BE1029436B1

BE1029436B1 - SEPARATION OF BREAST MILK OLIGOSACCHARIDES FROM A FERMENTATION BROTH

Info

Publication number: BE1029436B1
Application number: BE20225467A
Authority: BE
Inventors: Nikolay Khanzhin; Pierre Chassagne
Original assignee: Dsm Ip Assets Bv
Priority date: 2021-06-15
Filing date: 2022-06-14
Publication date: 2023-07-31
Also published as: BE1029436A1; WO2022263425A1

Abstract

De uitvinding heeft betrekking op een methode voor de terugwinning en de zuivering van een neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide (HMO) uit een fermentatiebouillon, die bestaat uit de stappen van ofwel de voorbehandeling van de fermentatiebouillon door aanpassing van de pH, verdunning en/of warmtebehandeling en vervolgens de zuivering van de voorbehandelde fermentatiebouillon door een behandeling met actieve koolstof of de scheiding van de fermentatiebouillon van biomassa. De methode omvat verder de nanofiltratie, de concentratie van de gezuiverde HMO-bevattende stroom en de droging van de gezuiverde HMO-bevattende stroom om een gestolde neutrale of gesialyleerde HMO te verkrijgen. Bovendien heeft de uitvinding ook betrekking op een neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide, verkregen volgens de methode van de uitvinding, en op het gebruik ervan in levensmiddelen, voeder en medische toepassingen.The invention relates to a method for the recovery and purification of a neutral or sialylated human milk oligosaccharide (HMO) from a fermentation broth, comprising the steps of either pre-treating the fermentation broth by pH adjustment, dilution and/or heat treatment and then the purification of the pre-treated fermentation broth by a treatment with active carbon or the separation of the fermentation broth from biomass. The method further includes the nanofiltration, the concentration of the purified HMO-containing stream and the drying of the purified HMO-containing stream to obtain a solidified neutral or sialylated HMO. In addition, the invention also relates to a neutral or sialylated breast milk oligosaccharide obtained by the method of the invention and its use in food, feed and medical applications.

Description

SCHEIDING VAN MOEDERMELKOLIGOSACHARIDEN UIT EENSEPARATION OF BREAST MILK OLIGOSACCHARIDES FROM A

FERMENTATIEBOUILLONFERMENTATION BROTH

GEBIED VAN DE UITVINDINGFIELD OF THE INVENTION

De uitvinding heeft betrekking op de scheiding en de isolatie van neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosachariden (HMO's) uit een reactiemengsel waarin ze zijn geproduceerd.The invention relates to the separation and isolation of neutral or sialylated breast milk oligosaccharides (HMOs) from a reaction mixture in which they have been produced.

ACHTERGROND VAN DE UITVINDINGBACKGROUND OF THE INVENTION

In de afgelopen decennia is de interesse in de bereiding en commercialisering van moedermelkoligosachariden (HMO's) gestaag toegenomen. Het belang van HMO's houdt rechtstreeks verband met hun unieke biologische activiteiten. Daarom zijn HMO's belangrijke potentiële producten voor voedings- en therapeutische doeleinden geworden. Er werd dan ook gezocht naar goedkope manieren om HMO's industrieel te produceren.In recent decades, interest in the preparation and commercialization of breast milk oligosaccharides (HMOs) has steadily increased. The importance of HMOs is directly related to their unique biological activities. Therefore, HMOs have become important potential products for nutritional and therapeutic purposes. Cheap ways to industrially produce HMOs were therefore sought.

Tot vandaag zijn de structuren van meer dan 140 HMO's bepaald en waarschijnlijk zijn er aanzienlijk meer aanwezig in moedermelk (Urashima et al.: Milk oligosaccharides, NovaTo date, the structures of more than 140 HMOs have been determined and significantly more are likely to be present in human milk (Urashima et al.: Milk oligosaccharides, Nova

Biomedical Books, 2011; Chen Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 72, 113 (2015)). De HMO's bevatten een lactosedeel (GalB1-4Glc) aan het reducerende uiteinde en kunnen worden verlengd met een N-acetylglucosaminedeel of een of meerdere N-acetyllactosaminedelen (GalB1-4GIcNAc) en/of een lacto-N-biosedeel (GalB1-3GlcNAc). Lactose en de N- acetyllactosaminyl- of lacto-N-biosylderivaten van lactose kunnen verder worden gesubstitueerd met een of meerdere fucose- en/of siaalzuurresiduen of lactose kan worden gesubstitueerd met een extra galactose om de tot dusver bekende HMO's te verkrijgen.Biomedical Books, 2011; Chen Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 72, 113 (2015)). The HMOs contain a lactose moiety (GalB1-4Glc) at the reducing end and can be extended with an N-acetylglucosamine moiety or one or more N-acetyllactosamine moieties (GalB1-4GlcNAc) and/or a lacto-N-biose moiety (GalB1-3GlcNAc). Lactose and the N-acetyllactosaminyl or lacto-N-biosyl derivatives of lactose can be further substituted with one or more fucose and/or sialic acid residues or lactose can be substituted with an additional galactose to obtain the hitherto known HMOs.

De inspanningen voor de ontwikkeling van processen voor de synthese van HMO's, inclusief gesialyleerde HMO's, zijn in de laatste tien jaar sterk toegenomen wegens hun rol in talrijke menselijke biologische processen. In dit verband zijn processen ontwikkeld voor de productie van HMO's door microbiële fermentaties, enzymatische processen, chemische syntheses of combinaties van deze technologieën.Efforts to develop processes for the synthesis of HMOs, including sialylated HMOs, have greatly increased in the last decade because of their role in numerous human biological processes. In this regard, processes have been developed for the production of HMOs by microbial fermentations, enzymatic processes, chemical synthesis or combinations of these technologies.

De directe fermentatieve productie van HMO's, vooral van HMO's die een trisacharide zijn, is onlangs in de praktijk gebracht (Han et al. Biotechnol. Adv. 30, 1268 (2012) en hierin aangegeven referenties). Bij een dergelijke fermentatietechnologie werd een recombinant Æ. coli-systeem gebruikt waarbij een of meerdere types glycosyltransferases afkomstig van virussen of bacteriën zijn gecoëxpresseerd om exogeen toegevoegde lactose te glycosyleren, die is geïnternaliseerd door de LacY-permease van de Æ. coli. Het gebruik van een recombinante glycosyltransferase, voornamelijk reeksen van recombinante glycosyltransferasen voor de productie van oligosachariden met vier of meer monosacharide-The direct fermentative production of HMOs, especially of HMOs that are a trisaccharide, has recently been put into practice (Han et al. Biotechnol. Adv. 30, 1268 (2012) and references indicated herein). In such a fermentation technology, a recombinant Æ. coli system in which one or more types of glycosyltransferases from viruses or bacteria are coexpressed to glycosylate exogenously added lactose, which is internalized by the LacY permease of the Æ. coli. The use of a recombinant glycosyltransferase, primarily series of recombinant glycosyltransferases, for the production of oligosaccharides with four or more monosaccharide

° BE2022/5467 eenheden, heeft echter altijd geleid tot de vorming van bijproducten, wat resulteert in een complex mengsel van oligosachariden in de fermentatiebouillon. Verder bevat een fermentatiebouillon onvermijdelijk een uitgebreid gamma van niet-oligosacharidestoffen zoals cellen, celfragmenten, eiwitten, erwitfragmenten, DNA, DNA-fragmenten, endotoxinen, gekarameliseerde bijproducten, mineralen, zouten of andere geladen moleculen. Daarom is het een bijzondere uitdaging om neutrale of gesialyleerde HMO's uit een complexe matrix zoals een fermentatiebouillon te isoleren.° BE2022/5467 units, however, has always led to the formation of by-products, resulting in a complex mixture of oligosaccharides in the fermentation broth. Furthermore, a fermentation broth inevitably contains a wide variety of non-oligosaccharide substances such as cells, cell fragments, proteins, pea fragments, DNA, DNA fragments, endotoxins, caramelized by-products, minerals, salts or other charged molecules. Therefore, it is a particular challenge to isolate neutral or sialylated HMOs from a complex matrix such as a fermentation broth.

Voor de scheiding van HMO's van koolhydraatbijproducten en andere verontreinigende bestanddelen werd een behandeling met actieve koolstof in combinatie met een gelfiltratiechromatografie voorgesteld als een voorkeursmethode (WO 01/04341, EP-A- 2479263, Dumon et al. Glycoconj. J. 18, 465 (2001), Priem et al. Glycobiology 12, 235 (2002), Drouillard et al. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 1778 (2006), Gebus et al. Carbohydr. Res. 361, 83 (2012), Baumgärtner et al. ChemBioChem 15, 1896 (2014)). Hoewel gelfiltratiechromatografie een geschikte methode is voor in het laboratorium, kan die niet efficiënt worden opgeschaald voor industriële productie.For the separation of HMOs from carbohydrate by-products and other contaminants, active carbon treatment in combination with gel filtration chromatography has been proposed as a preferred method (WO 01/04341, EP-A-2479263, Dumon et al. Glycoconj. J. 18, 465 ( 2001), Priem et al Glycobiology 12, 235 (2002), Drouillard et al Angew Chem Int Ed 45, 1778 (2006), Gebus et al Carbohydr Res 361, 83 (2012), Baumgärtner et al. ChemBioChem 15, 1896 (2014)). While gel filtration chromatography is a suitable method for the laboratory, it cannot be efficiently scaled up for industrial production.

EP-A-2896628 beschrijft een proces voor de zuivering van 2'-FL uit een fermentatiebouillon verkregen door microbiële fermentatie, dat uit de volgende stappen bestaat: ultrafiltratie, harschromatografie met sterke kationenwisseling (H*-vorm), neutralisatie, harschromatografie met sterke anionenwisseling (acetaatvorm), neutralisatie, behandeling met actieve koolstof, elektrodialyse, tweede harschromatografie met sterke kationenwisseling (H*- of Na*-vorm), tweede harschromatografie met sterke anionenwisseling (Cl-vorm), tweede behandeling met actieve koolstof, optionele tweede elektrodialyse en steriele filtratie. Een dergelijk zuiveringsproces is intrinsiek beperkt tot neutrale moedermelkoligosachariden.EP-A-2896628 describes a process for the purification of 2'-FL from a fermentation broth obtained by microbial fermentation, which consists of the following steps: ultrafiltration, high cation exchange resin chromatography (H* form), neutralization, high anion exchange resin chromatography (acetate form), neutralization, active carbon treatment, electrodialysis, second resin chromatography with strong cation exchange (H* or Na* form), second resin chromatography with strong anion exchange (Cl form), second active carbon treatment, optional second electrodialysis and sterile filtration. Such a purification process is intrinsically limited to neutral breast milk oligosaccharides.

WO 2017/182965 en WO 2017/221208 beschrijven een proces voor de zuivering van LNT ofWO 2017/182965 and WO 2017/221208 describe a process for the purification of LNT or

LNnT uit fermentatiebouillon bestaande uit ultrafiltratie, nanofiltratie, behandeling met actieve koolstof en behandeling met hars met sterke kationenwisseling (H’-vorm) gevolgd door hars met zwakke anionenwisseling (basevorm).LNnT from fermentation broth consisting of ultrafiltration, nanofiltration, activated carbon treatment and treatment with strong cation exchange resin (H' form) followed by weak anion exchange resin (base form).

WO 2015/188834 en WO 2016/095924 beschrijven de kristallisatie van 2'-FL uit een gezuiverde fermentatiebouillon, waarbij de zuivering bestaat uit ultrafiltratie, nanofiltratie, behandeling met actieve koolstof en behandeling met hars met sterke kationenwisseling (H*- vorm) gevolgd door zwak basisch hars (basevorm).WO 2015/188834 and WO 2016/095924 describe the crystallization of 2'-FL from a purified fermentation broth, where the purification consists of ultrafiltration, nanofiltration, treatment with active carbon and treatment with strong cation exchange resin (H* form) followed by weakly basic resin (base form).

Eerdere documenten beschreven zuiveringsmethoden die zijn uitgewerkt voor fermentatiebouillons met een laag lactosegehalte of zonder lactose. Volgens deze procedures is lactose die tijdens de fermentatieve productie van een neutrale HMO in overmaat isPrevious papers described purification methods elaborated for low-lactose or lactose-free fermentation broths. According to these procedures, lactose is in excess during the fermentative production of a neutral HMO

) BE2022/5467 toegevoegd, na voltooiing van de fermentatie in situ gehydrolyseerd door de werking van een) BE2022/5467 added, after completion of fermentation hydrolysed in situ by the action of a

B-galactosidase, wat leidt tot een bouillon die in wezen geen residuele lactose meer bevat.β-galactosidase, leading to a broth that is essentially free of residual lactose.

Overeenkomstig beschrijft WO 2012/112777 een reeks stappen om 2'-FL te zuiveren, bestaande uit centrifugeren, het vastleggen van de oligosacharide op koolstof gevolgd door elutie en flashchromatografie op ionenwisselingsmiddelen. WO 2015/106943 beschrijft de zuivering van 2'-FL bestaande uit ultrafiltratie, chromatografie met hars met sterke kationenwisseling (H'-vorm), neutralisatie, chromatografie met hars met sterke anionenwisseling (Cl-vorm), neutralisatie, nanofiltratie/diafiltratie, behandeling met actieve koolstof, elektrodialyse, facultatieve tweede chromatografie met hars met sterke kationenwisseling (Na*-vorm), tweede chromatografie met hars met sterke anionenwisseling (CI-vorm), tweede behandeling met actieve koolstof, optionele tweede elektrodialyse en steriele filtratie. WO 2019/063757 beschrijft een proces voor de zuivering van een neutraleAccordingly, WO 2012/112777 describes a series of steps to purify 2'-FL consisting of centrifugation, fixation of the oligosaccharide on carbon followed by elution and flash chromatography on ion exchange agents. WO 2015/106943 describes the purification of 2'-FL consisting of ultrafiltration, chromatography with high cation exchange resin (H' form), neutralization, chromatography with high anion exchange resin (Cl form), neutralisation, nanofiltration/diafiltration, treatment with active carbon, electrodialysis, optional second chromatography with strong cation exchange resin (Na* form), second chromatography with strong anion exchange resin (CI form), second treatment with active carbon, optional second electrodialysis and sterile filtration. WO 2019/063757 describes a process for the purification of a neutral

HMO, bestaande uit het scheiden van biomassa uit fermentatiebouillon en behandeling met een kationenwisselingsmateriaal, een anionenwisselingsmateriaal en een kationenwisselingsadsorptiehars.HMO, consisting of separating biomass from fermentation broth and treatment with a cation exchange material, an anion exchange material and a cation exchange adsorption resin.

Antoine et al. Angew. Chem. Int. Ed. 44, 1350 (2005) en US 2007/0020736 beschreven de productie van 3'-SL en bijbehorende di- en trigesialyleerde lactoses door een genetisch gemodificeerde Æ. coli; de bouillon met ca. 0,8 mM 3'-SL werd als volgt behandeld: adsorptie van de producten uit het gecentrifugeerde supernatans op houtskool/celiet, wegspoelen van de in water oplosbare zouten met gedestilleerd water, elueren van de verbindingen met gradiënt waterig ethanol, scheiding van de gesialyleerde producten op een Biogel-kolom en ontzouten, wat leidde tot 49 mg 3'-SL uit 1 liter bouillon. WO 01/04341 en Priem et al. Glycobiology 12, 235 (2002) beschreven de productie van 3'-SL door een genetisch gemodificeerde Æ. coli; 3'-Antoine et al. Angew. Chem. Int. Ed. 44, 1350 (2005) and US 2007/0020736 described the production of 3'-SL and associated di- and trisialylated lactoses by a genetically modified Æ. coli; the broth containing ca. 0.8 mM 3'-SL was treated as follows: adsorption of the products from the centrifuged supernatant onto charcoal/celite, washing away the water-soluble salts with distilled water, eluting the compounds with gradient aqueous ethanol , separation of the sialylated products on a Biogel column and desalting, yielding 49 mg of 3'-SL from 1 liter of broth. WO 01/04341 and Priem et al. Glycobiology 12, 235 (2002) described the production of 3'-SL by a genetically modified Æ. coli; 3'-

SL werd geïsoleerd door de volgende opeenvolging van bewerkingen: warmtepermeabilisatie van de producerende cellen gevolgd door centrifugatie, adsorptie van het product uit het supernatans op houtskool/celiet, wegspoelen van de in water oplosbare zouten met gedestilleerd water, elueren van de verbinding met gradiënt waterig ethanol, binden van de verbinding aan een sterke anionenwisselaar in HCO:'-vorm, elutie van de verbinding met een lineaire gradiënt NaHCO:-oplossing, vervolgens verwijdering van het natriumbicarbonaat met een kationenwisselaar (in H”-vorm), wat leidde tot geïsoleerd 3'-SL met een zuiveringsrendement van 49 %. WO 2007/101862 en Fierfort et al. J. Biotechnol. 134, 261 (2008) beschreven een alternatieve verwerkingsprocedure van een 3'-SL fermentatiebouillon.SL was isolated by the following sequence of operations: heat permeabilization of the producer cells followed by centrifugation, adsorption of the product from the supernatant onto charcoal/celite, washing away the water-soluble salts with distilled water, eluting the compound with gradient aqueous ethanol , binding the compound to a strong anion exchanger in HCO:' form, elution of the compound with a linear gradient NaHCO: solution, then removal of the sodium bicarbonate with a cation exchanger (in H" form), leading to isolated 3 '-SL with a purification efficiency of 49%. WO 2007/101862 and Fierfort et al. J. Biotechnol. 134, 261 (2008) described an alternative processing procedure of a 3'-SL fermentation broth.

De procedure bestaat uit de volgende stappen: warmtepermeabilisatie van de producerende cel, centrifugatie, aanpassing van de pH van het extracellulaire tot 3,0 door de toevoeging vanThe procedure consists of the following steps: heat permeabilization of the producer cell, centrifugation, adjustment of the extracellular pH to 3.0 by the addition of

’ BE2022/5467 een hars met sterke kationenwisseling in zuurvorm, verwijdering van de neergeslagen eiwitten door centrifugatie, aanpassing van de pH van het supernatans aan 6,0 door de toevoeging van een zwakke anionenwisselaar in basevorm, binding van de sialyllactose aan een anionenwisselaar in HCO:'-vorm, spoeling met gedestilleerd water, elutie van de verbinding met een continue gradiënt NaHCO:-oplossing, verwijdering van het natriumbicarbonaat met een kationenwisselaar (in H”-vorm) tot pH 3,0 is bereikt, vervolgens aanpassing van de pH tot 6,0 met NaOH. Met de bovenstaande zuivering kon 15 g 3'-SL worden geïsoleerd uit 1 liter bouillon met 25,5 g 3'-SL. Drouillard et al. Carbohydr. Res. 345, 1394 (2010)) paste de bovenstaande procedure van Fierfort toe op een fermentatiebouillon met 6'-SL (11 g/l) en een beetje 6,6'-disialyllactose (DSL) en isoleerde zo 3,34 g 6'-SL + DSL in een verhouding van 155/86.' BE2022/5467 a strong cation exchange resin in acid form, removal of the precipitated proteins by centrifugation, adjustment of the pH of the supernatant to 6.0 by the addition of a weak anion exchanger in base form, binding of the sialyl lactose to an anion exchanger in HCO form, rinse with distilled water, elute the compound with a continuous gradient NaHCO2 solution, remove the sodium bicarbonate with a cation exchanger (in H” form) until pH 3.0 is reached, then adjust the pH to 6.0 with NaOH. With the above purification, 15 g of 3'-SL could be isolated from 1 liter of broth containing 25.5 g of 3'-SL. Drouillard et al. Carbohydr. Res. 345, 1394 (2010)) applied the above procedure of Fierfort to a fermentation broth containing 6'-SL (11 g/l) and some 6,6'-disialyllactose (DSL) and isolated 3.34 g of 6'- SL + DSL in a ratio of 155/86.

WO 2006/034225 beschrijft twee alternatieve zuiveringen van 3'-SL uit een producerende fermentatiebouillon. Volgens de eerste procedure werd het lysaat van de kweek verdund met gedestilleerd water en geroerd met actieve koolstof/celiet. Het influent werd met water gespoeld, waarna het product met waterig ethanol van de houtskool/celiet werd geëlueerd.WO 2006/034225 describes two alternative purifications of 3'-SL from a producing fermentation broth. According to the first procedure, the culture lysate was diluted with distilled water and stirred with activated carbon/celite. The influent was rinsed with water and the product was eluted from the charcoal/celite with aqueous ethanol.

Volgens de tweede methode werden de kweekcellen warmtebehandeld en werden de neergeslagen vaste deeltjes door centrifugatie van het supernatans gescheiden. Het resulterende supernatans werd door een microfilter geleid, het permeaat werd door een 10 kDa-membraan geleid en vervolgens nanogefiltreerd. Het resulterende retentaat werd vervolgens gediafiltreerd om het uiteindelijke monster te verzamelen. Beide zuiveringsmethoden zorgden voor 90-100 mg 3'-SL uit 1 liter fermentatiebouillon.According to the second method, the culture cells were heat-treated and the precipitated solid particles were separated from the supernatant by centrifugation. The resulting supernatant was passed through a microfilter, the permeate was passed through a 10 kDa membrane and then nanofiltered. The resulting retentate was then diafiltered to collect the final sample. Both purification methods provided 90-100 mg of 3'-SL from 1 liter of fermentation broth.

Gilbert et al. Nature Biotechnol. 16, 769 (1998) en WO 99/31224 beschrijven de enzymatische productie van 3'-SL vanaf lactose, siaalzuur, fosfoenolpyruvaat, ATP en CMP met behulp van een CMP-Neu5Ac synthetase/a-2,3-sialyltransferase fusie-eiwitextract. Het product werd gezuiverd door een opeenvolging van ultrafiltratie (3000 MWCO), C18 omgekeerde-fasechromatografie, nanofiltratie/diafiltratie bij pH = 3 en pH = 7, aanzuring met een hars met sterke kationenwisseling (H”), neutralisatie met NaOH-oplossing en ontkleuring met actieve koolstof.Gilbert et al. Nature Biotechnol. 16, 769 (1998) and WO 99/31224 describe the enzymatic production of 3'-SL from lactose, sialic acid, phosphoenolpyruvate, ATP and CMP using a CMP-Neu5Ac synthetase/α-2,3-sialyltransferase fusion protein extract. The product was purified by a sequence of ultrafiltration (3000 MWCO), C18 reverse phase chromatography, nanofiltration/diafiltration at pH = 3 and pH = 7, acidification with a strong cation exchange resin (H”), neutralization with NaOH solution and decolorization with active carbon.

WO 2009/113861 beschrijft een proces voor de isolatie sialyllactose uit een ontvette en eiwitvrije melkstroom, bestaande uit een contact van deze melkstroom met een eerste anionenwisselaarshars in vrije basevorm en met een vochtgehalte van 30-48 %, zodat de negatief geladen mineralen aan het hars gebonden zijn en de sialyllactose niet, gevolgd door een behandeling met een tweede anionenwisselaarshars in vrije basevorm, van het macroporeuze of geltype, met een vochtgehalte tussen 50 en 70 %, zodat de sialyllactose aanWO 2009/113861 describes a process for the isolation of sialyl lactose from a defatted and protein-free milk stream, consisting of contact of this milk stream with a first anion exchange resin in free base form and with a moisture content of 30-48%, so that the negatively charged minerals are attached to the resin. are bound and the sialyl lactose is not, followed by a treatment with a second free base anion exchange resin, of the macroporous or gel type, with a moisture content between 50 and 70 %, so that the sialyl lactose

> BE2022/5467 het hars wordt gebonden. Bij dit proces is de sialyllactose bevattende stroom redelijk verdund (een concentratie van enkele honderden ppm) en is de terugwinning van sialyllactose uit het eerste hars matig.> BE2022/5467 the resin is bound. In this process, the sialyl lactose-containing stream is fairly dilute (a concentration of several hundred ppm) and the recovery of sialyl lactose from the first resin is moderate.

WO 2017/152918 beschrijft een methode voor het verkrijgen van een gesialyleerd oligosacharide uit een fermentatiebouillon, waarin dit gesialyleerd oligosacharide wordt geproduceerd door het kweken van een genetisch gemodificeerd micro-organisme dat in staat is om dit gesialyleerd oligosacharide te produceren uit een geïnternaliseerde koolhydraatprecursor, bestaande uit de volgende stappen: 1) ultrafiltratie (UF), ii) nanofiltratie (NF), 111) optionele behandeling met actieve koolstof, en iv) behandeling van de bouillon met een hars met sterke anionenwisseling en/of een kationenwisselaarshars.WO 2017/152918 describes a method for obtaining a sialylated oligosaccharide from a fermentation broth, in which this sialylated oligosaccharide is produced by culturing a genetically modified microorganism capable of producing this sialylated oligosaccharide from an internalized carbohydrate precursor, consisting of the following steps: 1) ultrafiltration (UF), ii) nanofiltration (NF), 111) optional active carbon treatment, and iv) treatment of the broth with a strong anion exchange resin and/or a cation exchange resin.

EP-A-3456836 beschrijft een methode voor de scheiding van een gesialyleerd oligosacharide uit een waterig medium, waarbij de methode bestaat uit een behandeling van een waterige oplossing die dit gesialyleerd oligosacharide bevat, met minstens twee soorten ionenwisselaarshars, waarvan de ene een sterk anionenwisselaarshars in Cl'-vorm en de andere een sterk kationenwisselaarshars is.EP-A-3456836 describes a method for the separation of a sialylated oligosaccharide from an aqueous medium, the method comprising treating an aqueous solution containing this sialylated oligosaccharide with at least two kinds of ion exchange resin, one of which contains a strong anion exchange resin in Cl' form and the other is a strong cation exchange resin.

WO 2019/043029 beschrijft een methode voor de zuivering van gesialyleerde oligosachariden die zijn geproduceerd door microbiële fermentatie of in vitro biokatalyse, waarbij de methode bestaat uit de volgende stappen: 1) de scheiding van biomassa uit de fermentatiebouillon, 11) de verwijdering van kationen uit de fermentatiebouillon of het reactiemengsel, iii) de verwijdering van anionische onzuiverheden uit de fermentatiebouillon of het reactiemengsel, en iv) de verwijdering van verbindingen met een lager molecuulgewicht dan dat van het te zuiveren gesialyleerde oligosacharide uit de fermentatiebouillon of het reactiemengsel.WO 2019/043029 describes a method for the purification of sialylated oligosaccharides produced by microbial fermentation or in vitro biocatalysis, the method comprising the following steps: 1) the separation of biomass from the fermentation broth, 11) the removal of cations from the fermentation broth or reaction mixture, iii) the removal of anionic impurities from the fermentation broth or reaction mixture, and iv) the removal of compounds with a lower molecular weight than that of the sialylated oligosaccharide to be purified from the fermentation broth or reaction mixture.

WO 2019/2291 18 beschrijft een methode voor de zuivering van een sialyllactose uit andere koolhydraten, waarbij de sialyllactose wordt geproduceerd door fermentatie, bestaande uit: a) de scheiding van de celmassa met ultrafiltratie, b) de behandeling met een sterk kationische ionenwisselaar, gevolgd door de behandeling van het filtraat met een sterk anionische ionenwisselaar (Cl’-vorm), c) eerste nanofiltratie, d) tweede nanofiltratie,WO 2019/2291 18 describes a method for the purification of a sialyl lactose from other carbohydrates, in which the sialyl lactose is produced by fermentation, consisting of: a) the separation of the cell mass by ultrafiltration, b) the treatment with a strong cationic ion exchanger, followed by treating the filtrate with a strongly anionic ion exchanger (Cl' form), c) first nanofiltration, d) second nanofiltration,

° BE2022/5467 e) elektrodialyse, f) omgekeerde osmose, g) behandeling met actieve koolstof, h) steriele filtratie, en 1) sproeidroging.° BE2022/5467 e) electrodialysis, f) reverse osmosis, g) active carbon treatment, h) sterile filtration, and 1) spray drying.

Er is echter behoefte aan alternatieve en/of verbeterde procedures voor de isolatie en zuivering van neutrale of gesialyleerde HMO's uit niet-koolhydraatbestanddelen van de fermentatiebouillon waarin ze zijn geproduceerd, met name procedures die geschikt zijn voor industriële schaal, om het terugwinningsrendement van de neutrale of gesialyleerde HMO's te verbeteren en/of de geavanceerde methoden te vereenvoudigen terwijl de zuiverheid van de neutrale of gesialyleerde HMO's minstens behouden blijft en bij voorkeur wordt verbeterd.However, there is a need for alternative and/or improved procedures for the isolation and purification of neutral or sialylated HMOs from non-carbohydrate components of the fermentation broth in which they are produced, especially procedures suitable for industrial scale, to improve the recovery efficiency of the neutral or improving sialylated HMOs and/or simplifying the advanced methods while at least maintaining and preferably improving the purity of the neutral or sialylated HMOs.

Bovendien leiden dergelijke alternatieve zuiveringsprocedures bij voorkeur tot gezuiverde neutrale of gesialyleerde HMO's die vrij zijn van eiwitten en recombinant materiaal afkomstig van de gebruikte recombinante microbiële stammen, en die dus zeer geschikt zijn voor gebruik in levensmiddelen, medische levensmiddelen en voedertoepassingen.Moreover, such alternative purification procedures preferably lead to purified neutral or sialylated HMOs that are free of proteins and recombinant material derived from the recombinant microbial strains used, and are thus well suited for use in food, medical food and feed applications.

SAMENVATTING VAN DE UITVINDINGSUMMARY OF THE INVENTION

De uitvinding heeft betrekking op een methode voor de terugwinning en de zuivering van een neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide (HMO) uit een fermentatiebouillon, die bestaat uit de volgende stappen: a. de voorziening van een HMO-bevattende fermentatiebouillon en al. de scheiding van de fermentatiebouillon om een gescheiden HMO-bevattende stroom en een biomassa-afvalstroom te vormen; of a2. de voorbehandeling van de fermentatiebouillon door pH-aanpassing, verdunning en/of warmtebehandeling, b. de behandeling van de gescheiden HMO-bevattende stroom van stap al) of de voorbehandelde fermentatiebouillon volgens stap a2) met actieve koolstof om eenThe invention relates to a method for the recovery and purification of a neutral or sialylated breast milk oligosaccharide (HMO) from a fermentation broth, which consists of the following steps: a. the provision of a HMO-containing fermentation broth and al. the separation of the fermentation broth to form a separated HMO-containing stream and a biomass waste stream; or a2. the pre-treatment of the fermentation broth by pH adjustment, dilution and/or heat treatment, b. treating the separated HMO-containing stream from step a1) or the pre-treated fermentation broth according to step a2) with active carbon to obtain a

HMO-bevattende stroom te verkrijgen; c. de zuivering van de HMO-bevattende stroom door nanofiltratie; d. de concentratie van de gezuiverde HMO-bevattende stroom; en e. de droging van de gezuiverde HMO-bevattende stroom om een gestolde neutrale of gesialyleerde HMO te verkrijgen.obtain HMO-containing stream; c. the purification of the HMO-containing stream by nanofiltration; d. the concentration of the purified HMO-containing stream; and e. drying the purified HMO-containing stream to obtain a solidified neutral or sialylated HMO.

In een ander aspect heeft de uitvinding betrekking op een neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide, verkregen of te verkrijgen volgens de methode van de uitvinding.In another aspect, the invention relates to a neutral or sialylated breast milk oligosaccharide obtained or obtainable by the method of the invention.

! BE2022/5467! BE2022/5467

Een ander aspect van de uitvinding heeft betrekking op een neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide, verkregen of te verkrijgen volgens de methode van de uitvinding, voor gebruik in de geneeskunde.Another aspect of the invention relates to a neutral or sialylated breast milk oligosaccharide, obtained or obtainable by the method of the invention, for use in medicine.

Een ander aspect van de uitvinding heeft betrekking op het gebruik van een neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide, verkregen of te verkrijgen volgens de methode van de uitvinding, voor voedings- en/of voedertoepassingen.Another aspect of the invention relates to the use of a neutral or sialylated breast milk oligosaccharide, obtained or obtainable by the method of the invention, for food and/or feed applications.

Een ander aspect van de uitvinding heeft betrekking op een voedingsmiddel of cosmetisch product dat de neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide bevat, verkregen of te verkrijgen volgens de methode van de uitvinding.Another aspect of the invention relates to a food or cosmetic product containing the neutral or sialylated breast milk oligosaccharide obtained or obtainable by the method of the invention.

GEDETAILLEERDE BESCHRIJVING VAN DE UITVINDINGDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

1. Termen en definities1. Terms and Definitions

De term ”fermentatiebouillon”, zoals gebruikt in deze specificatie, verwijst naar een product verkregen door de fermentatie van het microbiële organisme. Het fermentatieproduct omvat dus cellen (biomassa), het fermentatiemedium, zouten, residueel substraatmateriaal en alle moleculen/bijproducten die tijdens de fermentatie ontstaan, zoals de gewenste neutrale of gesialyleerde HMO's. Na elke stap van de zuiveringsmethode worden een of meerdere bestanddelen van het fermentatieproduct verwijderd, wat leidt tot een meer gezuiverde neutrale of gesialyleerde HMO.The term "fermentation broth" as used in this specification refers to a product obtained by the fermentation of the microbial organism. Thus, the fermentation product includes cells (biomass), the fermentation medium, salts, residual substrate material, and any molecules/by-products generated during the fermentation, such as the desired neutral or sialylated HMOs. After each step of the purification method, one or more components of the fermentation product are removed, resulting in a more purified neutral or sialylated HMO.

De term ”monosacharide” duidt op een suiker met 5-9 koolstofatomen, zijnde een aldose (bijv. D-glucose, D-galactose, D-mannose, D-ribose, D-arabinose, L-arabinose, D-xylose enz.), een ketose (bijv. D-fructose, D-sorbose, D-tagatose enz. ), een deoxysuiker (bijv. L- rhamnose, L-fucose enz.), een deoxyaminosuiker (bijv. N-acetylglucosamine, N- acetylmannosamine, N-acetylgalactosamine enz.), een ureumzuur, een ketoaldonzuur (bijv. siaalzuur) of equivalenten daarvan.The term "monosaccharide" refers to a sugar with 5-9 carbon atoms, which is an aldose (e.g. D-glucose, D-galactose, D-mannose, D-ribose, D-arabinose, L-arabinose, D-xylose, etc. ), a ketose (e.g., D-fructose, D-sorbose, D-tagatose, etc.), a deoxysugar (e.g., L-rhamnose, L-fucose, etc.), a deoxyaminosugar (e.g., N-acetylglucosamine, N-acetylmannosamine , N-acetylgalactosamine etc.), a urea acid, a ketoaldonic acid (e.g. sialic acid) or equivalents thereof.

De term ”disacharide” betekent een koolhydraat bestaande uit twee monosacharide-eenheden die via een interglycosidebinding met elkaar zijn verbonden.The term "disaccharide" means a carbohydrate consisting of two monosaccharide units linked together via an interglycosidic bond.

De term ”trioligosacharide” of hoger betekent een suikerpolymeer dat bestaat uit minstens drie, bij voorkeur drie tot acht, en bij voorkeur drie tot zes monosacharide-eenheden (vide supra). De oligosacharide kan een lineaire of vertakte structuur hebben die monosacharide- eenheden bevat die via een interglycosidebinding met elkaar zijn verbonden.The term "trioligosaccharide" or higher means a sugar polymer consisting of at least three, preferably three to eight, and preferably three to six monosaccharide units (vide supra). The oligosaccharide may have a linear or branched structure containing monosaccharide units linked together via an interglycosidic bond.

De term ”moedermelkoligosacharide” of ”HMO” betekent een complex koolhydraat dat voorkomt in moedermelk (Urashima et al.: Milk Oligosaccharides, Nova Medical Books, NY, 2011; Chen Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 72, 113 (2015)). De HMO's hebben een kernstructuur bestaande uit een lactose-eenheid aan het reducerende uiteinde die wordtThe term “breast milk oligosaccharide” or “HMO” means a complex carbohydrate found in human milk (Urashima et al.: Milk Oligosaccharides, Nova Medical Books, NY, 2011; Chen Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 72, 113 (2015)) . The HMOs have a core structure consisting of a lactose unit at the reducing end that becomes

© BE2022/5467 verlengd i) door een B-N-acetyl-glucosaminylgroep of ii) door een of meerdere B-N-acetyl- lactosaminyl- en/of een of meerdere B-lacto-N-biosyl-eenheden. De kernstructuren kunnen worden gesubstitueerd door een a-L-fucopyranosyl- en/of een a-N-acetyl-neuraminyl (sialyl)- deel. In dit verband zijn de niet-zure (of neutrale) HMO's vrij van een sialylresidu en hebben de zure HMO's minstens één sialylresidu in hun structuur. De niet-zure (of neutrale) HMO's kunnen gefucosyleerd of niet-gefucosyleerd zijn. Voorbeelden van dergelijke neutrale niet- gefucosyleerde HMO's zijn lacto-N-triose II (LNTri, GlcNAc{(B1-3)Gal(B1-4)Glc), lacto-N- tetraose (LNT), lacto-N-neotetraose (LNnT), lacto-N-neohexaose (LNnH), para-lacto-N- neohexaose (pLNnH), para-lacto-N-hexaose (pLNH) en lacto-N-hexaose (LNH).© BE2022/5467 extended i) by a β-N-acetyl-glucosaminyl group or ii) by one or more β-N-acetyl-lactosaminyl and/or one or more β-lacto-N-biosyl units. The core structures may be substituted by an α-L-fucopyranosyl and/or an α-N-acetyl-neuraminyl (sialyl) moiety. In this regard, the non-acidic (or neutral) HMOs are free of a sialyl residue and the acidic HMOs have at least one sialyl residue in their structure. The non-acidic (or neutral) HMOs can be fucosylated or non-fucosylated. Examples of such neutral non-fucosylated HMOs are lacto-N-triose II (LNTri, GlcNAc{(B1-3)Gal(B1-4)Glc), lacto-N-tetraose (LNT), lacto-N-neotetraose (LNnT ), lacto-N-neohexaose (LNnH), para-lacto-N-neohexaose (pLNnH), para-lacto-N-hexaose (pLNH), and lacto-N-hexaose (LNH).

Voorbeelden van neutrale gefucosyleerde HMO's zijn 2'-fucosyllactose (2'-FL), lacto-N- fucopentaose I (LNFP-I), lacto-N-difucohexaose I (LNDFH-I), 3-fucosyllactose (3-FL), difucosyllactose (DFL), lacto-N-fucopentaose II (LNFP-H), lacto-N-fucopentaose III (LNFP-Examples of neutral fucosylated HMOs are 2'-fucosyllactose (2'-FL), lacto-N-fucopentaose I (LNFP-I), lacto-N-difucohexaose I (LNDFH-I), 3-fucosyllactose (3-FL), difucosyllactose (DFL), lacto-N-fucopentaose II (LNFP-H), lacto-N-fucopentaose III (LNFP-

III), lacto-N-difucohexaose III (LNDFH-III), fucosyl-lacto-N-hexaose II (FLNH-IT), lacto-N- fucopentaose V (LNFP-V), lacto-N-difucohexaose II (LNDFH-H), fucosyl-lacto-N-hexaose I (FLNH-I), fucosyl-para-lacto-N-hexaose I (FpLNH-D), fucosyl-para-lacto-N-neohexaose II (F-pLNnH II) en fucosyl-lacto-N-neohexaose (FLNnH). Voorbeelden van zure HMO's zijn 3'- sialyllactose (3'-SL), 6'-sialyllactose (6'-SL), 3-fucosyl-3'-sialyllactose (FSL), LST a, fucosyl-III), lacto-N-difucohexaose III (LNDFH-III), fucosyl-lacto-N-hexaose II (FLNH-IT), lacto-N-fucopentaose V (LNFP-V), lacto-N-difucohexaose II (LNDFH- H), fucosyl-lacto-N-hexaose I (FLNH-I), fucosyl-para-lacto-N-hexaose I (FpLNH-D), fucosyl-para-lacto-N-neohexaose II (F-pLNnH II) and fucosyl-lacto-N-neohexaose (FLNnH). Examples of acidic HMOs are 3'-sialyl lactose (3'-SL), 6'-sialyl lactose (6'-SL), 3-fucosyl-3'-sialyl lactose (FSL), LST a, fucosyl-

LST a (FLST a), LST b, fucosyl-LST b (FLST b), LST c fucosyl-LST c (FLST c), sialyl-LNH (SLNH), sialyl-lacto-N-hexaose (SLNH), sialyl-lacto-N-neohexaose I (SLNH-I), sialyl-lacto-LST a (FLST a), LST b, fucosyl-LST b (FLST b), LST c fucosyl-LST c (FLST c), sialyl-LNH (SLNH), sialyl-lacto-N-hexaose (SLNH), sialyl- lacto-N-neohexaose I (SLNH-I), sialyl-lacto-

N-neohexaose II (SLNH-IT) en disialyl-lacto-N-tetraose (DSLNT).N-neohexaose II (SLNH-IT) and disialyl-lacto-N-tetraose (DSLNT).

De term ”sialyl” of ”sialyldeel” duidt op het glycosylresidu van siaalzuur (N-acetyl- neuraminezuur, NeuSAc), bij voorkeur verbonden met een a-binding:The term "sialyl" or "sialyl moiety" denotes the glycosyl residue of sialic acid (N-acetyl-neuraminic acid, NeuSAc), preferably linked by an α-bond:

Ho Pp! COOH > OHey PP! COOH > O

De term ”fucosyl” betekent een L-fucopyranosylgroep, bij voorkeur verbonden met een a- 1nterglycosidebinding: 2 27 OHThe term "fucosyl" means an L-fucopyranosyl group, preferably connected with an α-1nterglycosidic bond: 2 27 OH

OHOH

”N-acetyl-glucosaminyl” betekent een N-acetyl-2-amino-2-deoxy-D-glucopyranosylgroep (GleNAc), bij voorkeur verbonden met een B-binding:"N-acetyl-glucosaminyl" means an N-acetyl-2-amino-2-deoxy-D-glucopyranosyl group (GleNAc), preferably connected with a B bond:

OHOH

HO 0 %HO 0%

HOHO

NHAc ”N-acetyl-lactosaminyl” betekent het glycosylresidu van N-acetyl-lactosamine (LacNAc,NHAc "N-acetyl-lactosaminyl" means the glycosyl residue of N-acetyl-lactosamine (LacNAc,

GalpB1-4GIcNAc), bij voorkeur verbonden met een B-binding: on CHGalpB1-4GlcNAc), preferably linked with a B bond: on CH

OH oOOH oO

HO o © %HO o © %

OH HOOH HO

NHAcNHAc

Verder betekent de term ”lacto-N-biosyl” het glycosylresidu van lacto-N-biose (LNB,Furthermore, the term "lacto-N-biosyl" means the glycosyl residue of lacto-N-biose (LNB,

GalpB1-3GIcNAc), bij voorkeur verbonden met een B-binding:GalpB1-3GlcNAc), preferably linked with a B bond:

OH OH OHOH OH OH

Q HO Q %Q HO Q %

HO OHO O

De term ”biomassa”, in de context van fermentatie, verwijst naar de gesuspendeerde, neergeslagen of onoplosbare materialen afkomstig van fermentatiecellen, zoals intacte cellen, ontregelde cellen, celfragmenten, eiwitten, eiwitfragmenten, polysachariden.The term "biomass", in the context of fermentation, refers to the suspended, precipitated or insoluble materials derived from fermentation cells, such as intact cells, disordered cells, cell fragments, proteins, protein fragments, polysaccharides.

De term ”Brix” verwijst naar graden Brix, d.w.z. het suikergehalte van een waterige oplossing (g suiker in 100 g oplossing). In dit verband verwijst de Brix van een moedermelkoligosacharideoplossing van deze toepassing naar het totale koolhydraatgehalte van de oplossing, inclusief de moedermelkoligosachariden en de begeleidende koolhydraten.The term "Brix" refers to degrees Brix, i.e. the sugar content of an aqueous solution (g of sugar in 100 g of solution). In this context, the Brix of a breast milk oligosaccharide solution of this application refers to the total carbohydrate content of the solution, including the breast milk oligosaccharides and accompanying carbohydrates.

Brix wordt met een geijkte refractometer gemeten. ”Demineralisatie” betekent bij voorkeur een proces voor het verwijderen van mineralen of minerale zouten uit een vloeistof. In de context van deze uitvinding kan de demineralisatie plaatsvinden in de nanofiltratiestap, vooral wanneer die wordt gecombineerd met diafiltratie of door kation- en anionenwisselingsharsen te gebruiken (indien van toepassing).Brix is measured with a calibrated refractometer. “Demineralization” preferably means a process of removing minerals or mineral salts from a fluid. In the context of this invention, the demineralization can take place in the nanofiltration step, especially when combined with diafiltration or by using cation and anion exchange resins (if applicable).

De term ”eiwitvrij waterig medium” betekent bij voorkeur een waterig medium of een waterige bouillon, afkomstig van een fermentatie- of enzymatisch proces dat een neutraal of gesialyleerd HMO oplevert en dat is behandeld voor de verwijdering van nagenoeg alle eiwitten en peptiden, peptidefragmenten, RNA's en DNA's en endotoxinen en glycolipiden die de uiteindelijke zuivering van een of meerdere neutrale of gesialyleerde HMO's en/of een of meerdere bestanddelen ervan, met name het mengsel ervan, uit de fermentatiebouillon of het enzymatische procesmengsel zouden kunnen hinderen.The term "protein-free aqueous medium" preferably means an aqueous medium or broth derived from a fermentation or enzymatic process that yields a neutral or sialylated HMO and that has been treated to remove substantially all proteins and peptides, peptide fragments, RNAs and DNAs and endotoxins and glycolipids that could interfere with the final purification of one or more neutral or sialylated HMOs and/or one or more components thereof, especially their mixture, from the fermentation broth or enzymatic process mixture.

De term ”HMO-bevattende stroom” betekent een waterig medium dat neutrale of gesialyleerde HMO's bevat die zijn verkregen uit een fermentatieproces en dat is behandeld om gesuspendeerde deeltjes en verontreinigingen uit het proces te verwijderen, met name cellen, celbestanddelen, onoplosbare metabolieten en afval dat de uiteindelijke zuivering van een of meerdere neutrale of gesialyleerde HMO's en/of een of meerdere bestanddelen ervan, met name mengels ervan, zouden kunnen hinderen.The term “HMO-containing stream” means an aqueous medium containing neutral or sialylated HMOs obtained from a fermentation process and treated to remove process suspended particulates and contaminants, in particular cells, cell components, insoluble metabolites, and wastes that could interfere with the final purification of one or more neutral or sialylated HMOs and/or one or more components thereof, especially mixtures thereof.

De term ”biomassa-afvalstroom” betekent bij voorkeur gesuspendeerde deeltjes en verontreinigingen van het fermentatieproces, met name cellen, celbestanddelen, onoplosbare metabolieten en afval.The term “biomass waste stream” preferably means suspended particles and contaminants from the fermentation process, in particular cells, cell components, insoluble metabolites and waste.

De afstotingsfactor van een zout (in procent) wordt berekend als (1-kp/kr)-100, waarbij kp het geleidingsvermogen van het zout in het permeaat en kr het geleidingsvermogen van het zout in het retentaat is.The repellency factor of a salt (in percent) is calculated as (1-kp/kr)-100, where kp is the conductivity of the salt in the permeate and kr is the conductivity of the salt in the retentate.

De afstotingsfactor van een koolhydraat (in procent) wordt berekend als (1-Cp/Cr)-100, waarbij Cp de concentratie van het koolhydraat in het permeaat en C, de concentratie van het koolhydraat in het retentaat is.The rejection factor of a carbohydrate (in percent) is calculated as (1-Cp/Cr)-100, where Cp is the concentration of the carbohydrate in the permeate and C, the concentration of the carbohydrate in the retentate.

De term ”diafiltratie” verwijst naar de toevoeging van oplosmiddel (water) tijdens het membraanfiltratieproces. Als diafiltratie tijdens ultrafiltratie wordt toegepast, verbetert dit het rendement van de gewenste HMO in het permeaat. Als diafiltratie tijdens nanofiltratie wordt toegepast, verbetert dit de scheiding van kleinschalige onzuiverheden en zouten naar het permeaat. Het rendement van de opgeloste stof en dus de verrijking van het product kunnen worden berekend aan de hand van de formules die de professional kent op basis van de afstotingsfactoren en de relatieve hoeveelheid toegevoegd water.The term "diafiltration" refers to the addition of solvent (water) during the membrane filtration process. If diafiltration is used during ultrafiltration, this improves the yield of the desired HMO in the permeate. If diafiltration is applied during nanofiltration, this improves the separation of small-scale impurities and salts to the permeate. The efficiency of the solute and thus the enrichment of the product can be calculated using the formulas known to the professional based on the rejection factors and the relative amount of water added.

De term ”concentreren”, zoals gebruikt in stap d) van de methode volgens de uitvinding, verwijst naar de verwijdering van vloeistof, meestal water, waardoor een hogere concentratie van een neutrale of gesialyleerde HMO in de gezuiverde HMO-bevattende productstroom ontstaat. 2. Methode voor de zuivering van neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosachariden uit een fermentatiebouillonThe term "concentrate", as used in step d) of the method according to the invention, refers to the removal of liquid, usually water, resulting in a higher concentration of a neutral or sialylated HMO in the purified HMO-containing product stream. 2. Method for Purification of Neutral or Sialylated Breastmilk Oligosaccharides from a Fermentation Broth

De uitvinding heeft betrekking op een methode voor de terugwinning en de zuivering van een neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide (HMO) uit een fermentatiebouillon, die bestaat uit de volgende stappen: a. de voorziening van een HMO-bevattende fermentatiebouillon en al. de scheiding van de fermentatiebouillon om een gescheiden HMO-bevattende stroom en een biomassa-afvalstroom te vormen;The invention relates to a method for the recovery and purification of a neutral or sialylated breast milk oligosaccharide (HMO) from a fermentation broth, which consists of the following steps: a. the provision of a HMO-containing fermentation broth and al. the separation of the fermentation broth to form a separated HMO-containing stream and a biomass waste stream;

“U BE2022/5467 of a2. de voorbehandeling van de fermentatiebouillon door pH-aanpassing, verdunning en/of warmtebehandeling; b. de behandeling van de gescheiden HMO-bevattende stroom van stap al) of de voorbehandelde fermentatiebouillon volgens stap a2) met actieve koolstof om een“U BE2022/5467 or a2. the pre-treatment of the fermentation broth by pH adjustment, dilution and/or heat treatment; b. treating the separated HMO-containing stream from step a1) or the pre-treated fermentation broth according to step a2) with active carbon to obtain a

Bij voorkeur bestaat de methode volgens de uitvinding uit een opeenvolging van stappen bestaande uit de stappen al), b), c), d) en e).Preferably, the method according to the invention consists of a sequence of steps consisting of steps a1), b), c), d) and e).

Bij voorkeur bestaat de methode volgens de uitvinding uit een opeenvolging van stappen bestaande uit de stappen a2), b), c), d) en e).Preferably, the method according to the invention consists of a succession of steps consisting of steps a2), b), c), d) and e).

Bij voorkeur bevat de methode geen behandeling met een ionenwisselaarshars, maar in teder geval geen behandeling met basisch anionenwisselaarshars.Preferably, the method does not include treatment with an ion-exchange resin, but in any case no treatment with basic anion-exchange resin.

Bij voorkeur is een behandeling met ionenwisselaarshars, maar in ieder geval een behandeling met basische anionenwisselaarshars, uitgesloten van de methode volgens de uitvinding.Preferably a treatment with ion exchange resin, but in any case a treatment with basic anion exchange resin, is excluded from the method according to the invention.

Bij voorkeur bestaat de methode volgens de uitvinding uit de stappen al), b), c), d) en e).The method according to the invention preferably consists of steps a), b), c), d) and e).

Bij voorkeur bestaat de methode volgens de uitvinding uit de stappen a2), b), c), d) en e).The method according to the invention preferably consists of steps a2), b), c), d) and e).

Bij voorkeur worden de methodestappen al), b), c), d) en e) uitgevoerd in de opeenvolgende volgorde al), b), c), d) en e) zoals hierboven aangegeven.Preferably, the method steps a1), b), c), d) and e) are performed in the sequential order a1), b), c), d) and e) as indicated above.

Bij voorkeur worden de methodestappen a2), b), c), d) en e) uitgevoerd in de opeenvolgende volgorde a2), b), c), d) en e) zoals hierboven aangegeven.Preferably, the method steps a2), b), c), d) and e) are performed in the sequential order a2), b), c), d) and e) as indicated above.

De fermentatiebouillon:The fermentation broth:

In een uitvoering werd de neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide in de fermentatiebouillon verkregen door het kweken van een genetisch gemodificeerd micro- organisme dat in staat is om deze neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide te produceren uit een geïnternaliseerde koolhydraatprecursor. Bij voorkeur is het microbiële organisme een genetisch gemodificeerde bacterie of gist, zoals een E. coli-stam, een Bacillus- stam, een Saccharomyces-stam, een Candida-stam, een Hansenula-stam, een Kluyveromyces- stam, een Pichia-stam, een Schizosaccharomyces-stam, een Schwanniomyces-stam, eenIn one embodiment, the neutral or sialylated breast milk oligosaccharide in the fermentation broth was obtained by culturing a genetically modified microorganism capable of producing this neutral or sialylated breast milk oligosaccharide from an internalized carbohydrate precursor. Preferably, the microbial organism is a genetically modified bacteria or yeast, such as an E. coli strain, a Bacillus strain, a Saccharomyces strain, a Candida strain, a Hansenula strain, a Kluyveromyces strain, a Pichia strain , a Schizosaccharomyces strain, a Schwanniomyces strain, a

Torulaspora-stam, een Yarrowia-stam of een Zygosaccharomyces-stam. Nog meer bij voorkeur is de gist Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis,Torulaspora strain, a Yarrowia strain or a Zygosaccharomyces strain. Even more preferably, the yeast is Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis,

Kluyveromyces marxianus, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia stipites, Candida boidinii, Schizosaccharomyces pombe, Schwanniomyces occidentalis, Torulaspora delbrueckii, Yarrowia lipolytica, Zygosaccharomyces rouxii of Zygosaccharomyces bailii; en de Bacillus is Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis of Bacillus subtilis.Kluyveromyces marxianus, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia stipites, Candida boidinii, Schizosaccharomyces pombe, Schwanniomyces occidentalis, Torulaspora delbrueckii, Yarrowia lipolytica, Zygosaccharomyces rouxii or Zygosaccharomyces bailii; and the Bacillus is Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis or Bacillus subtilis.

Ineen uitvoering is minstens één neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide aanwezig in de fermentatiebouillon niet verkregen door microbiële fermentatie, maar is het bijvoorbeeld aan de fermentatiebouillon toegevoegd nadat het is geproduceerd door een niet- microbiële methode, bijvoorbeeld chemische en/of enzymatische synthese.In one embodiment, at least one neutral or sialylated breast milk oligosaccharide present in the fermentation broth has not been obtained by microbial fermentation, but has been added to the fermentation broth, for example, after it has been produced by a non-microbial method, e.g., chemical and/or enzymatic synthesis.

In een uitvoering is de zuiverheid van de neutrale of gesialyleerde HMO in de fermentatiebouillon <70 %, bij voorkeur <60 %, nog meer bij voorkeur <50 %, meest bij voorkeur <40 %. In de context van de zuiverheid van HMO of HMO's in een oplossing of in een uiteindelijke gestolde vorm wordt het percentage in deze specificatie geïnterpreteerd als massaprocent. De zuiverheid kan worden bepaald met behulp van bekende conventionele analyseprotocollen, bij voorkeur met HPLC.In one embodiment, the purity of the neutral or sialylated HMO in the fermentation broth is <70%, preferably <60%, even more preferably <50%, most preferably <40%. In the context of the purity of HMO or HMOs in a solution or in a final solidified form, the percentage in this specification is interpreted as a mass percent. Purity can be determined using known conventional analysis protocols, preferably by HPLC.

De HMO is bij voorkeur een neutrale HMO. In een uitvoering wordt de neutrale HMO bij voorkeur gekozen uit de groep bestaande uit 2'-fucosyllactose, 3-fucosyllactose, 2',3- difucosyllactose, lacto-N-triose II, lacto-N-tetraose, lacto-N-neotetraose, lacto-N- fucopentaose I, lacto-N-fucopentaose II, lacto-N-fucopentaose III, lacto-N-fucopentaose V, lacto-N-neofucopentaose V (alternatieve naam: lacto-N-fucopentaose VI), lacto-N- difucohexaose I, lacto-N-difucohexaose II, lacto-N-difucohexaose III, 6'-galactosyllactose, 3'- galactosyllactose, lacto-N-hexaose, lacto-N-neohexaose en elk mengsel daarvan. Nog meer bij voorkeur is de HMO 2'-fucosyllactose, 3-fucosyllactose, 2',3-difucosyllactose, lacto-N- triose IL, lacto-N-tetraose, lacto-N-neotetraose of een lacto-N-fucopentaose, meer bij voorkeur 2'-fucosyllactose, LNT, LNnT of een lacto-N-fucopentaose.The HMO is preferably a neutral HMO. In one embodiment, the neutral HMO is preferably selected from the group consisting of 2'-fucosyllactose, 3-fucosyllactose, 2',3-difucosyllactose, lacto-N-triose II, lacto-N-tetraose, lacto-N-neotetraose, lacto-N-fucopentaose I, lacto-N-fucopentaose II, lacto-N-fucopentaose III, lacto-N-fucopentaose V, lacto-N-neofucopentaose V (alternative name: lacto-N-fucopentaose VI), lacto-N- difucohexaose I, lacto-N-difucohexaose II, lacto-N-difucohexaose III, 6'-galactosyllactose, 3'-galactosyllactose, lacto-N-hexaose, lacto-N-neohexaose, and any mixture thereof. Even more preferably, the HMO is 2'-fucosyllactose, 3-fucosyllactose, 2',3-difucosyllactose, lacto-N-triose IL, lacto-N-tetraose, lacto-N-neotetraose or a lacto-N-fucopentaose, more preferably 2'-fucosyllactose, LNT, LNnT or a lacto-N-fucopentaose.

In een uitvoering wordt de gesialyleerde HMO gekozen uit de groep bestaande uit 3'- sialyllactose (3'-SL) en 6'-sialyllactose (6'-SL).In one embodiment, the sialylated HMO is selected from the group consisting of 3'-sialyl lactose (3'-SL) and 6'-sialyl lactose (6'-SL).

In een uitvoering 1s de neutrale of gesialyleerde HMO in de fermentatiebouillon één enkele neutrale of gesialyleerde HMO.In an embodiment, the neutral or sialylated HMO in the fermentation broth is a single neutral or sialylated HMO.

In een uitvoering is de neutrale of gesialyleerde HMO in de fermentatiebouillon een mengsel van verschillende afzonderlijke neutrale of gesialyleerde HMO's.In one embodiment, the neutral or sialylated HMO in the fermentation broth is a mixture of several individual neutral or sialylated HMOs.

In een uitvoering is de neutrale of gesialyleerde HMO een mengsel van twee afzonderlijke neutrale of gesialyleerde HMO's. In een andere uitvoering is de neutrale of gesialyleerdeIn one embodiment, the neutral or sialylated HMO is a mixture of two separate neutral or sialylated HMOs. In another embodiment, the is neutral or sialylated

HMO een mengsel van drie afzonderlijke neutrale of gesialyleerde HMO's. In een andere uitvoering is de neutrale of gesialyleerde HMO een mengsel van vier afzonderlijke neutrale of gesialyleerde HMO's. In een andere uitvoering is de neutrale of gesialyleerde HMO een mengsel van vijf afzonderlijke neutrale of gesialyleerde HMO's.HMO a mixture of three separate neutral or sialylated HMOs. In another embodiment, the neutral or sialylated HMO is a mixture of four individual neutral or sialylated HMOs. In another embodiment, the neutral or sialylated HMO is a mixture of five individual neutral or sialylated HMOs.

In een uitvoering is de neutrale of gesialyleerde HMO in de fermentatiebouillon een mengsel van een neutrale of gesialyleerde HMO die door microbiële fermentatie is verkregen en een neutrale of gesialyleerde HMO die niet door microbiële fermentatie is verkregen, maar bijv. door chemische en/of enzymatische synthese.In one embodiment, the neutral or sialylated HMO in the fermentation broth is a mixture of a neutral or sialylated HMO obtained by microbial fermentation and a neutral or sialylated HMO not obtained by microbial fermentation, but e.g. by chemical and/or enzymatic synthesis .

De scheiding van de fermentatiebouillon om een gescheiden neutrale of gesialyleerde HMO- bevattende stroom en een biomassa-afvalstroom te vormen in stap al) van de methode volgens de uitvindingThe separation of the fermentation broth to form a separated neutral or sialylated HMO-containing stream and a biomass waste stream in step al) of the method according to the invention

Instap al) van de methode volgens de uitvinding wordt de neutrale of gesialyleerde HMO- bevattende stroom van de biomassa-afvalstroom gescheiden.In step al) of the method according to the invention, the neutral or sialylated HMO-containing stream is separated from the biomass waste stream.

De fermentatiebouillon bevat doorgaans, naast de gewenste neutrale of gesialyleerde HMO, de biomassa van de cellen van het gebruikte micro-organisme samen met eiwitten, eiwitfragmenten, peptiden, DNA's, RNA's, endotoxinen, biogene aminen, aminozuren, organische zuren, anorganische zouten, niet-gereageerde koolhydraatacceptoren zoals lactose, suikerachtige bijproducten, monosachariden, kleurstoffen enz. In stap a) van de methode volgens de uitvinding moet de biomassa van de neutrale of gesialyleerde HMO worden gescheiden.The fermentation broth usually contains, in addition to the desired neutral or sialylated HMO, the biomass of the cells of the microorganism used together with proteins, protein fragments, peptides, DNAs, RNAs, endotoxins, biogenic amines, amino acids, organic acids, inorganic salts, not -reacted carbohydrate acceptors such as lactose, sugary by-products, monosaccharides, dyes, etc. In step a) of the method according to the invention, the biomass must be separated from the neutral or sialylated HMO.

Bij voorkeur wordt de biomassa van de neutrale of gesialyleerde HMO in stap al) gescheiden door microfiltratie. De microfiltratiestap is bedoeld om de biomassa en, bij voorkeur, ook de hoogmoleculaire bestanddelen en gesuspendeerde vaste stoffen te scheiden van de laagmoleculaire oplosbare bestanddelen van de bouillon, die door het microfiltratiemembraan in het permeaat gaan. Dit microfiltratiepermeaat is een waterige oplossing die de neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide bevat, ook wel de HMO-bevattende stroom genoemd, terwijl het microfiltratieretentaat de biomassa-afvalstroom omvat. Elk conventioneel microfiltratemembraan met een poriegrootte van 0,1 tot 10 um kan worden gebruikt. Stap 1) van de methode volgens de uitvinding kan meer dan één microfiltratiestap met membranen met een verschillende poriegrootte bevatten, bijvoorbeeld met toepassing van twee microfiltratiescheidingen, waarbij het eerste membraan een grotere poriegrootte heeft dan het tweede membraan. Deze opstelling kan zorgen voor een betere scheidingsefficiëntie van de bestanddelen met een hoger molecuulgewicht van de bouillon. Na deze scheidingsstap bevat het permeaat de neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosachariden die van belang zijn.Preferably, the biomass is separated from the neutral or sialylated HMO in step a1) by microfiltration. The microfiltration step is intended to separate the biomass and, preferably, also the high molecular weight components and suspended solids from the low molecular weight soluble components of the broth, which pass through the microfiltration membrane into the permeate. This microfiltration permeate is an aqueous solution containing the neutral or sialylated breast milk oligosaccharide, also referred to as the HMO-containing stream, while the microfiltration retentate comprises the biomass waste stream. Any conventional microfiltrate membrane with a pore size of 0.1 to 10 µm can be used. Step 1) of the method according to the invention may contain more than one microfiltration step with membranes of different pore size, for example using two microfiltration separations, the first membrane having a larger pore size than the second membrane. This arrangement can provide better separation efficiency of the higher molecular weight components of the broth. After this separation step, the permeate contains the neutral or sialylated breast milk oligosaccharides of interest.

In een andere voorkeursuitvoering wordt de biomassa in stap al) door ultrafiltratie gescheiden van de neutrale of gesialyleerde HMO. De ultrafiltratiestap is bedoeld om de biomassa en, bij voorkeur, ook de hoogmoleculaire bestanddelen en gesuspendeerde vaste stoffen te scheiden van de laagmoleculaire oplosbare bestanddelen van de bouillon, die door het ultrafiltratiemembraan in het permeaat gaan. Dit ultrafiltratiepermeaat is een waterige oplossing die de neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide bevat, ook wel deIn another preferred embodiment, the biomass is separated from the neutral or sialylated HMO in step al) by ultrafiltration. The ultrafiltration step is intended to separate the biomass and, preferably, also the high molecular weight components and suspended solids from the low molecular weight soluble components of the broth, which pass through the ultrafiltration membrane into the permeate. This ultrafiltration permeate is an aqueous solution containing the neutral or sialylated breast milk oligosaccharide, also known as the

HMO-bevattende stroom genoemd, terwijl het ultrafiltratieretentaat de biomassa-afvalstroom omvat.Called HMO-containing stream, while the ultrafiltration retentate comprises the biomass waste stream.

Elk conventioneel ultrafiltratiemembraan met een molecuulgewicht cut-off (MWCO) tussen ongeveer 1 en ongeveer 500 kDa, zoals 10-250, 50-100, 200-500, 100-250, 1-100, 1-50, 10- 25, 1-5 kDa of een ander geschikt subbereik kan worden gebruikt. Het membraanmateriaal kan keramisch zijn of gemaakt zijn van een synthetisch of natuurlijk polymeer, bijv. polysulfon, polyvinylideenfluoride, polyacrylonitril, polypropyleen, cellulose, celluloseacetaat of polymelkzuur. De ultrafiltratiestap kan in doodlopende of doorstromingsmodus worden toegepast. Stap al) van de methode volgens de uitvinding kan meer dan één ultrafiltratiestap met membranen met een verschillende MWCO bevatten, bijvoorbeeld met toepassing van twee ultrafiltratiescheidingen, waarbij het eerste membraan een hogere MWCO heeft dan het tweede membraan. Deze opstelling kan zorgen voor een betere scheidingsefficiëntie van de bestanddelen met een hoger molecuulgewicht van de bouillon. Na deze scheidingsstap bevat het permeaat materialen met een molecuulgewicht dat lager is dan de MWCO van het tweede membraan, inclusief de neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosachariden die van belang zijn.Any conventional ultrafiltration membrane with a molecular weight cut-off (MWCO) between about 1 and about 500 kDa, such as 10-250, 50-100, 200-500, 100-250, 1-100, 1-50, 10-25, 1 -5 kDa or other suitable subrange can be used. The membrane material may be ceramic or made of a synthetic or natural polymer, e.g. polysulphone, polyvinylidene fluoride, polyacrylonitrile, polypropylene, cellulose, cellulose acetate or polylactic acid. The ultrafiltration step can be used in dead-end or flow-through mode. Step al) of the method according to the invention may contain more than one ultrafiltration step with membranes of different MWCO, for example using two ultrafiltration separations, the first membrane having a higher MWCO than the second membrane. This arrangement can provide better separation efficiency of the higher molecular weight components of the broth. After this separation step, the permeate contains materials with molecular weights less than the MWCO of the second membrane, including the neutral or sialylated breast milk oligosaccharides of interest.

In een uitvoering wordt de fermentatiebouillon ultragefiltreerd met een membraan met eenIn one embodiment, the fermentation broth is ultrafiltered with a membrane containing a

MWCO van 5 tot 30 kDa, zoals 10-25, 15 of 20 kDa.MWCO from 5 to 30 kDa, such as 10-25, 15 or 20 kDa.

Bij voorkeur is het rendement van de gewenste neutrale of gesialyleerde HMO in het permeaat na de ultrafiltratiestap hoger dan 50 %, hoger dan 60 %, hoger dan 70 %, hoger dan 80 %, hoger dan 90 %, hoger dan 91 %, hoger dan 92 %, hoger dan 93 %, hoger dan 94 %, hoger dan 95 %, hoger dan 96 %, hoger dan 97 %, hoger dan 98 %, of hoger dan 99 %.Preferably, the yield of the desired neutral or sialylated HMO in the permeate after the ultrafiltration step is greater than 50%, greater than 60%, greater than 70%, greater than 80%, greater than 90%, greater than 91%, greater than 92%, greater than 93%, greater than 94%, greater than 95%, greater than 96%, greater than 97%, greater than 98%, or greater than 99%.

In een andere uitvoering wordt de door fermentatie verkregen bouillon onderworpen aan centrifugatie om de biomassa in stap al) van de methode volgens de uitvinding van de neutrale of gesialyleerde HMO (HMO-bevattende stroom) te scheiden. In deze uitvoering vertegenwoordigt het supernatans de HMO-bevattende stroom, terwijl het resterende materiaal, d.w.z. de ”biomassa-afvalstroom”, kan worden gescheiden. Door centrifugatie kan een helder supernatans met de neutrale of gesialyleerde HMO worden verkregen, die deIn another embodiment, the broth obtained by fermentation is subjected to centrifugation to separate the biomass in step a1) of the method according to the invention from the neutral or sialylated HMO (HMO-containing stream). In this embodiment, the supernatant represents the HMO-containing stream, while the remaining material, i.e. the "biomass waste stream", can be separated. By centrifugation, a clear supernatant containing the neutral or sialylated HMO can be obtained, which contains the

HMO-bevattende stroom vormt.HMO-containing stream forms.

De centrifugatie kan op laboratoriumschaal of, bij voorkeur over eerdere centrifugeermethoden, op commerciële schaal (bijv. industriële schaal, volledige productieschaal) plaatsvinden.The centrifugation can be done on a laboratory scale or, preferably over previous centrifugation methods, on a commercial scale (e.g., industrial scale, full production scale).

In sommige uitvoeringen kan een centrifugatie in meerdere stappen worden gebruikt. Er kan bijvoorbeeld een reeks van 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 of 10 centrifugatiestappen worden uitgevoerd.In some embodiments, multi-stage centrifugation may be used. For example, a series of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 centrifugation steps can be performed.

In andere uitvoeringen kan de centrifugatie in één enkele stap gebeuren. De centrifugatie zorgt voor een snelle verwijdering van de biomassa.In other embodiments, the centrifugation can be done in a single step. The centrifugation ensures rapid removal of the biomass.

In bepaalde uitvoeringen kan een Sedicanter®-centrifuge, ontworpen en geproduceerd doorIn certain versions, a Sedicanter® centrifuge, designed and manufactured by

Flottweg, worden gebruikt.Flottweg, are used.

Dit specifieke type centrifuge is niet beperkend. Er kunnen vele types centrifuges worden gebruikt. Het centrifugeren kan een continu proces zijn. In sommige uitvoeringen kan het centrifugeren een toevoer hebben. Het centrifugeren kan bijvoorbeeld een continue toevoer hebben. In bepaalde uitvoeringen kan het centrifugeren een verwijdering van vaste stoffen omvatten, zoals de verwijdering van natte vaste stoffen. De verwijdering van natte vaste stoffen kan in sommige implementaties continu en in andere implementaties periodiek zijn.This specific type of centrifuge is not limiting. Many types of centrifuges can be used. Centrifugation can be a continuous process. In some embodiments, the spin may have a feed. For example, the centrifuge may have a continuous feed. In certain embodiments, the centrifugation may include solids removal, such as wet solids removal. Wet solids removal may be continuous in some implementations and intermittent in others.

Er kan bijvoorbeeld een conische plaatcentrifuge (bijv. schijkomcentrifuge of schijfstapelscheider) worden gebruikt. De conische plaatcentrifuge kan worden gebruikt om vaste stoffen (doorgaans onzuiverheden) uit vloeistoffen te verwijderen of om twee vloeistoffasen met een grote centrifugale kracht van elkaar te scheiden. De dichtere vaste stoffen of vloeistoffen die aan deze krachten worden onderworpen, bewegen zich naar buiten in de richting van de draaiende komwand, terwijl de minder dichte vloeistoffen zich naar het midden bewegen. De speciale platen (bekend als schijfstapels) vergroten het bezinkingsoppervlak waardoor het scheidingsproces sneller verloopt. Voor verschillende processen worden verschillende stapelontwerpen, schikkingen en vormen gebruikt, afhankelijk van het aanwezige type voeder. De geconcentreerde dichtere vaste stof of vloeistof kan dan continu handmatig of met tussenpozen worden verwijderd, afhankelijk van het ontwerp van de conische plaatcentrifuge. Deze centrifuge is zeer geschikt voor het klaren van vloeistoffen met een kleine hoeveelheid gesuspendeerde vaste stoffen.For example, a conical plate centrifuge (e.g. disc centrifuge or disc stack separator) can be used. The conical plate centrifuge can be used to remove solids (usually impurities) from liquids or to separate two liquid phases with high centrifugal force. The denser solids or liquids subjected to these forces move outward toward the rotating bowl wall, while the less dense fluids move toward the center. The special plates (known as disc stacks) increase the settling surface making the separation process faster. Different stack designs, arrangements and shapes are used for different processes, depending on the type of feed present. The concentrated denser solid or liquid can then be manually removed continuously or intermittently, depending on the design of the conical plate centrifuge. This centrifuge is very suitable for clarifying liquids with a small amount of suspended solids.

De centrifuge werkt volgens het principe van de hellende plaat. Een reeks parallelle platen met een kantelhoek 6 ten opzichte van het horizontale vlak wordt geïnstalleerd om de afstand van de deeltjesbezinking te verkleinen. De reden voor de schuine hoek is dat de neergeslagen vaste stoffen op de platen door de centrifugale kracht naar beneden kunnen glijden, zodat ze zich niet ophopen en het kanaal tussen de aangrenzende platen verstoppen.The centrifuge works on the principle of the inclined plate. A series of parallel plates with a tilt angle of 6 relative to the horizontal plane are installed to reduce the particle settling distance. The reason for the slant angle is that the settled solids on the plates can slide down through the centrifugal force, so that they do not accumulate and clog the channel between the adjacent plates.

Dit type centrifuge bestaat in verschillende ontwerpen, zoals met nozzle, handmatige reiniging, zelfreiniging en hermetisch. De specifieke centrifuge is niet beperkend.This type of centrifuge comes in different designs, such as with nozzle, manual cleaning, self-cleaning and hermetic. The specific centrifuge is not limiting.

Factoren met een invloed op de centrifuge zijn onder andere de schijfhoek, het effect van de g-kracht, de schijfafstand, de toegevoerde vaste stoffen, de hoek van de kegel voor de afvoer, de afvoerfrequentie en de vloeistofafvoer.Factors affecting the centrifuge include disc angle, effect of g-force, disc spacing, solids input, angle of discharge cone, discharge frequency, and liquid discharge.

Als alternatief kan een centrifuge met vaste kom (bijv. een decanteercentrifuge) worden gebruikt. Dit is een soort centrifuge volgens het sedimentatieprincipe. Een centrifuge wordt gebruikt om een mengsel van twee substanties met verschillende dichtheid te scheiden door de centrifugale kracht als gevolg van de voortdurende rotatie te gebruiken. Hij wordt doorgaans gebruikt voor het scheiden van mengsels van een vaste stof en een vloeistof, twee vloeistoffen en twee vaste stoffen. Een voordeel van centrifuges met vaste kommen voor industrieel gebruik is de eenvoud van de installatie in vergelijking met andere soorten centrifuges. Er zijn drie ontwerptypes van centrifuges met vaste kommen, namelijk conisch, cilindrisch en conisch-cilindrisch.Alternatively, a fixed bowl centrifuge (e.g. a decanter centrifuge) can be used. This is a kind of centrifuge according to the sedimentation principle. A centrifuge is used to separate a mixture of two substances with different densities by using the centrifugal force resulting from the continuous rotation. It is typically used for separating mixtures of a solid and a liquid, two liquids and two solids. An advantage of fixed bowl centrifuges for industrial use is the simplicity of installation compared to other types of centrifuges. There are three design types of fixed bowl centrifuges namely conical, cylindrical and conical-cylindrical.

Centrifuges met vaste kommen kunnen een aantal verschillende ontwerpen hebben, die allemaal voor de beschreven methode kunnen worden gebruikt. Er kunnen bijvoorbeeld conische centrifuges met vaste kom, cilindrische centrifuges met vaste kom en conisch- cilindrische centrifuges met vaste kom worden gebruikt.Fixed bowl centrifuges can have a number of different designs, all of which can be used for the described method. For example, conical fixed bowl centrifuges, cylindrical fixed bowl centrifuges, and conical-cylindrical fixed bowl centrifuges can be used.

Het centrifugeren kan met een aantal snelheden en verblijftijden worden uitgevoerd. Het centrifugeren kan bijvoorbeeld met een relatieve centrifugale kracht (RCF) van 20000 g, 15000 g, 10000 g of 5000 g worden uitgevoerd. In sommige uitvoeringen kan het centrifugeren met een relatieve centrifugale kracht (RCF) van minder dan 20000 g, 15000 g, 10000 g of 5000 g worden uitgevoerd. In sommige uitvoeringen kan het centrifugeren met een relatieve centrifugale kracht (RCF) van meer dan 20000 g, 15000 g, 10000 g of 5000 g worden uitgevoerd.Centrifugation can be performed at a number of speeds and residence times. Centrifugation can be performed, for example, with a relative centrifugal force (RCF) of 20000 g, 15000 g, 10000 g or 5000 g. In some embodiments, the centrifugation may be performed with a relative centrifugal force (RCF) of less than 20000 g, 15000 g, 10000 g or 5000 g. In some embodiments, the centrifugation may be performed with a relative centrifugal force (RCF) greater than 20000 g, 15000 g, 10000 g or 5000 g.

In sommige uitvoeringen kan het centrifugeren door het werkvolume worden gekarakteriseerd. In sommige uitvoeringen kan het werkvolume 1, 5, 10, 15, 20, 50, 100, 300, of 500 | zijn. In sommige uitvoeringen kan het werkvolume minder dan 1, 5, 10, 15, 20, 50, 100, 300, of 500 | zijn. In sommige uitvoeringen kan het werkvolume meer dan 1, 5, 10, 15, 20, 50, 100, 300, of 500 1 zijn.In some embodiments, centrifugation may be characterized by working volume. In some embodiments, the working volume can be 1, 5, 10, 15, 20, 50, 100, 300, or 500 | are. In some embodiments, the working volume may be less than 1, 5, 10, 15, 20, 50, 100, 300, or 500 | are. In some embodiments, the working volume may be more than 1, 5, 10, 15, 20, 50, 100, 300, or 500 1.

In sommige uitvoeringen kan het centrifugeren door het toevoerdebiet worden gekarakteriseerd. In sommige uitvoeringen kan het toevoerdebiet 100, 500, 1000, 1500, 2000,In some embodiments, the centrifugation can be characterized by the feed rate. In some versions the supply flow rate can be 100, 500, 1000, 1500, 2000,

5000, 10000, 20000, 40000, of 100000 l/uur zijn. In sommige uitvoeringen kan het toevoerdebiet meer dan 100, 500, 1000, 1500, 2000, 5000, 10000, 20000, 40000, of 1000005000, 10000, 20000, 40000, or 100000 l/h. In some versions, the feed rate can exceed 100, 500, 1000, 1500, 2000, 5000, 10000, 20000, 40000, or 100000

Vuur zijn. In sommige uitvoeringen kan het toevoerdebiet minder dan 100, 500, 1000, 1500, 2000, 5000, 10000, 20000, 40000, of 100000 l/uur zijn.be fire. In some embodiments, the feed rate may be less than 100, 500, 1000, 1500, 2000, 5000, 10000, 20000, 40000, or 100000 l/hr.

Detijd die aan centrifugeren wordt besteed (bijv. verblijftijd), kan ook variëren. De verblijftijd kan bijvoorbeeld 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, of 10 minuten zijn. In sommige uitvoeringen kan de verblijftijd meer dan 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, of 10 minuten zijn. In sommige uitvoeringen kan de verblijftijd minder dan 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, of 10 minuten zijn.The time spent on centrifugation (e.g. residence time) may also vary. For example, the residence time may be 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 minutes. In some embodiments, the residence time may be greater than 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 minutes. In some embodiments, the residence time may be less than 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5.6, 7, 8, 9, or 10 minutes.

Elk van de bovengenoemde eigenschappen van het supernatans kan door één keer centrifugeren worden verkregen. Ze kunnen ook door meerdere keren te centrifugeren worden geproduceerd.Any of the above properties of the supernatant can be obtained by centrifugation once. They can also be produced by centrifugation several times.

Gezien het bovenstaande kan stap al) van de methode volgens de uitvinding worden uitgevoerd via microfiltratie zoals hierboven gedefinieerd, ultrafiltratie zoals hierboven gedefinieerd of centrifugatie, of via een combinatie van: ultrafiltratie en centrifugatie, microfiltratie en ultrafiltratie, microfiltratie en centrifugatie, microfiltratie en ultrafiltratie en centrifugatie. Bij voorkeur wordt methodestap al) uitgevoerd door ultrafiltratie zoals hierboven gedefinieerd om de HMO-bevattende stroom te verkrijgen die van de biomassa- afvalstroom 1s gescheiden.In view of the above, step al) of the method according to the invention can be performed via microfiltration as defined above, ultrafiltration as defined above or centrifugation, or via a combination of: ultrafiltration and centrifugation, microfiltration and ultrafiltration, microfiltration and centrifugation, microfiltration and ultrafiltration and centrifugation. Preferably, method step a1) is performed by ultrafiltration as defined above to obtain the HMO-containing stream separated from the biomass waste stream 1s.

Bij voorkeur is het rendement van de gewenste neutrale of gesialyleerde HMO in het permeaat/supernatans na de microfiltratie-, ultrafiltratie- of centrifugatiestap, of een combinatie daarvan, uitgevoerd in stap a) groter dan 50 %, groter dan 60 %, groter dan 70 %, groter dan 80 %, groter dan 90 %, groter dan 91 %, groter dan 92 %, groter dan 93 %, groter dan 94 %, groter dan 95 %, groter dan 96 %, groter dan 97 %, groter dan 98 %, of groter dan 99 %.Preferably, the yield of the desired neutral or sialylated HMO in the permeate/supernatant after the microfiltration, ultrafiltration or centrifugation step, or a combination thereof, performed in step a) is greater than 50%, greater than 60%, greater than 70 %, greater than 80%, greater than 90%, greater than 91%, greater than 92%, greater than 93%, greater than 94%, greater than 95%, greater than 96%, greater than 97%, greater than 98 %, or greater than 99 %.

Voor de microfiltratie- en/of de ultrafiltratie- en/of de centrifugatiestap kan de fermentatiebouillon aan een voorbehandelingsstap worden onderworpen. De voorbehandeling van de fermentatiebouillon kan een aanpassing van de pH en/of een verdunning en/of een warmtebehandeling omvatten. In bepaalde implementaties kunnen de aanpassing van de pH, de verdunning en de warmtebehandeling allemaal worden uitgevoerd. In alternatieve uitvoeringen kunnen de aanpassing van de pH en de verdunning worden uitgevoerd. In alternatieve uitvoeringen kunnen de aanpassing van de pH en de warmtebehandeling worden uitgevoerd. In alternatieve uitvoeringen kunnen de warmtebehandeling en de verdunning worden uitgevoerd. Een combinatie van verschillende voorbehandelingsmethoden kan een verbeterd synergetisch effect opleveren dat bij afzonderlijke voorbehandelingen niet wordt aangetroffen.Before the microfiltration and/or the ultrafiltration and/or the centrifugation step, the fermentation broth may be subjected to a pre-treatment step. The pre-treatment of the fermentation broth may include pH adjustment and/or dilution and/or heat treatment. In certain implementations, pH adjustment, dilution, and heat treatment can all be performed. In alternative embodiments, pH adjustment and dilution can be performed. In alternative embodiments, pH adjustment and heat treatment may be performed. In alternative embodiments, the heat treatment and dilution can be performed. A combination of different pre-treatment methods can provide an enhanced synergistic effect not found with separate pre-treatments.

In bepaalde uitvoeringen kunnen een of meerdere van de bovengenoemde voorbehandelingsstappen plaatsvinden tijdens de verwijdering van biomassa in stap al) door centrifugatie en/of ultrafiltratie en/of microfiltratie. Bijvoorbeeld tussen de stappen in een meerstapscentrifuge of het centrifugeervat kan de fermentatiebouillon tijdens het centrifugeren verwarmen.In certain embodiments, one or more of the above pretreatment steps can take place during the removal of biomass in step a1) by centrifugation and/or ultrafiltration and/or microfiltration. For example, between steps in a multi-stage centrifuge or the centrifuge vessel, the fermentation broth may heat during centrifugation.

De voorbehandeling kan de bezinkingssnelheid van de vaste deeltjes (biomassa) in de fermentatiebouillon met een factor van 100 tot 20000 verhogen, waardoor de scheiding van de biomassa door centrifugatie veel efficiënter wordt en dus op industriële schaal kan worden toegepast. Naast de bezinkingssnelheid worden door de voorbehandelingminstens drie andere parameters aanzienlijk verbeterd, namelijk een beter rendement van neutrale of gesialyleerdeThe pre-treatment can increase the sedimentation rate of the solid particles (biomass) in the fermentation broth by a factor of 100 to 20000, making the separation of the biomass by centrifugation much more efficient and thus applicable on an industrial scale. In addition to the sedimentation rate, the pre-treatment significantly improves at least three other parameters, namely a better yield of neutral or sialylated

HMO's in de HMO-bevattende stroom, een lager eiwit- en DNA-gehalte in het supernatans en een aanzienlijke verlaging van het gehalte aan residuen van gesuspendeerde vaste stoffen.HMOs in the HMO-containing stream, a lower protein and DNA content in the supernatant and a significant reduction in suspended solids residues.

Voorbehandeling van de fermentatiebouillon door aanpassing van de pH, verdunning en/of warmtebehandeling in stap a2) van de methode volgens de uitvindingPre-treatment of the fermentation broth by pH adjustment, dilution and/or heat treatment in step a2) of the method according to the invention

In stap a2) van de methode volgens de uitvinding wordt de fermentatiebouillon voorbehandeld door aanpassing van de pH, verdunning en/of warmtebehandeling.In step a2) of the method according to the invention, the fermentation broth is pre-treated by pH adjustment, dilution and/or heat treatment.

De fermentatiebouillon bevat doorgaans, naast de gewenste HMO, de biomassa van de cellen van het gebruikte micro-organisme samen met eiwitten, erwitfragmenten, peptiden, DNA's,The fermentation broth usually contains, in addition to the desired HMO, the biomass of the cells of the microorganism used together with proteins, pea fragments, peptides, DNAs,

RNA's, endotoxinen, biogene aminen, aminozuren, organische zuren, anorganische zouten, niet-gereageerde koolhydraatacceptoren zoals lactose, suikerachtige bijproducten, monosachariden, kleurstoffen enz. Deze onzuiverheden moeten zo volledig mogelijk van de gewenste HMO worden gescheiden.RNAs, endotoxins, biogenic amines, amino acids, organic acids, inorganic salts, unreacted carbohydrate acceptors such as lactose, sugary by-products, monosaccharides, dyes, etc. These impurities must be separated from the desired HMO as completely as possible.

Instap a2) van de methode volgens de uitvinding wordt de fermentatiebouillon voorbehandeld door aanpassing van de pH, verdunning en/of warmtebehandeling om de effectiviteit te verhogen en/of de volgende zuiveringsstappen te vereenvoudigen.In step a2) of the method according to the invention, the fermentation broth is pre-treated by adjusting the pH, dilution and/or heat treatment in order to increase the effectiveness and/or simplify the following purification steps.

De voorbehandeling van de fermentatiebouillon omvat een aanpassing van de pH en/of een verdunning en/of een warmtebehandeling. In bepaalde uitvoeringen worden de aanpassing van de pH, de verdunning en de warmtebehandeling allemaal uitgevoerd. In alternatieve uitvoeringen worden de aanpassing van de pH en de verdunning uitgevoerd. In alternatieve uitvoeringen worden de aanpassing van de pH en de warmtebehandeling uitgevoerd. In alternatieve uitvoeringen worden de warmtebehandeling en de verdunning uitgevoerd. Een combinatie van de bovengenoemde voorbehandelingen levert een verbeterd synergetisch effect op dat bij afzonderlijke voorbehandelingen niet wordt aangetroffen.The pre-treatment of the fermentation broth includes pH adjustment and/or dilution and/or heat treatment. In certain embodiments, pH adjustment, dilution, and heat treatment are all performed. In alternative embodiments, pH adjustment and dilution are performed. In alternative embodiments, pH adjustment and heat treatment are performed. In alternative embodiments, the heat treatment and dilution are performed. A combination of the above pre-treatments provides an enhanced synergistic effect not found with separate pre-treatments.

De voorbehandeling van de fermentatiebouillon in stap a2) van de methode volgens de uitvinding leidt tot een verbeterd HMO-rendement in de verdere zuiveringsstappen.The pre-treatment of the fermentation broth in step a2) of the method according to the invention leads to an improved HMO yield in the further purification steps.

Bovendien kan in de daaropvolgende zuiveringsstappen door toepassing van de voorbehandelingen een lager eiwit- en DNA-gehalte worden bereikt. Verder kunnen biomassa en gesuspendeerde vaste stoffen in de daaropvolgende zuiveringsstappen efficiënter worden verwijderd.In addition, a lower protein and DNA content can be achieved in the subsequent purification steps by applying the pre-treatments. Furthermore, biomass and suspended solids can be removed more efficiently in subsequent purification steps.

Bij voorkeur wordt de pH-waarde van de fermentatiebouillon ingesteld op een zure pH- waarde, zoals van 3 tot 6, bij voorkeur op een pH-waarde die niet hoger is dan 5, bij voorkeur niet hoger dan 4, en het meest bij voorkeur op een pH-waarde van 3 tot 4.Preferably, the pH value of the fermentation broth is adjusted to an acidic pH value, such as from 3 to 6, preferably to a pH value not higher than 5, preferably not higher than 4, and most preferably at a pH value of 3 to 4.

De pH van de fermentatiebouillon kan op elke geschikte manier worden verlaagd. Zo kan bijvoorbeeld een zuur aan de fermentatiebouillon worden toegevoegd om de pH-waarde van de fermentatiebouillon te verlagen. Dit kan een organisch of een anorganisch zuur zijn.The pH of the fermentation broth can be lowered in any convenient way. For example, an acid can be added to the fermentation broth to lower the pH value of the fermentation broth. This can be an organic or an inorganic acid.

Zo kan bijvoorbeeld zwavelzuur worden gebruikt om de pH-waarde van de gistingsbouillon te verlagen. Bijvoorbeeld een 20 % zwavelzuur. Er kunnen echter ook andere zuren worden gebruikt en het gebruikte specifieke zuur is niet beperkend. Het zuur kan bijvoorbeeld worden gekozen uit één of meerdere van zwavelzuur, zoutzuur, fosforzuur, mierenzuur, azijnzuur en citroenzuur of een mengsel daarvan.For example, sulfuric acid can be used to lower the pH of the fermentation broth. For example a 20% sulfuric acid. However, other acids may also be used and the specific acid used is not limiting. For example, the acid may be selected from one or more of sulfuric acid, hydrochloric acid, phosphoric acid, formic acid, acetic acid and citric acid or a mixture thereof.

De instelling van de pH-waarde op een dergelijke zure pH-waarde is bijzonder voordelig omdat dit leidt tot een aanzienlijke vermindering van opgeloste biomoleculen in de fermentatiebouillon, zoals oplosbare eiwitten en DNA's door denaturatie en precipitatie. Deze vermindering van de opgeloste biomoleculen maakt een efficiëntere scheiding van deze verbindingen tijdens de daaropvolgende zuiveringsstappen mogelijk.Adjusting the pH value to such an acidic pH value is particularly advantageous as it leads to a significant reduction of dissolved biomolecules in the fermentation broth, such as soluble proteins and DNAs through denaturation and precipitation. This reduction in dissolved biomolecules allows for more efficient separation of these compounds during subsequent purification steps.

Bij voorkeur wordt de fermentatiebouillon verwarmd tot een temperatuur die hoger is dan de omgevingstemperatuur. Bij voorkeur wordt de fermentatiebouillon verwarmd tot een temperatuur tussen 30 en 90 °C, meer bij voorkeur tussen 35 en 85 °C, en meest bij voorkeur tussen 50 en 75 °C. Deze warmtebehandeling vermindert het totale aantal levensvatbare micro-organismen (totaal microbieel aantal) in de fermentatiebouillon aanzienlijk. Bovendien vermindert deze verhittingsstap de hoeveelheid oplosbare eiwitten als gevolg van temperatuurgeïnduceerde denaturatie en precipitatie waardoor de efficiëntie van de verwijdering van resteiwitten in de daaropvolgende zuiveringsstappen (bijv. stap b) en stap c) van de methode volgens de uitvinding) toeneemt.Preferably, the fermentation broth is heated to a temperature higher than the ambient temperature. Preferably, the fermentation broth is heated to a temperature between 30 and 90°C, more preferably between 35 and 85°C, and most preferably between 50 and 75°C. This heat treatment significantly reduces the total number of viable microorganisms (total microbial count) in the fermentation broth. In addition, this heating step reduces the amount of soluble proteins due to temperature-induced denaturation and precipitation, thereby increasing the efficiency of the removal of residual proteins in the subsequent purification steps (e.g. step b) and step c) of the method according to the invention).

In bepaalde uitvoeringen wordt de fermentatiebouillon verwarmd tot een temperatuur van 20 tot 120 °C, bij voorkeur van 45 tot 110 °C, meer bij voorkeur van 60 tot 90 °C, meest bij voorkeur van 70 tot 80 °C.In certain embodiments, the fermentation broth is heated to a temperature of from 20 to 120°C, preferably from 45 to 110°C, more preferably from 60 to 90°C, most preferably from 70 to 80°C.

De warmtebehandeling kan met elke bekende methode worden uitgevoerd, zoals het gebruik van een oven, een brander, een waterbad, een oliebad, een verwarmingsmantel of andere verwarmingssystemen. Bij voorkeur wordt de warmtebehandeling uitgevoerd met behulp van een industriële verwarmingen waarbij één of een combinatie van de volgende warmteoverdrachtsmethoden wordt gebruikt: geleiding, convectie, straling. Dergelijke verwarmingen kunnen bijv. circulatieverwarmingen, warmtelampen, dompelaars, verwarmingen met stoom of verwarmingen met een verwarmingsmantel zijn.The heat treatment can be carried out by any known method, such as using a furnace, a burner, a water bath, an oil bath, a heating mantle or other heating systems. Preferably, the heat treatment is carried out using industrial heaters using one or a combination of the following heat transfer methods: conduction, convection, radiation. Such heaters can be e.g. circulation heaters, heat lamps, immersion heaters, steam heaters or heaters with a heating jacket.

In sommige uitvoeringen kan de fermentatiebouillon gedurende een bepaalde tijd op de warmtebehandelingstemperatuur worden gehouden. De fermentatiebouillon kan bijvoorbeeld gedurende 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25 of 30 minuten op een van de hierboven genoemde verwarmingstemperaturen worden gehouden. In sommige uitvoeringen kan de suspensie langer dan 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25 of 30 minuten op een van de hierboven genoemde verwarmingstemperaturen worden gehouden. In sommige uitvoeringen kan de suspensie minder dan 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25 of 30 minuten op een van de hierboven genoemde verwarmingstemperaturen worden gehouden.In some embodiments, the fermentation broth may be held at the heat treatment temperature for a period of time. For example, the fermentation broth can be held at one of the heating temperatures listed above for 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, or 30 minutes. In some embodiments, the suspension may be held at one of the heating temperatures listed above for longer than 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, or 30 minutes. In some embodiments, the suspension may be held at one of the heating temperatures listed above for less than 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, or 30 minutes.

In bepaalde uitvoeringen wordt de fermentatiebouillon voorbehandeld door de fermentatiebouillon rechtstreeks tot een van de hierboven genoemde temperaturen te verwarmen. In andere uitvoeringen wordt de fermentatiebouillon stapsgewijs verwarmd, waarbij die tot een eerste temperatuur wordt verwarmd, optioneel gedurende een bepaalde tijd op die eerste temperatuur wordt gehouden, en vervolgens tot een tweede temperatuur wordt verwarmd, optioneel gedurende een bepaalde tijd op die tweede temperatuur wordt gehouden.In certain embodiments, the fermentation broth is pre-treated by heating the fermentation broth directly to one of the above temperatures. In other embodiments, the fermentation broth is heated in a stepwise manner, being heated to a first temperature, optionally held at that first temperature for a period of time, and then heated to a second temperature, optionally held at that second temperature for a period of time .

Bij voorkeur wordt in stap al) van de methode volgens de uitvinding de pH-waarde verlaagd en de fermentatiebouillon verwarmd, waardoor met name de oplosbaarheid van de eiwitten wordt verminderd en de daaropvolgende zuiveringsstappen worden vereenvoudigd.Preferably, in step a1) of the method according to the invention, the pH value is lowered and the fermentation broth is heated, which in particular reduces the solubility of the proteins and simplifies the subsequent purification steps.

Bij voorkeur wordt de fermentatiebouillon zodanig verdund dat het gewicht van de verdunde suspensie tussen 1,1 en 10 maal het oorspronkelijke gewicht van de fermentatiebouillon ligt, bij voorkeur tussen 1,5 en 10, meer bij voorkeur tussen 2 en 4, en meest bij voorkeur tussen 2,5 en 3,5.Preferably, the fermentation broth is diluted such that the weight of the diluted suspension is between 1.1 and 10 times the original weight of the fermentation broth, preferably between 1.5 and 10, more preferably between 2 and 4, and most preferably between 2.5 and 3.5.

De verdunning gebeurt bij voorkeur met water. Het water kan kraanwater, gedeïoniseerd water of gedestilleerd water zijn.The dilution is preferably done with water. The water can be tap water, deionized water or distilled water.

In bepaalde uitvoeringen heeft de fermentatiebouillon een verdunningsverhouding van 2 tot 10, bij voorkeur van 3 tot 8, meer bij voorkeur van 4 tot 6. De verdunningsverhouding is de verhouding tussen het uiteindelijke volume van de fermentatiebouillon (d.w.z. na de verdunning) en het oorspronkelijke volume van de fermentatiebouillon (d.w.z. voor de verdunning). De fermentatiebouillon kan bijvoorbeeld worden verdund met een factor 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, of 10,0 ten opzichte van het oorspronkelijke volume van de fermentatiebouillon.In certain embodiments, the fermentation broth has a dilution ratio of 2 to 10, preferably 3 to 8, more preferably 4 to 6. The dilution ratio is the ratio between the final volume of the fermentation broth (i.e., after the dilution) and the original volume of the fermentation broth (i.e. before the dilution). For example, the fermentation broth can be diluted by a factor of 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7 .0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, or 10.0 relative to the original volume of the fermentation broth.

Een voordeel van de verdunning van de fermentatiebouillon is dat een hoger rendement vanAn advantage of the dilution of the fermentation broth is that a higher yield of

HMO na de daaropvolgende zuiveringsstappen kan worden bereikt (bijv. na stap b) en/of stap c) van de methode volgens de uitvinding).HMO can be achieved after the subsequent purification steps (e.g. after step b) and/or step c) of the method according to the invention).

Bij voorkeur wordt de fermentatiebouillon door een aanpassing van de pH en een warmtebehandeling voorbehandeld, waarbij de pH van de fermentatiebouillon bij voorkeur wordt aangepast tot een pH-waarde van 3 tot 4 en bij voorkeur wordt verwarmd tot een temperatuur van 50 tot 75 °C.Preferably, the fermentation broth is pretreated by pH adjustment and heat treatment, wherein the pH of the fermentation broth is preferably adjusted to a pH value of 3 to 4 and preferably heated to a temperature of 50 to 75°C.

De behandeling van de gescheiden HMO-bevattende stroom van stap al) of de voorbehandelde fermentatiebouillon volgens stap a2) met actieve koolstof om een HMO- bevattende stroom te verkrijgen (stap b)The treatment of the separated HMO-containing stream from step a1) or the pre-treated fermentation broth according to step a2) with active carbon to obtain an HMO-containing stream (step b)

In de methode volgens de uitvinding wordt in stap b) een behandeling met actieve koolstof uitgevoerd.In the method according to the invention, a treatment with active carbon is carried out in step b).

De behandeling met actieve koolstof is een ontkleuringsstap (verwijdering van de kleurende bestanddelen). Bij voorkeur kan actieve koolstof, zoals Norit CA1 actieve koolstof, worden gebruikt.The treatment with activated carbon is a decolorization step (removal of the coloring components). Preferably activated carbon, such as Norit CA1 activated carbon, can be used.

De behandeling met actieve koolstof dient om de kleurstoffen te verwijderen en kan de hoeveelheden in water oplosbare verontreinigingen, zoals zouten, verminderen. Bovendien dient de behandeling met actieve koolstof om eiwitten, DNA's, RNA's of endotoxines te verwijderen die in de HMO-bevattende stroom aanwezig kunnen zijn.The activated carbon treatment serves to remove the dyes and can reduce the amounts of water-soluble contaminants, such as salts. In addition, the activated carbon treatment serves to remove any proteins, DNAs, RNAs or endotoxins that may be present in the HMO-containing stream.

De behandeling met actieve koolstof in stap b1) van de methode volgens de uitvinding leidt dus tot een vermindering van kleurstoffen en/of zouten en/of eiwitten en/of DNA's en/ofThe treatment with active carbon in step b1) of the method according to the invention thus leads to a reduction of dyes and/or salts and/or proteins and/or DNAs and/or

RNA's en/of endotoxines in de HMO-bevattende stroom. Na de scheiding van deze bestanddelen van de gewenste HMO in stap b) wordt een HMO-bevattende stroom verkregen die van de bovengenoemde onzuiverheden is gescheiden.RNAs and/or endotoxins in the HMO-containing stream. After the separation of these components from the desired HMO in step b), an HMO-containing stream is obtained which has been separated from the impurities mentioned above.

Neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosachariden hebben de neiging om aan het oppervlak van koolstofdeeltjes uit de waterige oplossing te worden gebonden. Ook kleurstoffen kunnen aan de koolstof worden geadsorbeerd. Terwijl de neutrale of gesialyleerde HMO's en de kleurgevende stoffen worden geadsorbeerd, kunnen in water oplosbare stoffen die niet of slechts zwak aan de koolstof zijn gebonden, met water worden geëlueerd. Door het eluent te veranderen van water in waterig ethanol of andere in water oplosbare organische oplosmiddelen (bijv. methanol of isopropanol) kunnen de geadsorbeerde neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosachariden eenvoudig worden geëlueerd en in een afzonderlijke fractie worden verzameld. Daarbij blijven de geadsorbeerde kleurgevende stoffen aan de koolstof geadsorbeerd, zodat tegelijkertijd ontkleuring en gedeeltelijke ontzilting kunnen worden bereikt. Door de aanwezigheid van een organisch oplosmiddel (ethanol) in het elutieoplosmiddel is de ontkleuringsefficiëntie echter lager dan wanneer de elutie met zuiver water wordt uitgevoerd.Neutral or sialylated breast milk oligosaccharides tend to be bound to the surface of carbon particles from the aqueous solution. Dyes can also be adsorbed on the carbon. While the neutral or sialylated HMOs and the coloring substances are adsorbed, water-soluble substances that are not or only weakly bound to the carbon can be eluted with water. By changing the eluent from water to aqueous ethanol or other water-soluble organic solvents (e.g., methanol or isopropanol), the adsorbed neutral or sialylated breast milk oligosaccharides can be easily eluted and collected in a separate fraction. In addition, the adsorbed colorants remain adsorbed on the carbon, so that decolorization and partial desalination can be achieved at the same time. However, due to the presence of an organic solvent (ethanol) in the elution solvent, the decolorization efficiency is lower than when the elution is performed with pure water.

In een aspect van stap b) wordt de neutrale of gesialyleerde HMO dus geadsorbeerd door de actieve koolstof en weer gedesorbeerd door een waterig organisch oplosmiddel zoals bijvoorbeeld ethanol, methanol, isopropanol of een mengsel daarvan. Om ervoor te zorgen dat de actieve koolstof een aanzienlijke hoeveelheid (d.w.z. 80 % of meer) neutrale of gesialyleerde HMO uit de in de vorige stap verkregen gescheiden HMO-bevattende stroom adsorbeert, bedraagt de hoeveelheid actieve koolstof ongeveer 250-300 massaprocent of meer in verhouding tot de neutrale of gesialyleerde HMO die in de voorbehandelde bouillon (stap a2)) of in de gescheiden HMO-bevattende stroom (stap al)) aanwezig is. Dit aspect verdient de voorkeur om de voorbehandelde fermentatiebouillon volgens stap a2) te ontkleuren.Thus, in one aspect of step b), the neutral or sialylated HMO is adsorbed by the active carbon and desorbed again by an aqueous organic solvent such as, for example, ethanol, methanol, isopropanol or a mixture thereof. In order for the active carbon to adsorb a significant amount (i.e. 80% or more) of neutral or sialylated HMO from the separated HMO-containing stream obtained in the previous step, the amount of active carbon is approximately 250-300% by mass or more relative to to the neutral or sialylated HMO present in the pretreated broth (step a2)) or in the separated HMO-containing stream (step a1)). This aspect is preferred to decolorize the pre-treated fermentation broth according to step a2).

Onder bepaalde omstandigheden worden de neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosachariden niet of althans niet sterk aan de koolstofdeeltjes geadsorbeerd en geeft de elutie met water een waterige oplossing van de neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosachariden zonder een aanzienlijk verlies van hun hoeveelheden, terwijl de kleurstoffen geadsorbeerd blijven. In dit geval is het niet nodig om een organisch oplosmiddel zoals ethanol voor de elutie te gebruiken. Het is slechts een kwestie van routine om de omstandigheden te bepalen waaronder de neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosachariden aan de koolstof uit zijn waterige oplossing worden gebonden.Under certain circumstances, the neutral or sialylated breast milk oligosaccharides are not or at least not strongly adsorbed to the carbon particles and the elution with water gives an aqueous solution of the neutral or sialylated breast milk oligosaccharides without significant loss of their amounts, while the dyes remain adsorbed. In this case it is not necessary to use an organic solvent such as ethanol for the elution. It is only a matter of routine to determine the conditions under which the neutral or sialylated breast milk oligosaccharides are bound to the carbon from its aqueous solution.

In een ander aspect van stap b) wordt de neutrale of gesialyleerde HMO dus niet of althans niet aanzienlijk door de actieve koolstof geadsorbeerd. Onder ”niet aanzienlijk geadsorbeerd” wordt verstaan dat minder dan 10 %, bij voorkeur minder dan 5 %, en meer bij voorkeur minder dan 1 % van de neutrale of gesialyleerde HMO door de actieve koolstof wordt geadsorbeerd. De hoeveelheid actieve koolstof die in dit aspect wordt gebruikt is <100 % in gewicht ten opzichte van de neutrale of gesialyleerde HMO die in de HMO-bevattende stroom aanwezig is, bij voorkeur <10 %. Hierdoor kan het grootste deel van de neutrale of gesialyleerde HMO passeren, terwijl residuele biomoleculen, gekleurde verbindingen en andere hydrofobe moleculen door de actieve koolstof worden tegengehouden. In een uitvoering bedraagt de hoeveelheid actieve koolstof ongeveer 2-6 massaprocent. Dit is economisch omdat alle hierboven beschreven voordelen eenvoudig met een zeer kleine hoeveelheid koolstof kunnen worden bereikt. In een andere uitvoering wordt de actieve koolstof toegevoegd in een hoeveelheid tussen 0,25 en 3 massaprocent, bij voorkeur tussen 0,5 en 2,5 massaprocent, en meer bij voorkeur tussen 0,75 en 2,2 massaprocent, en nog meer bij voorkeur tussen 1,0 en 2,0 massaprocent, waarbij de percentages gebaseerd zijn op het totale gewicht van de HMO-bevattende stroom die aan de behandeling met actieve koolstof in stap b) wordt onderworpen. Deze kleine hoeveelheid actieve koolstof maakt een aanzienlijke vermindering van het verbruik van actieve koolstof en een aanzienlijke vermindering van productverliezen (neutrale of gesialyleerde HMO) mogelijk.Thus, in another aspect of step b), the neutral or sialylated HMO is not or at least not significantly adsorbed by the active carbon. By "not substantially adsorbed" is meant that less than 10%, preferably less than 5%, and more preferably less than 1% of the neutral or sialylated HMO is adsorbed by the active carbon. The amount of activated carbon used in this aspect is <100% by weight relative to the neutral or sialylated HMO present in the HMO-containing stream, preferably <10%. This allows most of the neutral or sialylated HMO to pass while residual biomolecules, colored compounds and other hydrophobic molecules are retained by the active carbon. In one embodiment, the amount of active carbon is about 2-6% by mass. This is economical because all the advantages described above can be easily achieved with a very small amount of carbon. In another embodiment, the active carbon is added in an amount between 0.25 and 3% by mass, preferably between 0.5 and 2.5% by mass, and more preferably between 0.75 and 2.2% by mass, and even more at preferably between 1.0 and 2.0 mass percent, the percentages being based on the total weight of the HMO-containing stream subjected to the activated carbon treatment in step b). This small amount of activated carbon allows a significant reduction in activated carbon consumption and a significant reduction in product losses (neutral or sialylated HMO).

In elk van de aspecten van stap b) hierboven kan de behandeling met actieve koolstof worden uitgevoerd door koolstofpoeder al roerend aan de HMO-bevattende stroom toe te voegen en de koolstof te filteren. In het aspect van adsorptie/desorptie wordt de gefiltreerde koolstof opnieuw gesuspendeerd in waterige ethanol, methanol, isopropanol, of een mengsel daarvan, door te roeren en de koolstof door filtratie te scheiden.In any of the aspects of step b) above, the activated carbon treatment can be performed by adding carbon powder to the HMO-containing stream while stirring and filtering the carbon. In the adsorption/desorption aspect, the filtered carbon is resuspended in aqueous ethanol, methanol, isopropanol, or a mixture thereof by stirring and separating the carbon by filtration.

Bij een zuivering op grotere schaal wordt de gescheiden HMO-bevattende stroom volgens stap al) of de voorbehandelde fermentatiebouillon volgens stap a2) bij voorkeur geladen in een kolom die is gevuld met actieve koolstof, die een gegranuleerde koolstof kan zijn of eventueel kan zijn gemengd met inerte filterhulpstof, waarna de kolom met het vereiste eluent wordt gespoeld. De fracties die de neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide bevatten, worden verzameld. De resterende organische oplosmiddelen kunnen indien nodig uit deze fracties worden verwijderd, bijv. door verdamping, zodat een waterige oplossing van de neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosachariden (HMO-bevattende stroom) wordt verkregen.In a larger scale purification, the separated HMO-containing stream according to step a1) or the pre-treated fermentation broth according to step a2) is preferably loaded into a column filled with active carbon, which can be a granulated carbon or optionally mixed with inert filter aid, after which the column is rinsed with the required eluent. The fractions containing the neutral or sialylated breast milk oligosaccharide are collected. The residual organic solvents can be removed from these fractions if necessary, e.g. by evaporation, to obtain an aqueous solution of the neutral or sialylated breast milk oligosaccharides (HMO-containing stream).

In elk van de aspecten van stap b) hierboven is de gebruikte actieve koolstof gegranuleerd. Dit zorgt voor een gunstige stroomsnelheid zonder hoge druk.In each of the aspects of step b) above, the active carbon used is granulated. This ensures a favorable flow rate without high pressure.

In een uitvoering wordt de behandeling met actieve koolstof, bij voorkeur bestaande uit een chromatografie met actieve koolstof, bij een verhoogde temperatuur uitgevoerd. Bij een verhoogde temperatuur vindt de binding van kleurstoffen, resterwitten enz. aan de koolstofdeeltjes in een kortere contacttijd plaats, zodat de stroomsnelheid eenvoudig kan worden verhoogd. Bovendien zorgt de behandeling met actieve koolstof bij een verhoogde temperatuur voor een aanzienlijke vermindering het totale aantal levensvatbare micro-In one embodiment, the active carbon treatment, preferably consisting of an active carbon chromatography, is carried out at an elevated temperature. At an elevated temperature, the binding of dyes, residual whites, etc. to the carbon particles takes place in a shorter contact time, so that the flow rate can be easily increased. In addition, treatment with activated carbon at an elevated temperature significantly reduces the total number of viable micro-

organismen (totaal microbieel aantal) in de HMO-bevattende stroom. De verhoogde temperatuur mag minstens 30-35 °C bedragen, zoals minstens 40 °C, minstens 50 °C, circa 40-50 °C of circa 60 °C.organisms (total microbial count) in the HMO-containing stream. The elevated temperature may be at least 30-35°C, such as at least 40°C, at least 50°C, about 40-50°C or about 60°C.

In een uitvoering wordt de actieve koolstof toegevoegd als een poeder met een deeltjesgrootteverdeling met een diameter d50 tussen 2 um en 25 um, bij voorkeur tussen 3 um en 20 um, en meer bij voorkeur tussen 3 um en 7 um, en nog meer bij voorkeur tussen 5 um en 7 um. De d50-waarde wordt met standaardprocedures bepaald.In one embodiment, the active carbon is added as a powder with a particle size distribution with a diameter d50 between 2 µm and 25 µm, preferably between 3 µm and 20 µm, and more preferably between 3 µm and 7 µm, and even more preferably between 5 um and 7 um. The d50 value is determined using standard procedures.

In een uitvoering wordt de pH van de gescheiden HMO-bevattende stroom volgens stap al) of de voorbehandelde fermentatiebouillon volgens stap a2) aangepast voordat de behandeling met actieve koolstof wordt uitgevoerd om de vermindering van kleurstoffen en/of eiwitten tijdens stap b) van de methode volgens de uitvinding te verbeteren. Bij voorkeur wordt de pH aangepast tot 5,5, bij voorkeur tot 5,0 en nog meer bij voorkeur tot 4,5 door een geschikt zuur toe te voegen.In one embodiment, the pH of the separated HMO-containing stream according to step a1) or the pre-treated fermentation broth according to step a2) is adjusted before the treatment with active carbon is carried out in order to reduce the reduction of dyes and/or proteins during step b) of the method. according to the invention. Preferably the pH is adjusted to 5.5, preferably to 5.0 and more preferably to 4.5 by adding a suitable acid.

In een uitvoering wordt in stap b) een hoeveelheid actieve koolstof gebruikt die in staat is om minstens 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 92 %, 95 % of meer van de kleurstoffen en/of polysachariden en/of eiwitten en/of nucleïnezuren zoals DNA of RNA, die in de gescheiden HMO-bevattende stroom volgens stap al) of de voorbehandelde fermentatiebouillon volgens stap a2) aanwezig zijn, te binden.In one embodiment, in step b) an amount of active carbon is used that is capable of containing at least 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 92%, 95% or more of the dyes and/or polysaccharides and/or proteins and/or nucleic acids such as DNA or RNA, which are present in the separated HMO-containing stream according to step a1) or the pretreated fermentation broth according to step a2).

De gezuiverde oplossing verkregen na stap b) van de methode volgens de uitvinding bevat de neutrale of gesialyleerde HMO met een zuiverheid van >50 %, bij voorkeur >60 %, meer bij voorkeur >70 %.The purified solution obtained after step b) of the method according to the invention contains the neutral or sialylated HMO with a purity of >50%, preferably >60%, more preferably >70%.

In een uitvoering is het rendement van de gewenste neutrale of gesialyleerde HMO na de behandeling met actieve koolstof hoger dan 50 %, hoger dan 60 %, hoger dan 70 %, hoger dan 80 %, hoger dan 90 %, hoger dan 91 %, hoger dan 92 %, hoger dan 93 %, hoger dan 94 %, hoger dan 95 %, hoger dan 96 %, hoger dan 97 %, hoger dan 98 % of hoger dan 99 %.In one embodiment, the efficiency of the desired neutral or sialylated HMO after the activated carbon treatment is greater than 50%, greater than 60%, greater than 70%, greater than 80%, greater than 90%, greater than 91%, greater over 92%, over 93%, over 94%, over 95%, over 96%, over 97%, over 98% or over 99%.

In elk van de aspecten van stap b) hierboven 1s de gezuiverde oplossing (HMO-bevattende stroom) verkregen na stap b) van de methode volgens de uitvinding vrij van eiwitten en/of recombinant genetisch materiaal.In each of the aspects of step b) above, the purified solution (HMO-containing stream) obtained after step b) of the method according to the invention is free of proteins and/or recombinant genetic material.

Verdere zuivering van de HMO-bevattende stroom in stap c) door nanofiltratieFurther purification of the HMO-containing stream in step c) by nanofiltration

Instap c) van de methode volgens de uitvinding wordt de HMO-bevattende stroom verder gezuiverd door nanofiltratie.In step c) of the method according to the invention, the HMO-containing stream is further purified by nanofiltration.

Nanofiltratie (NF) kan worden gebruikt om moleculen met een laag molecuulgewicht die kleiner zijn dan de gewenste neutrale of gesialyleerde HMO's te verwijderen, zoals mono- en disachariden, korte peptiden, kleine organische zuren, water en zouten.Nanofiltration (NF) can be used to remove low molecular weight molecules smaller than the desired neutral or sialylated HMOs, such as mono- and disaccharides, short peptides, small organic acids, water and salts.

De productstroom, d.w.z. de neutrale of gesialyleerde HMO-bevattende stoom, is het NF- retentaat. Het nanofiltratiemembraan heeft dus een MWCO of een poriegrootte die de retentie van de neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide garandeert, d.w.z. dat de MWCO van het nanofiltratiemembraan overeenkomstig wordt aangepast.The product stream, i.e. the neutral or sialylated HMO-containing steam, is the NF retentate. The nanofiltration membrane thus has a MWCO or a pore size that ensures the retention of the neutral or sialylated breast milk oligosaccharide, i.e. the MWCO of the nanofiltration membrane is adjusted accordingly.

Doorgaans bedraagt de poriegrootte van het nanofiltratiemembraan 0,5 nm tot 2 nm en/of 150 dalton (Da) molecuulgewicht cut-off (MWCO) tot 3000 Da MWCO.Typically, the pore size of the nanofiltration membrane is 0.5 nm to 2 nm and/or 150 dalton (Da) molecular weight cut-off (MWCO) to 3000 Da MWCO.

In een uitvoering liggen de membranen in het bereik van 150-300 Da MWCO, die worden gedefinieerd als ”dichte” NF-membranen.In one embodiment, the membranes are in the range of 150-300 Da MWCO, which are defined as "tight" NF membranes.

Bij voorkeur zijn de membranen groter dan 300 Da MWCO en bij voorkeur niet groter dan 3000 Da MWCO. In deze uitvoering worden de membranen beschouwd als ”losse” NF- membranen.Preferably the membranes are greater than 300 Da MWCO and preferably not greater than 3000 Da MWCO. In this embodiment, the membranes are regarded as “loose” NF membranes.

In een andere voorkeursuitvoering heeft het ”losse” nanofiltratiemembraan een molecuulgewicht cut-off (MWCO) van 500-3000 Da en is de actieve (top)laag van het membraan bij voorkeur samengesteld uit polyamide, bij voorkeur polyamide op basis van piperazine. Daarbij wordt de retentie van trioligosachariden of hoger gegarandeerd en kan minstens een deel van de disachariden het membraan passeren. In deze uitvoering moet het toegepaste nanofiltrattemembraan dicht zijn voor trioligosachariden of hoger, zodat die efficiënt worden tegengehouden. Tegelijkertijd moet het membraan relatief los zijn voorIn another preferred embodiment, the "loose" nanofiltration membrane has a molecular weight cut-off (MWCO) of 500-3000 Da and the active (top) layer of the membrane is preferably composed of polyamide, preferably piperazine-based polyamide. The retention of trioligosaccharides or higher is thereby guaranteed and at least part of the disaccharides can pass through the membrane. In this embodiment, the applied nanofiltration membrane must be dense for trioligosaccharides or higher so that they are efficiently retained. At the same time, the membrane must be relatively loose for

MgSO4, zodat de afstoting ongeveer 50-90 % bedraagt, zodat disachariden het membraan kunnen passeren. Op deze manier is het mogelijk om bijv. lactose, die een precursor is bij het maken van moedermelkoligosachariden bijv. door fermentatie, af te scheiden van het neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharidenproduct met een goede efficiëntie, en bovendien gaat een aanzienlijk deel van de divalente ionen ook naar het permeaat. In sommige uitvoeringen is de MgSO4-afstotingsfactor 60-90 %, 70-90 %, 50-80 %, 50-70 %, 60-70 % of 70-80 %. Bij voorkeur bedraagt de MgSO4-afstotingsfactor op dit membraan 80-90 %. Bij voorkeur heeft het membraan een afstotingsfactor voor NaCl die lager is dan die voor MgSO4.MgSO4, so that the repulsion is about 50-90%, so that disaccharides can cross the membrane. In this way it is possible to separate e.g. lactose, which is a precursor in the production of breast milk oligosaccharides e.g. to the permeate. In some embodiments, the MgSO4 rejection factor is 60-90%, 70-90%, 50-80%, 50-70%, 60-70%, or 70-80%. Preferably, the MgSO4 rejection factor on this membrane is 80-90%. Preferably, the membrane has a rejection factor for NaCl that is lower than that for MgSO4.

In een uitvoering is de afstotingsfactor voor NaCl niet meer dan 50 %. In een andere uitvoering is de afstotingsfactor voor NaCl niet hoger dan 40 %. In een andere uitvoering is de afstotingsfactor voor NaCl niet hoger dan 30 %. In deze laatste uitvoering kan ook een aanzienlijke vermindering van alle monovalente zouten in het retentaat worden bereikt. In deze uitvoering is het membraan een dunnefilmcomposietmembraan (TFC). Een voorbeeld van een geschikt op piperazine gebaseerd polyamide TFC-membraan is TriSep” UA60.In one embodiment, the rejection factor for NaCl is no more than 50%. In another embodiment, the rejection factor for NaCl does not exceed 40%. In another embodiment, the rejection factor for NaCl does not exceed 30%. In this latter embodiment, a significant reduction of all monovalent salts in the retentate can also be achieved. In this embodiment, the membrane is a thin film composite membrane (TFC). An example of a suitable piperazine-based polyamide TFC membrane is TriSep” UA60.

Andere voorbeelden van geschikte NF-membranen zijn Synder NFG (600-800 Da), SynderOther examples of suitable NF membranes are Synder NFG (600-800 Da), Synder

NDX (500-700 Da) en TriSep® XN-45 (500 Da).NDX (500-700 Da) and TriSep® XN-45 (500 Da).

Bij voorkeur is het rendement van de gewenste neutrale of gesialyleerde HMO in het retentaat na een nanofiltratiestap hoger dan 50 %, hoger dan 60 %, hoger dan 70 %, hoger dan 80 %, hoger dan 90 %, hoger dan 91 %, hoger dan 92 %, hoger dan 93 %, hoger dan 94 %, hoger dan 95 %, hoger dan 96 %, hoger dan 97 %, hoger dan 98 % of hoger dan 99 %.Preferably, the yield of the desired neutral or sialylated HMO in the retentate after a nanofiltration step is greater than 50%, greater than 60%, greater than 70%, greater than 80%, greater than 90%, greater than 91%, greater than 92%, higher than 93%, higher than 94%, higher than 95%, higher than 96%, higher than 97%, higher than 98% or higher than 99%.

Bij voorkeur omvat de nanofiltratiestap ook een diafiltratiestap, dat wil zeggen dat de nanofiltratie in diafiltratiemodus wordt uitgevoerd. Bij voorkeur volgt de diafiltratie op de bovengenoemde (conventioneel uitgevoerde) nanofiltratiestap.Preferably, the nanofiltration step also includes a diafiltration step, i.e. the nanofiltration is performed in diafiltration mode. Preferably, the diafiltration follows the above (conventionally performed) nanofiltration step.

Diafiltratie is een proces waarbij tijdens het membraanfiltratieproces gezuiverd water aan een oplossing wordt toegevoegd om de membraandoorlaatbare bestanddelen efficiënter te verwijderen. Diafiltratie kan dus worden gebruikt om bestanddelen te scheiden op basis van hun eigenschappen, met name molecuulgrootte, lading of polariteit, door geschikte membranen te gebruiken, waarbij één of meerde soorten efficiënt worden tegengehouden en andere soorten membraandoorlaatbaar zijn.Diafiltration is a process in which purified water is added to a solution during the membrane filtration process to more efficiently remove the membrane permeable constituents. Thus, diafiltration can be used to separate components based on their properties, in particular molecular size, charge or polarity, by using suitable membranes, where one or more species are efficiently retained and other species are membrane permeable.

Bij voorkeur worden de diafiltratie en de nanofiltratie in een stap (nanofiltratie/diafiltratie ofPreferably, the diafiltration and the nanofiltration are performed in one step (nanofiltration/diafiltration or

NF/DF genoemd) gecombineerd, waarbij de diafiltratie wordt uitgevoerd met een nanofiltrattemembraan dat doeltreffend is voor de scheiding van verbindingen en/of zouten met een laag molecuulgewicht uit de neutrale of gesialyleerde HMO's. Diafiltratie met een ”los” NF-membraan, zoals hierboven gedefinieerd, is bijzonder efficiënt voor zowel de verwijdering van mono- en divalente zouten als de verwijdering van disachariden uit neutrale of gesialyleerde HMO's.NF/DF) combined, the diafiltration being performed with a nanofiltration membrane effective for the separation of low molecular weight compounds and/or salts from the neutral or sialylated HMOs. Diafiltration with a “loose” NF membrane, as defined above, is particularly efficient for both the removal of mono- and divalent salts and the removal of disaccharides from neutral or sialylated HMOs.

Bij voorkeur wordt de DF-stap of de NF/DF-stap zodanig uitgevoerd dat de pH lager is dan 5,0, bij voorkeur lager dan 4,5, bij voorkeur lager dan 4,0, maar bij voorkeur niet lager dan 3,0. Onder deze omstandigheden worden zouten bestaande uit monovalente kationen zoals natriumzouten (d.w.z. natriumion samen met de co-anionen) effectief verwijderd, zodat een zoutarme of vrijwel zoutloze gezuiverde oplossing ontstaat die een neutrale of gesialyleerdePreferably the DF step or the NF/DF step is carried out such that the pH is less than 5.0, preferably less than 4.5, preferably less than 4.0, but preferably not less than 3, 0. Under these conditions, salts composed of monovalent cations such as sodium salts (i.e., sodium ion together with the co-anions) are effectively removed to yield a low-salt or substantially salt-free purified solution that has a neutral or sialylated

HMO in het retentaat bevat.HMO in the retentate.

In een uitvoering wordt een tweede nanofiltratiestap uitgevoerd in de methode volgens de uitvinding, zodat deze stap deel uitmaakt van stap c). In deze tweede nanofiltratiestap is het nanofiltratiemembraan een ”los” NF-membraan of een ”dicht” NF-membraan. De tweede optionele nanofiltratiestap wordt uitgevoerd na de eerste nanofiltratiestap (stap c), maar wordt bij voorkeur uitgevoerd voor stap d) van de methode volgens de uitvinding.In one embodiment, a second nanofiltration step is carried out in the method according to the invention, so that this step forms part of step c). In this second nanofiltration step, the nanofiltration membrane is a "loose" NF membrane or a "closed" NF membrane. The second optional nanofiltration step is performed after the first nanofiltration step (step c), but is preferably performed before step d) of the method according to the invention.

Evenzo kan een tweede diafiltratie in stap c) volgens de uitvinding worden uitgevoerd, zodat deze tweede optionele diafiltratiestap ook met de tweede nanofiltratiestap kan worden gecombineerd. Deze tweede NF/DF-stap, wanneer een ”los” NF-membraan wordt toegepast zoals hierboven beschreven, wordt zodanig uitgevoerd dat de pH lager 1s dan 5,0, bij voorkeur lager dan 4,5, bij voorkeur lager dan 4,0, maar bij voorkeur niet lager dan 3,0.Similarly, a second diafiltration in step c) can be performed according to the invention, so that this second optional diafiltration step can also be combined with the second nanofiltration step. This second NF/DF step, when a "loose" NF membrane is used as described above, is carried out in such a way that the pH is less than 1s than 5.0, preferably less than 4.5, preferably less than 4.0 , but preferably not lower than 3.0.

In een uitvoering bevat de gezuiverde oplossing verkregen na stap c) van de methode volgens de uitvinding de neutrale of gesialyleerde HMO met een zuiverheid van >80 %, bij voorkeur 285 %, meer bij voorkeur >90 %.In one embodiment, the purified solution obtained after step c) of the method according to the invention contains the neutral or sialylated HMO with a purity of >80%, preferably 285%, more preferably >90%.

In een uitvoering is de gezuiverde oplossing (HMO-bevattende stroom) verkregen na stap c) van de methode volgens de uitvinding vrij van eiwitten en/of recombinant genetisch materiaal.In one embodiment, the purified solution (HMO-containing stream) obtained after step c) of the method according to the invention is free of proteins and/or recombinant genetic material.

Concentratie van de gezuiverde HMO-bevattende stroom in stap d) van de methode volgens deuitvindingConcentration of the purified HMO-containing stream in step d) of the method according to the invention

Een concentratiestap wordt gebruikt om aanzienlijke hoeveelheden vloeistof, meestal water, op een economische manier uit de neutrale of gesialyleerde HMO-bevattende stroom te verwijderen door middel van bijv. verdamping, nanofiltratie of omgekeerde-osmosefiltratie.A concentration step is used to economically remove significant amounts of liquid, usually water, from the neutral or sialylated HMO-containing stream by e.g. evaporation, nanofiltration or reverse osmosis filtration.

Verdampingsprocessen kunnen bijvoorbeeld dalende filmverdamping, klimmende filmverdamping en roterende verdamping omvatten. De verdamping kan ook onder vacuüm worden uitgevoerd. De concentratie inkomende vaste stoffen in het proces is bij voorkeur ongeveer 5 tot 30 massaprocent. De concentratie uitgaande vaste stoffen uit een dergelijk proces is doorgaans meer dan 30 massaprocent, bij voorkeur meer dan 50 massaprocent. Meer bij voorkeur bedraagt de concentratie uitgaande stoffen bij het ontwateringsproces 60 tot 80 massaprocent. Het gedeelte vaste stoffen van het teruggewonnen materiaal is bij voorkeur groter dan 80 massaprocent neutrale of gesialyleerde HMO.For example, evaporation processes may include falling film evaporation, rising film evaporation, and rotary evaporation. The evaporation can also be carried out under vacuum. The concentration of incoming solids in the process is preferably about 5 to 30% by mass. The concentration of outgoing solids from such a process is generally more than 30% by mass, preferably more than 50% by mass. More preferably, the concentration of starting substances in the dewatering process is 60 to 80% by mass. The solids portion of the recovered material is preferably greater than 80% by mass of neutral or sialylated HMO.

In een uitvoering wordt de gezuiverde neutrale of gesialyleerde HMO-bevattende stroom geconcentreerd tot een concentratie van > 100 g/l neutrale of gesialyleerde HMO, bij voorkeur > 200 g/l, en nog meer bij voorkeur > 300 g/l.In one embodiment, the purified neutral or sialylated HMO-containing stream is concentrated to a concentration of > 100 g/l neutral or sialylated HMO, preferably > 200 g/l, and more preferably > 300 g/l.

Wanneer de gezuiverde neutrale of gesialyleerde HMO-bevattende stroom wordt geconcentreerd door verdamping, wordt de verdamping bij voorkeur uitgevoerd bij een temperatuur van ongeveer 20 tot ongeveer 80 °C. In sommige uitvoeringen wordt de verdamping uitgevoerd bij een temperatuur van 25 tot 75 °C. In sommige uitvoeringen wordt de verdamping uitgevoerd bij een temperatuur van 30 tot 70 °C. In sommige uitvoeringen wordt de verdamping uitgevoerd bij een temperatuur van 30 tot 65 °C. Bij voorkeur wordt de verdamping onder vacuüm uitgevoerd.When the purified neutral or sialylated HMO-containing stream is concentrated by evaporation, the evaporation is preferably conducted at a temperature of about 20 to about 80°C. In some embodiments, the evaporation is carried out at a temperature of 25 to 75 °C. In some embodiments, the evaporation is carried out at a temperature of 30 to 70 °C. In some embodiments, the evaporation is carried out at a temperature of 30 to 65 °C. Preferably, the evaporation is carried out under vacuum.

Wanneer de gezuiverde neutrale of gesialyleerde HMO-bevattende stroom wordt geconcentreerd door membraanfiltratie, is elk membraan, doorgaans een nanofiltrattemembraan, geschikt dat de neutrale of gesialyleerde HMO voldoende afstoot. Een concentratie door membraanfiltratie levert doorgaans een HMO-oplossing van ongeveer 30- 35 massaprocent op. Deze concentratie kan geschikt zijn voor de uitvoering van de daaropvolgende drogingsstollingsstap, bijv. vriesdrogen. Voor andere drogingsmethoden kunnen echter meer geconcentreerde oplossingen nodig zijn, bijv. sproeidroging of kristallisatie. In dit geval gaat de voorkeur uit naar een concentratie door verdamping, bij voorkeur onder vacuüm. Bij wijze van alternatief wordt de in de vorige stap verkregen neutrale of gesialyleerde HMO-bevattende stroom geconcentreerd tot ongeveer 30-35 massaprocent met behulp van een nanofiltratiemembraan en wordt de oplossing verder geconcentreerd door verdamping.When the purified neutral or sialylated HMO-containing stream is concentrated by membrane filtration, any membrane, typically a nanofiltration membrane, is suitable that sufficiently repels the neutral or sialylated HMO. Concentration by membrane filtration typically yields an HMO solution of about 30-35% by mass. This concentration may be suitable for carrying out the subsequent drying solidification step, e.g. freeze-drying. However, other drying methods may require more concentrated solutions, e.g. spray drying or crystallization. In this case, concentration by evaporation, preferably under vacuum, is preferred. Alternatively, the neutral or sialylated HMO-containing stream obtained in the previous step is concentrated to approximately 30-35% by mass using a nanofiltration membrane and the solution is further concentrated by evaporation.

In een uitvoering van de concentratie door membraanfiltratie is het gekozen membraan een ”dicht” NF met 150-300 Da MWCO.In an implementation of the concentration by membrane filtration, the chosen membrane is a "tight" NF with 150-300 Da MWCO.

In een andere uitvoering van de concentratie door membraanfiltratie is het gekozen membraan een nanofiltratiemembraan met een molecuulgewicht cut-off (MWCO) van 500-3500 Da en een actieve (top)laag van polyamide (”los” NF-membraan) en wordt de concentratiestap zodanig uitgevoerd dat de pH lager is dan 5,0, bij voorkeur lager dan 4,5, bij voorkeur lager dan 4,0, maar bij voorkeur niet lager dan 3,0. In deze laatste uitvoering kan ook een aanzienlijke vermindering van alle monovalente zouten in het retentaat worden bereikt. In deze uitvoering is het membraan bij voorkeur een dunnefilmcomposietmembraan (TFC), een polyamidemembraan op basis van piperazin, met een MgSO4-afstoting van ongeveer 50-90 %, en een NaCl-afstoting van niet meer dan 50 %. Een voorbeeld van een dergelijk membraan is TriSep” UA60. Onder deze omstandigheden worden ook de resterende zouten effectief verwijderd, zodat een zoutarm of vrijwel zoutloos gezuiverd neutrale of gesialyleerde HMO- concentraat ontstaat. In deze uitvoering wordt na voltooiing van de concentratiestap de pH van het neutrale of gesialyleerde HMO-concentraat bij voorkeur ingesteld tussen 4-6 voordat de volgende stap wordt uitgevoerd (bijv. verdamping, drogingsstolling, steriele filtratie).In another implementation of the concentration by membrane filtration, the chosen membrane is a nanofiltration membrane with a molecular weight cut-off (MWCO) of 500-3500 Da and an active (top) layer of polyamide ("loose" NF membrane) and the concentration step is performed such that the pH is less than 5.0, preferably less than 4.5, preferably less than 4.0, but preferably not less than 3.0. In this latter embodiment, a significant reduction of all monovalent salts in the retentate can also be achieved. In this embodiment, the membrane is preferably a thin film composite membrane (TFC), a piperazine-based polyamide membrane, with a MgSO4 repellency of about 50-90%, and a NaCl repellency of no more than 50%. An example of such a membrane is TriSep” UA60. Under these conditions, the remaining salts are also effectively removed, resulting in a low-salt or virtually salt-free purified neutral or sialylated HMO concentrate. In this embodiment, upon completion of the concentration step, the pH of the neutral or sialylated HMO concentrate is preferably adjusted to between 4-6 before performing the next step (e.g., evaporation, dry-coagulation, sterile filtration).

Droging van de gezuiverde HMO-bevattende stroom om een gestolde neutrale of gesialyleerde HMO te verkrijgen in stap e)Drying of the purified HMO-containing stream to obtain a solidified neutral or sialylated HMO in step e)

Bij voorkeur wordt de neutrale of gesialyleerde HMO na de scheidings-/zuiverings- /concentratiestappen volgens de stappen a) tot en met d) en de hieronder aangegeven optionele methodestappen in vaste vorm via een drogingsstap (stap e)) bezorgd.Preferably, the neutral or sialylated HMO is delivered in solid form via a drying step (step e)) after the separation/purification/concentration steps according to steps a) to d) and the optional method steps indicated below.

Bij voorkeur bestaat de drogingsstap e) uit de sproeidroging van de neutrale of gesialyleerdePreferably, the drying step e) consists of the spray-drying of the neutral or sialylated

HMO-bevattende stroom, bij voorkeur uit de sproeidroging van de neutrale of gesialyleerdeHMO-containing stream, preferably from the spray drying of the neutral or sialylated

HMO-bevattende stroom.HMO-containing stream.

Bij voorkeur leidt de sproeidroging tot een gestolde neutrale of gesialyleerde HMO met een amorfe structuur, d.w.z. dat een amorf poeder wordt verkregen.Preferably, the spray-drying results in a solidified neutral or sialylated HMO with an amorphous structure, i.e. an amorphous powder is obtained.

In een uitvoering wordt de sproeidroging uitgevoerd bij een concentratie van de neutrale of gesialyleerde HMO van 20-60 % (w/v), bij voorkeur 30-50 % (w/v), meer bij voorkeur 35-45 % (w/v), en een inlaattemperatuur van 110-150 °C, bij voorkeur 120-140 °C, meer bij voorkeur 125-135 °C en/of een uitlaattemperatuur van 60-80 °C, bij voorkeur 65-70 °C.In one embodiment, the spray drying is performed at a concentration of the neutral or sialylated HMO of 20-60% (w/v), preferably 30-50% (w/v), more preferably 35-45% (w/v). ), and an inlet temperature of 110-150°C, preferably 120-140°C, more preferably 125-135°C and/or an outlet temperature of 60-80°C, preferably 65-70°C.

In sommige uitvoeringen heeft de neutrale of gesialyleerde HMO-bevattende stroom die in de sproeidroger wordt gevoerd een Brix-waarde van ongeveer 8 tot ongeveer 75 % Brix. In sommige uitvoeringen ligt de Brix-waarde tussen ongeveer 30 en ongeveer 65 % Brix. In sommige uitvoeringen ligt de Brix-waarde tussen ongeveer 50 en ongeveer 60 % Brix. In sommige uitvoeringen heeft de toevoer in de sproeidroger een temperatuur van ongeveer 2 tot ongeveer 70 °C vlak voordat hij in druppeltjes in de sproeidroger wordt verdeeld. In sommige uitvoeringen heeft de toevoer in de sproeidroger een temperatuur van ongeveer 30 tot ongeveer 60 °C vlak voordat hij in druppeltjes in de sproeidroger wordt verdeeld. In sommige uitvoeringen heeft de toevoer in de sproeidroger een temperatuur van ongeveer 2 tot ongeveer 30 °C vlak voordat hij in druppeltjes in de sproeidroger wordt verdeeld. In sommige uitvoeringen wordt bij de sproeidroging lucht met een inlaattemperatuur van 120 tot 280 °C gebruikt. In sommige uitvoeringen is de luchtinlaattemperatuur van 120 tot 210 °C. In sommige uitvoeringen is de luchtinlaattemperatuur van ongeveer 130 tot ongeveer 190 °C. In sommige uitvoeringen is de luchtinlaattemperatuur van ongeveer 135 tot ongeveer 160 °C. In sommige uitvoeringen wordt bij de sproeidroging lucht met een luchtuitlaattemperatuur van ongeveer 80 tot ongeveer 110 °C gebruikt. In sommige uitvoeringen is de luchtuitlaattemperatuur van ongeveer 100 tot ongeveer 110 °C. In sommige uitvoeringen wordt de sproeidroging bij een temperatuur van ongeveer 20 tot ongeveer 90 °C uitgevoerd.In some embodiments, the neutral or sialylated HMO-containing stream fed into the spray dryer has a Brix value of about 8 to about 75% Brix. In some embodiments, the Brix value is between about 30 and about 65% Brix. In some embodiments, the Brix value is between about 50 and about 60% Brix. In some embodiments, the feed in the spray dryer has a temperature of from about 2 to about 70°C just before it is divided into droplets in the spray dryer. In some embodiments, the feed in the spray dryer has a temperature of about 30 to about 60°C just before it is divided into droplets in the spray dryer. In some embodiments, the feed in the spray dryer has a temperature of from about 2 to about 30°C just before it is divided into droplets in the spray dryer. In some versions, spray drying uses air with an inlet temperature of 120 to 280 °C. In some versions, the air inlet temperature is from 120 to 210 °C. In some embodiments, the air inlet temperature is from about 130 to about 190°C. In some embodiments, the air inlet temperature is from about 135 to about 160°C. In some embodiments, the spray drying uses air with an air outlet temperature of about 80 to about 110°C. In some embodiments, the air outlet temperature is from about 100 to about 110°C. In some embodiments, the spray drying is performed at a temperature of about 20 to about 90°C.

In sommige uitvoeringen is de sproeidroger een co-current sproeidroger. In sommige uitvoeringen is de sproeidroger aan een extern vloeistofbed vastgemaakt. In sommige uitvoeringen bestaat de sproeidroger uit een roterende schijf, een hogedrukspuitstuk of een spuitstuk met twee vloeistoffen. In sommige uitvoeringen bestaat de sproeidroger uit een verstuiverwiel. In sommige uitvoeringen is de sproeidroging de laatste zuiveringsstap voor de gewenste neutrale of gesialyleerde HMO.In some embodiments, the spray dryer is a co-current spray dryer. In some embodiments, the spray dryer is attached to an external fluid bed. In some versions, the spray dryer consists of a rotating disc, a high-pressure nozzle, or a two-fluid nozzle. In some versions, the spray dryer consists of an atomizer wheel. In some embodiments, the spray drying is the final purification step for the desired neutral or sialylated HMO.

Een andere mogelijkheid is dat de drogingsstollingsstap uit een indirecte drogingsmethode bestaat. In deze specificatie zijn indirecte drogers apparaten die geen gebruik maken van direct contact van het te drogen materiaal met een verwarmd procesgas voor de droging, maar in plaats daarvan rekenen op de warmteoverdracht via de wanden van de droger, bijv. via de wanden van de kuip in het geval van een trommeldroger, of afwisselend via de wanden van holle schoepen van een schoependroger, wanneer deze door de vaste stoffen draaien terwijl het warmteoverdrachtsmedium in de holle binnenkant van de schoepen circuleert. Andere voorbeelden van indirecte drogers zijn contactdrogers en vacuümtrommeldrogers.Another possibility is that the drying solidification step consists of an indirect drying method. In this specification, indirect dryers are devices that do not use direct contact of the material to be dried with a heated process gas for drying, but instead rely on heat transfer through the walls of the dryer, e.g. through the walls of the tub in the case of a drum dryer, or alternately through the walls of hollow blades of a paddle dryer, as they rotate through the solids as the heat transfer medium circulates in the hollow interior of the blades. Other examples of indirect dryers are contact dryers and vacuum drum dryers.

Een andere mogelijkheid is dat de drogingsstollingsstap uit een vriesdroging bestaat.Another possibility is that the drying solidification step consists of a freeze-drying.

Een andere mogelijkheid is dat de drogingsstollingsstap uit een kristallisatie bestaat (op voorwaarde dat de HMO in kristallijne vorm kan worden verkregen).Another possibility is that the drying solidification step consists of a crystallization (provided that the HMO can be obtained in crystalline form).

Optionele stappenOptional steps

Bij voorkeur omvat de methode volgens de uitvinding verder een zuivering van de HMO- bevattende stroom met een zuur kationenwisselaarshars, bij voorkeur een sterk zuur kationenwisselaarshars. Bij voorkeur is het kattonenwisselaarshars een polystyreen- divinylbenzeen-kationenwisselaarshars, meer bij voorkeur in geprotoneerde vorm.Preferably, the method according to the invention further comprises a purification of the HMO-containing stream with an acidic cation exchange resin, preferably a strong acid cation exchange resin. Preferably, the cattone exchange resin is a polystyrene divinyl benzene cation exchange resin, more preferably in protonated form.

In een dergelijke optionele behandeling met kationenwisselaarshars kunnen positief geladen materialen verder efficiënt uit de HMO-bevattende stroom worden verwijderd, bijvoorbeeld na de behandeling met actieve koolstof of de NF-stap, aangezien zij zich aan het hars binden, terwijl zure en neutrale HMO's niet door het zure kationenwisselaarshars zullen worden vastgehouden. Daarbij kunnen ook de hoeveelheden zouten en/of kleurstoffen en/of eiwitten verder worden verminderd.In such an optional cation exchange resin treatment, positively charged materials can further be efficiently removed from the HMO-containing stream, e.g. after the activated carbon treatment or the NF step, as they bind to the resin, while acidic and neutral HMOs do not pass through. the acidic cation exchange resin will be retained. In addition, the amounts of salts and/or dyes and/or proteins can be further reduced.

In een uitvoering bevat de stationaire fase (hars) sulfonaatgroepen. De bindingscapaciteit van de gebruikte harsen ligt doorgaans tussen 1,2 en 2,2 eq/l.In one embodiment, the stationary phase (resin) contains sulfonate groups. The binding capacity of the resins used is generally between 1.2 and 2.2 eq/l.

Wanneer een kationisch ionenwisselaarshars wordt gebruikt, kan de mate van verknoping worden gekozen afhankelijk van de bedrijfsomstandigheden van de ionenwisselaarskolom.When a cationic ion exchange resin is used, the degree of crosslinking can be selected depending on the operating conditions of the ion exchange column.

Een sterk verknoopt hars biedt het voordeel van duurzaamheid en een hoge mate van mechanische integriteit, maar heeft een verminderde porositeit en een afname van de massa- overdracht. Een zwak verknoopt hars is kwetsbaarder en heeft de neiging om op te zwellen door absorptie van de mobiele fase. De deeltjesgrootte van het ionenwisselaarshars wordt zodanig gekozen dat een efficiënte stroming van het eluent mogelijk is, terwijl de geladen materialen toch effectief worden verwijderd. Een geschikt debiet kan ook worden verkregen door een negatieve druk op het eluerende uiteinde van de kolom of een positieve druk op het ladende uiteinde van de kolom uit te oefenen en het eluent op te vangen. Een combinatie van positieve en negatieve druk kan ook worden gebruikt. De behandeling met kationisch ionenwisselaarshars kan op een conventionele manier worden uitgevoerd, bijv. per batch of continu.A highly cross-linked resin offers the advantage of durability and a high degree of mechanical integrity, but has reduced porosity and a decrease in mass transfer. A weakly cross-linked resin is more fragile and tends to swell due to absorption of the mobile phase. The particle size of the ion exchange resin is selected to allow efficient flow of the eluent while still effectively removing the charged materials. A suitable flow rate can also be obtained by applying negative pressure to the eluting end of the column or positive pressure to the loading end of the column and collecting the eluent. A combination of positive and negative pressure can also be used. The treatment with cationic ion exchange resin can be carried out in a conventional manner, e.g. batchwise or continuously.

Niet-limitatieve voorbeelden van een geschikt zuur kationenwisselaarshars zijn AmberliteNon-limiting examples of a suitable acidic cation exchange resin are Amberlite

IR100, Amberlite IR120, Amberlite FPC22, Dowex 50WX, Finex CS16GC, Finex CS13GC,IR100, Amberlite IR120, Amberlite FPC22, Dowex 50WX, Finex CS16GC, Finex CS13GC,

Finex CS12GC, Finex CS11GC, Lewatit S, Diaion SK, Diaion UBK, Amberjet 1000 enFinex CS12GC, Finex CS11GC, Lewatit S, Diaion SK, Diaion UBK, Amberjet 1000 and

Amberjet 1200.Amber Jet 1200.

Bij voorkeur wordt de bovengenoemde optionele behandeling met kationenuitwisselaarshars uitgevoerd na stap b) of stap c) van de methode volgens de uitvinding.Preferably, the above optional treatment with cation exchange resin is carried out after step b) or step c) of the method according to the invention.

In een andere voorkeursuitvoering omvat de methode volgens de uitvinding, inclusief de voorkeurs- en meer voorkeursrealisaties ervan, verder een stap waarin de gezuiverde neutrale of gesialyleerde HMO-bevattende oplossing, bij voorkeur na de concentratie volgens stap d) en voor de drogingsstap volgens stap e), steriel wordt gefilterd en/of aan endotoxineverwijdering wordt onderworpen, bij voorkeur door filtratie van de gezuiverde oplossing door een filter met 3 kDa of met behulp van een membraan met een poriegrootte van minder dan 0,5 um, minder dan 0,4 um, minder dan 0,3 um, of minder dan 0,2 um. Er moet echter worden opgemerkt dat de steriele filtratiestap niet bijdraagt aan de oplossing van het technische probleem, namelijk het verkrijgen van gezuiverde HMO of HMO's die geschikt zijn voor toediening aan de mens.In another preferred embodiment, the method according to the invention, including its preferred and more preferred realizations, further comprises a step in which the purified neutral or sialylated HMO-containing solution, preferably after the concentration according to step d) and before the drying step according to step e ), is sterile filtered and/or subjected to endotoxin removal, preferably by filtration of the purified solution through a 3 kDa filter or using a membrane with a pore size of less than 0.5 µm, less than 0.4 µm , less than 0.3 µm, or less than 0.2 µm. However, it should be noted that the sterile filtration step does not contribute to solving the technical problem of obtaining purified HMO or HMOs suitable for human administration.

Volgens een uitvoering maken zowel de stap van de behandeling met kationenwisselaarshars als de stap van de steriele filtratie, die hierboven zijn beschreven, deel uit van de methode van de uitvinding.In one embodiment, both the cation exchange resin treatment step and the sterile filtration step described above form part of the method of the invention.

Bijzondere uitvoeringen van de uitvindingParticular embodiments of the invention

Bij voorkeur omvat de methode volgens deze uitvinding geen ionenwisselaarsbehandelingsstap, d.w.z. dat de methode geen behandeling met een kationisch en/of anionisch ionenwisselaarshars omvat.Preferably, the method of this invention does not include an ion exchange treatment step, i.e., the method does not include treatment with a cationic and/or anionic ion exchange resin.

Bij voorkeur omvat de methode volgens deze uitvinding geen behandelingsstap met een basisch anionenwisselaarshars.Preferably, the method of this invention does not include a treatment step with a basic anion exchange resin.

Bij voorkeur omvat de methode volgens deze uitvinding geen elektrodialysestap.Preferably, the method of this invention does not include an electrodialysis step.

Bij voorkeur omvat de methode volgens deze uitvinding geen elektrodialysestap en geen behandelingsstap met een ionenwisselaarshars.Preferably, the method of this invention does not include an electrodialysis step and no treatment step with an ion exchange resin.

Bij voorkeur omvat de methode volgens deze uitvinding geen elektrodialysestap en geen behandelingsstap met een basisch anionenwisselaarshars.Preferably, the method of this invention does not include an electrodialysis step and no treatment step with a basic anion exchange resin.

In een voorkeursuitvoering waarin de methode volgens deze uitvinding stap a2) omvat, omvat die geen ultrafiltratie- en/of centrifugatiestap.In a preferred embodiment in which the method according to the invention comprises step a2), it does not comprise an ultrafiltration and/or centrifugation step.

In een voorkeursuitvoering waarin de methode volgens deze uitvinding stap a2) omvat, omvat die geen ultrafiltratie- en/of centrifugatiestap en geen elektrodialysestap.In a preferred embodiment in which the method according to the invention comprises step a2), it does not comprise an ultrafiltration and/or centrifugation step and no electrodialysis step.

In een voorkeursuitvoering waarin de methode volgens deze uitvinding stap a2) omvat, omvat die geen ultrafiltratie- en/of centrifugatiestap en geen behandelingsstap met een ionenwisselaarshars.In a preferred embodiment in which the method according to the invention comprises step a2), it does not include an ultrafiltration and/or centrifugation step and does not include a treatment step with an ion exchange resin.

In een voorkeursuitvoering waarin de methode volgens deze uitvinding stap a2) omvat, omvat die geen ultrafiltratie- en/of centrifugatiestap en geen behandelingsstap met een basisch anionenwisselaarshars.In a preferred embodiment in which the method according to the invention comprises step a2), it does not include an ultrafiltration and/or centrifugation step and does not include a treatment step with a basic anion exchange resin.

In een voorkeursuitvoering waarin de methode volgens deze uitvinding stap a2) omvat, omvat die geen ultrafiltratie- en/of centrifugatiestap en geen behandelingsstap met een ionenwisselaarshars en elektrodialysestap.In a preferred embodiment in which the method according to the invention comprises step a2), it does not include an ultrafiltration and/or centrifugation step and does not include a treatment step with an ion exchange resin and electrodialysis step.

In een voorkeursuitvoering waarin de methode volgens deze uitvinding stap a2) omvat, omvat die geen ultrafiltratie- en/of centrifugatiestap en geen behandelingsstap met een basisch anionenwisselaarshars en elektrodialysestap.In a preferred embodiment in which the method according to the invention comprises step a2), it does not include an ultrafiltration and/or centrifugation step and does not include a treatment step with a basic anion exchange resin and an electrodialysis step.

Bij voorkeur bestaat de methode volgens de uitvinding uit de volgende stappen, bij voorkeur in de volgende volgorde: - de voorbehandeling van de fermentatiebouillon door pH-aanpassing, verdunning en/of warmtebehandeling;, - de behandeling van de voorbehandelde fermentatiebouillon met actieve koolstof om een HMO-bevattende stroom te verkrijgen, waarbij de HMO door de actieve koolstof wordt geadsorbeerd en weer wordt gedesorbeerd door een waterig organisch oplosmiddel als eluent; - de zuivering van de hierboven verkregen HMO-bevattende stroom door gecombineerde nanofiltratie en diafiltratie, waarbij het nanofiltratiemembraan bij voorkeur in het bereik van 500-3000 Da MWCO ligt; - de concentratie van de gezuiverde HMO-bevattende stroom, bij voorkeur door verdamping; en - de sproeidroging van de gezuiverde HMO-bevattende stroom om een gestolde neutrale of gesialyleerde HMO te verkrijgen.Preferably, the method according to the invention consists of the following steps, preferably in the following order: - the pre-treatment of the fermentation broth by pH adjustment, dilution and/or heat treatment;, - the treatment of the pre-treated fermentation broth with active carbon to obtain a to obtain an HMO-containing stream in which the HMO is adsorbed by the active carbon and desorbed again by an aqueous organic solvent as eluent; - the purification of the HMO-containing stream obtained above by combined nanofiltration and diafiltration, the nanofiltration membrane preferably being in the range of 500-3000 Da MWCO; - the concentration of the purified HMO-containing stream, preferably by evaporation; and - the spray-drying of the purified HMO-containing stream to obtain a solidified neutral or sialylated HMO.

Nog meer bij voorkeur bestaat de methode volgens de uitvinding uit een opeenvolging van de volgende stappen, bij voorkeur in de volgende volgorde: - de voorbehandeling van de fermentatiebouillon door pH-aanpassing, verdunning en/of warmtebehandeling;, - de behandeling van de voorbehandelde fermentatiebouillon met actieve koolstof om een HMO-bevattende stroom te verkrijgen, waarbij de HMO door de actieve koolstof wordt geadsorbeerd en weer wordt gedesorbeerd door een waterig organisch oplosmiddel als eluent; - de zuivering van de hierboven verkregen HMO-bevattende stroom door gecombineerde nanofiltratie en diafiltratie, waarbij het nanofiltratiemembraan bij voorkeur in het bereik van 500-3000 Da MWCO ligt; - de concentratie van de gezuiverde HMO-bevattende stroom, bij voorkeur door verdamping; en - de sproeidroging van de gezuiverde HMO-bevattende stroom om een gestolde neutrale of gesialyleerde HMO te verkrijgen; of de methode bestaat uit de volgende stappen, bij voorkeur in de volgende volgorde: - de voorbehandeling van de fermentatiebouillon door pH-aanpassing, verdunning en/of warmtebehandeling;, - de behandeling van de voorbehandelde fermentatiebouillon met actieve koolstof om een HMO-bevattende stroom te verkrijgen, waarbij de HMO door de actieve koolstof wordt geadsorbeerd en weer wordt gedesorbeerd door een waterig organisch oplosmiddel als eluent; - de zuivering van de hierboven verkregen HMO-bevattende stroom door gecombineerde nanofiltratie en diafiltratie, waarbij het nanofiltrattemembraan bij voorkeur in het bereik van 500-3000 Da MWCO ligt; - de concentratie van de gezuiverde HMO-bevattende stroom, bij voorkeur door verdamping; en - de sproeidroging van de gezuiverde HMO-bevattende stroom om een gestolde neutrale of gesialyleerde HMO te verkrijgen.Even more preferably, the method according to the invention consists of a succession of the following steps, preferably in the following order: - the pre-treatment of the fermentation broth by pH adjustment, dilution and/or heat treatment;, - the treatment of the pre-treated fermentation broth with active carbon to obtain an HMO-containing stream, wherein the HMO is adsorbed by the active carbon and desorbed again by an aqueous organic solvent as eluent; - the purification of the HMO-containing stream obtained above by combined nanofiltration and diafiltration, the nanofiltration membrane preferably being in the range of 500-3000 Da MWCO; - the concentration of the purified HMO-containing stream, preferably by evaporation; and - the spray-drying of the purified HMO-containing stream to obtain a solidified neutral or sialylated HMO; or the method consists of the following steps, preferably in the following order: - the pre-treatment of the fermentation broth by pH adjustment, dilution and/or heat treatment;, - the treatment of the pre-treated fermentation broth with activated carbon to produce an HMO-containing stream wherein the HMO is adsorbed by the active carbon and desorbed again by an aqueous organic solvent as eluent; - the purification of the HMO-containing stream obtained above by combined nanofiltration and diafiltration, the nanofiltration membrane preferably being in the range of 500-3000 Da MWCO; - the concentration of the purified HMO-containing stream, preferably by evaporation; and - the spray-drying of the purified HMO-containing stream to obtain a solidified neutral or sialylated HMO.

In een andere voorkeursuitvoering bestaat de methode volgens de uitvinding uit de volgende stappen, bij voorkeur in de volgende volgorde: - de scheiding van de fermentatiebouillon door ultrafiltratie om een gescheiden HMO- bevattende stroom en een biomassa-afvalstroom te vormen; - de behandeling van de gescheiden HMO-bevattende stroom met een behandeling van actieve koolstof; - de zuivering van de HMO-bevattende stroom door gecombineerde nanofiltratie en diafiltratie, waarbij het nanofiltratiemembraan bij voorkeur in het bereik van 500-3000In another preferred embodiment, the method according to the invention consists of the following steps, preferably in the following order: - the separation of the fermentation broth by ultrafiltration to form a separated HMO-containing stream and a biomass waste stream; - treating the separated HMO-containing stream with an active carbon treatment; - the purification of the HMO-containing stream by combined nanofiltration and diafiltration, with the nanofiltration membrane preferably in the range of 500-3000

Da MWCO ligt; - de concentratie van de gezuiverde HMO-bevattende stroom, bij voorkeur door verdamping; enDa MWCO is located; - the concentration of the purified HMO-containing stream, preferably by evaporation; and

- de sproeidroging van de gezuiverde HMO-bevattende stroom om een gestolde neutrale of gesialyleerde HMO te verkrijgen.- the spray-drying of the purified HMO-containing stream to obtain a solidified neutral or sialylated HMO.

Nog meer bij voorkeur bestaat de methode volgens de uitvinding uit een opeenvolging van de volgende stappen, bij voorkeur in de volgende volgorde: - de scheiding van de fermentatiebouillon door ultrafiltratie om een gescheiden HMO- bevattende stroom en een biomassa-afvalstroom te vormen; - de behandeling van de gescheiden HMO-bevattende stroom met een behandeling van actieve koolstof; - de zuivering van de HMO-bevattende stroom door gecombineerde nanofiltratie en diafiltratie, waarbij het nanofiltratiemembraan bij voorkeur in het bereik van 500-3000Even more preferably, the method according to the invention consists of a sequence of the following steps, preferably in the following order: the separation of the fermentation broth by ultrafiltration to form a separated HMO-containing stream and a biomass waste stream; - treating the separated HMO-containing stream with an active carbon treatment; - the purification of the HMO-containing stream by combined nanofiltration and diafiltration, with the nanofiltration membrane preferably in the range of 500-3000

Da MWCO ligt; - de concentratie van de gezuiverde HMO-bevattende stroom, bij voorkeur door verdamping; en - de sproeidroging van de gezuiverde HMO-bevattende stroom om een gestolde neutrale of gesialyleerde HMO te verkrijgen; of de methode bestaat uit de volgende stappen, bij voorkeur in de volgende volgorde: - de scheiding van de fermentatiebouillon door ultrafiltratie om een gescheiden HMO- bevattende stroom en een biomassa-afvalstroom te vormen; - de behandeling van de gescheiden HMO-bevattende stroom met een behandeling van actieve koolstof, - de zuivering van de HMO-bevattende stroom door gecombineerde nanofiltratie en diafiltratie, waarbij het nanofiltratiemembraan bij voorkeur in het bereik van 500-3000Da MWCO is located; - the concentration of the purified HMO-containing stream, preferably by evaporation; and - the spray-drying of the purified HMO-containing stream to obtain a solidified neutral or sialylated HMO; or the method consists of the following steps, preferably in the following order: - the separation of the fermentation broth by ultrafiltration to form a separated HMO-containing stream and a biomass waste stream; - the treatment of the separated HMO-containing stream with an active carbon treatment, - the purification of the HMO-containing stream by combined nanofiltration and diafiltration, with the nanofiltration membrane preferably in the range of 500-3000

Da MWCO ligt; - de concentratie van de gezuiverde HMO-bevattende stroom, bij voorkeur door verdamping; en - de sproeidroging van de gezuiverde HMO-bevattende stroom om een gestolde neutrale of gesialyleerde HMO te verkrijgen.Da MWCO is located; - the concentration of the purified HMO-containing stream, preferably by evaporation; and - the spray-drying of the purified HMO-containing stream to obtain a solidified neutral or sialylated HMO.

In een aspect omvat de methode volgens de uitvinding, inclusief de hierboven beschreven voorkeurs- en meer voorkeursuitvoeringen, minstens een nanofiltratiestap waarbij het nanofiltratiemembraan een molecuulgewicht cut-off (MWCO) van 500-3000 Da heeft, de actieve (top)laag van het membraan uit polyamide bestaat, bij voorkeur polyamide op basis van piperazine, het membraan een MgSO4-afstotingsfactor van ongeveer 50-90 % en bij voorkeur een NaCl-afstotingsfactor van niet meer dan 50 % heeft en de nanofiltratiestap wordt uitgevoerd zodat de pH lager is dan 5,0, bij voorkeur lager dan 4,5, bij voorkeur lagerIn one aspect, the method of the invention, including the preferred and more preferred embodiments described above, comprises at least one nanofiltration step where the nanofiltration membrane has a molecular weight cut-off (MWCO) of 500-3000 Da, the active (top) layer of the membrane consists of polyamide, preferably piperazine based polyamide, the membrane has a MgSO4 rejection factor of about 50-90% and preferably a NaCl rejection factor of not more than 50% and the nanofiltration step is carried out so that the pH is less than 5 .0, preferably less than 4.5, preferably less

35 BE2022/5467 dan 4,0, maar bij voorkeur niet lager dan 3,0, zodat de te zuiveren neutrale of gesialyleerde35 BE2022/5467 than 4.0, but preferably not lower than 3.0, so that the neutral or sialylated

HMO wordt tegengehouden en de mono- en divalente zouten kunnen passeren en zich in het permeaat ophopen, en ook minstens een deel van de lactose kan passeren en zich in het permeaat kan ophopen. 3. Neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide geproduceerd volgens de methode van de uitvindingHMO is retained and the mono- and divalent salts can pass through and accumulate in the permeate, and at least some of the lactose can also pass through and accumulate in the permeate. 3. Neutral or sialylated breast milk oligosaccharide produced by the method of the invention

In een ander aspect heeft de uitvinding betrekking op een neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide, verkregen volgens de methode van de uitvinding.In another aspect, the invention relates to a neutral or sialylated breast milk oligosaccharide obtained by the method of the invention.

De neutrale of gesialyleerde HMO die volgens de beschreven methode in deze specificatie wordt gewonnen en gezuiverd, kan amorf of kristallijn zijn, maar is bij voorkeur amorf.The neutral or sialylated HMO recovered and purified by the method described in this specification may be amorphous or crystalline, but is preferably amorphous.

Bij voorkeur is de zuiverheid van de neutrale of gesialyleerde HMO op droge basis groter dan 80 massaprocent voor een enkele neutrale of gesialyleerde HMO op basis van droog materiaal; of voor mengsels van HMO's is de zuiverheid groter dan 70 % op basis van droog materiaal, voor de combinatie. Nog meer bij voorkeur is de zuiverheid van een enkele neutrale of gesialyleerde HMO groter dan 90 massaprocent.Preferably, the purity of the neutral or sialylated HMO on a dry basis is greater than 80% by weight for a single neutral or sialylated HMO on a dry basis; or for mixtures of HMOs, the purity is greater than 70% on a dry matter basis, for the combination. Even more preferably, the purity of a single neutral or sialylated HMO is greater than 90% by weight.

Bij voorkeur heeft de neutrale of gesialyleerde HMO minstens een van de volgende kenmerken (in gewicht): <2 % lactulose, <3 % fucose, <1 % galactose of <3 % glucose.Preferably, the neutral or sialylated HMO has at least one of the following characteristics (by weight): <2% lactulose, <3% fucose, <1% galactose, or <3% glucose.

In een uitvoering heeft de neutrale of gesialyleerde HMO een fijne fractie (kleiner dan of gelijk aan 10 um), van minder dan 10 %, bij voorkeur minder dan 5 %, meer bij voorkeur minder dan 1 %, meest bij voorkeur minder dan 0,1 %. De neutrale of gesialyleerde HMO heeft bij voorkeur ook een gemiddelde deeltjesgrootte (d 50) van meer dan 100 um, bij voorkeur meer dan 150 um, nog meer bij voorkeur meer dan 200 um.In one embodiment, the neutral or sialylated HMO has a fine fraction (less than or equal to 10 µm), of less than 10%, preferably less than 5%, more preferably less than 1%, most preferably less than 0, 1%. The neutral or sialylated HMO preferably also has an average particle size (d 50) of more than 100 µm, preferably more than 150 µm, even more preferably more than 200 µm.

De neutrale of gesialyleerde HMO geproduceerd volgens de methode van de uitvinding heeft een goede stroombaarheid. Bij voorkeur heeft de neutrale of gesialyleerde HMO een Carr- index van minder dan 30, waarbij de Carr-index (C) wordt bepaald aan de hand van de formule C = 100(1-p B/ p T), waarbij p B de vrij neergeslagen bulkdichtheid van het poeder en p T de afgetapte bulkdichtheid van het poeder na het ” neerslaan” is. Voor vrij stromende vaste stoffen zouden de waarden van bulkdichtheid en afgetapte dichtheid gelijkaardig zijn, met een lage waarde tot gevolg. Voor minder goed stromende vaste stoffen zouden de verschillen tussen deze waarden groter zijn, waardoor de Carr-index groter zou zijn.The neutral or sialylated HMO produced by the method of the invention has good flowability. Preferably, the neutral or sialylated HMO has a Carr index of less than 30, where the Carr index (C) is determined by the formula C = 100(1-pB/pT), where pB is the free precipitated bulk density of the powder and p T is the drained bulk density of the powder after "precipitation". For free-flowing solids, the values of bulk density and drained density would be similar, resulting in a low value. For less fluid solids, the differences between these values would be greater, causing the Carr index to be larger.

Bij voorkeur heeft de neutrale of gesialyleerde HMO een watergehalte van minder dan 15 massaprocent, minder dan 10 massaprocent, minder dan 9 massaprocent, minder dan 8 massaprocent, minder dan 7 massaprocent of minder dan 6 massaprocent. Om de terugwinning van het product te optimaliseren, heeft de neutrale of gesialyleerde HMO bij voorkeur een pH groter dan 3,0 in een oplossing van minstens 5 % en bij voorkeur een pH groter dan 4,0. Doorgaans wordt dit bereikt door de pH van de HMO-bevattende stroom voor de drogingsstap aan te passen tot meer dan 3,0. Bij voorkeur heeft de neutrale of gesialyleerdePreferably, the neutral or sialylated HMO has a water content of less than 15% by weight, less than 10% by weight, less than 9% by weight, less than 8% by weight, less than 7% by weight, or less than 6% by weight. To optimize product recovery, the neutral or sialylated HMO preferably has a pH greater than 3.0 in a solution of at least 5% and preferably a pH greater than 4.0. Typically, this is achieved by adjusting the pH of the HMO-containing stream to greater than 3.0 before the drying step. Preferably, the neutral or sialylated

HMO een pH tussen 4 en 7, meer bij voorkeur tussen 4,5 en 5,5.HMO has a pH between 4 and 7, more preferably between 4.5 and 5.5.

Ineen uitvoering is de volgens de methode van de uitvinding verkregen HMO een gedroogde neutrale of gesialyleerde HMO, bij voorkeur met een watergehalte van minder dan 6 massaprocent.In one embodiment, the HMO obtained by the method of the invention is a dried neutral or sialylated HMO, preferably with a water content of less than 6% by mass.

Ineen uitvoering is de volgens de methode van de uitvinding verkregen neutrale of gesialyleerde HMO in een voedingsproduct (bijv. voedsel voor mensen of dieren), voedingssupplement of geneesmiddel verwerkt.In one embodiment, the neutral or sialylated HMO obtained by the method of the invention is incorporated into a food product (e.g. human or animal food), food supplement or drug.

In sommige uitvoeringen wordt de neutrale of gesialyleerde HMO in babyvoeding verwerkt (bijv. zuigelingenvoeding). Zuigelingenvoeding is in het algemeen een gefabriceerd voedingsmiddel voor het voeden van zuigelingen als volledige of gedeeltelijke vervanging van moedermelk. In sommige uitvoerignen wordt zuigelingenvoeding verkocht als een poeder voor flesvoeding aan een zuigeling door het met water te mengen. De samenstelling van zuigelingenvoeding is meestal zodanig ontworpen dat ze moedermelk min of meer nabootst.In some embodiments, the bland or sialylated HMO is incorporated into infant formula (e.g., infant formula). Infant formula is generally a manufactured food for feeding infants as a full or partial replacement for breast milk. In some formats, infant formula is sold as a powder for formula feeding to an infant by mixing it with water. The composition of infant formulas is usually designed to more or less mimic breast milk.

In sommige uitvoeringen wordt een neutrale of gesialyleerde HMO gezuiverd volgens een methode in deze specificatie in zuigelingenvoeding verwerkt om voedingsvoordelen te bieden die vergelijkbaar zijn met de voordelen die worden geboden door een of meerdere neutrale of gesialyleerde HMO's in moedermelk. In sommige uitvoeringen wordt de neutrale of gesialyleerde HMO met een of meerdere ingrediënten van de zuigelingenvoeding gemengd.In some embodiments, a neutral or sialylated HMO purified by a method in this specification is incorporated into infant formula to provide nutritional benefits similar to those provided by one or more neutral or sialylated HMOs in human milk. In some embodiments, the neutral or sialylated HMO is mixed with one or more ingredients of the infant formula.

Voorbeelden van ingrediënten van zuigelingenvoeding zijn magere melk, koolhydraatbronnenExamples of infant formula ingredients are low-fat milk, carbohydrate sources

37 BE2022/5467 (bijv. lactose), eiwitbronnen (bijv. wei-eiwitconcentraat en caseïne), vetbronnen (bijv. plantaardige oliën zoals palmolie, saffloerolie met een hoog oliegehalte, raapzaadolie, kokosolie en/of zonnebloemolie; en visoliën), vitaminen (zoals vitamine A, B, B2, C en D), mineralen (zoals kaliumcitraat, calciumcitraat, magnesiumchloride, natriumchloride, natriumcitraat en calciumfosfaat).37 BE2022/5467 (e.g. lactose), protein sources (e.g. whey protein concentrate and casein), fat sources (e.g. vegetable oils such as palm oil, high oleic safflower oil, rapeseed oil, coconut oil and/or sunflower oil; and fish oils), vitamins ( such as vitamins A, B, B2, C and D), minerals (such as potassium citrate, calcium citrate, magnesium chloride, sodium chloride, sodium citrate and calcium phosphate).

Een ander aspect van de uitvinding heeft dus betrekking op een neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide, verkregen volgens de methode van de uitvinding, voor gebruik in de geneeskunde.Thus, another aspect of the invention relates to a neutral or sialylated breast milk oligosaccharide obtained by the method of the invention for use in medicine.

Een ander aspect van de uitvinding heeft dus betrekking op het gebruik van een neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide, verkregen volgens de methode van de uitvinding, voor voedings- en/of voedertoepassingen.Thus, another aspect of the invention relates to the use of a neutral or sialylated breast milk oligosaccharide obtained by the method of the invention for food and/or feed applications.

Een ander aspect van de uitvinding heeft dus betrekking op een voedingsmiddel of cosmetisch product dat de neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide bevat, verkregen volgens de methode van de uitvinding.Thus, another aspect of the invention relates to a food or cosmetic product containing the neutral or sialylated breast milk oligosaccharide obtained by the method of the invention.

VOORBEELDENEXAMPLES

Voorbeeld 1: vergelijking van MgSO4- en Na:SO4-afstoting 2,01 van 0,2 % MgSO4-oplossing werd geladen in een MMS SW18-systeem uitgerust met spiraalgewonden Trisep” UA60-element met een grootte van 1812 (piperazine-amide,Example 1: MgSO4 and Na:SO4 Repulsion Comparison 2.01 of 0.2% MgSO4 solution was loaded into an MMS SW18 system equipped with 1812 size Trisep” UA60 spiral wound element (piperazine amide,

MWCO 1000-3500 Da, membraanoppervlakte 0,23 m?). Het systeem draaide met een doorstroming van 400 l/u, waarbij het permeaat terug naar de toevoertank vloeide. Er werd gedurende minstens 5 min. of tot een constant geleidingsvermogen in het permeaat onder elke omstandigheid gestabiliseerd. De pH werd aangepast door een kleine hoeveelheid 25 %MWCO 1000-3500 Da, membrane area 0.23 m?). The system ran at a flow rate of 400 l/h, with the permeate flowing back to the feed tank. The permeate was stabilized for at least 5 minutes or to a constant conductivity under each condition. The pH was adjusted by adding a small amount of 25%

H;SO:-oplossing toe te voegen. Het geleidingsvermogen van het permeaat en het retentaat wordt in de onderstaande tabel aangegeven.H;SO: solution. The conductivity of the permeate and retentate is indicated in the table below.

MgSO4-afstoting vs pHMgSO4 Repulsion vs pH

T 25 % Stro | Geleidingsver | GeleidingsverT 25 % Straw | Conductivity | conductivity

T pH | DebTpH| The B

MP H;SO4 | om mogen mogen Afstotingsf (© (retent | iet (ba toegevo (1/m? retentaat permeaat actorMP H 2 SO 4 | om may be allowed Repulsionf (© (retent | iet (ba added (1/m? retentate permeate actor

C) aat) | (lu) r) egd (ul) u) (mS/em) (mS/em) 24, 6,06 | 21,1 | 91,6 2.100 0,785 62,61 % 7 25, 10 > 20 4,91 20,9 | 90,8 2.100 0,587 72,05 % 24, 10 40 435 | 20,9 | 90,8 2.130 0,624 70,70 % 9 25, 10 3,93 | 20,5 | 892 2.170 0,520 76,04 % 1 25, 10 1 160 3,56 | 20,2 | 87,7 2.260 0,538 76,19 %C) ate) | (lu) r) egd (ul) u) (mS/em) (mS/em) 24, 6.06 | 21.1 | 91.6 2,100 0.785 62.61 % 7 25.10 > 20 4.91 20.9 | 90.8 2,100 0.587 72.05 % 24.10 40 435 | 20.9 | 90.8 2,130 0.624 70.70 % 9 25.10 3.93 | 20.5 | 892 2,170 0.520 76.04 % 1 25, 10 1 160 3.56 | 20.2 | 87.7 2,260 0.538 76.19%

Hetzelfde experiment werd uitgevoerd met een 0,2 % Na:SO4-oplossing.The same experiment was performed with a 0.2% Na:SO4 solution.

T 25% Stro | Geleidingsver | GeleidingsverT 25% Straw | Conductivity | conductivity

T pH DebT pH Deb

MP H;SO4 om mogen mogen Afstotingsf (© (retent | iet (ba toegevo (1/m? retentaat permeaat actorMP H;SO4 om allowed Repulsionf (© (retent | iet (ba added (1/m? retentate permeate actor

C) aat) | (lu) 10 | 22, 5,70 | 16,7 | 72,6 2.840 0,0755 97,34 %C) ate) | (lu) 10 | 22, 5.70 | 16.7 | 72.6 2,840 0.0755 97.34%

Jp VTT EE 10 [22,] 10 5,24 | 15,6 | 67,8 2.840 0,1706 93,99 %Jp VTT EE 10 [22.] 10 5.24 | 15.6 | 67.8 2,840 0.1706 93.99%

Cp LT EE 10 | 22, 30 439 | nvt|nvt. 2.840 0,824 70,99 %Cp LT EE 10 | 22, 30 439 | N/A|N/A. 2,840 0.824 70.99%

HENTHEM

10 |22,| 70 3,91 | 13,6 | 59,1 2.850 1,706 40,14 % ep LVL EE 10 [22,| 110 3,71 | 18,0 | 78,3 2.880 1,939 32,67 %10 |22,| 70 3.91 | 13.6 | 59.1 2,850 1.706 40.14 % ep LVL EE 10 [22,| 110 3.71 | 18.0 | 78.3 2,880 1,939 32.67%

DA ADA A

10 | 22, 190 3,48 18,4 | 80,0 2.970 2.090 28,67 %10 | 22, 190 3.48 18.4 | 80.0 2,970 2,090 28.67%

EH REEH RE

10 | 22, 350 3,21 18,4 | 80,0 3.060 2.230 27,12 %10 | 22, 350 3.21 18.4 | 80.0 3,060 2,230 27.12%

DADA

10 | 22, 670 2,94 18,4 | 80,0 3.280 2.500 23,78%10 | 22, 670 2.94 18.4 | 80.0 3,280 2,500 23.78%

EN NHAND NH

10 | 22, 1310 2,65 18,1 | 78,7 3.730 2.870 23,06 %10 | 22, 1310 2.65 18.1 | 78.7 3,730 2,870 23.06%

DNDN

Er werd aangetoond dat de afstoting van natriumzout met divalent tegenion, zoals sulfaat, sterk pH-afhankelijk is in het geval van NF met polyamidemembraan. Omdat na de behandeling met een sterk kationenwisselaarshars een aanzienlijke hoeveelheid natriumzout in de verzamelde fracties aanwezig is als gevolg van de neutralisatie met een NaOH-oplossing (zie stap #3 in voorbeeld 4), kunnen deze zouten doeltreffend worden verwijderd in een tweede NF/DF (zie stap #5 in voorbeeld 4) wanneer de DF wordt uitgevoerd bij een pH van minder dan 4,5, bij voorkeur minder dan 4,0, wat leidt tot een vrijwel zoutvrije oplossing (zoals beoordeeld aan de hand van het geleidingsvermogen). In dit opzicht is het niet nodig om basische anionische harsen te gebruiken om een zoutvrije oplossing te verkrijgen.It was shown that the repulsion of sodium salt with divalent counterion, such as sulfate, is strongly pH dependent in the case of NF with polyamide membrane. Since a significant amount of sodium salt is present in the collected fractions after treatment with a strong cation exchange resin as a result of the neutralization with a NaOH solution (see step #3 in example 4), these salts can be effectively removed in a second NF/DF (see step #5 in Example 4) when the DF is performed at a pH of less than 4.5, preferably less than 4.0, resulting in a substantially salt-free solution (as judged by conductivity). In this regard, it is not necessary to use basic anionic resins to obtain a salt-free solution.

Voorbeeld 2 — Bepaling van de afstotingsfactor van een substantie op een membraanExample 2 — Determination of the repulsion factor of a substance on a membrane

De afstoting van NaCl en MgSO4 op een membraan wordt als volgt bepaald: in een membraanfiltratiesysteem wordt een NaCl- (0,1 %) of een MgSO4-oplossing (0,2 %) over de gekozen membraanplaat (voor Tami: buismodule) gecirculeerd terwijl de permeaatstroom terug naar de toevoertank wordt geleid. Het systeem wordt gedurende 10 minuten bij 10 bar en 25 °C gestabiliseerd voordat monsters van het permeaat en het retentaat worden genomen.The repellency of NaCl and MgSO4 on a membrane is determined as follows: in a membrane filtration system, a NaCl (0.1 %) or a MgSO4 solution (0.2 %) is circulated over the chosen membrane plate (for Tami: tube module) while the permeate stream is returned to the feed tank. The system is stabilized at 10 bar and 25 °C for 10 minutes before sampling the permeate and retentate.

De afstotingsfactor wordt aan de hand van het gemeten geleidingsvermogen van de monsters berekend: (1-kp/kr): 100, waarbij kp het geleidingsvermogen van NaCl of MgSO4 in het permeaat en kr het geleidingsvermogen van NaCl of MgSO4 in het retentaat is. membraan | actieve laag | MWCO spec. meting in spec. meting inThe rejection factor is calculated from the measured conductivity of the samples: (1-kp/kr): 100, where kp is the conductivity of NaCl or MgSO4 in the permeate and kr is the conductivity of NaCl or MgSO4 in the retentate. membrane | active layer | MWCO spec. measurement in spec. measurement

Trisep® | piperazine- | 1000- iNTrisep® | piperazine | 1000-in

EE ESEE ES

De afstotingsfactor van een koolhydraat wordt op een gelijkaardige manier, met dit verschil dat de afstotingsfactor wordt berekend op basis van de concentratie van de monsters (bepaald door HPLC): (1-Cp/Cr)-100, waarbij Cp de concentratie van het koolhydraat in het permeaat en Cr de concentratie van het koolhydraat in het retentaat is.The rejection factor of a carbohydrate is calculated in a similar way, except that the rejection factor is calculated based on the concentration of the samples (determined by HPLC): (1-Cp/Cr)-100, where Cp is the concentration of the carbohydrate in the permeate and Cr is the concentration of the carbohydrate in the retentate.

Voorbeeld 3Example 3

Algemeen: Het gehalte aan koolhydraten en onzuiverheden werd gekwantificeerd met behulp van gekalibreerde HPLC en/of HPAEC. De oplosbare eiwitten werden met de Bradford- bepaling gekwantificeerd. De kleur werd gekwantificeerd door UV-absorptiemeting bij 400 nm in een cuvette met een pad van 1 cm. De kleurindex CI 400 wordt aan de hand van de volgende formule berekend: CI 400 = 1000* Abs 400/Brix.General: Carbohydrate and impurity content was quantified using calibrated HPLC and/or HPAEC. The soluble proteins were quantified by the Bradford assay. The color was quantified by UV absorbance measurement at 400 nm in a cuvette with a 1 cm pad. The color index CI 400 is calculated using the following formula: CI 400 = 1000* Abs 400/Brix.

Fermentatie: LNT werd geproduceerd door microbiële fermentatie met behulp van een genetisch gemodificeerde E.coli-stam. De fermentatie werd uitgevoerd door de stam te kweken in aanwezigheid van exogeen toegevoegde lactose en een geschikte koolstofbron, waarbij LNT werd geproduceerd dat vergezeld ging van de trisacharide lacto-N-triose II, de hexasacharide pLNH II en niet-gereageerde lactose als belangrijkste koolhydraatonzuiverheden in de fermentatiebouillon. Aan het einde van de fermentatie werd de pH op 4 gebracht door 25 % zwavelzuur toe te voegen.Fermentation: LNT was produced by microbial fermentation using a genetically modified E.coli strain. The fermentation was performed by culturing the strain in the presence of exogenously added lactose and a suitable carbon source, producing LNT accompanied by the trisaccharide lacto-N-triose II, the hexasaccharide pLNH II and unreacted lactose as major carbohydrate impurities in the fermentation broth. At the end of the fermentation, the pH was adjusted to 4 by adding 25% sulfuric acid.

Voorbehandeling van de bouillon en verwijdering van de biomassa door centrifugati: een deel van de verkregen bouillon (4,3 kg, pH 4,45 na opslag) werd verdund tot een totaal van 11,1 kg met gedestilleerd water, gevolgd door een verwarming tot 80 °C binnen 40 minuten en onmiddellijk laten afkoelen tot de omgevingstemperatuur. De pH werd op 3,2 gebracht en de bouillon werd gecentrifugeerd. Het verkregen supernatans (9,0 kg) werd voorzichtig weggepompt om het van het sedigment (2130 g) te scheiden. Het verkregen geklaarde supernatans had de volgende parameters: Brix = 8,1, geleidingsvermogen 7,50 mS/cm, pH 3,27.Pre-treatment of the broth and removal of the biomass by centrifugation: part of the resulting broth (4.3 kg, pH 4.45 after storage) was diluted to a total of 11.1 kg with distilled water, followed by heating to 80 °C within 40 minutes and allow to cool immediately to ambient temperature. The pH was adjusted to 3.2 and the broth was centrifuged. The resulting supernatant (9.0 kg) was carefully pumped out to separate it from the sediment (2130 g). The clarified supernatant obtained had the following parameters: Brix = 8.1, conductivity 7.50 mS/cm, pH 3.27.

Membraanfiltratie: een deel van het verkregen supernatans (4,5 kg) werd onderworpen aan membraanfiltratie in een MMS SW18-systeem uitgerust met Synder® XT2B-1812F- membraanelement (UF PES-membraan, MWCO 1000 Da, oppervlakte 0,32 m°) bij transmembraandruk (TMP) = 3,0 bar, T = 23-25 °C en een doorstroming van 400 l/u. 3,5 kg membraanpermeaat werd in 35 min. opgevangen. Vervolgens werd het resterende retentaat (Brix 9,7, geleidingsvermogen 7,28 mS/cm) gediafiltreerd door continue toevoeging van water (3,0 | bij een debiet van 5,4 l/uur) onder dezelfde omstandigheden, zodat uiteindelijk een membraanpermeaat (6,9 kg, Brix 5,4) werd verkregen en een retentaat dat grotendeels ontdaan was van HMO's (Brix 1,0) en verrijkt was met eiwitten en resterende gesuspendeerde vaste stoffen.Membrane filtration: part of the obtained supernatant (4.5 kg) was subjected to membrane filtration in an MMS SW18 system equipped with Synder® XT2B-1812F membrane element (UF PES membrane, MWCO 1000 Da, area 0.32 m°) at transmembrane pressure (TMP) = 3.0 bar, T = 23-25 °C and a flow of 400 l/h. 3.5 kg of membrane permeate was collected in 35 minutes. Subsequently, the remaining retentate (Brix 9.7, conductivity 7.28 mS/cm) was diafiltered by continuous addition of water (3.0 | at a flow rate of 5.4 l/h) under the same conditions, resulting in a final membrane permeate ( 6.9 kg, Brix 5.4) was obtained and a retentate largely depleted of HMOs (Brix 1.0) and enriched in proteins and residual suspended solids.

Losse NF: het hierboven verkregen productbevattend membraanpermeaat (6,8 kg, geleidingsvermogen 5,84 mS/cm, pH 3,40) werd eerst geconcentreerd in hetzelfde SW18- systeem uitgerust met Trisep® UA60-1812-membraanelement (piperazine-amide, MWCO 1000-3500 Da, oppervlakte 0,23 m”, LNT-afstotingsfactor >99 %) door 5,44 kg permeaat te verwijderen in 26 minuten (TMP = 30 bar, T = 40-42 °C, doorstroming 400 l/u), gevolgd door diafiltratie onder dezelfde omstandigheden met toevoeging van 4 1 water met een debiet van 5,0 l/u debiet om in totaal 9,4 kg NF-permeaat te bekomen (Brix 0,6, geleidingsvermogen 4,28 mS/cm, pH 3,21). Het verkregen retentaat (Brix 20,2, geleidingsvermogen 1,67 mS/em, pH 3,54) werd verder gediafiltreerd met nog eens 10 liter water om een tweede NF-permeaat te verkrijgen (10,3 kg, Brix 0,1, geleidingsvermogen 0,458 mS/cm, pH 3,71) en het uiteindelijke NF-retentaat dat vrijwel zoutvrij was (ca. 1500 g, Brix 18,2, geleidingsvermogen 0,48 mS/cm, pH 4,28).Loose NF: The product-containing membrane permeate obtained above (6.8 kg, conductivity 5.84 mS/cm, pH 3.40) was first concentrated in the same SW18 system equipped with Trisep® UA60-1812 membrane element (piperazine amide, MWCO 1000-3500 Da, area 0.23 m", LNT rejection factor >99 %) by removing 5.44 kg permeate in 26 minutes (TMP = 30 bar, T = 40-42 °C, flow 400 l/h) , followed by diafiltration under the same conditions with the addition of 4 l of water at a flow rate of 5.0 l/h to obtain a total of 9.4 kg of NF permeate (Brix 0.6, conductivity 4.28 mS/cm, pH 3.21). The resulting retentate (Brix 20.2, conductivity 1.67 mS/em, pH 3.54) was further diafiltered with another 10 liters of water to obtain a second NF permeate (10.3 kg, Brix 0.1, conductivity 0.458 mS/cm, pH 3.71) and the final NF retentate which was substantially salt free (ca. 1500 g, Brix 18.2, conductivity 0.48 mS/cm, pH 4.28).

AC-behandeling: Een deel van het verkregen NF-retentaat (379 g) werd met een toevoersnelheid van ca. 6 ml/min. door een korte kolom gevoerd, die wa gevuld metAC treatment: Part of the obtained NF retentate (379 g) was added at a feed rate of about 6 ml/min. passed through a short column, which was filled with

Silcarbon® CW20 (6,00 g, ID = 2,1 cm, bedhoogte = 5,3 cm, voorgespoeld met 200 ml gedeïoniseerd water), gevolgd door 50 ml waterelutie om 407 g kleurloze oplossing te verkrijgen (Brix 16,2, geleidingsvermogen 0,455 mS/cm, pH 4,17, Abs 400 0,0130 in overeenstemming met CI 400 = 0,80). De verkregen oplossing werd gevriesdroogd en leverde 62 g witte vaste stof op.Silcarbon® CW20 (6.00 g, ID = 2.1 cm, bed height = 5.3 cm, pre-rinsed with 200 ml deionized water), followed by 50 ml water elution to obtain 407 g colorless solution (Brix 16.2, conductivity 0.455 mS/cm, pH 4.17, Abs 400 0.0130 in accordance with CI 400 = 0.80). The resulting solution was lyophilized to yield 62 g of white solid.

Voorbeeld 4Example 4

Fermentatie: 2'-FL werd geproduceerd door microbiële fermentatie met behulp van een genetisch gemodificeerde Æ. coli-stam die een recombinant gen bevat dat een a-1,2- fucosyltransferase codeert. De fermentatie werd uitgevoerd door de stam te kweken in aanwezigheid van exogeen toegevoegde lactose en een geschikte koolstofbron, waarbij 2’-FL werd geproduceerd dat vergezeld ging van DFL en niet-gereageerde lactose als belangrijkste koolhydraatonzuiverheden in de fermentatiebouillon.Fermentation: 2'-FL was produced by microbial fermentation using a genetically modified Æ. coli strain containing a recombinant gene encoding an α-1,2-fucosyltransferase. The fermentation was performed by growing the strain in the presence of exogenously added lactose and a suitable carbon source, producing 2'-FL accompanied by DFL and unreacted lactose as major carbohydrate impurities in the fermentation broth.

Zuivering: 1. UF/DF: De verkregen bouillon werd aangezuurd tot pH = 3,8 met zwavelzuur, gevolgd door ultrafiltratie-diafiltratie door keramische membraanelementen van 15 kDa bij T = 60 °C in een industrieel continu UF-systeem met een DF-waterstroom van ongeveer 2 keer de toevoerstroom en een UF-retentaatstroom van ca. de helft van de toevoerstroom. 2. NF/DF: De productbevattende UF-permeaatstroom (Brix ca. 5) werd onmiddellijk verwerkt door losse nanofiltratie met diafiltratie in een industrieel continu NF-systeem dat was uitgerust met Trisep® UA60-membraanelementen (piperazine-amide, MWCO 1000-3500 Da) (TMP = 30 bar, T = 15 °C) en met een DF-waterstroom die ongeveer twee keer zo groot was als de toevoerstroom (UF-permeaat). 3. Behandeling met een sterk kationenwisselaarshars: Een monster van het verkregen NF- retentaat (4,7 kg, Brix 23,8, geleidingsvermogen: 2,20 mS/cm, pH = 3,9, CI 400: 134) werd door een kolom geleid die was gevuld met 800 ml Dowex® 88 hars in H*-vorm (capaciteit 1,8 eq/l) bij een debiet van 2 bedvolumes per uur, gevolgd door elutie met water (730 ml). Er werd 400 ml fracties verzameld. Elke fractie werd getitreerd met IM NaOH tot pH = 4,5 en geanalyseerd op suiker-, kleur- en eiwitgehalte. De fracties #2-13 met aangepaste pH werden gecombineerd om 5,4 kg gele oplossing te verkrijgen (Brix 20,2, geleidingsvermogen: 3,48 mS/cm, pH = 4,55, CI 400: 67,3). 4. Ontkleuring met actieve houtskool: Een deel van de verkregen oplossing (3,5 kg) werd door gegranuleerde actieve houtskool CPG LF (75 g, 150 ml) geleid die in een kolom (ID =Purification: 1. UF/DF: The broth obtained was acidified to pH = 3.8 with sulfuric acid, followed by ultrafiltration-diafiltration through 15 kDa ceramic membrane elements at T = 60 °C in an industrial continuous UF system with a DF- water flow of approximately 2 times the feed flow and a UF retentate flow of approximately half the feed flow. 2. NF/DF: The product-containing UF-permeate stream (Brix approx. 5) was processed immediately by loose nanofiltration with diafiltration in an industrial continuous NF system equipped with Trisep® UA60 membrane elements (piperazine amide, MWCO 1000-3500 Da) (TMP = 30 bar, T = 15 °C) and with a DF water flow approximately twice as large as the feed flow (UF permeate). 3. Treatment with a strong cation exchange resin: A sample of the obtained NF retentate (4.7 kg, Brix 23.8, conductivity: 2.20 mS/cm, pH = 3.9, CI 400: 134) was passed through a column filled with 800 ml Dowex® 88 resin in H* form (capacity 1.8 eq/l) at a flow rate of 2 bed volumes per hour, followed by elution with water (730 ml). 400 ml fractions were collected. Each fraction was titrated with IM NaOH to pH = 4.5 and analyzed for sugar, color and protein content. The pH-adjusted fractions #2-13 were combined to obtain 5.4 kg of yellow solution (Brix 20.2, conductivity: 3.48 mS/cm, pH = 4.55, CI 400: 67.3). 4. Decolorization with activated charcoal: Part of the obtained solution (3.5 kg) was passed through granulated activated charcoal CPG LF (75 g, 150 ml) placed in a column (ID =

16 mm) was geplaatst bij +60 °C en een debiet van 2 bedvolumes per uur, gevolgd door elutie met water (300 ml). Er werd 150 ml fracties verzameld. De fracties #2-24 werden gecombineerd om 3,5 kg vrijwel kleurloze oplossing te verkrijgen (Brix 19,7, geleidingsvermogen 3,42 mS/cm, pH = 5,19, CI 400: 1,23). 5. NF/DF: De verkregen oplossing (3,4 kg) werd onderworpen aan diafiltratie met constant volume in een MMS SW 18-membraanfiltratiesysteem, uitgerust met een spiraalgewonden16 mm) was placed at +60 °C and a flow rate of 2 bed volumes per hour, followed by elution with water (300 ml). 150 ml fractions were collected. Fractions #2-24 were combined to obtain 3.5 kg of almost colorless solution (Brix 19.7, conductivity 3.42 mS/cm, pH = 5.19, CI 400: 1.23). 5. NF/DF: The resulting solution (3.4 kg) was subjected to constant volume diafiltration in an MMS SW 18 membrane filtration system equipped with a spiral wound

Trisep” UA60-membraan met een grootte van 1812, onder de volgende omstandigheden: doorstroming = 400 l/u, TMP = 30 bar, T = 30-35 °C en DF waterstroom 4,0 l/u. Eerst werd de DF uitgevoerd bij een pH van ongeveer 5 (10 1), vervolgens bij 3,8 (nog eens 10 1). Tot slot werd het retentaat verder geconcentreerd bij TMP = 39 bar, gevolgd door een aanpassing van de pH tot 4,5 met een 4 % NaOH-oplossing en uit het systeem gepompt om 1,8 kg eindoplossing te verkrijgen (Brix 30,6, geleidingsvermogen: 0,216 mS/cm, pH = 4,49,Trisep” UA60 membrane with a size of 1812, under the following conditions: flow = 400 l/h, TMP = 30 bar, T = 30-35 °C and DF water flow 4.0 l/h. First the DF was performed at a pH of about 5 (10 L), then at 3.8 (another 10 L). Finally, the retentate was further concentrated at TMP = 39 bar, followed by a pH adjustment to 4.5 with a 4% NaOH solution and pumped out of the system to obtain 1.8 kg of final solution (Brix 30.6, conductivity: 0.216 mS/cm, pH = 4.49,

CI 400: 1,35). 6. Microfiltratie en vriesdroging: Het hierboven verkregen NF-retentaat werd door een PES- microfilter van 0,2 um geleid, zodat 1,6 kg oplossing (Brix 30,6) overbleef en werd gevriesdroogd tot 492 g wit poeder.CI 400: 1.35). 6. Microfiltration and lyophilization: The NF retentate obtained above was passed through a 0.2 µm PES microfilter to leave 1.6 kg of solution (Brix 30.6) and lyophilized to 492 g of white powder.

Claims

CONCLUSIESCONCLUSIONS

1. Een methode voor de terugwinning en de zuivering van een neutrale of gesialyleerde moedermelkoligosacharide (HMO) uit een fermentatiebouillon, die bestaat uit de volgende stappen:1. A method for the recovery and purification of a neutral or sialylated human milk oligosaccharide (HMO) from a fermentation broth, comprising the following steps:

a. de voorziening van een HMO-bevattende fermentatiebouillon en al. de scheiding van de fermentatiebouillon om een gescheiden HMO-bevattende stroom en een biomassa-afvalstroom te vormen; of a2. de voorbehandeling van de fermentatiebouillon door pH-aanpassing, verdunning en/of warmtebehandeling;,a. providing an HMO-containing fermentation broth and al. separating the fermentation broth to form a separate HMO-containing stream and a biomass waste stream; or a2. the pre-treatment of the fermentation broth by pH adjustment, dilution and/or heat treatment;,

b. de behandeling van de gescheiden HMO-bevattende stroom van stap al) of de voorbehandelde fermentatiebouillon volgens stap a2) met actieve koolstof om een HMO-bevattende stroom te verkrijgen;b. treating the separated HMO-containing stream of step a1) or the pre-treated fermentation broth according to step a2) with active carbon to obtain an HMO-containing stream;

c. de zuivering van de HMO-bevattende stroom door nanofiltratie;c. the purification of the HMO-containing stream by nanofiltration;

d. de concentratie van de gezuiverde HMO-bevattende stroom; en e. de droging van de gezuiverde HMO-bevattende stroom om een gestolde neutrale of gesialyleerde HMO te verkrijgen.d. the concentration of the purified HMO-containing stream; and e. drying the purified HMO-containing stream to obtain a solidified neutral or sialylated HMO.

2. De methode volgens conclusie 1, waarbij de zuiverheid van de HMO in de fermentatiebouillon <70 %, bij voorkeur <60 %, nog meer bij voorkeur <50 %, meest bij voorkeur <40 % is.The method according to claim 1, wherein the purity of the HMO in the fermentation broth is <70%, preferably <60%, more preferably <50%, most preferably <40%.

3. De methode volgens conclusie 1 of 2, waarbij in stap a2) de pH-waarde van de fermentatiebouillon wordt verlaagd en de fermentatiebouillon wordt verwarmd.The method according to claim 1 or 2, wherein in step a2) the pH value of the fermentation broth is lowered and the fermentation broth is heated.

4. De methode volgens conclusie 3, waarbij de pH-waarde van de fermentatiebouillon op een zure pH-waarde wordt ingesteld, bij voorkeur van 3 tot 6.The method according to claim 3, wherein the pH value of the fermentation broth is adjusted to an acidic pH value, preferably from 3 to 6.

5. De methode volgens conclusie 3 of 4, waarbij de fermentatiebouillon tot een temperatuur van 30 tot 90 °C, bij voorkeur van 35 tot 85 °C wordt verwarmd.The method according to claim 3 or 4, wherein the fermentation broth is heated to a temperature of from 30 to 90°C, preferably from 35 to 85°C.

6. De methode volgens een van de conclusies 3 tot 5 die geen ultrafiltratie- en/of centrifugatiestap omvat.The method according to any one of claims 3 to 5 which does not include an ultrafiltration and/or centrifugation step.

7. De methode volgens een van de conclusies 3 tot 6, waarbij de HMO wordt geadsorbeerd door de actieve koolstof in stap b) en weer gedesorbeerd, bij voorkeur door een waterig organisch oplosmiddel.The method according to any one of claims 3 to 6, wherein the HMO is adsorbed by the active carbon in step b) and desorbed again, preferably by an aqueous organic solvent.

8. De methode volgens conclusie 1 of 2, waarbij de HMO uit de gescheiden HMO- bevattende stroom van stap al) niet of althans niet aanzienlijk door de actieve koolstof wordt geadsorbeerd in stap b).The method according to claim 1 or 2, wherein the HMO from the separated HMO-containing stream of step a1) is not or at least not significantly adsorbed by the active carbon in step b).

9. De methode volgens conclusie 8, waarbij in stap b) een hoeveelheid actieve koolstof wordt gebruikt van <10 % in gewicht ten opzichte van de HMO die in de HMO- bevattende stroom aanwezig is, en bij voorkeur een hoeveelheid van 2 tot 6 %.The method according to claim 8, wherein in step b) an amount of active carbon is used of <10% by weight relative to the HMO present in the HMO-containing stream, and preferably an amount of 2 to 6% .

10. De methode volgens een van de voorgaande conclusies, waarbij het nanofiltrattemembraan in stap c) een molecuulgewicht cut-off (MWCO) van 500-3000 Da heeft en de actieve laag van het membraan bij voorkeur bestaat uit polyamide, bij voorkeur polyamide op basis van piperazine.The method according to any one of the preceding claims, wherein the nanofiltration membrane in step c) has a molecular weight cut-off (MWCO) of 500-3000 Da and the active layer of the membrane preferably consists of polyamide, preferably polyamide based of piperazine.

11. De methode volgens conclusie 10, waarbij het nanofiltratiemembraan een MgSO:- afstotingsfactor van ongeveer 50-90 % en bij voorkeur een NaCl-afstotingsfactor van niet meer dan 50 % heeft.The method according to claim 10, wherein the nanofiltration membrane has a MgSO 2 rejection factor of about 50-90% and preferably a NaCl rejection factor of no more than 50%.

12. De methode volgens conclusie 10 of 11, waarbij stap c) wordt uitgevoerd zodat de pH lager wordt dan 5,0, bij voorkeur lager dan 4,5, bij voorkeur lager dan 4,0, maar bij voorkeur niet lager dan 3,0.The method according to claim 10 or 11, wherein step c) is performed so that the pH becomes lower than 5.0, preferably lower than 4.5, preferably lower than 4.0, but preferably not lower than 3, 0.

13. De methode volgens een van de voorgaande conclusies, waarbij stap d) bestaat uit verdamping, nanofiltratie en/of omgekeerde-osmosefiltratie, bij voorkeur uit verdamping.The method according to any one of the preceding claims, wherein step d) consists of evaporation, nanofiltration and/or reverse osmosis filtration, preferably evaporation.

14. De methode volgens conclusie 13, waarbij stap d) een concentratie met een nanofiltrattemembraan omvat, waarbij het nanofiltratiemembraan bij voorkeur een molecuulgewicht cut-off (MWCO) van 150-300 Da heeft.The method according to claim 13, wherein step d) comprises a concentration with a nanofiltration membrane, wherein the nanofiltration membrane preferably has a molecular weight cut-off (MWCO) of 150-300 Da.

15. De methode volgens een van de voorgaande conclusies, waarbij stap e) bij voorkeur bestaat uit de sproeidroging om een gestolde neutrale of gesialyleerde HMO te verkrijgen.The method according to any one of the preceding claims, wherein step e) preferably consists of the spray-drying to obtain a solidified neutral or sialylated HMO.

16. De methode volgens een van de voorgaande conclusies, waarbij de methode een verdere zuivering van de HMO-bevattende stroom omvat, bij voorkeur na stap c), met een zuur kationenwisselaarshars, bij voorkeur een sterk zuur kationenwisselaarshars.The method according to any of the preceding claims, wherein the method comprises a further purification of the HMO-containing stream, preferably after step c), with an acidic cation exchange resin, preferably a strong acid cation exchange resin.

17. De methode volgens een van de voorgaande conclusies, waarbij een behandelingsstap met basisch anionisch wisselaarshars en/of een elektrodialysestap is uitgesloten.The method according to any one of the preceding claims, wherein a treatment step with basic anionic exchange resin and/or an electrodialysis step is excluded.

18. De methode volgens conclusie 1 of 2 die uit de volgende stappen bestaat: - de voorbehandeling van de fermentatiebouillon door pH-aanpassing, verdunning en/of warmtebehandeling;The method according to claim 1 or 2 comprising the steps of: - pre-treating the fermentation broth by pH adjustment, dilution and/or heat treatment;

- de behandeling van de voorbehandelde fermentatiebouillon met actieve koolstof om een HMO-bevattende stroom te verkrijgen, waarbij de HMO door de actieve koolstof wordt geadsorbeerd en weer wordt gedesorbeerd door een waterig organisch oplosmiddel als eluent; - de zuivering van de hierboven verkregen HMO-bevattende stroom door gecombineerde nanofiltratie en diafiltratie, waarbij het nanofiltrattemembraan bij voorkeur in het bereik van 500-3000 Da MWCO ligt; - de concentratie van de gezuiverde HMO-bevattende stroom, bij voorkeur door verdamping; en - de sproeidroging van de gezuiverde HMO-bevattende stroom om een gestolde neutrale of gesialyleerde HMO te verkrijgen.- treating the pre-treated fermentation broth with active carbon to obtain an HMO-containing stream, the HMO being adsorbed by the active carbon and desorbed again by an aqueous organic solvent as eluent; - the purification of the HMO-containing stream obtained above by combined nanofiltration and diafiltration, the nanofiltration membrane preferably being in the range of 500-3000 Da MWCO; - the concentration of the purified HMO-containing stream, preferably by evaporation; and - the spray-drying of the purified HMO-containing stream to obtain a solidified neutral or sialylated HMO.

19. De methode volgens conclusie 1 of 2 die uit de volgende stappen bestaat: - de scheiding van de fermentatiebouillon door ultrafiltratie om een gescheiden HMO-bevattende stroom en een biomassa-afvalstroom te vormen; - de behandeling van de gescheiden HMO-bevattende stroom met een behandeling van actieve koolstof, - de zuivering van de HMO-bevattende stroom door gecombineerde nanofiltratie en diafiltratie, waarbij het nanofiltratiemembraan bij voorkeur in het bereik van 500- 3000 Da MWCO ligt; - de concentratie van de gezuiverde HMO-bevattende stroom, bij voorkeur door verdamping; en - de sproeidroging van de gezuiverde HMO-bevattende stroom om een gestolde neutrale of gesialyleerde HMO te verkrijgen.The method according to claim 1 or 2 comprising the steps of: - separating the fermentation broth by ultrafiltration to form a separated HMO-containing stream and a biomass waste stream; - treating the separated HMO-containing stream with an active carbon treatment, - purifying the HMO-containing stream by combined nanofiltration and diafiltration, the nanofiltration membrane preferably being in the range of 500-3000 Da MWCO; - the concentration of the purified HMO-containing stream, preferably by evaporation; and - the spray-drying of the purified HMO-containing stream to obtain a solidified neutral or sialylated HMO.

20. De methode volgens conclusie 18 of 19, waarbij het nanofiltratiemembraan een actieve (top)laag heeft die bestaat uit polyamide, het membraan een MgSO:- afstotingsfactor van ongeveer 50-90 % en een NaCl-afstotingsfactor van niet meer dan 50 % heeft, en de nanofiltratiestap zodanig wordt uitgevoerd dat de pH lager dan 5,0 is, bij voorkeur lager dan 4,5, bij voorkeur lager dan 4,0, maar bij voorkeur niet lager dan 3,0.The method according to claim 18 or 19, wherein the nanofiltration membrane has an active (top) layer consisting of polyamide, the membrane has a MgSO: rejection factor of about 50-90% and a NaCl rejection factor of no more than 50% , and the nanofiltration step is carried out such that the pH is less than 5.0, preferably less than 4.5, preferably less than 4.0, but preferably not less than 3.0.

21. De methode volgens een van de conclusies 18 tot en met 20, waarbij een behandelingsstap met ionenwisselaarshars en een elektrodialysestap zijn uitgesloten.The method according to any one of claims 18 to 20, wherein an ion exchange resin treatment step and an electrodialysis step are excluded.

22. De methode volgens een van de voorgaande conclusies, waarbij de HMO een neutrale HMO is.The method of any one of the preceding claims, wherein the HMO is a neutral HMO.

47 BE2022/546747 BE2022/5467

23. De methode volgens conclusie 22, waarbij de HMO wordt gekozen uit de groep bestaande uit: 2'-fucosyllactose, 3-fucosyllactose, 2',3-difucosyllactose, lacto-N-triose IL lacto-N-tetraose, lacto-N-neotetraose, lacto-N-fucopentaose I, lacto-N-fucopentaose IL lacto-N-fucopentaose III lacto-N-fucopentaose V, lacto-N-fucopentaose VI, lacto- N-difucohexaose I, lacto-N-difucohexaose II, lacto-N-difucohexaose III, 6'- galactosyllactose, 3'-galactosyllactose, lacto-N-hexaose en lacto-N-neohexaose.The method of claim 22, wherein the HMO is selected from the group consisting of: 2'-fucosyllactose, 3-fucosyllactose, 2',3-difucosyllactose, lacto-N-triose IL lacto-N-tetraose, lacto-N -neotetraose, lacto-N-fucopentaose I, lacto-N-fucopentaose IL lacto-N-fucopentaose III lacto-N-fucopentaose V, lacto-N-fucopentaose VI, lacto-N-difucohexaose I, lacto-N-difucohexaose II, lacto-N-difucohexaose III, 6'-galactosyllactose, 3'-galactosyllactose, lacto-N-hexaose and lacto-N-neohexaose.

24. De methode volgens conclusie 22 of 23, waarbij de HMO 2'-fucosyllactose, 3- fucosyllactose, 2',3-difucosyllactose, lacto-N-triose IL, lacto-N-tetraose, lacto-N- neotetraose of een lacto-N-fucopentaose is, bij voorkeur 2'-fucosyllactose, LNT, LNnT of een lacto-N-fucopentaose.The method of claim 22 or 23, wherein the HMO is 2'-fucosyllactose, 3-fucosyllactose, 2',3-difucosyllactose, lacto-N-triose IL, lacto-N-tetraose, lacto-N-neotetraose, or a lacto -N-fucopentaose is, preferably, 2'-fucosyllactose, LNT, LNnT or a lacto-N-fucopentaose.

25. De methode volgens een van de conclusies 1 tot 21, waarbij de HMO een gesialyleerde HMO is, bij voorkeur 3'-sialyllactose (3'-SL) of 6'-sialyllactose (6'-SL).The method according to any one of claims 1 to 21, wherein the HMO is a sialylated HMO, preferably 3'-sialyl lactose (3'-SL) or 6'-sialyl lactose (6'-SL).