<EMI ID=1.1>
ne et ses applications.
On a reconnu que le thymus est une glande endocrinienne ayant une fonction capitale dans le système des défenses immunolo.glques du corps. Récemment,on a examiné les extraits bruts de thymus de veau et on a constaté que ces extraits contiennent une famil
le d'hormones qu'on désigne sous le nom de thymosines et dont les
poids moléculaires se situent entre environ 3200 et 70.000 daltons
<EMI ID=2.1>
(1975)..
On pense que ces hormones agissent par un mécanisme de réglage du taux de maturation des cellules précurseuses incompétentes non encore identifiées en lyphocytes compétents (cellules T),
et deviennent ainsi des agents de lutte efficaces contre des "envahisseurs" externes. D'autre part, les cellules précurseurs d'autres types, par exemple les érythroldes, sont stimulées dans leur production et maturation par les préparations de thymosines.
Depuis peu de temps, on a utilisé un extrait relativement brut de
thymus de veau contenant de la thymosine pour renforcer la compéten.
ce immunologique d'une jeune fille née avec une Immunité détério-
<EMI ID=3.1>
Dans un rapport récente 1 on 8. également décrit une amélioration
de l'état hématologique total (augmentation du nombre à la fois
de globules blancs et de globules rouges) chez des patients traités par une préparation de tbymosines (voir Alexsandrowicz,
<EMI ID=4.1>
22-24-. 1974.
Il existe également des articles (voir par exemple
<EMI ID=5.1>
quent l'existence d'une activité analogue à celle des thymosines
dans le sang de porcs frais. On pense que le facteur responsable de
ce phénomène est un agent ayant un poids moléculaire d'environ
1.000 daltons.
La présente invention concerne des procédés et des compositions pharmaceutiques permettant de renforcer la compétence Immunologique.
La présente invention a également pour objet l'isolement
et la caractérisation d'une protéine possédant des propriétés
analogues à celles de l'hormone du thymus et ayant une compétence <EMI ID=6.1>
d'environ 56.700 daltons et la composition approximative cianrès en amino-acides:
<EMI ID=7.1>
La nouvelle protéine comporte de la glycine et de l'histidine en qualité d'amino-aeides N-terminaux. a un point isoélectrique d'en-
<EMI ID=8.1>
est composée de quatre sous-unités.
On a maintenant constaté que la protéine précédemment décrite était identique à la préalbumine du sérum humain, c'est-à-dire une protéine qui se retrouve naturellement dans le sérum humain,protéine qui a déjà été isolée, purifiée et identi-
<EMI ID=9.1>
<EMI ID=10.1>
L'identification de la présente protéine en qualité de préalbumine humaine a été faite par comparaison de ses propriétés physiques et chimiques avec un échantillon disponible dans le commerce et par la réactivité réciproque avec l'anticoprs de préalbumine humaine.
Bien que la préalbumine humaine ait déjà été décrite, on a pensé qu'elle agissait simplement en qualité de véhicule spécifique pour plusieurs molécules sélectionnées plus petites et on <EMI ID=11.1>
immunologique croissante" L'examen d'échantillons de préalbumine humaine qu'on trouve dans le commerce au cours de biotitrages sélectionnés, comme on l'expliquera par la suite, a montré effectivement que ces matières possèdent l'activité biologique précitée qui n'a pas encore été reconnue jusqu'à maintenant.
En conséquence, les principaux objets de l'invention eont : <EMI ID=12.1>
nologique en administrant une dose efficace de préalbumine de aérum humain à un sujet justifiable d'un tel traitement;
- des compositions pharmaceutiques utiles pour renforcer la compétence immunologique et comprenant une dose thérapeutiquemeit efficace de préalbumine de sérum humain en mélange avec un véhicule non toxique pharmaceutiquement acceptable; et
- des procédés d'isolement et de purification de la <EMI ID=13.1>
<EMI ID=14.1>
<EMI ID=15.1>
ainsi que de cellules d'autres espèces animales sans aucun dommage pour l'hôte.
Cette expression est bien connue et acceptée dans le domaine de l'immunologie, comme on peut le voir par exemple dans
<EMI ID=16.1>
l'immunité humorale fondée sur la production d'anticorps circulants solubles/et l'immunité par l'intermédiaire des cellules fondée
sur la production et le fonctionnement de certains types particu-
<EMI ID=17.1> <EMI ID=18.1>
Sans vouloir lier l'invention à un mode d'action quelconque , on pense que la matière considérée agit en augmentant à la fois le nombre et le taux de maturation des lymphocytes
<EMI ID=19.1>
incompétentes.
Le rehaussement de la compétence immunologique peut être démontré par divers indices utilisant des biotitrages aussi bien in vitro que in vivo sur des petits animaux, titrages qui sont bien connus dans l'art de l'immunologie. Par exemple,
on peut spécialement mentionner les titrages suivants:
1. Titrage de rosettes in vitro sensibles à l'azathioprine
(titrage de' rosette in vitro).
<EMI ID=20.1>
<EMI ID=21.1>
<EMI ID=22.1>
<EMI ID=23.1>
6. Réaction des lymphocytes mixtes'
7. Blastogénèse avec la concanavaline A.
8. Titrage spontané de rosettes in vitro
9. Production des lymphocytes cytotoxique
<EMI ID=24.1>
<EMI ID=25.1>
Selon l'invention,on a utilisé chacun des biotitrages ci-dessus pour démontrer le rehaussement de la compétence immunologique par préalbumine humaine, comme indiqué en détail dans les exemples.
Les titrages indiqués sont relatifs à une ou plusieurs des classes générales suivantes d'intérêt clinique,pour lesquelles la compétence immunologique constitue probablement un facteur:
-stimulation de la synthèse des anticorps (surtout les titrages 3 et 4):
-thérapie de remplacement; et de restauration (surtout les titrages 5 à 9); et
-maladies autoimmunes (surtout les titrages 10 et 11).
Le titrage le plus efficace pour une indication rapide
<EMI ID=26.1>
<EMI ID=27.1> <EMI ID=28.1>
Ce titrage est un bon indice du nombre de lymphocytes immunologiquement compétents de la classe T. C'est cette classe de lymphocytes qui est impliquée dans le fonctionnement coopéra-
<EMI ID=29.1>
et ce sont également les cellules principales qui règlent l'immunité par l'entremise des cellules. Un grand nombre de preuves supporte ou corrobore l'intérêt de ce titrage pour déterminer l'état
<EMI ID=30.1>
tant,,. par exemple dans les maladies autoimmunes (érythematose de lupus, colite. avec ulcération, anémie hémolytique autoimmune,
<EMI ID=31.1>
ou radiologique et ainsi de suite.
On a trouvé que la préalbumine humaine, essentiellement exempte d'impuretés, préparée comme ci-dessous, possède une
<EMI ID=32.1>
rieur à un nanogramme.
Bien qu'il soit souhaitable pour de nombreuses raisons et dans de nombreuses applications d'utiliser la préalbumine humaine essentiellement pure au sein d'une composition permettant l'administration thérapeutique, la purification fastidieuse et la préparation difficile d'une matière pure en quantités importantes, qui sont responsables d'une perte considérable de matières et aussi de frais et d'efforts importants, militent en faveur de l'utilisation, pour de nombreux usages thérapeutiques, de fractions
<EMI ID=33.1> <EMI ID=34.1>
pour des applications thérapeutiques.
la préalbumine humaine, sous forme essentiellement pure ou en qualité d'un composant d'une fraction partiellement purifiée et ne contenant pas d'impuretés cytotoxiques, peut être préparée sous forme de compositions pharmaceutiques ou médicales usuelles en mélangeant cette albumine avec des excipients non toxiques pharmaceutiquement acceptables. Par exemple, on peut mélanger la matière avec des véhicules pharmaceutiques inertes, organiques ou minéraux, convenant pour une administration parentérale
(intramusculaire, sous-cutanée, ou intraveineuse), notamment sous forme d'une solution, suspension ou autre composition liquide, sous forme de doses unitaires ou divisées.
Les compositions pharmaceutiques qui contiennent le produit selon l'invention peuvent être soumises aux traitements usuels dans l'art pharmaceutique, par exemple a la stérilisation
(filtration à travers un filtre millipore),et peuvent contenir des excipients pharmaceutiques classiques tels que des agents de conservation, des stabilisants,des agents d'émulsionnement, des agents de voluminosité et de liaison, des sels pour le réglage de la pression osmotique et des tampons. Les compositions peuvent également contenir d'autres matières thérapeutiquement utiles qui prolongent la durée d'activité du composé considéré. Les modes
de préparation des compositions sous forme de dosages variés
sont bien connus ou évidents pour les spécialistes. Une énumération très complète des techniques de formulation peut être trouvée
<EMI ID=35.1>
<EMI ID=36.1>
fermant la matière selon l'invention est une reconstitution de la préalbumine humaine lyophilisée, cette préalbumine humaine, préparée comme on le verra plus loin,peut être stérilisée ou lyophilisée isolément ou avec d'autres excipients solides et peut être emmagasinée dans des fioles stériles Jusqu'au moment de s'en servir. Immédiatement avant l'administration, on ajoute la quantité nécessaire de solvant, par exemple d'eau, d'eau contenant des agents de conservation ou une solution de divers excipients
<EMI ID=37.1> <EMI ID=38.1>
tient la préalbumine humaine en une proportion thérapeutiquement efficace pour le traitement de la maladie considérée.
La posologie peut comporter des dosages unitaires ou des dosages divisés mais, dans tous les cas, l'administration devra être réglée par le médecin traitant en fonction des besoins du sujet.
Cependant,pour guider d'une façon générale les spécialistes, on administre la matière essentiellement pure à une dose
<EMI ID=39.1>
<EMI ID=40.1>
ou bien son traitement doit être déterminé en fonction des résultats du traitement journalier initial aux dosages indiqués. Quand la fraction est moins pure,son administration doit se faire en des dosages plus élevés de façon correspondante.
On peut isoler la préalbumine humaine sous forme d'un composant d'une fraction partiellement purifiée, ne contenant pas d'impuretés cytotoxiques, ou bien sous une forme essentiellement pure, en partant du sang humain ou d'une fraction de sang humain facilement disponible, en utilisant un procédé de purification à stades multiples.
Une source particulièrement précieuse de préalbumine humaine est la fraction de sang humain connue sous le nom de fraction Cohn IV-1 qu'on obtient, et qu'on met en général au rebut comme fraction inutilisable/pendant le fractionnement du sang humain. On voit donc que cette fraction est disponible en abondance de toutes les sources de sang et elle est relativement bon marché.
<EMI ID=41.1>
<EMI ID=42.1>
de l'activité par le titrage de rosettes la fraction Cohn IV-1 représente une purification d'environ 10 fois à partir du sérum humain brut. Ainsi, la préalbumine humaine pure ayant, dans le
<EMI ID=43.1>
<EMI ID=44.1>
<EMI ID=45.1>
et un rehaussement de 240.000 à 1.200.000 fois d'activité par rapport au sérum humain brut. On pense que ce rehaussement d'activité s'explique en partie par l'élimination de la fraction inhibitrice <EMI ID=46.1>
l.a Filtration moléculaire pour éliminer les matières d'un poids
moléculaire trop élevé et d'un poids moléculaire trop faible ou
b. Fractionnement au sulfate d'ammonium.
<EMI ID=47.1>
3. Répétition du stade 2 ou électrophorèse à écoulement libre.
4. Electrophorèse préparative sur gel, et
5. Chromatographie sur gel.
pendant chaque stade du procédé de purification, on soumet les diverses fractions obtenues à un titrage de routine, de préférence un titrage de rosette in vitro,pour déterminer l'activité analogue à celle de l'hormone du thymus. On traite la ou les fractions possédant la majeure partie d'une telle activité au cours des stades ultérieurs, c'est-à-dire qu'on concentre les fractions actives en volumes de plus en plus petits tout en séparant le composant actif des impuretés inactives Jusqu'à l'obtention de la matière désirée sous forme essentiellement pure.
. Alors que les modes de réalisation préférés des stades de purification ci-dessus sont décrits dans les exemples 1 et 9, on va donner ci-après une brève description du procédé de purification.
On peut facultativement lyophiliser la fraction Cohn IV-1 brute, On effectue commodément cette opération en mettant ladite fraction en suspension dans de l'eau distillée ou désionisée; en agitant pour rompre les agglomérats et ensuite en éliminant
<EMI ID=48.1>
La matière lyophilisée possède une plus grande stabilité et on peut la stocker sous réfrigération pendant des périodes prolongées. Avant la purification,on forme avec la fraction
Cohn IV-1 brute ou lyophilisée une solution aqueuse et, de préfé-
<EMI ID=49.1>
distillée ou désionisée en qualité de solvant, en réglant de préférence le pH à 7, 0 environ' alors que pour le fractionnement <EMI ID=50.1>
Dans un mode de mise en oeuvre du présent procédé, on soumet la fraction Cohn IV-1 (brute ou, de préférence, lyophilisée) en solution dans l'eau désionisée ou distillée, à deux filtrations moléculaires de façon à éliminer les composants dont les poids moléculaires sont notablement plus élevés ou moins élevés que celui du produit recherché. Une technique appropriée de filtration moléculaire comporte le passage initial de la solution décrite à travers un fractionneur à fibres creuses comportant une membrane filtrante convenable pour éliminer les composants de poids moléculaire élevé (supérieur à 60.000 ou
70.000 dallons selon la pression de filtration). Des fractionneurs/fibres creuses de modèles appropriés sont (selon le volume
<EMI ID=51.1>
Si l'on utilise l'appareil DC-2 la membrane filtrante appropriée
<EMI ID=52.1>
un filtre convenable est "Amicon .HIOX-50".
Le filtrat provenant de la filtration moléculaire cidessus subit une seconde filtration moléculaire pour éliminer les matières de bas poids moléculaire. C'est ainsi que le passage à travers un fractionner en fibres creuses d'un type analogue, muni d'une membrane permettant de retenir les matières dont le poids moléculaire est d'environ 10.000 daltons ou plus, permet d'obtenir la matière désirée ayant un poids moléculaire d'environ
56.700 daltons que l'on isole sous forme de rétentat. Un filtre approprié pour cet usage est l'appareil "DC-2" muni d'une membrane "Amicon HIDP-10" et l'appareil "DC-30" avec une membrane "Amicon HIOSM".
En variante/on peut inverser le procédé de filtration, c'est-à-dire qu'on commence par enlever les matières de bas poids moléculaire et ensuite les impuretés d'un poids moléculaire trop élevé. On préfère cependant la première variante.
Dans un second mode de mise en oeuvre,qui est également avantageux, on soumet la fraction Cohn IV-1, brute ou , de préférence lyophilisée,à un fractionnement au sulfate d'ammonium. Par cette technique, le rendement en matière désirée est beaucoup plus important (environ 8 fois plus grand) que celui qu'on obtient
par les techniques de fractionnement moléculaire décrites plus haut.
<EMI ID=53.1> <EMI ID=54.1>
centrifugation pour faire disparaître les sédiments. On traite
<EMI ID=55.1>
portions de sulfate d'ammonium en vue de relarguer les diverses fractions. Après chaque addition de sulfate d'ammonium,on sépare le précipité formé du surnageant que l'on traite ensuite davantage avec du sulfate d'ammonium.
On soumet à un relargage ou on précipite la fraction contenant la matière désirée, en ajoutant du sulfate d'ammonium de manière à amener la teneur en sulfate d'ammonium dans la solution à une valeur d'environ 40 à 60% de saturation. En consultant les tables de solubilité, on peut facilement déterminer la quantité de sulfate d'ammonium nécessaire pour aboutir au degré approprié de saturation.
<EMI ID=56.1>
matière désirée par des techniques bien connues, par exemple par une diafiltration ou,de préférence, une dialyse de la solution du précipité dans l'eau distillée. On concentre la matière dessalée en vue du stade suivant,par exemple par lyophilisation à l'état congelé.
Au stade suivant,la matière désirée provenant de la filtration moléculaire ou du fractionnement au sulfate d'ammonium est soumise à une chromatographie sur une colonne de gel de polysaccharide qui fractionne les composants appliqués à la colonne selon leur poids moléculaires. On prépare des colonnes convenables avec des dextranes réticulés, comme par exemple Sephadex (G-75, G-100, G-150, ou 0-200),produit par Pharmacia Fine Chemicals. Une matière préférée est Sephadex G-150 car on obtient une séparation optimale des composants comme on peut le constater par un examen
de la courbe donnant Kav en fonction du logarithme du poids molé-
<EMI ID=57.1>
effectué une telle chromatographie sur gel en faisant passer à travers la colonne chargée un tampon aqueux d'élution à pH d'envi-
<EMI ID=58.1>
<EMI ID=59.1>
fractions de l'éluent de la chromatographie sur gel et on peut déterminer la ou les fractions qui contiennent le composant désiré <EMI ID=60.1>
un biotitrage. On peut étalonner la colonne de façon que la fraction d'éluent contenant le produit dans l'intervalle désiré de poids moléculaire soit facilement déterminée (voir Andrews, référence citée).
De préférence, on dessale la ou les fractions désirées
<EMI ID=61.1>
appropriées, pour retenir la matière désirée. A titre de membranes convenables., on peut citer les membranes "Amicon" UM-05 et UM-10 dont les pouvoirs de coupure en poids moléculaires sont respectivement de 500 et 10.000. D'autres membranes appropriées sont les mem-
<EMI ID=62.1>
Au stade suivant, on peut recycler la matière provenant de la chromatographie sur gel :vers la même colonne ou une colonne similaire de gel ou, en variante,on peut la soumettre à une électrophorèse à écoulement libre. Pour une telle électrophorèse, on pro-
<EMI ID=63.1>
être entre 5,0 et 5,5, de préférence d'environ 5,25. Un tampon préféré pour établir un tel pH est un mélange d'acétate de sodium et.d'acide acétique. On peut également établir l'emplacement du
<EMI ID=64.1>
totales et/ou un biotitrage ou encore par l'utilisation d'une colonne étalonnée.
On soumet ensuite la matière désirée provenant du stade précédent à une électrophorèse préparative sur gel de disques de
<EMI ID=65.1>
technique, on préfère que l'électrophorèse soit effectuée de manière que le gel séparateur et le tampon d'élution soient à un pH
<EMI ID=66.1>
pour établir un tel pH est le produit Tris-HCl. Normalement,après cette opération, on obtient une préalbumine humaine homogène sur
<EMI ID=67.1>
libère la matière de l'acide polyacryllque et des sels résiduels <EMI ID=68.1>
élué de la colonne contient la matière active comme on le démontre par les critères précités et on peut obtenir le produit luimême, par lyophilisation.
Les exemples suivants décrivent la préparation de la préalbumine humaine aussi bien essentiellement pure que partiellement purifiée, ainsi que les biotitrages utilisés et les résultats obtenus. Ces exemples, dans lesquels toutes les proportions sont en poids, sauf indication contraire,servent à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée, comme l'appréciera l'homme de l'art.
EXEMPLE 1-
<EMI ID=69.1>
<EMI ID=70.1>
<EMI ID=71.1>
(Cutter Laboratories) dans 20 litres d'eau doublement distillée
à 5[deg.]C pendant 4 heures et on lyophilise pour obtenir 1105g de matière sèche qu'on met en suspension dans 10 volumes d'eau désioni-
<EMI ID=72.1>
agite le mélange pendant 1 heure à température ambiante. On élimine le sédiment et on fait passer le surnageant à travers une cartou-
<EMI ID=73.1>
lyophilisation du rétentat,on obtient 50g de matière que l'on chro-
<EMI ID=74.1>
<EMI ID=75.1>
<EMI ID=76.1>
<EMI ID=77.1>
terminer les protéines totales puis à un titrage de rosette in vitro. On. récupère plus de 90% de l'activité éluée dans une frac-
<EMI ID=78.1>
50.000 à 70.000 daltons. cette matière (total de toutes les opéra- <EMI ID=79.1>
bre à pH 5,25 dans un système de tampon acétate (25 mM NaOAo-7mM HOAo) . Comme ci -dessus, on surveille la progression par la <EMI ID=80.1>
ratière résultant de la combinaison des fractions actives est soumise à une nouvelle purification par électrophorèse préparative sur gel de polyacrylamide en utilisant un gel réticulé à 10%.
Les gels d'espacement et des échantillons sont 0,060 M dans Tris qu'on règle à pH 6,6-6,8 avec HC1.Le gel séparateur est 0,375 M dans Tris qu'on règle à pH 8,9 avec HC1. Le tampon dans le réci-
<EMI ID=81.1>
pH réglé à 3,8-9,0 avec HC1. On élue l'activité dans une fraction
<EMI ID=82.1>
fraction d'albumine. Cette matière (total approximatif 100 mg) est homogène du point de vue électrophorètique quand on la fait passer dans un système analytique à pH 8,9.
Quand on répète la chromatographie sur Sephadex, comme on vient de le décrire sur une microcolonne (0,8 x 76 cm), on obtient de la préalbumine sensiblement pure sous forme d'un corps solide blanc.
<EMI ID=83.1>
tion dans un appareil d'ultracentrifugation.modèle E, de Spinco,
<EMI ID=84.1>
molécule par équilibre de sédimentation pour trouver 56.700 dal-
<EMI ID=85.1>
suivre d'une électrophorèse à pH 7,0 dans un gel d'acrylamide contenant du dodécylsulfate de sodium, on trouve que le poids moléculaire de la matière non dissociée est de 52.000 daltons et qu'une dissociation partielle apparaît pour fragmenter le produit en quatre sous-unités ayant un poids moléculaire d'environ 13.500 daltons chacune.
La protéine est homogène lors d'une focalisation
<EMI ID=86.1> histidine. On détermine la composition des amino-acides par hydrolyse des protéines et par chromatographie à l'aide d'un analyseur <EMI ID=87.1>
<EMI ID=88.1>
On établit encore l'identité par comparaison avec des échantillons authentiques de préalbumine humaine.
EXEMPLE 2-
<EMI ID=89.1>
mine humaine.
<EMI ID=90.1>
ment selon la technique décrite par Bach.. J.F. et al, Proc. Mail.
<EMI ID=91.1>
le suivant:
A. Préparation d'une solution de réserve de sel sodi-
<EMI ID=92.1>
Burroughs Wellcome) dans 25 ml d'eau dans un flacon volumétrique, puis on ajoute environ 1 ml de,NaOH normal, goutte à goutte et
<EMI ID=93.1>
<EMI ID=94.1>
<EMI ID=95.1> <EMI ID=96.1>
tion finale à l'abri de. la lumière dans un réfrigérateur. On contrôle la stabilité en mesurant la densité optique à 280 et 330 nm.
B. Pour le titrage lui-même,on se procure des cellules de rate de souris Simonsen C57B1/6, mâles, agées de 6 à 8 semaines, ayant subi une thymectomie 7 à 30 jours avant de les sacrifier.
On homogénéise les rates individuelles et on les lave dans une solution saline froide équilibrée de hank, On forme des pastilles avec les,: cellules à 200 x g pendant 10 minutes dans un appareil réfrigéré de centrifugation. On obtient ainsi une suspension finale groupée de 40 à 60 x 10 cellules nuclées par millilitre.
Série-témoin: Pour déterminer la sensibilité des cellules de rate thymectomisées au sel sodique d'azathioprine, on titre le sel sodique d'azathioprine dans l'intervalle de 25 à 1,56 microgrammes par tube en utilisant des dilutions successives à deux reprises de 0,25 ml de la solution de réserve (partie A) dans
la solution de Hank. On ajoute à chaque dilution la suspension des
<EMI ID=97.1>
par tube.
Série d'essai: On dilue successivement à deux reprises
<EMI ID=98.1>
quotes 0,125 ml). On ajoute 2,5 microgrammes de sel sodique dtazathioprine dans 0,125 ml de solution de Hank et'0,1 ml de suspension de cellules de rate à chaque dilution de la fraction d'essai.
Aussi bien pour la série-témoin que pour la série d'essai, on incube à 37[deg.]C dans un bain-marie pendant 60 minutes. On
<EMI ID=99.1>
abrégé SRBC) dans une solution d'Alsever (Grand Island Biological
<EMI ID=100.1>
<EMI ID=101.1>
cellules en pastilles dans une machine de centrifugation réfrigérée fonctionnant à 200 x g pendant 5 minutes.On réfrigère les cellules
<EMI ID=102.1>
suspension dans un rotateur pendant 5 minutes et on compte les rosettes dans un hémocytomètre Malessez.
On détermine l'activité spécifique par la quantité minimale de protéines dans les fractions d'essai qui Inhibent la forma-
<EMI ID=103.1>
de sel sodique d'azathioprine� L'activité spécifique des fractions
0 <EMI ID=104.1>
le tableau suivant, qui exprime le'facteur de purification relative en utilisant comme référence la fraction Cohn IV-1.
<EMI ID=105.1>
Le tableau ci-dessus montre que le titrage des rosettes in vitro permet de surveiller la purification de la préalbumine humaine et il met en évidence qu'on peut réaliser une purification de 60.000 fois (calculée par rapport à l'activité) en partant
<EMI ID=106.1>
EXEMPLE 3-
Stimulation de la synthèse des anticorps.
Quand on injecte à des animaux normaux, ou à des animaux ayant subi un abaissement expérimental de l'aptitude aux réponses
<EMI ID=107.1>
ayant la capacité de "neutraliser" la matière étrangère.
Protocole : On traite des souris normales (souche C57HL/6) en une seule injection intraveineuse, avec des érythrocytes de brebis (SRBC) en qualité de stimulant antigène. En même temps,on injecte à des souris d'essai, par voie intraveineuse, une certaine quantité de préalbumine humaine (une fraction appropriée par exemple comme indiqué dans le tableau de l'exemple 2). Les souris témoins reçoivent l'antigène et l'albumine de sérum bovin (BSAJ. Sept jours plus tard, on sacrifie les animaux.,on <EMI ID=108.1>
<EMI ID=109.1>
cellules de rate.
A . Le tableau ci-après fait ressortir la formation des anti-corps en utilisant une fraction de préalbumine humaine
<EMI ID=110.1>
<EMI ID=111.1>
Ces résultats montrent que l'administration de la préalbumine humaine augmente fortement la capacité des cellules de rate à
<EMI ID=112.1>
B. On peut également mettre en évidence l'effet de la préalbumine humaine ("hormone") sur la synthèse des anticorps par un titrage in vitro. Dans ce cas, on prélève les cellules des rates des souris C57B1/6J, on les cultive et on les traite avec les érythrocytes de brebis, ou bien avec les érythrocytes de brebis et l'hormone ou bien avec l'hormone toute seule. L'hormone utilisée sans ce cas provient du stade 3 du taBeau de l'exemple
2. On mesure la réponse aux anticorps après5 3 ours de culture.0n
<EMI ID=113.1>
dans le tableau suivant.
<EMI ID=114.1>
Ces résultats démontrent que la composition de préalbumine humaine est active pour stimuler la synthèse de l'anticorps
<EMI ID=115.1>
EXEMPIE 4-
Effet de la préalbumine humaine sur des souris ayant subi une thymectomie néonatale.
Il est bien connu que la thymectomie néonatale crée un "infirme immunologique" . Les animaux opérés ne grandissent pas normalement, dépérissent et n'offrent que peu de résistance aux infections, et ils ne peuvent pas synthétiser des anticorps en réponse à l'attaque par des antigènes spécifiques et ne possèdent pas d'immunité par l'entremise des cellules, c'est-à-dire qu'ils ne peuvent pas rejeter une greffe dermique d'une souche allogène de la même espèce. En général, les aninaux ainsi opérés meurent au bout de 5 à 10 semaines sous l'effet d'une infection généralisée qui dépend du degré d'absence ou de présence des agents infectieux dans l'environnement où ils sont logés. Le syndrome
de la thymectomie néonatale a été étudié sur diverses espèces et aussi chez des enfants nés sans thymus ou avec une aplasie ou dys-
<EMI ID=116.1>
<EMI ID=117.1>
262 (1974).
Protocole: On soumet à la thymectomie des souris C57B1/Ka dans les 24 heures après la naissance,en utilisant des techniques de stérilisation chirurgicale, et on loge les souris dans des conditions d'absence d'organismes pathogènes spécifiques d'infection. On traite des groupes de dix souris ayant subi une telle opération, de la façon indiquée ci-dessous. Comme protéine témoin, on utilise l'albumine de sérum bovin (BSA).
A. Synthèse des anticorps.
En commençant neuf semaines après la thymectomie, on
<EMI ID=118.1> <EMI ID=119.1>
<EMI ID=120.1>
pour cet essai est celle qui figure au stade 2 du tableau de l'exemple 2. On sacrifie les animaux une semaine après la dernière injection d'hormone ou 5 jours après l'unique injection i.p. d'antigène, savoir d'érythrocytes de brebis. On détermine les
<EMI ID=121.1>
tableau ci-après:
<EMI ID=122.1>
Ce tableau met en évidence que l'administration de la composition de préalbumine humaine rétablit chez les souris ayant subi une
<EMI ID=123.1>
<EMI ID=124.1>
dire un antigène tributaire de la fonction du thymus.
B. Interaction des lymphocytes mixtes.
Quand on mélange in vitro les cellules lymphoïdes de souris d'une souche spécifique avec les cellules lymphoïdes de souris d'une souche non apparentée, le caractère "étranger", du point
<EMI ID=125.1>
Comme indiqué plus bas, on peut empêcher la prolifération de l'une des deux populations de cellules ou bien on peut provoquer
la blastogénèse de cette population en ajoutant à cette dernière, avant le mélange,un agent qui inhibe la division des cellules. L'aptitude des cellules à reconnaître les cellules étrangères'est
<EMI ID=126.1>
raisons génétiques sont incapables d'une reconnaissance de ce genre, c'est-à-dire qu'elles ne réagissent pas dans la réaction des lymphocytes mixtes lors d'une incubation par des cellules
<EMI ID=127.1>
A.L., et al. J. Immunol., Vol. 106, p. 773 (1971).
<EMI ID=128.1>
néonatale et traitées à l'âge de quatre semaines par une injection
<EMI ID=129.1>
thymectomie néonatale, reçoit des doses analogues de 1 mg d'albumine de sérum bovin. On sacrifie ensuite les animaux et on dissèque les nodes de lymphes (mésentériques, axillaires et inguinaux) et les rates. On teste les suspensions cellulaires des nodes de lymphes de chaque souris dans la réaction de lymphocytes mixtes
en utilisant des nombres égaux de cellules de nodes de lymphes C57B16 /Ka (A) et de cellules (B) allogènes (BIA). L'incorporation de base pour chaque type de cellules est obtenue séparément et soustraite de la valeur de la réaction des cellules mixtes pour
<EMI ID=130.1>
par suite de l'interaction des deux types de cellules.
Les résultats obtenus sont les suivants:
T[
<EMI ID=131.1>
Il apparait clairement que les cellules nodales des lymphes provenant d'animaux traités par la composition de préalbumi-
<EMI ID=132.1>
ce de stimulation . Les résultats font ressortir que les cellules des souris ayant subi une thymectomie néonatale et un traitement par une composition selon l'invention sont fortement rehaussées du point de vue de la compétence immunologique qui se reflète par leur capacité de "reconnaître" les cellules des nodes lymphatiques d'une souche histo-incompatible de souris. EXEMPLE 5-
Prolifération des tissus lympholdes
Les souris privées de leur thymus dans les 24 à 48 heu-
<EMI ID=133.1>
privées de thymus pour des raisons génétiques (souris "nues ") <EMI ID=134.1>
sont petits et font preuve d'une carence en lymphocytes. Cela
<EMI ID=135.1>
thymus produit des nombres importants de cellules lymphoïdes qui sont "exportées" et ensemencées dans les organes lymphoïdes périphériques où ces cellules prolifèrent. Il en résulte normalement la croissance et la maturation de structures lympholdes normales.
protocole: On administre à des souris privées de thymus pour des raisons génétiques, âgées de quatre semaines, huit injections sous-cutanées journalières de 1 mg de la composition de pré-
<EMI ID=136.1>
de l'exemple 2, sur une période de deux semaines avant de sacrifier les animaux. Les souris témoins reçoivent des injections de 1 mg d'albumine de sérum d bovin. On dissèque les nodes lymphatiques
(mésentériques, inguinaux et axillaires), on les buvarde, on les
<EMI ID=137.1>
tient les résultats suivants:
<EMI ID=138.1>
On peut remarquer que la prolifération des cellules
<EMI ID=139.1>
<EMI ID=140.1>
génétiques ont des tissus lympholdes petits et mal développés. Les résultats ci-dessus font ressortir une augmentation du nombre de
<EMI ID=141.1>
augmentation de 200 fois.
EXEMPLE 6-
<EMI ID=142.1>
connu comme agissant sur les cellules T immunologiquement compétentes, en vue d'en accélérer la maturation et la différentiation.
<EMI ID=143.1>
<EMI ID=144.1>
même que celui décrit au sujet de la prolifération des tissus lymphoïdes (exemple.5) en utilisant la même composition et la même quantité de préalbumine humaine. Le titrage utilisé est celui
<EMI ID=145.1>
<EMI ID=146.1>
<EMI ID=147.1>
L'injection de la composition de préalbumine humaine augmente d'environ quatre fois la réponse mitogène des cellules à la coacanavaline A. Ainsi, l'administration de cette matière à des souris nues augmente le nombre de cellules hôtes manifestant
des propriétés des cellules T sur le plan de la réponse au mitogène.
<EMI ID=148.1>
Le nombre de cellules formant spontanément des rosettes d'érythrocytes (E) dans les lymphooytes du sang périphérique est
<EMI ID=149.1>
que cet indice reflète le nombre de cellules T circulantes immunologiquement compétentes.
Chez des individus normaux, le nombre de cellules de rosettes E dans le sang périphérique représente en général de 65
à 80% de la population totale de lymphocytes. Des valeurs plus basses sont fréquemment constatées dans des états immunologiquement déficients, notamment dans le cas de maladies malignes,d'aplasie
<EMI ID=150.1>
path . Vol. 1, p..511 (1973). Un changement de + 10% (sur une échelle de 100%) est considéré comme significatif, Les résultats <EMI ID=151.1>
<EMI ID=152.1>
Influence de la préalbumine humaine (hormone qui correspond au
<EMI ID=153.1>
des cellules formant spontanément des rosettes E en présence d'érythrocytes dans les lymphocytes du sang périphérique d'individus normaux et de patients souffrant de la maladie de Hodgkin.
<EMI ID=154.1>
Les résultats précédents suggèrent qu'une incuba-
<EMI ID=155.1>
phocytes séparés,du sang périphérique provenant d'individus, dont les pourcentages des cellules formant spontanément des rosettes E sont -inférieurs à la normale, se traduit par une augmentation du pourcentage de ces cellules. De tels résultats ont été interprétés pour indiquer qu'une concentration insuffisante des hormo-
<EMI ID=156.1>
des rosettes E dans des conditions cliniques envisagées. Au contraire,les cellules précurseurs semblent être présentes chez ces individus,étant donné que l'incubation de ces cellules avec <EMI ID=157.1>
nombre des cellules formant spontanément des rosettes E.
Les patients souffrant de la maladie de Hodgkin ont fréquemment des nombres de cellules formant spontanément des rosettes E au-dessous de la normale. Les résultats ci-dessus font ressortir que les lymphocytes périphériques chez cinq des six patients souffrant de la maladie de Hodgkin présentent,lors de
<EMI ID=158.1>
tation significative du pourcentage des cellules formant spontanément des rosettes E..
En outre,la composition de la préalbumine humaine a réussi à contrecarrer l'effet inhibiteur d'un extrait de rate provenant de patients souffrant de la maladie de Hodgkin,sur les nombres de cellules capables de former spontanément des rosettes E dans les lymphocytes du sang périphérique des individus normaux et un patient souffrant de la maladie de Hodgkin.
EXEMPLE 8-
Activité de la composition de préalbumine humaine in vivo
On utilise le titrage des cellules formant des rosettes chez les brebis (exemple 2) pour des essais dans lesquels on administre in vivo une composition de préalbumine humaine hautement purifiée (qui correspond au stade 6 du tableau de l'exemple 2). Le protocole est le suivant:
On administre la composition qu'on désire essayer à des souris adultes normales C57B1/6 (âgées de 6 à 8 semaines)
et ayant subi une thymectomie deux semaines avant l'essai. On effectue les injections journalières pendant trois jours successifs
<EMI ID=159.1>
24 heures après la dernière injection, on sacrifie les animaux,on enlève rapidement les rates,on prépare des suspensions cellulaires et on les utilise pour le titrage des rosettes. Les résultats sont résumés dans le tableau ci-après:
<EMI ID=160.1>
<EMI ID=161.1>
gique a été rétablie dans les cellules de la rate des souris, ayant subi la thymectomie, par l'administration de la composition selon l'invention. Il convient de remarquer que l'injection de la composition de préalbumine humaine purifiée rétablit dans les cellules de la rate des souris ayant subi la thymectomie une sensibilité vis-à-vis des effets inhibiteurs de l'azathioprine,en se basant sur le nombre de cellules formant des rosettes de rate, à une valeur égale à celle des cellules de rate d'une souris normale. L'activité absolue de la composition utilisée dans le titrage in vivo est de 0,4 ng.
EXEMPLE 9-
<EMI ID=162.1>
humaine provenant de la fraction Cohn IV-1
On agite 100g de fraction Cohn IV-1(poids humide) avec 500 ml d'eau distillée pendant 4 heures à une teppérature de 2 à 5[deg.]C. On lyophilise ensuite la suspension et on obtient environ 40g de poudre sèche, que l'on dissout ensuite dans 1000 ml d'un tampon 50 miM Tris/100 mM chlorure de sodium/0,02% azoture de sodium, à pH 8,0 et on agite pendant 3 heures à la température ambiante. On soumet la solution à une centrifugation au taux de
13.000 x g.pendant 30 minutes à 2-5[deg.]C. On sature ensuite à 40% avec du sulfate d'ammonium le surnageant limpide verdâtre au sein d'un récipient convenable entouré de glace et,pour cela, on ajoute
243 g de sulfate d'ammonium à 1000 ml du surnageant. On laisse la
<EMI ID=163.1>
<EMI ID=164.1>
avec du sulfate d'ammonium en ajoutant 132 g de sulfate d'ammonium
<EMI ID=165.1>
demment. On dissout le précipité dans un volume minimum d'eau froide distillée et on dialyse à fond au froid contre l'eau distillée après quoi on lyophilise et on obtient 17 g de matière.
<EMI ID=166.1>
colonne de Sephadex G-150 (50 x 90 cm, volume total du lit 1760 cm� équilibrée avec un tampon 50 mM Tris -100 mM chlorure de sodium0,02% azoture de sodium, à pH 8 et on élue la colonne avec le même tampon. On recueille la matière éluée dans l'intervalle des poids moléculaires de 40.000 à 70.000 daltons,on dessale par diafiltra-
<EMI ID=167.1>
d'azote de 4,9 à 5,6 bars et on lyophilise. Après toutes ces <EMI ID=168.1>
la colonne Sephadex représente 4g .
Après une nouvelle chromatographie de la matière,
<EMI ID=169.1>
Sephadex et en effectuant ensuite une diafiltration et une lyophilisation comme précédemment,on obtient 2 g de matière.
Le tableau ci-après montre le poids de la matière et l'activité par titrage des rosettes in vitro selon l'exemple 2.
<EMI ID=170.1>
On peut soumettre la matière provenant de ce procédé à une électrophorèse préparative sur gel de polyacylamide et à une ehromatographie sur une mierocolonne comme décrit dans l'exemple 1 pour obtenir une matière pratiquement exempte d'impuretés et dont l'activité dans le titrage des rosettes in vitro est comparable à celle
<EMI ID=171.1>
ron..
EXEMPLE 10-
Effet de la préalbumine humaine in vitro pour promouvoir la matura-
<EMI ID=172.1>
Les thymocytes non arrivés à maturation provenant de souris normales ne sont pas normalement des cellules T avec une activité cytotoxique notable. L'accélération de la maturation des
<EMI ID=173.1>
indication du rehaussement de la compétence immunologique.
Protocole: On cultive 1 x 10' thymocytes de souris C57B1/6 avec 5 x 106 cellules irradiées de rate de souris Balb/c, avec ou sans 5 microgrammes de matière qui correspond au dernier
<EMI ID=174.1>
On mesure la cytotoxicité sur des cellules P815 Y(H-2d) marquées
<EMI ID=175.1>
<EMI ID=176.1>
Ces résultats montrent que les cellules lympholdes ne possédant pas normalement d'activité cytotoxique font preuve de propriétés d'un développement d'une cytotoxicité notable sous l'effet de l'exposition in vitro à la composition de
<EMI ID=177.1>
Comme il est indiqué dans l'exemple 5,les cellules lympholdes des souris nues n'ont pas habituellement de réponse immunologique. On a effectué une étude pour déterminer l'effet de la composition de préalbumine humaine sur la création d'une réponse immunologique par les cellules de la rate d'une souris nue ayant subi une incubation in vitro. La réaction des lymphocytes mixtes (voir exemple 4) est le système de titrage choisi.
<EMI ID=178.1>
<EMI ID=179.1>
<EMI ID=180.1>
<EMI ID=181.1>
On utilise une concentration de 2 microgrammes par tube de la composition de préalbumine humaine (hormone),qui correspond au dernier stade du tableau de l'exemple 9. Les valeurs sont des
<EMI ID=182.1>
<EMI ID=183.1>
Les résultats montrent qu'alors que les cellules des rates des souris nues incubées avec l'albumine de sérum bovin ne répondent pas à la réaction des lymphocytes mixtes,des cellules
<EMI ID=184.1>
5 x 105 cellules de rate acquièrent une capacité certaine de répondre à la réaction des lymphocytes mixtes. Ainsi l'hormone
<EMI ID=185.1>
cellules dotées d'une telle capacité de réponse.
<EMI ID=186.1>
<EMI ID=187.1>
Quand on laisse incuber des cellules lymphoides
<EMI ID=188.1> <EMI ID=189.1>
appelle autosensibilisation. En d'autres termes,les cellules lympholdes immunologiquement actives sont capables de reconnaitre qu'un autre type de cellules n'est pas identique mais, à ce point de vue, est étranger. L'existence de ce phénomène peut être déterminée par une estimation du degré de cytotoxicité des lymphocytes sensibilisés. Pour cela, on mesure le degré de lyse ou de destruction de cellules (cellules-cibles) auquel les lymphocytes ont été sensibilisés en mélangeant les cellules sensibilisées avec les cellules-cibles marquées d'un isotope, habituellement
un sel de chrome marqué par un produit radioactif. Après incubation et à la suite de la lyse de la cellule-bible, la radioactivité
des cellules marquées est libérée dans le milieu où sa quantité peut être mesurée. Le pourcentage de radioactivité totale libérée est considéré comme une mesure du degré de cytotoxicité des cellules lymphoïdes sensibilisées, (Takagusi, M. et Klein, E., Transplantation..2 : 219,1970).
Protocole:
Préparation des lymphocytes du sang périphérique
On sépare les lymphocytes du sang entier par la
<EMI ID=190.1>
Lab. Inv., Vol 21 (supp.97), p.77 (1968).
Milieux de culture
On cultive des monocouches de fibroblastes et des cellules-cibles dans un milieu d'Earle additionné de 10% de sérum de foetus de veau (Gibco). On effectue la sensibilisation des lymphocytes et le titrage dans un milieu RPMI 1640 (Gibco) addi-
<EMI ID=191.1>
mine et de 4 millimoles d'un tampon Hepes (Gibco).
<EMI ID=192.1>
On ensemence des fibroplastes d'une peau normale,
<EMI ID=193.1>
USA). Peu de temps avant d'atteindre la confluence, on irradie
<EMI ID=194.1>
<EMI ID=195.1>
On remplacé le milieu de culture au ,troisième jour. Au sixième Jour, on récupère les lymphocytes à la pipette et on les lave avec du <EMI ID=196.1>
des reste solidement fixé à la monocouche de sensibilisation. On lave à deux reprises les lymphocytes recueillis et on les compte en présence de bleu de trypane.pour vérifier la viabilité. Titrage de cytotoxicité par l'entremise de cellules.
On teste des lymphocytes par la méthode Takasugi, M. et Klein E., Transplantation, Vol.9 p.219 (1970). On ensemence
<EMI ID=197.1>
<EMI ID=198.1>
50% des cellules sont fixées. On ajoute les lymphocytes dans un volume de 20 microlitres et on arrête la réaction après 48 heures. On enregistre le nombre de cellules-cibles restantes après lavage
<EMI ID=199.1>
avec le méthanol et marquage des plaques avec le produit "Giemsa"
<EMI ID=200.1>
tes préalablement cultivés en l'absence de monocouches de sensibilisation est pris comme une ligne de base pour l'estimation de la cytotoxicité. Le nombre de cellules dans les puits ensemencés
avec les lymphocytes sensibilisés et dans les puits-témoins est ensuite comparé à cette valeur de base.
<EMI ID=201.1>
sition au stade 4 dans le tableau de l'exemple 2) sur l'autosensibilisation décrite ci-dessus est testé comme suit:
On ajoute 10 miorogrammes d'hormone dans 0,1 ml de milieu RPMI 1640 à des flacons de sensibilisation contenant 4 ml de milieu de culture.
Dans les deux premiers tests (sujet C.C.), l'hormone est présente pendant les 6 jours de sensibilisation. Dans le test
<EMI ID=202.1>
trois premiers jours, après quoi on remplace le milieu. Omettre les lymphocytes et on les soumet à un test d'activité cytotoxique comme décrit plus haut.
Les résultats apparaissent dans le tableau ci-après:
Il ressort des résultats de ce tableau que les addi-
<EMI ID=203.1>
mone,soit pendant les six jours entiers de sensibilisation, soit pen-
<EMI ID=204.1>
tion de 6 Jours,empêchent dans les deux cas 1 apparition des cellu-
<EMI ID=205.1>
<EMI ID=206.1>
que la composition possède une utilisé potentielle pour empêcher ou
<EMI ID=207.1>
être un facteur étiologique dans les maladies autoimmunes.
<EMI ID=208.1>
<EMI ID=209.1>
Autosensibilisation. des lymphocytes in vivo
Protocole: On utilise la même technique que dans l'exemple 12 pour étudier l'effet de la composition hormonale sur l'auto-sensibilisation in vivo. D'autre part,on examine le rôle capital de la glande thymus et de ses hormones agissant sur ladite autosensibilisation. Le protocole diffère de celui de l'autosensibilisation in vitro qui a été décrit plus haut car on effectue l'autosensibilisation en plaçant les cellules-cibles (cellules
de tumeurs de fibrosarcome MC57M de souris de la même souche),en mélange avec des cellules de la rate de l'hôte, dans une chambre millipore imperméable aux cellules et on introduit la chambre
dans la cavité péritonéale de souris normales C57B1/6 ou de souris de cette même souche ayant subi une thymectomie à l'âge d'un mois. On administre la composition hormonale in vivo�on injecte 20 microgrammes une heure avant et 6 heures après l'implantation
de la chambre et ensuite chaque jour jusqu'au quatrième jour de sensibilisation. On sacrifie les animaux le cinquième jour; on recueille les cellules de chaque chambre (ce sont principalement des lymphocytes) et on effectue un titrage de cytotoxicité en utilisant
<EMI ID=210.1>
souche) en qualité de cellules-cibles.
Les résultats obtenus sont les suivants:
<EMI ID=211.1>
Ces résultats indiquent que l'injection de la composition hormonale in vivo à des souris ayant subi la thymectomie bloque efficacement le développement de l'autosensibilisation de la chambre contenant les lymphocytes par les cellules de fibrosarcome de souris. Ces résultats, conjointement avec l'exemple ci-dessus con- <EMI ID=212.1>
permettent encore de reconnaître l'utilité potentielle de la composition hormonale dans les maladies de l'homme ou un composant
<EMI ID=213.1>
reconnaître "soi-même".
EXEMPLE- 14
L'exemple suivant décrit des compositions pharmaceutiques représentatives (par dose) selon 1* invention, la composition correspondant toujours au dernier stade du tableau de l'exemple 9.
<EMI ID=214.1>
On dissout tous les ingrédients solides dans de 1 'eau et on lyophilise dans un flacon stérile. Avant l'administra-
<EMI ID=215.1>
Pour permettre d'utiliser les flacons à dosages multiples,on préfère utiliser de l'eau contenant un agent de conservation,par exemple,
<EMI ID=216.1>
<EMI ID=217.1>
pendant un maximum de deux semaines.
<EMI ID=218.1>
1. Composition pharmaceutique destinée à rehausser la
<EMI ID=219.1>
proportion thérapeutiquement efficace de préalbumine de sérum
humain en mélange avec un véhicule non toxique pharmaceutiquement acceptable.
2. Application de la préalbumine de sérum humain en vue
de l'augmentation de la compétence immunologique chez un sujet justifiant d'un tel traitement, selon laquelle on administre à ce
sujet une proportion thérapeutiquement efficace de préalbumine
de sérum humain ou d'une composition pharmaceutique contenant celle-ci.
<EMI ID = 1.1>
ne and its applications.
It has been recognized that the thymus is an endocrine gland with a major function in the body's immune system. Recently, crude calf thymus extracts have been examined and found that these extracts contain a famil
the hormones known as thymosins and whose
molecular weights are between approximately 3200 and 70,000 daltons
<EMI ID = 2.1>
(1975) ..
These hormones are thought to act through a mechanism that regulates the rate of maturation of incompetent precursor cells not yet identified into competent lyphocytes (T cells),
and thus become effective agents of struggle against external "invaders". On the other hand, precursor cells of other types, for example erythrocytes, are stimulated in their production and maturation by thymosin preparations.
Recently, a relatively crude extract of
calf thymus containing thymosin to strengthen competence.
this immunology of a young girl born with impaired immunity
<EMI ID = 3.1>
In a recent report 1 on 8. also describes an improvement
of the total haematological state (increase in the number of
white blood cells and red blood cells) in patients treated with a tbymosin preparation (see Alexsandrowicz,
<EMI ID = 4.1>
22-24-. 1974.
There are also articles (see for example
<EMI ID = 5.1>
the existence of an activity analogous to that of thymosins
in the blood of fresh pigs. It is believed that the factor responsible for
this phenomenon is an agent with a molecular weight of approximately
1,000 daltons.
The present invention relates to methods and pharmaceutical compositions for enhancing immunological competence.
The present invention also relates to the isolation
and the characterization of a protein with properties
similar to those of thymus hormone and having <EMI ID = 6.1> competence
of approximately 56,700 daltons and the approximate cianres amino acid composition:
<EMI ID = 7.1>
The new protein contains glycine and histidine as N-terminal amino acids. has an isoelectric point of en-
<EMI ID = 8.1>
is composed of four sub-units.
It has now been found that the protein described above was identical to the prealbumin of human serum, that is to say a protein which is found naturally in human serum, a protein which has already been isolated, purified and identified.
<EMI ID = 9.1>
<EMI ID = 10.1>
Identification of the present protein as human prealbumin was made by comparison of its physical and chemical properties with a commercially available sample and by reciprocal reactivity with human prealbumin anticoprs.
Although human prealbumin has already been described, it was thought to act simply as a specific vehicle for several smaller selected molecules and it was <EMI ID = 11.1>
increasing immunological "The examination of samples of human prealbumin which are found commercially during selected biotitrations, as will be explained later, has indeed shown that these materials possess the aforementioned biological activity which has not not yet recognized until now.
Consequently, the main objects of the invention are: <EMI ID = 12.1>
nological by administering an effective dose of human aerum prealbumin to a subject justifiable for such treatment;
- Pharmaceutical compositions useful for enhancing immunological competence and comprising a therapeutically effective dose of human serum prealbumin in admixture with a non-toxic pharmaceutically acceptable vehicle; and
- processes for the isolation and purification of <EMI ID = 13.1>
<EMI ID = 14.1>
<EMI ID = 15.1>
as well as cells of other animal species without any harm to the host.
This expression is well known and accepted in the field of immunology, as can be seen for example in
<EMI ID = 16.1>
humoral immunity based on the production of circulating soluble antibodies / and cell-mediated immunity
on the production and operation of certain particular types
<EMI ID = 17.1> <EMI ID = 18.1>
Without wishing to link the invention to any mode of action, it is believed that the material under consideration acts by increasing both the number and rate of lymphocyte maturation.
<EMI ID = 19.1>
incompetent.
Enhancement of immunological competence can be demonstrated by various indices using both in vitro and in vivo biotitre assays on small animals, which assays are well known in the art of immunology. For example,
the following titrations can especially be mentioned:
1. Titration of in vitro rosettes sensitive to azathioprine
(titration of 'rosette in vitro).
<EMI ID = 20.1>
<EMI ID = 21.1>
<EMI ID = 22.1>
<EMI ID = 23.1>
6. Mixed lymphocyte reaction '
7. Blastogenesis with concanavalin A.
8. Spontaneous titration of rosettes in vitro
9. Production of cytotoxic lymphocytes
<EMI ID = 24.1>
<EMI ID = 25.1>
According to the invention, each of the above biotitrations was used to demonstrate the enhancement of immunological competence by human prealbumin, as indicated in detail in the examples.
The titers indicated relate to one or more of the following general classes of clinical interest, for which immunological competence is probably a factor:
-stimulation of antibody synthesis (especially titrations 3 and 4):
-replacement therapy; and restoration (especially titrations 5 to 9); and
- autoimmune diseases (especially titrations 10 and 11).
The most efficient titration for rapid indication
<EMI ID = 26.1>
<EMI ID = 27.1> <EMI ID = 28.1>
This titration is a good indication of the number of immunologically competent lymphocytes of the T class. It is this class of lymphocytes which is involved in the cooperative functioning.
<EMI ID = 29.1>
and these are also the main cells that regulate immunity through cells. A large number of evidence supports or corroborates the interest of this titration to determine the state
<EMI ID = 30.1>
so much ,,. for example in autoimmune diseases (lupus erythematosis, colitis.with ulceration, autoimmune hemolytic anemia,
<EMI ID = 31.1>
or radiological and so on.
It has been found that human prealbumin, essentially free of impurities, prepared as below, has a
<EMI ID = 32.1>
laughing at a nanogram.
Although it is desirable for many reasons and in many applications to use essentially pure human prealbumin in a composition permitting therapeutic administration, tedious purification and difficult preparation of pure material in large quantities. , which are responsible for a considerable loss of materials and also for significant costs and efforts, argue in favor of the use, for many therapeutic uses, of fractions
<EMI ID = 33.1> <EMI ID = 34.1>
for therapeutic applications.
human prealbumin, in essentially pure form or as a component of a partially purified fraction and not containing cytotoxic impurities, can be prepared in the form of usual pharmaceutical or medical compositions by mixing this albumin with non-toxic excipients pharmaceutically acceptable. For example, the material can be mixed with inert pharmaceutical carriers, organic or inorganic, suitable for parenteral administration.
(intramuscular, subcutaneous, or intravenous), in particular in the form of a solution, suspension or other liquid composition, in the form of unit or divided doses.
The pharmaceutical compositions which contain the product according to the invention can be subjected to the usual treatments in the pharmaceutical art, for example to sterilization.
(filtration through a millipore filter), and may contain conventional pharmaceutical excipients such as preservatives, stabilizers, emulsifiers, bulking and binding agents, salts for osmotic pressure control and tampons. The compositions may also contain other therapeutically useful materials which prolong the duration of activity of the compound of interest. The trends
for preparing the compositions in the form of various dosages
are well known or obvious to those skilled in the art. A very complete enumeration of formulation techniques can be found
<EMI ID = 35.1>
<EMI ID = 36.1>
closing the material according to the invention is a reconstitution of lyophilized human prealbumin, this human prealbumin, prepared as will be seen later, can be sterilized or lyophilized alone or with other solid excipients and can be stored in sterile vials until 'when using it. Immediately before administration, the necessary amount of solvent is added, for example water, water containing preservatives or a solution of various excipients.
<EMI ID = 37.1> <EMI ID = 38.1>
maintains human prealbumin in a therapeutically effective proportion for the treatment of the disease under consideration.
The dosage may consist of unit dosages or divided dosages, but in all cases the administration should be adjusted by the attending physician according to the needs of the subject.
However, for general guidance to those skilled in the art, the essentially pure material is administered at a dose
<EMI ID = 39.1>
<EMI ID = 40.1>
or its treatment should be determined on the basis of the results of the initial daily treatment at the dosages indicated. When the fraction is less pure, its administration should be in correspondingly higher dosages.
Human prealbumin can be isolated as a component of a partially purified fraction, not containing cytotoxic impurities, or in an essentially pure form, from human blood or a readily available human blood fraction. , using a multi-stage purification process.
A particularly valuable source of human prealbumin is the fraction of human blood known as the Cohn IV-1 fraction which is obtained, and which is generally discarded as an unusable fraction during the fractionation of human blood. It can therefore be seen that this fraction is abundantly available from all sources of blood and is relatively inexpensive.
<EMI ID = 41.1>
<EMI ID = 42.1>
of activity by the titration of rosettes the Cohn fraction IV-1 represents an approximately 10-fold purification from crude human serum. Thus, pure human prealbumin having, in the
<EMI ID = 43.1>
<EMI ID = 44.1>
<EMI ID = 45.1>
and a 240,000 to 1,200,000 fold enhancement of activity over crude human serum. It is believed that this enhancement of activity is partly explained by the elimination of the inhibitory moiety <EMI ID = 46.1>
l.a Molecular filtration to remove materials with a
too high molecular weight and too low molecular weight or
b. Ammonium sulfate fractionation.
<EMI ID = 47.1>
3. Repeat step 2 or free-flow electrophoresis.
4. Preparative gel electrophoresis, and
5. Gel chromatography.
during each stage of the purification process, the various fractions obtained are subjected to a routine titration, preferably an in vitro rosette titration, to determine the activity analogous to that of the hormone of the thymus. The fraction (s) having the major part of such activity are processed in the later stages, i.e. the active fraction (s) are concentrated in smaller and smaller volumes while separating the active component from the impurities. inactive Until obtaining the desired material in essentially pure form.
. While the preferred embodiments of the above purification steps are described in Examples 1 and 9, a brief description of the purification process will be given below.
The crude Cohn IV-1 fraction can optionally be lyophilized. This is conveniently carried out by suspending said fraction in distilled or deionized water; stirring to break up agglomerates and then removing
<EMI ID = 48.1>
The lyophilized material has greater stability and can be stored under refrigeration for extended periods. Before purification, with the fraction
Cohn IV-1 crude or lyophilized an aqueous solution and, preferably
<EMI ID = 49.1>
distilled or deionized as a solvent, preferably by adjusting the pH to about 7.0, while for fractionation <EMI ID = 50.1>
In one embodiment of the present process, the Cohn IV-1 fraction (crude or, preferably, lyophilized), in solution in deionized or distilled water, is subjected to two molecular filtrations so as to remove the components whose molecular weights are significantly higher or lower than that of the desired product. A suitable molecular filtration technique involves the initial passage of the described solution through a hollow fiber fractionator having a suitable membrane filter to remove high molecular weight components (greater than 60,000 or more.
70,000 dallons depending on the filtration pressure). Suitable model fractionators / hollow fibers are (depending on the volume
<EMI ID = 51.1>
If using the DC-2 device the appropriate membrane filter
<EMI ID = 52.1>
a suitable filter is "Amicon .HIOX-50".
The filtrate from the above molecular filtration undergoes a second molecular filtration to remove low molecular weight material. Thus, passing through a hollow fiber fractionator of a similar type, provided with a membrane for retaining materials with a molecular weight of about 10,000 daltons or more, provides the desired material. having a molecular weight of about
56,700 daltons which are isolated in the form of retentate. A suitable filter for this use is the "DC-2" device with an "Amicon HIDP-10" membrane and the "DC-30" device with an "Amicon HIOSM" membrane.
Alternatively, the filtration process can be reversed, i.e. first removing low molecular weight materials and then excessively high molecular weight impurities. However, the first variant is preferred.
In a second embodiment, which is also advantageous, the Cohn IV-1 fraction, crude or, preferably lyophilized, is subjected to fractionation with ammonium sulfate. By this technique, the desired material yield is much greater (about 8 times greater) than that which is obtained
by the molecular fractionation techniques described above.
<EMI ID = 53.1> <EMI ID = 54.1>
centrifugation to remove sediment. We treat
<EMI ID = 55.1>
portions of ammonium sulphate in order to release the various fractions. After each addition of ammonium sulfate, the precipitate formed is separated from the supernatant which is then further treated with ammonium sulfate.
The fraction containing the desired material is salted out or precipitated, adding ammonium sulphate so as to bring the ammonium sulphate content in the solution to a value of about 40 to 60% saturation. By consulting the solubility tables, one can easily determine the amount of ammonium sulfate needed to achieve the appropriate degree of saturation.
<EMI ID = 56.1>
desired material by well known techniques, for example by diafiltration or, preferably, dialysis of the solution of the precipitate in distilled water. The desalted material is concentrated for the next stage, for example by freeze-drying in the frozen state.
In the next step, the desired material from molecular filtration or ammonium sulfate fractionation is subjected to chromatography on a polysaccharide gel column which fractionates the components applied to the column according to their molecular weights. Suitable columns are prepared with crosslinked dextrans, such as, for example, Sephadex (G-75, G-100, G-150, or 0-200), produced by Pharmacia Fine Chemicals. A preferred material is Sephadex G-150 because optimum separation of the components is obtained as can be seen by examination
of the curve giving Kav as a function of the logarithm of the molecular weight
<EMI ID = 57.1>
such gel chromatography was carried out by passing through the loaded column an aqueous elution buffer at a pH of approximately
<EMI ID = 58.1>
<EMI ID = 59.1>
fractions of the gel chromatography eluent and the fraction (s) which contain the desired component can be determined <EMI ID = 60.1>
a biotitration. The column can be calibrated so that the eluent fraction containing the product in the desired molecular weight range is easily determined (see Andrews, cited reference).
Preferably, the desired fraction (s) are desalted
<EMI ID = 61.1>
appropriate, to retain the desired material. Mention may be made, as suitable membranes, of the “Amicon” UM-05 and UM-10 membranes, the cleavage capacities in molecular weight of which are respectively 500 and 10,000. Other suitable membranes are the membranes
<EMI ID = 62.1>
At the next stage, the material from the gel chromatography can be recycled: to the same or a similar column of gel or, alternatively, it can be subjected to free-flow electrophoresis. For such an electrophoresis, we pro-
<EMI ID = 63.1>
be between 5.0 and 5.5, preferably about 5.25. A preferred buffer for establishing such a pH is a mixture of sodium acetate and acetic acid. The location of the
<EMI ID = 64.1>
total and / or a biotiter or by the use of a calibrated column.
The desired material from the previous step is then subjected to preparative gel electrophoresis of disc discs.
<EMI ID = 65.1>
Technically, it is preferred that the electrophoresis be carried out so that the separating gel and the elution buffer are at pH
<EMI ID = 66.1>
to establish such a pH is the product Tris-HCl. Normally, after this operation, a homogeneous human prealbumin is obtained on
<EMI ID = 67.1>
frees material from polyacrylic acid and residual salts <EMI ID = 68.1>
eluted from the column contains the active material as demonstrated by the above criteria and the product itself can be obtained by lyophilization.
The following examples describe the preparation of both essentially pure and partially purified human prealbumin, as well as the biotitrations used and the results obtained. These examples, in which all the proportions are by weight, unless otherwise indicated, serve to illustrate the invention without in any way limiting its scope, as one skilled in the art will appreciate.
EXAMPLE 1-
<EMI ID = 69.1>
<EMI ID = 70.1>
<EMI ID = 71.1>
(Cutter Laboratories) in 20 liters of double distilled water
at 5 [deg.] C for 4 hours and lyophilized to obtain 1105 g of dry matter which is suspended in 10 volumes of deionized water.
<EMI ID = 72.1>
stir the mixture for 1 hour at room temperature. The sediment is removed and the supernatant is passed through a cartridge.
<EMI ID = 73.1>
lyophilization of the retentate, 50g of material is obtained which is chromated
<EMI ID = 74.1>
<EMI ID = 75.1>
<EMI ID = 76.1>
<EMI ID = 77.1>
complete the total protein then to an in vitro rosette titration. We. recovers more than 90% of the activity eluted in a fraction
<EMI ID = 78.1>
50,000 to 70,000 daltons. this material (total of all opera- <EMI ID = 79.1>
bre at pH 5.25 in an acetate buffer system (25 mM NaOAo-7mM HOAo). As above, the progress is monitored by the <EMI ID = 80.1>
Dobby resulting from the combination of the active fractions is subjected to further purification by preparative electrophoresis on polyacrylamide gel using a 10% crosslinked gel.
The spacer gels and samples are 0.060 M in Tris which is adjusted to pH 6.6-6.8 with HCl. The separator gel is 0.375 M in Tris which is adjusted to pH 8.9 with HCl. The tampon in the container
<EMI ID = 81.1>
pH adjusted to 3.8-9.0 with HCl. We elute the activity in a fraction
<EMI ID = 82.1>
albumin fraction. This material (approximate total 100 mg) is electrophoretically homogeneous when passed through an analytical system at pH 8.9.
When the chromatography on Sephadex is repeated, as just described on a microcolumn (0.8 x 76 cm), substantially pure prealbumin is obtained in the form of a white solid body.
<EMI ID = 83.1>
tion in an ultracentrifugation device. model E, from Spinco,
<EMI ID = 84.1>
molecule by sedimentation equilibrium to find 56,700 dal-
<EMI ID = 85.1>
followed by electrophoresis at pH 7.0 in an acrylamide gel containing sodium dodecyl sulfate, the molecular weight of the undissociated material is found to be 52,000 daltons and partial dissociation occurs to split the product into four subunits having a molecular weight of about 13,500 daltons each.
The protein is homogeneous during focus
<EMI ID = 86.1> histidine. The amino acid composition is determined by protein hydrolysis and chromatography using an analyzer <EMI ID = 87.1>
<EMI ID = 88.1>
Identity is further established by comparison with authentic samples of human prealbumin.
EXAMPLE 2-
<EMI ID = 89.1>
human mine.
<EMI ID = 90.1>
ment according to the technique described by Bach .. J.F. et al, Proc. Mail.
<EMI ID = 91.1>
the following:
A. Preparation of stock solution of sodium salt
<EMI ID = 92.1>
Burroughs Wellcome) in 25 ml of water in a volumetric flask, then add about 1 ml of, normal NaOH, dropwise and
<EMI ID = 93.1>
<EMI ID = 94.1>
<EMI ID = 95.1> <EMI ID = 96.1>
final tion away from. light in a refrigerator. Stability is checked by measuring the optical density at 280 and 330 nm.
B. For the titration itself, spleen cells were obtained from Simonsen C57B1 / 6 mice, 6-8 weeks old, thymectomy 7-30 days before being sacrificed, male.
The individual spleens were homogenized and washed in cold hank's balanced saline solution. The cells were pelletized at 200 x g for 10 minutes in a refrigerated centrifuge. This gives a final pooled suspension of 40 to 60 x 10 nucleated cells per milliliter.
Control Series: To determine the sensitivity of thymectomized spleen cells to azathioprine sodium salt, azathioprine sodium salt is titrated to the range of 25 to 1.56 micrograms per tube using successive two-fold dilutions of 0.25 ml of the stock solution (part A) in
Hank's solution. The suspension of the
<EMI ID = 97.1>
per tube.
Test series: Diluted twice in succession
<EMI ID = 98.1>
quotes 0.125 ml). 2.5 micrograms of azathioprine sodium salt in 0.125 ml of Hank's solution and 0.1 ml of spleen cell suspension are added to each dilution of the test fraction.
Both for the control series and for the test series, incubation is carried out at 37 [deg.] C in a water bath for 60 minutes. We
<EMI ID = 99.1>
abbreviated SRBC) in an Alsever solution (Grand Island Biological
<EMI ID = 100.1>
<EMI ID = 101.1>
pelletized cells in a refrigerated centrifuge machine running at 200 x g for 5 minutes. The cells are refrigerated
<EMI ID = 102.1>
suspension in a rotator for 5 minutes and the rosettes are counted in a Malessez hemocytometer.
Specific activity is determined by the minimum amount of protein in the test fractions which inhibit forma-
<EMI ID = 103.1>
azathioprine sodium salt & The specific activity of the fractions
0 <EMI ID = 104.1>
the following table, which expresses the relative purification factor using the Cohn IV-1 fraction as a reference.
<EMI ID = 105.1>
The table above shows that the titration of the rosettes in vitro makes it possible to monitor the purification of human prealbumin and it shows that a purification of 60,000 times (calculated relative to the activity) can be carried out starting from
<EMI ID = 106.1>
EXAMPLE 3-
Stimulation of antibody synthesis.
When injecting into normal animals, or in animals which have undergone an experimental decrease in responsiveness
<EMI ID = 107.1>
having the ability to "neutralize" foreign matter.
Protocol: Normal mice (strain C57HL / 6) are treated in a single intravenous injection, with sheep erythrocytes (SRBC) as antigen stimulant. At the same time, test mice are injected intravenously with a certain amount of human prealbumin (a suitable fraction, for example as shown in the table of Example 2). Control mice receive antigen and bovine serum albumin (BSAJ. Seven days later, the animals are sacrificed., <EMI ID = 108.1>
<EMI ID = 109.1>
spleen cells.
AT . The table below shows the formation of antibodies using a fraction of human prealbumin.
<EMI ID = 110.1>
<EMI ID = 111.1>
These results show that the administration of human prealbumin greatly increases the capacity of spleen cells to
<EMI ID = 112.1>
B. The effect of human prealbumin ("hormone") on antibody synthesis can also be demonstrated by in vitro titration. In this case, the cells are removed from the spleens of C57B1 / 6J mice, cultured and treated with ewe erythrocytes, or with ewe erythrocytes and the hormone or with the hormone alone. The hormone used without this case comes from stage 3 of the example table
2. The antibody response is measured after 5 3 bears in culture.
<EMI ID = 113.1>
in the following table.
<EMI ID = 114.1>
These results demonstrate that the composition of human prealbumin is active in stimulating the synthesis of the antibody.
<EMI ID = 115.1>
EXEMPY 4-
Effect of human prealbumin on mice having undergone neonatal thymectomy.
It is well known that neonatal thymectomy creates an "immune cripple". Animals operated on do not grow normally, are wasting away, and offer little resistance to infection, and they cannot synthesize antibodies in response to attack by specific antigens, and do not have immunity through them. cells, that is, they cannot reject a dermal graft from an allogeneic strain of the same species. In general, the animals thus operated die after 5 to 10 weeks under the effect of a generalized infection which depends on the degree of absence or presence of the infectious agents in the environment in which they are housed. The syndrome
of neonatal thymectomy has been studied in various species and also in children born without thymus or with aplasia or dys-
<EMI ID = 116.1>
<EMI ID = 117.1>
262 (1974).
Protocol: C57B1 / Ka mice were thymectomy within 24 hours of birth, using surgical sterilization techniques, and the mice were housed under conditions free of infection-specific pathogens. Groups of ten mice having undergone such an operation are treated as described below. As a control protein, bovine serum albumin (BSA) is used.
A. Synthesis of antibodies.
Starting nine weeks after the thymectomy, we
<EMI ID = 118.1> <EMI ID = 119.1>
<EMI ID = 120.1>
for this test is that which appears in stage 2 of the table of Example 2. The animals are sacrificed one week after the last injection of hormone or 5 days after the single i.p. antigen, namely sheep erythrocytes. We determine the
<EMI ID = 121.1>
table below:
<EMI ID = 122.1>
This table shows that the administration of the composition of human prealbumin restores in mice having undergone a
<EMI ID = 123.1>
<EMI ID = 124.1>
say an antigen dependent on the function of the thymus.
B. Interaction of mixed lymphocytes.
When admixing in vitro mouse lymphoid cells of a specific strain with mouse lymphoid cells of an unrelated strain, the "foreign" character of the point
<EMI ID = 125.1>
As indicated below, one can prevent the proliferation of one of the two populations of cells or one can cause
blastogenesis of this population by adding to it, before mixing, an agent which inhibits cell division. The ability of cells to recognize foreign cells is
<EMI ID = 126.1>
genetic reasons are incapable of recognition of this kind, i.e. they do not react in the reaction of mixed lymphocytes during incubation by cells
<EMI ID = 127.1>
A.L., et al. J. Immunol., Vol. 106, p. 773 (1971).
<EMI ID = 128.1>
neonatal and treated at four weeks of age with an injection
<EMI ID = 129.1>
neonatal thymectomy, receives analogous doses of 1 mg of bovine serum albumin. The animals are then sacrificed and the lymph nodes (mesenteric, axillary and inguinal) and spleens are dissected. The cell suspensions of the lymph nodes of each mouse are tested in the mixed lymphocyte reaction
using equal numbers of C57B16 / Ka lymph node cells (A) and allogeneic (B) cells (BIA). The base incorporation for each cell type is obtained separately and subtracted from the value of the mixed cell reaction for
<EMI ID = 130.1>
as a result of the interaction of the two types of cells.
The results obtained are as follows:
T [
<EMI ID = 131.1>
It clearly appears that the nodal cells of lymphs originating from animals treated with the composition of prealbumi-
<EMI ID = 132.1>
this stimulation. The results show that the cells of the mice having undergone a neonatal thymectomy and a treatment with a composition according to the invention are greatly enhanced from the point of view of the immunological competence which is reflected by their capacity to "recognize" the cells of the lymphatic nodes. of a histo-incompatible strain of mice. EXAMPLE 5-
Proliferation of lymphoid tissue
Mice deprived of their thymus within 24 to 48 hours
<EMI ID = 133.1>
deprived of thymus for genetic reasons ("naked" mice) <EMI ID = 134.1>
are small and show lymphocyte deficiency. This
<EMI ID = 135.1>
thymus produces large numbers of lymphoid cells which are "exported" and seeded into peripheral lymphoid organs where these cells proliferate. This normally results in the growth and maturation of normal lymphoid structures.
protocol: Mice deprived of thymus for genetic reasons, four weeks old, are administered eight daily subcutaneous injections of 1 mg of the composition of pre-
<EMI ID = 136.1>
of Example 2, over a period of two weeks before sacrificing the animals. Control mice are injected with 1 mg of bovine serum albumin. The lymphatic nodes are dissected
(mesenteric, inguinal and axillary), we blot them, we
<EMI ID = 137.1>
holds the following results:
<EMI ID = 138.1>
We can notice that the proliferation of cells
<EMI ID = 139.1>
<EMI ID = 140.1>
genetics have small and poorly developed lymphoid tissue. The above results show an increase in the number of
<EMI ID = 141.1>
increase of 200 times.
EXAMPLE 6-
<EMI ID = 142.1>
known to act on immunologically competent T cells to accelerate their maturation and differentiation.
<EMI ID = 143.1>
<EMI ID = 144.1>
same as that described for lymphoid tissue proliferation (Example 5) using the same composition and the same amount of human prealbumin. The titration used is that
<EMI ID = 145.1>
<EMI ID = 146.1>
<EMI ID = 147.1>
Injection of the human prealbumin composition increases the mitogenic response of cells to coacanavalin by about four times. Thus, administration of this material to nude mice increases the number of host cells showing
mitogen response properties of T cells.
<EMI ID = 148.1>
The number of cells spontaneously forming rosettes of erythrocytes (E) in lymphooytes of peripheral blood is
<EMI ID = 149.1>
that this index reflects the number of immunologically competent circulating T cells.
In normal individuals, the number of E rosette cells in peripheral blood is typically 65
to 80% of the total lymphocyte population. Lower values are frequently observed in immunologically deficient conditions, especially in the case of malignant diseases, aplasia
<EMI ID = 150.1>
path. Flight. 1, p..511 (1973). A change of + 10% (on a 100% scale) is considered significant, The results <EMI ID = 151.1>
<EMI ID = 152.1>
Influence of human prealbumin (hormone corresponding to the
<EMI ID = 153.1>
cells spontaneously forming E rosettes in the presence of erythrocytes in peripheral blood lymphocytes of normal individuals and patients with Hodgkin's disease.
<EMI ID = 154.1>
Previous results suggest that an incuba-
<EMI ID = 155.1>
Separated phocytes from peripheral blood from individuals whose percentages of cells spontaneously forming E rosettes are lower than normal, results in an increase in the percentage of these cells. Such results have been interpreted to indicate that an insufficient concentration of the hormo-
<EMI ID = 156.1>
E rosettes under expected clinical conditions. In contrast, the precursor cells appear to be present in these individuals, since incubation of these cells with <EMI ID = 157.1>
number of cells spontaneously forming rosettes E.
Patients with Hodgkin's disease frequently have below normal numbers of cells spontaneously forming E rosettes. The above results show that peripheral lymphocytes in five of the six patients with Hodgkin's disease present, upon
<EMI ID = 158.1>
significant tation of the percentage of cells spontaneously forming E rosettes.
In addition, the composition of human prealbumin was successful in counteracting the inhibitory effect of a spleen extract from patients suffering from Hodgkin's disease, on the numbers of cells capable of spontaneously forming E rosettes in blood lymphocytes. peripheral of normal individuals and a patient with Hodgkin's disease.
EXAMPLE 8-
Activity of human prealbumin composition in vivo
The titration of rosette-forming cells in ewes (Example 2) is used for tests in which a highly purified human prealbumin composition (which corresponds to step 6 of the table of Example 2) is administered in vivo. The protocol is as follows:
The desired composition is administered to normal adult C57B1 / 6 mice (6 to 8 weeks old)
and having undergone a thymectomy two weeks prior to the test. Daily injections are performed for three successive days
<EMI ID = 159.1>
24 hours after the last injection, the animals are sacrificed, the spleens are quickly removed, cell suspensions are prepared and used for the titration of the rosettes. The results are summarized in the table below:
<EMI ID = 160.1>
<EMI ID = 161.1>
gique was restored in the spleen cells of mice, having undergone thymectomy, by the administration of the composition according to the invention. It should be noted that injection of the purified human prealbumin composition restores sensitivity to the inhibitory effects of azathioprine in the spleen cells of thymectomy mice based on the number of spleen rosette-forming cells, equal to that of the spleen cells of a normal mouse. The absolute activity of the composition used in the in vivo titration is 0.4 ng.
EXAMPLE 9-
<EMI ID = 162.1>
human from Cohn IV-1 fraction
100 g of Cohn fraction IV-1 (wet weight) are stirred with 500 ml of distilled water for 4 hours at a temperature of 2 to 5 [deg.] C. The suspension is then lyophilized and approximately 40 g of dry powder are obtained, which is then dissolved in 1000 ml of a 50 ml Tris / 100 mM sodium chloride / 0.02% sodium azide buffer, at pH 8.0. and stirred for 3 hours at room temperature. The solution is subjected to centrifugation at the rate of
13,000 x g. For 30 minutes at 2-5 [deg.] C. The clear greenish supernatant is then 40% saturated with ammonium sulfate in a suitable container surrounded by ice and, for this, is added
243 g of ammonium sulphate to 1000 ml of the supernatant. We leave it
<EMI ID = 163.1>
<EMI ID = 164.1>
with ammonium sulfate by adding 132 g of ammonium sulfate
<EMI ID = 165.1>
dement. The precipitate is dissolved in a minimum volume of cold distilled water and dialyzed thoroughly in the cold against distilled water after which lyophilization and 17 g of material are obtained.
<EMI ID = 166.1>
Sephadex G-150 column (50 x 90 cm, total bed volume 1760 cm) equilibrated with 50 mM Tris buffer -100 mM sodium chloride 0.02% sodium azide, pH 8 and the column eluted with the same buffer The eluted material is collected in the molecular weight range of 40,000 to 70,000 daltons, desalted by diafiltra-
<EMI ID = 167.1>
of nitrogen from 4.9 to 5.6 bars and lyophilized. After all these <EMI ID = 168.1>
the Sephadex column represents 4 g.
After a new chromatography of the material,
<EMI ID = 169.1>
Sephadex and then carrying out diafiltration and lyophilization as above, 2 g of material are obtained.
The table below shows the weight of the material and the activity by titration of the rosettes in vitro according to Example 2.
<EMI ID = 170.1>
The material from this process can be subjected to preparative polyacylamide gel electrophoresis and chromatography on a middle column as described in Example 1 to obtain a material substantially free of impurities and having activity in the titration of rosettes. in vitro is comparable to that
<EMI ID = 171.1>
ron ..
EXAMPLE 10-
Effect of human prealbumin in vitro to promote maturation
<EMI ID = 172.1>
Unmatured thymocytes from normal mice are not normally T cells with significant cytotoxic activity. The acceleration of the maturation of
<EMI ID = 173.1>
indication of enhancement of immunological competence.
Protocol: 1 x 10 ′ C57B1 / 6 mouse thymocytes are cultured with 5 x 106 irradiated Balb / c mouse spleen cells, with or without 5 micrograms of material which corresponds to the last
<EMI ID = 174.1>
Cytotoxicity is measured on labeled P815 Y (H-2d) cells
<EMI ID = 175.1>
<EMI ID = 176.1>
These results show that the lymphoid cells not normally possessing cytotoxic activity demonstrate properties of a development of a notable cytotoxicity under the effect of exposure in vitro to the composition of
<EMI ID = 177.1>
As shown in Example 5, lymphoid cells from nude mice usually do not have an immunological response. A study was performed to determine the effect of the human prealbumin composition on the creation of an immunological response by spleen cells of a nude mouse incubated in vitro. The mixed lymphocyte reaction (see Example 4) is the chosen titration system.
<EMI ID = 178.1>
<EMI ID = 179.1>
<EMI ID = 180.1>
<EMI ID = 181.1>
A concentration of 2 micrograms per tube of the composition of human prealbumin (hormone), which corresponds to the last step of the table of Example 9. The values are
<EMI ID = 182.1>
<EMI ID = 183.1>
The results show that while the spleen cells of nude mice incubated with bovine serum albumin do not respond to the mixed lymphocyte reaction, cells
<EMI ID = 184.1>
5 x 105 spleen cells acquire a certain capacity to respond to the reaction of mixed lymphocytes. So the hormone
<EMI ID = 185.1>
cells endowed with such a response capacity.
<EMI ID = 186.1>
<EMI ID = 187.1>
When incubating lymphoid cells
<EMI ID = 188.1> <EMI ID = 189.1>
called self-awareness. In other words, immunologically active lymphoid cells are able to recognize that another type of cell is not the same but, in this respect, is foreign. The existence of this phenomenon can be determined by estimating the degree of cytotoxicity of the sensitized lymphocytes. This is done by measuring the degree of lysis or destruction of cells (target cells) to which the lymphocytes have been sensitized by mixing the sensitized cells with the target cells labeled with an isotope, usually
a chromium salt labeled with a radioactive product. After incubation and following lysis of the bible cell, the radioactivity
labeled cells is released into the medium where its amount can be measured. The percentage of total radioactivity released is considered to be a measure of the degree of cytotoxicity of the sensitized lymphoid cells, (Takagusi, M. and Klein, E., Transplantation ... 2: 219,1970).
Protocol:
Preparation of peripheral blood lymphocytes
Lymphocytes are separated from whole blood by
<EMI ID = 190.1>
Lab. Inv., Vol 21 (supp. 97), p.77 (1968).
Culture media
Monolayers of fibroblasts and target cells are cultured in Earle's medium supplemented with 10% fetal calf serum (Gibco). Lymphocyte sensitization and titration are performed in RPMI 1640 medium (Gibco) addi-
<EMI ID = 191.1>
lead and 4 millimoles of a Hepes buffer (Gibco).
<EMI ID = 192.1>
We seed fibroplasts from normal skin,
<EMI ID = 193.1>
USA). Shortly before reaching the confluence, we radiate
<EMI ID = 194.1>
<EMI ID = 195.1>
The culture medium is replaced on the third day. On the sixth day, the lymphocytes are recovered by pipette and washed with <EMI ID = 196.1>
des remains firmly attached to the sensitizing monolayer. The collected lymphocytes are washed twice and counted in the presence of trypane blue to check for viability. Cytotoxicity titration through cells.
Lymphocytes are tested by the method Takasugi, M. and Klein E., Transplantation, Vol.9 p.219 (1970). We sow
<EMI ID = 197.1>
<EMI ID = 198.1>
50% of the cells are fixed. Lymphocytes are added in a volume of 20 microliters and the reaction is stopped after 48 hours. The number of target cells remaining after washing is recorded.
<EMI ID = 199.1>
with methanol and labeling of the plates with the product "Giemsa"
<EMI ID = 200.1>
Tes previously grown in the absence of sensitizing monolayers is taken as a baseline for estimation of cytotoxicity. The number of cells in the seeded wells
with the sensitized lymphocytes and in the control wells is then compared to this baseline value.
<EMI ID = 201.1>
sition at stage 4 in the table of example 2) on the self-sensitization described above is tested as follows:
10 miorograms of hormone in 0.1 ml of RPMI 1640 medium are added to sensitization flasks containing 4 ml of culture medium.
In the first two tests (subject C.C.), the hormone is present during the 6 days of sensitization. In the test
<EMI ID = 202.1>
first three days, after which the medium is replaced. Omit the lymphocytes and subject them to a test for cytotoxic activity as described above.
The results appear in the table below:
It emerges from the results of this table that the addi-
<EMI ID = 203.1>
mone, either during the entire six days of awareness raising or during
<EMI ID = 204.1>
tion of 6 days, in both cases prevent the appearance of cells
<EMI ID = 205.1>
<EMI ID = 206.1>
that the composition has a potential use to prevent or
<EMI ID = 207.1>
be an etiological factor in autoimmune diseases.
<EMI ID = 208.1>
<EMI ID = 209.1>
Self-awareness. lymphocytes in vivo
Protocol: The same technique as in Example 12 is used to study the effect of the hormonal composition on self-sensitization in vivo. On the other hand, we examine the capital role of the thymus gland and its hormones acting on said self-sensitization. The protocol differs from that of in vitro autosensitization which was described above because the autosensitization is carried out by placing the target cells (cells
MC57M mouse fibrosarcoma tumors of the same strain), mixed with host spleen cells, in a cell-impermeable millipore chamber and the chamber inserted
in the peritoneal cavity of normal C57B1 / 6 mice or of mice of the same strain having undergone a thymectomy at the age of one month. The hormonal composition is administered in vivo 20 micrograms are injected one hour before and 6 hours after implantation
from the room and then every day until the fourth awareness day. The animals are sacrificed on the fifth day; the cells from each chamber (these are mainly lymphocytes) are collected and a cytotoxicity assay is performed using
<EMI ID = 210.1>
strain) as target cells.
The results obtained are as follows:
<EMI ID = 211.1>
These results indicate that the injection of the hormonal composition in vivo into mice having undergone thymectomy effectively blocks the development of self-sensitization of the chamber containing the lymphocytes by the mouse fibrosarcoma cells. These results, together with the example above con- <EMI ID = 212.1>
still allow recognition of the potential utility of the hormonal composition in human diseases or a component
<EMI ID = 213.1>
recognize "oneself".
EXAMPLE- 14
The following example describes representative pharmaceutical compositions (per dose) according to the invention, the composition still corresponding to the last stage of the table of example 9.
<EMI ID = 214.1>
All the solid ingredients are dissolved in water and lyophilized in a sterile vial. Before the administra-
<EMI ID = 215.1>
To enable the use of the multi-dose vials, it is preferred to use water containing a preservative, for example,
<EMI ID = 216.1>
<EMI ID = 217.1>
for a maximum of two weeks.
<EMI ID = 218.1>
1. Pharmaceutical composition intended to enhance the
<EMI ID = 219.1>
therapeutically effective proportion of serum prealbumin
human in admixture with a non-toxic pharmaceutically acceptable vehicle.
2. Application of human serum prealbumin in view
of the increase in immunological competence in a subject justifying such treatment, according to which it is administered to this
subject a therapeutically effective proportion of prealbumin
human serum or a pharmaceutical composition containing the same.