетъчна културална среда се оставя да тече върху BIAcor биосензорни чипове, производни от CD86lg, или CD80lg (както е описано в Green et al., 1996 J. Biol. Chem. 271:26762-26771), и мутантни молекули се идентифицират с “off’ скорости по-бавни от тези, наблюдавани за див тип CTLA4lg. сДНК съответствуваща на избраните проби от средата се секвенира, и се получава ДНК, за да се даде възможност за по-голяма гама на временно трансфектиране на COS клетки, от които се получава мутантен CTLA4lg протеин, последван от А пречистване на културална среда.Conditioned COS cell culture medium was allowed to flow onto BIAcor biosensor chips derived from CD86Ig or CD80Ig (as described in Green et al., 1996 J. Biol. Chem. 271: 26762-26771), and mutant molecules were identified with 'Off' speeds slower than those observed for wild-type CTLA4lg. The cDNA corresponding to the selected media samples was sequenced and DNA was obtained to allow for a greater range of transient transfection of COS cells to produce a mutant CTLA4Ig protein followed by A purification of the culture medium.

Данни за условията от BIAcor анализ и данни равновесие на свързване се получават, както се описва в J. Green et al. 1996 J. Biol. Chem. 271:26762-26771, и както е описано тук.BIAcor assay condition data and binding equilibrium data are obtained as described in J. Green et al. 1996 J. Biol. Chem. 271: 26762-26771, and as described herein.

Данни от BIAcor анализData from BIAcor analysis

Базовата линия на Senosorgram се нормализира на нула единици отговор (RU) преди анализа. Пробите се преливат над mock-производни протичащи клетки за определяне стойностите на единицата (RU) на отговора на фона, дължаща се на големината на различията на индекси на рефракция между разтвори. Равновесните константи на дисоциация (K_d) се изчисляват от чертежите на R_eq спрямо С, където R_eq е отговора с постоянно състояние минус отговора на mock-производен чип, и С е моларната концентрация на анализа. Кривите на свързване се анализират, използувайки търговски нелинеен софтуер за чертане на криви (Prism, GraphPAD Sostware).The Senosorgram baseline was normalized to zero response units (RU) before analysis. Samples were poured over mock-derived flow cells to determine the unit response value (RU) of the background response due to the magnitude of the refractive index differences between solutions. The equilibrium dissociation constants (K _d ) are calculated from the drawings of R _{eq with} respect to C, where R _eq is the steady-state response minus the mock-derivative chip response, and C is the molar concentration of the assay. Link curves are analyzed using commercially available nonlinear curve drawing software (Prism, GraphPAD Sostware).

Експериментални данни най-напред се измерват на модела за свързване на единична лиганда към единичен рецептор (1-сайтов модел, например, обикновенна система langmuir, Α+ΒθΑΒ), и равновесни асоциационни константи (Κ_ά=[Α]·[Β]\[ΑΒ]) се изчисляват от уравнението R=Rmax*C/(K_d+C). След това данните се измерват на най-простия дву-сайтов модел за свързване на лиганда (например, към рецептор, имащ два не-взаимодействуващи си независимо свързващи сайтове, както се описва от уравнението R=Rmax1*C\(K_di+C)+R_max2*(K_d2+C)).The experimental data are first measured on the single ligand binding model to the single receptor (1-site model, for example, the ordinary langmuir system, Α + ΒθΑΒ), and equilibrium association constants (Κ _ά = [Α] · [Β] \ [ΑΒ]) are calculated from the equation R = Rmax * C / (K _d + C). The data are then measured on the simplest two-site ligand binding model (for example, to a receptor having two non-interacting independently binding sites, as described by the equation R = Rmax1 * C \ (K _d i + C ) + R _max 2 * (K _d 2 + C)).

Най-силните подготовки на тези модели се анализират визуално, като се сравняват с експериментални данни и статистически чрез F изследване със суми от квадрати. По-простият едно-сайтов модел се избира като най-доброто измерване, освен в случаите, когато измерването на дву-сайтовия модел е значително по-добро (р<0,1).The strongest preparations of these models are analyzed visually by comparing them with experimental data and statistically by means of an F study with sums of squares. The simpler one-site model is chosen as the best measurement, except when the measurement of the two-site model is significantly better (p <0.1).

Асоциационни и дисоциационни анализи се осъкествяват, използувайки BIA evaluation 2.1 Software (Pharmacia). Скоростната константа на асоциация к_оп се изчислява по два начина, допускайки и хомогенни едно-сайтови взаимодействия, и успоредни дву-сайтови взаимодействия. За едно-сайтови взаимо действия, к_оп стойностите се изчисляват съгласно уравнението Rt=R_eq(1-exp’^ks(t'^to), където Rt е отговор на определено време, t; Req е отговор в постоянно състояние; to е времето на началото на инжектирането; и ks=dR/dt=kon*CkOffq и където С е аналитичната концентрация, изчислена като мономерни свързващи сайтове. За дву-сайтови взаимодействия, kon стойностите се изчисляват съгласно уравнението Rt=Req(1-exp'^ks1(t’^to⁾+Req2(1-exp^ks2(t'^to⁾. За всеки модел, стойностите на k_on се определят от изчисления наклон (до приблизително 70% максимална асоциация) на чертежа на k_s спрямо С.Association and dissociation analyzes were performed using BIA evaluation 2.1 Software (Pharmacia). The rate constant of association k _op is calculated in two ways, assuming both homogeneous one-site interactions and parallel two-site interactions. For single-site interactions, k _op values are calculated according to the equation Rt = R _e q (1-exp ' ^{ks (t} ' ^t o), where Rt is a fixed-time response, t; Req is a steady-state response; to is the time of onset of injection; and ks = dR / dt = kon * CkOffq and where C is the analytic concentration calculated as the monomer binding sites. For two-site interactions, kon values are calculated according to the equation Rt = Req (1-exp ' ^{ks1 (t} ' ^t o ⁾ + Req2 (1-exp ^{ks2 (t} ' ^t o ⁾ . For each model, the values of k _on are determined by the calculated slope (up to approximately 70% maximum association) per line hedgehog of k _s versus C.

^w Дисоциационни данни се анализират съгласно модели с един сайт (АВ=А+В), или с два сайта (AiBj=Ai+Bj), и скороства константа (к_оп) се изчислява от най-добре измерените криви. Модела на свързващ сайт се използува с изключение на случаи, когато остатъчните са по-големи отколкото фона на апаратурата (2-10 RU, съгласно апаратура), като в такъв случай се използува модела с два свързващи сайта. Полу-времето на заемането от рецептора се изчислява, използувайки отношението ti/₂=0,693/k_off. ^w Dissociation data are analyzed according to single site (AB = A + B) or two site (AiBj = Ai + Bj) models, and the rate constant (k _o n) is calculated from the best measured curves. The link site model is used except where the residuals are larger than the background of the apparatus (2-10 RU, according to the equipment), in which case the model with two link sites is used. The half-life of receptor uptake is calculated using the ratio ti / ₂ = 0.693 / k _of f.

^v Поточна цитрометрия ^v Current cytometry

Миши гпАЬ1_307.4 (анти-С080) се купува от Becton Dickinson (San Jose, California), a IT2.2 (анти-В7-0 [също така известно като CD86]), от Pharmingen (San Diego, California). За имунооцветяване, СО80-позитиви и/или СО86-позитиви СНО клетки се отнемат от с техните културални съдове чрез инкубиране във физиологичен разтвор буфериран с фосфатен буфер (PBS), съдържащ 10 mM EDTA. Клетките СНО (1-10 х 10⁵) найнапред се инкубират с mAbs, или имуноглобелин слят протеин в DMEM, съдържащ 10 % ембрионален говежде серум (FBS),Mouse rnAl1_307.4 (anti-CD80) was purchased from Becton Dickinson (San Jose, California), and IT2.2 (anti-B7-0 [also known as CD86]), from Pharmingen (San Diego, California). For immunostaining, CD80-positive and / or CD86-positive CHO cells were removed from their culture vessels by incubation in phosphate-buffered saline (PBS) containing 10 mM EDTA. CHO cells (1-10 x 10 ⁵ ) were first incubated with mAbs or immunoglobulin fusion protein in DMEM containing 10% fetal bovine serum (FBS),

/ съответствуващ на последните седем амино киселини (например, амино киселини 118 - 124) в извънклетъчния домен на CTLA4, и съдържащ рестрикционен ензимен сайт, и стоп кодон (TGA). обратния праймер специфицирал C120S (цистеин до серин на позиция 120) мутация. По-специално, нукпеотидната последователност GCA (нуклеотиди 34 - 36) на обратния праймер, показан по-горе, се реплицира с една от следните нуклеотидни последователности: AGA, GGA, TGA, CGA, ACT, или GCT. Ккато забелязват специалистите в областта на техниката, нукпеотидната последователност GCA е обратна комплементарна последователност на кодона TGC за цистеин. По подобен начин, нуклеотидните последователности AGA, GGA, TGA, CGA, ACT, или GCT са обратни комплементарни последователности на кодона за серин. Продукти на верижна реакция на полимераза се усвояват с Hind/lll/Xbal и направо се субклонират в експресионния вектор πΙ_Ν (Bristol-Myers Squibb Company, Princeton, NJ). L1O4EA29YX_Ci2os се получава no идентичен начин. Всяка структура се проверява чрез ДНК секвениране./ corresponding to the last seven amino acids (eg, amino acids 118 - 124) in the extracellular domain of CTLA4, and containing a restriction enzyme site, and a stop codon (TGA). the reverse primer specified a C120S (cysteine to serine at position 120) mutation. In particular, the GCA nucleotide sequence (nucleotides 34-36) of the reverse primer shown above is replicated with one of the following nucleotide sequences: AGA, GGA, TGA, CGA, ACT, or GCT. As noted by those skilled in the art, the GCA nucleotide sequence is the inverse complementary sequence of the cysteine codon TGC. Similarly, the nucleotide sequences of AGA, GGA, TGA, CGA, ACT, or GCT are inverse complementary sequences of the codon for serine. Polymerase chain reaction products were digested with Hind / III / Xbal and directly subcloned into the πΙ_Ν expression vector (Bristol-Myers Squibb Company, Princeton, NJ). L1O4EA29YX _C i2os is obtained in an identical manner. Each structure is verified by DNA sequencing.

Идентифициране и биохимично охарактеризиране на мутанти с голяма склонностIdentification and biochemical characterization of mutants with high propensity

Двадесет и четири амино киселини се избират за мутагенезис и получените ~ 2300 метантни протеини се изследват за CD86lg свързване с резонанс на повърхностен плазмон (SPR; както се описва, supra). Предоминантните ефекти на мутагенезиса на всеки сайт се сумират в таблица II. Рандомизиран мутагенезис на някои амино киселини в S25 - R33 видимо не изменят свързването на риганда. Мутагенезис на Е31 и R33 и остатъци М97 - Y102 видимо водят до намаляване свързването на лиганда. Мутагенезис на остатъци, S25, А29, и ТЗО, К93, L96, Υ103, L104, и G105, водят до протеини с малки “on” и/или малки “off” скорости. Тези резултати потвърждават схващането, че остатъци в областта S25 - R33, и остатъци в, или близо до М97 - Y102 влияят върху свързването на лиганда (Peach etal., (1994) J. Exp. Med., 180:2049-2058.Twenty-four amino acids are selected for mutagenesis, and the resulting ~ 2300 methantine proteins are assayed for CD86lg surface plasmon resonance coupling (SPR; as described, supra). The pre-dominant effects of mutagenesis at each site are summarized in Table II. Randomized mutagenesis of some amino acids in S25 - R33 does not appear to alter the binding of the rigand. E31 and R33 mutagenesis and M97 - Y102 residues apparently lead to a decrease in ligand binding. Mutagenesis of residues, S25, A29, and SCI, K93, L96, Υ103, L104, and G105, results in proteins with small “on” and / or small “off” speeds. These results support the notion that residues in the S25-R33 region and residues in or near M97-Y102 affect ligand binding (Peach et al., (1994) J. Exp. Med., 180: 2049-2058.

Мутагенезис на сайтове S25, ТЗО, К93, L96, Y103, и G105 водят до идентифицциране на някои мутантни протеини, които са имали по-малки “off’ скорости от CD86lg. Обаче, в такива моменти, HHCKaTa“off’ скорост се компрометира от ниската “onf скорост, която води до мутантни протеини с повече склонност за CD86lg, отколкото е било очевидно подобно на това, наблюдавано с див тип CTI_A4lg. Освен това, мутагенезис на Н93 води до значително агрегиране, което може да е отговорно за наблюдаваните кинетични промени.Mutagenesis of sites S25, SCI, K93, L96, Y103, and G105 led to the identification of some mutant proteins that had lower "off" rates than CD86lg. However, at such times, the HHCKaTa 'off' rate is compromised by the low 'onf' rate, which results in mutant proteins with a greater propensity for CD86lg than was apparently similar to that observed with wild-type CTI_A4lg. In addition, mutagenesis of H93 leads to significant aggregation, which may be responsible for the observed kinetic changes.

Рандомна мутагенеза на L104, последвана от трансфектиране на COS клетки и скриниране с SPR на пробите културална среда върху неподвижен CD86lg дава шест проби на културална среда, съдържащи мутантни протеини с приблизително 2-кратно по-малки “off’ скорости, отколкото див тип CTLA4lg. Когато съответстващата сДНК на тези мутанти се секвенира, установява се, че всеки един кодира левцин до глутаминова киселина мутация (L104E). Очевидно, заместване на левцин 104 до аспарагинова киселина (L104D) не засяга CD86lg свързване.Random mutagenesis of L104, followed by transfection of COS cells and screening with SPR of samples of culture medium on immobile CD86lg yields six samples of culture medium containing mutant proteins at approximately 2-fold lower "off" rates than wild-type CTLA4lg. When the corresponding cDNA of these mutants is sequenced, it is found that each encodes a leucine to glutamic acid mutation (L104E). Obviously, the substitution of leucine 104 to aspartic acid (L104D) does not affect CD86Ig binding.

След това мутагенезата се повтаря за всеки от сайтовете, изброени в таблицаП, използувайки в това време L104E като PCR матрица вместо див тип CTLA4lg, съгласно описаното погоре. SPR анализ, използуващ отново обездвижен CD86lg, идентифицирани шест проби културална среда от мутагенезиса на аланин 29 с протеини, имащи приблизително 4-кратно помълки “off” скорости, отколкото див тип CTLA4lg. Двата найбавни са тирозин замествания (L104EA29Y), два са тирозин (L104EA29L), един е триптофан (L104EA29W), и един е треонин (L104EA29T). Очевидно, мутанти с не-малка “off’ скорост се идентифицират, когато аланин 29 е мутирал рандомизирано, сам, в див тип CTLA4lg.The mutagenesis was then repeated for each of the sites listed in Table II, using at this time L104E as a PCR matrix instead of wild-type CTLA4Ig, as described above. SPR analysis using re-immobilized CD86Ig identified six samples of alanine 29 mutagenesis culture medium with proteins having approximately 4-fold "off" speeds than wild-type CTLA4Ig. The two slowest are tyrosine substitutions (L104EA29Y), two are tyrosine (L104EA29L), one is tryptophan (L104EA29W), and one is threonine (L104EA29T). Obviously, mutants with a low "off" rate are identified when alanine 29 mutated randomly, alone, in wild-type CTLA4lg.

Относителната молекулна маса и състояние на агрегация на пречистен L104E и L104EA29Yig се оценяват посредством SDS-PAGE и хроматография с изключване по размер. L104EA29Yig (~ 1 цд; ивица 3) и L104Eig (~ 1 цд; ивица 2) очевидно имат еднаква електрофоретична подвижност като CTLA4lg (~ 1 цд; ивица 1) в условия на редуциране (~ 50 kDa; + βΜΕ; плюс 2-меркаптоетанол) и в не-редукционни (- 100 kDa; - βΜΕ) условия (фигура 10А).The relative molecular weight and aggregation state of purified L104E and L104EA29Yig were evaluated by SDS-PAGE and size exclusion chromatography. L104EA29Yig (~ 1 µg; lane 3) and L104Eig (~ 1 μg; lane 2) apparently have the same electrophoretic mobility as CTLA4lg (~ 1 μg; lane 1) under reducing conditions (~ 50 kDa; + βΜΕ; plus 2-mercaptoethanol ) and under non-reducing (- 100 kDa; - βΜΕ) conditions (Figure 10A).

Хроматографията с изключване по размер демонстрира, че L104EA29Ylg (фигура 10С) очевидно има същата подвижност както димерен CTLA4lg (фигура 10В). Главният пик представлява протеин димер, докато малкият пик на по-бавно елуиране на фигура 10В представлява агрегати с по-голямо молекулно тегло. Приблизително 5,0 % от CTLA4lg се представят като агрегати с по-голямо молекулно тегло, но няма очевидност за агрегиране на L104EA29Ylg, или L104Elg. Поради това, поздравото свързване към CD86lg, наблюдавано с L104Elg и L104EA29Yig не би трябвало да се причислява към агрегация, индуцирана от мутагенезис.Size exclusion chromatography demonstrates that L104EA29Ylg (Figure 10C) clearly has the same mobility as dimeric CTLA4lg (Figure 10B). The major peak is a protein dimer, while the smaller peak of slower elution in Figure 10B is aggregates with a higher molecular weight. Approximately 5.0% of CTLA4Ig is presented as higher molecular weight aggregates, but there is no evidence of aggregation of L104EA29Ylg or L104Elg. Therefore, the congenital binding to CD86lg observed with L104Elg and L104EA29Yig should not be considered as mutagenesis induced aggregation.

Анализ на равновесие и кинетика на свързванетоEquilibrium analysis and binding kinetics

Анализът на равновесие и кинетика на свързването се осъществява с протеин А пречистени CTLA4lg, L104Elg, иEquilibrium analysis and binding kinetics were performed with protein A purified CTLA4Ig, L104Elg, and

L104EA29Yig, използувайки повърхностен резонанс на плазмон (SPR). Резултатите са показани на таблица I. Наблюдаваната равновесна дисоциационна константа (K_d; таблица I), се изчислява от кривите на свързване, генерирани в обхват от концентрации (5,0 - 200 пМ). L104EA29Yig се свързва по-здраво към CD86lg, отколкото L104Elg, или CTLA4lg. По-ниската K_d на L104EA29Yig (3,2 пМ), отколкото на L104Elg (6,06 пМ), или на CTLA4lg (13,9 пМ), показва по-висока склонност за свързване на L104EA29Yig към CD86lg. По-ниската K_d на L104EA29Yig (3,66 пМ), отколкото на L104Elg (4,47 пМ), или на CTLA4lg (6,51 пМ), показва по-висока склонност за свързване на L104EA29Yig към CD80lg.L104EA29Yig using surface plasmon resonance (SPR). The results are shown in Table I. The observed equilibrium dissociation constant (K _d ; Table I) is calculated from the binding curves generated in the concentration range (5.0 - 200 nM). L104EA29Yig binds more tightly to CD86lg than L104Elg or CTLA4lg. A lower K _d of L104EA29Yig (3.2 nM) than L104Elg (6.06 nM) or CTLA4lg (13.9 nM) showed a higher propensity for binding L104EA29Yig to CD86lg. A lower K _d of L104EA29Yig (3.66 nM) than L104Elg (4.47 nM) or CTLA4lg (6.51 nM) showed a higher tendency to bind L104EA29Yig to CD80lg.

Анализът на кинетиката на свързване разкрива, че сравнителните “on” скорости за CTLA4lg, L104Elg, и L104EA29Yig свързване кам CD80 са подобни, както са “on” скоростите за CD86lg (таблица I). Обаче, “off’ скоростите на тези молекули не са еквивалентни (таблица I). В сравнение с CTLA4lg, L104EA29Ylg има приблизително 2-кратно по-малка “off” скорост от CD80lg, и приблизително 4-кратно по-малка “off’ скорост от CD86lg. L104E има “off” скорости междинни между L104EA29Yig и CTLA4lg. Тъй като въвеждането на такива мутации не засяга чувствително “on” скоростите, повишаването на склонността за CD80lg и CD86lg, наблюдавана с L104EA29Yig като че ли се дължи първостепенно на понижение на “off’ скоростите.Analysis of binding kinetics reveals that the comparative “on” rates for CTLA4lg, L104Elg, and L104EA29Yig binding cam CD80 are similar to the “on” rates for CD86lg (Table I). However, the “off” velocities of these molecules are not equivalent (Table I). Compared to CTLA4lg, the L104EA29Ylg has an approximately 2x lower “off” speed than CD80lg, and approximately 4x lower “off” speeds than CD86lg. The L104E has “off” speeds intermediate between L104EA29Yig and CTLA4lg. As the introduction of such mutations does not significantly affect the "on" speeds, the increased propensity for CD80lg and CD86lg observed with L104EA29Yig appears to be primarily due to a decrease in "off" speeds.

За да се определи дали повишаването на склонността на L104EA29Ylg за CD86lg и CD80lg се дължи на мутациите, засягащи начина, по който всеки един мономер се асоциира като димер, или дали има склонност, усилваща структурни промени, въвесени във всеки мономер, едноверижни структури от извънклетъчни домени на CTLA4 и L104EA29Y се получават след мутагенезис на цистеин 120 до серин, съгласно описаното supra, и от Linsley et al., (1995) J. Biol. Chem., 270:15417-15424. Пречистените протеини CTI_A4X_Ci2os и L1O4EA29YX_Ci2os показват, че са мономерни чрез гел проникваща хроматография (Linsley et al., (1995), supra), преди свойствата на техните лиганди за свързване да се анализират чрез SPR. Резултатите показват, че афинитетът към свързване на двата мономерни протеина към CD86lg са приблизително 35 - 8—кратно помалки, отколкото наблюдаваните за техните съответни димери (таблица I). Това поддържа публикуваните преди това данни, установяващи, че димеризирането на CTLA4 се изисква за лиганди с голяма склонност към свързване (Green et al., (1996) J. Biol. Chem., 271:26762-26771).To determine whether the increase in the propensity of L104EA29Ylg for CD86lg and CD80lg is due to mutations affecting the way that each monomer associates as a dimer, or whether there is a tendency to enhance structural changes introduced into each monomer, single-stranded extracellular structures domains of CTLA4 and L104EA29Y are obtained after mutagenesis of cysteine 120 to serine, as described supra, and by Linsley et al., (1995) J. Biol. Chem., 270: 15417-15424. The purified CTI_A4X _C i2os and L1O4EA29YX _C i2os proteins were shown to be monomeric by gel permeation chromatography (Linsley et al. (1995), supra) before the properties of their binding ligands were analyzed by SPR. The results show that the affinity for binding of the two monomeric proteins to CD86Ig is approximately 35-8-fold lower than observed for their respective dimers (Table I). This supports the previously published data finding that the dimerization of CTLA4 is required for ligands with a high propensity to bind (Green et al., (1996) J. Biol. Chem., 271: 26762-26771).

L1O4EA29YX_Ci2os се свързва c приблизително 2-кратно поголям афинитет, отколкото CTLA4X_Ci2os както към CD80lg, така и към CD86lg. Повишеният афинитет се дължи на приблизително 3-кратно по-малка скоростна дисоцииране от двата лиганда. Поради това, по-здравото свързване на лиганди от L104EA29Y по-вероятно се дължи на усилващи склонността структурни промени, които се въвеждат във всяка една мономерна верига, по-скоро, отколкото на изменения, при които молекулата се димеризира.L1O4EA29YX _C i2os binds to approximately 2-fold greater affinity than CTLA4X _C i2os to both CD80lg and CD86lg. The increased affinity is due to approximately 3-fold slower dissociation of the two ligands. Therefore, the more robust ligand binding of L104EA29Y is more likely due to the tendency-enhancing structural changes that are introduced into each monomeric chain, rather than changes in which the molecule dimerizes.

Анализ на местоположението и структурата на усилващи склонността мутацииAnalysis of the location and structure of mutation-enhancing mutations

Структурата на течността на извънклетъчния lgV-подобен домен неотдавна беше определен посредством NMR спектроскопия (Metzler et al., (1997) Ndture Struct. Biol., 4:527-531. Това позволява акуратно местоположение на левцин 14 и аланин 29The fluid structure of the extracellular IgV-like domain was recently determined by NMR spectroscopy (Metzler et al., (1997) Ndture Struct. Biol., 4: 527-531. This allows for the accurate location of leucine 14 and alanine 29

54.54.

/»·* Чвг в тридимензионалното нагъване (Фигура 11). Левцин 104 е разположен близо до високо консервираната MYPPPY (SEQ ID N0:9) аминокиселинна последователност. Аланин 29 е разположен близо до С-терминалния край на S25-R33 областта, която е пространствено съседна на MYPPPY (SEQ ID N0:9) област. Тъй като има значително взаимодействие между остатъци в основата на тези области, има видимо не пряко взаимодействие между L104 и А29 , въпреки че те и двете съдържат част от съседна хидрофобна сърцевина в протеина. Структурните последици от двете повишаващи склонността мутации, са определени чрез моделиране. A29Y мутация може лесно да бъде настанена в цепнатината между S25-R33 областта и MYPPPY (SEQ ID N0:9) областта, и може да служи за стабилизиране конформацията на MYPPPY (SEQ ID N0:9) областта. У дивия тип CTLA4, L104 образува големи хидрофобни взаимодействия с L96 и V94 близо до MYPPPY (SEQ ID NO: 9) областта. Много невероятно е, глутаминова киселина мутацията да придобива конформация, сходна с тази на L104 по две причини. Първо, има недостатъчно пространство за да се помести по-дългата странична верига на глутаминова киселина в структурата, без значимо смущение в S25-R33 областта. Второ, енергетичните разходи за покриване на отрицателния заряд на веригата на глутаминовата киселина в хидрофобната област биха били големи. Вместо това, моделиращи проучвания предсказват, че страничната верига на глутаминовата киселина се избутва навън по повърхността, където нейните заряди могат да бъдат стабилизирани чрез солватиране. Такава конформационна промяна може лесно да бъде приспособена с G105, с минимална деформация към други остатъци в областите./ »· * Nod in three-dimensional folding (Figure 11). Leucine 104 is located close to the highly conserved MYPPPY (SEQ ID NO: 9) amino acid sequence. Alanine 29 is located near the C-terminal end of the S25-R33 region, which is spatially adjacent to the MYPPPY (SEQ ID NO: 9) region. As there is a significant interaction between residues at the base of these regions, there is a visible not direct interaction between L104 and A29, although they both contain part of an adjacent hydrophobic core in the protein. The structural consequences of the two mutation-enhancing mutations were determined by modeling. The A29Y mutation can easily be located in the cleft between the S25-R33 region and the MYPPPY (SEQ ID NO: 9) region, and may serve to stabilize the conformation of the MYPPPY (SEQ ID NO: 9) region. In wild-type CTLA4, L104 forms major hydrophobic interactions with L96 and V94 near the MYPPPY (SEQ ID NO: 9) region. It is very unlikely that a glutamic acid mutation acquires a conformation similar to that of L104 for two reasons. First, there is insufficient space to accommodate the longer glutamic acid side chain in the structure without significant interference with the S25-R33 region. Secondly, the energy costs of covering the negative charge of the glutamic acid chain in the hydrophobic region would be large. Instead, modeling studies predict that the glutamic acid side chain is pushed outward on the surface where its charges can be stabilized by solvation. Such a conformational change can easily be adapted with the G105, with minimal deformation to other debris in the areas.

Свързване на мутанти с голяма склонност към СНО клетки експресиращи CD80, или CD86Binding of mutants highly prone to CHO cells expressing CD80 or CD86

FACS анализиране (фигура 2) на свързване на CTLA4 и мутантни молекули към стабилни трансфектирани CD80+ и CD86+CHO клетки, се осаществява както се описна тук. С080-позитивни и СО86-позитивни СНО клетки се инкубират с повишаващи концентрации CTLA4lg, L104EA29Ylg, или L104Elg, и след това се промиват. Свързан имуноглобулин слят протеин се открива, използувайки флуоресцеин изотиоцианатконюгиран кози анти-човешки имуноглобулин.FACS analysis (Figure 2) of binding CTLA4 and mutant molecules to stable transfected CD80 + and CD86 + CHO cells was carried out as described herein. CD80-positive and CD86-positive CHO cells were incubated with increasing concentrations of CTLA4Ig, L104EA29Ylg, or L104Elg, and then washed. Bound immunoglobulin fusion protein was detected using fluorescein isothiocyanatoconjugated goat anti-human immunoglobulin.

Както е показано на фигура 2, CD80- позитивни и CD86позитивни СНО клетки (1,5x10⁵) се инкубират с посочените концентрации на CTLA4lg (затворени квадрати), L104EA29Ylg (кръгове), или L104Elg (триъгълници) за 2 часа при 23°С, промиват се, и се инкубират с флуоресцеин изотиоцианат-конюгиран кози анти-човешки имуноглобулин антитяло. Свързване общо на 5,000 жизнеспособни клетки се анализира (единично определяне) с FACScan, и средния интензитет на флуоресценция (MFI) се определя от данни на хистограми, използувайки PC-LYSYS. Данните се корегират за измерения фон на флуоресценция само на инкубирани клетки с втора степен на реактив (MFI = 7). Контролен L6 mAb (80 gg/ml) дава MFI < 30. Тези резултати са представителни за четири независими експерименти.As shown in Figure 2, CD80-positive and CD86-positive CHO cells (1.5x10 ⁵ ) were incubated with the indicated concentrations of CTLA4lg (closed squares), L104EA29Ylg (circles), or L104Elg (triangles) for 2 hours at 23 ° C. washed, and incubated with fluorescein isothiocyanate-conjugated goat anti-human immunoglobulin antibody. Total binding of 5,000 viable cells was assayed (single determination) with FACScan, and mean fluorescence intensity (MFI) was determined from histogram data using PC-LYSYS. Data are corrected for the measured background fluorescence of incubated cells with a second reagent grade only (MFI = 7). A control L6 mAb (80 gg / ml) gave an MFI <30. These results are representative of four independent experiments.

Свързване на L104EA29Ylg, L104Elg, и CTLA4lg към човешки С080-трансфектирани СНО клетки е приблизително еквивалентно (фигура 2А). L104EA29Ylg и L104Elg се свързват по-здраво към СНО клетки стабилно трансфектирани с човешки CD86, отколкото CTLA4lg (фигура 2В).Binding of L104EA29Ylg, L104Elg, and CTLA4lg to human CD80-transfected CHO cells is approximately equivalent (Figure 2A). L104EA29Ylg and L104Elg bind more strongly to CHO cells stably transfected with human CD86 than CTLA4lg (Figure 2B).

Функционално оценяване:Functional evaluation:

Човешки СО4-позитивни Т клетки се изолират чрез имуномагнетична негативна селекция (Linsley et al., (1992) J. Exp. Med. 176:1595-1604). Изолираните СО4-позитивни T клетки се стимулират с форбал миристат ацетат (РМА) плюс CDSO-позитивни и СО86-позитивни СНО клетки в присъствие на титриращи концентрации инхибитор. СО4-позитивни Т клетки (8 - 10 х 10⁴/ямка) се култивират в присъствие на 1 пМ РМА с, или без облъчени СНО клетъчни стимулатори. Пролиферативни отговори се измерват чрез прибавяне на 1 μθΐ/ямка от [ЗН]тимидин в продължение на 7 часа на 72 часова култура. Инхибиране на РМА плюс С080-позитивни СНО, или CD86позитивни СНО, стимулирани Т клетки чрез L104EA29Ylg и CTLA4lg се осъществява. Резултатите са показани на фигура 3. L104EA29Ylg инхибира пролиферирането на СО80-позитивни СНО клетки третирани с РМА, повече, отколкото CTLA4lg (фигура ЗА). L104EA29Ylg също е по-ефективен, отколкото CTLA4lg при инхибиране пролиферирането на СО86-позитивни СНО клетки третирани с РМА (фигура ЗВ). Поради това, L104EA29Ylg е по-мощен инхибитор иза двете - и за CD80-, и за СО86-медиирана ко-стимулиране на Т клетки.Human CD4-positive T cells were isolated by immunomagnetic negative selection (Linsley et al., (1992) J. Exp. Med. 176: 1595-1604). Isolated CD4-positive T cells were stimulated with phorbal myristate acetate (PMA) plus CDSO-positive and CD86-positive CHO cells in the presence of titrating inhibitor concentrations. CO2-positive T cells (8 - 10 x 10 ⁴ / well) were cultured in the presence of 1 nM PMA with or without irradiated CHO cell stimuli. Proliferative responses were measured by adding 1 μθΐ / well of [3H] thymidine for 7 hours per 72 hour culture. Inhibition of PMA plus CD80 positive CHO or CD86positive CHO stimulated T cells by L104EA29Ylg and CTLA4lg is accomplished. The results are shown in Figure 3. L104EA29Ylg inhibits the proliferation of CD80-positive CHO cells treated with PMA more than CTLA4lg (Figure 3A). L104EA29Ylg is also more effective than CTLA4lg in inhibiting the proliferation of PM86-treated CHO cells treated with PMA (Figure 3B). Therefore, L104EA29Ylg is a more potent inhibitor for both CD80- and CD86-mediated co-stimulation of T cells.

Фигура 4 показва инхибиране с L104EA29Ylg и CTLA4lg на алостимулирани човешки Т клетки, получени по-горе, и следващо алостимулиране с човешки В лимфобластоидна клетъчна линия (LCL) наречена РМ, която експресира CD80 и CD86 (Т клетки при 3,0 х 10⁴/ямка и РМ при 8,0 х 10³/ямка). Първично алостимулиране става за 6 дни, след това клетките се пулсират с ³Н-тимидин за 7 дни, преди да се определи инкорпориране на радиоактивен изотоп.Figure 4 shows inhibition by L104EA29Ylg and CTLA4lg of allostimulated human T cells obtained above, and subsequent allostimulation with a human B lymphoblastoid cell line (LCL) called PM, which expresses CD80 and CD86 (T cells at 3.0 x 10 ⁴ / well and PM at 8.0 x 10 ³ / well). Primary allostimulation was performed for 6 days, then the cells were pulsed with ³ H-thymidine for 7 days before determining incorporation of a radioactive isotope.

Вторично алостимулиране се осъществява както следва. Седем дневни първично алостимулирани Т клетки се събират чрез лимфоцит разделяща среда (LSM) (ICN, Aurora, OH), и остават в продължение на 24 часа. След това Т клетките се стимулират отново (вторично), в присъствие на титруващи количества CTLA4lg, или L104EA29Ylg, чрез прибавяне на РМ в същото съотношение както по-горе. Стимулиране става за 3 дни, след това клетките се пулсират като се бележат радиоактивен изотоп и се събират както по-горе. Ефектът на L104EA29Ylg върху алостимулирани Т клетки е показан на фигура 4А. Ефектът на L104EA29Ylg върху алостимулирани Т клетки е показан на фигура 4В. L104EA29Ylg инхибира и първични и вторични отговори на пролиферативни Т клетки подобре отколкото CTLA4lg.Secondary allostimulation is as follows. Seven daily primary allostimulated T cells were harvested by lymphocyte separation medium (LSM) (ICN, Aurora, OH), and remained for 24 hours. The T cells are then stimulated again (secondarily) in the presence of titrating amounts of CTLA4Ig or L104EA29Ylg by adding PM in the same ratio as above. Stimulation was performed for 3 days, after which the cells were pulsed with radiolabeling and collected as above. The effect of L104EA29Ylg on allostimulated T cells is shown in Figure 4A. The effect of L104EA29Ylg on allostimulated T cells is shown in Figure 4B. L104EA29Ylg inhibits both primary and secondary responses of proliferative T cells better than CTLA4lg.

За измерване продуцирането на цитокини (фигура 5), двойни алостимулационни плата се приготвят. След 3 дни, културалната течност се изследва, използувайки кит (набор) ELISA (Biosource, Camarillo, СА), използувайки условията, препоръчвани от производителя. Установява се, че L104EA29Ylg е помощен, отколкото CTLA4 при блокиране продуцирането на Т клетки IL-2, IL-4, и γ-IFN цитокин, след вторично алогенно стимулиране (фигури 5А - С).To measure cytokine production (Figure 5), double allostimulation plates were prepared. After 3 days, the culture fluid was examined using an ELISA kit (Biosource, Camarillo, CA) using the conditions recommended by the manufacturer. L104EA29Ylg was found to be more potent than CTLA4 in blocking the production of IL-2, IL-4, and γ-IFN T cells by cytokine after secondary allogeneic stimulation (Figures 5A - C).

Ефектите от CTLA4lg върху отговор смесени лимфоцити от маймуни (MLR) са показани на фигура 6. Мононукпеарни клетки от периферна кръв (PBMC’S; 3,5 х 10⁴ кпетки/ямка от всяка маймуна) от 2 маймуни се пречистват в среда разделяща лимфоцити (LSM) и се смесват с 2 pg/ml фитохемаглутинин (РНА). Клетките се стимулират 3 дена, след това се пулсират и бележат с радиоактивен изотоп 16 часа преди събирането.The effects of CTLA4lg on mixed monkey lymphocyte response (MLR) are shown in Figure 6. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC'S; 3.5 x 10 ⁴ capsules / well of each monkey) from 2 monkeys were purified in lymphocyte separating medium (LSM) ) and mixed with 2 pg / ml phytohaemagglutinin (PHA). Cells were stimulated for 3 days, then pulsed and radiolabeled 16 hours before collection.

L104EA29Ylg инхибирано пролифериране на маймунски Т клетки е по-добро, отколкото с CTLA4lg.L104EA29Ylg inhibited proliferation of monkey T cells is better than with CTLA4lg.

Таблица ITable I

Равновесната и видимата кинетична константи са дадени в следващата таблица (стойностите са средни ± стандартно отклонение от три различни експерименти):The equilibrium and apparent kinetic constants are given in the following table (values are mean ± standard deviation from three different experiments):

Обездвижен протеин Immobilized protein аналитично analytically K„„(x10⁵) M'¹ S‘¹ K „„ (x10 ⁵ ) M ' ¹ S' ¹ K_off(x 10'³) S'¹ K _off (x 10 ' ³ ) S' ¹ K_d nMK _d nM CD80lg CD80lg CTLA4lg CTLA4lg 3,44±0,29 3.44 ± 0.29 2,21±0,18 2.21 ± 0.18 6,51±1,08 6.51 ± 1.08 CD80lg CD80lg L104Elg L104Elg 3,02±0,05 3.02 ± 0.05 1,35±0,08 1.35 ± 0.08 4,47±0,36 4.47 ± 0.36 CD80lg CD80lg L104EA29Ylg L104EA29Ylg 2,96±0,20 2.96 ± 0.20 1,08±0,05 1.08 ± 0.05 3,66±0,41 3.66 ± 0.41 CD80lg CD80lg CTI_A4Xci2os CTI_A4Xci2os 12,0±1,0 12.0 ± 1.0 230±10 230 ± 10 195±25 195 ± 25 CD80lg CD80lg L1O4EA29YX_Ci2osL1O4EA29YX _C i2os 8,3±0,26 8.3 ± 0.26 71±5 71 ± 5 85±2,5 85 ± 2.5 CD86lg CD86lg CTLA4lg CTLA4lg 5,95±0,57 5.95 ± 0.57 8,16±0,52 8.16 ± 0.52 13,9±2,27 13.9 ± 2.27 CD86lg CD86lg L104Elg L104Elg 7,03±0,22 7.03 ± 0.22 4,26±0,11 4.26 ± 0.11 6,06±0,05 6.06 ± 0.05 CD86lg CD86lg L104EA29Ylg L104EA29Ylg 6,42±0,40 6.42 ± 0.40 2,06±0,03 2.06 ± 0.03 3,21±0,23 3.21 ± 0.23 CD86lg CD86lg CTLA4Xci2os CTLA4Xci2os 16,5±0,5 16.5 ± 0.5 840±55 840 ± 55 511±17 511 ± 17 CD86lg CD86lg L104EA29YXci2os L104EA29YXci2os 11,4±1,6 11.4 ± 1.6 300±10 300 ± 10 267±29 267 ± 29

Таблица IITable II

Ефекта на CD86lg ссвързване от мутагенезис на CTLA4lg върху изброените сайтовете се определя чрез SPR, описан supra. Преобладаващият ефект е отбелязан със знакThe effect of CD86lg binding by CTLA4lg mutagenesis on the listed sites was determined by the SPR described supra. The prevailing effect is indicated by a sign

Мутагенезисен Mutagenesis Ефекти Effects Намалено Reduced сайт site от мутагенезис by mutagenesis свързване connection на лиганди of ligands Няма There is no Малка Small видим ефект visible effect “оп”скорост/малка “oif'CKopocT "Op" speed / low “Oif'CKopocT S25 S25 + + Р26 P26 + + G27 G27 + + К28 K28 + + А29 A29 + + ТЗО SCI + + Е31 E31 + + R33 R33 + + К93 К93 + + L96 L96 + + М97 M97 + + Y98 Y98 + + Р99 P99 + + Р100 P100 + + Р101 P101 + + Y102 Y102 + + Y103 Y103 + + L104 L104 + + G105 G105 + +

1106 1106 + + G107 G107 + + Q111 Q111 + + Y113 Y113 + + 1115 1115 + +

Както е очевидно за специалистите в областта на техниката, за които се отнася изобретението, настоящето изобретение може да има варианти за изпълнение под форми, различни от тези, описани специфицирано по-горе, без с това да се излиза от духа, или от основните характеристики на изобретението. По-специалните варианти за изпълнение на изобретението, описани по-горе, поради това трябва да се смятат като илюстриращи, а не ограничаващи. Обхватът на настоящето изобретение, както се посочва ясно в приложените патентни претенции, не се ограничава от примерите, които се съдържат в горното описание.As will be apparent to those skilled in the art, the present invention may have embodiments in forms other than those described above without departing from the spirit or essential features. of the invention. The more specific embodiments of the invention described above should therefore be considered to be illustrative and not limiting. The scope of the present invention, as clearly stated in the appended claims, is not limited to the examples contained in the foregoing description.

Claims

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИPatent Claims

1. CTLA4 мутантна молекула, която свързва CD80 и/или CD86, съдържаща извънклетъчен домен на CTLA4, така че в извънклетъчния домен (а) аланин на позиция +29 е заместен с амино киселина, избрана от групата, състояща се от тирозин, левцин, триптофан, и треонин, и (Ь) левцин на позиция +104 е заместен с глутаминова киселина.A CTLA4 mutant molecule that binds CD80 and / or CD86 containing the extracellular domain of CTLA4 such that in the extracellular domain (a) alanine at position +29 is substituted with an amino acid selected from the group consisting of tyrosine, leucine, tryptophan, and threonine, and (b) leucine at position +104 is replaced by glutamic acid.

2. CTLA4 мутантната молекула съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че също така съдържа амино киселинна последователност, която изменя разтворимостта, афинитета, или валентността на разтворимата CTLA4 мутантна молекула.The CTLA4 mutant molecule according to claim 1, characterized in that it also contains an amino acid sequence that alters the solubility, affinity or valence of the soluble CTLA4 mutant molecule.

3. CTLA4 мутантната молекула съгласно претенция 2, характеризираща се с това, че амино киселинната последователност съдържа човешка имуноглобулин константна област.The CTLA4 mutant molecule according to claim 2, characterized in that the amino acid sequence contains a human immunoglobulin constant region.

4. CTLA4 мутантната молекула съгласно претенция 2, характеризираща се с това, че също така съдържа амино киселинна последователност, която дава възможност за секретиране на разтворимата CTLA4 мутантна молекула.The CTLA4 mutant molecule according to claim 2, further comprising an amino acid sequence that allows the soluble CTLA4 mutant molecule to be secreted.

5. CTLA4 мутантната молекула съгласно претенция 4, характеризираща се с това, че амино киселинните последователности съдържат онкостатин М сигнален пептид.The CTLA4 mutant molecule of claim 4, wherein the amino acid sequences comprise an oncostatin M signal peptide.

6. CTLA4 мутантната молекула съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че съдържа метионин на позиция +CTLA4 mutant molecule according to claim 1, characterized in that it contains methionine at position +

1 и аспарагинова киселина на позиция +124, както е показано на фигура 7.1 and aspartic acid at position +124 as shown in Figure 7.

7. CTLA4 мутантната молекула съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че съдържа аланин на позиция -1 и аспарагинова киселина на позиция +124, както е показано на фигура 7.The CTLA4 mutant molecule according to claim 1, characterized in that it contains alanine at position -1 and aspartic acid at position +124, as shown in Figure 7.

8. CTLA4 мутантната молекула съгласно претенция 3, характеризираща се с това, че човешката имуноглобулин константна област е мутирала да включва цистеин на позиция +130, заместен със серин, цистеин на позиция +136, заместен със серин, цистеин на позиция +139, заместен със серин, и пролин на позиция +148, заместен със серин, както е показано на фигура 7.The CTLA4 mutant molecule according to claim 3, characterized in that the human immunoglobulin constant region is mutated to include cysteine at position +130, substituted with serine, cysteine at position +136, substituted with serine, cysteine at position +139, substituted with serine, and proline at position +148, substituted with serine, as shown in Figure 7.

9. CTLA4 мутантна молекула, която свързва с по-голяма склонност към CD80 и/или CD86, отколкото CTLA4, съдържаща извънклетъчен домен на CTLA4, като в извънклетъчния домен, аланин на позиция +29 е заместен с тирозин, а левцин на позиция +104 е заместен с глутаминова киселина както е показано на фигура 7.9. A CTLA4 mutant molecule that binds more to CD80 and / or CD86 than CTLA4 containing the extracellular domain of CTLA4, in the extracellular domain, alanine at position +29 is replaced by tyrosine and leucine at position +104 is substituted with glutamic acid as shown in Figure 7.

10. CTLA4 мутантната молекула съгласно претенция 9, характеризираща се с това, че също така съдържа амино киселинна последователност, която изменя разтворимостта, афинитета, или валентността на разтворимата CTLA4 мутантна молекула.The CTLA4 mutant molecule of claim 9, further comprising an amino acid sequence that alters the solubility, affinity or valence of the soluble CTLA4 mutant molecule.

11. CTLA4 мутантната молекула съгласно претенция 10, характеризираща се с това, че съдържа амино киселинна последователност, съдържаща човешка имуноглобулин константна област.The CTLA4 mutant molecule according to claim 10, characterized in that it contains an amino acid sequence comprising a human immunoglobulin constant region.

12. CTLA4 мутантната молекула съгласно претенция 10, характеризираща се с това, че също така съдържа амино киселинна последователност, която дава възможност за секретиране на разтворимата CTLA4 мутантна молекула.The CTLA4 mutant molecule of claim 10, further comprising an amino acid sequence that allows the soluble CTLA4 mutant molecule to be secreted.

13. CTLA4 мутантната молекула съгласно претенция 12, характеризираща се с това, че амино киселинната последователност съдържа онкостатин М сигнален пептид.The CTLA4 mutant molecule of claim 12, wherein the amino acid sequence comprises an oncostatin M signal peptide.

14. CTLA4 мутантната молекула съгласно претенция 9, характеризираща се с това, че съдържа метионин на позиция +1 и аспарагинова киселина на позиция +124, както е показано на фигура 7.The CTLA4 mutant molecule according to claim 9, characterized in that it contains methionine at position +1 and aspartic acid at position +124, as shown in Figure 7.

15. CTLA4 мутантната молекула съгласно претенция 9, характеризираща се с това, че съдържа аланин на позиция -1 и аспарагинова киселина на позиция +124, както е показано на фигура 7.The CTLA4 mutant molecule according to claim 9, characterized in that it contains alanine at position -1 and aspartic acid at position +124, as shown in Figure 7.

16. CTLA4 мутантната молекула съгласно претенция 11, характеризираща се с това, че човешката имуноглобулин константна област е мутирала да включва цистеин на позиция +130, заместен със серин, цистеин на позиция +136, заместен със серин, цистеин на позиция +139, заместен със серин, и пролин на позиция +148, заместен със серин, както е показано на фигура 7.CTLA4 mutant molecule according to claim 11, characterized in that the human immunoglobulin constant region has mutated to include cysteine at position +130, substituted with serine, cysteine at position +136, substituted with serine, cysteine at position +139, substituted with serine, and proline at position +148, substituted with serine, as shown in Figure 7.

17. Разтворима CTLA4 мутантна молекула, която свързва с по-голяма склонност към CD80 и/или CD86, отколкото CTLA4, съдържаща извънклетъчен домен на CTLA4, като в извънклетъчния домен, левцин на позиция +104 е заместен с глутаминова киселина както е показано на фигура 8.17. A soluble CTLA4 mutant molecule that binds more to CD80 and / or CD86 than CTLA4 containing the extracellular domain of CTLA4, and in the extracellular domain, leucine at position +104 is replaced by glutamic acid as shown in figure 8.

18. Молекула нуклеинова киселина, съдържаща нуклеотидна последователност, кодираща амино киселинна последователност, съответстваща на разтворимата CTLA4 мутантна молекула съгласно претенция 1.A nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence corresponding to the soluble CTLA4 mutant molecule according to claim 1.

19. Молекула нуклеинова киселина, съдържаща нуклеотидна последователност, кодираща амино киселинна последователност, съответстваща на разтворимата CTLA4 мутантна молекула, съгласно претенция 9.A nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence corresponding to the soluble CTLA4 mutant molecule according to claim 9.

20. Молекулата нуклеинова киселина, съгласно претенцияThe nucleic acid molecule according to claim

18, характеризираща се с това, че има нуклеотидна последователност, започваща с аденин на нуклеотидна позиция +1, и завършваща с аденин на +1071, както е показано на фигура 7 или 8.18, characterized in that it has a nucleotide sequence beginning with adenine at nucleotide position +1 and ending with adenine at +1071, as shown in Figure 7 or 8.

21. Молекулата нуклеинова киселина, съгласно претенцияThe nucleic acid molecule according to claim

19, характеризираща се с това, че има нуклеотидната последователност, започваща с аденин на нуклеотидна позиция +1, и завършваща с аденин на +1071, както е показано на фигура 7 или 8.19, characterized in that it has the nucleotide sequence beginning with adenine at nucleotide position +1 and ending with adenine at +1071, as shown in Figure 7 or 8.

22. Молекулата нуклеинова киселина, съгласно претенцияThe nucleic acid molecule according to claim

18, характеризираща се с това, че има нуклеотидната последователност, започваща с гуанин на -3, и завършваща с аденин на +1071, както е показано на фигура 7 или 8.18, characterized in that it has the nucleotide sequence starting with guanine at -3 and ending with adenine at +1071, as shown in Figure 7 or 8.

23. Молекулата нуклеинова киселина, съгласно претенцияThe nucleic acid molecule according to claim

19, характеризираща се с това, че има нуклеотидната последователност, започваща с гуанин на -3, и завършваща с аденин на +1071, както е показано на фигура 7 или 8.19, characterized in that it has the nucleotide sequence starting with guanine at -3 and ending with adenine at +1071, as shown in Figure 7 or 8.

24. Вектор, съдържащ нуклеотидната последователност, Q съгласно която и да е от претенции 18 да 23.A vector comprising the nucleotide sequence Q according to any one of claims 18 to 23.

25. Вектор, кодиращ L104EA29Ylg, означен като pD16 L104EA29Ylg и депозиран в АТСС като АТСС № РТА-2104.25. A vector encoding L104EA29Ylg, designated pD16 L104EA29Ylg, and deposited in the ATCC as ATCC No. PTA-2104.

26. Векторна система гостоприемник, съдържаща вектор от претенция 24 или 25 в подходяща клетка гостоприемник.A vector host system comprising a vector of claim 24 or 25 in a suitable host cell.

27. Векторна система гостоприемник, съгласно претенция 26, където подходящата клетка гостоприемник е бактериална клетка, или еукариотна клетка.The vector host system of claim 26, wherein the suitable host cell is a bacterial cell or eukaryotic cell.

28. Клетка гостоприемник, имаща вектора от претенция 24, или 25.A host cell having the vector of claim 24 or 25.

29. Клетката гостоприемник съгласно претенция 28, характеризираща се с това, че е еукариотна клетка.29. The host cell of claim 28, wherein it is a eukaryotic cell.

30. Клетката гостоприемник съгласно претенция 29, характеризираща се с това, че еукариотната клетка е COS клетка.30. The host cell of claim 29, wherein the eukaryotic cell is a COS cell.

31. Клетката гостоприемник съгласно претенция 29, характеризираща се с това, че еукариотната клетка е Chinest Hamster Ovary (СНО) клетка.31. The host cell of claim 29, wherein the eukaryotic cell is a Chinest Hamster Ovary (CHO) cell.

32. Клетката гостоприемник съгласно претенция 31, характеризираща се с това, че СНО клетката се избира от групата, състояща се от DG44, СНО-К1, СНО-К1 Tet-On клетъчна линия, СНО се обозначава като ЕСАСС 85050302, СНО клон 13, СНО клон В, CHO-H1/SF, RR-CHOK1.32. The host cell of claim 31, wherein the CHO cell is selected from the group consisting of DG44, CHO-K1, CHO-K1 Tet-On cell line, CHO is designated ECACC 85050302, CHO clone 13. CHO clone B, CHO-H1 / SF, RR-CHOK1.

33. Метод за продуциране на разтворим CTLA4 мутантен протеин, характеризиращ се с това, че се състои в прорастване на векторната система гостоприемник съгласно претенция 26, така че да се продуцира CTLA4 мутантния протеин в клетката гостоприемник, и възстановяване на така продуцирания протеин.33. A method for producing soluble CTLA4 mutant protein, characterized in that it comprises sprouting the vector host system of claim 26 to produce the CTLA4 mutant protein in the host cell, and recovering the protein produced in this manner.

34. Метод за продуциране на L104EA29Ylg, характеризиращ се с това, че се състои в прорастване на векторната система гостоприемник съгласно претенция 28, така че да се продуцира L104EA29Ylg в клетката гостоприемник, и възстановяване на така продуцирания протеин.34. A method of producing L104EA29Ylg, characterized in that it comprises sprouting the vector host system according to claim 28 so as to produce L104EA29Ylg in the host cell, and recovering the protein thus produced.

35. Разтворим CTLA4 мутантен протеин, продуциран съгласно метода на претенция 33.A soluble CTLA4 mutant protein produced according to the method of claim 33.

36. L104EA29Yig, продуциран съгласно метода на претенция 34.36. L104EA29Yig produced according to the method of claim 34.

37. Метод за регулиране на Т клетъчно взаимодействие с CD80 и/или CD86 позитивна клетка, характеризиращ се с това, че се състои в контактуване на CD80 и/или CD86 позитивната клетка с разтворимата CTLA4 мутантна молекула съгласно претенция 1, така че да се образува комплекс CTLA4 мутантна молекула/ CD80, или CTLA4 мутантна молекула/СО86, като комплексът интерферира с взаимодействие между Т клетката и CD80 и/или CD86 позитивната клетка.37. A method of regulating a T cell interaction with a CD80 and / or CD86 positive cell, characterized in that it comprises contacting the CD80 and / or CD86 positive cell with the soluble CTLA4 mutant molecule according to claim 1 so as to form CTLA4 mutant molecule / CD80 complex, or CTLA4 mutant molecule / CD86, the complex interfering with the interaction between the T cell and the CD80 and / or CD86 positive cell.

38. Метод за регулиране на Т клетъчно взаимодействие с CD80 и/или CD86 позитивна клетка, характеризиращ се с това, че се състои в контактуване на CD80 и/или CD86 позитивната клетка с разтворимата CTLA4 мутантна молекула съгласно претенция 9, така че да се образува комплекс CTLA4 мутантна молекула/С080, или CTLA4 мутантна молекула/СО86, комплексът интерфериращ с взаимодействие между Т клетката и CD80 и/или CD86 позитивната клетка.38. A method for regulating a T cell interaction with a CD80 and / or CD86 positive cell, characterized in that it comprises contacting the CD80 and / or CD86 positive cell with the soluble CTLA4 mutant molecule according to claim 9 so as to form CTLA4 mutant molecule / CD80 complex, or CTLA4 mutant molecule / CD86, the complex interfering with the interaction between the T cell and the CD80 and / or CD86 positive cell.

39. Методът съгласно претенция 37, характеризиращ се с това, че разтворимата CTLA4 мутантна молекула съдържа извънклетъчен домен на CTLA4, където в извънклетъчния домен, левцин на позиция +104 е заместен с глутаминова киселина, както е показано на фигура 8.The method of claim 37, wherein the soluble CTLA4 mutant molecule comprises an extracellular domain of CTLA4, wherein in the extracellular domain, leucine at position +104 is substituted with glutamic acid, as shown in Figure 8.

40. Методът съгласно претенция 37, характеризиращ се с това, че CD80 и/или CD86 позитивната клетка контактува с фрагмент, или с производно на разтворимата CTLA4 мутантна молекула.The method of claim 37, wherein the CD80 and / or CD86 positive cell is in contact with a fragment or derivative of the soluble CTLA4 mutant molecule.

41. Методът съгласно претенция 38, характеризиращ се с това, че CD80 и/или CD86 позитивната клетка контактува с фрагмент, или с производно на разтворимата CTLA4 мутантна молекула.The method of claim 38, wherein the CD80 and / or CD86 positive cell is in contact with a fragment or derivative of the soluble CTLA4 mutant molecule.

^:W*' ^: W * '

42. Методът съгласно претенция 37, характеризиращ се с това, че CD80 и/или CD86 позитивната клетка е представяща антиген клетка.The method of claim 37, wherein the CD80 and / or CD86 positive cell is an antigen presenting cell.

43. Методът съгласно претенция 38, характеризиращ се с това, че CD80 и/или CD86 позитивната клетка е представяща антиген клетка.43. The method of claim 38, wherein the CD80 and / or CD86 positive cell is an antigen presenting cell.

44. Методът съгласно претенция 37, характеризиращ се с това, че взаимодействието на СТ1_А4-позитивните Т клетки с CD80 и/или CD86 позитивните клетки се инхибира.The method of claim 37, wherein the interaction of CT1A4-positive T cells with CD80 and / or CD86 positive cells is inhibited.

45. Методът съгласно претенция 38, характеризиращ се с това, че взаимодействието на СТ1_А4-позитивните Т клетки с CD80 и/или CD86 позитивните клетки се инхибира.The method of claim 38, wherein the interaction of CT1A4-positive T cells with CD80 and / or CD86 positive cells is inhibited.

46. Използуване на CD80 и/или CD86 позитивни клетки за лечение на заболяване на имунната система медиирано от Т клетъчни взаимодействия с CD80 и/или CD86 позитивни клетки, което се състои в прилагане върху субект на разтворимата CTLA4 мутантна молекула съгласно претенция 1, за регулиране на Т клетъчни взаимодействия с CD80 и/или CD86 позитивни клетки.Use of CD80 and / or CD86 positive cells for the treatment of immune system disease mediated by T cell interactions with CD80 and / or CD86 positive cells, which comprises administering to the subject the soluble CTLA4 mutant molecule according to claim 1 for regulation of T cell interactions with CD80 and / or CD86 positive cells.

47. Използуване на CD80 и/или CD86 позитивни клетки за лечение на заболяване на имунната система медиирано от Т клетъчни взаимодействия с CD80 и/или CD86 позитивни клетки, което се състои в прилагане върху субект на разтворимата CTLA4 мутантна молекула съгласно претенция 9, за регулиране на Т клетъчни взаимодействия с CD80 и/или CD86 позитивни клетки.Use of CD80 and / or CD86 positive cells for the treatment of immune system disease mediated by T cell interactions with CD80 and / or CD86 positive cells, which comprises administering to the subject the soluble CTLA4 mutant molecule according to claim 9 for regulation of T cell interactions with CD80 and / or CD86 positive cells.

48. Използуване съгласно претенция 46, където разтворимата CTLA4 мутантна молекула съдържа извънклетъчен домен на CTLA4, където в извънклетъчния домен, левцин на позиция +104 е заместен с глутаминова киселина, както е показано на фигура 8.The use of claim 46, wherein the soluble CTLA4 mutant molecule comprises an extracellular domain of CTLA4, wherein in the extracellular domain, leucine at position +104 is substituted with glutamic acid, as shown in Figure 8.

49. Използване съгласно претенция 46, където посочените Т клетъчни взаимодействия се инхибират.The use of claim 46, wherein said T cell interactions are inhibited.

50. Използване съгласно претенция 47, където посоченитеThe use of claim 47, wherein said

Т клетъчни взаимодействия се инхибират.T cell interactions are inhibited.

51. Използване на разтворимата CTLA4 мутантна молекула от претенция 1 и лиганд, реактивен към IL-4, за инхибиране на заболяване предизвикано от реакция на присадката срещу приемника, което включва въвеждане у даден индивид на разтворимата CTLA4 мутантна молекула, съгласно претенция 1 и51. Use of the soluble CTLA4 mutant molecule of claim 1 and a ligand reactive to IL-4 for inhibiting a disease caused by a graft-versus-host reaction that involves administering to an individual the soluble CTLA4 mutant molecule of claim 1 and

С лиганд, реактивен към IL-4.With a ligand reactive to IL-4.

52. Използване за получаване на разтворимата CTLA4 мутантна молекула от претенция 9 и лиганд, реактивен към IL-4, за инхибиране на заболяване, предизвикано от реакция на присадката срещу приемника, което включва въвеждане у даден индивид на разтворимата CTLA4 мутантна молекула, съгласно претенция 1 и лиганд реактивен към IL-4.Use for the preparation of the soluble CTLA4 mutant molecule of claim 9 and a ligand reactive to IL-4 for inhibiting a disease caused by a graft-versus-host reaction that involves the administration to an individual of the soluble CTLA4 mutant molecule according to claim 1 and a ligand reactive to IL-4.

53. Използване съгласно претенция 51, където разтворимият CTLA4 мутант съдържа извънклетъчен домен от CTLA4, където извънклетъчният домен, левцин на позиция +104, еThe use of claim 51, wherein the soluble CTLA4 mutant comprises an extracellular domain of CTLA4, wherein the extracellular domain, leucine at position +104, is

С заместен с глутаминова киселина, както е показано на фигура 8.Glutamic acid substituted as shown in Figure 8.

54. Разтворима CTLA4 мутантна молекула, кодирана от молекулата нуклеинова киселина, обозначена като АТСС № РТА2104.54. A soluble CTLA4 mutant molecule encoded by a nucleic acid molecule designated ATCC No. PTA2104.

55. ДНК последователност, кодираща L104EA29Ylg и имаща АТСС № РТА-2104.55. A DNA sequence encoding L104EA29Ylg and having ATCC No. PTA-2104.

56. Разтворима CTLA4 мутантна молекула, съдържаща аминокиселинната последователност от фигура 7.56. A soluble CTLA4 mutant molecule comprising the amino acid sequence of Figure 7.

57. Молекула нуклеинова киселина, кодираща разтворимата CTLA4 мутантна молекула, съгласно претенция 56.A nucleic acid molecule encoding the soluble CTLA4 mutant molecule according to claim 56.

58. Разтворима CTLA4 мутантна молекула, която свързва CD86 с по-голяма склонност, отколкото див тип CTLA4.58. A soluble CTLA4 mutant molecule that binds CD86 with a greater propensity than wild-type CTLA4.

59. Разтворима CTLA4 мутантна молекула, която има помалка дисоциационна скорост от свързване на CD80 и/или CD86, отколкото див тип CTLA4. .59. A soluble CTLA4 mutant molecule that has a lower dissociation rate of CD80 and / or CD86 binding than wild-type CTLA4. .

60. Разтворима CTLA4 мутантна молекула, която има помалка асоциационна и дисоциационна скорости от свързване на CD80 и/или CD86, отколкото див тип CTLA4.60. A soluble CTLA4 mutant molecule that has a lower association and dissociation rate of CD80 and / or CD86 binding than wild-type CTLA4.

61. Част от разтворима CTLA4 мутантна молекула, кодирана от молекулата нуклеинова киселина, обозначена като АТСС№. РТА-2104, където частта съдържа извънклетъчния домен на мутанта CTLA4.61. A portion of a soluble CTLA4 mutant molecule encoded by a nucleic acid molecule designated ATCC #. PTA-2104, wherein the portion contains the extracellular domain of the CTLA4 mutant.

62. Частта от разтворимата CTLA4 мутантна молекула съгласно претенция 61, съдържаща също така, lg опашка.The portion of the soluble CTLA4 mutant molecule according to claim 61, further comprising an Ig tail.

63. Част от молекула нуклеинова киселина, кодираща разтворима CTLA4 мутантна молекула, и имаща АТСС№. РТА2104, където частта кодира извънклетъчния домен от CTLA4 мутантната молекула.63. A portion of a nucleic acid molecule encoding a soluble CTLA4 mutant molecule and having ATCC #. PTA2104, where the portion encodes the extracellular domain of the CTLA4 mutant molecule.

64. Частта от молекулата нуклеинова киселина съгласно претенция 63, съдържаща също така, молекула нуклеинова киселина, която кодира lg опашка.The portion of the nucleic acid molecule according to claim 63, further comprising a nucleic acid molecule that encodes an Ig tail.

65. Фармацевтичен състав за лечение на заболяване на имунната система, характеризиращ се с това, че съдържа фармацевтично приемлив носител и разтворимата CTLA4 мутантна молекула съгласно претенция 1.65. A pharmaceutical composition for the treatment of a disease of the immune system comprising a pharmaceutically acceptable carrier and the soluble CTLA4 mutant molecule according to claim 1.

66. Фармацевтичен състав за лечение на заболяване на имунната система, характеризиращ се с това, че съдържа фармацевтично приемлив носител и разтворимата CTLA4 мутантна молекула съгласно претенция 9.66. A pharmaceutical composition for the treatment of a disease of the immune system comprising a pharmaceutically acceptable carrier and the soluble CTLA4 mutant molecule according to claim 9.

СПИСЪК НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ <110> Peach, Robert J.LIST OF SEQUENCES <110> Peach, Robert J.

Naemura, Joseph RNaemura, Joseph R

Linsley, Peter S.Linsley, Peter S.

Bajorath, Jurgen <120> РАЗТВОРИМИ CTLA4 МУТАНТНИ МОЛЕКУЛИ И ТЯХНОТО ИЗПОЛЗВАНЕ <130> D0028PCT/30436.57WOU1 <140> PCT/US01/17139 <141> 2001-05-23 <150> 60/287,576 <151> 2000-05-26 <150> 60/214,065 <151> 2000-06-26 /**· <160> 9 <170> Patentin Ver. 2.1 <210> 1 <211> 41 <212> ДНК <213> Изкуствена последователност <220>Bajorath, Jurgen <120> SOLUBLE CTLA4 MUTANT MOLECULES AND THEIR USE <130> D0028PCT / 30436.57WOU1 <140> PCT / US01 / 17139 <141> 2001-05-23 <150> <60/285/2000/2001/2000/2000/2000/2001/2000/2000/2000/2000/60/28/2000 <150> 60 / 214,065 <151> 2000-06-26 / ** · <160> 9 <170> Patent Ver. 2.1 <210> 1 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Описание на изкуствена последователност :Онкостатин М<223> Artificial sequence description: Oncostatin M

CTLA4 (OMCTLA4) Отправящ Праймер <400> 1 gaggtgataa agcttcacca atgggtgtac tgctcacaca g 41 <210> 2 <211> 42 <212> ДНК f <213> Изкуствена последователност <220>CTLA4 (OMCTLA4) Reference Primer <400> 1 gaggtgataa agcttcacca atgggtgtac tgctcacaca g 41 <210> 2 <211> 42 <212> DNA f <213> Artificial Sequence <220>

<223> Описание на изкуствена последователност:Онкостатин М CTLA4 (OMCTLA4) Обратен Праймер <400> 2 gtggtgtatt ggtctagatc aatcagaatc tgggcacggt tc <^210> 3 <211> 1152 <212> DNA <213> Изкуствена последователност <220><223> Artificial sequence description: Oncostatin M CTLA4 (OMCTLA4) Reverse Primer <400> 2 gtggtgtatt ggtctagatc aatcagaatc tgggcacggt tc <^ 210> 3 <211> 1152 <212> DNA <213> Artificial sequence <220>

<223> Описание на изкуствена последователност:L104EA29YIg <400> 3 atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60 agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga 120<223> Artificial sequence description: L104EA29YIg <400> 3 atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60 agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tgcggggggggggg