<EMI ID=1.1> La présente invention concerne des procédés de préparation de L-leupeptines par fermentation, de même que leur extraction et leur purification à partir de bière de fermentation.
Les leupeptines sont des inhibiteurs d'enzymes
qui ont été découverts par Umezawa et ses collaborateurs dans des filtrats de culture de Streptomyces, roseus et d'une grande variété de micro-organismes de Streptomyces. Les structures chimiques
des leupeptines sont représentées par la formule générale suivante :
<EMI ID=2.1>
<EMI ID=3.1>
t
CH3 CH3
<EMI ID=4.1>
Ces leupeptines sont des substances utiles ayant une faible toxicité et exerçant des activités inhibitrices de protéases telles que des activités anti-plasmine et anti-trypsine, de même que des effets anti-inflammatoires et différents autres effets pharmacologiques (voir Brevet Japonais n[deg.] 595.140, Brevet des Etats-Unis d'Amérique n[deg.] 3.840.513).
Les composants principaux des leupeptines obtenues jusqu'à présent par fermentation sont le propionyl- et l'acétyl-Lleucyl-L-leucyl-DL-argininal comportant chacun un groupe argininal de la configuration stérique DL (ces leupeptines étant appelées ci-après "DL-leupeptines" ou "forme DL") [Kondo, S. et al.,
<EMI ID=5.1>
Unis d'Amérique n[deg.] 3.840.513].
Jusqu'à la présente invention, les L-leupeptines n'ont jamais été obtenues par fermentation et, par conséquent, on a considéré que les DL-leupeptines étaient préparées par fermentation.
Shimizu et al. ont effectué la synthèse chimique
de leupeptines comportant un groupe argininal de configuration L
(ces leupeptines étant appelées ci-après "L-leupeptines" ou
"forme L"), ainsi que d'autres leupeptines comportant un groupe argininal de configuration D (ces leupeptines étant appelées ci-après "D-leupeptines" ou "forme D"). Sur la base d'essais biochimiques, ils ont confirmé que le principe actif responsable des effets inhibiteurs exercés sur les enzymes était les L-leupeptines, tandis que les D-leupeptines sont inactives et que les DL-leupeptines obtenues par fermentation n'exercent que la moitié de l'activité des L-leupeptines [Shimizu, B. et al., "J. Antibiotics", 25, 515 (1972) ; Umezawa, H., "Enzyme Inhibitors of Microbial Origin", "University of Tokyo Press" (1972), pages 24-25].
La Demanderesse a entrepris des études poussées
sur le procédé de fermentation, ainsi que sur les procédés d'extraction et de purification et, suite à ces études, elle a découvert pour la première fois les faits mentionnés ci-après et ces découvertes ont abouti à la présente invention.
Un objet de la présente invention est de fournir
de nouveaux procédés pour la préparation de L-leupeptines par fermentation.
Un autre objet de la présente invention est de fournir de nouveaux procédés pour l'extraction et la purification de L-leupeptines formées dans un bouillon de culture par fermentation.
D'autres objets et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture de la description ci-après.
La figure 1 des dessins annexés représente le déroulement de la racémisation de la L-leupeptine obtenue par le procédé de la présente invention et ce, en termes d'activité relative et de pouvoir rotatoire spécifique, mesurés tous deux en fonction de la période de conservation exprimée en jours. La figure 2 donne les spectres d'absorption des rayons infrarouges du chlorhydrate de L-leupeptine (en traits pleins) obtenu par le procédé de la présente invention, ainsi que du chlorhydrate de DL-leupeptine préparé par le procédé classique de fermentation et d'extraction (traits discontinus).
(1) Lors de la fermentation de la leupeptine au cours de laquelle le pH du milieu de culture est maintenu dans
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milieu tandis que, lorsque la réaction du milieu est déplacée vers le domaine alcalin, on obtient des DL-leupeptines. Même lorsque le pH du milieu de culture est maintenu dans l'intervalle
<EMI ID=7.1>
de L-leupeptines ait atteint. le maximum, provoque une racémisation partielle des L-leupeptines accumulées en donnant des L-leupeptines contaminées par la forme D.
(2) Les L-leupeptines purifiées subissent également une r-acémisation progressive dans un milieu légèrement alcalin
(par exemple, d'un pH de 8) dans des conditions thermiques modérées, Epar exemple, 23[deg.]C) et elles sont amenées complètement à la forme
DL après plusieurs jours.
(3) Dans des procédés de purification spécifiques connus, les leupeptines du filtrat de culture sont soumises à des traitements d'adsorption et de désorption en utilisant une colonne de charbon actif ou d'une résine échangeuse. d'ions du type à base d'un acide carboxylique, par exemple, "Lewatit CNP" (marque commerciale pour une résine échangeuse de cations contenant un groupe d'acide carboxylique, fabriquée par "Bayer Co.") ou "Amberlite IRC-50" (marque commerciale pour une résine échangeuse de cations contenant un groupe d'acide carboxylique, fabriquée par "Rohm
and Haas Co.") sous forme H, sous forme Na ou sous forme mixte.
Dans le cas des résines échangeuses de cations du type comportant un groupe d'acide carboxylique, la forme H ne provoque pas la racémisation des L-leupeptines, mais elle n'est pas économique par suite de sa faible capacité d'adsorption, tandis que la forme Na possède une capacité d'adsorption plus faible encore et provoque, en outre, une racémisation complète. Bien qu'un type mixte des formes H et Na dans un rapport approprié (7-8 : 3-2 en volume) soit supérieur à n'importe quel autre adsorbant connu en raison de sa capacité d'adsorption maximale et de ses hauts rendements d'adsorption et de désorption, ce type n'est cependant pas approprié pour obtenir des L-leupeptines, car il provoque une forte racémisation, même si les traitements sont effectués dans des conditions faiblement ou modérément acides.
(4) Le procédé comportant l'adsorption de leupeptines provenant d'un filtrat de culture sur du charbon actif avec désorption ultérieure au moyen d'un solvant organique acide aqueux (par exemple, du méthanol à 80% d'un pH de 2) donne des DL-leupeptines lorsqu'il est appliqué à la bière fermentée par les procédés classiques sans contrôle du pH. La Demanderesse a trouvé que ce procédé donnait des L-leupeptines lorsqu'il était appliqué à la bière préparée par les procédés mis au point suivant la présente invention. Toutefois, le rendement est faible (30 à
<EMI ID=8.1>
ou l'alumine, le charbon actif est un adsorbant que l'on emploie utilement lors de la chromatographie en colonne effectuée au cours de l'étape de purification ultérieure.
(5) Le procédé de la présente invention, dans lequel on utilise une résine adsorbante non ionique poreuse, est applicable à la fois à la première étape d'extraction-purification impliquant l'adsorption de leupeptines à partir d'un filtrat de culture et la désorption des leupeptines adsorbées, ainsi qu'à la dernière étape de la purification complémentaire des L-leupeptines de la solution contenant des L-leupeptines préalablement purifiées, l'application à la première étape étant particulièrement avantageuse.
Lorsqu'un filtrat de culture contenant des leupeptines est traité conformément au procédé de la présente invention, on observe des avantages nettement supérieurs à ceux de n'importe quel autre procédé connu, par exemple, une capacité d'adsorption de loin plus élevée que dans n'importe quel procédé classique, l'absence de racémisation de L-leupeptines et un haut rendement d'environ 90% lors de l'étape d'adsorption-désorption.
(6) En ajoutant de la L-leucine,de la L-arginine
(sous forme de chlorhydrate) et de la glycine en une quantité de
<EMI ID=9.1>
la production de L-leupeptines est accrue 4 à 6 fois comparativement à celle obtenue dans les procédés classiques.
(7) Le rendement en L-leupeptines est porté à une valeur aussi élevée que 7 à 10 fois celui obtenu par les procédés classiques en ajoutant, au milieu ci-dessus contenant les acides aminés précités, au moins une des différentes substances organiques naturelles telles que les acides ribonucléiques, l'extrait de levure et l'hydrolysat de caséine.
(8) Lorsqu'on utilise un milieu de fermentation contenant les trois acides aminés précités (ce milieu ne contenant pas plus de 0,3% (poids/volume) d'acides aminés, y compris les acides aminés eux-mêmes et les substances en contenant, par exemple, les peptides, les protéines, etc., autres que les trois acides
<EMI ID=10.1>
d'acétyl-L-leucyl-L-leucyl-L-argininal seul et elle ne contient aucune autre leupeptine comportant un groupe propionyle, un groupe isoleucine ou un groupe valine.
Par la\mise en oeuvre de la présente invention sur la base des découvertes précitées, on a mis au point pour la première fois des procédés de préparation de L-leupeptines (qui sont une formé active) avec de hauts rendements par fermentation. De même, une découverte importante pour la production d'une seule leupeptine de qualité constante réside dans le fait que l'on peut
<EMI ID=11.1>
L-leucyl-L-argininal avec de hauts rendements en effectuant le procédé de la présente invention avec un milieu de culture contenant de la L-leucine, de la L-arginine (sous forme de chlorhydrate)
<EMI ID=12.1>
compris les acides aminés eux-mêmes et les substances en contenant telles que les peptides, les protéines, etc., autres que les trois acides aminés précités.
Les avantages de la présente invention sont illustrés dans les exemples expérimentaux ci-après.
Suivant la présente invention, on mesure la puissance des leupeptines de la manière suivante :
A 2,5 ml d'une solution 1,25 x 10-4M du chlorhydrate d'ester méthylique de p-toluène-sulfonyl-L-arginine dans un tampon tris d'un pH de 8,1, on ajoute 0,5 ml d'une solution de leupeptine préparée de telle sorte que la concentration puisse atteindre environ 8 mcg (puissance)/ml. Après pré-incubation à 32[deg.]C pendant 5 minutes, à ce mélange, on ajoute 0,1 ml d'une solution aqueuse de trypsine (7,5 mcg/ml). Immédiatement après incubation à 32[deg.]C pendant 30 minutes, on soumet le mélange réactionnel à un essai
de détermination de la capacité d'absorption à .247 nm pour obtenir la valeur d'essai. La valeur témoin est obtenue de la même manière que celle indiquée ci-dessus, avec cette exception que l'on n'ajoute pas de leupeptine. On calcule le degré d'inhibition de la trypsine en divisant, par la valeur témoin, la différence entre cette valeur témoin et la valeur d'essai. Suivant ce procédé d'essai, la con-
<EMI ID=13.1>
d'acétyl-L-leucyl-L-leucyl-L-argininal de la pureté la plus élevée est de 0,98 mcg/ml. On utilise cette substance comme échantillon de référence et la puissance des leupeptines est exprimée en poids
(par exemple, en mcg et en mg (puissance)).
Les DL-leupeptines de la pureté la plus élevée que l'on obtient par les procédés classiques de fermentation et
<EMI ID=14.1>
On mesure la teneur en L-leupeptines d'un mélange
de L-leupeptines et de D-leupeptines de la manière décrite ci-après.
On forme une solution aqueuse des leupeptines soumises à l'essai et, avec du permanganate de potassium, on oxyde
en acides de leupeptines (la fraction argininal de la leupeptine
est oxydée pour former de l'arginine). On purifie les acides
obtenus et on les isole par chromatographie sur du charbon actif
et sur de l'alumine acide. On hydrolyse les acides isolés avec de l'acide chlorhydrique 6N à 110[deg.]C pendant 24 heures. On détermine la teneur totale en arginine de l'hydrolysat au moyen d'un instrument d'analyse des acides aminés. D'autre part, on détermine la teneur
en L-arginine de l'hydrolysat par dosage biologique en utilisant
des bactéries d'acide lactique. On suppose que la teneur en L-arginine (%) de la quantité totale d'arginine est égale à la
teneur en L-leupeptines (pourcentage de forme L) de la quantité totale de leupeptines. La teneur en forme L de l'échantillon
de référence est de 100% et celle des DL-leupeptines obtenues par
les procédés classiques de fermentation est de 52%.
Exemple expérimental 1
On inocule une culture inclinée de Streptomyces roseus MA839-A1 (FERM-P N[deg.] 3017 ; ATCC 31245) dans 100 ml d'un milieu contenant 2% de glucose, 2% d'amidon, 3% de polypeptone, 0,5% de NaCl et 0,3% de KH2P04 que l'on dépose dans un ballon et que l'on stérilise, après quoi on effectue une culture agitée à une température de 27 à 28[deg.]C pendant 2 jours pour préparer l'inoculum (les pourcentages utilisés ci-dessus sont des pour-cent en
<EMI ID=15.1>
ci-après). On prépare 20 litres du même milieu que celui indiqué ci-dessus dans une cuve de fermentation de 30 litres et on inocule
<EMI ID=16.1>
avec aération et agitation. A intervalles réguliers, on prélève une portion du bouillon de culture et on la purifie sans racémisation conformément à la présente invention pour obtenir des chlorhydrates de leupeptines purifiés sous forme d'une poudre. Les résultats des essais de détermination de l'activité et du pourcentage de forme L sont indiqués dans le tableau 1 ci-après.
<EMI ID=17.1>
<EMI ID=18.1>
Ainsi qu'on le constate d'après le tableau 1, la puissance de la poudre de leupeptine est de 1.000 mcg/mg après culture pendant 42 et 48 heures, tandis qu'elle est réduite à 910 mcg/mg après culture pendant 60 heures et à
620 mcg/mg après culture pendant 72 heures. La teneur en forme L de la poudre de leupeptine est également réduite en dessous de 100% après culture pendant 42 et 48 heures, à 92% après culture pendant 60 heures et à 84% après culture pendant
72 heures. En conséquence, il convient de veiller à éviter une prolongation superflue de la culture car, même si l'on contrôle le pH dans l'intervalle de 5 à 7, après avoir atteint une accumulation maximale de L-leupeptines, une prolongation de la culture semble provoquer une racémisation partielle des L-leupeptines déjà formées.
Exemple expérimental 2
On dissout les chlorhydrates de L-leupeptines obtenus après la culture de l'exemple expérimental 1 pendant
<EMI ID=19.1>
former une solution à 1%. On laisse reposer la solution obtenue
à 23[deg.]C et l'on mesure les changements survenant dans l'activité relative (mcg/mg) et le pouvoir rotatoire spécifique en fonction de la durée. Les résultats obtenus sont représentés en figure 1. Les leupeptines récupérées après 7 jours ont une teneur en forme
L de 50% et une activité relative de 490 mcg/mg, ce qui indique qu'il s'est produit une racémisation complète. D'après les résultats ci-dessus, il est évident que les L-leupeptines subissent une racémisation même dans des conditions modérées telles qu'un pH de 8 et une température de 23[deg.]C.
Exemple expérimental 3
En utilisant le bouillon de culture obtenu après avoir effectué une culture pendant 48 heures de la même manière
<EMI ID=20.1>
purification ci-après.
Procédé A : On fait passer le bouillon de culture dtun pH de 6,0 à travers une colonne de "Lewatit CNP-80" (marque commerciale déposée, forme Na : forme H = 2:8 en volume) pour adsorber les L-leupeptines. On élue le produit d'adsorption avec du méthanol
<EMI ID=21.1>
de l'éluat sont acides. On'évapore les fractions actives pour obtenir une solution aqueuse. De la solution aqueuse, on extrait les leupeptines avec du n-butanol et l'on évapore la solution
de n-butanol sous pression réduite pour éliminer le n-butanol.
On fait passer la solution aqueuse obtenue à travers une colonne de charbon actif et on développe la phase adsorbée avec de l'acétone aqueuse à 20% réglée à un pH de 2 avec de l'acide chlorhydrique. On recueille les fractions actives de l'effluent et on
<EMI ID=22.1>
constituée d'amines primaires, secondaires et tertiaires, cette résine étant fabriquée par "Dow Chemical Co."), après quoi on
les concentre et on les sèche par évaporation de glace. On dissout la poudre obtenue dans du méthanol et on l'adsorbe dans une colonne d'alumine acide remplie de méthanol, après quoi on développe avec
du méthanol. On recueille les fractions actives de l'effluent et
on les évapore à sec pour obtenir des chlorhydrates de L-leupep- tines purifiés. Le rendement à partir du filtrat de culture est de 33%.
Procédé B : On fait passer le même filtrat de culture que celui utilisé dans le procédé A à travers une colonne d'"Amberlite XAD-2"
(marque commerciale pour une résine adsorbante non ionique cons-tituée d'un copolymère de styrène.et de divinyl-benzène, cette résine étant fabriquée par "Rohm and Haas Co.") pour adsorber la leupeptine, après quoi on élue la phase adsorbée avec du méthanol à 50% d'un pH de 2,0. On recueille les fractions actives de l'éluat et on les libère du méthanol par distillation, pour obtenir une solution aqueuse. Avec du n-butanol, on extrait les leupeptines de la solution aqueuse et les procédés ultérieurs à l'extraction au n-butanol sont effectués de la même manière que dans le procédé A pour obtenir des chlorhydrates de leupeptines purifiés. Le rendement à partir du filtrat de culture est de 65%.
Les résultats obtenus par les deux procédés sont comparés dans le tableau 2 ci-après.
TABLEAU 2 Comparaison entre les procédés A et B '
<EMI ID=23.1>
D'après les résultats ci-dessus, on constate que, lors de l'extraction et de la purification de L-leupeptines, si l'étape d'adsorption-désorption est effectuée en utilisant une résine échangeuse d'ions faiblement acide du type comportant un groupe d'acide carboxylique partiellement transformé sous la
forme Na, une importante proportion des L-leupeptines subissent
une racémisation, même si les solutions contenant des leupeptines restent acides.
<EMI ID=24.1>
tion et le milieu classique concernant la productivité de leupeptines.
1. Milieu
<EMI ID=25.1>
0,75% de chlorhydrate de L-arginine, 0,75% de glycine,
<EMI ID=26.1>
Japonais n[deg.] 595.140 ; Brevet des Etats-Unis d'Amérique N[deg.] 3.840.513).
(3) Milieu synthétique classique (témoin) : 1% de glucose,
1% d'amidon, 0,26% de L-leucine, 0,4% de chlorhydrate
<EMI ID=27.1>
page 20).
2. Souche utilisée : identique à celle employée dans l'exemple
expérimental 1.
3. Conditions de culture : Dans 100 ml du milieu déposé dans un
ballon de 500 ml, on inocule <1> ml de l'inoculum cultivé de la même manière qu'à l'exemple expérimental 1. On cultive le milieu inoculé à une température de 27 à 28[deg.]C avec une machine à agitation fonctionnant à une amplitude de 7 cm et à 135 mouvements de va-et-vient par minute. On prélève des échantillons après 48 et 72 heures et on les soumet à des essais en vue de déterminer la puissance des leupeptines.
4. Résultats : les résultats obtenus sont repris au tableau 3.
TABLEAU 3
<EMI ID=28.1>
Ainsi qu'on le constate d'après le tableau 3, après une culture pendant 72 heures, le milieu de l'invention donne une productivité de leupeptiries 4 à 6 fois supérieure à celles obtenues avec le milieu classique et le milieu synthétique classique utilisés comme témoins. Bien que ces milieux comprennent presque les mêmes ingrédients, le rendement obtenu avec le milieu de la présente invention est six fois supérieur à celui obtenu avec le milieu synthétique classique car, dans le milieu de l'invention, on a amélioré les concentrations en L-leucine,
en L-arginine et en glycine, ainsi que leur équilibre.
Exemple expérimental 5
Intervalles appropriés des quantités de L-leucine, de L-arginine et de glycine.
1. Milieu : on ajoute des quantités variables
(indiquées au tableau 4) de L-leucine, de chlorhydrate de Larginine et de glycine au milieu de base comprenant 3% de glucose,
<EMI ID=29.1>
à base de silicone.
2. Souche utilisée : identique à celle employée dans l'exemple expérimental 1.
3. Conditions de cultures : identiques à celles de 1'exemple expérimental 4.
<EMI ID=30.1>
qués au tableau 4'
TABLEAU 4
<EMI ID=31.1>
Ainsi qu'on le constate dans le tableau 4, lorsque, au milieu, on ajoute de la L-leucine, du chlorhydrate de L-arginine et de la glycine chacun en une quantité de 0,25%, le rendement en leupeptines après culture pendant 72 heures est insignifiant tandis que, lorsquton ajoute 0,5 à 1,25% de chacun de ces acides aminés, au cours de la même période de culture, le rendement en leupeptines atteint 2.560 à 4*370 mcg/ml. Toutefois, lorsque
la quantité de chacun de ces acides aminés est portée à 1,50%,
on n'obtient qu'une quantité insignifiante de leupeptines. Ces résultats confirment que l'on obtient spécifiquement un haut rendement en leupeptines lorsque, au milieu, on ajoute de la L-leucine, de la L-arginine (sous forme de chlorhydrate) et de
<EMI ID=32.1>
Exemple expérimental 6 : Effet de l'addition de substances organiques complexes naturelles.
1. Milieu : On ajoute des substances organiques naturelles indiquées au tableau 5 au milieu de la présente invention, utilisé dans l'exemple expérimental 4.
2. Souche utilisée : identique à celle employée dans l'exemple expérimental 1.
3. Conditions de culture : identiques à celles de l'exemple expérimental 4.
4. Résultats : les résultats obtenus sont indiqués au tableau 5.
<EMI ID=33.1>
<EMI ID=34.1>
Ainsi qu'on le constate d'après le tableau 5, lorsque, au milieu initial de la présente invention (utilisé comme témoin), on ajoute 0,1 à 0,2% d'extrait de levure, d'acides casaminés ou d'acides ribonucléiques, on augmente davantage le rendement en leupeptines ; en particulier, lorsqu'on ajoute des acides ribonucléiques, le rendement atteint une valeur égale à deux fois celui obtenu avec le milieu initial.
Dans les procédés de la présente invention, on
peut utiliser n'importe quel micro-organisme capable de produire des L-leupeptines. Parmi ces micro-organismes, il y a, par exemple, Streptomyces roseus [2 souches, leurs numéros du laboratoire de l'"Institute of Microbial Chemistry" sont : MA839-A1 et MB262-M1, ; la souche MA839-A1 est déposée au "Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology", Japon (Kogyo
<EMI ID=35.1>
Type Culture Collection", Maryland, E.U.A., les numéros de dépôt sont FERM-P N[deg.] 3017 et ATCC 31245 respectivement], Streptomyces roseochromogenes (3 souches : MA943-Ml, MB 456-AE1 et MB260-A2),
<EMI ID=36.1>
albireticuli (1 souche : MB26-A1), Streptomyces thioluteus
(1 souche : MB321-A1), Streptomyces lavendulae (1 souche :
MB172-A2) et Streptomyces noboritoensis (1 souche : MB46-AG). Les propriétés de ces espèces ont été décrites dans "The Actinomycetes", volume II (par S.A. Waksman, �'The Williams & Wilkins
<EMI ID=37.1>
Les sources de carbone pouvant être utilisées dans le milieu producteur de leupeptines de la présente invention sont l'acide acétique, le glycérol, le glucose, le sucrose, le maltose, la dextrine, l'amidon et autres ; parmi ces sources,
le glycérol et le glucose sont particulièrement utiles. Comme source d'azote inorganique, l'azote d'ammoniac est supérieur à l'azote de nitrate.
Les acides aminés devant être ajoutés au milieu sont la L-leucine, la L-arginine et la glycine.
Parmi les substances organiques naturelles ajoutées au milieu, il y a les acides ribonucléiques, l'extrait de levure et l'hydrolysat de caséine ; les acides ribonu�léiques peuvent être de qualité purifiée ou de qualité brute et l'on peut égale-ment utiliser des substances contenant des acides ribonucléiques en concentrations relativement élevées.
Parmi les résines adsorbantes non ioniques poreuses utilisées suivant la présente invention, il y a, par exemple, les résines "Amberlite XAD-1, XAD-2, XAD-4 et XAD-5" (marques commerciales, fabriquées par "Rohm and Haas Co.", E.U.A.) et
<EMI ID=38.1>
commerciales, fabriquées par "Mitsubishi Chemical Co.", Japon),
(ces neuf résines sont constituées d'un copolymère de styrène/ divinyl-benzène), les résines "Amberlite XAD-7 et XAD-8" (marques commerciales pour des adsorbants constitués d'un polymère d'ester acrylique, fabriquées par "Rohm and Haas Co."), ainsi que la
résine "Duolite S-30" (marque commerciale pour un adsorbant constitué d'une résine phénolique, fabriquée par "Chemical Process Co.", E.U.A.).
Les L-leupeptines sont préparées par les procédés de la présente invention comme décrit ci-après.
Le milieu de culture contient, par exemple, 1 à
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L-leucine, 0,5 à 1,25% de L-arginine (sous forme de chlorhydrate), 0,5 à 1,25% de glycine, 0,05 à 0,3% d'une substance organique naturelle telle que l'acide ribonucléique, l'extrait de levure
et l'hydrolysat de caséine, de même que 0,01 à 0,3% d'un agent antimousse à base de silicone (pH : 6,5). Après stérilisation
de la manière habituelle, on inocule , dans le milieu et dans des aseptiques, une culture d'ensemencement préparée en cultivant une souche productrice de leupeptines telle que Streptomyces roseus
(souche MA839-A1 ; FERM-P N[deg.] 3017 ; ATCC 31245), puis on cultive à une température de 23 à 37[deg.]C, de préférence, de 25 à 30[deg.]C.
<EMI ID=40.1> par addition d'acide sulfurique ou d'acide phosphorique. Habituellement, après fermentation pendant 3 à 4 jours, l'accumulation
<EMI ID=41.1>
On filtre le bouillon de culture ainsi obtenu et
on traite le filtrat avec une résine afin de récupérer les Lleupeptines. On peut effectuer le traitement à la résine de diverses manières, mais le plus efficacement en utilisant une colonne de résine. On charge la résine adsorbante dans une-
colonne, puis on l'active en y faisant passer, par exemple, du méthanol aqueux à 80% et en la lavant convenablement avec de
l'eau. On règle le filtrat de culture contenant des leupeptines
à un pH compris entre environ 5 et 6, puis on le fait passer à travers la colonne de résine afin d'adsorber les leupeptines
sur cette dernière. Après adsorption, on lave la colonne avec
de l'eau et on élue les leupeptines adsorbées. Parmi les éluants pouvant être utilisés, il y a les alcools inférieurs tels que le méthanol, l'éthanol, le n-propanol, l'isopropanol, le n-butanol
et l'isobutanol, les alcools inférieurs aqueux, l'acétone aqueuse, la méthyl-éthyl-cétone aqueuse, les solvants organiques contenant
de l'eau acide, de même que l'eau acide. Parmi les éluants souhaitables, il y a, par exemple, le méthanol aqueux à 10-95%,
réglé à un pH de 4 ou moins avec un acide inorganique tel que l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, l'acide nitrique ou l'acide phosphorique. Une vitesse spatiale appropriée du liquide est de 0,5 à 2 dans l'étape d'adsorption et de 0,1 à 1, en particulier, d'environ 0,5 dans l'étape d'élution. On recueille
l'éluat en fractions de quantités définies. On obtient une fraction de l'éluat contenant des leupeptines en combinant les fractions présentant une activité anti-trypsine, une réaction positive de sakaguchi ou une réaction positive de Rydon-Smith. C'est ainsi que l'on peut obtenir une solution partiellement purifiée de L-leupeptines en effectuant l'adsorption et la désorption dans
des conditions acides. Etant donné que l'on n'a pas encore trouvé un procédé industriellement économique pour la séparation des D-leupeptines et des L-leupeptines, pour la production de L-leupeptines par fermentation, il est nécessaire de prendre
des mesures permettant d'éviter la racémisation des L-leupeptines tout au long des étapes opératoires de fermentation et de purification. Un des avantages principaux des procédés de la présente invention réside dans le fait qu'ils permettent dtobtenir une récupération efficace de L-leupeptines à partir d'un filtrat de bouillon de culture contenant uniquement des L-leupeptines. On peut effectuer une purification complémentaire des L-leupeptines ainsi obtenues par une combinaison appropriée de techniques connues de purification telles qu'une chromatographie dans des conditions acides avec du charbon actif, de l'alumine (de préférence, de l'alumine acide) ou du gel de silice, de même qu'une extraction à partir d'une solution aqueuse avec du n-butanol ou analogues.
La présente invention sera illustrée ci-après plus en détail par des exemples n'ayant cependant aucun caractère limitatif.
Exemple 1
On divise, en portions de 100 ml, un milieu cQntenant 2% de glucose, 2% d'amidon, 3% de polypeptone, 0,5% de
<EMI ID=42.1>
chaque portion de 100 ml dans un ballon à agitation de 500 ml
et on les stérilise à 120[deg.]C pendant 20 minutes. Dans le milieu stérilisé, on inocule une boucle en platine d'une culture inclinée d'une souche productrice de leupeptines [Streptomyces roseus,
<EMI ID=43.1>
culture agitée à 27[deg.]C pendant 2 jours. On inocule 200 ml du bouillon de culture obtenu dans une cuve de fermentation de 30 litres contenant 20 litres du même milieu que celui utilisé
<EMI ID=44.1>
de 20 litres/minute et à une vitesse d'agitation de 400 tours/ minute. Des échantillons prélevés après culture pendant 24, 36,
42 et 48 heures présentent respectivement un pH de 6,7, de 6,8, de 6,4 et de 6,7, tandis que la puissance des leupeptines est
<EMI ID=45.1>
On mélange le bouillon de culture ainsi obtenu avec 5% (poids/volume) d'un produit auxiliaire de filtration
<EMI ID=46.1>
hydrique dilué pour obtenir environ 15 litres d'un filtrat de culture présentant une puissance de leupeptines de 665 mcg/ml.
On fait passer 4 litres (puissance totale = 2.660 mg unité) du filtrat de culture à travers une colonne garnie de 100 ml d'"Amberlite XAD-2" (résine adsorbante non ionique) à une vitesse spatiale de 1 pour adsorber des leupeptines sur la résine. Après lavage à l'eau, on élue les leupeptines adsorbées avec du méthanol aqueux à 80% réglé à un pH de 2 avec de l'acide chlorhydrique.
On combine les fractions actives de ltéluat, puis on les libère du méthanol par distillation sous pression réduite et on règle
la solution aqueuse résiduelle à un pH de 5,5 avec une solution diluée d'hydroxyde de sodium pour obtenir 100 ml d'une solution aqueuse d'une puissance de 24,5 mg/ml (le rendement à partir du filtrat de culture est de 92%). On extrait deux fois cette solution aqueuse avec 70 ml de n-butanol et on libère la couche des extraits combinés du n-butanol par distillation sous pression réduite tout en ajoutant de l'eau pour obtenir 50 ml d'une solution aqueuse ayant une puissance de 47 mg/ml (puissance totale = 2.350 mg unité et le rendement à partir du filtrat de culture est de 88%). On règle la solution aqueuse ainsi obtenue à un pH de 2 avec de l'acide chlorhydrique dilué et on l'introduit
<EMI ID=47.1>
actif ("Refined Shirasagi" pour chromatographie, fabriqué par
<EMI ID=48.1>
l'acétone par distillation pour obtenir une solution aqueuse.
<EMI ID=49.1>
"Dowex 44" (marque commerciale déposée, forme OH) et on la sèche par évaporation de glace pour obtenir 3,31 g d'une poudre jaune pâle ayant une puissance de 582 mcg/mg (la puissance totale est de 1.926 mg et le rendement à partir du filtrat de culture est de
72%). On dissout la poudre dans 30 ml de méthanol, on introduit la solution ainsi obtenue dans une colonne garnie de 90 g d'alumine acide avec.du méthanol et on développe avec du méthanol à une vitesse spatiale de 0,5. On combine les fractions actives de l'effluent et on les évapore à sec. On dissout la poudre obtenue dans de l'eau, on sépare les produits insolubles par
<EMI ID=50.1>
1,85 g de chlorhydrates de L-leupeptines ayant une puissance
de 988 mcg/mg. La puissance totale de la poudre est de 1.828 mg et le rendement à partir du filtrat de culture est d'environ
69%. La teneur de la poudre en forme L est de 100%.
Exemple 2
On charge chaque portion de 100 ml d'un milieu
(pH : 6,5) contenant 2% de glycérol, 1% de polypeptone et 1% d'extrait de viande dans des ballons Erlenmeyer de 500 ml, on
les stérilise à 120[deg.]C pendant 30 minutes, on y inocule une
boucle en platine d'une culture inclinée de Streptomyces roseus, MA839-A1 (FERM-P N[deg.] 3.017 ; ATCC 31245) et on effectue une culture agitée à 27[deg.]C pendant 24 heures pour obtenir un bouillon préalablement cultivé. Dans un ballon de 500 ml, on charge une portion de 100 ml d'un autre milieu (pH : 6,5) contenant 3% de glycérol, 0,75% de L-leucine, 0,75% de chlorhydrate de L-arginine, 0,75%
<EMI ID=51.1>
antimousse à base de silicone, on stérilise à 120[deg.]C pendant 30 minutes puis, dans des conditions aseptiques, on inocule 1 ml du bouillon préalablement cultivé ci-dessus et on effectue une culture à 27[deg.]C pendant 3 jours dans une machine à agitation fonctionnant à une amplitude de 7 cm et à 210 mouvements de vaet-vient par minute. Le déroulement de la culture est indiqué
<EMI ID=52.1>
TABLEAU 6
Déroulement de la culture
<EMI ID=53.1>
Après culture pendant 72 heures, on filtre le bouillon cultivé pour éliminer le mycélium et on règle le filtrat
<EMI ID=54.1>
à un pH de 6, puis on le fait passer à travers une colonne garnie de 120 ml de "Diaion HP 40" afin d'adsorber la leupeptine . Après lavage à l'eau, on élue la leupeptine adsorbée avec du méthanol aqueux à 50% d'un pH de 2 pour recueillir 235 ml d'une fraction de leupeptine. Après élimination du méthanol de la fraction de
<EMI ID=55.1>
<EMI ID=56.1>
aqueuse à un pH de 5,5 avec une solution aqueuse diluée d'hydro- xyde de sodium et on ltextrait trois fois avec 50 ml de n-butanol.
On combine les couches d'extrait et on les distille à 40[deg.]C pour éliminer le n-butanol sous forme d'un azéotrope avec de l'eau et l'on obtient 100 ml d'une solution aqueuse contenant 28 mg
(puissance) de leupeptine/ml. On règle la solution aqueuse ainsi obtenue à un pH de 2 avec de l'acide chlorhydrique et on élimine
le précipité formé par filtration. On fait passer le filtrat à travers une colonne garnie de 100 ml de charbon actif ("Refined Shirasagi", fabriqué par "Takeda Chemical Co.") pour adsorber
la leupeptine. Après lavage avec de l'acide chlorhydrique dilué d'un pH de 2, on élue la leupeptine adsorbée avec de ltacétone aqueuse à 20% d'un pH de 2 pour obtenir 210 ml d'une fraction de leupeptine. On règle la fraction de leupeptine à un pH de 5 avec la résine "Dowex 44" (forme OH) et on la concentre à sec sous pression réduite pour obtenir 4 g d'une poudre presque blanche ayant une activité de 580 mcg/mg. On dissout la poudre dans du méthanol, puis on la fait passer à travers une colonne contenant
60 g d'une alumine acide (fabriquée par"Woelm Co.", République Fédérale d'Allemagne) en suspension dans du méthanol et on développe avec du méthanol pour recueillir des fractions de leupeptines. On concentre les fractions de leupeptines combinées à sec sous pression réduite pour obtenir 2,22 g d'une poudre blanche de chlorhydrate de leupeptine ayant une puissance de 1.000 mcg/mg, le rendement à partir du filtrat de culture étant de 68%.
La poudre ci-dessus a un pouvoir rotatoire spécifique la] <2><3> de -75[deg.] (c = 1, H20) et un point de fusion de 143-146[deg.]C
(décomposition) ; cette poudre donne une réaction de Sakaguchi positive, une réaction de Rydon-Smith positive et une réaction négative à la ninhydrine. Elle ne présente aucune absorption spécifique dans la zone de l'ultraviolet, mais.une absorption finale uniquement. Comme représenté en figure 2, le spectre d'absorption des rayons infrarouges de cette poudre coïncide avec celui d'une DL-leupeptine obtenue par un procédé classique.
On hydrolyse 20 mg des chlorhydrates ci-dessus avec de l'acide chlorhydrique 6N dans un tube scellé à 110[deg.]C pendant 24 heures et on extrait l'acide gras libre contenu dans l'hydrolysat avec de l'éther éthylique. On conc.entre la couche d'extrait et on la soumet à une chromatographie gazeuse en uti-
- lisant une colonne garnie de "Chromosolb 101" (60-80 mailles) <EMI ID=57.1>
de l'acide acétique. En conséquence, il se confirme que la
poudre est un chlorhydrate de leupeptine ne comportant qu'un
groupe acétyle comme groupe acyle.
Ensuite, on dissout environ 200 mg du chlorhydrate dans 8 ml d'eau. A la solution de chlorhydrate ci-dessus, tout
en agitant à la température ambiante, on ajoute goutte à goutte
une solution de 52 mg de permanganate de potassium dans 2 ml
d'eau et l'on poursuit l'agitation pendant deux heures supplémentaires pour assurer l'oxydation. Ensuite, on neutralise le permanganate de potassium en excès avec du thiosulfate de sodium
et on fait passer le mélange obtenu à travers une colonne garnie
de 5 ml de charbon actif. Après lavage à l'eau, on élue la phase adsorbée avec de l'acétone aqueuse à 20% d'un pH de 2 pour recueillir des fractions donnant une réaction de Sakaguchi positive.
On combine ces fractions, on les règle à un pH de 5 avec la résine "Dowex 44" (marque commerciale déposée, forme OH) et on évapore
à sec pour obtenir 170 mg d'une poudre. On dissout cette poudre dans 1 ml de méthanol et on la fait passer à travers une colonne contenant 5 g d'une alumine acide en suspension dans du méthanol, puis on développe avec 15 ml de méthanol et ensuite, avec 25 ml
de méthanol aqueux à 50% et d'un pH de 3,0. On combine les fractions de l'effluent donnant une réaction de Sakaguchi positive,
on les règle à un pH de 5 avec la résine "Dowex 4411 (marque commerciale déposée, forme OH) et on évapore à sec pour obtenir
75 mg d'acide de leupeptine (acyl-L-leucyl-L-leucyl-arginine).
On pèse avec précision environ 10 mg de cet acide de leupeptine, on y ajoute 2 ml d'acide chlorhydrique 6N et on hydrolyse dans un tube scellé à 110[deg.]C pendant 24 heures. On évapore la solution de l'hydrolysat à sec et on la dissout dans l'eau. On soumet une partie de la solution obtenue à une analyse qualitative et quantitative des acides aminés constitutifs. On soumet le reste de la solution à un dosage biologique en utilisant, comme organismes d'essai, des bactéries d'acide lactique nécessitant de la L-arginine afin de déterminer la teneur en L-arginine. Les résultats
<EMI ID=58.1>
TABLEAU 7
Composition des acides aminés dans l'hydrolysat d'acide de leupeptinc
<EMI ID=59.1>
D'après les résultats ci-dessus, on peut conclure que l'acide de leupeptine ayant subi l'hydrolyse contient de la L-leucine et de la L-arginine dans un rapport molaire de 2:1, tandis qu'il ne contient pas de valine, d'isovaline et de D-arginine. En conséquence, il se confirme que la leupeptine obtenue
<EMI ID=60.1>
L-leucyl-L-argininal.
Exemple 3
Dans un ballon de 500 ml, on charge 100 ml d'un milieu (pH : 6,5) contenant 3% de glycérol, 0,75% de L-leucine, 0,75% de chlorhydrate de L-arginine, 0,75% de glycine, 0,5% de
<EMI ID=61.1>
d'un agent antimousse de silicone et on stérilise à 120[deg.]C pendant 30 minutes. Dans le milieu stérilisé, on inocule 1 ml d'un bouillon préalablement cultivé et préparé de la même manière
<EMI ID=62.1>
une machine à agitation fonctionnant à une amplitude de 7 cm et à 210 mouvements de va-et-vient par minute. Le déroulement de la. culture est indiqué au tableau 8-.
TABLEAU 8
Déroulement de la culture
<EMI ID=63.1>
Du filtrat de culture (2.350 mcg/ml, 800 ml), on extrait la L-leupeptine de la même manière qutà l'exemple 2, avec cette exception que l'on utilise l'"Amberlite XAD-4" au lieu de la résine "Diaion HP40" et l'on obtient 1,22 g de chlorhydrate de L-leupeptine.
Exemple 4
Dans un ballon de 500 ml, on charge 100 ml d'un milieu (pH : 6,5) contenant 3% de glucose, 0,75% de L-leucine, 0,75% de chlorhydrate de L-arginine, 0,75% de glycine, 0,8% de
<EMI ID=64.1>
0,2% d'acide ribonucléique et 0,1% d'un agent antimousse à base de silicone, puis on stérilise à 120[deg.]C pendant 30 minutes. Dans le milieu stérilisé, on inocule 1 ml d'un bouillon de culture d'ensemencement préparé de la même manière qu'à l'exemple 2 et on cultive à 27[deg.]C pendant 3 jours dans une machine à agitation
<EMI ID=65.1>
va-et-vient par minute. Le déroulement de la culture est indiqué au tableau 9.
TABLEAU 9
Déroulement de la culture
<EMI ID=66.1>
<EMI ID=67.1>
extrait la L-leupeptine et on la purifie de la même manière qu'à l'exemple 2, avec cette exception que l'on utilise la résine "Diaion HP20" au lieu de la résine "Diaion HP40" et l'on obtient 1,96 g de chlorhydrate de L-leupeptine.
Exemple 5
Dans des ballons de 500 ml, on charge chaque fois des portions de 100 ml d'un milieu (pH : 6,5) contenant 3% de
<EMI ID=68.1>
de silicone et on stérilise à 120[deg.]C pendant 20 minutes. Dans chaque portion, on inocule ensuite 1 ml d'un bouillon préalablement cultivé et préparé de la même manière qu'à l'exemple 2, puis on cultive à 27[deg.]C pendant 3 jours avec une machine à agitation fonctionnant à une amplitude de 7 cm et à 210 mouvements de vaet-vient par minute. Les résultats obtenus sont indiqués au tableau 10.
TABLEAU 10
Déroulement de la culture
<EMI ID=69.1>
Du filtrat de culture (3.700 mcg/ml, 800 ml), on isole la L-leupeptine de la même manière qu'à l'exemple 2, avec cette exception que l'on utilise la résine "Diaion HP30"au lieu de la résine "Diaion HP40" et l'on obtient 1,93 g de chlorhydrate de L-leupeptine.
Exemple 6
Dans une cuve de fermentation de 30 litres, on charge 20 litres d'un milieu (pH : 6,5) contenant 3% de glycérol, 0,75% de L-leucine, 0,75% de chlorhydrate de L-arginine, 0,75%
<EMI ID=70.1>
0,05% de KC1, 0,2% d'acide ribonucléique et 0,05% d'un agent j
<EMI ID=71.1>
s
30 minutes. Dans le milieu stérilisé, on inocule 200 ml d'un
<EMI ID=72.1>
<EMI ID=73.1>
conditions suivantes : vitesse de l'agitateur : 400 tours/minute débit d'air : 20 litres par minute. Le déroulement de la culture est indiqué au tableau 11.
<EMI ID=74.1>
Déroulement de la culture
<EMI ID=75.1>
Du filtrat de culture (4.350 mcg/ml, 800 ml chaque fois), on isole la L-leupeptine de la même manière qu'à l'exemple 2, avec cette exception qu'au lieu de la résine "Diaion HP40", on utilise les résines "Amberlite XAD-1, XAD-5,
<EMI ID=76.1>
<EMI ID=77.1>
2,01 g de chlorhydrate de L-leupeptine.
REVENDICATIONS
1. Procédé de production de L-leupeptines, caractérisé en ce qu'il consiste à inoculer une souche de Streptomyces productrice de leupeptines dans un milieu contenant des
sources nutritives, cultiver cette souche dans des conditions
aérobies à un pH compris entre 5 et 7 pour produire et accumuler
des L-leupeptines dans le milieu, puis extraire et purifier les L-leupeptines du bouillon de culture à un pH de 7 ou moins.
<EMI ID = 1.1> The present invention relates to methods of preparing L-leupeptins by fermentation, as well as their extraction and purification from fermentation beer.
Leupeptins are enzyme inhibitors
which were discovered by Umezawa et al in culture filtrates of Streptomyces, roseus and a wide variety of Streptomyces microorganisms. Chemical structures
leupeptins are represented by the following general formula:
<EMI ID = 2.1>
<EMI ID = 3.1>
t
CH3 CH3
<EMI ID = 4.1>
These leupeptins are useful substances having low toxicity and exerting protease inhibitory activities such as anti-plasmin and anti-trypsin activities, as well as anti-inflammatory and various other pharmacological effects (see Japanese Patent No. [deg. ] 595,140, U.S. Patent No. [deg.] 3,840,513).
The main components of the leupeptins obtained so far by fermentation are propionyl- and acetyl-Lleucyl-L-leucyl-DL-argininal each comprising an argininal group of the steric configuration DL (these leupeptins being referred to hereinafter as "DL -leupeptins "or" DL form ") [Kondo, S. et al.,
<EMI ID = 5.1>
States of America n [deg.] 3.840.513].
Until the present invention, L-leupeptins have never been obtained by fermentation and, therefore, DL-leupeptins have been considered to be prepared by fermentation.
Shimizu et al. performed chemical synthesis
leupeptins with an argininal group of L configuration
(these leupeptins being called hereinafter "L-leupeptins" or
"L-form"), as well as other leupeptins comprising an argininal group of configuration D (these leupeptins being called hereinafter "D-leupeptins" or "D-form"). On the basis of biochemical tests, they confirmed that the active ingredient responsible for the inhibitory effects exerted on the enzymes was L-leupeptins, while D-leupeptins are inactive and DL-leupeptins obtained by fermentation only exert half of the activity of L-leupeptins [Shimizu, B. et al., "J. Antibiotics", 25, 515 (1972); Umezawa, H., "Enzyme Inhibitors of Microbial Origin", "University of Tokyo Press" (1972), pages 24-25].
The Applicant has undertaken extensive studies
on the fermentation process, as well as on the extraction and purification processes and, as a result of these studies, it discovered for the first time the facts mentioned below and these findings resulted in the present invention.
An object of the present invention is to provide
new processes for the preparation of L-leupeptins by fermentation.
Another object of the present invention is to provide novel methods for the extraction and purification of L-leupeptins formed in a culture broth by fermentation.
Other objects and advantages of the present invention will become apparent on reading the description below.
Figure 1 of the accompanying drawings shows the course of the racemization of L-leupeptin obtained by the process of the present invention, in terms of relative activity and specific optical rotation, both measured as a function of the storage period. expressed in days. Figure 2 gives the infrared ray absorption spectra of L-leupeptin hydrochloride (in solid lines) obtained by the process of the present invention, as well as of DL-leupeptin hydrochloride prepared by the conventional fermentation and fermentation process. extraction (broken lines).
(1) During the fermentation of leupeptin during which the pH of the culture medium is maintained in
<EMI ID = 6.1>
medium whereas, when the reaction of the medium is shifted to the alkaline domain, DL-leupeptins are obtained. Even when the pH of the culture medium is maintained in the meantime
<EMI ID = 7.1>
of L-leupeptins has reached. maximally, causes partial racemization of accumulated L-leupeptins to form D-contaminated L-leupeptins.
(2) Purified L-leupeptins also undergo gradual r-acemization in a slightly alkaline medium
(eg pH 8) under moderate thermal conditions, eg 23 [deg.] C) and are brought to full form
DL after several days.
(3) In specific known purification methods, the leupeptins in the culture filtrate are subjected to adsorption and desorption treatments using an activated carbon column or an exchange resin. of the carboxylic acid type ion, for example, "Lewatit CNP" (trademark for a cation exchange resin containing a carboxylic acid group, manufactured by "Bayer Co.") or "Amberlite IRC- 50 "(Trademark for a cation exchange resin containing a carboxylic acid group, manufactured by" Rohm
and Haas Co. ") as H, as Na or as a mixture.
In the case of cation exchange resins of the type having a carboxylic acid group, the H form does not cause the racemization of L-leupeptins, but it is uneconomical due to its low adsorption capacity, while the Na form has an even lower adsorption capacity and furthermore causes complete racemization. Although a mixed type of H and Na forms in an appropriate ratio (7-8: 3-2 by volume) is superior to any other known adsorbent due to its maximum adsorption capacity and high yields adsorption and desorption, however, this type is not suitable for obtaining L-leupeptins, because it causes strong racemization, even if the treatments are carried out under weak or moderately acidic conditions.
(4) The process involving the adsorption of leupeptins from cultured filtrate on activated carbon with subsequent desorption using an aqueous acidic organic solvent (e.g. 80% methanol with a pH of 2) gives DL-leupeptins when applied to beer fermented by conventional methods without pH control. We have found that this process gives L-leupeptins when applied to beer prepared by the processes developed according to the present invention. However, the yield is low (30 to
<EMI ID = 8.1>
or alumina, activated carbon is an adsorbent which is usefully employed during column chromatography carried out during the subsequent purification step.
(5) The method of the present invention, in which a porous nonionic adsorbent resin is used, is applicable to both the first extraction-purification step involving the adsorption of leupeptins from a culture filtrate and the desorption of the adsorbed leupeptins, as well as in the last step of the complementary purification of the L-leupeptins from the solution containing previously purified L-leupeptins, the application to the first step being particularly advantageous.
When a cultured filtrate containing leupeptins is treated in accordance with the method of the present invention, advantages are observed markedly superior to those of any other known method, for example, an adsorption capacity far higher than in any conventional process, the absence of racemization of L-leupeptins and a high yield of about 90% in the adsorption-desorption step.
(6) By adding L-leucine, L-arginine
(as hydrochloride) and glycine in an amount of
<EMI ID = 9.1>
the production of L-leupeptins is increased 4 to 6 times compared to that obtained in conventional methods.
(7) The yield of L-leupeptins is brought to a value as high as 7 to 10 times that obtained by conventional methods by adding, to the above medium containing the above-mentioned amino acids, at least one of the various natural organic substances such as as ribonucleic acids, yeast extract and casein hydrolyzate.
(8) When using a fermentation medium containing the three above-mentioned amino acids (this medium not containing more than 0.3% (w / v) amino acids, including the amino acids themselves and the substances containing, for example, peptides, proteins, etc., other than the three acids
<EMI ID = 10.1>
acetyl-L-leucyl-L-leucyl-L-argininal alone and it does not contain any other leupeptin having a propionyl group, an isoleucine group or a valine group.
By the practice of the present invention on the basis of the above findings, for the first time, methods for the preparation of L-leupeptins (which are an active form) have been developed in high yields by fermentation. Likewise, an important discovery for the production of a single leupeptin of constant quality is that one can
<EMI ID = 11.1>
L-leucyl-L-argininal with high yields by carrying out the process of the present invention with a culture medium containing L-leucine, L-arginine (as hydrochloride)
<EMI ID = 12.1>
including the amino acids themselves and substances containing them such as peptides, proteins, etc., other than the above three amino acids.
The advantages of the present invention are illustrated in the experimental examples below.
According to the present invention, the potency of leupeptins is measured as follows:
To 2.5 ml of a 1.25 x 10-4M solution of p-toluene-sulfonyl-L-arginine methyl ester hydrochloride in a tris buffer with a pH of 8.1 is added 0.5 ml of a leupeptin solution prepared in such a way that the concentration can reach about 8 mcg (potency) / ml. After pre-incubation at 32 [deg.] C for 5 minutes, to this mixture is added 0.1 ml of an aqueous solution of trypsin (7.5 mcg / ml). Immediately after incubation at 32 [deg.] C for 30 minutes, the reaction mixture is subjected to testing.
determining the absorption capacity at .247 nm to obtain the test value. The control value is obtained in the same manner as that indicated above, with the exception that no leupeptin is added. The degree of inhibition of trypsin is calculated by dividing, by the control value, the difference between this control value and the test value. According to this test method, the con-
<EMI ID = 13.1>
highest purity acetyl-L-leucyl-L-leucyl-L-argininal is 0.98 mcg / ml. This substance is used as a reference sample and the potency of leupeptins is expressed in weight
(for example, in mcg and mg (potency)).
The DL-leupeptins of the highest purity obtained by conventional fermentation processes and
<EMI ID = 14.1>
The L-leupeptin content of a mixture is measured
L-leupeptins and D-leupeptins as described below.
The leupeptins under test are formed into an aqueous solution and, with potassium permanganate, oxidized.
in leupeptin acids (the argininal fraction of leupeptin
is oxidized to form arginine). We purify the acids
obtained and isolated by chromatography on activated carbon
and on acidic alumina. The isolated acids are hydrolyzed with 6N hydrochloric acid at 110 [deg.] C for 24 hours. The total arginine content of the hydrolyzate is determined using an amino acid analysis instrument. On the other hand, we determine the content
in L-arginine from the hydrolyzate by biological assay using
lactic acid bacteria. It is assumed that the L-arginine content (%) of the total amount of arginine is equal to the
L-leupeptin content (percentage of L-form) of the total amount of leupeptins. The L-shaped content of the sample
of reference is 100% and that of DL-leupeptins obtained by
conventional fermentation processes is 52%.
Experimental example 1
A slant culture of Streptomyces roseus MA839-A1 (FERM-P N [deg.] 3017; ATCC 31245) is inoculated in 100 ml of a medium containing 2% glucose, 2% starch, 3% polypeptone, 0 , 5% NaCl and 0.3% KH2PO4 which is placed in a flask and sterilized, after which stirred culture is carried out at a temperature of 27-28 [deg.] C for 2 days to prepare the inoculum (the percentages used above are percent in
<EMI ID = 15.1>
below). 20 liters of the same medium as indicated above are prepared in a 30-liter fermentation tank and inoculated
<EMI ID = 16.1>
with aeration and agitation. At regular intervals, a portion of the culture broth is taken and purified without racemization in accordance with the present invention to obtain purified leupeptin hydrochlorides in powder form. The results of the tests for determining the activity and the percentage of form L are shown in Table 1 below.
<EMI ID = 17.1>
<EMI ID = 18.1>
As seen from Table 1, the potency of leupeptin powder is 1,000 mcg / mg after culturing for 42 and 48 hours, while it is reduced to 910 mcg / mg after culturing for 60 hours. and to
620 mcg / mg after culture for 72 hours. The L-form content of leupeptin powder is also reduced below 100% after cultivation for 42 and 48 hours, to 92% after cultivation for 60 hours and to 84% after cultivation for
72 hours. Therefore, care should be taken to avoid unnecessary prolongation of the culture because, even if the pH is controlled in the range of 5 to 7, after reaching a maximum accumulation of L-leupeptins, a prolongation of the culture appears to cause partial racemization of already formed L-leupeptins.
Experimental example 2
The hydrochlorides of L-leupeptins obtained after the culture of Experimental Example 1 are dissolved for
<EMI ID = 19.1>
form a 1% solution. The solution obtained is left to stand
at 23 [deg.] C and the changes in relative activity (mcg / mg) and specific optical rotation are measured as a function of time. The results obtained are shown in FIG. 1. The leupeptins recovered after 7 days have a form content.
L of 50% and a relative activity of 490 mcg / mg, indicating that complete racemization has occurred. From the above results, it is evident that L-leupeptins undergo racemization even under moderate conditions such as pH 8 and temperature 23 [deg.] C.
Experimental example 3
Using the culture broth obtained after culturing for 48 hours in the same way
<EMI ID = 20.1>
purification below.
Method A: The culture broth with a pH of 6.0 is passed through a column of "Lewatit CNP-80" (registered trademark, Na form: H form = 2: 8 by volume) to adsorb L-leupeptins. . The adsorption product is eluted with methanol
<EMI ID = 21.1>
of the eluate are acidic. The active fractions are evaporated to obtain an aqueous solution. From the aqueous solution, the leupeptins are extracted with n-butanol and the solution evaporated.
of n-butanol under reduced pressure to remove the n-butanol.
The resulting aqueous solution is passed through an activated carbon column and the adsorbed phase is developed with 20% aqueous acetone adjusted to pH 2 with hydrochloric acid. The active fractions of the effluent are collected and
<EMI ID = 22.1>
consisting of primary, secondary and tertiary amines, this resin being manufactured by "Dow Chemical Co."), after which one
They are concentrated and dried by evaporation of ice. The resulting powder is dissolved in methanol and adsorbed in an acid alumina column filled with methanol, after which it is developed with
methanol. The active fractions of the effluent are collected and
they are evaporated to dryness to obtain purified L-leupeptin hydrochlorides. The yield from the culture filtrate is 33%.
Method B: The same culture filtrate as that used in method A is passed through an "Amberlite XAD-2" column.
(trademark for a nonionic adsorbent resin consisting of a copolymer of styrene and divinyl-benzene, this resin being manufactured by "Rohm and Haas Co.") for adsorbing leupeptin, after which the adsorbed phase is eluted with 50% methanol with a pH of 2.0. The active fractions of the eluate are collected and freed from methanol by distillation, to obtain an aqueous solution. With n-butanol, the leupeptins are extracted from the aqueous solution and the subsequent n-butanol extraction processes are carried out in the same manner as in Process A to obtain purified leupeptin hydrochlorides. The yield from the culture filtrate is 65%.
The results obtained by the two methods are compared in Table 2 below.
TABLE 2 Comparison between processes A and B '
<EMI ID = 23.1>
From the above results, it can be seen that during the extraction and purification of L-leupeptins, if the adsorption-desorption step is carried out using a weakly acidic ion exchange resin of the type having a partially converted carboxylic acid group under the
form Na, a significant proportion of L-leupeptins undergo
racemization, even if solutions containing leupeptins remain acidic.
<EMI ID = 24.1>
tion and the conventional medium concerning the productivity of leupeptins.
1. Middle
<EMI ID = 25.1>
0.75% L-arginine hydrochloride, 0.75% glycine,
<EMI ID = 26.1>
Japanese n [deg.] 595,140; United States Patent N [deg.] 3,840,513).
(3) Classic synthetic medium (control): 1% glucose,
1% starch, 0.26% L-leucine, 0.4% hydrochloride
<EMI ID = 27.1>
page 20).
2. Strain used: identical to that used in the example
experimental 1.
3. Culture conditions: In 100 ml of the medium deposited in a
500 ml flask, <1> ml of the cultured inoculum is inoculated in the same way as in Experimental Example 1. The inoculated medium is cultured at a temperature of 27 to 28 [deg.] C with a machine. agitation operating at an amplitude of 7 cm and 135 back and forth movements per minute. Samples are taken after 48 and 72 hours and tested for the potency of leupeptins.
4. Results: the results obtained are shown in Table 3.
TABLE 3
<EMI ID = 28.1>
As can be seen from Table 3, after culturing for 72 hours, the medium of the invention gives a productivity of leupeptiries 4 to 6 times higher than those obtained with the conventional medium and the conventional synthetic medium used as witnesses. Although these media comprise almost the same ingredients, the yield obtained with the medium of the present invention is six times greater than that obtained with the conventional synthetic medium because, in the medium of the invention, the concentrations of L- have been improved. leucine,
in L-arginine and glycine, as well as their balance.
Experimental example 5
Appropriate ranges of the amounts of L-leucine, L-arginine and glycine.
1. Medium: variable quantities are added
(shown in Table 4) of L-leucine, Larginine hydrochloride and glycine in the base medium comprising 3% glucose,
<EMI ID = 29.1>
silicone based.
2. Strain used: identical to that used in experimental example 1.
3. Culture conditions: identical to those of experimental example 4.
<EMI ID = 30.1>
ques in table 4 '
TABLE 4
<EMI ID = 31.1>
As seen in Table 4, when, to the medium, L-leucine, L-arginine hydrochloride and glycine are added each in an amount of 0.25%, the yield of leupeptins after cultivation for 72 hours is insignificant whereas, when 0.5 to 1.25% of each of these amino acids is added, during the same culture period, the yield of leupeptins reaches 2,560 to 4 * 370 mcg / ml. However, when
the amount of each of these amino acids is increased to 1.50%,
only an insignificant amount of leupeptins is obtained. These results confirm that a high yield of leupeptins is specifically obtained when, to the medium, L-leucine, L-arginine (as hydrochloride) and
<EMI ID = 32.1>
Experimental Example 6: Effect of the addition of natural complex organic substances.
1. Medium: Natural organic substances shown in Table 5 are added to the medium of the present invention, used in Experimental Example 4.
2. Strain used: identical to that used in experimental example 1.
3. Culture conditions: identical to those of experimental example 4.
4. Results: the results obtained are shown in Table 5.
<EMI ID = 33.1>
<EMI ID = 34.1>
As can be seen from Table 5, when, to the initial medium of the present invention (used as a control), 0.1 to 0.2% of yeast extract, of casamino acids or of d ribonucleic acids, the yield of leupeptins is further increased; in particular, when ribonucleic acids are added, the yield reaches a value equal to twice that obtained with the initial medium.
In the methods of the present invention, it is
can use any microorganism capable of producing L-leupeptins. Among these microorganisms, there are, for example, Streptomyces roseus [2 strains, their laboratory numbers of the "Institute of Microbial Chemistry" are: MA839-A1 and MB262-M1,; strain MA839-A1 is deposited with the "Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology", Japan (Kogyo
<EMI ID = 35.1>
Type Culture Collection ", Maryland, E.U.A., the accession numbers are FERM-P N [deg.] 3017 and ATCC 31245 respectively], Streptomyces roseochromogenes (3 strains: MA943-M1, MB 456-AE1 and MB260-A2),
<EMI ID = 36.1>
albireticuli (1 strain: MB26-A1), Streptomyces thioluteus
(1 strain: MB321-A1), Streptomyces lavendulae (1 strain:
MB172-A2) and Streptomyces noboritoensis (1 strain: MB46-AG). The properties of these species have been described in "The Actinomycetes", volume II (by S.A. Waksman, � 'The Williams & Wilkins
<EMI ID = 37.1>
The carbon sources which can be used in the leupeptin producing medium of the present invention are acetic acid, glycerol, glucose, sucrose, maltose, dextrin, starch and the like; among these sources,
glycerol and glucose are particularly useful. As a source of inorganic nitrogen, ammonia nitrogen is superior to nitrate nitrogen.
The amino acids to be added to the medium are L-leucine, L-arginine and glycine.
Among the natural organic substances added to the medium are ribonucleic acids, yeast extract and casein hydrolyzate; ribonucleic acids can be purified grade or crude grade, and substances containing ribonucleic acids in relatively high concentrations may also be used.
Among the porous nonionic adsorbent resins used according to the present invention, there are, for example, the resins "Amberlite XAD-1, XAD-2, XAD-4 and XAD-5" (trademarks, manufactured by "Rohm and Haas Co. ", EUA) and
<EMI ID = 38.1>
commercial, manufactured by "Mitsubishi Chemical Co.", Japan),
(these nine resins consist of a styrene / divinyl-benzene copolymer), the resins "Amberlite XAD-7 and XAD-8" (trademarks for adsorbents made of an acrylic ester polymer, manufactured by "Rohm and Haas Co. "), as well as
resin "Duolite S-30" (trade mark for an adsorbent consisting of a phenolic resin, manufactured by "Chemical Process Co.", E.U.A.).
L-leupeptins are prepared by the methods of the present invention as described below.
The culture medium contains, for example, 1 to
<EMI ID = 39.1>
L-leucine, 0.5 to 1.25% L-arginine (as hydrochloride), 0.5 to 1.25% glycine, 0.05 to 0.3% of a naturally occurring organic substance such as ribonucleic acid, yeast extract
and casein hydrolyzate, as well as 0.01 to 0.3% of a silicone defoamer (pH: 6.5). After sterilization
in the usual manner, a seed culture prepared by culturing a leupeptin-producing strain such as Streptomyces roseus is inoculated into the medium and aseptically.
(strain MA839-A1; FERM-P N [deg.] 3017; ATCC 31245), then cultured at a temperature of 23 to 37 [deg.] C, preferably 25 to 30 [deg.] C.
<EMI ID = 40.1> by addition of sulfuric acid or phosphoric acid. Usually, after fermentation for 3-4 days, the accumulation
<EMI ID = 41.1>
The culture broth thus obtained is filtered and
the filtrate is treated with a resin in order to recover the lleupeptins. Resin treatment can be carried out in various ways, but most effectively using a resin column. The adsorbent resin is loaded into a
column and then activated by passing, for example, 80% aqueous methanol through it and washing it appropriately with
the water. The culture filtrate containing leupeptins is adjusted
to a pH of between about 5 and 6, then it is passed through the resin column in order to adsorb the leupeptins
on the latter. After adsorption, the column is washed with
from water and the adsorbed leupeptins are eluted. Among the eluents that can be used, there are lower alcohols such as methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol
and isobutanol, aqueous lower alcohols, aqueous acetone, aqueous methyl ethyl ketone, organic solvents containing
acidic water, as well as acidic water. Among the desirable eluents are, for example, 10-95% aqueous methanol,
adjusted to a pH of 4 or less with an inorganic acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid or phosphoric acid. A suitable space velocity of the liquid is 0.5 to 2 in the adsorption step and 0.1 to 1, in particular, about 0.5 in the elution step. We collect
the eluate in fractions of defined amounts. A fraction of the eluate containing leupeptins is obtained by combining the fractions exhibiting anti-trypsin activity, a positive sakaguchi reaction or a positive Rydon-Smith reaction. Thus, a partially purified solution of L-leupeptins can be obtained by carrying out adsorption and desorption in
acidic conditions. Since we have not yet found an industrially economical process for the separation of D-leupeptins and L-leupeptins, for the production of L-leupeptins by fermentation, it is necessary to take
measures making it possible to avoid the racemization of L-leupeptins throughout the operating stages of fermentation and purification. One of the main advantages of the methods of the present invention is that they allow efficient recovery of L-leupeptins from a culture broth filtrate containing only L-leupeptins. Further purification of the L-leupeptins thus obtained can be carried out by a suitable combination of known purification techniques such as chromatography under acidic conditions with activated carbon, alumina (preferably acidic alumina) or silica gel, as well as extraction from an aqueous solution with n-butanol or the like.
The present invention will be illustrated below in more detail by examples which, however, have no limiting nature.
Example 1
A medium containing 2% glucose, 2% starch, 3% polypeptone, 0.5% protein is divided into 100 ml portions.
<EMI ID = 42.1>
each 100 ml portion in a 500 ml shaking flask
and sterilized at 120 [deg.] C for 20 minutes. In the sterilized medium, a platinum loop is inoculated with a slant culture of a leupeptin-producing strain [Streptomyces roseus,
<EMI ID = 43.1>
shake culture at 27 [deg.] C for 2 days. 200 ml of the culture broth obtained are inoculated into a 30-liter fermentation tank containing 20 liters of the same medium as that used.
<EMI ID = 44.1>
of 20 liters / minute and at a stirring speed of 400 revolutions / minute. Samples taken after culture for 24, 36,
42 and 48 hours have a pH of 6.7, 6.8, 6.4 and 6.7, respectively, while the potency of leupeptins is
<EMI ID = 45.1>
The culture broth thus obtained is mixed with 5% (weight / volume) of a filtration aid.
<EMI ID = 46.1>
diluted water to obtain about 15 liters of a culture filtrate having a leupeptin potency of 665 mcg / ml.
4 liters (total power = 2,660 mg unit) of the culture filtrate are passed through a column packed with 100 ml of "Amberlite XAD-2" (nonionic adsorbent resin) at a space velocity of 1 to adsorb leupeptins on. resin. After washing with water, the adsorbed leupeptins are eluted with 80% aqueous methanol adjusted to pH 2 with hydrochloric acid.
The active fractions of the eluate are combined, then freed from methanol by distillation under reduced pressure and adjusted.
the residual aqueous solution at pH 5.5 with dilute sodium hydroxide solution to obtain 100 ml of an aqueous solution with a strength of 24.5 mg / ml (the yield from the culture filtrate is 92%). This aqueous solution was extracted twice with 70 ml of n-butanol, and the layer of the combined extracts of n-butanol was released by distillation under reduced pressure while adding water to obtain 50 ml of an aqueous solution having a potency. of 47 mg / ml (total potency = 2,350 mg unit and the yield from the culture filtrate is 88%). The aqueous solution thus obtained is adjusted to a pH of 2 with dilute hydrochloric acid and introduced
<EMI ID = 47.1>
active ("Refined Shirasagi" for chromatography, manufactured by
<EMI ID = 48.1>
acetone by distillation to obtain an aqueous solution.
<EMI ID = 49.1>
"Dowex 44" (registered trade mark, OH form) and dried by evaporation of ice to obtain 3.31 g of a pale yellow powder having a potency of 582 mcg / mg (the total potency is 1,926 mg and the yield from the culture filtrate is
72%). The powder is dissolved in 30 ml of methanol, the solution thus obtained is introduced into a column packed with 90 g of acid alumina with methanol and developed with methanol at a space velocity of 0.5. The active fractions of the effluent are combined and evaporated to dryness. The powder obtained is dissolved in water, the insoluble products are separated by
<EMI ID = 50.1>
1.85 g of L-leupeptin hydrochlorides with a potency
of 988 mcg / mg. The total potency of the powder is 1,828 mg and the yield from the culture filtrate is approximately
69%. The content of the L-shaped powder is 100%.
Example 2
Each portion is loaded with 100 ml of a medium
(pH: 6.5) containing 2% glycerol, 1% polypeptone and 1% meat extract in 500 ml Erlenmeyer flasks, one
sterilizes them at 120 [deg.] C for 30 minutes, they are inoculated with a
platinum loop of a slant culture of Streptomyces roseus, MA839-A1 (FERM-P N [deg.] 3.017; ATCC 31245) and stirred culture at 27 [deg.] C for 24 hours to obtain a broth previously cultivated. In a 500 ml flask, a 100 ml portion of another medium (pH: 6.5) containing 3% glycerol, 0.75% L-leucine, 0.75% L- hydrochloride is charged. arginine, 0.75%
<EMI ID = 51.1>
silicone-based defoamer, sterilized at 120 [deg.] C for 30 minutes then, under aseptic conditions, 1 ml of the broth previously cultivated above is inoculated and cultivation is carried out at 27 [deg.] C for 3 days in a stirring machine operating at an amplitude of 7 cm and 210 back and forth movements per minute. The course of cultivation is indicated
<EMI ID = 52.1>
TABLE 6
Culture process
<EMI ID = 53.1>
After culturing for 72 hours, the cultured broth is filtered to remove the mycelium and the filtrate is adjusted.
<EMI ID = 54.1>
at pH 6, then passed through a column packed with 120 ml of "Diaion HP 40" to adsorb leupeptin. After washing with water, the adsorbed leupeptin is eluted with 50% aqueous methanol of pH 2 to collect 235 ml of a leupeptin fraction. After removal of methanol from the fraction
<EMI ID = 55.1>
<EMI ID = 56.1>
aqueous at pH 5.5 with dilute aqueous sodium hydroxide solution and extracted three times with 50 ml of n-butanol.
The extract layers are combined and distilled at 40 [deg.] C to remove n-butanol as an azeotrope with water and 100 ml of an aqueous solution containing 28 mg are obtained.
(potency) of leupeptin / ml. The aqueous solution thus obtained is adjusted to a pH of 2 with hydrochloric acid and removed.
the precipitate formed by filtration. The filtrate is passed through a column packed with 100 ml of activated carbon ("Refined Shirasagi", manufactured by "Takeda Chemical Co.") to adsorb.
leupeptin. After washing with dilute hydrochloric acid of pH 2, the adsorbed leupeptin is eluted with 20% aqueous acetone of pH 2 to obtain 210 ml of a leupeptin fraction. The leupeptin fraction was adjusted to pH 5 with "Dowex 44" resin (OH form) and concentrated to dryness under reduced pressure to obtain 4 g of an almost white powder having an activity of 580 mcg / mg. The powder is dissolved in methanol, then passed through a column containing
60 g of an acidic alumina (manufactured by "Woelm Co.", Federal Republic of Germany) suspended in methanol and developed with methanol to collect leupeptin fractions. The combined leupeptin fractions were concentrated to dryness under reduced pressure to obtain 2.22 g of a white powder of leupeptin hydrochloride having a potency of 1000 mcg / mg, the yield from the culture filtrate being 68%.
The above powder has a specific optical rotation 1a] <2> <3> of -75 [deg.] (C = 1, H20) and a melting point of 143-146 [deg.] C
(decomposition) ; this powder gives a positive Sakaguchi reaction, a positive Rydon-Smith reaction and a negative ninhydrin reaction. It has no specific absorption in the ultraviolet region, but only final absorption. As shown in Figure 2, the absorption spectrum of infrared rays of this powder coincides with that of a DL-leupeptin obtained by a conventional process.
20 mg of the above hydrochlorides are hydrolyzed with 6N hydrochloric acid in a sealed tube at 110 [deg.] C for 24 hours and the free fatty acid contained in the hydrolyzate is extracted with ethyl ether. The extract layer is concentrated and subjected to gas chromatography using
- reading a column packed with "Chromosolb 101" (60-80 meshes) <EMI ID = 57.1>
acetic acid. Consequently, it is confirmed that the
powder is leupeptin hydrochloride containing only one
acetyl group as an acyl group.
Then, about 200 mg of the hydrochloride is dissolved in 8 ml of water. To the hydrochloride solution above, all
with stirring at room temperature, add dropwise
a solution of 52 mg of potassium permanganate in 2 ml
of water and stirring continued for a further two hours to ensure oxidation. Then the excess potassium permanganate is neutralized with sodium thiosulfate
and the resulting mixture is passed through a packed column
of 5 ml of activated carbon. After washing with water, the adsorbed phase is eluted with 20% aqueous acetone, pH 2, to collect fractions giving a positive Sakaguchi reaction.
These fractions are combined, adjusted to a pH of 5 with the resin "Dowex 44" (registered trade mark, OH form) and evaporated.
dry to obtain 170 mg of a powder. This powder is dissolved in 1 ml of methanol and passed through a column containing 5 g of an acidic alumina suspended in methanol, then developed with 15 ml of methanol and then, with 25 ml.
of 50% aqueous methanol and a pH of 3.0. The fractions of the effluent are combined giving a positive Sakaguchi reaction,
they are adjusted to a pH of 5 with the resin "Dowex 4411 (registered trade mark, OH form) and evaporated to dryness to obtain
75 mg of leupeptin acid (acyl-L-leucyl-L-leucyl-arginine).
About 10 mg of this leupeptin acid is weighed accurately, 2 ml of 6N hydrochloric acid is added thereto and hydrolyzed in a sealed tube at 110 [deg.] C for 24 hours. The hydrolyzate solution is evaporated to dryness and dissolved in water. Part of the solution obtained is subjected to a qualitative and quantitative analysis of the constituent amino acids. The remainder of the solution was subjected to a biological assay using, as test organisms, lactic acid bacteria requiring L-arginine in order to determine the L-arginine content. The results
<EMI ID = 58.1>
TABLE 7
Composition of amino acids in leupeptinc acid hydrolyzate
<EMI ID = 59.1>
From the above results, it can be concluded that the hydrolyzed leupeptin acid contains L-leucine and L-arginine in a molar ratio of 2: 1, while it does not contain no valine, isovaline and D-arginine. As a result, it is confirmed that the leupeptin obtained
<EMI ID = 60.1>
L-leucyl-L-argininal.
Example 3
In a 500 ml flask, 100 ml of a medium (pH: 6.5) containing 3% glycerol, 0.75% L-leucine, 0.75% L-arginine hydrochloride, 0, are charged. 75% glycine, 0.5%
<EMI ID = 61.1>
of a silicone antifoam agent and sterilized at 120 [deg.] C for 30 minutes. In the sterilized medium is inoculated 1 ml of a broth previously cultivated and prepared in the same way
<EMI ID = 62.1>
a stirring machine operating at an amplitude of 7 cm and 210 back and forth movements per minute. The course of the. culture is shown in Table 8-.
TABLE 8
Culture process
<EMI ID = 63.1>
From the culture filtrate (2,350 mcg / ml, 800 ml), L-leupeptin is extracted in the same way as in Example 2, with the exception that "Amberlite XAD-4" is used instead of "Diaion HP40" resin and 1.22 g of L-leupeptin hydrochloride are obtained.
Example 4
In a 500 ml flask, 100 ml of a medium (pH: 6.5) containing 3% glucose, 0.75% L-leucine, 0.75% L-arginine hydrochloride, 0, is charged. 75% glycine, 0.8%
<EMI ID = 64.1>
0.2% ribonucleic acid and 0.1% of a silicone-based defoamer, then sterilized at 120 [deg.] C for 30 minutes. In the sterilized medium, 1 ml of a seed culture broth prepared in the same manner as in Example 2 is inoculated and cultured at 27 [deg.] C for 3 days in a shaking machine.
<EMI ID = 65.1>
back and forth per minute. The course of the culture is shown in Table 9.
TABLE 9
Culture process
<EMI ID = 66.1>
<EMI ID = 67.1>
L-leupeptin is extracted and purified in the same way as in Example 2, with the exception that the resin "Diaion HP20" is used instead of the resin "Diaion HP40" and one obtains 1 , 96 g of L-leupeptin hydrochloride.
Example 5
Each time, 100 ml portions of a medium (pH: 6.5) containing 3% of
<EMI ID = 68.1>
of silicone and sterilized at 120 [deg.] C for 20 minutes. In each portion, 1 ml of a broth previously cultivated and prepared in the same manner as in Example 2 is then inoculated, followed by cultivation at 27 [deg.] C for 3 days with a shaking machine operating at a temperature. amplitude of 7 cm and 210 back and forth movements per minute. The results obtained are shown in Table 10.
TABLE 10
Culture process
<EMI ID = 69.1>
From the culture filtrate (3,700 mcg / ml, 800 ml), the L-leupeptin is isolated in the same way as in Example 2, with the exception that the resin "Diaion HP30" is used instead of the "Diaion HP40" resin and 1.93 g of L-leupeptin hydrochloride are obtained.
Example 6
20 liters of a medium (pH: 6.5) containing 3% glycerol, 0.75% L-leucine, 0.75% L-arginine hydrochloride, are charged into a 30-liter fermentation tank, 0.75%
<EMI ID = 70.1>
0.05% KC1, 0.2% ribonucleic acid and 0.05% of an agent j
<EMI ID = 71.1>
s
30 minutes. In the sterilized medium, 200 ml of a
<EMI ID = 72.1>
<EMI ID = 73.1>
following conditions: agitator speed: 400 revolutions / minute air flow rate: 20 liters per minute. The course of the culture is shown in Table 11.
<EMI ID = 74.1>
Culture process
<EMI ID = 75.1>
From the culture filtrate (4,350 mcg / ml, 800 ml each time), the L-leupeptin is isolated in the same way as in Example 2, with the exception that instead of the resin "Diaion HP40", it is isolated. uses the resins "Amberlite XAD-1, XAD-5,
<EMI ID = 76.1>
<EMI ID = 77.1>
2.01 g of L-leupeptin hydrochloride.
CLAIMS
1. Process for the production of L-leupeptins, characterized in that it consists in inoculating a strain of Streptomyces producing leupeptins in a medium containing
nutrient sources, grow this strain under conditions
aerobic at a pH between 5 and 7 to produce and accumulate
L-leupeptins in the medium, then extract and purify the L-leupeptins from the culture broth to a pH of 7 or less.