"Anticorps monoclonaux dirigés contre l'urokinase humaine"
Cette invention a été réalisée à l'Université Libre de Bruxelles, Faculté des Sciences, Département de Biologie moléculaire, rue des Chevaux, 67, 1640 Rhode-Saint-Genèse (Belgique) par MM. P.Herion, Ingénieur industriel; J. Urbain, Professeur d'Immunologie; A. Bollen, Maître de Recherches F.N.R.S.
Anticorps monoclonaux dirigés contre l'urokinase humaine
La présente invention concerne des anticorps monoclonaux dirigés contre la protéine humaine urokinase.
L'urokinase est une protéine synthétisée dans le rein et excrétée dans l'urine. Cette protéine fonctionne en tant qu'activateur du plasminogène. A cet égard, l'urokinase possède une valeur thérapeutique bien établie puisqu'elle conduit à la dissolution des caillots sanguins in vivo. Deux formes de l'enzyme sont actuellement produites commercialement,la forme lourde, 54.000 daltons, et son dérivé plus court,
33.000 daltons. Les deux espèces protéiques sont utilisées en thérapeutique humaine pour combattre les maladies thromboemboliques. Un certain nombre de tumeurs, tels les carcinomes de l'ovaire, produisent de l'urokinase en relativement grande quantité. A cet égard, la disponibilité d'un système de dosage de l'urokinase dans les fluides biologiques pourrait faciliter la détection précoce de tumeurs.
Les procédés de purification de l'urokinase au départ de sources conventionnelles, telle l'urine, ou de milieu de culture de cellules humaines embryonnaires rénales, reposent sur des procédés de fractionnement classiques. Un système de purification simple et économique serait de nature à diminuer le coût de production de l'urokinase et à élargir son usage thérapeutique.
Dans le cadre de l'invention, on a maintenant trouvé que pour doser l'urokinase dans des fluides biologiques et pour purifier l'enzyme, on peut avoir recours à un ensemble d'anticorps monoclonaux qui sont dirigés contre l'urokinase humaine.
L'invention a pour objet un ensemble de 18 anticorps monoclonaux dirigés contre l'urokinase humaine. Par "ensemble" on comprend la totalité des 18 anticorps.
Suivant la présente invention, l'ensemble d'anticorps monoclonaux dirigés contre l'urokinase humaine comporte 18 anticorps monoclonaux dont 14 sont d'isotype IgGl et 4 sont d'isotype IgG2. Tous les anticorps de l'ensemble ont une chaîne légère de type K et diffèrent par leur isotype. Un autre caractère de l'ensemble d'anticorps monoclonaux selon l'invention, tient à ce qu'un anticorps inhibe l'activité enzymatique de l'urokinase humaine. Tous les anticorps monoclonaux de cet ensemble reconnaissant différents épitopes de l'urokinase humaine.
On a montré de plus que divers anticorps monoclonaux de cet ensemble ne sont pas mutuellement inhibants, c'est-à-dire se lient ensemble à l'urokinase humaine, tandis que d'autres sont mutuellement inhibants, c'est-à-dire qu'ils ne se lient pas simultanément à l'urokinase humaine.
Suivant la présente invention, l'ensemble d'anticorps monoclonaux tel que revendiqué trouve une application nouvelle pour la détection de l'urokinase humaine dans les fluides biologiques.
Par fluides biologiques, on comprend notament l'urine, les liquides tumoraux, par exemple les ascites et les milieux de culture cellulaire.
Pour la détection de l'urokinase humaine dans des fluides biologiques, un des anticorps monoclonaux est fixé sur une matrice solide, mis en contact avec un liquide biologique contenant l'urokinase humaine, ensuite avec un deuxième anticorps dudit ensemble marqué de manière connue, par exemple par radio activité ou par une enzyme. La matrice est d'une nature quelconque et peut être par exemple choisie parmi les matrices polymères solides telles que le chlorure de polyvinyle.
Le marquage du 2ème anticorps peut être obtenu de préférence, par un marquage enzymatique et plus particulièrement à la peroxydase qui peut ensuite réagir avec un substrat chromogénique et être ainsi décelé.
La réalisation du test sandwich en phase solide pour le dosage de l'urokinase humaine peut s'effectuer selon des procédés classiques mais on peut simplifier substantiellement le procédé en faisant incuber ensemble des anticorps non marqués et marqués dès le début de l'essai.
Le procédé de détection de l'urokinase humaine basé sur l'application de deux anticorps monoclonaux de l'ensemble pour un test sandwich en phase solide permet de détecter jusqu'à une concentration de 1 ng/ml dans des fluides biologiques.
Une autre application nouvelle de cet ensemble d'anticorps monoclonaux dirigés contre l'urokinase humaine consiste dans leur utilisation pour la purification de l'urokinase humaine.
La plupart des méthodes de purification de l'urokinase reposent sur la concentration de grands volumes d'urine ou de milieu de culture, sur une série de procédés chromatographiques classiques et/ou sur l'emploi de colonnes d'affinité portant des analogues des substrats naturels de l'urokinase.
L'utilisation de un ou plusieurs anticorps monoclonaux antiurokinase de l'ensemble revendiqué fournit un moyen simple et efficace de purifier l'urokinase. Dans le cadre de l'invention on a développé une méthode chromatographique basée sur l'emploi d'un ou de plusieurs anticorps monoclonaux faisant partie de l'ensemble tel que revendiqué.
La matrice solide utilisée est d'un type habituellement utilisé en chromatographie d'affinité. On utilise de préférence comme support solide l'Affi-gel 10 de Biorad Laboratories.
Pour une purification à l'échelle commerciale, l'affinité de l'anticorps monoclonal utilisé doit être suffisamment élevée pour que l'urokinase soit retenue de façon quantitative sur la colonne.
L'urokinase purifiée suivant la présente invention peut être utilisée dans des buts cliniques.
La préparation des anticorps monoclonaux s'effectue selon une technologie de fusion cellulaire classique,
<EMI ID=1.1>
1976, Eur.J.Immunol.6, 511, dans laquelle on fusionne des cellules de myélome avec des cellules de rate de souris qui ont été immunisées avec l'urokinase humaine. Les hybridomes ainsi obtenus sécrètent des anticorps monoclonaux contre l'urokinase humaine. Selon un aspect particulier de l'invention, les anticorps monoclonaux sont sécrétés par différents hybridomes.
Nous donnons ci-après une description, à titre d'exemple non limitatif, d'une méthode de préparation de l'ensemble des 18 anticorps monoclonaux contre l'urokinase humaine faisant l'objet de la présente invention.
Préparation des anticorps monoclonaux
1. Immunisation de souris
L'urokinase humaine (forme 33.000 daltons) est disponible en quantité suffisante et à l'état hautement purifié, et peut être utilisée comme antigène. Cette préparation a été utilisée pour immuniser des souris femelles (souche A/J) âgées de 8 semaines. On immunise tout d'abord les souris avec 100� g d'antigène émulsifié dans l'adjuvant complet de Freund et on injecte le mélange par voie sous-cutanée et intra-péritonéale. Trois semaines plus tard, les souris
<EMI ID=2.1>
dans l'adjuvant incomplet de Freund, par voie intra-péritonéale. Après une période de repos de 6 semaines, les souris reçoivent au jour -3 et -4 avant la fusion, respectivement 200,eg d'antigène (en NaCl
<EMI ID=3.1>
(en NaCl 0.15 M) par voie intra-péritonéale et intraveineuse. Au jour 0, on sacrifie les souris et prélève la rate pour la préparation des cellules destinées à la fusion cellulaire.
2. Fusion cellulaire
Pour effectuer la fusion cellulaire, on utilise les matières et les milieux suivants. On obtient chez GIBCO, le milieu DMEM que l'on complète avec du sérum de cheval (10 %), du sérum de veau (5 %), des acides aminés non essentiels, du pyruvate de sodium (lmM), de la pénicilline (100 U/ml) et de la streptomycine
(100 g/ml).
Le milieu de sélection complet (HAT) se compose du milieu décrit ci-dessus ainsi que d'hypoxanthine
(10 -4 M), d'aminoptérine (4.10 -7 M) et de thymidine
(1,5.10 -5 M) Le milieu solide contenant de l'agar
(1,5%) comporte les ingrédients décrits ci-dessus. Les cellules sont cultivées à 37[deg.] C dans une atmosphère humide de 5 % C02 et 95 % d'air.
La fusion avec une lignée cellulaire de myélome de souris (clones sélectionnés SP2/0-Agl4) est réalisée selon le procédé de Franssen, J.D., Hérion, P. and Urbain, J., 1981, Proc. XXIX Colloquium on Protides of the Biological Fluids, Peeters Ed. Selon ce protocole,
<EMI ID=4.1>
cellules de myélome de la lignée SP2/0-Agl4. Après chaque fusion, on distribue les cellules fusionnées dans des plaques de microculture à 96 puits en effectuant des dilutions de 10 en 10 fois . Les cultures sont alimentées au jour 5, 8, 11 et 13 après la fusion en remplaçant la moitié du milieu dans les puits par du milieu frais. Au jour 15 après la fusion,
<EMI ID=5.1> un radio-immunoessai en phase solide pour détecter la sécrétion d'anticorps contre l'urokinase.
3. Détection des hybridomes spécifiques de l'urokinase humaine par un test radio-immunoloqique en phase solide (SPRIA)
<EMI ID=6.1>
d'une solution 10 M en PBS pH 8) dans chaque puit de plaques PVC microwell LINBRO pendant une nuit à 4[deg.]C Après saturation des sites libres par de la sérum
<EMI ID=7.1>
surnageant des cultures cellulaires. La réaction a lieu pendant 16 h à 20[deg.]C. Après lavage au PBS pH 8, les anticorps fixés à l'urokinase immobilisée sont révélés par des immnoglobulines (Fab) de lapin anti-souris marquées à l'iode 125 (10.000 cpm/ng , 16 h à 20[deg.] C). Après lavage, les cupules sont séchées, découpées et comptées dans un compteur à scintillation gamma.
4. Propagation dans les ascites
5.105 cellules hybridomes ont été injectées intra-péritonéalement dans des souris (syngéniques ou FI progeny) qui ont été préalablement traitées au pristane.
5. Purification des anticorps monoclonaux au départ de liquide ascitique
Le procédé décrit par Staehelin, T., Mobbs, D.S., Hsiang-Fu, K., Chun-yen, L. and Pestka, S., 1981, J.Biol.Chem. 256, 9750, a été suivi dans son entièreté, si ce n'est que la DEAE a été remplacée par la DEAE Affi-gel Blue (Biorad) pour éliminer les protéases. Toutes les opérations se font à 4[deg.] C. Les fractions d'anticorps monoclonaux sont recueillies,
<EMI ID=8.1>
et dialysées contre un tampon carbonate 0,1 M pH 8,5.
6. Clonage et identification
Les cellules de vingt puits positifs dans le test
i SPRIA ont été propagées dans le milieu approprié puis clonées en agar mou. 18 lignées cellulaires sur les 20 analysées sécrètent des immunoglobulines. Ces lignées ont- été reclonées et retestées dans le système SPRIA. Ce protocole a permis de récupérer 18 hybridomes distincts sécrétant des anticorps monoclonaux antiurokinase. La classe d'Ig à laquelle appartiennent ces anticorps monoclonaux fut déterminée par test d'Ouchterlony sur le surnageant de culture des cellules. 14 anticorps monoclonaux appartiennent à la classe IgGl et 4 à la classe IgG2. Pour tous les anticorps monoclonaux, les chaines légères sont de type K..Les hybridomes ont été injectés et se sont propagés dans des ascites.
Les liquides ascitiques recueillis ont été analysés par le test SPRIA et par électrophorèse sur acétate de cellulose; ils contiennent en moyenne de 2 à 10 mg/ml d'anticorps monoclonaux anti-urokinase.
Plusieurs surnageants d'hybridome ou d'anticorps purifiés ont été analysés pour leur effet sur l'activité enzymatique de l'urokinase; l'essai met en oeuvre le substrat chromogénique S2444 (Kabi). Les résultats montrent qu'un seul anticorps monoclonal que l'on désigne par AAU18 inhibe l'activité enzymatique de l'urokinase.
La table 1 indique la classe d'immunoglobulines à laquelle appartiennent les anticorps monoclonaux de l'ensemble selon l'invention.
La table 2 donne le titre des liquides ascitiques pour quelques-uns des anticorps monoclonaux de l'ensemble selon l'invention.
La figure 1 montre l'inhibition de l'activité enzymatique de l'urokinase (A 405) par les anticorps <EMI ID=9.1> La figure 2 montre la spécificité des anticorps monoclonaux pour l'urokinase humaine .
TABLE 1
Classes d'immunoglobulines des anticorps monoclonaux
<EMI ID=10.1>
TABLE 2
Titres en anticorps des liquides ascitiques, déterminés par radioimmunoassay
<EMI ID=11.1>
Le titre est donné par le facteur de dilution des liquides ascitiques donnant lieu à 50 % de fixation de l'antigène marqué à l'iode 125.
L'inhibition de la fixation de l'urokinase marquée à l'125 1 (en ordonnée) sur les différents anticorps monoclonaux testés, AAU2 et AAU16, est donnée en fonction des concentrations en inhibiteur (en
<EMI ID=12.1>
obtenus avec un antisérum conventionnel sont également <EMI ID=13.1>
Les applications de cet ensemble de 18 anticorps monoclonaux contre l'urokinase humaine seront mieux comprises à l'aide des exemples non limitatifs suivants.
Exemple 1
Dosage de l'urokinase dans des fluides biologiques
Le dosage de l'urokinase dans des fluides biologiques tels l'urine ou des liquides tumoraux requiert un essai sensible et rapide. A cet égard, un immuno-essai basé sur l'emploi d'anticorps monoclonaux se révèle très satisfaisant.
Dans l'ensemble d'anticorps monoclonaux décrits dans l'invention, on a identifié les 2 anticorps monoclonaux les plus favorables à la mise au point du système de dosage. En fait, on choisit des anticorps monoclonaux qui se fixent à des épitopes distincts de l'urokinase et dont la fixation n'est pas mutuellement exclusive. On procède donc à la classification des anticorps monoclonaux selon l'épitope reconnu; ces informations sont reprises dans la table 3.
On choisit les anticorps monoclonaux AAU2 et AAU6 parce que d'une part, AAU2 se fixe très bien sur une matrice en polystyrène et que, d'autre part, AAU6 convient parfaitement au marquage par une enzyme, la peroxydase. On peut alors calibrer l'essai en procédant comme suit. Des plaques de polystyrène (NUNC Immunoplate I) sont recouvertes du premier anticorps monoclonal AAU2 (purifié selon Staehelin, T., Hobbs, D.S., Hsiang Fu Kung, Chun-Yen Cai and Pestka, S.,
1981, J.Biol.Chem.256, 9750-9754). Après saturation des sites libres, on incube l'anticorps immobilisé avec une solution témoin d'urokinase (concentration décroissante). On fait réagir ensuite le deuxième anticorps monoclonal AAU6 purifié et marqué à la peroxydase (O'Sullivan, M.J. and Marks, V., 1981, in "Methods in Enzymology" vol. 73, 147, Academic Press, New York).
On révèle ensuite la présence de complexes spécifiques par le substrat chromogénique de la peroxydase (orthophenylenediamine). On enregistre alors l'absorbance à 492 nm dans un lecteur automatique microelisa Dynatech AM120. On peut raccourcir l'essai tout en gardant une bonne sensibilité en incubant simultanément l'urokinase et le deuxième anticorps mono* clonal AAU6 marqué à la peroxydase. Lorsqu'on applique ces protocoles , on détecte l'urokinase jusqu'à une concentration de 2ng/ml L'essai est reproductible et peut être réalisé sur des plaques, préalablement recouvertes du premier anticorps monoclonal AAU2, conservées à 4[deg.]C pendant plusieurs jours ou séchées.
Le dosage de l'urokinase a été réalisé sur des échantillons d'urine humaine et sur des liquides tumoraux obtenus dans les hopitaux.
La figure 3 montre la courbe de dosage de l'urokinase utilisant le test selon l'invention. L'absorption à 492 nm (en ordonnée) est donnée en fonction de la concentration en urokinase ng/ml (en abscisse) pour un échantillon standard d'urokinase <EMI ID=14.1> pour un échantillon d'urine (A).
La table 4 donne la quantification de l'urokinase dans diverses tumeurs.
Exemple 2
Purification de l'urokinase humaine par chromatographie d'affinité
On a développé une méthode chromatographique basée sur l'emploi d'un anticorps monoclonal faisant partie de l'ensemble selon l'invention. Le choix du meilleur anticorps monoclonal repose sur la nécessité d'obtenir une récupération élevée de l'antigène sans perte d'activité de celui-ci.
TABLE 3
Spécificité d'épitope des anticorps monoclonaux dirigés contre l'urokinase humaine
<EMI ID=15.1>
AAU12 et AAU17 inhibent faiblement la fixation de AAU2 à l'urokinase humaine.
TABLE 4
Dosage de l'urokinase dans des fluides ascitiques
(asc.) et des effusions pleurales (e.p.) .
<EMI ID=16.1>
On a donc fixé 5 anticorps monoclonaux purifiés à de l'Affi-gel 10 (Biorad) dans les conditions décrites par le fournisseur, puis on a incubé ces anticorps immobilisés avec une solution d'urokinase. Après lavage , on a décroché l'urokinase et on a mesuré le taux de récupération ainsi que l'activité enzymatique de l'enzyme qui est mesurée à l'aide du substrat S2444, Kabi. On a trouvé que l'anticorps monoclonal AAU2 convient idéalement à la chromatographie d'affinité en ce sens que la récupération de l'urokinase est totale et qu'il n'y a pas de perte d'activité.
Les conditions de l'essai sont les suivantes :
incubation de l'urokinase avec l'anticorps immobilisé pendant 3 heures à 4[deg.]C en tampon PBS. Lavage de la colonne avec le tampon PBS puis avec un tampon phosphate (0,1 M pH 7,5) contenant 0,15 M NaCl et 0,1 % Tween 80. Elution de l'urokinase par un tampon 0,2 M
<EMI ID=17.1>
Les fractions sortant de la colonne sont immédiatement neutralisées avec du Tris 1 M pH 8, puis testées pour l'activité enzymatique. On peut vérifier par électrophorèse que l'urokinase éluée de la colonne est essentiellement pure et, sur base de l'activité enzymatique, que l'activité spécifique de l'enzyme est d'environ 140.000 IU/mg. On a déterminé que la capacité de la colonne d'affinité est de 2.5 mg d'urokinase par ml de support d'affinité. De plus, la colonne d'affinité portant l'anticorps monoclonal AAU2 peut être reconditionnée et réutilisée plusieurs fois sans perte des propriétés de fixation de l'urokinase.
Etant donné que l'on peut obtenir de l'ordre de 30 mg d'anticorps monoclonal purifié au départ du liquide d'ascite d'une souris, on peut réaliser des colonnes d'affinité de grande dimension et appliquer la méthode à la purification de l'urokinase au départ de grands échantillons d'urine humaine ou de milieu de culture de cellules humaines embryonnaires rénales.
La table 5 montre la purification de l'urokinase par chromatographie d'affinité.
TABLE 5
Purification de l'urokinase par chromatographie d'affinité utilisant l'anticorps monoclonal AAU2
<EMI ID=18.1>
L'activité totale récupérée de la colonne semble légèrement plus élevée que dans l'extrait brut; ceci pourrait être dû au démasquage de sites actifs.
REVENDICATIONS
1. Ensemble d'anticorps monoclonaux dirigés contre l'urokinase humaine caractérisé en ce que cet ensemble comporte 18 anticorps monoclonaux dont 14 sont d'isotype IgGl et 4 sont d'isotype IgG2, que ces
<EMI ID=19.1>
reconnaissent différents épitopes et qu'un des anticorps inhibe l'activité enzymatique de l'urokinase humaine.
2. Utilisation de cet ensemble d'anticorps monoclonaux dirigés contre l'urokinase humaine suivant la renvendication 1 pour la détection de l'urokinase humaine dans des fluides biologiques.
3. Utilisation de cet ensemble d'anticorps monoclonaux dirigés contre l'urokinase humaine suivant la
"Monoclonal antibodies to human urokinase"
This invention was made at the Free University of Brussels, Faculty of Sciences, Department of Molecular Biology, rue des Chevaux, 67, 1640 Rhode-Saint-Genèse (Belgium) by MM. P.Herion, Industrial Engineer; J. Urbain, Professor of Immunology; A. Bollen, Master of Research F.N.R.S.
Monoclonal antibodies to human urokinase
The present invention relates to monoclonal antibodies directed against the human protein urokinase.
Urokinase is a protein synthesized in the kidney and excreted in the urine. This protein works as an activator of plasminogen. In this regard, urokinase has a well-established therapeutic value since it leads to the dissolution of blood clots in vivo. Two forms of the enzyme are currently commercially produced, the heavy form, 54,000 daltons, and its shorter derivative,
33,000 daltons. The two protein species are used in human therapy to combat thromboembolic diseases. A number of tumors, such as ovarian carcinomas, produce relatively large amounts of urokinase. In this regard, the availability of a system for measuring urokinase in biological fluids could facilitate the early detection of tumors.
The methods for purifying urokinase from conventional sources, such as urine, or from culture medium for human embryonic renal cells, are based on conventional fractionation methods. A simple and economical purification system would reduce the cost of producing urokinase and expand its therapeutic use.
In the context of the invention, it has now been found that, for assaying urokinase in biological fluids and for purifying the enzyme, it is possible to use a set of monoclonal antibodies which are directed against human urokinase.
The invention relates to a set of 18 monoclonal antibodies directed against human urokinase. By "set" is meant all of the 18 antibodies.
According to the present invention, the set of monoclonal antibodies directed against human urokinase comprises 18 monoclonal antibodies of which 14 are of the IgG1 isotype and 4 are of the IgG2 isotype. All the antibodies in the set have a light chain of type K and differ in their isotype. Another characteristic of the set of monoclonal antibodies according to the invention is that an antibody inhibits the enzymatic activity of human urokinase. All the monoclonal antibodies in this set recognizing different epitopes of human urokinase.
It has also been shown that various monoclonal antibodies of this set are not mutually inhibiting, i.e. bind together to human urokinase, while others are mutually inhibiting, i.e. that they do not simultaneously bind to human urokinase.
According to the present invention, the set of monoclonal antibodies as claimed finds a new application for the detection of human urokinase in biological fluids.
Biological fluids include urine, tumor fluids, for example ascites and cell culture media.
For the detection of human urokinase in biological fluids, one of the monoclonal antibodies is fixed on a solid matrix, brought into contact with a biological liquid containing human urokinase, then with a second antibody of said set marked in known manner, by for example by radio activity or by an enzyme. The matrix is of any kind and can for example be chosen from solid polymer matrices such as polyvinyl chloride.
The labeling of the 2nd antibody can preferably be obtained by enzymatic labeling and more particularly with peroxidase which can then react with a chromogenic substrate and thus be detected.
The carrying out of the solid phase sandwich test for the assay of human urokinase can be carried out according to conventional methods but the method can be substantially simplified by incubating together unlabeled and labeled antibodies at the start of the test.
The human urokinase detection method based on the application of two monoclonal antibodies from the set for a solid phase sandwich test makes it possible to detect up to a concentration of 1 ng / ml in biological fluids.
Another novel application of this set of monoclonal antibodies directed against human urokinase consists in their use for the purification of human urokinase.
Most of the methods for purifying urokinase are based on the concentration of large volumes of urine or culture medium, on a series of conventional chromatographic procedures and / or on the use of affinity columns carrying analogues of the substrates. natural urokinase.
The use of one or more monoclonal antiurokinase antibodies from the claimed set provides a simple and effective means of purifying urokinase. In the context of the invention, a chromatographic method has been developed based on the use of one or more monoclonal antibodies forming part of the assembly as claimed.
The solid matrix used is of a type usually used in affinity chromatography. Preferably, the Affi-gel 10 from Biorad Laboratories is used as solid support.
For purification on a commercial scale, the affinity of the monoclonal antibody used must be sufficiently high for the urokinase to be retained quantitatively on the column.
The purified urokinase according to the present invention can be used for clinical purposes.
The preparation of the monoclonal antibodies is carried out according to a conventional cell fusion technology,
<EMI ID = 1.1>
1976, Eur.J. Immunol. 6, 511, in which myeloma cells are fused with mouse spleen cells which have been immunized with human urokinase. The hybridomas thus obtained secrete monoclonal antibodies against human urokinase. According to a particular aspect of the invention, the monoclonal antibodies are secreted by different hybridomas.
We give below a description, by way of nonlimiting example, of a method of preparation of all 18 monoclonal antibodies against human urokinase which is the subject of the present invention.
Preparation of monoclonal antibodies
1. Mouse immunization
Human urokinase (form 33,000 daltons) is available in sufficient quantity and in a highly purified state, and can be used as an antigen. This preparation was used to immunize female mice (strain A / J) 8 weeks old. The mice are first immunized with 100 # g of antigen emulsified in the complete Freund's adjuvant and the mixture is injected subcutaneously and intraperitoneally. Three weeks later, the mice
<EMI ID = 2.1>
in Freund's incomplete adjuvant, intraperitoneally. After a rest period of 6 weeks, the mice receive on day -3 and -4 before fusion, respectively 200, eg of antigen (in NaCl
<EMI ID = 3.1>
(in 0.15 M NaCl) intraperitoneally and intravenously. On day 0, the mice are sacrificed and the spleen is removed for the preparation of cells intended for cell fusion.
2. Cell fusion
The following materials and media are used to perform the cell fusion. The DMEM medium is obtained from GIBCO, which is supplemented with horse serum (10%), calf serum (5%), non-essential amino acids, sodium pyruvate (lmM), penicillin ( 100 U / ml) and streptomycin
(100 g / ml).
The complete selection medium (HAT) consists of the medium described above as well as hypoxanthine
(10 -4 M), aminopterin (4.10 -7 M) and thymidine
(1.5.10 -5 M) The solid medium containing agar
(1.5%) contains the ingredients described above. The cells are cultured at 37 ° C. in a humid atmosphere of 5% CO 2 and 95% air.
Fusion with a mouse myeloma cell line (selected clones SP2 / 0-Agl4) is carried out according to the method of Franssen, J.D., Hérion, P. and Urbain, J., 1981, Proc. XXIX Colloquium on Protides of the Biological Fluids, Peeters Ed. According to this protocol,
<EMI ID = 4.1>
myeloma cells of the SP2 / 0-Agl4 line. After each fusion, the fused cells are distributed in 96-well microculture plates, making 10-fold dilutions. The cultures are fed on day 5, 8, 11 and 13 after the fusion, replacing half of the medium in the wells with fresh medium. On day 15 after the merger,
<EMI ID = 5.1> a solid phase radioimmunoassay to detect the secretion of antibodies against urokinase.
3. Detection of specific hybridomas of human urokinase by a solid phase radioimmunoassay (SPRIA)
<EMI ID = 6.1>
of a 10 M solution in PBS pH 8) in each well of LINBRO microwell PVC plates overnight at 4 [deg.] C After saturation of the free sites with serum
<EMI ID = 7.1>
supernatant of cell cultures. The reaction takes place for 16 h at 20 [deg.] C. After washing with PBS pH 8, the antibodies attached to the immobilized urokinase are revealed by rabbit anti-mouse immunoglobulins (Fab) labeled with iodine 125 (10,000 cpm / ng, 16 h at 20 [deg.] C) . After washing, the wells are dried, cut and counted in a gamma scintillation counter.
4. Spread in ascites
5.105 hybridoma cells were injected intraperitoneally into mice (syngenic or IF progeny) which were previously treated with pristane.
5. Purification of monoclonal antibodies from ascites fluid
The method described by Staehelin, T., Mobbs, D.S., Hsiang-Fu, K., Chun-yen, L. and Pestka, S., 1981, J. Biol. Chem. 256, 9750, was followed in its entirety, except that the DEAE was replaced by the DEAE Affi-gel Blue (Biorad) to eliminate the proteases. All operations are carried out at 4 [deg.] C. The fractions of monoclonal antibodies are collected,
<EMI ID = 8.1>
and dialyzed against a 0.1 M carbonate buffer pH 8.5.
6. Cloning and identification
Cells from twenty positive wells in the test
i SPRIA were propagated in the appropriate medium and then cloned into soft agar. 18 of the 20 cell lines analyzed secrete immunoglobulins. These lines have been recloned and retested in the SPRIA system. This protocol made it possible to recover 18 distinct hybridomas secreting monoclonal antiurokinase antibodies. The Ig class to which these monoclonal antibodies belong was determined by an Ouchterlony test on the cell culture supernatant. 14 monoclonal antibodies belong to the IgGl class and 4 to the IgG2 class. For all monoclonal antibodies, the light chains are of the K type. The hybridomas were injected and propagated in ascites.
The ascites liquids collected were analyzed by the SPRIA test and by electrophoresis on cellulose acetate; they contain an average of 2 to 10 mg / ml of anti-urokinase monoclonal antibodies.
Several supernatants of hybridoma or purified antibodies were analyzed for their effect on the enzymatic activity of urokinase; the test uses the chromogenic substrate S2444 (Kabi). The results show that a single monoclonal antibody which is designated by AAU18 inhibits the enzymatic activity of urokinase.
Table 1 indicates the class of immunoglobulins to which the monoclonal antibodies of the assembly according to the invention belong.
Table 2 gives the titer of ascites liquids for some of the monoclonal antibodies of the assembly according to the invention.
FIG. 1 shows the inhibition of the enzymatic activity of urokinase (A 405) by the antibodies <EMI ID = 9.1> FIG. 2 shows the specificity of the monoclonal antibodies for human urokinase.
TABLE 1
Immunoglobulin classes of monoclonal antibodies
<EMI ID = 10.1>
TABLE 2
Antibody titers of ascites, determined by radioimmunoassay
<EMI ID = 11.1>
The titer is given by the dilution factor of ascites liquids giving rise to 50% of binding of the antigen labeled with iodine 125.
The inhibition of binding of 125 1-labeled urokinase (on the ordinate) to the different monoclonal antibodies tested, AAU2 and AAU16, is given as a function of the inhibitor concentrations (in
<EMI ID = 12.1>
obtained with a conventional antiserum are also <EMI ID = 13.1>
The applications of this set of 18 monoclonal antibodies against human urokinase will be better understood with the aid of the following nonlimiting examples.
Example 1
Determination of urokinase in biological fluids
The determination of urokinase in biological fluids such as urine or tumor fluids requires a sensitive and rapid test. In this respect, an immunoassay based on the use of monoclonal antibodies is very satisfactory.
In the set of monoclonal antibodies described in the invention, the 2 monoclonal antibodies most favorable for the development of the assay system have been identified. In fact, we choose monoclonal antibodies which bind to epitopes distinct from urokinase and whose binding is not mutually exclusive. We therefore proceed to the classification of monoclonal antibodies according to the recognized epitope; this information is given in table 3.
The monoclonal antibodies AAU2 and AAU6 are chosen because, on the one hand, AAU2 binds very well to a polystyrene matrix and, on the other hand, AAU6 is perfectly suitable for labeling with an enzyme, peroxidase. The test can then be calibrated by following these steps. Polystyrene plates (NUNC Immunoplate I) are covered with the first monoclonal antibody AAU2 (purified according to Staehelin, T., Hobbs, D.S., Hsiang Fu Kung, Chun-Yen Cai and Pestka, S.,
1981, J. Biol. Chem. 256, 9750-9754). After saturation of the free sites, the immobilized antibody is incubated with a control solution of urokinase (decreasing concentration). The second purified and labeled peroxidase AAU6 monoclonal antibody is then reacted (O'Sullivan, M.J. and Marks, V., 1981, in "Methods in Enzymology" vol. 73, 147, Academic Press, New York).
The presence of specific complexes is then revealed by the chromogenic substrate for peroxidase (orthophenylenediamine). The absorbance is then recorded at 492 nm in an automatic reader microelisa Dynatech AM120. The test can be shortened while maintaining good sensitivity by simultaneously incubating the urokinase and the second mono-clonal antibody AAU6 labeled with peroxidase. When these protocols are applied, urokinase is detected up to a concentration of 2 ng / ml. The test is reproducible and can be carried out on plates, previously coated with the first monoclonal antibody AAU2, stored at 4 [deg.] C for several days or dried.
The urokinase assay was performed on human urine samples and on tumor fluids obtained in hospitals.
Figure 3 shows the urokinase assay curve using the test according to the invention. The absorption at 492 nm (on the ordinate) is given as a function of the urokinase concentration ng / ml (on the abscissa) for a standard sample of urokinase <EMI ID = 14.1> for a urine sample (A).
Table 4 gives the quantification of urokinase in various tumors.
Example 2
Purification of human urokinase by affinity chromatography
A chromatographic method has been developed based on the use of a monoclonal antibody forming part of the assembly according to the invention. The choice of the best monoclonal antibody is based on the need to obtain a high recovery of the antigen without loss of activity thereof.
TABLE 3
Epitope specificity of monoclonal antibodies against human urokinase
<EMI ID = 15.1>
AAU12 and AAU17 weakly inhibit the binding of AAU2 to human urokinase.
TABLE 4
Determination of urokinase in ascites fluids
(asc.) and pleural effusions (e.p.).
<EMI ID = 16.1>
5 purified monoclonal antibodies were therefore attached to Affi-gel 10 (Biorad) under the conditions described by the supplier, and these immobilized antibodies were then incubated with a urokinase solution. After washing, urokinase was picked up and the recovery rate was measured as well as the enzyme activity of the enzyme which is measured using the substrate S2444, Kabi. It has been found that the monoclonal antibody AAU2 is ideally suited for affinity chromatography in the sense that the recovery of urokinase is complete and that there is no loss of activity.
The test conditions are as follows:
incubation of urokinase with the immobilized antibody for 3 hours at 4 [deg.] C in PBS buffer. Wash the column with PBS buffer and then with phosphate buffer (0.1 M pH 7.5) containing 0.15 M NaCl and 0.1% Tween 80. Elution of urokinase with 0.2 M buffer
<EMI ID = 17.1>
The fractions leaving the column are immediately neutralized with 1 M Tris pH 8, then tested for enzymatic activity. It can be verified by electrophoresis that the urokinase eluted from the column is essentially pure and, on the basis of the enzyme activity, that the specific activity of the enzyme is approximately 140,000 IU / mg. The capacity of the affinity column has been determined to be 2.5 mg urokinase per ml of affinity support. In addition, the affinity column carrying the monoclonal antibody AAU2 can be repackaged and reused several times without losing the binding properties of urokinase.
Since it is possible to obtain on the order of 30 mg of purified monoclonal antibody from the ascites liquid of a mouse, it is possible to produce large affinity columns and apply the method to the purification urokinase from large samples of human urine or culture medium from human embryonic kidney cells.
Table 5 shows the purification of urokinase by affinity chromatography.
TABLE 5
Purification of urokinase by affinity chromatography using the monoclonal antibody AAU2
<EMI ID = 18.1>
The total activity recovered from the column seems slightly higher than in the crude extract; this could be due to the unmasking of active sites.
CLAIMS
1. Set of monoclonal antibodies directed against human urokinase characterized in that this set comprises 18 monoclonal antibodies of which 14 are of isotype IgGl and 4 are of isotype IgG2, that these
<EMI ID = 19.1>
recognize different epitopes and one of the antibodies inhibits the enzymatic activity of human urokinase.
2. Use of this set of monoclonal antibodies directed against human urokinase according to claim 1 for the detection of human urokinase in biological fluids.
3. Use of this set of monoclonal antibodies directed against human urokinase according to the