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"Procédé de préparation de stéroïdes polyoxygénés."
Il est déjà connu qu'on peut Introduire de l'oxygène dans des stéroïdes, à l'aidé de microorganismes, dans certaines positions,en particulier en position 11 (voir par exemple le brevet américain No. 2.602.769, demandé le 23 février 1952 par la Société dite : The Upjohn Company).
Dans la demande de brevet déposée le 14 avril 1955 par la demanderesse et ayant pour titre : "Procédé pour introduire de l'oxygène dans des stéroïdes.", un procédé est décrit suivant lequel on réussit.,
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en utilisant certains champignons, à oxygéner des stéroïdes en position 17. Suivant la demande de brevet déposée par la demanderesse le 20 juin 1955 et ayant pour titre : "Procédé pour introduire de l'oxygène dans des stéroïdes. ', il est en outre possible d'introduire par vole biochimique de l'oxygène en position 21 dans des stéroïdes. Il est également connu que l'on peut oxygéner des stéroïdes simultanément dans diverses positions, par exemple en position 6 et 11, à l'aide de cultures de certains champignons.
Jusqu'à présent, il n'était toutefois pas possible en une phase opératoire, d'introduire par voie biochimique de l'oxygène dans au moins deux des positions importantes 11, 17 et 21: Un'tel procédé serait évidemment d'une très grande importance technique.
La. présente invention est relative à un procédé permettant de préparer d'uns façon simple des stéroïdes poly- oxygénés, ledit procédé étant caractérisé par le fait que, sur des stéroïdes qui ne sont pas oxygénés dans au moins deux des positions 11,17 et 21, on fait agir en une phase opératoire des enzymes de cultures aérobies d'au moins deux souches de champignons d'un groupe de trois, dont chacune permet d'intro-, dulre de l'oxygène en position 11, en position 17 ou en posi- tion 21.
Les substances de départ pour le nouveau procédé sont, de préférence, des composés de la série du prégnane, parmi les- quels il y a lieu de comprendre les dérivés saturés ou non-
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[ID. te J;'6fJ, d'une configuration quelconque, du 10,1µ-diinéthyl-17- éti1yl-Cyclopcntano-polyhydrophénanthrèrae, ainsi que de ses homologues supérieurs et infér4àu>%s, par exemple des A-nor-, D-homo- et 19-nor-composés correspondants. Des doubles liaisons se trouvent, par exemple, en position 1, 4, 5, 6, 7, 9, Ils 14, 15 et/ou 16.
La configuration des substances de départ est en particulier celle du prégnane, du 5a-prégnane, du 17[alpha]-
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prwn.nE ou de raoémates correspondants tels qu'on les obtient par synthèse totale. Comme substances de départ de ce genre, .on utilise surtout des composés oxygénés en position 3 et 20 et, le cas échéant, en position 18 et/ou Dans l'une des positions
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11, 17 et 21 et leur dérivés fonctionnels, c'est-à-dire des prégnanes qui présentent dans les positions indiquées un groupe oxo ou hydroxy libre ou fonctionnellement modifié, par exemple
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dos esters, éthers, thioéthers, thiol- et th1on-estera, acétals, mercaptals, acétals, des dérives énoliques comme les esters énol1qucs ou les étamines, des hydrazones,
Semlearbazones et analogues. Ils peuvent aussi porter d'autres substituants, notamment des groupes hydroyy ou oxo libres ou fonctionnelle-
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ment mQd1r1és,PQ exemple en position 1, 2, 6, 7, 12, 15, 16, ou 19 et en particulier en position 9 des atomes d'halogène, comme le chlore ou le fluor.
Des substances de départ spéciales sont entre autres la progestérone, la 17 -Progestérone, la r
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16"hYd" WP" Seatérone, la 17a-hydroxyprogestérone ou la 18a-hydroxyprogeatérane, la cortexone, la 11-edto-progestérone,
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la .3a-hydroxyprogestdrana ainsi que la Ilp-hydroxyprogestérone la 9, I1- ou la .1, $2-dhydrQpros3tdrone, la 19-hydroxy- progestérone, la 9-chiro- ou Wluoro-1$-hydroy-p:cgsstrone, la 11, .-dihydroacy-progastërbne, la llp-hydroxy-18-oxo-progea- tér-one, la 9-chloro- ou ¯'$ucro-11-hyc3roxy-18-a proostérone, . ;
\ la 11,18-dioxo-prazestérone,'1a . 19-nor-progestérone, la 19-nor- t 111#-igdzox--18-o.o-progsstd'sne, la pr6gnénolone, les 1-déhydro-, composéa correspondants, par exemple la 1-déhydroprogentérone, la I-d6hYdo-11a-hydroxy-proge8térone, la 1-déhydro-11-céto-,, Îllu- ou 11-hy roxy-pogastérone, ou leurs dérivés fonctionnels.
L--3 enzymes utilisées pour l'oxydation en position 11 sont, de préférence, produites par des cultures aérobies de champignons des genres thiopus, Mucor, Aspergillus, Penicil- liam, Curvularia, unritgh,e3$a, Spondy&oc$adïtar ou Strepto- syces. Pour l'oxydation en position 17 sont appropriées des
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enzymes provenant de cultures aérobies de champignons des'
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genres Tllohothec1um, AcrQthéclum,.Leptosphaeria, Cucurbltaria, Acrospelra, Lophotricus, Melanospora et Thielavia, en parti- culîer'do souches actives du Trichothecium roseum, du Lepto-
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sphaeria maculans, du Cureurbitaria laburni, de l'Aorospeis'a levis, du Lopotrichus hart'inii, du Melanospora parasitica et du Th1elav1a terricola.
Les enzymes pour l'oxydation en position cl sont avantagOUSement obtenues à l'aide de cultures aérobies de champignons des genres Oph1obolus ou Sclérotinla, 'en parti- culier par des souches actives de l'Ophlobolus herpotplohus et -t
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du Sclerotinia fructicola. Dans ce cas, on peut travailler avec des préparations d'enzymes isolées ou enrichies, en particulier toutefois avec des cultures brutes de champignons ou avec leurs filtrats.
Les solutions de culture sur lesquelles on ensemence ces champignons sont avantageusement remuées, c'est-à-dire écoutes ou agitées, et elles renferment du carbone assimilable, en particulier des hydrates de carbone, ainsi que, le cas échéant, des substances de par exemple de l'eau de gonflement du maïe ou du moût de bière, et des sels inorgani- ques. On peut ainsi utiliser des solutions nutritives naturelles, synthétiques ou semi-synthétiques. On utilise avantageusement les solutions nutritives qui offront aux champignons utilisés des conditions de croissance optima..
Il est possible d'ajouter ultérieurement des sub@tances nutritive et des substances de croissance spécialement appropriée)'pour le second ou le troisième champignon.
Ce procédé est exécuta en une phase opératoire. Il s'est toutefois avéré avantageux d'effectuer successivement dans le tempe-les oxygénations dans les positions indiquées.
Un procède pratiquement tres simple est décrit dana ce qui suit, sans que l'invention se trouve pour autant limitée à ces seules indications
On cultive l'organisme nécessaire pour la première oxygénation dans des appareils et dans des conditions analogues
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in, ceux qui sont connus pour les cultures Atcatergees, dans la
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fabrication des antibiotiques. Lorsque les cultures sont bien
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développées, on ajoute les subatanoea de dépare indi-luées, à
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l'état de fine dispersion ou de solution, par exemple dune le
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méthanol, l'acétone ou l' étlalng3,ttol, et poursuit l'incuba- tion, juaqulâ ce que l'oxygénation maximum Boit atteinte.
On ajoute alors au mélange réactionnel, sans filtrer iaa$iab3.::nt
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ou sans isoler le produit d'oxydation, une culture développée
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du second organisme et si clect nécensa1re des substances nutritives et des substances de croissance COY':3pP3ïltYi':'.s et poursuit l'incubation. Le cas échéant,, on réphte cette opération avec un tl'01s1èma m1croorgenlDme. La Msxh# des di- verses oxygénations peut 8tre suivie par chromatographie sur pcpiep.
Finalement, on 8#pa le mycélium, extrait l9 filtrat et/ou la masse de mycéllum et isole les produits réactionnala de l'extrait, d'une manière en elle-mama connus, par excssple par répartition entre solvants ou mélanges de colvatits non Miscibles l'un avec l'autre, par adsorption, chrom!3.tcgre.n"lle, cr1atallisatlon, transformation en dérivés fonctionnels tels que les compostts.. <2$ Girard OM par d'autres procédés apP;lopr1és.
Les cultures do champignons ou les enzymes peuvent
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être ajoutées dans un ordre quelconque. On peut d'ailleurs facilement déterminer par des essais préalables quel est l'ordre
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4ui offre le cas échéant des avantagea.
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Les produits obtenus par le présent procédé peuvent
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8t.t'u utilIsés comme médicaments ou comme produits j.nte:rméd1s.1rliJ/3 pour préparer d'autres produits précieux. Parmi ces produits, ceux qui présentent un grand Intérêt pratiqua sont par exemple
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la cortisone, l'hydrocortisone, la 1-déiiyàro-cortisone, la l-diShydro-hydl'ocort1mone, la substance S de Reichste1n, 18 aldostérone, et la corticcatëx'OKe.
L'invention ddorïte plus en détail dinx les exemples non llnitatifa qui suivent. Dans ces exemples les
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températures sont indiquées en degrés cent1gades.
¯!.ft.i'ilp-l, 1:.-
Dans une fiole conique d'une capacité de 500 cm3, on une stérilise 50 cm3 de moût de bière et les ensemence avec/souche
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d'Ophiobolus herpotrichus. On agite la cultt1o a 270, Au bout de trois jours elle a 0 est bien cléveloppée et on y ajoute dans des conditions stériles une solution de 15 mg de progestérone dans 0,75 cin d "acétone. En m.Cm4., temps on stérilise dans une seconde fiole conique 50 cm3 de moût de bière et les ensemence
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avec une souche de Cuvulàr1a brachysporà, On ag1teSLors les deux cultures de'"la même façon à 270, Au bout de trois jours, la culture développée de Curvularla est ajoutée à la culture
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d'Ohplobolus dans des conditions stériles. On continue d'agiter les cultures réunies.
Au bout .de trois jours,, on sépare le
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tcél1um et extrait le filtrat de culture a toio ''3 i: avec chaque fois 30 em3 d'acétate d'éthyle. On lava les extraits ira l'eau, les sèche et les évapore. L'examen du réaldu effectué par chromatographle sur papier montre la présence de isx 3.-3!-fdro. proroae (cort1costérol'H).
Si l'on remgls.ce 5ns le procédé ci-dessus la proges- térone par de la i8-8ß o-ps c:sron,. on obtient alors do 1 aldo3 téro11e.
ExemuJi. 2" Comre décrit dcns l'exsaple 1 on ajoute à une culture ;110-ze.'j.ebolus her-rotricht,2 dans 50 c*n3 de Ro8t de bière, une ? 1+8À?n à* 15 zs àe ps'osss'ëércne dans 0,75 03 F:t,3iît. En r.-;91 -:::,emp3 a a'rt#e yne ses onde !'lo1 conique, on @KS@'s3noe 50 cm' 4e fi=<>5t ee bière até:;.j.liëé avee eu Trichoth-3ciu:3 'wfiiW'à:.(i. On &glt& . C :'sr à 1;x E: i ß3r'.'. à 27 .. Au bout 6s trois jours ::;n ?:'i!1t:nit ces CltV37S tout en évitant des 1.fect1ons, et , agit'= 3.e Béisnse pendant tyals jours à la même ba:praba;3.
On :p"L alors le mycélium et extrait le f11trut da culture t";OTIme èéc!'1t . Cmaüe 1. D'après 1'examen effectua par chrcEatozraphieur papier le résidu d'extraction rz-nn nue
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: la 17G,21-dihydroxy-prog3stëron$ (substance S de Rlchste1n).
" Ex#H:ple.
Si Pon remplace dans l'exemple 2 la progestérone par de la 1)+Ôét -Pr Zeatéronc et qu'on incube de la man1ère décrite avec des cultures dQOp1obolU8 herpotrichus et de
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Trichothcoium roseum, on peut alors Poêler dans le résidu d'extraction de notables quantités de 7,i.-céto-l7a,wlwdlp hydOXYDproge8térone (cortisone).
Exemple 4.
Si l'on remplace dans l'exemple 2 la progestérone
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par de la Ilf3...hydroxy-progestérone et que l'on Incube de la m3ma manière avec des cultures dOOph1obolus herpotrlchus et de Trichothenlum roseum, on peut alors déceler dans le résidu d'extraction de notables quantités de ll,l?ac,2ltrüdroac¯ ,progestérone (hydro-cortisone).
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xcâiif.c :,j.
Comme décrit à l'exemple 1, on ajoute à une culture del3phiobo.us herpotr1ohu dans 50 car de moût de bière, dans des conditions stériles, une solution de 15 mg de progestérone dans 0,75 cm3 d'acétone. En même temps on ensemence, dans une seconde fiole conique, 50 cm3 de moût de bière stérile avec
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du Trichothecium roseum. Les deux cultures sont agitées à 270 et réunies au bout de trois jours. En même temps, on ensemence dans une troisième.fiole conique 50 cm3 de moût de bière stérile Avec du Rhizopus nigricans. Cette culture et le mélange de cultures décrit ci-dessus pont agités trois jours à 27 , la culture de Rhizoupus se développant bien.
On la réunit alors, dans des conditions stériles, au mélange de cultures. On agite encore trois jours à 27 et sépare alors le mycélium* On extrait le filtrat de culture comme décrit à l'exemple 1.
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L'examen du résidu d'extraction effectué par chrom@@@graphie sur papier, montre la présence de quantités notables de 11[alpha],17[alpha],21-trihydroxy-progestérone.
Exemple 6'¯..
On procède de la même manière que celle décrite à l'exemple 5 avec cette seule différence toutefois qu'on ajouta au lieu d'une culture de Rhizopus nigrioans, une culture de Cunninghamella Blakesleena dans 50 cm3 de moût de bière au mélange de la culture d'Ohpiobolus herpotriohus et de Tricho- thecium roseum. Après avoir incubé et extrait de manière analogue, on obtient un résidu d'extraction qui renferme de la 11ss,17[alpha],21-trihydroxy-progestérone (hydrocortisone) et de la 11-céto-17[alpha],21-dihydroxy-progestérone (cortisone).
Exemple 7.
Si dans l'exemple 6, on modifie l'ordre dans lequel on ajoute les cultures indiquées, en incubant d'abord de la progestérone avec une culture de Cunninghamella Blakealeena et en ajoutant ensuite de la manière décrite une culture d'Ophiobolus herpotrichus, puis une culture de trichothecium rosaum, le résidu d'extraction obtenu de manière usuelle' renferme alors également de la 11ss,17[alpha],21-trihydroxy-propges- térone (hydrocortisone) et de la 11-céto-17[alpha],21-dihydroxy- progestérone (cortisone).
Exemple 8.
On ensemence 50 cm3 de moût de bière stérile avec du
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Cunninghamella Blakesleena. On agite la @ulture deux Jours à 27 et ajoute alors, dans des conditions stériles, une
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solution de 15 mg de 11-déaoxy.acortis:ostérone cor'exone dans 0,75 cm3 d'acétone. En même temps, on ensemence dans une seconde fiole conique 50 cm de moût de bière stérile avec du Trichothecium roseum. On continue d"agi ter les deux cultures pendant deux jours à la même température, puis les réunit dans des conditions stériles. On continue d'agiter le mélange et sépare le mycélium au bout de deux jours. L'extraction 'du filtrat de culture a lieu de la même manière que celle décrite à l'exemple 1.
Le résidu d'extraction renferme d'assez
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grandes quantités de 11,.'a,2lmtrihylroxmpoge$tsrone (hydrocortisone) à c8té de llmcto-l7oc,21-:Lhydrox-pxogesté- .*ne (cortisone).
Exemple 9.
Dans une fiole conique, on ensemence 50 cm3 de moût de bière stérile à l'aide de Curvularia lunata et agite deux Jours à 27 . On ajoute alors dans des conditions stériles une
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solution de 15 mg de coxtexone (11-dêaoxy-cortleostdicone) dans , 5 CE! d'acétone. En même temps, on ensemence dans une seconde 'iole conique 50 cm3 de moût de bière stérile à l'aide de
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ptosphaeria maculant. On agite les deux cultures pendant 34 heures à la même température et les réunit alors dans des conditions stériles. On continue d'agiter le mélange pendant $eux jours et sépare alors le mycélium.
On extrait le filtrat
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do cu3 tu a dt4crit à rlple 1 avec de i'<;Jàt:,ie dgéthyle. 1-c résidu d'extinction ronformj, a côté da COr.tii3Or.3, d'assez grandes quantités d'hydro-cortisone.
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Ex xx1! a 10.
Si, dans l'exemple ci-dessus, on ajoute, à la place de la solution de cortexone, une solution de 15 mg de 1-déhydro-
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cortexone dans 0,5 cm3 d'acétone et qu'on incube de la mloea manière avec des cultures de Curvularia lunata et de Leptos- phaeria maculans, le résidu d'extraction renferme alors, à
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côté de 1-déhydro-cortisone, d'assez grandes quantités de 1- déhyaro-hydrocortiaone.
Exemple 11.
Dans un récipient d'agitation d'une capacité de 18 litres, on stérilise 3,6 litres de moût de bière et ensemence
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avec 400 cm3 d'une culture d'agitation d'Ophlobolus harpotriahua âgée de deux jours, développée sur du moût de bière. En
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agitant pendant deux jours à 270 la culture se développs bin.
On ajoute alors dans des conditions stériles une solution de 1,0 g de progestérone dans 25 cm3 d'acétone. En même tempo, on ensemence dans un second récipient d'agitation, 3,6 litres de moût de bière stérile avec 400 cm3 d'une culture d'agitation
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ie Tricotheoium roseum âgée de trois jours, également développée sur moût de bière. On agite les deux récipients pendant trois
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jours à 270.
On transfère alors la culture de Trichothecium développéedans des conditions stériles, dans le récipient
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de 18 litres et au même moment on ensemence, dans un autre récipient d'agitation, 3,6 litres de moût de bière stérile avec 400 cm3 d'une culture d'agitation de Cunninghamella Blakes@cena, âgée de 24 heures, développée sur moût de bière.
On agite ce récipient, de même que celui renfermant le mélange de culture décrit ci-dessus, pendant trois jours à 27 et réunit alors leur contenu dans des conditions stériles, après quoi l'on agite à nouveau pendant deux jours à la température Indiquée. On sépare alors le mycélium. On extrait le filtrat ! de culture à quatre reprises avec chaque fois 3 litres d'acé- tate d'éthyle. On lave les extraits réunis à trois reprises avec chaque fois 500 cm3 d'eau, sèche et évapore. On dissout le résidu obtenu (1,1 g) dans 160 cm3 de méthanol, ajoute
40 cm3 d'eau et extrait à trois reprises avec chaque fois
50 cm3 de pentane.
Les extraits dans le pentane ne renferment que des impuretés huileuses, tandis que les stéroïdes restent dans la solution méthanolique. Celle-ci est évaporée sous vide à 30 et séchée sous un vide poussé. On chromatographie le ré- sidu sur 30 g de gel de silice suivant la méthode par passage, en éluant d'abord avec du chlorure de méthylène, puis avec du chloroforme et avec des mélanges de chloroforme et d'acétone et finalement avec de l'acétone. Les diverses fractions (150 cm3) sont examinées par chromatographie sur papier.
Les fractions éluées avec du chlorure de méthylène et avec du chloroforme renferment des impuretés, un peu de la matière de
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départ et de la 11-désoxy-corticostérone, tandis que dans les mélanges de chloroforme et d'acétone (9:1 et 8:2) se trouve de la 11-céto-17[alpha],21-dihydroxy-progestérone (cortisone). On évapore les fractions en question et l'on obtient la cortisone, après recristallisation dans un mélange d'acétone et d'éther lsoproylique, sous formede cristaux fondant à 208 - 216 .
Les fractions de chloroforme et d'acétone (1:1) renferment de la 11ss,17[alpha],21-trihydroxy-progestérone (hydrocortisone) que l'on cristallise dans l'éther; point de fusion - 204 - 2100.
Exemple 12.
Si, dans l'exemple 2, on remplace la progestérone par de la 1-déhydro-11-céto-progestérone et qu'on Incube de la même manière avec des cultures d'Ophlobolus herpotrichus et de Trichotheclum roseum, on peut alors déceler dans le résidu d'extraction des quantités notables de 1-déhydro-cortisone.
Exemple 13.
Si, dans l'exemple 2, on remplace la progestérone par de la 1-déhydro-11ss-hydroxy-progestérone et qu'on incuba de la même manière avec des cultures d'Ophiobolus herpotrichus .et de Trichothecium roseum, on peut alors déceler dans le résidu d'extraction de notables quantités de 1-déhydro- hydrocortisone.
Exemnle 14.
Si, dans l'exemple 6, on remplace la progestérone par de la 1-déhydro-progestérone et qu'on Incube de la même manière
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avec des cultures d'Oph10bolus herpotrlchus, de Trichotheaium roseum et de Cunninghamella H,akesleeng, on peut alors déceler dans le résidu d'extraction, 8 coté de 1-déhydro-cortisone# de notables quantités de 1-déhydro-hydrocortleone.
Revendications.
,
I.) Un procédé de préparation de stéroïdes polybxygénés, remarquable par le fait que, sur des stéroïdes qui ne sont pas oxygénés au moins dans deux des positions 11, 17 et 21, on fait agir en une phase opératoire des enzymes provenant de cultures aérobies d'au moins deux souches de champignons d'un groupe de trois, dont chacune permet d'introduire de l'oxygène en position 11, en position 17 ou en position 21.
Le présent procédé peut encore être caractérisé par les points suivants :
1. ) Pour l'oxygénation en position 11, 'on utilise des enzymes provenant de cultures aérobies de champignons des genres Rhizopus, Mucor, Aspergillus, Pénicillium, Curvularia,
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Cunninghamella, Spondyloeladium ou Streptomyaès.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.