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La présente invention a pour objet l'extraction de la chloro- tétracycline et/ou de la tétracycline à partir de mélanges de fermentation qui les contiennento
Il a été proposé antérieurement d'extraire la clorotéracycline des liqueurs de fermentation par un procédé qui consiste à acidifier le bouillon pour solubiliser la chloretétracycline, puis à séparer les solides de mycélium par filtration, et à extraire la chlorotétracycline du filtrat à l'aide d'un solvant organique et d'un agent tensio-actif. Le procédé d'extraction utilisant des solvants organiques n'a donc été appliqué, an- térieurement, qu'aux filtrats contenant le prinacipe actif, et non aux mélanges de fermentation eux-mêmes.
Jusqu'à présent, on pensait qu'il n'était pas possible, d'extraire directement la chlorotétracycline du mélange de fermentation, car on sup- posait que, les solides de mycélium agissent d'une certaine façon pour retenir la chlorotétracycline et emchent ainsi l'extraction facile de celle-ci au moyen de solvants. En conséquence, dans tous les procédas de la technique antérieure on filtrait invariablement le mélange pour obtenir un filtrat contenant le principe actif, avant toute extraction de la chlorotétracyline.
Des considérations similaires s'appliquent à l'extraction de la tétracycline à partir de mélanges de fermentation qui la contiennent, et aussi à l'extraction des deux antibiotiques à la fois à partir d'un même mélange, car on sait que la chlorotétracycline et la tétracycline se for- ment toutes deux dans la fermentation par le S. aureofaciens.
La présente invention a pour objet une simplification des pro- cédés de la technique antérieure, reposant sur la découverte d'après la- quelle, dans certaines conditions, il est possible d'extraire directement la chlorotétracycline et/ou la tétracycline du mélange de fermentation sans qu'il soit nécessaire de filtrer le mélange pour éliminer les solides de mycélium comme on croyait devoir le faire antérieuremento
Suivant 1 invention,¯ on fournit un procédé pour l'extraction de la chlorotétracycline et/ou de'la tétracyline à partir d'un mélange de fermentation qui les contient, procédé qui consiste :
1) à acidifier le mélange à un pH compris ente 0,5 et 2,5 environ pour solubiliser les antibiotiques qu'il contient ;
2) à ajuster la teneur du mélange en ions calcium et magnésium à environ 10-45 mg par gramme d'antibiotique que contient le mélange ;
3) à y ajouter un composé d'ammonium quaternaire répondant à la formule :
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dans laquelle R1 est un radical alkyle inférieur ou benzyle, R2 est une chaîne grasse longue, R et R sont des radicaux alkyle inférieurs, et R1 et R considérés ensemble, représentent une chaîne carbonée divalente de " 2 à 4 atomes de carbone ;
4) à ajuster le pH du mélange entre 5,5 et 11 environ, et 5 à ajouter un solvant organique polaire non miscible à l'eau pour extraire les antibiotiques du mélange traité.
Outre l'extraction directe des antibiotiques à partir du mélange de fermentation, un autre avantage de l'invention est que l'on peut ob- tenir des rendements accrus, représentant une augmentation de 10% ou davantage, par rapport au rendement de l'extraction de la chlorotétracycli- ne et/ou de la tétracycline à partir du filtrat contenant le principe actif. Cette augmentation de rendement est due en partie au fait que l'on supprime le traitement du gâteau-filtre par un acide chaud, qui était nécessaire dans le procédé de la technique antérieure pour retirer le principe actif du gâteau-filtre, et qui aboutissait toujours à détruire cette activité dans une certaine mesure.
Donc, non seulement la présente invention est avantageuse économiquement, parce qu'elle supprime une étape du procédé antérieur que l'on croyait essentielle, mais encore elle est facile à réaliser et aboutit à des rendements élevés en matière pure, rendements qui sont meilleurs encore que ceux couramment obtenus lorsqu'on extrait la chlorotétracycline ou la tétracycline à partir du filtrat acidifié.
Un autre avantage de la présente invention réside dans le fait qu'elle supprime la nécessité de manipuler de grands volumes d'eau qui étaient nécessaires dans les procédés de la technique antérieureo Pour extraire le maximum de principe actif dans un filtrat aqueux, il est né- cessaire d'utiliser 2,5 volumes d'eau pour un volume de mélange de fermen- tation, et même ainsi l'extraction n'est pas complète. Pour des fermentations à grande échelle, on peut voir qu'il est extrêmement onéreux de récupérer la chlorotétracycline ou la tétracycline à partir d'un tel filtrat aqueux.
Un autre avantage encore de la présente invention est qu'elle donne des rendements élevés en matière pratiquement pure de qualité pharmaceutique, c'est-à-dire pure à 95-97%. La pureté accrue peut être le résultat du traitement par un réducteur, expliqué plus en détail ci-après.
La chlorotétracycline et la tétracycline obtenues par les procédés de la technique antérieure nécessitent habituellement deux recristallisations par le butanol acidifié pour les amener à satisfaire aux normes pharma- ceutiqueso
Un autre avantage de la chlorotétracycline pure obtenue par la présente invention réside dans le fait que l'on peut la réduire directement en tétracycline sans autres opérations de recristallisation ni de purifi- cation.
Quand on réalise l'invention en l'appliquant à l'extraction de la chlorotétracycline à partir d'un mélange de fermentation qui en contient, la-première étape consiste à acidifier le mélange pour solubiliser la chlorotétracycline qu'il contient. On acidifie le mélange à un pH de 0,5 - 2,5 environ, et de préférence à un pH de 1,3 - 1,4, à l'aide d'un acide minéral fort tel que l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, l'acide phosphorique, etc. On conduit ce traitement à l'acide à la température ambiante. On agite pendant peu de temps le mélange acidifié, pour solu- biliser la chlorotétracycline, puis on ajoute une quantité définie'd'acide oxalique ou d'oxalate d'ammonium, de manière à ajuster à un niveau pré-
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déterminé la teneur du mélange en ions calcium et magnésium.
A ce propos, on a trouvé que le procédé d'extraction décrit ci-après ne marche pas bien lorsqu'on extrait la chlorotétracycline du mélange sans avoir ajusté à un niveau bien défini la teneur du mélange en ions calcium et magnésium.
On a trouvé quesi la ',eneur du mélange en ions calcium et magnésium est ajustée entre 10 et 45 mg environ par gramme de chlorotétracycline présent dans le mélange, on peut obtenir une extraction satisfaisante du principe actif du mélange. Si l'on laisse dans le mélange des quantités de ces ions très supérieures ou très inférieures à ces chiffres, on obtient une extraction insuffisante du principe actif.
La cause exacte de ce fait n'est pas absolument éclaircie, mais on a observé que la chlorotétracycline pure ne peut pas être extraite par le solvant organique si les ions calcium sont absents, et que, s'il y a trop d'ions calcium dans le mélange, il se formera pendant l'étape d' extraction un précipité volumineux de chlorotétracycline qui n'est pas facilement dissous par le solvant organique. Mais comme on l'a dit cidessus, lorsque l'on ajuste la teneur du mélange en ions calcium et magnésium entre les limites indiquées plus haut, l'extraction de la chlorotétracyline par le solvant organique se déroule régulièrement et aboutit à de bons rendements en matière pure.
Lorsqu'on a achevé la précipitation de la quantité d'ion désirée, de manière ajuster la teneur du mélange en ions calcium et magnésium au niveau voulu, on ajoute au mélange décalcifié une quantité appropriée d'un composé d'ammonium quaternaire, ainsi qu'il est expliqué plus précisément ci-après. En général, la quantité de composé d'ammonium quaternaire peut varier d'environ 1/2 à 3 moles de composé quaternaire par mole de chlorotétracycline. On agite alors le mélange et on ajuste le pH du mélange entre 5,5 et 11, et de préférence entre 8,4 et 8,6, avec de la soude. On ajoute alors au mélange, en agitant, un solvant organique, de préférence à raison d'environ 10 % du volume du mélange, ou davantage.
On peut utiliser jusqu'à 50% de solvant ou davantage, mais on n'a observé jusqu'à présent aucun avantage particulier avec des quantités supérieures, et aux niveaux supérieurs cela devient peu économique. On agite le mélange et on le filtre, de préférence avec l'aide d'un adjuvant de filtration tel que la terre d'infusoires. La chlorotétracycline passe dans la phase solvant, et on laisse reposer le filtrat jusqu'à ce que les deux phases se séparent, puis on décante la phase solvant. On délaie le gâteau-filtre avec du solvant frais et on le filtre à nouveau, et on réunit les deux extraits pour les traiter ultérieurement.
On peut utiliser, dans l'étape d'extraction, divers solvants organiques polaires non miscibles à l'eau. Parmi les solvants utilisables, on citera le butanol, etc.. Des solvants préférentiels sont les méthylalkylcétones, telles que la méthylbutylcétone, la méthylpropylcétone, etc.
On obtient des résultats particulièrement bons avec la méthylisobutylcétone,. parce que ce solvant est extrêmement sélectif quant à sa propriété d'extraire la chlorotétracycline du mélange et de laisser les impuretés.
Les composés d'ammonium quaternaire qui sont utiles comme véhicules dans le procédé d'extraction par solvant décrit ci-dessus peuvent être représentés par la formule générale suivante :
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dans laquelle R1 est un radical alkyle inférieur ou benzyle, R2 est une chaîne grasse longue d'au moins 8 atomes de carbone, R est un radical alkyle inférieur, R4 est un radical alkyle inférieur, et R et R , considérés ensemble, représentent une chaîne carbonée divalente de 4 2 à 5 atomes. Ainsi, l'azote peut faire partie du noyau hétérocyclique, comme dans les composés du type "Onamine RO", par exemple ceux qui répondent à la formule :
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dans laquelle R1, R2,R3 et R4 ont la même signification que ci-dessus.
Les composés d'ammonium quaterniare appelés "Arquad", sont des véhicules particulièrement efficaces pour le procédé d'extraction par solvant ici décrit. Ces composés sont principalement des chlorures d' alkyltriméthyl-ammonium et peuvent être représentés par la formule R-N(CH3)Cl, dams laquelle R est un groupe alkyle à longue chaîne d'au moins 8 atomes de carbone.
Ces composés d'ammonium quaternaire particuliers sont vendus par Armour and Company sous la marque commerciale "Arquad". On trouve divers composés de cette classe, qui varient quant à la longueur et au nombre des groupes alkyle à longue chaîne rattachés à l'atome d'azote. On cite ci-dessus quelques types d'"Arquada" qui se trouvent dans le commerce et qui peuvent avantageusement servir à la conduite de la présente invention.
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COMPOSITION <SEP> MOYENNE <SEP> DES <SEP> "ARQUADS" <SEP> EN <SEP> INGREDIENTS <SEP> ACTIFS
<tb> Groupes <SEP> substituants <SEP> Longueur <SEP> de <SEP> "Arquad" <SEP> "Arquad" <SEP> "Arquad"
<tb> chaîne <SEP> car- <SEP> 12 <SEP> 16 <SEP> 18
<tb> bonée
<tb> Octyle <SEP> 8- <SEP> - <SEP> Décyle <SEP> 10 <SEP> - <SEP> - <SEP> Dodécyle <SEP> 12 <SEP> 90% <SEP> - <SEP> Tétradécyle <SEP> 14 <SEP> 9% <SEP> Hexadécyle <SEP> 16 <SEP> - <SEP> 90% <SEP> 6%
<tb> Ootadécyle <SEP> 18- <SEP> 6% <SEP> 93%
<tb> Octadécécyle <SEP> 18 <SEP> 1% <SEP> 4% <SEP> 1%
<tb> Octadécadiényle <SEP> 18- <SEP> - <SEP> COMPOSITION <SEP> MOYENNE <SEP> DES <SEP> "ARQUADS" <SEP> EN <SEP> INGREDIENTS <SEP> ACTIFS
<tb> Groupe <SEP> Longueur <SEP> de <SEP> "Arquad" <SEP> "Arquad" <SEP> "Arquad" <SEP> "Arquad"
<tb> substituants <SEP> chaîne <SEP> car- <SEP> C <SEP> S <SEP> 2C <SEP> 2HT
<tb> bouée
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Octyle <SEP> 8 <SEP> 8% <SEP> - <SEP> 8% <SEP> Décyle <SEP> 10 <SEP> 9% <SEP> - <SEP> 9% <SEP> Dodécyle <SEP> 12 <SEP> 47% <SEP> - <SEP> 47% <SEP> Tétradécyle <SEP> 14 <SEP> 18% <SEP> - <SEP> 18% <SEP> Hexadécyle <SEP> 16 <SEP> 8% <SEP> 10% <SEP> 8% <SEP> 30%
<tb> Octadécyle <SEP> 18 <SEP> 5% <SEP> 10% <SEP> 10% <SEP> 70%
<tb> Octadécényle <SEP> 18 <SEP> 5% <SEP> 35% <SEP> - <SEP> Octadécadiényle <SEP> 18- <SEP> 45% <SEP> - <SEP> -
<tb>
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L'"Arquad" 16, qui est un chlorure d'alkyltriméthylammonium à longue chaîne dans lequel les groupes alkyle comprennent 90% de groupes hexadécyle, 6% de groupes octadécyle et 4% de groupes octadécényle, est particulièrement préférable car il semble être particulièrement sélectif pour donner un produit de chlorotétracycline plus pur.
Un autre composé d'ammonium quaternaire qui est un véhicule utile dans le présent procédé est le produit appelé "Onamine RO", vendu par Onyx Oil and Chemical Company. C'est un dérivé d'imidazoline substituée, soluble dans l'huile, contenant une chaîne grasse longue en combinaison avec des groupes amine et hydroxyle.
Après le procédé d'extraction décrit, on peut récupérer la chlorotétracycline à partir de l'extrait de plusieurs façons. Une méthode préférentielle comporte l'acidification directe pour récupérer la chlorotétracycline sous forme d'un sel d'acide minéral, par exemple de chlorhydrate. Pour réaliser cette opération d'isolement, on ajoute à l'extrait, préparé comme ci-dessus, environ 5 cm3 d'eau par gramme de chlorotétracycline présent dans le mélange de fermentation. Puis on acidifie le mélange avec de l'acide chlorhydrique concentré jusqu'à un pH d'environ 0,4 - 0,5.
Après avoir agité 18 à 24 heures pour favdriser la cristallisation, on filtre les cristaux de chlorhydrate de chlorotétracycline, on les lave à l'eau, on les lave avec un alcoxyalcanol inférieur tel que le 2-éthoxy- éthanol, puis avec un alcool inférieur tel que l'isopropanol, puis on'les sèche sous vide.
Les produits obtenus par le procédé d'extraction décrit ci-dessus sont généralement de qualité supérieure à tous égards, sauf l'apparence
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visuelle. Apparemment, certaines des impuretés colorées qui seraient normalement éliminées par filtration du mélange acidifié sont véhiculées dans ce procédé, et elles communiquent une apparence verdâtre ou brunâtre au produit cristallin. Ce seul inconvénient, qui se produit par suite de l'extraction directe du mélange de fermentation, peut.être facilement remédié si l'on traite l'extrait au solvant par un réducteur tel que l'hydrosulfite de sodium. Il est préférable de conduire ce traitement en milieu acide.
Donc, après addition d'eau l'extrait à la méthylisobutylcétone, on ajuste le pH entre 1 et 4 environ, et de préférence à 1,8 environ, à l'aide d'acide sulfurique. Il est essentiel que cette acidification soit opérée avec un acide qui ne provoque pas la cirstallisation prématurée du produit. On ajoute alors de l'hydrosulfite de sodium, à raison d'environ 0,3 à 0,6 g / 100 cm3. Cet intervalle est très critique, car tout excès tend à provoquer une coloration brune du produit final. On agite alors vigoureusement le mélange traité pendant un temps court avant de continuer le traitement. On effectue alors l'acidification à pH 0,5 environ, par addition d'acide chlorhydrique concentré.
On ajoute alors environ 0,5 g de chlorure de sodium par 100 cm3 d'extrait à la méthylisobutylcétone, pour introduire les ions chlorure qui font défaut par suite de l'acidification préliminaire par l'acide sulfurique. On laisse alors vieillir le mélange et on récupère les cristaux comme on l'a décrit plus haut à propos de l'étape d'isolement.
L'invention n'est pas limitée à l'hydrosulfite de sodium comme réducteur, car on peut aussi utiliser d'autres réducteurs, par exemple l'anhydride sulfureux, le sulfite de sodium, etc.
Les méthodes d'extraction et d'isolement décrites ci-dessus à propos des mélanges contenant de la chlorotétracycline peuvent s'appliquer, pratiquement sans modification, à la récupération de la tétracycline à partir de mélanges de fermentation contenant de la tétracycline, ainsi qu' à la récupération des deux antibiotiques à partir du même mélange. On a trouvé que les conditions générales d'extraction, à savoir le pH, la proportion de solvant, les quantités de véhicules, etc., sont pratiquement similaires à celles décrites en détail à propos de l'extraction de la chlorotétracycline directement à partir du mélange de fermentation.
Mais, alors que la chlorotétracycline obtenue par extraction directe du mélange de fermentation nécessite un traitement par un réducteur pour donner un produit ayant une apparence satisfaisante, on a trouvé que ce traitement n'est pas nécessaire dans le cas de la tétracycline. Le procédé d'extraction directe de la tétracycline à partir du mélange de fermentation, lorsqu'on le conduit dans les conditions de travail préférentielles décrites ci-dessus, donne généralement un produit d'apparence visuellle satisfaisante en l'absence de tout traitement par un réducteur.
On a trouvé que cela était particulièrement vrai quand on traite le mélange peu de temps après la récolte et qu'on ne le laisse pas-reposer un temps considérable avant l'extraction.
On peut isoler la tétracycline de l'extrait par acidification directe pour récupérer le chlorhydrate de tétracycline, à peu près de la façon que l'on a décrite à propos de la méthode préférentielle de récupération de la chlorotétracycline à partir de l'extrait au solvant. En outre, on peut isoler la tétracycline sous forme de base libre en mettant l'extrait de tétracycline dans la méthylalkylcétone en contact avec de l'eau acidulée, à un pH compris entre 1,5 et 2,0, en séparant la phase aqueuse contenant la tétracycline d'avec la phase solvant, en ajustant le pH de la phase aqueuse entre 2 et 4, et en récupérant la tétracycline neutre
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par cristallisation dans la phase aqueuse.
Ce procédé, plus particulière- ment décrit dans la demande de brevet français du 22 juillet 1957, est particulièrement avantageux si l'on veut obtenir des produits d'une cou- leur supérieures
Un autre procédé qui peut servir avantageusement ici pour isoler la tétracycline de l'extrait au solvant, consiste à lettre l'extrait en contact avec de l'urée aqueuse, et à séparer la tétracycline sous forme de composé tétracycline-urée, à partir duquel on peut facilement régénérer la tétracycline pure.Le procédé, qui fait l'objet de le demande de brevet francais du 6 décembre 1956 fournit un excellent moyen pour isoler la tétracycline de l'extrait au solvant.
Les cristaux d'antibiotique obtenus par le procédé d'isolement ci-dessus sont habituellement de la tétracycline neutre à 97 - 100 % de pureté, et peuvent être convertis en chlorhydrate de tétracycline de qualité pharmaceutique par un simple procédé en une seule étape consistant à délayer la tétracycline neutre dans du butanol, du 2-éthoxy-éthanol, et de l'acide chlorhydrique,
On décrira l'invention plus en détail à propos des exemples précis qui suivent.
EXEMPLE 1 Extraction directe de la chlorotétracycline à partir du mélange de fermentation.
On prend une portion de 3 kg de m é l a n g e .d e fermenta- tion de chlorotétracycline titrant 5800 gammas/cm3, on l'ajuste à pH 1,4 par addition d'acide sulfurique à 25 %. Après avoir agité pendant 30 mi- nutes, on ajoute 75 g d'oxalate d'ammonium monohydraté et on agite le mélange pendant 45 minutes. Au mélange, on ajoute 54 cm3 d'"Arquad 16", sous forme de solution à 50 % dans l'isopropanol, et on ajuste le pH à 8,5 avec de la soude à 25%. On extrait alors le mélange en agitant vigou- reusement pendant 20 minutes avec 600 cm3 de méthylisobutylcétone. On ajoute au mélange 120 g de "Hyflo", et on filtre le mélange. On laisse dé- poser le filtrat pendant 3 heures, après quoi on sépare la phase solvant.
On reprend le gâteau-filtre dans 450 cm3 de méthylisobutylcétone, on filtre et on rince avec 50 cm3 de méthylisobutylcétone. On réunit les extraits . a u solvant p o u r d o n n e r un volume total de 980 cm3, titrant 16 000 gammas/cm3, ce qui représente une récupération de 90,2 %.
EXEMPLE 2 Récupération du chlorhydrate de chlorotétracycline.
A 654 cm3 d'extrait à la méthylisobutylcétone préparé comme dans l'exemple 1, titrant 16 000 gammas/cm3, on ajoute 65 em3 d'eau, et on ajuste le pH à 0,5 en ajoutant 8 cm3 d'acide chlorhydrique concentré.
On agite le mélange à la température ante pendant 17 heures, après quoi on filtre les cristaux obtenus,on les lave avec 15 cm3 d'eau, 15 em3 de 2-éthoxyéthanol et 15 cm3 d'isopropanol, et on les sèche sous vide à 40 C pendant 16 heures. On obtient un rendement de 9,74 g de chlorhy- drate de chlorotétracycline titrant 987 gammas/mg, ce qui représente un rendement d'ensemble de 82% par rapport au mélange de fermentation. Le produit, qui est brun grisâtre clair, présente une valeur E 1% 1 cm de 0,13 à 460 millimicrons. 1 cm EXEMPLE 3 Traitement par un réducteur..
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A 100 cm3 d'extrait à la méthylisobutylcétone préparé comme dans l'exemple 1 et titrant 17 800 gammas/cm3, on ajoute 15 cm3 d'eau et on ajuste le pH à 1,8 avec de l'acide sulfurique à 25%. Au mélange, on ajoute 0,3 g d'hydrosulfite de sodium et on agite vigoureusement le mélange pendant 10 minutes, après quoi on ajuste le pH à 0,5 avec de 1' acide chlorhydrique concentré. Pour fournir un supplément d'ion chlorure, on ajoute 0,5 g de chlorure de sodium. On agite le mélange pendant 20 heu- res, on filtre, on lave à l'eau, au 2-éthoxyéthanol et à l'isopropanol, et on sèche sous vide. On obtient un rendement de 1,68 g de chlorhydrate de chlorotétracycline, qui titre 973 gammas/mg, ce qui représente un rendement d'étape de 92 %. Le produit, qui est jaune vif, présente une valeur E 1% de 0,22 à 460 millimicrons.
EXEMPLE 4 Extraction directe de la tétracycline du mélange de fermentation.
A 2 litres de mélange de fermentation de tétracycline titrant 6 200 gammas/om3, on ajoute 40 g d'acide oxalique pour ajuster le pH à 1,5 et on agite le mélange pendant 30 minutes. Sur la base de la puissance du mélange, on ajoute 24 cm3 (1 équivalent) d' "Arquad 16" sous forme de solution à 50% dans l'isopropanolo Après 15 minutes d'agitation, on ajoute 400 cm3 de méthylisobutylcétone et on ajuste le pH à 9,5 avec de la soude.
On agite le mélange vigoureusement pendant 20 minutes9 après quoi on ajoute 80 g de "Hyflo", et on filtre le mélange. On sépare ensuite l'extrait de la phase aqueuse épliséeo On reprend le gâteau-filtre dans la phase aqueuse épuisée et on y ajoute 200 cm3 de méthylisobutylcétone fraîche. Après avoir agité pendant 30 minutes, on filtre le mélange et on sépare l'extrait.
Les extraits réunis, qui représentent au total 575 cm3, titrent 18 600 gammas/cm3,ce qui représente un rendement de 87,8 %.
EXEMPLE Lavage à l'eau de l'extrait à la méthylisobutylcétone.
On prend une portion de 555 cm3 d'extrait à la méthylisobutylcé- tone préparé comme dans l'exemple 4, on le lave avec 272 cm3 d'eau préala- blement ajustée à pH 9,5 avec de la soude, en agitant pendant 20 minutes, et on sépare. L'extrait lavé, représentant 520 cm3, titre 19 450 gammas/ cm3, soit un rendement d'étape de 98,3 %.
EXEMPLE 6 Nouvelle extraction par l'eau de l'extrait au solvant lavé.
A 500 cm3 de l'extrait à la méthylisobutylcétone préparé comme dans l'exemple 5, on ajoute 150 cm3 d'eau et on ajuste - le pH à 1,2 par addition d'acide sulfurique. Après avoir agité pendant 30 minutes, on sépare les phases. L'extrait aqueux de 165 cm3 ainsi obtenu titre 56 000 gammas/cm3 ce qui représente un rendement d'étape de 95 %.
EXEMPLE 7 Récupération de la tétracycline neutre.
On prend une portion de 145 cm3 de l'extrait aqueux obtenu comme dans l'exemple 6, et on l'ajuste successivement à pH 1,6, 2,0, 2,6, 3,0 et finalement à 3,6 par addition de soude à 15 %; en agitant le mélange pendant 15 à 20 minutes à chaque niveau. Après vieillissement avec agita- tion à pH 3,6 pendant 16 heures à la température ambiante, on filtre le produit cristallin, on le lave à l'eau et on le sèche sous vide à 40 C.
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On obtient un rendement de 7,4 g de tétracycline neutre titrant 1003 gam- mas/mg soit un rendement d'étape de 92,1 %. Le produit ainsi obtenu a une apparence jaune vif.
EXEMPLE 8 Extraction directe de la chlorotétracycline du mélange de fermentation.
On prend 1500 cm3 de mélange de fermentation de chlorotétracy- cline titrant 6600 gammas/cm3, on l'ajuste à pH 1,5 avec de l'acide sulfuri- que à 25 %. On ajoute-36 g d'oxalate d'ammonium et on agite le mélange pen- dant 45 minutes. On ajoute au mélange 26 cm3 d'"Onamine RO". On ajoute 600 cm3 de méthylisobutyloétone et on ajuste le pH à 8,5 avec de la soude à 25 %. On agite le mélange pendant 20 minutes. On ajoute au mélange 45 g de "Hyflo" et on filtre le mélange. On laisse déposer le filtrat et on sépare la phase solvant. On délaie le gâteau-filtre avec 300 cm3 de méthylisobutylcétone et on filtre. On réunit les filtrats et on sépare les extraits au solvant de la phase aqueuse pour donner un volume total de 780 cm3, titrant 10 250 gammas/cm3, ce qui représente un rendement de 77,8 %.
N.B.- L'"Onamine RO" est vendue par Onyx Oil and Chemical Company, c'est un dérivé d'imidazoline substituée soluble dans l'huile contenant une chaîne grasse longue en combinaison avec des groupes amine et hydroxyle.
EXEMPLE 9 Récupération du chlorhydrate de chlorotétracycline.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.
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The present invention relates to the extraction of chlorotetracycline and / or tetracycline from fermentation mixtures which contain them.
It has previously been proposed to extract cloroteracycline from fermentation liquors by a process which consists of acidifying the broth to solubilize the chloretetracycline, then separating the mycelium solids by filtration, and extracting the chlorotetracycline from the filtrate using an organic solvent and a surfactant. The extraction process using organic solvents was therefore previously applied only to the filtrates containing the active principle, and not to the fermentation mixtures themselves.
Until now, it was thought that it was not possible to extract chlorotetracycline directly from the fermentation mixture, since it was assumed that, mycelial solids act in some way to retain chlorotetracycline and suck thus the easy extraction thereof by means of solvents. Consequently, in all the procedures of the prior art, the mixture was invariably filtered to obtain a filtrate containing the active principle, before any extraction of the chlorotetracyline.
Similar considerations apply to the extraction of tetracycline from fermentation mixtures which contain it, and also to the extraction of both antibiotics from the same mixture at the same time, since it is known that chlorotetracycline and both tetracycline are formed in fermentation by S. aureofaciens.
The object of the present invention is to simplify the processes of the prior art, based on the discovery that, under certain conditions, it is possible to extract chlorotetracycline and / or tetracycline directly from the fermentation mixture. without the need to filter the mixture to remove mycelium solids as it was thought to be done previously.
According to the invention, there is provided a process for the extraction of chlorotetracycline and / or tetracyline from a fermentation mixture which contains them, which process consists of:
1) in acidifying the mixture to a pH between approximately 0.5 and 2.5 in order to dissolve the antibiotics it contains;
2) adjusting the content of the mixture of calcium and magnesium ions to about 10-45 mg per gram of antibiotic in the mixture;
3) to add thereto a quaternary ammonium compound corresponding to the formula:
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in which R1 is a lower alkyl or benzyl radical, R2 is a long fatty chain, R and R are lower alkyl radicals, and R1 and R taken together represent a divalent carbon chain of "2 to 4 carbon atoms;
4) adjusting the pH of the mixture to about 5.5 to 11, and adding a polar organic solvent immiscible with water to extract the antibiotics from the treated mixture.
In addition to the direct extraction of antibiotics from the fermentation mixture, another advantage of the invention is that increased yields, representing an increase of 10% or more, over the yield of the fermentation can be obtained. extraction of chlorotetracycline and / or tetracycline from the filtrate containing the active principle. This increase in yield is partly due to the elimination of the treatment of the filter cake with hot acid, which was necessary in the prior art process to remove the active principle from the filter cake, and which always resulted to destroy this activity to some extent.
Therefore, not only is the present invention economically advantageous, because it eliminates a step of the prior process which was believed to be essential, but also it is easy to carry out and results in high yields of pure material, yields which are even better. than those commonly obtained when chlorotetracycline or tetracycline is extracted from the acidified filtrate.
Another advantage of the present invention resides in the fact that it eliminates the need to handle large volumes of water which were necessary in the processes of the prior art. To extract the maximum of active principle in an aqueous filtrate, it was born - required to use 2.5 volumes of water for one volume of fermentation mixture, and even so the extraction is not complete. For large scale fermentations, it can be seen that it is extremely expensive to recover chlorotetracycline or tetracycline from such an aqueous filtrate.
Yet another advantage of the present invention is that it gives high yields of substantially pure pharmaceutical grade material, i.e. 95-97% pure. The increased purity can be the result of the treatment with a reducing agent, explained in more detail below.
Chlorotetracycline and tetracycline obtained by the methods of the prior art usually require two recrystallizations with acidified butanol to bring them to meet pharmaceutical standards.
Another advantage of the pure chlorotetracycline obtained by the present invention resides in the fact that it can be reduced directly to tetracycline without further recrystallization or purification operations.
When the invention is carried out by applying it to the extraction of chlorotetracycline from a fermentation mixture which contains it, the first step consists in acidifying the mixture in order to solubilize the chlorotetracycline which it contains. The mixture is acidified to a pH of about 0.5 - 2.5, and preferably to a pH of 1.3 - 1.4, using a strong mineral acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, etc. This acid treatment is carried out at room temperature. The acidified mixture is stirred for a short time to dissolve the chlorotetracycline, then a defined quantity of oxalic acid or ammonium oxalate is added, so as to adjust to a pre-level.
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determined the content of the mixture of calcium and magnesium ions.
In this connection, it has been found that the extraction process described below does not work well when the chlorotetracycline is extracted from the mixture without having adjusted the content of the mixture of calcium and magnesium ions to a well defined level.
It has been found that if the content of the mixture of calcium and magnesium ions is adjusted to between 10 and 45 mg approximately per gram of chlorotetracycline present in the mixture, satisfactory extraction of the active principle from the mixture can be obtained. If quantities of these ions are left in the mixture that are much greater or much less than these figures, insufficient extraction of the active principle is obtained.
The exact cause of this fact is not absolutely cleared up, but it has been observed that pure chlorotetracycline cannot be extracted by the organic solvent if calcium ions are absent, and if there are too many calcium ions in the mixture, during the extraction step, a bulky precipitate of chlorotetracycline will form which is not easily dissolved by the organic solvent. But as was said above, when the content of the mixture of calcium and magnesium ions is adjusted between the limits indicated above, the extraction of chlorotetracyline by the organic solvent takes place regularly and results in good yields of pure matter.
When the precipitation of the desired amount of ion has been completed, so as to adjust the content of the mixture of calcium and magnesium ions to the desired level, to the decalcified mixture is added an appropriate amount of a quaternary ammonium compound, as well as 'it is explained more precisely below. In general, the amount of quaternary ammonium compound can vary from about 1/2 to 3 moles of quaternary compound per mole of chlorotetracycline. The mixture is then stirred and the pH of the mixture is adjusted to between 5.5 and 11, and preferably between 8.4 and 8.6, with sodium hydroxide. An organic solvent is then added to the mixture, with stirring, preferably in an amount of about 10% of the volume of the mixture, or more.
Up to 50% solvent or more can be used, but no particular advantage has heretofore been observed with higher amounts, and at higher levels it becomes uneconomical. The mixture is stirred and filtered, preferably with the help of a filter aid such as diatomaceous earth. The chlorotetracycline passes into the solvent phase, and the filtrate is left to stand until the two phases separate, then the solvent phase is decanted. The filter cake is stirred with fresh solvent and filtered again, and the two extracts are combined for further processing.
Various polar organic solvents immiscible with water can be used in the extraction step. Among the solvents which can be used, mention will be made of butanol, etc. Preferred solvents are methylalkyl ketones, such as methylbutyl ketone, methylpropyl ketone, etc.
Particularly good results are obtained with methyl isobutyl ketone. because this solvent is extremely selective in its property of extracting chlorotetracycline from the mixture and leaving behind impurities.
Quaternary ammonium compounds which are useful as vehicles in the solvent extraction process described above can be represented by the following general formula:
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EMI4.1
wherein R1 is a lower alkyl or benzyl radical, R2 is a fatty chain of at least 8 carbon atoms, R is a lower alkyl radical, R4 is a lower alkyl radical, and R and R, taken together, represent a divalent carbon chain of 4 2 to 5 atoms. Thus, nitrogen can form part of the heterocyclic ring, as in compounds of the “Onamine RO” type, for example those which correspond to the formula:
EMI4.2
where R1, R2, R3 and R4 have the same meaning as above.
Quaternary ammonium compounds referred to as "Arquad" are particularly effective vehicles for the solvent extraction process described herein. These compounds are primarily alkyltrimethylammonium chlorides and can be represented by the formula R-N (CH3) Cl, where R is a long chain alkyl group of at least 8 carbon atoms.
These particular quaternary ammonium compounds are sold by Armor and Company under the trademark "Arquad". There are various compounds of this class, which vary in the length and number of long chain alkyl groups attached to the nitrogen atom. A few types of "Arquada" which are commercially available and which can advantageously be used in carrying out the present invention are cited above.
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EMI5.1
<tb>
<tb>
COMPOSITION <SEP> AVERAGE <SEP> OF <SEP> "ARQUADS" <SEP> EN <SEP> ACTIVE <SEP> INGREDIENTS
<tb> Groups <SEP> substituents <SEP> Length <SEP> of <SEP> "Arquad" <SEP> "Arquad" <SEP> "Arquad"
<tb> string <SEP> char- <SEP> 12 <SEP> 16 <SEP> 18
<tb> bonée
<tb> Octyle <SEP> 8- <SEP> - <SEP> Decyle <SEP> 10 <SEP> - <SEP> - <SEP> Dodecyle <SEP> 12 <SEP> 90% <SEP> - <SEP> Tetradecyle <SEP> 14 <SEP> 9% <SEP> Hexadecyle <SEP> 16 <SEP> - <SEP> 90% <SEP> 6%
<tb> Ootadecyle <SEP> 18- <SEP> 6% <SEP> 93%
<tb> Octadecyle <SEP> 18 <SEP> 1% <SEP> 4% <SEP> 1%
<tb> Octadecadienyl <SEP> 18- <SEP> - <SEP> COMPOSITION <SEP> AVERAGE <SEP> DES <SEP> "ARQUADS" <SEP> EN <SEP> ACTIVE <SEP> INGREDIENTS
<tb> Group <SEP> Length <SEP> of <SEP> "Arquad" <SEP> "Arquad" <SEP> "Arquad" <SEP> "Arquad"
<tb> placeholders <SEP> string <SEP> char- <SEP> C <SEP> S <SEP> 2C <SEP> 2HT
<tb> buoy
<tb>
Octyle <SEP> 8 <SEP> 8% <SEP> - <SEP> 8% <SEP> Decyle <SEP> 10 <SEP> 9% <SEP> - <SEP> 9% <SEP> Dodecyle <SEP> 12 < SEP> 47% <SEP> - <SEP> 47% <SEP> Tetradecyle <SEP> 14 <SEP> 18% <SEP> - <SEP> 18% <SEP> Hexadecyle <SEP> 16 <SEP> 8% <SEP > 10% <SEP> 8% <SEP> 30%
<tb> Octadecyle <SEP> 18 <SEP> 5% <SEP> 10% <SEP> 10% <SEP> 70%
<tb> Octadecadienyl <SEP> 18 <SEP> 5% <SEP> 35% <SEP> - <SEP> Octadecadienyl <SEP> 18- <SEP> 45% <SEP> - <SEP> -
<tb>
<tb>
"Arquad" 16, which is a long chain alkyltrimethylammonium chloride in which the alkyl groups include 90% hexadecyl groups, 6% octadecyl groups and 4% octadecenyl groups, is particularly preferable because it appears to be particularly selective. to give a purer chlorotetracycline product.
Another quaternary ammonium compound which is a useful vehicle in the present process is the product referred to as "Onamine RO", sold by Onyx Oil and Chemical Company. It is a substituted, oil-soluble imidazoline derivative containing a long fatty chain in combination with amine and hydroxyl groups.
After the described extraction process, the chlorotetracycline can be recovered from the extract in several ways. A preferred method involves direct acidification to recover the chlorotetracycline in the form of a mineral acid salt, for example hydrochloride. To carry out this isolation operation, approximately 5 cm3 of water is added to the extract, prepared as above, per gram of chlorotetracycline present in the fermentation mixture. The mixture is then acidified with concentrated hydrochloric acid to a pH of about 0.4-0.5.
After having stirred for 18 to 24 hours to favor crystallization, the crystals of chlorotetracycline hydrochloride are filtered, washed with water, washed with a lower alkoxyalkanol such as 2-ethoxyethanol, then with a lower alcohol. such as isopropanol and then dried in vacuo.
The products obtained by the extraction process described above are generally of superior quality in all respects except appearance.
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visual. Apparently, some of the colored impurities which would normally be removed by filtration from the acidified mixture are carried in this process, and they impart a greenish or brownish appearance to the crystalline product. This only drawback, which occurs as a result of the direct extraction of the fermentation mixture, can be easily remedied by treating the solvent extract with a reducing agent such as sodium hydrosulphite. It is preferable to carry out this treatment in an acidic environment.
Therefore, after adding water to the methyl isobutyl ketone extract, the pH is adjusted to between 1 and 4 approximately, and preferably to approximately 1.8, using sulfuric acid. It is essential that this acidification be carried out with an acid which does not cause the premature cirstallization of the product. Sodium hydrosulfite is then added in an amount of approximately 0.3 to 0.6 g / 100 cm 3. This range is very critical, as any excess tends to cause brown coloration of the final product. The treated mixture is then stirred vigorously for a short time before continuing the treatment. Acidification is then carried out to approximately pH 0.5, by addition of concentrated hydrochloric acid.
Approximately 0.5 g of sodium chloride is then added per 100 cm3 of methyl isobutyl ketone extract, to introduce the chloride ions which are lacking as a result of the preliminary acidification with sulfuric acid. The mixture is then allowed to age and the crystals are recovered as described above with regard to the isolation step.
The invention is not limited to sodium hydrosulfite as reducing agent, since other reducing agents can also be used, for example sulfur dioxide, sodium sulfite, etc.
The extraction and isolation methods described above with respect to mixtures containing chlorotetracycline can be applied, with virtually no modification, to the recovery of tetracycline from fermentation mixtures containing tetracycline, as well as recovery of the two antibiotics from the same mixture. It has been found that the general conditions of extraction, i.e. pH, proportion of solvent, amounts of vehicles, etc., are substantially similar to those described in detail in connection with the extraction of chlorotetracycline directly from chlorotetracycline. fermentation mixture.
However, while the chlorotetracycline obtained by direct extraction from the fermentation mixture requires treatment with a reducing agent to give a product having a satisfactory appearance, it has been found that this treatment is not necessary in the case of tetracycline. The process of direct extraction of tetracycline from the fermentation mixture, when carried out under the preferential working conditions described above, generally gives a product of satisfactory visual appearance in the absence of any treatment with a reducer.
This has been found to be particularly true when the mixture is processed shortly after harvest and not allowed to stand for a considerable time before extraction.
Tetracycline can be isolated from the extract by direct acidification to recover tetracycline hydrochloride, much as described in connection with the preferred method of recovering chlorotetracycline from the solvent extract. . In addition, tetracycline can be isolated in the form of the free base by contacting the tetracycline extract in methylalkyl ketone with acidulated water, at a pH of between 1.5 and 2.0, separating the aqueous phase. containing tetracycline from the solvent phase, adjusting the pH of the aqueous phase between 2 and 4, and recovering the neutral tetracycline
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by crystallization in the aqueous phase.
This process, more particularly described in the French patent application of July 22, 1957, is particularly advantageous if it is desired to obtain products of a superior color.
Another method which can be used advantageously here to isolate the tetracycline from the solvent extract, consists literally the extract in contact with aqueous urea, and to separate the tetracycline in the form of tetracycline-urea compound, from which pure tetracycline can be easily regenerated. The process, which is the subject of the French patent application of December 6, 1956, provides an excellent means of isolating tetracycline from the solvent extract.
The antibiotic crystals obtained by the above isolation method are usually 97 - 100% pure neutral tetracycline, and can be converted to pharmaceutical grade tetracycline hydrochloride by a simple one-step process of dilute the neutral tetracycline in butanol, 2-ethoxy-ethanol, and hydrochloric acid,
The invention will be described in more detail with regard to the specific examples which follow.
EXAMPLE 1 Direct extraction of chlorotetracycline from the fermentation mixture.
A 3 kg portion of chlorotetracycline fermentation mixture titrating 5800 gammas / cm3 is taken and adjusted to pH 1.4 by addition of 25% sulfuric acid. After stirring for 30 minutes, 75 g of ammonium oxalate monohydrate is added and the mixture is stirred for 45 minutes. To the mixture, 54 cm3 of "Arquad 16", in the form of a 50% solution in isopropanol, are added and the pH is adjusted to 8.5 with 25% sodium hydroxide. The mixture is then extracted by stirring vigorously for 20 minutes with 600 cm 3 of methyl isobutyl ketone. 120 g of "Hyflo" are added to the mixture, and the mixture is filtered. The filtrate is allowed to settle for 3 hours, after which the solvent phase is separated.
The filter cake is taken up in 450 cm3 of methyl isobutyl ketone, filtered and rinsed with 50 cm3 of methyl isobutyl ketone. We combine the extracts. in solvent for a total volume of 980 cm3, assaying 16,000 gammas / cm3, which represents a recovery of 90.2%.
EXAMPLE 2 Recovery of chlorotetracycline hydrochloride.
To 654 cm3 of methyl isobutyl ketone extract prepared as in Example 1, titrating 16,000 gammas / cm3, 65 em3 of water are added, and the pH is adjusted to 0.5 by adding 8 cm3 of concentrated hydrochloric acid .
The mixture is stirred at ante temperature for 17 hours, after which the crystals obtained are filtered, washed with 15 cm3 of water, 15 cm3 of 2-ethoxyethanol and 15 cm3 of isopropanol, and dried in vacuo at 40 C for 16 hours. A yield of 9.74 g of chlorotetracycline hydrochloride is obtained, assaying 987 gammas / mg, which represents an overall yield of 82% relative to the fermentation mixture. The product, which is light grayish brown, exhibits an E 1% 1 cm value of 0.13 to 460 millimicrons. 1 cm EXAMPLE 3 Treatment with a reducing agent.
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To 100 cm3 of methyl isobutyl ketone extract prepared as in Example 1 and titrating 17,800 gammas / cm3, 15 cm3 of water are added and the pH is adjusted to 1.8 with 25% sulfuric acid. To the mixture, 0.3 g of sodium hydrosulfite is added and the mixture is stirred vigorously for 10 minutes, after which the pH is adjusted to 0.5 with concentrated hydrochloric acid. To provide additional chloride ion, 0.5 g of sodium chloride is added. The mixture is stirred for 20 hours, filtered, washed with water, 2-ethoxyethanol and isopropanol, and dried in vacuo. A yield of 1.68 g of chlorotetracycline hydrochloride is obtained, which titers 973 gammas / mg, which represents a step yield of 92%. The product, which is bright yellow, has an E 1% value of 0.22-460 millimicrons.
EXAMPLE 4 Direct extraction of tetracycline from the fermentation mixture.
To 2 liters of tetracycline fermentation mixture assaying 6,200 gammas / om3, 40 g of oxalic acid is added to adjust the pH to 1.5 and the mixture is stirred for 30 minutes. Based on the potency of the mixture, 24 cm3 (1 equivalent) of "Arquad 16" is added as a 50% solution in isopropanolo. After 15 minutes of stirring, 400 cm3 of methyl isobutyl ketone is added and adjusted. the pH to 9.5 with sodium hydroxide.
The mixture is stirred vigorously for 20 minutes after which 80 g of "Hyflo" is added, and the mixture is filtered. The extract is then separated from the split aqueous phase. The filter cake is taken up in the exhausted aqueous phase and 200 cm3 of fresh methyl isobutyl ketone are added thereto. After stirring for 30 minutes, the mixture is filtered and the extract is separated.
The combined extracts, which represent a total of 575 cm3, assay 18,600 gammas / cm3, which represents a yield of 87.8%.
EXAMPLE Washing the extract with methyl isobutyl ketone with water.
A 555 cm3 portion of the methylisobutylketone extract prepared as in Example 4 is taken, washed with 272 cm3 of water previously adjusted to pH 9.5 with sodium hydroxide, with stirring for 20 minutes. minutes, and we separate. The washed extract, representing 520 cm3, has a titre of 19,450 gammas / cm3, ie a step yield of 98.3%.
EXAMPLE 6 Further water extraction of the washed solvent extract.
To 500 cm3 of the methyl isobutyl ketone extract prepared as in Example 5, 150 cm3 of water are added and the pH is adjusted to 1.2 by addition of sulfuric acid. After stirring for 30 minutes, the phases are separated. The 165 cm3 aqueous extract thus obtained has a titrate of 56,000 gammas / cm3, which represents a stage yield of 95%.
EXAMPLE 7 Recovery of neutral tetracycline.
A 145 cm3 portion of the aqueous extract obtained as in Example 6 is taken, and it is successively adjusted to pH 1.6, 2.0, 2.6, 3.0 and finally to 3.6 by addition of 15% sodium hydroxide; stirring the mixture for 15 to 20 minutes at each level. After aging with stirring at pH 3.6 for 16 hours at room temperature, the crystalline product is filtered, washed with water and dried in vacuo at 40 ° C.
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A yield of 7.4 g of neutral tetracycline titrating 1003 gammas / mg is obtained, ie a stage yield of 92.1%. The product thus obtained has a bright yellow appearance.
EXAMPLE 8 Direct extraction of chlorotetracycline from the fermentation mixture.
1500 cm3 of chlorotetracycline fermentation mixture assaying 6600 gammas / cm3 is taken and adjusted to pH 1.5 with 25% sulfuric acid. Ammonium oxalate 36 g is added and the mixture stirred for 45 minutes. 26 cm3 of "Onamine RO" are added to the mixture. 600 cm3 of methyl isobutyloetone are added and the pH is adjusted to 8.5 with 25% sodium hydroxide. The mixture is stirred for 20 minutes. 45 g of "Hyflo" are added to the mixture and the mixture is filtered. The filtrate is allowed to settle and the solvent phase is separated. The filter cake is stirred with 300 cm3 of methyl isobutyl ketone and filtered. The filtrates were combined and the solvent extracts separated from the aqueous phase to give a total volume of 780 cm3, assaying 250 gammas / cm3, which represents a yield of 77.8%.
N.B.- "Onamine RO" is sold by Onyx Oil and Chemical Company, it is an oil soluble substituted imidazoline derivative containing a long fatty chain in combination with amine and hydroxyl groups.
EXAMPLE 9 Recovery of chlorotetracycline hydrochloride.
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