BE1026457B1

BE1026457B1 - Method and device for the detection and differentiation of point mutations in microorganisms by oligochromatography

Info

Publication number: BE1026457B1
Application number: BE20185469A
Authority: BE
Inventors: Laetitia Avrain; Florence Naze; Thierry Leclipteux; Pascal Mertens; Olivia Lefevre
Original assignee: Coris Bioconcept
Priority date: 2018-07-04
Filing date: 2018-07-04
Publication date: 2020-02-06
Also published as: BE1026457A1; EP3818181A1; WO2020008009A1

Abstract

La présente invention se rapporte à une méthode de détection et de différenciation de mutations ponctuelles chez des microorganismes, en particulier une bactérie, comprenant une étape d’amplification d’une ou plusieurs cibles d’ADN, précédée ou non d'une étape de transcription inverse d’un ou plusieurs ARN, et suivie d’une étape de détection par oligochromatographie des produits amplifiés et de différenciation (ou discrimination) de mutations ponctuelles (mutations par substitution, insertion ou délétion de bases nucléiques).The present invention relates to a method for the detection and differentiation of point mutations in microorganisms, in particular a bacterium, comprising a step of amplification of one or more DNA targets, whether or not preceded by a step of transcription reverse of one or more RNAs, and followed by a step of detection by oligochromatography of the amplified products and of differentiation (or discrimination) of point mutations (mutations by substitution, insertion or deletion of nucleic bases).

Description

BE2018/5469 Procédé et dispositif pour la détection et différenciation de mutations ponctuelles chez des microorganismes par oligochromatographieBE2018 / 5469 Method and device for the detection and differentiation of point mutations in microorganisms by oligochromatography

La présente invention se rapporte à une méthode de détection et de différenciation de mutations ponctuelles chez des microorganismes, en particulier une bactérie, comprenant une étape d'amplification d'une ou plusieurs cibles d'ADN, précédée ou non d'une étape de transcription inverse d'un ou plusieurs ARN, et suivie d'une étape de détection par oligochromatographie des produits amplifiés et de différenciation (ou discrimination) de mutations ponctuelles (mutations par substitution, insertion ou délétion de bases nucléiques).The present invention relates to a method for the detection and differentiation of point mutations in microorganisms, in particular a bacterium, comprising a step of amplification of one or more DNA targets, whether or not preceded by a step of transcription inverse of one or more RNA, and followed by a step of detection by oligochromatography of the amplified products and of differentiation (or discrimination) of point mutations (mutations by substitution, insertion or deletion of nucleic bases).

Les mutations ponctuelles, ou polymorphismes (mono)nucléotidiques, peuvent être responsables de pathologies chez les êtres vivants ou encore permettre à certains microorganismes de s'adapter à un environnement défavorable, comme dans le cas de l'apparition d'une résistance à des agents anti-infectieux.Point mutations, or (mono) nucleotide polymorphisms, can be responsible for pathologies in living beings or even allow certain microorganisms to adapt to an unfavorable environment, as in the case of the appearance of resistance to agents anti-infectives.

Les techniques disponibles actuellement permettent difficilement d'identifier rapidement plusieurs polymorphismes nucléotidiques c'est-à-dire de détecter l'insertion ou la délétion d'une base nucléotidique, de même que la substitution d'une base nucléotidique de type sauvage par une autre base nucléotidique (mutée), capables, éventuellement, de conférer un nouveau phénotype.The techniques currently available make it difficult to rapidly identify several nucleotide polymorphisms, that is to say to detect the insertion or deletion of a nucleotide base, as well as the substitution of a wild-type nucleotide base by another nucleotide base (mutated), capable, possibly, of conferring a new phenotype.

Plusieurs variants ou sous-populations polymorphiques peuvent également coexister chez un seul individu. Par exemple, certaines bactéries résistantes aux antibiotiques coexistent avec des bactéries sensibles. La détection de ces différentes sous-populations peut avoir des conséquences sur la gravité de la maladie ou encore sur le choix du traitement à administrer au patient.Several polymorphic variants or subpopulations can also coexist in a single individual. For example, some bacteria resistant to antibiotics coexist with sensitive bacteria. The detection of these different sub-populations can have consequences on the severity of the disease or on the choice of treatment to be administered to the patient.

Dans le cas de polymorphismes nucléotidiques dans une séquence codante, l'une des difficultés majeures est de pouvoir non seulement identifier la région ou la position dans le génome de la base nucléique mutée, mais également, dans le cas de régions codantes, de déterminer spécifiquement l'acide aminé modifié par la mutation ponctuelle. En effet, une seule et même position du génome peut présenter différents polymorphismes nucléotidiques, engendrant le cas échéant la synthèse d'acides aminés différents.In the case of nucleotide polymorphisms in a coding sequence, one of the major difficulties is being able not only to identify the region or the position in the genome of the mutated nucleic base, but also, in the case of coding regions, to determine specifically the amino acid modified by the point mutation. Indeed, one and the same position of the genome can present different nucleotide polymorphisms, generating where appropriate the synthesis of different amino acids.

Dans certains cas, la réponse à la gravité de la pathologie ou la sensibilité ou la résistance à l'agent anti-infectieux est dépendante de l'acide-aminé synthétisé. Il est doncIn some cases, the response to the severity of the pathology or the sensitivity or resistance to the anti-infective agent is dependent on the amino acid synthesized. It is therefore

BE2018/5469 primordial de pouvoir identifier la base nucléotidique modifiée par rapport à la séquence codante sauvage.BE2018 / 5469 essential to be able to identify the modified nucleotide base compared to the wild-type coding sequence.

A l'heure actuelle, il existe plusieurs technologies pouvant être utilisées pour la détection et la caractérisation d'une mutation ponctuelle. Par exemple, on peut notamment citer :Currently, there are several technologies that can be used for the detection and characterization of a point mutation. For example, we can notably cite:

- Les techniques de PCR « molecular beacons » ou « Taqman » permettant d'identifier les polymorphismes nucléotidiques par l'hybridation de sondes « beacons » ou « Taqman » spécifiques à la région d'intérêt après amplification de la séquence cible par PCR. Cependant, certaines sondes peuvent couvrir plusieurs positions mutationnelles ce qui ne permet pas d'identifier spécifiquement la base nucléotidique mutée et par conséquent le nouvel acide aminé formé (dans le cas d'un gène codant). L'autre limitation de cette technique est le recours à des fluorophores différents pour le marquage des sondes spécifiques. Les appareils de PCR en temps réel permettant la quantification des fluorophores sont limités à 4, voire 5, canaux de fluorescence, ce qui limite le nombre de mutations détectées par réaction PCR.- PCR techniques “molecular beacons” or “Taqman” making it possible to identify the nucleotide polymorphisms by hybridization of “beacons” or “Taqman” probes specific to the region of interest after amplification of the target sequence by PCR. However, certain probes can cover several mutational positions, which does not make it possible to specifically identify the mutated nucleotide base and therefore the new amino acid formed (in the case of a coding gene). The other limitation of this technique is the use of different fluorophores for the labeling of specific probes. Real-time PCR devices allowing the quantification of fluorophores are limited to 4 or even 5 fluorescence channels, which limits the number of mutations detected by PCR reaction.

- La PCR avec agent intercalant suivie d'une analyse par High Resolution Melting (HRM). L'amplification de la cible est réalisée en présence d'un intercalant de l'ADN, puis une courbe de dissociation des doubles brins d'ADN est réalisée sous l'effet de températures croissantes. Les liaisons entre les bases G-C étant plus fortes que pour une liaison A-T, cette technique peut permettre de discriminer des acides nucléiques sauvages, d'acides nucléiques hétérozygotes (mutation sur un seul des deux brins d'ADN), d'acides nucléiques homozygotes (mutation sur les deux brins d'ADN), mais ne permet de détecter qu'une seule mutation par réaction PCR et doit être préférentiellement comparée au signal obtenu pour une séquence sauvage.- PCR with intercalating agent followed by analysis by High Resolution Melting (HRM). Amplification of the target is carried out in the presence of a DNA intercalator, then a dissociation curve for the double strands of DNA is carried out under the effect of increasing temperatures. The links between the GC bases being stronger than for an A-T link, this technique can make it possible to discriminate from wild nucleic acids, from heterozygous nucleic acids (mutation on only one of the two strands of DNA), from nucleic acids homozygous (mutation on the two DNA strands), but only allows a single mutation to be detected per PCR reaction and should preferably be compared to the signal obtained for a wild-type sequence.

- Les techniques de digital PCR permettent d'augmenter significativement la sensibilité de détection de mutants au sein d'une large population sauvage. Elles permettent ainsi d'affiner le diagnostic, voire même de faire du pronostic. Comme décrit pour les techniques de PCR, les instruments de lecture de la fluorescence sont limités à la détection de 4 ou 5 variants par échantillon ce qui nécessite soit la multiplication des essais pour un même échantillon soit la limitation en terme de mutations détectées.- Digital PCR techniques make it possible to significantly increase the sensitivity of detection of mutants in a large wild population. They thus make it possible to refine the diagnosis, or even to make a prognosis. As described for the PCR techniques, the fluorescence reading instruments are limited to the detection of 4 or 5 variants per sample, which requires either the multiplication of tests for the same sample or the limitation in terms of mutations detected.

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- Le séquençage de Sanger et le séquençage à haut débit. Toutefois, ces méthodes nécessitent des équipements couteux ainsi que des temps de préparation et d'analyses relativement longs pouvant aller d'une dizaine d'heures à une dizaine de jours.- Sanger sequencing and high speed sequencing. However, these methods require expensive equipment as well as relatively long preparation and analysis times which can range from ten hours to ten days.

Il demeure ainsi nécessaire de mettre au point une technique d'identification de mutations ponctuelles qui soit sensible, rapide et qui permette d'identifier un plus grand nombre de mutations ponctuelles simultanément; c'est ce à quoi sont parvenus les Inventeurs en mettant au point une méthode permettant une détection rapide et efficace de séquences nucléotidiques spécifiques, susceptibles de porter une mutation ponctuelle et permettant une corrélation de cette détection à des formes mutées de microorganismes, telles que des bactéries résistantes à des agents anti-infectieux comme des antibiotiques.It therefore remains necessary to develop a technique for identifying point mutations which is sensitive, rapid and which makes it possible to identify a greater number of point mutations simultaneously; this is what the inventors have achieved by developing a method allowing rapid and efficient detection of specific nucleotide sequences, capable of carrying a point mutation and allowing a correlation of this detection with mutated forms of microorganisms, such as bacteria resistant to anti-infective agents such as antibiotics.

Cette méthode permet à la fois l'amplification multiplexe de cibles et la détection spécifique de mutations ponctuelles au sein d'au moins neuf positions mutationnelles sur chaque séquence nucléotidique cible amplifiée (aussi appelé amplicon) à partir d'un seul et même échantillon d'acides nucléiques.This method allows both the multiplex amplification of targets and the specific detection of point mutations within at least nine mutational positions on each amplified target nucleotide sequence (also called amplicon) from a single sample of nucleic acids.

La présente méthode permet en particulier :This method allows in particular:

- de détecter la position mutée par la présence de sondes nucléotidiques complémentaires aux séquences nucléotidiques cibles mutées (sondes de capture immobilisées sur un support d'oligochromatographie) ;- detecting the mutated position by the presence of nucleotide probes complementary to the mutated target nucleotide sequences (capture probes immobilized on an oligochromatography support);

- d'identifier spécifiquement la base nucléotidique mutée, et par conséquent l'acide aminé introduit par le codon muté dans le cas d'une mutation présente dans une séquence codante ;- to identify specifically the mutated nucleotide base, and therefore the amino acid introduced by the mutated codon in the case of a mutation present in a coding sequence;

- de détecter simultanément au moins neuf positions mutationnelles sur une seule séquence d'ADN;- to simultaneously detect at least nine mutational positions on a single DNA sequence;

- de présenter, pour chaque position mutationnelle, une sonde de capture correspondant au type sauvage et des sondes de capture correspondant aux mutations possibles (jusqu'à au moins 5 sondes mutées par position mutationnelle) ;- to present, for each mutational position, a capture probe corresponding to the wild type and capture probes corresponding to the possible mutations (up to at least 5 mutated probes per mutational position);

- de distinguer, dans un même échantillon, des populations microbiennes sauvages et mutées.- to distinguish, in the same sample, wild and mutated microbial populations.

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Un autre avantage de la méthode de l'invention est sa rapidité, car elle peut être exécutée rapidement, en moins de 90 minutes, de préférence en moins de 60 minutes, voire dans des conditions préférées en moins de 30 minutes.Another advantage of the method of the invention is its speed, because it can be executed quickly, in less than 90 minutes, preferably in less than 60 minutes, or even under preferred conditions in less than 30 minutes.

Ainsi, cette méthode représente un outil de diagnostic des polymorphismes (mono)nucléotidiques dans le domaine médical et plus particulièrement dans celui des maladies infectieuses et de la résistance aux antibiotiques.Thus, this method represents a diagnostic tool for (mono) nucleotide polymorphisms in the medical field and more particularly in that of infectious diseases and antibiotic resistance.

Plus spécifiquement, la présente invention se rapporte à une méthode de détection et de différenciation par oligochromatographie d'au moins une mutation ponctuelle du génome d'un microorganisme, de préférence d'une bactérie, présent dans un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes :More specifically, the present invention relates to a method of detection and differentiation by oligochromatography of at least one point mutation in the genome of a microorganism, preferably a bacterium, present in a biological sample comprising the following steps:

a- l'amplification d'au moins une séquence nucléotidique cible, ladite séquence nucléotidique cible étant susceptible de porter une mutation ponctuelle, c'est-à-dire de présenter, à une position donnée, la délétion d'un nucléotide, la substitution de ce nucléotide par un autre nucléotide ou encore l'insertion d'un nucléotide juste avant ou juste après ladite position ;a- amplification of at least one target nucleotide sequence, said target nucleotide sequence being capable of carrying a point mutation, that is to say of presenting, at a given position, the deletion of a nucleotide, the substitution of this nucleotide with another nucleotide or else the insertion of a nucleotide just before or just after said position;

b- la détection parmi les séquences nucléotidiques cibles amplifiées obtenues à l'étape a) de séquences nucléotidiques sauvages ou porteuses d'une mutation ponctuelle par la mise en contact desdites séquences nucléotidiques cibles amplifiées avec plusieurs sondes de capture immobilisées sur un support, l'une de ces sondes de capture étant complémentaire et spécifique d'une partie de la séquence nucléotidique sauvage, chacune des autres étant complémentaires et spécifiques d'une partie de séquence nucléotidique comprenant au moins une mutation ponctuelle, et la détection des séquences nucléotidiques cibles amplifiées hybridées sur les sondes de capture.b- the detection, among the amplified target nucleotide sequences obtained in step a) of wild-type nucleotide sequences or carriers of a point mutation by bringing said amplified target nucleotide sequences into contact with several capture probes immobilized on a support, the one of these capture probes being complementary and specific to a part of the wild-type nucleotide sequence, each of the others being complementary and specific to a part of nucleotide sequence comprising at least one point mutation, and the detection of the amplified target nucleotide sequences hybridized on the capture probes.

L'échantillon biologique consiste en des acides nucléiques extraits d'échantillons biologiques (humains, animaux, plantes...) ; il peut notamment consister en un échantillon extrait d'un animal ou d'un individu tel qu'un mammifère, plus particulièrement d'un humain, ou d'une composition alimentaire.The biological sample consists of nucleic acids extracted from biological samples (humans, animals, plants, etc.); it may in particular consist of a sample extracted from an animal or from an individual such as a mammal, more particularly from a human, or from a food composition.

L'échantillon biologique est préférentiellement lysé dans un tampon de lyse chimique ou par lyse thermique ou par lyse mécanique avant d'être extrait par desThe biological sample is preferably lysed in a chemical lysis buffer or by thermal lysis or by mechanical lysis before being extracted by

BE2018/5469 méthodes d'extractions manuelles ou automatisées combinant en général deux à trois des étapes suivantes telles que la rétention ou séparation par affinité sur colonne chromatographique ou de billes magnétiques, de précipitation chimiques, de centrifugations ...BE2018 / 5469 manual or automated extraction methods generally combining two to three of the following stages such as retention or separation by affinity on a chromatographic column or magnetic beads, chemical precipitation, centrifugation ...

Les séquences nucléotidiques cibles peuvent être des séquences d'ADN, en particulier des séquences d'ADN simple brin ou double brin ou partiellement double brin, ainsi que des séquences d'ADNc obtenues par transcription inverse de séquences d'ARN. Ainsi, la méthode selon l'invention peut comprendre une étape optionnelle, préalable à l'étape a), correspondant à la transcription inverse de l'ARN contenu dans l'échantillon.The target nucleotide sequences can be DNA sequences, in particular single-stranded or double-stranded or partially double-stranded DNA sequences, as well as cDNA sequences obtained by reverse transcription of RNA sequences. Thus, the method according to the invention can comprise an optional step, prior to step a), corresponding to the reverse transcription of the RNA contained in the sample.

Dans un mode de réalisation, les séquences cibles amplifiées ont une taille comprise entre 50 et 200 bases, en particulier de 70 à 150 bases.In one embodiment, the amplified target sequences have a size of between 50 and 200 bases, in particular from 70 to 150 bases.

L'étape a) d'amplification peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier ; plus particulièrement, elle peut être réalisée par PCR ou par amplification isotherme, notamment par la méthode LAMP (Loop-Mediated Amplification) (Notomi et al., Nucleic acid Res., 2000, 28, e63) ou RPA (Recombinase Polymerase Amplification) (Piepenburg et al., PLOS Biol., 2006, 4(7), e204) ou NASBA (Nucleic Acid sequencebased amplification) (Guatelli et al., PNAS, 1990, 87(5), 1874-1878). Il est également possible d'utiliser la technique de MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) (Schouten et al., Nucleic Acid Res., 2002, 30, e57). La MLPA est une variante de la PCR multiplexe et permet d'amplifier de multiples séquences nucléotidiques cibles avec une paire d'amorces universelles.The amplification step a) can be carried out by any method known to those skilled in the art; more particularly, it can be carried out by PCR or by isothermal amplification, in particular by the LAMP method (Loop-Mediated Amplification) (Notomi et al., Nucleic acid Res., 2000, 28, e63) or RPA (Recombinase Polymerase Amplification) ( Piepenburg et al., PLOS Biol., 2006, 4 (7), e204) or NASBA (Nucleic Acid sequencebased amplification) (Guatelli et al., PNAS, 1990, 87 (5), 1874-1878). It is also possible to use the MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) technique (Schouten et al., Nucleic Acid Res., 2002, 30, e57). MLPA is a variant of multiplex PCR and makes it possible to amplify multiple target nucleotide sequences with a pair of universal primers.

De préférence, l'étape d'amplification est réalisée par PCR.Preferably, the amplification step is carried out by PCR.

Le mélange réactionnel pour l'amplification peut contenir plusieurs réactifs comme un tampon, des enzymes, des désoxynucléotides triphosphates (dNTPs), des additifs, et notamment plusieurs couples d'amorces pour l'amplification simultanée de séquences multiples dans un seul échantillon.The reaction mixture for amplification may contain several reagents such as a buffer, enzymes, deoxynucleotide triphosphates (dNTPs), additives, and in particular several pairs of primers for the simultaneous amplification of multiple sequences in a single sample.

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Les deux étapes de transcription inverse et d’amplification par PCR peuvent être réalisées soit dans des tubes réactionnels fermés, insérés dans un instrument programmable qui chauffe et refroidit une chambre de réaction stationnaire (tel qu’un thermocycleur), soit dans un dispositif microfluidique à usage unique dans lequel le mélange réactionnel circule sur des zones statiques ayant chacune une température définie. En général, la transcription inverse est réalisée à une température unique avant que des cycles successifs de chauffe et de refroidissement permettent la multiplication (amplification) des cibles par réaction de PCR. Selon un mode de réalisation préféré, ces étapes sont réalisées en flux continu dans un système microfluidique tel que décrit dans le Brevet Européen EP 2 870 260 ou dans la demande de brevet EP 3 075 451.The two stages of reverse transcription and amplification by PCR can be carried out either in closed reaction tubes, inserted in a programmable instrument which heats and cools a stationary reaction chamber (such as a thermocycler), or in a microfluidic device with single use in which the reaction mixture circulates on static zones each having a defined temperature. In general, reverse transcription is performed at a single temperature before successive heating and cooling cycles allow targets to be multiplied (amplified) by PCR reaction. According to a preferred embodiment, these steps are carried out in continuous flow in a microfluidic system as described in European Patent EP 2 870 260 or in patent application EP 3 075 451.

Le choix des séquences nucléotidiques utilisées comme amorces pour l'amplification, de préférence par PCR, est fait en fonction de la ou des séquence(s) nucléotidique(s) cibles à amplifier et à détecter. La sélection de ces amorces est à la portée de l'homme de l'art, ainsi que leur marquage éventuel par des éléments comme des particules métalliques, de préférence des particules d'or, des colloïdes, des particules de polystyrène, des particules colorées, des particules (para)-magnétiques ou des éléments fluorescents ou tout autre marqueur permettant la détection.The choice of nucleotide sequences used as primers for amplification, preferably by PCR, is made according to the target nucleotide sequence (s) to be amplified and detected. The selection of these primers is within the reach of those skilled in the art, as well as their possible labeling with elements such as metallic particles, preferably gold particles, colloids, polystyrene particles, colored particles. , (para) -magnetic particles or fluorescent elements or any other marker allowing detection.

La séquence nucléotidique cible amplifiée (amplicon) peut être marquée, directement ou indirectement, par différents marqueurs de détection, de préférence des fluorophores (ou éléments fluorescents) ou des nanoparticules comme l’or colloïdal. Le marquage de l’amplicon peut se faire (i) soit dès l’étape d’amplification par l’utilisation d’une amorce d’amplification marquée par un fluorophore (Figure 1A), (ii) soit après resuspension d’une sonde fluorescente ou d’une sonde couplée à un conjugué à l’or colloïdal (Figure 1B) déposée au niveau de la région d’application du support d’oligochromatographie, dont la séquence est différente de la séquence de la sonde de capture immobilisée et complémentaire d’une partie de la séquence nucléotidique cible amplifiée, (iii) soit par l'incorporation d'une amorce marquée par un haptène (par exemple DIG, DNP ou FAM) et la resuspension du récepteur de cet haptène, récepteur lui-même couplé à un marqueur de détection (Figure 1C).The amplified target nucleotide sequence (amplicon) can be labeled, directly or indirectly, with different detection markers, preferably fluorophores (or fluorescent elements) or nanoparticles such as colloidal gold. The amplicon can be labeled (i) either from the amplification step by the use of an amplification primer labeled with a fluorophore (Figure 1A), (ii) or after resuspension of a probe fluorescent or a probe coupled to a conjugate with colloidal gold (Figure 1B) deposited at the level of the region of application of the oligochromatography support, the sequence of which is different from the sequence of the immobilized and complementary capture probe of a part of the amplified target nucleotide sequence, (iii) either by the incorporation of a primer labeled with a hapten (for example DIG, DNP or FAM) and the resuspension of the receptor for this hapten, the receptor itself coupled to a detection marker (Figure 1C).

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De préférence, le marqueur est un marqueur fluorescent, de préférence constitué de cyanine (Cy5) ou d'un marqueur ayant des propriétés fluorescentes similaires.Preferably, the marker is a fluorescent marker, preferably consisting of cyanine (Cy5) or a marker having similar fluorescent properties.

Des marqueurs présentant différents types de coloration ou différentes longueurs d'ondes de fluorescence peuvent être utilisés pour le marquage des séquences nucléotidiques cibles amplifiées de manière à faciliter leur détection simultanée ou consécutive sur le support, chaque couleur étant spécifique d'une séquence ou d'un groupe de séquences nucléotidiques cibles amplifiées et présentes initialement dans l'échantillon testé, leur détection colorimétrique peut ainsi être obtenue par des moyens connus de l'homme de l'art.Markers having different types of staining or different wavelengths of fluorescence can be used for the labeling of the amplified target nucleotide sequences so as to facilitate their simultaneous or consecutive detection on the support, each color being specific for a sequence or a group of amplified target nucleotide sequences initially present in the test sample, their colorimetric detection can thus be obtained by means known to those skilled in the art.

Le nombre de séquences nucléotidiques différentes pouvant être détectées par la méthode selon l'invention peut être adapté selon les besoins de l'application. La méthode de l'invention est modulable et permet d'adapter le nombre de sondes de capture présentes sur le support oligochromatographique selon le nombre de séquences nucléotidiques cibles à détecter.The number of different nucleotide sequences which can be detected by the method according to the invention can be adapted according to the needs of the application. The method of the invention is modular and makes it possible to adapt the number of capture probes present on the oligochromatographic support according to the number of target nucleotide sequences to be detected.

Dans un mode de réalisation préféré, entre environ 2 séquences et environ 50 séquences nucléotidiques cibles, de préférence entre environ 4 séquences et environ 40 séquences nucléotidiques cibles sont amplifiées et détectées dans le même échantillon.In a preferred embodiment, between about 2 sequences and about 50 target nucleotide sequences, preferably between about 4 sequences and about 40 target nucleotide sequences are amplified and detected in the same sample.

En particulier, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 séquences cibles sont amplifiées et détectées dans un même échantillon.In particular, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 or 50 target sequences are amplified and detected in the same sample.

Pour la mise en œuvre de l'étape b) de détection, les sondes de capture, utilisées pour détecter par hybridation les séquences nucléotidiques cibles amplifiées à l'étape a), ont de préférence une longueur comprise entre 18 et 35 bases. Leur séquence est définie en fonction de la région dans laquelle la mutation ponctuelle est recherchée.For the implementation of step b) of detection, the capture probes, used to detect by hybridization the target nucleotide sequences amplified in step a), preferably have a length of between 18 and 35 bases. Their sequence is defined according to the region in which the point mutation is sought.

En particulier, les sondes de capture selon l'invention ont une taille de 18, 19, 20, 21,In particular, the capture probes according to the invention have a size of 18, 19, 20, 21,

22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ou 35 bases.22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 or 35 bases.

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Les sondes de capture peuvent être formées de bases nucléotidiques puriques, pyrimidiques, dégénérées, universelles, ou de type LNA (lock nucleic acid), ANA (altritol nucleic acid), HNA (hexitol nucleic acid), ... ou des sondes non-nucléiques de type PNA (peptide nucleic acid) mais pouvant s'apparier à des séquences nucléotidiques ou encore des combinaisons de ces différents types de bases.The capture probes can be formed from purine, pyrimidine, degenerate, universal, or LNA (lock nucleic acid), ANA (altritol nucleic acid), HNA (hexitol nucleic acid), etc. nucleotide bases. nucleic acid type PNA (peptide nucleic acid) but which can be paired with nucleotide sequences or combinations of these different types of bases.

Les sondes de capture peuvent être entièrement spécifiques d'une séquence cible ou bien contenir en plus de la séquence définie en fonction de la région dans laquelle la mutation ponctuelle est recherchée (par exemple en plus de leurs 18 à 35 bases) des espaceurs (« spacers ») de nature nucléotidiques ou chimiques. Selon un mode de réalisation particulier, l'espaceur de type nucléotidique est une séquence d'au moins 2 T (thymine), de préférence entre 5T et 8T, et l'espaceur de type chimique est une chaîne de type carbonée de minimum 3 carbones et de maximum 12 carbones.The capture probes may be entirely specific for a target sequence or may contain, in addition to the sequence defined according to the region in which the point mutation is sought (for example in addition to their 18 to 35 bases), spacers (“ spacers ") of a nucleotide or chemical nature. According to a particular embodiment, the spacer of nucleotide type is a sequence of at least 2 T (thymine), preferably between 5T and 8T, and the spacer of chemical type is a carbon type chain of at least 3 carbons and a maximum of 12 carbons.

Les sondes de capture, avec ou sans espaceur, sont immobilisées sur un support, de préférence sur une membrane d'oligochromatographie, permettant la capture ou l'hybridation des séquences nucléotidiques cibles amplifiées.The capture probes, with or without a spacer, are immobilized on a support, preferably on an oligochromatography membrane, allowing the capture or the hybridization of the amplified target nucleotide sequences.

Dans l'invention, le terme oligochromatographie désigne une méthode de détection par écoulement d'acides nucléiques sur un support pour permettre leur hybridation à des sondes de capture spécifiques.In the invention, the term oligochromatography designates a method of detection by flow of nucleic acids on a support to allow their hybridization to specific capture probes.

Les sondes de capture spécifiques à chaque mutation ponctuelle, débutant ou non par un espaceur, sont immobilisées sur le support, de préférence sur une membrane d'oligochromatographie sous forme de points (spottées) (Figure 2), notamment via des liaisons covalentes ou via une molécule porteuse pour faciliter l'accrochage sur le support et l'accessibilité de la sonde. La molécule porteuse s'ajoute à la séquence nucléotidique de la sonde, indépendamment de la présence de l'espaceur. Cette fixation peut être directe ou indirecte ; dans ce dernier cas, la sonde de capture est couplée à une première molécule, telle que la biotine, elle-même fixée sur la membrane par une seconde molécule protéique complémentaire, telle que l'avidine, la streptavidine ou des molécules dérivées.The capture probes specific to each point mutation, whether or not starting with a spacer, are immobilized on the support, preferably on an oligochromatography membrane in the form of points (spotted) (Figure 2), in particular via covalent bonds or via a carrier molecule to facilitate attachment to the support and accessibility of the probe. The carrier molecule is added to the nucleotide sequence of the probe, regardless of the presence of the spacer. This fixation can be direct or indirect; in the latter case, the capture probe is coupled to a first molecule, such as biotin, itself fixed on the membrane by a second complementary protein molecule, such as avidin, streptavidin or derived molecules.

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Le support peut être de différentes natures ; il peut d'agir d'une membrane, par exemple une membrane de nitrocellulose, de cellulose, d'acétate de cellulose, de nylon, de copolymère acrylique et nylon, ....The support can be of different natures; it can act on a membrane, for example a membrane of nitrocellulose, cellulose, cellulose acetate, nylon, acrylic and nylon copolymer, etc.

En particulier, le support peut être sous la forme d'une tigette. Une tigette selon l'invention peut être trempée dans un tube réactionnel ou disposée dans système microfluidique.In particular, the support can be in the form of a strip. A strip according to the invention can be dipped in a reaction tube or placed in a microfluidic system.

En particulier, une tigette selon l'invention a une longueur de 40 à 60 mm et une largueur de 4 à 10 mm. Plus particulièrement, une tigette selon l'invention a une longueur de 57 mm et une largeur de 5 mm.In particular, a strip according to the invention has a length of 40 to 60 mm and a width of 4 to 10 mm. More particularly, a strip according to the invention has a length of 57 mm and a width of 5 mm.

Dans un mode de réalisation particulier, le support peut également être une puce de détection microfluidique en polymère de cyclo-oléfine.In a particular embodiment, the support can also be a microfluidic detection chip made of a cycloolefin polymer.

La capture des séquences nucléotidiques cibles amplifiées est réalisée par l'hybridation entre les séquences nucléotidiques cibles amplifiées et les sondes nucléotidiques de capture immobilisées sur ledit support, de préférence sur une membrane d'oligochromatographie. Pour cela, est utilisé un tampon de migration ; ce tampon peut consister en une solution tamponnée, de préférence, il s'agit d'un tampon de bases phosphate-Tris supplémenté en sels (KCl et MgCl₂) et de saturants (hydrolysat de caséine et thréalose).Capture of the amplified target nucleotide sequences is carried out by hybridization between the amplified target nucleotide sequences and the nucleotide capture probes immobilized on said support, preferably on an oligochromatography membrane. For this, a migration buffer is used; this buffer can consist of a buffered solution, preferably it is a phosphate-Tris base buffer supplemented with salts (KCl and MgCl ₂ ) and saturants (casein hydrolyzate and threealose).

La température d'hybridation est adaptée à la séquence des sondes de capture, elle est généralement comprise entre 45°C et 80°C, de préférence, entre 50°C et 75°C.The hybridization temperature is adapted to the sequence of capture probes, it is generally between 45 ° C and 80 ° C, preferably between 50 ° C and 75 ° C.

Comme indiqué plus tôt, les différentes étapes de la méthode selon l'invention, c'està-dire, la transcription inverse optionnelle, l'amplification et la détection, peuvent être réalisées soit dans un dispositif microfluidique unique, soit dans des tubes réactionnels fermés nécessitant alors une étape de détection, séparée de l'amplification, de préférence sur le support oligochromatographique.As indicated earlier, the different steps of the method according to the invention, that is to say, the optional reverse transcription, the amplification and the detection, can be carried out either in a single microfluidic device, or in closed reaction tubes. then requiring a detection step, separate from the amplification, preferably on the oligochromatographic support.

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Selon un mode de réalisation, la méthode est mise en œuvre dans un dispositif microfluidique, tel que décrit dans le Brevet Européen EP 2 870 260 et représenté à la Figure 3 ; ce dispositif microfluidique est inséré dans un équipement dédié permettant de gérer les températures de la transcription inverse, de la PCR et de la détection. Le flux du mélange réactionnel est conditionné par une pompe péristaltique et la lecture de la zone de détection est réalisée à l'aide d'une caméra. Un logiciel d'analyse des signaux observés permet de différencier les polymorphismes (mono)nucléotidiques.According to one embodiment, the method is implemented in a microfluidic device, as described in European Patent EP 2 870 260 and shown in Figure 3; this microfluidic device is inserted into dedicated equipment allowing the temperatures of reverse transcription, PCR and detection to be managed. The flow of the reaction mixture is conditioned by a peristaltic pump and the detection zone is read using a camera. Software for analyzing the signals observed makes it possible to differentiate the (mono) nucleotide polymorphisms.

Selon un autre mode de mise en œuvre de la méthode selon l'invention, elle est réalisée à l'aide de tubes réactionnels qui sont insérés dans un thermocycler permettant la réalisation de l'éventuelle RT-PCR et de la PCR. Les séquences nucléotidiques cibles amplifiées (amplicons), sont ensuite détectées après migration sur le support oligochromatographique, sur lequel sont immobilisées les sondes de capture. La lecture de la zone optique et l'analyse des signaux sont ensuite réalisées à l'aide d'un lecteur et d'un logiciel d'analyse.According to another embodiment of the method according to the invention, it is carried out using reaction tubes which are inserted into a thermocycler allowing the possible RT-PCR and PCR to be carried out. The amplified target nucleotide sequences (amplicons) are then detected after migration on the oligochromatographic support, on which the capture probes are immobilized. Reading of the optical zone and analysis of the signals are then carried out using a reader and analysis software.

Après l'étape de capture des séquences nucléiques cibles amplifiées, le support oligochromatographique est lavé par une solution tamponnée visant à éliminer les amorces marquées en excès et les hybridations aspécifiques. La solution tamponnée peut être introduite, soit au niveau du réservoir de tampon dans le dispositif microfluidique tel que décrit dans (Figure 3, référence 12), soit au fond d'un tube dans le cas d'une oligochromatographie verticale. La solution tamponnée de lavage peut consister en une solution tamponnée. De préférence, il s'agit d'un tampon de bases phosphate-Tris supplémenté en sels (KCl et MgCl₂) et de saturants (hydrolysat de caséine et thréalose)... Dans le cas où la solution tamponnée est introduite au niveau du réservoir de tampon du dispositif microfluidique (Figure 3, référence 12), la solution tamponnée est soumise aux températures d'abord de la transcription inverse, de la PCR, puis de l'hybridation au niveau du dispositif oligochromatographique. Dans le cas où la migration est réalisée dans un tube à la verticale, le tube contenant la solution de lavage tamponnée est chauffé à la température permettant l'hybridation entre les sondes nucléotidiques immobilisées sur le dispositif oligochromatographie et les séquences nucléotidiques amplifiées.After the step of capturing the amplified target nucleic sequences, the oligochromatographic support is washed with a buffered solution aimed at eliminating the primers marked in excess and the aspecific hybridizations. The buffered solution can be introduced either at the level of the buffer reservoir in the microfluidic device as described in (Figure 3, reference 12), or at the bottom of a tube in the case of vertical oligochromatography. The buffered wash solution may consist of a buffered solution. Preferably, it is a phosphate-Tris base buffer supplemented with salts (KCl and MgCl ₂ ) and saturants (casein hydrolyzate and threalose) ... In the case where the buffered solution is introduced at the level of buffer reservoir of the microfluidic device (FIG. 3, reference 12), the buffered solution is subjected to the temperatures first of the reverse transcription, of the PCR, then of the hybridization at the level of the oligochromatographic device. In the case where the migration is carried out in a vertical tube, the tube containing the buffered washing solution is heated to the temperature allowing hybridization between the nucleotide probes immobilized on the oligochromatography device and the amplified nucleotide sequences.

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Après lavage du support avec la solution tamponnée, par exemple pendant 5, 10, 15, 20 ou 30 minutes, ou quand l'équipement dédié établit le meilleur rapport signal/bruit de fond au niveau de chaque spot de sondes nucléotidiques, la zone de détection est exposée à la source lumineuse d'un équipement dédié ou d'un microscope afin de détecter et de quantifier le signal soit d'un marqueur fluorescent, soit d'un élément détectable dans les spectres de lumière visible telle que des billes d'or colloïdal. Le temps d'exposition est adapté à la méthode mise en œuvre, à titre d'exemple, il peut être compris entre 1 et 5000 ms, en particulier entre 50 ms et 1500 ms.After washing the support with the buffered solution, for example for 5, 10, 15, 20 or 30 minutes, or when the dedicated equipment establishes the best signal / background noise ratio at each spot of nucleotide probes, the area of detection is exposed to the light source of dedicated equipment or a microscope in order to detect and quantify the signal either of a fluorescent marker or of a detectable element in the visible light spectra such as beads colloidal gold. The exposure time is adapted to the method used, for example, it can be between 1 and 5000 ms, in particular between 50 ms and 1500 ms.

Les intensités des signaux sont mesurées au niveau de chaque position (« spot ») où est immobilisée une sonde nucléotidique de capture sur le dispositif oligochromatographique; il s'agit du signal spécifique, et autour de chaque position, il s'agit du bruit de fond.The signal intensities are measured at each position (“spot”) where a nucleotide capture probe is immobilized on the oligochromatographic device; this is the specific signal, and around each position it is the background noise.

Dans le cas de l'utilisation d'un équipement spécifique au dispositif microfluidique précité, cet équipement positionne une grille d'analyse permettant la quantification automatique du signal lumineux pour chaque spot et pour le signal de bruit de fond autour de chaque spot.In the case of the use of equipment specific to the aforementioned microfluidic device, this equipment positions an analysis grid allowing the automatic quantification of the light signal for each spot and for the background noise signal around each spot.

L'intensité du signal est plus élevé lorsque la sonde reconnaît sa séquence homologue dans l'amplicon. Si l'amplicon est de type sauvage, c'est la sonde sauvage qui sera plus lumineuse. Par exemple, si dans la séquence sauvage le nucléotide en position X est G alors c'est le spot avec la sonde portant un C complémentaire au G en position X qui sera plus lumineuse. Si l'amplicon est de type muté, c'est la sonde mutée qui sera plus lumineuse. Par exemple, si dans la séquence mutée le nucléotide en position X est remplacé par un T (G>T) alors c'est le spot avec la sonde portant un A à la position X qui sera plus lumineux. De préférence, un algorithme d'analyse facilite l'interprétation des résultats.The signal strength is higher when the probe recognizes its homologous sequence in the amplicon. If the amplicon is wild type, the wild probe will be brighter. For example, if in the wild sequence the nucleotide in position X is G then it is the spot with the probe carrying a C complementary to the G in position X which will be brighter. If the amplicon is of the mutated type, the mutated probe will be brighter. For example, if in the mutated sequence the nucleotide in position X is replaced by a T (G> T) then it is the spot with the probe carrying an A at position X which will be brighter. Preferably, an analysis algorithm facilitates the interpretation of the results.

De préférence, la mutation ponctuelle à détecter est susceptible d'être présente dans le génome d'un microorganisme, en particulier d'une bactérie.Preferably, the point mutation to be detected is likely to be present in the genome of a microorganism, in particular of a bacterium.

Selon un mode de réalisation préféré, la méthode est destinée à détecter une mutation ponctuelle dans le génome bactérien de Mycobacterium tuberculosis.According to a preferred embodiment, the method is intended to detect a point mutation in the bacterial genome of Mycobacterium tuberculosis.

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Dans le cadre de la présente invention, on entend par génome bactérien, le chromosome bactérien et les plasmides bactériens naturels.In the context of the present invention, the term “bacterial genome” means the bacterial chromosome and the natural bacterial plasmids.

Une mutation ponctuelle représente une délétion, insertion ou substitution d'un nucléotide dans un codon du génome bactérien pouvant conduire à l'expression d'une protéine ayant un acide aminé modifié par rapport à la séquence sauvage de cette protéine. La séquence sauvage d'un gène ou d'une protéine est celle présente majoritairement dans la nature.A point mutation represents a deletion, insertion or substitution of a nucleotide in a codon of the bacterial genome which can lead to the expression of a protein having an amino acid modified compared to the wild-type sequence of this protein. The wild sequence of a gene or a protein is that present mainly in nature.

Plus spécifiquement, la méthode selon l'invention permet la détection d'une mutation ponctuelle associée à une résistance à un antibiotique. L'antibiotique peut être choisi parmi les familles suivantes : les béta-lactamines, les glycopeptides, les aminosides, les macrolides, les phénicolés, les cyclines, les acides fusidiques, les oxazolidinones, les quinolones, les sulfamides et triméthoprime, les produits nitrés (nitrofuranes et nitroimidazoles), les antituberculeux en particulier, il peut s'agir d'une mutation ponctuelle associée à une résistance chez Mycobacterium tuberculosis à la rifampicine, à l'isoniazide, à la pyrazinamide, à l'ethanbutol et aux fluoroquinolones ...More specifically, the method according to the invention allows the detection of a point mutation associated with resistance to an antibiotic. The antibiotic can be chosen from the following families: beta-lactams, glycopeptides, aminoglycosides, macrolides, phenicolics, cyclins, fusidic acids, oxazolidinones, quinolones, sulfonamides and trimethoprim, nitrated products ( nitrofurans and nitroimidazoles), anti-tuberculosis drugs in particular, it may be a point mutation associated with resistance in Mycobacterium tuberculosis to rifampicin, isoniazid, pyrazinamide, ethanbutol and fluoroquinolones ...

La résistance aux antibiotiques de première intention peut résulter d'une mutation ponctuelle localisée dans le gène : par exemple dans le gène rpoB pour la résistance à la rifampicine, ou dans le gène katG, inhA ou kasA pour la résistance à l'isoniazide ...Resistance to first-line antibiotics can result from a point mutation localized in the gene: for example in the rpoB gene for resistance to rifampicin, or in the katG, inhA or kasA gene for resistance to isoniazid. .

Dans le cas de la résistance à la rifampicine, la mutation ponctuelle est localisée dans le gène rpoB (gène de la sous-unité β de l'ARN polymérase). De manière non limitative, le tableau 1 présente une liste de sondes de capture ciblant différentes positions mutationnelles au sein du gène rpoB chez M. tuberculosis.In the case of resistance to rifampicin, the point mutation is localized in the rpoB gene (gene for the β subunit of RNA polymerase). In a nonlimiting manner, table 1 presents a list of capture probes targeting different mutational positions within the rpoB gene in M. tuberculosis.

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Position mutationnelle (Numérotation E. coli / M. tuberculosis') Mutational position (E. coli / M. tuberculosis' numbering) Génotype Genotype Acide aminé correspondant à la position mutationnelle Amino acid corresponding to the mutational position Séquence de la sonde (5’-3’) base substituée en gras Probe sequence (5'-3 '') base substituted in bold SEQ ID NO. SEQ ID NO. Amplicon 1 Amplicon 1 Position 511/430 Position 511/430 sauvage wild Leucine leucine GCACCAGCCAGCTGAGCC AATTCATGG GCACCAGCCAGCTGAGCC AATTCATGG 1 1 muté mutated Proline proline GGCACCAGCCAGCCGAGC CAATTCATGG GGCACCAGCCAGCCGAGC CAATTCATGG 2 2 Position 512/431 Position 512/431 sauvage wild Sérine serine GCACCAGCCAGCTGAGCCA ATTCATGG GCACCAGCCAGCTGAGCCA ATTCATGG 1 1 muté mutated Cystéine cysteine GCACCAGCCAGCTGTGCCA ATTCATGG GCACCAGCCAGCTGTGCCA ATTCATGG 3 3 Position 513/432 Position 513/432 sauvage wild Glutamine glutamine GCACCAGCCAGCTGAGCCA ATTCATGG GCACCAGCCAGCTGAGCCA ATTCATGG 1 1 muté mutated Leucine leucine ACCAGCCAGCTGAGCCTAT TCATGGACCA ACCAGCCAGCTGAGCCTAT TCATGGACCA 4 4 Position 516/435 Position 516/435 sauvage wild Aspartate aspartate AGCCAATTCATGGACCAGA ACAACCCGCT AGCCAATTCATGGACCAGA ACAACCCGCT 5 5 muté mutated Tyrosine tyrosine CTGAGCCAATTCATGTACC AGAACAACCCGCT CTGAGCCAATTCATGTACC AGAACAACCCGCT 6 6 muté mutated Valine valine AGCCAATTCATGGTCCAGA ACAACCCGCT AGCCAATTCATGGTCCAGA ACAACCCGCT 7 7 muté mutated Alanine alanine CCAATTCATGGCCCAGAAC AACCCGCTG CCAATTCATGGCCCAGAAC AACCCGCTG 8 8 Position 522/441 Position 522/441 sauvage wild Sérine serine CCAGAACAACCCGCTGTCG GGGTTGACC CCAGAACAACCCGCTGTCG GGGTTGACC 9 9 muté mutated Leucine leucine CCAGAACAACCCGCTGTTG GGGTTGACC CCAGAACAACCCGCTGTTG GGGTTGACC 10 10 Position 526/445 Position 526/445 sauvage wild Histidine histidine GCTGTCGGGGTTGACCCAC AAGCGCC GCTGTCGGGGTTGACCCAC AAGCGCC 11 11 muté mutated Aspartate aspartate GCTGTCGGGGTTGACCGAC AAGCGCC GCTGTCGGGGTTGACCGAC AAGCGCC 12 12 muté mutated Asparagine asparagine CGCTGTCGGGGTTGACCAA CAAGCGCC CGCTGTCGGGGTTGACCAA CAAGCGCC 13 13 muté mutated Tyrosine tyrosine CGCTGTCGGGGTTGACCTA CAAGCGCC CGCTGTCGGGGTTGACCTA CAAGCGCC 14 14 muté mutated Leucine leucine CGCTGTCGGGGTTGACCCT CAAGCGCC CGCTGTCGGGGTTGACCCT CAAGCGCC 15 15 muté mutated Arginine arginine GCTGTCGGGGTTGACCCGC AAGCGCC GCTGTCGGGGTTGACCCGC AAGCGCC 16 16 Position 529/448 Position 529/448 sauvage wild Arginine arginine GGGGTTGACCCACAAGCGC CGACTGT GGGGTTGACCCACAAGCGC CGACTGT 17 17 Arginine arginine GGGTTGACCCACAAGCGCC GACTGTCGGC GGGTTGACCCACAAGCGCC GACTGTCGGC 18 18 muté mutated Glutamine glutamine GGGGTTGACCCACAAGCGC CAACTGT GGGGTTGACCCACAAGCGC CAACTGT 19 19 Glutamine glutamine GGGTTGACCCACAAGCGCC AACTGTCGGC GGGTTGACCCACAAGCGCC AACTGTCGGC 20 20 Position 531/450 Position 531/450 sauvage wild Sérine serine GCCGACTGTCGGCGCTGG GGCC GCCGACTGTCGGCGCTGG GGCC 21 21 muté mutated Leucine leucine CGCCGACTGTTGGCGCTGG CGCCGACTGTTGGCGCTGG 22 22

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GGC GGC muté mutated Tryptophane tryptophan CGCCGACTGTGGGCGCTGG GGC CGCCGACTGTGGGCGCTGG GGC 23 23 muté mutated Glutamine glutamine CGCCGACTGCAGGCGCTGG GGC CGCCGACTGCAGGCGCTGG GGC 24 24 muté mutated Phénylalanine phenylalanine CGCCGACTGTTCGCGCTGG GGCC CGCCGACTGTTCGCGCTGG GGCC 25 25 Position 533/452 Position 533/452 sauvage wild Leucine leucine ACTGTCGGCGCTGGGGCCC GG ACTGTCGGCGCTGGGGCCC GG 26 26 muté mutated Proline proline ACTGTCGGCGCCGGGGCCC G ACTGTCGGCGCCGGGGCCC G 27 27 Amplicon 2 Amplicon 2 Position 572/491 Position 572/491 sauvage wild Isoleucine isoleucine GGCCCAACATCGGTCTGAT CGGCTCG GGCCCAACATCGGTCTGAT CGGCTCG 28 28 muté mutated Phénylalanine phenylalanine GGCCCAACATCGGTCTGTT CGGCTCG GGCCCAACATCGGTCTGTT CGGCTCG 29 29

Tableau 1 : Séquences des sondes ciblant les génotypes sauvages et mutés détectés au niveau du gène rpoB. La numérotation en italique est liée à la première numérotation des codons en fonction du génome d'Escherichia coli. La numérotation en gras est liée à la nouvelle nomenclature des codons, basée sur le génome de Mycobacterium tuberculosis.Table 1: Sequences of the probes targeting the wild and mutated genotypes detected at the level of the rpoB gene. The numbering in italics is linked to the first numbering of the codons according to the genome of Escherichia coli. The bold numbering is linked to the new codon nomenclature, based on the genome of Mycobacterium tuberculosis.

Dans le cas de la résistance à l’isoniazide, la mutation ponctuelle est localisée dans le gène katG (heme-containing enzyme catalase-peroxidase), dans le gène kasA (3-oxoacylACP synthase) ou dans la région promotrice du gène inhA (gène de enoyl-acyl carrier protein reductase). De manière non limitative, le tableau 2 présente une liste de sondes de 10 capture ciblant différentes positions mutationnelles au sein des gènes katG et inhA chez M. tuberculosis.In the case of isoniazid resistance, the point mutation is localized in the katG gene (heme-containing enzyme catalase-peroxidase), in the kasA gene (3-oxoacylACP synthase) or in the promoter region of the inhA gene (gene enoyl-acyl carrier protein reductase). In a nonlimiting manner, table 2 presents a list of capture probes targeting different mutational positions within the katG and inhA genes in M. tuberculosis.

Position mutationnelle (Numérotation M. tuberculosis) Mutational position (Numbering M. tuberculosis) Génotype Genotype Acide aminé correspondant à la position mutationnelle Amino acid corresponding to the mutational position Séquence de la sonde (5’-3’) base substituée en gras Probe sequence (5'-3 '') base substituted in bold Seq ID NO Seq ID NO Amplicon katG Amplicon KatG Position 315 Position 315 sauvage wild Sérine serine GTAAGGACGCGATCACCAGCGG CATCGAGG GTAAGGACGCGATCACCAGCGG CATCGAGG 30 30 muté mutated Thréonine threonine GTAAGGACGCGATCACCACCGGC ATCGAGG GTAAGGACGCGATCACCACCGGC ATCGAGG 31 31 muté mutated Thréonine threonine GTAAGGACGCGATCACCACAGG CATCGAGGT GTAAGGACGCGATCACCACAGG CATCGAGGT 32 32 muté mutated Asparagine asparagine GTAAGGACGCGATCACCAACGG CATCGAGGT GTAAGGACGCGATCACCAACGG CATCGAGGT 33 33 muté mutated Isoleucine isoleucine GTAAGGACGCGATCACCATCGGC GTAAGGACGCGATCACCATCGGC 34 34

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ATCGAGGT ATCGAGGT Amplicon inhA Amplicon inhA Position -15 Position -15 sauvage wild GCGGCGAGACGATAGGTTGTCG GGGTG GCGGCGAGACGATAGGTTGTCG GGGTG 35 35 muté mutated GCCGCGGCGAGATGATAGGTTG TCGGG GCCGCGGCGAGATGATAGGTTG TCGGG 36 36 Position -16 Position -16 sauvage wild GCGGCGAGACGATAGGTTGTCG GGGTG GCGGCGAGACGATAGGTTGTCG GGGTG 35 35 muté mutated CCGCGGCGAGGCGATAGGTTGT CG CCGCGGCGAGGCGATAGGTTGT CG 37 37 Position -8 Position -8 sauvage wild GCGGCGAGACGATAGGTTGTCG GGGTG GCGGCGAGACGATAGGTTGTCG GGGTG 35 35 muté mutated CGGCGAGACGATAGGCTGTCGG GGTG CGGCGAGACGATAGGCTGTCGG GGTG 38 38 muté mutated GCGGCGAGACGATAGGATGTCG GGGTG GCGGCGAGACGATAGGATGTCG GGGTG 39 39

Tableau 2 : Séquences des sondes ciblant les génotypes sauvages et mutés détectés au niveau des gènes katG et inhA.Table 2: Sequences of the probes targeting the wild and mutated genotypes detected at the level of the katG and inhA genes.

La présente invention se rapporte également à un support oligochromatographique sur lequel sont immobilisées des sondes de capture spécifiques. Le support oligochromatographique et les sondes de captures sont tels que définis précédemment.The present invention also relates to an oligochromatographic support on which specific capture probes are immobilized. The oligochromatographic support and the capture probes are as defined above.

Selon un mode de réalisation, ledit support comprend une sonde de capture complémentaire et spécifique de la séquence sauvage de la région cible et au moins une sonde de capture complémentaire et spécifique de la séquence mutée de la région cible.According to one embodiment, said support comprises a capture probe complementary and specific to the wild sequence of the target region and at least one capture probe complementary and specific to the mutated sequence of the target region.

La présente invention se rapporte encore à un dispositif microfluidique comprenant le support oligochromatographique selon l'invention. De préférence, le dispositif microfluidique est tel que décrit dans le Brevet Européen EP 2 870 260.The present invention also relates to a microfluidic device comprising the oligochromatographic support according to the invention. Preferably, the microfluidic device is as described in European Patent EP 2 870 260.

La présente invention se rapporte enfin à une trousse de réactifs comprenant au moins des amorces d'amplification d'une région cible et le support oligochromatographique selon l'invention.The present invention finally relates to a reagent kit comprising at least primers for amplification of a target region and the oligochromatographic support according to the invention.

Les exemples suivants décrivent certains modes de réalisation de la présente invention. Cependant, les exemples ne sont présentés qu'à titre illustratif et ne limitent en aucun cas la portée de l'invention.The following examples describe some embodiments of the present invention. However, the examples are presented only by way of illustration and in no way limit the scope of the invention.

BE2018/5469 LEGENDE DES FIGURESBE2018 / 5469 LEGEND OF FIGURES

Figure 1 : Représentation schématique de l'hybridation de l'amplicon et des systèmes de marquage de l'amplicon.Figure 1: Schematic representation of amplicon hybridization and amplicon labeling systems.

Figure 2 : Représentation schématique de sondes de captures immobilisées sur le support oligochromatographique : damier de 40 spots et exemple de 4 sondes de capture dont celle ayant le génotype sauvage ; la sonde 1 a une mutation en position 5 (G > C), la sonde 2 a une mutation en position 5 (G > T) et la sonde 3 a une mutation en position 4 (A > G).Figure 2: Schematic representation of capture probes immobilized on the oligochromatographic support: checkerboard of 40 spots and example of 4 capture probes including the one with the wild genotype; probe 1 has a mutation in position 5 (G> C), probe 2 has a mutation in position 5 (G> T) and probe 3 has a mutation in position 4 (A> G).

Figure 3 : Dispositif microfluidique décrit dans le Brevet Européen EP 2 870 260.Figure 3: Microfluidic device described in European Patent EP 2 870 260.

1. chambre d'amplification, 2. chambre de détection, 3. canal, 4. support oligochromatographique (tigette), 5. partie proximale de la tigette, 6. partie distale de la tigette, 7. région d'application, 8. région de détection, 9. région absorbante, 10. communication fluidique, 11. réservoir de mélange réactionnel, 12. réservoir de tampon, 13. tuyau de contact avec le système de pompage, 14. tuyau de liaison.1. amplification chamber, 2. detection chamber, 3. channel, 4. oligochromatographic support (rod), 5. proximal part of the rod, 6. distal part of the rod, 7. region of application, 8. detection region, 9. absorbing region, 10. fluid communication, 11. reaction mixture tank, 12. buffer tank, 13. contact pipe with the pumping system, 14. connecting pipe.

Figure 4 : Histogramme illustrant la détection d'une souche de Mycobacterium tuberculosis mutée en position 526 et sauvage pour les positions 511-512-513 ; 516 ; 522 ;Figure 4: Histogram illustrating the detection of a strain of Mycobacterium tuberculosis mutated in position 526 and wild for positions 511-512-513; 516; 522;

529 ; 531 ; 533 au niveau du gène rpoB.529; 531; 533 at the level of the rpoB gene.

Figure 5 : Histogramme illustrant la détection d'une souche de Mycobacterium tuberculosis mutée en position 315 au niveau du gène katG.Figure 5: Histogram illustrating the detection of a strain of Mycobacterium tuberculosis mutated in position 315 at the level of the katG gene.

BE2018/5469 EXEMPLESBE2018 / 5469 EXAMPLES

Exemple 1 - Détection de souches de Mycobacterium tuberculosis sauvages ou résistantes à la rifampicineExample 1 Detection of Wild or Rifampicin Resistant Mycobacterium Tuberculosis Strains

Il est connu que la résistance à la rifampicine est due à un ou des polymorphismes (mono)nucléotidiques dans le gène rpoB (gène de la sous-unité β de l'ARN polymérase, cible de la rifampicine chez Mycobacterium tuberculosis).It is known that resistance to rifampicin is due to one or more (mono) nucleotide polymorphisms in the rpoB gene (gene for the β subunit of RNA polymerase, target of rifampicin in Mycobacterium tuberculosis).

Deux séquences cibles, respectivement de 113 et 119 nucléotides, ont donc été sélectionnées au niveau du gène rpoB (Tableau 3).Two target sequences, of 113 and 119 nucleotides respectively, were therefore selected at the level of the rpoB gene (Table 3).

Séquence nucléotidique (5'-3') Nucleotide sequence (5'-3 ') Seq ID NO Seq ID NO Amplicon 1 amplicon 1 AGGAGTTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCA GAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGG CGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACG AGGAGTTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCA GAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGG CGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACG 40 40 Amplicon 2 amplicon 2 GCACCCGTCGCACTACGGCCGGATGTGCCCGATCGAAACCCCT GAGGGGCCCAACATCGGTCTGATCGGCTCGCTGTCGGTGTACGC GCGGGTCAACCCGTTCGGGTTCATCGAAACGC GCACCCGTCGCACTACGGCCGGATGTGCCCGATCGAAACCCCT GAGGGGCCCAACATCGGTCTGATCGGCTCGCTGTCGGTGTACGC GCGGGTCAACCCGTTCGGGTTCATCGAAACGC 41 41

Tableau 3. Séquences cibles du gène rpoB amplifiées par PCR. Les séquences des amorces sont indiquées en gras.Table 3. Target sequences of the rpoB gene amplified by PCR. The primer sequences are indicated in bold.

Sur ces séquences, 10 positions mutationnelles montrant des polymorphismes (mono)nucléotidiques impliqués dans la résistance à la rifampicine ont été ciblées. L'amplicon_1 comporte 9 positions mutationnelles et l'amplicon_2 comporte une seule position mutationnelle. De 2 à 6 variants de séquences sont détectés pour chacune des positions (Tableau 1).On these sequences, 10 mutational positions showing (mono) nucleotide polymorphisms involved in rifampicin resistance were targeted. Amplicon_1 has 9 mutational positions and amplicon_2 has only one mutational position. From 2 to 6 sequence variants are detected for each of the positions (Table 1).

Dans cette application, les régions cibles du gène rpoB de Mycobacterium tuberculosis sont amplifiées par PCR, suivie d'une détection sur support oligochromatographique, dans le dispositif microfluidique tel que décrit dans la demande de brevet EP 3075451.In this application, the target regions of the rpoB gene of Mycobacterium tuberculosis are amplified by PCR, followed by detection on an oligochromatographic support, in the microfluidic device as described in patent application EP 3075451.

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Remplissage du dispositif : le réservoir de tampon (12) est rempli par un volume de solution de lavage tamponnée pouvant aller de 50 à 80 μL. Le réservoir de mélange réactionnel (11) est rempli par un volume de 10 à 20 μL de mélange réactionnel contenant l'échantillon et les réactifs d'amplification, et, le cas échéant, de transcription inverse.Filling the device: the buffer tank (12) is filled with a volume of buffered washing solution which can range from 50 to 80 μL. The reaction mixture tank (11) is filled with a volume of 10 to 20 μL of reaction mixture containing the sample and the amplification reagents, and, if necessary, reverse transcription.

Fermeture du dispositif : le dispositif microfluidique est fermé hermétiquement par une tête de pompe (Demande de brevet EP 3075451).Closing of the device: the microfluidic device is hermetically closed by a pump head (Patent application EP 3075451).

Amplification et détection : le dispositif est inséré dans un équipement dédié approprié permettant la réalisation des étapes de transcription inverse, d'amplification par PCR, d'hybridation des produits d'amplification aux sondes immobilisées sur le dispositif d'oligochromatographie et de lavage de la zone de lecture par la solution de lavage tamponnée.Amplification and detection: the device is inserted into appropriate dedicated equipment allowing the steps of reverse transcription, PCR amplification, hybridization of the amplification products to the probes immobilized on the oligochromatography device and washing of the reading area with buffered washing solution.

Le dispositif est géré par un équipement dédié permettant la gestion du flux du liquide dans le canal du dispositif microfluidique via un système de pompage actif et la gestion de la température d'au moins deux, et jusqu'à 5, zones de chauffe sous le réservoir de mélange réactionnel, la chambre d'amplification et le canal PCR et d'une zone de chauffe sous la tigette de détection.The device is managed by dedicated equipment allowing the management of the flow of liquid in the channel of the microfluidic device via an active pumping system and the management of the temperature of at least two, and up to 5, heating zones under the reaction mixture tank, amplification chamber and PCR channel and a heating zone under the detection rod.

Les résultats sont interprétés par le logiciel d'analyse de l'équipement dédié. L'identification du caractère sauvage ou muté de chaque position d'intérêt est réalisée par l'analyse des valeurs de fluorescence entre sondes s'hybridant aux mêmes positions.The results are interpreted by the dedicated equipment analysis software. The identification of the wild or mutated character of each position of interest is carried out by the analysis of the fluorescence values between probes hybridizing at the same positions.

Par exemple, pour la position 526/445 du gène rpoB, 6 acides aminés ont été identifiés dans des variants naturels: l'histidine (H) dans la séquence sauvage, l'aspartate (D), l'asparagine (N), la tyrosine (Y), la leucine (L) ou l'arginine (R) dans des variants mutés.For example, for position 526/445 of the rpoB gene, 6 amino acids have been identified in natural variants: histidine (H) in the wild sequence, aspartate (D), asparagine (N), tyrosine (Y), leucine (L) or arginine (R) in mutated variants.

Chacun de ces changements d'acide aminé est dû à une mutation dans le codon correspondant.Each of these amino acid changes is due to a mutation in the corresponding codon.

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Six sondes couvrant ce codon ont été immobilisées sur le damier de la tigette oligochromatographique, chaque sonde étant spécifique à un des codons (sauvage ou muté, Tableau 1).Six probes covering this codon were immobilized on the checkerboard of the oligochromatographic strip, each probe being specific to one of the codons (wild or mutated, Table 1).

Le produit d'amplification s'hybride à chacune de ces 6 sondes et l'intensité du signal est mesurée. Pour chaque sonde, le signal est rapporté à la moyenne des signaux des 5 autres sondes. Les rapports de signaux ainsi calculés permettent d'identifier le génotype à la position considérée : la sonde pour lequel un rapport de signaux supérieur à la valeur cut-off pré-déterminée (par exemple la valeur 2) est obtenu correspond à la séquence présente dans l'échantillon.The amplification product hybridizes to each of these 6 probes and the signal intensity is measured. For each probe, the signal is related to the average of the signals of the 5 other probes. The signal ratios thus calculated make it possible to identify the genotype at the position considered: the probe for which a signal ratio greater than the predetermined cut-off value (for example the value 2) is obtained corresponds to the sequence present in the sample.

Dans le cas des positions 511-512-513, l'utilisation d'une sonde de type « sauvage » commune pour ces 3 positions permet de pallier au problème de proximité des séquences, alors que les sondes correspondant aux génotypes mutés sont spécifiques de chaque position, respectivement en position 577/430, 572/431, 575/432.In the case of positions 511-512-513, the use of a common “wild type” probe for these 3 positions makes it possible to alleviate the problem of proximity of the sequences, while the probes corresponding to the mutated genotypes are specific for each position, respectively in position 577/430, 572/431, 575/432.

Exemple d'une souche Mycobacterium tuberculosis, portant la mutation H526Y :Example of a Mycobacterium tuberculosis strain, carrying the H526Y mutation:

Dans cet exemple, le génotype est sauvage pour les positions 511-512-513-522-529531 et 533 (identifié par un ratio supérieur à 2, barres d'histogramme gris foncé) et le génotype est muté H526Y (barre noire) pour la position 526 (nomenclature d'E. coli) (Figure 4).In this example, the genotype is wild for positions 511-512-513-522-529531 and 533 (identified by a ratio greater than 2, dark gray histogram bars) and the genotype is mutated H526Y (black bar) for the position 526 (nomenclature of E. coli) (Figure 4).

Les barres gris clair représentent le ratio obtenu pour chacune des sondes qui correspondent au génotype sauvage H526 et aux mutant non détectés. (Figure 4). Le changement d'acide aminé est identifié. L'histidine en position 526 est remplacée par une tyrosine; les acides aminés aux autres positions sont de type sauvage.The light gray bars represent the ratio obtained for each of the probes which correspond to the wild-type H526 and to the mutants not detected. (Figure 4). The amino acid change is identified. The histidine at position 526 is replaced by a tyrosine; amino acids at other positions are wild type.

Cette méthode permet également de détecter des mélanges de souches ou de variants.This method also makes it possible to detect mixtures of strains or variants.

BE2018/5469 Exemple 2 - Détection de souches de Mycobacterium tuberculosis sauvages ou résistantes à l’isionazideBE2018 / 5469 Example 2 - Detection of strains of wild or iscazide-resistant Mycobacterium tuberculosis

Chez Mycobacterium tuberculosis, il est connu que les résistances à l'isonazide sont majoritairement dues à un ou des polymorphismes (mono)nucléotidiques dans le gène katG ou dans la région promotrice du gène inhA.In Mycobacterium tuberculosis, it is known that isoniazid resistance is mainly due to one or more (mono) nucleotide polymorphisms in the katG gene or in the promoter region of the inhA gene.

Une séquences cible de 85 nucléotides a donc été sélectionnée au niveau du gène katG et une séquence de 123 nucléotides a été sélectionnée au niveau du gène inhA (Tableau 4).A target sequence of 85 nucleotides was therefore selected at the level of the katG gene and a sequence of 123 nucleotides was selected at the level of the inhA gene (Table 4).

Séquence nucléotidique (5'-3') Nucleotide sequence (5'-3 ') Seq ID NO Seq ID NO Amplicon katG amplicon katG GGCTTGGGCTGGAAGAGCTCGTATGGCACCGGAACCGGTAAGG ACGCGATCACCAGCGGCATCGAGGTCGTATGGACGAACACCC GGCTTGGGCTGGAAGAGCTCGTATGGCACCGGAACCGGTAAGG ACGCGATCACCAGCGGCATCGAGGTCGTATGGACGAACACCC 42 42 Amplicon inhA Amplicon inhA GTTACGCTCGTGGACATACCGATTTCGGCCCGGCCGCGGCGAG ACGATAGGTTGTCGGGGTGACTGCCACAGCCACTGAAGGGGCCA AACCCCCATTCGTATCCCGTTCAGTCCTGGTTACCG GTTACGCTCGTGGACATACCGATTTCGGCCCGGCCGCGGCGAG ACGATAGGTTGTCGGGGTGACTGCCACAGCCACTGAAGGGGCCA AACCCCCATTCGTATCCCGTTCAGTCCTGGTTACCG 43 43

Tableau 4. Séquences cibles des gènes katG et inhA amplifiées par PCR. Les séquences des amorces sont indiquées en gras.Table 4. Target sequences of the katG and inhA genes amplified by PCR. The primer sequences are indicated in bold.

Une position montrant des polymorphismes (mono)nucléotidiques impliqués dans la résistance l'isoniazide a été ciblée dans la séquence cible du gène katG, tandis que 3 positions ont été ciblées dans la séquence promotrice du gène inhA. Entre 2 à 5 variants de séquences sont détectés pour chacune des positions (Tableau 2).One position showing (mono) nucleotide polymorphisms involved in isoniazid resistance was targeted in the target sequence of the katG gene, while 3 positions were targeted in the promoter sequence of the inhA gene. Between 2 to 5 sequence variants are detected for each of the positions (Table 2).

Dans le cas du gène inhA, les différentes positions mutationnelles se retrouvent au niveau de la région promotrice du gène. Une mutation à ce niveau n'induit donc pas la formation d'un nouvel acide aminé mais la surexpression du gène qui va entrainer une résistance à l'isoniazide.In the case of the inhA gene, the different mutational positions are found at the promoter region of the gene. A mutation at this level therefore does not induce the formation of a new amino acid but the overexpression of the gene which will lead to resistance to isoniazid.

Comme dans l'exemple précédent, les régions cibles du gène katG et de la région promotrice du gène inhA de Mycobacterium tuberculosis sont amplifiées séparément parAs in the previous example, the target regions of the katG gene and of the promoter region of the inhA gene of Mycobacterium tuberculosis are amplified separately by

BE2018/5469 PCR, suivie d'une détection sur support oligochromatographique dans le dispositif microfluidique, comme décrit dans l'exemple précédent.BE2018 / 5469 PCR, followed by detection on an oligochromatographic support in the microfluidic device, as described in the previous example.

Exemple d'une souche Mycobacterium tuberculosis , portant la mutation S315N :Example of a Mycobacterium tuberculosis strain, carrying the mutation S315N:

Par exemple, dans le cas du gène katG, la position mutationnelle 315 peut présenter 4 acides aminés différents : la serine (S) qui correspond à la séquence sauvage, la thréonine (T), retrouvée dans deux des séquences mutées, l'asparagine (N) et l'isoleucine (I). Chacun de ces changements d'acide aminé est dû à une mutation dans le codon correspondant. La synthèse de la thréonine peut être induite par deux polymorphismes nucléotidiques différents.For example, in the case of the katG gene, the mutational position 315 can have 4 different amino acids: the serine (S) which corresponds to the wild sequence, threonine (T), found in two of the mutated sequences, asparagine ( N) and isoleucine (I). Each of these amino acid changes is due to a mutation in the corresponding codon. The synthesis of threonine can be induced by two different nucleotide polymorphisms.

Cinq sondes couvrant ce codon ont été immobilisées sur le damier de la tigette oligochromatographique, chaque sonde étant spécifique à un des codons (sauvage ou muté, Tableau 2).Five probes covering this codon were immobilized on the checkerboard of the oligochromatographic strip, each probe being specific to one of the codons (wild or mutated, Table 2).

Le produit d'amplification s'hybride à chacune de ces 5 sondes et l'intensité du signal est mesurée. Pour chaque sonde, le signal est rapporté à la moyenne des signaux des 4 autres sondes. Les rapports de signaux ainsi calculés permettent d'identifier le génotype à la position considérée : la sonde pour lequel un rapport de signaux supérieur à un cut-off prédéterminé est obtenu correspond à la séquence présente dans l'échantillon.The amplification product hybridizes to each of these 5 probes and the signal intensity is measured. For each probe, the signal is related to the average of the signals of the other 4 probes. The signal ratios thus calculated make it possible to identify the genotype at the position considered: the probe for which a signal ratio greater than a predetermined cut-off is obtained corresponds to the sequence present in the sample.

Dans cet exemple, le génotype pour la position 315 est muté S315N (nomenclature d'E. coli). Les barres grises claires représentent le ratio obtenu pour chacune des sondes qui correspondent aux génotypes sauvages et mutant non détectés. (Figure 5). Le changement d'acide aminé est identifié. La sérine est remplacée par une asparagine.In this example, the genotype for position 315 is mutated S315N (nomenclature of E. coli). The light gray bars represent the ratio obtained for each of the probes which correspond to the undetected wild and mutant genotypes. (Figure 5). The amino acid change is identified. The serine is replaced by an asparagine.

Claims

BE2018/5469 REVENDICATIONSBE2018 / 5469 CLAIMS

1. Méthode de détection et de différenciation par oligochromatographie d'au moins une mutation ponctuelle du génome d'un microorganisme, de préférence d'une bactérie, présent dans un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes :1. Method for the detection and differentiation by oligochromatography of at least one point mutation in the genome of a microorganism, preferably a bacterium, present in a biological sample comprising the following steps:

a- l'amplification d'au moins une séquence nucléotidique cible ; ladite séquence nucléotidique cible étant susceptible de porter une mutation ponctuelle, c'est-à-dire de présenter, à une position donnée, la délétion d'un nucléotide, la substitution de ce nucléotide par un autre nucléotide ou encore l'insertion d'un nucléotide juste avant ou juste après ladite position ;a- amplification of at least one target nucleotide sequence; said target nucleotide sequence being capable of carrying a point mutation, that is to say of presenting, at a given position, the deletion of a nucleotide, the substitution of this nucleotide by another nucleotide or even the insertion of a nucleotide just before or just after said position;

b- la détection parmi les séquences nucléotidiques cibles amplifiées obtenues à l'étape a) de séquences nucléotidiques porteuses d'une mutation ponctuelle par une hybridation réalisée à une température comprise entre 50 et 80 °C desdites séquences nucléotidiques cibles amplifiées avec plusieurs sondes de capture qui contiennent de 18 à 35 bases immobilisées sur un support oligochromatographique, l'une de ces sondes de capture étant complémentaire et spécifique d'une partie de la séquence nucléotidique sauvage, chacune des autres étant complémentaires et spécifiques d'une partie de séquence nucléotidique comprenant au moins une mutation ponctuelle, et la détection des séquences nucléotidiques cibles amplifiées hybridées sur les sondes de capture.b- the detection among the amplified target nucleotide sequences obtained in step a) of nucleotide sequences carrying a point mutation by a hybridization carried out at a temperature between 50 and 80 ° C. of said target nucleotide sequences amplified with several capture probes which contain from 18 to 35 bases immobilized on an oligochromatographic support, one of these capture probes being complementary and specific to a part of the wild nucleotide sequence, each of the others being complementary and specific to a part of nucleotide sequence comprising at least one point mutation, and the detection of the amplified target nucleotide sequences hybridized on the capture probes.

2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend une étape préalable de transcription inverse de l'ARN contenu dans l'échantillon.2. Method according to claim 1, characterized in that it comprises a prior step of reverse transcription of the RNA contained in the sample.

3. Méthode selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que l'amplification est réalisée par PCR ou par amplification isotherme.3. Method according to claim 1 or claim 2, characterized in that the amplification is carried out by PCR or by isothermal amplification.

4. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la séquence nucléotidique cible amplifiée est marquée, directement ou indirectement, par un marqueur.4. Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the amplified target nucleotide sequence is marked, directly or indirectly, with a marker.

5. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les séquences de capture contiennent un espaceur.5. Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the capture sequences contain a spacer.

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6. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'hybridation est suivie d'un lavage à l'aide d'un tampon de migration.6. Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the hybridization is followed by washing with a migration buffer.

7. Méthode selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'hybridation est réalisée à une température comprise entre 50°C et 75°C.7. Method according to claim 6, characterized in that the hybridization is carried out at a temperature between 50 ° C and 75 ° C.

8. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le support est une membrane de nitrocellulose, de cellulose, d'acétate de cellulose, de nylon, ou de copolymère acrylique et nylon.8. Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the support is a nitrocellulose, cellulose, cellulose acetate, nylon, or acrylic and nylon copolymer membrane.

9. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la mutation ponctuelle à détecter est présente dans le génome bactérien de Mycobacterium tuberculosis.9. Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the point mutation to be detected is present in the bacterial genome of Mycobacterium tuberculosis.

10. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ladite mutation ponctuelle est associée à :10. Method according to any one of the preceding claims, characterized in that said point mutation is associated with:

- une résistance à la rifampicine et est localisée dans le gène rpoB, ou- resistance to rifampicin and is localized in the rpoB gene, or

- à la résistance à l'isoniazide respectivement localisée dans le gène katG et le promoteur du gène inhA.- resistance to isoniazid respectively located in the katG gene and the promoter of the inhA gene.

11. Méthode selon la revendication 10, caractérisée en ce que les sondes de capture sont choisies parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 et 39.11. Method according to claim 10, characterized in that the capture probes are chosen from the sequences SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 , 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 and 39.

12. Support oligochromatographique sur lequel sont immobilisées des sondes de capture choisies parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 et 39.12. Oligochromatographic support on which are immobilized capture probes chosen from the sequences SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 and 39.

13. Dispositif microfluidique comprenant le support oligochromatographique selon la revendication 12.13. Microfluidic device comprising the oligochromatographic support according to claim 12.

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14. Trousse de réactifs comprenant au moins des amorces d’amplification d'une région cible d’un génome bactérien et le support oligochromatographique selon la revendication 12.14. Reagent kit comprising at least primers for amplification of a target region of a bacterial genome and the oligochromatographic support according to claim 12.