Procédé peur l'extraction de silymarine à partir des nlantes, silymarine ainsi obtenue et son utilisation en thérapeutique.
L'invention concerne un procédé pour l'obtention de silymarine pure par extraction des fruits du chardon de Notre-Dame (Silybum marianum Gaertn.).
Par l'expression silymarine on entend selon l'état de
la technique le groupe de la silymarine, c'est-à-dire les
<EMI ID=1.1>
drogue (DE-AS 1 923 082).
<EMI ID=2.1>
brute C25H22010 et ont été caractérisées dans la littérature comme étant, du point de vue de la chimie structurale,
la silybine, la silydianine et la silychristine (DE-AS
1 923 082; PELTER, A. et HANSEL, R., Tetrahedron Letters, London 25, 2911, 1968; WAGNER, H., HOR HAMMER, L., SELIG-
MANN, 0. et FARNSWORTH, N.R., Tetrahedron Letters No. 31, pages 2675 - 2678, 1970; WAGNER, H., SELIGMANN, O., HOR-
HAMMER, L. et SEITZ, M., Tetrahedron Letters No. 22, pages
1895 - 1899, 1971). La silymarine IV est la taxifoline (DEAS 1 923 082).
La silymarine est un précieux médicament du foie et le mélange des différentes silymarines a, en raison d'un synergisme, une activité supérieure à la somme des activités
des différents isomères (DE-AS 1 923 082).
Grâce à la DE-AS 1 923 082 on connaît un procédé pour l'extraction de la silymarine (silymarines I-IV) , selon lequel les fruits séchés de Silybum marianum Gaertn. sont
pressés mécaniquement pour leur enlever la plus grande partie des huiles grasses. Par extraction complète (épuise-
ment) du résidu de pressage avec de l'acétate d'éthyle, évaporation de la solution d'acétate d'éthyle, reprise du résidu sec dans du méthanol aqueux, dégraissage par partage similaire multiple- à contre-courant et évaporation sous
vide jusqu'à siccité de la solution méthanolique dégraissée, on ob-
<EMI ID=3.1> tion totale de silymarine.
En tant qu'état de la technique supplémentaire on peut encore citer la DE-OS 2 020 407. Le procédé de cette DE-OS concerne l'isolement de la silymarine sans dégraissage préalable, par extraction globale directe au moyen d'un "rr�élange de solvantsconstitué d'alcool-eau-esters d'acides gras inférieurs ou hydrocarbures" et séparation des constituants gras "par distillation subséquente.de 10-40% du volume de la solution d'extraction obtenue, repos subséquent et élimination des graisses déposées au-dessus de la solution". Ce procédé ne conduit, selon la demande, qu'à un extrait à 40% de silymarine ; de plus la demande de brevet recommande une recristallisation avec le méthanol, sans autre indication en ce qui concerne d'éventuelles mesures
à prendre pour mettre en oeuvre le procédé. Lors d'une tentative de mise en oeuvre, ce procédé n'a pas été reproductible et dans le produit final il restait environ 13% des graisses d'origine.
Un autre procédé est connu par la DE-OS 2 017 789. Les produits finals de ce procédé devraient contenir 40 à 70% de silymarine et le rendement en produit final est de 0,8 à 2,4% au maximum (pour de la silymarine à 40%). Un essai de mise en oeuvre a montré que ce procédé également n'était pas reproductible.
De plus il existe dans l'état de la technique le brevet FR 72 14042 qui concerne la préparation d'un extrait à partir de silybum marianum,sans dégraissage préalable. Il est précisé que le produit final contient environ 82% de polyhydroxyphénylchromones ; 50% de ces 82% doivent représenter de la silymarine. On doit à ce propos remarquer que la silymarine appartient à une autre classe de composés, à savoir les polyhydroxyphénylchromanones, mais non les polyhydroxyphénylchromones. Ce procédé également n'est pas reproductible.
Jusqu'à présent on n'a pas réussi à améliorer considérablement le procédé de la DE-AS 1 923 082. D'une part on rencontre des difficultés dans la séparation des substances actives à partir de la drogue en préservant le mélange de silymarine présent et d'autre part dans la séparation de
<EMI ID=4.1> <EMI ID=5.1>
difficiles à éliminer- Ces difficultés n'ont été que partiellement surmontées selon la DE-AS 1 923 082.
Comme la silymarine est un précieux médicament pour le foie, il existe un besoin d'avoir la possibilité de disposer de silymarine à une forte concentration, supérieure à la concentration connue jusqu'à présent par l'état de la technique.
La présente invention a pour but de mettre au point un nouveau procédé pour l'extraction de silymarine pure (silymarines I-IV) qui soit dans une large mesure exempte d'impuretés et qui contienne tous les isomères naturels. Grâce à ce procédé, on pourra, de façon simple, obtenir un produit particulièrement pur et des rendements élevés.
On a trouvé de façon surprenante un procédé qui évite les inconvénients des méthodes connues et,qui conduit par une voie économique à de la silymarine pure (silymarines I-IV) (pureté de 90-96%) .
Le procédé selon l'invention pour l'obtention de silymarine (silymarines I-IV) selon lequel on débarrasse les fruits de silybum marianum d'une grande partie de l'huile grasse par extraction par pression à froid, on broie la masse extraite par pression, on extrait le résidu d'extraction par pression avec de l'acétate d'éthyle, on évapore l'extrait d'acétate d'éthyle et on traite, est caractérisé en ce que a) on extrait le résidu d'extraction par pression plusieurs fois avec de l'acétate d'éthyle anhydre et on sépare les extraits du résidu, b) ou bien l'on dégraisse le résidu d'évaporation a) des extraits à l'acétate d'éthyle combinés par extraction solide-liquide répétée à l'éther de pétrole, ou b') on dissout le résidu d'évaporation a) dans le méthanol et on dégraisse la solution par extraction liquideliquide répétée à l'éther de pétrole, c)
ou bien on dissout largement le résidu dégraissé b) dans le méthanol et on sépare la solution des constituants insolubles, ou
<EMI ID=6.1>
de l'éther de pétrole, d) on ajoute à la solution méthanolique c) ou cI) un alcane inférieur chlorosubstitué en tant que solvant et de l'eau, on extrait, on sépare la solution hydrométhanolique et on la conserve, e) on mélange intimement la phase du solvant chloré plusieurs fois avec du méthanol et de l'eau sous agitation et l'on sépare par décantation, f) on évapore les phases hydrométhanoliques combinées, g) on met le résidu d'évaporation en suspension dans' un peu de méthanol, on introduit ensuite la suspension dans de l'eau en agitant et on lave plusieurs fois le précipité à l'eau après centrifugation, et h) on sèche le précipité sous vide, on le broie et on le sèche de nouveau sous vide.
Un mode préféré de mise en oeuvre du procédé selon l'invention est caractérisé en ce que a) on extrait le résidu d'extraction par pression sous agitation puissante, dans une proportion de 1:8 à 1:12, de préférence 1:10, à une température de 65 à 76[deg.]C, de préférence de 75[deg.]C, 2 à 4 fois, de préférence 3 fois, pendant à chaque fois 1/2 heure à 1 heure 1/2, de préférence 1 heure,avec de l'acétate d'éthyle anhydre et on sépare la drogue extraite, <EMI ID=7.1> réunis à 40 - 55[deg.]C, de préférence 50[deg.]C, sous vide à 15 mbar, on dégraisse le résidu d'évaporation a) par extraction solideliquide à l'éther de pétrole 60/70[deg.] dans une proportionde 1:15 à 1:25, de préférence 1:20, répétée trois fois pendant 10 à 20 minutes, de préférence 15 minutes, ou
b') on dissout le résidu d'évaporation a) dans 6 à 10 fois, de préférence 8 fois, son poids de méthanol, on sépare les constituants restant non dissous,, on dégraisse par extraction liquide-liquide à l'éther de pétrole (domaine d'ébullition 60/700C) dans une proportion de 1:1,5 à 1:2,5, <EMI ID=8.1>
nutes, de préférence 15 minutes, c) ou bien on dissout le résidu dégraissé b) dans 6 à
10 fois, de préférence 8 fois, son poids de méthanol et on sépare les constituants restant non dissous, ou
ci) on sépare la solution méthanolique dégraissée b') de l'éther de pétrole, d) on ajoute le même volume de chloroforme et le même volume d'eau à la solution méthanolique c) ou c') et on. a gite puissamment le mélange pendant environ 15 minutes et on sépare par décantation, e) on mélange 5 fois sous agitation puissante la phase chloroformique avec du méthanol et de l'eau dans les proportions en volume de 1:1:1, à chaque fois pendant 15 minutes et on sépare ensuite la phase chloroformique, <EMI ID=9.1> de à 15 mbar les phases hydrométhanoliques combinées,
g) on met le résidu d'évaporation en suspension dans
<EMI ID=10.1>
rence 1:5, et on introduit la suspension en agitant dans 8 à 12 fois, de préférence 10 fois son volume d'eau, de même que l'on lave plusieurs fois à l'eau le résidu après
centrifugation,
h) on sèche le précipité 20 à 30, de préférence 24 heures, à une température de 30 à 50[deg.]C, de préférence 40[deg.]C, sous vide à 10 mbar, ensuite on broie et on sèche de nouveau le produit broyé sous vide à 10 mbar, également à une
<EMI ID=11.1>
base de la substance anhydre.
En ce qui concerne la technologie de mise en oeuvre, les différentes étapes et les mesures spécifiques sont choisies de manière à ce que le mélange de substances actives présent dans la drogue soit pratiquement isolé en totalité. Si l'on s'écartait de ces étapes de procédure, l'un ou l'autre des composés serait totalement ou en partie perdu. Cette difficulté croît avec le degré d'enri- <EMI ID=12.1>
culier dans les étapes avancées du procédé,étant donné que les substances actives recherchées ont tendance à être perdues en partie sous forme de composés isolés ou de mélange global avec les impuretés à éliminer.
Le procédé selon l'invention prend ce point en considération de sorte qu'il conduit à un produit pur avec un rendement optimal en obtenant dans une large mesure la proportion d'isomères qui se trouve dans la drogue.
De manière surprenante on ne parvient au produit avantageux recherché que grâce à la combinaison de mesures particulières de mise en oeuvre du procédé, de solvants ou respectivement systèmes de solvants et de conditions physiques ou respectivement chimiques choisie.
Grâce à l'extraction par pression à froid des fruits de silybum marianum, on empêche la dégradation chimique
ou la polymérisation de la silymarine et on évite l'émulsification intime de la silymarine et des- impuretés dans l'huile grasse ce qui serait nuisible pour la séparation subséquente. La drogue est en partie dégraissée par l'extraction sous pression. Environ 25 - 30% de l'huile sont extraits par pression.
L'étape de broyage fin permet une extraction subséquente plus rapide car l'agent, d'extraction peut pénétrer plus facilement dans les particules de drogue.
Il est dans ce procédé décisif que l'extraction à l'acétate d'éthyle soit effectuée avec de l'acétate d'éthyle
<EMI ID=13.1>
étapes suivantes du procédé, séparer les impuretés. Cet effet surprenant est, en combinaison avec les autres mesures particulières du procédé,décisif pour le succès du procédé, à savoir l'obtention de silymarine pure.
La proportion drogue/solvant dans l'extraction à l'acé-
<EMI ID=14.1>
de telle sorte qu'elle garantisse, sans excès inutiles, la dissolution de la silyuarine de façon spécifique et avec ménagement. L'extraction répétée 2 à 4 fois, de préférence 3 fois, permet l'extraction complète de la silymarine à
<EMI ID=15.1>
férence 7 5[deg.]C, est favorable à une bonne dissolution des substances actives et ne conduit pas simultanément à des phénomènes de décomposition des produits chimiques alors présents.
L'agitation poussée avec un agitateur intensif entraîne un "ameublissement" mécanique de la drogue, ce qui favorise l'extraction. La faible durée choisie lors de chacune des nombreuses extractions, de 1/2 heure à 1 heure 1/2, de préférence 1 heure, permet cependant d'effectuer une extraction avec épuisement.
Les extraits à l'acétate d'éthyle combinés sont éva-
<EMI ID=16.1>
nagée.
Le dégraissage solide-liquide subséquent, répété plusieurs fois, du résidu à l'éther de pétrole avec un.. proportion relativement élevée de résidu par rapport à l'éther de pétrole, de par exemple environ 1:20, présente l'avantage de permettre de séparer complètement l'huile grasse dans un temps court et sans grande dépense en ce qui concerne l'appareillage. Facultativement on peut dissoudre le résidu d'évaporation dans environ 8 fois son poids de méthanol, séparer les constituants non dissous et effectuer ensuite une extraction liquide-liquide répétée avec de l'éther de pétrole, dans une proportion d'environ 1:2. Les résultats sont pratiquement les mêmes.
Le méthanol, en tant que solvant relativement peu coûteux, convient particulièrement bien, en raison de sa grande capacité de solvatation, à la dissolution du résidu dégraissé. La silymarine (silymarines I-IV) s'y dissout relativement bien. La proportion élevée résidu/solvant est
<EMI ID=17.1>
lymarines 1-IV). Dans le résidu il n'y a plus de silymarine.
Il est nouveau et particulièrement inventif d'utiliser des solvants organiques chlorés, en particulier des alcanes inférieurs chlorosubstitués comme le chloroforme, le chlorure de méthylène, le 1, 2-dichloroéthane, de préférence le chloroforme, pour éliminer les impuretés restant encore de la silymarine (silymarines I-IV) sans que la silymarine dans son ensemble ne subisse une perte et également sans qu'aucun isomère ne disparaisse. Grâce à cela; la séparation d'autres impuretés lipophiles, qui n'avaient pas été éliminées dans l'étape de dégraissage avec l'huile et l'éther de pétrole, de même que d'autres impuretés moins polaires qui certes avaient d'abord été dissoutes dans le méthanol mais qui se comportaient de façon correspondante dans un système de phases de partition.
L'équilibre en solution diagramme de phase - du système de solvants choisi - tant en ce qui concerne sa nature que sa quantité -, dans ce cas méthanol-eau-chloroforme 1:1:1, est en présence de la silymarine (silymarines I-IV) et d'éventuelles impuretés encore présentes, particulièrement approprié car avec ce système de solvants on obtient de bonnes séparations en deux phases. La zone de dissociation du diagramme de phase comprend les proportions de solvants indiquées.
Le coefficient de partition de la silymarine (silymarines I-IV) entre les deux phases est très élevé. Après avoir effectué six extractions dans le système méthanol/ chloroforme/eau 1/1/1 (v/v/v) on obtient une proportion de silymarine dans les phases hydrométhanoliques combinées par rapport à la silymarine restant dans la phase chloroformique de 13:1. Ce grâce à quoi on peut extraire pratiquement toute la silymarine (silymarines I-IV) de la phase méthanolique.
Selon l'invention on a pu, de manière surprenante, obtenir que les silymarines I à IV restent également dans la phase hydrométhanolique sous forme de composés individuels, dans les mêmes proportions, de sorte que la proportion des isomères soit maintenue.
La phase hydrcméthanolique est évaporée jusqu'à siccité, de façon ménagée, à une température basse et sous vide et le résidu est mis en suspension plusieurs fois dans l'eau pour être lavé complètement. Cette étape de lavage s'est révélée avantageuse pour remédier aux occlusions dues à des impuretés dans le produit qui se produisent lors des f�ltrations normales.
Par rapport aux procédés de l'état de la technique, le procédé selon l'invention présente l'avantage de conduire de façon simple à une silymarine (silymarines I-IV) pure
à 90 - 96% avec un rendement d'environ 1,7%. Seule la combinaison selon l'invention des mesures opératoires choisies avec utilisation d'acétate d'éthyle anhydre et d'un alcane substitué par le chlore, comme le chloroforme, conduit de façon surprenante à l'obtention de silymarine très pure à partir des fruits de silybum marianum.
L'effet de l'extraction de la drogue à l'acétate d'éthyle anhydre est à signaler comme particulièrement inven-
tif par rapport à l'état de la technique. Grâce à cette extraction les substances hydrophiles de la drogue restent dans le résidu. Lors des étapes subséquentes comme la partition dans les solvants, il n'est normalement plus nécessaire de séparer dans une large mesure ces impuretés hydrophiles de la silymarine.
De plus est particulièrement surprenante l'activité de partition des solvants d'un alcane inférieur chlorosubstitué, en particulier le chloroforme, dans la deuxième phase du procédé en raison de la sélectivité spécifique, pratiquement toutes les impuretés présentes lors de cette étape de mise en oeuvre du procédé étant alors éliminées, de sorte que la silymarine reste largement pure dans la solution méthanolique.
Exemples d'extraction de la silymarine (silymarines 1-IV)
Exemple 1 :
300 kg de fruits de chardon de Notre-Dame extraits par
pression à froid et finement broyés sont additionnés de
3000 1 d'acétate d'éthyle anhydre et chauffés à 75[deg.]C. A
cette température, on agite énergiquement le mélange avec un agitateur intensif pendant une heure. Ensuite on filtre et on extrait le résidu de drogue encore deux fois, comme décrit, avec de l'acétate d'éthyle.
Les solutions d'acétate d'éthyle clarifiées et
<EMI ID=18.1>
vide à 15mbar. Pour dégraisser, on agite bien le résidu à la température ambiante trois fois avec des portions de 300 1 d'éther de pétrole
60/70[deg.], 15 minutes et on chasse ensuite le solvant sous vide. Le produit brut ainsi obtenu est repris dans une quantité quadruple de méthanol, la matière solide ne passant pas en solution est alors séparée par centrifugation, lavas deux fois avec des portions de méthanol égales à la moitié des quantités mentionnées et enfin - comme elle ne contient pratiquement pas de silymarine séparé e.
Les solutions méthanoliques combinées sont ensuite additionnées de chloroforme, puis d'eau dans une proportion volumétrique de 1:1:1 et transférées dans un récipient de décantation. Après agitation puissante du mélange pendant 15 minutes et séparation des phases, on élimine la
<EMI ID=19.1>
1:1:1 avec du méthanol-eau. Ensuite on sépare
la phase chloroformique.
Les phases hydrométhanoliques combinées sont évaporées à 50[deg.]C sous vide à 15 mbar et le résidu est mis en suspension dans cinq fois la même quantité de méthanol. La suspension est ajoutée, sous forme d'un jet fin, à dix fois le même volume d'eau puis agitée puissamment pendant 15 minutes. Ensuite on centrifuge et on lave le produit de centrifugation,en suspension,plusieurs fois avec de l'eau. Le produit est séché à l'é-
<EMI ID=20.1>
et séché encore pendant 48 heures supplémentaires
<EMI ID=21.1> <EMI ID=22.1>
On obtient une poudre colorée en beige clair avec une teneur en silymarine de 90 - 96% (déterminée selon la méthode à la dinitrophénylhydrazine
(méthode à la DNPH) en procédant de façon analogue à la détermination de la silymarine dans les fruits du chardon de Notre-Dame, DAB VII édition 1968, second supplément 1975, page 198, ainsi que selon l'interprétation quantitative des courbes de réflexion ou "courbe de rémission") .
L'identification a été effectuée par chromatographie en couches minces.
La proportion relative des différents isomères a été déterminée par interprétation quantitative des courbes de réflexion (voir figure unique).
<EMI ID=23.1>
drogue sèche.
Exemple 2 :
300 kg de fruits de chardon de Notre-Dame extraits par
pression à froid et finement pulvérisés sont additionnés de
3000 1 d'acétate d'éthyle anhydre et chauffés à 75[deg.]C. A
cette température on agite puissamment, pendant une heure, le mélange avec un agitateur intensif.
Ensuite on filtre et on extrait encore deux fois à l'acétate d'éthyle le résidu de drogue , comme décrit.
Les solutions d'acétate d'éthyle clarifiées et
<EMI ID=24.1>
sous vide à 15 mbar.
Le résidu d'évaporation est dissous avec 120 1 de méthanol et les substances solides qui ne passent pas alors en solution sont éliminées par c.entrifugation. La solution méthanolique est soumise
3 fois pendant 15 minutes à une extraction liquide-liquide avec des portions de 135 1 d'éther de pétrole.
La solution méthanolique est d'abord additionnée de chloroforme, ensuite d'eau dans une proportion
<EMI ID=25.1> volumétrique de 1:1:1 et transférée dans un récipient de décantation.
Après avoir agité puissamment le mélange pendant
15 minutes et obtention d'une séparation des phases, on sépare la phase inférieure (phase chloroformique) et on extrait encore 5 fois, pendant 15 minutes avec du méthanol et de l'eau, également dans une proportion volumétrique de 1:1:1. On se' pare ensuite la phase chloroformique.
Les phases hydrométhanoliques combinées sont évaporées à 50[deg.]C sous vide à 15 mbar et le résidu
est mis en suspension dans 5 fois la même quantité de méthanol. La suspension est introduite sous agitation, sous forme d'un et fin, dans 10 fois son volume d'eau et agitée puissamment ensuite pendant 15 minutes. Ensuite on centrifuge
et on lave le produit de centrifugation, en suspension, plusieurs fois avec de l'eau. Le produit est séché à l'étuve sous vide pendant 24
<EMI ID=26.1>
Le procédé conduit à une silymarine à 90 - 96% de la même qualité que dans l'exemple 1.
Exemple 3 :
Les mêmes caractéristiques de mise en oeuvre du procédé en utilisant du chlorure de méthylène à la place du chloroforme conduisent à une silymarine à 90 - 94%.
<EMI ID=27.1>
Exemple 4 :
Les mêmes caractéristiques de mise en oeuvre du procédé avec utilisation de 1,2�dichloroéthane au lieu de chloroforme conduisent à une silymarrne à 90 - 93%. Le rendement est de 1,8%.
Pour tous .les exemples :
Le degré de pureté et les petites variations dans le rendement dépendent de la drogue.
REVENDICATIONS
1. Procédé pour l'obtention de silymarine (silymarines
<EMI ID=28.1>
rianum d'une grande partie de l'huile grasse par extraction par pression à froid, on broie la masse extraite par pression, on extrait le résidu d'extraction par pression avec de l'acétate d'éthyle, on évapore l'extrait d'acétate d'éthyle et on traite., caractérisé en ce que a) on extrait le résidu d'extraction par pression plusieurs fois avec de l'acétate d'éthyle anhydre et on sépare les extraits du résidu, b) ou bien l'on dégraisse le résidu d'évaporation a) des extraits à l'acétate d'éthyle combinés par extraction solide-liquide répétée à l'éther de pétrole, ou
b') on dissout le résidu d'évaporation a) dans le méthanol et on dégraisse la solution par extraction liquideliquide répétée à l'éther de pétrole, c) ou bien on dissout largement le résidu dégraissé b) dans le méthanol et on sépare la solution des constituants insolubles, ou c') on sépare la solution méthanolique dégraissée b')
de l'éther de pétrole, d) on ajoute à la solution méthanolique c) ou c') un alcane inférieur chlorosubstitué en tant que solvant et de l'eau, on extrait, on sépare la solution hydrométhanolique et on la conserve, e)on mélange intimement la phase du solvant chloré plusieurs fois avec du méthanol et de l'eau sous agitation et l'on sépare par décantation, f) on évapore les phases hydrométhanoliques combinées, g) on met le résidu d'évaporation en suspension dans
un peu de méthanol, on introduit ensuite la suspension dans
de l'eau en agitant et on lave plusieurs fois le précipité
à l'eau après centrifugation, et
h) on sèche le précipité sous vide, on le broie et on
le sèche de nouveau sous vide.