"Ensembles d'anticorps monoclonaux dirigés contre les protéines humaines impliquées dans la coagulation et la fibrinolyse du sang" Ensemble d'anticorps monoclonaux dirigés contre les protéines humaines impliquées dans la coagulation et la fibrinolyse du sang.
La présente invention concerne des ensembles d'anticorps monoclonaux dirigés contre chacune des trois protéines humaines sui-
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psine. Ces trois protéines sont impliquées dans la fibrinolyse et/ou la coagulation du sang.
L'antithrombine III (AT III) est une glycoprotéine de Mw
58000 daltons (425 acides aminés), synthétisée dans le foie et présente dans le plasma (demi-vie : 2,7 jours). Dans de nombreuses circonstances, le taux d'AT III dans le sang peut diminuer, entraînant des états pathologiques graves. Une déficience en AT III est souvent associée à des troubles hépatiques, à l'apparition généralisée de micro-caillots dans le système circulatoire (coagulation intravasculaire disséminée), à la protéinurie et à la leucémie aiguë. De plus après intervention chirurgicale, un taux réduit d'AT III accompagne souvent un état thrombotique. Le taux d'AT III constitue dès lors un révélateur efficace de troubles des processus de coagulation et de fibrinolyse.
Outre les différentes conditions du milieu qui peuvent affecter le taux d'antithrombineIII, il existe des cas de déficience héréditaire à relativement haute fréquence (de 1 à 2,5 pour mille). Actuellement, une partie des problèmes liés à un taux réduit d'antithrombine III peut être surmonté par l'administration de plasma enrichi en cette enzyme.
A cet égard, la disponibilité d'un système de dosage de l'antithrombine III dans les fluides biologiques, basé sur l'utilisation d'anticorps monoclonaux dirigés contre elle, facilite la détection précoce des troubles des processus de coagulation et de fibrinolyse. En outre, la mise au point d'un système simple de purification de l'antithrombine III au départ de plasma ou de toute autre source appropriée au moyen de l'ensemble d'anticorps monoclonaux dirigés contre l'AT III humaine permettrait des essais cliniques approfondis de l'AT III en tant qu' agent thérapeutique.
<EMI ID=2.1> de plasma de Mw 65 000 daltons dont la déficience héréditaire con-
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complexant rapidement la plasmine circulante et en bloquant ses activités protéolytiques.
La mise au point de systèmes simples de dosage et de purifi-
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monoclonaux dirigés contre elle pourrait conduire à la détection précoce de troubles fibrinolytiques et à l'emploi thérapeutique de
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ma sanguin est synthétisée dans le foie et sécrétée dans le plasma ou sa demi-vie est de 6 jours. Cette enzyme fonctionne essentiellement en tant qu'inhibiteur d'enzymes protéolytiques. La cible
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pour la plasmine et la thrombine; c'est là que se situe son rôle dans le processus de fibrinolyse. Par ailleurs, la déficience héréditaire en cette enzyme, phénomène assez fréquent, s'accompagne de troubles de dégénérescence précoce du poumon et, dans certains cas, de troubles hépatiques. Il semble que des facteurs génétiques et de l'environnement participent ensemble à l'apparition des problèmes de santé.
Si pour des raisons génétiques ou autres, le taux d�l-antitrypsine dans le plasma tombe sous un certain seuil, des troubles pulmonaires graves se déclarent. La perte d'élasticité des poumons conduit à des dégâts irréversibles, caractéristiques de l'emphysème. Une des causes principales de l'emphysème trouve son origine dans le tabagisme; l'exposition des poumons à la fumée du tabac induit une activité protéolytique accrue dans les macrophages des alvéoles pulmonaires et la concentration de leucocytes riches en élastase s'accroît dans celles-ci. Ces deux phénomènes conduisent
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tabagisme résulte d'un déséquilibre entre protéase et anti-proté-ase.
La compréhension de la pathogénèse des troubles pulmonaires fournit la base de nouveaux concepts comme, par exemple, la thérapie par remplacement d'anti-protéase. Une telle voie suppose no-
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l'on pourrait administrer aux emphysémateux.
A cet égard, la mise au point de systèmes simples de dosage et de purification de l�l-antitrypsine basés sur l'utilisation de l'ensemble des anticorps monoclonaux dirigés contre elle conduit à la détection des troubles liés à la déficience en cette enzyme et
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Dans le cadre de l'invention, on a trouvé des ensembles d'anticorps monoclonaux dirigés respectivement contre l'antithrombine-
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bles, en raison de la diversité des anticorps qui les composent peuvent être utilisés comme agent diagnostique et constituent un moyen de réaliser les objectifs de dosage et de purification des trois protéines sus-mentionnées.
L'invention concerne trois ensembles distincts d'anticorps monoclonaux dirigés contre des protéines humaines impliquées dans la coagulation et la fibrinolyse du sang. Ces ensembles contiennent 15 anticorps monoclonaux dirigés contre l'antitrombine III,
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Par "ensemble" on comprend la totalité des anticorps qui le constitue.
Selon un aspect particulier de l'invention, les anticorps monoclonaux de chaque ensemble sont sécrétés par différents hybridomes.
Dans le cadre de l'invention, on a aussi montré que divers anticorps monoclonaux, au sein de chaque ensemble, ne sont pas mutuellement inhibants, c'est-à-dire se lient ensemble soit à l'AT
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En outre, on a montré que chaque ensemble se compose de grou-pes d'anticorps monoclonaux dont les éléments reconnaissent différents déterminants antigéniques (épitopes) soit de l'AT III, soit de 1�2-AP, soit l'�l-AT.
Suivant la présente invention, l'ensemble des anticorps monoclonaux dirigés contre l'AT III contient 15 anticorps monoclonaux répartis en 7 groupes d'anticorps dont la spécificité d'épitope est différente et comporte six anticorps monoclonaux qui inhibent l'activité enzymatique de l'AT III humaine.
Cet ensemble comporte 8 anticorps qui présentent une structure IgGl et 7 anticorps qui présentent une structure IgG2. Tous
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se répartissent en 7 groupes d'anticorps de spécificités d'épitope différentes.
Un autre caractère de l'ensemble AT III, selon l'invention, tient à ce que six anticorps inhibent l'activité enzymatique de l'anthitrombine III humaine.
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humaine, contient 23 anticorps monoclonaux répartis en 11 groupes d'anticorps dont la spécificité d'épitope est différente. 14 anticorps sont de structure IgGlet 9 anticorps sont de structure IgG2.
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micro-organismes portant l'information génétique correspondant à cette protéine. Les 26 anticorps monoclonaux de cet ensemble reconnaissent l'o�l-antitrypsine humaine.
La préparation des anticorps monoclonaux s'effectue selon une technologie de fusion cellulaire, dérivée de celle publiée par
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Suivant la présente invention, le procédé pour produire les ensembles d'anticorps monoclonaux dirigés contre des protéines humaines impliquées dans la coagulation et la fibrinolyse du sang
/ est caractérisé par la fusion cellulaire de cellules de souris,
un sousclone sélectionné de SP 2/0-Ag 14 avec des cellules de
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soit avec l' 1-AT, par la sélection des hybridomes sécréteurs d'anticorps, par le clonage de ces dernièrs hybridomes, par leur production en culture ou en ascite, par l'identification des anticorps secrétés par ces clones et par la caractérisation des classes d'immunoglobulines de ces anticorps, de leur affinité relative
et de leur spécificité.
Pour mieux comprendre le procédé, faisant l'objet de la présente invention, l'exemple non limitatif suivant décrit la préparation des trois ensembles d'anticorps monoclonaux sus-mentionnés.
1.Cellules de myélome de souris.
On a sélectionné des cellules de myélome de souris possédant les propriétés suivantes : croissance rapide in vivo et in vitro, capacité de pouvoir être clonées sans le support de cellules nourricières et en milieu semi-solide ,capacité de fusionner à taux élevé. Cette lignée a été développée par Shulamn,M; Wilde,C.D
and Koller,G (1978) Nature 276,269-270.
Dans ce but, les cellules myelomateuses SP 2/0-AG 14 ont été clonées en agar. Les cellules capables de pousser dans ces conditions ont alors été reclonées en agar puis injectées par voie intrapéritonéale dans des souris syngéniques. Après une à deux semaines, les cellules myelomateuses se développent sous forme de tumeur dans les souris injectées. Les cellules sont alors collectées dans la cavité péritonéale, resélectionnées, reclonées en agar et essayées dans une expérience de fusion cellulaire. Le cycle décrit ci-dessus est recommencé 3 fois. A l'issue du procédé,
on obtient des sous-clones sélectionnés de la lignée myélomateuse
SP 2/0-Agl4 possédant les propriétés voulues pour leur fusion cellulaire ultérieure suivant le procédé revendiqué. On trouvera dans Franssen,J.D.;Hérion,P et Urbain,J.(1981,Proc.XXIX Colloquium
on Protides of the Biological Fluids, Peeters Ed.) le détail de la méthode appliquée.
2.Immunisation des souris.
Les antigènes utilisés ont été obtenus comme suit. L'anti-thrombine III a été purifiée par la méthode de MACKAY,E.J., Thrombosis Research, 21, 1981, 375-382 au départ d'un pool de plasma citraté.
L'� 2-antiplasmine pure a été fournie par le Dr D. COLLEN de la Katolieke Universiteit Leuven.
L' �l-antitrypsine a été purifiée par la méthode de Mahoney, W.C.; Kurachi, K. et Hermodson,M.A. Eur. J. Biochem,105,545-542,-
1980 au départ d'un pool de plasma citraté.
Ces différentes préparations purifiées ont été utilisées pour immuniser des souris femelles (souches Balb/c, A/J and AKR) âgées de 8 semaines.
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fié dans l'adjuvant complet de Freund et on injecte le mélange par voie sous-cutanée et intra-péritonéale. Trois semaines plus tard, les souris reçoivent une injection de rappel, 100�g d'antigène dans l'adjuvant incomplet de Freund, par voie intraperitonéale. Après une période de repos de 6 semaines, les souris reçoivent au
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NaCl 0,15 M) par voies intra-péritonéale et sous-cutanée.
Au jour zéro, on sacrifie les souris et on prélève la rate pour la préparation des cellules destinées aux fusions cellulaires.
3.Fusions cellulaires.
Pour effectuer les fusions, on utilise les matières et milieux suivants. On obtient chez GIBCO le milieu DMEM que l'on complète avec du sérum de cheval (10%), du sérum de veau (5%), des acides aminés non essentiels, du pyruvate de sodium (lmM), de la
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Le milieu de sélection complet (HAT) se compose du milieu décrit ci-dessus ainsi que d'hypoxanthine (10-4 M),d'aminoptérine
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nant de l'agar (1,5%) comporte les ingrédients décrits ci-dessus. Les cellules sont cultivées à 37[deg.]C dans une atmosphère humide de 5% C02 et 95% d'air.
La fusion avec des cellules provenant d'une lignée cellulaire de myélome de souris (sous-clones sélectionnés SP2/0 - Ag 14) est réalisée selon le procédé de Franssen, J.D., Herion, P.and Urbain J.-1981-Proc. XXIX Colloquium on Protides of the Biological Fluids, Peeters Ed.
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SP2/0-Ag 14. Pour chaque fusion, on distribue les cellules fusionnées dans des plaques de microculture à 96 puits en effectuant des dilutions de 10 en 10 fois. Les cultures sont alimentées au jour 5,8,11 et 13 après la fusion en remplaçant la moitié du milieu dans le puits par du milieu frais. Au jour 15 après la fusion, 50
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dans du tampon NaCl 0.15M, acétate 0,02 M PH5 sont incubés dans des puits de plaques LINBRO en PVC à 96 puits durant une nuit à 4[deg.]C. Les sites d'absorption restants sont alors bloqués par incu-
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val et 1% d'albumine bovine. Les plaques sont alors lavées plusieurs fois avec du tampon PBS, puis les surnageants de culture ou des dilutions d'antise�um de souris sont mis à réagir avec l'antigène adsorbé, durant une nuit à 4[deg.]C.
Les anticorps fixés sont alors révélés par l'une des deux procédures suivantes :
a) des Fab d'anticorps de chèvre antiimmunoglobuline de <EMI ID=25.1>
une nuit dans les puits qui sont ensuite lavés, séchés et comptés dans un compteur à scintillation-( b) des immunoglobulines de chèvre antiimmunoglobuline de souris marquées à la peroxydase (O'Sullivan, M.J. and Marks, V., Me- <EMI ID=26.1>
tampon PBS 7.5 contenant 10% de sérum de cheval, 1% d'albumine bovine et 0.1% de tween 80 sont incubés durant 4 heures à température ambiante dans les puits qui sont ensuite lavés plusieus fois. L'enzyme confugué fixé est alors mis en évidence par addition de
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ce est lue à 492 nm dans un lecteur automatique (Dynatech AM 120).
5.Clonage et Identification.
Les cellules des puits positifs dans l'immuno essai caracté-
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gées dans le milieu approprié puis clonées en agar mou. Les lignées qui secrètent des Ig ont été reclonées et retestées dans l' immunoessai. Ce protocole a permis de récupérer 15 hybridomes distincts secrétant des anticorps monoclonaux dirigésd contre l'AT III, 23 hybridomes distincts secrétant des anticorps
<EMI ID=29.1> lement dans des souris (syngéniques ou FI progeny) qui ont été préalablement traitées au pristane.
7.Purification des anticorps monoclonaux au départ de liquide ascitique.
Le procédé décrit par Staehelin, T., Mobbs, D.S., Hsiang-Fu, K., Chun-yen, L. and Pestka, S., 1981, J.Biol. Chem. 256, 9750, a été suivi dans sa totalité si ce n'est que la DEAE a été remplacée par la DEAE Affi-gel Blue (Biorad) pour éliminer les protéases. Toutes les opérations se font à 4[deg.]C. Les fractions d'anticorps monoclonaux sont recueillies, précipitées deux fois au sulfate de
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pH 8,5.
8.Caractéristiques des anticorps monoclonaux.
a)anticorps monoclonaux dirigés contre l'AT III.
La classe d'Ig à laquelle appartiennent les 15 anticorps monoclonaux de l'ensemble fut déterminée par test d'Ouchterlony sur le surnageant de culture des cellules. 8 anticorps monoclo-
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Table 1
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(1) Rapport AC 1 où AC 1 et AC 2 représentent les concentra-
AC 2
tions en anticorps donnant une même densité optique en ELISA sur des phases solides préparées avec des solutions contenant respec-
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n'ont qu'une valeur qualitative.
(2) Densité optique en ELISA avec du surnageant de culture non dilué.
Pour tous les 15 anticorps monoclonaux de l'ensemble des anticorps monoclonaux dirigés contre l'AT III, les chaînes légères sont de type K.
En outre, l'affinité relative des 15 anticorps monoclonaux de l'ensemble a été déterminée par un test ELISA sur phases solides
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et 6,0�g/ml d'antithrombine III (table 1).
D'autre part, la spécificité des 15 anticorps monoclonaux de l'ensemble a été évaluée dans un système ELISA en phase solide ou on mesure la compétition entre l'antigène AT III et des protéines
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plasmine (table 1).
On a aussi déterminé la spécificité d'épitope
des 15 anticorps monoclonaux de l'ensemble dans des expériences de compétition entre chaque anticorps monoclonal(marqué à la methionine 35S et les 14 autres anticorps monoclonaux de l'ensemble pour la fixation sur l'antigène AT III immobilisé en phase solide. Ces expériences ont mis en évidence l'existence de sept groupes d'anticorps monoclonaux caractérisés par leur spécificité d'épitope
(table 2).
Table 2
Spécificité d'épitope des anticorps monoclonaux dirigés contre l'antithrombine III humaine.
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On a aussi déterminé l'effet des anticorps monoclonaux dirigés contre l'AT III sur l'activité enzymatique de l'antithrombine III en utilisant un test indirect qui consiste à mesurer l'activité neutralisante de l'antithrombine III, en présence et en absence d'héparine, vis à vis de l'activité enzymatique de la thrombine. Cet essai repose sur l'emploi d'un substrat chromogénique de la thrombine (Chromozym TH, Boehringer). On a montré que six anticorps monoclonaux de l'ensemble inhibent l'activité enzymatique de l'antithrombine III, en présence ou en absence de l'héparine qui est un accélérateur de l'activité enzymatique de l'AT III (table
3).
Table 3
Inhibition de l'activité enzymatique de l'antithrombine III par les anticorps monoclonaux
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Effet des anticorps monoclonaux sur l'activité enzymatique de l'AT III; l'AT III fut incubée en présence des anticorps monoclonaux puis mise en contact avec la thrombine en présence ou en absence d'héparine. L'activité résiduelle de la thrombine fut mesurée par le substrat chomogénique (chromozym TH).
Table 4
Anticorps monoclonaux dirigés contre 1�2-antiplasmine
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(1) Rapport AC 1 où AC 1 et AC 2 représentent les concentra-
AC 2
tions en anticorps donnant une même densité optique en ELISA sur des phases solides préparées avec des solutions contenant respec-
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n'ont qu'une valeur qualitative.
(2) Densité optique en ELISA avec du surnageant non dilué.
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nent à la classe IgGl et 9 anticorps à la classe IgG2. (table 4). Pour tous les anticorps monoclonaux de l'ensemble, les chaînes
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des anticorps monoclonaux de l'ensemble ont été déterminées par un test Elisa indirect, utilisant des matrices solides recouvertes de
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On a aussi déterminé la spécificité d'épitope des anticorps monoclonaux de l'ensemble en réalisant des expériences de compétition entre chaque anticorps marqué et chacun des autres anticorps
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tiplasmine fixé sur support solide. Ces expériences ont mis en évidence l'existence de 11 groupes d'anticorps monoclonaux caractérisés par leur spécificité d'épitope (table 5).
Table 5
Spécificité d'épitope des anticorps monoclonaux dirigés
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Le test d'Ouchterlohy a montré que tous les 26 anticorps monoclonaux de l'ensemble, ont une structure de type IgGl (table 6). En outre, l'emploi d'un test Elisa en phase solide où l'on mesure la fixation de chaque anticorps monoclonal sur l'antigène
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et 1,2 �g/ml) a permis de mesurer l'affinité relative de chacun des anticorps monoclonaux de l'ensemble (table 6). On a aussi déterminé la spécificité des anticorps monoclonaux de l'ensemble en réalisant des expériences où l'on mesure la fixation de ces anti-
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On a montré dans un test Elisa en phase solide (dont le principe est décrit dans.le Brevet belge n[deg.]89596l) que les 26 anti-
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naissent cette protéine de manière spécifique et de façon comparable quelle que soit l'origine de l'�l-antitrypsine humaine, qu'elle provienne de plasma humain ou d'extraits de micro-organismes exprimant l'information génétique correspondant à l'�l-antitrypsine (table 7).
Table 6
Anticorps monoclonaux dirigés contre 1�1-antitrypsine
humaine.
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(1) Rapport AC 1 où AC 1 et AC 2 représentent les concentra-
AC 2
tions en anticorps donnant une même densité optique en ELISA sur des phases solides préparées avec des solutions contenant respec-
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n'ont qu'une valeur qualificative.
(2) Densité optique obtenue en ELISA avec du surnageant non dilué
Table 7
Identification à l'aide d'anticorps monoclonaux de
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bactériens.
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REVENDICATIONS
1) Ensembles d'anticorps monoclonaux dirigés contre des protéines humaines impliquées dans la coagulation et la fibrinolyse du sang, caractérisés en ce que ces ensembles contiennent 15 anticorps monoclonaux dirigés contre l'antithrombine III humaine, 23 anticorps monoclonaux dirigés
<EMI ID=54.1>
2) Procédé pour produire ces ensembles d'anticorps monoclonaux dirigés contre des protéines humaines impliquées dans la