BE1025333B1

BE1025333B1 - ANTI-TIGIT ANTIBODIES

Info

Publication number: BE1025333B1
Application number: BE2017/5535A
Authority: BE
Inventors: Anthony Cooper; Christophe Quéva; Sofie Denies; Catherine Hoofd; Julia Cuende; Gregory Driessens
Original assignee: Iteos Therapeutics S.A.; Adimab Llc
Priority date: 2017-07-27
Filing date: 2017-07-31
Publication date: 2019-01-23

Abstract

La présente invention concerne des anticorps anti-TIGIT et des fragments de liaison à l'antigène de ceux-ci qui inhibent la signalisation se faisant par l'intermédiaire de TIGIT.The present invention provides anti-TIGIT antibodies and antigen-binding fragments thereof that inhibit signaling via TIGIT.

Description

L'immunothérapie anti-cancéreuse repose sur la modulation du système immunitaire pour augmenter la reconnaissance et la réponse dirigée contre des cellules tumorales. Une telle modulation peut être obtenue par de multiples mécanismes comprenant l'activation des molécules costimulatrices présentes sur les cellules immunitaires ou à travers l'inhibition des récepteurs coinhibiteurs. L'activation d'une réponse immunitaire est un mécanisme complexe impliquant de nombreuses populations cellulaires, telles que les cellules présentatrices d’antigène qui sont importantes pour l'initiation d'une réponse antigène-spécifique et des cellules effectrices responsables de la destruction des cellules tumorales. Les mécanismes de modulation de l'activité des cellules effectrices, telles que les lymphocytes T cytotoxiques, sont nombreux et représentent une cible de choix dans le contexte de l'immunothérapie anti-cancéreuseAnti-cancer immunotherapy relies on the modulation of the immune system to increase recognition and the response directed against tumor cells. Such modulation can be obtained by multiple mechanisms including the activation of costimulatory molecules present on immune cells or through the inhibition of coinhibitor receptors. Activation of an immune response is a complex mechanism involving many cell populations, such as antigen-presenting cells which are important for the initiation of an antigen-specific response and the effector cells responsible for cell destruction tumor. The mechanisms for modulating the activity of effector cells, such as cytotoxic T lymphocytes, are numerous and represent a target of choice in the context of anti-cancer immunotherapy

TIGIT (immunorécepteur de lymphocyte T avec des domaines Ig et ITIM), également appelé WUCAM, VSIG9 ou Vstm3, est un récepteur co-inhibiteur préférentiellement exprimé sur les cellules NK, les lymphocytes CD8+ et CD4+ aussi bien que sur des lymphocytes T régulateurs (cellules Treg, ou simplement « Tregs »). TIGIT est une protéine transmembranaire contenant un domaine ITIM dans sa partie intracellulaire, un domaine transmembranaire et un domaine variable d'immunoglobuline sur la partie extracellulaire du récepteur. Plusieurs ligands du récepteur TIGIT ont été décrits avec le CD155/PVR démontrant la meilleure affinité suivi du CD113/PVRL3 et du CD112/PVRL2 (Yu et al. (2009) Nat. Immunol. 10:48.). DNAM/CD226, un récepteur co-stimulateur, également exprimé sur les cellules NK et les lymphocytes T, entre en compétition avec TIGIT pour la liaison avec le CD155 et le CD112 mais avec une affinité plus faible, ce qui suggère un contrôle étroit de l'activation des cellules effectrices pour éviter une cytotoxicité non contrôlée contre des cellules normales exprimant le ligand CD155.TIGIT (T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains), also called WUCAM, VSIG9 or Vstm3, is a co-inhibitory receptor preferentially expressed on NK cells, CD8 + and CD4 + lymphocytes as well as on regulatory T lymphocytes (cells Treg, or simply "Tregs"). TIGIT is a transmembrane protein containing an ITIM domain in its intracellular part, a transmembrane domain and a variable domain of immunoglobulin on the extracellular part of the receptor. Several ligands of the TIGIT receptor have been described with CD155 / PVR demonstrating the best affinity followed by CD113 / PVRL3 and CD112 / PVRL2 (Yu et al. (2009) Nat. Immunol. 10:48.). DNAM / CD226, a co-stimulatory receptor, also expressed on NK cells and T lymphocytes, competes with TIGIT for binding with CD155 and CD112 but with a lower affinity, which suggests close control of activation of effector cells to avoid uncontrolled cytotoxicity against normal cells expressing the CD155 ligand.

L'expression de TIGIT est augmentée sur les lymphocytes infiltratrants les tumeurs (TIL) et dans des contextes de pathologie, telle qu'une infection au VIH. L'expression de TIGIT marque les lymphocytes T épuisés qui ont une fonction effectrice plus faible en comparaison à leurs homologues négatifs pour TIGIT (Kurtulus et al. (2015) J. Clin. Invest. 276:112; Chew et al. (2016) Plos Pathogens. 12). Inversément, les cellules Treg qui expriment TIGIT démontrent une activité immunosuppressive supérieure en comparaison à la population de cellules Treg négative pour TIGIT (Jolleretal. (2014) Immunity. 40:569).The expression of TIGIT is increased on tumor infiltrating lymphocytes (TIL) and in contexts of pathology, such as HIV infection. TIGIT expression marks depleted T cells which have weaker effector function compared to their TIGIT negative counterparts (Kurtulus et al. (2015) J. Clin. Invest. 276: 112; Chew et al. (2016) Plos Pathogens. 12). Conversely, Treg cells which express TIGIT demonstrate superior immunosuppressive activity compared to the TIGIT negative Treg cell population (Jolleretal. (2014) Immunity. 40: 569).

Comme d'autres récepteurs co-inhibiteurs (PD1 ou CTLA4) exprimés sur les lymphocytes T qui ont été confirmés comme des cibles pertinentes pour l'immunothérapie et pour lesquels des anticorps antagonistes ont été approuvés pour le traitement du cancer chez l'humain, le développement d'un anticorps anti-TIGIT antagoniste peut aider à activer le système immunitaire et àLike other co-inhibitory receptors (PD1 or CTLA4) expressed on T lymphocytes which have been confirmed as relevant targets for immunotherapy and for which antagonistic antibodies have been approved for the treatment of cancer in humans, the development of an antagonistic anti-TIGIT antibody can help activate the immune system and

BE2017/5535 mieux lutter contre les cellules cancéreuses. Il a été suggéré que les anticorps anti-TIGIT antagonistes en monothérapie, ou en association avec un anticorps a-PD1 améliorent l’efficacité antitumorale dans des modèles précliniques (Johnston et al. (2014) Cancer Cell 26:1 ; WO2016/028656 ; US2016/0176963 ; US2016/0376365, le tout étant incorporé ici à titre de référence).BE2017 / 5535 better fight against cancer cells. It has been suggested that antagonistic anti-TIGIT antibodies as monotherapy, or in combination with an a-PD1 antibody, improve antitumor efficacy in preclinical models (Johnston et al. (2014) Cancer Cell 26: 1; WO2016 / 028656; US2016 / 0176963; US2016 / 0376365, the whole being incorporated here for reference).

Ainsi, les anticorps antagonistes spécifiques de TIGIT qui inhibent l'activité du récepteur TIGIT représentent une opportunité pour diminuer l'effet immunosuppresseur associé aux microenvironnements tumoraux et, par conséquent, augmenter la réponse immunitaire antitumorale contre les cellules tumorales.Thus, TIGIT-specific antagonist antibodies which inhibit the activity of the TIGIT receptor represent an opportunity to decrease the immunosuppressive effect associated with tumor microenvironments and, consequently, increase the anti-tumor immune response against tumor cells.

RÉSUMÉ DE L'INVENTIONSUMMARY OF THE INVENTION

La présente invention décrit des anticorps anti-TIGIT qui peuvent diminuer l'effet immunosuppresseur de la signalisation par le récepteur TIGIT. En particulier, les anticorps de l'invention peuvent inhiber l'immunosuppression dûe à TIGIT, par la prévention de la fixation du ligand sur les cellules NK et les lymphocytes T et/ou l'épuisement des cellules Treg positives pour le TIGIT, et/ou en induisant une internalisation du récepteur TIGIT.The present invention describes anti-TIGIT antibodies which can decrease the immunosuppressive effect of TIGIT receptor signaling. In particular, the antibodies of the invention can inhibit the immunosuppression due to TIGIT, by preventing the binding of the ligand on NK cells and T lymphocytes and / or the exhaustion of Treg cells positive for TIGIT, and / or by inducing internalization of the TIGIT receptor.

Dans un aspect, la présente invention décrit un anticorps isolé ou un fragment de liaison à l'antigène de celui-ci qui se lie au TIGIT humain qui comprend un domaine variable de la chaîne lourde comprenant une chaîne lourde CDR1 (HCDR1), une chaîne lourde CDR2 (HCDR2) et une chaîne lourde CDR3 (HCDR3) choisies parmi les séquences HCDR1, HCDR2 et HCDR3 illustrées dans la Figure 1 et qui comprend également un domaine variable de la chaîne légère comprenant une chaîne légère CDR1 (LCDR1), une chaîne légère CDR2 (LCDR2) et une chaîne légère CDR3 (LCDR3) choisies parmi les séquences LCDR1, LCDR2 et LCDR3 illustrées dans la Figure 2.In one aspect, the present invention describes an isolated antibody or an antigen binding fragment thereof which binds to human TIGIT which comprises a heavy chain variable domain comprising a heavy chain CDR1 (HCDR1), a chain heavy CDR2 (HCDR2) and a heavy chain CDR3 (HCDR3) chosen from the sequences HCDR1, HCDR2 and HCDR3 illustrated in FIG. 1 and which also comprises a variable domain of the light chain comprising a light chain CDR1 (LCDR1), a light chain CDR2 (LCDR2) and a light chain CDR3 (LCDR3) chosen from the sequences LCDR1, LCDR2 and LCDR3 illustrated in Figure 2.

Dans certains modes de réalisation, l'anticorps ou le fragment de liaison à l'antigène comprend une combinaison de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 et LCDR3, dans lesquels la combinaison est choisie dans le groupe des combinaisons formées par les HCDR provenant de chaque anticorps de la Figure 1 pris avec les LCDR de l'anticorps correspondant de la Figure 2.In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment comprises a combination of HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 and LCDR3, wherein the combination is selected from the group of combinations formed by HCDRs from of each antibody in Figure 1 taken with the LCDRs of the corresponding antibody in Figure 2.

Dans certains modes de réalisation, un anticorps ou un fragment de liaison à l'antigène selon l'invention peut comprendre un domaine variable de chaîne lourde ayant une séquence d'acides aminés choisie dans le groupe composé des : SEQ ID NO: 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 327, 329 et 331 et des séquences d'acides aminés démontrant une identité de séquence d'au moins 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % à celles-ci ; et, éventuellement, comprend un domaine variable de la chaîne légère ayant une séquence d'acides aminés choisie dans le groupe composé des séquences d'acides aminés des SEQ ID NO:212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 328, 330 et 332 et des séquences d'acides aminés démontrant une identité de séquence d'au moins 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % à celles-ci.In certain embodiments, an antibody or an antigen-binding fragment according to the invention can comprise a variable heavy chain domain having an amino acid sequence chosen from the group consisting of: SEQ ID NO: 211, 213 , 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 327, 329 and 331 and amino acid sequences demonstrating a sequence identity of at least 90% , 95%, 97%, 98% or 99% to them; and, optionally, comprises a variable domain of the light chain having an amino acid sequence chosen from the group composed of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226 , 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 328, 330 and 332 and amino acid sequences demonstrating a sequence identity of at least 90%, 95%, 97%, 98% or 99% to these.

BE2017/5535BE2017 / 5535

Dans certains modes de réalisation, l'anticorps ou le fragment de liaison à l'antigène comprend une combinaison d'un domaine variable de la chaîne lourde et d'un domaine variable de la chaîne légère, dans lesquels la combinaison est choisie dans le groupe des combinaisons formées par le VH provenant de chaque anticorps dans la figure 5, ou d'une séquence d'acides aminés démontrant une identité de séquence d'au moins 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % à celle-ci, pris avec le VL du même anticorps dans la figure 5, ou d'une séquence d'acides aminés démontrant une identité de séquence d'au moins 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % à celle-ci.In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment comprises a combination of a heavy chain variable domain and a light chain variable domain, in which the combination is selected from the group combinations formed by VH from each antibody in Figure 5, or from an amino acid sequence demonstrating a sequence identity of at least 90%, 95%, 97%, 98% or 99% to this ci, taken with the VL of the same antibody in Figure 5, or of an amino acid sequence demonstrating a sequence identity of at least 90%, 95%, 97%, 98% or 99% thereto .

Dans certains modes de réalisation, un anticorps ou un fragment de liaison à l'antigène selon l'invention comprend HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 et LCDR3 dans lesquels HCDR1 comprend ou est composé de la SEQ ID NO :16, HCDR2 comprend ou est composé de la SEQ ID NO :17, HCDR3 comprend ou est composé de la SEQ ID NO :18, et LCDR1 comprend ou est composé de la SEQ ID NO :61, LCDR2 comprend ou est composé de la SEQ ID NO :62, et LCDR3 comprend ou est composé de la SEQ ID NO :63. Dans certains modes de réalisation, le domaine variable de la chaîne lourde comprend ou est composé d'une séquence d'acides aminés selon la SEQ ID NO :221 ou une séquence d'acides aminés démontrant une identité de séquence d'au moins 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % à celle-ci, et le domaine variable de la chaîne légère comprend ou est composé d'une séquence d'acides aminés selon la SEQ ID NO :222 ou une séquence d'acides aminés démontrant une identité de séquence d'au moins 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % à celle-ci.In certain embodiments, an antibody or an antigen binding fragment according to the invention comprises HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 in which HCDR1 comprises or is composed of SEQ ID NO: 16, HCDR2 comprises or is made up of SEQ ID NO: 17, HCDR3 includes or is made up of SEQ ID NO: 18, and LCDR1 understands or is made up of SEQ ID NO: 61, LCDR2 understands or is made up of SEQ ID NO: 62 , and LCDR3 includes or is composed of SEQ ID NO: 63. In certain embodiments, the variable domain of the heavy chain comprises or is composed of an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 221 or an amino acid sequence demonstrating a sequence identity of at least 90% , 95%, 97%, 98% or 99% thereof, and the variable domain of the light chain comprises or is composed of an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 222 or an acid sequence amines demonstrating a sequence identity of at least 90%, 95%, 97%, 98% or 99% thereof.

Dans un autre aspect, l'invention décrit un anticorps isolé ou un fragment de liaison à l'antigène de celui-ci qui se lie au TIGIT humain et qui n'entre pas en compétition avec le CD155 pour la liaison avec le TIGIT. Dans certains modes de réalisation, l'anticorps ou un fragment de liaison à l'antigène comprend HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 et LCDR3 dans lequel HCDR1 comprend ou est composé de la SEQ ID NO:280, HCDR2 comprend ou est composé de la SEQ ID NO:281, HCDR3 comprend ou est composé de la SEQ ID NO:282, et LCDR1 comprend ou est composé de la SEQ ID NO :292, LCDR2 comprend ou est composé de la SEQ ID NO:293, et LCDR3 comprend ou est composé de la SEQ ID NO:294. Dans certains modes de réalisation, le domaine variable de la chaîne lourde comprend ou est composé de la séquence d'acides aminés illustrée comme SEQ ID NO:333 ou une séquence d'acides aminés démontrant une identité de séquence d'au moins 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % à celle-ci, et le domaine variable de la chaîne légère comprend ou est composé de la séquence d'acides aminés illustrée comme SEQ ID NO:334 ou une séquence d'acides aminés démontrant une identité de séquence d'au moins 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % à celle-ci. Dans certains modes de réalisation de ce type, l'anticorps ou un fragment de liaison à l'antigène de celui-ci se lie au TIGIT humain et n'entre pas en compétition avec le CD155 pour la liaison avec le TIGIT.In another aspect, the invention describes an isolated antibody or an antigen binding fragment thereof which binds to human TIGIT and which does not compete with CD155 for binding with TIGIT. In certain embodiments, the antibody or antigen binding fragment comprises HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 in which HCDR1 comprises or is composed of SEQ ID NO: 280, HCDR2 comprises or is composed of SEQ ID NO: 281, HCDR3 includes or is composed of SEQ ID NO: 282, and LCDR1 includes or is composed of SEQ ID NO: 292, LCDR2 includes or is composed of SEQ ID NO: 293, and LCDR3 includes or is composed of SEQ ID NO: 294. In certain embodiments, the variable domain of the heavy chain comprises or is composed of the amino acid sequence illustrated as SEQ ID NO: 333 or an amino acid sequence demonstrating a sequence identity of at least 90%, 95%, 97%, 98% or 99% to it, and the variable domain of the light chain comprises or is composed of the amino acid sequence illustrated as SEQ ID NO: 334 or an amino acid sequence demonstrating a sequence identity of at least 90%, 95%, 97%, 98% or 99% thereto. In certain embodiments of this type, the antibody or an antigen binding fragment thereof binds to human TIGIT and does not compete with CD155 for binding with TIGIT.

Dans un autre aspect l'invention décrit un anticorps isolé ou un fragment de liaison à l'antigène de celui-ci, qui entre en compétition croisée pour la liaison avec le TIGIT humain avec un anticorps selon le premier aspect de l'invention, par ex., un anticorps donné en exemple ici.In another aspect the invention describes an isolated antibody or an antigen binding fragment thereof, which cross-competes for binding with human TIGIT with an antibody according to the first aspect of the invention, by e.g. an antibody given as an example here.

BE2017/5535BE2017 / 5535

Dans un autre aspect, l'invention décrit un anticorps isolé ou un fragment de liaison à l'antigène de celui-ci, qui se lie au même épitope qu'un anticorps selon le premier aspect de l'invention, par ex., un anticorps donné en exemple ici.In another aspect, the invention describes an isolated antibody or an antigen-binding fragment thereof, which binds to the same epitope as an antibody according to the first aspect of the invention, e.g. antibody given as an example here.

Dans un autre aspect, l'invention décrit un anticorps anti-TIGIT isolé ou un fragment de liaison à l'antigène de celui-ci qui diminue préférentiellement les cellules Treg exprimant le TIGIT, éventuellement dans lequel l'anticorps ou le fragment de liaison à l'antigène de celui-ci est un anticorps ou un fragment de liaison à l'antigène selon le premier aspect de l'invention, par ex., un anticorps donné en exemple ici.In another aspect, the invention describes an isolated anti-TIGIT antibody or an antigen binding fragment thereof which preferentially decreases TIGIT-expressing Treg cells, optionally in which the antibody or the binding fragment the antigen thereof is an antibody or an antigen binding fragment according to the first aspect of the invention, e.g., an antibody exemplified here.

Dans un autre aspect, l'invention décrit un variant de la ligne germinale ou un variant d'affinité d'un anticorps selon les autres aspects de l'invention, par ex., un anticorps donné en exemple ici.In another aspect, the invention describes a variant of the germ line or an affinity variant of an antibody according to the other aspects of the invention, eg, an antibody exemplified here.

Dans un autre aspect, l'invention décrit un polynucléotide isolé codant pour un anticorps ou un fragment de liaison à l'antigène, selon un quelconque autre aspect de l'invention, par ex., un anticorps donné en exemple ici.In another aspect, the invention describes an isolated polynucleotide encoding an antibody or antigen binding fragment, according to any other aspect of the invention, e.g., an antibody exemplified here.

Dans un autre aspect, l'invention décrit un polynucléotide isolé codant pour un domaine VH et/ou VL d'un anticorps anti-TIGIT, dans lequel le polynucléotide comprend une ou plusieurs séquences choisies parmi le groupe composé des SEQ ID NO: 241-270 et 335-342.In another aspect, the invention describes an isolated polynucleotide encoding a VH and / or VL domain of an anti-TIGIT antibody, in which the polynucleotide comprises one or more sequences chosen from the group consisting of SEQ ID NO: 241- 270 and 335-342.

Dans un autre aspect, l'invention décrit un vecteur d'expression comprenant un polynucléotide selon l'invention lié en fonctionnement à des séquences de régulation qui permettent l'expression du polypeptide de liaison à l'antigène dans une cellule hôte ou dans un système d'expression exempt de cellules.In another aspect, the invention describes an expression vector comprising a polynucleotide according to the invention linked in operation to regulatory sequences which allow the expression of the antigen-binding polypeptide in a host cell or in a system. cell-free expression.

Dans un autre aspect, l'invention décrit une cellule hôte ou un système d'expression exempt de cellules contenant un vecteur d'expression selon l'invention.In another aspect, the invention describes a host cell or a cell-free expression system containing an expression vector according to the invention.

Dans un autre aspect, l'invention décrit une méthode de production d'un anticorps recombinant ou d'un fragment de liaison à l'antigène de celui-ci qui comprend la culture d'une cellule hôte ou d'un système d'expression exempt de cellules selon l'invention dans des conditions qui permettent l'expression de l'anticorps ou du fragment de liaison à l'antigène et la récupération de l'anticorps ou du fragment de liaison à l'antigène exprimé.In another aspect, the invention describes a method of producing a recombinant antibody or an antigen binding fragment thereof which comprises culturing a host cell or an expression system free of cells according to the invention under conditions which allow the expression of the antibody or of the antigen-binding fragment and the recovery of the antibody or of the expressed antigen-binding fragment.

Dans un autre aspect, l'invention décrit une composition pharmaceutique comprenant un anticorps ou un fragment de liaison à l'antigène selon l'invention, par ex., un anticorps donné en exemple ici, et au moins un support ou excipient pharmaceutiquement acceptable.In another aspect, the invention describes a pharmaceutical composition comprising an antibody or an antigen binding fragment according to the invention, e.g., an antibody exemplified herein, and at least one pharmaceutically acceptable carrier or excipient.

Dans un autre aspect, l'invention décrit un anticorps ou un fragment de liaison à l'antigène selon l'invention ou une composition pharmaceutique selon l'invention pour une utilisation en thérapie.In another aspect, the invention describes an antibody or antigen binding fragment according to the invention or a pharmaceutical composition according to the invention for use in therapy.

BE2017/5535 Dans un autre aspect, l'invention décrit un anticorps ou un fragment de liaison à l'antigène selon l'invention (par ex., un anticorps donné en exemple ici) ou une composition pharmaceutique selon l'invention pour une utilisation dans une méthode de traitement du cancer.BE2017 / 5535 In another aspect, the invention describes an antibody or antigen-binding fragment according to the invention (eg, an antibody given as an example here) or a pharmaceutical composition according to the invention for use in a method of treating cancer.

Dans un autre aspect, l'invention décrit une méthode de traitement du cancer chez un sujet par l'administration d'une quantité efficace d'un anticorps ou d'un fragment de liaison à l'antigène selon l'invention (par ex., un anticorps donné en exemple ici) ou une composition pharmaceutique selon l'invention à un sujet, traitant ainsi le cancer.In another aspect, the invention describes a method of treating cancer in a subject by administering an effective amount of an antibody or antigen-binding fragment according to the invention (e.g. , an antibody given as an example here) or a pharmaceutical composition according to the invention to a subject, thus treating cancer.

Dans certains modes de réalisation, il est décrit un anticorps ou un fragment de liaison à l'antigène ou une composition pharmaceutique pour une utilisation dans une méthode selon l'invention, ou une méthode de traitement du cancer selon l'invention, dans lequel la méthode comprend également l'administration d'un agent thérapeutique supplémentaire.In some embodiments, there is described an antibody or antigen binding fragment or a pharmaceutical composition for use in a method according to the invention, or a method of treating cancer according to the invention, wherein the method also includes administering an additional therapeutic agent.

BRÈVE DESCRIPTION DES FIGURESBRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

Figure 1 Tableau présentant les séquences de la région déterminant la complémentarité (CDR) du domaine variable de la chaîne lourde (VH) des anticorps de l'invention.Figure 1 Table showing the sequences of the region determining the complementarity (CDR) of the variable domain of the heavy chain (VH) of the antibodies of the invention.

Figure 2 Tableau présentant les séquences CDR du domaine variable de la chaîne légère (VL) des anticorps de l'invention.Figure 2 Table presenting the CDR sequences of the variable domain of the light chain (VL) of the antibodies of the invention.

Figure 3 Tableau présentant les séquences cadres (FR) du domaine variable de la chaîne lourde (VH) des anticorps de l'invention.Figure 3 Table showing the framework sequences (FR) of the variable domain of the heavy chain (VH) of the antibodies of the invention.

Figure 4 Tableau présentant les séquences cadres (FR) du domaine variable de la chaîne légère (VL) des anticorps de l'invention.Figure 4 Table showing the framework sequences (FR) of the variable domain of the light chain (VL) of the antibodies of the invention.

Figure 5 Tableau présentant les séquences d'acides aminés du domaine variable de la chaîne lourde (VH) et du domaine variable de la chaîne légère (VL) des anticorps de l'invention.Figure 5 Table showing the amino acid sequences of the variable domain of the heavy chain (VH) and the variable domain of the light chain (VL) of the antibodies of the invention.

Figure 6 Tableau présentant les séquences des polynucléotides codant pour les domaines VH et VL des anticorps selon l'invention.Figure 6 Table showing the sequences of the polynucleotides coding for the VH and VL domains of the antibodies according to the invention.

Figure 7 Graphique illustrant les résultats d'un essai de compétition entre le hCD155 et l'anticorps anti-TIGIT pour la liaison aux cellules Jurkat-hTIGIT.Figure 7 Graph illustrating the results of a competition trial between hCD155 and the anti-TIGIT antibody for binding to Jurkat-hTIGIT cells.

Figure 8 (Planche A) Graphique illustrant la proportion des cellules positives pour TIGIT parmi des sous-populations de lymphocytes T sur des cellules de PBMC provenant de 7 donneurs humains sains. (Planche B) Graphique illustrant la proportion des cellules positives pour TIGIT parmi différentes sous-populations immunitaires de PBMC provenant de 7 donneurs humains sains.Figure 8 (Plate A) Graph illustrating the proportion of TIGIT positive cells among T cell subpopulations on PBMC cells from 7 healthy human donors. (Plate B) Graph illustrating the proportion of TIGIT positive cells among different immune subpopulations of PBMC from 7 healthy human donors.

Figure 9 Graphique illustrant les résultats d'un essai de liaison de l'anticorps anti-TIGIT sur les cellules Jurkat-hTIGIT.Figure 9 Graph illustrating the results of an anti-TIGIT antibody binding assay on Jurkat-hTIGIT cells.

Figure 10 (Planches A et B) Graphiques illustrant les résultats d'un essai de liaison de l'anticorps anti-TIGIT sur des lymphocytes T CD8⁺ primairesFigure 10 (Plates A and B) Graphs illustrating the results of an anti-TIGIT antibody binding assay on primary CD8 ⁺ T lymphocytes

BE2017/5535 provenant des PBMC humaines saines. (Planche C) Graphique illustrant les résultats d'un essai de liaison de l'anticorps anti-TIGIT sur des lymphocytes T CD8⁺ primaires mémoires et des Treg provenant des PBMC humaines saines.BE2017 / 5535 from healthy human PBMCs. (Plate C) Graph illustrating the results of an anti-TIGIT antibody binding test on primary memory CD8 ⁺ T lymphocytes and Tregs from healthy human PBMCs.

FigureU (Planches A et B) Graphiques illustrant les résultats d'un essai de liaison de l'anticorps anti-TIGIT sur des lymphocytes T CD8⁺ primaires provenant des PBMC de cynomolgus sains.FigureU (Plates A and B) Graphs illustrating the results of an anti-TIGIT antibody binding assay on primary CD8 ⁺ T lymphocytes from PBMCs of healthy cynomolgus.

Figure 12 (Planches A, B et C) Graphiques illustrant l’effet des anticorps anti-TIGIT dans un bioessai CHO-TCR-CD155 et Jurkat-hTIGIT.Figure 12 (Plates A, B and C) Graphs illustrating the effect of anti-TIGIT antibodies in a CHO-TCR-CD155 and Jurkat-hTIGIT bioassay.

Figure 13 (Planches A, B et C) Graphiques illustrant l'effet des anticorps anti-TIGIT pour augmenter la sécrétion de l'IFNg dans un essai fonctionnel sur les lymphocytes T CD8⁺ primaires humains provenant de donneurs sains activés avec les cellules CHO-TCR-CD155.Figure 13 (Plates A, B and C) Graphs illustrating the effect of anti-TIGIT antibodies to increase the secretion of IFNg in a functional test on human primary CD8 ⁺ T lymphocytes from healthy donors activated with CHO- cells TCR-CD155.

Figure 14 Histogramme illustrant l'effet de l'anticorps anti-TIGIT pour augmenter la sécrétion de l'IFNg dans un essai fonctionnel sur les TIL CD8⁺ primaires humaines provenant d’ascite de patients atteint d’un cancer de l’ovaire et activées avec les cellules CHO-TCR-CD155.Figure 14 Histogram illustrating the effect of the anti-TIGIT antibody to increase the secretion of IFNg in a functional test on primary human CD8 ⁺ TILs from ascites of activated ovarian cancer patients with CHO-TCR-CD155 cells.

Figure 15 (Planche A) Graphique illustrant les résultats d'un essai de compétition entre le CD155 de souris et l'anticorps anti-TIGIT pour la liaison aux cellules Jurkat-mTIGIT. (Planche B) Graphique illustrant l'effet de l'anticorps antiTIGIT pour augmenter la sécrétion de l'IFNg dans un essai fonctionnel sur les lymphocytes T de souris OT-1. (Planche C) Graphique illustrant l'effet de l'anticorps anti-TIGIT pour augmenter la cytotoxicité dans un essai fonctionnel sur les lymphocytes T de souris OT-1.Figure 15 (Plate A) Graphic illustrating the results of a competition test between the mouse CD155 and the anti-TIGIT antibody for binding to Jurkat-mTIGIT cells. (Plate B) Graph illustrating the effect of the antiTIGIT antibody to increase the secretion of IFNg in a functional test on T lymphocytes of OT-1 mice. (Plate C) Graph illustrating the effect of the anti-TIGIT antibody to increase cytotoxicity in a functional test on T lymphocytes of OT-1 mice.

Figure 16 (Planche A) Graphique illustrant l'efficacité antitumorale de l'anticorps anti-TIGIT en monothérapie dans un modèle tumoral CT26. (Planches B et C) Graphiques illustrant l'efficacité antitumorale de l'anticorps anti-TIGIT en association avec l'anti-PD 1 dans un modèle tumoral CT26.Figure 16 (Plate A) Graphic illustrating the anti-tumor efficacy of the anti-TIGIT antibody as monotherapy in a CT26 tumor model. (Boards B and C) Graphs illustrating the anti-tumor efficacy of the anti-TIGIT antibody in combination with anti-PD 1 in a CT26 tumor model.

Figure 17 (Planche A) Graphique illustrant l'efficacité antitumorale en fonction de l'isotype de l'anticorps anti-TIGIT en monothérapie dans un modèle tumoral CT26. (Planche B) Graphique illustrant l'efficacité antitumorale en fonction de l'isotype de l'anticorps anti-TIGIT en association avec l'anti-PD1 dans un modèle tumoral CT26.Figure 17 (Plate A) Graph illustrating the antitumor efficacy as a function of the isotype of the anti-TIGIT antibody as monotherapy in a CT26 tumor model. (Plate B) Graph illustrating the anti-tumor efficacy as a function of the isotype of the anti-TIGIT antibody in combination with the anti-PD1 in a CT26 tumor model.

Figure 18 (Planches A et G) Graphiques illustrant la modulation de la proportion de cellules Treg dans la population de lymphocytes T CD4⁺ totale dans la tumeur CT26 traitée avec l'anticorps anti-TIGIT en monothérapie ou en combinaison avec l'anti-PD 1. (Planches B et H) Graphiques illustrant la modulation de la proportion de lymphocytes T CD8⁺ dans la population totale de CD45⁺ dans la tumeur CT26 traitée avec l'anticorps anti-TIGIT en monothérapie ou en combinaison avec l'antiPD1. (Planches C et I) Graphiques illustrant la modulation du rapport de lymphocytes T CD8⁺/cellules Treg dans la tumeur CT26 traitée avec l'anticorps anti-TIGIT enFigure 18 (Boards A and G) Graphs illustrating the modulation of the proportion of Treg cells in the total CD4 ⁺ T lymphocyte population in the CT26 tumor treated with the anti-TIGIT antibody as monotherapy or in combination with anti-PD 1. (Boards B and H) Graphs illustrating the modulation of the proportion of CD8 ⁺ T lymphocytes in the total population of CD45 ⁺ in the CT26 tumor treated with the anti-TIGIT antibody as monotherapy or in combination with the antiiPD1. (Boards C and I) Graphs illustrating the modulation of the ratio of CD8 ⁺ T lymphocytes / Treg cells in the CT26 tumor treated with the anti-TIGIT antibody in

BE2017/5535 monothérapie ou en combinaison avec l'anti-PD1. (Planches D et J) Graphique illustrant la modulation des lymphocytes T CD4⁺ sécrétant de l'IFNg dans la tumeur CT26 traitée avec l'anticorps anti-TIGIT en monothérapie ou en combinaison avec l'anti-PD1. (Planche E) Graphique illustrant la modulation des lymphocytes T CD8⁺sécrétant de l'IFNg dans la tumeur CT26 traitée avec l'anticorps anti-TIGIT. (Planches L et F) Graphiques illustrant le rapport des lymphocytes T CD4⁺ sécrétant de l’IFNg/IL10 dans la tumeur CT26 traitée avec l'anticorps anti-TIGIT en monothérapie ou en combinaison avec l'anti-PD1. (Planches K) Graphique illustrant la modulation des lymphocytes T CD4⁺ sécrétant de l'IL-10 dans la tumeur CT26 traitée avec l'anticorps anti-TIGIT en combinaison avec l'anticorps anti-PD1.BE2017 / 5535 monotherapy or in combination with anti-PD1. (Plates D and J) Graph illustrating the modulation of CD4 ⁺ T lymphocytes secreting IFNg in the tumor CT26 treated with the anti-TIGIT antibody as monotherapy or in combination with anti-PD1. (Plate E) Graphic illustrating the modulation of CD8 ⁺ T lymphocytes secreting IFNg in the tumor CT26 treated with the anti-TIGIT antibody. (Plates L and F) Graphs illustrating the ratio of CD4 ⁺ T lymphocytes secreting IFNg / IL10 in the tumor CT26 treated with the anti-TIGIT antibody as monotherapy or in combination with anti-PD1. (Plates K) Graph illustrating the modulation of CD4 ⁺ T lymphocytes secreting IL-10 in the tumor CT26 treated with the anti-TIGIT antibody in combination with the anti-PD1 antibody.

Figure 19 (Planche A) Graphique illustrant l'effet du traitement avec l'anticorps anti-TIGIT pour moduler l'expression génique dans la tumeur CT26 et mesuré par NanoString. (Planche B) Graphique illustrant la modulation du score cytotoxique dans la tumeur CT26 traitée avec l'anticorps anti-TIGIT en monothérapie ou en combinaison avec l'anti-PD1. (Planche C) Graphique illustrant la modulation du score de lymphocytes T CD8⁺ dans la tumeur CT26 traitée avec l'anticorps anti-TIGIT en monothérapie ou en combinaison avec l'anti-PD1.Figure 19 (Plate A) Graphic illustrating the effect of treatment with the anti-TIGIT antibody to modulate gene expression in the CT26 tumor and measured by NanoString. (Plate B) Graphic illustrating the modulation of the cytotoxic score in the CT26 tumor treated with the anti-TIGIT antibody as monotherapy or in combination with anti-PD1. (Plate C) Graph illustrating the modulation of the CD8 ⁺ T lymphocyte score in the CT26 tumor treated with the anti-TIGIT antibody as monotherapy or in combination with anti-PD1.

Figure 20 (Planche A) Histogrammes illustrant la proportion des populations de lymphocytes T TIGIT⁺ CD4⁺, CD8⁺ et des cellules Treg dans les PBMC provenant de volontaires sains humains. (Planche B) Graphique illustrant l'effet cytotoxique, in vitro, de l'anticorps anti-TIGIT sur des populations conventionnelles de lymphocytes T CD4⁺, CD8⁺ et des cellules Treg dans les PBMC provenant de volontaires humains sains.Figure 20 (Plate A) Histograms illustrating the proportion of TIGIT ⁺ CD4 ⁺ , CD8 ⁺ T lymphocyte populations and Treg cells in PBMCs from healthy human volunteers. (Plate B) Graph illustrating the cytotoxic effect, in vitro, of the anti-TIGIT antibody on conventional populations of CD4 ⁺ , CD8 ⁺ T lymphocytes and Treg cells in PBMCs from healthy human volunteers.

Figure 21 Graphique illustrant l'effet cytotoxique, ex vivo, de l'anticorps anti-TIGIT sur des populations conventionnelles de lymphocytes T CD4⁺, CD8⁺ et des cellules Treg dans la tumeur CT26, chez la souris.Figure 21 Graph illustrating the cytotoxic effect, ex vivo, of the anti-TIGIT antibody on conventional populations of CD4 ⁺ , CD8 ⁺ T lymphocytes and Treg cells in the CT26 tumor, in mice.

DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTIONDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Dans le présent contexte, le terme « immunoglobuline » comprend un polypeptide ayant une combinaison de deux chaînes lourdes et de deux chaînes légères, qu'il possède ou non une quelconque immunoréactivité spécifique pertinente. Le terme « anticorps » décrit de tels ensembles qui ont une activité immunoréactive spécifique importante connue contre un antigène d'intérêt (par ex., TIGIT). Les termes « anticorps TIGIT » ou « anticorps anti-TIGIT » sont utilisés ici pour décrire des anticorps qui démontrent une spécificité immunologique envers la protéine TIGIT. Les anticorps et les immunoglobulines comprennent des chaînes légères et lourdes, en présence ou en absence d'une liaison covalente interchaîne entre les deux. Les structures de base des immunoglobulines dans les systèmes de vertébrés sont relativement bien comprises.In the present context, the term "immunoglobulin" includes a polypeptide having a combination of two heavy chains and two light chains, whether or not it has any relevant specific immunoreactivity. The term "antibody" describes such arrays that have known significant specific immunoreactive activity against an antigen of interest (eg, TIGIT). The terms "TIGIT antibody" or "anti-TIGIT antibody" are used herein to describe antibodies which demonstrate immunological specificity towards the TIGIT protein. Antibodies and immunoglobulins include light and heavy chains, in the presence or absence of an interchain covalent bond between the two. The basic structures of immunoglobulins in vertebrate systems are relatively well understood.

BE2017/5535BE2017 / 5535

Le terme générique « immunoglobuline » comprend cinq classes distinctes d'anticorps qui peuvent être différenciés biochimiquement. Même si les cinq classes d'anticorps sont dans la portée de la présente invention, la présente discussion se portera généralement sur la classe d'IgG des molécules d'immunoglobuline. Concernant les IgG, les immunoglobulines comprennent deux chaînes polypeptidiques légères identiques avec un poids moléculaire d'environ 23 000 Daltons, et deux chaînes lourdes identiques avec un poids moléculaire entre 53 000 et 70 000. Les quatre chaînes sont liées par des ponts disulfures dans une configuration en « Y » dans laquelle les chaînes légères entourent les chaînes lourdes commençant au niveau de la bouche du « Y » et continuant à travers la région variable.The generic term "immunoglobulin" includes five distinct classes of antibodies that can be biochemically differentiated. Although all five classes of antibodies are within the scope of the present invention, the present discussion will generally focus on the IgG class of immunoglobulin molecules. With regard to IgG, the immunoglobulins comprise two identical light polypeptide chains with a molecular weight of approximately 23,000 Daltons, and two identical heavy chains with a molecular weight between 53,000 and 70,000. The four chains are linked by disulfide bridges in a "Y" configuration in which the light chains surround the heavy chains starting at the mouth of the "Y" and continuing through the variable region.

Les chaînes légères d'un anticorps sont classées comme kappa ou lambda (κ, λ). Chaque classe de chaîne lourde peut être liée soit avec une chaîne légère kappa soit avec une chaîne légère lambda. En règle générale, les chaînes lourdes et légères sont liées de façon covalente l'une à l'autre, et les parties de « queue » des deux chaînes lourdes sont liées l'une à l'autre par des liaisons disulfures covalentes ou des liaisons non covalentes lorsque les immunoglobulines sont produites par les lymphocytes B ou des cellules hôtes génétiquement modifiées. Dans la chaîne lourde, les séquences d'acides aminés vont d’une extrémité N-terminale au niveau des extrémités fourchues de la configuration en Y vers l'extrémité C-terminale au bas de la chaîne. Les spécialistes du domaine comprendront que les chaînes lourdes sont classées comme gamma, mu, alpha, delta ou epsilon, (γ, μ, α, δ, ε) avec quelques sous-classes parmi elles (par ex., γ 1-γ4). C'est la nature de cette chaîne qui détermine la « classe » de l'anticorps comme IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE, respectivement. Les sousclasses d'immunoglobulines (isotypes), par ex., lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1, etc., sont bien caractérisées et sont connues pour conférer une spécialisation fonctionnelle. Des versions modifiées de chacune de ces classes et des isotypes sont facilement différentiables par un spécialiste du domaine à la lumière de la présente divulgation et, par conséquent, sont dans la portée de la présente invention.The light chains of an antibody are classified as kappa or lambda (κ, λ). Each heavy chain class can be linked either with a kappa light chain or with a lambda light chain. Typically, the heavy and light chains are covalently linked to each other, and the "tail" portions of the two heavy chains are linked to each other by covalent disulfide bonds or bonds non-covalent when immunoglobulins are produced by B lymphocytes or genetically modified host cells. In the heavy chain, the amino acid sequences go from an N-terminal end at the split ends of the Y configuration to the C-terminal end at the bottom of the chain. Specialists in the field will understand that heavy chains are classified as gamma, mu, alpha, delta or epsilon, (γ, μ, α, δ, ε) with a few subclasses among them (e.g., γ 1-γ4) . It is the nature of this chain that determines the "class" of the antibody like IgG, IgM, IgA, IgD or IgE, respectively. Immunoglobulin subclasses (isotypes), e.g., lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1, etc., are well characterized and are known to confer functional specialization. Modified versions of each of these classes and isotypes are readily distinguishable by a person skilled in the art in light of the present disclosure and, therefore, are within the scope of the present invention.

Comme il a été précédemment indiqué, la région variable d'un anticorps permet à l'anticorps de reconnaître sélectivement et de se lier spécifiquement à des épitopes sur des antigènes. C'est-àdire, le domaine VL et le domaine VH d'un anticorps s'associent pour former la région variable qui définit un site de liaison à l'antigène en 3D. Cette structure d'anticorps quaternaire forme le site de liaison à l'antigène présent à l'extrémité de chaque bras de ΙΎ. Plus spécifiquement, le site de liaison à l'antigène est défini par trois régions déterminant la complémentarité (CDR) sur chacune des chaînes VH et VL.As previously indicated, the variable region of an antibody allows the antibody to selectively recognize and specifically bind to epitopes on antigens. That is, the VL domain and the VH domain of an antibody combine to form the variable region which defines a 3D antigen binding site. This quaternary antibody structure forms the antigen binding site present at the end of each ΙΎ arm. More specifically, the antigen binding site is defined by three regions determining complementarity (CDR) on each of the VH and VL chains.

Dans le présent contexte, les termes « protéine TIGIT » ou « antigène TIGIT » ou « TIGIT » sont utilisés de façon interchangeable et décrivent l'immunorécepteur des lymphocytes T humains (numéro d'accès GenBank : NM_173799) qui se lie au récepteur/ligand du poliovirus (PVR également appelé CD155). TIGIT est également appelé VSIG9, VSTM3 ou WUCAM. La référence à TIGIT comprend la protéine TIGIT humaine native exprimée naturellement chez l'hôte humain et/ouIn the present context, the terms “TIGIT protein” or “TIGIT antigen” or “TIGIT” are used interchangeably and describe the human T lymphocyte immunoreceptor (GenBank access number: NM_173799) which binds to the receptor / ligand poliovirus (PVR also called CD155). TIGIT is also called VSIG9, VSTM3 or WUCAM. The reference to TIGIT includes the native human TIGIT protein expressed naturally in the human host and / or

BE2017/5535 sur la surface des lignées cellulaires humaines cultivées, aussi bien que les formes recombinantes et des fragments de celles-ci, et également des formes mutantes naturelles.BE2017 / 5535 on the surface of cultured human cell lines, as well as recombinant forms and fragments thereof, and also natural mutant forms.

Dans le présent contexte, le terme « site de liaison » comprend une région d'un polypeptide qui est responsable de la liaison sélective à un antigène cible d'intérêt (par ex., le TIGIT). Les domaines de liaison comprennent au moins un site de liaison. Des exemples de domaines de liaison comprennent un domaine variable d'anticorps. Les molécules d'anticorps de l'invention peuvent comprendre un site de liaison unique ou de multiples (par ex., deux, trois ou quatre) sites de liaison.In the present context, the term "binding site" includes a region of a polypeptide which is responsible for selective binding to a target antigen of interest (eg, TIGIT). The binding domains include at least one binding site. Examples of binding domains include a variable antibody domain. The antibody molecules of the invention may include a single binding site or multiple (eg, two, three or four) binding sites.

Dans le présent contexte, le terme « dérivé » d'une protéine désignée (par ex., un anticorps TIGIT ou un fragment de liaison à l'anticorps de celui-ci) décrit l'origine du polypeptide. Dans un mode de réalisation, le polypeptide ou la séquence d'acides aminés qui est dérivée d'un polypeptide de départ donné est une séquence CDR ou une séquence apparentée à celle-ci. Dans un mode de réalisation, la séquence d'acides aminés qui est dérivée d'un polypeptide de départ donné n'est pas contiguë. Par exemple, dans un mode de réalisation, une, deux, trois, quatre, cinq ou six CDR sont dérivées d'un anticorps de départ. Dans un mode de réalisation, le polypeptide ou la séquence d'acides aminés qui est dérivée d'un polypeptide de départ donné ou d'une séquence d'acides aminés comporte une séquence d'acides aminés qui est essentiellement identique à celle de la séquence de départ, ou d'une partie de celle-ci, dans laquelle la partie est composée d'au moins 3 à 5 acides aminés, d'au moins 5 à 10 acides aminés, d'au moins 10 à 20 acides aminés, d'au moins 20 à 30 acides aminés ou d'au moins 30 à 50 acides aminés, ou qui est identifiable par un homme de métier comme ayant son origine dans la séquence de départ. Dans un mode de réalisation, l'une ou plusieurs séquences CDR dérivées de l'anticorps de départ sont modifiées pour produire des séquences CDR variantes, par ex., des variants d'affinité, dans lesquelles les séquences CDR variantes maintiennent l'activité de liaison au TIGIT.In the present context, the term "derivative" of a designated protein (eg, a TIGIT antibody or an antibody-binding fragment thereof) describes the origin of the polypeptide. In one embodiment, the polypeptide or amino acid sequence which is derived from a given starting polypeptide is a CDR sequence or a sequence related thereto. In one embodiment, the amino acid sequence which is derived from a given starting polypeptide is not contiguous. For example, in one embodiment, one, two, three, four, five, or six CDRs are derived from a starting antibody. In one embodiment, the polypeptide or amino acid sequence which is derived from a given starting polypeptide or from an amino acid sequence has an amino acid sequence which is essentially identical to that of the sequence starting material, or a part thereof, in which the part consists of at least 3 to 5 amino acids, at least 5 to 10 amino acids, at least 10 to 20 amino acids, d '' at least 20 to 30 amino acids or at least 30 to 50 amino acids, or which is identifiable by a person skilled in the art as having its origin in the starting sequence. In one embodiment, one or more CDR sequences derived from the starting antibody are modified to produce variant CDR sequences, e.g., affinity variants, in which the variant CDR sequences maintain the activity of link to TIGIT.

Dans le présent contexte, une « substitution d'acide aminé conservatrice » est une substitution dans laquelle le résidu d'acides aminés est remplacé par un résidu d'acide aminé ayant une chaîne latérale semblable. Des familles de résidus d'acides aminés ayant des chaînes latérales semblables ont été définies dans le domaine, comprenant des chaînes latérales basiques (par ex., lysine, arginine, histidine), des chaînes latérales acides (par ex., acide aspartique, acide glutamique), des chaînes latérales polaires non chargées (par ex., glycine, asparagine, glutamine, sérine, thréonine, tyrosine, cystéine), des chaînes latérales non polaires (par ex., alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phénylalanine, méthionine, tryptophane), des chaînes latérales à ramification bêta (par ex., thréonine, valine, isoleucine) et des chaînes latérales aromatiques (par ex., tyrosine, phénylalanine, tryptophane, histidine). Ainsi, un résidu d'acide aminé non essentiel dans un polypeptide d'immunoglobuline peut être remplacé par un autre résidu d'acide aminé appartenant à la même famille de chaîne latérale. Dans un autre mode de réalisation, une chaîne d'acides aminés peut être remplacée par une chaîne ayant une structure semblable qui diffère en ordre et/ou en composition des membres de la famille de la chaîne latérale.In the present context, a "conservative amino acid substitution" is a substitution in which the amino acid residue is replaced by an amino acid residue having a similar side chain. Families of amino acid residues having similar side chains have been defined in the art, including basic side chains (eg, lysine, arginine, histidine), acid side chains (eg, aspartic acid, acid glutamic), uncharged polar side chains (e.g., glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), non-polar side chains (e.g., alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine , methionine, tryptophan), beta branching side chains (e.g. threonine, valine, isoleucine) and aromatic side chains (e.g. tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine). Thus, a non-essential amino acid residue in an immunoglobulin polypeptide can be replaced by another amino acid residue belonging to the same side chain family. In another embodiment, an amino acid chain can be replaced with a chain having a similar structure which differs in order and / or composition from the members of the side chain family.

BE2017/5535BE2017 / 5535

Dans le présent contexte, le terme « partie de chaîne lourde » comprend des séquences d'acides aminés dérivées des domaines constants d'une chaîne lourde d'immunoglobuline. Un polypeptide comprenant une partie de chaîne lourde comprend au moins: un domaine CH1, un domaine charnière (par ex., la région charnière supérieure, moyenne et/ou inférieure), un domaine CH2, un domaine CH3 ou un variant ou un fragment de celui-ci. Dans un mode de réalisation, un anticorps ou un fragment de liaison à l'antigène de l'invention peut comprendre la partie Fc d'une chaîne lourde d'immunoglobuline (par ex., une partie charnière, un domaine CH2 et un domaine CH3). Dans un autre mode de réalisation, il peut manquer à un anticorps ou à un fragment de liaison à l'antigène de l'invention une partie d'un domaine constant (par ex., toute ou une partie du domaine CH2). Dans certains modes de réalisation, au moins un, et préférablement tous, les domaines constants sont dérivés d'une chaîne lourde d'immunoglobuline humaine. Par exemple, dans un mode de réalisation préféré, la partie de chaîne lourde comprend un domaine charnière totalement humain. Dans d'autres modes de réalisation préférés, la partie de chaîne lourde comprend une partie Fc totalement humaine (par ex., une charnière, des séquences de domaine CH2 et CH3 provenant d'une immunoglobuline humaine).In the present context, the term "heavy chain part" includes amino acid sequences derived from the constant domains of an immunoglobulin heavy chain. A polypeptide comprising a heavy chain part comprises at least: a CH1 domain, a hinge domain (e.g., the upper, middle and / or lower hinge region), a CH2 domain, a CH3 domain or a variant or fragment of this one. In one embodiment, an antibody or antigen binding fragment of the invention may comprise the Fc portion of an immunoglobulin heavy chain (e.g., a hinge portion, a CH2 domain and a CH3 domain ). In another embodiment, an antibody or an antigen binding fragment of the invention may lack part of a constant domain (eg, all or part of the CH2 domain). In some embodiments, at least one, and preferably all, the constant domains are derived from a heavy chain of human immunoglobulin. For example, in a preferred embodiment, the heavy chain portion comprises a fully human hinge domain. In other preferred embodiments, the heavy chain portion comprises a fully human Fc portion (eg, a hinge, CH2 and CH3 domain sequences from a human immunoglobulin).

Dans certains modes de réalisation, les domaines constants constituant la partie de chaîne lourde proviennent de différentes molécules d'immunoglobulines. Par exemple, une partie de chaîne lourde d'un polypeptide peut comprendre un domaine CH2 dérivé d'une molécule d'IgG 1 et une région charnière dérivée d'une molécule d'lgG3 ou d'lgG4. Dans d'autres modes de réalisation, les domaines constants sont des domaines chimères comprenant des parties de différentes molécules d'immunoglobulines. Par exemple, une charnière peut comprendre une première partie provenant d'une molécule d'IgGI et une seconde partie provenant d'une molécule d'lgG3 ou d'lgG4. Comme il est décrit ci-dessus, un homme de métier comprendra que les domaines constants de la partie de chaîne lourde peuvent être modifiés de sorte qu'ils varient au niveau de la séquence d'acides aminés par rapport à la molécule d'immunoglobuline naturelle (de type sauvage). C'est à dire, les polypeptides de l'invention divulgués ici peuvent comprendre des altérations ou des modifications sur un ou plusieurs domaines constants de la chaîne lourde (CH1, charnière, CH2 ou CH3) et/ou le domaine de la région constante de la chaîne légère (CL). Des exemples de modifications comprennent des additions, des délétions ou des substitutions d'un ou de plusieurs acides aminés dans un ou plusieurs domaines.In certain embodiments, the constant domains constituting the heavy chain part come from different immunoglobulin molecules. For example, a heavy chain portion of a polypeptide may include a CH2 domain derived from an IgG 1 molecule and a hinge region derived from an IgG3 or IgG4 molecule. In other embodiments, the constant domains are chimeric domains comprising parts of different immunoglobulin molecules. For example, a hinge may include a first part from an IgGI molecule and a second part from an IgG3 or IgG4 molecule. As described above, a person skilled in the art will understand that the constant domains of the heavy chain part can be modified so that they vary in the amino acid sequence compared to the natural immunoglobulin molecule. (wild type). That is, the polypeptides of the invention disclosed herein may include alterations or modifications to one or more constant domains of the heavy chain (CH1, hinge, CH2 or CH3) and / or the domain of the constant region of the light chain (CL). Examples of modifications include additions, deletions or substitutions of one or more amino acids in one or more domains.

Dans le présent contexte, les termes « région variable » et « domaine variable » sont utilisés de façon interchangeable et sont destinés à avoir une signification équivalente. Le terme « variable » décrit le fait que certaines parties des domaines variable VH et VL diffèrent de façon importante au niveau de la séquence parmi les anticorps et sont utilisés dans la liaison et la spécificité de chaque anticorps donné pour son antigène cible. Cependant, la variabilité n'est pas également distribuée à travers tous les domaines variables des anticorps. Elle est concentrée en trois segments appelés les « boucles hypervariables » dans chacun des domaine VL et VH qui font partie du site de liaison à l'antigène. La première, la deuxième et la troisième boucles hypervariables du domaine de la chaîneIn the present context, the terms “variable region” and “variable domain” are used interchangeably and are intended to have an equivalent meaning. The term "variable" describes the fact that certain parts of the VH and VL variable domains differ significantly in sequence among antibodies and are used in the binding and specificity of each given antibody for its target antigen. However, the variability is not evenly distributed across all of the variable domains of the antibodies. It is concentrated in three segments called the “hypervariable loops” in each of the VL and VH domains which are part of the antigen binding site. The first, second and third hypervariable loops of the chain domain

BE2017/5535 légere V_Lambda sont ici appelées 1_1 (λ), Ι_2(λ) et Ι_3(λ) et peuvent être définies comme comprenant les résidus 24-33 (L1(À), composés de 9, 10 ou 11 résidus d'acides aminés), 49-53 (L2(À), composés de 3 résidus) et 90-96 (L3(À), composés de 5 résidus) dans le domaine VL (Morea et al. , Methods 20, 267279, 2000). La première, la deuxième et la troisième boucles hypervariables du domaine de la chaîne légère V_Kappa sont ici appelées L1(k), L2(k) et L3(k) et peuvent être définies comme comprenant les résidus 25-33 (L1(k), composés de 6, 7, 8, 11, 12 ou 13 résidus d'acides aminés), 49-53 (L2(k), composés de 3 résidus) et 90-97 (L3(k), composés de 6 résidus) dans le domaine VL (Morea et al., Methods 20, 267-279, 2000). La première, la deuxième et la troisième boucles hypervariables du domaine VH sont ici appelées H1, H2 et H3 et peuvent être définies comme comprenant les résidus 25-33 (H1, composé de 7, 8 ou 9 résidus), 52-56 (H2, composé de 3 ou 4 résidus) et 91-105 (H3, de longueur très variable) dans le domaine VH (Morea et al., Methods 20, 267-279, 2000).BE2017 / 5535 slight V _Lam bda are here called 1_1 (λ), Ι_2 (λ) and Ι_3 (λ) and can be defined as comprising residues 24-33 (L1 (À), composed of 9, 10 or 11 residues d amino acids), 49-53 (L2 (À), composed of 3 residues) and 90-96 (L3 (À), composed of 5 residues) in the VL domain (Morea et al., Methods 20, 267279, 2000 ). The first, second and third hypervariable loops of the V _Ka ppa light chain domain are here called L1 (k), L2 (k) and L3 (k) and can be defined as comprising residues 25-33 (L1 ( k), composed of 6, 7, 8, 11, 12 or 13 amino acid residues), 49-53 (L2 (k), composed of 3 residues) and 90-97 (L3 (k), composed of 6 residues) in the VL field (Morea et al., Methods 20, 267-279, 2000). The first, second and third hypervariable loops of the VH domain are here called H1, H2 and H3 and can be defined as comprising residues 25-33 (H1, composed of 7, 8 or 9 residues), 52-56 (H2 , composed of 3 or 4 residues) and 91-105 (H3, of very variable length) in the VH domain (Morea et al., Methods 20, 267-279, 2000).

Sauf en cas d'indication contraire, les termes L1, L2 et L3 décrivent respectivement la première, la deuxième et la troisième boucles hypervariables du domaine VL, et englobent les boucles hypervariables obtenues à partir des deux isotypes V_Kappa et V_Lambda· Les termes H1, H2 et H3 décrivent respectivement la première, la deuxième et la troisième boucles hypervariables du domaine VH, et englobent les boucles hypervariables obtenues de l'un quelconque des isotypes de la chaîne lourde connu, comprenant y, ε, δ, a ou μ.Unless otherwise indicated, the terms L1, L2 and L3 respectively describe the first, the second and the third hypervariable loops of the VL domain, and include the hypervariable loops obtained from the two isotypes V _Ka ppa and V _Lam bda · The terms H1, H2 and H3 respectively describe the first, second and third hypervariable loops of the VH domain, and include hypervariable loops obtained from any of the known heavy chain isotypes, including y, ε, δ, a or μ.

Les boucles hypervariables L1, L2, L3, H1, H2 et H3 peuvent chacune comprendre une partie d'une « région déterminant la complémentarité » ou « CDR », tel que défini ci-dessous. Les termes « boucle hypervariable » et « région déterminant la complémentarité » ne sont pas strictement synonymes, étant donné que les boucles hypervariables (HV) sont définies sur la base d'une structure, alors que les régions déterminant la complémentarité (CDR) sont définies en se basant sur la variabilité de la séquence (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991) et les limites HV et des CDR peuvent être différentes dans certains domaines VH et VL.The hypervariable loops L1, L2, L3, H1, H2 and H3 may each include part of a "region determining complementarity" or "CDR", as defined below. The terms "hypervariable loop" and "region determining complementarity" are not strictly synonymous, since hypervariable loops (HV) are defined on the basis of a structure, while regions determining complementarity (CDR) are defined based on sequence variability (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991) and the HV and CDR limits may be different in certain areas VH and VL.

Les CDR des domaines VL et VH peuvent généralement être définies comme comprenant les acides aminés suivants : résidus 24-34 (CDRL1), 50-56 (CDRL2) et 89-97 (CDRL3) dans le domaine variable de la chaîne légère, et les résidus 31-35 ou 31-35b (CDRH1), 50-65 (CDRH2) et 95-102 (CDRH3) dans le domaine variable de la chaîne lourde ; (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991). Ainsi, les HV peuvent être compris dans les CDR correspondantes et les références données ici pour les « boucles hypervariables » des domaines VH et VL, doivent être interprétées comme englobant également les CDR correspondantes, et vice versa, sauf en cas d'indication contraire.The CDRs of the VL and VH domains can generally be defined as comprising the following amino acids: residues 24-34 (CDRL1), 50-56 (CDRL2) and 89-97 (CDRL3) in the variable domain of the light chain, and the residues 31-35 or 31-35b (CDRH1), 50-65 (CDRH2) and 95-102 (CDRH3) in the variable domain of the heavy chain; (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991). Thus, the HVs can be included in the corresponding CDRs and the references given here for the “hypervariable loops” of the VH and VL domains, should be interpreted as also encompassing the corresponding CDRs, and vice versa, unless otherwise indicated.

Les parties les mieux conservées des domaines variables sont appelées la région cadre (FR), tel que défini ci-dessous. Les domaines variables des chaînes lourdes et légères natives comprennent chacun quatre FR (FR1, FR2, FR3 et FR4, respectivement), adoptant largement la configuration en feuilles β, reliés par les trois boucles hypervariables. Les boucles hypervariables dans chaque chaîneThe best-preserved parts of the variable domains are called the framework region (FR), as defined below. The variable domains of the native heavy and light chains each include four FRs (FR1, FR2, FR3 and FR4, respectively), largely adopting the configuration in β sheets, connected by the three hypervariable loops. The hypervariable loops in each chain

BE2017/5535 sont maintenues ensemble, à proximité les unes des autres, par les FR, les boucles hypervariables de l'autre chaîne contribuant à la formation du site de liaison à l'antigène des anticorps. Une analyse structurale des anticorps a révélé la relation entre la séquence et la forme du site de liaison formée par les régions déterminant la complémentarité (Chothia et al., J. Mol. Biol. 227, 799-817, 1992 ; Tramontano étal., J. Mol. Biol, 215, 175-182, 1990). Malgré leur variabilité de séquences élevée, cinq des six boucles adoptent seulement un petit répertoire de conformations de la chaîne principale, appelé les « structures canoniques ». Ces conformations sont premièrement déterminées par la longueur des boucles et, deuxièmement, par la présence de résidus clés à certaines positions dans les boucles et dans les régions cadres qui déterminent la conformation à travers leur repliement, les liaisons hydrogènes ou la capacité à assumer des conformations de chaîne principale inhabituelles.BE2017 / 5535 are held together, close to each other, by the FRs, the hypervariable loops of the other chain contributing to the formation of the antigen binding site of the antibodies. A structural analysis of the antibodies revealed the relationship between the sequence and the shape of the binding site formed by the regions determining the complementarity (Chothia et al., J. Mol. Biol. 227, 799-817, 1992; Tramontano et al., J. Mol. Biol, 215, 175-182, 1990). Despite their high sequence variability, five of the six loops adopt only a small repertoire of main chain conformations, called "canonical structures". These conformations are firstly determined by the length of the loops and, secondly, by the presence of key residues at certain positions in the loops and in the frame regions which determine the conformation through their folding, the hydrogen bonds or the capacity to assume conformations. unusual main chain.

Dans le présent contexte, le terme « CDR » ou « région déterminant la complémentarité » décrit les sites de combinaison d'antigène non contigus retrouvés à l'intérieur de la région variable à la fois des polypeptides de la chaîne lourde et de la chaîne légère. Ces régions particulières ont été décrites par Kabat et al., J. Biol. Chem. 252, 6609-6616, 1977, par Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991, par Chothia et al., J. Mol. Biol. 196, 901-917, 1987, and par MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262, 732-745, 1996, dans lesquelles les définitions comprennent des résidus d'acides aminés se chevauchant ou des sous-ensembles de résidus d'acides aminés lorsqu'ils sont comparés les uns aux autres. Les résidus d'acides aminés qui englobent les CDR, telles qu'elles sont définies par chacune des références susmentionnées, sont décrits pour la comparaison. De préférence, le terme « CDR » est une CDR telle que définie par Kabat en se basant sur les comparaisons de séquences.In the present context, the term “CDR” or “complementarity determining region” describes the non-contiguous antigen combination sites found within the variable region of both the heavy chain and the light chain polypeptides. . These particular regions have been described by Kabat et al., J. Biol. Chem. 252, 6609-6616, 1977, by Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991, by Chothia et al., J. Mol. Biol. 196, 901-917, 1987, and by MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262, 732-745, 1996, wherein the definitions include overlapping amino acid residues or subsets of amino acid residues when compared to each other. Amino acid residues which encompass the CDRs, as defined by each of the above references, are described for comparison. Preferably, the term "CDR" is a CDR as defined by Kabat based on the sequence comparisons.

Tableau 1 : Définitions des CDR.Table 1: Definitions of CDRs.

Définitions des CDR CDR definitions Kabat ' Kabat ' Chothi Chothi MacCa Macca V_H V _H 31-35 31-35 26-32 26-32 30-35 30-35 V_H V _H 50-65 50-65 53-55 53-55 47-58 47-58 V_H V _H 95-102 95-102 96-101 96-101 93-101 93-101 V_l V _l 24-34 24-34 26-32 26-32 30-36 30-36 V_l V _l 50-56 50-56 50-52 50-52 46-55 46-55 V_l V _l 89-97 89-97 91-96 91-96 89-96 89-96

¹La numérotation des résidus suit la nomenclature de Kabat et al., supra ²La numérotation des résidus suit la nomenclature de Chothia et al., supra ³La numérotation des résidus suit la nomenclature de MacCallum et al., supra ¹ The numbering of residues follows the nomenclature of Kabat et al., Supra ² The numbering of residues follows the nomenclature of Chothia et al., Supra ³ The numbering of residues follows the nomenclature of MacCallum et al., Supra

Dans le présent contexte, le terme « région cadre » ou « région FR » comprend les résidus d'acides aminés qui font partie de la région variable, mais qui ne font pas partie des CDR (par ex., enIn the present context, the term "framework region" or "FR region" includes amino acid residues that are part of the variable region, but which are not part of the CDRs (eg, in

BE2017/5535 utilisant la définition de Kabat des CDR). Par conséquent, un cadre de région variable a une longueur d'environ 100 à 120 acides aminés mais comprend seulement les acides aminés à l'extérieur des CDR. Pour l'exemple spécifique d'un domaine variable de chaîne lourde pour les CDR définies selon Kabat et al., la région cadre 1 correspond au domaine de la région variable englobant les acides aminés 1 à 30 ; la région cadre 2 correspond au domaine de la région variable englobant les acides aminés 36 à 49 ; la région cadre 3 correspond au domaine de la région variable englobant les acides aminés 66 à 94 et la région cadre 4 correspond au domaine de la région variable allant des acides aminés 103 jusqu'à la fin de la région variable. Les régions cadres pour la chaîne légère sont séparées de la même façon par chacune de la région variable de la chaîne légère des CDR. De la même façon, en utilisant la définition des CDR donnée par Chothia et al. ou McCallum et al., les limites de la région cadre sont séparées par leur extrémité CDR respective comme il est décrit cidessus. Dans les modes de réalisation préférés, les CDR sont telles que définies par Kabat.BE2017 / 5535 using the Kabat definition of CDR). Therefore, a variable region frame is about 100 to 120 amino acids in length but includes only amino acids outside of the CDRs. For the specific example of a heavy chain variable domain for the CDRs defined according to Kabat et al., The framework region 1 corresponds to the domain of the variable region encompassing amino acids 1 to 30; the framework region 2 corresponds to the domain of the variable region encompassing amino acids 36 to 49; the frame region 3 corresponds to the domain of the variable region including amino acids 66 to 94 and the frame region 4 corresponds to the domain of the variable region ranging from amino acids 103 to the end of the variable region. The framework regions for the light chain are similarly separated by each of the variable region of the light chain of the CDRs. Similarly, using the definition of CDR given by Chothia et al. or McCallum et al., the boundaries of the framework region are separated by their respective CDR ends as described above. In the preferred embodiments, the CDRs are as defined by Kabat.

Dans les anticorps naturels, les six CDR présentes sur chaque anticorps monomérique sont des séquences courtes, non contiguës d'acides aminés qui sont spécifiquement positionnées pour former le site de liaison à l'antigène lorsque l'anticorps assume sa configuration tridimensionnelle dans un environnement aqueux. Le reste des domaines variables de chaînes lourdes et légères démontrent moins de variabilités intermoléculaires au niveau de la séquence d'acides aminés et sont appelés les régions cadre. Les régions cadre adoptent largement une conformation en feuille ß et les CDR forment des boucles qui relient, et dans certains cas font partie de, la structure en feuille ß. Ainsi, ces régions cadre agissent pour former un échafaudage qui permet le positionnement des six CDR dans une bonne orientation par des interactions interchaînes, non covalentes. Le site de liaison à l'antigène formé par les CDR positionnées définit une surface complémentaire à l'épitope sur l'antigène immunoréactif. Cette surface complémentaire promeut la liaison non covalente de l'anticorps à l'épitope de l'antigène immunoréactif. La position des CDR peut être facilement identifiée par un homme du métier.In natural antibodies, the six CDRs present on each monomeric antibody are short, non-contiguous amino acid sequences that are specifically positioned to form the antigen binding site when the antibody assumes its three-dimensional configuration in an aqueous environment . The rest of the heavy and light chain variable domains demonstrate less intermolecular variability in the amino acid sequence and are called the framework regions. The frame regions largely adopt a ß-sheet conformation and the CDRs form loops which connect, and in some cases are part of, the ß-sheet structure. Thus, these framework regions act to form a scaffold which allows the positioning of the six CDRs in a good orientation by interchain interactions, not covalent. The antigen binding site formed by the positioned CDRs defines a surface complementary to the epitope on the immunoreactive antigen. This complementary surface promotes the non-covalent binding of the antibody to the epitope of the immunoreactive antigen. The position of the CDRs can be easily identified by a person skilled in the art.

Dans le présent contexte, le terme « fragment » décrit une partie ou une portion d'un anticorps ou d'une chaîne d'anticorps comprenant moins de résidus d'acides aminés qu'un anticorps ou qu'une chaîne d'anticorps intacte ou complète. Le terme « fragment de liaison à l'antigène » décrit un fragment de polypeptide d'une immunoglobuline ou d'un anticorps qui se lie à l'antigène ou qui entre en compétition avec l'anticorps intact (c.-à-d., avec l'anticorps intact duquel il est dérivé) pour la liaison à l'antigène (c.-à-d., la liaison spécifique à TIGIT). Dans le présent contexte, le terme « fragment » d'une molécule d'anticorps comprend des fragments de liaison à l'antigène des anticorps, par ex., un domaine variable de la chaîne légère d'un anticorps (VL), un domaine variable de la chaîne lourde d'un anticorps (VH), un anticorps à chaîne unique (scFv), un fragment F(abj2, un fragment Fab, un fragment Fd, un fragment Fv et un fragment d'anticorps à domaine unique (DAb). Les fragments peuvent être obtenus, par ex., par traitement chimique ou enzymatique d'un anticorps ou d'une chaîne d'anticorps intacte ou complète par des moyens de recombinaison.In the present context, the term “fragment” describes a part or a portion of an antibody or of an antibody chain comprising less amino acid residues than an antibody or than an intact antibody chain or complete. The term "antigen binding fragment" describes a polypeptide fragment of an immunoglobulin or an antibody which binds to the antigen or which competes with the intact antibody (i.e. , with the intact antibody from which it is derived) for binding to the antigen (i.e., specific binding to TIGIT). In the present context, the term "fragment" of an antibody molecule includes fragments of the antibody antigen binding, eg, a variable domain of the light chain of an antibody (VL), a domain antibody heavy chain variable (VH), single chain antibody (scFv), F fragment (abj2, Fab fragment, Fd fragment, Fv fragment and single domain antibody fragment (DAb Fragments can be obtained, eg, by chemical or enzymatic treatment of an antibody or an intact or complete antibody chain by recombinant means.

BE2017/5535BE2017 / 5535

Dans le présent contexte, le terme « valence » décrit le nombre de sites de liaison cibles potentiels dans un polypeptide. Chaque site de liaison cible se lie spécifiquement à une molécule cible ou à un site spécifique sur une molécule cible. Lorsqu'un polypeptide contient plusieurs sites de liaison cibles, chaque site de liaison cible peut spécifiquement se lier à la même molécule ou à des molécules différentes (par ex., peut se lier à des ligands différents ou des antigènes différents, ou différents épitopes sur le même antigène). Les molécules de liaison de l'objet de la présente invention ont au moins un site spécifique de liaison pour TIGIT.In the present context, the term "valence" describes the number of potential target binding sites in a polypeptide. Each target binding site specifically binds to a target molecule or to a specific site on a target molecule. When a polypeptide contains multiple target binding sites, each target binding site may specifically bind to the same molecule or to different molecules (e.g., may bind to different ligands or different antigens, or different epitopes on the same antigen). The binding molecules of the subject of the present invention have at least one specific binding site for TIGIT.

Dans le présent contexte, le terme « spécificité » décrit la capacité de lier (par ex., de réagir immunologiquement avec) une cible donnée, par ex., TIGIT. Un polypeptide peut être monospécifique et contenir un ou plusieurs sites de liaison qui se lient spécifiquement à une cible ou un polypeptide peut être multispécifique et contient deux ou plusieurs sites de liaison qui se lient spécifiquement à la même cible ou à des cibles différentes. Dans un mode de réalisation, un anticorps de l'invention est spécifique pour plusieurs cibles. Par exemple, dans ce mode de réalisation, une molécule de liaison multispécifique de l'invention se lie au TIGIT et à une seconde molécule cible. Dans ce contexte, la seconde molécule cible est une molécule autre que le TIGIT.In the present context, the term "specificity" describes the ability to bind (eg, to react immunologically with) a given target, eg, TIGIT. A polypeptide can be monospecific and contain one or more binding sites which specifically bind to a target or a polypeptide can be multispecific and contains two or more binding sites which specifically bind to the same target or to different targets. In one embodiment, an antibody of the invention is specific for several targets. For example, in this embodiment, a multispecies binding molecule of the invention binds to TIGIT and to a second target molecule. In this context, the second target molecule is a molecule other than TIGIT.

Dans le présent contexte, le terme « synthétique » par rapport aux polypeptides comprend des polypeptides qui comprennent une séquence d'acides aminés qui n'est pas naturelle. Par exemple, des polypeptides artificiels qui sont des formes modifiées de polypeptides naturels (par ex., comprenant une mutation telle qu'une addition, une substitution ou une délétion) ou qui comprennent une première séquence d'acides aminés (qui peut être naturelle ou artificielle) qui est liée dans une séquence linéaire d'acides aminés à une seconde séquence d'acides aminés (qui peut être naturelle ou artificielle) à laquelle elle n'est pas naturellement liée dans la nature.In the present context, the term "synthetic" with respect to polypeptides includes polypeptides which include an unnatural amino acid sequence. For example, artificial polypeptides which are modified forms of natural polypeptides (eg, comprising a mutation such as addition, substitution or deletion) or which comprise a first amino acid sequence (which may be natural or artificial) which is linked in a linear amino acid sequence to a second amino acid sequence (which may be natural or artificial) to which it is not naturally linked in nature.

Dans le présent contexte, le terme « modifié » comprend la manipulation des molécules d'acides nucléiques ou de polypeptides par des moyens synthétiques (par ex., des techniques recombinantes, la synthèse peptidique in vitro, le couplage enzymatique ou chimique des peptides ou certaines combinaisons de ces techniques). De préférence, les anticorps de l'invention ont été modifiés pour améliorer une ou plusieurs propriétés, telles que la liaison à l'antigène, la stabilité/la demi-vie ou la fonction effectrice.In the present context, the term "modified" includes the manipulation of nucleic acid or polypeptide molecules by synthetic means (eg, recombinant techniques, in vitro peptide synthesis, enzymatic or chemical coupling of peptides, or certain combinations of these techniques). Preferably, the antibodies of the invention have been modified to improve one or more properties, such as antigen binding, stability / half-life or effector function.

Dans le présent contexte, le terme « anticorps modifié » comprend des formes synthétiques des anticorps qui sont modifiées de sorte qu'elles ne sont pas naturelles, par ex., des anticorps qui comprennent au moins deux parties de chaîne lourde mais pas deux chaînes lourdes complètes (tels que, anticorps ou miniscorps à domaine supprimé) ; des formes multispécifiques d'anticorps (par ex., bispécifique, trispécifique, etc.) modifiées pour se lier à deux ou plusieurs antigènes différents ou à des épitopes différents sur un antigène unique ; des molécules de chaîne lourde liées aux molécules scFv, etc. Les molécules scFv sont connues dans le domaine et sont décrites, par ex., dans le brevet américain 5,892,019. En outre, le terme « anticorps modifié » comprend des formes multivalentes des anticorps (par ex., trivalent, tétravalant, etc., des anticorps qui se lient à deux ou plusieurs copies duIn the present context, the term "modified antibody" includes synthetic forms of the antibodies which are modified so that they are unnatural, eg, antibodies which comprise at least two parts of heavy chain but not two heavy chains complete (such as antibody or minibody with deleted domain); multispecific forms of antibodies (eg, bispecific, trispecific, etc.) modified to bind to two or more different antigens or to different epitopes on a single antigen; heavy chain molecules linked to scFv molecules, etc. ScFv molecules are known in the art and are described, e.g., in U.S. Patent 5,892,019. In addition, the term "modified antibody" includes multivalent forms of the antibodies (eg, trivalent, tetravalant, etc., antibodies which bind to two or more copies of the

BE2017/5535 même antigène). Dans un autre mode de réalisation, un anticorps modifié de l'invention est une protéine de fusion comprenant au moins une partie de chaîne lourde ne contenant pas le domaine CH2 et comprenant un domaine de liaison d'un polypeptide comprenant la partie de liaison d'un membre d'une paire de ligands de récepteur.BE2017 / 5535 same antigen). In another embodiment, a modified antibody of the invention is a fusion protein comprising at least one heavy chain portion not containing the CH2 domain and comprising a binding domain of a polypeptide comprising the binding portion a member of a pair of receptor ligands.

Le terme « anticorps modifié » peut également être utilisé ici pour décrire les variants de la séquence d'acides aminés d'un anticorps TIGIT de l'invention. Un homme de métier comprendra qu'un anticorps TIGIT de l'invention peut être modifié pour produire un anticorps TIGIT variant qui varie au niveau de la séquence d'acides aminés en comparaison à l'anticorps TIGIT duquel il a été dérivé. Par exemple, des substitutions de nucléotides ou d'acides aminés conduisant à des substitutions ou des changements conservateurs au niveau des résidus d'acides aminés « non essentiels » peuvent être réalisées (par ex., dans les résidus de la CDR et/ou du cadre). Les substitutions d'acides aminés peuvent comprendre le remplacement d'un ou de plusieurs acides aminés par un acide aminé naturel ou artificiel.The term "modified antibody" can also be used herein to describe variants of the amino acid sequence of a TIGIT antibody of the invention. Those skilled in the art will understand that a TIGIT antibody of the invention can be modified to produce a variant TIGIT antibody which varies in the amino acid sequence compared to the TIGIT antibody from which it was derived. For example, nucleotide or amino acid substitutions leading to conservative substitutions or changes in "nonessential" amino acid residues can be made (eg, in CDR and / or frame). Amino acid substitutions may include the replacement of one or more amino acids with a natural or artificial amino acid.

Le terme « variant de la lignée germinale » est utilisé ici pour décrire spécifiquement les variants dans lesquels les substitutions entraînent un remplacement d'un ou de plusieurs résidus d'acides aminés présents à une ou à des positions données dans le domaine VH ou VL d'un anticorps TIGIT de l'invention avec un résidu d'acide aminé qui se trouve à une position équivalente dans un domaine VH ou VL humain de référence codé par la lignée germinale humaine. Généralement, pour un quelconque « variant de la lignée germinale », les résidus d'acides aminés de remplacement substitués dans le variant de la lignée germinale sont pris exclusivement, ou essentiellement, à partir d'un domaine VH ou VL unique codé par la lignée germinale humaine.The term “variant of the germ line” is used here to specifically describe the variants in which the substitutions result in the replacement of one or more amino acid residues present at one or at given positions in the VH or VL d domain. 'A TIGIT antibody of the invention with an amino acid residue which is at an equivalent position in a reference human VH or VL domain encoded by the human germ line. Generally, for any "variant of the germ line", the substituted amino acid residues substituted in the variant of the germ line are taken exclusively, or essentially, from a single VH or VL domain encoded by the line human germ.

Dans le présent contexte, le terme « variant d'affinité » décrit un anticorps variant qui démontre un ou plusieurs changements au niveau de la séquence d'acides aminés en comparaison à un anticorps TIGIT de référence de l'invention, dans lequel le variant d'affinité démontre une affinité altérée pour le TIGIT en comparaison à l'anticorps de référence. De préférence, le variant d'affinité démontrera une affinité améliorée pour TIGIT, en comparaison à l'anticorps TIGIT de référence. L'amélioration peut être apparente sous forme d'une KD inférieure pour TIGIT, ou une vitesse de dissociation plus lente pour TIGIT. Les variants d'affinité démontrent généralement un ou plusieurs changements dans la séquence d'acides aminés dans les CDR, en comparaison à l'anticorps TIGIT de référence. De telles substitutions peuvent entraîner le remplacement de l'acide aminé originel présent à une position donnée dans les CDR par un résidu d'acide aminé différent, qui peut être un résidu d'acide aminé naturel ou un résidu d'acide aminé artificiel. Les substitutions d'acides aminés peuvent être conservatrices ou non conservatrices.In the present context, the term “affinity variant” describes a variant antibody which demonstrates one or more changes in the amino acid sequence in comparison with a reference TIGIT antibody of the invention, in which the variant d affinity demonstrates an altered affinity for TIGIT compared to the reference antibody. Preferably, the affinity variant will demonstrate an improved affinity for TIGIT, compared to the reference TIGIT antibody. The improvement may be apparent in the form of a lower KD for TIGIT, or a slower dissociation rate for TIGIT. Affinity variants generally demonstrate one or more changes in the amino acid sequence in CDRs, compared to the reference TIGIT antibody. Such substitutions may result in the replacement of the original amino acid present at a given position in the CDRs with a different amino acid residue, which may be a natural amino acid residue or an artificial amino acid residue. Amino acid substitutions can be conservative or non-conservative.

Dans le présent contexte, le terme « affinité » ou « affinité de liaison » doit être compris en se basant sur la signification habituelle dans le domaine dans le contexte de la liaison des anticorps, et reflète la solidité et/ou la stabilité de la liaison entre un antigène et un site de liaison sur un anticorps ou un fragment de liaison à l'antigène de celui-ci.In the present context, the term "affinity" or "binding affinity" should be understood based on the usual meaning in the field in the context of antibody binding, and reflects the strength and / or stability of the binding between an antigen and a binding site on an antibody or an antigen binding fragment thereof.

BE2017/5535BE2017 / 5535

Les anticorps anti-TIGIT décrits ici sont caractérisés par une liaison à haute affinité à TIGIT humain. L'affinité de liaison pour TIGIT peut être évaluée à l'aide de techniques standards connues des spécialistes du domaine.The anti-TIGIT antibodies described here are characterized by a high affinity binding to human TIGIT. The binding affinity for TIGIT can be assessed using standard techniques known to those skilled in the art.

L'affinité de liaison peut également être exprimée sous forme de constante de dissociation pour un anticorps donné, ou la K_D. Plus la valeur de la K_D est faible, plus forte sera l'interaction de liaison entre un anticorps et son antigène cible. Dans un mode de réalisation, l'affinité de liaison d'un clone de Fab comprenant un appariement VH/VL défini peut être évaluée à l'aide de méthodes connues dans le domaine, par ex., par le système ForteBio™, par la titration à l'équilibre de la solution MSD (SET) ou par la résonance plasmonique de surface, par ex., en utilisant le système Biacore™ comme il est décrit dans les exemples ci-joints. Les fragments Fab des anticorps selon l'invention démontrent généralement une K_D pour le TIGIT mesurée par ForteBio™ dans la fourchette allant de 1 x 1O'¹⁰ à 5 x 10'⁸ M, éventuellement 7 x 1O'¹⁰ à 4 x 10'⁸ M. Une KD dans cette fourchette peut être prise comme une indication que le Fab, et un mAb correspondant divalent, démontrent une liaison à haute affinité pour le hTIGIT. Les mAbs divalents comprenant deux Fab (individuellement) démontrant une KD pour le hTIGIT dans les fourchettes mentionnées sont aussi prises pour démontrer une liaison à haute affinité pour le hTIGIT. Une MSD KD dans la fourchette allant de 1 x 10'¹¹ à 5 x 10'⁹, éventuellement 2 x 10'¹¹ à 1 x 10'⁹ peut être prise comme une indication d'une liaison à haute affinité au hTIGIT. Les fragments Fab des anticorps selon l'invention démontrent généralement une KD pour le TIGIT mesurée par Biacore™ dans la fourchette allant de 1 x 1O'¹⁰ M à 1 x 1O'¹⁰ M, éventuellement 2 x 10'¹°à 7 x 1O'¹⁰ M. Une K_D dans cette fourchette peut être prise comme une indication que le Fab, et un mAb correspondant divalent, démontrent une liaison à haute affinité pour hTIGIT.Binding affinity can also be expressed as a dissociation constant for a given antibody, or K _D. The lower the K _D value, the stronger the binding interaction between an antibody and its target antigen. In one embodiment, the binding affinity of a Fab clone comprising a defined VH / VL pairing can be assessed using methods known in the art, e.g., by the ForteBio ™ system, by equilibration titration of the MSD solution (SET) or by surface plasmon resonance, eg using the Biacore ™ system as described in the examples attached. The Fab fragments of the antibodies according to the invention generally demonstrate a K _D for the TIGIT measured by ForteBio ™ in the range going from 1 × 10 ^'10 to 5 × 10' ⁸ M, possibly 7 × 10 ^'10 to 4 × 10' ⁸ M. A KD in this range can be taken as an indication that the Fab, and a corresponding divalent mAb, demonstrate a high affinity binding for hTIGIT. Divalent mAbs comprising two Fabs (individually) demonstrating a KD for hTIGIT in the ranges mentioned are also taken to demonstrate a high affinity binding for hTIGIT. MSD a KD in the range of 1 x 10 ^'11 5 x 10' ^9, possibly 2 x 10 ^'11 to 1 x 10' ⁹ can be taken as an indication of a high affinity binding to hTIGIT. The Fab fragments of the antibodies according to the invention generally demonstrate a KD for the TIGIT measured by Biacore ™ in the range going from 1 x 10 ^'10 M to 1 x 10' ¹⁰ M, possibly 2 x 10 ' ¹ ° to 7 x 10 ^'10 M. A K _D in this range can be taken as an indication that the Fab, and a corresponding divalent mAb, demonstrate a high affinity binding for hTIGIT.

L'affinité de liaison à TIGIT humain peut également être évaluée en utilisant un système à base de cellules comme il est décrit dans les exemples ci-joints, dans lesquels les mAbs sont testés pour la liaison à des cellules de mammifères (lignées cellulaires ou cellules ex vivo qui expriment TIGIT), par ex., à l'aide d'un ELISA ou de la cytométrie de flux. Une affinité élevée pour TIGIT peut être indiquée, par ex., par une CE₅₀ inférieure ou égale à 0,5 nM par une analyse de cytométrie de flux (par ex., FACS) telle que celle décrite dans l'Exemple 10. Dans certains modes de réalisation, les anticorps de l'invention démontrent une CE₅₀ de liaison à la cellule inférieure ou égale à 0,5 nM, éventuellement inférieure ou égale à 0,2 nM. La détermination de l'affinité basée sur les cellules exprimées sous forme de CE₅₀ est préférablement réalisée en utilisant des cellules Jurkat exprimant le hTIGIT ou des lymphocytes T CD8⁺ primaires provenant de cellules mononucléaires du sang périphérique humain (PBMC).Binding affinity to human TIGIT can also be assessed using a cell-based system as described in the attached examples, in which the mAbs are tested for binding to mammalian cells (cell lines or cells ex vivo which express TIGIT), e.g. using ELISA or flow cytometry. A high affinity for TIGIT can be indicated, for example, by an EC ₅₀ less than or equal to 0.5 nM by a flow cytometry analysis (for example, FACS) such as that described in Example 10. In certain embodiments, the antibodies of the invention demonstrate an EC ₅₀ of binding to the cell less than or equal to 0.5 nM, possibly less than or equal to 0.2 nM. The determination of the affinity based on the cells expressed in the form of EC ₅₀ is preferably carried out using Jurkat cells expressing hTIGIT or primary CD8 ⁺ T lymphocytes originating from human peripheral blood mononuclear cells (PBMC).

Dans le présent contexte, les « cellules Treg », ou simplement les « Tregs », décrivent des lymphocytes T CD4+ régulateurs, c.-à-d., des lymphocytes T qui diminuent la ou les fonctions effectrices des lymphocytes T conventionnels (lymphocytes T CD8⁺ ou CD4⁺). Les Tregs peuvent être identifiées selon les méthodes connues dans le domaine, par ex., en utilisant la cytométrie de flux pour identifier les cellules CD4 exprimant des niveaux élevés de CD25 et de faibles niveaux ou l'absence de CD127.In the present context, "Treg cells", or simply "Tregs", describe regulatory CD4 + T cells, ie, T cells which decrease the effector (s) of conventional T cells (T cells CD8 ⁺ or CD4 ⁺ ). Tregs can be identified by methods known in the art, e.g., using flow cytometry to identify CD4 cells expressing high levels of CD25 and low levels or the absence of CD127.

BE2017/5535BE2017 / 5535

Comme il a été résumé ci-dessus, l'invention concerne, au moins en partie, les anticorps et les fragments de liaison à l'antigène de ceux-ci, qui se lient à TIGIT. Les propriétés et les caractéristiques des anticorps TIGIT, et les fragments d'anticorps selon l'invention seront maintenant décrites avec plus de détails.As summarized above, the invention relates, at least in part, to the antibodies and antigen binding fragments thereof, which bind to TIGIT. The properties and characteristics of the TIGIT antibodies, and the antibody fragments according to the invention will now be described in more detail.

Dans un aspect, la présente invention décrit un anticorps isolé ou un fragment de liaison à l'antigène de celui-ci qui se lie à TIGIT humain qui comprend un domaine variable de la chaîne lourde comprenant une chaîne lourde CDR1 (HCDR1), une chaîne lourde CDR2 (HCDR2) et une chaîne lourde CDR3 (HCDR3) choisies parmi les séquences HCDR1, HCDR2 et HCDR3 illustrées dans la Figure 1 et qui comprend également un domaine variable de la chaîne légère comprenant une chaîne légère CDR1 (LCDR1), une chaîne légère CDR2 (LCDR2) et une chaîne légère CDR3 (LCDR3) choisies parmi les séquences LCDR1, LCDR2 et LCDR3 illustrées dans la Figure 2. C'est-à-dire, l'invention décrit un anticorps isolé ou un fragment de liaison à l'antigène de celui-ci qui se lie au TIGIT humain et qui comprend un domaine variable de chaîne lourde comprenant une chaîne lourde CDR1 (HCDR1), une chaîne lourde CDR2 (HCDR2) et une chaîne lourde CDR3 (HCDR3), dans lequel :In one aspect, the present invention describes an isolated antibody or an antigen binding fragment thereof which binds to human TIGIT which comprises a heavy chain variable domain comprising a heavy chain CDR1 (HCDR1), a chain heavy CDR2 (HCDR2) and a heavy chain CDR3 (HCDR3) chosen from the sequences HCDR1, HCDR2 and HCDR3 illustrated in FIG. 1 and which also comprises a variable domain of the light chain comprising a light chain CDR1 (LCDR1), a light chain CDR2 (LCDR2) and a CDR3 light chain (LCDR3) selected from the sequences LCDR1, LCDR2 and LCDR3 illustrated in Figure 2. That is, the invention describes an isolated antibody or a binding fragment antigen thereof which binds to human TIGIT and which comprises a heavy chain variable domain comprising a CDR1 heavy chain (HCDR1), a CDR2 heavy chain (HCDR2) and a CDR3 heavy chain (HCDR3), in which:

(i) HCDR1 est choisie dans le groupe composé des SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22,(i) HCDR1 is chosen from the group composed of SEQ ID NOs: 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22,

25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 271,274 et 277 ;25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 271, 274 and 277;

(ii) HCDR2 est choisie dans le groupe composé des SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23,(ii) HCDR2 is chosen from the group composed of SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23,

26, 29, 32, 35, 38, 41,44, 272, 275 et 278 ;26, 29, 32, 35, 38, 41.44, 272, 275 and 278;

(iii) HCDR3 est choisie dans le groupe composé des SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24,(iii) HCDR3 is chosen from the group composed of SEQ ID NOs: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24,

27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 273, 276 et 279 ;27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 273, 276 and 279;

et qui comprend également un domaine variable de chaîne légère comprenant une chaîne légère CDR1 (LCDR1), une chaîne légère CDR2 (LCDR2) et une chaîne légère CDR3 (LCDR3), dans lequel (iv) LCDR1 est choisie dans le groupe composé des SEQ ID NO: 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64,and which also comprises a light chain variable domain comprising a CDR1 light chain (LCDR1), a CDR2 light chain (LCDR2) and a CDR3 light chain (LCDR3), in which (iv) LCDR1 is chosen from the group consisting of SEQ IDs NO: 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64,

67, 70, 73, 76, 79, 82, 85, 88, 283, 286 et 289 ;67, 70, 73, 76, 79, 82, 85, 88, 283, 286 and 289;

(v) LCDR2 est choisie dans le groupe composé des SEQ ID NO: 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65,(v) LCDR2 is chosen from the group composed of SEQ ID NOs: 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65,

68, 71, 74, 77, 80, 83, 86, 89, 284, 287 et 290 ; et (vi) LCDR3 est choisie dans le groupe composé des SEQ ID NO: 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66,68, 71, 74, 77, 80, 83, 86, 89, 284, 287 and 290; and (vi) LCDR3 is chosen from the group consisting of SEQ ID NOs: 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66,

69, 72, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 285, 288 et 291.69, 72, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 285, 288 and 291.

Un quelconque anticorps anti-TIGIT ou un fragment de liaison à l'antigène de celui-ci comprenant un domaine VH apparié avec un domaine VL pour former un site de liaison pour l'antigène (TIGIT humain) comprendra une combinaison de six CDR : chaîne lourde variable CDR3 (HCDR3), chaîne lourde variable CDR2 (HCDR2), chaîne lourde variable CDR1 (HCDR1), chaîne légère variable CDR3 (LCDR3), chaîne légère variable CDR2 (LCDR2) et chaîne légère variableAny anti-TIGIT antibody or an antigen binding fragment thereof comprising a VH domain paired with a VL domain to form an antigen binding site (human TIGIT) will comprise a combination of six CDRs: chain CDR3 variable heavy (HCDR3), CDR2 variable heavy chain (HCDR2), CDR1 variable heavy chain (HCDR1), CDR3 variable light chain (LCDR3), CDR2 variable light chain (LCDR2) and variable light chain

BE2017/5535 CDR1 (LCDR1). Même si beaucoup de combinaisons différentes des six CDR choisies parmi les groupes de séquences de CDR énumérés ci-dessus sont permises, et dans la portée de l'invention, certaines combinaisons des six CDR sont particulièrement préférées ; celles-ci étant les combinaisons « natives » à l'intérieur d'un mAb unique démontrant une haute affinité de liaison au TIGIT humain. Dans certains modes de réalisation, l'anticorps ou le fragment de liaison à l'antigène comprend une combinaison de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 et LCDR3, dans lesquels la combinaison est choisie dans le groupe des combinaisons formées par les HCDR provenant de chaque anticorps de la Figure 1 pris avec les LCDR de l'anticorps correspondant de la Figure 2. C'est-à-dire, dans certains modes de réalisation, l'anticorps ou le fragment de liaison à l'antigène comprend une combinaison de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 et LCDR3, dans lequel la combinaison est choisie dans le groupe composé de :BE2017 / 5535 CDR1 (LCDR1). Although many different combinations of the six CDRs selected from the groups of CDR sequences listed above are permitted, and within the scope of the invention, certain combinations of the six CDRs are particularly preferred; these being the “native” combinations within a single mAb demonstrating a high affinity for binding to human TIGIT. In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment comprises a combination of HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 and LCDR3, in which the combination is selected from the group of combinations formed by HCDRs from of each antibody of Figure 1 taken with the LCDRs of the corresponding antibody of Figure 2. That is, in some embodiments, the antibody or the antigen binding fragment comprises a combination of HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 and LCDR3, in which the combination is chosen from the group consisting of:

(i) HCDR1 comprenant la SEQ ID NO:1, HCDR2 comprenant la SEQ ID NO:2, HCDR3 comprenant la SEQ ID NO:3, LCDR1 comprenant la SEQ ID NO:46, LCDR2 comprenant la SEQ ID NO :47 et LCDR3 comprenant la SEQ ID NO:48 ;(i) HCDR1 comprising SEQ ID NO: 1, HCDR2 comprising SEQ ID NO: 2, HCDR3 comprising SEQ ID NO: 3, LCDR1 comprising SEQ ID NO: 46, LCDR2 comprising SEQ ID NO: 47 and LCDR3 comprising SEQ ID NO: 48;

(ii) HCDR1 comprenant la SEQ ID NO:4, HCDR2 comprenant la SEQ ID NO:5, HCDR3 comprenant la SEQ ID NO:6, LCDR1 comprenant la SEQ ID NO:49, LCDR2 comprenant la SEQ ID NO:50 et LCDR3 comprenant la SEQ ID NO:51 ;(ii) HCDR1 comprising SEQ ID NO: 4, HCDR2 comprising SEQ ID NO: 5, HCDR3 comprising SEQ ID NO: 6, LCDR1 comprising SEQ ID NO: 49, LCDR2 comprising SEQ ID NO: 50 and LCDR3 comprising SEQ ID NO: 51;

(iii) HCDR1 comprenant la SEQ ID NO:7, HCDR2 comprenant la SEQ ID NO:8, HCDR3 comprenant la SEQ ID NO:9, LCDR1 comprenant la SEQ ID NO:52, LCDR2 comprenant la SEQ ID NO:53 et LCDR3 comprenant la SEQ ID NO:54 ;(iii) HCDR1 comprising SEQ ID NO: 7, HCDR2 comprising SEQ ID NO: 8, HCDR3 comprising SEQ ID NO: 9, LCDR1 comprising SEQ ID NO: 52, LCDR2 comprising SEQ ID NO: 53 and LCDR3 comprising SEQ ID NO: 54;

(iv) HCDR1 comprenant la SEQ ID NO: 10, HCDR2 comprenant la SEQ ID NO:11, HCDR3 comprenant la SEQ ID NO:12, LCDR1 comprenant la SEQ ID NO:55, LCDR2 comprenant la SEQ ID NO:56 et LCDR3 comprenant la SEQ ID NO:57 ;(iv) HCDR1 comprising SEQ ID NO: 10, HCDR2 comprising SEQ ID NO: 11, HCDR3 comprising SEQ ID NO: 12, LCDR1 comprising SEQ ID NO: 55, LCDR2 comprising SEQ ID NO: 56 and LCDR3 comprising SEQ ID NO: 57;

(v) HCDR1 comprenant la SEQ ID NO:13, HCDR2 comprenant la SEQ ID NO:14, HCDR3 comprenant la SEQ ID NO: 15, LCDR1 comprenant la SEQ ID NO:58, LCDR2 comprenant la SEQ ID NO:59 et LCDR3 comprenant la SEQ ID NO:60 ;(v) HCDR1 comprising SEQ ID NO: 13, HCDR2 comprising SEQ ID NO: 14, HCDR3 comprising SEQ ID NO: 15, LCDR1 comprising SEQ ID NO: 58, LCDR2 comprising SEQ ID NO: 59 and LCDR3 comprising SEQ ID NO: 60;

(vi) HCDR1 comprenant la SEQ ID NO: 16, HCDR2 comprenant la SEQ ID NO: 17, HCDR3 comprenant la SEQ ID NO:18, LCDR1 comprenant la SEQ ID NO:61, LCDR2 comprenant la SEQ ID NO:62 et LCDR3 comprenant la SEQ ID NO:63 ;(vi) HCDR1 comprising SEQ ID NO: 16, HCDR2 comprising SEQ ID NO: 17, HCDR3 comprising SEQ ID NO: 18, LCDR1 comprising SEQ ID NO: 61, LCDR2 comprising SEQ ID NO: 62 and LCDR3 comprising SEQ ID NO: 63;

(vii) HCDR1 comprenant la SEQ ID NO: 19, HCDR2 comprenant la SEQ ID NO:20, HCDR3 comprenant la SEQ ID NO:21, LCDR1 comprenant la SEQ ID NO:64, LCDR2 comprenant la SEQ ID NO:65 et LCDR3 comprenant la SEQ ID NO:66 ;(vii) HCDR1 including SEQ ID NO: 19, HCDR2 including SEQ ID NO: 20, HCDR3 including SEQ ID NO: 21, LCDR1 including SEQ ID NO: 64, LCDR2 including SEQ ID NO: 65 and LCDR3 including SEQ ID NO: 66;

BE2017/5535 (viii) HCDR1 comprenant la SEQ ID NO:22, HCDR2 comprenant la SEQ ID NO:23, HCDR3 comprenant la SEQ ID NO:24, LCDR1 comprenant la SEQ ID NO:67, LCDR2 comprenant la SEQ ID NO:68 et LCDR3 comprenant la SEQ ID NO:69 ;BE2017 / 5535 (viii) HCDR1 including SEQ ID NO: 22, HCDR2 including SEQ ID NO: 23, HCDR3 including SEQ ID NO: 24, LCDR1 including SEQ ID NO: 67, LCDR2 including SEQ ID NO: 68 and LCDR3 comprising SEQ ID NO: 69;

(ix) HCDR1 comprenant la SEQ ID NO:25, HCDR2 comprenant la SEQ ID NO:26, HCDR3 comprenant la SEQ ID NO:27, LCDR1 comprenant la SEQ ID NO:70, LCDR2 comprenant la SEQ ID NO:71 et LCDR3 comprenant la SEQ ID NO:72 ;(ix) HCDR1 including SEQ ID NO: 25, HCDR2 including SEQ ID NO: 26, HCDR3 including SEQ ID NO: 27, LCDR1 including SEQ ID NO: 70, LCDR2 including SEQ ID NO: 71 and LCDR3 including SEQ ID NO: 72;

(x) HCDR1 comprenant la SEQ ID NO:28, HCDR2 comprenant la SEQ ID NO:29, HCDR3 comprenant la SEQ ID NO:30, LCDR1 comprenant la SEQ ID NO:73, LCDR2 comprenant la SEQ ID NO:74 et LCDR3 comprenant la SEQ ID NO:75 ;(x) HCDR1 comprising SEQ ID NO: 28, HCDR2 comprising SEQ ID NO: 29, HCDR3 comprising SEQ ID NO: 30, LCDR1 comprising SEQ ID NO: 73, LCDR2 comprising SEQ ID NO: 74 and LCDR3 comprising SEQ ID NO: 75;

(xi) HCDR1 comprenant la SEQ ID NO:31, HCDR2 comprenant la SEQ ID NO:32, HCDR3 comprenant la SEQ ID NO:33, LCDR1 comprenant la SEQ ID NO:76, LCDR2 comprenant la SEQ ID NO:77 et LCDR3 comprenant la SEQ ID NO:78 ;(xi) HCDR1 including SEQ ID NO: 31, HCDR2 including SEQ ID NO: 32, HCDR3 including SEQ ID NO: 33, LCDR1 including SEQ ID NO: 76, LCDR2 including SEQ ID NO: 77 and LCDR3 including SEQ ID NO: 78;

(xii) HCDR1 comprenant la SEQ ID NO:34, HCDR2 comprenant la SEQ ID NO:35, HCDR3 comprenant la SEQ ID NO:36, LCDR1 comprenant la SEQ ID NO:79, LCDR2 comprenant la SEQ ID NO:80 et LCDR3 comprenant la SEQ ID NO:81 ;(xii) HCDR1 comprising SEQ ID NO: 34, HCDR2 comprising SEQ ID NO: 35, HCDR3 comprising SEQ ID NO: 36, LCDR1 comprising SEQ ID NO: 79, LCDR2 comprising SEQ ID NO: 80 and LCDR3 comprising SEQ ID NO: 81;

(xiii) HCDR1 comprenant la SEQ ID NO:37, HCDR2 comprenant la SEQ ID NO:38, HCDR3 comprenant la SEQ ID NO:39, LCDR1 comprenant la SEQ ID NO:82, LCDR2 comprenant la SEQ ID NO:83 et LCDR3 comprenant la SEQ ID NO:84 ;(xiii) HCDR1 including SEQ ID NO: 37, HCDR2 including SEQ ID NO: 38, HCDR3 including SEQ ID NO: 39, LCDR1 including SEQ ID NO: 82, LCDR2 including SEQ ID NO: 83 and LCDR3 including SEQ ID NO: 84;

(xiv) HCDR1 comprenant la SEQ ID NO:40, HCDR2 comprenant la SEQ ID NO:41, HCDR3 comprenant la SEQ ID NO:42, LCDR1 comprenant la SEQ ID NO:85, LCDR2 comprenant la SEQ ID NO:86 et LCDR3 comprenant la SEQ ID NO:87 ;(xiv) HCDR1 comprising SEQ ID NO: 40, HCDR2 comprising SEQ ID NO: 41, HCDR3 comprising SEQ ID NO: 42, LCDR1 comprising SEQ ID NO: 85, LCDR2 comprising SEQ ID NO: 86 and LCDR3 comprising SEQ ID NO: 87;

(xv) HCDR1 comprenant la SEQ ID NO:43, HCDR2 comprenant la SEQ ID NO:44, HCDR3 comprenant la SEQ ID NO:45, LCDR1 comprenant la SEQ ID NO:88, LCDR2 comprenant la SEQ ID NO:89 et LCDR3 comprenant la SEQ ID NO:90 ;(xv) HCDR1 including SEQ ID NO: 43, HCDR2 including SEQ ID NO: 44, HCDR3 including SEQ ID NO: 45, LCDR1 including SEQ ID NO: 88, LCDR2 including SEQ ID NO: 89 and LCDR3 including SEQ ID NO: 90;

(xvi) HCDR1 comprenant la SEQ ID NO:271, HCDR2 comprenant la SEQ ID NO:272, HCDR3 comprenant la SEQ ID NO:273, LCDR1 comprenant la SEQ ID NO:283, LCDR2 comprenant la SEQ ID NO:284 et LCDR3 comprenant la SEQ ID NO:285 ;(xvi) HCDR1 including SEQ ID NO: 271, HCDR2 including SEQ ID NO: 272, HCDR3 including SEQ ID NO: 273, LCDR1 including SEQ ID NO: 283, LCDR2 including SEQ ID NO: 284 and LCDR3 including SEQ ID NO: 285;

(xvii) HCDR1 comprenant la SEQ ID NO:274, HCDR2 comprenant la SEQ ID NO:275, HCDR3 comprenant la SEQ ID NO:276, LCDR1 comprenant la SEQ ID NO:286, LCDR2 comprenant la SEQ ID NO:287 et LCDR3 comprenant la SEQ ID NO:288 ;(xvii) HCDR1 comprising SEQ ID NO: 274, HCDR2 comprising SEQ ID NO: 275, HCDR3 comprising SEQ ID NO: 276, LCDR1 comprising SEQ ID NO: 286, LCDR2 comprising SEQ ID NO: 287 and LCDR3 comprising SEQ ID NO: 288;

(xviii) HCDR1 comprenant la SEQ ID NO:277, HCDR2 comprenant la SEQ ID NO:278,(xviii) HCDR1 comprising SEQ ID NO: 277, HCDR2 comprising SEQ ID NO: 278,

HCDR3 comprenant la SEQ ID NO:279, LCDR1 comprenant la SEQ ID NO:289, LCDR2 comprenant la SEQ ID NQ:290 et LCDR3 comprenant la SEQ ID NO:291.HCDR3 including SEQ ID NO: 279, LCDR1 including SEQ ID NO: 289, LCDR2 including SEQ ID NQ: 290 and LCDR3 including SEQ ID NO: 291.

BE2017/5535BE2017 / 5535

Dans certains modes de réalisation, l'anticorps ou le fragment de liaison à l'antigène comprend un domaine variable de chaîne lourde ayant une séquence d'acides aminés choisie dans le groupe composé des : SEQ ID NO:211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 327, 329 et 331 et des séquences d'acides aminés démontrant une identité de séquence d'au moins 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % à celles-ci ; et, éventuellement, comprend un domaine variable de la chaîne légère ayant une séquence d'acides aminés choisie dans le groupe composé des :séquences d'acides aminés des SEQ ID NO: 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 328, 330 et 332 et des séquences d'acides aminés démontrant une identité de séquence d'au moins 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % à celles-ci.In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment comprises a heavy chain variable domain having an amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 211, 213, 215, 217 , 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 327, 329 and 331 and amino acid sequences demonstrating a sequence identity of at least 90%, 95%, 97%, 98% or 99% to them; and, optionally, comprises a variable domain of the light chain having an amino acid sequence chosen from the group composed of: amino acid sequences of SEQ ID NO: 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 328, 330 and 332 and amino acid sequences demonstrating a sequence identity of at least 90%, 95%, 97%, 98% or 99 % to these.

Même si tous les appariements possibles des domaines VH et des domaines VL choisis parmi les groupes de séquences de domaines VH et VL énumérés ci-dessus sont permis, et dans la portée de l'invention, certaines combinaisons de VH et VL sont particulièrement préférées ; celles-ci étant les combinaisons « natives » à l'intérieur d'un mAb unique démontrant une haute affinité de liaison au TIGIT humain.Even if all the possible pairings of the VH domains and of the VL domains chosen from the VH and VL domain sequence groups listed above are permitted, and within the scope of the invention, certain combinations of VH and VL are particularly preferred; these being the “native” combinations within a single mAb demonstrating a high affinity for binding to human TIGIT.

Dans certains modes de réalisation, l'anticorps ou le fragment de liaison à l'antigène comprend une combinaison d'un domaine variable de la chaîne lourde et d'un domaine variable de la chaîne légère, dans lesquels la combinaison est choisie dans le groupe des combinaisons formées par le VH provenant de chaque anticorps dans la figure 5, ou d'une séquence d'acides aminés démontrant une identité de séquence d'au moins 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % à celle-ci, pris avec le VL du même anticorps dans la Figure 5, ou d'une séquence d'acides aminés démontrant une identité de séquence d'au moins 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % à celle-ci. Dans certains modes de réalisation, l'anticorps ou le fragment de liaison à l'antigène comprend une combinaison d'un domaine variable de chaîne lourde et d'un domaine variable de chaîne légère, dans lequel la combinaison est choisie dans le groupe composé :In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment comprises a combination of a heavy chain variable domain and a light chain variable domain, in which the combination is selected from the group combinations formed by VH from each antibody in Figure 5, or from an amino acid sequence demonstrating a sequence identity of at least 90%, 95%, 97%, 98% or 99% to this ci, taken with the VL of the same antibody in Figure 5, or of an amino acid sequence demonstrating a sequence identity of at least 90%, 95%, 97%, 98% or 99% thereto . In certain embodiments, the antibody or the antigen-binding fragment comprises a combination of a heavy chain variable domain and a light chain variable domain, in which the combination is chosen from the group consisting of:

(i) d'un domaine variable de chaîne lourde comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID NO:211 et d'un domaine variable de chaîne légère comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID NO:212 ;(i) a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 211 and a light chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 212;

(ii) d'un domaine variable de chaîne lourde comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID NO:213 et d'un domaine variable de chaîne légère comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID NO:214 ;(ii) a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 213 and a light chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 214;

(iii) d'un domaine variable de chaîne lourde comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID NO:215 et d'un domaine variable de chaîne légère comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQIDNO:216;(iii) a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 215 and a light chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQIDNO: 216;

(iv) d'un domaine variable de chaîne lourde comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID NO:217 et d'un domaine variable de chaîne légère comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQIDNO:218;(iv) a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 217 and a light chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQIDNO: 218;

BE2017/5535 (v) d'un domaine variable de chaîne lourde comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID NO:219 et d'un domaine variable de chaîne légère comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID NO:220 ;BE2017 / 5535 (v) of a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 219 and of a light chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 220;

(vi) d'un domaine variable de chaîne lourde comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID NO:221 et d'un domaine variable de chaîne légère comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID NO:222 ;(vi) a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 221 and a light chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 222;

(vii) d'un domaine variable de chaîne lourde comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID NO:223 et d'un domaine variable de chaîne légère comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID NO:224 ;(vii) a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 223 and a light chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 224;

(viii) d'un domaine variable de chaîne lourde comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID NO:225 et d'un domaine variable de chaîne légère comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID NO:226 ;(viii) a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 225 and a light chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 226;

(ix) d'un domaine variable de chaîne lourde comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID NO:227 et d'un domaine variable de chaîne légère comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID NO:228 ;(ix) a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 227 and a light chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 228;

(x) d'un domaine variable de chaîne lourde comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID NO:229 et d'un domaine variable de chaîne légère comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID NO:230 ;(x) a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 229 and a light chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 230;

(xi) d'un domaine variable de chaîne lourde comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID NO:231 et d'un domaine variable de chaîne légère comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID NO:232 ;(xi) a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 231 and a light chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 232;

(xii) d'un domaine variable de chaîne lourde comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID NO:233 et d'un domaine variable de chaîne légère comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID NO:234 ;(xii) a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 233 and a light chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 234;

(xiii) d'un domaine variable de chaîne lourde comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID NO:235 et d'un domaine variable de chaîne légère comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID NO:236 ;(xiii) a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 235 and a light chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 236;

(xiv) d'un domaine variable de chaîne lourde comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID NO:237 et d'un domaine variable de chaîne légère comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID NO:238 ;(xiv) a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 237 and a light chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 238;

(xv) d'un domaine variable de chaîne lourde comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID NO:239 et d'un domaine variable de chaîne légère comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID NQ:240 ;(xv) a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 239 and a light chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NQ: 240;

BE2017/5535 (xvi) d'un domaine variable de chaîne lourde comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID NO:327 ou une séquence d'acides aminés identique à au moins 90 % à celle-ci et un domaine variable de chaîne légère comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID NO:328 ou une séquence d'acides aminés identique à au moins 90 % à celle-ci ;BE2017 / 5535 (xvi) of a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 327 or an amino acid sequence identical to at least 90% thereof and a variable domain of light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 328 or an amino acid sequence identical to at least 90% thereof;

(xvii) d'un domaine variable de chaîne lourde comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID NO:329 ou une séquence d'acides aminés identique à au moins 90 % à celle-ci et un domaine variable de chaîne légère comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID NO:330 ou une séquence d'acides aminés identique à au moins 90 % à celle-ci ; et (xviii) d'un domaine variable de chaîne lourde comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID NO:331 ou une séquence d'acides aminés identique à au moins 90 % à celle-ci et un domaine variable de chaîne légère comprenant la séquence d'acides aminés de la SEQ ID NO:332 ou une séquence d'acides aminés identique à au moins 90 % à celle-ci.(xvii) a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 329 or an amino acid sequence identical to at least 90% thereof and a light chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 330 or an amino acid sequence identical to at least 90% thereof; and (xviii) a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 331 or an amino acid sequence identical to at least 90% thereof and a light chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 332 or an amino acid sequence identical to at least 90% thereof.

Pour chacune des combinaisons VH/VL spécifiques énumérées ci-dessus, il est également permis, et dans la portée de l'invention, de combiner un domaine VH ayant une séquence d'acides aminés identique à au moins 90 %, 92 %, 95 %, 97 % ou 99 % à la séquence du domaine VH décrite avec un domaine VL ayant une séquence d'acides aminés identique à au moins 90 %, 92 %, 95 %, 97 % ou 99 % à la séquence du domaine VL décrite. Les modes de réalisation dans lesquels la séquence d'acides aminés du domaine VH démontre une identité de séquence inférieure à 100 % avec une séquence VH de référence donnée, peuvent néanmoins comprendre des CDR de chaîne lourde qui sont identiques aux HCDR1, HCDR2 et HCDR3 de la séquence de référence tout en démontrant une variation au niveau de la séquence d'acides aminés à l'intérieur des régions cadre. De la même façon, les modes de réalisation dans lesquels la séquence d'acides aminés du domaine VL démontre une identité de séquence inférieure à 100 % avec une séquence VL de référence donnée, peuvent néanmoins comprendre des CDR de chaîne légère qui sont identiques aux LCDR1, LCDR2 et LCDR3 de la séquence de référence tout en démontrant une variation au niveau de la séquence d'acides aminés à l'intérieur des régions cadre.For each of the specific VH / VL combinations listed above, it is also permitted, and within the scope of the invention, to combine a VH domain having an amino acid sequence identical to at least 90%, 92%, 95 %, 97% or 99% to the VH domain sequence described with a VL domain having an amino acid sequence identical to at least 90%, 92%, 95%, 97% or 99% to the VL domain sequence described . The embodiments in which the amino acid sequence of the VH domain demonstrates a sequence identity of less than 100% with a given reference VH sequence, may nevertheless include heavy chain CDRs which are identical to HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of the reference sequence while demonstrating variation in the amino acid sequence within the framework regions. Likewise, embodiments in which the amino acid sequence of the VL domain demonstrates a sequence identity of less than 100% with a given reference VL sequence, may nevertheless include light chain CDRs which are identical to LCDR1 , LCDR2 and LCDR3 of the reference sequence while demonstrating a variation in the amino acid sequence within the framework regions.

Dans le paragraphe précédent, et ailleurs dans le présent document, la structure des fragments de liaison aux anticorps/à l'antigène est définie sur la base d'un pourcentage d'identité de séquence avec une séquence de référence décrite (avec une SEQ ID NO donnée). Dans ce contexte, le pourcentage d'identité de séquence entre deux séquences d'acides aminés peut être déterminé par comparaison de ces deux séquences alignées de manière optimale dans laquelle la séquence d'acides aminés à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences. Généralement, la fenêtre deIn the previous paragraph, and elsewhere in this document, the structure of the antibody / antigen binding fragments is defined on the basis of a percentage of sequence identity with a reference sequence described (with an SEQ ID NO given). In this context, the percentage of sequence identity between two amino acid sequences can be determined by comparison of these two optimally aligned sequences in which the amino acid sequence to be compared can comprise additions or deletions with respect to to the reference sequence for optimal alignment between these two sequences. The percentage of identity is calculated by determining the number of identical positions for which the amino acid residue is identical between the two sequences, by dividing this number of identical positions by the total number of positions in the comparison window and by multiplying the result obtained by 100 to obtain the percentage of identity between these two sequences. Generally, the

BE2017/5535 comparaison correspondra à la longueur totale de la séquence qui est comparée. Par exemple, il est possible d'utiliser le programme BLAST, « Blast 2 sequences » (Tatusova et al, « Blast 2 sequences a new tool for comparing protein and nucleotide sequences», FEMS Microbiol Lett. 174:247-250) disponible sur le site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, les paramètres utilisés étant ceux donnés par défaut (en particulier, pour les paramètres de « pénalité pour trous ouverts » : 5, et « pénalité d'extension de trou » : 2 ; la matrice choisie étant, par ex., la matrice « BLOSUM 62 » proposée par le programme), le pourcentage d'identité entre les deux séquences qui doivent être comparées étant calculé directement par le programme. La détermination de l'identité de séquence d'une séquence d'interrogation par rapport à une séquence de référence est dans la capacité du spécialiste et peut être réalisée à l'aide de logiciels d'analyse disponibles dans le commerce, tels que BLAST™.BE2017 / 5535 comparison will be the total length of the sequence being compared. For example, it is possible to use the BLAST program, "Blast 2 sequences" (Tatusova et al, "Blast 2 sequences a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174: 247-250) available on the site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, the parameters used being those given by default (in particular, for the parameters of “penalty for open holes”: 5, and “penalty hole extension ”: 2; the chosen matrix being, for example, the“ BLOSUM 62 ”matrix proposed by the program), the percentage of identity between the two sequences which must be compared being calculated directly by the program. Determining the sequence identity of an interrogation sequence relative to a reference sequence is within the skill of the expert and can be performed using commercially available analysis software, such as BLAST ™ .

Dans certains modes de réalisation préférés, l'anticorps peut comprendre un domaine variable de chaîne lourde et un domaine variable de chaîne légère dans lequel HCDR1 comprend la SEQ ID NO: 16, la HCDR2 comprend la SEQ ID NO: 17, la HCDR3 comprend la SEQ ID NO: 18, et la LCDR1 comprend la SEQ ID NO:61, LCDR2 comprend la SEQ ID NO:62, et la LCDR3 comprend la SEQ ID NO:63. Dans certains modes de réalisation de ce type, le domaine variable de la chaîne lourde peut comprendre la séquence d'acides aminés illustrée comme la SEQ ID NO:221 ou une séquence d'acides aminés démontrant une identité de séquence d'au moins 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % à celle-ci, et le domaine variable de la chaîne légère peut comprendre la séquence d'acides aminés illustrée comme la SEQ ID NO:222 ou une séquence d'acides aminés démontrant une identité de séquence d'au moins 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % à celle-ci.In certain preferred embodiments, the antibody may comprise a heavy chain variable domain and a light chain variable domain in which HCDR1 comprises SEQ ID NO: 16, HCDR2 comprises SEQ ID NO: 17, HCDR3 comprises SEQ ID NO: 18, and the LCDR1 includes the SEQ ID NO: 61, LCDR2 includes the SEQ ID NO: 62, and the LCDR3 includes the SEQ ID NO: 63. In certain embodiments of this type, the variable domain of the heavy chain can comprise the amino acid sequence illustrated as SEQ ID NO: 221 or an amino acid sequence demonstrating a sequence identity of at least 90% , 95%, 97%, 98% or 99% thereof, and the variable domain of the light chain can comprise the amino acid sequence illustrated as SEQ ID NO: 222 or an amino acid sequence demonstrating sequence identity of at least 90%, 95%, 97%, 98% or 99% to it.

Les modes de réalisation dans lesquels la séquence d'acides aminés du domaine VH démontre une identité de séquence inférieure à 100 % avec la séquence illustrée comme la SEQ ID NO:221 peuvent néanmoins comprendre les CDR de chaîne lourde qui sont identiques aux HCDR1, HCDR2 et HCDR3 de la SEQ ID NO:221 (SEQ ID NO:16, 17 et 18, respectivement) tout en démontrant une variation au niveau de la séquence d'acides aminés à l'intérieur des régions cadre. De la même façon, les modes de réalisation dans lesquels la séquence d'acides aminés du domaine VL démontre une identité de séquence inférieure à 100 % avec la séquence illustrée comme la SEQ ID NO:222 peuvent néanmoins comprendre des CDR de chaîne lourde qui sont identiques aux LCDR1, LCDR2 et LCDR3 de la SEQ ID NO:222 (SEQ ID NO: 61, 62 et 63, respectivement) tout en démontrant une variation au niveau de la séquence d'acides aminés à l'intérieur des régions cadre.The embodiments in which the amino acid sequence of the VH domain demonstrates a sequence identity of less than 100% with the sequence illustrated as SEQ ID NO: 221 may nevertheless include the heavy chain CDRs which are identical to HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of SEQ ID NO: 221 (SEQ ID NO: 16, 17 and 18, respectively) while demonstrating variation in the amino acid sequence within the framework regions. Likewise, embodiments in which the amino acid sequence of the VL domain demonstrates a sequence identity of less than 100% with the sequence illustrated as SEQ ID NO: 222 may nevertheless include heavy chain CDRs which are identical to LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of SEQ ID NO: 222 (SEQ ID NO: 61, 62 and 63, respectively) while demonstrating a variation in the amino acid sequence within the framework regions.

Les anticorps TIGIT peuvent prendre la forme de divers modes de réalisation dans lesquels à la fois un domaine VH et un domaine VL sont présents. Le terme «anticorps» est utilisé dans le présent contexte dans sa signification la plus large et englobe, sans limitation, des anticorps monoclonaux (y compris des anticorps monoclonaux de pleine longueur), des anticorps polyclonaux, des anticorps multi-spécifiques (par ex., des anticorps bispécifiques), aussi longtemps qu'ils démontrent la spécificité immunologique appropriée pour une protéine TIGIT humaine. Le terme « anticorps monoclonal », tel qu'il est utilisé ici, se rapporte à un anticorps obtenu à partir d’uneTIGIT antibodies can take the form of various embodiments in which both a VH domain and a VL domain are present. The term "antibody" is used in the present context in its broadest sense and includes, without limitation, monoclonal antibodies (including full-length monoclonal antibodies), polyclonal antibodies, multi-specific antibodies (eg. , bispecific antibodies), as long as they demonstrate the appropriate immunological specificity for a human TIGIT protein. The term "monoclonal antibody", as used herein, refers to an antibody obtained from a

BE2017/5535 population d'anticorps substantiellement homogène, c'est-à-dire que les anticorps individuels formant la population sont identiques à l'exception d'éventuelles mutations d'origine naturelle qui peuvent être présentes dans des quantités mineures. Les anticorps monoclonaux sont hautement spécifiques, étant dirigés contre un site antigénique unique. En outre, contrairement à des préparations d'anticorps classiques (polyclonaux) qui comprennent généralement différents anticorps dirigés contre différents déterminants (épitopes) sur l'antigène, chaque anticorps monoclonal est dirigé contre un seul déterminant ou épitope sur l'antigène.BE2017 / 5535 substantially homogeneous antibody population, that is to say that the individual antibodies forming the population are identical except for possible mutations of natural origin which may be present in minor amounts. Monoclonal antibodies are highly specific, being directed against a single antigenic site. In addition, unlike conventional antibody preparations (polyclonal) which generally include different antibodies directed against different determinants (epitopes) on the antigen, each monoclonal antibody is directed against a single determinant or epitope on the antigen.

Les « fragments d'anticorps » comprennent une partie d'un anticorps de pleine longueur, généralement la région de liaison à l'antigène ou le domaine variable de celui-ci. Des exemples de fragments d'anticorps comprennent le Fab, le Fab', le F(ab')2, les Fab bispécifiques et les fragments Fv, les diacorps, les anticorps linéaires, les molécules d'anticorps à chaîne unique, un fragment variable de chaîne unique (scFv) et des anticorps multispécifiques formés à partir de fragments d'anticorps (voir Holliger and Hudson, Nature Biotechnol. 23:1126-1136, 2005, dont le contenu est incorporé ici à titre de référence)."Antibody fragments" include part of a full-length antibody, usually the antigen binding region or the variable domain thereof. Examples of antibody fragments include Fab, Fab ', F (ab') 2, bispecific Fabs and Fv fragments, diabodies, linear antibodies, single chain antibody molecules, variable fragment single chain (scFv) and multispecific antibodies formed from antibody fragments (see Holliger and Hudson, Nature Biotechnol. 23: 1126-1136, 2005, the content of which is incorporated herein by reference).

Dans des modes de réalisation non limitatifs, les anticorps TIGIT décrits ici peuvent comprendre des domaines CH1 et/ou des domaines CL, dont la séquence d'acides aminés est totalement ou essentiellement humaine. Si l'anticorps TIGIT est destinée à une utilisation thérapeutique chez l'humain, il est habituel pour la totalité de la région constante de l'anticorps, ou au moins une partie de celle-ci, d'avoir une séquence d'acides aminés totalement ou essentiellement humaine. Par conséquent, une ou plusieurs ou une quelconque combinaison du domaine CH1, de la région charnière, du domaine CH2, du domaine CH3 et du domaine CL (et le domaine CH4, s'il est présent) peut être totalement ou essentiellement humaine par rapport à sa séquence d'acides aminés. De tels anticorps peuvent être d'un quelconque isotype humain, l'lgG4 et l'IgGI humaines étant particulièrement préférées.In nonlimiting embodiments, the TIGIT antibodies described here can comprise CH1 domains and / or CL domains, the amino acid sequence of which is completely or essentially human. If the TIGIT antibody is for therapeutic use in humans, it is usual for the entire constant region of the antibody, or at least part of it, to have an amino acid sequence totally or essentially human. Therefore, one or more or any combination of the CH1 domain, the hinge region, the CH2 domain, the CH3 domain and the CL domain (and the CH4 domain, if present) may be wholly or essentially human with respect to to its amino acid sequence. Such antibodies can be of any human isotype, human IgG4 and IgGI being particularly preferred.

De façon avantageuse, le domaine CH1, la région charnière, le domaine CH2, le domaine CH3 et le domaine CL (et le domaine CH4, s'il est présent) peuvent tous avoir une séquence d'acides aminés totalement ou essentiellement humaine. Dans le contexte de la région constante d'un anticorps humanisé ou chimère, ou d'un fragment d'anticorps, le terme « essentiellement humain » décrit une identité de séquence d'acides aminés d'au moins 90 %, ou d'au moins 92 %, ou d'au moins 95 %, ou d'au moins 97 %, ou d'au moins 99 % avec une région constante humaine. Le terme « séquence d'acides aminés humaine » dans le présent contexte décrit une séquence d'acides aminés qui est codée par un gène d'immunoglobuline humaine, qui comprend des gènes mutés de la lignée germinale, réarrangés ou somatiques. De tels anticorps peuvent être d'un quelconque isotype humain, l'lgG4 et l'IgGI humaines étant particulièrement préférées.Advantageously, the CH1 domain, the hinge region, the CH2 domain, the CH3 domain and the CL domain (and the CH4 domain, if present) may all have a fully or essentially human amino acid sequence. In the context of the constant region of a humanized or chimeric antibody, or an antibody fragment, the term "essentially human" describes an amino acid sequence identity of at least 90%, or at least at least 92%, or at least 95%, or at least 97%, or at least 99% with a constant human region. The term "human amino acid sequence" in the present context describes an amino acid sequence which is encoded by a human immunoglobulin gene, which comprises mutated germ line genes, rearranged or somatic. Such antibodies can be of any human isotype, human IgG4 and IgGI being particularly preferred.

Il est également décrit des anticorps TIGIT comprenant des domaines constants de la séquence « humaine » qui ont été altérés, par une ou plusieurs additions, délétions ou substitutions d'acides aminés par rapport à la séquence humaine.Also described are TIGIT antibodies comprising constant domains of the “human” sequence which have been altered by one or more additions, deletions or substitutions of amino acids with respect to the human sequence.

BE2017/5535BE2017 / 5535

Les anticorps TIGIT décrits ici peuvent être d'un quelconque isotype. Les anticorps destinés à une utilisation thérapeutique chez les humains seront généralement du type IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, souvent du type IgG, auquel cas, ils peuvent appartenir à l'une quelconque des quatre sous-classes lgG1, lgG2a et b, lgG3 ou lgG4. À l'intérieur de chacune de ces sous-classes, il est permis de faire une ou plusieurs substitutions, insertions ou délétions d'acides aminés à l'intérieur de la partie Fc, ou de faire d'autres modifications structurales, par ex., pour améliorer ou réduire les fonctionnalités dépendantes du Fc. Dans certains modes de réalisation préférés, les anticorps TIGIT décrits ici sont des anticorps IgG. Dans certains modes de réalisation, les anticorps selon l'invention sont des anticorps lgG1. Dans certains modes de réalisation alternatifs, les anticorps selon l'invention sont des anticorps lgG4. Les anticorps lgG4 sont connus pour subir un échange de bras Fab (FAE), qui peut donner des propriétés pharmacodynamiques imprévisibles d'un anticorps lgG4. Il a été démontré que le FAE peut être empêché par une mutation S228P dans la région charnière (Silva et al. J Biol Chem. 2015 Feb 27 ; 290(9):5462-5469). Par conséquent, dans certains modes de réalisation dans lesquels un anticorps selon l'invention est un anticorps lgG4, l'anticorps comprend la mutation S228P, c.-à-d., une mutation sérine à proline à la position 228 (selon la numérotation UE).The TIGIT antibodies described here can be of any isotype. Antibodies for therapeutic use in humans will generally be of the IgA, IgD, IgE, IgG, IgM type, often of the IgG type, in which case, they may belong to any of the four subclasses lgG1, lgG2a and b , lgG3 or lgG4. Within each of these subclasses, it is permitted to make one or more substitutions, insertions or deletions of amino acids inside the Fc part, or to make other structural modifications, e.g. , to improve or reduce the Fc dependent functionality. In certain preferred embodiments, the TIGIT antibodies described herein are IgG antibodies. In certain embodiments, the antibodies according to the invention are IgG1 antibodies. In certain alternative embodiments, the antibodies according to the invention are IgG4 antibodies. IgG4 antibodies are known to undergo Fab arm exchange (FAE), which can give unpredictable pharmacodynamic properties of an IgG4 antibody. It has been shown that FAE can be prevented by an S228P mutation in the hinge region (Silva et al. J Biol Chem. 2015 Feb 27; 290 (9): 5462-5469). Consequently, in certain embodiments in which an antibody according to the invention is an IgG4 antibody, the antibody comprises the mutation S228P, i.e., a serine to proline mutation at position 228 (according to the numbering EU).

Dans des modes de réalisation non limitatifs, il est envisagé qu'une ou plusieurs substitutions, insertions ou délétions d'acides aminés peuvent être réalisées à l'intérieur de la région constante de la chaîne lourde et/ou légère, particulièrement à l'intérieur de la région Fc. Les substitutions d'acides aminés peuvent entraîner le remplacement de l'acide aminé substitué par un acide aminé naturel différent, ou par un acide aminé artificiel ou modifié. D'autres modifications structurales sont également permises, telles que, par ex., des changements dans le schéma de glycosylation (par ex., par addition ou délétion des sites de glycosylation liés au N ou à l'O). En fonction de l'utilisation prévue de l'anticorps TIGIT, il peut être souhaitable de modifier l'anticorps de l'invention par rapport à ses propriétés de liaison aux récepteurs Fc, par ex., pour moduler la fonction effectrice.In nonlimiting embodiments, it is envisaged that one or more substitutions, insertions or deletions of amino acids can be carried out inside the constant region of the heavy and / or light chain, particularly inside from the Fc region. Amino acid substitutions can result in the replacement of the substituted amino acid with a different natural amino acid, or with an artificial or modified amino acid. Other structural modifications are also permitted, such as, for example, changes in the glycosylation pattern (eg, by addition or deletion of glycosylation sites linked to N or O). Depending on the intended use of the TIGIT antibody, it may be desirable to modify the antibody of the invention with respect to its Fc receptor binding properties, eg, to modulate the effector function.

Dans certains modes de réalisation, les anticorps TIGIT peuvent comprendre une région Fc d'un isotype d'anticorps donné, par ex., l'IgGI humaine, qui est modifiée afin de réduire ou de sensiblement éliminer une ou plusieurs fonctions effectrices d'anticorps associées naturellement à cet isotype d'anticorps.In some embodiments, TIGIT antibodies may include an Fc region of a given antibody isotype, e.g., human IgGI, which is modified to reduce or substantially eliminate one or more antibody effector functions naturally associated with this antibody isotype.

Comme il est démontré ici, les anticorps avec des fonctions effectrices de lyse peuvent être efficaces pour réduire les populations de cellules Treg mais, de façon surprenante, sans affecter de façon adverse les populations de lymphocytes T effecteurs classiques. Cette sélectivité permet une inhibition plus puissante de l'effet régulateur des Tregs tout en maintenant les lymphocytes T effecteurs anti-tumoraux. Par conséquent, dans certains modes de réalisation alternatifs, les anticorps TIGIT retiennent une ou plusieurs des fonctions effectrices de l'anticorps associées naturellement avec cet isotype d'anticorps. Par exemple, les anticorps TIGIT de l'invention peuvent être des anticorps lgG1 qui retiennent la fonctionnalité ADCC. Dans d'autres modes de réalisation, les anticorps TIGIT peuvent comprendre une région Fc d'un isotype d'anticorps donné, par ex., l'IgGI humaine, qui est modifiée afin d'améliorer une ou plusieurs fonctions effectrices d'anticorps associéesAs demonstrated here, antibodies with effector lysis functions can be effective in reducing Treg cell populations but, surprisingly, without adversely affecting populations of conventional effector T cells. This selectivity allows a more powerful inhibition of the regulatory effect of Tregs while maintaining the anti-tumor effector T lymphocytes. Therefore, in some alternative embodiments, TIGIT antibodies retain one or more of the effector functions of the antibody naturally associated with this antibody isotype. For example, the TIGIT antibodies of the invention can be IgG1 antibodies which retain ADCC functionality. In other embodiments, TIGIT antibodies may include an Fc region of a given antibody isotype, e.g., human IgGI, which is modified to improve one or more effector functions of associated antibodies

BE2017/5535 naturellement à cet isotype d'anticorps. Dans ce contexte, les « fonctions effectrices d'anticorps » comprennent une ou plusieurs de la cytotoxicité cellulaire dépendante de l'anticorps (ADCC), de la cytotoxicité dépendante du complément (CDC) et de la phagocytose cellulaire dépendante de l'anticorps (ADCP), ou l’ensemble des trois.BE2017 / 5535 naturally to this antibody isotype. In this context, "antibody effector functions" include one or more of antibody-dependent cell cytotoxicity (ADCC), complement-dependent cytotoxicity (CDC) and antibody-dependent cell phagocytosis (ADCP ), or all three.

Les anticorps monoclonaux ou les fragments de liaison à l'antigène de ceux-ci qui entrent en « compétition croisée » avec les anticorps TIGIT divulgués ici sont ceux qui se lient au TIGIT humain au ou aux sites qui sont identiques, qui chevauchent, au ou aux sites au niveau desquels les anticorps TIGIT de la présente invention se lient. Les anticorps monoclonaux compétiteurs ou des fragments de liaison à l'antigène de ceux-ci peuvent être identifiés, par ex., par un essai de compétition d'anticorps. Par exemple, un échantillon de TIGIT humain purifié ou partiellement purifié peut être fixé à un support solide. Ensuite, un anticorps (ou un de ses fragment de liaison à l'antigène) parmi la présente invention et un anticorps monoclonal (ou un de ses fragment de liaison à l'antigène) qui serait capable d'entrer en compétition avec un anticorps de l'invention sont ajoutés. L'une des deux molécules est marquée. Si le composé marqué et le composé non marqué se lient à des sites distincts et indépendants sur le TIGIT, le composé marqué se fixera au même niveau indépendamment du fait que le composé supposé en compétition est présent ou non. Cependant, si les sites d'interaction sont identiques ou se chevauchent, le composé non marqué entrera en compétition, et la quantité du composé marqué liée à l'antigène sera diminuée. Si le composé non marqué est présent en excès, une quantité très faible, si elle est présente, du composé marqué va se fixer.The monoclonal antibodies or antigen-binding fragments thereof which "cross-compete" with the TIGIT antibodies disclosed herein are those which bind to human TIGIT at the site (s) which are identical, overlap, or to the sites at which the TIGIT antibodies of the present invention bind. Competitive monoclonal antibodies or antigen-binding fragments thereof can be identified, e.g., by an antibody competition assay. For example, a sample of purified or partially purified human TIGIT can be attached to a solid support. Next, an antibody (or one of its antigen-binding fragments) among the present invention and a monoclonal antibody (or one of its antigen-binding fragments) which would be able to compete with an antibody of the invention are added. One of the two molecules is marked. If the labeled compound and the unlabeled compound bind to separate and independent sites on the TIGIT, the labeled compound will bind at the same level regardless of whether the supposedly competing compound is present or not. However, if the interaction sites are identical or overlap, the unlabeled compound will compete, and the amount of the labeled compound bound to the antigen will be decreased. If the unlabeled compound is present in excess, a very small amount, if present, of the labeled compound will bind.

Dans le cadre de la présente invention, les anticorps monoclonaux compétiteurs (ou des fragments de liaison à l'antigène de ceux-ci) sont ceux qui diminuent la liaison des composés d'anticorps de la présente invention au TIGIT d’environ 50 %, environ 60 %, environ 70 %, environ 80 %, environ 85 %, environ 90 %, environ 95 % ou environ 99 %. Les détails des procédures pour réaliser de tels essais de compétition sont bien connus dans le domaine et peuvent être trouvés, par ex., dans Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1988, 567-569, 1988, ISBN 0-87969-314-2. De tels essais peuvent devenir quantitatifs par l'utilisation d'anticorps purifiés. Une courbe standard est tracée en diluant un anticorps contre lui-même, c.-à-d., le même anticorps est utilisé à la fois pour le marqueur et le compétiteur. La capacité d'un anticorps monoclonal compétiteur non marqué ou d'un fragment de liaison à l'antigène de celui-ci d'inhiber la liaison de la molécule marquée à la plaque est mesurée. Les résultats sont rapportés et les concentrations nécessaires pour obtenir le degré souhaité d'inhibition de liaison sont comparées.In the context of the present invention, the competing monoclonal antibodies (or antigen-binding fragments thereof) are those which reduce the binding of the antibody compounds of the present invention to the TIGIT by approximately 50%, approximately 60%, approximately 70%, approximately 80%, approximately 85%, approximately 90%, approximately 95% or approximately 99%. Details of the procedures for performing such competitive trials are well known in the art and can be found, e.g., in Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1988, 567-569, 1988, ISBN 0-87969-314-2. Such tests can become quantitative by the use of purified antibodies. A standard curve is plotted by diluting an antibody against itself, i.e., the same antibody is used for both the marker and the competitor. The ability of an unlabelled competitive monoclonal antibody or an antigen binding fragment thereof to inhibit the binding of the labeled molecule to the plate is measured. The results are reported and the concentrations necessary to achieve the desired degree of binding inhibition are compared.

Des exemples d'anticorps TIGIT décrits ici et ayant les séquences données dans les figures 1 à 5 ont été développés à partir de 5 clones d'anticorps parents. Le Tableau 2 résume la lignée des anticorps décrits ici. Les anticorps anti-TIGIT parents humains exprimés chez la levure et démontrant une activité fonctionnelle élevée contre le TIGIT ont été sélectionnés (lignes grises, nommées 26...), ont subi une maturation d'affinité et ont été exprimés dans des cellules de mammifères pour produire la seconde génération d'anticorps (lignes blanches en dessous de chaque parent, nommées 29...). EnExamples of TIGIT antibodies described here and having the sequences given in FIGS. 1 to 5 were developed from 5 clones of parent antibodies. Table 2 summarizes the antibody line described here. The human parent anti-TIGIT antibodies expressed in yeast and demonstrating a high functional activity against TIGIT were selected (gray lines, named 26 ...), underwent affinity maturation and were expressed in mammalian cells. to produce the second generation of antibodies (white lines below each parent, named 29 ...). In

BE2017/5535 outre, l'anticorps 31282 a été produit à partir du 29489 par une substitution M-T au niveau de l'acide aminé 116 dans la région FR4 du VH. On comprend que cette substitution enlève un site d'oxydation potentielle de l'anticorps et améliore ainsi la stabilité sans affecter la fonction. En outre, l'anticorps 31288 a été produit à partir du 29494 par une substitution V-L au niveau de l'acide aminé 2 dans la région FR1 du VH et par une substitution M-T au niveau de l'acide aminé 120 dans la région FR4 duBE2017 / 5535 in addition, the antibody 31282 was produced from 29489 by an M-T substitution at amino acid 116 in the FR4 region of the VH. It is understood that this substitution removes a site of potential oxidation of the antibody and thus improves the stability without affecting the function. In addition, antibody 31288 was produced from 29494 by a V-L substitution at amino acid 2 in the FR1 region of VH and by an M-T substitution at amino acid 120 in the FR4 region of

VH. On comprend que la substitution V-L restaure la séquence de la lignée germinale VH4-39 et la substitution M-T enlève le site d'oxydation potentielle de l'anticorps et améliore ainsi la stabilité sans affecter la fonction.VH. It is understood that the V-L substitution restores the sequence of the VH4-39 germ line and the M-T substitution removes the potential oxidation site of the antibody and thus improves stability without affecting function.

Tableau 2Table 2

Clone d'anticorps Antibody clone Lignée CDR3 du VH VH CDR3 line Procédé d'optimisation Optimization process Lignée germinale du VH Germline of VH 26518 26518 26518 26518 Parent relative VH3-07 VH3-07 29478 29478 26518 26518 H1/H2/H3 H1 / H2 / H3 VH3-30 VH3-30 26452 26452 26452 26452 Parent relative VH 1-46 VH 1-46 29487 29487 26452 26452 H1/H2/H3 H1 / H2 / H3 VH 1-46 VH 1-46 29489 29489 26452 26452 H1/H2/H3 H1 / H2 / H3 VH 1-46 VH 1-46 31282 31282 29489 29489 Mutation d'acide aminé M116T Amino acid mutation M116T VH 1-46 VH 1-46 26486 26486 26486 26486 Parent relative VH4-0B VH4-0B 29499 29499 26486 26486 H1/H2/H3 H1 / H2 / H3 VH4-39 VH4-39 29494 29494 26486 26486 H1/H2/H3 H1 / H2 / H3 VH4-39 VH4-39 31288 31288 29494 29494 Inversion de la lignée germinale + mutation d'acide aminé M116T Inversion of the germ line + mutation of amino acid M116T VH4-39 VH4-39 32919 32919 31288 31288 L1/L2/L3 L1 / L2 / L3 VH4-39 VH4-39 32931 32931 31288 31288 L1/L2/L3 L1 / L2 / L3 VH4-39 VH4-39 26521 26521 26521 26521 Parent relative VH 1-69 VH 1-69 29513 29513 26521 26521 H1/H2/H3 H1 / H2 / H3 VH 1-69 VH 1-69 26493 26493 26493 26493 Parent relative VH3-09 VH3-09 29520 29520 26493 26493 H1/H2/H3 H1 / H2 / H3 VH3-09 VH3-09 29523 29523 26493 26493 H1/H2/H3 H1 / H2 / H3 VH3-33 VH3-33 29527 29527 26493 26493 H1/H2/H3 H1 / H2 / H3 VH3-30 VH3-30 26432 26432 26432 26432 Parent relative VH 1-69 VH 1-69

La seconde génération d'anticorps démontre une affinité plus élevée que les anticorps parents respectifs, comme il est résumé dans le Tableau 3.The second generation of antibodies demonstrates higher affinity than the respective parent antibodies, as summarized in Table 3.

BE2017/5535BE2017 / 5535

Tableau 3Table 3

Clone clone ForteBio Fab KD TIGIT Biotinylé Humain TIGIT HIS (M) Monovalent ForteBio Fab KD TIGIT Human Biotinylated TIGIT HIS (M) Monovalent ForteBio Fab KD TIGIT-Fc de souris (M) Monovale nt ForteBio Fab KD TIGIT-Fc mouse (M) Monovale nt ForteBio Fab KD TIGIT-Fc cyno (M) Monovalent ForteBio Fab KD TIGIT-Fc cyno (M) Monovalent ForteBio IgG KD IgG KD TIGIT-Fc humain (M) Avid ForteBio IgG KD IgG KD TIGIT-Fc human (M) Avid MSD monovalent KD (M), TIGIT-His humain MSD monovalent KD (M), TIGIT-His human Biacore monovale nt KD (M), TIGIT-His humain Biovore monovale nt KD (M), human TIGIT-His Liaison à Jurkat Humain TIGIT (Différence versus cellules négatives) Link to Human Jurkat TIGIT (Difference versus negative cells) Liaison à Jurkat souris TIGIT (Différence versus cellules négatives) Link to Jurkat TIGIT mice (Difference versus negative cells) 26518 26518 1.24E-09 1.24E-09 N.B. N.B. 4.47E-09 4.47E-09 6.30E-10 6.30E-10 154 154 233 233 29478 29478 7.03E-10 7.03E-10 9.18E-08 9.18E-08 1.26E-09 1.26E-09 5.27E-10 5.27E-10 182 182 500 500 26452 26452 5.08E-09 5.08E-09 N.B. N.B. N.B. N.B. 4.74E-10 4.74E-10 164 164 47 47 29487 29487 2.08E-09 2.08E-09 N.B. N.B. 1.55E-07 1.55E-07 3.96E-10 3.96E-10 161 161 95 95 29489 29489 8.81E-10 8.81E-10 N.B. N.B. 3.52E-08 3.52E-08 3.53E-10 3.53E-10 1.1E-10 1.1E-10 2.48E-10 2.48E-10 162 162 187 187 31282 31282 1.34E-09 1.34E-09 N.B. N.B. 3.77E-08 3.77E-08 2.94E-10 2.94E-10 26486 26486 2.19E-08 2.19E-08 N.B. N.B. N.B. N.B. 5.89E-10 5.89E-10 143 143 199 199 29499 29499 1.66E-09 1.66E-09 2.55E-08 2.55E-08 1.45E-08 1.45E-08 3.19E-10 3.19E-10 1.9E-11 1.9E-11 164 164 541 541 29494 29494 1.66E-09 1.66E-09 5.36E-08 5.36E-08 1.86E-08 1.86E-08 3.76E-10 3.76E-10 7.0E-11 7.0E-11 2.70E-10 2.70E-10 164 164 511 511 31288 31288 2.09E-09 2.09E-09 2.51E-08 2.51E-08 1.92E-10 1.92E-10 32919 32919 1.42E-09 1.42E-09 6.57E-09 6.57E-09 680 680 32931 32931 1.18E-09 1.18E-09 1.97E-09 1.97E-09 741 741 29499 29499 1.66E-09 1.66E-09 2.55E-08 2.55E-08 1.45E-08 1.45E-08 3.19E-10 3.19E-10 1.9E-11 1.9E-11 164 164 541 541 26521 26521 9.87E-09 9.87E-09 N.B. N.B. 1.49E-07 1.49E-07 5.41E-10 5.41E-10 146 146 218 218 29513 29513 7.74E-10 7.74E-10 8.55E-08 8.55E-08 9.56E-09 9.56E-09 3.92E-10 3.92E-10 2.5E-11 2.5E-11 156 156 406 406 26493 26493 4.06E-08 4.06E-08 2.67E-08 2.67E-08 N.B. N.B. 1.49E-09 1.49E-09 80 80 463 463 29520 29520 1.31E-09 1.31E-09 1.95E-09 1.95E-09 2.68E-09 2.68E-09 3.84E-10 3.84E-10 2.1E-10 2.1E-10 7.16E-10 7.16E-10 166 166 535 535 29523 29523 3.84E-09 3.84E-09 1.89E-08 1.89E-08 2.79E-08 2.79E-08 5.31E-10 5.31E-10 1.7E-09 1.7E-09 150 150 502 502 29527 29527 1.33E-09 1.33E-09 2.02E-08 2.02E-08 1.76E-08 1.76E-08 3.50E-10 3.50E-10 6.4E-10 6.4E-10 142 142 414 414 26432 26432 1.31E-08 1.31E-08 N.B. N.B. N.B. N.B. 4.62E-09 4.62E-09

Par conséquent, dans certains modes de réalisation, les anticorps ou les fragments de liaison à l'antigène de l'invention démontrent une affinité élevée pour le TIGIT humain. Dans certains modes 5 de réalisation, les fragments Fab des anticorps selon l'invention démontrent une K_D pour TIGIT mesurée par ForteBio™ dans la fourchette allant de 1 x 1O'¹⁰ à 5 x 10'⁸ M, éventuellement 7 x 1O'¹⁰ à 4 x 10'⁸ M. Dans certains modes de réalisation, les anticorps selon l'invention démontrent une KD mesurée par MSD dans la fourchette de 1 x 10'¹¹ à 5 x 10'⁹ M, éventuellement 2 x 10'¹¹ à 1 x 10'⁹. Dans certains modes de réalisation, les fragments Fab des anticorps selon l'invention démontrent une 10 KD pour TIGIT mesurée par Biacore™ dans la fourchette allant de 1 x 1O'¹⁰ M à 1 x 10'⁹ M, éventuellement 2 x 10'¹⁰ à 7 x 10'¹⁰ M.Therefore, in some embodiments, the antibodies or antigen binding fragments of the invention demonstrate a high affinity for human TIGIT. In certain embodiments, the Fab fragments of the antibodies according to the invention demonstrate a K _D for TIGIT measured by ForteBio ™ in the range ranging from 1 × 10 ¹⁰ to 5 × 10 ⁸ M, possibly 7 × 10 ¹⁰ at 4 x 10 ' ⁸ M. In certain embodiments, the antibodies according to the invention demonstrate a KD measured by MSD in the range from 1 x 10' ¹¹ to 5 x 10 ' ⁹ M, possibly 2 x 10' ¹¹ to 1 x 10 ' ⁹ . In certain embodiments, the Fab fragments of the antibodies according to the invention demonstrate a 10 KD for TIGIT measured by Biacore ™ in the range going from 1 × 10 ⁻¹⁰ M to 1 × 10 ⁻⁹ M, possibly 2 × 10 ¹⁰ at 7 x 10 ^'10 M.

Dans certains modes de réalisation, les anticorps ou les fragments de liaison à l'antigène de l'invention ont une réaction croisée avec TIGIT de souris et/ou TIGIT de cynomolgus.In some embodiments, the antibodies or antigen binding fragments of the invention cross-react with TIGIT from mice and / or TIGIT from cynomolgus.

Étant donné que les anticorps de seconde génération « 29... » sont une progéniture maturée 15 par affinité à partir des anticorps parents hautement fonctionnels, on s'attend à ce qu'ils démontrent des propriétés fonctionnelles au moins semblables ou équivalentes aux anticorps parents, et vice versa.Since the second generation antibodies "29 ..." are an affinity-matured progeny from the highly functional parent antibodies, it is expected that they will demonstrate functional properties at least similar or equivalent to the parent antibodies , and vice versa.

Comme il est décrit ici, dans certains modes de réalisation, un anticorps ou un fragment de liaison à l'antigène de l'invention a une affinité équivalente pour la TIGIT exprimée sur les lymphocytesAs described herein, in some embodiments, an antibody or antigen binding fragment of the invention has equivalent affinity for TIGIT expressed on lymphocytes

BE2017/5535 T CD8 et les cellules Treg. Dans le présent contexte, un anticorps ou un fragment de liaison à l'antigène a une « affinité équivalente » pour les lymphocytes T CD8 et les cellules Treg si l'affinité pour les lymphocytes T CD8 se situe dans la fourchette de 0,5 à 1,5 fois celle de l'affinité pour les cellules Treg. Par exemple, un anticorps ayant une affinité équivalente pour les lymphocytes T CD8 et les cellules Treg qui démontre une affinité pour les cellules Treg de 0,03 nM démontrerait une affinité pour les lymphocytes T CD8 dans la fourchette de 0,015 à 0,045 nM.BE2017 / 5535 T CD8 and Treg cells. In the present context, an antibody or antigen binding fragment has "equivalent affinity" for CD8 T cells and Treg cells if the affinity for CD8 T cells is in the range of 0.5 to 1.5 times that of the affinity for Treg cells. For example, an antibody with equivalent affinity for CD8 T cells and Treg cells that demonstrates an affinity for Treg cells of 0.03 nM would demonstrate an affinity for CD8 T cells in the range of 0.015 to 0.045 nM.

Le Tableau 3 présente un résumé des propriétés d'affinité des anticorps anti-TIGIT de l'invention, les cellules grises indiquant des clones de l'anticorps parent, les anticorps de la deuxième et de la troisième génération de chaque lignée étant illustrés immédiatement en dessous de l'anticorps parent respectif (voir également le Tableau 2).Table 3 presents a summary of the affinity properties of the anti-TIGIT antibodies of the invention, the gray cells indicating clones of the parent antibody, the second and third generation antibodies of each line being immediately illustrated in below the respective parent antibody (see also Table 2).

Comme il est démontré dans les exemples ci-joints, dans certains modes de réalisation, des anticorps de l'invention entrent en compétition avec CD155/PVR pour la liaison avec TIGIT. Dans certains modes de réalisation, les anticorps de l'invention démontrent une compétition avec le CD155 caractérisé par une CI₅₀ de 0,2 nM ou moins, de préférence 0,1 nM ou moins. Sans intention d'être lié par la théorie, on s'attend à ce que la compétition des anticorps avec le CD155 pour la liaison à la TIGIT diminue les niveaux de signalisation induits par CD155 via TIGIT, augmentant ainsi les niveaux d’activation des lymphocytes T effecteurs.As demonstrated in the attached examples, in some embodiments, antibodies of the invention compete with CD155 / PVR for binding with TIGIT. In some embodiments, the antibodies of the invention demonstrate competition with CD155 characterized by an IC ₅₀ of 0.2 nM or less, preferably 0.1 nM or less. Without intending to be bound by theory, the competition of antibodies with CD155 for binding to TIGIT is expected to decrease the signaling levels induced by CD155 via TIGIT, thereby increasing lymphocyte activation levels. T effectors.

Comme il est démontré dans les exemples ci-joints, dans certains modes de réalisation, les anticorps de l'invention démontrent une affinité élevée pour les lymphocytes T CD8 exprimant TIGIT et une affinité élevée pour les cellules Treg exprimant TIGIT. Dans certains modes de réalisation, les anticorps de l'invention démontrent une affinité pour les lymphocytes T CD8 exprimant TIGIT et les cellules Treg exprimant TIGIT caractérisée par une CE₅₀ inférieure à 0,5 nM, de préférence inférieure à 0,3 nM, de préférence inférieure à 0,2 nM. Dans certains modes de réalisation, les anticorps de l'invention démontrent une affinité équivalente pour les lymphocytes T CD8 exprimant TIGIT et pour les cellules Treg exprimant TIGIT.As demonstrated in the attached examples, in certain embodiments, the antibodies of the invention demonstrate a high affinity for CD8 T lymphocytes expressing TIGIT and a high affinity for Treg cells expressing TIGIT. In certain embodiments, the antibodies of the invention demonstrate an affinity for CD8 T lymphocytes expressing TIGIT and Treg cells expressing TIGIT characterized by an EC _{50 of} less than 0.5 nM, preferably less than 0.3 nM, of preferably less than 0.2 nM. In certain embodiments, the antibodies of the invention demonstrate an equivalent affinity for CD8 T lymphocytes expressing TIGIT and for Treg cells expressing TIGIT.

Les anticorps selon l'invention sont également en mesure de diminuer préférentiellement les cellules Treg exprimant TIGIT. C'est-à-dire, les anticorps de l'invention réduisent la proportion de cellules Treg exprimant TIGIT par rapport à la population totale des lymphocytes T d'une ampleur supérieure à la réduction de la proportion des lymphocytes T effecteurs (lymphocytes T CD4 ou CD8). Cette diminution sélective des cellules Treg exprimant TIGIT peut être facilité par une lyse sélective des cellules Treg exprimant TIGIT (par ex., par ADCC ou CDC (voir les Figures 20 et 21). On comprend que les cellules Treg exprimant TIGIT sont des cellules régulatrices plus puissantes que les cellules Treg qui n'expriment pas TIGIT. Sans intention d'être lié par la théorie, on s'attend à ce que l'épuisement sélectif par lyse des cellules Treg exprimant TIGIT augmente la fonction des lymphocytes T effecteurs (par ex., la cytotoxicité facilitée par le lymphocyte T, la libération des cytokines pro-inflammatoires) en épuisant le nombre global de cellules Treg et en épuisant également les cellules Treg démontrant la fonction régulatrice la plus puissante. Par conséquent, dans certainsThe antibodies according to the invention are also able to preferentially decrease the Treg cells expressing TIGIT. That is to say, the antibodies of the invention reduce the proportion of Treg cells expressing TIGIT relative to the total population of T lymphocytes by a magnitude greater than the reduction in the proportion of effector T lymphocytes (CD4 T lymphocytes). or CD8). This selective decrease in TIGIT-expressing Treg cells can be facilitated by selective lysis of TIGIT-expressing Treg cells (eg, by ADCC or CDC (see Figures 20 and 21). It is understood that TIGIT-expressing Treg cells are regulatory cells more potent than TregIT cells which do not express TIGIT. Without intending to be bound by theory, selective lysis depletion of TIGIT expressing Treg cells is expected to increase the function of effector T cells (by eg, T cell facilitated cytotoxicity, release of pro-inflammatory cytokines) by depleting the overall number of Treg cells and also depleting Treg cells demonstrating the most potent regulatory function.

BE2017/5535 modes de réalisation, les anticorps de l'invention lysent sélectivement les cellules Treg exprimant TIGIT. Un épuisement sélectif des cellules Treg exprimant TIGIT peut également être facilité par l'induction de l'internalisation du récepteur TIGIT de sorte qu'il ne soit plus exprimé au niveau de la membrane cellulaire. Sans intention d'être lié par la théorie, en induisant l'internalisation du TIGIT de sorte que les cellules Treg TIGIT+ deviennent des cellules Treg TIGIT-, on s'attend à ce que la fonction régulatrice de ces cellules devienne moins puissante (étant donné que les cellules Treg TIGIT+ sont des cellules régulatrices plus puissantes). Suite à l'internalisation du récepteur et à la diminution subséquente de la puissance de régulation de ces cellules Treg, on s'attend à une augmentation de la fonction effectrice des lymphocytes T. Par conséquent, dans certains modes de réalisation, les anticorps de l'invention démontrent une activité suppressive des cellules Treg exprimant TIGIT, de préférence en induisant une internalisation du TIGIT par les cellules Treg exprimant TIGIT.BE2017 / 5535 embodiments, the antibodies of the invention selectively lyse TIGIT-expressing Treg cells. Selective depletion of TIGIT-expressing Treg cells can also be facilitated by inducing the internalization of the TIGIT receptor so that it is no longer expressed at the cell membrane. Without intending to be bound by theory, by inducing the internalization of TIGIT so that Treg TIGIT + cells become Treg TIGIT- cells, it is expected that the regulatory function of these cells will become less powerful (given that TregIT TIGIT + cells are more powerful regulatory cells). Following the internalization of the receptor and the subsequent decrease in the regulatory power of these Treg cells, an increase in the effector function of T lymphocytes is expected. Consequently, in certain embodiments, the antibodies of l The invention demonstrates suppressive activity of TIGIT-expressing Treg cells, preferably by inducing TIGIT internalization by TIGIT-expressing Treg cells.

Il est particulièrement avantageux pour les anticorps anti-TIGIT de l'invention de démontrer une affinité élevée pour les lymphocytes T CD8 et les cellules Treg et de démontrer également une diminution séléctive des cellules Treg, promouvant ainsi la fonction effectrice des lymphocytes T à travers deux mécanismes. Le maintien de la fonction effectrice de l'anticorps (par ex., ADCC, CDC) entraîne une diminution réelle des cellules Treg et la sélectivité veut dire que la fonction effectrice de l'anticorps n'entraîne pas une diminution indésirable des lymphocytes T effecteurs. Cette sélectivité est particulièrement étonnante étant donné que les tentatives précédentes pour produire un anticorps anti-TIGIT ont essayé d'éliminer la fonction effectrice de l'anticorps afin d'éviter la lyse des lymphocytes T effecteurs exprimant TIGIT. En outre, étant donné que les anticorps TIGIT de l'invention démontrent une affinité pour les lymphocytes T effecteurs (par ex., les lymphocytes T CD8), la signalisation se faisant via TIGIT dans ces cellules peut être inhibée par la compétition pour la liaison au CD155 et/ou l'induction de l’internalisation du TIGIT sur les lymphocytes T effecteurs. En association, ces effets des anticorps de l'invention peuvent entraîner une régulation positive importante de la fonction effectrice des lymphocytes T.It is particularly advantageous for the anti-TIGIT antibodies of the invention to demonstrate a high affinity for CD8 T lymphocytes and Treg cells and also to demonstrate a selective decrease in Treg cells, thereby promoting the effector function of T lymphocytes through two mechanisms. Maintaining the effector function of the antibody (eg, ADCC, CDC) results in an actual decrease in Treg cells and selectivity means that the effector function of the antibody does not cause an undesirable decrease in effector T cells . This selectivity is particularly surprising since previous attempts to produce an anti-TIGIT antibody have attempted to eliminate the effector function of the antibody in order to avoid lysis of the effector T lymphocytes expressing TIGIT. In addition, since the TIGIT antibodies of the invention demonstrate an affinity for effector T cells (eg, CD8 T cells), signaling via TIGIT in these cells can be inhibited by competition for binding to CD155 and / or the induction of TIGIT internalization on effector T lymphocytes. In combination, these effects of the antibodies of the invention can lead to significant upregulation of the effector function of T lymphocytes

D'autres propriétés avantageuses surprenantes démontrées par les anticorps de l'invention comprennent l'augmentation de la fonction effectrice des lymphocytes T (par ex., la libération des cytokines pro-inflammatoires) des lymphocytes infiltrant les tumeurs (TIL). L'exposition aux microenvironnements de la tumeur peut entraîner le développement de phénotypes anergiques, ou soi-disant « épuisés », par les TIL, possiblement en raison d'une surexposition à l'antigène et/ou à un microenvironnement tumoral immunosuppresseur. L'amélioration de la fonction effectrice des TIL est souhaitable étant donné que ce sont ces cellules qui infiltrent la tumeur elle-même et sont donc positionnées dans l’environnement le plus approprié pour réduire la taille ou la croissance de la tumeur ; cependant, en raison du phénotype anergique ou épuisé de beaucoup de TIL, on s'attend à ce qu'il soit difficile de potentialiser leur fonction effectrice. L'augmentation de la réponse proinflammatoire des TIL suite à l'exposition aux anticorps de l'invention est donc surprenante et indique que les anticorps peuvent être des agents thérapeutiques particulièrement efficaces.Other surprising advantageous properties demonstrated by the antibodies of the invention include increasing the effector function of T lymphocytes (eg, the release of proinflammatory cytokines) from tumor infiltrating lymphocytes (TIL). Exposure to tumor microenvironments can lead to the development of anergic, or so-called "depleted" phenotypes by TIL, possibly due to overexposure to the antigen and / or an immunosuppressive tumor microenvironment. Improving the effector function of TIL is desirable since it is these cells which infiltrate the tumor itself and are therefore positioned in the most suitable environment to reduce the size or growth of the tumor; however, due to the anergic or depleted phenotype of many TILs, it is expected to be difficult to potentiate their effector function. The increase in the pro-inflammatory response of TIL following exposure to the antibodies of the invention is therefore surprising and indicates that the antibodies can be particularly effective therapeutic agents.

BE2017/5535BE2017 / 5535

Dans certains modes de réalisation, l'invention décrit des anticorps anti-TIGIT ou des fragments de liaison à l'antigène de ceux-ci dans lesquels le domaine VH est dérivé d'une séquence de la lignée germinale de la région V humaine sélectionnée parmi : VH3-07, VH3-30, VH1-46, VH40B, VH4-39, VH 1-69, VH3-09, VH3-33, VH3-30. Dans certains modes de réalisation préférés, l'anticorps ou le fragment de liaison à l'antigène de celui-ci comprend un domaine VH dérivé d'une lignée germinale V1-46 de la région V humaine.In certain embodiments, the invention describes anti-TIGIT antibodies or antigen binding fragments thereof in which the VH domain is derived from a sequence of the germ line of the human V region selected from : VH3-07, VH3-30, VH1-46, VH40B, VH4-39, VH 1-69, VH3-09, VH3-33, VH3-30. In certain preferred embodiments, the antibody or the antigen binding fragment thereof comprises a VH domain derived from a V1-46 germline from the human V region.

Un domaine VH est « dérivé d'une » séquence de lignée germinale de la région V particulière si la séquence de la région variable de chaîne lourde est plus probablement dérivée de la lignée germinale donnée que d'une quelconque autre lignée.A VH domain is "derived from" a particular V-region germ line sequence if the heavy chain variable region sequence is more likely to be derived from the given germ line than from any other line.

Comme il est démontré dans les exemples ci-joints, la présente invention décrit également des anticorps qui n'entrent pas en compétition avec le CD155/PVR pour la liaison au TIGIT. Par conséquent, dans un autre aspect, l'invention décrit un anticorps ou un fragment de liaison à l'antigène de celui-ci qui n'entre pas en compétition avec le CD155/PVR pour la liaison avec le TIGIT humain. Dans certains modes de réalisation de ce type, les fragments Fab des anticorps CD155 antiTIGIT non-compétitifs selon l'invention démontrent une K_D pour le TIGIT mesurée par ForteBio™ dans la fourchette allant de 5 x 10'⁹ à 5 x 10'⁸ M, éventuellement 1 x 10'⁸ à 3 x 10'⁸ M.As demonstrated in the attached examples, the present invention also describes antibodies which do not compete with CD155 / PVR for binding to TIGIT. Therefore, in another aspect, the invention describes an antibody or antigen binding fragment thereof which does not compete with CD155 / PVR for binding with human TIGIT. In certain embodiments of this type, the Fab fragments of the non-competitive CD155 antiTIGIT antibodies according to the invention demonstrate a K _D for TIGIT measured by ForteBio ™ in the range from 5 × 10 ′ ⁹ to 5 × 10 ′ ⁸ M, possibly 1 x 10 ' ⁸ to 3 x 10' ⁸ M.

Dans certains modes de réalisation préférés, l'anticorps peut comprendre un domaine variable de chaîne lourde et un domaine variable de chaîne légère dans lequel HCDR1 comprend la SEQ ID NO:280, la HCDR2 comprend la SEQ ID NO:281, la HCDR3 comprend la SEQ ID NO:282, et LCDR1 comprend la SEQ ID NO :292, la LCDR2 comprend la SEQ ID NO :293, et la LCDR3 comprend la SEQ ID NO:294. Dans certains modes de réalisation de ce type, le domaine variable de la chaîne lourde peut comprendre la séquence d'acides aminés illustrée comme la SEQ ID NO:333 ou une séquence d'acides aminés démontrant une identité de séquence d'au moins 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % à celle-ci, et le domaine variable de la chaîne légère peut comprendre la séquence d'acides aminés illustrée comme la SEQ ID NO:334 ou une séquence d'acides aminés démontrant une identité de séquence d'au moins 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % à celle-ci.In certain preferred embodiments, the antibody may comprise a heavy chain variable domain and a light chain variable domain in which HCDR1 comprises SEQ ID NO: 280, HCDR2 comprises SEQ ID NO: 281, HCDR3 comprises SEQ ID NO: 282, and LCDR1 includes SEQ ID NO: 292, LCDR2 includes SEQ ID NO: 293, and LCDR3 includes SEQ ID NO: 294. In certain embodiments of this type, the variable domain of the heavy chain can comprise the amino acid sequence illustrated as SEQ ID NO: 333 or an amino acid sequence demonstrating a sequence identity of at least 90% , 95%, 97%, 98% or 99% thereof, and the variable domain of the light chain may include the amino acid sequence illustrated as SEQ ID NO: 334 or an amino acid sequence demonstrating sequence identity of at least 90%, 95%, 97%, 98% or 99% to it.

Les modes de réalisation dans lesquels la séquence d'acides aminés du domaine VH démontre une identité de séquence inférieure à 100 % avec la séquence illustrée comme la SEQ ID NO:333 peuvent néanmoins comprendre les CDR de chaîne lourde qui sont identiques aux HCDR1, HCDR2 et HCDR3 de la SEQ ID NO:333 (SEQ ID NO :280, 281 et 282, respectivement) tout en démontrant une variation au niveau de la séquence d'acides aminés à l'intérieur des régions cadre. De la même façon, les modes de réalisation dans lesquels la séquence d'acides aminés du domaine VL démontre une identité de séquence inférieure à 100 % avec la séquence illustrée comme la SEQ ID NO:334 peuvent néanmoins comprendre des CDR de chaîne légère qui sont identiques aux LCDR1, LCDR2 et LCDR3 de la SEQ ID NO:334 (SEQ ID NO :292, 293 et 294, respectivement) tout en démontrant une variation au niveau de la séquence d'acides aminés à l'intérieur des régions cadre.The embodiments in which the amino acid sequence of the VH domain demonstrates a sequence identity of less than 100% with the sequence illustrated as SEQ ID NO: 333 may nevertheless include the heavy chain CDRs which are identical to HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of SEQ ID NO: 333 (SEQ ID NO: 280, 281 and 282, respectively) while demonstrating variation in the amino acid sequence within the framework regions. Likewise, embodiments in which the amino acid sequence of the VL domain demonstrates a sequence identity of less than 100% with the sequence illustrated as SEQ ID NO: 334 may nevertheless include light chain CDRs which are identical to LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of SEQ ID NO: 334 (SEQ ID NO: 292, 293 and 294, respectively) while demonstrating a variation in the amino acid sequence within the framework regions.

BE2017/5535BE2017 / 5535

L'invention décrit également des « variants de la lignée germinale » des anticorps décrits ici. L'invention décrit en outre des « variants d'affinité » des anticorps décrits ici.The invention also describes "germline variants" of the antibodies described herein. The invention further describes "affinity variants" of the antibodies described herein.

L'invention décrit également un anticorps isolé ou un fragment de liaison à l'antigène de celuici, qui entre en compétition croisée pour la liaison au TIGIT humain avec un anticorps ou un fragment de liaison à l'antigène décrit ici.The invention also describes an isolated antibody or antigen binding fragment thereof, which cross-competes for binding to human TIGIT with an antibody or antigen binding fragment described herein.

L'invention décrit également un anticorps isolé ou un fragment de liaison à l'antigène de celuici, qui se lie au même épitope que l'anticorps ou que le fragment de liaison à l'antigène décrit ici.The invention also describes an isolated antibody or an antigen binding fragment thereof, which binds to the same epitope as the antibody or the antigen binding fragment described herein.

L'invention décrit également des molécules polynucléotidiques codant pour les anticorps TIGIT de l'invention, et également des vecteurs d'expression contenant des séquences nucléotidiques qui codent pour les anticorps TIGIT de l'invention liées en fonctionnement à des séquences régulatrices qui permettent l'expression du polypeptide de liaison à l'antigène dans une cellule hôte ou un système d'expression exempt de cellules, et une cellule hôte ou un système d'expression exempt de cellules contenant ce vecteur d'expression.The invention also describes polynucleotide molecules coding for the TIGIT antibodies of the invention, and also expression vectors containing nucleotide sequences which code for the TIGIT antibodies of the invention linked in operation to regulatory sequences which allow the expression of the antigen binding polypeptide in a host cell or cell free expression system, and a host cell or cell free expression system containing this expression vector.

Les molécules polynucléotidiques codant pour les anticorps TIGIT de l'invention comprennent, par ex., des molécules d'ADN recombinantes. Les termes « acide nucléique », « polynucléotide » ou une « molécule polynucléotidique » tels qu'ils sont utilisés dans la présente invention de façon interchangeable se réfèrent à une quelconque molécule d'ADN ou d'ARN, monocaténaire ou bicaténaire et, dans le cas d'une molécule monocaténaire, la molécule de sa séquence complémentaire. Dans la discussion sur les molécules d'acide nucléique, une séquence ou une structure d'une molécule d'acide nucléique donnée peut être décrite ici selon la convention normale de description de la séquence dans la direction 5' vers 3'. Dans certains modes de réalisation de l'invention, les acides nucléiques ou les polynucléotides sont « isolés ». Ce terme, lorsqu'il est appliqué à une molécule d'acide nucléique, décrit une molécule d'acide nucléique qui est séparée des séquences avec lesquelles elle est immédiatement contiguë dans le génome naturel de l'organisme duquel elle provient. Par exemple, un « acide nucléique isolé » peut comprendre une molécule d'ADN insérée dans un vecteur, tel qu'un plasmide ou un vecteur viral, ou intégré dans l'ADN génomique d'une cellule procaryote ou eucaryote, ou d'un organisme hôte non humain. Lorsqu'il est appliqué à l'ARN, le terme « polynucléotide isolé » décrit principalement une molécule d'ARN codée par une molécule d’ADN isolée, tel qu'il est défini ci-dessus. Par ailleurs, le terme peut décrire une molécule d'ARN qui a été purifiée/séparée des autres acides nucléiques avec lesquels elle serait associée dans son état naturel (c.-à-d., dans les cellules ou les tissus). Un polynucléotide isolé (ADN ou ARN) peut également représenter une molécule produite directement par des moyens biologiques ou synthétiques et séparée des autres composants présents au cours de sa production.Polynucleotide molecules encoding the TIGIT antibodies of the invention include, for example, recombinant DNA molecules. The terms "nucleic acid", "polynucleotide" or "polynucleotide molecule" as used in the present invention interchangeably refer to any single or double stranded DNA or RNA molecule and, in the case of a single-stranded molecule, the molecule of its complementary sequence. In the discussion of nucleic acid molecules, a sequence or structure of a given nucleic acid molecule can be described here according to the normal convention of description of the sequence in the 5 'to 3' direction. In some embodiments of the invention, the nucleic acids or polynucleotides are "isolated". This term, when applied to a nucleic acid molecule, describes a nucleic acid molecule which is separated from the sequences with which it is immediately contiguous in the natural genome of the organism from which it originates. For example, an "isolated nucleic acid" can comprise a DNA molecule inserted into a vector, such as a plasmid or a viral vector, or integrated into the genomic DNA of a prokaryotic or eukaryotic cell, or of a non-human host organism. When applied to RNA, the term "isolated polynucleotide" primarily describes an RNA molecule encoded by an isolated DNA molecule, as defined above. Furthermore, the term may describe an RNA molecule that has been purified / separated from other nucleic acids with which it would be associated in its natural state (i.e., in cells or tissues). An isolated polynucleotide (DNA or RNA) can also represent a molecule produced directly by biological or synthetic means and separated from the other components present during its production.

Pour la production recombinante d'un anticorps TIGIT selon l'invention, un polynucléotide recombinant codant pour l'anticorps peut être préparé (à l'aide de techniques de biologie moléculaire standards) et inséré dans un vecteur de réplication pour l'expression dans une cellule hôte choisie, ouFor the recombinant production of a TIGIT antibody according to the invention, a recombinant polynucleotide encoding the antibody can be prepared (using standard molecular biology techniques) and inserted into a replication vector for expression in a chosen host cell, or

BE2017/5535 un système d'expression exempt de cellule. Des cellules hôtes appropriées peuvent être procaryotes, des levures, ou des cellules d'eucaryotes supérieures, spécifiquement des cellules de mammifères. Des exemples de lignées cellulaires hôtes de mammifère utiles sont la lignée rénale CV1 de singe transformée par SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651) ; la lignée rénale embryonnaire humaine (cellules 293 ou 293 sous-clonées pour une croissance en culture en suspension, Graham et al. ,J. Gen. Virol. 36 :59-74, 1977) ; les cellules rénales de bébé hamster (BHK, ATCC CCL 10) ; les cellules ovariennes de hamster chinois/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216, 1980 ; ou des clones dérivés de CHO tels que CHO-K1, ATCC CCL-61, Kao and Puck, Genetics of somatic mammalian cells, VII. Induction and isolation of nutritional mutants in Chinese hamster cells, Proc. Natl. Acad. Sei. 60:1275-1281, 1968) ; les cellules de Sertoli de souris (TM4 ; Mather, Biol. Reprod. 23:243-252, 1980) ; les cellules de myélome de souris SP2/0-AG14 (ATCC CRL 1581 ; ATCC CRL 8287) ou NS0 (collections de culture HPA no. 85110503) ; les cellules rénales de singe (CV1 ATCC CCL 70) ; les cellules rénales du singe vert africain (VERO-76, ATCC CRL-1587) ; les cellules du carcinome cervical humain (HELA, ATCC CCL 2) ; les cellules rénales des canins (MDCK, ATCC CCL 34) ; les cellules hépatiques du rat Buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442) ; les cellules pulmonaires humaines (W138, ATCC CCL 75) ; les cellules hépatiques humaines (Hep G2, HB 8065) ; la tumeur des glandes mammaires de la souris (MMT 060562, ATCC CCL51) ; les cellules TRI (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sei. 383:44-68, 1982) ; les cellules MRC 5 ; les cellules FS4 et une lignée d'hépatome humain (Hep G2), aussi bien que la lignée cellulaire PERC-6 de DSM. Les vecteurs d'expression appropriés pour une utilisation dans chacune de ces cellules hôtes sont également généralement connus dans le domaine.BE2017 / 5535 a cell-free expression system. Suitable host cells can be prokaryotic, yeast, or higher eukaryotic cells, specifically mammalian cells. Examples of useful mammalian host cell lines are the SV1 transformed monkey CV1 renal line (COS-7, ATCC CRL 1651); the human embryonic renal line (cells 293 or 293 subcloned for growth in suspension culture, Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59-74, 1977); baby hamster kidney cells (BHK, ATCC CCL 10); Chinese hamster ovary cells / -DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216, 1980; or clones derived from CHO such as CHO-K1, ATCC CCL-61, Kao and Puck, Genetics of somatic mammalian cells, VII. Induction and isolation of nutritional mutants in Chinese hamster cells, Proc. Natl. Acad. Sci. 60: 1275-1281, 1968); mouse Sertoli cells (TM4; Mather, Biol. Reprod. 23: 243-252, 1980); mouse myeloma cells SP2 / 0-AG14 (ATCC CRL 1581; ATCC CRL 8287) or NS0 (HPA culture collections no. 85110503); monkey kidney cells (CV1 ATCC CCL 70); African green monkey kidney cells (VERO-76, ATCC CRL-1587); human cervical carcinoma cells (HELA, ATCC CCL 2); canine kidney cells (MDCK, ATCC CCL 34); Buffalo rat liver cells (BRL 3A, ATCC CRL 1442); human lung cells (W138, ATCC CCL 75); human liver cells (Hep G2, HB 8065); mouse mammary gland tumor (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI cells (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci. 383: 44-68, 1982); MRC 5 cells; FS4 cells and a human hepatoma line (Hep G2), as well as the DSM PERC-6 cell line. Expression vectors suitable for use in each of these host cells are also generally known in the art.

Il doit être noté que le terme « cellule hôte » décrit généralement une lignée cellulaire cultivée. Des êtres humains entiers dans lesquels un vecteur d'expression codant pour un polypeptide de liaison à un antigène selon l'invention a été introduit sont explicitement exclus de la définition d'une « cellule hôte ».It should be noted that the term "host cell" generally describes a cultured cell line. Whole human beings into which an expression vector coding for an antigen-binding polypeptide according to the invention has been introduced are explicitly excluded from the definition of a "host cell".

Dans un aspect important, l'invention décrit également une méthode de production d'un anticorps TIGIT de l'invention qui comprend la culture d'une cellule hôte (ou d'un système d'expression exempt de cellules) contenant un polynucléotide (par ex., un vecteur d'expression) codant pour l'anticorps TIGIT dans des conditions qui permettent l'expression de l'anticorps TIGIT, et la récupération de l'anticorps TIGIT exprimé. Ce procédé d'expression recombinant peut être utilisé pour une production à grande échelle des anticorps TIGIT selon l'invention, y compris des anticorps monoclonaux destinés à une utilisation thérapeutique chez les humains. Des vecteurs, lignées cellulaires et procédés de production appropriés pour la fabrication à grande échelle des anticorps recombinants appropriés pour une utilisation thérapeutique in vivo sont généralement disponibles dans le domaine et seront bien connus des spécialistes.In an important aspect, the invention also describes a method of producing a TIGIT antibody of the invention which comprises culturing a host cell (or a cell-free expression system) containing a polynucleotide (by eg, an expression vector) encoding the TIGIT antibody under conditions which allow expression of the TIGIT antibody, and recovery of the expressed TIGIT antibody. This recombinant expression method can be used for large-scale production of the TIGIT antibodies according to the invention, including monoclonal antibodies intended for therapeutic use in humans. Vectors, cell lines and methods of production suitable for the large scale manufacture of recombinant antibodies suitable for therapeutic use in vivo are generally available in the art and will be well known to those skilled in the art.

Par conséquent, également conformément à l'invention, il est décrit un polynucléotide isolé codant pour un anticorps ou un fragment de liaison à l'antigène décrit ici.Therefore, also in accordance with the invention, there is described an isolated polynucleotide encoding an antibody or an antigen binding fragment described herein.

BE2017/5535BE2017 / 5535

Également conformément à l'invention, il est décrit un polynucléotide isolé codant pour un domaine VH et/ou VL d'un anticorps anti-TIGIT, dans lequel le polynucléotide comprend une ou plusieurs séquences choisies parmi le groupe composé des SEQ ID NO:241-270 et 335-342.Also according to the invention, there is described an isolated polynucleotide encoding a VH and / or VL domain of an anti-TIGIT antibody, in which the polynucleotide comprises one or more sequences chosen from the group consisting of SEQ ID NO: 241 -270 and 335-342.

Également, conformément à l'invention, il est décrit un vecteur d'expression comprenant un polynucléotide, selon l'invention, lié en fonctionnement à des séquences de régulation qui permettent l'expression du polypeptide de liaison à l'antigène dans une cellule hôte ou dans un système d'expression exempt de cellules.Also, in accordance with the invention, there is described an expression vector comprising a polynucleotide, according to the invention, linked in operation to regulatory sequences which allow the expression of the antigen binding polypeptide in a host cell. or in a cell-free expression system.

Également conformément à l'invention, il est décrit une cellule hôte ou un système d'expression exempt de cellules contenant un vecteur d'expression selon l'invention.Also in accordance with the invention, there is described a host cell or a cell-free expression system containing an expression vector according to the invention.

Également conformément à l'invention, il est décrit une méthode de production d'un anticorps recombinant ou d'un fragment de liaison à l'antigène de celui-ci qui comprend la culture de la cellule hôte ou d'un système d'expression exempt de cellules selon l'invention dans des conditions qui permettent l'expression de l'anticorps ou du fragment de liaison à l'antigène et la récupération de l'anticorps ou du fragment de liaison à l'antigène exprimé.Also according to the invention there is described a method of producing a recombinant antibody or an antigen binding fragment thereof which comprises culturing the host cell or an expression system free of cells according to the invention under conditions which allow the expression of the antibody or of the antigen-binding fragment and the recovery of the antibody or of the expressed antigen-binding fragment.

L'invention décrit également des compositions pharmaceutiques comprenant un anticorps ou un fragment de liaison à l'antigène selon l'invention préparées avec un ou plusieurs véhicules ou excipients pharmaceutiquement acceptables. De telles compositions peuvent comprendre une ou plus d’une combinaison (par ex., deux ou plus de deux anticorps) d’anticorps TIGIT. Les techniques pour la préparation d'anticorps pour une utilisation thérapeutique chez les humains sont bien connues dans le domaine et sont résumées, par ex., dans Wang et al., Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 96, pp1-26, 2007.The invention also describes pharmaceutical compositions comprising an antibody or an antigen binding fragment according to the invention prepared with one or more pharmaceutically acceptable vehicles or excipients. Such compositions may include one or more of a combination (eg, two or more of two antibodies) of TIGIT antibodies. Techniques for the preparation of antibodies for therapeutic use in humans are well known in the art and are summarized, e.g., in Wang et al., Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 96, pp1-26, 2007.

Les anticorps TIGIT et les compositions pharmaceutiques décrits ici ont une utilité en thérapie, en particulier dans le traitement thérapeutique d'une maladie, en particulier des pathologies qui bénéficient d'une inhibition de la fonction de TIGIT.The TIGIT antibodies and the pharmaceutical compositions described herein are useful in therapy, in particular in the therapeutic treatment of a disease, in particular pathologies which benefit from an inhibition of the function of TIGIT.

Les anticorps TIGIT, ou les fragments de liaison à l'antigène de ceux-ci, et les compositions pharmaceutiques décrits ici peuvent être utilisés pour inhiber la croissance des cellules tumorales cancéreuses in vivo et sont donc utiles dans le traitement des tumeurs.The TIGIT antibodies, or the antigen binding fragments thereof, and the pharmaceutical compositions described herein can be used to inhibit the growth of cancer tumor cells in vivo and are therefore useful in the treatment of tumors.

Par conséquent, d'autres aspects de l'invention concernent des méthodes d'inhibition de la croissance cellulaire tumorale chez un patient humain, et également des méthodes de traitement ou de prévention du cancer, qui comprennent l'administration à un patient d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un anticorps TIGIT ou d'un fragment de liaison à l'antigène ou des compositions pharmaceutiques, tel qu'il est décrit ici.Therefore, other aspects of the invention relate to methods of inhibiting tumor cell growth in a human patient, and also methods of treating or preventing cancer, which include administering to a patient a therapeutically effective amount of a TIGIT antibody or antigen binding fragment or pharmaceutical compositions, as described herein.

Un autre aspect de l'invention décrit un anticorps TIGIT ou un fragment de liaison à l'antigène, tel que décrit ici, pour une utilisation dans l'inhibition de la croissance des cellules tumorales chez unAnother aspect of the invention describes a TIGIT antibody or an antigen binding fragment, as described herein, for use in inhibiting the growth of tumor cells in a

BE2017/5535 patient humain. Un autre aspect encore de l'invention décrit un anticorps TIGIT ou un fragment de liaison à l'antigène, tel que décrit ici, pour une utilisation dans le traitement ou la prévention du cancer chez un patient humain.BE2017 / 5535 human patient. Yet another aspect of the invention describes a TIGIT antibody or an antigen binding fragment, as described herein, for use in the treatment or prevention of cancer in a human patient.

Les cancers préférés dont la croissance peut être inhibée par l'utilisation des anticorps TIGIT décrits ici comprennent le cancer du rein (par ex., le carcinome des cellules rénales), le cancer du sein, les tumeurs cérébrales, les leucémies aiguës ou chroniques, y compris la leucémie myéloïde aiguë, la leucémie myéloïde chronique, la leucémie lymphoblastique aiguë, la leucémie lymphoïde chronique, les lymphomes (par ex., le lymphome hodgkinien et non hodgkinien, le lymphome lymphocytaire, le lymphome primaire du SNC, le lymphome des lymphocytes B, le lymphome des lymphocytes T), les carcinomes naso-pharyngiens, les mélanomes (par ex., le mélanome malin métastatique), le cancer de la prostate, le cancer du côlon, le cancer des poumons, le cancer des os, le cancer du pancréas, le cancer de la peau, le cancer cervico-facial, le mélanome malin cutané ou intraoculaire, le cancer de l'utérus, le cancer des ovaires, le cancer du rectum, le cancer de la région anale, le cancer de l'estomac, le cancer des testicules, le cancer de l'utérus, le carcinome des trompes de Fallope, le carcinome de l'endométriose, le carcinome du col de l'utérus, le carcinome du vagin, le carcinome de la vulve, le cancer de l'œsophage, le cancer de l'intestin grêle, le cancer du système endocrinien, le cancer de la glande thyroïdienne, le cancer de la glande parathyroïdienne, le cancer de la glande surrénale, le sarcome des tissus mous, le cancer de l'urètre, le cancer du pénis, les tumeurs solides de l'enfance, le cancer de la vessie, le cancer du rein ou de l'urètre, le cancer du bassinet du rein, le néoplasme du système nerveux central (SNC), l'angiogenèse tumorale, la tumeur de l'axe rachidien, le gliome du tronc cérébral, l'adénome hypophysaire, le sarcome de Kaposi, le cancer épidermoïde, le cancer des cellules squameuses, le mésothéliome.Preferred cancers whose growth can be inhibited by the use of the TIGIT antibodies described here include kidney cancer (e.g., renal cell carcinoma), breast cancer, brain tumors, acute or chronic leukemia, including acute myeloid leukemia, chronic myeloid leukemia, acute lymphoblastic leukemia, chronic lymphocytic leukemia, lymphomas (e.g., Hodgkin's and non-Hodgkin's lymphoma, lymphocytic lymphoma, primary CNS lymphoma, lymphoma lymphoma B, T-cell lymphoma), nasopharyngeal carcinoma, melanoma (e.g., metastatic malignant melanoma), prostate cancer, colon cancer, lung cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, cervico-facial cancer, malignant skin or intraocular melanoma, uterine cancer, ovarian cancer, rectal cancer, cancer of the an region ale, stomach cancer, testicular cancer, uterine cancer, carcinoma of the fallopian tubes, carcinoma of endometriosis, carcinoma of the cervix, carcinoma of the vagina, carcinoma of the vulva, cancer of the esophagus, cancer of the small intestine, cancer of the endocrine system, cancer of the thyroid gland, cancer of the parathyroid gland, cancer of the adrenal gland, sarcoma soft tissue, cancer of the urethra, cancer of the penis, solid tumors of childhood, cancer of the bladder, cancer of the kidney or urethra, cancer of the renal pelvis, neoplasm of the system central nervous system (CNS), tumor angiogenesis, spinal axis tumor, brainstem glioma, pituitary adenoma, Kaposi's sarcoma, squamous cell cancer, squamous cell cancer, mesothelioma.

Dans certains modes de réalisation, la méthode du traitement de cancer comprend également l'administration d'un agent thérapeutique supplémentaire, par ex., un agent chimiothérapeutique.In some embodiments, the method of treating cancer also includes administering an additional therapeutic agent, eg, a chemotherapeutic agent.

Comme il est démontré ici, les anticorps de l'invention ou les fragments de liaison à l'antigène de ceux-ci sont particulièrement efficaces lorsqu'ils sont administrés en association avec les anticorps anti-PD-1 (c.-à-d., des anticorps antagonistes spécifiques pour la molécule immunorégulatrice humaine PD-1). L'administration des anticorps anti-TIGIT en association avec les anticorps anti-PD-1 entraîne une réduction synergique dans la croissance tumorale en comparaison à chaque anticorps seul. Par conséquent, l'invention décrit également une méthode de traitement du cancer chez un sujet comprenant l'administration au sujet d'une quantité efficace d'un anticorps anti-TIGIT ou d'un fragment de liaison à l'antigène de celui-ci selon l'invention et également l'administration d'une quantité efficace d’un anticorps anti-PD-1. On s'attend à observer des effets semblables en utilisant une combinaison d'un anticorps anti-TIGIT selon l'invention et d'un anticorps anti-PD-L1.As demonstrated here, the antibodies of the invention or the antigen binding fragments thereof are particularly effective when administered in combination with anti-PD-1 antibodies (i.e. ., specific antagonistic antibodies for the human immunoregulatory molecule PD-1). Administration of anti-TIGIT antibodies in combination with anti-PD-1 antibodies results in synergistic reduction in tumor growth compared to each antibody alone. Therefore, the invention also describes a method of treating cancer in a subject comprising administering to the subject an effective amount of an anti-TIGIT antibody or an antigen binding fragment thereof. according to the invention and also the administration of an effective amount of an anti-PD-1 antibody. Similar effects are expected to be observed using a combination of an anti-TIGIT antibody according to the invention and an anti-PD-L1 antibody.

EXEMPLESEXAMPLES

BE2017/5535BE2017 / 5535

Exemple 1 : Sélection de protéines de liaison à l'antigène TIGITEXAMPLE 1 Selection of TIGIT Antigen Binding Proteins

Les ABP de TIGIT ont été choisies à partir d'une banque synthétique d'anticorps humains exprimés et présentés sur la surface des cellules de levure, généralement en format IgG, tel qu'il est décrit, par ex., dans W02009036379 ; W02010105256 ; W02012009568 ; et Xu et al., Protein Eng Des Sel., Vol. 26(10), pp. 663-670 (2013)), et plus spécifiquement décrit ci-dessus. Les séquences et les caractéristiques des ABP isolées des banques recombinantes sont données dans les Figures 1 à 6.The TIGIT ABPs were chosen from a synthetic library of human antibodies expressed and presented on the surface of yeast cells, generally in IgG format, as described, for example, in WO2009036379; W02010105256; W02012009568; and Xu et al., Protein Eng Des Sel., Vol. 26 (10), pp. 663-670 (2013)), and more specifically described above. The sequences and characteristics of the ABPs isolated from the recombinant libraries are given in Figures 1 to 6.

Huit banques de levure synthétique humaine naïve chacune avec une diversité d'environ 10⁹ont été propagées comme il a été décrit précédemment (voir, par ex., : Xu et al, 2013 ; W02009036379 ; W02010105256 et W02012009568). Pour les deux premiers cycles de sélection, une technique de triage par billes magnétiques utilisant le système Miltenyi MACS a été réalisée, comme il est décrit (voir, par ex., Siegel et al., 2004). Brièvement, des cellules de levure (environ 10¹⁰cellules/banque) ont été incubées avec un antigène TIGIT-Fc biotinylé (Creative Biomart) dans un tampon de lavage FACS (solution saline tamponnée au phosphate (PBS)/0,1 % de sérum-albumine bovine (BSA)). Après un lavage avec 50 ml de tampon de lavage glacé, le culot cellulaire a été resuspendu dans 40 ml de tampon de lavage, et des microbilles de Streptavidine (500 pi) ont été ajoutées à la levure et incubées pendant 15 min à 4 °C. Ensuite, les levures ont été mises en culot, resuspendues dans 5 ml de tampon de lavage et chargées sur une colonne Miltenyi LS. Après chargement des 5 ml, la colonne a été lavée 3 fois avec 3 ml de tampon de lavage FACS. La colonne a ensuite été enlevée du champ magnétique, et les levures ont été éluées avec 5 ml de milieu de culture et ensuite cultivées pendant toute une nuit. Les cycles de triage suivants ont été réalisés avec cytométrie de flux. Environ 1x10⁸ levures ont été mises en culot, lavées trois fois avec un tampon de lavage et incubées avec un antigène de fusion TIGIT-Fc biotinylé (10 nM) dans des conditions d'équilibre à température ambiante. Les levures ont été lavées deux fois et colorées avec du LC-FITC (dilué 1:100) et des réactifs secondaires SA-633 (dilué 1:500) ou EA-PE (dilué 1:50) pendant 15 minutes à 4 °C. Après deux lavages avec un tampon de lavage glacé, les culots de cellules ont été resuspendus dans 0,4 ml de tampon de lavage et transférés dans des tubes de tri munis de bouchons à filtre. Le tri a été réalisé avec un trieur FACS ARIA (BD Biosciences) et les grilles de tri ont été attribuées pour sélectionner des anticorps montrant une liaison spécifique par rapport à un contrôle de référence. Les cycles de sélection ultérieures ont été utilisés afin de réduire le nombre d’anticorps non spécifiques en utilisant des protéines membranaires solubles provenant des cellules CHO (voir, par ex., WO2014179363 et Xu et al., Protein Eng Des Sel, Vol. 26(10), pp. 663-670 (2013)), et pour identifier les liants qui ont amélioré l'affinité au TIGIT en utilisant l'antigène TIGIT-Fc. À l'issue du dernier cycle de tri, les levures ont été ensemencées et des colonies individuelles ont été sélectionnées pour la caractérisation et la nomination des clones pour la maturation par affinité. On a analysé l'activité fonctionnelle chez 63 clones. Suite à l'analyse, les clones 26518, 26452, 26486, 26521 et 26493 présentaient la meilleure activité fonctionnelle et ont été sélectionnés pour une optimisation plus poussée.Eight banks of naive synthetic human yeast each with a diversity of about 10 ⁹ were propagated as previously described (see, e.g., Xu et al, 2013; W02009036379; W02010105256 and W02012009568). For the first two selection cycles, a magnetic bead sorting technique using the Miltenyi MACS system was performed, as described (see, e.g., Siegel et al., 2004). Briefly, yeast cells (approximately 10 ¹⁰ cells / bank) were incubated with a biotinylated TIGIT-Fc antigen (Creative Biomart) in FACS wash buffer (phosphate buffered saline (PBS) / 0.1% serum - bovine albumin (BSA)). After washing with 50 ml of ice-cold washing buffer, the cell pellet was resuspended in 40 ml of washing buffer, and Streptavidin microbeads (500 µl) were added to the yeast and incubated for 15 min at 4 ° C . Then, the yeasts were pelletized, resuspended in 5 ml of washing buffer and loaded onto a Miltenyi LS column. After loading the 5 ml, the column was washed 3 times with 3 ml of FACS wash buffer. The column was then removed from the magnetic field, and the yeasts were eluted with 5 ml of culture medium and then cultured overnight. The following sorting cycles were carried out with flow cytometry. About 1x10 ⁸ yeasts were pelletized, washed three times with washing buffer and incubated with a biotinylated TIGIT-Fc fusion antigen (10 nM) under equilibrium conditions at room temperature. The yeasts were washed twice and stained with LC-FITC (diluted 1: 100) and secondary reagents SA-633 (diluted 1: 500) or EA-PE (diluted 1:50) for 15 minutes at 4 ° C . After two washes with ice-cold wash buffer, the cell pellets were resuspended in 0.4 ml wash buffer and transferred to sorting tubes with filter caps. The sorting was carried out with a FACS ARIA sorter (BD Biosciences) and the sorting grids were assigned to select antibodies showing a specific binding compared to a reference control. Subsequent selection cycles have been used to reduce the number of non-specific antibodies by using soluble membrane proteins from CHO cells (see, e.g., WO2014179363 and Xu et al., Protein Eng Des Sel, Vol. 26 (10), pp. 663-670 (2013)), and to identify the binders which improved affinity for TIGIT using the TIGIT-Fc antigen. At the end of the last sorting cycle, the yeasts were seeded and individual colonies were selected for the characterization and the nomination of the clones for maturation by affinity. Functional activity was analyzed in 63 clones. Following the analysis, clones 26518, 26452, 26486, 26521 and 26493 showed the best functional activity and were selected for further optimization.

BE2017/5535BE2017 / 5535

Exemple 2 : Optimisation de l'anticorpsExample 2 Optimization of the Antibody

L'optimisation des clones naïfs a été réalisée en utilisant trois stratégies de maturation :Optimization of naive clones was carried out using three maturation strategies:

diversification de la chaîne légère ; diversification de la CDRH1 et de la CDRH2 ; et diversification de la CDRH3 à l'intérieur des groupes de diversité de CDRH1 et CDRH2 choisis.diversification of the light chain; diversification of CDRH1 and CDRH2; and diversification of CDRH3 within the diversity groups of CDRH1 and CDRH2 chosen.

Diversification de la chaîne légère : les régions variables de chaîne lourde ont été extraites à partir des résultats naïfs (décrits ci-dessus) et transformées en une banque de chaîne légère avec une diversité de 1 x 10⁶. Les sélections ont été réalisées comme décrit ci-dessus avec un cycle de tri par MACS et trois cycles de tri par FACS en utilisant 10 nM ou 1 nM d'antigène TIGIT-HIS biotinylé (Creative Biomart) pour les cycles respectifs.Light chain diversification: the heavy chain variable regions were extracted from the naive results (described above) and transformed into a light chain library with a diversity of 1 x 10 ⁶ . Selections were made as described above with one MACS sorting cycle and three FACS sorting cycles using 10 nM or 1 nM biotinylated TIGIT-HIS antigen (Creative Biomart) for the respective cycles.

Sélection de CDRH1 et de CDRH2 : les CDRH3 provenant des clones sélectionnés à partir de la procédure de diversification de la chaîne légère ont été recombinés dans une banque préétablie avec les variants CDRH1 et CDRH2 ayant une diversité de 1 x 10⁸ et les sélections ont été réalisées à l'aide de l'antigène monomère HIS-TIGIT. Les pressions d'affinité ont été appliquées en utilisant des concentrations décroissantes de l'antigène HIS-TIGIT biotinylé (100 à 1 nM) dans des conditions d'équilibre à température ambiante.Selection of CDRH1 and CDRH2: the CDRH3s from the clones selected from the light chain diversification procedure were recombined in a pre-established library with the variants CDRH1 and CDRH2 having a diversity of 1 × 10 ⁸ and the selections were performed using the HIS-TIGIT monomeric antigen. The affinity pressures were applied using decreasing concentrations of the biotinylated HIS-TIGIT antigen (100 to 1 nM) under equilibrium conditions at room temperature.

Sélection de CDRH3/CDRH1/CDRH2 : des oligos ont été commandés chez. l'IDT qui comprenaient ies CDRH3 aussi bien que la région flanquante homologue de part et d'autre de ia CDRH3. Une variété de positions d'acides aminés dans la CDRH3 ont été testées par une variation NNK au niveau de deux positions par oligo à travers l'intégralité de la CHRH3. Les oligos CDRH3 étaient bicaténaires et utilisant des amorces qui s'appariaient avec la région flanquante de ia CDRH3. Le restant des FWR1 à FWR3 de la région variable de chaîne lourde a été amplifié à partir des groupes d’anticorps qui ont amélioré l'affinité et qui ont été isolés à partir des diversités de CDRH1 et de CDRH2 choisies ci-dessus. La banque a ensuite été créée en transformant l'oligo CDRH3 bicaténaire, les fragments FWR1 à FWR3 regroupés, et ie vecteur d'expression de chaîne lourde dans ia levure contenant déjà la chaîne légère du parent naïf originel. Les sélections ont été réalisées comme dans les cycles précédents à l'aide du tri par FACS pendant quatre cycles. Pour chaque cycle de FACS, les banques ont été évaluées pour la liaison au PSR, la réactivité croisée entre espèces et la pression d'affinité, et le tri a été réalisé pour obtenir des populations avec les caractéristiques souhaitées. Les pressions d'affinité pour ces sélections ont été réalisées comme décrit ci-dessus dans la sélection de CDRH1 et CDRH2.Selection of CDRH3 / CDRH1 / CDRH2: oligos have been ordered from. the IDT which included CDRH3 as well as the homologous flanking region on either side of CDRH3. A variety of amino acid positions in CDRH3 were tested by NNK variation at two positions per oligo across all of CHRH3. The CDRH3 oligos were double-stranded and used primers which paired with the flanking region of CDRH3. The remainder of the FWR1 to FWR3 of the heavy chain variable region was amplified from antibody groups which improved affinity and which were isolated from the diversity of CDRH1 and CDRH2 selected above. The library was then created by transforming the double-stranded CDRH3 oligo, the FWR1 to FWR3 fragments combined, and the heavy chain expression vector in yeast already containing the light chain of the original naive parent. The selections were made as in the previous cycles using sorting by FACS for four cycles. For each FACS cycle, the banks were evaluated for PSR binding, cross-reactivity between species and affinity pressure, and sorting was carried out to obtain populations with the desired characteristics. The affinity pressures for these selections were made as described above in the selection of CDRH1 and CDRH2.

Exemple 3 : Production et purification d'anticorpsExample 3: Production and purification of antibodies

A. Production chez la levureA. Production in yeast

Afin de produire des quantités suffisantes d'anticorps optimisés et non optimisés sélectionnés pour une caractérisation plus poussée, les clones de levure ont été cultivés à saturation et ensuite incubés pendant 48 h à 30 °C sous agitation. Après induction, les cellules de levure ont été mises enIn order to produce sufficient quantities of optimized and non-optimized antibodies selected for further characterization, the yeast clones were cultured to saturation and then incubated for 48 h at 30 ° C with shaking. After induction, the yeast cells were put in

BE2017/5535 culot et les surnageants ont été recueillis pour la purification. Les IgG ont été purifiés en utilisant une colonne de protéine A et élués avec de l'acide acétique, pH 2,0. Les fragments Fab ont été produits par digestion à la papaïne et purifiés au cours d’un procédé à deux étapes sur la protéine A (GE LifeSciences) et KappaSelect (GE Healthcare LifeSciences).BE2017 / 5535 pellet and supernatants were collected for purification. The IgGs were purified using a protein A column and eluted with acetic acid, pH 2.0. The Fab fragments were produced by papain digestion and purified in a two-step process on protein A (GE LifeSciences) and KappaSelect (GE Healthcare LifeSciences).

B. Production dans les cellules de mammifèresB. Production in mammalian cells

Afin de produire des quantités suffisantes d'anticorps optimisés et non optimisés sélectionnés pour une caractérisation plus poussée, un vecteur ADN codant pour les clones d'anticorps spécifiques a été produit et transduit dans les cellules HEK. Des fragments d'ADN synthétiques de codon humain optimisé pour les domaines variables de l'anticorps ont été commandés chez Geneart. Les séquences du domaine variable ont été liguées de façon homogène dans les vecteurs d'expression pUPE contenant la séquence signal IgKappa de souris et les régions constantes de la classe d'anticorps respective. Les vecteurs d'expression ont été vérifiés par analyse par restriction et séquençage d'ADN. Pour la transfection transitoire, des maxipreps d'ADN ne contenant pas d'endotoxine (Sigma) ont été produits et des vecteurs de chaîne lourde et légère ont été co-transfectés dans les cellules HEK293EBNA1, en milieu Freestyle (ThermoFisherScientific), selon les protocoles établis. Du Primatone (volume final à 0,55 %) a été ajouté 24 h après la transfection. Le milieu conditionné a été recueilli 6 jours après la transfection. Les anticorps ont été purifiés par lots par chromatographie d'affinité sur Mabselect sureLX (GE Healthcare). Les anticorps liés ont été lavés en deux étapes avec du PBS contenant du NaCl à 1M et du PBS. Les anticorps ont été élués avec du citrate à 20 mM, du NaCl à 150 mM, pH3 et neutralisés jusqu'à un pH d'environ 7 avec un volume de 1/6 de K2HPO4/KH2PO4 à 1 M, pH 8.In order to produce sufficient amounts of optimized and non-optimized antibodies selected for further characterization, a DNA vector encoding the specific antibody clones was produced and transduced in HEK cells. Synthetic DNA fragments of human codon optimized for the variable domains of the antibody were ordered from Geneart. The variable domain sequences were homogeneously ligated into the pUPE expression vectors containing the mouse IgKappa signal sequence and the constant regions of the respective antibody class. The expression vectors were verified by restriction analysis and DNA sequencing. For transient transfection, DNA maxipreps containing no endotoxin (Sigma) were produced and heavy and light chain vectors were co-transfected in HEK293EBNA1 cells, in Freestyle medium (ThermoFisherScientific), according to the protocols established. Primatone (final volume 0.55%) was added 24 h after transfection. The conditioned medium was collected 6 days after transfection. The antibodies were purified in batches by affinity chromatography on Mabselect sureLX (GE Healthcare). Bound antibodies were washed in two steps with PBS containing 1M NaCl and PBS. The antibodies were eluted with 20 mM citrate, 150 mM NaCl, pH3 and neutralized to a pH of about 7 with a volume of 1/6 of 1 M K2HPO4 / KH2PO4, pH 8.

Ensuite les anticorps ont été davantage purifiés par filtration sur gel avec une colonne Superdex200, équilibrée avec du PBS. Les fractions ont été analysées par NuPAGE et les fractions contenant l'anticorps ont été regroupées. Les produits finaux ont été stérilisés dans un filtre à seringue de 0,22 μΜ. Le produit a été analysé par NuPAGE et les niveaux d'endotoxine ont été mesurés par un essai LAL.The antibodies were then further purified by gel filtration with a Superdex200 column, equilibrated with PBS. The fractions were analyzed by NuPAGE and the fractions containing the antibody were pooled. The final products were sterilized in a 0.22 μΜ syringe filter. The product was analyzed by NuPAGE and the endotoxin levels were measured by an LAL test.

Exemple 4 : Détermination de l'affinité pour la liaison des anticorps anti-TIGIT à la protéine recombinante humaine TIGITEXAMPLE 4 Determination of the Affinity for the Binding of Anti-TIGIT Antibodies to the Recombinant Human TIGIT Protein

A. Mesures de la K_D sur ForteBioA. K _D measurements on ForteBio

Les mesures de l'affinité sur ForteBio des anticorps sélectionnés ont généralement été réalisées comme décrit précédemment (voir, par ex., Estep et al., Mabs, Vol. 5(2), pp. 270-278 (2013)). Brièvement, les mesures de l'affinité sur ForteBio ont été réalisées en chargeant des IgG en ligne sur des capteurs AHQ. Les capteurs ont été équilibrés hors ligne dans un tampon d'essai pendant 30 minutes et ensuite surveillés en ligne pendant 60 secondes pour l'établissement des valeurs de référence. Les capteurs chargés avec des IgG ont été exposés à 100 nM d'antigène (TIGIT-Fc humain, TIGIT-His humain ou TIGIT-Fc cyno) pendant 5 minutes, avant d’être transférésThe affinity measurements on ForteBio of the selected antibodies have generally been carried out as described previously (see, for example, Estep et al., Mabs, Vol. 5 (2), pp. 270-278 (2013)). Briefly, the affinity measurements on ForteBio were carried out by loading IgGs online on AHQ sensors. The sensors were equilibrated offline in a test buffer for 30 minutes and then monitored online for 60 seconds to establish reference values. The sensors loaded with IgG were exposed to 100 nM of antigen (human TIGIT-Fc, human TIGIT-His or TIGIT-Fc cyno) for 5 minutes, before being transferred

BE2017/5535 dans un tampon d'analyse pendant 5 minutes pour une mesure de dissociation. Les paramètres cinétiques ont été analysés à l'aide d'un modèle de liaison 1:1. Plus de 90 anticorps ont été testés pour l'affinité par ForteBio et le Tableau 3 présente des données pour 15 anticorps anti-TIGIT démontrant une forte liaison à la protéine TIGIT recombinante.BE2017 / 5535 in an analysis buffer for 5 minutes for a dissociation measurement. The kinetic parameters were analyzed using a 1: 1 binding model. More than 90 antibodies have been tested for affinity by ForteBio and Table 3 presents data for 15 anti-TIGIT antibodies demonstrating a strong binding to the recombinant TIGIT protein.

B. Mesures de la K_D sur MSD-SETB. Measurements of K _D on MSD-SET

Les mesures de l'affinité à l'équilibre des anticorps sélectionnés ont été généralement réalisées comme précédemment décrit (Estep et al., Mabs, Vol. 5(2), pp. 270-278 (2013)). Brièvement, des titres d'équilibre de solution (SET) ont été réalisés dans du PBS + 0,1 % de BSA (PBSF) ne contenant pas d'IgG avec l'antigène (monomère TIGIT-His) maintenus à une concentration constante de 10 à 100 pM et incubés avec des dilutions en série de 3 à 5 fois des Fab ou mAbs, commençant entre 10pM et 10 nM. Les anticorps (20 nM dans du PBS) ont été déposés sur des plaques de liaison standard MSD-ECL pendant toute une nuit à 4 °C ou à température ambiante pendant 30 minutes. Les plaques ont ensuite été bloquées avec du BSA pendant 30 minutes sous agitation à 700 tpm, suivi par trois lavages avec un tampon de lavage (PBSF + 0,05 % Tween 20). Les échantillons SET ont été déposés et incubés sur les plaques pendant 150 secondes sous agitation à 700 tpm suivi par un lavage. L'antigène capté sur une plaque a été détecté avec 250 ng/ml de streptavidine marquée au sulfotag dans du PBSF incubé sur la plaque pendant 3 minutes. Les plaques ont été lavées trois fois avec un tampon de lavage et ensuite lues sur un instrument MSD Sector Imager 2400, 1x tampon de lecture T avec le surnageant. Le pourcentage d'antigène libre a été rapporté dans Prism comme une fonction de l'anticorps titré et ajusté sur une équation quadratique pour extraire la K_D. Afin d'améliorer le rendement, des robots de manipulation de liquide ont été utilisés dans toutes les expériences MSD-SET, y compris la préparation de l'échantillon SET. Les anticorps sélectionnés ont été testés pour l'affinité par MSD et le Tableau 4 présente des données pour 7 clones anti-TIGIT démontrant une forte liaison à la protéine TIGIT recombinante.The equilibrium affinity measurements of the selected antibodies were generally carried out as previously described (Estep et al., Mabs, Vol. 5 (2), pp. 270-278 (2013)). Briefly, equilibrium solution titers (SET) were performed in PBS + 0.1% BSA (PBSF) not containing IgG with the antigen (monomer TIGIT-His) maintained at a constant concentration of 10 to 100 μM and incubated with serial dilutions of 3 to 5 times Fab or mAbs, starting between 10 μM and 10 nM. The antibodies (20 nM in PBS) were deposited on standard MSD-ECL binding plates overnight at 4 ° C or at room temperature for 30 minutes. The plates were then blocked with BSA for 30 minutes with stirring at 700 rpm, followed by three washes with washing buffer (PBSF + 0.05% Tween 20). The SET samples were deposited and incubated on the plates for 150 seconds with shaking at 700 rpm followed by washing. The antigen captured on a plate was detected with 250 ng / ml of sulfotag-labeled streptavidin in PBSF incubated on the plate for 3 minutes. The plates were washed three times with washing buffer and then read on an MSD Sector Imager 2400 instrument, 1x reading buffer T with the supernatant. The percentage of free antigen has been reported in Prism as a function of the titrated antibody and fitted to a quadratic equation to extract the K _D. In order to improve the yield, liquid handling robots were used in all MSD-SET experiments, including the preparation of the SET sample. The selected antibodies were tested for affinity by MSD and Table 4 presents data for 7 anti-TIGIT clones demonstrating a strong binding to the recombinant TIGIT protein.

Tableau 4 : Analyse MSD de l'affinité pour les anticorps anti-TIGIT sélectionnésTable 4: MSD analysis of the affinity for the selected anti-TIGIT antibodies

Clone clone Affinité MSD KD (M) de TIGIT-His humain monovalent MSD affinity KD (M) of TIGIT-His human monovalent 29489 29489 1,1E-10 1,1E-10 29494 29494 7.0E-11 7.0E-11 29499 29499 1,9E-11 1,9E-11 29513 29513 2,5E-11 2.5E-11

BE2017/5535BE2017 / 5535

29520 29520 2,1 E-10 2.1 E-10 29523 29523 1,7E-09 1.7E-09 29527 29527 6.4E-10 6.4E-10

C. Mesure sur BiacoreC. Measurement on Biacore

L'analyse du biocapteur a été réalisée à 25 °C dans un système de tampon HBS-EP (HEPES à 10 mM, pH 7,3, NaCl à 150 mM, EDTA à 3 mM, 0,05% de surnageant P20) en utilisant un biocapteur optique Biacore 8K muni d'une puce de capteur CM5 (GE Healthcare, Marlboro, MA). Les échantillons ont été maintenus à 8 °C. Un anticorps de capture IgG de chèvre anti-humain (fragment spécifique Fcy, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA; 109-005-098) a été immobilisé (11 700 +/- 200 RU) sur les deux cellules d'écoulement de la puce de capteur à l'aide de la chimie de couplage par amine standard. Ce type de surface a fourni un format pour la capture reproductible d'anticorps d'analyse frais après chaque étape de régénération. La cellule d'écoulement 2 a été utilisée pour analyser l'anticorps capté (60-90 UR) alors que la cellule d'écoulement 1 a été utilisée comme cellule d'écoulement de référence. Des concentrations d'antigène allant de 30 à 0,123 nM (dilution de 3 fois) ont été préparées dans le tampon circulant. Chacune des concentrations de l'échantillon d'antigène a été analysée sous forme d'un réplicat unique. Deux injections témoins (tampon) ont également été analysées et utilisées pour évaluer et soustraire les artefacts du système. Les phases d'association (300 s) et de dissociation (600 s) pour toutes les concentrations d'antigène ont été réalisées à un débit de 30 ul/min. La surface a été régénérée avec trois injections séquentielles (15 s, 15 s et 60 s) de glycine à 10 mM, pH 1,5 à un débit de 30 ul/min. Les données ont été alignées, doublement référencées et ajustées à un modèle de liaison 1:1 en utilisant un logiciel d'évaluation Biacore 8K, version 1.0. Les anticorps sélectionnés ont été testés pour l'affinité par Biacore et le Tableau 5 présente des données pour 5 clones anti-TIGIT démontrant une forte liaison à la protéine TIGIT recombinante.The biosensor analysis was carried out at 25 ° C in an HBS-EP buffer system (10 mM HEPES, pH 7.3, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% P20 supernatant) in using a Biacore 8K optical biosensor fitted with a CM5 sensor chip (GE Healthcare, Marlboro, MA). The samples were kept at 8 ° C. An anti-human goat IgG capture antibody (specific fragment Fcy, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA; 109-005-098) was immobilized (11,700 +/- 200 RU) on the two d cells. flow of the sensor chip using standard amine coupling chemistry. This type of surface provided a format for the reproducible capture of fresh test antibodies after each regeneration step. Flow cell 2 was used to analyze the captured antibody (60-90 UR) while flow cell 1 was used as the reference flow cell. Antigen concentrations ranging from 30 to 0.123 nM (3-fold dilution) were prepared in the circulating buffer. Each of the concentrations in the antigen sample was analyzed as a single replicate. Two control injections (buffer) were also analyzed and used to assess and remove the artifacts from the system. The association (300 s) and dissociation (600 s) phases for all the antigen concentrations were carried out at a flow rate of 30 μl / min. The surface was regenerated with three sequential injections (15 s, 15 s and 60 s) of 10 mM glycine, pH 1.5 at a flow rate of 30 μl / min. The data were aligned, doubly referenced and fitted to a 1: 1 linkage model using Biacore 8K evaluation software, version 1.0. The selected antibodies were tested for affinity by Biacore and Table 5 presents data for 5 anti-TIGIT clones demonstrating a strong binding to the recombinant TIGIT protein.

Tableau 5 : Analyse de l'affinité par Biacore pour les anticorps anti-TIGIT sélectionnésTable 5: Analysis of the affinity by Biacore for the selected anti-TIGIT antibodies

Clone clone Biacore : KD (M) monovalent (IgG sur puce CM5, TIGIT-HIS solution (concentration de départ dilution) Biacore: monovalent KD (M) (IgG on CM5 chip, TIGIT-HIS solution (starting concentration dilution) humain en 25 nM, 3x human in 25 nM, 3x 29489 29489 2.48E-10 2.48E-10 31282 31282 2.94E-10 2.94E-10 29494 29494 2.70E-10 2.70E-10

BE2017/5535BE2017 / 5535

29520 29520 7.16E-10 7.16E-10 29527 29527 1.20E-09 1.20E-09 31288 31288 1.92E-10 1.92E-10

Exemple 5 : Essai de compétition entre les anticorps antagonistes anti-TIGIT et les ligands naturels du TIGITEXAMPLE 5 Competition Test Between Antagonistic Anti-TIGIT Antibodies and Natural TIGIT Ligands

A. Compartimentation d'épitope Octet Red384/blocage par ligandA. Epitope compartment Red384 byte / ligand blocking

La compartimentation des épitopes/le blocage par ligand des anticorps sélectionnés a été réalisée avec un essai de blocage croisé en format sandwich standard. Les IgG anti-cible témoins ont été chargés sur des capteurs AHQ, et les sites de liaison Fc non occupés sur le capteur ont été bloqués avec un anticorps lgG1 humain non pertinant. Les capteurs ont ensuite été exposés à un antigène cible à 100 nM (hTIGIT, Creative Biomart) suivi par un second antigène anti-cible ou ligand (anticorps anti-TIGIT et CD155 ou CD113 ou CD112). Les données ont été traitées avec le logiciel d'analyse des données 7.0 de ForteBio. La liaison additionnelle par le second anticorps ou ligand après l'association d'antigène indique un épitope non occupé (non compétiteur), alors qu'une absence de liaison indique un blocage de l'épitope (blocage compétiteur ou ligand). Les anticorps parents (avant l'optimisation) ont été testés pour la compétition avec des ligands naturels et le Tableau 6 résume les données obtenues pour la compétition contre CD155, CD112 et CD113. Il a été trouvé que le clone parental 26432 n'entre pas en compétition avec le CD155 pour la liaison au TIGIT. Tous les autres anticorps anti-TIGIT sélectionnés entrent en compétition avec le ligand naturel pour la liaison à la protéine humaine TIGIT recombinante.The compartmentalization of the epitopes / blocking by ligand of the selected antibodies was carried out with a cross-blocking test in standard sandwich format. Control anti-target IgGs were loaded onto AHQ sensors, and unoccupied Fc binding sites on the sensor were blocked with an irrelevant human IgG1 antibody. The sensors were then exposed to a target antigen at 100 nM (hTIGIT, Creative Biomart) followed by a second anti-target antigen or ligand (anti-TIGIT antibody and CD155 or CD113 or CD112). The data were processed with ForteBio 7.0 data analysis software. The additional binding by the second antibody or ligand after the antigen association indicates an unoccupied epitope (non-competitor), while an absence of binding indicates a blockage of the epitope (competitor or ligand blocking). Parent antibodies (before optimization) were tested for competition with natural ligands and Table 6 summarizes the data obtained for competition against CD155, CD112 and CD113. It was found that the parental clone 26432 does not compete with CD155 for binding to TIGIT. All other selected anti-TIGIT antibodies compete with the natural ligand for binding to the recombinant human TIGIT protein.

Tableau 6 : Analyse de compartimentation contre les ligands naturels du TIGIT pour les anticorps anti-TIGIT non optimisésTable 6: Analysis of compartmentalisation against natural ligands of TIGIT for non-optimized anti-TIGIT antibodies

26518 26518 Oui Yes Oui Yes Oui Yes 26452 26452 Oui Yes Oui Yes Oui Yes .....................I I ..................... ...................................... ...................................... ............................................. ............................................. î oüi î where 26521 26521 Oui Yes Oui Yes Oui Yes

BE2017/5535BE2017 / 5535

26493 26493 Oui Yes Oui Yes Oui Yes 26432 26432 Non No : :

B. Compétition des anticorps antagonistes anti-TIGIT avec le CD155 sur JurkathTIGITB. Competition of anti-TIGIT antagonist antibodies with CD155 on JurkathTIGIT

Les cellules Jurkat surexprimant la TIGIT humaine (Jurkat-hTIGIT) ont été recueillies et distribuées à 10⁵ cellules/puits et incubées avec des anticorps TIGIT anti-humains aux concentrations suivantes : 166,6 ; 53,24 ; 17,01 ; 5,43 ; 1,73 ; 0,55 ; 0,17 ; 0,05 ; 0,01 ; 5,78 x 10'³ ; 1,85 x 10'³ ; 5,9 x 10'³ nM dans un milieu complet pendant 45 minutes à 37 °C. L'excédent d'anticorps a été lavé, et ensuite les cellules ont été incubées avec un CD155-His à 5 pg/ml (Creative Biomart, PVR-3141H) pendant 45 minutes à 37 °C. Ensuite, le CD155-His lié a été détecté en utilisant un anti-His couplé à PE (Biolegend, 362603, à 2 pi par test), incubé pendant 30 minutes à 4 °C. Les cellules ont été analysées par FACS avec un BD LSRFortessa et la concentration (CI₅₀) qui empêche la moitié des liaisons CD155 a été calculée sur la base de la fluorescence géométrique moyenne. Les résultats ont été les suivants : 0,101 nM pour le clone 29489 ; 0,07 nM pour le clone 29494 ; 0,102 nM pour le clone 29520 et 0,078 nM pour le clone 29527, pour les résultats illustrés dans la Figure 7. Les valeurs des autres anticorps testés sont résumées dans le Tableau 7 ci-dessus. Globalement, les résultats démontrent une forte compétition par les anticorps anti-TIGIT antagonistes testés avec le CD155 pour la liaison à TIGIT exprimé à la membrane.Jurkat cells overexpressing human TIGIT (Jurkat-hTIGIT) were collected and distributed to 10 ⁵ cells / well and incubated with anti-human TIGIT antibodies at the following concentrations: 166.6; 53.24; 17.01; 5.43; 1.73; 0.55; 0.17; 0.05; 0.01; 5.78 x 10 '³; 1.85 x 10 '³; 5.9 x 10 ' ³ nM in complete medium for 45 minutes at 37 ° C. The excess antibody was washed, and then the cells were incubated with CD155-His at 5 pg / ml (Creative Biomart, PVR-3141H) for 45 minutes at 37 ° C. Then, bound CD155-His was detected using an anti-His coupled to PE (Biolegend, 362603, 2 µl per assay), incubated for 30 minutes at 4 ° C. The cells were analyzed by FACS with a BD LSRFortessa and the concentration (IC ₅₀ ) which prevents half of the CD155 bonds was calculated on the basis of the mean geometric fluorescence. The results were as follows: 0.101 nM for clone 29489; 0.07 nM for clone 29494; 0.102 nM for clone 29520 and 0.078 nM for clone 29527, for the results illustrated in FIG. 7. The values of the other antibodies tested are summarized in Table 7 above. Overall, the results demonstrate strong competition by the antagonistic anti-TIGIT antibodies tested with CD155 for binding to TIGIT expressed at the membrane.

Tableau 7 : Données de CI₅₀ pour la compétition CD155 sur le TIGIT humainTable 7: CI _{50 data} for the CD155 competition on human TIGIT

29489 29489 0,101 0,101 29494 29494 0,070 0,070 29499 29499 0,103 0,103 29513 29513 0,094 0.094 29520 29520 0,102 0,102 29523 29523 0,079 0.079 29527 29527 0,078 0.078

Exemple 6 : Caractérisation de la chromatographie par interaction hydrophobe (MAbs. 2015 May-Jun ; 7(3):553-561)Example 6: Characterization of hydrophobic interaction chromatography (MAbs. 2015 May-Jun; 7 (3): 553-561)

Des échantillons d'anticorps igG1 anti-TIGIT ont été échangés par tampon dans du sulfate d’ammonium à 1 M et du phosphate de sodium à 0,1 M à pH 6,5 sur une colonne à centrifuger ZebaAnti-TIGIT igG1 antibody samples were swapped in 1 M ammonium sulfate and 0.1 M sodium phosphate pH 6.5 on a Zeba centrifuge column

BE2017/5535 kDa de 0,5 ml (Thermo Pierce, no. de catalogue 87766). Un gradient sahn a été établi sur une colonne Dionex ProPac HIC-10 allant de 1,8 M de sulfate d'ammonium, de 0,1 M de phosphate de sodium à pH 6,5 à la même condition qu’en absence de sulfate d’ammonium. Le gradient a duré 17 minutes à un débit de 0,75 ml/min. Une étape de lavage à l'acétonitrile a été ajoutée à la fin du cycle pour enlever toute protéine restante et la colonne a été rééquilibrée sur 7 volumes de colonne avant le prochain cycle d'injection. Les pics des temps de rétention ont été mesurés à une absorbance à A280 et les concentrations de sulfate d’ammonium à l'élution ont été calculées en se basant sur le gradient et le débit. Le Tableau 8 résume les résultats obtenus pour 15 anticorps anti-TIGIT sélectionnés.BE2017 / 5535 kDa 0.5 ml (Thermo Pierce, catalog no. 87766). A sahn gradient was established on a Dionex ProPac HIC-10 column ranging from 1.8 M ammonium sulphate, 0.1 M sodium phosphate at pH 6.5 on the same condition as in the absence of sulphate ammonium. The gradient lasted 17 minutes at a flow rate of 0.75 ml / min. An acetonitrile washing step was added at the end of the cycle to remove any remaining protein and the column was rebalanced over 7 column volumes before the next injection cycle. The peaks of the retention times were measured at absorbance at A280 and the elution concentrations of ammonium sulfate were calculated based on the gradient and the flow rate. Table 8 summarizes the results obtained for 15 selected anti-TIGIT antibodies.

Tableau 8 : Analyse par chromatographie d'interaction hydrophobe pour les anticorps anti-TIGIT sélectionnésTable 8: Analysis by hydrophobic interaction chromatography for the selected anti-TIGIT antibodies

Cione Cione Chromatographie d’interaction hydrophobe (HIC) Temps de rétention (min) Interaction chromatography hydrophobic (HIC) Retention time (min) 26518 26518 10,4 10.4 29478 29478 iiiiiiiiiiliiiiiil iiiiiiiiiiliiiiiil 26452 26452 9,3 9.3 29487 29487 liiiiiiiiiiliiii liiiiiiiiiiliiii 29489 29489 10,6 10.6 26486 26486 iiiiiiiiiiliiiiiil iiiiiiiiiiliiiiiil 29494 29494 9,7 9.7 29499 29499 26521 26521 12,4 12.4 29513 29513 iiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiii iiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiii 26493 26493 8,8 8.8 29520 29520 29523 29523 8,7 8.7 29527 29527 iiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiii^^ iiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiii ^^ 26432 26432 11,1 11.1 32919 32919 liiiiiiiiililiiiiiiiii liiiiiiiiililiiiiiiiii iiiiiiiiiiiiiiiliiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiii iiiiiiiiiiiiiiiliiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiii

Exemple 7 : Caractérisation de la préparation du réactif de polyspécificité PSRExample 7: Characterization of the preparation of the PSR polyspecificity reagent

A. Préparation du réactif de polyspécificité :A. Preparation of the polyspecificity reagent:

BE2017/5535BE2017 / 5535

Le réactif de polyspécificité (PSR) a été préparé selon Xu et. al., mAbs 2013. En bref, 2,5 litres de cellules CHO-S ont été utilisés comme matériau de départ. Les cellules ont été mises en culot à 2 400 x g pendant 5 minutes dans des bouteilles de centrifugation de 500 ml remplies à 400 ml. Les culots de cellules ont été combinés et ensuite resuspendus dans 25 ml de tampon B et mis en culot à 2 400 x g pendant 3 minutes. Le tampon a ensuite été décanté et le lavage répété une fois. Les culots de cellules ont été resuspendus dans 3 fois le volume du culot du tampon B contenant 1 x inhibiteur de protéase (Roche, cOmplete, EDTA-free) avec un homogénéisateur polytron, les cellules étant maintenues sur la glace. L'homogénat a ensuite été centrifugé à 2 400 x g pendant 5 minutes et le surnageant retenu et mis en culot une fois encore (2 400 x g/5 min) pour s'assurer de l'élimination des cellules non cassées, des débris cellulaires et des noyaux ; le surnageant ainsi obtenu représente la préparation de protéines totale. Le surnageant a ensuite été transféré dans deux tubes de centrifuge Nalgene Oak Ridge de 45 ml et mis en culot à 40 000 x g pendant 40 minutes à 4 °C. Les surnageants contenant les protéines systoliques séparées (SCP) ont ensuite été transférés dans des tubes Oak Ridge propres et centrifugés à 40 000 x g une fois de plus. En parallèle, les culots contenant la fraction membranaire (EMF) ont été retenus et centrifugés à 40 000 g pendant 20 minutes pour éliminer le surnageant résiduel. Les culots EMF ont ensuite été rincés avec le tampon B. 8 ml de tampon B ont ensuite été ajoutés aux culots membranaires pour déloger les culots et les transférer dans un homogénéisateur Dounce. Après homogénéisation des culots, ils ont été transférés dans un tube conique de 50 ml et représentaient la préparation EMF finale.The polyspecificity reagent (PSR) was prepared according to Xu and. al., mAbs 2013. In short, 2.5 liters of CHO-S cells were used as starting material. The cells were pelletized at 2400 x g for 5 minutes in 500 ml centrifuge bottles filled to 400 ml. The cell pellets were combined and then resuspended in 25 ml of buffer B and pelletized at 2400 x g for 3 minutes. The buffer was then decanted and the washing repeated once. The cell pellets were resuspended in 3 times the pellet volume of buffer B containing 1 × protease inhibitor (Roche, cOmplete, EDTA-free) with a polytron homogenizer, the cells being kept on ice. The homogenate was then centrifuged at 2400 xg for 5 minutes and the supernatant retained and pelletized once again (2400 xg / 5 min) to ensure removal of unbroken cells, cell debris and nuclei; the supernatant thus obtained represents the total protein preparation. The supernatant was then transferred to two 45 ml Nalgene Oak Ridge centrifuge tubes and pelletized at 40,000 x g for 40 minutes at 4 ° C. The supernatants containing the separated systolic proteins (SCP) were then transferred to clean Oak Ridge tubes and centrifuged at 40,000 x g once more. In parallel, the pellets containing the membrane fraction (EMF) were retained and centrifuged at 40,000 g for 20 minutes to remove the residual supernatant. The EMF pellets were then rinsed with buffer B. 8 ml of buffer B were then added to the membrane pellets to dislodge the pellets and transfer them to a Dounce homogenizer. After homogenization of the pellets, they were transferred to a 50 ml conical tube and represented the final EMF preparation.

Un milliard de cellules de mammifères (par ex., CHO, HEK293, Sf9) à environ 10⁶ à 10⁷cellules/ml ont été transférées de l'environnement de culture tissulaire dans 4 tubes coniques de 250 ml et mises en culot à 550 x g pendant 3 minutes. Toutes les étapes qui suivent ont été réalisées à 4 °C ou sur de la glace avec des tampons glacés. Les cellules ont été lavées avec 100 ml de PBSF (1 x PBS + 1 mg/ml BSA) et regroupées dans un tube conique. Après élimination du surnageant, le culot de cellules a ensuite été resuspendu dans 30 ml de tampon B (50 mM HEPES, 0,15 M NaCl, mM CaCI2, 5 mM KCI, 5 mM MgCI2, 10 % glycérol, pH 7,2) est mis en culot à 550 x g pendant minutes. Le surnageant du tampon B a été décanté et les cellules suspendues dans 3 fois le volume du culot de tampon B plus 2,5 x l'inhibiteur de protéase (Roche, cOmplete, EDTA-free). Des inhibiteurs de protéase dans le tampon B ont été systématiquement ajoutés à partir de cette étape. Les cellules ont été homogénéisées quatre fois par des impulsions de 30 secondes (Polyton homogenizer, PT1200E) et la fraction membranaire a été mise en culot à 40 000 x g pendant 1 heure à 4 °C. Le culot a été rincé dans 1 ml de tampon B ; le surnageant retenu et représente le « s ». Le culot a été transféré dans un homogénéisateur Dounce avec 3 ml de tampon B et resuspendu en bougeant lentement le pilon du haut vers le bas pendant 30 à 35 coups. La fraction membranaire enrichie (EMF) est mise dans un nouveau tube de collecte, en rinçant le pilon pour recueillir toutes les protéines potentielles. La concentration de protéines de l'EMF purifiée a été déterminée en utilisant la trousse de test Dc-protéine (BioRad). Pour solubiliser l'EMF, elle a été transférée dans le tampon deOne billion mammalian cells (eg, CHO, HEK293, Sf9) at approximately 10 ⁶ to 10 ⁷ cells / ml were transferred from the tissue culture environment into 4 conical tubes of 250 ml and pelletized at 550 xg for 3 minutes. All of the following steps were performed at 4 ° C or on ice with ice pads. The cells were washed with 100 ml of PBSF (1 x PBS + 1 mg / ml BSA) and pooled in a conical tube. After removal of the supernatant, the cell pellet was then resuspended in 30 ml of buffer B (50 mM HEPES, 0.15 M NaCl, mM CaCI2, 5 mM KCI, 5 mM MgCI2, 10% glycerol, pH 7.2) is pelletized at 550 xg for minutes. The buffer B supernatant was decanted and the cells suspended in 3 times the volume of the buffer B pellet plus 2.5 × the protease inhibitor (Roche, cOmplete, EDTA-free). Protease inhibitors in buffer B were systematically added from this step. The cells were homogenized four times by 30 second pulses (Polyton homogenizer, PT1200E) and the membrane fraction was pelletized at 40,000 xg for 1 hour at 4 ° C. The pellet was rinsed in 1 ml of buffer B; the supernatant retained and represents the "s". The pellet was transferred to a Dounce homogenizer with 3 ml of buffer B and resuspended by slowly moving the pestle from top to bottom for 30 to 35 strokes. The enriched membrane fraction (EMF) is put in a new collection tube, rinsing the pestle to collect all the potential proteins. The protein concentration of the purified EMF was determined using the Dc-protein test kit (BioRad). To dissolve the EMF, it was transferred to the buffer of

BE2017/5535 solubilisation (50 mM HEPES, 0,15 M NaCl, 2 mM CaCI2, 5 mM KCI, 5 mM MgCI2, 1 % n-Dodécyl-bD-Maltopyranoside (DDM), 1 x inhibiteur de protéase, pH 7,2) à une concentration finale de 1 mg/ml. Le mélange a été mis sous rotation pendant toute une nuit à 4 °C, suivi d'une centrifugation dans un tube Oak Ridge de 50 ml (Fisher Scientific, 050529-ID) à 40 000 x g pendant 1 heure. Le surnageant contenant les protéines membranaires solubles (SMP) a été receuilli avant la quantification du rendement en protéines comme décrit ci-dessus.BE2017 / 5535 solubilization (50 mM HEPES, 0.15 M NaCl, 2 mM CaCI2, 5 mM KCI, 5 mM MgCI2, 1% n-Dodecyl-bD-Maltopyranoside (DDM), 1 x protease inhibitor, pH 7.2 ) at a final concentration of 1 mg / ml. The mixture was rotated overnight at 4 ° C, followed by centrifugation in a 50 ml Oak Ridge tube (Fisher Scientific, 050529-ID) at 40,000 x g for 1 hour. The supernatant containing the soluble membrane proteins (SMP) was collected before the quantification of the protein yield as described above.

Pour la biotinylation, la solution mère de NHS-LC-Biotine a été préparée selon le protocole du fabricant (Pierce, Thermo Fisher). Brièvement, 20 pi de réactif biotine est ajouté pour chaque mg d'échantillon EMF et incubé à 4 °C pendant 3 heures sous agitation lente. Le volume est ajusté à 25 ml avec le tampon B et transféré dans un tube de centrifugation Oak Ridge. Ensuite, une mise en culot de l'EMF biotinylée (b-EMF) à 40 000 x g pendant une heure, et deux rinçages avec 3 ml de tampon C (tampon B moins le glycérol) sans déranger le culot. La solution résiduelle est éliminée et le culot resuspendu avec un homogénéisateur Dounce dans 3 ml de tampon C comme décrit précédemment. Le culot resuspendu représente maintenant l'EMF biotinylée (b-EMF). Les b-SMP sont préparées en solubilisant comme décrit précédemment.For biotinylation, the NHS-LC-Biotin stock solution was prepared according to the manufacturer's protocol (Pierce, Thermo Fisher). Briefly, 20 µl of biotin reagent is added for each mg of EMF sample and incubated at 4 ° C for 3 hours with slow shaking. The volume is adjusted to 25 ml with buffer B and transferred to an Oak Ridge centrifuge tube. Then, pellet the biotinylated EMF (b-EMF) at 40,000 x g for one hour, and two rinses with 3 ml of buffer C (buffer B minus glycerol) without disturbing the pellet. The residual solution is removed and the residue resuspended with a Dounce homogenizer in 3 ml of buffer C as described above. The resuspended pellet now represents the biotinylated EMF (b-EMF). The b-SMPs are prepared by solubilizing as described above.

B. Analyses de liaison PSRB. PSR linkage analyzes

Les analyses PSR ont été réalisées comme il est décrit dans le brevet WO2014/179363.PSR analyzes were carried out as described in patent WO2014 / 179363.

Brièvement, pour caractériser le profil PSR des anticorps monoclonaux présentés sur la levure, deux millions de levures présentant des IgG ont été transférées dans une plaque d'essai de 96 puits et mises en culot à 3 000 x g pendant 3 minutes pour éliminer le surnageant. Le culot a été resuspendu dans 50 pi de solution de dilution b-PSRs 1:10 fraîchement préparée et incubé sur de la glace pendant 20 minutes. Les cellules ont été lavées deux fois avec 200 pl de PBSF froid et le culot resuspendu dans 50 pi de mélange de marquage secondaire (Extravidine-R-PE, LC-FITC anti-humain et iodure de propidium). Le mélange a été incubé sur glace pendant 20 minutes suivi par deux lavages avec 200 pi de PBSF glacé. Les cellules ont été resuspendues dans 100 pi de PBSF glacé et la plaque a été analysée dans un FACS Canto (BD Biosciences) utilisant un injecteur d'échantillon HTS. Les données de la cytométrie de flux ont été analysées pour l'intensité de fluorescence moyenne dans le canal R-PE et normalisées sur des témoins appropriés afin d'évaluer la liaison non spécifique. Le Tableau 9 résume les résultats de la liaison du réactif de polyspécificité obtenus pour 15 anticorps anti-TIGIT sélectionnés, ce que confirme les faibles scores pour la plupart des clones.Briefly, to characterize the PSR profile of the monoclonal antibodies presented on the yeast, two million yeasts presenting IgG were transferred to a 96-well test plate and pelletized at 3000 × g for 3 minutes to remove the supernatant. The pellet was resuspended in 50 µl of freshly prepared b-PSRs 1:10 dilution solution and incubated on ice for 20 minutes. The cells were washed twice with 200 μl of cold PBSF and the pellet resuspended in 50 μl of secondary labeling mixture (Extravidine-R-PE, anti-human LC-FITC and propidium iodide). The mixture was incubated on ice for 20 minutes followed by two washes with 200 µl ice cold PBSF. The cells were resuspended in 100 μl of ice-cold PBSF and the plate was analyzed in a FACS Canto (BD Biosciences) using an HTS sample injector. The flow cytometry data were analyzed for the average fluorescence intensity in the R-PE channel and normalized on appropriate controls to assess non-specific binding. Table 9 summarizes the polyspecific reagent binding results obtained for 15 selected anti-TIGIT antibodies, which is confirmed by the low scores for most of the clones.

Tableau 9 : Analyse du réactif de polyspécificitéTable 9: Analysis of the polyspecificity reagent

Clone clone Score (0-1) du réactif de polyspécificité Polyspecificity reagent score (0-1) 26518 26518 0,00 0.00 29478 29478 llllllllllllllllllll^ llllllllllllllllllll ^ 26452 26452 0.00 0.00

BE2017/5535BE2017 / 5535

29487 29487 ||||||||||||||||1|||||||||| |||||||||||||||| 1 |||||||||| 29489 29489 0,01 0.01 26486 26486 lllllllllllillllllllllllll lllllllllllillllllllllllll 29494 29494 0,00 0.00 29499 29499 lllllllllllillllllllllllll^ lllllllllllillllllllllllll ^ 26521 26521 0.00 0.00 29513 29513 llllllllillllll llllllllillllll 26493 26493 0,00 0.00 29520 29520 29523 29523 0,12 0.12 2952/ 2952 / lllllllllllillllllllllllll lllllllllllillllllllllllll 26432 26432 0 00 0 00 31288 31288 lllllllillllllllllllllllllll lllllllillllllllllllllllllll 32919 32919 32931 32931 llllllllllllllll llllllllllllllll

Exemple 8 : Caractérisation de l'expression de la TIGIT sur les populations immunitaires provenant de PBMC humaines sainesExample 8 Characterization of the Expression of TIGIT on Immune Populations Coming from Healthy Human PBMCs

A. Profil d'expression de la TIGIT sur des sous-ensembles de lymphocytes TA. TIGIT expression profile on T lymphocyte subsets

Des analyses par cytométrie de flux ont été réalisées pour évaluer l'expression de TIGIT sur des sous-populations de cellules immunitaires sur les PBMC fraîchement isolées provenant d'individus sains. Des anticorps conjugués ont été achetés chez Ebioscience/Thermo Fisher Scientific, BioLegend ou BD Biosciences. Les cellules ont été colorées selon les instructions du fabricant en utilisant le tampon FACS filtré (PBS + 2mM EDTA + 0,1 % BSA) et le tampon Brilliant Stain (BD #563794). Les cellules ont été bloquées avec le FcBlock (BD #564220) humain approprié avant la coloration et ont été fixées avec le tampon de fixation Cl (eBioscience #00-8222-49) avant l'acquisition. L'acquisition a été réalisée sur un FACS Fortessa (BD Biosciences) et analysée avec le logiciel FlowJo (FlowJo, LLC). Les cellules viables ont été délimitées grâce à leur taille et leur granularité. Divers sous-populations de cellules immunitaires ont été définies comme suit : CD19⁺(lymphocytes B), CD3' CD19' CD14⁺ (monocytes), CD3⁺ TCRab' (cellules TCRgd T), CD3⁺ TCRab⁺(TCRab lymphocytes T), CD3' CD19’ CD14’ HLA-DR' CD56^{faible/élevé} (cellules NK), CD3' CD19’ CD14' HLA-DR⁺ (cellules dendritiques), CD3⁺ TCRab⁺ CD4⁺ CD127^faible CD25⁺ (lymphocytes T régulateurs), CD3⁺ TCRab⁺ CD4⁺ ou CD8⁺ CD45RO' CCR7⁺ (CD4 ou CD8 lymphocytes T naïfs), CD3⁺ TCRab⁺CD4⁺ ou CD8⁺ CD45RO⁺ (lymphocytes T mémoire) et CD45ROCD62L' (lymphocytes T effecteurs),Flow cytometry analyzes were performed to assess the expression of TIGIT on immune cell subpopulations on freshly isolated PBMCs from healthy individuals. Conjugated antibodies were purchased from Ebioscience / Thermo Fisher Scientific, BioLegend or BD Biosciences. The cells were stained according to the manufacturer's instructions using the filtered FACS buffer (PBS + 2mM EDTA + 0.1% BSA) and the Brilliant Stain buffer (BD # 563794). Cells were blocked with the appropriate human FcBlock (BD # 564220) before staining and were fixed with Cl fixation buffer (eBioscience # 00-8222-49) before acquisition. The acquisition was carried out on a Fortessa FACS (BD Biosciences) and analyzed with FlowJo software (FlowJo, LLC). The viable cells were delimited thanks to their size and their granularity. Various subpopulations of immune cells have been defined as follows: CD19 ⁺ (B lymphocytes), CD3 'CD19' CD14 ⁺ (monocytes), CD3 ⁺ TCRab '(TCRgd T cells), CD3 ⁺ TCRab ⁺ (TCRab T lymphocytes), CD3 'CD19' CD14 'HLA-DR' CD56 ^{low / high} (NK cells), CD3 'CD19' CD14 'HLA-DR ⁺ (dendritic cells), CD3 ⁺ TCRab ⁺ CD4 ⁺ CD127 ^low CD25 ⁺ (regulatory T lymphocytes), CD3 ⁺ TCRab ⁺ CD4 ⁺ or CD8 ⁺ CD45RO 'CCR7 ⁺ (CD4 or CD8 naive T lymphocytes), CD3 ⁺ TCRab ⁺ CD4 ⁺ or CD8 ⁺ CD45RO ⁺ (memory T lymphocytes) and CD45ROCD62L' (effector T lymphocytes),

Comme il est démontré dans la Figure 8A and 8B, TIGIT est préférentiellement exprimée sur les cellules NK, les lymphocytes T régulateurs et les lymphocytes T CD8 mémoire. La protéine TIGIT est présente à un niveau plus faible sur d'autres sous-populations de lymphocytes T avec une faibleAs shown in Figure 8A and 8B, TIGIT is preferentially expressed on NK cells, regulatory T cells and memory CD8 T cells. The TIGIT protein is present at a lower level on other T lymphocyte subpopulations with a low

BE2017/5535 proportion de lymphocytes T naïfs démontrant une expression de TIGIT. En outre, TIGIT n'est pas exprimé sur les monocytes, les cellules dendritiques et les lymphocytes B (Fig. 8B). Cet ensemble de données est en accord avec les données publiées (Yu et al. NI 2008 et Wang et al. EJI 2015).BE2017 / 5535 proportion of naive T lymphocytes demonstrating TIGIT expression. In addition, TIGIT is not expressed on monocytes, dendritic cells and B lymphocytes (Fig. 8B). This dataset is in agreement with the published data (Yu et al. NI 2008 and Wang et al. EJI 2015).

Exemple 9 : Liaison cellulaire des anticorps antagonistes anti-TIGITEXAMPLE 9 Cell Binding of Antagonistic Anti-TIGIT Antibodies

A. Liaison des anticorps anti-TIGIT aux Jurkat-hTIGIT et Jurkat-mTIGITA. Binding of anti-TIGIT antibodies to Jurkat-hTIGIT and Jurkat-mTIGIT

L'affinité des anticorps anti-TIGIT humains a été mesurée avec des cellules Jurkat E6.1 transduites avec un vecteur contenant la séquence de TIGIT humain (Jurkat hTIGIT) ou murin (JurkatmTIGIT). Afin d'analyser l'affinité des anticorps sélectionnés pour hTIGIT ou mTIGIT, 10⁵ cellules ont été distribuées par puits et incubées avec l'anticorps anti-TIGIT à une dose unique de 100 nM (Tableau 3) ou avec une concentration décroissante (166,6 ; 53,24 ; 17,01 ; 5,43 ; 1,73 ; 0,55 ; 0,17 ; 0,05; 0,01 ; 5,78 x 10'³; 1,85 x 10'³; 5,9 x 10'³nM) des anticorps sélectionnés (Figure 9). Les anticorps ont été incubés avec les cellules pendant 20 minutes à 4 °C dans le tampon FACS. Après lavage, les cellules ont été incubées avec l'Ig anti humain (Fc gamma spécifique)-PE (eBioscience, 12-4998-82, à 2,5pg/ml) pendant 20 minutes sur glace et lavées deux fois. L'intensité de la fluorescence moyenne géométrique a été analysée avec LSR BD Fortessa. La liaison cellulaire a été enregistrée sous la forme de l'intensité de fluorescence moyenne du PE sur la lignée transfectée en comparaison à la lignée non-transfectée pour chaque anticorps (Tableau 3). Pour le calcul de la liaison CE50, la concentration semi-maximale de liaison (CE50) aux hTIGIT-Jurkat a été calculée avec une équation de courbe d'ajustement à quatre variables dans Prism, et les valeurs obtenues étaient les suivantes : 0,082 nM pour le clone 29489 ; 0,07 nM pour le clone 29494 ; 0,119 nM pour le clone 29520 et 0,05 nM pour le clone 29527 pour les données illustrées dans la Figure 9. Les résultats démontrent une forte liaison de la TIGIT humaine exprimée sur la membrane pour les anticorps antiTIGIT testés.The affinity of human anti-TIGIT antibodies was measured with Jurkat E6.1 cells transduced with a vector containing the human (Jurkat hTIGIT) or murine (JurkatmTIGIT) TIGIT sequence. In order to analyze the affinity of the antibodies selected for hTIGIT or mTIGIT, 10 ⁵ cells were distributed per well and incubated with the anti-TIGIT antibody at a single dose of 100 nM (Table 3) or with a decreasing concentration (166 , 6; 53.24; 17.01; 5.43; 1.73; 0.55; 0.17; 0.05; 0.01; 5.78 x 10 '³; 1.85 x 10'³; 5.9 x 10 ' ³ nM) of the selected antibodies (Figure 9). The antibodies were incubated with the cells for 20 minutes at 4 ° C in FACS buffer. After washing, the cells were incubated with anti-human Ig (specific gamma Fc) -PE (eBioscience, 12-4998-82, at 2.5 μg / ml) for 20 minutes on ice and washed twice. The intensity of the geometric mean fluorescence was analyzed with LSR BD Fortessa. Cell binding was recorded as the average fluorescence intensity of PE on the transfected line compared to the non-transfected line for each antibody (Table 3). For the calculation of the CE50 binding, the semi-maximum binding concentration (CE50) to hTIGIT-Jurkat was calculated with a four-variable adjustment curve equation in Prism, and the values obtained were as follows: 0.082 nM for clone 29489; 0.07 nM for clone 29494; 0.119 nM for clone 29520 and 0.05 nM for clone 29527 for the data illustrated in FIG. 9. The results demonstrate a strong binding of human TIGIT expressed on the membrane for the antiTIGIT antibodies tested.

B. Liaison des anticorps antagonistes anti-TIGIT aux lymphocytes T primaires humainsB. Binding of anti-TIGIT antagonist antibodies to human primary T lymphocytes

Des PBMC humaines isolées provenant de volontaires sains ont été analysées pour la liaison par les anticorps anti-TIGIT agonistes. Les cellules ont été distribuées à 5 x 10⁵ par puits. Les cellules ont été incubées avec l'anti-CD16 (Clone 3G8, BioLegend 302002), CD32 (Clone FLI8.26, BD Bioscience 557333) et CD64 (BD Bioscience 555525) à température ambiante pendant 10 minutes, et les anticorps anti-humains TIGIT indiqués ont été directement ajoutés à une concentration finale de : 12,65 ; 4 ; 1,26 ; 0,40 ; 0,126 ; 0,040 ; 0,12 et 4x10'³ nM dans un tampon FACS et incubés pendant 20 minutes à 4 °C. Après lavage, les cellules ont été incubées avec l'Ig anti-humain (Fc gamma spécifique)-PE (eBioscience, 12-4998-82, à 2,5pg/ ml) pendant 20 minutes à 4 °C. Ensuite, les cellules ont été lavées et incubées avec les anticorps suivants et un mélange LVD pour les résultats des Figures 10A et 10B : anti-CD4-PercP-Cy5.5 (clone A161A1, BioLegend 357414); anti-CD8BV510 (clone SK1, BD Bioscience 563919) et LVD efluor 520 (eBioscience 65-0867-14). Pour laIsolated human PBMCs from healthy volunteers were analyzed for binding by anti-TIGIT agonist antibodies. The cells were distributed at 5 x 10 ⁵ per well. The cells were incubated with anti-CD16 (Clone 3G8, BioLegend 302002), CD32 (Clone FLI8.26, BD Bioscience 557333) and CD64 (BD Bioscience 555525) at room temperature for 10 minutes, and anti-human antibodies TIGIT indicated were directly added to a final concentration of: 12.65; 4; 1.26; 0.40; 0.126; 0.040; 0.12 and 4x10 ' ³ nM in FACS buffer and incubated for 20 minutes at 4 ° C. After washing, the cells were incubated with anti-human Ig (specific gamma Fc) -PE (eBioscience, 12-4998-82, at 2.5 μg / ml) for 20 minutes at 4 ° C. Then, the cells were washed and incubated with the following antibodies and an LVD mixture for the results of FIGS. 10A and 10B: anti-CD4-PercP-Cy5.5 (clone A161A1, BioLegend 357414); anti-CD8BV510 (clone SK1, BD Bioscience 563919) and LVD efluor 520 (eBioscience 65-0867-14). For the

BE2017/5535 Figure 10 C, les cellules ont été lavées et incubées avec les anticorps suivants et le mélange LVD : LVD efluor 520 (eBioscience 65-0867-14), ant-TCRab-PercP-Cy5.5 (Clone IP26, Biolegend 306723), anti-CD4-BV510 (Clone SK3, BD Horizon 562970), anti-CD8-APC-Cy7 (Clone SK1, Biolegend 344714), anti-CD25-BV605 (Clone 2A3, Biolegend 562660), anti-CD 127-APC (A019D5, Biolegend 351316), anti-CCR7-BV421 (Clone G043H7, Biolegend 353207) et anti-CD45RO-PE-Cy7 (Clone UCHL1, Biolegend 304229).BE2017 / 5535 Figure 10 C, the cells were washed and incubated with the following antibodies and the LVD mixture: LVD efluor 520 (eBioscience 65-0867-14), ant-TCRab-PercP-Cy5.5 (Clone IP26, Biolegend 306723 ), anti-CD4-BV510 (Clone SK3, BD Horizon 562970), anti-CD8-APC-Cy7 (Clone SK1, Biolegend 344714), anti-CD25-BV605 (Clone 2A3, Biolegend 562660), anti-CD 127-APC (A019D5, Biolegend 351316), anti-CCR7-BV421 (Clone G043H7, Biolegend 353207) and anti-CD45RO-PE-Cy7 (Clone UCHL1, Biolegend 304229).

La valeur de CE₅₀ pour la liaison aux lymphocytes T CD8⁺ primaires humains a été calculée en utilisant le % des cellules positives pour TIGIT positives sur les lymphocytes T LVD'CD8⁺ (Figures 10A et 10B). La valeur de CE₅₀ pour la liaison aux lymphocytes T mémoire CD8⁺ ou aux lymphocytes T Treg primaires humains a été calculée en utilisant le % de cellules TIGIT positives sur les lymphocytes T LVD TCRab⁺CD45RO⁺CD8⁺ polarisés (pour les lymphocytes T mémoire CD8⁺) ou sur les lymphocytes T LVD TCRab⁺CD127^l0CD25^hlCD4⁺ polarisés (pour les Tregs) et est illustrée dans la Figure 10C.The EC ₅₀ value for binding to human primary CD8 ⁺ T cells was calculated using the% of TIGIT positive cells positive on LVD'CD8 ⁺ T cells (Figures 10A and 10B). The EC ₅₀ value for binding to CD8 ⁺ memory T cells or primary human Treg T cells was calculated using the% TIGIT cells positive on LVD TCRab ⁺ CD45RO ⁺ CD8 ⁺ polarized T cells (for memory T cells CD8 ⁺ ) or on LVD TCRab ⁺ T lymphocytes CD127 ^l0 CD25 ^hl CD4 ⁺ polarized (for Tregs) and is illustrated in Figure 10C.

Comme le montre la Figure 10A, la valeur de CE₅₀ pour la liaison aux lymphocytes T CD8⁺totalement humains est de 0,123 nM pour le clone 29489 ; 0,181 nM, pour le clone 29520 et 0,253 nM pour le clone 29527. Une comparaison directe entre 29489 et 31282 (le mutant 29489 avec une mutation M vers T sur le résidu 116) a été réalisée, et la valeur CE50 était de 0,057 nM et 0,086 nM respectivement, démontrant une efficacité de liaison forte et semblable aux lymphocytes T CD8⁺primaires humains pour les 2 clones (Figure 10B). Les valeurs de CE50 obtenues pour la liaison aux lymphocytes T CD8⁺ mémoire et aux Treg étaient de 0,039 nM et 0,03 nM respectivement, démontrant une affinité forte et semblable pour les deux populations (Figure 10C).As shown in Figure 10A, the EC ₅₀ value for binding to fully human CD8 ⁺ T cells is 0.123 nM for clone 29489; 0.181 nM, for clone 29520 and 0.253 nM for clone 29527. A direct comparison between 29489 and 31282 (mutant 29489 with an M to T mutation on residue 116) was carried out, and the EC50 value was 0.057 nM and 0.086 nM respectively, demonstrating a strong binding efficiency similar to the primary human CD8 ⁺ T lymphocytes for the 2 clones (FIG. 10B). The EC50 values obtained for binding to memory CD8 ⁺ T cells and to Tregs were 0.039 nM and 0.03 nM respectively, demonstrating a strong and similar affinity for the two populations (Figure 10C).

C. Liaison des anticorps antagonistes anti-TIGIT aux lymphocytes T primairesC. Binding of anti-TIGIT antagonist antibodies to primary T lymphocytes

Cynomolguscynomolgus

Des PBMC isolées de Macaca fascicularis ont été obtenues chez BioPRIM. Les cellules ont été décongelées et stimulées avec une solution d'activation/de propagation de lymphocytes T pour les primates non humains (Miltenyi Biotec) à 1:2 (rapport bille:cellule) suivant les spécifications du fabricant. Le jour suivant, les cellules ont été récoltées, comptées et distribuées à 5 x 10⁴ cellules par puits. Les cellules ont été incubées avec l'anti-CD16 (Clone 3G8, BioLegend 302002), CD32 (Clone FLI8.26, BD Bioscience 557333) et CD64 (BD Bioscience 555525) à température ambiante pendant 10 minutes, et les anticorps anti-humains TIGIT sélectionnés ont été directement ajoutés à une concentration finale de : 12,65 ; 4 ; 1,26 ; 0,40 ; 0,126 ; 0,040 ; 0,12 et 4 x 10'³ nM dans un tampon FACS et incubées pendant 20 minutes à 4 °C. Après lavage, les cellules ont été incubées avec l'Ig anti-humain (Fc gamma spécifique)-PE (eBioscience, 12-4998-82, à 2,5pg/ml) pendant 20minutes à 4 °C. Ensuite, les cellules ont été lavées et incubées avec les anticorps suivants et un mélange LVD pour les données illustrées dans les Figures 11A et 11B : anti-CD4-PercP-Cy5.5 (clone A161A1, BioLegend 357414); anti-CD8-BV510 (clone SK1, BD Bioscience 563919), CD69-APC-Cy7 (Clone FN50, BioLegend, 310914) et LVD efluor 520 (eBioscience 65-0867-14). Les cellules marquées ontPBMCs isolated from Macaca fascicularis were obtained from BioPRIM. The cells were thawed and stimulated with a T cell activation / propagation solution for non-human primates (Miltenyi Biotec) at 1: 2 (ball: cell ratio) according to the manufacturer's specifications. The next day, the cells were harvested, counted and distributed to 5 x 10 ⁴ cells per well. The cells were incubated with anti-CD16 (Clone 3G8, BioLegend 302002), CD32 (Clone FLI8.26, BD Bioscience 557333) and CD64 (BD Bioscience 555525) at room temperature for 10 minutes, and anti-human antibodies TIGIT selected were directly added to a final concentration of: 12.65; 4; 1.26; 0.40; 0.126; 0.040; 0.12 and 4 x 10 ' ³ nM in FACS buffer and incubated for 20 minutes at 4 ° C. After washing, the cells were incubated with anti-human Ig (specific gamma Fc) -PE (eBioscience, 12-4998-82, at 2.5 μg / ml) for 20 minutes at 4 ° C. Then, the cells were washed and incubated with the following antibodies and an LVD mixture for the data illustrated in Figures 11A and 11B: anti-CD4-PercP-Cy5.5 (clone A161A1, BioLegend 357414); anti-CD8-BV510 (clone SK1, BD Bioscience 563919), CD69-APC-Cy7 (Clone FN50, BioLegend, 310914) and LVD efluor 520 (eBioscience 65-0867-14). The labeled cells have

BE2017/5535 été analysées par FACS utilisant BD LSR Fortessa. La valeur de CE50 pour la liaison a été calculée en utilisant le % des cellules marquées par TIGIT positives sur les lymphocytes T LVD'CD69⁺CD8⁺polarisés. Comme le montre la Figure 11, les valeurs de CE₅₀ pour la liaison aux lymphocytes T CD8⁺de cynomolgus étaient de 0,487 nM pour le clone 29489, 1,73 nM pour le clone 29520 et 0,378 nM pour le clone 29527. Les clones 29489 et 31282 (le mutant 29489 avec une mutation M vers T sur le résidu 116) ont également été comparés, et les valeurs de CE₅₀ étaient de 0,25 nM et 0,26 nM respectivement pour l'exemple illustré dans la Figure 11 B, démontrant une affinité forte et semblable pour les lymphocytes T CD8⁺ primaires de cynomolgus pour les deux clones.BE2017 / 5535 been analyzed by FACS using BD LSR Fortessa. The EC50 value for binding was calculated using the% of TIGIT positive labeled cells on LVD'CD69 ⁺ CD8 ⁺ polarized T cells. As shown in Figure 11, the EC ₅₀ values for binding to cynomolgus CD8 ⁺ T lymphocytes were 0.487 nM for clone 29489, 1.73 nM for clone 29520 and 0.378 nM for clone 29527. Clones 29489 and 31282 (mutant 29489 with an M to T mutation on residue 116) were also compared, and the EC ₅₀ values were 0.25 nM and 0.26 nM respectively for the example illustrated in Figure 11B , demonstrating a strong and similar affinity for the primary CD8 ⁺ T cells of cynomolgus for the two clones.

BE2017/5535 Exemple 10 : Caractérisation fonctionnelle in vitro de l'activité anti-TIGIT antagonisteBE2017 / 5535 Example 10: In vitro functional characterization of the antagonistic anti-TIGIT activity

A. Bioessai TIGIT sur une co-culture CHO-TCR-CD155 et Jurkat-hTIGITA. TIGIT bioassay on a CHO-TCR-CD155 and Jurkat-hTIGIT co-culture

Pour caractériser la conséquence fonctionnelle du blocage du récepteur TIGIT humain, nous avons co-cultivé des cellules Jurkat, qui expriment le hTIGIT et un rapporteur luciférase activé lors du contact des TCR (cellules effectrices TIGIT « Thaw-and-Use » (Décongeler et utiliser) de Promega), avec la lignée cellulaire CHO-K1 modifiée pour exprimer le CD155 humain et l'activateur TCR (CD155 aAPC/CHO-K1 « Thaw-and-Use » de Promega). L'activation des cellules Jurkat surexprimant le TIGIT peut être induite par contact avec les cellules CHO-K1 exprimant le CD155 lors du contact du TCR avec les cellules Jurkat et peut être augmentée en présence d'un anticorps anti-TIGIT antagoniste. Afin de comparer la puissance des différents anticorps pour augmenter l'activation des cellules Jurkat, l'expérience a été réalisée en présence de concentrations croissantes d'anticorps et les valeurs de CE50 ont été calculées.To characterize the functional consequence of blocking the human TIGIT receptor, we co-cultivated Jurkat cells, which express hTIGIT and a luciferase reporter activated during contact with TCRs (TIGIT effector cells "Thaw-and-Use" (Thaw and use ) from Promega), with the CHO-K1 cell line modified to express human CD155 and the TCR activator (CD155 aAPC / CHO-K1 "Thaw-and-Use" from Promega). Activation of Jurkat cells overexpressing TIGIT can be induced by contact with CHO-K1 cells expressing CD155 during contact of TCR with Jurkat cells and can be increased in the presence of an antagonistic anti-TIGIT antibody. In order to compare the power of the different antibodies to increase the activation of Jurkat cells, the experiment was carried out in the presence of increasing concentrations of antibodies and the EC50 values were calculated.

Les cellules «Thaw-and-Use» CD155 aAPC/CHO-K1 (Promega, CS198811) ont été ensemencées selon les recommandations du fabricant et incubées à 37 °C, 5 % CO2 dans un incubateur O/N. Le jour suivant, les cellules effectrices TIGIT « Thaw-and-Use » (Promega, CS198811) ont été ajoutées selon les recommandations du fabricant aux plaques cellulaires de CD155 aAPC/CHO-K1 contenant un milieu complet frais avec l'anticorps anti-TIGIT à 133 nM (Figure 12A) ou des concentrations croissantes (0,22; 0,54; 1,36; 3,41 ; 8,53; 21,3; 53,3; 133,33 et 333 nM) d'anticorps anti-TIGIT (Figure 12B) et incubées à 37 °C, 5 % CO2 pendant 6 heures.The “Thaw-and-Use” CD155 aAPC / CHO-K1 cells (Promega, CS198811) were seeded according to the manufacturer's recommendations and incubated at 37 ° C, 5% CO2 in an O / N incubator. The following day, the TIGIT “Thaw-and-Use” effector cells (Promega, CS198811) were added according to the manufacturer's recommendations to the CD155 aAPC / CHO-K1 cell plates containing fresh complete medium with the anti-TIGIT antibody. at 133 nM (Figure 12A) or increasing concentrations (0.22; 0.54; 1.36; 3.41; 8.53; 21.3; 53.3; 133.33 and 333 nM) of antibodies anti-TIGIT (Figure 12B) and incubated at 37 ° C, 5% CO2 for 6 hours.

Après les 6 heures d'incubation, l'activation des cellules effectrices TIGIT a été évaluée en mesurant l'activité luciférase à l'aide d'un système de test Bio-GloTM Luciferase (Promega, G7941).After the 6 hours of incubation, the activation of the TIGIT effector cells was evaluated by measuring the luciferase activity using a Bio-GloTM Luciferase test system (Promega, G7941).

Comme montré dans la Figure 12A, l'ajout de tous les clones sélectionnés (à l'exception du 26493 qui est spécifique pour la TIGIT murin) a fait augmenter le signal luciférase en comparaison à l'isotype témoin, démontrant l'activité antagoniste de ces anticorps qui a entraîné une activation plus forte des cellules Jurkat-hTIGIT. Le Tableau 10 résume le facteur multiplificatif de changement dans l'induction de l'expression de la luciférase obtenue pour les différents anticorps anti-TIGIT en comparaison au clone isotype contrôle (03847).As shown in Figure 12A, the addition of all selected clones (except 26493 which is specific for murine TIGIT) increased the luciferase signal compared to the control isotype, demonstrating the antagonistic activity of these antibodies which resulted in stronger activation of Jurkat-hTIGIT cells. Table 10 summarizes the multiplying factor of change in the induction of the expression of the luciferase obtained for the various anti-TIGIT antibodies in comparison with the isotype control clone (03847).

Tableau 10 : Facteur multiplificatif de changement dans l'induction par rapport à l'isotype témoinTable 10: Multiplying factor of change in induction compared to the control isotype

Nom du cloné Clone name 1111¾^ 11¾¾¾ multiplitteatif) 1111¾ ^ 11¾¾¾ multiplitteatif) 26518 26518 2.89 2.89

BE2017/5535BE2017 / 5535

Comme il est démontré dans la Figure 12B, l'activation des cellules Jurkat-hTIGIT a été évaluée avec un anticorps anti-TIGIT entre 0,22 nM et 333 nM et a donné une valeur de CE₅₀ de 3,0 nM pour le clone 29489 ; 4,4 nM pour le clone 29494 ; 2,3 nM pour le clone 29520 et 32 nM pour le clone 29527 ; 2,7 nM pour le clone 32919 et 3,2 nM pour le clone 32931 démontrant une activité fonctionnelle puissante suite au blocage du signal inhibiteur TIGIT. Les clones 29489 et 31282 (le mutant 29489 avec une mutation M vers T sur le résidu 116) ont également été comparés, et les valeurs de CE₅₀ étaient respectivement de 4,3 nM et 8,1 nM pour l'exemple illustré dans la Figure 12C, démontrant une activité fonctionnelle semblable pour les deux clones.As shown in Figure 12B, the activation of Jurkat-hTIGIT cells was evaluated with an anti-TIGIT antibody between 0.22 nM and 333 nM and gave an EC ₅₀ value of 3.0 nM for the clone 29489; 4.4 nM for clone 29494; 2.3 nM for clone 29520 and 32 nM for clone 29527; 2.7 nM for clone 32919 and 3.2 nM for clone 32931 demonstrating a powerful functional activity following blockade of the inhibitory signal TIGIT. Clones 29489 and 31282 (mutant 29489 with an M to T mutation on residue 116) were also compared, and the EC ₅₀ values were 4.3 nM and 8.1 nM respectively for the example illustrated in the Figure 12C, demonstrating similar functional activity for the two clones.

B. Essai fonctionnel basé sur les lymphocytes T CD8⁺ primaires humainsB. Functional test based on human primary CD8 ⁺ T lymphocytes

Pour caractériser la conséquence fonctionnelle du blocage du récepteur TIGIT humain, nous avons co-cultivé des lymphocytes T CD8⁺ humains provenant des PBMC de donneurs humains sains avec la lignée cellulaire CHO-K1 modifiée pour exprimer le CD155 humain et pour activer les lymphocytes T humains. Nous avons observé que la libération des IFNg par les lymphocytes T CD8⁺en présence des cellules CHO-K1 exprimant le CD155 pouvait être augmentée en bloquant le hTIGIT avec des anticorps anti-TIGIT antagonistes. Afin de comparer la puissance de ces anticorps à augmenter la libération de l'IFNg, l'expérience a été réalisée en présence de concentrations croissantes d'anticorps et les valeurs de CE₅₀ ont été calculées.To characterize the functional consequence of blocking the human TIGIT receptor, we co-cultivated human CD8 ⁺ T lymphocytes from PBMCs of healthy human donors with the CHO-K1 cell line modified to express human CD155 and to activate human T lymphocytes . We observed that the release of IFNg by CD8 ⁺ T lymphocytes in the presence of CD155-expressing CHO-K1 cells could be increased by blocking hTIGIT with antagonistic anti-TIGIT antibodies. In order to compare the power of these antibodies to increase the release of IFNg, the experiment was carried out in the presence of increasing concentrations of antibodies and the EC ₅₀ values were calculated.

Les cellules « Thaw-and-Use » CD155 aAPC/CHO-K1 (Promega, CS198811) ont été ensemencées dans les plaques à 96 puits à fond en U selon les recommandations du fabricant et incubées à 37 °C, 5 % CO2 dans un incubateur O/N. Le jour suivant, les lymphocytes T CD8⁺ ont été purifiés selon les recommandations du fabricant en utilisant des solutions de sélection négative (Stemcell Technologies, 17953) provenant de cellules mononucléées du sang périphérique humainThe “Thaw-and-Use” CD155 aAPC / CHO-K1 cells (Promega, CS198811) were seeded in 96-well plates with U-bottom according to the manufacturer's recommendations and incubated at 37 ° C, 5% CO2 in a O / N incubator. The following day, the CD8 ⁺ T lymphocytes were purified according to the manufacturer's recommendations using negative selection solutions (Stemcell Technologies, 17953) from mononuclear cells from human peripheral blood.

BE2017/5535 congelées isolé du sang total de donneurs sains (Immunehealth). Les lymphocytes T CD8 purifiés ont ensuite été incubés à des concentrations croissantes (0,11 nM, 0,33 nM, 1,06 nM, 3,3 nM, 10,6 nM, 33,3 nM, 105,5 nM et 333 nM) d'anticorps (100 000 lymphocytes T CD8/100 pi du milieu complet contenant l'anticorps) pendant 1 heure. Ensuite, le mélange d'anticorps-CD8 a été ajouté aux plaques cellulaires de CD155 aAPC/CHO-K1 contenant 50 pi de milieu complet frais et incubé à 37 °C, 5 % CO2 pendant 5 jours. Finalement, les concentrations d'IFNg ont été évaluées dans le surnageant cellulaire avec un essai ELISA (Affymetrix eBioscience, 88-7316-86) qui a été réalisé selon les recommandations du fabricant.BE2017 / 5535 frozen isolated from whole blood from healthy donors (Immunehealth). The purified CD8 T cells were then incubated at increasing concentrations (0.11 nM, 0.33 nM, 1.06 nM, 3.3 nM, 10.6 nM, 33.3 nM, 105.5 nM and 333 nM) of antibodies (100,000 CD8 T lymphocytes / 100 μl of complete medium containing the antibody) for 1 hour. Then, the antibody-CD8 mixture was added to the CD155 aAPC / CHO-K1 cell plates containing 50 µl of fresh complete medium and incubated at 37 ° C, 5% CO2 for 5 days. Finally, the concentrations of IFNg were evaluated in the cell supernatant with an ELISA test (Affymetrix eBioscience, 88-7316-86) which was carried out according to the manufacturer's recommendations.

Comme le montre la Figure 13A, tous les anticorps anti-TIGIT ont augmenté la sécrétion de l'IFNg par rapport à l'isotype témoin. L'augmentation la plus élevée a été observée avec le clone 29489 (6,4 fois) suivi par 29494 (5,8 fois), 29520 (5,4 fois), 29499 (5,2 fois), 29527 (4,5 fois) et 29513 (3,2 fois).As shown in Figure 13A, all anti-TIGIT antibodies increased the secretion of IFNg compared to the control isotype. The highest increase was observed with clone 29489 (6.4 times) followed by 29494 (5.8 times), 29520 (5.4 times), 29499 (5.2 times), 29527 (4.5 times) and 29513 (3.2 times).

Une étude d'intervalle de doses (entre 0,22 nM et 333 nM d'anticorps anti-TIGIT) a également été réalisée pour évaluer la valeur CE50 pour l'augmentation de la sécrétion de l'IFNg par les lymphocytes T CD8 primaires humains. Comme il est démontré dans la Figure 13 B, l'anticorps antiTIGIT 29489 a démontré la meilleure activité avec une CE₅₀ de 3,5 nM suivie par le clone 29527 (CE₅₀= 5,1 nM), le clone 29494 (CE₅₀ = 6,1 nM) et le clone 29520 (CE₅₀ =11,1 nM). Finalement, le clone 29489 et son mutant 31282 ont été testés en parallèle et ont démontré une activité semblable avec une valeur de CE₅₀ respective de 0,49 nM et 0,50 nM (Figure 13C). Prises ensemble, ces données démontrent une activité fonctionnelle puissante des anticorps anti-TIGIT antagonistes pour bloquer le signal inhibiteur TIGIT dans les lymphocytes T CD8⁺ humains et pour augmenter les fonctions effectrices, caractérisées par une forte augmentation dans la production de l'IFNg.A dose interval study (between 0.22 nM and 333 nM of anti-TIGIT antibody) was also carried out to assess the EC50 value for the increase in the secretion of IFNg by human primary CD8 T lymphocytes . As shown in Figure 13B, the antiTIGIT 29489 antibody demonstrated the best activity with an EC ₅₀ of 3.5 nM followed by clone 29527 (EC ₅₀ = 5.1 nM), clone 29494 (EC ₅₀ = 6.1 nM) and the clone 29520 (EC ₅₀ = 11.1 nM). Finally, clone 29489 and its mutant 31282 were tested in parallel and demonstrated a similar activity with an EC ₅₀ value of 0.49 nM and 0.50 nM respectively (Figure 13C). Taken together, these data demonstrate potent functional activity of antagonistic anti-TIGIT antibodies to block the TIGIT inhibitory signal in human CD8 ⁺ T cells and to increase effector functions, characterized by a large increase in the production of IFNg.

C. Essai fonctionnel du T IL humainC. Functional test of human T IL

Pour caractériser la conséquence fonctionnelle du blocage du récepteur TIGIT humain sur les lymphocytes infiltrant les tumeurs (TIL) de patients atteints d’un cancer, nous avons co-cultivé des lymphocytes T CD8⁺ humains provenant des TIL d'ascites ovariens de patient avec la lignée cellulaire CHO-K1 modifiée pour exprimer le CD155 humain et pour activer les lymphocytes T. Nous avons observé que la libération de l'IFNg par les lymphocytes T CD8⁺ en présence des cellules CHO-K1 modifiées exprimant le CD155 peut être augmentée en bloquant le hTIGIT avec des anticorps antiTIGIT antagonistes.To characterize the functional consequence of the blocking of the human TIGIT receptor on tumor infiltrating lymphocytes (TIL) of cancer patients, we co-cultivated human CD8 ⁺ T lymphocytes from the TIL of ovarian ascites of patient with CHO-K1 cell line modified to express human CD155 and to activate T lymphocytes. We observed that the release of IFNg by CD8 ⁺ T lymphocytes in the presence of modified CHO-K1 cells expressing CD155 can be increased by blocking hTIGIT with antagonistic antiTIGIT antibodies.

Les cellules « Thaw-and-Use » CD155 aAPC/CHO-K1 (Promega, CS198811) ont été ensemencées dans les plaques à 96 puits à fond en U selon les recommandations du fabricant et incubées à 37 °C, 5 % CO2 dans un incubateur O/N. Le jour suivant, les lymphocytes T CD8⁺ ont été purifiés selon les recommandations du fabricant en utilisant une colonne de sélection négative (Stemcell Technologies, 17953) à partir de TIL humains congelés et isolés de l’ascite ovarien (Immunehealth). Les lymphocytes T CD8⁺ purifiés ont ensuite été incubés avec le clone 26452 deThe “Thaw-and-Use” CD155 aAPC / CHO-K1 cells (Promega, CS198811) were seeded in 96-well plates with U-bottom according to the manufacturer's recommendations and incubated at 37 ° C, 5% CO2 in a O / N incubator. The next day, CD8 ⁺ T cells were purified according to the manufacturer's recommendations using a negative selection column (Stemcell Technologies, 17953) from frozen human TIL isolated from ovarian ascites (Immunehealth). The purified CD8 ⁺ T cells were then incubated with clone 26452 of

BE2017/5535 l'anticorps anti-TIGIT, le parent non optimisé des clones 29489 et 31282 (100 000 lymphocytes T CD8⁺/100pl du milieu complet contenant l'anticorps) pendant 1 heure. Ensuite, le mélange d'anticorps-CD8 a été ajouté aux plaques cellulaires CD155 aAPC/CHO-K1 contenant 50 pi de milieu complet frais et incubé à 37 °C, 5 % CO2 pendant 5 jours.BE2017 / 5535 the anti-TIGIT antibody, the non-optimized parent of clones 29489 and 31282 (100,000 CD8 ⁺ T lymphocytes / 100 μl of complete medium containing the antibody) for 1 hour. Then, the antibody-CD8 mixture was added to the CD155 aAPC / CHO-K1 cell plates containing 50 µl of fresh complete medium and incubated at 37 ° C, 5% CO2 for 5 days.

Finalement, les concentrations d'IFNg ont été évaluées dans le surnageant cellulaire avec un essai ELISA (Affymetrix eBioscience, 88-7316-86) qui a été réalisé selon les recommandations du fabricant. Comme le démontre la Figure 14, la sécrétion de l'IFNg a été augmentée par presque 2 fois lorsque l'anticorps anti-TIGIT a été ajouté à la co-culture. Ces données démontrent une activité fonctionnelle puissante des anticorps anti-TIGIT antagonistes pour bloquer le signal inhibiteur TIGIT dans les TIL CD8⁺ humains et pour augmenter les fonctions effectrices des lymphocytes T dans un environnement tumoral.Finally, the concentrations of IFNg were evaluated in the cell supernatant with an ELISA test (Affymetrix eBioscience, 88-7316-86) which was carried out according to the manufacturer's recommendations. As shown in Figure 14, the secretion of IFNg was increased by almost 2-fold when the anti-TIGIT antibody was added to the coculture. These data demonstrate a powerful functional activity of antagonistic anti-TIGIT antibodies to block the TIGIT inhibitory signal in human CD8 ⁺ TILs and to increase the effector functions of T lymphocytes in a tumor environment.

Exemple 11 : Caractérisation de l'anticorps anti-TIGIT antagoniste avec une activité fonctionnelle chez la sourisExample 11 Characterization of the Antagonistic Anti-TIGIT Antibody with Functional Activity in Mice

A. Essai de compétition CD155 chez la souris pour un substitut de l'anticorps anti-TIGIT antagonisteA. CD155 competition test in mice for a substitute for the antagonistic anti-TIGIT antibody

Pour cet essai, des cellules Jurkat (clone E6-1, ATCC TIB-152) modifiées pour surexprimer TIGIT murin (Jurkat-mTIGIT) ont été utilisées. Les cellules ont été préincubées pendant 45 minutes à 37 °C avec différentes concentrations du clone 26493 de l'anticorps anti-TIGIT (0,03 à 10 pg/ml) dans 25 pi de milieu complet (RPMI + 10 % SVF). Les cellules ont été lavées une fois et incubées avec 4 pg/ml de la protéine CD155-His-Fc de souris (Thermo Fisher, 50259M03H50) dans 50 pi de milieu complet pendant 45 minutes dans un incubateur. Les cellules ont été lavées une fois, et colorées avec l'anticorps anti-His couplé au PE (Biolegend, 362603) pendant 30 minutes à 4 °C. L'intensité fluorescente médiane (MFI) mesurée par FACS a été utilisée comme une mesure de la liaison du CD155 aux Jurkat-mTIGIT. La Figure 15A illustre la courbe dose-réponse pour le clone 26493 de l'anti-TIGIT pour la mesure de la compétition avec le CD155 avec une valeur de CI₅₀ calculée à 2,3 nM (la ligne pointillée supérieure représente le signal provenant de l'isotype, la ligne pointillée inférieure le signal provenant des cellules sans CD155). Ces résultats démontrent l'efficacité fonctionnelle de l'anticorps anti-TIGIT pour entrer en compétition avec le ligand CD155 pour TIGIT murin.For this test, Jurkat cells (clone E6-1, ATCC TIB-152) modified to overexpress murine TIGIT (Jurkat-mTIGIT) were used. The cells were preincubated for 45 minutes at 37 ° C. with different concentrations of clone 26493 of the anti-TIGIT antibody (0.03 to 10 μg / ml) in 25 μl of complete medium (RPMI + 10% FCS). The cells were washed once and incubated with 4 μg / ml of the mouse CD155-His-Fc protein (Thermo Fisher, 50259M03H50) in 50 μl of complete medium for 45 minutes in an incubator. The cells were washed once, and stained with anti-His antibody coupled to PE (Biolegend, 362603) for 30 minutes at 4 ° C. The median fluorescent intensity (MFI) measured by FACS was used as a measure of the binding of CD155 to Jurkat-mTIGIT. FIG. 15A illustrates the dose-response curve for the anti-TIGIT clone 26493 for measuring the competition with CD155 with an IC ₅₀ value calculated at 2.3 nM (the upper dotted line represents the signal from the isotype, the lower dashed line the signal from cells without CD155). These results demonstrate the functional efficacy of the anti-TIGIT antibody to compete with the ligand CD155 for murine TIGIT.

B. Essai fonctionnel in vitro chez la souris : cytotoxicité spécifique d’un antigène (OT-I)B. In vitro functional test in mice: specific cytotoxicity of an antigen (OT-I)

Afin d'évaluer l'activité cytotoxique spécifique d’un antigène des lymphocytes T OT-I CD8⁺ sur les cellules cibles pulsées avec OVA et d’évaluer l'effet de l'anticorps anti-TIGIT dans cet essai, des cellules OT1 ont été isolées des rates de souris C57BL/6-Tg^(TcraTcrb)1100Mjb/Crl (Charles River) parIn order to evaluate the specific cytotoxic activity of an OT-I CD8 ⁺ T lymphocyte antigen on the target cells pulsed with OVA and to evaluate the effect of the anti-TIGIT antibody in this test, OT1 cells were were isolated from spleens of C57BL / 6-Tg ^(TcraTcrb) 1100Mjb / Crl (Charles River) mice by

BE2017/5535 dissociation mécanique suivie d'une sélection négative pour les lymphocytes T de souris en utilisant un kit d'isolation des lymphocytes T de souris EasySep™ (Stemcell, no. de catalogue 19851). Les cellules cancéreuses PanO2 qui expriment naturellement le CD155, ont été traitées avec de la Mitomycine C (25pg/ml) et ensuite pulsées avec le peptide OVA (S7951-1MG, Sigma Aldrich, 1 pg/ ml, 1 heure à 37 °C) afin d’être utilisées comme cellules présentant l'antigène,. Les lymphocytes T CD8⁺ et les cellules PanO2 ont été co-cultivées pendant 3 jours en présence du clone 26493 antiTIGIT ou de l'isotype témoin à 133 nM. Au bout de 3 jours, le surnageant a été collecté pour la détection de l'IFN-gamma par ELISA (Figure 15B) et les lymphocytes T pour l'essai de cytotoxicité (Figure 15C). Les cellules PanO2 OVA-pulsées ont été utilisées comme cellules cibles. Les cellules cibles ainsi que des cellules Pan02 non pulsées (témoins internes), 1 x 10⁶ chacune, ont été marquées avec du CFSE (C1157, ThermoFisher) et avec le kit de prolifération de cellules CelITrace™ Far Red (C34564, ThermoFisher) respectivement, selon les instructions du fabricant. Ces cellules ont été mélangées (rapport 1:1) et ensemencées à 2 x 10⁴ cellules par puits. Les lymphocytes T stimulés par l'OT-1 CD8⁺ont été ajoutés à 1 x 10⁵ cellules/puits (cellules effectrices) donnant un rapport effecteur sur cible de 10:1 en présence du clone 26493 anti-TIGIT ou de l'isotype témoin à 133 nM. Après 24 heures, les cellules ont été lavées avec du PBS et décollées par trypsinisation. Les cellules ont ensuite été colorées avec la trousse de coloration de cellules « Live/dead fixable violet dead » (Molecular Probes, L34955). La destruction cytotoxique des cellules cibles a ensuite été mesurée en surveillant la modulation du rapport des cellules cibles vivantes aux cellules non cibles par cytométrie de flux. La Figure 15B démontre que l'anticorps anti-TIGIT augmente la production de l'IFN-gamma par presque deux fois alors que la Figure 15C démontre une augmentation de l'activité cytotoxique des lymphocytes T OT-I CD8⁺ de souris d'environ 60 %. Pris ensemble, ces résultats confirment l'activité fonctionnelle de l'anticorps anti-TIGIT pour augmenter la fonction effectrice des lymphocytes T CD8⁺ de souris.BE2017 / 5535 mechanical dissociation followed by negative selection for mouse T cells using an EasySep ™ mouse T cell isolation kit (Stemcell, catalog no. 19851). The PanO2 cancer cells which naturally express CD155, were treated with Mitomycin C (25pg / ml) and then pulsed with the OVA peptide (S7951-1MG, Sigma Aldrich, 1 pg / ml, 1 hour at 37 ° C) in order to be used as cells presenting the antigen ,. CD8 ⁺ T lymphocytes and PanO2 cells were co-cultured for 3 days in the presence of the clone 26493 antiTIGIT or of the control isotype at 133 nM. After 3 days, the supernatant was collected for the detection of IFN-gamma by ELISA (Figure 15B) and the T lymphocytes for the cytotoxicity test (Figure 15C). PanO2 OVA-pulsed cells were used as target cells. The target cells as well as non-pulsed Pan02 cells (internal controls), 1 × 10 ⁶ each, were labeled with CFSE (C1157, ThermoFisher) and with the CelITrace ™ Far Red cell proliferation kit (C34564, ThermoFisher) respectively , according to the manufacturer's instructions. These cells were mixed (1: 1 ratio) and seeded at 2 x 10 ⁴ cells per well. OT-1 CD8 ⁺ stimulated T cells were added to 1 x 10 ⁵ cells / well (effector cells) giving an effector to target ratio of 10: 1 in the presence of the anti-TIGIT clone 26493 or of the isotype witness at 133 nM. After 24 hours, the cells were washed with PBS and detached by trypsinization. The cells were then stained with the "Live / dead fixable violet dead" cell staining kit (Molecular Probes, L34955). Cytotoxic destruction of target cells was then measured by monitoring the modulation of the ratio of living target cells to non-target cells by flow cytometry. Figure 15B demonstrates that the anti-TIGIT antibody increases the production of IFN-gamma by almost twice while Figure 15C demonstrates an increase in the cytotoxic activity of mouse CD8 ⁺ OT-I T lymphocytes by approximately 60%. Taken together, these results confirm the functional activity of the anti-TIGIT antibody to increase the effector function of mouse CD8 ⁺ T cells.

Exemple 12 : Activité antitumorale de l'anticorps anti-TIGIT antagoniste en monothérapie et en association avec les anticorps anti-PD1 dans un modèle chez la sourisExample 12 Antitumour Activity of the Antagonist Anti-TIGIT Antibody in Monotherapy and in Combination with the Anti-PD1 Antibodies in a Mouse Model

A. Activité antitumorale in vivo de l'anticorps anti-TIGIT antagoniste en monothérapieA. In vivo anti-tumor activity of the antagonist anti-TIGIT antibody in monotherapy

Pour cette expérience, le clone 26493 anti-TIGIT a été produit dans des cellules de mammifères sur un isotype lgG2a de souris. Des souris femelles Balb/c de 8 semaines ont été inoculées avec 500 000 cellules du cancer du colon CT26 (ATCC® CRL-2638™) en sous-cutanée. Au 9e jour après l'inoculation, lorsque les volumes des tumeurs étaient en moyenne autour de 45 mm³, les souris ont été randomisées dans des groupes de traitement avec un volume tumoral égal (n=8 par groupe). Les souris ont été traitées avec 200 pg de l'anti-TIGIT ou de l'isotype témoin (mlgG2a, Bioxcell) ou avec 200 pg d'anti-PD-1 (RMP1-14, BioXcell) et 200 pg de l'isotype témoin (mlgG2a, Bioxcell) ou avec 200 pg de l'anti-PD-1 (RMP1-14, BioXcell) et différentes concentrations d'anti-TIGIT (200 pg, 60 pg, 20 pg) par injections intrapéritonéales au jour 9, jour 12 et jour 15. La croissance tumorale a été surveillée et les volumes des tumeurs ont été mesurés avec un pied à coulisseFor this experiment, the anti-TIGIT clone 26493 was produced in mammalian cells on a mouse lgG2a isotype. 8 week old female Balb / c mice were inoculated with 500,000 CT26 colon cancer cells (ATCC® CRL-2638 ™) subcutaneously. On the 9th day after inoculation, when the tumor volumes were on average around 45 mm ³ , the mice were randomized into treatment groups with an equal tumor volume (n = 8 per group). The mice were treated with 200 μg of anti-TIGIT or of the control isotype (mlgG2a, Bioxcell) or with 200 μg of anti-PD-1 (RMP1-14, BioXcell) and 200 μg of the isotype control (mlgG2a, Bioxcell) or with 200 μg of anti-PD-1 (RMP1-14, BioXcell) and different concentrations of anti-TIGIT (200 μg, 60 μg, 20 μg) by intraperitoneal injections on day 9, day 12 and day 15. Tumor growth was monitored and tumor volumes were measured with a caliper

BE2017/5535 éléctronique, trois fois par semaine, du jour 9 jusqu'au jour 36. Les souris ont été sacrifiées lorsque le volume tumoral dépassait 2 000 mm³. Une analyse statistique des courbes de croissance tumorale a été réalisée à l’aide d’un modèle linéaire mixte. Les différences entre les groupes de traitements ont été évaluées en testant l'interaction du groupe temps*traitement. Afin de tester un effet synergique entre l'anti-TIGIT et l'anti-PD-1, les groupes de traitement ont été enregistrés par une combinaison de deux variables ; anti-TIGIT (oui/non) et anti-PD-1 (oui/non). Un effet synergique, en sus de l'effet additif de chaque traitement (anti-TIGIT*temps et anti-PD-1 *temps) a été évalué en testant l'interaction anti-TIGIT*anti-PD-1*temps.BE2017 / 5535 electronic, three times a week, from day 9 to day 36. The mice were sacrificed when the tumor volume exceeded 2000 mm ³ . A statistical analysis of tumor growth curves was performed using a mixed linear model. The differences between the treatment groups were evaluated by testing the interaction of the time * treatment group. In order to test a synergistic effect between anti-TIGIT and anti-PD-1, the treatment groups were recorded by a combination of two variables; anti-TIGIT (yes / no) and anti-PD-1 (yes / no). A synergistic effect, in addition to the additive effect of each treatment (anti-TIGIT * time and anti-PD-1 * time) was evaluated by testing the anti-TIGIT * anti-PD-1 * time interaction.

La Figure 16A illustre les courbes de croissance tumorale moyenne par groupe aussi bien que des courbes de croissance individuelles pour les souris traitées avec l'anticorps anti-TIGIT en monothérapie. Alors que dans le groupe témoin, aucune souris n'a démontré une régression de la tumeur, 2 souris sur 8 traitées avec l'anti-TIGIT ont démontré une réponse complète. Chez les souris restantes, un retard de croissance tumorale important était présent. Dans le groupe témoin, aucune souris n'a survécu au-delà de 30 jours, alors que dans le groupe traité, 7 souris sur 8 ont survécu audelà de 30 jours.Figure 16A illustrates the mean tumor growth curves by group as well as individual growth curves for mice treated with the anti-TIGIT antibody as monotherapy. While in the control group, no mouse demonstrated regression of the tumor, 2 out of 8 mice treated with anti-TIGIT demonstrated a complete response. In the remaining mice, significant tumor growth retardation was present. In the control group, no mouse survived beyond 30 days, while in the treated group, 7 out of 8 mice survived beyond 30 days.

La Figure 16B illustre les courbes de croissance tumorale moyenne par groupe aussi bien que des courbes de croissance individuelles pour les souris traitées avec l'anti-PD1 en monothérapie ou en combinaison avec l'anti-TIGIT. Un retard significatif de la croissance tumorale a été observé chez les souris traitées avec l'anti-TIGIT+anti-PD-1 en comparaison avec la monothérapie anti-PD-1 (p<0,0001). La combinaison de l'anti-TIGIT + anti-PD-1 a permis d'obtenir une efficacité antitumorale synergique qui était supérieure à l'effet additif des deux traitements de monothérapie (p=0,02). La combinaison des anticorps anti-TIGIT (à 200 pg) et anti-PD1 a entraîné une réponse complète chez 7 souris sur 8. L'efficacité antitumorale a été maintenue avec la combinaison de l'anti-PD1 et des doses plus faibles d'anti-TIGIT qui a donné une réponse complète chez 8 souris sur 8 lorsque l'anticorps anti-TIGIT a été diminué à 60 pg et 5 souris sur 8 lorsque l'anticorps anti-TIGIT a encore été diminué jusqu'à 20 pg (Figure 16C). Ces données démontrent l'efficacité antitumorale importante de la thérapie anti-TIGIT en monothérapie (p<0,0001) ou en combinaison (p<0,0001) pour le traitement des tumeurs préétablies.Figure 16B illustrates the mean tumor growth curves by group as well as individual growth curves for mice treated with anti-PD1 as monotherapy or in combination with anti-TIGIT. A significant delay in tumor growth was observed in mice treated with anti-TIGIT + anti-PD-1 compared to anti-PD-1 monotherapy (p <0.0001). The combination of anti-TIGIT + anti-PD-1 made it possible to obtain a synergistic anti-tumor efficacy which was greater than the additive effect of the two monotherapy treatments (p = 0.02). The combination of anti-TIGIT (200 µg) and anti-PD1 antibodies resulted in a complete response in 7 out of 8 mice. Antitumor efficacy was maintained with the combination of anti-PD1 and lower doses of anti-TIGIT which gave a complete response in 8 out of 8 mice when the anti-TIGIT antibody was reduced to 60 pg and 5 out of 8 mice when the anti-TIGIT antibody was further reduced to 20 pg (Figure 16C). These data demonstrate the significant anti-tumor efficacy of anti-TIGIT therapy as monotherapy (p <0.0001) or in combination (p <0.0001) for the treatment of pre-established tumors.

Exemple 13 : Activité antitumorale dépendant de l'isotype de l'anticorps anti-TIGIT antagoniste en monothérapie et en association avec les anticorps anti-PD1 dans un modèle chez la sourisEXAMPLE 13 Antitumor Activity Dependent on the Isotype of the Antagonist Anti-TIGIT Antibody in Monotherapy and in Association with the Anti-PD1 Antibodies in a Mouse Model

Pour cette expérience, le clone 26493 anti-TIGIT a été produit dans des cellules de mammifères sur un isotype lgG2a et IgG 1 de souris. Des souris femelles Balb/c de 8 semaines ont été inoculées avec 500 000 cellules du cancer du colon CT26 (ATCC® CRL-2638™) en sous-cutanée. Au 10e jour après l'inoculation, lorsque les volumes des tumeurs étaient en moyenne autour de 100 mm³,For this experiment, the anti-TIGIT clone 26493 was produced in mammalian cells on a mouse IgG2a and IgG 1 isotype. 8 week old female Balb / c mice were inoculated with 500,000 CT26 colon cancer cells (ATCC® CRL-2638 ™) subcutaneously. On the 10th day after inoculation, when the tumor volumes were on average around 100 mm ³ ,

BE2017/5535 les souris ont été randomisées dans des groupes de traitement avec un volume tumoral égal (n=10 par groupe). Pour l'évaluation de la monothérapie, les souris ont été traitées avec 200 pg d'anti-TIGIT ou de l'isotype témoin (mlgG2a, Bioxcell) par injections intrapéritonéales au jour 10, jour 13 et au jour 16. Pour l'évaluation de la combinaison avec l'anti-PD-1, les souris ont été traitées avec 200 pg d'antiPD-1 (RMP1-14, BioXcell) et 200 pg de l'isotype témoin (mlgG2a, Bioxcell) ou avec une combinaison de 200 pg de l'anti-PD-1 (RMP1-14, BioXcell) et 200 pg d'anti-TIGIT par injections intrapéritonéales au jour 10, jour 13 et jour 16. La croissance tumorale a été suivie et les volumes des tumeurs ont été mesurés avec un pied à coulisse électroniques, trois fois par semaine, du jour 10 jusqu'au jour 33. Les souris ont été sacrifiées lorsque le volume tumoral a dépassait 2 000 mm³.BE2017 / 5535 the mice were randomized into treatment groups with an equal tumor volume (n = 10 per group). For the evaluation of monotherapy, the mice were treated with 200 μg of anti-TIGIT or of the control isotype (mlgG2a, Bioxcell) by intraperitoneal injections on day 10, day 13 and day 16. For evaluation of the combination with anti-PD-1, the mice were treated with 200 μg of antiiPD-1 (RMP1-14, BioXcell) and 200 μg of the control isotype (mlgG2a, Bioxcell) or with a combination of 200 µg of anti-PD-1 (RMP1-14, BioXcell) and 200 µg of anti-TIGIT by intraperitoneal injections on day 10, day 13 and day 16. Tumor growth was monitored and tumor volumes were were measured with an electronic caliper, three times a week, from day 10 to day 33. The mice were sacrificed when the tumor volume a exceeded 2000 mm ³ .

La Figure 17A illustre les courbes de croissance tumorale moyenne par groupe aussi bien que des courbes de croissance individuelles pour la monothérapie avec l'anticorps anti-TIGIT et la Figure 17B pour la thérapie de combinaison entre les anticorps anti-TIGIT et anti-PD1. À la fois en monothérapie et en association avec l’anti-PD-1, le traitement avec l'anticorps anti-TIGIT a entraîné une efficacité anti-tumorale significative lorsqu'il est administré sous forme d'isotype de souris lgG2a (p=0,0001 et p=0,009, respectivement). Cependant, aucune efficacité antitumorale n'a pu être observée avec l'anti-TIGIT sous forme de l'isotype lgG1 de souris, ce qui suggère que l'interaction du récepteur Fc avec le mlgG2a est importante pour l'activité antitumorale des anticorps anti-TIGIT antagonistes dans le modèle CT26 chez la souris. Ces résultats démontrent une efficacité antitumorale, en monothérapie ou en combinaison, qui dépend de l'isotype de l’anti-TIGIT pour le traitement de tumeurs préétablies.Figure 17A illustrates the mean tumor growth curves by group as well as individual growth curves for monotherapy with anti-TIGIT antibody and Figure 17B for combination therapy between anti-TIGIT and anti-PD1 antibodies. Both as monotherapy and in combination with anti-PD-1, treatment with the anti-TIGIT antibody resulted in significant anti-tumor efficacy when administered in the form of the lgG2a mouse isotype (p = 0.0001 and p = 0.009, respectively). However, no anti-tumor efficacy could be observed with the anti-TIGIT in the form of the mouse lgG1 isotype, which suggests that the interaction of the Fc receptor with mlgG2a is important for the anti-tumor activity of the anti antibodies. -TIGIT antagonists in the CT26 model in mice. These results demonstrate an anti-tumor efficacy, in monotherapy or in combination, which depends on the anti-TIGIT isotype for the treatment of pre-established tumors.

Exemple 14 : Caractérisation du mécanisme d'action de l'activité antitumorale in vivo de l'anticorps anti-TIGIT antagonisteExample 14 Characterization of the Mechanism of Action of the In Vivo Antitumor Activity of the Antagonistic Anti-TIGIT Antibody

A. Analyse par cytométrie de flux de la rate et de la tumeurA. Analysis by flow cytometry of the spleen and tumor

Afin d'étudier le mode d'action in vivo de l'anticorps anti-TIGIT antagoniste, des tumeurs ont été analysées par cytométrie de flux pour l'infiltrat de cellules immunitaires suivant un traitement avec l'anticorps anti-TIGIT, en monothérapie et en combinaison avec l'anti-PD-1. Les souris ont été inoculées et traitées comme il est décrit dans l'exemple 12. Deux jours après le second traitement, les souris (8 souris par groupe) ont été sacrifiées et les tumeurs prélevées. Les tumeurs ont été dissociées avec un kit de dissociation de tumeurs (Miltenyi Biotec). Pour une coloration ex vivo directe, les cellules ont été colorées avec l'anti-CD45, l'anti-CD4, l'anti-CD8 et l'anti-FoxP3 (tous de eBioscience) après coloration avec un colorant de viabilité (Molecular Probes, L34955) et Fc-block. Pour une stimulation ex vivo, les cellules ont été incubées avec un cocktail de stimulation de cellules (eBioscience) et un inhibiteur du transport de protéines (eBioscience) pendant 3 heures. Ceci a été suivi par la coloration avec l'anti-CD4 et les anticorps anti-CD8 et Fc-block. Après fixation et perméabilisation avec des tampons commerciaux (tampon de fixation Cl et tampon deIn order to study the in vivo mode of action of the antagonistic anti-TIGIT antibody, tumors were analyzed by flow cytometry for the infiltrate of immune cells following treatment with the anti-TIGIT antibody, as monotherapy and in combination with anti-PD-1. The mice were inoculated and treated as described in Example 12. Two days after the second treatment, the mice (8 mice per group) were sacrificed and the tumors removed. The tumors were dissociated with a tumor dissociation kit (Miltenyi Biotec). For direct ex vivo staining, the cells were stained with anti-CD45, anti-CD4, anti-CD8 and anti-FoxP3 (all from eBioscience) after staining with a viability dye (Molecular Probes, L34955) and Fc-block. For ex vivo stimulation, the cells were incubated with a cell stimulation cocktail (eBioscience) and a protein transport inhibitor (eBioscience) for 3 hours. This was followed by staining with anti-CD4 and anti-CD8 and Fc-block antibodies. After fixing and permeabilization with commercial buffers (Cl fixing buffer and

BE2017/5535 perméabilisation), les cellules ont été marquées avec l'anti-IL-10 et l'anti-IFN-gamma (tous de eBioscience). Dans toutes les figures, le pourcentage de changement en comparaison avec le groupe témoin pertinent (isotype témoin pour la monothérapie, l'anti-PD-1 pour l'association) est illustré, avec une valeur négative représentant une diminution et une valeur positive représentant une augmentation en comparaison au groupe témoin.BE2017 / 5535 permeabilization), the cells were labeled with anti-IL-10 and anti-IFN-gamma (all from eBioscience). In all the figures, the percentage change compared to the relevant control group (control isotype for monotherapy, anti-PD-1 for the combination) is illustrated, with a negative value representing a decrease and a positive value representing an increase compared to the control group.

La Figure 18A montre que le traitement in vivo de la tumeur avec l'anticorps anti-TIGIT mlgG2a entraîne une diminution dans la proportion des lymphocytes T régulateurs parmi la population des TIL CD4⁺ de 28 % en comparaison au groupe témoin, et qui n'est pas observé après traitement avec l'anti-TIGIT mlgG1. Ceci démontre qu'il y a une diminution des cellules Treg TIGIT⁺, expliquant possiblement l'efficacité différentielle de ces deux isotypes, comme il est présenté dans l'exemple 14. La Figure 18B démontre qu'il n'y a pas de diminution des TIL CD8⁺, mais plutôt, une petite augmentation qui est observée pour les deux isotypes (une augmentation de 17 % en comparaison aux témoins pour le mlgG1 et de 16% pour le mlgG2a). Ces résultats combinés montrent une augmentation de plus de 50 % du rapport CD8/Treg dans les tumeurs traitées avec l'anti-TIGIT mlgG2a (Figure 18C). La fonctionnalité des lymphocytes T intratumoraux est également améliorée pour le groupe traité avec l'anticorps anti-TIGIT mlgG2a, avec une forte augmentation de la production de l'IFN-gamma à la fois pour les TIL CD4⁺ (Figure 18D) et les TIL CD8⁺ (Figure 18E). Ceci a entraîné une forte augmentation du rapport des cellules produisant de l'IFN-g par rapport aux cellules produisant de l'IL-10 après une stimulation ex vivo dans la population des TIL CD4⁺/CD8⁺ (Figure 18F).FIG. 18A shows that the in vivo treatment of the tumor with the anti-TIGIT antibody mlgG2a results in a decrease in the proportion of regulatory T lymphocytes in the CD4 ⁺ TIL population of 28% compared to the control group, and which does not is not observed after treatment with anti-TIGIT mlgG1. This demonstrates that there is a decrease in TregIT TIGIT ⁺ cells, possibly explaining the differential efficiency of these two isotypes, as it is presented in example 14. FIG. 18B demonstrates that there is no decrease of CD8 ⁺ TILs, but rather, a small increase that is observed for the two isotypes (an increase of 17% compared to the controls for mlgG1 and 16% for mlgG2a). These combined results show an increase of more than 50% in the CD8 / Treg ratio in tumors treated with the anti-TIGIT mlgG2a (Figure 18C). The functionality of intratumoral T lymphocytes is also improved for the group treated with the anti-TIGIT antibody mlgG2a, with a large increase in the production of IFN-gamma for both CD4 ⁺ TILs (FIG. 18D) and TILs CD8 ⁺ (Figure 18E). This resulted in a large increase in the ratio of IFN-g producing cells to IL-10 producing cells after ex vivo stimulation in the CD4 ⁺ / CD8 ⁺ TIL population (Figure 18F).

La Figure 18G montre que la combinaison de l'anti-TIGIT mlgG2a avec l'anti-PD-1 entraîne une diminution de 33 % des lymphocytes T régulateurs en comparaison à une monothérapie anti-PD1. Encore une fois, pour les lymphocytes T CD8⁺ le contraire est vrai, avec une augmentation de 22 % et de 28 % dans l'infiltration des lymphocytes T CD8⁺, respectivement pour les isotypes mlgG1 et mlgG2a, en comparaison à la monothérapie anti-PD-1 (Figure 18H). Ensemble, ceci entraîne une augmentation de plus de deux fois dans le rapport TIL CD8⁺/Treg dans la tumeur pour la combinaison avec l'anti-TIGIT mlgG2a (Figure 181). En outre, le traitement avec l'anticorps anti-TIGIT mlgG2a en combinaison avec l'anti-PD-1 montre un enrichissement du phénotype Th1 versus Th2 pour les lymphocytes T CD4⁺ intratumoraux, avec une augmentation marquée des cellules CD4 produisant l'IFN-gamma (Figure 18J) et une diminution dans les cellules CD4 produisant l'IL-10 (Figure 18K). Ceci entraîne une forte augmentation du rapport de cellules produisant l'IFN-gamma versus l’IL-10 après une stimulation ex vivo dans la population des TIL CD4⁺ en comparaison aux souris traitées avec la monothérapie anti-PD-1 (Figure 18L).Figure 18G shows that the combination of anti-TIGIT mlgG2a with anti-PD-1 results in a 33% decrease in regulatory T cells compared to anti-PD1 monotherapy. Again, for CD8 ⁺ T cells the opposite is true, with an increase of 22% and 28% in the infiltration of CD8 ⁺ T cells, respectively for the isotypes mlgG1 and mlgG2a, in comparison to monotherapy PD-1 (Figure 18H). Together, this results in an increase of more than twice in the TIL CD8 ⁺ / Treg ratio in the tumor for the combination with the anti-TIGIT mlgG2a (Figure 181). In addition, treatment with the anti-TIGIT antibody mlgG2a in combination with the anti-PD-1 shows an enrichment of the Th1 versus Th2 phenotype for intratumoral CD4 ⁺ T lymphocytes, with a marked increase in CD4 cells producing IFN. -gamma (Figure 18J) and a decrease in CD4 cells producing IL-10 (Figure 18K). This leads to a large increase in the ratio of cells producing IFN-gamma versus IL-10 after ex vivo stimulation in the population of CD4 ⁺ TIL compared to mice treated with anti-PD-1 monotherapy (Figure 18L) .

Tableau 11 : Expression différentielle des gènes entre les souris traitées avec l'anti-TIGIT mlgG2a et les souris traitées avec le supportTable 11: Differential gene expression between mice treated with anti-TIGIT mlgG2a and mice treated with the support

Symbole du gène Gene symbol Facteur de changement Log2 Log2 change factor Valeur-p corrigée Corrected p-value

BE2017/5535BE2017 / 5535

Ccr2 CCR2 -1,29 -1.29 0,0000668 0.0000668 Prf1 PRF1 1,79 1.79 0,0000668 0.0000668 Ctsg CTSG 2,13 2.13 0,0000668 0.0000668 Ctla4 CTLA4 1,72 1.72 0,00309 0.00309 Gzmb GZMB 1,51 1.51 0,00309 0.00309 Ccl2 CCL2 0,56 0.56 0,0174 0.0174 Il2ra IL2RA 1,61 1.61 0,0174 0.0174 Cd55 CD55 1,64 1.64 0,0213 0.0213 Il2rb IL2RB 0,872 0.872 0,0379 0.0379 Cd274 Cd274 0,982 0.982 0,0385 0.0385 Klrgl Klrgl 1,3 1.3 0,0402 0.0402 Icos Icos 1,26 1.26 0,0402 0.0402 111 rn 111 rn 0,87 0.87 0,0402 0.0402 Cx3cr1 Cx3cr1 -0,82 -0.82 0,0428 .0428 Cira Cira 0,896 0.896 0,0428 .0428 Cd33 CD33 -0,906 -0.906 0,0479 0.0479 Ccl4 CCl4 0,886 0.886 0,0518 .0518

Tableau 12 : Expression différentielle des gènes entre les souris traitées avec l'anti-TIGIT mlgG2a + anti-PD-1 et les souris traitées avec l'anti-PD-1Table 12: Differential gene expression between mice treated with anti-TIGIT mlgG2a + anti-PD-1 and mice treated with anti-PD-1

Symbole du gène Gene symbol Facteur de changement Log2 Log2 change factor Valeur-p corrigée Corrected p-value Ctsg CTSG 2,34 2.34 0,0000375 0.0000375 Prf1 PRF1 1,69 1.69 0,000255 0.000255 Gzmb GZMB 1,71 1.71 0,000766 0.000766 Cd55 CD55 2,08 2.08 0,00131 0.00131 EntpcH EntpcH 0,839 0.839 0,00131 0.00131 Klrgl Klrgl 1,76 1.76 0,00132 0.00132 Itgal ITGAL 0,874 0.874 0,0017 0.0017 Ctla4 CTLA4 1,72 1.72 0,00173 0.00173 Il2ra IL2RA 1,82 1.82 0,00237 0.00237 Itgb3 ITGB3 0,863 0.863 0,00237 0.00237 Slc11a1 SLC11A1 0,849 0.849 0,00329 0.00329 Cd36 CD36 1,44 1.44 0,0049 0.0049 Cd 180 CD 180 0,899 0.899 0,00602 0.00602 Icaml Icaml 0,893 0.893 0,00802 0.00802 Cd274 Cd274 1,06 1.06 0,00993 0.00993 Cd40 CD40 0,926 0.926 0,0113 0.0113

BE2017/5535BE2017 / 5535

Eomes Eomes 1,28 1.28 0,0113 0.0113 Abcgl Abcgl 0,869 0.869 0,0113 0.0113 Ccr2 CCR2 -0,781 -0.781 0,0122 0.0122 Thy1 Thy1 0,868 0.868 0,0165 0.0165 Ccl2 CCL2 0,501 0.501 0,0203 0.0203 Gbp5 GBP5 1,12 1.12 0,0216 0.0216 Icos Icos 1,24 1.24 0,0263 0.0263 Tgfbr2 TGFBR2 0,458 0.458 0,0278 0.0278 H2 K1 H2 K1 0,292 0.292 0,0307 0.0307 Sh2d1a SH2D1A 0,999 0,999 0,0307 0.0307 Il2rb IL2RB 0,808 0.808 0,0307 0.0307 Selplg SELPLG 0,64 0.64 0,031 0.031 Bst1 BST1 0,702 0.702 0,0317 0.0317 Cd247 Cd247 1 1 0,032 0,032 Irf8 IRF8 0,699 0.699 0,0365 0.0365 1121 r 1121 r 0,899 0.899 0,0392 0.0392 Gbp2b Gbp2b 1,11 1.11 0,0392 0.0392 Statl Statl 0,865 0.865 0,0427 0.0427 C4b C4b 0,922 0.922 0,0428 .0428 Abcal ABCAL 0,537 0.537 0,044 0.044 Trem2 TREM2 0,482 0.482 0,0454 0.0454

B. Analyse transcriptomique de la tumeur par NanoStringB. Transcriptomic analysis of the tumor by NanoString

Afin d'étudier le mode d'action in vivo de l'anticorps anti-TIGIT, l'infiltrat de cellules immunitaires des tumeurs traitées avec l'anti-TIGIT, en monothérapie et en association avec l'anti-PD5 1, a été analysé par analyse transcriptomique (Nanostring). Les souris ont été inoculées et traitées comme décrit dans l'exemple 12. Deux jours après le troisième traitement avec les anticorps antiTIGIT et/ou anti-PD1, les souris ont été sacrifiées et les tumeurs prélevées. L'ARN a été extrait et l'expression d'une sélection de 770 gènes impliqués dans l'immunologie cancéreuse a été directement quantifiée avec la technologie nCounter (PanCancer Immune Profiling panel, Nanostring ; réalisée par 10 VIB Nucleomics Core). Les données ont été analysées avec le logiciel nSolver (Nanostring).In order to study the in vivo mode of action of the anti-TIGIT antibody, the infiltrate of immune cells from tumors treated with anti-TIGIT, as monotherapy and in combination with anti-PD5 1, was analyzed by transcriptomic analysis (Nanostring). The mice were inoculated and treated as described in Example 12. Two days after the third treatment with antiTIGIT and / or anti-PD1 antibodies, the mice were sacrificed and the tumors removed. The RNA was extracted and the expression of a selection of 770 genes involved in cancer immunology was directly quantified with nCounter technology (PanCancer Immune Profiling panel, Nanostring; carried out by 10 VIB Nucleomics Core). The data were analyzed with nSolver software (Nanostring).

La Figure 19A illustre un graphique en volcan des gènes qui sont différentiellement régulés entre les souris traitées avec le diluant et les souris traitées avec l'anti-TIGIT mlgG2a. Les gènes avec une significativité statistique élevée se trouvent en haut du graphique, et les gènes exprimés de façon très différenciée se trouvent de part et d'autre (gauche = régulation négative chez les souris traitées 15 avec l'anti-TIGIT, droite = régulation positive chez les souris traitées avec l'anti-TIGIT). Les exemples de gènes présentants une régulation positive élevée comprennent la perforine, le granzyme B et le CTLA-4. La ligne solide représente une valeur de p non corrigée de 0,01, la ligne pointillée représente une valeur de p corrigée de 0,05 (correction de Benjamini-Hochberg). Le Tableau 11 et le Tableau 12Figure 19A illustrates a volcano graph of the genes which are differentially regulated between the mice treated with the diluent and the mice treated with the anti-TIGIT mlgG2a. Genes with high statistical significance are found at the top of the graph, and genes expressed in very differentiated ways are found on both sides (left = negative regulation in mice treated with anti-TIGIT, right = regulation positive in mice treated with anti-TIGIT). Examples of genes exhibiting high upregulation include perforin, granzyme B and CTLA-4. The solid line represents an uncorrected p value of 0.01, the dotted line represents a corrected p value of 0.05 (Benjamini-Hochberg correction). Table 11 and Table 12

BE2017/5535 montrent les gènes qui sont exprimés différentiellement de façon significative pour l'anti-TIGIT mlgG2a en comparaison avec le diluant et l'anti-PD-1 + anti-TIGIT mlgG2a versus l'anti-PD1 respectivement. Lorsque de multiples gènes ont été résumés dans les scores pour les souspopulations de cellules immunitaires fonctionnelles, le résultat le plus marquant est une augmentation du score des cellules cytotoxiques et des lymphocytes T CD8⁺ (Figure 19B). Les mêmes changements sont présents chez les souris traitées avec l'anti-PD-1 + anti-TIGIT mlgG2a en comparaison avec l'anti-PD-1 seul. Aucun changement n'a été observé chez les souris traitées avec l'anti-TIGIT mlgG1, en monothérapie ou en combinaison avec l'anti-PD-1.BE2017 / 5535 show the genes which are significantly differentially expressed for the anti-TIGIT mlgG2a in comparison with the diluent and the anti-PD-1 + anti-TIGIT mlgG2a versus the anti-PD1 respectively. When multiple genes have been summarized in the scores for functional immune cell subpopulations, the most significant result is an increase in the score for cytotoxic cells and CD8 ⁺ T lymphocytes (Figure 19B). The same changes are present in mice treated with anti-PD-1 + anti-TIGIT mlgG2a in comparison with anti-PD-1 alone. No change was observed in mice treated with anti-TIGIT mlgG1, as monotherapy or in combination with anti-PD-1.

Pris ensemble, ces résultats démontrent que l'efficacité antitumorale observée après traitement in vivo avec l'anticorps anti-TIGIT est facilitée par une diminution de l'infiltrat des Treg dans la tumeur alors que la population des lymphocytes T CD8⁺ effecteurs est augmentée. En outre, la fonction effectrice des TIL CD4⁺ et CD8⁺ est augmentée comme montré par la proportion plus élevée de cellules produisant de l'IFNg, l’augmentation de la réponse TH1 et l'augmentation de l'expression des gènes importants pour les fonctions cytotoxiques des lymphocytes T.Taken together, these results demonstrate that the anti-tumor efficacy observed after in vivo treatment with the anti-TIGIT antibody is facilitated by a decrease in the Treg infiltrate in the tumor while the population of CD8 ⁺ effector T lymphocytes is increased. In addition, the effector function of TIL CD4 ⁺ and CD8 ⁺ is increased as shown by the higher proportion of cells producing IFNg, the increase in TH1 response and the increase in expression of genes important for cytotoxic functions of T lymphocytes

Exemple 15 : Activité de la toxicité cellulaire dépendante de l'anticorps (ADCC) induite par les anticorps anti-TIGIT antagonistesExample 15 Activity of Antibody Dependent Cell Toxicity Induced by Antagonistic Anti-TIGIT Antibodies

A. ADCC in vitro sur les PBMC humaines provenant de donneurs sainsA. In vitro ADCC on human PBMCs from healthy donors

Les PBMC isolées provenant de donneurs humains sains ont été resuspendues dans du milieu RPMI complet (supplémenté avec du SVF à 10 % inactivé par la chaleur + 50 U Peniciline + 50 U Streptomycine, et supplémenté avec 200 Ul d'IL-2/ml). 2,5x10⁵ de PBMC humaines ont été distribuées par puits dans une plaque à 96 U puits. Le clone 26452 de l'anticorps TIGIT anti-humain produit dans les cellules de mammifères ou l'isotype lgG1 témoin (Biolegend, 403102) a été ajouté à une concentration finale de 66,6 ; 0,66 et 0,006 nM à chaque puits correspondant. Les cellules sont incubées pendant 20 heures à 37 °C avec 5 % de CO2. Les cellules ont ensuite été récoltées et colorées avec les anticorps suivants : LVD efluor 520 (eBioscience 65-0867-14), ant-TCRab-PercPCy5.5 (Clone IP26, Biolegend 306723), anti-CD4-BV510 (Clone SK3, BD Horizon 562970), anti-CD8APC-Cy7 (Clone SK1, Biolegend 344714), anti-CD25-BV605 (Clone 2A3, Biolegend 562660), antiCD127-APC (A019D5, Biolegend 351316), anti-CCR7-BV421 (Clone G043H7, Biolegend 353207) et anti-CD45RO-PE-Cy7 (Clone UCHL1, Biolegend 304229). Les résultats sont présentés pour des sous-populations de cellules vivantes. CD45⁺CD4⁺ ou CD45⁺CD8⁺ représentent les lymphocytes T CD4⁺ ou CD8⁺ totaux. Les cellules CD45⁺RO⁺CD4⁺ ou CD45⁺RO⁺CD8⁺ représentent les lymphocytes T CD4⁺ ou CD8⁺ mémoire alors que les CD25^eleveeCD127^faibleCD4⁺ représentent les cellules Treg. La proportion des cellules TIGIT⁺ sur les cellules Treg prises à part est plus élevée que pour les lymphocytes T CD8⁺ et les lymphocytes T CD4⁺ mémoire polarisés, comme le démontre la Figure 20A.PBMCs isolated from healthy human donors were resuspended in complete RPMI medium (supplemented with 10% heat inactivated SVF + 50 U Peniciline + 50 U Streptomycin, and supplemented with 200 IU IL-2 / ml) . 2.5x10 ⁵ of human PBMC were distributed per well in a 96 U well plate. Clone 26452 of the anti-human TIGIT antibody produced in mammalian cells or the control IgG1 isotype (Biolegend, 403102) was added to a final concentration of 66.6; 0.66 and 0.006 nM for each corresponding well. The cells are incubated for 20 hours at 37 ° C with 5% CO2. The cells were then harvested and stained with the following antibodies: LVD efluor 520 (eBioscience 65-0867-14), ant-TCRab-PercPCy5.5 (Clone IP26, Biolegend 306723), anti-CD4-BV510 (Clone SK3, BD Horizon 562970), anti-CD8APC-Cy7 (Clone SK1, Biolegend 344714), anti-CD25-BV605 (Clone 2A3, Biolegend 562660), antiCD127-APC (A019D5, Biolegend 351316), anti-CCR7-BV421 (Clone G043H7 353207) and anti-CD45RO-PE-Cy7 (Clone UCHL1, Biolegend 304229). The results are presented for subpopulations of living cells. CD45 ⁺ CD4 ⁺ or CD45 ⁺ CD8 ⁺ represent the total CD4 ⁺ or CD8 ⁺ T lymphocytes. The CD45 ⁺ RO ⁺ CD4 ⁺ or CD45 ⁺ RO ⁺ CD8 ⁺ represent CD4 ⁺ T cells or CD8 ⁺ memory while the ^low CD4 ⁺ CD25 ^HIGH CD127 represent the Treg cells. The proportion of TIGIT ⁺ cells on Treg cells taken apart is higher than for CD8 ⁺ T cells and CD4 ⁺ memory polarized T cells, as shown in Figure 20A.

BE2017/5535BE2017 / 5535

La quantification absolue est réalisée avec les billes de comptage AccuCheck (Life technologies) suivant les spécifications du fabricant. Après le calcul du nombre absolu de cellules par pl, le % de lyse spécifique est calculé en utilisant la formule suivante = (1-(nombre absolu de cellules par pl sur l'échantillon traité avec l'anticorps TIGIT 26452/moyenne de triplicat sans traitement aux anticorps)) x100. Comme le montre la Figure 20B, l'anticorps anti-TIGIT 26452 hlgG1 déclenche une lyse spécifique plus élevée sur les Tregs (62,22 %) que sur les lymphocytes T CD8⁺T totaux (12,2 %) ou les lymphocytes T CD4⁺ totaux (16,36 %).Absolute quantification is carried out with AccuCheck counting balls (Life technologies) according to the manufacturer's specifications. After calculating the absolute number of cells per μl, the% of specific lysis is calculated using the following formula = (1- (absolute number of cells per μl on the sample treated with the TIGIT 26452 antibody / mean of triplicate without antibody treatment)) x100. As shown in Figure 20B, the anti-TIGIT 26452 hlgG1 antibody triggers higher specific lysis on Tregs (62.22%) than on total CD8 ⁺ T T cells (12.2%) or CD4 T cells ⁺ totals (16.36%).

B. ADCC ex-vivo sur la tumeur chez la sourisB. Ex-vivo ADCC on the tumor in mice

Pour confirmer que l'anticorps anti-TIGIT lgG2a de souris peut diminuer les lymphocytes T régulateurs TIGIT⁺, un essai ADCC ex-vivo a été mis au point. Des souris femelles Balb/c de 8 semaines ont été inoculées avec 500 000 cellules du cancer du colon CT26 (ATCC® CRL-2638™) en sous-cutanée. Trois semaines après l'inoculation, les tumeurs ont été prélevées et dissociées avec un kit de dissociation de tumeurs (Miltenyi Biotec). La suspension de cellules unique a été incubée avec 133 nM de l'anticorps anti-TIGIT (mlgG1 ou mlgG2a) pendant 20 heures (1 million cellules/200 pl dans du RPMI + 10 % SVF). Après 20 heures, les cellules ont été marquées avec l'anti-CD4, l'antiTIGIT, l'anti-CD8 et l'anti-FoxP3 (tous de eBioscience) après coloration avec un colorant de viabilité (Molecular Probes, L34955) et Fc-block.To confirm that the mouse anti-TIGIT lgG2a antibody can decrease TIGIT ⁺ regulatory T cells, an ex-vivo ADCC assay has been developed. 8 week old female Balb / c mice were inoculated with 500,000 CT26 colon cancer cells (ATCC® CRL-2638 ™) subcutaneously. Three weeks after inoculation, the tumors were removed and dissociated with a tumor dissociation kit (Miltenyi Biotec). The single cell suspension was incubated with 133 nM anti-TIGIT antibody (mlgG1 or mlgG2a) for 20 hours (1 million cells / 200 µl in RPMI + 10% FCS). After 20 hours, the cells were labeled with anti-CD4, antiTIGIT, anti-CD8 and anti-FoxP3 (all from eBioscience) after staining with a viability dye (Molecular Probes, L34955) and Fc-block.

La Figure 21 illustre le % de diminution du nombre absolu de cellules TIGIT⁺ en comparaison au traitement avec l'isotype témoin pour les différentes sous-populations immunitaires TIGIT⁺. La diminution la plus forte après traitement avec l'anticorps anti-TIGIT mlgG2a est évidente pour les lymphocytes T régulateurs (une diminution aux alentours de 40 %), ce qui suggère que ces cellules sont plus susceptibles à l'ADCC que les lymphocytes T CD4⁺ ou CD8⁺ classiques.Figure 21 illustrates the% decrease in the absolute number of TIGIT ⁺ cells compared to treatment with the control isotype for the various TIGIT ⁺ immune subpopulations. The largest decrease after treatment with the anti-TIGIT antibody mlgG2a is evident for regulatory T cells (a decrease around 40%), suggesting that these cells are more susceptible to ADCC than CD4 T cells ⁺ or classic CD8 ⁺ .

Globalement, ces résultats démontrent l'efficacité de l'anti-TIGIT hlgG1 ou du mlgG2a pour diminuer les cellules immunitaires TIGIT⁺ avec une activité préférentielle sur la population des Treg.Overall, these results demonstrate the effectiveness of the anti-TIGIT hlgG1 or mlgG2a to decrease the TIGIT ⁺ immune cells with preferential activity on the Treg population.

Exemple 16 : Prédiction de l'immunogénicité à l'aide d'une analyse informatique {in silico)Example 16: Prediction of immunogenicity using computer analysis (in silico)

Le potentiel immunogénique des clones 29494 et 29489 aussi bien que pour son variant 31282 a été évalué par prédiction informatique en utilisant le score de protéine EpiMatrix (De Groot et al. (2009) Clinical Immunol. 131:189). Pour compléter l'analyse, les séquences d'entrée ont été analysées dans des cadres 9-mer se chevauchant et chaque cadre a été évalué par rapport à un jeu de huit allèles HLA communs de Classe II. Ces allèles sont des « super types ». Chacun est fonctionnellement équivalent à, ou presque équivalent à, plusieurs autres allèles « membres de la famille ». Pris ensemble, ces huit allèles super-types, accompagnés des membres de leurs familles respectifs, «couvrent» bien au-delà de 95% de la population humaine (Southwood et al. (1998) J. Immunol 160:3363). Chaque « évaluation » cadre-par-allèle est une déclaration concernant l'affinité de liaison HLA prédite. Les scores d'évaluation par EpiMatrix vont d'environ -3 à +3 et sont normalementThe immunogenic potential of clones 29494 and 29489 as well as for its variant 31282 was evaluated by computer prediction using the protein score EpiMatrix (De Groot et al. (2009) Clinical Immunol. 131: 189). To complete the analysis, the input sequences were analyzed in overlapping 9-mer frames and each frame was evaluated against a set of eight common HLA Class II alleles. These alleles are "super types". Each is functionally equivalent to, or almost equivalent to, several other "family member" alleles. Taken together, these eight super-type alleles, accompanied by members of their respective families, "cover" well over 95% of the human population (Southwood et al. (1998) J. Immunol 160: 3363). Each frame-by-allele "assessment" is a statement regarding the predicted HLA binding affinity. EpiMatrix assessment scores range from approximately -3 to +3 and are normally

BE2017/5535 distribués. Les scores d'évaluation EpiMatrix au-dessus de 1,64 sont définis comme des « touches » ; c.-à-d., qu'ils sont potentiellement immunogéniques et doivent être davantage considérés.BE2017 / 5535 distributed. EpiMatrix assessment scores above 1.64 are defined as "keys"; i.e., they are potentially immunogenic and should be considered further.

Tous les autres facteurs étant égaux, plus il y a de ligands HLA (c.-à-d., touches EpiMatrix) dans une protéine donnée, plus la probabilité que cette protéine induise une réponse immunitaire est élevée. Le score de protéine EpiMatrix représente la différence entre le nombre d'épitopes de lymphocytes T prédit, qu'on s'attend à retrouver dans une protéine d'une taille donnée, et le nombre d'épitopes putatifs prédit par le système EpiMatrix. Le score de protéine EpiMatrix est corrélé à l'immunogénicité observée. Les scores des scores de protéine EpiMatrix sont « normalisés » et peuvent être rapportés sur une échelle standardisée. Le score « EpiMatrix Protein Score » d'une protéine « moyenne » est de zéro. Les scores de protéine EpiMatrix supérieurs à zéro indiquent la présence d'un excès de ligands MHC et indiquent un potentiel plus élevé pour l'immunogénicité alors que les scores en-dessous de zéro indiquent la présence d'une plus petite quantité de ligands MHC potentiels que prévu et un potentiel plus faible pour l'immunogénicité. Les protéines avec un score supérieur à +20 sont considérées comme ayant un potentiel d'immunogénicité significatif.All other factors being equal, the more HLA ligands (i.e., EpiMatrix keys) present in a given protein, the higher the probability that this protein will induce an immune response. The EpiMatrix protein score represents the difference between the number of predicted T cell epitopes expected to be found in a protein of a given size, and the number of putative epitopes predicted by the EpiMatrix system. The EpiMatrix protein score is correlated with the observed immunogenicity. Scores of EpiMatrix protein scores are "normalized" and can be reported on a standardized scale. The “EpiMatrix Protein Score” for an “average” protein is zero. EpiMatrix protein scores greater than zero indicate the presence of excess MHC ligands and indicate higher potential for immunogenicity while scores below zero indicate the presence of a smaller amount of potential MHC ligands than expected and a lower potential for immunogenicity. Proteins with a score greater than +20 are considered to have significant immunogenicity potential.

Ajustement pour la présence des épitopes de lymphocytes T régulateurs.Adjustment for the presence of regulatory T cell epitopes.

Les anticorps sont des protéines uniques car la séquence d'acides aminés de leur domaine variable, particulièrement de leur région déterminant la complémentarité (CDR), peut varier dans une mesure extraordinaire. C'est cette variabilité qui permet aux anticorps de reconnaître une grande diversité d'antigènes. Cependant, les événements de recombinaison et de mutation qui contrôlent la maturation de l'anticorps peuvent également produire de nouveaux épitopes ou des néo-épitopes de lymphocytes T. Ces néo-épitopes peuvent apparaître comme étant « étrangers » aux lymphocytes T en circulation. La présence des néo-épitopes dans les séquences d'anticorps peut entraîner la formation d'une réponse d'anticorps humain-anti-humain également appelée une réponse HAHA ou ADA (Anticorps anti-médicament).Antibodies are unique proteins because the amino acid sequence of their variable domain, particularly their complementarity determining region (CDR), can vary to an extraordinary extent. It is this variability that allows antibodies to recognize a wide variety of antigens. However, the recombination and mutation events that control the maturation of the antibody can also produce new epitopes or T-cell neo-epitopes. These neo-epitopes may appear to be "foreign" to circulating T cells. The presence of neo-epitopes in antibody sequences can result in the formation of a human-anti-human antibody response, also called a HAHA or ADA (anti-drug antibody) response.

Les lymphocytes T régulateurs jouent un rôle important dans la suppression des réponses immunitaires contre les protéines totalement humaines en périphérie, y compris celles contenant des séquences mutées et/ou des séquences hautement variables telles que les CDR des anticorps. Les lymphocytes T régulateurs entrent en contact et sont activés par les épitopes des lymphocytes T régulateurs. Le risque inhérent associé à la présence des néo-épitopes dans les séquences d'anticorps semble être équilibré par la présence d'épitopes de lymphocytes T régulateurs naturels.Regulatory T cells play an important role in suppressing immune responses against completely human proteins at the periphery, including those containing mutated sequences and / or highly variable sequences such as antibody CDRs. Regulatory T cells come into contact and are activated by epitopes of regulatory T cells. The inherent risk associated with the presence of neo-epitopes in antibody sequences appears to be balanced by the presence of epitopes of natural regulatory T cells.

En criblant les séquences de beaucoup d'anticorps humains isolés, EpiVax a identifié plusieurs ligands HLA hautement conservés qui auraient un potentiel de régulation. Les données expérimentales suggèrent que plusieurs de ces peptides sont, en fait, activement tolérogéniques chez la plupart des sujets. Ces épitopes de lymphocytes T hautement conservés, ubiquistes et régulateurs sont appelés des Tregitopes (De Groot et al. (2008) Blood 112:3303)By screening the sequences of many isolated human antibodies, EpiVax identified several highly conserved HLA ligands that have regulatory potential. Experimental data suggests that many of these peptides are, in fact, actively tolerogenic in most subjects. These highly conserved, ubiquitous and regulatory T cell epitopes are called Tregitopes (De Groot et al. (2008) Blood 112: 3303)

BE2017/5535BE2017 / 5535

Dans beaucoup de cas, le potentiel immunogénique des néo-épitopes contenus dans les anticorps humanisés peut effectivement être contrôlé par la présence d'un nombre important deIn many cases, the immunogenic potential of the neo-epitopes contained in humanized antibodies can effectively be controlled by the presence of a large number of

Tregitopes. Dans le cadre de l'analyse de l'immunogénicité des anticorps, EpiVax a développé un score EpiMatrix ajusté pour le Tregitope et la prédiction correspondante d'une réponse d'anticorps anti-thérapeutique. Afin de calculer le score EpiMatrix ajusté pour le Tregitope, les scores des Tregitopes ont été déduits du score de protéine EpiMatrix. Il a été démontré que les scores ajustés pour le Tregitope sont bien corrélés avec des réponses immunitaires cliniques observées pour un ensemble de 23 anticorps commerciaux (De Groot et al. (2009) Clinical Immunol. 131:189).Tregitopes. As part of the analysis of the immunogenicity of the antibodies, EpiVax developed an EpiMatrix score adjusted for the Tregitope and the corresponding prediction of an anti-therapeutic antibody response. In order to calculate the adjusted EpiMatrix score for the Tregitope, the Tregitope scores were deduced from the protein score EpiMatrix. Adjusted scores for Tregitope have been shown to correlate well with clinical immune responses observed for a set of 23 commercial antibodies (De Groot et al. (2009) Clinical Immunol. 131: 189).

Le score des séquences d'anticorps des clones 29489, 29494 et 31282 se trouve sur la partie inférieure de l'échelle EpiMatrix, indiquant un potentiel limité pour l'immunogénicité. Une analyse par régression des anticorps monoclonaux sous-licence prédit une réponse ADA chez environ 0 % des patients exposés pour les clones 29489 et 31282 de l'anticorps. Pour le clone 29494, l'analyse prédit une réponse ADA chez 2,78 % des patients exposés pour la séquence VH de référence, et 2,88 % pour la séquence VH variante. Les données sont résumées dans le Tableau 13 ci-dessous.The antibody sequence score for clones 29489, 29494 and 31282 is found at the bottom of the EpiMatrix scale, indicating limited potential for immunogenicity. Regression analysis of the sublicensed monoclonal antibodies predicts an ADA response in approximately 0% of patients exposed for clones 29489 and 31282 of the antibody. For clone 29494, the analysis predicts an ADA response in 2.78% of the patients exposed for the reference VH sequence, and 2.88% for the variant VH sequence. The data is summarized in Table 13 below.

Tableau 13 : Scores EpiMatrix ajustés par EpiMatrix et TregitopeTable 13: EpiMatrix scores adjusted by EpiMatrix and Tregitope

Séquence d’entrée Entry sequence Longueur Length Évaluations Ratings Touches EpiMatrix EpiMatrix keys Score EpiMatrix EpiMatrix Score Score EpiMatrix ajusté pour le Tregitope EpiMatrix score adjusted for Tregitope liilliiiii liilliiiii iiiiiiiiiii IIIIIIIIIII iiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiin iiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiin iiiiiiiiiii IIIIIIIIIII iiiiiililliiiiiii iiiiiililliiiiiii 29489_VL 29489_VL 108 108 800 800 39 39 -17.58 -17.58 -51.75 -51.75 31282_VH 31282_VH 121 121 904 904 40 40 -19.41 -19.41 -47.26 -47.26 liiiiiiiii liiiiiiiii iiiiiiiiii iiiiiiiiii iiiiiiiiiii IIIIIIIIIII iiiiiiiiiii IIIIIIIIIII -17.58 -17.58 iiiiiiiiiiiiiiiii IIIIIIIIIIIIIIIII iiiliiliili iiiliiliili liiiiiiiii liiiiiiiii iiiilliiiiii iiiilliiiiii iiiiiiiiiii IIIIIIIIIII iiiiiiiiiii IIIIIIIIIII -7.18 -7.18 29494 VL 29494 VL 107 107 792 792 40 40 -12.2 -12.2 -38.83 -38.83

BE2017/5535BE2017 / 5535

Légende des figures :Legend of figures:

Fig. 7 : Compétition avec le ligand CD155 humainFig. 7: Competition with the human CD155 ligand

Fig. 8 : Expression de TIGIT sur différentes populations immunitaires provenant des PBMC de donneurs sainsFig. 8: Expression of TIGIT on different immune populations originating from PBMCs of healthy donors

Fig. 9 : Liaison aux Jurkat-hTIGITFig. 9: Liaison with Jurkat-hTIGIT

Fig. 10 : Liaison aux lymphocytes T CD8⁺ primaires humainsFig. 10: Binding to human primary CD8 ⁺ T cells

Fig. 11 : Liaison aux lymphocytes T CD8⁺ primaires de CynomolgusFig. 11: Binding to primary CD8 ⁺ T cells from Cynomolgus

Fig. 12 : Effet des anticorps anti-TIGIT dans un bioessai CHO-TCR-CD155 et Jurkat-hTIGITFig. 12: Effect of anti-TIGIT antibodies in a CHO-TCR-CD155 and Jurkat-hTIGIT bioassay

Fig. 13 : Effet des anticoprs anti-TIGIT sur les lymphocytes T CD8⁺ humains basés sur un essai fonctionnelFig. 13: Effect of anti-TIGIT anticoprs on human CD8 ⁺ T lymphocytes based on a functional test

Fig. 14 : Effet des anticoprs anti-TIGIT sur les TIL humains basés sur un essai fonctionnelFig. 14: Effect of anti-TIGIT anticoprs on human TIL based on a functional test

Fig. 15: Caractérisation de l’anticoprs de remplacement anti-TIGIT de souris qui démontre une activité fonctionnelle chez la sourisFig. 15: Characterization of the mouse anti-TIGIT replacement anticoprs which demonstrates functional activity in mice

Fig. 16 : Efficacité anti-tumorale de l’anticorps anti-TIGIT antagonisteFig. 16: Anti-tumor efficacy of the antagonistic anti-TIGIT antibody

Fig. 17 : Efficacité anti-tumorale dépendante de l’isotype de l’anticorps anti-TIGIT antagonisteFig. 17: Anti-tumor efficacy dependent on the isotype of the antagonistic anti-TIGIT antibody

Fig. 18 : Mécanisme de l’efficacité anti-tumorale de l’anticoprs anti-TIGIT antagonisteFig. 18: Mechanism of the anti-tumor efficacy of the antagonistic anti-TIGIT anticoprs

Fig. 19 : Mécanisme de l’efficacité anti-tumorale de l’anticoprs anti-TIGIT antagoniste (analyse transcriptionnelle)Fig. 19: Mechanism of the anti-tumor efficacy of the antagonist anti-TIGIT anticoprs (transcriptional analysis)

Fig. 20 : Activité ADCC sur des PBMC humaines sainesFig. 20: ADCC activity on healthy human PBMCs

Fig. 21 : Diminution préférentielle des cellules Treg dans une suspension de tumeur chez la sourisFig. 21: Preferential decrease in Treg cells in a tumor suspension in mice

Claims

REVENDICATIONS

1. Un anticorps isolé ou fragment de liaison à l'antigène de celui-ci qui se lie au TIGIT humain et qui comprend un domaine variable de chaîne lourde dans lequel l'anticorps ou le fragment de liaison à l'antigène comprend une combinaison de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 et LCDR3, dans lequel :1. An isolated antibody or antigen binding fragment thereof which binds to human TIGIT and which comprises a heavy chain variable domain in which the antibody or antigen binding fragment comprises a combination of HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 and LCDR3, in which:

HCDR1 comprend la SEQ ID NO : 16 (YTFTSYYMH),HCDR1 includes SEQ ID NO: 16 (YTFTSYYMH),

HCDR2 comprend la SEQ ID NO : 17 (VIGPSGASTSYAQKFQG),HCDR2 includes SEQ ID NO: 17 (VIGPSGASTSYAQKFQG),

HCDR3 comprend la SEQ ID NO : 18 (ARDHSDYWSGIMEV),HCDR3 includes SEQ ID NO: 18 (ARDHSDYWSGIMEV),

LCDR1 comprend la SEQ ID NO : 61 (RASQSVRSSYLA),LCDR1 includes SEQ ID NO: 61 (RASQSVRSSYLA),

LCDR2 comprend la SEQ ID NO : 62 (GASSRAT), etLCDR2 includes SEQ ID NO: 62 (GASSRAT), and

LCDR2 comprend la SEQ ID NO : 63 (QQYFSPPWT).LCDR2 includes SEQ ID NO: 63 (QQYFSPPWT).

2. Anticorps ou fragment de liaison à l'antigène selon la revendication 1, dans lequel le domaine variable de chaîne lourde comprend la séquence d'acides aminés illustrée comme SEQ ID NO:221 ou une séquence d'acides aminés démontrant une identité de séquence d'au moins 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % à celle-ci, et le domaine variable de la chaîne légère comprendre la séquence d'acides aminés illustrée comme la SEQ ID NO:222 ou une séquence d'acides aminés démontrant une identité de séquence d'au moins 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % à celle-ci.2. The antibody or antigen binding fragment of claim 1, wherein the heavy chain variable domain comprises the amino acid sequence illustrated as SEQ ID NO: 221 or an amino acid sequence demonstrating sequence identity at least 90%, 95%, 97%, 98% or 99% thereof, and the variable domain of the light chain include the amino acid sequence illustrated as SEQ ID NO: 222 or a sequence d amino acids demonstrating a sequence identity of at least 90%, 95%, 97%, 98% or 99% thereto.

3. Anticorps ou fragment de liaison à l'antigène selon la revendication 5, dans lequel le domaine variable de chaîne lourde comprend la séquence d'acides aminés illustrée comme SEQ ID NO:219 ou une séquence d'acides aminés démontrant une identité de séquence d'au moins 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % à celle-ci, et le domaine variable de la chaîne légère comprendre la séquence d'acides aminés illustrée comme la SEQ ID NO:220 ou une séquence d'acides aminés démontrant une identité de séquence d'au moins 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % à celle-ci.3. The antibody or antigen binding fragment according to claim 5, wherein the heavy chain variable domain comprises the amino acid sequence illustrated as SEQ ID NO: 219 or an amino acid sequence demonstrating sequence identity at least 90%, 95%, 97%, 98% or 99% thereof, and the variable domain of the light chain include the amino acid sequence illustrated as SEQ ID NO: 220 or a sequence d amino acids demonstrating a sequence identity of at least 90%, 95%, 97%, 98% or 99% thereto.

4. Anticorps ou fragment de liaison à l’antigène selon une quelconque revendication précédente, qui est un anticorps IgG humain, de préférence un anticorps lgG1 humain.4. The antibody or antigen binding fragment according to any preceding claim, which is a human IgG antibody, preferably a human IgG1 antibody.

5. Anticorps ou fragment de liaison à l'antigène selon une quelconque revendication précédente, qui démontre une ou plusieurs fonctions effectrices choisies parmi la cytotoxicité facilitée par la cellule dépendante de l'anticorps (ADCC), la cytotoxicité dépendante du complément (CDC) et la phagocytose facilitée par la cellule dépendante de l'anticorps (ADCP) contre les cellules exprimant le TIGIT sur la surface cellulaire.5. Antibody or antigen-binding fragment according to any preceding claim, which demonstrates one or more effector functions chosen from cytotoxicity facilitated by the antibody-dependent cell (ADCC), complement-dependent cytotoxicity (CDC) and phagocytosis facilitated by the antibody-dependent cell (ADCP) against cells expressing TIGIT on the cell surface.

BE2017/5535BE2017 / 5535

6. Anticorps ou fragment de liaison à l'antigène selon une quelconque revendication précédente, qui diminue préférentiellement les cellules Treg exprimant TIGIT.6. Antibody or antigen binding fragment according to any preceding claim, which preferentially decreases Treg cells expressing TIGIT.

7. Anticorps anti-TIGIT isolé ou fragment de liaison à l'antigène de celui-ci qui épuise préférentiellement les cellules Treg exprimant TIGIT, éventuellement dans lequel l'anticorps ou le fragment de liaison à l'antigène est un anticorps ou un fragment de liaison à l'antigène selon l’une quelconque des revendications 1 à 3.7. Isolated anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof which preferentially depletes TIGIT-expressing Treg cells, optionally in which the antibody or antigen-binding fragment is an antibody or a fragment of binding to the antigen according to any one of claims 1 to 3.

8. Anticorps ou fragment de liaison à l'antigène selon une quelconque revendication précédente, qui démontre une affinité équivalente pour les cellules Treg exprimant TIGIT et les lymphocytes T CD8⁺exprimant TIGIT.8. Antibody or antigen binding fragment according to any preceding claim, which demonstrates an equivalent affinity for Treg cells expressing TIGIT and CD8 ⁺ T lymphocytes expressing TIGIT.

9. Anticorps ou fragment de liaison à l'antigène selon une quelconque revendication précédente, qui diminue l'expression de TIGIT sur les lymphocytes T CD8⁺ et/ou sur les cellules Treg.9. Antibody or antigen binding fragment according to any preceding claim, which decreases the expression of TIGIT on CD8 ⁺ T lymphocytes and / or on Treg cells.

10. Polynucléotide isolé codant pour un anticorps ou un fragment de liaison à l'antigène selon une quelconque revendication précédente.10. An isolated polynucleotide encoding an antibody or an antigen binding fragment according to any preceding claim.

11. Polynucléotide isolé selon la revendication 10, dans lequel le polynucléotide isolé comprend la SEQ ID NO : 251 et la SEQ ID NO : 252.11. The isolated polynucleotide according to claim 10, wherein the isolated polynucleotide comprises SEQ ID NO: 251 and SEQ ID NO: 252.

12. Vecteur d'expression comprenant le polynucléotide selon la revendication 10 ou la revendication12. Expression vector comprising the polynucleotide according to claim 10 or claim

11, lié en fonctionnement à des séquences de régulation qui permettent l'expression du polypeptide de liaison à l'antigène dans une cellule hôte ou dans un système d'expression exempt de cellules.11, operably linked to regulatory sequences which allow expression of the antigen binding polypeptide in a host cell or in a cell-free expression system.

13. Cellule hôte ou système d'expression exempt de cellules contenant le vecteur d'expression selon la revendication 12.13. Host cell or expression system free of cells containing the expression vector according to claim 12.

14. Méthode de production d'un anticorps recombinant ou d'un fragment de liaison à l'antigène de celui-ci qui comprend la culture de la cellule hôte ou du système d'expression exempt de cellules selon la revendication 13, dans des conditions qui permettent l'expression de l'anticorps ou du fragment de liaison à l'antigène et la récupération de l'anticorps ou du fragment de liaison à l'antigène exprimé.14. A method of producing a recombinant antibody or an antigen binding fragment thereof which comprises culturing the host cell or the cell-free expression system according to claim 13, under conditions which allow expression of the antibody or antigen binding fragment and recovery of the antibody or expressed antigen binding fragment.

15. Composition pharmaceutique comprenant un anticorps ou un fragment de liaison à l'antigène selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, et au moins un support ou un excipient pharmaceutiquement acceptable.15. A pharmaceutical composition comprising an antibody or an antigen-binding fragment according to any one of claims 1 to 9, and at least one pharmaceutically acceptable carrier or excipient.

16. Anticorps ou fragment de liaison à l'antigène selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, ou composition pharmaceutique selon la revendication 15 pour une utilisation en thérapie.16. The antibody or antigen binding fragment according to any of claims 1 to 9, or the pharmaceutical composition according to claim 15 for use in therapy.

BE2017/5535BE2017 / 5535

17. Anticorps ou fragment de liaison à l'antigène selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, ou composition pharmaceutique selon la revendication 15 pour une utilisation dans une méthode de traitement du cancer.17. The antibody or antigen binding fragment according to any of claims 1 to 9, or the pharmaceutical composition according to claim 15 for use in a method of treating cancer.

18. Méthode de traitement du cancer chez un sujet comprenant l'administration d'une quantité efficace18. A method of treating cancer in a subject comprising administering an effective amount

5 d'un anticorps ou d'un fragment de liaison à l'antigène selon l'une quelconque des revendications 1 à5 of an antibody or antigen binding fragment according to any one of claims 1 to

9 ou composition pharmaceutique selon la revendication 15 au sujet, traitant ainsi le cancer.9 or a pharmaceutical composition according to claim 15 to the subject, thereby treating cancer.

19. Anticorps ou un fragment de liaison à l'antigène ou une composition pharmaceutique pour une utilisation dans une méthode selon la revendication 17, ou une méthode de traitement du cancer selon la revendication 18, dans lequel la méthode comprend également l'administration d'un agent19. An antibody or an antigen binding fragment or a pharmaceutical composition for use in a method according to claim 17, or a method of treating cancer according to claim 18, wherein the method also comprises administering an agent

10 thérapeutique supplémentaire.10 additional therapy.

20. Anticorps ou le fragment de liaison à l'antigène ou la composition pharmaceutique pour une utilisation dans une méthode selon la revendication 19 ou une méthode de traitement du cancer selon la revendication 19, dans lequel l'agent thérapeutique est choisi parmi :un agent chimiothérapeutique, un anticorps anti-PD1, un anticorps anti-PD-L1.20. Antibody or the antigen binding fragment or pharmaceutical composition for use in a method according to claim 19 or a method of treating cancer according to claim 19, wherein the therapeutic agent is selected from: an agent chemotherapeutic, anti-PD1 antibody, anti-PD-L1 antibody.