BG103840A - Fungicidebinding polypeptides expression in plants for forming tolerance to fungicides - Google Patents

Abstract

The method for forming tolerance in plants to fungicides is effected by fungicidebinding antibody expression in the plants. 28 claims

Description

Настоящето изобретение се отнася до метод за получаване на растения с поносимост спрямо фунгициди, чрез експресия на екзогенен фунгицид-свързващ полипептид в растения или в части от растения. Изобретението се отнася освен това до използване на съответни нуклеинови киселини, кодиращи полипептид, анти тяло или части на антитяло с фунгицид-свързващи свойства в трансгенни растения и по този начин до трансформираното растение само по себе си.The present invention relates to a method for the preparation of fungicide-tolerant plants by expression of an exogenous fungicide-binding polypeptide in plants or in parts of plants. The invention further relates to the use of appropriate nucleic acids encoding a polypeptide, anti-body or antibody portions with fungicidal-binding properties in transgenic plants and thus to the transformed plant itself.

Предшествуващо състояние на техникатаBACKGROUND OF THE INVENTION

Известно е, че с помощта на методите на генното инженерство, могат целенасочено в генома на растението да се въведат чужди гени. Този процес се нарича трансформация и получените растения се наричат трансгенни. Трансгенни растения се използват понастоящем в различни биотехнологични области. Така напр. са описани растения, резистентни спрямо инсекти (Vaek et al. Plant Cell 5 (1987), 159-169), растения, резистентни спрямо вируси (Powell et al. Science 232 (1986), 738-743) и растения, резистентни спрямо озон (Van Camp et al. BioTech. 12 (1994), 165-168). Примери за подобряване на качеството по пътя мкмшIt is known that by means of genetic engineering methods, foreign genes can be deliberately introduced into the plant genome. This process is called transformation and the resulting plants are called transgenic. Transgenic plants are currently used in various biotechnological fields. For example, insect resistant plants (Vaek et al. Plant Cell 5 (1987), 159-169), virus resistant plants (Powell et al. Science 232 (1986), 738-743) and ozone resistant plants have been described (Van Camp et al. BioTech. 12 (1994), 165-168). Examples of quality improvement on the road mmsh

904.99-ПБ на генното инженерство са: повишаване на съхраняемостта на плодове (Oeller et al. Science 254 (1 991), 437-439); повишаване на904.99-GB of genetic engineering are: increasing the conservation of fruits (Oeller et al. Science 254 (1 991), 437-439); increasing

продукцията на нишесте в картофени растения (Stark et al., Science 242 (1992), 419), промяна на нишестения състав (Visser et al. Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 289-296), промяна на липидния състав (Voelker et al. Science 257 (1992), 72-74) и продукция на непривични за растението полимери (Poirer et al. Science 256 (1992), 520-523).starch production in potato plants (Stark et al., Science 242 (1992), 419), change in starch composition (Visser et al. Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 289-296), change in lipid composition (Voelker et al. Science 257 (1992), 72-74) and production of non-plant-friendly polymers (Poirer et al. Science 256 (1992), 520-523).

Важна цел на работата в областта на молекулната генетика на растенията е да се създаде поносимост спрямо хербициди. Тя се изразява с повишена по вид или по сила поносимост на растенията или на части от тях спрямо приложен хербицид. Тази поносимост може да се повлияе по различен начин. Познатите методи се състоят в използване на ген на метаболизъм, напр. patgen, във връзка с глуфозинатна резистентност (WO 8705629) или на хербицид-резистентен целеви ензим, както е напр. в случая с Enolpyruvylshiki-mat-3-phosphat-Synthase (WO 9204449), която е резистентна спрямо глифосфат, както и използване на хербицид в клетъчни и тъканни култури за селекция на растителни клетки с добра поносимост и на получените резистентни растения, както е описано за ацетил СоА карбоксилазни инхибитори (US 5162602, US 5290696).An important goal of working in the field of plant molecular genetics is to create tolerance for herbicides. It is expressed by the increased tolerance of the plants or parts of them to the applied herbicide by type or strength. This tolerance may be affected differently. The known methods consist in the use of a metabolism gene, e.g. patgen, in connection with glufosinate resistance (WO 8705629) or a herbicide-resistant target enzyme, such as e.g. in the case of Enolpyruvylshiki-mat-3-phosphate-Synthase (WO 9204449), which is glyphosphate resistant, as well as the use of herbicide in cell and tissue cultures for selection of well tolerated plant cells and the resulting resistant plants, as described for acetyl CoA carboxylase inhibitors (US 5162602, US 5290696).

Антителата са протеини, които са част от имунната система.Antibodies are proteins that are part of the immune system.

Всички антитела имат пространствена глобуларна структура, изградена от по-леки и по-тежки вериги. Те по принцип имат способността да могат да свързват молекули или части от структурата на молекули с голяма специфичност (Alberts et al.,:All antibodies have a spatial globular structure made up of lighter and heavier chains. They generally have the ability to bind molecules or parts of the structure of highly specific molecules (Alberts et al.,:

Molekularbiologie der Zelle, 2. Auflage 1990, VCH Verlag, ISBN 3527-27983-0, 1198-1237). Въз основа на тези свойства антителатаMolecularbiologie der Zelle, 2nd Auflage 1990, VCH Verlag, ISBN 3527-27983-0, 1198-1237). Based on these properties, antibodies

904.99-ПБ ·· ·· • · · · ·· • ·904.99-PB ·· ·· • · · · ·· • ·

се използват за различни цели. При това се различава използване на антитела в животински или човешки организми, които ги продуцират, тъй наречените in-situ използване, както и ex-situ използване, т.е. използването на антитела след изолиране от продуциращите клетки или организми (Whitelam und Cockburn, TIPS Vol. 1, 8 (1996), 268-272).are used for different purposes. This distinguishes between the use of antibodies in animal or human organisms that produce them, the so-called in-situ use, as well as ex-situ use, i. the use of antibodies after isolation from producing cells or organisms (Whitelam und Cockburn, TIPS Vol. 1, 8 (1996), 268-272).

Използването на хибридни соматични клетъчни линии (хибридоми) като източник на антитела спрямо конкретно определени антигени е познато от работите на Koehler и Milstein (Nature 256 (1975) 495-97) и след това. По този метод се получават тъй наречените моноклонални антитела, които притежават единна структура и са получени чрез клетъчно сливане. За целта клетки от далака на имунизирана мишка се сливат с клетки на мишимиелом. Така се получават хибридомни клетки, които се размножават неограничено. Същевременно клетките отделят специфични антитела срещу антигени, с които мишката е била имунизирана. Клетките от далака създават възможност за продукция на антитела, докато миеломните клетки осигуряват неограничена възможност за растеж и направляват непрекъснатата секреция на антитела. Тъй като всяка хибридомна клетка се отделя като клон от една единствена В-клетка, то всички изградени молекули на антитела притежават еднаква структура, включително на антигенсвързващото място. Този метод дава тласък на използването на антитела, тъй като чрез него са на разположение неограничен брой антитела с еднаква, позната специфичност и с хомогенна структура. Моноклонални антитела намират вече приложение при имунодиагностиката и като терапевтични средства.The use of hybrid somatic cell lines (hybridomas) as a source of antibodies to specific antigens is known from the work of Koehler and Milstein (Nature 256 (1975) 495-97) and thereafter. This method produces so-called monoclonal antibodies, which have a single structure and are obtained by cell fusion. For this purpose, cells from the spleen of an immunized mouse are fused with mycelium cells. This produces hybridoma cells that multiply indefinitely. At the same time, the cells secrete specific antibodies against the antigens with which the mouse has been immunized. Spleen cells create the ability to produce antibodies, while myeloma cells provide unlimited growth potential and guide the continued secretion of antibodies. Since each hybridoma cell is detached as a clone from a single B cell, all constructed antibody molecules have the same structure, including the antigen-binding site. This method gives impetus to the use of antibodies, since an unlimited number of antibodies of uniform, known specificity and homogeneous structure are available through it. Monoclonal antibodies are already being used in immunodiagnostics and as therapeutic agents.

От няколко години съществува тъй нареченият PhagenDisplay-метод за получаване на антитела, при който се избягваFor several years, there has been the so-called PhagenDisplay method of producing antibodies, which avoids

904.99-ПБ • · · ···· у904.99-PB • · · ···· y

въздействие върху имунната система и някои имунизирания на животни, При това афинитетът и специфичността на антителата in vitro се изравняват (Winter et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994), 433-455; Hoogenboom TlBTech Vol 15 (1997), 62-70). Гениите сегменти, които съдържат кодиращата секвенция на променлив регион от антитела, т.е. антиген-свързващите мяста, се сливат с гени за обвиващ протеин на бактериофаг. След това бактериите се инфектират с фаги, които съдържат такива слети гени. Получаващите се части от фаги притежават сега обвивки от антитяло-подобни слети протеини, при което свързващите антителата домени се показват навън. От такава Phagen-Displayбиблиотека могат да се изолират фаги, които съдържат желаните фрагменти от антитела и са свързани специфично към определен антиген. Всеки изолиран по този начин фаг произвежда моноклонален, антигенсвързващ полипептид, който отговаря на едно моноклонално антитяло. Гените на антигенсвързващото място, които са различни за всеки фаг, могат да се изолират от фаг-ДНК и да се вложат в конструкция на пълноценни антитяло-гени.effects on the immune system and certain immunizations of animals, the affinity and specificity of antibodies in vitro are leveled (Winter et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994), 433-455; Hoogenboom TlBTech Vol 15 (1997). 62-70). Genius segments that comprise the coding sequence of a variable region of antibodies, i. antigen-binding sites are fused to bacteriophage envelope protein genes. The bacteria are then infected with phages that contain such fusion genes. The resulting phage portions now have envelopes of antibody-like fusion proteins, with the antibody binding domains showing outward. From such a Phagen-Display library phages can be isolated that contain the desired antibody fragments and are specifically bound to a specific antigen. Each phage isolated in this way produces a monoclonal, antigen-binding polypeptide that responds to a single monoclonal antibody. Antigen-binding site genes that are different for each phage can be isolated from phage DNA and inserted into the construction of complete antibody genes.

В областта на растителната защита, антителата се използват особено като средство за анализ ex-sito за количесвено и качествено доказване на антигени. Това включва доказване на съдържанието на вещества в растенията, на хербициди или фунгициди в питейната вода (Sharp et al. (1991) ACS Symp Ser., 446 (Pestic. Residues Food Sat.) 87-95), в проби от пръст (WOIn the field of plant protection, antibodies are used especially as an ex-sieve assay for the quantitative and qualitative detection of antigens. This includes demonstrating the content of substances in plants, herbicides or fungicides in drinking water (Sharp et al. (1991) ACS Symp Ser., 446 (Pestic. Residues Food Sat.) 87-95), in soil samples (WO

9423018) или в растения или части от растения. Освен това антитела се използват като помощно средство за почистване от свързани молекули.9423018) or in plants or parts of plants. In addition, antibodies are used as an adjuvant for cleansing of bound molecules.

Продукция на имуноглобулини за пръв път еIt is the production of immunoglobulins for the first time

904.99-ПБ904.99-PB

• ·· ·· ·· ·· · · · · ·· • · · · · ·· ·· ·· ······ • ·· · · • · · · · · · · · в растения описана от Hiatt et al., Nature, 342 (1989), 76-78. Спектърът се• · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · Hiatt et al., Nature, 342 (1989), 76-78. The spectrum is up

простира от едноверижни антитела, до многоверижни секреторни антитела (J. Ма und Mich Hein, 1996, Annuals New York Academy of Sciences, 72- 81).extends from single-stranded antibodies to multi-stranded secretory antibodies (J. Ma und Mich Hein, 1996, Annuals New York Academy of Sciences, 72-81).

При по-нови опити, антитела се използват in-situ за защита от патогени в растения, по-специално от вирусни заболявания, чрез експресия на специфични антитела или части от тях, насочена срещу вирусни обвивни протеини в растителни клетки (Tavladoraki et al., Nature 366 (1993), 469-472; Voss et al., Mol. Breeding 1 (1995), 39-50).In more recent experiments, antibodies are used in situ to protect against pathogens in plants, in particular from viral diseases, by expressing specific antibodies or portions thereof against viral envelope proteins in plant cells (Tavladoraki et al. Nature 366 (1993), 469-472; Voss et al., Mol. Breeding 1 (1995), 39-50).

Подобно приложение е използването за защита от инфекция на растенията чрез нематоди (Rosso et al., Biochem. Biophys. Res. Com., 220 (1996), 255-263). Известни са също примери за фармацевтично приложение на експресията на антитела in-situ в растения за нуждите на орално имунизиране, напр. (Ма et al., Science 268 (1995), 716-719; Mason und Arntzen, Tibtech Vol. 13 (1996), 388-392). Изградените от растението антитела при това се приемат чрез растението или чрез консумиране на подходящи части от растението, като се усвояват чрез устата, фаринкса или стомашночревтния тракт на тялото и причиняват активна имунна защита. Освен това е известно експресиране на едноверижни антитела (single chain antibody) в растения срещу нискомолекулния растителния хормон абсцизинова киселина, при което се наблюдава понижено наличие на растителния хормон въз основа на свързването на абсцизиновата киселина в растението (Artsaenko et al., The Plant Journal (1995), 8. (5), 745-750).A similar application is the use of plant protection against nematode infection (Rosso et al., Biochem. Biophys. Res. Com., 220 (1996), 255-263). Also known are examples of pharmaceutical applications of in-situ antibody expression in plants for oral immunization purposes, e.g. (Ma et al., Science 268 (1995), 716-719; Mason und Arntzen, Tibtech Vol. 13 (1996), 388-392). The antibodies produced by the plant are then taken by the plant or by consuming appropriate portions of the plant, absorbed by the mouth, pharynx or gastrointestinal tract of the body and cause active immune defenses. In addition, expression of single chain antibodies in plants against low molecular weight plant hormone abscisic acid is known, with a decrease in the presence of plant hormone based on the binding of abscisic acid in the plant (Artsaenko et al., The Plant Journal ( 1995), 8 (5), 745-750).

904.99-ПБ904.99-PB

Борбата с фунги по химически начин при важните за селското стопанство култури изисква използването на високо-селективни фунгициди, без фитотоксично въздействие. Фитотоксичното дейсвие се изразява напр. в забавяне на растежа на растението, намаляване на степента на фотосинтезата и свързаните с това понижавания на добива. В някои случаи все пак е трудно да се създадат фунгициди с достатъчно висока селективност, които да не причиняват вреди на културното растение. Създаването на резистентни към фунгицида или понасящи фунгицида културни растения може да допринесе за решаване на този проблем и да даде възможност за използване на фунгициди при култури, при които те не са прилагани досега, или са прилагани без задоволителен ефект.The fight against chemical fungus in crops important to agriculture requires the use of highly selective fungicides without phytotoxic effects. The phytotoxic effect is expressed e.g. in slowing down the growth of the plant, reducing the rate of photosynthesis and the associated decreases in yield. In some cases, however, it is difficult to create fungicides of sufficiently high selectivity that do not cause damage to the crop. The creation of fungicide-resistant or fungicide-bearing crops may contribute to addressing this problem and allow the use of fungicides in crops where they have not previously been applied or have been applied without satisfactory effect.

На разработването на резистентни към фунгициди културни растения чрез тъкачни култури или мутагенеза на семената и естествен подбор се поставят граници. Така чрез генното инженерство могат да се манипулират само тези растения, регенерирането на които става от клетъчната култура до цялото растение. Освен това културните растения могат да проявят след мутагенеза и селекция нежелани свойства, които биха могли да бъдат отстранени чрез частично многократно обратно кръстосване. Също би могло да бъде ограничено създаването на резистентност чрез кръстоска върху растения от същия вид.The development of fungicide-resistant crop plants through tissue cultures or seed mutagenesis and natural selection is bounded. Thus, through genetic engineering, only those plants can be manipulated, the regeneration of which takes place from cell culture to the whole plant. In addition, cultivated plants may exhibit, after mutagenesis and selection, undesirable properties that may be eliminated by partial repeated crossover. The creation of cross-resistance to plants of the same species could also be restricted.

По тези съображения от вставката, създадена по пътя на генното инженерство трябва да се изолира кодиращ резистентност ген и целенасочено да се прехвърли в растението, при използване на класическите методи за отглеждане на растението.For these reasons, a gene encoding resistance gene should be isolated from the insert created in the path of genetic engineering and intentionally transferred to the plant using the classical methods of plant cultivation.

904.99-ПБ904.99-PB

Развитието на поносимост спрямо хербициди по пътя на молекулната биология, напр. създаването на културни растения резистентни спрямо хербициди, изискваше досега въздействащият механизъм на хербицида в растението да е познат и да бъде намерен ген, който да причинява резистентност спрямо хербицида. Много от търговски използваните понастоящем хербициди действат чрез блокиране на ензим, необходим за биосинтезата на основна аминокиселина, липид или пигмент. Чрез промяна на генаThe development of tolerance to herbicides in the path of molecular biology, e.g. the creation of crop plants resistant to herbicides required the hitherto mechanism of action of the herbicide in the plant to be known and to find a gene that causes resistance to the herbicide. Many of the commercially used herbicides currently act by blocking the enzyme required for the biosynthesis of a basic amino acid, lipid or pigment. By changing the gene

на този ензим се стига до това че хербицидът не може повече да се свърже и чрез въвеждане на тези променени гени в културните растения се създава поносимост спрямо хербицида. Алтернативно, примерно в природата могат да се намерят аналогични ензими, напр. в някои микроорганизми, които способстват за природна резистентност спрямо хербициди. Този способстващ за резистентност ген се изолира от такъв микроорганизъм, клонира се в подходящи вектори и накрая след успешна трансформация сеthis enzyme causes the herbicide to no longer bind, and by introducing these altered genes into cultivated plants, tolerance to the herbicide is created. Alternatively, for example, similar enzymes may be found in nature, e.g. in some microorganisms that contribute to natural resistance to herbicides. This resistance-promoting gene is isolated from such a microorganism, cloned into suitable vectors and finally after successful transformation

въвежда за експресия в културно растение, което е чувствително спрямо хербицида (WO 96/38567).introduced for expression in a herbicide-sensitive crop plant (WO 96/38567).

Задача на настоящето изобретение е да се създаде нов вид общоприложим метод на генното инженерство за отглеждане на понасящи фунгициди трансгенни растения.It is an object of the present invention to provide a novel type of generally applicable genetic engineering method for the cultivation of fungicidal transgenic plants.

Техническа същност на изобретениетоSUMMARY OF THE INVENTION

Сега по неочакван начин е създаден метод за експресия на екзогенни полипептиди, антитела или части от антитела, които притежават свойството да свързват фунгициди в растенията.An unexpected method has now been devised for the expression of exogenous polypeptides, antibodies or antibody portions having the property of binding fungicides in plants.

Един първи обект на изобретението представлява получаването на фунгицид-свързващо антитяло и клониране на принадлежащия ген, съответно генен фрагмент.One first object of the invention is the production of a fungicide-binding antibody and cloning of the associated gene or gene fragment, respectively.

904.99-ПБ • ·904.99-PB • ·

Първоначално се продуцира антитяло, което да свързва фунгицида. Това може да стане напр. чрез имунизиране на гръбначни животни, най-често мишка, плъх, куче, кон, магаре или коза с антиген. Антигенът при това е фунгицид-активно вещество, ····An antibody is initially produced to bind the fungicide. This can be done e.g. by immunization of vertebrates, most commonly a mouse, rat, dog, horse, donkey or goat with antigen. The antigen is a fungicide-active substance, ····

което е присъединено или асоциирано чрез функционална група към високомолекулен носител, като говежди серумен албумин (BSA), кокоши белтък (овалбумин), keyhole limpet хемоцианин (KLH) или други носители. Имунният отговор се получава след многократно използване на антиген по бързите методи и води до изолиране на подходящ антисерум. Тази вставка осигурява първоначално поликлонален серум, който съдържа антитела с различна специфичност. За целите на използване in-situ е необходимо да се изолира секвенция, кодираща определени специфични моноклонални тела. За постигане на тази цел има различни пътища. Първият от тях използва сливане на клетки, продуциращи антитела с ракови клетки до една постоянно продуцираща антитела хибридома-клетъчна култура, която чрез уеднаквяване на получените клони накрая води до получаване на хомогенна, дефинирана моноклонална, продуцираща антитела клетъчна линия.which is attached or associated by a functional group to a high molecular weight carrier, such as bovine serum albumin (BSA), chicken protein (ovalbumin), keyhole limpet hemocyanin (KLH) or other carriers. The immune response is obtained after repeated use of the antigen by rapid methods and results in the isolation of a suitable antiserum. This insert provides initially a polyclonal serum containing antibodies of different specificity. For the purposes of in-situ use, it is necessary to isolate a sequence encoding certain specific monoclonal bodies. There are different ways to achieve this. The first of these uses the fusion of cancer-producing antibody cells to a single antibody-producing hybridoma-cell culture, which, by aligning the resulting clones, ultimately yields a homogeneous, defined monoclonal, antibody-producing cell line.

От една такава моноклонална клетъчна линия се изолира кДНК за антитела, съответно части от антитела, на тъй-нарече ните едноверижни антитела (single chain amtibody - scFv). Тези кДНК-секвенции могат след това да се клонират в експресионна касета и да се използват за функционална експресия в прокариотни и еукариотни организми, включително в растения.From such a monoclonal cell line is isolated the cDNA for antibodies, respectively parts of antibodies, of the so-called single chain amtibody (scFv). These cDNA sequences can then be cloned into an expression cassette and used for functional expression in prokaryotic and eukaryotic organisms, including plants.

Възможно е също по метода Phagen-Displey-Banken да се селекционират антитела, които да свързват молекулите на фунгицида и да се получи каталитично продукт, който не притежаваIt is also possible to select antibodies by the Phagen-Displey-Banken method to bind the fungicide molecules and produce a catalyst that does not have any

904.99-ПБ904.99-PB

·· ·· A ·· ·· ·· • · · · ···· ···· ··· · · · ···· ·· · · ·· 4 · ··· ··· ··· · · · < · ···· ·· ··· ·· ·· ·· фунгицидни свойства. Методи за получаване на каталитични антитела са описани от Janda et al., в Science 275 (1997) 945-948, Chemical selection for catalysis in combinatorial Antibodiy libraries; Catalytic Antibodies, 1991, Ciba Foundation Symposium 159, WileyInterscience Publication. Чрез клониране на гена на това каталитично антитяло и експресията му в растение може по принцип също така да се получи резистентно спрямо фунгицид растение.· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · <· · · · · · · · · · · · · · · · Fungicidal properties. Methods for the preparation of catalytic antibodies are described by Janda et al., In Science 275 (1997) 945-948, Chemical selection for catalysis in combinatorial Antibodiy libraries; Catalytic Antibodies, 1991, Ciba Foundation Symposium 159, WileyInterscience Publication. By cloning the gene of this catalytic antibody and its expression in a plant, it can in principle also be obtained by a fungicide-resistant plant.

Обект на изобретението са по-специално експресионни касети, кодиращите секвенции на които кодират за фунгицидсвързващ полипептид или за негови функционални еквиваленти, както и тяхното използване за получаване на устойчиви спрямо фунгициди растения. Секвенцията от нуклеинови киселини може при това да бъде напр. една ДНК- или кДНК-секвенция. За въвеждане в експресионната касета, съгласно изобретението, на подходящи кодиращи секвенции се предлагат напр. такива, които съдържат една ДНК-секвенция, получена от една хибридомна клетка, която кодира за полипептид с фунгицид-свързващи свойства и която осигурява на гостоприемника резистентност спрямо инхибиторни растителни ензими.An object of the invention is in particular expression cassettes, the coding sequences of which encode for a fungicide-binding polypeptide or for its functional equivalents, and their use for the production of fungicide-resistant plants. The nucleic acid sequence may then be e.g. a DNA or cDNA sequence. For insertion into the expression cassette of the invention, suitable coding sequences are offered, e.g. those that contain a DNA sequence derived from a hybridoma cell that encodes for a polypeptide with fungicidal-binding properties and that provides host resistance to inhibitory plant enzymes.

Експресионната касета съгласно изобретението съдържа освен това регулативна секвенция от нуклеинови киселини, която направлява експресията на кодираща секвенция в клетките на гостоприемника. Съгласно една предпочитана форма на изпълнение на изобретението, експресионната касета обхваща по направление нагоре, т. е. на 5’-края на кодиращата секвенция един промотор и по направление надолу, т.е. на 3’-края на секвенцията един полиаденилиращ сигнал и в даден случай други регулационни елементи, които с намиращата се помежду кодираща секвенция са свързани оперативно с пептида с фунгицид-The expression cassette of the invention further comprises a regulatory nucleic acid sequence that directs the expression of a coding sequence in the host cells. According to a preferred embodiment of the invention, the expression cassette spans upwards, i.e. at the 5′-end of the coding sequence, one promoter and downwards, i.e. at the 3'-end of the sequence, a polyadenylation signal, and optionally other regulatory elements, which are operatively linked to the fungicide peptide located between the coding sequence,

904.99-ПБ904.99-PB

свързващи свойства и/или с транспептид. Под понятието оперативно свързване се разбира последователното подреждане на промотор, кодираща секвенция, терминатор и в даден случай други регулиращи елементи, по такъв начин, че да може всеки от регулиращите елементи да изпълни своята функция при експресията на кодиращите секвенции по предназначение. Предпочитаните за оперативното свързване секвенции, без изобретението да се ограничава до тях, са целевите-секвенции за осигуряване на субцелуларна локализация в апопластите, в плазмените мембрани, във вакуолите, в пластиците, в митохондриума, в ендоплазматичния ретикулум (ER), в ядрото на клетката, в маслените телца и в други части и транслационните усилватели, като напр. 5’въвеждащата секвенция от Tabak Mosaic Virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711).binding properties and / or with transpeptide. The term operative linkage is understood to mean the sequential ordering of a promoter, coding sequence, terminator, and optionally other regulatory elements, in such a way that each of the regulatory elements can fulfill its function in the expression of the coding sequences for its intended purpose. Preferred operative sequences, without being limited to the invention, are the target sequences for providing subcellular localization in the apoplasts, in the plasma membranes, in the vacuoles, in the plastics, in the mitochondria, in the endoplasmic reticulum (ER), in the nucleus of the cell , in oil bodies, and in other parts and translational amplifiers, e.g. 5'Introduction sequence of Tabak Mosaic Virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711).

Като промотор на експресионната касета съгласно изобретението е подходящ общо взето всеки промотор, който може да направлява експресията на чужди гени. Така напр. се използва по-специално растителен промотор, или промотор, който произхожда от растителен вирус. Особено предпочитан е CaMVЗбв-промотор от Blumenkohl-Mosaic Virus (Franck et al., Cell 21 (1980), 285-294). Този промотор съдържа различни отличителни секвенции за транскрипционални ефектори, които в тяхната цялост водят до постоянна и конститутивна експресия на въведения ген (Benfey et al., EMBO J., 8 (1989), 2195-2202).As a promoter of the expression cassette of the invention, it is generally suitable for any promoter that can direct the expression of foreign genes. For example, in particular, a plant promoter or a promoter derived from a plant virus is used. A particularly preferred CaMV3bv promoter is from Blumenkohl-Mosaic Virus (Franck et al., Cell 21 (1980), 285-294). This promoter contains various distinctive sequences for transcriptional effectors that, in their entirety, lead to constant and constitutive expression of the gene introduced (Benfey et al., EMBO J., 8 (1989), 2195-2202).

Експесионната касета съгласно изобретението може да съдържа също химически индуциращ се промотор, чрез който експресията на екзогенни полипептиди в растенията може да бъде направлявана до един определен момент във времето. Такива промотори , като напр. PRP1-промотор (Ward et al., Plant. Mol.The expression cassette of the invention may also comprise a chemically inducible promoter through which the expression of exogenous polypeptides in plants can be directed to a particular point in time. Such promoters as e.g. PRP1 promoter (Ward et al., Plant Mol.

Biol. 22(1993), 361-366), промотор, индуциращ се чрез салицилова киселина (WO 95/1919443), промотор, индуциращ се от бензенсулфонамид (ЕР 388186), промотор, индуциращ се от абсцизинова киселина (ЕР 335528), съответно промотор, индуциращ се отBiol. 22 (1993), 361-366), a salicylic acid-inducible promoter (WO 95/1919443), a benzene sulfonamide-inducible promoter (EP 388186), an abscisic acid-inducible promoter (EP 335528), respectively. induced by

904.99-ПБ • ·904.99-PB • ·

етанол или циклохексанон (WO 9321334), са описани в литературата и могат също така да бъдат използвани.ethanol or cyclohexanone (WO 9321334) have been described in the literature and may also be used.

Освен това са предпочитени особено промотори, коитоIn addition, particular promoters are preferred which

окигуряват експресия в тъкани или части от растения, в които се разпространява действието на фунгицида. По-специално трябва да бъдат споменати промотори, които осигуряват специфична експресия в листата. Могат да се споменат промоторите на цитозолна FB-фаза от картофи или ST-LSI промотор от картофи (Stockhaus et al., EMBO J., 8, (1989), 2445-245).provide expression in tissues or parts of plants in which the action of the fungicide is spread. In particular, promoters that provide specific expression in the leaves should be mentioned. The promoters of the cytosolic FB-phase of potatoes or the ST-LSI promoter of potatoes may be mentioned (Stockhaus et al., EMBO J., 8, (1989), 2445-245).

C помощта на промотор, специфичен за семена, могат да се експресират едноверижни-антитела, стабилни до 0.67 % спрямо общата стойност на разтворими семе-протеини в семената на трансгенни тютюневи растения (Fiedler und Conrad, Bio/Technology 10 (1995), 1090-1094). Тъй като е възможна също експресия в засети или покълнали семена, то по смисъла на настоящето изобретение, специфични промотори от кълнове или семена могат да са също така предпочитани регулиращи елементи съгласно изобретението. Експресионната касета съгласно изобретението може да съдържа също напр. специфичен за семена промотор (за предпочитане USP- или 1_ЕВ4-промотор, 1_ЕВ4-сигнален пептид), който съдържа гена за експесиране и един ER-задържащ сигнал. Изграждането на касетата е показано схематично на фигура 1, например за едноверижно антитяло (scFv-Gen).Using a seed-specific promoter, single-stranded antibodies stable up to 0.67% relative to the total value of soluble seed proteins in transgenic tobacco plant seeds can be expressed (Fiedler und Conrad, Bio / Technology 10 (1995), 1090- 1094). Since expression is also possible in sowed or germinated seeds, specific sprout or seed promoters may also be preferred control elements of the invention in the meaning of the present invention. The expression cassette of the invention may also comprise e.g. a seed-specific promoter (preferably a USP- or 1-EB4-promoter, 1-EB4-signal peptide) that contains the expression gene and an ER-retaining signal. The construction of the cassette is shown schematically in Figure 1, for example for a single-stranded antibody (scFv-Gen).

• · • ·• · · ·

Получаването на експресионна касета съгласно изобретението се провежда чрез сливане на подходящ промотор с подходяща полипептид-ДНК и за предпочитане инсерция на единThe preparation of an expression cassette according to the invention is carried out by fusion of a suitable promoter with a suitable polypeptide DNA and preferably the insertion of one

904.99-ПБ904.99-PB

• ·• ·

междинен промотор и полипептид-ДНК, за една хлоропластиспецифична, кодираща транзитен пептид ДНК, както и един полиаденилиращ сигнал, при използване на бързи рекомби национни и клониращи техники, каквито са описани например отan intermediate promoter and a polypeptide-DNA for a chloroplast-specific, coding transit peptide DNA, as well as a polyadenylation signal, using rapid recombination and cloning techniques as described, for example, by

Т. Maniatis, E.F. Fritsch и J. Sambrook, Molecular Cloning: AT. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A

Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989), също и от T. J. Silhavy, M.L. Berman und L. W.Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989), also by T. J. Silhavy, M.L. Berman und L.W.

Enquist, в Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984), и от Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc, and Wiley-lnterscience (1987).Enquist, in Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984), and by Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc, and Wiley-lnterscience (1987).

Особено предпочитани са секвенции, които са насочени към апопласти, пластиди, вакуоли, плазмени мембрани, митохондрии, ендоплазматичен ретикулум (ER) или чрез отсъствие на съответна оперативна секвенция на мястото на създаване осигуряват оставането на цитозол (Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996), 285-423). За количеството на натрупване на протеин в трансгенни растения се оказва особено необходима локализация в ER, както и в стената на клетката (Schouten et al., Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-792; Artsaenko et al., Plant J., 8, (1995), 745-750).Particularly preferred sequences targeting apoplasts, plastids, vacuoles, plasma membranes, mitochondria, endoplasmic reticulum (ER) or, through the absence of an appropriate operative sequence at the site of creation, ensure cytosol remains (Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996), 285-423). The amount of protein accumulation in transgenic plants is particularly necessary for localization in the ER as well as in the cell wall (Schouten et al., Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-792; Artsaenko et al., Plant J ., 8, (1995), 745-750).

Обект на изобретението са също експресионни касети, кодиращата секвенция на които кодира фунгицид-свързващ слят протеин, при което част от слетия протеин е транзитен пептид, който направлява транслокация на полипептида. Особено предпочитани са хлоропласт-специфични транзитни пептиди, които след транслокация на фунгицид-свързващите полипептиди вAlso contemplated are expression cassettes, the coding sequence of which encodes a fungicide-binding fusion protein, wherein part of the fusion protein is a transit peptide that directs translocation of the polypeptide. Chloroplast-specific transit peptides, which after translocation of the fungicide-binding polypeptides, are particularly preferred

904.99-ПБ904.99-PB

растителните хлоропласти се отцепват ензимно от фунгицидсвързващата полипептидна част. Особено се предпочита транзитният пептид да се отстрани от пластидната транскетолаза (ТК) или един функционален еквивалент на този транзитен пептид (напр. транзитен пептид на малките елементи на Rubisko или на Ferredoxin NADP- оксидоредуктаза).plant chloroplasts are enzymatically cleaved from the fungicide binding polypeptide moiety. It is particularly preferred that the transit peptide be removed from the plastid transketolase (TC) or one functional equivalent of that transit peptide (eg, the small peptide transit element of Rubisko or Ferredoxin NADP oxidoreductase).

Необходимите за получаване на експресионни касети съгласно изобретението полипептид-ДНК или кДНК се амплифицират за предпочитане с помощта на метода Polimerase Chain Reaction (PCR). Познати са методи за ДНК-амплификация чрез PCR, напр. описаните от Innes et al., PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990). Целесъобразно е получените по метода PCR ДНК-фрагменти да се подлагат на изпитване чрез секвенционен анализ за избягване на грешки на полимеразата в конструкта, подлежащ на експресия.The polypeptide-DNA or cDNA polypeptide-cDNA or cDNA required for the preparation of expression cassettes are preferably amplified using the Polymerase Chain Reaction (PCR) method. Methods for DNA amplification by PCR are known, e.g. described by Innes et al., PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990). It is appropriate that the DNA fragments obtained by the PCR method be tested by sequential analysis to avoid polymerase errors in the construct to be expressed.

Включената нуклеотидна секвенция, кодираща за фунгицидсвързващ полипептид може да се получи по синтетичен път или да е получена в природата, или да съдържа смес от синтетични и природни ДНК-съставни части. Общо взето синтетичните нуклеотидни секвенции се получават с кодони, които са предпочитани от растения. Тези предпочитани от растенията кодони могат да се определят от кодони с по-високо протеиново число, които се експресират най-често в интересни растителни видове. При получаване на експресионна касета могат да се обработят различни ДНК-фрагменти, за да се получи нуклеотидна секвенция, която целесъобразно е насочена в коректната посока и която е изградена с коректен Leseraster. За свързване на ДНК-фрагментите един с друг могат към фрагментите да се присъединят адаптери или свързваща ДНК.The included nucleotide sequence coding for a fungicide binding polypeptide may be synthetically produced or obtained in nature, or may contain a mixture of synthetic and natural DNA components. Generally, synthetic nucleotide sequences are obtained with codons that are preferred by plants. These plant-codon codons may be determined by codons with a higher protein number, which are most commonly expressed in interesting plant species. Upon preparation of the expression cassette, various DNA fragments may be processed to produce a nucleotide sequence that is appropriately directed in the correct direction and which is constructed with the correct Leseraster. Adapters or binding DNA can be attached to the fragments to bind DNA fragments to one another.

• · · · · · • · · · · · • · · · · · • ·· ··· ··· • · · · • »· ·· ·· • · с• · · · · · · · · · · · · · · · · · • · · · · · · · · · · · · · · · · · ·

едноone

904.99-ПБ • *904.99-PB • *

По целесъобразен терминатора в посока начин трябва областите на промотора на транскрипцията да бъдат снабдени свързваща ДНК или с много свързващи ДНК, които съдържат или повече рестрикционни места заAs appropriate, the transcriptional promoter regions in the direction of the terminator should be provided with binding DNA or many binding DNAs containing or more restriction sites for

По правило свързващата ДНК има 1 првдпочитане 2 до 6 рестрикционни въвеждане на тази секвенция.As a rule, the binding DNA has a 1 preferred 2 to 6 restriction insertion of this sequence.

до 10, най-често 1 до 8, за места. Общо взето свързващата ДНК има в регулаторната област големина по-малка от 100up to 10, most often 1 to 8, for seats. Generally, the binding DNA has a size smaller than 100 in the regulatory area

Ьр, често пъти по-малка от 60 Ьр и все пак най-малко 5 Ьр. Промоторът съгласно изобретението може да бъде както природен продукт, ложен за съгласно съответно хомоложен, така и чужд, съответно хетерорастението гостоприемник. Експресионната касета изобретението съдържа в 5’-3’-транскрипционно направление промотора, съгласно изобретението, на секвенция и една област на транскрипционнотоBp, often less than 60 bp and still at least 5 bp. The promoter according to the invention can be both a natural product, according to a homologous or foreign, respectively, hetero-growth host. The expression cassette of the invention contains in the 5′-3′ transcriptional direction the promoter according to the invention, a sequence and one region of the transcription

Различните области на прекратяване на синтезата взаимозаменяеми.The various areas of termination of synthesis are interchangeable.

Освен това могат да се въведат манипулации, една произволпрекратяване.In addition, manipulations can be introduced, one arbitrary termination.

са произволно които осигуряват протичащите рестрикционни етапи или с които се отстранява излишната ДНК или се отстраняват рестрикционните места на късане. Където става въпрос за инсерция, делеция или заместване, като напр. транзиция и тренсверсия, могат да се използват in vitro мутагенеза, primerre-pair, рестрикция или лигиране. При подходящи манипулации, като напр. рестрикция, “chewing-back или допълване на натрупвания за bluntends, комплементарните краища на фрагментите могат да бъдат на разположение за лигиране.are arbitrarily providing restriction steps or removing excess DNA or removing restriction sites. When it comes to insertion, deletion or substitution, such as transcription and transversion, in vitro mutagenesis, primer-pair, restriction or ligation can be used. With proper manipulation, such as restriction, chewing-back, or bluntends accumulation, the complementary ends of the fragments may be available for ligation.

От особено значение за успеха на решението съгласно изобретението е прикачването на специфичен ER-задържащ сигналOf particular importance for the success of the solution according to the invention is the attachment of a specific ER retention signal

SEKDEL (Schuoten, A. et al., Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-792), cSEKDEL (Schuoten, A. et al., Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-792), c

904.99-ПБ което се утроява до учетворява средната величина на експресията. За изграждане на касетата могат да бъдат въведени също и други задържащи сигнали, които по естествен начин се срещат в ER-локализирани растителни и животински протеини.904.99-PB, which tripled to four times the average expression. Other retention signals that naturally occur in ER-localized plant and animal proteins may also be introduced to construct the cartridge.

Предпочитаните полиаденилиращи сигнали са растителнитеPreferred polyadenylation signals are plant

полиаденилиращи сигнали, за предпочитане такива, които отговарят по същество на T-DNA-полиаденилиращи сигнали от Agrobacterium tumefaciens, особено отговарящите на/ен-3 на ТDNA (Octopin Syntase) на Ti-плазмид pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3, (1984), стр. 835 и следващи) или на техни функционални еквиваленти.polyadenylation signals, preferably those that respond substantially to T-DNA polyadenylation signals of Agrobacterium tumefaciens, especially those corresponding to T-plasmid pTiACH5 / en-3 (Octopin Syntase) (Gielen et al., EMBO J. 3 , (1984), pp. 835 et seq.) Or their functional equivalents.

Една експресионна касета съгласно изобретението може да съдържа например конститутивен промотор (за предпочитане CaMV 35 S-промотор), 1еВ4-сигнален пептид, ген за експресия и ER-задържащ сигнал. Изграждането на касетата е представено схематично на Фигура 2, например за едноверижно антитяло (scFv-Gen). Като ER-задържащ сигнал се използва за предпочитане аминокиселинната последователност KDEL (лизин, аспарагинова киселина, глутаминова киселина, левцин).An expression cassette of the invention may comprise, for example, a constitutive promoter (preferably a CaMV 35 S promoter), an 1eB4 signal peptide, an expression gene, and an ER retention signal. The construction of the cassette is shown schematically in Figure 2, for example for a single-stranded antibody (scFv-Gen). Preferably, the amino acid sequence KDEL (lysine, aspartic acid, glutamic acid, leucine) is used as the ER retention signal.

За предпочитане сливащата експресионна касета, която кодира за полипептид с фунгицид-свързващи свойства е клонирана във вектор, например pBinl9, който е подходящ да трансформира Agrobacterium tumefaciens. Трансформираните с такъв вектор агробактерии могат след това да се използват по познат начин за трансформиране на растения, по-специално на културни растения, като напр. тютюневи растения, при което напр. използваните листа или късчета от листа се промиват в агробактериен разтвор и след това се култивират в подходяща среда. Трансформация на растения с акробактерии е позната • · • ·Preferably, the fusion expression coding for a fungicide-binding polypeptide is cloned into a vector, for example pBinl9, which is suitable for transforming Agrobacterium tumefaciens. Agrobacteria transformed with such a vector can then be used in a known manner to transform plants, especially cultivated plants, such as e.g. tobacco plants, e.g. the used leaves or leaf fragments are washed in agrobacterium solution and then cultured in a suitable medium. Transformation of plants with acrobacteria is known • · • ·

904.99-ПБ904.99-PB

• · · · • · · · • · · · · · · • · • » ·· между другото от публикацията на F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, издадена от S.D. Kung и R. Wu, Academic Press, 1993, стр. 15-38 и от публикацията на S.B. Gelvin, Molecular Genetics of T-DNA Transfer from Agrobakterium to Plants, публикувана също в Transgenic Plants, стр. 49-78. От трансформираните· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · White, Gene Transfer Vectors in Higher Plants; and Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, issued by S.D. Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38 and from the publication of S.B. Gelvin, Molecular Genetics of T-DNA Transfer from Agrobacterium to Plants, also published in Transgenic Plants, pp. 49-78. Of the transformed

клетки на използваните листа, съответно късове от листа, могат по познат начин да се регенерират трансгенни растения, които съдържат интегриран в касетата съгласно изобретението ген за експресия на полипептид с фунгицид-свързващи свойства.cells of the leaves used, respectively, fragments of leaves, can be regenerated in a known manner by transgenic plants which comprise a gene for expression of a fungicide-binding polypeptide integrated into the cassette of the invention.

За трансформация на растение-гостоприемник с една, кодирана за фунгицид-свързващ полипептид ДНК, се изгражда експресионна касета съгласно изобретението, въведена като инсерция в рекомбинантен вектор, чиято векторна ДНК съдържа допълнително функционални регулационни сигнали, например секвенции за репликация или интеграция. Подходящи вектори са описани между другото в Metods in Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press), Kap. 6/7, стр. 71-119 (1993).For transformation of a host plant with one encoded for a fungicide-binding polypeptide DNA, an expression cassette according to the invention is introduced, introduced as an insertion into a recombinant vector, whose vector DNA contains further functional regulatory signals, such as replication or integration sequences. Suitable vectors are described, inter alia, in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press), Kap. 6/7, pp. 71-119 (1993).

При използване на цитираните по-горе рекомбинантни техники и техники за клониране, експресионните касети съгласно изобретението могат да се клонират в подходящи вектори, които да дават възможност за тяхното размножаване, напр. в Е. coli. Подходящи клониращи вектори са между другото pBR332, pUCсерии, М13тр-серии и pA-CYC184. Особено подходящи са бинерни вектори, които могат да се реплицират както в Е. coli, така и в агробактерии, като напр. pBinl9 (Bevan et al. (1980) Nucl. Acids Res. 12, 8711).When using the recombinant and cloning techniques mentioned above, the expression cassettes of the invention can be cloned into suitable vectors to allow their propagation, e.g. in E. coli. Suitable cloning vectors include, but are not limited to, pBR332, pUCseries, M13tr-series, and pA-CYC184. Particularly suitable are binary vectors that can be replicated in both E. coli and agrobacteria, such as e.g. pBinl9 (Bevan et al. (1980) Nucl. Acids Res. 12, 8711).

904.99-ПБ904.99-PB

Друг обект на изобретението е използване на експресионни касети съгласно изобретението за трансформация на растения, растителни клетки, тъкани и части от растения. Цел на използването е за предпочитане създаване на резистентност срещу фунгициди с фитотоксично действие.Another object of the invention is the use of expression cassettes according to the invention for the transformation of plants, plant cells, tissues and parts of plants. The purpose of the use is preferably to create resistance to phytotoxic fungicides.

При това според избора на промоторите експресията се осъществява специфично в листата, в семената или в други части на растенията. Такива трансгенни растения, техни плодове, както и клетки, тъкани или части от растението, са друг обект на настоящето изобретение.In this case, according to the choice of the promoters, the expression is carried out specifically in the leaves, in the seeds or in other parts of the plants. Such transgenic plants, their fruits, as well as cells, tissues or parts of the plant, are another object of the present invention.

Пренасянето на чужди гени в генома на растение се нарича трансформация. При това се използват описаните методи за трансформация и регенерация на растения от растителни тъкани и растителни клетки за провеждане на преходна или стабилна трансформация. Подходящи методи са трансформация на протопласти чрез полиетиленгликол-индуцирано приемане на ДНК, биолитично въвеждане на генканон, електропорообразуване, инкубиране на сухи ембриони в съдържащи ДНК разтвори, ♦ микроинжектиране и генен трансфер с помощта на агробактерия. Посочените методи са описани, напр. от В. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, в: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, издадена от S.D. Kung и R. Wu, Academic Press, 1993, стр. 128-143, както и в Portykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225). За предпочитане конструктът, който подлежи на експресия се клонира в един вектор, който е подходящ, за да се трансформира Agrobacterium tumefaciens, напр. pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711).The transfer of foreign genes into the plant genome is called transformation. The described methods for transformation and regeneration of plants from plant tissues and plant cells are used to effect a transient or stable transformation. Suitable methods are transformation of protoplasts by polyethylene glycol-induced DNA uptake, biolytic introduction of gancanon, electroporation, incubation of dry embryos in DNA-containing solutions, ♦ microinjection, and gene transfer by means of agrobacteria. The above methods are described, e.g. by W. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, issued by S.D. Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 128-143, and in Portykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225). Preferably, the construct to be expressed is cloned into a vector that is suitable to transform Agrobacterium tumefaciens, e.g. pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711).

• ·• ·

904.99-ПБ904.99-PB

Трансформираните с помощта на експресионната касета съгласно изобретението агробактерии могат след това по познат начин да се използват за трансформация на растения, по-специ-Agrobacteria transformed using the expression cassette according to the invention can then be used in a known manner to transform plants, in particular

ално на културни растения, като пшеница, царевица, соя, ориз, памук, захарна тръстика, канола, слънчоглед, лен, картофи, тютюн, домати, рапица, люцерна, салата и различни видове храсти, овощия, ореховидни и лозя, напр. кафе, плодови дървета, като ябълки, круши и череши, ореховидни насаждения, като орех или пекан, при което заболелите листа и листни късове се промиват в разтвор на агробактерии и след това се култивират в подходящ разтвор.of cultivated plants such as wheat, corn, soybeans, rice, cotton, cane, canola, sunflower, flax, potatoes, tobacco, tomatoes, rapeseed, alfalfa, lettuce and various shrubs, vegetables, nuts and vines, e.g. coffee, fruit trees, such as apples, pears, and cherries, nuts, such as walnut or pecan, in which diseased leaves and leaf fragments are washed in a solution of agrobacteria and then cultivated in a suitable solution.

функционално еквивалентни секвенции, които кодират фунгицид-свързващ полипептид, съгласно изобретението, са такива секвенции, които освен различаващата се нуклеотидна секвенция имат желани функционални групи, функционалните еквиваленти обхващат при това природно наличните варианти на описаните тук секвенции, както и изкуствени, които са получени напр. чрез химически синтез, пригодени за кодон-използване при растения, изкуствени нуклеотидни секвенции.functionally equivalent sequences encoding a fungicide-binding polypeptide according to the invention are such sequences which, in addition to the differing nucleotide sequence, have the desired functional groups, the functional equivalents comprising the naturally occurring variants of the sequences described herein, as well as artificial ones which have been obtained artificially . by chemical synthesis, adapted for codon use in plants, artificial nucleotide sequences.

Под понятието функционални еквиваленти се разбират поспециално природни или изкуствени мутации на предварително изолирана, кодираща фунгицид-свързващ полипептид секвенция, която проявява освен това желана функция. Мутациите обхващат заместване, прибавяне, делеция, замяна или инсерция на един или повече нуклеотидни участъка. Така например съгласно изобретението се обхващат също и такива нуклеотидни секвенции, които се получават чрез модификация на тези нуклеотидни секвенции. Цел на такава модификация може напр. да бъде следващо ограничаване на получената кодираща секвенция в него ·· ·· • · · • «The term functional equivalents means, in particular, natural or artificial mutations of a pre-isolated, coding fungicidal-binding polypeptide sequence that also exhibits a desired function. Mutations involve the substitution, addition, deletion, replacement or insertion of one or more nucleotide regions. Thus, for example, the invention also encompasses such nucleotide sequences that are obtained by modifying these nucleotide sequences. The purpose of such modification may e.g. be the next restriction of the resulting coding sequence therein ·· ·· • · · • «

904.99-ПБ904.99-PB

• · · ···· ·· · • · ·• · · · · · · · ·

или напр. също включване на други места за късане от рестрикционни ензими.or e.g. also the inclusion of other restriction enzyme breakpoints.

Функционални еквиваленти са също такива варианти, чието действие е сравнимо с това на изходния ген, съответно генни фрагменти или е по-слабо или по-силно, в сравнение с изходния ген, съответно генен фрагмент.Functional equivalents are also variants whose action is comparable to that of the parent gene, or gene fragments, or is weaker or stronger than the parent gene or gene fragment, respectively.

Освен това са подходящи изкуствени ДНК секвенции, доколкото те, както е описано по-горе, индуцират желаната резистентност спрямо хербициди. Такива изкуствени ДНК секвенции могат напр. да проявят фунгицид-свързваща активност при обратен повтор чрез молекулно моделиране на конструирани протеини или да бъдат получени чрез селекция in-vitro. Особено подходящи са кодиращи ДНК секвенции, които се получават чрез обратен повтор на полипептидна секвенция, съгласно специфично по отношение на раствнието-гостоприемник използване на кодон. Специфично използване на кодон може лесно да се осъществи с познатите на специалиста методи на генно инженерство при растения, чрез компютърно систематизиране на други познати гени за трансформиране на растения.In addition, artificial DNA sequences are suitable as they, as described above, induce the desired resistance to herbicides. Such artificial DNA sequences may e.g. to exhibit fungicidal-binding activity in reverse repetition by molecular modeling of engineered proteins or to be obtained by in vitro selection. Particularly suitable are DNA coding sequences, which are obtained by reverse repeating a polypeptide sequence, according to the codon specific host-specific use. Specific codon use can be readily accomplished by methods known in the art for genetic engineering in plants, by computerized systematization of other known genes for plant transformation.

Като друга подходяща за използване съгласно изобретението еквивалентна секвенция на нуклеинова киселина трябва да се споменат секвенции, кодиращи слят протеин, при което съставната част на слетия протеин е част от фунгицид-свързващ полипептид, който не е от растителен произход или част от негов функционален еквивалент. Втората част на слетия протеин може напр. да бъде друг полипептид с ензимна активност или една антиген полипептидна секвенция, с помощта на която е възможно доказването на scFvs експресия (напр. myc-tag или his-tag). За предпочитане това се отнася до една регулативна протиенова • ·· ·· ·· ·· · · · · · · • · · · · · · • · · · ··· ··· • · · · · ··· ·· ·· ··As another suitable nucleic acid sequence for use according to the invention, reference is made to sequences encoding a fusion protein, wherein the fusion protein component is part of a fungicide binding polypeptide that is not of plant origin or part of its functional equivalent. The second portion of the fusion protein may e.g. be another polypeptide with enzymatic activity or an antigen polypeptide sequence, by which scFvs expression can be demonstrated (eg, myc-tag or his-tag). Preferably, this applies to a regulatory anti-protein. • · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·· ··

904.99-ПБ904.99-PB

секвенция, като напр. сигнален или транзитен пептид, който въвежда полипептида с фунгицид-свързващи свойства на желаното място за действие.a sequence, e.g. a signal or transit peptide that introduces the polypeptide with the fungicide-binding properties to the desired site of action.

Предмет на изобретението са обаче също получените съгласно изобретението експресионни продукти, както и слети протеини от транзитен пептид и полипептид с фунгицид-свързващи свойства.However, it is also an object of the invention to obtain the expression products obtained according to the invention, as well as fusion proteins of a transit peptide and a polypeptide with fungicidal binding properties.

Понятията резистентност, съответно поносимост. в рамките на настоящето изобретение означава изкуствено придобита устойчивост срещу действието на фунгициди с фитотоксично действие. Тя обхваща частична и по-специално пълна нечувствителност срещу тези инхибитори с продължителност най-малко на една генерация на растението.The concepts of resistance, respectively tolerance. within the present invention means an artificially acquired resistance to the action of phytotoxic fungicides. It encompasses partial and in particular complete insensitivity to these inhibitors lasting at least one generation of the plant.

Първичното място на действие на фунгицидите е обикновено растителната тъкан, така че специфична за листата експресия на екзогенни фунгицид-свързващи полипептиди осигурява достатъчна защита. Близък до това е все пак случаят, когато действието на фунгицида не трябва да се ограничи само до тъканите на листата, а може да въздейства също върху всички други останали части от растението специфично спрямо тъканите.The primary site of action of the fungicides is usually the plant tissue, so that leaf-specific expression of exogenous fungicidal-binding polypeptides provides sufficient protection. This is nevertheless close to the case where the action of the fungicide must not be limited to the tissues of the leaves, but may also affect all other parts of the plant specifically in relation to the tissues.

Освен това конститутивната експресия на екзогенен фунгицид-свързващ полипептид дава предимство. От друга страна може също да бъда желателна индуцираща се експресия.Furthermore, constitutive expression of an exogenous fungicide-binding polypeptide is advantageous. On the other hand, inducible expression may also be desirable.

Действието на трансгенни експресионни полипептиди с фунгицид-свързващи свойства може да се установи напр. in-vitro чрез увеличаване на кълнове върху фунгицид-съдържаща среда спрямо постепенно променяща се поредица от концентрации или чрез тестове с покълвано на семена. При това определено растение може да се подложи на изпитания във вегетационнаThe action of transgenic expression polypeptides with fungicidal binding properties can be established e.g. in vitro by increasing germination on a fungicide-containing medium over a gradually changing series of concentrations or by seed germination tests. In this case, a particular plant may be subjected to vegetation testing

904.99-ПБ ·· ··904.99-PB ·· ··

• · · ···· ·· къща, за да се определи вида и големината на промяната в поносимостта спрямо фунгициди.• · · · ······ house to determine the type and magnitude of the change in tolerance to fungicides.

Обект на изобретението са също така трансгенни растения, трансформирани с експресионна касета, съгласно изобретението, както и трансгенни клетки, тъкани, части и плодове от такива растения. Особено предпочитани при това са трансгенни културни растения, като напр. пшеница, царевица, соя, ориз, памук, захарна тръстика, канола, слънчоглед, лен, картофи, тютюн,The subject of the invention are also transgenic plants transformed with an expression cassette according to the invention, as well as transgenic cells, tissues, parts and fruits of such plants. Particularly preferred in this context are transgenic cultivated plants, e.g. wheat, corn, soy, rice, cotton, cane, canola, sunflower, flax, potatoes, tobacco,

домати, рапица, люцерна, салата и различни видове храсти, овощни дървета, ореховидни и лозя, по-специално кафе, овощни дървета, като ябълки, круши и вишни, или орехови, като орех или пекан и особено важно - лозя.tomatoes, rapeseed, alfalfa, lettuce and various types of shrubs, fruit trees, walnuts and vines, in particular coffee, fruit trees such as apples, pears and sour cherries, or walnuts such as walnuts or pecans, and most importantly vineyards.

Трансгенните растения, растителни клетки, растителни тъкани или части от растения могат да се обработят с фунгицид с фитотоксично действие, който инхибира растителните ензими, така че неуспешно трансформираните растения, растителни клетки, растителни тъкани или части от растения да бъдат унищожени, съответно увредени. Примери за подходящи активни вещества са по-специално стробилкарбамид, по-специално метил метоксиимино-а-(о-толилокси)-о-толилацетат (BAS 490F), както и метаболити и функционални производни на тези съединения. Кодиращата полипептид ДНК с фунгицид-свързващи свойства, която се въвежда в експресионната касета съгласно изобретението, може да се използва също като селекционен маркер.Transgenic plants, plant cells, plant tissues or plant parts can be treated with a phytotoxic fungicide that inhibits plant enzymes so that unsuccessfully transformed plants, plant cells, plant tissues or plant parts are destroyed or damaged accordingly. Examples of suitable active substances are, in particular, strobylurea, in particular methyl methoxyimino-α- (o-tolyloxy) -o-tolyl acetate (BAS 490F), as well as metabolites and functional derivatives of these compounds. The coding polypeptide DNA with fungicidal binding properties that is inserted into the expression cassette of the invention can also be used as a selection marker.

Особено при културни растения, настоящето изобретение осигурява предимството, че след индукция на селективна резистентност на културното растение спрямо фунгициди с фитотоксично действие, тези фунгициди могат да се използват вParticularly in crop plants, the present invention provides the advantage that, after induction of selective resistance of the crop to fungicides with phytotoxic action, these fungicides can be used in

904.99-ПБ904.99-PB

тези култури също в по-големи разходни количества за борба с вредни фунги, каквито количества в обикновения случай биха били вредни за растението. Като примери на такива фунгициди с фитотоксично действие могат да бъдат посочени съединения от следните групи, без изобретението да се ограничава до тях:these crops also in greater quantities to combat harmful fungus, which in the ordinary case would be harmful to the plant. Examples of such phytotoxic fungicides include compounds of the following groups, without being limited to the invention:

• сяра, дитиокарбамат и техни производни, като феридиметилдитиокарбамат, цинкдиметилдитиокарбамат, цинкетиленбисдитиокарбамат, манганетиленбисдитиокарбамат, манган-цинкетил ендиамин-бис-дитиокарбамат, тетраметилтиурамдисулфид, амонячен комплекс на цинк-(М.М-етилен-бис-дитиокарбамат), амонячен комплекс на цинкЦМ.ЬГ-пропилен-бис-дитиокарбамат), ци ηκ-(Ν, Ν’-пропил е н-бис-дитиокарбамат), Ν,Ν’-полипропилен-бис(тиокарбамоил)дисулфид, • нитропроизводни, като динитро-(1-метилхептил)фенилкротонат, 2-сек.бутил-4,6-динитрофенил-3,3-диметилакрилат, 2-сек. бутил-4,6-динитрофенил-изопропилкарбонат, 5-нитро-изофталова кисел ина-ди-изопропил естер, • хетероциклени съединения, като 2-хептадецил-2-имидазолинацетат, 2,4-дихлор-6-(о-хлоранилино)-з-триазин, О,О-диетилфталимидофосфонотиоат, 5-амино-1-(бис-(диметиламино)фосфинил]-3-фенил-1,2,4-триазол, 2,3-дициано-1,4-дитиоантрахинон, 2тио-1,3-дитиоло[4,5-Ь]хиноксалин, метилестер на 1-(бутилкарбамоил)-2-бензимидазол-карбаминова киселина, 2-метоксикарбониламино-бензимидазол, 2-(фурил-(2))-бензимидазол, 2-(тиазолил- (4))-бензимидазол, N-(1,1 .г.г.-тетрахлоретилтисЦ-тетрахидрофталимид, N-трихлорометилтио-тетрахидрофталимид, N-трихлорметилтиофталимид,• sulfur, dithiocarbamate and their derivatives, such as feridimethyldithiocarbamate, zincdimethyldithiocarbamate, zincethylenebisdithiocarbamate, manganethylenebisdithiocarbamate, manganese-zincethyl endiamine-bis-dithiocarbamate, tetramethylthiurimdicarbenate, cytomethylthuramdisulphate (cytomethylthuramdisulfide) LH-propylene-bis-dithiocarbamate), ci ηκ- (Ν, Ν'-propyl is n-bis-dithiocarbamate), Ν, Ν'-polypropylene-bis (thiocarbamoyl) disulfide, • nitro derivatives, such as dinitro- (1-methylheptyl) ) phenyl crotonate, 2-sec-butyl-4,6-dinitrophenyl-3,3-dimethylacrylate, 2 sec. butyl-4,6-dinitrophenyl-isopropylcarbonate, 5-nitro-isophthalic acid in-di-isopropyl ester, • heterocyclic compounds, such as 2-heptadecyl-2-imidazoline acetate, 2,4-dichloro-6- (o-chloroanilino) 3-triazine, O, O-diethylphthalimidophosphonothioate, 5-amino-1- (bis- (dimethylamino) phosphinyl] -3-phenyl-1,2,4-triazole, 2,3-dicyano-1,4-dithioanthraquinone, 2thio -1,3-Dithiolo [4,5-b] quinoxaline, 1- (butylcarbamoyl) -2-benzimidazole-carbamic acid methyl ester, 2-methoxycarbonylamino-benzimidazole, 2- (furyl- (2)) -benzimidazole, 2- (thiazolyl- (4)) -benzimidazole, N- (1,1g-tetrachloroethyltis-Tetrahydrophthalic) id, N-trichloromethylthio-tetrahydrophthalimide, N-trihlormetiltioftalimid,

904.99-ПБ ·· ·· ft ·· ·· ·· • ••ft ···· ft··· ··· ··· ···· ·· ·· ·· ·· ··· ··· ··· ft ft ft ft ft • ••ft ·· ft·· ·· ft· ··904.99-PB ·· ·· ft ·· ·· ·· • •• ft ···· ft ··· ··· ··· ··················· · · · Ft ft ft ft ft • •• ft ·· ft ·· ·· ft · ··

• N-дихлорфлуорметилтио-М’,1\Г-диметил-М-фенилсярна киселина-диамид, 5-етокси-3-трихлорметил-1,2,3-тиадиазол, 2-роданметилтиобензтиазол, 1,4-дихлор-2,5-диметоксибензол, 4-(2-хлорфенилхидразоно)-3-метил-5-изоксазолон, лиридин-2-тио-1 -оксид, 8-хидроксихинолин, съотв. негови медни соли, 2,3-дихидро-5карбоксанилидо-6-метил-1,4-оксатиин-4,4-диоксид, 2-метил-5,6дихидро-4Н-пиран-3-карбоксанилид, 2-метилфуран-З-карбоксанилид, 2,5-диметил-фуран-З-карбоксанилид, 2,4,5-триметилфуран-3-карбоксанилид, 2,5-диметилфуран-З-карбоксилна киселина-циклохексиламид, М-циклохексил-М-метокси-2,5-диметилфуран-• N-dichlorofluoromethylthio-N ', 1' N-dimethyl-N-phenylsulfonic acid-diamide, 5-ethoxy-3-trichloromethyl-1,2,3-thiadiazole, 2-rhodanmethylthiobenzthiazole, 1,4-dichloro-2,5 -dimethoxybenzene, 4- (2-chlorophenylhydrazono) -3-methyl-5-isoxazolone, lyridine-2-thio-1-oxide, 8-hydroxyquinoline, resp. its copper salts, 2,3-dihydro-5carboxanilido-6-methyl-1,4-oxathiine-4,4-dioxide, 2-methyl-5,6-dihydro-4H-pyran-3-carboxanilide, 2-methylfuran-3- carboxanilide, 2,5-dimethyl-furan-3-carboxanilide, 2,4,5-trimethylfuran-3-carboxanilide, 2,5-dimethylfuran-3-carboxylic acid-cyclohexylamide, N-cyclohexyl-N-methoxy-2,5 -dimethylfuran-

3-карбоксамид, анилид на 2-метил-бензоена киселина, анилид на3-carboxamide, 2-methyl-benzoic acid anilide, anilide of

2-йод-бензоена киселина, М-формил-М-морфолин-2,2,2-трихлоретилацетал, пиперазин-1,4-диил-бис-1 -(2,2,2-трихлоретил)формамид, 1 -(3,4-дихлоранилино)-1-формил амино-2,2,2трихлоретан, • амино, като 2,6-диметил-М-тридецилморфолин, съотв. негови соли, 2,6-диметил-М-циклододецилморфолин съотв. негови соли, Ν-[3-(ρ-τρθτ. бутил фенил )-2-метил пропил ]-цис-2,6-диметил морфолин, Ν-[3-(ρ-τρβτ. бутилфенил)-2-метилпропил]-пиперидин, (8-(1,1ди мети л етил )-Ν-βτππ-Ν-προπ ил-1,4-диоксаспиро[4.5]декан-2метанамин, • азоли, като 1-(2-(2,4-дихлорфенил)-4-етил-1,3-диоксолан-2ил-етил]-1 Н-1,2,4-триазол, 1-(2-(2,4-дихлорфенил)-4-п-пропил-1,3диоксолан-2-ил-етил]-1 Н-1,2,4-триазол, N-(n-nponnn)-N-(2,4,6трихлорфеноксиетил)-М’-имидазолил-карбамид, 1-(4-хлорфенокси)-3,3-ди метил-1 -(1 Н-1,2,4-триазол-1 -ил)-2-бутанон, 1 -(4-хлорфенокси)-3,3-диметил-1-(1 Н-1,2,4-триазол-1 -ил)-2-бутанол, (2В5,ЗВ5)-1-[3-(2-хлорфенил)-2-(4-флуорфенил)-оксиран-2- ил метил ]-1 Н-1,2,4-триазол, 1-(2-(2,4-дихлорфенил )-пентил]-1 Н*· ·· · ·· ·· ·· ··«· ·· · · · · · · ··· ··· · · · · ·· ·· · · · · ··· ··· ··· · · · · · ···· ·· ·♦· ·· ·· ··2-iodo-benzoic acid, N-formyl-N-morpholine-2,2,2-trichloroethyl acetal, piperazine-1,4-diyl-bis-1- (2,2,2-trichloroethyl) formamide, 1- (3 , 4-dichloroanilino) -1-formyl amino-2,2,2trichloroethane, • amino, such as 2,6-dimethyl-N-tridecylmorpholine, resp. its salts, 2,6-dimethyl-N-cyclododecylmorpholine, resp. salts thereof, N- [3- (ρ-τρθτ. butyl phenyl) -2-methyl propyl] -cis-2,6-dimethyl morpholine, N- [3- (ρ-τρβτ. butylphenyl) -2-methylpropyl] - piperidine, (8- (1,1-methyl methyl) -N-βτππ-Ν-προπ yl-1,4-dioxaspiro [4.5] decane-2-methanamine, • azoles, such as 1- (2- (2,4-dichlorophenyl) ) -4-ethyl-1,3-dioxolan-2-yl-ethyl] -1H-1,2,4-triazole, 1- (2- (2,4-dichlorophenyl) -4-n-propyl-1,3dioxolane -2-yl-ethyl] -1H-1,2,4-triazole, N- (n-propynyl) -N- (2,4,6trichlorophenoxyethyl) -N'-imidazolyl-urea, 1- (4-chlorophenoxy) ) -3,3-dimethyl-1- (1H-1,2,4-triazol-1-yl) -2-butanone, 1- (4-chlorophenoxy) -3,3-dimethyl-1- (1 N-1,2,4-triazol-1-yl) -2-butanol, (2B5, 3B5) -1- [3- (2-chlorophenyl) -2- (4-fluorophenyl) oxy an-2-yl methyl] -1H-1,2,4-triazole, 1- (2- (2,4-dichlorophenyl) -pentyl] -1 H * · · · · · · · · · · · «· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·

904.99-ПБ904.99-PB

1,2,4-триазол, 2,4’-дифлуор-алфа-(1 Н-1,2,4-триазолил-1-метил)бензхидрилалкохол, 1 -((бис-(4-флуорфенил)метилсилил)метил)-1 Н-1,2,4-triazole, 2,4'-difluoro-alpha- (1H-1,2,4-triazolyl-1-methyl) benzhydryl alcohol, 1 - ((bis- (4-fluorophenyl) methylsilyl) methyl) -1 N-

1,2,4-триазол, 1 -[2RS, 4RS; 2RS, 4Нв)-4-бром-2-(2,4-дихлорфенил)тетрахидрофурил]-1 Н-1,2,4-триазол, 2-(4-хлорфенил)-3-циклопропил-1 -(1 Н-1,2,4-триазол-1-ил)бутан-2-ол, ( + )-4-хлор-4-[4метил-2-(1 Н-1,2,4-триазол-1 - ил метил )-1,3-диоксолан-2-ил]-фенил-1,2,4-triazole, 1- [2RS, 4RS; 2RS, 4Hb) -4-bromo-2- (2,4-dichlorophenyl) tetrahydrofuryl] -1H-1,2,4-triazole, 2- (4-chlorophenyl) -3-cyclopropyl-1- (1H- 1,2,4-triazol-1-yl) butan-2-ol, (+) -4-chloro-4- [4methyl-2- (1H-1,2,4-triazol-1-yl methyl) -1,3-dioxolan-2-yl] -phenyl-

4-хлорфенилетер, (E)-(R,S)-1 -(2,4-дихлорофенил)-4,4-диметил-2(1 Н-1,2,4-триазол-1 -ил)лент-1 -ен-3-ол, 4-(4-хлорфенил-2-фенил-2(1 Н-1,2,4-триазол илметил )бутиро нитрил, 3-(2,4-дихлорфенил)-6флуор-2-(1 Н-1,2,4-триазол-1 -ил)хиназолин-4(ЗН)-он, (R,S)-2-(2,4дихлорфенил)-1 Н-1,2,4-триазол-1-ил)хексан-2-ол, (1RS, 5RS; 1RS, 55Р)-5-(4-хлорбензил)-2,2-диметил-1 -(1 Н-1,2,4-триазол-1-илметил )циклопентанол, (R,S)-1 -(4-хлорфенил)-4,4-диметил-3-(1 Н-1,2,4триазол-1 - илметил)пентан-1-ол, (+ )-2-(2,4-дихлорфенил )-3-(1 Н-4-chlorophenylether, (E) - (R, S) -1- (2,4-dichlorophenyl) -4,4-dimethyl-2 (1H-1,2,4-triazol-1-yl) tape-1 -en-3-ol, 4- (4-chlorophenyl-2-phenyl-2 (1H-1,2,4-triazolylmethyl) butyro nitrile, 3- (2,4-dichlorophenyl) -6fluoro-2- ( 1H-1,2,4-triazol-1-yl) quinazolin-4 (3H) -one, (R, S) -2- (2,4dichlorophenyl) -1H-1,2,4-triazol-1 -yl) hexan-2-ol, (1RS, 5RS; 1RS, 55P) -5- (4-chlorobenzyl) -2,2-dimethyl-1- (1H-1,2,4-triazol-1-ylmethyl) ) cyclopentanol, (R, S) -1- (4-chlorophenyl) -4,4-dimethyl-3- (1H-1,2,4triazol-1-ylmethyl) pentan-1-ol, (+) -2 - (2,4-dichlorophenyl) -3- (1H-

1,2,4-триазолил)пропил-1,1,2,2,-тетрафлуоретилетер, (Е)-1-[1-[4хлор-2-трифлуорометил)фенил]-имино)-2-пропоксиетил]-1Нимидазол, 2-(4-хлорфенил)-2-(1 Н-1, 2,4-триазол-1 - илметил )хексаннитрил, а-(2-хлорофенил)-а-(4-хлорфенил)-5-пиримидин-метанол,1,2,4-triazolyl) propyl-1,1,2,2-tetrafluoroethyl ether, (E) -1- [1- [4-chloro-2-trifluoromethyl) phenyl] -imino) -2-propoxyethyl] -1Nimidazole, 2- (4-chlorophenyl) -2- (1H-1,2,4-triazol-1-ylmethyl) hexanenitrile, α- (2-chlorophenyl) -α- (4-chlorophenyl) -5-pyrimidine-methanol,

5-бутил-2-диметиламино-4-хидрокси-б-метилпиримидин, бис-(рхлорфенил)-3-пиридинметанол, 1,2-бис-(3-етоксикарбонил)-2тиоуреидо)бензол, 1,2-бис-(3-метоксикарбонил)-2-тиоуреидо)бензол, • стробилкарбамиди, като метил-Е-метоксиимино-[а-(отолилокси)-о-толил]ацетат, метил-Е-2-{2-[6-(2-цианофенокси)пиримидин-4-илокси]фенил}-3-метоксиакрилат, метил-Е-метоксиимино-[а-(2-феноксифенил)]ацетамид, метил-Е-метоксиимино-[а(2,5-диметилфенокси)-о-толил]ацетамид, ·· ·· ··5-Butyl-2-dimethylamino-4-hydroxy-6-methylpyrimidine, bis- (chlorophenyl) -3-pyridinethanol, 1,2-bis- (3-ethoxycarbonyl) -2-thioureido) benzene, 1,2-bis- (3 -methoxycarbonyl) -2-thioureido) benzene, • strobylureas, such as methyl-E-methoxyimino- [α- (otolyloxy) -o-tolyl] acetate, methyl-E-2- {2- [6- (2-cyanophenoxy) pyrimidin-4-yloxy] phenyl} -3-methoxyacrylate, methyl-E-methoxyimino- [a- (2-phenoxyphenyl)] acetamide, methyl-E-methoxyimino- [a (2,5-dimethylphenoxy) -o-tolyl] acetamide, ·· ·· ··

904.99-ПБ ·· ·♦ • · • ·· • · · ·· • · ♦ ·· ·· ······ е ·· ·· ·* ··904.99-PB ·· · ♦ • · • ·· • · · ·· • · ♦ ·· ·· ······ f ·· ·· · * ··

• анилинопиримидини, като М-(4,6-диметилпиримидин-2-ил)анилин, М-[4-метил-6-(1-пропинил)пиримидин-2-ил]анилин, N-[4метил-6-циклопропил-пиримидин-2-ил]анилин, • фенилпироли, като 4-(2,2-дифлуор-1,3-бензодиоксол-4-ил)пирол-3-карбонитрил, • бета-фенилакриламиди, като 3-(4-хлорфенил)-3-(3,4- ди мето ксифенил)акрил морфол ид, • както и различни фунгициди, като додецилгуанидинацетат,• anilinopyrimidines such as N- (4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) aniline, N- [4-methyl-6- (1-propynyl) pyrimidin-2-yl] aniline, N- [4methyl-6-cyclopropyl- pyrimidin-2-yl] aniline, • phenylpyrroles, such as 4- (2,2-difluoro-1,3-benzodioxol-4-yl) pyrrole-3-carbonitrile, • beta-phenylacrylamides, such as 3- (4-chlorophenyl) -3- (3,4-methoxyphenyl) acrylic morphol id, as well as various fungicides such as dodecylguanidine acetate,

3-(3-(3,5-диметил-2-оксициклохекс ил )-2-хидроксиетил]глутаримид, N-метил-, М-етил-(4-трифлуорметил-2-[3’,4^,-диметоксифенил]бензамид, хексахлоробензол, О1-метил-М-(2,6-диметилфенил)-Мфуроил(2)-аланинат, 01_-М-(2,6-диметилфенил)-М-(2’-метоксиацети л )ал ан и н-метил естер, М-(2,6-диметилфенил)-М-хлорацетил-О,1_-3- (3- (3,5-dimethyl-2-oxycyclohexyl) -2-hydroxyethyl] glutarimide, N-methyl-, N-ethyl- (4-trifluoromethyl-2- [3 ', 4 ^, -dimethoxyphenyl] benzamide , hexachlorobenzene, O1-methyl-N- (2,6-dimethylphenyl) -Mfuroyl (2) -alaninate, N-N- (2,6-dimethylphenyl) -N- (2'-methoxyacetyl) alan and n- methyl ester, N- (2,6-dimethylphenyl) -N-chloroacetyl-O, 1-

2-аминобутиролактон, DL-N-(2,6-диметилфенил)-N-(фенилацетил)аланин метилестер, 5-метил-5-винил-3-(3,5-дихлорфенил)-2,4диоксо-1,3-оксазолидин, 3-[3,5-дихлорофенил (5-метил-5метоксиметил]-1,3-оксазолидин-2,4-дион, 3-(3,5-дихлорфенил)-1 изопропилкарбамоилхидантоин, 1\1-(3,5-дихлорфенил)-1,2-диметилциклопропан-1,2-дикарбоксимид, 2-циано-[М-(етиламинокарбонил)-2-метоксимино]ацетамид, М-(3-хлор-2,6-динитро-4-трифлуормети л фен и л)-5-трифлуорметил-З-хлор-2-ами но пиридин.2-Aminobutyrolactone, DL-N- (2,6-dimethylphenyl) -N- (phenylacetyl) alanine methyl ester, 5-methyl-5-vinyl-3- (3,5-dichlorophenyl) -2,4 dioxo-1,3- oxazolidine, 3- [3,5-dichlorophenyl (5-methyl-5methoxymethyl] -1,3-oxazolidine-2,4-dione, 3- (3,5-dichlorophenyl) -1 isopropylcarbamoylhydantoin, 1 \ 1- (3, 5-dichlorophenyl) -1,2-dimethylcyclopropane-1,2-dicarboximide, 2-cyano- [N- (ethylaminocarbonyl) -2-methoxyimino] acetamide, N- (3-chloro-2,6-dinitro-4-trifluoromethyl) l phenyl and l) -5-trifluoromethyl-3-chloro-2-amino pyridine.

Функционално еквивалентните производни на такива фунгициди притежават сравним спектър на действие срещу фитопатогенни гъбички, както конкретно посочените съединения, при по-ниска, еднаква или по-висока фитотоксична активност.Functionally equivalent derivatives of such fungicides have a comparable spectrum of action against phytopathogenic fungi, as specifically specified compounds, at lower, equal or higher phytotoxic activity.

·* ·· • · · • ·· • · • · · ···· «· • ·· · · · · · · · · · · · · · · · · · ·

904.99-ПБ904.99-PB

Примери за изпълнение на изобретениетоExamples of carrying out the invention

Изобретението се пояснява от следващите примери, без да се ограничава до тях.The invention will be illustrated by the following examples, but not limited to.

Общ метод на клониранеCommon method of cloning

Етапите на клониране, провеждани в рамките на настоящето изобретение, като напр. рестрикционни отцепвания, агарознагел-електрофореза, пречистване на ДНК-фрагменти, трансфер на нуклеинови киселини върху нитроцелулоза и найлонови (полиамидни) мембрани, свързване на ДНК-фрагменти, трансформация на клетки от Е coli, отглеждане на бактерии, размножаване на фаги и секвенц-анализ на рекомбинантна ДНК се провеждат по начина, описан от Sambrook et al., (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6).The cloning steps carried out within the scope of the present invention, e.g. restriction cleavages, agarose gel electrophoresis, DNA fragment purification, nucleic acid transfer to nitrocellulose and nylon (polyamide) membranes, DNA fragment binding, transformation of E coli cells, bacterial cultivation, phage propagation and sequencing recombinant DNAs were performed as described by Sambrook et al., (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6).

Използваните по-долу бактериални щамове (Е. coli, XL-I Blue) се взимат от Stratagene. Използваните за растителна трансформация агробактерийни щамове (Agrobacterium tumefaciens, С58С1 с плазмид pGV2260 или pGV3850kan) са описани от Deblaere et al., (Nucl. Acids Res. 13 (1985), 4777). Алтернативно могат да се използват също агробактериен щам LBA4404 (Clontech) или други подходящи щамове. За клониране се използват векторите pUC19 (Yanish-Perron, Gene 33 (1985), 103-119), pBluescript SK(Stratagene), pGEM-T (Promega), pZerO (Invitrogen), pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acides Res. 12(1984) 8711-8720) и pBinAR (Hoefgen und Willmitzer, Plant Science 66, (1990), 221-230).The bacterial strains (E. coli, XL-I Blue) used below are taken from Stratagene. Agrobacterial strains (Agrobacterium tumefaciens, C58Cl with plasmid pGV2260 or pGV3850kan) used for plant transformation have been described by Deblaere et al., (Nucl. Acids Res. 13 (1985), 4777). Alternatively, the Agrobacterial strain LBA4404 (Clontech) or other suitable strains may also be used. The pUC19 vectors (Yanish-Perron, Gene 33 (1985), 103-119), pBluescript SK (Stratagene), pGEM-T (Promega), pZerO (Invitrogen), pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acides) are used for cloning. Res. 12 (1984) 8711-8720) and pBinAR (Hoefgen und Willmitzer, Plant Science 66, (1990), 221-230).

Секвенционен анализ на рекомбинантна ДНКSequential analysis of recombinant DNA

Секвенирането на рекомбинантна ДНК молекула се провежда с уред за ДНК-секвениране чрез лазерна флуоресценция на • · · · • ·The sequencing of a recombinant DNA molecule is performed with a DNA sequencing device by laser fluorescence at

904.99-ПБ ·· ·· • · · • ·· • · · • · ·· • · · · ··· ···904.99-PB ·· ·· • · · • ·· • · · • · ·· • · · · ··· ···

фирмата Pharmacia, по метода на Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977), 5463-5467).the Pharmacia company, by the method of Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977), 5463-5467).

Получаване на растителна експресионна касетаPreparation of a plant expression cassette

В плазмид pBinl9 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12, 8711 (1984)) се вмества (инсерция) 35S CaMV промотор като EcoRIKpnl-фрагмент (отговарящ на нуклеотиди 6909-7437 на CauliflowerMosaik-Virus (Franck et al. Cell 21 (1980) 285). Полиаденилиращ сигнал на ген 3 на T-DNA на Ti-плазмида pTiACHS (Gielen et al., EMBO J. 3, (1984), 835). Нуклеотидът 11749-11939 се изолира като Pvull-Hindlll-фрагмент и след прибавяне на Sphl-свързваща ДНК се клонира към рестрикционно място Pvull, между SpHI-Hindi 11 рестрикционно място на вектора. При това се получава плазмид pBi-nAR (Hoefgen und Willmitzer, Plant Science 66 (1990), 221-230).In plasmid pBinl9 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12, 8711 (1984)), a 35S CaMV promoter is inserted as an EcoRIKpnl fragment (corresponding to CauliflowerMosaik-Virus nucleotides 6909-7437 (Franck et al. Cell 21 (1980) 285) The polyadenylation signal of the T-DNA T-DNA gene of the Ti-plasmid pTiACHS (Gielen et al., EMBO J. 3, (1984), 835). The nucleotide 11749-11939 was isolated as Pvull-HindIII. fragment and after addition of Sph1-binding DNA was cloned to the restriction site Pvull, between the SpHI-Hindi 11 restriction site of the vector, thus obtaining the plasmid pBi-nAR (Hoefgen und Willmitzer, Plant Science 66 (1990), 221-230) .

Примери за използванеExamples of use

Пример 1Example 1

Тъй като фунгицидите не са имуногенни, те трябва да се свържат с носител, като напр. KLH. Това свързване може да се проведе директно, ако в молекулата има функционална група, иначе по време на синтезата на фунгицида ще трябва да се въведе функционална група или да се намери реактивоспособен предварителен етап по време на синтезата, така че тази молекула да се свърже в един прост реакционен етап. Примери за начини на свързване са описани от Miroslavic Ferencik в Handbook of Immunochemistry'¹, 1993, Chapman & Hall, Kapitel Antigene, стр. 20-49.Because fungicides are not immunogenic, they must bind to a carrier, such as e.g. KLH. This coupling can be carried out directly if there is a functional group in the molecule, otherwise a functional group will need to be introduced during the synthesis of the fungicide or a reactive precursor step must be found during the synthesis so that the molecule binds in one simple reaction step. Examples of binding methods are described by Miroslavic Ferencik in Handbook of Immunochemistry ' ¹ , 1993, Chapman & Hall, Kapitel Antigene, pp. 20-49.

904.99-ПБ • ·904.99-PB • ·

Чрез повтарящо се инжектиране на тази модифицирана носеща молекула (антиген) се имунизират напр. Balb/с-мишки. Тъй като в серума има достатъчно антитела с връзка към антиген, които могат да се докажат по метода ELISA (ensyme linked immuno sorbent assay), то се взимат клетки от далака на тези животни и се сливат с миеломни клетки, за да се култивира хибрид. ELISA се използва по-нататък като антиген фунгицидмодифициран BSA, за да се разграничат насоченият спрямо Hapten имунен отговор от този, насочен спрямо KLH-отговора.By repeated injection of this modified carrier molecule (antigen), they are immunized e.g. Balb / c-mice. Since there are sufficient antibodies to the antigen to be detected in the serum that can be demonstrated by the ELISA (ensyme linked immuno sorbent assay), cells from the spleens of these animals are taken and fused with myeloma cells to cultivate the hybrid. The ELISA is further used as an antigen of fungicidal modified BSA to differentiate the Hapten-directed immune response from that directed by the KLH response.

Получаването на моноклонални антитела се провежда, като се следват познатите методи, напр. описани в Practical Immunology, Leslie Hudson und Frank Hay, Blackwell Scientific Publications, 1989, или в Monoclonal antibodies: Principles and Practice, James Goding, 1983, Academic Press, Inc., или в A practical guide to monoclonal antibodies, J. Liddell und A. Cryer, 1991, John Wiley&Sons; или Achim Moeller und Franz Emling Monoklonale Antikoerper gegen TNF und deren Verwendung. Патентно описание EP-A260610.The production of monoclonal antibodies is carried out by following known methods, e.g. described in Practical Immunology, Leslie Hudson and Frank Hay, Blackwell Scientific Publications, 1989, or in Monoclonal antibodies: Principles and Practice, James Goding, 1983, Academic Press, Inc., or in A practical guide to monoclonal antibodies, J. Liddell und A. Cryer, 1991, John Wiley &Sons; or Achim Moeller and Franz Emling Monoclonal Antikoerper gegen TNF und Verwendung. Patent Description EP-A260610.

Пример 2Example 2

Изходна точка на изследването е моноклонално антитяло, което различава специфично фунгицида BAS 490F и което освен това показва висок свързващ афинитет. Селекционираните хибридомни клетъчни линии се характеризират с това, че секретираните насочени срещу фунгицидния антиген BAS 490F моноклонални антитела проявяват висок афинитет и са на разположение специфичните секвенции на имуноглобулин (Berek,The starting point of the study is a monoclonal antibody that specifically differentiates the BAS 490F fungicide and which also exhibits high binding affinity. Selected hybridoma cell lines are characterized by the fact that secreted anti-fungicidal antigen BAS 490F monoclonal antibodies exhibit high affinity and specific immunoglobulin sequences are available (Berek,

С. et al., Nature 316, 412-418 (1985)). Това моноклонално антитяло • · • · • ·C. et al., Nature 316, 412-418 (1985). This monoclonal antibody

904.99-ПБ904.99-PB

срещу BAS 490F е изходна точка за конструкция на едноверижен антитяло фрагмент (scFv-anti BAS 490F).against BAS 490F is the starting point for the construction of a single-stranded antibody fragment (scFv-anti BAS 490F).

Най-напред се изолира mRNA от хибридомни клетки и се вписва в кДНК. Тази кДНК служат като матрици за амплификация на вариращи имуноглобулини VH и VK със специфични Primern VH1 BACK и VH FOR-2 за тежки вериги, както и VK2 BACK и MJK5 FON X за леки вериги (Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)). Изолираните вариращи имуноглуболини са изходна точка за констрикция на едноверижно-антитяло фрагмент (scFv-anti BAS 490F). При следващата фузия по метода PCR три компонента VH, VK и свързващ фрагмент се обединяват в една PCR-реакционна вставка и scFv-anti BAS 490F се амплифицира (фиг. 3).First, the mRNA was isolated from hybridoma cells and inserted into the cDNA. These cDNAs serve as amplifiers of the VH and VK variable immunoglobulins with specific Primern VH1 BACK and VH FOR-2 specific for heavy chains, as well as VK2 BACK and MJK5 FON X for light chains (Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991). Isolated variable immunoglobulins are the starting point for single-stranded antibody fragment constriction (scFv-anti BAS 490F). In the next PCR fusion, the three components VH, VK and the binding fragment were combined into a single PCR reaction insert and the scFv-anti BAS 490F amplified (Fig. 3).

Функционалната характеристика (антигенсвързваща активност) на конструирания scFv-anti BAS 490F-reH се извършва чрез експресия на бактериална система. При това се синтезира scFv-anti BAS 490F по метода на Hoogenboom, H.R. et al., Nucleic Acids Research, 19, 4133-4137 (1991) като разтворим фрагмент отThe functional characteristic (antigen-binding activity) of engineered scFv-anti BAS 490F-reH is accomplished by expression of a bacterial system. The scFv-anti BAS 490F was then synthesized by the method of Hoogenboom, H.R. et al., Nucleic Acids Research, 19, 4133-4137 (1991) as a soluble fragment of

антитяло в Е. coli. Активността и специфичността на конструирания фрагмент от антитяло се определя чрез теста ELISA (фиг.4).antibody in E. coli. The activity and specificity of the engineered antibody fragment was determined by the ELISA test (Figure 4).

За да стане възможно провеждане на семе-специфична експресия на фрагмент от антитяло в тютюн се клонира scFv-anti BAS 490F-reH по посока надолу от LeB4-npoMOTopa. Изолираният от Vicia faba 1еВ4-промотор проявява силна семе-специфична експресия на различни чужди гени в тютюн (Baeumlein, Н. et. al.,In order to allow for seed-specific expression of an antibody fragment in tobacco, scFv-anti BAS 490F-reH is cloned downstream of LeB4-npoMOTopa. The Vicia faba 1eB4 promoter isolated exhibits strong seed-specific expression of various foreign genes in tobacco (Baeumlein, H. et al.,

Mol. Gen. Genet., 225, 121-128 (1991)). Чрез транспорт на scFv-anti сигнал-пептидна секвенция, която осигурява входа в ендоплазBAS 490F полипептида в ендоплазматичния ретикулум се постига стабилно натрупване на високи количества от фрагменти от антитяло. Генът scFv-anti BAS 490F се слива за тази цел съсMol. Gen. Genet., 225, 121-128 (1991). By transporting the scFv-anti signal-peptide sequence that secures entry into the endoplasmBAS 490F polypeptide into the endoplasmic reticulum, a steady accumulation of high amounts of antibody fragments is achieved. The scFv-anti BAS 490F gene fuses for this purpose with

904.99-ПБ • ·904.99-PB • ·

матичния ретикулум и на ER-задържащия сигнал SEKDEL, който осигурява задържане в ER (Wandelt et al., 1992), (Фиг. 5).the reticulum and the ER retention signal SEKDEL, which provides retention in the ER (Wandelt et al., 1992), (Fig. 5).

Конструираната експресионна касета се клонира в бинерния вектор pGSGLUC 1 (Saito et al., 1990) и се пренася чрез електропорообразуване в Agrobakterium-Stamm ЕНА 101. Рекомбинантният агробактериен клон се използва за следващата трансформация на Nicotiana tabacum. За конструкт се регенерират 70-140 тютюневи растения. От регенерираните трансгенни тютюневи растения се събират семена в различни стадии на развитие при оплождане по естествен начин. От тези семена се получават разтворими протеини след екстракция във водна буферна система. Анализът на трансгенни растения показва, че чрез сливане на scFv-anti BAS 490F ген с ДНК-секвенция на ERзадържащия сигнал SEKDEL може да се получи максимално натрупване от 1.9 % scFv-anti BAS 490F протеин в узрели семена.The engineered expression cassette was cloned into the bG vector pGSGLUC 1 (Saito et al., 1990) and transferred by electroporation into Agrobakterium-Stamm EPA 101. The recombinant Agrobacterium clone was used for the subsequent transformation of Nicotiana tabacum. 70-140 tobacco plants are regenerated for the construct. From the recovered transgenic tobacco plants, seeds are collected at different stages of development in natural fertilization. From these seeds soluble proteins are obtained after extraction in an aqueous buffer system. Analysis of transgenic plants showed that by fusing the scFv-anti BAS 490F gene with the DNA sequence of the ER retention signal SEKDEL, a maximum accumulation of 1.9% scFv-anti BAS 490F protein could be obtained in mature seeds.

Конструираният scFv-anti BAS 490F ген има големина от около 735 Ьр. Вариращите домени са слети един с друг в последователност VH-L-VL.The engineered scFv-anti BAS 490F gene has a size of about 735 bp. The variable domains are fused to one another in sequence VH-L-VL.

Специфичната селективност се определя в екстракти на узрели семена от тютюн чрез директен тест ELISA. Получените при това стойности показват ясно, че протеиновите екстракти съдържат функционалноактивни фрагменти от антитела.Specific selectivity is determined in ripe tobacco seed extracts by direct ELISA. The values obtained here indicate that the protein extracts contain functionally active antibody fragments.

Пример 3Example 3

Специфична за семена експресия и обогатяване на едноверижни фрагменти от антитяло в ендоплазматичен ретикулум от клетки на трансгенни тютюневи семена, контролирана от USPпромоторSeed-specific expression and enrichment of single-stranded antibody fragments in the endoplasmic reticulum of transgenic tobacco seed cells controlled by the USP promoter

904.99-ПБ904.99-PB

• · · • ·• · · • ·

Изходната точка на изследването е едноверижен фрагмент от антитяло срещу фунгицида BAS 490F (scFv-anti BAS 490F). Функционалното характеризиране (активност на свързването на антиген) на този конструиран scFv-anti BAS 490F-reH се провежда след експресия в бактериална система и след експресия в листаThe starting point of the study is a single-stranded antibody fragment against the fungicide BAS 490F (scFv-anti BAS 490F). Functional characterization (antigen binding activity) of this engineered scFv-anti BAS 490F-reH is performed after expression in a bacterial system and after expression in the leaf

от тютюн. Активността и специфичността на конструираните фрагменти от антитяло се определят чрез тест ELISA.from tobacco. The activity and specificity of engineered antibody fragments were determined by ELISA.

За да се осъществи специфична спрямо семена експресия на фрагменти от антитела в тютюн се клонира scFv-anti BAS 490F-reH по направление надолу от USP-промотор. Изолираният от Vicia faba USP-промотор проявява силна специфична спрямо семена експресия на различни чужди гени в тютюн (Fiedler, Н. et al., Plant Mol. Biol. 22, 669-679 (1993)). Чрез пренос на scFv-anti BAS 490F полипептида в ендоплазматичния ретикулум се постига стабилно натрупване на високи количества от фрагменти от антитяло. Генът scFv-anti BAS 490F се слива за тази цел със сигнал-пептидна секвенция, която осигурява входа в ендоплазматичния ретикулум и на ER-задържащия сигнал SEKDEL, който осигурява задържане в ER (Wandelt et al., 1992), (Фиг. 1).To effect seed-specific expression of antibody fragments in tobacco, the scFv-anti BAS 490F-reH is cloned downstream of the USP promoter. The Vicia faba isolate from the USP promoter exhibits strong seed-specific expression of various foreign genes in tobacco (Fiedler, H. et al., Plant Mol. Biol. 22, 669-679 (1993)). By transferring the scFv-anti BAS 490F polypeptide into the endoplasmic reticulum, a steady accumulation of high amounts of antibody fragments is achieved. The scFv-anti BAS 490F gene fuses for this purpose with a signal-peptide sequence that provides input to the endoplasmic reticulum and an ER-retaining signal SEKDEL that provides retention in the ER (Wandelt et al., 1992), (Fig. 1). .

Конструираната експресионна касета се клонира в бинерния вектор pGSGLUC 1 (Saito et al., 1990) и се пренася чрез електропорообразуване в Agrobakterium-Stamm ЕНА 101. Рекомбинантният агробактериен клон се използва за следващата трансформация на Nicotiana tabacum. От регенерираните трансгенни тютюневи растения се събират семена в различни стадии на развитие при оплождане по естествен начин. От тези семена се получават разтворими протеини след екстракция във водна буферна система. Анализът на трансгенни растения показва, че чрез сливане на scFv-anti BAS 490Б-ген с ДНК-секвенция на ER-The engineered expression cassette was cloned into the bG vector pGSGLUC 1 (Saito et al., 1990) and transferred by electroporation into Agrobakterium-Stamm EPA 101. The recombinant Agrobacterium clone was used for the subsequent transformation of Nicotiana tabacum. From the recovered transgenic tobacco plants, seeds are collected at different stages of development in natural fertilization. From these seeds soluble proteins are obtained after extraction in an aqueous buffer system. The analysis of transgenic plants shows that by fusing the scFv-anti BAS 490B gene with the DNA sequence of ER-

904.99-ПБ • · · · · · · • · · · · ·· · • · · · · · · • · ·· «·· · · · • · · * · • · · · · «· ·· задържащия сигнал SEKDEL под контрола на USP-промотор вече след ден 10 на развитие на семената се синтезират едноверижни фрагменти, със свързващ афинитет спрямо BAS 490F.904.99-PB • · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · The Holder the SEKDEL signal under control of the USP promoter, after day 10 of seed development, single stranded fragments are synthesized, with binding affinity to BAS 490F.

Пример 4Example 4

За получаване на юбиквитерна експресия на фрагменти от антитела в растения, специално в листа се клонира scFv-anti-BAS 490F-reH по направление надолу от CaMV 35 S-промотор. Този силно конституивен промотор предизвиква експесия на чужди гени почти във всички растителни тъкани (Benfey und Chua, Science 250, (1990), 956-966). Чрез пренос на scFv-anti BAS 490F протеина в ендоплазматичния ретикулум се постига стабилно натрупване на високи количества от фрагменти от антитяло в листния материал. Генът scFv-anti BAS 490F се слива за тази целIn order to obtain Jubicterin expression of antibody fragments in plants, the scFv-anti-BAS 490F-reH downstream of the CaMV 35 S promoter is cloned specifically into the leaf. This highly constitutive promoter induces the expression of foreign genes in almost all plant tissues (Benfey und Chua, Science 250, (1990), 956-966). By transferring the scFv-anti BAS 490F protein into the endoplasmic reticulum, a steady accumulation of high amounts of antibody fragments in the leaf material is achieved. The scFv-anti BAS 490F gene is fused for this purpose

със сигнал-пептидна секвенция, която осигурява входа в ендоплазматичния ретикулум и на ER-задържащия сигнал KDEL, който осигурява задържане в ER (Wandelt et al., Plant J. 2 (1992), 181-192). Конструираната експресионна касета се клонира в бинерния вектор pGSGLUC 1 (Saito et al., Plant Cell Rep. 8 (1990), 718-721) и се пренася чрез електропорообразуване в Agrobakterium-Stamm EHA 101. Рекомбинантният агробактериен клон се използва за следващата трансформация на Nicotians tabacum. Регенерират се около 100 тютюневи растения. От регенерираните трансгенни тютюневи растения се събира растителен материал. От този растителен материал се получават разтворими протеини след екстракция във водна буферна система. Следващите анализи (Western-Blot-анализи и тестове ELISA) показват, че в листата може да се получи максимално натрупване от 2 % биологично активен антиген-свързващ scFv-anti BAS 490F протеин. Високите • · • ·with a signal-peptide sequence that provides entry into the endoplasmic reticulum and an ER-retaining signal KDEL that provides retention in the ER (Wandelt et al., Plant J. 2 (1992), 181-192). The engineered expression cassette is cloned into the bG vector pGSGLUC 1 (Saito et al., Plant Cell Rep. 8 (1990), 718-721) and transferred by electroporation into Agrobacterium-Stamm EHA 101. The recombinant agrobacterial clone is used for the subsequent transformation of Nicotians tabacum. About 100 tobacco plants are regenerated. Vegetable material is recovered from the recovered transgenic tobacco plants. This vegetable material produces soluble proteins after extraction in an aqueous buffer system. The following assays (Western-Blot assays and ELISA tests) indicate that a maximum accumulation of 2% biologically active antigen-binding scFv-anti BAS 490F protein can be obtained in the leaves. High • · • ·

904.99-ПБ904.99-PB

• · · • · · · · · • · стойности на експресия се развиват в развити зелени листа, но също така в чувствителен листен материал може да се докаже наличие на фрагменти от антитела.Expression values develop in mature green leaves, but antibody fragments can also be demonstrated in sensitive leaf material.

Пример 5Example 5

PCR-приложение на фрагмент от кДНК, кодираща едноверижно антитяло срещу BAS 490F, с помощта на синтенични олигонуклеидиPCR application of a cDNA fragment encoding a single stranded antibody against BAS 490F using syntenic oligonucleides

PCR-приложението на едноверижно антитяло кДНК се провежда в апарат DNA-Thermal Cycler на фирмата Perkin Elmer. Реакционната смес, съдържаща 8 ng/μΙ едноверижна матричнакДНК, 0.5 μΜ от съответните олигонуклеиди, 200 μΜ нуклеотиди (Pharmacia), 50 mM KCI, 10 тМ Tris-HCI (pH 8.3 при 25°С, 1.5 тМ MgCl2) и 0.02 U/μΙ Taq полимераза (Perkin Elmer). Условията за приложение са следните:The PCR application of a single-stranded cDNA antibody was performed on a Perkin Elmer DNA-Thermal Cycler apparatus. The reaction mixture containing 8 ng / μΙ single stranded cDNA, 0.5 μΜ of the corresponding oligonucleides, 200 μΜ nucleotides (Pharmacia), 50 mM KCI, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25 ° C, 1.5 mM MgCl2) and 0.02 U / μΙ Taq polymerase (Perkin Elmer). The conditions of application are as follows:

Температура на съхранение Storage temperature 45°С 45 ° C Температура за денатуриране Denaturing temperature 94°С 94 ° C Температура за елонгация Elongation temperature 72°С 72 ° C Брой на циклите: Number of cycles: 40 40

В резултат се получава фрагмент с около 735 основни двойки, който се лигира във вектор pBluescript. С лигирането се трансформира Е. coli XL-I Blue и протича амплификация на плазмида. За приложение и оптимизиране на полимеразната верижна реакция виж: Innes et al., 1990, PCR Protocols, a Guide to Metods and Aplications, Academic Press.The result is a fragment of about 735 base pairs that is ligated into the pBluescript vector. Ligation transforms E. coli XL-I Blue and amplification of the plasmid takes place. For application and optimization of the polymerase chain reaction, see: Innes et al., 1990, PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications, Academic Press.

Пример 6Example 6

Получаване на трансгенни тютюневи растения, които експесират кДНК, кодираща едноверижно антитяло с фунгицидсвързващи свойстваPreparation of transgenic tobacco plants that express cDNA encoding a single-stranded antibody with fungicidal binding properties

904.99-ПБ904.99-PB

Плазмидът pGSGLUC 1 се трансформира в Agrobacterium tumefaciens С58С1 :pGV2260. За трансформация на тютюневи растения (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN) се използва 1:50 разреждане на култура, престояла една нощ от положително трансформирана колония на агробактерии в среда MurashigeSkoog Medium (Physiol. Plant. 15 (1962), 473 и следващи) c 2 % захароза (2Мв-среда). Листни отрези от стерилни растения (всяко едно около 1 cm²) се инкубират в продължение на 5 до 10 минути в съдче на Петри, при разреждане на агробактериите 1:50. Следва инкубиране в продължение на 2 дни на тъмно при 25°С върху 2MSсреда с 0.8 Bacto-Agar. Култивирането се провежда по-нататък след 2 дни в продължение на 16 часа на светлина и 8 часа на тъмно и след това се продължава в седмичен ритъм върху MSсреда с 500 mg/l Claforan (Cefotaxame-Natrium), 50 mg/l канамицин, 1 mg/l бензиламинопурин (ВАР), 0.2 mg/l нафтилоцетна киселина и 1.6 g/l глюкоза. Растящите филизи се прехвърлят в MSсреда с 2 % захароза, 250 mg/l Claforan и 0.8 % Bacto-Agar.Plasmid pGSGLUC 1 was transformed into Agrobacterium tumefaciens C58Cl: pGV2260. For the transformation of tobacco plants (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN), a 1:50 dilution of a culture overnight of a positively transformed colony of Agrobacteria in MurashigeSkoog Medium medium (Physiol. Plant. 15 (1962), 473 et seq.) Was used 2% sucrose (2MB medium). Leaf sections of sterile plants (each about 1 cm ^{2 each} ) are incubated for 5 to 10 minutes in a Petri dish, at a 1:50 dilution of Agrobacteria. This was followed by incubation for 2 days in the dark at 25 ° C on 2MS medium with 0.8 Bacto-Agar. Cultivation was carried out further after 2 days for 16 hours in the light and 8 hours in the dark and then continued at weekly rhythm on MS with 500 mg / l Claforan (Cefotaxame-Natrium), 50 mg / l kanamycin, 1 mg / l benzylaminopurine (BAP), 0.2 mg / l naphthylacetic acid and 1.6 g / l glucose. Growing shoots were transferred to MS with 2% sucrose, 250 mg / l Claforan and 0.8% Bacto-Agar.

Пример 7Example 7

Стабилно натрупване на едноверижни фрагменти от антитяло срещу фунгицида BAS 490F в ендоплазматичен ретикулумStable accumulation of single-stranded antibody fragments against the fungicide BAS 490F in the endoplasmic reticulum

Изходна точка на изследването е експресиран в тютюневи растения едноверижен фрагмент от антитяло срещу фунгицида BAS 490F (scFv-anti BAS 490F). Количеството и активността на синтезираните scFv-anti BAS 490Р-полипептиди се определят чрез Western-Blot-анализи и тестове ELISA.The starting point of the study was a single-stranded fragment of an antibody against the fungicide BAS 490F (scFv-anti BAS 490F) expressed in tobacco plants. The amount and activity of the synthesized scFv-anti BAS 490P-polypeptides were determined by Western blot analysis and ELISA assays.

За да се даде възможнаст за експресия на scFv-anti BAS 490F ген в ендоплазматичен ретикулум се експресират чужди гени под контрола на CaMV 35 S-промотор, като транслационно сливане сTo enable expression of the scFv-anti BAS 490F gene in the endoplasmic reticulum, foreign genes are expressed under the control of the CaMV 35 S promoter, such as translational fusion with

904.99-ПБ ft · · · · · · · · · • 9 9 · 9 9 9 9 9 9 99904.99-PB ft · · · · · · · · · • 9 9 · 9 9 9 9 9 9 99

99 9 9 9 9 9 9999 9 9 9 9 9 99

9 9 9 9 9 9 9 999 9999 9 9 9 9 9 9 999 999

9 9 9 9 9 99 •••’35 .........9 9 9 9 9 99 ••• '35 ..........

1_еВ4-сигнален пептид (N-края) и ER-задържащ сигнал KDEL (Скрая). Чрез транспорт на scFv-anti BAS 490Е-полипептида в ендоплазматичния ретикулум се постига стабилно натрупване на високи количества фрагменти от антитяло в листата. След отстраняване на растителния материал, късовете се замразяват при -20° С (1), лиофилизират (2) или се сушат при стайна температура (3). Разтворимите протеини се получават от съответния листен материал чрез екстракция с воден буфер и scFv-anti BAS 490Fполипептидът се пречисва чрез афинитетна хроматография. Еднакви количества от пречистените scFv-anti BAS 490Fполипептиди (след замръзяване, лиофилизиране и сушене) се използват за определяне на активността на фрагментите от антитяло (Фиг. 6). На фиг. 6А е показана активността за свързване на антиген на пречистени scFv-anti BAS 490Fполипептиди от свежи (1), лиофилизирани (2) и изсушени (3) листа. На Фиг. 6А са дадени съответните количества scFv-anti BAS 490Р-протеин (около 100 ng), определени чрез тестове ELISA и Western-Blot-анализи. Величините на стандартите за протеинмолекулно тегло са представени в ляво. При това се установява почти еднаква антиген-свързваща активност.1_eB4-signal peptide (N-terminus) and ER-retention signal KDEL (End). By transporting the scFv-anti BAS 490E polypeptide into the endoplasmic reticulum, a steady accumulation of high amounts of antibody fragments in the leaves is achieved. After removal of the plant material, the pieces were frozen at -20 ° C (1), lyophilized (2) or dried at room temperature (3). Soluble proteins are obtained from the corresponding leaf material by extraction with aqueous buffer and the scFv-anti BAS 490F polypeptide is purified by affinity chromatography. Equal amounts of purified scFv-anti BAS 490F polypeptides (after freezing, lyophilization and drying) were used to determine the activity of antibody fragments (Fig. 6). In FIG. 6A shows antigen binding activity of purified scFv-anti BAS 490F polypeptides of fresh (1), lyophilized (2) and dried (3) leaves. In FIG. 6A shows the corresponding amounts of scFv-anti BAS 490P protein (about 100 ng) determined by ELISA and Western Blot assays. Protein molecular weight standards are shown on the left. This results in almost identical antigen-binding activity.

Пример 8Example 8

За доказване на поносимостта спрямо фунгициди на трансгенни тютюневи растения, продуциращи полипептид с фунгицидсвързващи свойства, те се обработват с различни количества от фунгицида BAS 490F. Във всички случаи е доказано във вегетационна къща, че scFv-anti BAS 490F експресиращите растения проявяват поносимост срещу фунгицида BAS 490F в сравнение с контролите.To demonstrate the tolerance to fungicides of transgenic tobacco plants producing a polypeptide having fungicidal binding properties, they are treated with different amounts of the BAS 490F fungicide. In all cases it has been demonstrated in the growing house that scFv-anti BAS 490F expressing plants exhibit tolerance to the BAS 490F fungicide compared to controls.

Claims (28)

1. Метод за получаване на растения, проявяващи поносимост спрямо фунгицид, чрез експресия в растенията на екзогенен фунгицид-свързващ полипептид.A method for the preparation of fungicide-tolerant plants by expression in plants of an exogenous fungicide-binding polypeptide. 2. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че екзогенният фунгицид-свързващ полипептид е фрагмент от едноверижно антитяло.The method of claim 1, wherein the exogenous fungicide-binding polypeptide is a single-stranded antibody fragment. 3. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че екзогенният фунгицид-свързващ полипептид е цяло антитяло или фрагмент от антитяло.A method according to claim 1, characterized in that the exogenous fungicide-binding polypeptide is a whole antibody or antibody fragment. 4. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че фунгицидът е метил метоксиимино-а-(о-толилокси)-о-толилацетат (BAS 490F).A method according to claim 1, wherein the fungicide is methyl methoxyimino-α- (o-tolyloxy) -o-tolyl acetate (BAS 490F). 5. Метод съгласно претенции 1 до 3, характеризиращ се с това, че растението е едносемеделно или двусемеделно.A method according to claims 1 to 3, characterized in that the plant is monoecious or bi-weekly. 6. Метод съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че растението е тютюн.6. The method of claim 5, wherein the plant is tobacco. 7. Метод съгласно претенции 1-6, характеризиращ се с това, че експресията на екзогенен полипептид се провежда конститутивно в растението.The method of claims 1-6, characterized in that the expression of an exogenous polypeptide is constitutively carried out in the plant. 8. Метод съгласно претенции 1-6, характеризиращ се с това, че експресията на екзогенен полипептид се индуцира в растението.The method of claims 1-6, wherein the expression of an exogenous polypeptide is induced in the plant. 9. Метод съгласно претенции 1-6, характеризиращ се с това, че експресията на екзогенен полипептид се провежда в листата на растението.A method according to claims 1-6, characterized in that the expression of an exogenous polypeptide is carried out in the leaves of the plant. • · • ·• · · · 904.99-ПБ904.99-PB 10. Метод съгласно претенции 1-6, характеризиращ се с това, че експресията на екзогенен полипептид се провежда в семената на растението.A method according to claims 1-6, characterized in that the expression of an exogenous polypeptide is carried out in the seeds of the plant. 11. Експресионна касета за растения, характеризираща се с това, че се състои от промотор, сигнален пептид, ген, кодиращ експресия на екзогенен фунгицид-свързващ полипептид, ERзадържащ сигнал и терминатор.An expression plant cassette comprising a promoter, a signal peptide, a gene encoding the expression of an exogenous fungicide-binding polypeptide, an ER retention signal and a terminator. 12. Експресионна касета съгласно претенция 11 . характеризираща се с това, че като конститутивен промотор се използва CaMV 35S-npoMOTop.An expression cassette according to claim 11. characterized in that CaMV 35S-npoMOTop is used as a constitutive promoter. 13. Експресионна касета съгласно претенция 11, характеризираща се с това, че като ген за експресия се въвежда едноверижен фрагмент от антитяло.An expression cassette according to claim 11, characterized in that a single-stranded antibody fragment is introduced as the expression gene. 14. Експресионна касета съгласно претенция 11, характеризираща се с това, че като ген за експресия се въвежда фунгицидсвързващ полипептид за транслационно сливане с други функционални протеини, напр. ензими, токсини, хромофори и свързани протеини.An expression cassette according to claim 11, characterized in that a fungicidal binding polypeptide for translation fusion with other functional proteins is introduced as the expression gene. enzymes, toxins, chromophores and related proteins. 15. Експресионна касета съгласно претенция 11, характеризираща се с това, че полипептидите за експресиране се получават от хибридомни клетки или с помощта на други рекомбинантни методи - като напр. по метода антитяло-Phage-Display.An expression cassette according to claim 11, characterized in that the polypeptides for expression are obtained from hybridoma cells or by other recombinant methods, such as e.g. by antibody-Phage-Display method. 16. Използване на експесионна касета съгласно претенция 11 за трансформация на едносемеделни и двусемеделни растения, които експресират конститутивно семе- или лист-специфично екзогенен фунгицид-свързващ полипептид.Use of an expression cassette according to claim 11 for the transformation of monocotyledonous and dicotyledonous plants that express a constitutively seed- or leaf-specific exogenous fungicide-binding polypeptide. 17. Използване съгласно претенция 16, характеризиращо се с това, че експесионната касета трансферира бактериен щам и създаденият рекомбинантен клон се използва за трансформацияUse according to claim 16, characterized in that the expression cassette transfers the bacterial strain and the recombinant clone generated is used for transformation 904.99-ПБ904.99-PB .... ₃ на едносемеделни и двусемеделни растения, които експресират конститутивно семе- или лист-специфично екзогенен фунгицидсвързващ полипептид..... ₃ of monocotyledonous and dicotyledonous plants that express a constitutively seed- or leaf-specific exogenous fungicide binding polypeptide. 18. Използване на експресионна касета съгласно претенция 11 като селекционен маркер.Use of an expression cassette according to claim 11 as a selection marker. 19. Използване на растение, което съдържа експресионна касета съгласно претенции 17 или 18, за получаване на фунгицидсвързващ полипептид.Use of a plant comprising an expression cassette according to claims 17 or 18 for the preparation of a fungicidal binding polypeptide. 20. Метод за трансформация на растение, чрез въвеждане на секвенция, която кодира фунгицид-свързващ полипептид в растителна клетка, в калусна тъкан, в цяло растение и в протопласти на растителни клетки.20. A method of transforming a plant by introducing a sequence that encodes a fungicide-binding polypeptide in a plant cell, in callus tissue, in the whole plant, and in plant cell protoplasts. 21. Метод съгласно претенция 20, характеризиращ се с това, че трансформацията се провежда с помощта на агробактерия, поспециално от вида Agrobacterium tumefaciens.21. The method of claim 20, wherein the transformation is carried out using an Agrobacterium, especially of the species Agrobacterium tumefaciens. 22. Метод съгласно претенция 20, характеризиращ се с това, че трансформацията се провежда чрез електропорообразуване.A method according to claim 20, characterized in that the transformation is carried out by electrodeposition. 23. Метод съгласно претенция 20, характеризиращ се с това, че трансформацията се провежда с помощта на метода на бомбандиране с частици.A method according to claim 20, characterized in that the transformation is carried out using the particle bombardment method. 24. Метод за получаване на фунгицид-свързващ полипептид чрез експресия на ген, кодиращ такъв полипептид в растение, съответно в клетки на растение и следващо изолиране на полипептида.24. A method of producing a fungicide-binding polypeptide by expressing a gene encoding such a polypeptide in a plant, respectively, in plant cells and subsequent isolation of the polypeptide. 25. Растение, съдържащо експресионна касета съгласно претенция 11, характеризиращо се с това, че експресионната касета осигурява поносимост на растението спрямо фунгицид.A plant comprising an expression cassette according to claim 11, characterized in that the expression cassette provides tolerance of the plant to the fungicide. • « • * • 9• «• * • 9 904.99-ПБ • · • · ·904.99-PB • · • · · 26. Растение съгласно претенция 25, характеризиращо се с това, че проявява поносимост спрямо фунгицида метил метоксиимино-а-(о-толилокси)-о-толилацетат (BAS 490F).A plant according to claim 25, characterized in that it is tolerant to the fungicide methyl methoxyimino-α- (o-tolyloxy) -o-tolyl acetate (BAS 490F). 27. Метод за борба с нежелана растителност в трансгенни, фунгицид-резистетни културни растения, характеризиращ се с това, че се въвеждат фунгициди, срещу които културното растение изгражда фунгицид-свързващи полипептиди или антитела.27. A method of combating unwanted vegetation in transgenic, fungicide-resistant crop plants, characterized in that fungicides are introduced against which the crop produces fungicide-binding polypeptides or antibodies. 28. фунгицид-свързващи полипептиди или антитела, с повишен афинитет за свързване на метил метоксиимино-а-(о-толилокси)-отолилацетат (BAS 490F), характеризиращи се с това, че са получени съгласно претенция 24.28. Fungicidal binding polypeptides or antibodies with increased affinity for binding to methyl methoxyimino-α- (o-tolyloxy) -otolyl acetate (BAS 490F), characterized in that they are obtained according to claim 24.