BE1027715B1

BE1027715B1 - RAPID IMMUNODIAGNOSTIC METHOD AND TEST FOR COVID-19 INFECTION

Info

Publication number: BE1027715B1
Application number: BE20205229A
Authority: BE
Inventors: Pascal Mertens; Henri Magein; Justine Bouzet; Laurence Denorme
Original assignee: Coris Bioconcept Sprl
Priority date: 2020-04-08
Filing date: 2020-04-08
Publication date: 2021-05-26

Abstract

La présente invention concerne une méthode et un test ou une trousse immunochromatographiques (ICT) rapides de la COVID-19 pour la détection d'un antigène de SRAS-CoV-2 sur un échantillon naso-pharyngé en 15 minutes. La présente invention concerne aussi le procédé de production du test ou de la trousse selon l'invention.The present invention provides a rapid COVID-19 immunochromatographic (ICT) method and test or kit for the detection of a SARS-CoV-2 antigen in a nasopharyngeal sample within 15 minutes. The present invention also relates to the method of producing the test or the kit according to the invention.

Description

METHODE ET TEST IMMUNODIAGNOSTIQUES RAPIDES DE L’ INFECTION COVID-19 Domaine de l'invention La présente invention est dans le domaine de la détection d'une infection et concerne en particulier une méthode et un test ou une trousse immunodiagnostiques rapides améliorés, plus particulièrement une méthode et un test ou une trousse immunodiagnostiques rapides de l'infection COVID-19, mais aussi le procédé pour la production de ce test ou cette trousse immunodiagnostique. Arrière-plan de l'invention Parmi les nouvelles infections virales, le coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère 2 (SRAS-CoV-2, ou infection dite COVID-19) représente une menace sanitaire majeure pour le genre humain. En l'absence de vaccin et de traitement spécifique, la circonscription de l'épidémie repose principalement sur une identification et une isolation rapides des patients COVID-19. En plus d'une tomodensitométrie (TDM) de la poitrine, cette stratégie se base sur la disponibilité d'un dosage d'amplification en chaîne par polymérase à transcription inverse en temps réel (RT-PCR) devant être effectué sur tout patient suspect présentant des symptômes spécifiques (1).Field of the invention The present invention is in the field of the detection of an infection and in particular relates to an improved rapid immunodiagnostic method and test or kit, more particularly a method and rapid immunodiagnostic test or kit for COVID-19 infection, but also the process for producing such immunodiagnostic test or kit. Background of the invention Among the new viral infections, the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2, or so-called COVID-19 infection) represents a major health threat to mankind. In the absence of a vaccine and specific treatment, the containment of the epidemic relies mainly on the rapid identification and isolation of COVID-19 patients. In addition to computed tomography (CT) of the chest, this strategy is based on the availability of a real-time reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) assay to be performed on any suspected patient with specific symptoms (1).

Comme les symptômes du SRAS-CoV-2 (infection COVID-19) sont similaires à ceux de la grippe saisonnière, il n'est actuellement pas possible de tester tous les patients présentant des symptômes grippaux en raison du manque de ressources et de tests diagnostiques disponibles. Comme mentionné dans l'entretien audio du New England Journal of Medicine le 19 mars 2020 (2), l'importance de l'établissement d'un diagnostic correct est essentielle pour donner les soins appropriés aux patients positifs au COVID-19.As the symptoms of SARS-CoV-2 (COVID-19 infection) are similar to those of seasonal flu, it is currently not possible to test all patients with flu-like symptoms due to lack of resources and diagnostic tests. available. As mentioned in the audio interview for the New England Journal of Medicine on March 19, 2020 (2), the importance of making a correct diagnosis is critical to providing the appropriate care to patients who are COVID-19 positive.

A ce jour, plusieurs tests moléculaires ont été développés et sont en cours d'application dans les laboratoires et les centres de référence ayant les moyens d'effectuer ces tests (voir https://Wwww.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical- guidance/laboratory-guidance pour des détails).To date, several molecular tests have been developed and are being applied in laboratories and reference centers having the means to perform these tests (see https://Wwww.who.int/emergencies/diseases/novel -coronavirus-2019 / technical- guidance / laboratory-guidance for details).

Toutefois, la disponibilité des tests diagnostiques moléculaires pose problème, étant donné que nous faisons face à des ruptures de stock mondiales des réactifs. Bien qu'un diagnostic moléculaire constitue la méthode diagnostique la plus sensible et spécifique, la nécessité de matériels, réactifs et personnels entraînés limite le nombre de dosages qui peuvent être réalisés et sature les laboratoires. De plus, une amplification génétique, en particulier une PCR, n'a toujours pas un temps d'exécution très court.However, the availability of molecular diagnostic tests is problematic as we face global stockouts of reagents. Although molecular diagnostics is the most sensitive and specific diagnostic method, the need for equipment, reagents and trained personnel limits the number of assays that can be performed and saturates laboratories. In addition, genetic amplification, especially PCR, still does not have a very short execution time.

Le développement de tests diagnostiques rapides rendant possible de confirmer Pt rapidement une suspicion clinique d'une infection virale, en particulier d'une infection COVID- 19, permettant une adaptation plus précoce de la réponse clinique et l'isolation plus rapide du patient, est par conséquent justifié.The development of rapid diagnostic tests making it possible to quickly confirm a clinical suspicion of a viral infection, in particular a COVID-19 infection, allowing earlier adaptation of the clinical response and faster isolation of the patient, is possible. therefore justified.

Plusieurs tests sérologiques ont été développés, mais les dosages de détection d'anticorps sérologiques ne satisfont pas à l'exigence d'une détection peu de temps après une infection, puisque la période d'incubation moyenne, de 3 à 5 jours, est trop courte pour le développement d'une réponse immunitaire.Several serological tests have been developed, but serological antibody detection assays do not meet the requirement for detection soon after infection, since the average incubation period, 3 to 5 days, is too high. short for the development of an immune response.

Buts de l'invention Le but principal de la présente invention est de proposer une méthode et un test ou une trousse immunochromatographiques (ICT) rapides améliorés, de préférence une méthode et un test ou une trousse utilisés pour la détection rapide de la présence d'antigène de SRAS- CoV-2 (ou d'agent infectieux de COVID-19) dans un échantillon individuel et pour l'obtention d'un diagnostic positif rapide de cet individu concernant l'infection COVID-19, qui ne présentent pas les inconvénients de la méthode et des dosages de l'état de la technique.Aims of the invention The main object of the present invention is to provide an improved rapid immunochromatographic (ICT) method and test or kit, preferably a method and test or kit used for the rapid detection of the presence of. SARS-CoV-2 antigen (or infectious agent of COVID-19) in an individual sample and for obtaining a rapid positive diagnosis of that individual regarding COVID-19 infection, which does not present the disadvantages of the method and assays of the state of the art.

Un autre but de l'invention est d'obtenir ces méthode et test ou trousse qui sont caractérisés par un ou plusieurs des avantages suivants : - efficaces, - simples à utiliser, - pouvant être obtenus avec des réactifs facilement disponibles, - bon marché, - présentant une sensibilité élevée et une spécificité convenable, - pouvant être directement appliqués sur un échantillon naso-pharyngé, pour une détection efficace dans un délai court, de préférence inférieur à 30 minutes, mieux encore inférieur à 20 minutes, plus particulièrement d'environ 15 minutes, et - pouvant être appliqués de préférence sur des échantillons présentant une forte concentration ou une faible concentration du virus cible devant être détecté.Another object of the invention is to obtain these method and test or kit which are characterized by one or more of the following advantages: - effective, - simple to use, - obtainable with readily available reagents, - inexpensive, - exhibiting high sensitivity and suitable specificity, - can be applied directly to a nasopharyngeal sample, for effective detection in a short time, preferably less than 30 minutes, more preferably less than 20 minutes, more particularly approximately 15 minutes, and - can be applied preferably to samples having a high concentration or a low concentration of the target virus to be detected.

Un dernier but de l'invention est d'obtenir un procédé de production simple et amélioré de ce test ou cette trousse qui puisse satisfaire aux exigences ci-dessus, en particulier en ce qui concerne la sensibilité et la spécificité requises.A final aim of the invention is to obtain a simple and improved method of producing this test or this kit which can satisfy the above requirements, in particular as regards the required sensitivity and specificity.

Résumé de l'invention La présente invention concerne la méthode et le test ou la trousse présentant les caractéristiques telles que décrites dans les revendications.Summary of the Invention The present invention relates to the method and the test or kit having the features as described in the claims.

Un premier aspect de l'invention concerne une méthode de détection immunochromatographique (ICT) d'une infection virale, de préférence induite par le SARS-A first aspect of the invention relates to a method for immunochromatographic (ICT) detection of a viral infection, preferably induced by SARS-.

CoV-2 ou dite infection COVID-19 qui comprend une étape de dilution de l'échantillon, par 0720/5229 exemple un échantillon naso-pharyngé, par l'addition d'un tampon de dilution comprenant un sel, de préférence le NaCl à une concentration comprise entre 0,5 M et 1,5 M. La présente invention concerne aussi un test, en particulier une trousse de détection immunochromatographioque (ICT) d’une infection, en particulier une infection virale, notamment du SARS-CoV-2 ou dite infection COVID-19, comprenant un tampon de dilution avec un sel, de préférence du NaCl, présent à une concentration comprise entre 0.5M et 1.5M. De préférence, dans le procédé et le test ou la trousse de l’invention, le dit tampon de dilution comprend en outre un détergent doux, en particulier un détergent tel qu’une émulsion non-ionique, en particulier un produit d'éthoxylation d'un alcool laurylique. De préférence, le tampon de dilution de l'invention comprend en outre de l'hydrolysat de caséine, de l'EDTA et de l'azoture de sodium.CoV-2 or so-called COVID-19 infection which comprises a step of diluting the sample, for example 0720/5229 a nasopharyngeal sample, by adding a dilution buffer comprising a salt, preferably NaCl to a concentration between 0.5 M and 1.5 M. The present invention also relates to a test, in particular an immunochromatographic detection kit (ICT) of an infection, in particular a viral infection, in particular of SARS-CoV-2 or known as COVID-19 infection, comprising a dilution buffer with a salt, preferably NaCl, present at a concentration of between 0.5M and 1.5M. Preferably, in the method and the test or kit of the invention, said dilution buffer further comprises a mild detergent, in particular a detergent such as a nonionic emulsion, in particular a dye ethoxylate. a lauryl alcohol. Preferably, the dilution buffer of the invention further comprises casein hydrolyzate, EDTA and sodium azide.

Selon une forme d’exécution préférée de l’invention, le test ou la trousse de l’invention, comprend en outre des réactifs de capture, de préférence appliqués sous forme de revêtement sur une surface de support solide d’un dispositif analogue à une feuille, de type tigette et des réactifs de détection directement ou non directement marqués (formant un conjugué), les deux réactifs étant dirigés contre une molécule cible spécifique de l’agent infectieux, en particulier viral tel qu’un antigène du SARS-CoV-2 devant être détectée dans l'échantillon.According to a preferred embodiment of the invention, the test or kit of the invention further comprises capture reagents, preferably applied as a coating on a solid support surface of a device-like device. leaf, strip type and detection reagents directly or not directly labeled (forming a conjugate), the two reagents being directed against a specific target molecule of the infectious agent, in particular viral such as an antigen of SARS-CoV- 2 to be detected in the sample.

Dans le test ou la trousse de l'invention, les réactifs de capture et les réactifs de détection sont choisis de préférence dans le groupe constitué par les anticorps monoclonaux, les anticorps polyclonaux, les régions variables se liant à un antigène de fragments de ces anticorps, les nanocorps, les alphacorps, les micro-anticorps, les affilines, les affimères, les fymomères, les affitines ou un de leurs mélanges et ce test ou cette trousse est ou comprend un dispositif chromatographique analogue à une feuille jetable ou tigette avec un support solide poreux permettant la migration par action capillaire d'un fluide et de ses composants, de préférence l'échantillon et le tampon de dilution de l'invention et qui comprend une région d'application, une ou plusieurs régions de détection et une région d'adsorption.In the test or kit of the invention, the capture reagents and the detection reagents are preferably chosen from the group consisting of monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, variable regions binding to an antigen of fragments of these antibodies. , nanobodies, alpha-bodies, micro-antibodies, affilins, affimers, fymomers, affitins or a mixture thereof and this test or kit is or comprises a chromatographic device similar to a disposable sheet or strip with a support porous solid allowing migration by capillary action of a fluid and its components, preferably the sample and the dilution buffer of the invention and which comprises an application region, one or more detection regions and a region of 'adsorption.

Dans le procédé, le test ou la trousse de l'invention, la molécule cible à détecter et est un antigène de SRAS-CoV2, en particulier la nucléoprotéine RecNP-2.In the method, test or kit of the invention, the target molecule to be detected and is an antigen of SARS-CoV2, in particular the nucleoprotein RecNP-2.

De plus, dans le procédé, le test ou la trousse de l'invention, les réactifs de capture se lient à une région de la molécule cible à détecter qui est différente de la région de la cible liée par le réactif de détection. De préférence, le réactif de détection du procédé, test ou trousse de l'invention, est directement ou indirectement marqué par un marqueur particulaire choisi dans le groupe constitué par un colloïde métallique conjugué, de préférence des particules d'or, des particules de latex conjuguées, et des microparticules ayant une couleur spécifique.In addition, in the method, test or kit of the invention, the capture reagents bind to a region of the target molecule to be detected which is different from the region of the target bound by the detection reagent. Preferably, the detection reagent of the method, test or kit of the invention is directly or indirectly labeled with a particulate label chosen from the group consisting of a conjugated metallic colloid, preferably gold particles, latex particles conjugates, and microparticles having a specific color.

Un dernier aspect de l’invention concerne un procédé de production du test ou de la trousse de l'invention, dans lequel un conjugué ou des réactifs de détection marqués sont 2920/5229 pulvérisés sur la surface d’un support solide par un dispositif de pulvérisation ayant une tête de buse de pulvérisation qui est située à une distance inférieure à 5 mm de préférence comprise entre 4 mm et 3 MM, du tampon de conjugué ou de la surface de support solide correspondante du test ou de la trousse immunochromatographique.A final aspect of the invention relates to a method of producing the assay or kit of the invention, wherein a labeled conjugate or detection reagents are 2920/5229 sprayed onto the surface of a solid support by a screening device. spray having a spray nozzle head which is located at a distance of less than 5mm, preferably between 4mm and 3mm, from the conjugate pad or the corresponding solid support surface of the assay or immunochromatographic kit.

Définitions Comme décrit ci-après, l'expression "infection COVID-19" se réfère à une infection virale induite par le dénommé coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère 2 (SRAS- CoV-2).Definitions As described below, the term "COVID-19 infection" refers to a viral infection induced by the so-called severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2).

L'expression " test de COVID-19" se réfère à tout instrument, test, dosage, trousse ou dispositif diagnostique utilisé conformément à la méthode de l'invention pour la détection rapide et spécifique d'une infection par ce virus, qui peut identifier si un individu testé (humain ou animal) est potentiellement affecté par ce virus et peut propager (ou pas) l'infection à d'autres personnes. La trousse de l'invention incorpore outre ledit test de COVID-19 de l'invention, des autres instruments comme des flacons ou tubes, des réactifs et les instructions pour effectuer les différentes étapes de la méthode de détection de l'invention L'expression "dispositif analogue à une feuille" se réfère à des tests jetables rapides appelés "bandelettes ou tigettes réactives" et "dispositifs à écoulement latéral” éventuellement intégrée dans une trousse immunochromatographique (ICT).The term "COVID-19 test" refers to any instrument, test, assay, kit or diagnostic device used in accordance with the method of the invention for the rapid and specific detection of infection with this virus, which can identify if a tested individual (human or animal) is potentially affected by this virus and can (or not) spread the infection to other people. The kit of the invention incorporates, in addition to said test for COVID-19 of the invention, other instruments such as vials or tubes, reagents and the instructions for carrying out the various steps of the detection method of the invention. "sheet-like device" refers to rapid disposable tests called "test strips or test strips" and "lateral flow devices" optionally integrated into an immunochromatographic (ICT) kit.

Les expressions "réactif(s) de capture" et "réactif(s) de détection" se réfèrent à des molécules qui peuvent se lier spécifiquement à un ou plusieurs épitopes d'une structure antigénique spécifique de l'infection (virale) devant être testée. Des exemples de ces molécules comprennent, mais sans s'y limiter, les anticorps monoclonaux, les anticorps polyclonaux, les portions (région Fab, région CDR, région FV, …) de ces anticorps, de préférence les portions comprenant la région variable se liant à un antigène de fragment de ces anticorps, les nanocorps, les alphacorps, les micro-anticorps, les affilines, les affimères, les fymomères, les affitines ou un de leurs mélanges. Des exemples préférés de réactifs de capture et de détection sont les anticorps monoclonaux.The terms "capture reagent (s)" and "detection reagent (s)" refer to molecules which can bind specifically to one or more epitopes of an antigenic structure specific to the infection (viral) to be tested. . Examples of these molecules include, but are not limited to, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, portions (Fab region, CDR region, FV region, ...) of these antibodies, preferably the portions comprising the binding variable region. to a fragment antigen of these antibodies, nanobodies, alpha-bodies, micro-antibodies, affilins, affimers, fymomers, affitins or a mixture thereof. Preferred examples of capture and detection reagents are monoclonal antibodies.

Description détaillée de l'invention Le but de l'invention est de mettre en place une méthode et un test ou une trousse immunochromatographiques (ICT) (rapides) basés sur des réactifs déjà disponibles.Detailed description of the invention The aim of the invention is to set up a method and an immunochromatographic (ICT) (rapid) test or kit based on reagents already available.

Conformément à l'invention, les nouveaux tests ou trousses ICT et méthodes d'utilisation, produits et développés avec succès, peuvent détecter un antigène de SRAS-CoV- 2 avec la sensibilité élevée requise sans réduction de la spécificité.In accordance with the invention, new ICT tests or kits and methods of use, produced and developed successfully, can detect SARS-CoV-2 antigen with the required high sensitivity without reduction in specificity.

La technique diagnostique immunochromatographique, consistant en un réactif TE 7020/5229 capture anti-SRAS-CoV, de preference un anticorps, fixe sur une bande de nitrocellulose formant une tigette, et un reactif de detection anti-SRAS-CoV marque, de preference un anticorps, migrant avec le tampon et l'échantillon, est différente de la biologie moléculaire.The immunochromatographic diagnostic technique, consisting of a TE 7020/5229 anti-SARS-CoV capture reagent, preferably an antibody, fixed on a nitrocellulose strip forming a strip, and a branded anti-SARS-CoV detection reagent, preferably a antibody, migrating with the buffer and the sample, is different from molecular biology.

5 Dans la technologie de l'immunochromatographie, les réactifs utilisés pour la détection d'un antigène cible ont besoin d'être optimisés. De façon plus spécifique, dans un test ou une trousse en sandwich d'antigène, la quantité des réactifs (dans le présent cas, des anticorps) immobilisés sur le support solide par revêtement (= réactifs de capture) et la quantité du réactif de détection couplé à la molécule de détection (= conjugué ; réactifs de détection marqués) sont optimisées pour que la sensibilité maximale soit atteinte sans réduction de la spécificité.In immunochromatography technology, the reagents used for the detection of a target antigen need to be optimized. More specifically, in an antigen sandwich test or kit, the amount of reagents (in this case, antibodies) immobilized on the solid support per coating (= capture reagents) and the amount of detection reagent coupled to the detection molecule (= conjugate; labeled detection reagents) are optimized so that maximum sensitivity is achieved without reduction in specificity.

La manière la plus facile d'augmenter la sensibilité de méthodes et de tests immunochromatographiques consiste à augmenter les quantités des deux réactifs dans chaque test.The easiest way to increase the sensitivity of immunochromatographic assays and methods is to increase the amounts of both reagents in each assay.

Toutefois, une telle augmentation importante va conduire à l'apparition d'un signal positif léger sur la ligne de test, qui sera interprété comme un échantillon faiblement positif (positif faux), conduisant à une diminution de la spécificité.However, such a large increase will lead to the appearance of a slight positive signal on the test line, which will be interpreted as a weak positive sample (false positive), leading to a decrease in specificity.

Pour le présent type de test d'immunochromatographie, des exemples de quantités de réactifs par test sont les suivants : Capture : 0,28 ug d'anticorps par test.For the present type of immunochromatography test, examples of amounts of reagents per test are as follows: Capture: 0.28 µg of antibody per test.

Détection : 2,5 DO par test (DO se réfère à la concentration du conjugué mesurée par prise de l'absorbance du conjugué d'or colloïdal à 530 nm).Detection: 2.5 OD per test (OD refers to the concentration of the conjugate measured by taking the absorbance of the colloidal gold conjugate at 530 nm).

Au-delà de ces quantités, les tests conduisent à des résultats positifs faux en utilisant du tampon sans l'antigène cible.Beyond these amounts, the tests lead to false positive results using buffer without the target antigen.

Par conséquent, un premier aspect de l'invention est lié à la manière dont le conjugué est déposé par le procédé de production de l'invention, sur le tampon de conjugué du test ou de la trousse de l'invention. Un moyen ou un procédé de production classique de l'état de la technique consiste en le dépôt du conjugué par un dispositif de pulvérisation à une distance entre la tête de buse de pulvérisation de ce dispositif de pulvérisation et le tampon de conjugué correspondant de 10 mm du dosage ou de la trousse. Le conjugué pulvérisé est ensuite relativement gros.Therefore, a first aspect of the invention relates to the manner in which the conjugate is deposited by the production method of the invention, on the conjugate pad of the test or kit of the invention. A conventional means or method of production in the state of the art consists of depositing the conjugate by a spray device at a distance between the spray nozzle head of this spray device and the corresponding conjugate pad of 10 mm. dosage or kit. The sprayed conjugate is then relatively large.

Les inventeurs ont amélioré le procédé de production du test ou de la trousse selon l'invention en réduisant la distance entre la tête de buse de pulvérisation du dispositif de pulvérisation et le tampon de conjugué du test ou de la trousse, de 10 mm à environ 3,5 mm.The inventors have improved the method of producing the test or kit according to the invention by reducing the distance between the spray nozzle head of the spray device and the conjugate pad of the test or kit, from 10 mm to about 10 mm. 3.5mm.

Par conséquent, de cette façon, l'homme du métier est en premier lieu capable de pulvériser de façon inattendue le conjugué à 6 DO par test et ensuite capable d'augmenter avantageusement la concentration de réactif de capture de 0,28 à 0,4 ug par test, sans avoir de résultats positifs faux. Même à 9 DO et une concentration de réactif de capture de 0,4 ie 2020/5229 par test, aucun résultat positif faux n'a été avantageusement obtenu.Therefore, in this way, one skilled in the art is first able to unexpectedly spray the 6 OD conjugate per test and then advantageously able to increase the concentration of capture reagent from 0.28 to 0.4. ug per test, without having false positive results. Even at 9 OD and a capture reagent concentration of 0.4 ie 2020/5229 per test, no false positive results were advantageously obtained.

Les concentrations plus élevées permettent d'augmenter davantage l'intensité des lignes de test, tant pour les échantillons fortement positifs (échantillons contenant une grande quantité de l'antigène cible) que pour les échantillons très faiblement positifs (échantillons contenant une très petite quantité d'antigène cible).The higher concentrations allow the intensity of the test lines to be further increased, both for strongly positive samples (samples containing a large amount of the target antigen) and for very weak positive samples (samples containing a very small amount of target antigen). target antigen).

Dans les présents méthode et test appliqués à la détection d'une infection COVID-19, la détection de la nucléoprotéine de SRAS-CoV a été identifiée comme une cible convenable pour le développement d'un dosage diagnostic en sandwich sensible utilisant des anticorps monoclonaux (3).In the present method and test applied to the detection of COVID-19 infection, the detection of the SARS-CoV nucleoprotein has been identified as a suitable target for the development of a sensitive sandwich diagnostic assay using monoclonal antibodies ( 3).

Le virus SRAS-CoV-2 partage une similarité élevée avec des coronavirus de chauve- souris et le SRAC-CoV connu de l'épidémie de 2002-2003 (4), ce qui offre avantageusement l'opportunité d'utiliser des réactifs antérieurement développés pour développer un test diagnostic rapide capable de détecter le nouveau SRAS-CoV-2.The SARS-CoV-2 virus shares a high similarity with bat coronaviruses and the SARS-CoV known from the 2002-2003 epidemic (4), which advantageously offers the opportunity to use previously developed reagents. to develop a rapid diagnostic test capable of detecting the new SARS-CoV-2.

Matériels et méthodes Développement du test Respi-Strip de COVID-19 Anticorps et antigène : Onze anticorps (appelés anticorps A à K), antérieurement développés contre le SRAS- CoV, ont été appliqués sous forme de revêtement à diverses concentrations sur de la nitrocellulose (Advanced Microdevices, Inde) ; les anticorps A à J ont été couplés à des particules d'or colloïdal (NanoQ, Belgique).Materials and methods Development of the Respi-Strip test for COVID-19 Antibodies and antigen: Eleven antibodies (called antibodies A to K), previously developed against SARS-CoV, were applied as a coating at various concentrations on nitrocellulose ( Advanced Microdevices, India); antibodies A to J were coupled to colloidal gold particles (NanoQ, Belgium).

Une préparation de nucléoprotéine de SRAS-CoV recombinée (recNP) a été produite dans E. coli en 2006 et a été stockée à -20°C ; elle a ensuite été appliquée sous forme de revêtement sur de la nitrocellulose ou conjuguée sur des nanoparticules d'or colloïdal.A preparation of recombinant SARS-CoV nucleoprotein (recNP) was produced in E. coli in 2006 and was stored at -20 ° C; it was then applied as a coating on nitrocellulose or conjugated on colloidal gold nanoparticles.

La NP de SRAS-CoV-2 étiquetée par his recombinée (recNP-2) a été produite dans une cellule d'insecte et purifiée (purification en 2 étapes) ; pureté finale > 90 % (Genscript, Leiden, Pays-Bas) et a été appliquée sous forme de revêtement sur de la nitrocellulose ou conjuguée sur des nanoparticules d'or colloïdal.Recombinant his-tagged SARS-CoV-2 NP (recNP-2) was produced in an insect cell and purified (2-step purification); final purity> 90% (Genscript, Leiden, the Netherlands) and was applied as a coating on nitrocellulose or conjugated on colloidal gold nanoparticles.

Respi-Strip d'Ag de COVID-19 : La bandelette ou tigette CT est constituée de nitrocellulose stratifiée sur un envers en matière plastique, les conjugués d'or colloïdal étant séchés dans un tampon de conjugué (Ahlstrom-Munksjô, FR) recouvrant le fond de la nitrocellulose. Pour une détection directe préliminaire, la NP de SRAS-CoV-2 a été appliquée sous forme de revêtement à 100 ug/ml et les anticorps marqués à l'or ont été déposés à 0,85 ul/mm à 3 DO 530 nm. Pour le test Respi-Strip d'Ag de COVID-19, des anticorps monoclonaux dirigés contre l'antigène de nucléoprotéine fortement conservé de SRAS-CoV et de SRAS-CoV-2 sont 2020/5229 appliqués sous forme de revêtement sur la nitrocellulose. Un autre anticorps monoclonal est conjugué à des nanoparticules d'or colloïdal. Le conjugué est immobilisé sur le tampon de conjugué. Le mode opératoire standard pour le test Respi Strip d'Ag de COVID-19 est le suivant : Transférer 100 ul d'un échantillon dans le tube de collecte. Ajouter 100 ul du tampon de dilution pour atteindre un rapport de dilution de 1/2 et mélanger. Immerger la bandelette ou tigette dans la direction indiquée et fermer le tube avec le bouchon.COVID-19 Ag Respi-Strip: The CT strip or strip is made of nitrocellulose laminated to a plastic backing, the colloidal gold conjugates being dried in a conjugate pad (Ahlstrom-Munksjô, FR) covering the nitrocellulose background. For preliminary direct detection, the NP of SARS-CoV-2 was applied as a coating at 100 µg / ml and the gold-labeled antibodies were deposited at 0.85 µl / mm at 3 OD 530 nm. For the COVID-19 Respi-Strip Ag assay, monoclonal antibodies directed against the highly conserved SARS-CoV and SARS-CoV-2 nucleoprotein antigen are 2020/5229 coated on the nitrocellulose. Another monoclonal antibody is conjugated to colloidal gold nanoparticles. The conjugate is immobilized on the conjugate pad. The standard procedure for the COVID-19 Respi Strip Ag assay is as follows: Transfer 100 µl of a sample to the collection tube. Add 100 µl of the dilution buffer to achieve a dilution ratio of 1/2 and mix. Immerse the strip or test strip in the direction indicated and close the tube with the stopper.

Laisser réagir 15 minutes et lire le résultat. Pour l'interprétation des résultats, avec un résultat de test négatif, une ligne pourpre rougeâtre apparaît à la position de la ligne de témoin (ligne supérieure). Aucune autre bande n'est présente sur la bandelette ou tigette.Leave to react for 15 minutes and read the result. For interpretation of results, with a negative test result, a reddish purple line appears at the position of the control line (top line). No other band is present on the strip or strip.

Pour un résultat de test positif, en plus d'une bande pourpre rougeâtre à la position de la ligne de témoin, une bande pourpre rougeâtre visible apparaît à la position de ligne de test. L'intensité de la ligne de test peut varier en fonction de la quantité d'antigènes trouvée dans l'échantillon.For a positive test result, in addition to a reddish purple band at the position of the control line, a visible reddish purple band appears at the test line position. The intensity of the test line may vary depending on the amount of antigens found in the sample.

Toute ligne pourpre rougeâtre, même faible, devrait être considérée comme un résultat positif. Le résultat du test est invalide quand l'absence d'une ligne de témoin indique une défaillance dans la procédure de test. Répéter les tests invalides avec une nouvelle bandelette ou tigette. Jeter le tube fermé conformément aux règlementations sur les risques biologiques.Any reddish purple line, even faint, should be considered a positive result. The test result is invalid when the absence of a control line indicates a failure in the test procedure. Repeat invalid tests with a new strip or test strip. Dispose of the closed tube in accordance with biohazard regulations.

Pour améliorer encore la sensibilité, le tampon de dilution a été encore modifié.To further improve sensitivity, the dilution buffer was further modified.

Le tampon de dilution initial consiste en un tampon de dilution TRIS contenant un hydrolysat de caséine, de l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), un détergent doux, de préférence un émulsionnant non-ionique biodégradable, tel que le produit d'éthoxylation de l'alcool laurylique (vendu par Solvay ® sous la marque déposée Rhodasurf ®) et un conservateur (tel que l'azoture de sodium).The initial dilution buffer consists of a TRIS dilution buffer containing casein hydrolyzate, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), a mild detergent, preferably a biodegradable nonionic emulsifier, such as the ethoxylate of lauryl alcohol (sold by Solvay ® under the registered trademark Rhodasurf ®) and a preservative (such as sodium azide).

Une amélioration avantageuse et inattendue a été obtenue par une modification du détergent et par l'addition de sel utilisé dans le procédé de préparation du test selon l'invention pour augmenter la salinité.An advantageous and unexpected improvement was obtained by a modification of the detergent and by the addition of salt used in the method of preparation of the test according to the invention to increase the salinity.

Résultats Sélection et caractérisation d'anticorps monoclonaux Avant l'utilisation des anticorps dans des tests de détection en sandwich, les anticorps ont été testés individuellement sur leur aptitude à capturer et/ou détecter la recNP cible dans le format de dosage ICT.Results Selection and Characterization of Monoclonal Antibodies Prior to the use of the antibodies in detection sandwich assays, the antibodies were individually tested for their ability to capture and / or detect the target recNP in the ICT assay format.

Les anticorps ont donc été appliqués sous forme de revêtement sur de la nitrocellulose et testés par utilisation de la recNP couplée à des particules d'or colloïdal ; la réactivité a été enregistrée sur la base de l'intensité visuelle sur les bandelettes ou tigettes ICT (Tableau 7 2020/5229 colonne |).The antibodies were therefore applied as a coating on nitrocellulose and tested using recNP coupled to colloidal gold particles; reactivity was recorded on the basis of visual intensity on ICT strips or tapes (Table 7 2020/5229 column |).

En second lieu, les anticorps ont été couplés à des particules d'or colloïdal et migrés sur une bandelette ou tigette ICT où de la recNP était immobilisée (Tableau 1, colonne Il) ou bien où de la rec-NP-2 était immobilisée (Tableau 1, colonne Ill). Tableau 1 Résultats des réactivités d'anticorps sur la NP de SRAS-CoV (I-Il) et sur la NP de SRAS-CoV-2 (Ill). Les intensités relatives sont enregistrées avec l'échelle suivante : ++++ > +++ > ++(+) > ++ > + > (+) (- = pas de détection).Second, the antibodies were coupled to colloidal gold particles and migrated onto an ICT strip or strip where recNP was immobilized (Table 1, column II) or where rec-NP-2 was immobilized ( Table 1, column Ill). Table 1 Results of antibody reactivities on SARS-CoV NP (I-II) and on SARS-CoV-2 NP (III). The relative intensities are recorded with the following scale: ++++> +++> ++ (+)> ++> +> (+) (- = no detection).

LLL Détection directe Détection directe sur Détection directe surLLL Direct detection Direct detection on Direct detection on

ME marquée à l'or forme de revêtement forme de revêtement 1 8 | 8 UT NE SC. BU 9ME gold marked coating form coating form 1 8 | 8 UT NE SC. BU 9

FLFL HLHL

LO Comme on peut l'observer dans le Tableau 1, les anticorps n'ayant pas d'activité détectable en tant que réactif de détection (anticorps B, D, colonne Il) présentent une certaine capacité de capture (colonne |). A l'opposé, les anticorps H, |, J présentent une capacité de détection meilleure que la capacité de capture.LO As can be seen in Table 1, the antibodies having no detectable activity as detection reagent (antibody B, D, column II) exhibit a certain capture capacity (column |). In contrast, the H, |, J antibodies have a better detection capacity than the capture capacity.

Si l'on compare la réactivité sur les deux recNP et recNP-2, la réactivité globale était plus élevée sur recNP-2, bien que les anticorps aient été initialement déclenchés et sélectionnés contre la recNP. Ceci peut refléter des protocoles de préparation de protéine et un temps de stockage différents. Ce qui est plus intéressant est que les anticorps B, C et H, qui réagissaient contre la recNP, ne réagissent pas du tout avec la recNP-2, conduisant à l'hypothèse que ces anticorps peuvent réagir avec un épitope qui est spécifique de la recNP et qui n'est pas présent sur la recNP-2. BE2020/5229 Des tests ICT en sandwich ont été effectués par combinaison d'anticorps fonctionnant comme des réactifs de capture (appliqués sous forme de revêtement sur de la nitrocellulose) et d'anticorps fonctionnant comme des réactifs de détection (marqués à l'or). Ces tests ICT ont été testés en premier lieu par utilisation de recNP à une concentration similaire pour tous les tests (100 ng/ml). 20 combinaisons ont donné un signal visible (Tableau 2), parmi lesquelles les prototypes 4 et 5 ont donné les signaux les plus élevés. Un test Respi-Strip d'Ag de COVID-19 a été encore optimisé. Iableau2 Résultats des réactivités de tests en sandwich sur la recNP ee LU 8 | EU 8 4 8 LU 7 | 8 0 NY 1 8 4 8 04 NE LU 8 | Eu 8 NEWhen comparing the reactivity on both recNP and recNP-2, the overall reactivity was higher on recNP-2, although the antibodies were initially raised and selected against recNP. This may reflect different protein preparation protocols and storage time. What is more interesting is that the B, C and H antibodies, which reacted against recNP, do not react at all with recNP-2, leading to the hypothesis that these antibodies can react with an epitope which is specific for the recNP and which is not present on recNP-2. BE2020 / 5229 ICT sandwich tests were performed by combining antibodies functioning as capture reagents (applied as a coating on nitrocellulose) and antibodies functioning as detection reagents (gold labeled) . These ICT assays were first tested using recNP at a similar concentration for all assays (100 ng / ml). 20 combinations gave a visible signal (Table 2), of which prototypes 4 and 5 gave the highest signals. A Respi-Strip Ag test for COVID-19 has been further optimized. Iableau2 Results of the reactivity of sandwich tests on the recNP ee LU 8 | EU 8 4 8 LU 7 | 8 0 NY 1 8 4 8 04 NE LU 8 | Eu 8 NE

NEL B 4 4 UNE 9 | EU NE La détectabilité a été effectuée sur la recNP virale avec le prototype 5 sur des dilutions au 1/10 de recNP, et le dosage s'est avéré avoir un niveau de détection supérieur à 1 ng/ml (10 ng/ml étant positifs, 1 ng/ml ou moins étant négatif).NEL B 4 4 A 9 | EU NE Detectability was performed on viral recNP with Prototype 5 on 1/10 dilutions of recNP, and the assay was found to have a detection level greater than 1 ng / ml (10 ng / ml being positive , 1 ng / ml or less being negative).

Pour augmenter de façon inattendue le niveau de détection, les inventeurs ont ausst 2920/5229 amélioré le tampon de dilution en y ajoutant un détergent convenable et en augmentant la salinité du tampon de dilution. Le signal de la ligne de test et la détectabilité étaient principalement augmentés par l'addition avantageuse de NaCl au tampon, avec un effet similaire du NaCl d'environ 0,5 M à environ 1,5 M. Dans les conditions finales du test, le tampon avec du NaCl 1 M a permis d'atteindre de façon inattendue un niveau de détectabilité de 0,25 ng/ml de recNP-2. L'urgence et la propagation extraordinaire du SRAS-CoV2 ont eu pour résultat de nombreux enjeux concernant les paramètres tant à ressources abondantes qu'à ressources limitées. RéférencesTo unexpectedly increase the level of detection, the inventors have also 2920/5229 improved the dilution buffer by adding a suitable detergent thereto and increasing the salinity of the dilution buffer. The test line signal and detectability were mainly increased by the advantageous addition of NaCl to the buffer, with a similar effect of NaCl from about 0.5 M to about 1.5 M. Under the final conditions of the test, buffer with 1 M NaCl unexpectedly reached a detectability level of 0.25 ng / ml recNP-2. The emergency and extraordinary spread of SARS-CoV2 has resulted in many challenges for both resource-rich and resource-limited settings. References

1. Ye Z, Zhang Y, Wang Y, Huang Z, Song B. Chest CT manifestations of new coronavirus disease 2019 (COVID-19) : a pictorial review. Eur Radiol. 19 mars 2020. doi :1. Ye Z, Zhang Y, Wang Y, Huang Z, Song B. Chest CT manifestations of new coronavirus disease 2019 (COVID-19): a pictorial review. Eur Radiol. March 19, 2020. doi:

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10.1056/NEJMe200575910.1056 / NEJMe2005759

3. X.-y. Che, L.-w. Qiu, Y.-x. Pan, K. Wen, W. Hao, L.-y. Zhang, Y.-d. Wang, Z.-y. Liao, X. Hua, V.C.C. Cheng, K.-y. Yuen. Sensitive and Specific Monoclonal Antibody-Based Capture Enzyme Immunoassay for Detection of Nucleocapsid Antigen in Sera from Patients with Severe Acute Respiratory Syndrome. J. Clin. Microbiol. 2004, 42(6) : 2629-26353. X.-y. Che, L.-w. Qiu, Y.-x. Pan, K. Wen, W. Hao, L.-y. Zhang, Y.-d. Wang, Z.-y. Liao, X. Hua, V.C.C. Cheng, K.-y. Yuen. Sensitive and Specific Monoclonal Antibody-Based Capture Enzyme Immunoassay for Detection of Nucleocapsid Antigen in Sera from Patients with Severe Acute Respiratory Syndrome. J. Clin. Microbiol. 2004, 42 (6): 2629-2635

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Claims

REVENDICATIONS

1. Méthode de détection immunochromatographique (ICT) d'une infection virale, qui comprend une étape de dilution de l'échantillon par l'addition d'un tampon de dilution comprenant un sel à une concentration comprise entre 0,5 M et 1,5 M.1. Method of immunochromatographic detection (ICT) of a viral infection, which comprises a step of diluting the sample by the addition of a dilution buffer comprising a salt at a concentration between 0.5 M and 1, 5 M.

2. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle le sel est du NaCl.2. Method according to claim 1, wherein the salt is NaCl.

3. Méthode selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans laquelle le tampon de dilution comprend en outre un détergent doux.3. A method according to claim 1 or claim 2, wherein the dilution buffer further comprises a mild detergent.

4. Méthode selon la revendication 3, dans laquelle le détergent est un émulsionnant non-ionique.4. A method according to claim 3, wherein the detergent is a nonionic emulsifier.

5. Méthode selon la revendication 3 ou la revendication 4, dans laquelle le détergent est un produit d'éthoxylation d'alcool laurylique.5. A method according to claim 3 or claim 4, wherein the detergent is a lauryl alcohol ethoxylate.

6. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le tampon de dilution comprend en outre de l'hydrolysat de caséine, de l'EDTA et de l'azoture de sodium.6. A method according to any preceding claim, wherein the dilution buffer further comprises casein hydrolyzate, EDTA and sodium azide.

7. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l'infection virale est induite par le SRAS-CoV-2 ou est l'infection COVID-19.7. A method according to any preceding claim, wherein the viral infection is induced by SARS-CoV-2 or is the COVID-19 infection.

8. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l'échantillon est un échantillon naso-pharyngé.8. A method according to any preceding claim, wherein the sample is a nasopharyngeal sample.

9. Test ou trousse de détection immunochromatographique, qui comprend un tampon de dilution d'échantillon comprenant un sel à une concentration comprise entre 0,5 M et 1,5 M.9. Immunochromatographic detection test or kit, which comprises a sample dilution buffer comprising a salt at a concentration between 0.5 M and 1.5 M.

10. Test ou trousse selon la revendication 9, dans lequel le sel est NaCI.10. Test or kit according to claim 9, wherein the salt is NaCl.

11. Test ou trousse selon la revendication 9 ou la revendication 10, dans lequel le tampon de dilution d'échantillon comprend en outre un détergent doux.11. The test or kit of claim 9 or claim 10, wherein the sample dilution buffer further comprises a mild detergent.

mee ‚ BE2020/5229mee ‚BE2020 / 5229

12. Test ou trousse selon la revendication 11, dans lequel le détergent est un émulsionnant non-ionique.12. Test or kit according to claim 11, wherein the detergent is a nonionic emulsifier.

13. Test ou trousse selon la revendication 11 ou la revendication 12, dans lequel le détergent est un produit d'éthoxylation d'alcool laurylique.13. A test or kit according to claim 11 or claim 12, wherein the detergent is a lauryl alcohol ethoxylate.

14. Test ou trousse selon l'une quelconque des revendications 9 à 13, dans lequel le tampon de dilution comprend en outre de l'hydrolysat de caséine, de l'EDTA et de l'azoture de sodium.14. Test or kit according to any one of claims 9 to 13, wherein the dilution buffer further comprises casein hydrolyzate, EDTA and sodium azide.

15. Test ou trousse selon l'une quelconque des revendications 9 à 14, qui comprend en outre des réactifs de capture, de préférence appliqués sous forme de revêtement sur une surface de support solide et des réactifs de détection directement ou non directement marqués (formant un conjugué), les deux réactifs étant dirigés contre une molécule cible devant être détectée dans l'échantillon.15. Test or kit according to any one of claims 9 to 14, which further comprises capture reagents, preferably applied as a coating on a solid support surface and detection reagents directly or not directly labeled (forming a conjugate), the two reagents being directed against a target molecule to be detected in the sample.

16. Test ou trousse selon la revendication 15, dans lequel les réactifs de capture et les réactifs de détection sont choisis dans le groupe constitué par les anticorps monoclonaux, les anticorps polyclonaux, les régions variables se liant à un antigène de fragments de ces anticorps, les nanocorps, les alphacorps, les micro-anticorps, les affilines, les affimères, les fymomères, les affitines ou un de leurs mélanges.16. Test or kit according to claim 15, in which the capture reagents and the detection reagents are chosen from the group consisting of monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, the variable regions binding to an antigen of fragments of these antibodies, nanobodies, alpha-bodies, micro-antibodies, affilins, affimers, fymomers, affitins or a mixture thereof.

17. Test ou trousse selon la revendication 15 ou la revendication 16, qui est un dispositif chromatographique analogue à une feuille jetable avec un support solide poreux permettant la migration par action capillaire d'un fluide et de ses composants, de préférence l'échantillon et le tampon de dilution.17. A test or kit according to claim 15 or claim 16, which is a disposable sheet-like chromatographic device with a porous solid support allowing migration by capillary action of a fluid and its components, preferably the sample and. the dilution buffer.

18. Test ou trousse selon l'une quelconque des revendications 15 à 17, qui comprend une région d'application, une ou plusieurs régions de détection et une région d'adsorption.18. A test or kit according to any one of claims 15 to 17, which comprises an application region, one or more detection regions and an adsorption region.

19. Test ou trousse selon l'une quelconque des revendications 15 à 18, dans lequel la molécule cible est un antigène de SRAS-CoV2.19. Test or kit according to any one of claims 15 to 18, wherein the target molecule is a SARS-CoV2 antigen.

20. Test ou trousse selon la revendication 19, dans lequel l'antigène de SARS- CoV2 est la nucléoprotéine RecNP-2.20. Test or kit according to claim 19, in which the SARS-CoV2 antigen is the nucleoprotein RecNP-2.

21. Test ou trousse selon l'une quelconque des revendications 15 à 20, dans laquelle les réactifs de capture se lient à une région de la molécule cible qui est différente de la région de la cible liée par le réactif de détection.21. The test or kit of any one of claims 15 to 20, wherein the capture reagents bind to a region of the target molecule which is different from the region of the target bound by the detection reagent.

22. Test ou trousse selon l'une quelconque des revendications 15 à 21, dans lequel le réactif de détection est marqué par un marqueur particulaire choisi dans le groupe constitué par un colloïde métallique conjugué, de préférence des particules d'or, des particules de latex conjuguées, et des microparticules ayant une couleur spécifique.22. Test or kit according to any one of claims 15 to 21, wherein the detection reagent is labeled with a particulate label selected from the group consisting of a conjugated metallic colloid, preferably gold particles, particles of conjugated latex, and microparticles having a specific color.

23. Procédé de production du test ou de la trousse de l'une quelconque des revendications 10 à 22, dans lequel un conjugué ou des réactifs de détection marqués sont pulvérisés sur la surface du support solide dun test ou d’une trousse immunochromatographique par un dispositif de pulvérisation ayant une tête de buse de pulvérisation qui est située à une distance inférieure à 5 mm du tampon de conjugué ou de la surface de support solide.23. A method of producing the assay or kit of any one of claims 10 to 22, wherein a labeled conjugate or detection reagents are sprayed onto the surface of the solid support of an assay or immunochromatographic kit by an immunochromatographic test or kit. A spray device having a spray nozzle head which is located at a distance of less than 5 mm from the conjugate pad or the solid support surface.

24. Procédé de production selon la revendication 23, dans lequel la distance est comprise entre 4 mm et 3 mm.24. The production method according to claim 23, wherein the distance is between 4mm and 3mm.