BE1030650A1 - COMPOSITION FOR STOPTING AND SAMPLING MICROORGANISMS - Google Patents
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Abstract
Composition stérile d'échantillonnage comprenant un tensioactif, une ou plusieurs enzymes choisies dans le groupe constitué d'une protéase, une polysaccharidase, une laccase, une lipase, une cellulose et une mannanase, , kit d'échantillonnage comprenant cette composition, procédé d'échantillonnage basé sur cette composition ou ce kit et utilisation de cette composition ou ce kit pour la détection de bactéries sur une surface.Sterile sampling composition comprising a surfactant, one or more enzymes chosen from the group consisting of a protease, a polysaccharidase, a laccase, a lipase, a cellulose and a mannanase, sampling kit comprising this composition, method of sampling based on this composition or this kit and use of this composition or this kit for the detection of bacteria on a surface.
Description
COMPOSITION DE DECROCHAGE ET DE PRELEVEMENT DE MICROORGANISMESCOMPOSITION FOR STOPTING AND SAMPLING MICROORGANISMS
Domaine techniqueTechnical area
La présente invention se rapporte à une composition de décrochage et de prélèvement de microorganismes, à un kit de décrochage, de prélèvement et de conservation de microorganismes comprenant ladite composition et à un procédé de décrochage, de prélèvement et de conservation de microorganismes.The present invention relates to a composition for removing and sampling microorganisms, to a kit for removing, sampling and preserving microorganisms comprising said composition and to a method for removing, sampling and preserving microorganisms.
L'art antérieurPrior art
Dans de nombreux domaines d'activités comme les secteurs agroalimentaires, les collectivités, les secteurs médicaux et vétérinaires, des contaminations problématiques dues à la présence de microorganismes sont observées très fréquemment.In many areas of activity such as the agri-food sectors, communities, medical and veterinary sectors, problematic contaminations due to the presence of microorganisms are observed very frequently.
Classiquement, dans les hôpitaux et dans les cabinets médicaux ou vétérinaires, la présence de microorganismes est responsable de maladies nosocomiales tandis qu'en agroalimentaire et en collectivité, ces microorganismes sont responsables de la dégradation de denrées périssables mais aussi du transfert de contaminants vers les consommateurs des produits issus par exemple d'une chaîne de production de viande, de fruits, de légumes ou autres.Classically, in hospitals and in medical or veterinary offices, the presence of microorganisms is responsible for nosocomial diseases while in the food industry and in communities, these microorganisms are responsible for the degradation of perishable foods but also for the transfer of contaminants to consumers. products from, for example, a meat, fruit, vegetable or other production chain.
Or, de nos jours, des normes strictes en matière d'hygiène sont imposées et il convient donc de s'assurer que le nombre de microorganismes responsables de telles contaminations soit maintenu sous une valeur seuil acceptable, cette valeur seuil acceptable étant propre à chaque domaine d'activité.Nowadays, strict hygiene standards are imposed and it is therefore necessary to ensure that the number of microorganisms responsible for such contamination is kept below an acceptable threshold value, this acceptable threshold value being specific to each area. of activity.
Les bactéries planctoniques sont un premier exemple de microorganismes contaminants, ces bactéries sont libres au niveau d'un substrat liquide ou solide et posent un problème en soi car elles sont à même de contaminer directement tout type de surface comme les denrées alimentaires, les outils médicaux, les bandes transporteuses, les réservoirs de stockage ou encore les patients humains ou les animaux eux- mêmes.Planktonic bacteria are a first example of contaminating microorganisms, these bacteria are free at the level of a liquid or solid substrate and pose a problem in themselves because they are able to directly contaminate any type of surface such as foodstuffs, medical tools , conveyor belts, storage tanks or even human patients or animals themselves.
Toutefois, aujourd'hui, il est largement reconnu que les problématiques liés à la contamination par des microorganismes sont d'autant plus importants que ces derniers forment des biofilms.However, today, it is widely recognized that the problems linked to contamination by microorganisms are all the more important as the latter form biofilms.
En effet, dans tout type d'industrie et plus particulièrement dans le domaine de l'industrie agroalimentaire, les biofilms se forment de manière inévitable, cela au vu de la richesse du milieu environnant.Indeed, in any type of industry and more particularly in the field of the food industry, biofilms form inevitably, given the richness of the surrounding environment.
Les biofims sont définis comme un consortium deBiofims are defined as a consortium of
Microorganismes enchâssés dans une matrice de substances polymériques extracellulaires. Autrement dit, les biofilms sont des pellicules visqueuses qui se développent sur toutes les surfaces, suite à l'adhésion de microorganismes sur ces surfaces et à la sécrétion par ceux-ci de polymères les recouvrant, facilitant leur adhésion à la surface et formant ainsi Ia matrice extracellulaire. Les biofilms constituent ainsi une couche de protection autour des microorganismes très résistante aux agressions chimiques et thermiques ce qui rend ainsi leur élimination très difficile au moyen des biocides conventionnels et représentent de plus une source récurrente et important de contamination du milieu environnant.Microorganisms embedded in a matrix of extracellular polymeric substances. In other words, biofilms are viscous films which develop on all surfaces, following the adhesion of microorganisms to these surfaces and the secretion by them of polymers covering them, facilitating their adhesion to the surface and thus forming the extracellular matrix. Biofilms thus constitute a protective layer around microorganisms that is very resistant to chemical and thermal attacks, which makes their elimination very difficult using conventional biocides and also represents a recurring and important source of contamination of the surrounding environment.
Cette résistance est expliquée d'une part par la matrice de substances polymériques extracellulaires qui forme une barrière physique à la diffusion des molécules biocides dans le biofilm et, d'autre part, à l'état sessile des microorganismes et à leur capacité à s'échanger entre eux très rapidement des gènes responsables de certains mécanismes de résistance aux biocides.This resistance is explained on the one hand by the matrix of extracellular polymeric substances which forms a physical barrier to the diffusion of biocidal molecules in the biofilm and, on the other hand, by the sessile state of the microorganisms and their capacity to very quickly exchange genes responsible for certain biocide resistance mechanisms with each other.
Dès lors, on comprend aisément que les biofilms sont des structures très résistantes et extrêmement variées, par exemple des souches différentes d'une même bactérie peuvent former des biofilms différents, ces biofilms étant encore plus variés qu'ils sont composés de plusieurs bactéries différentes. De plus, les bactéries s'échangeant entre elles des gènes de résistance et l'environnement influe également sur le biofilm, accentuant encore leur complexité et leur résistance.From then on, we easily understand that biofilms are very resistant and extremely varied structures, for example different strains of the same bacteria can form different biofilms, these biofilms being even more varied as they are composed of several different bacteria. In addition, bacteria exchange resistance genes with each other and the environment also influences the biofilm, further accentuating their complexity and resistance.
En outre, la matrice extracellulaire des biofims peut être identifiée lorsqu'elle est fortement développée mais dans la majorité des cas, le biofiim se développe insidieusement dans les installations et sa présence sera détectée que lors de l'analyse de Ia qualité du produit fini.In addition, the extracellular matrix of biofilms can be identified when it is strongly developed but in the majority of cases, the biofilm develops insidiously in the installations and its presence will only be detected during the analysis of the quality of the finished product.
Concernant la croissance du biofilm, celle-ci a leu de manière cyclique en comprenant une phase de croissance durant laquelle se produit l'accumulation des microorganismes et une phase de détachement durant laquelle des morceaux entiers de biofilms et des microorganismes se détachent par érosion et sous l'effet de leur poids pour contaminer les surfaces, les denrées alimentaires, les outils médicaux, les bandes transporteuses, les réservoirs de stockage ou encore les patients humains, consommateurs ou les animaux eux-mêmes.Concerning the growth of the biofilm, this took place in a cyclical manner, comprising a growth phase during which the accumulation of microorganisms occurs and a detachment phase during which entire pieces of biofilms and microorganisms are detached by erosion and under the effect of their weight to contaminate surfaces, foodstuffs, medical tools, conveyor belts, storage tanks or even human patients, consumers or the animals themselves.
Cela devant entraîner pour l'industriel, l'arrêt de sa chaîne de production, effectuer un cycle de nettoyage pour éliminer le biofilm, représentant de nombreuses heures de travail, ressources déployées et de perte de rendement.This should result in the industrialist stopping his production line and carrying out a cleaning cycle to eliminate the biofilm, representing many hours of work, resources deployed and loss of yield.
De tout ceci, il ressort que les microorganismes contaminants et/ou les biofilms constituent une reelle problématique, tout particulièrement dans le domaine des soins de santé (hôpitaux, cabinets dentaires ou médicaux), des soins vétérinaires et de l'agroalimentaire.From all this, it appears that contaminating microorganisms and/or biofilms constitute a real problem, particularly in the field of health care (hospitals, dental or medical practices), veterinary care and the food industry.
Cette problématique est d'autant plus critique que les microorganismes et/ou les biofilms peuvent impliquer des bactéries responsables d'infections potentiellement mortelles chez les individus, que ces bactéries soient présentes dans les hôpitaux, les cabinets vétérinaires ou encore dans l'industrie agroalimentaire et se retrouvent au final sur les produits alimentaires destinés à la consommation.This problem is all the more critical since microorganisms and/or biofilms can involve bacteria responsible for potentially fatal infections in individuals, whether these bacteria are present in hospitals, veterinary practices or even in the food and beverage industry. are ultimately found on food products intended for consumption.
Comme cela a été indiqué plus haut, la problématique des microorganismes et plus particulièrement des biofilms est double. D'une part, les désinfectants et biocides classiques sont très souvent inefficaces car ils ne parviennent pas à atteindre les microorganismes protégés par la matrice extracellulaire du biofilm, cette matrice étant de structure et de composition complexe et très variable. D'autre part, un biofilm est généralement mixte, c'est-à-dire qu'il contient une multitude de bactéries différentes ou de mêmes bactéries mais qui sont de souches différentes, ce qui favorise la propagation des gènes de résistance entre les bactéries du biofilm et rend ainsi leur traitement très difficile voire inefficace.As indicated above, the problem of microorganisms and more particularly biofilms is twofold. On the one hand, conventional disinfectants and biocides are very often ineffective because they do not succeed in reaching the microorganisms protected by the extracellular matrix of the biofilm, this matrix being of complex and very variable structure and composition. On the other hand, a biofilm is generally mixed, that is to say it contains a multitude of different bacteria or the same bacteria but which are of different strains, which favors the propagation of resistance genes between bacteria. biofilm and thus makes their treatment very difficult or even ineffective.
Par conséquent, d'un environnement à l'autre ou d'un secteur d'activité à l'autre, il est plutôt fréquent que les biofilms détectés soient totalement différents. Afin de détecter les biofilms, il existe des kits de détection de la présence de biofilms sur des surfaces ou dans des installation plus spécifiques (circuits d'eau, etc…), ces kits (tel que celui divulgué dans le document EP2537601) permettent de réaliser une coloration sélective des biofilms. II est donc actuellement possible de déterminer des zones où sont présents des biofilms afin de procéder à une élimination de ces derniers sans toutefois connaître la nature précise des microorganismes (bactéries) à l'origine du biofilm ciblé. en résulte que des compositions d'élimination des biofilms comprenant plusieurs enzymes sont employées sans toutefois savoir si les enzymes utilisées et éventuellement formulées dans une base détergente (voir par exemple le document EP2243821) sont réellement adéquates pour agir sur un biofilm donné. Pour cette raison, les traitements actuels sont plutôt aléatoires et non spécifiques, ce qui est économiquement non rentable et peut entraîner une perte de temps et un arrêt considérable des installations. 5 Par aileurs, des techniques de prélèvement de microorganismes au départ de surfaces ont été développées afin de caractériser et/ou de quantifier les populations de microorganismes présentes sur des surfaces et responsables de contaminations. Ces méthodes de prélèvement permettent donc de déterminer, sur une surface, les différents types (de souches) de bactéries et de microorganismes présents.Consequently, from one environment to another or from one sector of activity to another, it is quite common for the biofilms detected to be completely different. In order to detect biofilms, there are kits for detecting the presence of biofilms on surfaces or in more specific installations (water circuits, etc.), these kits (such as that disclosed in document EP2537601) make it possible to carry out selective staining of biofilms. It is therefore currently possible to determine areas where biofilms are present in order to eliminate them without knowing the precise nature of the microorganisms (bacteria) causing the targeted biofilm. as a result, biofilm elimination compositions comprising several enzymes are used without knowing whether the enzymes used and possibly formulated in a detergent base (see for example document EP2243821) are really adequate to act on a given biofilm. For this reason, current treatments are rather random and non-specific, which is economically unprofitable and can result in wasted time and considerable plant downtime. 5 Furthermore, techniques for sampling microorganisms from surfaces have been developed in order to characterize and/or quantify the populations of microorganisms present on surfaces and responsible for contamination. These sampling methods therefore make it possible to determine, on a surface, the different types (of strains) of bacteria and microorganisms present.
Parmi les méthodes de prélèvement de microorganismes présents sur une surface, l'une des références en la matière est la NormeAmong the methods for sampling microorganisms present on a surface, one of the references in this area is the Standard
ISO 18593 :2004(F) qui prévoit et définit des méthodes horizontales pour des techniques de prélèvement sur des surfaces (plus spécifiquement sur des surfaces se rencontrant dans l'environnement des industries agroalimentaire). La méthode à «l'étoffe/éponge » est un exemple de techniques de prélèvement cité dans cette Norme, cette méthode permettant de rechercher et/ou de dénombrer des microorganismes présents sur une surface. Brièvement, selon cette méthode de prélèvement, il s'agit de mouiller l'étoffe/éponge avec une quantité de diluant qui est du sérum physiologique stérile, d'échantillonner la surface dans deux directions perpendiculaires avant d'introduire l'étoffe/éponge dans un récipient stérile avec le diluant. Par la suite, après un éventuel stockage du prélèvement, ce dernier est analysé quantitativement et/ou qualitativement.ISO 18593:2004(F) which provides and defines horizontal methods for sampling techniques on surfaces (more specifically on surfaces encountered in the environment of the agri-food industries). The “cloth/sponge” method is an example of sampling techniques cited in this Standard, this method making it possible to search for and/or count microorganisms present on a surface. Briefly, according to this sampling method, it involves wetting the cloth/sponge with a quantity of diluent which is sterile physiological serum, sampling the surface in two perpendicular directions before introducing the cloth/sponge into a sterile container with the diluent. Subsequently, after possible storage of the sample, it is analyzed quantitatively and/or qualitatively.
Malheureusement, si une telle méthode permet d'assurer un prélèvement de microorganismes libres à la surface d'un substrat, c'est- d-dire un prélèvement de microorganismes planctoniques, elle se relève être inefficace lorsque la surface est contaminée por des microorganismes ayant formé un biofilm. En effet, comme expliqué plus haut, les microorganismes protégés par la matrice extracellulaire du biofilm, cette matrice étant de structure et de composition complexe et très variable et les biofilms étant mixtes, ils sont encore plus variés et complexes qu'ils sont composés de plusieurs bactéries différentes ou de souches différentes.Unfortunately, if such a method makes it possible to ensure a sampling of free microorganisms on the surface of a substrate, that is to say a sampling of planktonic microorganisms, it turns out to be ineffective when the surface is contaminated by microorganisms having formed a biofilm. Indeed, as explained above, the microorganisms protected by the extracellular matrix of the biofilm, this matrix being of complex and very variable structure and composition and the biofilms being mixed, they are even more varied and complex as they are composed of several different bacteria or different strains.
De plus, il s'avère que les techniques de prélèvement reposant sur un support imprégné d'eau peuvent avoir un effet bénéfique sur le développement des microorganismes, même lors de la réalisation d'un prélèvement au départ d'une surface. En effet, il est reconnu que certaines bactéries présentent une croissance accrue en présence d'eau, le support imbibé d'eau favorisant donc cette croissance pendant le prélèvement mais également après celui-ci puisqu'une fine pellicule d'eau subsiste sur le support traité où a eu lieu le prélèvement. Ceci peut donc favoriser le développement de certains microorganismes non prélevés, en particulier lorsqu'ils sont protégés par Un biofilm.In addition, it turns out that sampling techniques based on a support impregnated with water can have a beneficial effect on the development of microorganisms, even when taking a sample from a surface. Indeed, it is recognized that certain bacteria exhibit increased growth in the presence of water, the support soaked in water therefore promoting this growth during sampling but also after it since a thin film of water remains on the support treaty where the sampling took place. This can therefore promote the development of certain uncollected microorganisms, in particular when they are protected by a biofilm.
Afin de palier aux inconvénients des supports de prélèvement imprégnés d'eau, on connait de l'état de la technique le document DE10304331 qui divulgue une préparation enzymatique qui peut être utilisée pour éliminer les biofilms des surfaces en l'absence de biocides. Cette préparation enzymatique comprend une ou plusieurs enzymes du groupe des polysacchoridases et/ou protéases et éventuellement des nucléases.In order to overcome the disadvantages of water-impregnated sampling supports, we know from the state of the art the document DE10304331 which discloses an enzymatic preparation which can be used to eliminate biofilms from surfaces in the absence of biocides. This enzyme preparation comprises one or more enzymes from the group of polysacchoridases and/or proteases and optionally nucleases.
Malheureusement, même si les compositions selon le document DE10304331 présentent une certaine efficacité en terme de prélèvement des microorganismes, il apparaît qu'elles sont insuffisantes compte tenu de la diversité et de la complexité des microorganismes et des biofilms qui peuvent être présents sur une surface d'une installation et qu'elles ne permettent pas un prélèvement représentatif des populations bactériennes y étant pourtant bien présentes, c'est-à-dire qu'elles ne permettent qu'un faible recouvrement des microorganismes.Unfortunately, even if the compositions according to document DE10304331 present a certain effectiveness in terms of collecting microorganisms, it appears that they are insufficient given the diversity and complexity of microorganisms and biofilms which can be present on a surface of an installation and that they do not allow a representative sampling of the bacterial populations which are nevertheless present there, that is to say that they only allow a weak coverage of the microorganisms.
En effet, les biofilms et/ou les microorganismes présents sur une surface d'une installation sont d'une part composés d'une population de microorganismes variée et complexe, c'est-à-dire différents microorganismes mais également ces différents microorganismes pouvant encore être de souches différents, cela entraînant des résistances différentes mais également la formation de matrices extracellulaires de biofilms variées, complexes et différentes, parfois au sein d'une même surface d'une installation.Indeed, the biofilms and/or microorganisms present on a surface of an installation are on the one hand composed of a varied and complex population of microorganisms, that is to say different microorganisms but also these different microorganisms which can still be be of different strains, this leading to different resistances but also the formation of varied, complex and different extracellular biofilm matrices, sometimes within the same surface of an installation.
Il existe donc un réel besoin de fournir une composition qui a pour but de palier les inconvénients de l'état de la technique en permettant un prélèvement efficace, représentatif et de manière adéquate des populations de microorganismes, qu'ils soient libres mais également sous la forme d'un biofilm de structure complexe qui peut varier considérablement d'un prélèvement à un autre. En outre, il existe un besoin de fournir une composition permettant le prélèvement des microorganismes sur différents types de surfaces, dans différents environnements, stable dans le temps et qui soit facile à utiliser par lesThere is therefore a real need to provide a composition which aims to overcome the disadvantages of the state of the art by allowing effective, representative and adequate sampling of populations of microorganisms, whether they are free but also under the form of a biofilm with a complex structure which can vary considerably from one sample to another. In addition, there is a need to provide a composition allowing the collection of microorganisms from different types of surfaces, in different environments, stable over time and which is easy to use by operators.
Utilisateurs ou encore compatible avec la chaîne de production, par exemple les aliments dans une industrie agroalimentaire.Users or even compatible with the production chain, for example food in a food industry.
A ce titre, la demande de brevet WO 2018/002013 décrit une solution aqueuse visqueuse comprenant une ou plusieurs enzymes et 8,4% de surfactants pour une application sur une surface horizontale ou même verticale, en vue d'une imprégnation prolongée d'un tissu placé sur cette surface, de manière à récupérer un Maximum des micro-organismes éventuellement présents, y compris sous forme de biofilm, tout en préservant leur viabilité et de quantifier leur présence.As such, patent application WO 2018/002013 describes a viscous aqueous solution comprising one or more enzymes and 8.4% surfactants for application to a horizontal or even vertical surface, with a view to prolonged impregnation of a fabric placed on this surface, so as to recover a Maximum of the microorganisms possibly present, including in the form of biofilm, while preserving their viability and quantifying their presence.
Bref résumé de l'inventionBrief summary of the invention
La présente invention a trait à une composition (stérile) d'échantilonnage de microorganismes présents sur une surface, l'échantilonage étant compatible avec les tests microbiologiques en aval, comprenant : un ou plusieurs tensioactif(s), présent{s) à une teneur d'au moins 0,01% en poids et au plus de 1,5% en poids par rapport au poids de ladite composition (somme des poids en tensioactifs : poids de la composition), ce ou ces tensioactif(s) comprenant (ou consistant essentiellement en) un tensioactif anionique ; au moins deux enzymes choisies dans le groupe constitué d'une (sérine) protéase, une polysaccharidase, une laccase, une lipase, une cellulase et une mannanase ; au moins un agent stabilisant présent à une teneur d'au moins 15% par rapport au poids de ladite composition, ledit stabilisant étant choisi dans le groupe des polyols (de préférence le glycérol) et, de préférence au moins un agent séquestrant.The present invention relates to a (sterile) composition for sampling microorganisms present on a surface, the sampling being compatible with downstream microbiological testing, comprising: one or more surfactant(s), present at a concentration of at least 0.01% by weight and at most 1.5% by weight relative to the weight of said composition (sum of the weight of surfactants: weight of the composition), this or these surfactant(s) comprising (or consisting essentially of) an anionic surfactant; at least two enzymes selected from the group consisting of a (serine) protease, a polysaccharidase, a laccase, a lipase, a cellulase and a mannanase; at least one stabilizing agent present at a content of at least 15% relative to the weight of said composition, said stabilizer being chosen from the group of polyols (preferably glycerol) and, preferably at least one sequestering agent.
La présente invention a également trait à l'utilisation de cette composition pour le prélèvement en vue de la détection de microorganismes, avantageusement Salmonella sp. et/ou Listeria sp.The present invention also relates to the use of this composition for sampling for the detection of microorganisms, advantageously Salmonella sp. and/or Listeria sp.
Description détaillée d'une réalisation de l'inventionDetailed description of an embodiment of the invention
Les techniques pour l'évaluation de la présence de microorganismes comprennent la culture, la biochimie (la mesure de la production d'ATP ou de NADH, la Mesure d'une activité enzymatique, par exemple la catalase, voire même la mesure de protéines dans un milieu), les méthodes génétiques de « Polymerase Chain Reaction » (PCR) et de séquençage (ex. ARN riposomial 165) et des méthodes immunologiques.Techniques for assessing the presence of microorganisms include culture, biochemistry (measuring ATP or NADH production, measuring enzyme activity, e.g. catalase, or even measuring proteins in a medium), genetic methods of “Polymerase Chain Reaction” (PCR) and sequencing (e.g. riposomal RNA 165) and immunological methods.
En d'autres termes, de nombreuses enzymes sont utilisées pour une analyse biochimique ou pour les analyses de biologie moléculaire, de cytométrie de flux ou les tests immunologiques (immunoassays), telles que la phosphatase alcaline, la Tag polymérase, la luciférase, etc.In other words, many enzymes are used for biochemical analysis or for molecular biology analyses, flow cytometry or immunological tests (immunoassays), such as alkaline phosphatase, Tag polymerase, luciferase, etc.
Cependant, les inventeurs ont remarqué que l'activité protéolytique résiduelle interférait avec ces tests. De plus les protéases interférèrent avec les complexes antigène-anticorps lors de réactions de type immunologique, également largement utilsés pour la détection de microorganismes. Souvent plusieurs méthodes sont combinées, en particulier la détection de microorganismes pathogènes potentiellement présents à faible intensité comprend une étape de culture, suivie du marquage immunologique et/ou génétique. Ceci implique que le prélèvement des microorganismes doit assurer une récupération suffisante, une viabilité suffisante, mais également que les produits utilisés n'interfèrent pas avec les tests à réaliser en aval. Il y a donc un égquiliore très délicat à respecter.However, the inventors noticed that residual proteolytic activity interfered with these tests. In addition, proteases interfere with antigen-antibody complexes during immunological type reactions, also widely used for the detection of microorganisms. Often several methods are combined, in particular the detection of pathogenic microorganisms potentially present at low intensity includes a culture step, followed by immunological and/or genetic marking. This implies that the sampling of microorganisms must ensure sufficient recovery and sufficient viability, but also that the products used do not interfere with the tests to be carried out downstream. There is therefore a very delicate balance to respect.
Pour résoudre ce problème, il est prévu suivant l'invention une composition stérile d'échantilonnage, de décrochage et/ou de prélèvement, de microorganismes potentiellement présents sur une surface comprenant : - Qu moins un tensioactif anionique, le ou les tensioactifs représentant ensemble au moins 0,01% (de préférence au moins 0,02%) en poids par rapport au poids de ladite composition (poids des tensioactifs :poids de la solution), et au plus 1,5%, de préférence au plus 1%, voire 0,5%, voire même 0,1% ; - Qu moins un polyol (glycérol) en tant qu'agent stabilisant et/ou agent viscosant représentant au moins 15%, de préférence au moins 18%, préférentiellement environ 20% en poids par rapport au poids de ladite composition, et/ou de préférence moins de 30%, voire moins de 25%, en poids par rapport au poids de ladite composition,To solve this problem, according to the invention a sterile composition is provided for sampling, removing and/or taking samples of microorganisms potentially present on a surface comprising: - Qu minus an anionic surfactant, the surfactant(s) together representing at least 0.01% (preferably at least 0.02%) by weight relative to the weight of said composition (weight of the surfactants: weight of the solution), and at most 1.5%, preferably at most 1%, or even 0.5%, or even 0.1%; - Qu least one polyol (glycerol) as stabilizing agent and/or viscosity agent representing at least 15%, preferably at least 18%, preferably approximately 20% by weight relative to the weight of said composition, and/or preferably less than 30%, or even less than 25%, by weight relative to the weight of said composition,
- avantageusement, au moins un agent séquestrant (les cations di- ou multi-valents), de préférence en une teneur pondérale d'au moins 0,2%, de préférence au moins 0,3%, voire au moins 0,4% ; - au moins deux enzymes (en concentration apte à dégrader les éventuels biofilms bactériens ou les souillures et en concentration non interférente avec les tests microbiologiques en aval), lesdites au moins deux enzymes étant choisies dans le groupe constitué d'une (sérine) protéase, une polysaccharidase, une laccase, une lipase, une cellulose et une mannanase. - De préférence, le ou les tensioactifs présent(s) dans la composition de prélèvement (ex. à une teneur comprise entre 0,02% et 1,5%, ou maximum 1%, maximum 0,5% maximum 0,1%) consiste(nt) (essentiellement) en un ou plusieurs tensioactif(s) anioniques.- advantageously, at least one sequestering agent (di- or multi-valent cations), preferably in a weight content of at least 0.2%, preferably at least 0.3%, or even at least 0.4% ; - at least two enzymes (in a concentration capable of degrading any bacterial biofilms or dirt and in a concentration that does not interfere with downstream microbiological tests), said at least two enzymes being chosen from the group consisting of a (serine) protease, a polysaccharidase, a laccase, a lipase, a cellulose and a mannanase. - Preferably, the surfactant(s) present in the sampling composition (e.g. at a content between 0.02% and 1.5%, or maximum 1%, maximum 0.5% maximum 0.1% ) consist(s) (essentially) of one or more anionic surfactant(s).
Cette composition présente de préférence (i) un pH compris entre 5 et 11, de préférence entre 6 et 10, de manière encore plus préférée, entre 7 et 9, ou entre 7,5 et 8 et/ou (ii) une viscosité dynamique (20°C) comprise entre 1, de préférence 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50 mPa.s et 150, de préférence 100, 90, 80, voire 70 mPass.This composition preferably has (i) a pH of between 5 and 11, preferably between 6 and 10, even more preferably, between 7 and 9, or between 7.5 and 8 and/or (ii) a dynamic viscosity (20°C) between 1, preferably 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50 mPass and 150, preferably 100, 90, 80, even 70 mPass.
Dans le contexte de la présente invention, le mot « surface » est entendu de manière large et signifie de préférence une surface d'objets ou de locaux de particuliers, de l'industrie, voire de l'espace public (y compris les transports en commun ou les sanitaires publics) potentiellement contaminée par des microorganismes, y compris des bactéries ou microorganismes pathogènes. Par exemple de nombreuses surfaces de l'industrie agro-alimentaire risquent d'être contaminées par des microorganismes potentiellement délétères (toxiques ou altérants), ce qui est intolérable et force, le cas échéant, à supprimer les lots infectés.In the context of the present invention, the word "surface" is understood broadly and preferably means a surface of objects or premises of individuals, industry, or even public space (including public transport). common or public sanitary facilities) potentially contaminated by microorganisms, including pathogenic bacteria or microorganisms. For example, many surfaces in the food industry risk being contaminated by potentially harmful microorganisms (toxic or harmful), which is intolerable and forces, where necessary, the removal of infected batches.
Parmi ces surfaces, l'on peut retrouver des tables, des ustensiles, des poignées. Les pharmacies, les industries pharmaceutiques, les hôpitaux, les cabinets médicaux ont également de nombreuses surfaces potentiellement contaminées par des microorganismes potentiellement nocifs, qu'il convient d'identifier avec rapidité et précision, ce que permet la présente invention.Among these surfaces, we can find tables, utensils, handles. Pharmacies, pharmaceutical industries, hospitals, medical offices also have numerous surfaces potentially contaminated by potentially harmful microorganisms, which must be identified quickly and precisely, which the present invention allows.
Parmi les microorganismes dont l'identification rapide et/ou précise représente un intérêt, l'on retrouve, pour l'industrie alimentaire, les microorganismes pathogènes (par exemple, Escherichia Coli, Salmonella sp. Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus,Among the microorganisms whose rapid and/or precise identification is of interest, we find, for the food industry, pathogenic microorganisms (for example, Escherichia Coli, Salmonella sp. Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus,
Pseudomonas aeruginosa, Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens,Pseudomonas aeruginosa, Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens,
Aspergillus flavus), des microorganismes altérants (par exemple, Brochotrix thermosphacta, Lactaobcillus rahmnosus, Lactococcus piscium,Aspergillus flavus), spoilage microorganisms (e.g. Brochotrix thermosphacta, Lactaobcillus rahmnosus, Lactococcus piscium,
Leuconostoc carnosum/gelidum, Paenibacillus sp, Zygosaccharomyces baili/rouxi, Candida sp), ou les ferments (Lactobacillus cosei,Leuconostoc carnosum/gelidum, Paenibacillus sp, Zygosaccharomyces baili/rouxi, Candida sp), or ferments (Lactobacillus cosei,
Lactococcus lactis, Lactobacillus sakei, Streptococcus thermophilus,Lactococcus lactis, Lactobacillus sakei, Streptococcus thermophilus,
Pédiococcus acidilactici, Staphylococcus xylosus, Saccharomyces cerevisiae). Plus généralement, les microorganismes potentiellement présents sur des surfaces (non alimentaires) et intéressants à identifier de manière rapide et/ou précise se retrouvent par exemple parmiPédiococcus acidilactici, Staphylococcus xylosus, Saccharomyces cerevisiae). More generally, microorganisms potentially present on (non-food) surfaces and interesting to identify quickly and/or precisely are found, for example, among
Escherichia coli, Salmonella sp., Pseudomonns sp (ex. P. aeruginosa),Escherichia coli, Salmonella sp., Pseudomonns sp (e.g. P. aeruginosa),
Staphylococcus sp. (ex. S. aureus), Candida albicans, Alicyclobacillus sp.…Staphylococcus sp. (e.g. S. aureus), Candida albicans, Alicyclobacillus sp.…
Stenotrophomonas sp. Acinetobacter sp., Klebsiella sp., Serratia Sp.Stenotrophomonas sp. Acinetobacter sp., Klebsiella sp., Serratia sp.
Bacillus sp., Ralstonia picketi et Burkholderia Cepacia.Bacillus sp., Ralstonia picketi and Burkholderia Cepacia.
Contrairement aux solutions de nettoyage ou de prélèvement classiques, les détergents de la présente invention sont avantageusement choisis pour ne pas affecter la viabilité des bactéries à prélever: tant leur teneur que leur structure chimique sont importants.Unlike conventional cleaning or sampling solutions, the detergents of the present invention are advantageously chosen so as not to affect the viability of the bacteria to be sampled: both their content and their chemical structure are important.
Ainsi, leur concentration est inférieure à 1,5% (poids de l'ensemble des détergents :poids de l'ensemble de la composition). Cependant, une teneur minimale, par exemple au moins 0,01 ou au moins 0,02 voire 0,03% est nécessaire.Thus, their concentration is less than 1.5% (weight of all detergents: weight of the entire composition). However, a minimum content, for example at least 0.01 or at least 0.02 or even 0.03%, is necessary.
Parmi les détergents préférés, se retrouvent le laureth sulfate (ou d'autres détergents anioniques « doux», idéalement une chaine hydro corbonée de 12 à 14 atomes de carbone, un segment de poly(oxyéthane-1,2-diyl) et une tête anionique, par exemple un sulfate de sodium).Among the preferred detergents are laureth sulfate (or other “mild” anionic detergents), ideally a hydrocarbon chain of 12 to 14 carbon atoms, a segment of poly(oxyethane-1,2-diyl) and a head anionic, for example sodium sulfate).
L'homme de l'art connait d'autres détergents anioniques qui soient «doux», voire est en mesure de tester d'autres détergents anioniques qui sont considérés comme « doux », par exemple au moyen d'un test in vitro sur culture de microorganismes (cfr. ci-dessous).Those skilled in the art know other anionic detergents which are “mild”, or even are able to test other anionic detergents which are considered “mild”, for example by means of an in vitro culture test. of microorganisms (see below).
De préférence, l'indice HLB de l'ensemble des émulsifiants dePreferably, the HLB index of all the emulsifiers of
Ia composition est compris entre 10 et 16.The composition is between 10 and 16.
Dans le contexte de la présente invention, la terminologie indice HLB (pour « Hydrophilic-lipophilic balance ») porte sur le caractère hydrophile ou lipophile des agents tensioactifs ajoutés.In the context of the present invention, the terminology HLB index (for “Hydrophilic-lipophilic balance”) relates to the hydrophilic or lipophilic nature of the added surfactants.
Avantageusement, la composition a été stérilsée par des moyens physiques, par exemple par irradiation, tel que aux rayons gamma.Advantageously, the composition has been sterilized by physical means, for example by irradiation, such as gamma rays.
De préférence, cette composition ne comporte pas d'agent conservateur. Alternativement, un éventuel agent conservateur qui serait malgré tout présent doit être le plus dilué possible, ou neutralisé rapidement (avant application de la composition sur une surface ou juste après), de manière à ne pas interférer avec le métabolisme des microorganismes prélevés. Ainsi, les inventeurs ont remarqué que des compositions, où les agents conservateurs habituels, en ce compris le phénoxyéthanol, étaient présent à moins de 50 ppm, étaient acceptables. Les compositions préférées ont, avantageusement, une concentration en conservateurs moindre, par exemple moins de 20 ppm, moins de 10 ppm, moins de 5 ppm (partie pour million : poids de la somme des conservateurs (ex. le phénoxyéthanol) : poids total de la composition), voire une concentration qui est en-dessous de la limite de détection et/ou de 0,1 ppm.Preferably, this composition does not contain a preservative agent. Alternatively, any preservative agent which may nevertheless be present must be as diluted as possible, or neutralized quickly (before application of the composition to a surface or just after), so as not to interfere with the metabolism of the microorganisms sampled. Thus, the inventors noticed that compositions, where the usual preservative agents, including phenoxyethanol, were present at less than 50 ppm, were acceptable. The preferred compositions advantageously have a lower concentration of preservatives, for example less than 20 ppm, less than 10 ppm, less than 5 ppm (part per million: weight of the sum of preservatives (e.g. phenoxyethanol): total weight of composition), or even a concentration which is below the detection limit and/or 0.1 ppm.
Ainsi, le choix des constituants (ex. les enzymes) formant Ia composition est basé en partie sur leur teneur en agents conservateurs, Ia plus faible possible et/ou des agents conservateurs non-interférant. Ainsi, une teneur résiduelle faible en 2-phénoxyéthanol est acceptable, même si elle gagne à être maintenue aussi basse que possible.Thus, the choice of constituents (e.g. enzymes) forming the composition is based in part on their content of preservative agents, the lowest possible and/or non-interfering preservative agents. Thus, a low residual content of 2-phenoxyethanol is acceptable, even if it benefits from being kept as low as possible.
Cette composition d'échantillonnage est de préférence pour une application sur une surface, telle qu'une surface utilisée dans les industries alimentaires. La composition peut avantageusement être appliquée à d'autres surfaces industrielles comme par exemple l'industrie pharmaceutique, le milieu des soins de santé voire même la pétrochimie.This sampling composition is preferably for application to a surface, such as a surface used in food industries. The composition can advantageously be applied to other industrial surfaces such as the pharmaceutical industry, the health care sector or even the petrochemical industry.
Les caractéristiques de la composition selon la présente invention présentent l'avantage de fournir une composition de prélèvement de microorganismes, qu'ils soient sous forme planctoniques ou bien sous forme de biofilms complexes et variés. Cette composition permet un échantillonnage précis des microorganismes.The characteristics of the composition according to the present invention have the advantage of providing a composition for sampling microorganisms, whether in planktonic form or in the form of complex and varied biofilms. This composition allows precise sampling of microorganisms.
La composition selon la présente invention, en comprenant au moins deux enzymes choisies dans le groupe comprenant une protéase, une polysaccharidase, une laccase, une lipase, une cellulase et une mannanase, permet avantageusement de dégrader et de déstructurer efficacement la matrice extracellulaire des biofilms et notamment d'une population variée et complexe de biofilms ayant des matrices extracellulaires différentes permettant ainsi de libérer les bactéries afin de les prélever. Toutefois, les inventeurs ont remarqué que l'utilisation d'enzymes était particulièrement délicate lorsque les microorganismes à prélever sont sensibles et en faible quantité.The composition according to the present invention, by comprising at least two enzymes chosen from the group comprising a protease, a polysaccharidase, a laccase, a lipase, a cellulase and a mannanase, advantageously makes it possible to effectively degrade and destructure the extracellular matrix of biofilms and in particular of a varied and complex population of biofilms having different extracellular matrices thus making it possible to release the bacteria in order to sample them. However, the inventors noticed that the use of enzymes was particularly delicate when the microorganisms to be sampled are sensitive and in small quantities.
Ainsi la viabilité de certaines bactéries, en particulier Gram positif, est affectée par de nombreux composés : les tests en aval qui impliquent la culture ou le métabolisme d'une telle bactérie donneraient des résultats faussement négatifs, ce qui est inacceptable (un «faux positif» est moins grave qu'un « faux négatif », ce dernier pouvant être mortel). En effet, Listeria est un contaminant redouté, et les inventeurs ont remarqué que de nombreux composants utilisés empêchaient sa détection en aval, ce qui est d'autant plus pernicieux que ceci s'accompagne d'une bonne récupération d'autres microorganismes, ce qui laisse penser que le procédé aurait bien fonctionné. Au-delà deThus the viability of certain bacteria, particularly Gram positive, is affected by many compounds: downstream tests that involve the culture or metabolism of such bacteria would give false negative results, which is unacceptable (a "false positive » is less serious than a “false negative”, the latter of which can be fatal). Indeed, Listeria is a feared contaminant, and the inventors noticed that many components used prevented its downstream detection, which is all the more pernicious as this is accompanied by good recovery of other microorganisms, which suggests that the process would have worked well. Beyond
Listeria, les inventeurs ont remarqué que d'autres bactéries Gram positif étaient très sensibles aux différents composants des solutions de prélèvement habituellement utilisées.Listeria, the inventors noticed that other Gram-positive bacteria were very sensitive to the different components of the sampling solutions usually used.
De préférence, la composition comprend au moins une protéase, telle qu'une sérine protéase (ex. une subtilisine), l'au moins autre enzyme étant choisie parmi une polysaccharidase, une laccase, une lipase, une cellulose et une mannanase.Preferably, the composition comprises at least one protease, such as a serine protease (eg a subtilisin), the at least other enzyme being chosen from a polysaccharidase, a laccase, a lipase, a cellulose and a mannanase.
L'utilisation d’une protéase augmente fortement la capacité de prélèvement de la composition mais, comme écrit ci-dessus, les inventeurs ont remarqué que cette enzyme interfère avec les tests en aval et même, dans certains cas, avec les autres composants de la composition de prélèvement elle-même.The use of a protease greatly increases the collection capacity of the composition but, as written above, the inventors have noticed that this enzyme interferes with downstream tests and even, in certain cases, with the other components of the sample composition itself.
Certes, une activité protéase peut facilement être inhibée, au moins dans des conditions de laboratoire. Cependant, les inventeurs ontremarqué que, en pratique (sur site, hors laboratoire), les inhibiteurs de protéases disponibles étaient soit d'un usage compliqué, soit inefficaces, soit interféraient eux-mêmes avec les tests microbiologiques en aval. Ainsi, après de nombreux tests infructueux, les inventeurs privilégient l'incorporation d'une activité protéase à faible intensité. Dans le cas de l'Alcalase (ex. Alcalase 2,5 DX), il s'agit de préférence d'environ 0,5 à 5Certainly, protease activity can easily be inhibited, at least under laboratory conditions. However, the inventors noted that, in practice (on site, outside the laboratory), the available protease inhibitors were either complicated to use, ineffective, or themselves interfered with downstream microbiological tests. Thus, after numerous unsuccessful tests, the inventors favor the incorporation of a low intensity protease activity. In the case of Alcalase (e.g. Alcalase 2.5 DX), this is preferably around 0.5 to 5
Unité Anson par kg de la composition (0,2 g à 2g de l'alcalase 2,5 DX/Kg de composition), par exemple environ 1 Unité Anson par kilo de la composition. D'autres protéases, y compris d'autres lots commerciaux de l'alcalase peuvent être utilisées, par exemple des sérine protéases.Anson unit per kg of the composition (0.2 g to 2g of alcalase 2.5 DX/Kg of composition), for example approximately 1 Anson Unit per kilo of the composition. Other proteases, including other commercial batches of alcalase may be used, for example serine proteases.
L'activité à incorporer, soit correspond à celle mentionnée ci-dessus pour l'alcalase (2,5 DX), soit est déterminée à la lumière des exemples de la présente invention : la concentration la plus élevée qui n'interfère pas avec les tests microbiologiques en aval.The activity to be incorporated either corresponds to that mentioned above for alcalase (2.5 DX), or is determined in the light of the examples of the present invention: the highest concentration which does not interfere with the downstream microbiological tests.
L'homme de l'art connait très bien la manière de tester une activité protéolytique, par exemple en utilisant un substrat dont la coloration (ou les propriétés de fluorescence) change après clivage protéolytique. Ainsi, le fait de déterminer une activité équivalente à celle d'une certaine quantité d'alcalose 25 DX est à sa portée.Those skilled in the art are very familiar with how to test for proteolytic activity, for example by using a substrate whose coloring (or fluorescence properties) changes after proteolytic cleavage. Thus, determining an activity equivalent to that of a certain quantity of alkalose 25 DX is within its reach.
Alternativement, ou en addition, de préférence, le substrat utilisé est le N- succinyl-alanyl-alanyl-propyl-phénylalanyl-p-nitroanilide (CAS 70967-97- 4), qui est dissous dans un tampon phosphate à pH 7, 25 mM à une concentration de 1 mM. 1 ml de ce substrat porté à 20°C est mis en présence de 100 ul de la solution à tester (également à 20°C), par exemple à pH 7, ou à un pH optimal pour l'activité enzymatique et l'absorbance est mesurée en fonction du temps. L'activité enzymatique est alors facilement déterminée en aval, par exemple par la loi deAlternatively, or in addition, preferably, the substrate used is N-succinyl-alanyl-alanyl-propyl-phenylalanyl-p-nitroanilide (CAS 70967-97-4), which is dissolved in a phosphate buffer at pH 7.25 mM at a concentration of 1 mM. 1 ml of this substrate brought to 20°C is placed in the presence of 100 μl of the solution to be tested (also at 20°C), for example at pH 7, or at an optimal pH for enzymatic activity and absorbance is measured as a function of time. The enzymatic activity is then easily determined downstream, for example by the law of
Lambert-Beer. En d'autres termes, à la lumière de ce qui précède, le fait de déterminer une activité équivalente, représente une activité de routine. Par exemple, une activité équivalente à 0,2; 0,3:0,4:0,5:0,6 ; 0, 7: 08: 0,9; 1: 15 ou 2 g/Kg de l'alcalase 25 DX signifie avantageusement, dans le contexte de la présente invention, que la protéase considérée (ex. une sérine protéase, voire même une autre subtilisine) a la même activité dans les conditions décrites ci-dessus (substrat CAS 70967-97-4).Lambert-Beer. In other words, in light of the above, determining an equivalent activity represents a routine activity. For example, activity equivalent to 0.2; 0.3:0.4:0.5:0.6; 0.7:08:0.9; 1: 15 or 2 g/Kg of alcalase 25 DX advantageously means, in the context of the present invention, that the protease considered (e.g. a serine protease, or even another subtilisin) has the same activity under the conditions described above (substrate CAS 70967-97-4).
A la lumière de la présente invention, un test de routine peut être développé, soit comme une alternative, soit en association, en mélangeant plusieurs dilutions d'une culture de Listeria avec la faible quantité d'alcalase ci-dessus, ou avec une solution saline ou avec une autre protéase considérée (à plusieurs concentrations), suivie de la mesure par un test spécifique de détection de Listeria : Ia composition saline et l'alcalase (appliquée à faible dose) représentant deux contrôles positifs.In light of the present invention, a routine test can be developed, either as an alternative or in combination, by mixing several dilutions of a Listeria culture with the small amount of alcalase above, or with a solution saline or with another protease considered (at several concentrations), followed by measurement by a specific Listeria detection test: the saline composition and alcalase (applied at low dose) representing two positive controls.
Dans le cas, non préféré, OÙ un inhibiteur de protéase est ajouté après le prélèvement, les concentrations en protéases peuvent être revues à la hausse. Cependant, la nature et la concentration de l'inhibiteur de protéase doit, de manière particulièrement préférée, être déterminée de manière à ne pas interférer avec les tests microbiologiques enaval.In the non-preferred case where a protease inhibitor is added after sampling, the protease concentrations may be increased. However, the nature and concentration of the protease inhibitor must, particularly preferably, be determined so as not to interfere with downstream microbiological tests.
En outre, l'agent séquestrant ainsi que le pH compris entre 5 et 11 (entre 7 et 8,5) de la composition selon la présente invention permet avantageusement de former des complexes avec des ions minéraux qui vont être fixés sous une forme empêchant leur précipitation par les reactions habituelles et ainsi de stabiliser dans le temps la composition selon la présente invention, notamment au vu des enzymes présentes dans de telles proportions.In addition, the sequestering agent as well as the pH between 5 and 11 (between 7 and 8.5) of the composition according to the present invention advantageously makes it possible to form complexes with mineral ions which will be fixed in a form preventing their precipitation by the usual reactions and thus to stabilize over time the composition according to the present invention, particularly in view of the enzymes present in such proportions.
Dans le contexte de la présente invention, l'agent séquestrant est de préférence une substance chimique ayant la capacité à former des complexes avec des ions minéraux qu'il fixe sous une forme empêchant leur précipitation par les réactions habituelles. A titre d'exemple, l'agent séquestrant peut être le glucono-delta-lactone, le gluconate de sodium, le gluconate de potassium, le gluconate de calcium, l'acide citrique, l'acide phosphorique, l'acide tartrique, l'acétate de sodium, le sorbitol, un composé comportant un atome de phosphore, voire la corboxymethyl inuline (le sel sodique). Les agents séquestrants dits « doux » sont préférés : les inventeurs ont remarqué que ces séquestrants « doux» permettaient une meilleure activité enzymatique au niveau du prélèvement et/ou pour les tests microbiologiques en aval impliquant des enzymes (ex. les inventeurs ont noté des interférences avec les tests PCR en aval lorsque trop d'agent séquestrants et/ou des agents séquestrants trop puissants étaient présents). Alternativement, l'agent séquestrant peut être un oxyde de phosphore tel qu'un phosphonate, un phosphinate ou un phosphate ou leur mélange, ou un sel de celui-ci, une amine ou un oxyde d'amine portant au moins, dans sa structure, un groupement fonctionnel phosphine, oxyde de phosphine, phophinite, phosphonite, phosphite, phosphonate, phosphinate ou phosphate, seul ou en combinaison, ou un sel de ceux-ci. La carboxyméthyl inuline est avantageuse et les inventeurs ont montré que ce composé n'interfère pas avec les tests microbiologiques en aval. De même des mélanges de carboxyméthyl inuline avec un glycolate (ex. en ratio massique compris entre 0,5:1 et 2:1; carboxyméthyl inuline : glycolate de sodium) sont préférés. Les inventeurs ont également obtenu des bons résultats avec les phosphonates.In the context of the present invention, the sequestering agent is preferably a chemical substance having the capacity to form complexes with mineral ions which it fixes in a form preventing their precipitation by the usual reactions. By way of example, the sequestering agent may be glucono-delta-lactone, sodium gluconate, potassium gluconate, calcium gluconate, citric acid, phosphoric acid, tartaric acid, sodium acetate, sorbitol, a compound containing a phosphorus atom, or even corboxymethyl inulin (the sodium salt). So-called “mild” sequestering agents are preferred: the inventors have noticed that these “mild” sequestrants allow better enzymatic activity at the level of the sample and/or for downstream microbiological tests involving enzymes (e.g. the inventors have noted interferences with downstream PCR tests when too much sequestering agent and/or too strong sequestering agents were present). Alternatively, the sequestering agent may be a phosphorus oxide such as a phosphonate, a phosphinate or a phosphate or their mixture, or a salt thereof, an amine or an amine oxide carrying at least, in its structure , a phosphine, phosphine oxide, phophinite, phosphonite, phosphite, phosphonate, phosphinate or phosphate functional group, alone or in combination, or a salt thereof. Carboxymethyl inulin is advantageous and the inventors have shown that this compound does not interfere with downstream microbiological testing. Likewise, mixtures of carboxymethyl inulin with a glycolate (e.g. in a mass ratio of between 0.5:1 and 2:1; carboxymethyl inulin: sodium glycolate) are preferred. The inventors have also obtained good results with phosphonates.
Dans le cadre de la présente invention, il a été déterminé que la composition suivant l'invention en comprenant au moins Un tensioactif anionique (comprenant un ou plusieurs tensioactif, ledit ou lesdits tensioactifs étant (essentiellement) un ou des tensioactifs anioniques) qui représente au moins 0,01% en poids par rapport au poids de cette composition (de préférence au moins 0,02%, et moins de 1,5%, de préférence moins de 1%, voire moins de 0,5%, voire même de moins de 0,1%), permet de manière particulièrement avantageuse de décrocher et de prélever une proportion représentative et complète d'une population de microorganismes présents sur une surface, qu'ils soient planctoniques ou bien sous la forme de biofilms puisque les enzymes de la composition selon l'invention permettent leur libération. Il s'agit donc d'un équilibre délicat entre la nature des détergents, leur faible concentration, la nature des enzymes et une faible activité (protéase).In the context of the present invention, it has been determined that the composition according to the invention comprising at least one anionic surfactant (comprising one or more surfactants, said surfactant(s) being (essentially) one or more anionic surfactants) which represents at least 0.01% by weight relative to the weight of this composition (preferably at least 0.02%, and less than 1.5%, preferably less than 1%, or even less than 0.5%, or even less than 0.1%), makes it possible in a particularly advantageous manner to remove and sample a representative and complete proportion of a population of microorganisms present on a surface, whether they are planktonic or in the form of biofilms since the enzymes of the composition according to the invention allows their release. It is therefore a delicate balance between the nature of detergents, their low concentration, the nature of enzymes and low activity (protease).
Avantageusement, ce tensioactif anionique consiste en un tensioactif moussant ou un tensioactif moussant est incorporé au(x) tensioactif(s) anionique(s), cela présentant l'avantage d'une part de décrocher et prélever les microorganismes et d'autre part d'emprisonner les microorganismes prélevés dans la composition selon l'invention afin de réaliser un prélèvement efficace et représentatif de la population de contaminants d'une surface.Advantageously, this anionic surfactant consists of a foaming surfactant or a foaming surfactant is incorporated into the anionic surfactant(s), this having the advantage on the one hand of removing and removing the microorganisms and on the other hand of trap the microorganisms taken in the composition according to the invention in order to carry out an efficient and representative sampling of the population of contaminants on a surface.
En outre, la composition selon la présente invention en comprenant au moins un tensioactif anionique et au moins un polyol ou le propylène glycol en tant qu'agent stabilisant et/ou agent viscosant à au moins 15% en poids, est stable dans le temps.In addition, the composition according to the present invention, comprising at least one anionic surfactant and at least one polyol or propylene glycol as stabilizing agent and/or viscosity agent at least 15% by weight, is stable over time.
Par ailleurs, il a été déterminé que la composition selon la présente invention, en n'étant pas trop visqueuse permet de réduire significativement le temps de contact nécessaire avec les microorganismes et/ou les biofilms présents sur une surface de sorte à les déstructurer suffisamment pour en libérer les bactéries et ainsi pouvoir les échantillonner et/ou identifier ces derniers en vue du traitement ultérieur spécifique et approprié des surfaces. En d'autres termes, la composition selon la présente invention permet donc d'entourer totalement les microorganismes ou les biofilms et de déstructurer ces derniers plus rapidement et plus efficacement, apportant ainsi une composition de prélèvement adéquate et optimale, et permettant également de piéger les microorganismes et contaminants prélevés au départ d'une surface sans que la problématique de l'évaporation rapide des compositions liquides de prélèvement ne soit rencontrée.Furthermore, it has been determined that the composition according to the present invention, by not being too viscous, makes it possible to significantly reduce the contact time necessary with the microorganisms and/or biofilms present on a surface so as to destructure them sufficiently to release the bacteria and thus be able to sample them and/or identify them for subsequent specific and appropriate treatment of the surfaces. In other words, the composition according to the present invention therefore makes it possible to completely surround the microorganisms or biofilms and to destructure the latter more quickly and more efficiently, thus providing an adequate and optimal sampling composition, and also making it possible to trap the microorganisms and contaminants taken from a surface without the problem of rapid evaporation of the liquid sampling compositions being encountered.
en résulte que la composition selon la présente invention, au contraire des compositions actuelles, permet d'obtenir Un prélèvement réellement représentatif et suffisamment complet des contaminants présents sur une surface, pour différents types de surfaces et pour différents environnements. Cela est particulièrement avantageux car en ayant un prélèvement représentatif et complet des microorganismes, ceux-ci pourront par la suite être identifiés et un traitement d'élimination ciblé et efficace, en utilisant les composés adéquats et non plus un cocktail de composés bien souvent inefficace, pourra être appliqué sur la surface. Ceci représente bien entendu un avantage économique et de temps considérable.As a result, the composition according to the present invention, unlike current compositions, makes it possible to obtain a truly representative and sufficiently complete sampling of the contaminants present on a surface, for different types of surfaces and for different environments. This is particularly advantageous because by having a representative and complete sample of the microorganisms, they can subsequently be identified and a targeted and effective elimination treatment, using the appropriate compounds and no longer a cocktail of compounds which is often ineffective, can be applied to the surface. This of course represents a considerable economic and time advantage.
L'intérêt de la composition selon la présente invention est donc double en ce sens qu'elle permet d'une part de prélever et d'échantillonner l'ensemble des contaminants d'une surface qu'ils soient planctoniques ou sous forme de biofilms en vue de leur analyse et qu'elle permet ensuite de déterminer précisément quel traitement d'élimination de ces contaminants sera à appliquer.The interest of the composition according to the present invention is therefore twofold in the sense that it allows on the one hand to take and sample all the contaminants from a surface whether they are planktonic or in the form of biofilms in view of their analysis and that it then makes it possible to determine precisely which treatment to eliminate these contaminants will be applied.
De préférence, comme décrit ci-dessus, l'au moins un tensioactif anionique de la composition selon l'invention est choisi dans le groupe comprenant le laureth sulfate de sodium. Cette molécule a le numéro CAS 9004-82-4. Il s'agit, de préférence du laureth-2 sulfate de sodium et/ou du laureth-3 sulfate de sodiumPreferably, as described above, the at least one anionic surfactant of the composition according to the invention is chosen from the group comprising sodium laureth sulfate. This molecule has the CAS number 9004-82-4. It is preferably sodium laureth-2 sulfate and/or sodium laureth-3 sulfate
De préférence, l'au moins un polyol ou alcool gras en tant qu'agent stabilisant et/ou agent viscosant est le glycérol. Les inventeurs ont remarqué que le glycérol (ou d'autres polyols), lorsqu'il est présent en grande quantité (par exemple plus de 15% en poids), augmente la stabilité de la composition dans le temps.Preferably, the at least one polyol or fatty alcohol as stabilizing agent and/or viscosity agent is glycerol. The inventors have noticed that glycerol (or other polyols), when present in large quantities (for example more than 15% by weight), increases the stability of the composition over time.
De préférence, la composition selon l'invention comprend en outre un agent régulateur de pH.Preferably, the composition according to the invention further comprises a pH regulating agent.
De préférence, la composition selon l'invention présente un pH compris entre 6 et 10, de préférence entre 7 et 9, préférentiellement entre 8 et 9, de manière particulièrement avantageuse entre 8,2 et 8,6.Preferably, the composition according to the invention has a pH of between 6 and 10, preferably between 7 and 9, preferably between 8 and 9, particularly advantageously between 8.2 and 8.6.
De préférence, la composition selon l'invention est sous forme liquide, de préférence sous forme liquide pulvérisable.Preferably, the composition according to the invention is in liquid form, preferably in sprayable liquid form.
De préférence, la composition selon l'invention comprend en outre au moins une enzyme additionnelle choisie dans le groupe constitué des oxydo-réductases, des lyases, des transférases, des lipases, des estérases, des glucosaminidases.Preferably, the composition according to the invention further comprises at least one additional enzyme chosen from the group consisting of oxidoreductases, lyases, transferases, lipases, esterases and glucosaminidases.
Comme expliqué ci-avant, l'intérêt de la composition selon la présente invention est double en ce sens qu'elle permet d'une part de prélever et d'échantillonner l'ensemble des contaminants d'une surface qu’ils soient planctoniques ou sous forme de biofilms et qu'elle permet ensuite de déterminer précisément la nature de ces contaminants, ce qui permet de savoir quel traitement d'élimination de ces contaminants sera à appliquer.As explained above, the interest of the composition according to the present invention is twofold in the sense that it allows on the one hand to take and sample all the contaminants from a surface whether they are planktonic or in the form of biofilms and that it then makes it possible to precisely determine the nature of these contaminants, which makes it possible to know what treatment to eliminate these contaminants will be applied.
Par conséquent, il est important que la composition selon l'invention, qui contient les contaminants, microorganismes et biofilms suite au prélèvement, puisse permettre une analyse fiable, correcte et représentative de la population prélevée sans que ladite composition après prélèvement n'interfère avec les analyses ultérieures.Consequently, it is important that the composition according to the invention, which contains the contaminants, microorganisms and biofilms following sampling, can allow a reliable, correct and representative analysis of the population sampled without said composition after sampling interfering with the subsequent analyses.
L'invention se rapporte donc également à un kit d'échantilonnage, de décrochage, de prélèvement et de conservation, de microorganismes (à l'état vivant ou revivifiable) en vue d'analyses de laboratoire ultérieures.The invention therefore also relates to a kit for sampling, removing, collecting and preserving microorganisms (in a living or revivable state) for subsequent laboratory analyses.
Ce kit comprend la composition décrite ci-dessus, et un moyen d'application contrôlée de celle-ci. Par exemple Un pulvérisateur calibré de manière à projeter Ia même quantité de composition, avec la même dispersion et en gouttelettes de volume identiques.This kit includes the composition described above, and a means of controlled application thereof. For example A sprayer calibrated so as to project the same quantity of composition, with the same dispersion and in droplets of identical volume.
En d'autres termes, il est prévu par la présente invention un kit d'échantilonnage, de décrochage (d'une surface), de prélèvement et de conservation de microorganismes à l'état vivant ou revivifiable en vue d'analyses de laboratoire ultérieures comprenant : - Une composition d'échantilonnage (de décrochage et de prélèvement) de microorganismes selon la présente invention, - Qu moins un dispositif d'application contrôlée de cette composition d'échantilonnage (de décrochage et de prélèvement) sur lo surface ; - de préférence au moins un moyen de récolte stérile de ces microorganismes, - de préférence au moins un récipient stérile, par exemple un sachet stérile, comprenant une solution de conservation de microorganismes en vue d'analyses de laboratoire ultérieures.In other words, the present invention provides a kit for sampling, removing (from a surface), collecting and preserving microorganisms in a living or revivable state for subsequent laboratory analyzes comprising: - A sampling composition (detachment and sampling) of microorganisms according to the present invention, - Qu less a device for controlled application of this sampling composition (detachment and sampling) on the surface; - preferably at least one means of sterile harvesting of these microorganisms, - preferably at least one sterile container, for example a sterile bag, comprising a solution for preserving microorganisms for subsequent laboratory analyses.
De préférence, l'au moins un moyen de récolte stérile des microorganismes du kit selon Ia présente invention est un tissu, une lingette ou une éponge.Preferably, the at least one means of sterile harvesting of the microorganisms of the kit according to the present invention is a tissue, a wipe or a sponge.
La solution de conservation, dans le contexte de la présente invention, comprend, de préférence, du polyoxyéthylène sorbitane et/ou un dérivé de phosphoglycéride (ex. de la lécithine) ; cette composition a, de préférence, comme fonction de neutraliser une quelconque potentielle activité biocide qui serait présente dans la composition d’échantilonnage, par exemple causée par la présence de conservateurs qui seraient toujours présents ou d'agents désinfectants accidentellement présents.The preservation solution, in the context of the present invention, preferably comprises polyoxyethylene sorbitan and/or a phosphoglyceride derivative (e.g. lecithin); this composition preferably has the function of neutralizing any potential biocidal activity which would be present in the sampling composition, for example caused by the presence of preservatives which would always be present or disinfectant agents accidentally present.
De préférence, la composition de conservation comprend un tampon phosphate (ex. pH 7, 25 MM) qui peut avantageusement comprendre en outre des sels, tels que le chlorure de magnésium et/ou le chlorure de calcium.Preferably, the preservative composition comprises a phosphate buffer (e.g. pH 7.25 MM) which may advantageously also comprise salts, such as magnesium chloride and/or calcium chloride.
Cette solution de conservation peut avantageusement comprendre en outre un hydrolysat de protéine (ex. peptone) ou un composé riche en protéines, de manière à fournir des nutriments aux microorganismes prélevés et/ou à contrecarrer les effets délétères associés à une activité protéase résiduelle, si présente.This preservation solution may advantageously further comprise a protein hydrolyzate (e.g. peptone) or a protein-rich compound, so as to provide nutrients to the microorganisms sampled and/or to counteract the deleterious effects associated with residual protease activity, if present.
Cette solution de conservation comprend avantageusement des groupements thiols réducteurs, par exemples via des cystéines (sous forme réduite) et/ou du glutathion. Des thiols qui ne sont pas de cette nature sont également possibles, pour autant qu'ils restent compatibles avec le métabolisme des microorganismes. Lorsque le groupement thiol est la cystéine, il peut être présent via l'hydrolysat de protéines, par exemple un hydrolysat de protéines riche en cystéine et/ou où le potentiel réducteur a été assuré.This preservation solution advantageously comprises reducing thiol groups, for example via cysteines (in reduced form) and/or glutathione. Thiols which are not of this nature are also possible, as long as they remain compatible with the metabolism of microorganisms. When the thiol group is cysteine, it can be present via the protein hydrolyzate, for example a protein hydrolyzate rich in cysteine and/or where the reducing potential has been ensured.
De préférence le dérivé de polyoxyéthylène sorbitane de ce kit est le monooléate de polyoxyéthylène sorbitane et/ou le dérivé de phosphoglycéride est Ia phosphatidylcholine.Preferably the polyoxyethylene sorbitan derivative of this kit is polyoxyethylene sorbitan monooleate and/or the phosphoglyceride derivative is phosphatidylcholine.
Avantageusement, le dérivé de polyoxyéthylène sorbitane, lorsqu'il est présent, est présent à une teneur d'au moins 4 g/L, de préférence à une teneur d'au moins 4,3 g/L, préférentiellement à une teneur d'au moins 4,6 g/L, avantageusement à une teneur d'au moins 4,9 g/L. De même, le dérivé de phosphoglycéride , lorsqu'il est présent, est présent à une teneur comprise entre 0,5 et 3 g/L, de préférence à une teneur comprise entre 0,5 et 2,5 g/L, préférentiellement entre 0,5 et 2 g/L, avantageusement entre 0,5 et 1,5 g/LAdvantageously, the polyoxyethylene sorbitan derivative, when present, is present at a content of at least 4 g/L, preferably at a content of at least 4.3 g/L, preferably at a content of at least 4.6 g/L, advantageously at a content of at least 4.9 g/L. Likewise, the phosphoglyceride derivative, when present, is present at a content of between 0.5 and 3 g/L, preferably at a content of between 0.5 and 2.5 g/L, preferably between 0.5 and 2 g/L, advantageously between 0.5 and 1.5 g/L
De préférence, l'hydrolysat de protéines (peptone) est présent à une teneur d'au moins 10 g/L, de manière préférée au moins 11 g/L, de préférence au moins 12 g/L, préférentiellement au moins 13 g/L, avantageusement au moins 14 g/L de manière particulièrement avantageuse au moins 15 g/L.Preferably, the protein hydrolyzate (peptone) is present at a content of at least 10 g/L, preferably at least 11 g/L, preferably at least 12 g/L, preferably at least 13 g/L. L, advantageously at least 14 g/L, particularly advantageously at least 15 g/L.
L'invention se rapporte en outre à un procédé d'échantilonnage, de décrochage, de prélèvement et de conservation de microorganismes à l'état vivant ou revivifiable en vue d'analyses de laboratoire ultérieures comprenant les étapes suivantes : a) au moins une application contrôlée d'une composition d'échantilonnage, de décrochage et de prélèvement de microorganismes selon la présente invention, b) laisser agir cette composition d'échantilonnage (de décrochage) sur cette surface à prélever, c) déposer au moins un moyen de récolte de ces microorganismes sur cette surface à prélever, d) laisser imbiber ce moyen de récolte par cette composition d’échantilonnage (de décrochage), e) prélever stérilement ce moyen de récolte des microorganismes imbibé et le déposer dans au moins un récipient stérile, par exemple un sachet stérile comprenant une solution de conservation de microorganismes à l'état vivant ou revivifiable en vue d'analyses de laboratoire ultérieures.The invention further relates to a process for sampling, removing, collecting and preserving microorganisms in a living or revivable state for subsequent laboratory analyzes comprising the following steps: a) at least one application controlled use of a composition for sampling, removing and collecting microorganisms according to the present invention, b) allowing this sampling (detaching) composition to act on this surface to be sampled, c) depositing at least one means for collecting these microorganisms on this surface to be sampled, d) allow this harvesting means to be soaked by this sampling (detachment) composition, e) sterilely take this soaked microorganism harvesting means and place it in at least one sterile container, for example a sterile bag comprising a solution for preserving microorganisms in a living or revivable state for subsequent laboratory analyses.
Avantageusement, l'étape b} du procédé selon l'invention a lieu pendant une durée d'au moins 10 secondes, au moins 20 secondes, au moins 30 secondes, au moins 1 mn, de préférence d'au moins 2mn, préférentiellement d'au moins 3 mn, avantageusement d'au moins 4mn, de manière particulièrement avantageuse d'au moins 5 mn et, de préférence, de moins de 30 minutes, de préférence de moins de 15 ou 10 minutes.Advantageously, step b} of the method according to the invention takes place for a duration of at least 10 seconds, at least 20 seconds, at least 30 seconds, at least 1 minute, preferably at least 2 minutes, preferably d at least 3 minutes, advantageously at least 4 minutes, particularly advantageously at least 5 minutes and, preferably, less than 30 minutes, preferably less than 15 or 10 minutes.
De préférence, le procédé selon l'invention comprend en outre au moins une étape préliminaire de préchauffage de cette composition d'échantilonnage (de décrochage), de préférence à une température comprise entre 20 et 60 °C, préférentiellement entre 30 et 50 °C, avantageusement entre 40 et 50 °C.Preferably, the method according to the invention further comprises at least one preliminary step of preheating this sampling (detachment) composition, preferably at a temperature between 20 and 60 °C, preferably between 30 and 50 °C. , advantageously between 40 and 50 ° C.
De préférence, le procédé selon l'invention comprend en outre au moins une étape de stockage de ce récipient stérile contenant ce moyen de récolte imbibé, à une température inférieure à 15 °C, de préférence inférieure à 10°C, avantageusement inférieure à 5°C, telle que de 4 à 8°C. Alternativement, le stockage peut être réalisé à moins de O°C, pour autant que l'activité microbiologique puisse être restaurée ultérieurement.Preferably, the method according to the invention further comprises at least one step of storing this sterile container containing this soaked harvesting means, at a temperature lower than 15°C, preferably lower than 10°C, advantageously lower than 5 °C, such as 4 to 8°C. Alternatively, storage can be carried out at less than 0°C, provided that microbiological activity can be subsequently restored.
De préférence l'application contrôlée d'un volume de lo composition d'échantilonnage est une application d'une teneur comprise entre 0,5 et 2 gramme(s) de composition (par 100 cm’), de préférence d'une teneur comprise entre 0,7 et 18 gramme de composition par application, préférentiellement entre 0,9 et 1,6 gramme decomposition (par 100 cm’), avantageusement entre 1,1 et 1,4 gramme de composition (par 100 cm’).Preferably the controlled application of a volume of the sampling composition is an application of a content of between 0.5 and 2 gram(s) of composition (per 100 cm'), preferably of a content of between 0.7 and 18 grams of composition per application, preferably between 0.9 and 1.6 grams of decomposition (per 100 cm'), advantageously between 1.1 and 1.4 grams of composition (per 100 cm').
De préférence, le moyen de récolte stérile est Un tissu, une lingette, un swap, un racloir, un écouvillon ou une éponge.Preferably, the sterile collection means is a tissue, wipe, swap, scraper, swab or sponge.
Avantageusement, les analyses ultérieures en laboratoire de l'étape e) décrite ci-dessus comprend un ou plusieurs des tests suivants : un test impliquant une étape de culture des microorganismes ;Advantageously, the subsequent laboratory analyzes of step e) described above comprise one or more of the following tests: a test involving a step of culturing the microorganisms;
un test biochimique (par exemple l'ATP-métrie, la détection de NADH, la mesure de l'activité catalase) ; un test comprenant une étape de reconnaissance immunologique, et un test de biologie moléculaire (une étape de test impliquant des marqueurs et/ou des sondes et/ou des amorces génétiques et une combinaison de ces étapes, séquençage).a biochemical test (e.g. ATP-metry, detection of NADH, measurement of catalase activity); a test comprising an immunological recognition step, and a molecular biology test (a test step involving markers and/or probes and/or genetic primers and a combination of these steps, sequencing).
Comme ce sera décrit ci-dessous, ces tests sont faussés par les solutions de prélèvement de l'art antérieur, mais sont à présent possibles lorsque les solutions de prélèvement de la présente invention sont utilisées, même pour les microorganismes les plus délicats, tels queAs will be described below, these tests are confounded by the sampling solutions of the prior art, but are now possible when the sampling solutions of the present invention are used, even for the most delicate microorganisms, such as
Listeria sp., ou les microorganismes présents en faible quantité (CFU).Listeria sp., or microorganisms present in low quantities (CFU).
D'autres caractéristiques, détails et avantages de l'invention ressortiront de la description donnée ci-après, à titre non limitatif et en faisant référence aux exemples.Other characteristics, details and advantages of the invention will emerge from the description given below, without limitation and with reference to the examples.
Exemples.Examples.
Les premiers obstacles que les inventeurs ont dus surmonter portent sur le manque de représentativité des biofilms générés au laboratoire, par rapport à la situation sur site. Ceci complique en particulier les choix des activités enzymatiques (nature des enzymes, leurs abondances, présence de composés potentiellement délétères). Sur base de ces tests préliminaires, les inventeurs ont donc décidé que toutes les compositions qui seraient formulées au laboratoire devraient être testées en conditions réelles : de nombreuses formulations prometteuses àléchele du laboratoire sont inutilisables, en pratique, et les inventeurs n'ont pas trouvé de directives publiées, même à l'aide de leur expertise, qui aurait pu les aider à identifier les compositions fonctionnelles.The first obstacles that the inventors had to overcome relate to the lack of representativeness of the biofilms generated in the laboratory, compared to the situation on site. This particularly complicates the choice of enzymatic activities (nature of enzymes, their abundances, presence of potentially deleterious compounds). On the basis of these preliminary tests, the inventors therefore decided that all the compositions which would be formulated in the laboratory should be tested in real conditions: many promising formulations on a laboratory scale are unusable, in practice, and the inventors have not found a solution. published guidelines, even using their expertise, which could have helped them identify functional compositions.
Cependant, une fois qu'une formulation complexe a été identifiée, telles celles décrites ci-dessous, certains composés de cette formulation peuvent être remplacés par d'autres, ce qui est facilement testable au laboratoire (efficacité, absence de toxicité pour les microorganismes), puis sur site, ou directement sur site. Ainsi, dans une certaine mesure, une protéase est substituable par une autre, en particulier lorsque celles-ci sont des sérine-protéases (subtilisines). Cependant, lorsque des compositions enzymatiques commerciales sont utilisées, les inventeurs ont remarqué que, selon les fournisseurs, et même les marques, différents additifs risquent d'interférer avec les analyses de microbiologie, ainsi les variations de la composition de la présente invention sont possibles, grâce à l'enseignement de la présente invention, mais nécessitent de suivre les règles de prudence décrites dans la présente invention.However, once a complex formulation has been identified, such as those described below, certain compounds in this formulation can be replaced by others, which is easily testable in the laboratory (effectiveness, absence of toxicity for microorganisms). , then on site, or directly on site. Thus, to a certain extent, one protease is substitutable for another, in particular when these are serine proteases (subtilisins). However, when commercial enzymatic compositions are used, the inventors have noticed that, depending on the suppliers, and even the brands, different additives risk interfering with microbiology analyses, thus variations in the composition of the present invention are possible, thanks to the teaching of the present invention, but require following the rules of caution described in the present invention.
Example 1Example 1
Une société de transformation de viande située en Belgique a été sélectionnée pour cette étude. Toutes les installations ont été préalablement nettoyées et désinfectées avant de réaliser les prélèvements.A meat processing company located in Belgium was selected for this study. All facilities were previously cleaned and disinfected before taking samples.
Le protocole de décrochage est appliqué avec une limitation des actions mécaniques pouvant introduire une erreur de reproductibilité ; il comporte les étapes suivantes :The dropout protocol is applied with a limitation of mechanical actions that could introduce a reproducibility error; it includes the following steps:
Parcourir rapidement (screener) les zones à prélever avec la lampe UV et kit de détection BDK (Realco) ;Quickly scan (screen) the areas to be sampled with the UV lamp and BDK detection kit (Realco);
Préchauffer la solution de prélèvement à 45°C ;Preheat the sampling solution to 45°C;
Déposer deux gabarits sur les surfaces à prélever (afin de délimiter une surface de 10cm sur 10 cm): eau physiologue vs composition de prélèvement (14 sprays pour couvrir Ia zone ;1,2 g /spray) ;Place two templates on the surfaces to be sampled (in order to delimit an area of 10cm by 10cm): physiologist water vs sampling composition (14 sprays to cover the area; 1.2 g/spray);
Laisser agir 5 minutes Ia solution de prélèvement ;Leave the sampling solution to act for 5 minutes;
Déposer la lingette stérile sur les deux zones de prélèvement et laisser imbiber ;Place the sterile wipe on the two sampling areas and leave to soak;
Prélever stérilement à l'aide de pince et déposé dans un sachet stérile de transport ;Take sterilely using forceps and place in a sterile transport bag;
Stocker les échantillons dans des bacs frigos à 4°C ;Store the samples in refrigerated containers at 4°C;
Évaluer après les deux zones avec la lampe et le BDK.Afterwards evaluate the two zones with the lamp and the BDK.
Au total 6 zones de prélèvements ont été incluses dans cette étude : Zone 1 table ronde ; Zone 2 couvercle pour table poubelle ; Zone 3 bac inox; Zone 4 table scie; Zone 5 surface plastique ; Zone 6 découenneuse.A total of 6 sampling zones were included in this study: Zone 1 round table; Zone 2 lid for trash table; Zone 3 stainless steel tank; Zone 4 table saw; Zone 5 plastic surface; Zone 6 derinding.
Dans ces 6 zones, la composition de prélèvement comprenant des enzymes (dont une subtilisine, activité équivalente à 10In these 6 zones, the sample composition comprising enzymes (including a subtilisin, activity equivalent to 10
Unités Anson/kg) et des détergents (environ 10% en poids) permet une bien meilleure récupération des microorganismes, tant en microbiologie classique que par mesure ATP (2G) ou par culture. Réciproquement, il ne resta plus de microorganismes sur les surfaces où la solution de prélèvement a été placée, contrairement à la surface traitée par l'eau physiologique. La différence est surtout marquée au niveau de la microbiologie classique, par rapport à l'ATP 2G ou par test impliquent une étape de culture (peu de différence remarquées).Anson units/kg) and detergents (approximately 10% by weight) allows a much better recovery of microorganisms, both in classic microbiology and by ATP measurement (2G) or by culture. Conversely, there were no more microorganisms remaining on the surfaces where the sampling solution was placed, unlike the surface treated with physiological water. The difference is especially marked at the level of classic microbiology, compared to ATP 2G or by test involving a culture step (little difference noticed).
Les inventeurs ont reproduit l'exemple, pour y inclure des analyses métagénomiques, tout en variant le temps de contact de la composition de prélèvement sur la surface (30 secondes et 5 minutes). A nouveau, la composition enzymatique permet un bien meilleur prélèvement (ex. 100 fois mieux en microbiologie classique et 14 fois mieux en OPCR). Les bactéries retrouvées montrent une proportion accrue enThe inventors reproduced the example, to include metagenomic analyses, while varying the contact time of the sample composition on the surface (30 seconds and 5 minutes). Again, the enzymatic composition allows for much better sampling (e.g. 100 times better in classic microbiology and 14 times better in OPCR). The bacteria found show an increased proportion in
Pseudomonas.Pseudomonas.
Exemple 2 - addition d'une solution de conservation ;Example 2 - addition of a preservation solution;
SalmonellaSalmonella
Les inventeurs, suspectant des effets délétères associés à la composition de prélèvement, ont cherché à déterminer dans quelle mesure une solution adjuvante pouvait contrecarrer ceux-ci, dans le cadre de tests visant à déterminer la présence de Salmonella et/ou deThe inventors, suspecting deleterious effects associated with the sample composition, sought to determine to what extent an adjuvant solution could counteract these, in the context of tests aimed at determining the presence of Salmonella and/or
Listeria, soit par PCR ou OPCR, soit en utilisant des kits de détection commerciaux, par exemple ceux de BioMérieux. Pour ce faire, une solution dite ‘de conservation’ a été testée (en g/l) : Protéines (extrait de viande de boeuf ; 5) ; Peptone, 10 ; Polysorbate 80 (Tween 80 ; 5) ; Lecithin 0,7 ; NaCl, 5. En outre, divers inhibiteurs de sérine protéase ont été utilisés, dons le but de neutraliser l'activité de la subtilisine de la solution de prélèvement.Listeria, either by PCR or OPCR, or by using commercial detection kits, for example those from BioMérieux. To do this, a so-called 'preservation' solution was tested (in g/l): Proteins (beef extract; 5); Peptone, 10; Polysorbate 80 (Tween 80; 5); Lecithin 0.7; NaCl, 5. In addition, various serine protease inhibitors have been used, with the aim of neutralizing the subtilisin activity of the sample solution.
La première série de tests a été réalisée en laboratoire, où des quantités connues des bactéries (0,1 ml de 107 UFC/mI de Salmonella} ont été incubées soit dans une solution physiologique (100 ml), soit dans la composition de prélèvement de l'exemple 1 (6m! + 94 ml eau physiologique), soit dans la composition de l'exemple 1, avant que lo solution de conservation ne soit ajoutée (6 ml composition de prélèvement, 90 ml eau, 4 ml de la solution de conservation).The first series of tests was carried out in the laboratory, where known quantities of the bacteria (0.1 ml of 107 CFU/mI of Salmonella) were incubated either in a physiological solution (100 ml) or in the sample composition of example 1 (6m! + 94 ml physiological water), or in the composition of example 1, before the preservation solution is added (6 ml sampling composition, 90 ml water, 4 ml of the solution of conservation).
Lorsque 107 UFC/ml de Salmonella sont analysés (donc 104When 107 CFU/ml of Salmonella are analyzed (therefore 104
UFC/ml dans le mélange final), les différentes situations sont compatibles avec l'identification du microorganisme au moyen d'analyses PCR ou du test Vidas® Salmonella. Cependant, une mise en évidence par le testCFU/ml in the final mixture), the different situations are compatible with the identification of the microorganism by means of PCR analyzes or the Vidas® Salmonella test. However, evidence by the test
Vidas SLM® (bouillon culture, puis mesure spécifique par test antigénique et fluorescence ; ce test renseigne quant à l'absence ou à la présence de Salmonella) échoue lorsque la composition de prélèvement est présente, alors qu'il fonctionne lorsque les bactéries sont diluées dans l'eau physiologique ou lorsque la solution de conservation a été ajoutée.Vidas SLM® (broth culture, then specific measurement by antigen test and fluorescence; this test provides information on the absence or presence of Salmonella) fails when the sample composition is present, whereas it works when the bacteria are diluted in physiological water or when the preservative solution has been added.
En outre, dans cet exemple, les inventeurs considèrent que les concentrations en Salmonella sont élevées, ce qui ne représente pas nécessairement, voire rarement, la situation sur le terrain, où même 1 CFU doit être détecté.Furthermore, in this example, the inventors consider that the concentrations of Salmonella are high, which does not necessarily, or even rarely, represent the situation in the field, where even 1 CFU must be detected.
Exemple 3 - addition d'une solution de conservation ; ListeriaExample 3 - addition of a preservation solution; Listeria
Dans ce cas, les inventeurs ont remarqué que la solution enzymatique cause des problèmes au niveau de la détection (dénombrement et qPCR) ; ces problèmes sont réduits grâce à la solution de conservation, cependant le kit commercial Vidos® (LMX) ne fonctionne toujours pas.In this case, the inventors noticed that the enzymatic solution causes problems in detection (enumeration and qPCR); these problems are reduced with the preservation solution, however the commercial Vidos® (LMX) kit still does not work.
En outre, lorsque la quantité de Listera ensemencée est réduite, le microorganisme n'est généralement plus détecté suite au mélange (Vidas LMX®, jamais ; Vidas LMO2®, pas à chaque fois) avec la composition de prélèvement, alors que la détection reste robuste lorsque le mélange a été effectué uniquement dans l'eau physiologique. Dans ce cas (volontairement extrême), Ia composition de conservation n'a pas amélioré la détection. Par prudence, les tests ont été reproduits et trois souches de Listeria ont été testée avec toujours les mêmes résultats ; il s'agit des souches ATCC 19114, NCTC 11994 et ATCC 13932.In addition, when the quantity of Listera inoculated is reduced, the microorganism is generally no longer detected following mixing (Vidas LMX®, never; Vidas LMO2®, not every time) with the sampling composition, while detection remains robust when the mixing was carried out only in physiological water. In this case (deliberately extreme), the conservation composition did not improve detection. As a precaution, the tests were reproduced and three strains of Listeria were tested with always the same results; these are strains ATCC 19114, NCTC 11994 and ATCC 13932.
En comparant tous les résultats, les inventeurs concluent que la composition de prélèvement ralentit Ia croissance de microorganismes (Listeria), problème qui est partiellement résolu par Ia composition de conservation. Par contre, la composition de prélèvement interfère avec certains tests microbiologiques en aval. Vu que la nature et l'abondance des microorganismes sur une surface à tester est inconnue à l'avance, les inventeurs concluent donc que les compositions des exemples 1 à 3 sont utiles, mais gagneraient à être encore améliorées.By comparing all the results, the inventors conclude that the sample composition slows down the growth of microorganisms (Listeria), a problem which is partially resolved by the conservation composition. On the other hand, the sample composition interferes with certain downstream microbiological tests. Since the nature and abundance of microorganisms on a surface to be tested is unknown in advance, the inventors therefore conclude that the compositions of Examples 1 to 3 are useful, but would benefit from being further improved.
Exemple 4 - Identifications des composés délétèresExample 4 - Identifications of deleterious compounds
Les inventeurs ont recherché dans les différentes enzymes commerciales si certains composés interféraient avec les tests microbiologiques en aval. Les inventeurs ont remarqué que la présence de composés tels que le phénoxyéthanol, le sorbate de potassium ou des dérivés de thiazolinone est assez répandue. Ainsi, les inventeurs ont sélectionné des compositions enzymatiques qui sont dépourvues de tels composés, ou les plus pauvres possibles, même si les inventeurs ont retrouvé des concentrations importantes de 2-phénoxyéthanol dans de nombreuses compositions enzymatiques commerciales. Parmi les composés recherchés se retrouvent le Bronopol, le triclosan, l'idocarb, le chlorhexidine, le DCOIT, le BIT, le OIT, le CIT, le MIT, l'éthyl-parabène, le méthylparabène, le butythylparabène, le phénylparabène, l'isoproylparabène, l'isobutylparabène, le propylparabène, l'acide salisyllique, l'acide 4-hydroxybenzoïque, l'acide 4-méthylbenzoïque, l'acide benzoïque, l'acide sorbique, l'acide déhydroacétique, le 1- phénoxypropane-2-ol, le 1,2dioromo-2,4-dicyonobutane, le 2-The inventors searched the various commercial enzymes to see if certain compounds interfered with downstream microbiological tests. The inventors have noticed that the presence of compounds such as phenoxyethanol, potassium sorbate or thiazolinone derivatives is quite widespread. Thus, the inventors have selected enzymatic compositions which are devoid of such compounds, or as poor as possible, even if the inventors have found significant concentrations of 2-phenoxyethanol in numerous commercial enzymatic compositions. Among the compounds sought are Bronopol, triclosan, idocarb, chlorhexidine, DCOIT, BIT, OIT, CIT, MIT, ethyl-paraben, methylparaben, butythylparaben, phenylparaben, isoproylparaben, isobutylparaben, propylparaben, salisyllic acid, 4-hydroxybenzoic acid, 4-methylbenzoic acid, benzoic acid, sorbic acid, dehydroacetic acid, 1-phenoxypropane-2 -ol, 1,2dioromo-2,4-dicyonobutane, 2-
hydroxybiphényle, le 2-phénoxyéthanol (le plus abondamment retrouvé, parfois jusqu'à 0,4% en poids), l'alcool bensylique et le chlorophenesin.hydroxybiphenyl, 2-phenoxyethanol (most abundantly found, sometimes up to 0.4% by weight), bensyl alcohol and chlorophenesin.
Exemple comparatif 1Comparative example 1
Suspectant une interférence entre les protéases de lo composition de prélèvement et les enzymes ou les anticorps des tests en aval, les inventeurs ont testé l'effet de l'addition d'inhibiteurs de protéases dans la solution de conservation (cfr exemple 3), tout en évitant au maximum les compositions enzymatiques commerciales comprenant des composés identifiés comme délétères (cfr. exemple 4).Suspecting an interference between the proteases of the sample composition and the enzymes or antibodies of the downstream tests, the inventors tested the effect of the addition of protease inhibitors in the preservation solution (see example 3), while avoiding as much as possible commercial enzymatic compositions comprising compounds identified as deleterious (see example 4).
Différentes manières d'appliquer l'inhibiteur de protéase ont été testées. La protéase choisie étant une subtilisine ou la trypsine, deux inhibiteurs de serine-protéase ont été testés : le PMSF et l'AEBSF.Different ways of applying the protease inhibitor were tested. The chosen protease being a subtilisin or trypsin, two serine protease inhibitors were tested: PMSF and AEBSF.
Le PMSF a permis une bonne inhibition des activités protéolytiques des sérine-protéases testées. Par contre, l'AEBSF n'a inhibé que la trypsine. Des tests de mesure où Listeria (les 3 souches ci-dessus ont été testées) est mise en contact avec une composition comprenant une subtilisine, puis l'AEBSF en concentration suffisante pour causer l'inhibition complète de la subtilisine ont montré que différents tests microbiologiques donnaient des valeurs plus basses, voire même ne détectaient pas Listeria dans les conditions du test, au contraire du contrôle sans les enzymes ou lorsque le PMSF est ajouté.PMSF provided good inhibition of the proteolytic activities of the serine proteases tested. On the other hand, AEBSF only inhibited trypsin. Measuring tests where Listeria (the 3 strains above were tested) is brought into contact with a composition comprising a subtilisin, then AEBSF in sufficient concentration to cause complete inhibition of the subtilisin have shown that different microbiological tests gave lower values, or even did not detect Listeria under the test conditions, unlike the control without enzymes or when PMSF is added.
Ainsi, les inventeurs ont choisi d'incorporer le PMSF dans la solution de conservation à tester, malgré les inconvénients de cette molécule.Thus, the inventors chose to incorporate PMSF into the preservation solution to be tested, despite the disadvantages of this molecule.
Malheureusement, même dans ces conditions, le test Vidas®Unfortunately, even under these conditions, the Vidas® test
LMX ne permet pas de mettre en évidence la présence de Listeria monocytogenes.LMX does not demonstrate the presence of Listeria monocytogenes.
Exemple 5 - Optimisation de la composition de prélèvementExample 5 – Optimization of the sample composition
Les inventeurs ont alors décidé de tester l'efficacité d'une composition de prélèvement fortement diluée et évitant autant que possible les composés identifiés comme délétères. En outre, les activités enzymatiques sont réduites, tout comme la teneur en détergent. Les détergents sont choisis après des tests au laboratoire pour leur compatibilité avec la vie des microorganismes, y compris de Listeria, qui a été identifiée comme plus sensible.The inventors then decided to test the effectiveness of a highly diluted sampling composition and avoiding as much as possible the compounds identified as deleterious. Additionally, enzymatic activities are reduced, as is detergent content. Detergents are chosen after laboratory testing for their compatibility with microorganism life, including Listeria, which has been identified as more sensitive.
Tout d'abord, avec des concentrations en détergent de 10% en poids, même en présence d'activité enzymatique faible, en présence de teneur minimales en agents conservateurs (ex. non-détectables pour la quasi-totalité ; phénoxyéthanol inférieur à 4 ppm) et en absence deFirst of all, with detergent concentrations of 10% by weight, even in the presence of low enzymatic activity, in the presence of minimal preservative agent contents (e.g. non-detectable for almost all; phenoxyethanol less than 4 ppm ) and in the absence of
PMSF, les tests de détection de Listeria, de type Vidas®, ne fonctionnent pas bien (sous-quantification massive), ou pas de manière reproductible.PMSF, Listeria detection tests, such as Vidas®, do not work well (massive underquantification), or not in a reproducible manner.
Même des tests moins spécifiques ne fonctionnent pas lorsqu'une culture de Listeria est soumise à ces différents traitements.Even less specific tests do not work when a Listeria culture is subjected to these different treatments.
Ainsi, tous les paramètres de la composition doivent être vérifiés, avec le problème qu'une trop forte dilution des activités enzymatiques risque de ne plus permettre le décrochage des microorganismes, alors qu'une trop forte dilution des détergents risque de ne plus permettre une application homogène de la composition ou un bon contact avec le biofilm. Ainsi, les inventeurs ont remarqué que, outre la quantité des composants, leur nature devait être reconsidérée.Thus, all the parameters of the composition must be checked, with the problem that too high a dilution of the enzymatic activities risks no longer allowing the microorganisms to drop out, while too high a dilution of the detergents risks no longer allowing application. homogeneous composition or good contact with the biofilm. Thus, the inventors noticed that, in addition to the quantity of the components, their nature had to be reconsidered.
Une formulation diluée a été testée comprenant environ 20% en poids de glycérol, environ 0,03% en poids d'un détergent anionique de type laureth sulfate (de sodium), 0,4% en poids de séquestrant (carboxyméthylinuline) ; 0,4% en poids de glycolate de sodium; 0,04 % en poids d'une subtilisine (activité 1 Unité Anson], ainsi qu'une lipase ; une amylase, une cellulase et une mannanase. Les inventeurs ont sélectionné des enzymes, ici des enzymes commerciales, dépourvues d'agents conservateurs tels que le sorbate de potassium, le MIT, l'OIT, le BIT et le CIT.A diluted formulation was tested comprising approximately 20% by weight of glycerol, approximately 0.03% by weight of an anionic detergent of the (sodium) laureth sulfate type, 0.4% by weight of sequestrant (carboxymethylinulin); 0.4% by weight of sodium glycolate; 0.04% by weight of a subtilisin (activity 1 Anson Unit], as well as a lipase; an amylase, a cellulase and a mannanase. The inventors have selected enzymes, here commercial enzymes, devoid of preservative agents such as potassium sorbate, MIT, OIT, BIT and CIT.
Lorsque c'était possible, les inventeurs ont utilisé des enzymes commerciales dépourvues de phénoxyéthanol (cellulase et mannanase), ou à faible teneur en cette molécule (subtilisine ; 4 g/kg de la formulation enzymatique, lipase ; 0,249 g/kg et amylase ; 0,233 g/kg). Les enzymes autres que la subtilisine ont été ajoutées dans des teneurs pondérales comprises entre 0,1 et 0,5% (poids de la composition enzymatique :poids total) et la quantité d'enzyme est typiquement de 1 à 10% en poids par rapport à la formulation commerciale.When possible, the inventors used commercial enzymes devoid of phenoxyethanol (cellulase and mannanase), or with a low content of this molecule (subtilisin; 4 g/kg of the enzyme formulation, lipase; 0.249 g/kg and amylase; 0.233 g/kg). Enzymes other than subtilisin were added in weight contents of between 0.1 and 0.5% (weight of the enzyme composition: total weight) and the quantity of enzyme is typically 1 to 10% by weight relative to to commercial formulation.
Suite à l'utilisation de cette composition, la présence deFollowing the use of this composition, the presence of
Listeria est détectée, et le test Vidas® LMX pour Listeria est, enfin, positif et reproductible. Les inventeurs ont remarqué en outre que, dans ces conditions diluées, l'ajout de l'inhibiteur de protéase PMSF n'est pas nécessaire, et même réduit Ia propagation de Listeria.Listeria is detected, and the Vidas® LMX test for Listeria is, finally, positive and reproducible. The inventors further noted that, under these diluted conditions, the addition of the protease inhibitor PMSF is not necessary, and even reduces the spread of Listeria.
Les inventeurs considèrent que la concentration des enzymes autres que les protéases (ici, une subtilisine) peuvent encore être quelque peu réduites, ex. la concentration la plus faible qui permet le détachement, tout comme celles de l'agent séquestrant. A la lumière de la présente invention, ceci peut se tester au laboratoire sur les 3 souches de Listerig ou dans d'autres modèles, y compris, de préférence, plus complexes.The inventors consider that the concentration of enzymes other than proteases (here, a subtilisin) can still be reduced somewhat, e.g. the lowest concentration which allows detachment, just like those of the sequestering agent. In light of the present invention, this can be tested in the laboratory on the 3 strains of Listerig or in other models, including, preferably, more complex ones.
Les inventeurs ont ensuite testé une éventuelle synergie avec la solution de conservation (cfr. exemples 2 et 3) : vu que les résultats sont déjà très bons, l'amélioration associée à l'ajout de la solution de conservation est marginale, mais elle a été cependant intéressante dans le cas d'un test qui comprend une propagation suivie d'une détection par PCR.The inventors then tested a possible synergy with the conservation solution (see examples 2 and 3): given that the results are already very good, the improvement associated with the addition of the conservation solution is marginal, but it has was however interesting in the case of a test which includes propagation followed by detection by PCR.
Il est bien entendu que la présente invention n'est en aucune façon limitée aux formes de réalisations décrites ci-dessus et que bien des modifications peuvent y être apportées sans sortir du cadre des revendications annexées.It is of course understood that the present invention is in no way limited to the embodiments described above and that many modifications can be made without departing from the scope of the appended claims.
Claims (18)
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