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BREVET D'INVENTION Au nom de : NOVO INDUSTRI A/S Titre : PROCEDE DE PRODUCTION D'UNE PREPARATION D'ENZYME
IMMOBILISEE AU MOYEN D'UN AGENT DE RETICULATION,
PREPARATION D'ENZYME IMMOBILISEE AINSI OBTENUE
ET UTILISATION DE CELLE-CI.
Priorité : demande de brevet déposée au Danemark le
6 octobre 1982 sous le nO 4431/82.
Inventeurs : Shmuel Amotz.
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PROCEDE DE PRODUCTION D'UNE PREPARATION D'ENZYME
IMMOBILISEE AU MOYEN D'UN AGENT DE RETICULATION,
PREPARATION D'ENZYME IMMOBILISEE AINSI OBTENUE ET
UTILISATION DE CELLE-CI.
La présente invention concerne un procédé de production d'une préparation d'enzyme immobilisée au moyen d'un agent de réticulation, la préparation ainsi obtenue ainsi que son application à la conversion enzymatique en colonne.
Les enzymes immobilisées au moyen d'un agent de réticulation comptent parmi les formes les plus répandues d'enzymes immobilisées. En vue de produire. de telles enzymes immobilisées on a développé bon nombre de procédés.
Dans l'un de ces procédés on active en premier lieu un support au moyen de l'agent de réticulation et on traite ensuite avec l'enzyme qui se fixe fermement au support.
Une telle activation peut comporter une imprégnation du support avec une polyamine et un traitement ultérieur avec un excès de qlutaraldéhyde, comme décrit dans le brevet des Etats-Unis n 4.292. 199 ou dans"Biotechnology and Bioengineering", 22, pages 271 à 287,1980. Une autre activation de ce type peut comprendre un revêtement du support avec un polymère insoluble favorisant l'adsorption, l'adsorption ultérieure de l'enzyme sur le polymère et ensuite l'immobilisation au moyen d'un agent de réticulation in situ, tel que décrit dans le brevet des
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Etats-Unis n 3. 705. 084. Une autre activation de ce type est décrit dans le brevet des Etat-Unis n 4. 069. 106 : on active un support contenant de la kératine par réduction de la kératine et par réticulation de l'enzyme sur le support via des groupes S-S.
Une autre activation de ce type est décrite dans le brevet des EtatsUnis n 3.802. 909 : on broyé du verre en présence d'une protéine en fournissant ainsi des sites actifs fraîchement produits pour lier la protéine. Une autre activation de ce type est décrite dans le brevet des Etats-Unis No 3.519. 538 : on traite du verre avec une série de substances chimiques en vue de fournir les sites activés dési-
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rés. Un autre procédé de production d'une enzyme immobilisée est décrite dans"Biochemical and Biophysical Research Communications", Volume 36, pages 235 à 242,1969 : l'enzyme est adsorbée sur de la silice colloïdale, sans activation préalable, et ensuite fixée par réticulation au moyen de qlutaraldéhyde.
Tous les procédés mentionnés ci-dessus sont caractérisés par une couche mince de molécules d'enzyme qui sont directement attachées aux sites actifs du support et, par conséquent, la quantité d'enzyme immobilisée est déterminée par le nombre de sites actifs.
Une approche tout-à-fait différente consiste à fournir une couche beaucoup plus épaisse fixée à la surface du support, rien qu'une petite fraction des molécules d'enzyme étant en contact direct avec le support.
Dans ce cas, ce n'est pas la surface du support qui détermine la quantité d'enzyme immobilisée et cette approche permet d'optimiser la quantité d'enzyme liée en fonction des paramètres du procédé, lors de l'utilisation finale. Cette solution est cependant plus difficile à mettre en oeuvre étant donné que la quantité relativement grande d'enzyme est difficile à maintenir en place pendant l'immobilisation. C'est pourquoi on n'a publié que relativement peu sur cette approche, malgré ses avantages évidents.
Les brevets canadiens n 1.011. 671 et 1. Oll. 672 proposent d'utiliser une solution aqueuse d'un solvant organique soluble dans l'eau en tant que milieu de réticulation, la concentration du solvant orqanique étant maintenue suffisamment élevée pour maintenir l'enzyme à l'état insoluble, mais suffisamment basse pour ne pas trop interférer avec la réaction de réticulation.
Le principal inconvénient de ce procédé réside dans le besoin de quantités relativement importantes de solvants organiques accompagné du danqer d'explosion exigeant des mesures de sécurité importantes. De même, le produit obtenu de cette manière n'est pas entièrement satisfaisant au niveau de la stabilité physique et du rendement de l'activité ; ceci étant probablement dû à la
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concentration relativement élevée du solvant organique qui est nécessaire pour maintenir l'enzyme hors solution, pendant l'immobilisation.
Un autre procédé qui concerne également ce problème est proposé dans le brevet des Etats-Unis nO 4.116. 771 : l'enzyme est traitée avec du glutaraldéhyde et avec une protéine inerte dans un volume d'eau limité, avant d'être ajoutée rapidement au support, elle est ensuite gélifiée, puis granulée et finalement séchée. Le principal inconvénient de ce procédé réside dans la concentration élevée de l'agent de réticulation qui est une conséquence de la quantité d'eau limitée. De nombreuses enzymes sont très sensibles à des concentrations élevées d'agents de réticulation, soit parce qu' elles sont inactivées, soit parce qu'elles sont rendues inaccessibles pendant l'utilisation ultérieure, étant donné la réticulation importante, soit en raison de ces deux causes susmentionnées.
Ces documents précités sont destinés à indiquer la difficulté principale que l'on rencontre lorsque l'on applique une quantité élevée d'enzymes sur un support : en vue d'obtenir une concentration suffisamment basse d'agent de réticulation on a besoin de quantités relativement importantes de milieu dans lequel il est impossible d'empêcher la dissolution de l'enzyme, avant que la réticulation ne soit effective, tandis qu'une concentration élevée d'agent de réticulation qui peut empêcher la dissolution de l'enzyme est indésirable, comme expliqué ci-dessus.
Une approche complètement différente du problème consiste à éviter entièrement le milieu aqueux et à utiliser une phase gazeuse au lieu de celui-ci ; ceci est décrit dans"The Journal of Society of Chemical Industry", volume 18, pages 16 à 20 (1899), pour la production de fibres de gélatine insolubles et dans le brevet japonais J 57002683 pour l'immobilisation d'enzymes. Cependant, ce procédé exige un système de ventilation très élaboré et exige en outre des moyens spéciaux pour empêcher la formation de dépots insolubles à l'intérieur du système de ventilation.
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Par conséquent, un objet de la présente invention vise à fournir un procédé de production d'une préparation d'enzyme immobilisée au moyen d'un agent de réticulation, ledit procédé étant simple à mettre en oeuvre, p. ex. sans devoir prendre des mesures de sécurité élaborées, procédé au moyen duquel l'enzyme immobilisée produite présente un rendement d'activité enzymatique élevé et une bonne stabilité physique.
On a trouvé à présent, suivant la présente invention, qu'il est possible d'atteindre le but précité en utilisant certains sels en une concentration minimum spécifiée. Alors que l'état de la technique précitée ne concerne que des préparations d'enzymes immobilisées sur des supports, la présente invention n'est pas limitée à de telles préparations d'enzymes immobilisées mais englobe également des préparations d'enzyme immobilisée ne comportant pas de support.
Par conséquent, la présente invention concerne un procédé de production d'une préparation d'enzyme immobilisée au moyen d'un agent de réticulation, dans lequel on rassemble les composants suivants dans un milieu aqueux : a) une préparation d'enzyme à l'état solide ou dissous, b) un agent de réticulation, et c) un sel soluble dans l'eau qui ne réagit pas avec l' agent de réticulation ou qui ne rend pas l'enzyme in- active, en une concentration suffisante pour empêcher qu'une partie importante de l'enzyme ne se dissolve dans la solution de sel ou ne se mélange avec celle-ci, pendant que la réaction de réticulation s'effectue, après quoi on sépare l'enzyme immobilisée.
Dans le cas où l'enzyme immobilisée obtenue contient un excès d'agent de réticulation, ce dernier peut en être éliminé par lavage. Il faut noter que la préparation d'enzyme peut se trouver à l'état solide ou dissous ; en outre, la préparation d'enzyme peut présenter une pureté élevée ou elle peut également contenir des additifs inertes (par exemple des charges, des agents de
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renforcement, des liants ou des agents de granulation).
De même il faut noter que la séquence dans laquelle sont rassemblés les ingrédients est arbitraire sauf que dans le cas où la préparation d'enzyme et l'agent de réticulation sont mélangés avant l'addition de sel le rendement d'enzyme décroît si l'addition de sel est retardée de manière irraisonnable.
La catégorie de sels indiquée ci-dessus (une catégorie spécifique de sels peut être destinée à chaque combinaison d'une enzyme spécifiée et d'un agent de réticulation spécifié) comporte généralement des sels peu onéreux. Il faut noter qu'une ou plusieurs-préparations d'enzyme, un ou plusieurs agents de réticulation et un ou plusieurs sels peuvent être utilisés dans le procédé suivant la présente invention.
Dans une forme d'exécution préférée du procédé suivant la présente invention, la préparation d'enzyme comporte un support. Bien que le procédé suivant la présente invention puisse être effectué sans support (par exemple voir exemple 15), on préfère en général utiliser un support, principalement à cause de la possibilité qu' offre le support de fournir une particule présentant de très bonnes propriétés d'écoulement convenant bien pour le fonctionnement en lit fixe. Indépendamment du fait que l'enzyme se trouve à l'état solide ou à l'état dissous, elle est, dans ce cas, associée fermement au support ; à l'état solide, l'enzyme peut se présenter à l'état d'une couche de revêtement sur le support et, à l'état dissous, la solution d'enzyme peut imprégner le support (poreux).
Dans un mode d'exécution préféré du procédé suivant la présente invention, la préparation d'enzyme consiste en un support revêtu d'une couche d'enzyme solide. Il est possible ainsi de produire une préparation d'enzyme présentant toute charge d'enzyme désirée entre de larges limites en faisant varier l'épaisseur de la couche d'enzyme.
Dans un mode d'exécution préféré du procédé de la présente invention, la préparation d'enzyme consiste
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en un support poreux imprégné d'une solution d'enzyme.
Ceci représente un procédé très simple pour la production d'une préparation d'enzyme immobilisée suivant la présente invention.
Dans un mode d'exécution préféré du procédé de la présente invention, l'agent de réticulation est le glutaraldéhyde. Le glutaraldéhyde est relativement peu onéreux et n'est pas mis en question par les autorités de la santé publique. De même, le glutaraldéhyde est un agent de réticulation très efficace et pourtant doux par rapport à bon nombre d'enzymes.
Dans un mode d'exécution préféré du procédé de la présente invention, la concentration du glutaraldéhyde dans le milieu aqueux est comprise entre 0, 001 et 5 % (poids/volume), de préférence entre 0,005 et l % (poids/ volume). Comme il apparaîtra plus loin dans les exemples, le rendement de l'activité enzymatique dépend de la concentration du glutaraldéhyde et, en général, la concentration du glutaraldéhyde correspondant à un rendement d'activité enzymatique maximum est située dans l'intervalle susmentionné.
Le pourcentage de glutaraldéhyde (poids/volume) est calculé suivant la formule
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poids du glutaraldéhyde, volume (de la solution de sel et du glutaraldéhyde), ml
Suivant un mode d'exécution préféré du procédé de la présente invention, le sel est choisi parmi le groupe comprenant un sulfate, phosphate, citrate, bicarbonate, carbonate, fluorure, acétate, tartrate, polysulfate, polyphosphate, ferrocyanure, phénolsulfonate, sorbate, éthylsulfate, chlorure, nitrate et succinate d'ammonium secondaire, tertiaire ou quaternaire ou de métaux alcalins, en particulier le sulfate de sodium, le phosphate de sodium, le phosphate de potassium et le citrate de potassium.
En général, ces sels sont peu onéreux et récupérables et permettent de produire une préparation d'enzyme immobilisée présentant un rendement de l'activité enzymatique élevé.
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Suivant un mode d'exécution préféré du procédé de la présente invention, la concentration du sel est comprise entre 0, 1 M et la saturation, en particulier entre environ 0,5 M et environ 3 M. Comme il apparaîtra dans les exemples donnés plus loin dans cette description, il est possible de choisir la concentration du glutaraldehyde et une molarité de sel dans les intervalles susmentionnés ; ce qui entraîne un rendement de l'activité enzymatique très élevé.
Suivant un mode d'exécution préféré du procédé de la présente invention, l'enzyme est choisie parmi le groupe contenant la glucose isomérase, les Åamylases, en particulier l'amyloglucosidase, la pullulanase, la lactase, les pectinases, la naringinase, les pénicilline acylases, les inulinases, les lipases et les protéases.
Par conséquent, l'utilisation des sels susmentionnés, même en des concentrations plus faibles que nécessaire pour la précipitation des enzymes, empêche que l'enzyme soit dissoute dans le milieu de réticulation (solution de sel), dans toute application pratique, en la maintenant tout à fait accessible à l'agent de réticulation, si l'enzyme se trouve à l'état solide, ou empêche que l'enzyme soit mélangée dans la solution de sel, si elle se trouve à l'état dissous. De cette manière, on peut utiliser une concentration optimum de l'agent de réticulation, qui ne provoque que de faibles dommages à l'enzyme et qui lui procure pourtant une stabilité physique suffisante.
On a trouvé ainsi que pour réduire la concentration de l'agent de réticulation, il faut augmenter la concentration en sel en vue de maintenir le rendement de l'activité enzymatique au niveau optimal. Selon la présente invention, il faut éviter l'utilisation de sels qui réagissent soit avec l'enzyme soit avec l'agent de réticulation, tels que les sels d'argent ou de mercure qui peuvent rendre l'enzyme inactive ou les sels d'ammonium ou d'amine primaire ou les sels de sulfite qui tendent à réagir avec bon nombre d'agents de réticulation.
Les sels qui peuvent être utilisés pour la présente
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invention sont différents en fonction de leur efficacité et, en outre, cette efficacité peut varier d'une enzyme à l'autre. On peut cependant donner un grand principe général pour le choix des sels : il est avantageux de choisir le sel le plus soluble lorsque deux sels présentent, mise à part la solubilité, des propriétés identiques.
Par conséquent, on préfère le Na-SO. au KSO., étant donné la solubilité beaucoup plus importante. On a également trouvé qu'en général, les sels d'anions, polyvalents tels que les sulfates, les phosphates, les carbonates, les citrates et autres, sont plus efficaces que les anions monovalents, tels que les chlorures et les nitrates.
L'inverse est cependant en général vrai pour les cations : les cations monovalents, tels que Na+,
K+ ou le tétraméthylammonium sont plus efficaces que les cations polyvalents tels que Mg ou Ca++. Parmi les sels on utilisera de préférence, à cet effet, les sels de métaux alcalins des sulfates, des phosphates et des citrates, et en particulier le sulfate de sodium, le phosphate de sodium, le phosphate de potassium, le citrate de potassium et le sulfate de tétraméthylammonium.
La concentration en sel est en général maintenue à un minimum. Ce minimum dépend, d'une part, de l' enzyme en question, étant donné que différentes enzymes exigent souvent différentes concentrations, et, d'autre part, de la concentration de l'agent de réticulation : plus la dernière est élevée, plus la concentration en sel nécessaire est basse et vice versa. La concentration de l'agent de réticulation est également maintenue à un minimum, étant donné que la plupart des enzymes sont sensibles aux agents de réticulation. La concentration doit cependant être suffisamment élevée pour assurer une immobilisation efficace. Il faut cependant être attentif lorsque l'on établit les conditions optimales pour la réaction de réticulation à des concentrations salines très élevées, en particulier avec des sels efficaces.
Ainsi, on a trouvé qu'à des concentrations élevées de
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NsSO., ou de phosphate de potassium, par exemple, les rendements de l'activité sont considérablement réduits par rapport à ceux à des concentrations plus modérées. Ceci est propablement dû à une réticulation très serrée qui rend les molécules d'enzyme partiellement inaccessibles.
Encore un autre avantage de l'utilisation de ces sels dans le milieu de réticulation réside dans le fait que ceux-ci empêchent l'agglomération des particules contenant l'enzyme pendant la réaction d'immobilisation, lorsque l'enzyme se trouve à l'état solide. Une telle agglomération est indésirable étant donné qu'il en résulte une efficacité moindre et des propriétés d'écoulement inférieures, lors de l'utilisation. En ce point également, les sels se distinguent largement les uns des autres.
Le procédé suivant la présente invention peut être effectué en de nombreuses étapes dont l'ordre d'exécution n'est pas important. Ainsi par exemple, selon un mode d'exécution préféré de l'invention, on traite en premier lieu le support avec une solution d'enzyme, on sèche et on le traite ensuite dans une solution contenant un agent de réticulation et un sel, on lave et on sèche éventuellement. Dans une variante du même procédé, une partie de la quantité totale de sel peut se trouver dans la solution d'enzyme. Dans une autre variante, l'enzyme est d'abord traitée avec l'agent de réticulation et ensuite immédiatement avec le sel.
Dans certains cas, par exemple lorsque l'on désire que l'enzyme immobilisée soit légère et fibreuse, la quantité de support peut être très faible ou le support entièrement supprimé, et l'enzyme est traitée dans un bain coagulant avec l'agent de réticulation et le sel. Ainsi, l'enzyme peut être dissoute dans une solution qui est coagulée dans un bain de sel, l'agent de réticulation étant additionné à la solution d'enzyme ou au bain, soit avant soit après la coagulation. De même, on peut ajouter le sel à l'état de poudre sèche, au lieu de l'ajouter à l'état de solution, lorsque l'on désire limiter la quantité d'eau.
Par
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conséquent, l'ordre dans lequel les différents composants sont mis en mélange ou leur état, c'est-à-dire à l'état de solution ou à l'état sec, ne sont pas importants pour le procédé de la présente invention.
Le pH, la température et la durée de la réaction de réticulation peuvent avoir un effet important sur le rendement de l'activité, en fonction de l'enzyme et des additifs inertes, s'il y en a. En général, on a trouvé que l'intervalle de pH d'environ 4 à environ 9 est avantageux. Le domaine de température avantageux dans la plupart des cas est compris entre environ 15 C et environ 30*C, bien que des températures plus élevées puissent avantageusement être utilisées dans certains cas, par exemple lorsque l'on désire abréger la durée de la réaction de réticulation, et des températures plus basses peuvent avantageusement être utilisées dans les cas d'enzymes très sensibles à la température.
La durée de la réaction de réticulation peut varier largement, de quelques minutes jusqu'à quelques jours, en fonction du type et de la concentration de l'agent de réticulation, du type et de la concentration du sel, de l'enzyme, du pH et de la température, et elle doit par conséquent être déterminée dans chaque cas individuel. Pour le glutaraldéhyde et la plupart des enzymes cependant, l'intervalle compris entre environ 10 minutes et plusieurs heures à température ambiante semble être adéquat.
Dans la suite, on se réfère à des documents NOVO. On peut obtenir les copies de tous ces documents chez NOVO Industri A/S, Novo Allé, 2880 Bagsvaerd, Danemark.
Le procédé suivant la présente invention sera décrit plus en détail à l'appui des exemples suivants.
Dans la partie qui suit de la présente description, qui comporte les exemples, on donne les valeurs de la perte de charge (résistance physique) lors du travail en colonne. Cette valeur est déterminée en fonction de la norme AF 166/2 qui est une description d'un procédé de laboratoire de NOVO. Certaines considérations théoriques
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en rapport avec cette détermination de la perte de charge sont décrites dans Starch/Starke 31 (1979) No. l, pages 13 à 16. A titre de comparaison avec des produits commerciaux connus, on peut dire que les meilleures valeurs de la perte de charge pour les préparations de glucose isomérase immobilisée SWEETZYME est située aux environs de 100 Pa (10 g/cm2).
Des exemples il apparaît que les pertes de charge des préparations d'enzyme immobilisée produites suivant le procédé de la présente invention peuvent atteindre des valeurs faibles telles que 20 Pa (2 g/cm2) et que toutes les valeurs sont considérablement plus faibles que 100 Pa (10 g/cm), ce qui démontre clairement l'avantage technique de la présente invention.
Exemple 1 :
On a mis en suspension dans 500 ml de solution contenant du phosphate de sodium 0,06 M, du Na2S04 1, 4 M et diverses quantités de glutaraldéhyde, ajustées au pH 7,0, des portions de 20 q de particules de support sèches revêtues d'une préparation de glucose isomérase partiellement purifiée à raison de 28 % en poids produite suivant le procédé décrit dans l'exemple 8 de la demande de brevet danois n 4430/82 et on a agité doucement à température ambiante. Après une heure on a retiré les particules et on les a mises en suspension, pendant une heure, dans une solution de phosphate de sodium 0,06 M ajustée à pH 7,0. On a répété ce lavage 3 fois et on a laissé les particules, pendant la nuit, dans la solution de phosphate, après quoi leur activité a été déterminée suivant NOVO analyseforskrift AF 189/1.
Les résultats sont représentés à la figure l qui est un graphique dans lequel le rendement de l'activité enzymatique exprimé en unités d'enzyme/q est donné en fonction du pourcentage de glutaraldéhyde et qui met en relief la sensibilité de l'enzyme au glutaraldéhyde.
Exemple 2 (exemple de comparaison) :
On a préparé les particules suivant l'exemple l, mais on n'a pas ajouté de sel, mise à part une quanti-
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té minimale de phosphate qui sert de tampon (phosphate de sodium 0,06 M, pH 6,5). Le rendement de l'activité enzymatique en unités/g est exprimé en fonction du pourcentage de glutaraldéhyde tel que représenté à la fiqure 2 qui montre que l'agent de réticulation a deux effets opposés : d'une part il augmente le rendement en empêchant la dissolution de l'enzyme ; d'autre part il réduit le rendement en rendant l'enzyme inactive. L'optimum est établi, dans ce cas, aux environs de l % de glutaraldéhyde.
Il apparaît de la comparaison entre les figures l et 2 que l'optimum de la concentration de glutaraldéhyde est d'environ 40 fois plus élevé que lors de l'utilisation de sulfate de sodium 1, 4 M, et que le rendement n'est, dans ce cas, que d'environ 60 % du rendement obtenu lors de l'utilisation de sel.
Exemple 3 :
On a préparé les particules comme à l'exemple l, mais, dans ce cas, on n'a utilisé que du phosphate de potassium en temps que sel et on a fait varier la concentration de sel en maintenant constante à 3 niveaux la concentration de glutaraldéhyde et en maintenant le pH à 6,5. Le rendement d'activité enzymatique en unités/g a été représenté en fonction du pourcentage de phosphate de potassium tel que le montre la figure 3 où apparaît clairement l'effet bénéfique de l'accroissement de la concentration en sel, particulièrement aux faibles concentrations de glutaraldéhyde.
Exemple 4 :
On a répété l'essai de l'exemple 3 en utilisant le sulfate de sodium au lieu du phosphate de potassium.
On a exprimé le rendement d'activité enzymatique en unités/g en fonction de la molarité de Na2S04 tel que représenté à la figure 4 où apparaît clairement l'effet bénéfique du sel. De la figure 4 apparaît également qu' il existe un optimum pour l'effet du sel au-delà duquel le rendement d'activité décroît, ledit optimum dépendant de la concentration en glutaraldéhyde.
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Exemple 5 :
On a répété l'essai de l'exemple 3 mais on a augmenté la concentration en sel. On a exprimé le rendement d'activité enzymatique en unités/g en fonction de la molarité du phosphate de potassium tel que représenté à la figure 5. Une comparaison entre les figures 4 et 5 montre que le Na2S04 et le phosphate de potassium se comportent de manière analogue.
Exemple 6 :
On a répété l'essai décrit à l'exemple 1 en utilisant le citrate de potassium, à pH 7,0, au lieu du phosphate et du sulfate dans le milieu de réticulation.
A la figure 6, on a représenté l'activité en unités d'enzyme/gramme en fonction de la concentration en glutaraldéhyde et les résultats ressemblent fortement à ceux de l'exemple 1.
Exemple 7 :
On a fluidisé 20 g de particules de support séchées produites comme décrit à l'exemple 4 de la demande de brevets danois n 4430/82 dans un lit fluidisé du type Lab. On a pulvérisé sur les particules support, entre 30 et 40 C, 45,8 g de boue cellulaire à 11, 0 % en poids homogénéisée (fermentée comme indiqué à l'exemple 1 de la demande de brevet danois n 5190/79, la boue étant produite comme indiqué à l'exemple 4 de la demande de brevet danois n 5190/79) contenant 80,1 U/g de lactase thermophile provenant du Bacillus sp. NRRL Bll. 229, et on a fait sécher les particules revêtues.
L'unité d'activité de lactase est définie en tant que la quantité de lactase qui décompose 1 m01 de lactose/minute dans les conditions de réaction suivantes : concentration du substrat = 10 % de lactose, température = 60 C, pH = 6,5 et temps de réaction = 30 minutes. Le rendement de l'activité enzymatique était de 79,8 %. On a ensuite traité 10 g de sphères revêtues dans 250 ml d'une solution contenant du Na2HPO4 0,06 M, du NaSO 1,4 M et 0, 1 % poids/volume de glutaraldéhyde à pH 7, 5. Après une heure à température ambiante, on a retiré les particules et on
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les a lavées à fond avec 0,06 M de KHPO. à pH 7,5.
Le rendement d'activité par rapport à l'étape de réticulation était de 17, 2 %.
Exemple 8 :
On a trempé 24 g de particules de support sèches produites tel que décrit dans l'exemple 4 de la demande de brevet danois no. 4430/82 dans 20,2 g de solution à 39,6 % en poids d'amyloglucosidase partiellement purifiée provenant de A. niger et produite par ultrafiltration du produit commercial AMG 200 L (décrit dans la brochure de NOVO, NOVO Enzymes AMG, B 020 g-GB), en vue d'éliminer les constituants à bas poids moléculaire pour obtenir une teneur en matière sèche de 39,6 % en poids (activité 2610 IAG/g, l'unité d'activité étant définie dans NOVO Analyseforskrift AF 159/2). On a appliqué le vide pendant 1 heure. Le produit ainsi obtenu contenait 25 % en poids de matière sèche d'amyloglucosidase partiellement purifiée avec un rendement d'activité enzymatique de 77, 9 %.
On a ensuite traité 20 g de particules contenant 71,8 % de matière sèche dans 1600 ml d'une solution contenant du NaH2 PO4 0,06 M, du Na2SO4 1,4 M et 0,2 % de glutaraldéhyde, à pH 4,5. Après une heure, on a séparé les particules par filtration et on les a lavées avec du NaH2PO4 0,06 M à pH 4,5. Le rendement d'activité enzymatique par rapport à l'étape de réticulation était de 55, 1 %.
Exemple 9 :
On a mélangé 40 g de particules de support préparées comme décrit dans l'exemple 4 de la demande de brevet danois n 4430/82 et présentant une teneur en matière sèche de 98,8 % avec 24 g de concentré de glucose isomérase évaporé sous vide, partiellement purifié et obtenu à'partir de Bacillus coagulans et additionné de 5 % de glucose et de 8 % de sulfate de sodium (substance sèche 41,8 %) et on a laissé le liquide déplacer l'air dans les pores des particules au moyen d'un traitement sous vide. Le poids après mélange était de 63,22 g. La teneur
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en matière sèche était de 79,2 %.
On a traité des fractions de 18 g de cette préparation ( 14 g de matière'sèche), pendant une heure, à température ambiante, avec 375 ml d'une solution contenant dans tous les cas du sulfate de sodium 1, 5 M, 5 % de glucose et du phosphate de sodium 0,06 M, le pH de la solution étant réglé à 7,5, la solution contenant encore soit O, l soit 0,2 soit 0,3 % de glutaraldéhyde.
Après ce traitement, les fractions ont été lavées cinq fois avec approximativement 150 ml de phosphate de sodium à l %, pH 7,5.
L'activité enzymatique a été déterminée suivant AF 189/1 après avoir soutiré le liquide des particules.
On a également déterminé les matières sèches sur les particules égouttées.
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<tb>
% <SEP> de <SEP> mat. <SEP> U/g <SEP> U/g <SEP> Rende-Rendement
<tb> sèches <SEP> humi-sec <SEP> ment <SEP> % <SEP> de <SEP> l'imde <SEP> mobilisation, <SEP> %
<tb> Concentré <SEP> d'enzyme <SEP> 41,8 <SEP> 1415 <SEP> 3385
<tb> Concentré <SEP> d'enzyme
<tb> + <SEP> support <SEP> 79,2 <SEP> 463 <SEP> 585 <SEP> 86 <SEP> - <SEP>
<tb> Immob. <SEP> avec <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> % <SEP> GA <SEP> 32, <SEP> 5 <SEP> 158 <SEP> 486 <SEP> 72 <SEP> 83
<tb> 0, <SEP> 2 <SEP> %-38, <SEP> 9 <SEP> 141 <SEP> 362 <SEP> 53 <SEP> 62
<tb> 0, <SEP> 3 <SEP> %--117 <SEP> 333 <SEP> 49 <SEP> 57
<tb>
On a fait des essais avec des fractions équivalentes à 5 g de matière sèche pour déterminer la perte de charge.
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<tb>
<tb>
Concentration <SEP> de <SEP> Perte <SEP> de <SEP> charge
<tb> glutaraldéhyde <SEP> à <SEP> l'25 <SEP> heures <SEP> 50 <SEP> heures
<tb> immobilisation
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> % <SEP> 3 <SEP> 5
<tb> 0, <SEP> 2 <SEP> % <SEP> 1 <SEP> 3
<tb> 0. <SEP> 3 <SEP> % <SEP> 2 <SEP> 3
<tb>
Exemple 10 :
Cet exemple décrit un procédé pour la préparation d'un produit d'enzyme immobilisée sur du charbon actif de Norit en tant que support.
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Ainsi, on a trempé 20 g de charbon actif Norit Rox 0,8 type A-3397, dans 33 g d'une solution à 39,2 % en poids de glucose isomérase partiellement purifiée obtenue à partir de Bacillus coagulans (activité 3950 U/g de matière sèche, l'unité d'activité étant définie dans Novo "Analyseforskrift"AF 189/1).
On a appliqué le vide pendant 20 heures à 4 C, mis à part le fait que l'on a supprimé le vide 4 fois pendant cette période. Le produit ainsi obtenu contenait 35 % en poids de matière sèche de glucose isomérase partiellement purifiée avec un rendement d'activité enzymatique de 97 %.
On a ensuite immobilisé 98 % du produit agglo-
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méré susmentionné dans 890 ml d'une solution contenant 06 M, du 1, 4 M et 0, 18 % de glutaraldéhyde, réglée à pH 7, 5 au moyen de NaOH 4 N.
Après 2 heures à température ambiante et sous agitation douce, on a séparé les particules par filtration et on les a lavées à fond avec KH2P04 0,06 M à pH 8,0.
Le rendement de l'activité par rapport à l'étape de réticulation était de 31 %.
Exemple 11 :
Cet exemple décrit un procédé pour la production d'une préparation d'enzyme immobilisée contenant un support constitué par des sphères de silice ayant un diamètre d'environ 2 mm.
A. On a fluidisé 20 g de sphères de silice dans un lit fluidisé du type Lab et on a pulvérisé 40 g de solution à 15 % en poids de glucose isomérase partiellement purifiée obtenue à partir de Bacillus coagulans (ac- tivité 3306 U/g de matière sèche, l'activité étant définie dans NOVO analyseforskrift AF
189/1) sur les sphères, entre 25 et 30 C, et on a fait sécher les sphères enrobées. Le produit ainsi obtenu contenait 23 % en poids de glucose isomérase partiellement purifiée avec un rendement d'activité de 78 %.
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On a ensuite traité 95 % de sphères enrobées dans 500 ml de solution contenant du K2HP04
0,06 M, du Na2S04 1, 4 M et 0,1 % en poids/volume de glutaraldéhyde, réglée à pH
7,5 au moyen de NaOH 4N ; après une heure à température ambiante, on a séparé les parti- cules et on les a lavées à fond avec du KH2P04 0, 06 M à pH 8,0. On a ensuite déterminé l'activité. Le rendement d'acti- vité par rapport à l'étape de réticulation était de 55 %.
B. On a trempé 20 g de sphères de silice dans
15 g de solution à 40 % en poids de glucose isomérase partiellement purifiée obtenue à partir de Bacillus coagulans (activité 3270
U/g de matière sèche) contenant du Na2S04
0,56 M. On a appliqué le vide pendant
20 minutes sauf que le vide a été interrompu
4 fois pendant cette période. Le produit ainsi obtenu contenait 20 % en poids de glu- cose isomérase partiellement purifiée avec un rendement d'activité enzymatique de 90 %.
95 % des sphères enrobées a ensuite été traité tel que décrit dans la partie A de cet exemple. Le rendement de l'activité par rapport à l'étape de réticulation était de
45 %.
Dans certains cas dans lesquels l'enzyme est particulièrement difficile à réticuler, les sels peuvent devenir non seulement avantageux mais plutôt indispensables, si l'enzyme doit être immobilisée à l'état pur.
Un bon exemple est l'amyloglucosidase qui est produite par NOVO (et vendue, par exemple, sous la marque AMG 200 L, voir la brochure de NOVO, NOVO enzymes AMG, B 020 g-GB 2500 de juillet 1982) et qui est pratiquement impossible à immobiliser au moyen du glutaraldéhyde si elle est à l'état pur : il s'est avéré impossible de rendre cette amyloglucosidase insoluble même à des concentrations
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telles que 50 % en poids de glutaraldéhyde. Cependant, grâce aux sels utilisés dans le procédé de la présente invention (bien qu'ils soient utilisés à des concentrations assez élevées), il est possible de rendre l'enzyme réellement insoluble, même à des concentrations aussi faibles que 0,05 % poids/volume de glutaraldéhyde, comme le démontrent les exemples 12 à 17 qui suivent.
Les préparations ainsi obtenues qui ont des propriétés de filtration excellentes et qui peuvent même être aisément immergées peuvent avantageusement être utilisées dans la production de bière à peu de calories, par exemple.
Exemple 12 :
Le produit commercial NOVO AMG 200 L dilué de manière à obtenir une teneur en matière sèche de 30 % poids/volume a été mélangé avec du Hyflo Celite et séché, de manière à obtenir une préparation contenant 21 % en poids de matière sèche provenant de la préparation AMG.
On a ajouté des fractions de 1 g de la préparation à une solution contenant du Na2S04 2,4 M, du phosphate de potassium 0,06 M, à pH 6,5 et du glutaraldéhyde à différentes concentrations à 32 C, et on a maintenu le mélange à cette température, pendant 20 heures. Les particules ont ensuite été filtrées et rincées trois fois avec de l'eau désionisée et on a mesuré le rendement de l'activité. Les résultats donnent l'allure classique des deux effets opposés du glutaraldéhyde avec un optimum à 0,05 %, voir figure 7.
Exemple 13 :
On a répété le même procédé que celui de l' exemple 12 en utilisant cependant cette fois-ci des concentrations différentes de Na2S04. Le rendement d' activité avec cette enzyme est extrêmement sensible à la quantité de sel présente, voir figure 8.
Exemple 14 :
On a répété le même procédé que celui de l' exemple 12 sauf que l'on a utilisé cette fois-ci une préparation AMG ne contenant que la moitié d'enzyme. On a constaté que l'optimum de la concentration en glutaraldé-
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hyde s'est déplacé vers une concentration inférieure, voir figure 9.
Exemple 15 :
On a séché le produit commercial NOVO AMG 200 L par pulvérisation et on a utilisé la poudre obtenue en tant que substance de départ en modifiant légèrement le mode opératoire : on a ajouté 0,5 g de la poudre AMG à une solution de 100 ml contenant du Na2S04 2,5 M, du phosphate de potassium 0, 1 M, à pH 6,5 et 1 % poids/ volume de glutaraldéhyde à 32 C, et on a maintenu cette température pendant 1 heure, en agitant de temps en temps. Les particules insolubles ainsi formées ont ensuite été filtrées et ont de nouveau été incubées dans le même milieu, cette fois-ci sans glutaraldéhyde, à la même température, pendant encore 20 heures. Ensuite on les a filtrées et rincées trois fois avec de l'eau désionisée.
Ces microsphères qui sont aisément filtrables présentent un diamètre d'environ 10 à 100 pm, et ont gardé 19 % de l'activité de départ.
Exemple 16 :
Dans ce cas on a adopté un mode opératoire identique à celui de l'exemple 15 mis à part le fait que l'on a ajouté le glutaraldéhyde à la solution de sel après y avoir ajouté la poudre d'enzyme. On a obtenu un produit analogue ayant 34 % de l'activité de départ.
Exemple 17 :
On a de nouveau adopté le mode opératoire de l'exemple 15, mis à part le fait que l'on n'a utilisé que 0,4 % poids/volume de glutaraldéhyde et que l'on a ramené l'incubation totale à 3 heures. On a obtenu un produit ayant 37 % de l'activité de départ.
Exemple 18 :
Cet exemple démontre que le procédé de la présente invention peut être appliqué à d'autres agents de réticulation que le glutaraldéhyde, à savoir les cations polyvalents. Dans ce cas on a utilisé le Sn.... à titre d'agent de réticulation. On a ainsi ajouté lentement et en agitant 0,5 g de la préparation de Célite-AMG de
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l'exemple 12, à l'état avant réticulation, dans 100 ml d'une solution contenant du 2 M, de l'acétate de potassium 0, 4 M (pH 4, 35) 0086 M et on a maintenu le mélange à température ambiante pendant 5 minutes en agitant de temps en temps. Les particules ainsi obtenues ont été filtrées et dispersées dans 100 ml d'acétate de potassium 0,2 M, pH 4,35, et on a agité la suspension pendant 5 minutes. On a répété ce mode opératoire à 3 reprises.
Le produit final présentait un rendement d'activité enzymatique de 43 %.
Exemple 19 :
Dans cet exemple on a produit une-préparation suivant le procédé décrit dans l'exemple 18 en doublant les concentrations de l'acétate et du sel stanneux à, respectivement, 0,8 M et 0, 017 M. On a obtenu un produit similaire, le rendement d'activité enzymatique étant de 65 %.
Exemple 20 :
Dans cet exemple, le procédé de l'exemple 18 a également été répété en réduisant de moitié la concentration d'acétate, à savoir 0,2 M. On a de nouveau obtenu un produit analogue ayant un rendement d'activité enzymatique de 48 %.
Exemple 21 :
Dans cet exemple, on décrit l'utilisation d'un autre agent de réticulation, à savoir la benzoquinone.
On a ainsi ajouté 0,5 g d'une préparation de Celite-AMG séchée, comme pour l'exemple 12, à 75 ml d'un mélange contenant du Na2S04 2, 1 M, de l'acétate de sodium 0,05 M ; puis on y a ajouté 5 ml d'une solution à 20 % poids/ volume de benzoquinone dans de l'éthanol pur et on a abandonné tout le mélange à température ambiante pendant 80 minutes, en agitant de temps en temps. Les particules ainsi formées ont ensuite été filtrées, dispersées dans 75 ml d'un tampon à l'acétate de potassium 0, 1 M, pH 4, 4.
On a agité pendant 5 minutes et effectué une nouvelle
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filtration. Ce mode opératoire a été répété trois fois et on a ensuite déterminé l'activité. Le rendement d'activité enzymatique était-de 14 %.