BE1024420B1 - Polynucleotides et polypeptides d'adenovirus - Google Patents

Polynucleotides et polypeptides d'adenovirus Download PDF

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BE1024420B1 BE2016/5434A BE201605434A BE1024420B1 BE 1024420 B1 BE1024420 B1 BE 1024420B1 BE 2016/5434 A BE2016/5434 A BE 2016/5434A BE 201605434 A BE201605434 A BE 201605434A BE 1024420 B1 BE1024420 B1 BE 1024420B1
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Virginia Ammendola
Fabiana Grazioli
Alessandra Vitelli
Alfredo Nicosia
Riccardo Cortese
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Abstract

Il est fourni entre autres un polynucléotide isolé, polynucléotide codant pour un polypeptide choisi dans le groupe constitué de : (a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1, et (c) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3.

Description

(73) Titulaire(s) :
GLAXOSMITHKLINE BIOLOGICALS SA
1330, RIXENSART
Belgique (72) Inventeur(s) :
COLLOCA Stefano 00144 ROME Italie
AMMENDOLA Virginia 00144 ROME Italie
GRAZIOLI Fabiana 00144 ROME Italie
VITELLI Alessandra 00144 ROME Italie
NICOSIA Alfredo 80121 NAPLES Italie
CORTESE Riccardo 4001 BASEL
Suisse (54) POLYNUCLEOTIDES ET POLYPEPTIDES D'ADENOVIRUS (57) Il est fourni entre autres un polynucléotide isolé polynucléotide codant pour un polypeptide choisi dans le groupe constitué de : (a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1, et (c) un polypeptide ayant la séquence d’acides aminés selon SEQ ID NO : 3.
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BREVET D'INVENTION BELGE
SPF Economie, PME, Classes Moyennes & Energie
Numéro de publication : 1024420 Numéro de dépôt : BE2016/5434
Office de la Propriété intellectuelle Classification Internationale : A61K 39/235 C07K 14/75 C12N 15/861A61K 39/12 A61K 39/00 Date de délivrance : 19/02/2018
Le Ministre de l'Economie,
Vu la Convention de Paris du 20 mars 1883 pour la Protection de la propriété industrielle ;
Vu la loi du 28 mars 1984 sur les brevets d'invention, l'article 22, pour les demandes de brevet introduites avant le 22 septembre 2014 ;
Vu le Titre 1er “Brevets d’invention” du Livre XI du Code de droit économique, l'article XI.24, pour les demandes de brevet introduites à partir du 22 septembre 2014 ;
Vu l'arrêté royal du 2 décembre 1986 relatif à la demande, à la délivrance et au maintien en vigueur des brevets d'invention, l'article 28 ;
Vu la demande de brevet d'invention reçue par l'Office de la Propriété intellectuelle en date du 10/06/2016.
Considérant que pour les demandes de brevet tombant dans le champ d'application du Titre 1er, du Livre XI du Code de Droit économique (ci-après CDE), conformément à l'article XI. 19, §4, alinéa 2, du CDE, si la demande de brevet a fait l'objet d'un rapport de recherche mentionnant un défaut d'unité d'invention au sens du §ler de l'article XI.19 précité et dans le cas où le demandeur n'effectue ni une limitation de sa demande ni un dépôt d'une demande divisionnaire conformément aux résultats du rapport de recherche, le brevet délivré sera limité aux revendications pour lesquelles le rapport de recherche a été établi.
Arrête :
Article premier. - Il est délivré à
GLAXOSMITHKLINE BIOLOGICALS SA, Rue de l'Institut 89, 1330 RIXENSART Belgique;
représenté par
PRONOVEM - Office Van Malderen, Avenue Josse Goffin 158, 1082, BRUXELLES;
un brevet d'invention belge d'une durée de 20 ans, sous réserve du paiement des taxes annuelles visées à l’article XI.48, §1 du Code de droit économique, pour : POLYNUCLEOTIDES ET POLYPEPTIDES
D'ADENOVIRUS.
INVENTEUR(S) :
COLLOCA Stefano, Via Salaria 73, 00144, ROME;
AMMENDOLA Virginia, Viale Città d'Europa 679,00144, ROME;
GRAZIOLI Fabiana, Viale Città d'Europa 679,00144, ROME;
VITELLI Alessandra, Via del Casaletto 521, 00144, ROME;
NICOSIAAlfredo, Via Parco Carelli 70, 80121, NAPLES;
CORTESE Riccardo, Rheinsprung 5, 4001, BASEL;
PRIORITE(S) :
12/06/2015 GB 1510357.5;
19/08/2015 GB 1514772.1;
12/06/2015 EP PCT/EP2015/063248;
DIVISION :
divisé de la demande de base :
date de dépôt de la demande de base :
Article 2. - Ce brevet est délivré sans examen préalable de la brevetabilité de l'invention, sans garantie du mérite de l'invention ou de l'exactitude de la description de celle-ci et aux risques et périls du (des) demandeur(s).
Bruxelles, le 19/02/2018, Par délégation spéciale :
BE2016/5434
POLYNUCLEOTIDES ET POLYPEPTIDES D'ADENOVIRUS
Domaine de 1'invention
La présente invention concerne des séquences polynucléotidiques et polypeptidiques isolées dérivées du nouvel adénovirus de chimpanzé ChAdl55, ainsi que des polynucléotides, des vecteurs, des adénovirus recombinants, des cellules et des compositions comprenant lesdites séquences polynucléotidiques et polypeptidiques.
Contexte de 1'invention
L’adénovirus a été larqement utilisé pour des applications de transfert de qènes en raison de sa capacité d'obtention d'un transfert de qènes hautement efficace dans divers tissus cibles et d'une qrande capacité de transqènes. De façon traditionnelle, les qènes El d'adénovirus sont délétés et remplacés par une cassette de transqène constituée du promoteur de choix, de la séquence d'ADNc du qène d'intérêt et d'un siqnal poly A, produisant un virus recombinant défectueux pour la réplication.
Les adénovirus recombinants sont utiles en thérapie qénique et en tant que vaccins. Les vecteurs viraux à base d'adénovirus de chimpanzé représentent une alternative à l'utilisation de vecteurs Ad d'oriqine humaine pour le développement de vaccins qénétiques. Les adénovirus isolés des chimpanzés sont étroitement apparentés aux adénovirus isolés des êtres humains comme il a été démontré par leur propaqation efficace dans des cellules d'oriqine humaine. Toutefois,
BE2016/5434 adénovirus humains et de chimpanzé sont apparentés, une réactivité croisée entre les deux espèces de virus est puisque les étroitement sérologique possible.
Il existe une demande pour des vecteurs qui administrent efficacement des molécules à une cible et qui minimisent l'effet de l'immunité préexistante envers des sérotypes d'adénovirus sélectionnés dans la population. Un aspect de l'immunité préexistante qui est observée chez les êtres humains est l'immunité humorale, qui peut résulter de la production et de la persistance d'anticorps qui sont spécifiques de protéines adénovirales. La réponse humorale déclenchée par les adénovirus est dirigée principalement contre les trois protéines structurales principales de la capside : la fibre, le penton et 1'hexon.
Les vecteurs, les compositions et les procédés de la présente invention peuvent présenter une ou plusieurs des caractéristiques suivantes améliorées par rapport à l'art antérieur, y compris, mais n'y étant pas limitées, une productivité supérieure, une immunogénicité améliorée et une expression accrue de transgènes.
Résumé de 1'invention
Il est fourni un polynucléotide isolé, le polynucléotide codant pour un polypeptide choisi dans le groupe constitué de :
(a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1,
BE2016/5434 (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1, et (c) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3.
Il est également fourni un polynucléotide recombinant comprenant un polynucléotide choisi dans le groupe constitué de :
(a) un polynucléotide qui code pour un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, (b) un polynucléotide qui code pour un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1, et (c) un polynucléotide qui code pour un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3.
Il est également fourni un vecteur recombinant comprenant un polynucléotide choisi dans le groupe constitué de :
(a) un polynucléotide qui code pour un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, (b) un polynucléotide qui code pour un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1, et
BE2016/5434 (c) un polynucléotide qui code pour un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3.
Il est également fourni un adénovirus recombinant comprenant au moins un polynucléotide ou un polypeptide choisi dans le groupe constitué de :
(a) un polynucléotide qui code pour un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, (b) un polynucléotide qui code pour un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1, (c) un polynucléotide qui code pour un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3, (d) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, (e) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1, et (f) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3.
Il est également fourni une composition comprenant au moins l'un des suivants :
(a) un polynucléotide qui code pour un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, (b) un polynucléotide qui code pour un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, où le dérivé fonctionnel a
BE2016/5434 une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 % sur sa lonqueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1, (c) un polynucléotide qui code pour un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3, (d) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, (e) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 % sur sa lonqueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1, (f) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3, (q) un vecteur comprenant un polynucléotide tel que décrit en (a), (b) ou (c) ci-dessus, et (h) un adénovirus recombinant comprenant un polynucléotide tel que décrit en (a) , (b) ou (c) cidessus, et un excipient pharmaceutiquement acceptable.
Il est éqalement fourni une cellule comprenant au moins l'un des suivants :
(a) un polynucléotide qui code pour un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, (b) un polynucléotide qui code pour un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 % sur sa lonqueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1,
BE2016/5434 (c) un polynucléotide qui code pour un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3, (d) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, (e) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1, (f) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3, (g) un vecteur comprenant un polynucléotide tel que décrit en (a), (b) ou (c) ci-dessus, et (h) un adénovirus recombinant comprenant un polynucléotide tel que décrit en (a) , (b) ou (c) cidessus, et un excipient pharmaceutiquement acceptable.
Il est également fourni un polypeptide adénoviral isolé choisi dans le groupe constitué de :
(a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1, et (c) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3.
Il est également fourni un polynucléotide isolé, un vecteur, un adénovirus recombinant, une composition
BE2016/5434 ou une cellule comprenant ou constitué de la séquence selon SEQ ID NO : 6.
Description des figures
Figures IA à C - Alignement des séquences de la
protéine fibre provenant des adénovirus simiens
indiqués
ChAd3 (SEQ ID NO : 27)
PanAd3 (SEQ ID NO : 28)
ChAdl7 (SEQ ID NO : 29)
ChAdl9 (SEQ ID NO : 30)
ChAd24 (SEQ ID NO : 31)
ChAdl55 (SEQ ID NO : 1)
ChAdll (SEQ ID NO : 32)
ChAd20 (SEQ ID NO : 33)
ChAd31 (SEQ ID NO : 34)
PanAdl (SEQ ID NO : 35)
PanAd2 (SEQ ID NO : 36)
Figure 2 - Organigramme pour la production d'un
BAC de ChAD155 spécifique et de vecteurs plasmidiques
Figure 3 - Schéma du BAC navette espèce C No. 1365
Figure 4 - Schéma de 1 'AD5E4orf6-2 de pArsChAdl55
(No. 1490)
Figure 5 - Schéma de pChAdl55/RSV
Figure 6 - Schéma de BAC ChAdl55/RSV et
Figure 7 - Productivité des vecteurs ChAd3
ChAdl55 exprimant un transgène de Gag du VIH
(expérience 1)
Figure 8 - Productivité des vecteurs ChAd3 et
ChAdl55 exprimant un transgène de Gag du VIH
(expérience 2)
BE2016/5434
Figure 9 - Productivité des vecteurs PanAd3 et ChAdl55 exprimant un transgène du RSV
Figure 10 - Taux d'expression des vecteurs ChAd3 et ChAdl55 exprimant un transgène de Gag du VIH
Figure 11 - Taux d'expression des vecteurs PanAd3 et ChAdl55 exprimant un transgène de Gag du VIH Western blot
Figure 12 - Immunogénicité des vecteurs ChAd3 et ChAdl55 exprimant un transgène de Gag du VIH - ELISpot pour l'IFN-gamma
Figure 13 - Immunogénicité des vecteurs PanAd3 et ChAD155 exprimant un transgène de Gag du VIH - ELISpot pour l'IFN-gamma
Description des séquences
SEQ ID NO : 1 - Séquence polypeptidique de la
fibre du ChAdl55
SEQ ID NO : 2 - Séquence polynucléotidique codant
pour la fibre du ChAdl55
SEQ ID NO : 3 - Séquence polypeptidique du penton
du ChAdl55
SEQ ID NO : 4 - Séquence polynucléotidique codant
pour le penton du ChAdl55
SEQ ID NO : 5 - Séquence polypeptidique de 1'hexon
du ChAdl55
SEQ ID NO : 6 - Séquence polynucléotidique codant
pour 1'hexon du ChAdl55
SEQ ID NO : 7 - Séquence polynucléotidique codant
pour le ChAdl55 No. 1434
SEQ ID NO : 8 - Séquence polynucléotidique codant
pour le ChAdl55 No. 1390
BE2016/5434
SEQ ID NO : 9 - séquence polynucléotidique codant pour le ChAdl55 No. 1375
SEQ ID NO : 10 - Séquence polynucléotidique codant pour le ChAdl55 de type sauvaqe
SEQ ID NO : 11 - Séquence polynucléotidique codant pour le ChAdl55/RSV
SEQ ID NO : 12 - Séquence polynucléotidique codant pour le promoteur CASI
SEQ ID NO : 13 - Séquence polynucléotidique de
1'amorce 1 de l'orf6 de l'Ad5
SEQ ID NO : 14 - Séquence polynucléotidique de
1'amorce 2 de l'orf6 de l'Ad5
SEQ ID NO : 15 - Séquence polynucléotidique de
1'amorce 1 de BAC/CHAdl55 ΔΕ1 TetO hCMV RpsL-Kana
SEQ ID NO : 16 - Séquence polynucléotidique de
l'amorce 2 BAC/CHAdl55 AEl_TetO hCMV RpsL-Kana (No. 1375)
SEQ ID NO : 17 - Séquence polynucléotidique de
1'amorce 1021-FW E4 Del Stepl
SEQ ID NO : 18 - Séquence polynucléotidique de
1'amorce 1022-RW E4 Del Stepl
SEQ ID NO : 19 - Séquence polynucléotidique de
1'amorce 1025-FW E4 Del Step2
SEQ ID NO : 20 - Séquence polynucléotidique de
1'amorce 1026-RW E4 Del Step2
SEQ ID NO : 21 - Séquence polynucléotidique de
1'amorce 91-SubMonte FW
SEQ ID NO : 22 - Séquence polynucléotidique de
1'amorce 8 90-BqhPoly RW
SEQ ID NO : 23 - Séquence polynucléotidique de
1'amorce CMVfor
BE2016/5434
SEQ ID NO : 24 - Séquence polynucléotidique de 1'amorce CMVrev
SEQ ID NO : 25 - Séquence polynucléotidique de la sonde de qPCR CMVFAM-TAMRA
SEQ ID NO : 26 - Séquence polynucléotidique de l'élément régulateur posttranscriptionnel du virus de l'hépatite de la marmotte (WPRE)
SEQ ID NO : 27 - Séquence d'acides aminés pour la
protéine fibre du ChAd3
SEQ ID NO : 28 - Séquence d'acides aminés pour la
protéine fibre du PanAd3
SEQ ID NO : 29 - Séquence d'acides aminés pour la
protéine fibre du ChAdl7
SEQ ID NO : 30 - Séquence d'acides aminés pour la
protéine fibre du ChAdl9
SEQ ID NO : 31 - Séquence d'acides aminés pour la
protéine fibre du ChAd24
SEQ ID NO : 32 - Séquence d'acides aminés pour la
protéine fibre du ChAdll
SEQ ID NO : 33 - Séquence d'acides aminés pour la
protéine fibre du ChAd20
SEQ ID NO : 34 - Séquence d'acides aminés pour la
protéine fibre du ChAd31
SEQ ID NO : 35 - Séquence d'acides aminés pour la
protéine fibre du PanAdl
SEQ ID NO : 36 - Séquence d'acides aminés pour la
protéine fibre du PanAd2
SEQ ID NO : 37 - Séquence d'acides aminés du RSV
FATM
SEQ ID NO : 38 - Séquence polynucléotidique de Gag du VIH
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Description détaillée de l'invention
Adénovirus
Les adénovirus ont une morphologie caractéristique avec une capside icosaédrique comprenant trois protéines majeures, l'hexon (II), la base du penton (III) et une fibre globulaire (IV), accompagnées d'un certain nombre d'autres protéines mineures, VI, VIII, IX, Ilia et IVa2. Le génome du virus est un ADN double brin linéaire. L'ADN du virus est associé intimement à la protéine VII hautement basique et à un petit peptide pX (auparavant appelé mu). Une autre protéine, V, est encapsidée avec ce complexe ADNprotéines et fournit une liaison structurale à la capside par l'intermédiaire de la protéine VI. Le virus contient également une protéase codée par le virus, qui est nécessaire au traitement de certaines des protéines structurales pour produire le virus infectieux mature.
Le génome adénoviral est bien caractérisé. Il existe une conservation générale dans l'organisation globale du génome adénoviral en ce qui concerne des cadres de lecture ouverts spécifiques positionnés de façon similaire, par exemple, l'emplacement des gènes EIA, E1B, E2A, E2B, E3, E4, Ll, L2, L3, L4 et L5 de chaque virus. Chaque extrémité du génome adénoviral comprend une séquence connue comme une répétition terminale inversée (ITR), qui est nécessaire à la réplication virale. Le virus comprend également une protéase codée par le virus, qui est nécessaire au
BE2016/5434 traitement de certaines des protéines structurales requises pour produire des virions infectieux. La structure du génome adénoviral est décrite sur la base de l'ordre dans lequel les gènes viraux sont exprimés à la suite de la transduction de la cellule hôte. De façon plus spécifique, les gènes viraux sont appelés gènes précoces (E) ou tardifs (L) selon si la transcription survient avant ou après le début de la réplication de l'ADN. Dans la phase précoce de la transduction, les gènes EIA, EIB, E2A, E2B, E3 et E4 de 1'adénovirus sont exprimés pour préparer la cellule hôte à la réplication virale. Durant la phase tardive de l'infection, l'expression des gènes tardifs Ll à L5, qui codent pour les composants structuraux des particules virales, est activée.
Les adénovirus sont spécifiques de l'espèce et différents sérotypes, c'est-à-dire, des types de virus qui ne subissent pas une neutralisation croisée par des anticorps, ont été isolés à partir de diverses espèces de mammifères. Par exemple, plus de 50 sérotypes ont été isolés à partir d'êtres humains, lesquels sont divisés en six sous-groupes (A à F ; B est sous-divisé en B1 et B2) en se basant sur l'homologie de séquence et sur leur capacité d'agglutiner les hématies (Tatsis and Ertl Molecular Therapy (2004) 10: 616-629) . De nombreux adénovirus ont été isolés à partir de simiens non humains tels que les chimpanzés, les Bonobos, les macaques Rhésus et les gorilles, et ils sont classés dans les mêmes groupes humains en se basant sur les relations phylogénétiques basées sur les séquences de l'hexon ou de la fibre (Colloca et al. (2012)
BE2016/5434
Science Translational Medicine 4: 1-9 ; Roy et al. (2004) Virology 324: 361-372 ; Roy et al. (2010) Journal of Gene Medicine 13: 17-25) .
Protéines de la capside adénovirale y compris la protéine fibre et polynucléotides codant pour ces protéines
Comme il a été souligné ci-dessus, la capside adénovirale comprend trois protéines majeures, l'hexon, le penton et la fibre. L'hexon représente la majorité des composants structuraux de la capside, laquelle est constituée de 240 capsomères trimères d'hexon et de 12 bases du penton. L'hexon comporte trois tonneaux doubles conservés, alors que le haut comporte trois tours, chaque tour contenant une boucle provenant de chaque sous-unité qui forme la majeure partie de la capside. La base de l'hexon est hautement conservée entre les sérotypes adénoviraux, alors que les boucles de la surface sont variables (Tatsis and Ertl Molecular Therapy (2004) 10: 616-629).
Le penton est une autre protéine de la capside adénovirale qui forme une base pentamère à laquelle la fibre se fixe. La protéine fibre trimère dépasse de la base du penton au niveau de chacun des 12 sommets de la capside et il s'agit d'une structure de type bâtonnet globulaire. Une différence remarquable dans la surface des capsides des adénovirus comparativement à celle de la plupart des virus icosaédriques est la présence de la longue protéine fibre mince. Le rôle principal de la protéine fibre est la fixation de la capside virale à
BE2016/5434 la surface cellulaire par l'intermédiaire de son interaction avec un récepteur cellulaire.
Les protéines fibres de nombreux sérotypes d'adénovirus partagent une architecture commune : une queue N-terminale, une tige centrale constituée de séquences répétitives, et un domaine « knob » globulaire C-terminal (ou « tête ») . Le domaine de la tige centrale est constitué d'un nombre variable de répétitions bêta. Les répétitions bêta se joignent pour former une structure allongée de trois brins en spirale entrelacés qui est hautement rigide et stable. La tige relie la queue N-terminale à la structure du « knob » globulaire, qui est responsable de l'interaction avec le récepteur cellulaire cible. La nature globulaire du domaine « knob » des adénovirus présente de grandes surfaces pour la liaison du récepteur de façon latérale et apicale. L'effet de cette architecture est de projeter le site de liaison du récepteur loin de la capside virale, libérant ainsi le virus des contraintes stériques présentées par la surface relativement plate de la capside.
Bien que les fibres de nombreux sérotypes des adénovirus présentent la même architecture globale, elles ont des séquences d'acides aminés variables qui influencent leur fonction ainsi que leur structure. Par exemple, un certain nombre de régions exposées sur la surface du « knob » de la fibre présentent un site de liaison du récepteur facilement adaptable. La forme globulaire du « knob » de la fibre permet au récepteur de se lier aux côtés du « knob » ou sur le haut du « knob » de la fibre. Ces sites de liaison reposent
BE2016/5434 généralement sur des boucles exposées à la surface reliant les brins bêta qui sont faiblement conservés parmi les adénovirus humains. Les chaînes latérales exposées sur ces boucles donnent au « knob » diverses caractéristiques de surface tout en préservant la structure tertiaire et quaternaire. Par exemple, les distributions des potentiels et des charges électrostatiques au niveau des surfaces des « knobs » peuvent varier grâce à la large plage des points isoélectriques dans les séquences des « knobs » des fibres, d'un pl approximativement de 9 pour Ad 8, Ad 19, et Ad 37 jusqu'à approximativement 5 pour les adénovirus du sous-groupe B. En tant que ligand de virus structuralement complexe, la protéine fibre permet la présentation de diverses surfaces de liaison (« knob ») dans un certain nombre d'orientations et de distances (tige) à partir de la capside virale.
L'une des variations les plus évidentes entre certains sérotypes est la longueur de la fibre. Des études ont montré que la longueur de la tige de la fibre influence fortement l'interaction du « knob » et du virus avec ses récepteurs cibles. En outre, les protéines fibres entre les sérotypes peuvent également varier dans leur capacité de se courber. Bien que les répétitions bêta dans la tige forment une structure hautement stable et régulière, des études par microscopie électronique (EM) ont montré des charnières distinctes dans la fibre. L'analyse de la séquence de la protéine provenant de plusieurs sérotypes d'adénovirus identifie une perturbation dans les séquences répétitives de la tige au niveau de la
BE2016/5434 cellulaires
Ad et la troisième répétition bêta à partir de la queue Nterminale, qui corréle fortement avec l'une des charnières dans la tige, comme il est observé par EM. Les charnières dans la fibre permettent au « knob » d'adopter diverses orientations par rapport à la capside virale, lesquelles peuvent circonvenir les encombrements stériques pour la mobilisation du récepteur nécessitant la présentation correcte du site de liaison du récepteur sur le « knob ». Par exemple, les fibres rigides des Ad du sous-groupe D requièrent ainsi un récepteur flexible ou un récepteur prépositionné pour la fixation du virus, car elles sont incapables de se courber. (Nicklin ei al. Molecular Therapy 2005 12: 384-393)
L'identification des récepteurs spécifiques des différents sérotypes connaissance de comment ils contribuent au tropisme tissulaire ont été obtenues grâce à l'utilisation de la technologie du pseudotypage de la fibre. Bien que les Ad de certains sous-groupes utilisent CAR en tant que récepteur primaire, il devient clair que de nombreux Ad utilisent des variantes de récepteurs primaires, menant à un tropisme largement différent in vitro et in vivo. Les fibres de ces sérotypes montrent des différences nettes dans leurs structures primaires et tertiaires, comme la rigidité de la tige de la fibre, la longueur de la tige de la fibre, et le manque d'un site de liaison de CAR et/ou du motif de liaison de HSPG putatif, conjointement avec les différences de charge nette au sein du « knob » de la fibre. Le pseudotypage des particules d'Ad 5 avec une tige et un « knob » en
BE2016/5434 alternance fournit ainsi une opportunité pour éliminer des domaines de liaison cellulaire importants et, en outre, peut permettre une administration de transgène plus efficace (et potentiellement plus sélective pour les cellules) à des types cellulaires définis comparativement à celle obtenue avec 1'Ad 5. La neutralisation des particules Ad à fibre pseudotypée peut être également réduite si les fibres utilisées proviennent d'Ad de séroprévalence inférieure chez les êtres humains ou dans des modèles expérimentaux, une situation qui favorise une administration réussie du vecteur (Nicklin et al. Molecular Therapy (2005) 12:
384-393). En outre, la fibre pleine longueur ainsi que des régions isolées du « knob » de la fibre, mais pas l'hexon ou le penton seul, sont capables d'induire la maturation des cellules dendritiques et sont associées à l'induction d'une réponse puissante des lymphocytes T CD8+ (Molinier-Frenkel et al. J. Biol. Chem. (2003) 278: 37175-37182). Prises ensemble, les fibres adénovirales jouent un rôle important dans au moins la liaison du récepteur et l'immunogénicité des vecteurs adénoviraux.
L'illustration des différences entre les protéines
fibres des adénovirus simiens du groupe C est
1'alignement fourni sur la figure 1. Une
caractéristique surprenante est que les séquences des
fibres de ces adénovirus peuvent être groupées de façon
large en ce qu'elles ont une fibre longue, comme le ChAdl55, ou une fibre courte, comme le ChAd3. Cette longueur différentielle est due à une délétion de 36 acides aminés approximativement au niveau de la position 321 dans la fibre courte par rapport à la
BE2016/5434 fibre longue. En outre, il y a un certain nombre de substitutions d'acides aminés qui diffèrent entre le sous-groupe à fibre courte contre celui à fibre longue mais qui sont cependant homogènes au sein de chaque sous-groupe. Alors que les fonctions exactes de ces différences n'ont pas encore été élucidées, étant donné la fonction et l'immunogénicité de la fibre, elles sont probablement significatives. Il a été montré que l'un des déterminants du tropisme viral est la longueur de la tige de la fibre. Il a été montré qu'un vecteur Ad5 avec une tige plus courte présente une efficacité inférieure de liaison au récepteur CAR et une infectivité inférieure (Ambriovic-Ristov A. et al.: Virology. (2003) 312(2): 425-33). Il a été supposé que cette altération est le résultat d'une augmentation de la rigidité de la fibre plus courte menant à une fixation moins efficace au récepteur cellulaire (Wu, E et al.: J Virol. (2003) 77(13): 7225-7235). Ces études peuvent expliquer les propriétés améliorées du ChAdl55 portant une fibre plus longue et plus flexible comparativement aux ChAd3 et PanAd3 décrits auparavant portant une fibre avec une tige plus courte.
Dans un aspect de l'invention, il est fourni des polypeptides isolés de la fibre, du penton et de l'hexon de la capside de 1'adénovirus de chimpanzé ChAdl55 et des polynucléotides isolés codant pour les polypeptides de la fibre, du penton et de l'hexon de la capside de 1'adénovirus de chimpanzé ChAdl55.
On s'attend à ce que les trois protéines de la capside contribuent à la faible séroprévalence et qu'elles puissent, ainsi, être utilisées indépendamment
BE2016/5434 les unes des autres ou en combinaison pour supprimer l'affinité d'un adénovirus à des anticorps neutralisants préexistants, par exemple, pour fabriquer un adénovirus recombinant avec une séroprévalence réduite. Un tel adénovirus recombinant peut être un adénovirus chimérique avec des protéines de la capside provenant de sérotypes différents avec au moins une protéine fibre provenant du ChAdl55.
La séquence polypeptidique de la fibre du ChAdl55
est fournie dans SEQ ID NO : 1.
La séquence polypeptidique du penton du ChAdl55
est fournie dans SEQ ID NO : 3.
La séquence polypeptidique de 1'hexon du ChAdl55
est fournie dans SEQ ID NO : 5.
Polypeptides , adénovirus recombinants,
compositions ou cellules comprenant des séquences polypeptidiques de la fibre du ChAdl55 ou de l'un de ses dérivés fonctionnels
De façon appropriée, le polypeptide isolé, 1'adénovirus recombinant, la composition ou la cellule de 1 ' invention comprend un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1.
De façon appropriée, le polypeptide, 1'adénovirus recombinant, la composition ou la cellule de 1'invention comprend un polypeptide qui est un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1. De façon appropriée, le dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides
BE2016/5434 aminés selon SEQ ID NO : 1 a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 %, comme au moins identique à 85,0 %, comme au moins identique à 90 %, comme au moins identique à 91,0 %, comme au moins
identique à 93,0 %, comme au moins identique à 95,0 %,
comme au moins identique à 97,0 %, comme au moins
identique à 98,0 %, comme au moins identique à 99,0 %,
comme au moins identique à 99,2 %, comme au moins
identique à 99,4 %, comme au moins identique à 99,5 %,
comme au moins identique à 99,6 %, comme au moins
identique à 99, 8 %, comme au moins identique à 99,9 %
sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés
de SEQ ID NO : 1. En variante, , le dérivé fonctionnel ne
comporte pas plus de 130, de façon davantage appropriée pas plus de 120, de façon davantage appropriée pas plus de 110, de façon davantage appropriée pas plus de 100, de façon davantage appropriée pas plus de 90, de façon
davantage appropriée pas plus de 80, de façon davantage
appropriée pas plus de 70, de façon davantage
appropriée pas plus de 60, de façon davantage
appropriée pas plus de 50, de façon davantage
appropriée pas plus de 40, de façon davantage
appropriées pas plus de 30, de façon davantage
appropriée pas plus de 20, de façon davantage
appropriée pas plus de 10, de façon davantage
appropriée pas plus de 5 , de façon davantage appropriée
pas plus de 4, de façon davantage appropriée pas plus de 3, de façon davantage appropriée pas plus de 2, de façon davantage appropriée pas plus de 1 addition (s), délétion(s) ou substitution (s) comparativement à SEQ ID NO : 1.
BE2016/5434
De façon appropriée, le polypeptide, 1'adénovirus recombinant, la composition ou la cellule selon 1'invention comprend en outre :
(a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3 ; ou (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 50,0 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 3, et/ou (a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5 ; ou (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 50 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 5.
De façon appropriée, le dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3 a une séquence d'acides aminés qui est au
moins identique à 60,0 %, comme au moins identique à
70,0 % , comme au moins identique à 80,0 %, comme au
moins identique à 85, 0 %, comme au moins identique à
90,0 % , comme au moins identique à 91,0 %, comme au
moins identique à 93, 0 %, comme au moins identique à
95, 0 % , comme au moins identique à 97,0 %, comme au
moins identique à 98,0 %, comme au moins identique à
99, 0 % , comme au moins identique à 99, 2 %, comme au
moins identique à 99, 4 %, comme au moins identique à
99,5 % , comme au moins identique à 9 9,6 %, comme au
BE2016/5434 moins identique à 99,7 %, comme au moins identique à 99,8 %, comme au moins identique à 99,9 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 3. En variante, le dérivé fonctionnel ne comporte pas plus de 300, de façon davantage appropriée pas plus de 250, de façon davantage appropriée pas plus de 200, de façon davantage appropriée pas plus de 150, de façon davantage appropriée pas plus de 125, de façon
davantage appropriée pas plus de 100, de façon
davantage , appropriée pas plus de 90, de façon davantage
appropriée pas plus de 80, de façon davantage
appropriée pas plus de 70, de façon davantage
appropriée pas plus de 60, de façon davantage
appropriée pas plus de 50, de façon davantage
appropriée pas plus de 40, de façon davantage
appropriée pas plus de 30, de façon davantage
appropriée pas plus de 20, de façon davantage
appropriée pas plus de 10, de façon davantage
appropriée pas plus de 5, de façon davantage appropriée
pas plus de 4, de façon davantage appropriée pas plus de 3, de façon davantage appropriée pas plus de 2, de façon davantage appropriée pas plus de 1 addition (s), délétion(s) ou substitution (s) comparativement à SEQ ID NO : 3.
De façon appropriée, le dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5 a une séquence d'acides aminés qui est au
moins identique à 60,0 %, comme au moins identique à
70,0 % , comme au moins identique à 80,0 %, comme au
moins identique à 85, 0 %, comme au moins identique à
90,0 % , comme au moins identique à 91,0 %, comme au
BE2016/5434
moins identique à 93,0 %, comme au moins identique à
95, 0 % , comme au moins identique à 97,0 %, comme au
moins identique à 98,0 %, comme au moins identique à
99, 0 % , comme au moins identique à 99,2 %, comme au
moins identique à 99,4 %, comme au moins identique à
99,5 % , comme au moins identique à 99, 6 %, comme au
moins identique à 99,7 %, comme au moins identique à
99, 8 % , comme au moins identique à 99, 9 % sur sa
longueur entière à la séquence d'acides ; aminés de
SEQ ID NO : 5. En variante, le dérivé fonctionnel ne
comporte pas plus de 500, de façon davantage appropriée pas plus de 400, de façon davantage appropriée pas plus de 450, de façon davantage appropriée pas plus de 300, de façon davantage appropriée pas plus de 250, de façon
davantage appropriée pas plus de 200, de façon
davantage appropriée pas plus de 150, de façon
davantage appropriée pas plus de 125, de façon
davantage appropriée pas plus de 100, de façon
davantage , appropriée pas plus de 90, de façon davantage
appropriée pas plus de 80, de façon davantage
appropriée pas plus de 70, de façon davantage
appropriée pas plus de 60, de façon davantage
appropriée pas plus de 50, de façon davantage
appropriée pas plus de 40, de façon davantage
appropriée pas plus de 30, de façon davantage
appropriée pas plus de 20, de façon davantage
appropriée pas plus de 10, de façon davantage
appropriée pas plus de 5, de façon davantage appropriée
pas plus de 4, de façon davantage appropriée pas plus de 3, de façon davantage appropriée pas plus de 2, de façon davantage appropriée pas plus de 1 addition (s),
BE2016/5434 délétion (s) ou substitution (s) comparativement à SEQ ID NO : 5.
Polypeptides, adénovirus recombinants, compositions ou cellules comprenant des séquences polypeptidiques du penton du ChAdl55
De façon appropriée, le polypeptide, l'adénovirus recombinant, la composition ou la cellule de 1'invention comprend un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3.
De façon appropriée, le polypeptide, l'adénovirus
recombinant, la composition ou la cellule de
1'invention comprend en outre :
(a) un polypeptide ayant la séquence d'acides
aminés selon SEQ ID NO : 1 ; ou
(b) un dérivé fonctionnel d ' un polypeptide ayant
la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1 et/ou (a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5 ; ou (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 60 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 5.
De façon appropriée, le dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1 a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 60,0 %, comme au moins identique à
BE2016/5434
70,0 % , comme au moins identique à 80,0 %, comme au
moins identique à 85, 0 %, comme au moins identique à
87,0 % , comme au moins identique à 89, 0 %, comme au
moins identique à 91,0 %, comme au moins identique à
93, 0 % , comme au moins identique à 95, 0 %, comme au
moins identique à 97,0 %, comme au moins identique à
98,0 % , comme au moins identique à 99, 0 %, comme au
moins identique à 99, 2 %, comme au moins identique à
99,4 % , comme au moins identique à 99, 5 %, comme au
moins identique à 9 9,6 %, comme au moins identique à
99, 8 % , comme au moins identique à 99, 9 % sur sa
longueur entière à la séquence d' acides aminés de
SEQ ID NO : 1 . En variante, le dérivé fonctionnel ne
comporte pas plus de 130, de façon davantage appropriée pas plus de 120, de façon davantage appropriée pas plus de 110, de façon davantage appropriée pas plus de 100, de façon davantage appropriée pas plus de 90, de façon
davantage , appropriée pas plus de 80, de façon davantage
appropriée pas plus de 70, de façon davantage
appropriée pas plus de 60, de façon davantage
appropriée pas plus de 50, de façon davantage
appropriée pas plus de 40, de façon davantage
appropriée pas plus de 30, de façon davantage
appropriée pas plus de 20, de façon davantage
appropriée pas plus de 10, de façon davantage
appropriée pas plus de 5 , de façon davantage appropriée
pas plus de 4, de façon davantage appropriée pas plus de 3, de façon davantage appropriée pas plus de 2, de façon davantage appropriée pas plus de 1 addition (s), délétion(s) ou substitution (s) comparativement à SEQ ID NO : 1.
BE2016/5434
De façon appropriée, le dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5 a une séquence d'acides aminés qui est au
moins identique à 60,0 %, comme au moins identique à
70,0 % , comme au moins identique à 80,0 %, comme au
moins identique à 85, 0 %, comme au moins identique à
90,0 % , comme au moins identique à 95, 0 %, comme au
moins identique à 97,0 %, comme au moins identique à
98,0 % , comme au moins identique à 99, 0 %, comme au
moins identique à 99, 2 %, comme au moins identique à
99,4 % , comme au moins identique à 99, 5 %, comme au
moins identique à 9 9,6 %, comme au moins identique à
99, 8 % , comme au moins identique à 99, 9 % sur sa
longueur entière à la séquence d'acides ; aminés de
SEQ ID NO : 5. En variante, le dérivé fonctionnel ne
comporte pas plus de 500, de façon davantage appropriée pas plus de 400, de façon davantage appropriée pas plus de 450, de façon davantage appropriée pas plus de 300, de façon davantage appropriée pas plus de 250, de façon
davantage appropriée pas plus de 200, de façon
davantage appropriée pas plus de 150, de façon
davantage appropriée pas plus de 125, de façon
davantage appropriée pas plus de 100, de façon
davantage < appropriée pas plus de 90, de façon davantage
appropriée pas plus de 80, de façon davantage
appropriée pas plus de 70, de façon davantage
appropriée pas plus de 60, de façon davantage
appropriée pas plus de 50, de façon davantage
appropriée pas plus de 40, de façon davantage
appropriée pas plus de 30, de façon davantage
appropriée pas plus de 20, de façon davantage
BE2016/5434 appropriée pas plus de 10, de façon davantage appropriée pas plus de 5, de façon davantage appropriée pas plus de 4, de façon davantage appropriée pas plus de 3, de façon davantage appropriée pas plus de 2, de façon davantage appropriée pas plus de 1 addition (s), délétion(s) ou substitution (s) comparativement à SEQ ID NO : 5.
Polynucléotides isolés, vecteurs, adénovirus recombinants, compositions ou cellules comprenant des polynucléotides codant pour la fibre du ChAdl55 ou l'un de ses dérivés fonctionnels
De façon appropriée, le polynucléotide isolé, le vecteur, I'adénovirus recombinant, la composition ou la cellule de l'invention comprend un polynucléotide qui code pour un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1. De façon appropriée le polynucléotide a une séquence selon SEQ ID NO : 2.
En variante, le polynucléotide, le vecteur, I'adénovirus recombinant, la composition ou la cellule de l'invention comprend un polynucléotide qui code pour un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1. De façon appropriée, le dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1 a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 %, comme au moins identique à 85,0 %, comme au moins identique à 90 %, comme au moins identique à 91,0 %, comme au moins identique à 93,0 %, comme au
BE2016/5434 moins identique à 95,0 %, comme au moins identique à 97,0 %, comme au moins identique à 98,0 %, comme au moins identique à 99,0 %, comme au moins identique à
99,2 %, comme au moins identique à 99,4 %, comme au
moins ident ;ique à 9 9,6 %, comme au moins identique à
99,8 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides
aminés de SEQ ID NO : : 1. En variante, le dérivé
fonctionnel ne comporte pas plus de 130, de façon
davantage appropriée pas plus de 120, de façon
davantage appropriée pas plus de 110, de façon
davantage appropriée pas plus de 100, de façon
davantage appropriée pas plus de 90, < de façon davantage
appropriée pas plus de 80, de façon davantage
appropriée pas plus de 70, de façon davantage
appropriée pas plus de 60, de façon davantage
appropriée pas plus de 50, de façon davantage
appropriée pas plus de 40, de façon davantage
appropriée pas plus de 30, de façon davantage
appropriée pas plus de 20, de façon davantage
appropriée pas plus de 10, de façon davantage
appropriée pas plus de 5, de façon davantage appropriée
pas plus de 4, de façon davantage appropriée pas plus de 3, de façon davantage appropriée pas plus de 2, de façon davantage appropriée pas plus de 1 addition (s), délétion(s) ou substitution (s) comparativement à SEQ ID NO : 1.
De façon appropriée, le poiynucléotide, le vecteur, 1'adénovirus recombinant, la composition ou la cellule de l'invention comprend en outre un poiynucléotide codant pour :
BE2016/5434 (a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3 ; ou (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 50,0 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 3, et/ou (a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5 ; ou (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 50 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 5.
De façon appropriée, le dérivé fonctionnel du polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3 a une séquence d'acides aminés qui est au
moins identique à 60,0 %, comme au moins identique à
70,0 % , comme au moins identique à 80,0 %, comme au
moins identique à 85, 0 %, comme au moins identique à
90,0 % , comme au moins identique à 91,0 %, comme au
moins identique à 93, 0 %, comme au moins identique à
95, 0 % , comme au moins identique à 97,0 %, comme au
moins identique à 98,0 %, comme au moins identique à
99, 0 % , comme au moins identique à 99, 2 %, comme au
moins identique à 99, 4 %, comme au moins identique à
99,6 % , comme au moins identique à 99, 8 % sur sa
longueur entière à la séquence d1 'acides aminés de
SEQ ID NO : 3. En variante, le dérivé fonctionnel ne
comporte pas plus de 300, de façon davantage appropriée
BE2016/5434 pas plus de 250, de façon davantage appropriée pas plus de 200, de façon davantage appropriée pas plus de 150, de façon davantage appropriée pas plus de 125, de façon
davantage appropriée pas plus de 100, de façon
davantage , appropriée pas plus de 90, de façon davantage
appropriée pas plus de 80, de façon davantage
appropriée pas plus de 70, de façon davantage
appropriée pas plus de 60, de façon davantage
appropriée pas plus de 50, de façon davantage
appropriée pas plus de 40, de façon davantage
appropriée pas plus de 30, de façon davantage
appropriée pas plus de 20, de façon davantage
appropriée pas plus de 10, de façon davantage
appropriée pas plus de 5, de façon davantage appropriée
pas plus de 4, de façon davantage appropriée pas plus de 3, de façon davantage appropriée pas plus de 2, de façon davantage appropriée pas plus de 1 addition (s), délétion(s) ou substitution (s) comparativement à SEQ ID NO : 3.
De façon appropriée, le dérivé fonctionnel du polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5 a une séquence d'acides aminés qui est au
moins identique à 60,0 %, comme au moins identique à
70,0 % , comme au moins identique à 80,0 %, comme au
moins identique à 85, 0 %, comme au moins identique à
90,0 % , comme au moins identique à 95, 0 %, comme au
moins identique à 97,0 %, comme au moins identique à
98,0 % , comme au moins identique à 99, 0 %, comme au
moins identique à 99, 2 %, comme au moins identique à
99,4 % , comme au moins identique à 99, 5 %, comme au
moins identique à 9 9,6 %, comme au moins identique à
BE2016/5434
99,7 %, comme au moins identique à 99,8 %, comme au moins identique à 99, 9 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 5. En variante, le dérivé fonctionnel ne comporte pas plus de 500, de façon davantage appropriée pas plus de 400, de façon
davantage appropriée pas plus de 450, de façon
davantage appropriée pas plus de 300, de façon
davantage appropriée pas plus de 250, de façon
davantage appropriée pas plus de 200, de façon
davantage appropriée pas plus de 150, de façon
davantage appropriée pas plus de 125, de façon
davantage appropriée pas plus de 100, de façon
davantage appropriée pas plus de 90, de façon davantage
appropriée pas plus de 80, de façon davantage
appropriée pas plus de 70, de façon davantage
appropriée pas plus de 60, de façon davantage
appropriée pas plus de 50, de façon davantage
appropriée pas plus de 40, de façon davantage
appropriée pas plus de 30, de façon davantage
appropriée pas plus de 20, de façon davantage
appropriée pas plus de 10, de façon davantage
appropriée pas plus de 5, de façon davantage appropriée
pas plus de 4, de façon davantage appropriée pas plus de 3, de façon davantage appropriée pas plus de 2, de façon davantage appropriée pas plus de 1 addition (s), délétion(s) ou substitution (s) comparativement à SEQ ID NO : 5.
Polynucléotides isolés, vecteurs, adénovirus recombinants, compositions ou cellules comprenant des polynucléotides codant pour le penton du ChAdl55
BE2016/5434
De façon appropriée, le polynucléotide isolé, le vecteur, 1'adénovirus recombinant, la composition ou la cellule de l'invention comprend un polynucléotide qui code pour un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3. De façon appropriée, le polynucléotide a une séquence selon SEQ ID NO : 4.
De façon appropriée, le polynucléotide, le vecteur, 1'adénovirus recombinant, la composition ou la cellule de l'invention comprend en outre un polynucléotide codant pour :
(a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1 ; ou (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 50 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1 et/ou (a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5 ; ou (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 50 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 5.
De façon appropriée, le dérivé fonctionnel du polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1 a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 60,0 %, comme au moins identique à 70,0 %, comme au moins identique à 80,0 %, comme au moins identique à 85,0 %, comme au moins identique à
BE2016/5434
87,0 % , comme au moins identique à 89, 0 %, comme au
moins identique à 91,0 %, comme , au moins identique à
93, 0 % , comme au moins identique à 95, 0 %, comme au
moins identique à 97,0 %, comme , au moins identique à
98,0 % , comme au moins identique à 99, 0 %, comme au
moins identique à 99, 2 %, comme , au moins identique à
99,4 % , comme au moins identique à 99, 5 %, comme au
moins identique à 9 9,6 %, comme , au moins identique à
99,7 % , comme au moins identique à 99, 8 %, comme au
moins identique à 99, 9 % sur sa longueur entière à la
séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1. En variante,
le dérivé fonctionnel ne comporte pas plus de 130, de façon davantage appropriée pas plus de 120, de façon
davantage appropriée pas plus de 110, de façon
davantage appropriée pas plus de 100, de façon
davantage , appropriée pas plus de 90, î de façon davantage
appropriée pas plus de 80, de façon davantage
appropriée pas plus de 70, de façon davantage
appropriée pas plus de 60, de façon davantage
appropriée pas plus de 50, de façon davantage
appropriée pas plus de 40, de façon davantage
appropriée pas plus de 30, de façon davantage
appropriée pas plus de 20, de façon davantage
appropriée pas plus de 10, de façon davantage
appropriée pas plus de 5, de façon davantage appropriée
pas plus de 4, de façon davantage appropriée pas plus de 3, de façon davantage appropriée pas plus de 2, de façon davantage appropriée pas plus de 1 addition (s), délétion (s) ou substitution (s)
SEQ ID NO : 1 .
comparativement à
BE2016/5434
De façon appropriée, le dérivé fonctionnel du polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5 a une séquence d'acides aminés qui est au
moins identique à 60,0 %, comme au moins identique à
70,0 % , comme au moins identique à 80,0 %, comme au
moins identique à 85, 0 %, comme au moins identique à
90,0 % , comme au moins identique à 95, 0 %, comme au
moins identique à 97,0 %, comme au moins identique à
98,0 % , comme au moins identique à 99, 0 %, comme au
moins identique à 99, 2 %, comme au moins identique à
99,4 % , comme au moins identique à 99, 5 %, comme au
moins identique à 9 9,6 %, comme au moins identique à
99,7 % , comme au moins identique à 99, 8 %, comme au
moins identique à 99, 9 % sur sa longueur entière à la
séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 5. En variante,
le dérivé fonctionnel ne comporte pas plus de 500, de
façon davantage appropriée pas plus de 400, de façon
davantage appropriée pas plus de 450, de façon
davantage appropriée pas plus de 300, de façon
davantage appropriée pas plus de 250, de façon
davantage appropriée pas plus de 200, de façon
davantage appropriée pas plus de 150, de façon
davantage appropriée pas plus de 125, de façon
davantage appropriée pas plus de 100, de façon
davantage . appropriée pas plus de 90, de façon davantage
appropriée pas plus de 80, de façon davantage
appropriée pas plus de 70, de façon davantage
appropriée pas plus de 60, de façon davantage
appropriée pas plus de 50, de façon davantage
appropriée pas plus de 40, de façon davantage
appropriée pas plus de 30, de façon davantage
BE2016/5434 appropriée pas plus de 20, de façon davantage appropriée pas plus de 10, de façon davantage appropriée pas plus de 5, de façon davantage appropriée pas plus de 4, de façon davantage appropriée pas plus de 3, de façon davantage appropriée pas plus de 2, de façon davantage appropriée pas plus de 1 addition (s), délétion(s) ou substitution (s) comparativement à SEQ ID NO : 5.
Squelettes du ChAdl55
L'invention fournit des séquences polynucléotidiques isolées de l’adénovirus de chimpanzé ChAdl55, y compris celles du ChAdl55 de type sauvage non modifié (SEQ ID NO : 10) et des constructions de squelettes modifiés du ChAdl55. Ces constructions de squelettes modifiés comprennent le ChAdl55 No. 1434 (SEQ ID NO : 7), le ChAdl55 No. 1390 (SEQ ID NO : 8) et le ChAdl55 No. 1375 (SEQ ID NO : 9). Les squelettes du ChAdl55 peuvent être utilisés dans la construction d'adénovirus recombinants compétents pour la réplication ou incompétents pour la réplication, par exemple pour l'administration de transgènes.
L'annotation de la séquence de type sauvage du ChAdl55 (SEQ ID NO : 10) est fournie ci-dessous.
B E2016/5434
LOCOS ChAdl55 - ADN linéaire de 37830 pb - 10 juin
2015
DEFINITION Adénovirus de chimpanzé 155, génome complet
COMMENTAIRE Annotation selon l'alignement du ChAdl55 cont
la souche de référence de 1'adénovirus 2 huma
5 NC 001405
Deux ORF putatifs dans la région E3 ajoutés
manuellement
CARACTERISTIQUES Emplacement/Qualificateurs
source 1..37830
/organisme = « Adénovirus de chimpanzé 155 »
10 région de /type de molécule = « ADN génomique » /acronyme = « ChAdl55 » 1..101
répétitions /nom standard = « ITR »
/type de répétition = inversée
15 gène 466..1622
/gène = « E1A »
.séquence 466 . .471
TATA /gène = « E1A »
transcrit 497..1622
20 ' primaire /gène = « E1A »
séquence jonction (577..1117,1231..1532)
codante /gène = « E1A » /produit = « EIA 280R »
25 séquence jonction (577..979,1231..1532)
codante /gène = « E1A » /produit = « EIA 243R »
signal polyA 1600..1605
/gène = « E1A »
30 gène 1662 . .4131
/gène = « E1B »
B E2016/5434 séquence
TATA transcrit primaire séquence codante séquence codante gène séquence
TATA transcrit primaire séquence codante signal poiyA gène transcrit primaire gène transcrit primaire
1662.. 1667 /gène = « E1B »
1692.. 4131 /gène = « E1B »
1704 . .2267 /gène = « E1B » /produit = « E1B_19K »
2009.. 3532 /gène = « E1B » /produit = « E1B_55K »
3571.. 4131 /gène = « IX »
3571. .3576 /gène = « IX »
3601.. 4131 /gène = « IX »
3628.. 4092
/gène = « IX »
/produit = « IX 4097 . .4102 »
/note = « E1B, IX »
complémentaire /gène = « E2B » (4117 . .27523)
complémentaire (4117. .27494)
/gène = « E2B »
complémentaire (4117. .5896)
/gène = « IVa2 »
complémentaire (4117 . .5896)
B E2016/5434
/gène = « IVa2 »
séquence complémentaire (jonction (4151
codante 5766..5778))
/gène = « IVa2 »
/produit = « E2B IVa2 »
signal polyA complémentaire (4150. .4155)
/note = « IVa2, E2B »
séquence complémentaire (jonction (5257
codante 14209. . 14217) )
/gène = « E2B »
/produit = « E2B polymérase »
gène 6078..34605
/gène = « L5 »
gène 6078..28612
/gène = « L4 »
gène 6078..22658
/gène = « L3 »
gène 6078..18164
/gène = « L2 »
gène 6078..14216
/gène = « Ll »
séquence 6078..6083
TATA /note = « L »
transcrit 6109..34605
primaire /gène = « L5 »
transcrit 6109..28612
primaire /gène = « L4 »
transcrit 6109..22658
primaire
/gène = « L3 »
transcrit 6109..18164
primaire
/gène = « L2 »
B E2016/5434 transcrit primaire séquence codante séquence codante gène
ARN différent gène
ARN différent séquence codante séquence codante signal polyA séquence codante
6109..14216 /gène = « LI » jonction (8038..8457,9722..9742) /gène = « LI » /produit = « L1_L3.6K » complémentaire (jonction (8637..10640, 14209. . 14217) /gène = « E2B » /produit = « E2B__pTP »
10671..10832 /gène = « VAI »
10671.. 10832 )
/gène = « VAI » ;
/produit = « VAI » !
10902.. 11072 ) /gène = « VAII » '
10902.. 11072 f /gène = « VAII » /produit = « VAII » i
11093.. 12352 t î
/gène = « LI » ) /produit = « L1_52K » (
12376.. 14157 j
I /gène = « LI » ) /produit = « Ll__pIIIa » 5
14197.. 14202 { /gène = « LI » (
14254.. 16035 5 /gène = « L2 /produit = « » 5 ί
L2_penton »
B E2016/5434 séquence codante séquence codante séquence codante signal polyA séquence codante séquence codante séquence codante signal polyA gène transcrit primaire gène transcrit primaire
16050..16646 /gène = « L2 » /produit ='« L2j>VII » 16719. . 17834
/gène = « L2 /produit = « 17859..18104 »
L2 __v »
/gène = « L2 »
/produit = « L2_ pX »
18143. .18148
/gène = « L2 »
18196..18951
/gène = « L3 »
/produit = « L3_ jo VI »
19063. .21945
/gène = « L3 »
/produit = « L3_ hexon »
21975 . . 22604
/gène = « L3 »
/produit = « LA protéase »
22630. .22635
/gène = « L3 »
complémentaire ( 22632..27523)
/gène = « E2A »
complémentaire ( 22632..27494)
/gène = « E2A »
complémentaire (22632..26357) /gène = « E2A-L » complémentaire (22632..26328)
B E2016/5434
/gène = « E2A-L »
signal polyA complémentaire (22649..22614)
/note = « E2A, E2A-L »
séquence complémentaire (22715..24367)
codante
5 séquence /gène = « E2A » /note = « DBF, commune au genre ; famille des DBF » /codon de départ = 1 /produit = « E2A » 24405..26915
10 codante /gène = « L4 »
/produit = « L4 100k »
séquence complémentaire (26352..26357)
' TATA /gène = « E2A-L »
15 séquence jonction- (26602..26941,27147..27529)
codante /gène = « L4 » /produit = « L4 33K »
séquence 26602 . . 27207
codante
20 /gène = « L4 »
/produit = « L4 22K »
séquence complémentaire (27518..27523)
TATA /note = « E2A, E2B ; nominal »
séquence 27604 . .28287
25 codante /gène = « L4 » /produit = « L4 pVIII »
gène 27969..32686
/gène = « E3B »
gène 27969..31611
30 /gène = « E3A »
B E2016/5434 séquence
TATA transcrit primaire transcrit primaire séquence codante signal poïyA séquence codante séquence codante séquence codante séquence codante séquence codante signal poïyA
27969.. 27974 /note = « E3A, E3B »
27998.. 32686 /gène = « E3B »
27998. . 31611 /gène = « E3A »
28288. .28605 /gène = « E3A » /produit = « E3 ORFi »
28594.. 28599 /gène = « L4 »
29103. .29303 /gène = « E3A » /produit = « E3 ORF2 »
29300.. 29797 /gène = « E3A » /produit = « E3 ORF3 »
29826.. 30731 /gène = « E3A » /produit = « E3 ORF4 »
30728.. 31579 /gène = « E3A » /produit = « E3 .ORF5 »
31283.. 31579 /gène = « E3A » /produit = « E3 ORF6 »
31578.. 31584 /gène = « E3A »
B E2016/5434 séquence codante séquence codante séquence codante signal polyA gène séquence codante
31591. .31863 /gène - « E3B » /produit = « E3 ORF7 »
31866..32264 /gène = « E3B » /produit = « E3 ORF8 » 32257. . 32643 /gène = « E3B » /produit = « E3 ORF9 »
32659..32664 /gène = « E3B » complémentaire (<32678..32838) /gène = « U » complémentaire (<32678..32838) /gène = « U »
/note = « exon codant pour l'extrémité C-
terminale non identifiée ; commun au genre
/produit = « protéine U »
séquence 32849. .34585
codante /gène = « L5 » /produit = « L5 fibre »
signal polyA 34581. .34586
gène /gène = « L5 » complémentaire (34611..37520)
/gène = « E4 »
transcrit complémentaire (34611..37490)
primaire signal polyA /gène = « E4 » complémentaire (34625..34630)
/gène = « E4 »
séquence complémentaire (jonction (34794..35069,
codante 35781..35954)
B E2016/5434 /gène = « E4 »
/produit = « E4 ORF7 »
séquence complémentaire (35070..35954)
codante /gène = « E4 » /produit = « E4 ORF6 »
séquence complémentaire (35875..36219)
codante /gène = « E4 » /produit = « E4 ORF 4 »
séquence complémentaire (36235..36582)
codante /gène = « E4 » /produit = « E4 ORF 3 »
séquence complémentaire (36579..36971)
codante /gène = « E4 » /produit = « E4 ORF2 »
séquence complémentaire (37029..37415)
codante /gène = « E4 » /produit = « E4 ORF1 »
séquence complémentaire (37515 . .37520)
TATA /gène = « E4 »
région de 37740 . .37830
répétitions /nom standard = « ITR »
/type de répétition = inversée
Dans un mode de réalisation, des fragments des séquences de SEQ ID NO : 7, 8, 9, 10 et de leurs brins complémentaires, l'ADNc et 1'ARN complémentaire de ceux-ci sont fournis. De façon appropriée, les fragments sont d'au moins 15 nucléotides en longueur, de façon davantage appropriée 30 nucléotides en
BE2016/5434
longueur, de façon davantage appropriée
60 nucléotides en longueur, de façon davantage
appropriée 120 nucléotides en longueur, de façon
davantage appropriée 240 nucléotides en longueur, de façon davantage appropriée 480 nucléotides en longueur et englobent des fragments fonctionnels, c'est-à-dire, des fragments qui sont d'un intérêt biologique. Par exemple, un fragment fonctionnel peut exprimer un produit adénoviral souhaité ou peut être utile dans la production de vecteurs viraux recombinants. De tels fragments comprennent les séquences géniques énumérées ci-dessus.
Les produits géniques de 1'adénovirus ChAdl55, tels que les protéines, les enzymes, et leurs fragments, qui sont codés par les acides nucléiques adénoviraux décrits ici sont fournis. De telles protéines comprennent celles codées par les cadres de lecture ouverts identifiés ci-dessus et les protéines codées par les polynucléotides fournis dans la Liste des séquences.
Autres polynucléotides et polypeptides du ChAdl55
Dans certains modes de réalisation, le polynucléotide de 1'invention comprend un polynucléotide codant pour un polypeptide de la fibre ;
un polypeptide du penton ; un polypeptide de l'hexon et un polypeptide du penton ; un polypeptide de l'hexon et un polypeptide de la fibre ; un polypeptide du penton et un polypeptide de la fibre ; ou un polypeptide de l'hexon, un polypeptide du penton et un polypeptide de la fibre de l'invention ; et il peut en outre comprendre des polynucléotides adénoviraux
BE2016/5434 supplémentaires, de façon appropriée des polynucléotides du ChAdl55. Ainsi, de façon appropriée, le polynucléotide selon 1'invention comprend un ou plusieurs des suivants, les coordonnées des séquences par rapport à SEQ ID NO : 10 fournie dans l'annotation précédente :
(a) une répétition terminale inversée (ITR) en 5' adénovirale ;
(b) une région E1A adénovirale, ou l'un de ses fragments, choisie parmi les régions E1A_28OR et E1A_243R ;
(c) une région E1B ou IX adénovirale, ou l'un de ses fragments, choisie dans le groupe constitué des régions E1B_19K, E1B_55K et IX ;
(d) une région E2B adénovirale, ou l'un de ses fragments, choisie dans le groupe constitué des régions E2B_pTP, E2B_polymérase et E2B_IVa2 ;
(e) une région L1 adénovirale, ou l'un de ses fragments, ledit fragment codant pour une protéine adénovirale choisie dans le groupe constitué des protéines Ll_13,6K, L1_52K et Ll_pIIIa ;
(f) une région L2 adénovirale ou une région L2 comprenant un polynucléotide codant pour la protéine du penton de l'invention, ou l'un de ses fragments, ledit fragment codant pour une protéine adénovirale choisie dans le groupe constitué de la protéine L2_penton, la protéine L2_pVII, la protéine L2_V et la protéine L2_pX ;
(g) une région L3 adénovirale ou une région L3 comprenant un polynucléotide codant pour la protéine de l'hexon de l'invention, ou l'un de ses fragments, ledit
BE2016/5434 fragment codant pour une protéine adénovirale choisie dans le groupe constitué de la protéine L3_pVI, la protéine L3_hexon et la protéine L3_protéase ;
(h) une région E2A adénovirale ;
(i) une région L4 adénovirale, ou l'un de ses fragments, ledit fragment codant pour une protéine adénovirale choisie dans le groupe constitué de la protéine L4_100k, la protéine L4_33K, la protéine L4_22K et la protéine L4_VIII ;
(j) une région E3 adénovirale, ou l'un de ses fragments, choisie dans le groupe constitué de l'ORFl de E3, 1 ' ORF2 de E3, de 1 ' ORF3 de E3, 1ORF4 de de E3, 1 ' ORF5 de E3, 1ORF6 de E3, 1 ' ORF7 de E3, 1ORF8 de E3, et 1ORF9 de E3 ;
(k) une région L5 adénovirale ou une région L5 comprenant un polynucléotide codant pour le polypeptide fibre L5_fibre de l'invention ;
(l) une région E4 adénovirale (comme de l'Ad5), ou l'un de ses fragments, choisie dans le groupe constitué de 1 ' ORF7 de E4, 1ORF6 de E4, 1 ' ORF4 de E4, 1 ' ORF3 de
E4, 1 ' ORF2 de E4, et l'ORFl de E4 ; en particulier l'ORF6 de ladite région E4 ;
(m) une ITR en 3' adénovirale ; et/ou (n) une région d'ARN VAI ou VAII adénovirale, de préférence une région d'ARN VAI ou VAII adénovirale provenant d'un adénovirus autre que ChAdl55, de façon davantage préférée provenant de l'Ad5.
Définitions
De façon appropriée, les polynucléotides ou les polypeptides de l'invention sont isolés. Un
BE2016/5434 polynucléotide « isolé » est un polynucléotide qui est prélevé de son environnement d'origine. Par exemple, un polynucléotide existant à l'état naturel est isolé s'il est séparé de certains ou de la totalité des matériaux coexistant dans le système naturel. Un polynucléotide est considéré comme étant isolé si, par exemple, il est cloné dans un vecteur qui ne fait pas partie de son environnement naturel ou s'il est compris au sein de 1'ADNc.
De façon appropriée, les polynucléotides de l'invention sont recombinants. Recombinant signifie que le polynucléotide est le produit d'au moins l'une des étapes de clonage, de restriction ou de ligature, ou d'autres procédures qui aboutissent à un polynucléotide qui est distinct d'un polynucléotide trouvé dans la nature. Un adénovirus recombinant est un adénovirus comprenant un polynucléotide recombinant. Un vecteur recombinant est un vecteur comprenant un polynucléotide recombinant. Un « virus recombinant » comprend la descendance du virus recombinant d'origine. Un « vecteur recombinant » comprend les réplicats du vecteur recombinant d'origine. Un « polynucléotide recombinant » comprend les réplicats du polynucléotide recombinant d'origine.
De façon appropriée, la séquence polypeptidique de la présente invention contient au moins une modification par rapport à une séquence native. De façon appropriée, les séquences polynucléotidiques de la présente invention contiennent au moins une modification par rapport à une séquence native. Par exemple, un polynucléotide introduit par des techniques
BE2016/5434 de génie génétique dans un plasmide ou un vecteur dérivé d'une espèce différente (et souvent d'un genre, d'une sous-famille ou d'une famille différent(e)) est un polynucléotide hétérologue. Un promoteur prélevé de sa séquence codante native est lié de façon fonctionnelle à une séquence codante avec laquelle il n'est pas trouvé naturellement lié est un promoteur hétérologue. Un site de recombinaison spécifique qui a été cloné dans un génome d'un virus ou d'un vecteur viral, où le génome du virus ne le contient pas naturellement, est un site de recombinaison hétérologue. Une séquence d'acide nucléique hétérologue comprend également une séquence trouvée naturellement dans un génome adénoviral, mais localisée au niveau d'une position non native au sein du vecteur adénoviral.
Généralement, « hétérologue » signifie dérivé d'une entité génotypiquement distincte de celle du reste de l'entité à laquelle il est comparé. Une séquence d'acide nucléique hétérologue se rapporte à toute séquence d'acide nucléique qui n'est ni isolée de, ni dérivée de, ni basée sur une séquence d'acide nucléique existant à l'état naturel du vecteur adénoviral. « Existant à l'état naturel » signifie une séquence trouvée dans la nature et ni préparée par synthèse ni modifiée. Une séquence est « dérivée » d'une source lorsqu'elle est isolée d'une source mais modifiée (par exemple, par délétion, substitution (mutation), insertion, ou une autre modification), de façon appropriée afin de ne pas perturber la fonction normale du gène source.
BE2016/5434
Un « dérivé fonctionnel » d'un polypeptide se rapporte de façon appropriée à une version modifiée d'un polypeptide, par exemple, dans lequel un ou plusieurs acides aminés du polypeptide peuvent être délétés, insérés, modifiés et/ou substitués. Un dérivé d'une protéine de la capside adénovirale non modifiée est considéré comme fonctionnel si, par exemple :
(a) un adénovirus comprenant le dérivé de la protéine de la capside au sein de sa capside conserve une séroprévalence sensiblement identique ou inférieure comparativement à un adénovirus comprenant la protéine de la capside non modifiée et/ou (b) un adénovirus comprenant le dérivé de la protéine de la capside au sein de sa capside conserve une infectivité pour la cellule hôte sensiblement identique ou supérieure pour la cellule hôte comparativement à un adénovirus comprenant la protéine de la capside non modifiée et/ou (c) un adénovirus comprenant le dérivé de la protéine de la capside au sein de sa capside conserve une immunogénicité sensiblement identique ou supérieure comparativement à un adénovirus comprenant la protéine de la capside non modifiée et/ou (d) un adénovirus comprenant le dérivé de la protéine de la capside au sein de sa capside conserve un taux de productivité de transgènes sensiblement identique ou supérieur comparativement à un adénovirus comprenant la protéine de la capside non modifiée.
Les propriétés (a) à (d) ci-dessus peuvent être mesurées de façon appropriée en utilisant les procédés décrits dans la section Exemples ci-dessous.
BE2016/5434
De façon appropriée, le polypeptide, le vecteur ou 1'adénovirus recombinant présente une séroprévalence faible dans une population humaine. « Séroprévalence faible » peut signifier posséder un taux d'anticorps neutralisants préexistants comparativement à 1'adénovirus 5 humain (Ad5). De façon similaire ou en variante, « séroprévalence faible » peut signifier moins d'environ 20 % de séroprévalence, moins d'environ 15 % de séroprévalence, moins d'environ 10 % de séroprévalence, moins d'environ 5 % de séroprévalence, moins d'environ 4 % de séroprévalence, moins d'environ 3 % de séroprévalence, moins d'environ 2 % de séroprévalence, moins d'environ 1 % de séroprévalence, ou aucune séroprévalence détectable. La séroprévalence peut être mesurée sous la forme du pourcentage d'individus présentant un titre neutralisant cliniquement pertinent (défini comme un titre de neutralisation à 50 % > 200) en utilisant des procédés tels que décrits dans Aste-Amézaga et al., Hum. Gene Ther. (2004) 15(3): 293-304.
Les termes polypeptide, peptide et protéine sont utilisés ici de façon interchangeable.
Le terme « simien » est généralement censé englober les primates non humains, par exemple, les singes de l'Ancien Monde, les singes du Nouveau Monde, les grands singes et les gibbons. En particulier, simien peut se rapporter à des grands singes non humains tels que les chimpanzés (Pan troglodyte) , les bonobos (Pan paniscus) et les gorilles (genre Gorilla). Les simiens non grands singes peuvent comprendre les macaques Rhésus (Macaca mulatta).
BE2016/5434 comparaison de deux ou polypeptidiques d'identité » entre une
Comparaison des séquences Pour les objectifs de séquences polynucléotidiques étroitement apparentées, le « première séquence et une seconde séquence peut être calculé en utilisant un programme d'alignement tel que BLAST® (disponible sur blast.ncbi.nlm.nih.gov, dernière consultation le 9 mars 2015) en utilisant les réglages standard. Le % d'identité est le nombre de résidus identiques divisés par le nombre de résidus dans la séquence de référence, multiplié par 100. Les chiffres de % d'identité auxquels il a été fait référence cidessus et dans les revendications sont des pourcentages calculés par cette méthodologie. Une variante de définition du % d'identité est le nombre de résidus identiques divisés par le nombre de résidus alignés, multiplié par 100. Les variantes de procédés comprennent l'utilisation d'un procédé à brèches dans lequel des brèches dans l'alignement, par exemple des délétions dans une séquence par rapport à l'autre séquence, sont prises en compte dans un score de brèche ou un coût de brèche dans le paramètre d'attribution du score. Pour plus d'informations, voir la fiche d'information BLAST® disponible sur ftp.ncbi.nlm.nih. gov/pub/factsheets/HowTo_BLASTGuide.pdf, dernière consultation le 9 mars 2015.
Les séquences qui concernent la fonctionnalité du polynucléotide ou d'un polypeptide codé de cette façon sont vraisemblablement plus étroitement identiques. Les séquences polypeptidiques ou polynucléotidiques sont dites être les mêmes que ou identiques à d'autres
BE2016/5434 séquences polypeptidiques ou polynucléotidiques, si elles partagent 100 % d'identité de séquence sur leur longueur entière.
Une « différence » entre des séquences se rapporte à une insertion, une délétion ou une substitution d'un seul résidu d'acide aminé dans une position de la seconde séquence, comparativement à la première séquence. Deux séquences polypeptidiques peuvent contenir une, deux ou plus de ces différences d'acides aminés. Des insertions, des délétions ou des substitutions dans une seconde séquence qui est autrement identique (100 % d'identité de séquence) par rapport à une première séquence produisent une réduction du pourcentage d'identité de séquence. Par exemple, si les séquences identiques ont une longueur de 9 résidus d'acides aminés, une substitution dans la seconde séquence produit une identité de séquence de
88,9 %. Si les séquences identiques ont une longueur de 17 résidus d'acides aminés, deux substitutions dans la seconde séquence produisent une identité de séquence de
88,2 %. Si les séquences identiques ont une longueur de 7 résidus d'acides aminés, trois substitutions dans la seconde séquence produisent une identité de séquence de 57,1 %. Si la première et la seconde séquences polypeptidiques ont une longueur de 9 résidus d'acides aminés et qu'elles partagent 6 résidus identiques, la première et la seconde séquences polypeptidiques partagent plus de 66 % d'identité (la première et la seconde séquences polypeptidiques partagent 66,7 % d'identité). Si la première et la seconde séquences polypeptidiques ont une longueur de 17 résidus d'acides
BE2016/5434 aminés et qu'elles partagent 16 résidus identiques, la première et la seconde séquences polypeptidiques partagent plus de 94 % d'identité (la première et la seconde séquences polypeptidiques partagent 94,1 % d'identité). Si la première et la seconde séquences polypeptidiques ont une longueur de 7 résidus d'acides aminés et qu'elles partagent 3 résidus identiques, la première et la seconde séquences polypeptidiques partagent plus de 42 % d'identité (la première et la seconde séquences polypeptidiques partagent 42,9 % d'identité) .
En variante, pour les objectifs de comparaison d'une première, séquence polypeptidique de référence à une seconde, séquence polypeptidique de comparaison, le nombre des additions, des substitutions et/ou des délétions effectuées sur la première séquence pour produire la seconde séquence peut être déterminé. Une addition est l'addition d'un résidu d'acide aminé dans la séquence du premier polypeptide (y compris l'addition à l'une ou l'autre extrémité du premier polypeptide). Une substitution est la substitution d'un résidu d'acide aminé dans la séquence du premier polypeptide par un résidu d'acide aminé différent. Une délétion est la délétion d'un résidu d'acide aminé à partir de la séquence du premier polypeptide (y compris la délétion à l'une ou l'autre extrémité du premier polypeptide).
Pour les objectifs de comparaison d'une première, séquence polynucléotidique de référence à une seconde, séquence polynucléotidique de comparaison, le nombre des additions, des substitutions et/ou des délétions
BE2016/5434 réalisées sur la première séquence pour produire la seconde séquence peut être déterminé. Une addition est l'addition d'un résidu de nucléotide dans la séquence du premier polynucléotide (y compris l'addition à l'une ou l'autre extrémité du premier polynucléotide). Une substitution est la substitution d'un résidu de nucléotide dans la séquence du premier polynucléotide par un résidu de nucléotide différent. Une délétion est la délétion d'un résidu de nucléotide à partir de la séquence du premier polynucléotide (y compris la délétion à l'une ou l'autre extrémité du premier polynucléotide).
De façon appropriée, les substitutions dans les séquences de la présente invention peuvent être des substitutions conservatives. Une substitution conservative comprend la substitution d'un acide aminé par un autre acide aminé ayant une propriété chimique similaire à l'acide aminé qui est substitué (voir, par exemple, Stryer et al., Biochemistry, 5ème Edition 2002, pages 44-49) . De préférence, la substitution conservative est une substitution choisie dans le groupe constitué de : (i) une substitution d'un acide aminé basique par un autre, acide aminé basique différent ; (ii) une substitution d'un acide aminé acide par un autre, acide aminé acide différent ; (iii) une substitution d'un acide aminé aromatique par un autre, acide aminé aromatique différent ; (iv) une substitution d'un acide aminé aliphatique non polaire par un autre, acide aminé aliphatique non polaire différent ; et (v) une substitution d'un acide aminé polaire non chargé par un autre, acide aminé polaire
BE2016/5434 non chargé. Un acide aminé basique est de préférence choisi dans le groupe constitué de l'arginine, 1'histidine, et la lysine. Un acide aminé acide est de préférence 1 ' aspartate ou le glutamate. Un acide aminé aromatique est choisi de préférence dans le groupe constitué de la phénylalanine, la tyrosine et le tryptophane. Un acide aminé aliphatique non polaire est choisi de préférence dans le groupe constitué de la glycine, l'alanine, la valine, la leucine, la aminé est acide aminé méthionine et 1 ' isoleucine. Un acide aminé polaire non chargé est choisi de préférence dans le groupe constitué de la sérine, la thréonine, la cystéine, la proline, l'asparagine et la glutamine. Au contraire d'une substitution conservative d'acide aminé, une substitution non conservative d'acide l'échange d'un acide aminé par un quelconque qui ne se situe pas parmi les substitutions conservatives (i) à (v) présentées ci-dessus.
Vecteurs et adénovirus recombinants Les séquences du ChAdl55 de l'invention sont utiles en tant qu'agents thérapeutiques et dans la construction de divers systèmes de vecteurs, de divers adénovirus recombinants et de diverses cellules hôtes. De façon appropriée, le terme « vecteur » se rapporte à un acide nucléique qui a été sensiblement modifié (par exemple, un gène ou une région fonctionnelle qui a été délété (e) et/ou inactivé(e)) par rapport à une séquence de type sauvage et/ou qui incorpore une séquence hétérologue, c'est-à-dire, un acide nucléique obtenu à partir d'une source différente (également appelé un « insert »), et la réplication et/ou l'expression de la
BE2016/5434 séquence polynucléotidique insérée, lorsqu'il est introduit dans une cellule (par exemple, une cellule hôte) . Par exemple, 1 ' insert peut être la totalité ou une partie des séquences du ChAdl55 décrites ici. En outre ou en variante, un vecteur ChAdl55 peut être un adénovirus ChAdl55 comprenant une ou plusieurs délétions ou inactivations de gènes viraux, tels que El ou un autre gène viral ou une région fonctionnelle décrite ici. Un tel ChAdl55, qui peut comprendre ou pas une séquence hétérologue, est souvent appelé un « squelette » et il peut être utilisé tel quel ou comme point de départ pour d'autres modifications dans le vecteur.
Un vecteur peut être toute molécule d'acide nucléique appropriée y compris de l'ADN nu, un plasmide, un virus, un cosmide, un vecteur de phage tel que le vecteur lambda, un chromosome artificiel tel qu'un BAC (chromosome bactérien artificiel), ou un épisome. En variante, un vecteur peut être une unité de transcription et/ou d'expression pour une transcription ou une expression in vitro sans cellules, comme un système compatible avec T7. Les vecteurs peuvent être utilisés seuls ou en combinaison avec d'autres séquences ou fragments adénoviraux, ou en combinaison avec des éléments de séquences non adénovirales. Les séquences du ChAdl55 sont également utiles dans des vecteurs d'administration de séquences antisens, des vecteurs de thérapie génique, ou des vecteurs de vaccins. Ainsi, il est en outre fourni des vecteurs d'administration de gènes, et des cellules hôtes qui contiennent les séquences du ChAdl55.
BE2016/5434
Le terme adénovirus « compétent pour la réplication » se rapporte à un adénovirus qui peut se répliquer dans une cellule hôte en l'absence de toute protéine auxiliaire recombinante comprise dans la cellule. De façon appropriée, un adénovirus « compétent pour la réplication » comprend les gènes précoces essentiels intacts ou fonctionnels suivants : EIA, E1B, E2A, E2B, E3 et E4. Les adénovirus de type sauvage isolés d'un animal particulier seront compétents pour la réplication chez cet animal.
Le terme adénovirus « incompétent pour la réplication » ou « déficient pour la réplication » se rapporte à un adénovirus qui est incapable de réplication parce qu'il a été modifié pour comprendre au moins une délétion fonctionnelle (ou une mutation « perte de fonction »), c'est-à-dire une délétion ou une mutation qui altère la fonction d'un gène sans l'éliminer entièrement, par exemple, l'introduction de codons d'arrêt artificiels, la délétion ou la mutation de sites actifs ou de domaines d'interaction, la mutation ou la délétion d'une séquence régulatrice d'un gène etc., ou une élimination complète d'un gène codant pour un produit génique qui est essentiel à la réplication virale, tel que l'un ou plusieurs des gènes adénoviraux choisis parmi EIA, EIB, E2A, E2B, E3 et E4 (tels que l'ORFl de E3, 1 ' ORF2 de E3, 1 ' ORF3 de E3, ' ORF4 de E3, 1 ' ORF5 de E3, 1ORF6 de E3, 1 ' ORF7 de E3,
1ORF8 de E3, 1ORF9 de E3, 1 ' ORF7 de E4, 1ORF6 de E4, ' ORF4 de E4, 1 ' ORF3 de E4, 1 ' ORF2 de E4 et/ou l'ORFl de E4) . De façon particulièrement appropriée El et éventuellement E3 et/ou E4 sont délétés. S'ils sont
BE2016/5434 délétés, la région génique délétée susmentionnée, de façon appropriée, ne sera pas prise en considération dans l'alignement lors de la détermination du % d'identité par rapport à une autre séquence.
La présente invention fournit des vecteurs tels que des adénovirus recombinants qui administrent une protéine, de façon appropriée une protéine hétérologue, à des cellules, pour des objectifs soit thérapeutiques soit vaccinaux. Un vecteur peut comprendre tout élément génétique y compris de 1'ADN nu, un phage, un transposon, un cosmide, un épisome, un plasmide, ou un virus. De tels vecteurs contiennent l'ADN du ChAdl55 tel que divulgué ici et un minigène. Par « minigène » (ou « cassette d'expression »), il est signifié la combinaison d'un gène hétérologue choisi (transgène) et d'autres éléments régulateurs nécessaires pour conduire la traduction, la transcription et/ou l'expression du produit génique dans une cellule hôte.
Généralement, un vecteur adénoviral dérivé du ChAdl55 est conçu de telle façon que le minigène est localisé dans une molécule d'acide nucléique qui contient d'autres séquences adénovirales dans la région native par rapport à un gène adénoviral choisi. Le minigène peut être inséré dans une région génique existante pour perturber la fonction de cette région, si c'est souhaité. En variante, le minigène peut être inséré dans le site d'un gène adénoviral partiellement ou totalement délété. Par exemple, le minigène peut être localisé dans le site d'une mutation, d'une insertion ou d'une délétion qui rend non fonctionnel au moins un gène d'une région génomique choisie dans le
BE2016/5434 groupe constitué de EIA, E1B, E2A, E2B, E3 et E4. Le terme « rend non fonctionnel » signifie qu'une quantité suffisante de la région génique est éliminée ou sinon perturbée, si bien que la région génique n'est plus capable de produire des produits fonctionnels de l'expression génique. Si c'est souhaité, la région génique entière peut être éliminée (et de façon appropriée remplacée par le minigène).
Par exemple, pour un vecteur de production utile pour la génération d'un virus recombinant, le vecteur peut contenir le minigène et soit l'extrémité 5' du génome adénoviral soit l'extrémité 3' du génome adénoviral, ou les extrémités à la fois 5' et 3' du génome adénoviral. L'extrémité 5' du génome adénoviral contient les éléments cis en 5' nécessaires à 1 ' encapsidation et à la réplication, c'est-à-dire, les séquences ITR en 5' (qui fonctionnent comme des origines de réplication) et les domaines amplificateurs de 1'encapsidation en 5' natifs (qui contiennent des séquences nécessaires à 1'encapsidation des génomes linéaires d'Ad et des éléments amplificateurs pour le promoteur El) . L'extrémité 3' du génome adénoviral comprend les éléments cis en 3 ' (y compris les ITR) nécessaires à 1 ' encapsidation. De façon appropriée, un adénovirus recombinant contient des éléments cis adénoviraux à la fois en 5 ' et en 3 ' et le minigène (contenant de façon appropriée un transgène) est localisé entre les séquences adénovirales en 5 ' et en 3'. Un vecteur adénoviral basé sur le ChAdl55 peut également contenir des séquences adénovirales supplémentaires.
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De façon appropriée, les vecteurs basés sur le ChAdl55 contiennent un ou plusieurs éléments adénoviraux dérivés du génome adénoviral du ChAdl55 de l'invention. Dans un mode de réalisation, les vecteurs contiennent des ITR adénovirales provenant du ChAdl55 et des séquences adénovirales supplémentaires provenant du même sérotype adénoviral. Dans un autre mode de réalisation, les vecteurs contiennent des séquences adénovirales qui sont dérivées d'un sérotype adénoviral différent de celui qui fournit les ITR.
Tel que défini ici, un adénovirüs pseudotypé se rapporte à un adénovirüs dans lequel les protéines de la capside de 1'adénovirüs proviennent d'un adénovirüs différent de 1'adénovirüs qui fournit les ITR.
En outre, des adénovirüs chimériques ou hybrides peuvent être construits en utilisant les adénovirüs décrits ici en utilisant des techniques connues de l'homme du métier (par exemple, US 7 291 498).
Les ITR et toutes les autres séquences adénovirales présentes dans le vecteur de la présente invention peuvent être obtenues auprès de nombreuses sources. Diverses souches d'adénovirüs sont disponibles auprès de 1'American Type Culture Collection, Manassas, Virginie ou sont disponibles sur demande auprès de diverses sources commerciales et institutionnelles. En outre, les séquences d'un grand nombre de ces souches sont disponibles à partir de diverses bases de données y compris, par exemple, PubMed et GenBank. Des vecteurs d'adénovirüs homologues préparés à partir d'autres adénovirüs de chimpanzés ou humains sont décrits dans la littérature publiée (par exemple, US 5 240 846). Les
BE2016/5434 séquences d'ADN d'un certain nombre de types d'adénovirus sont disponibles auprès de la GenBank, y compris le type Ad5 (numéro d'accession GenBank M73370). Les séquences d'adénovirus peuvent être obtenues à partir de tout sérotype d'adénovirus connu tel que les sérotypes 2, 3, 4, 12 et 40, et y compris en outre l'un quelconque des types humains présentement identifiés. De façon similaire, des adénovirus connus pour infecter des animaux non humains (par exemple, des simiens) peuvent être éqalement employés dans les constructions de vecteurs de cette invention (par exemple, US 6 083 716) . Les séquences virales, les virus auxiliaires (si nécessaires), et les particules virales recombinantes, et d'autres composants de vecteurs et les séquences employées dans la construction des vecteurs décrits ici peuvent être obtenus comme il est décrit ci-dessous.
Production des séquences, des vecteurs et des adénovirus
Les séquences de
1'invention peuvent être produites par tout moyen approprié, y compris une production recombinante, une synthèse chimique, ou d'autres moyens de synthèse. Les techniques de production appropriées sont bien connues de l'homme du métier. En variante, les peptides peuvent être éqalement synthétisés par des procédés bien connus de synthèse de peptides en phase solide.
Les plasmides adénoviraux (ou d'autres vecteurs) peuvent être utilisés pour produire des vecteurs adénoviraux. Dans un mode de réalisation, les vecteurs adénoviraux sont des particules adénovirales, qui sont
BE2016/5434 incompétentes pour la réplication. Dans un mode de réalisation, les particules adénovirales sont rendues incompétentes pour la réplication par des délétions dans les gènes E1A et/ou E1B. En variante, les adénovirus sont rendus incompétents pour la réplication par d'autres moyens, éventuellement tout en conservant les gènes E1A et/ou E1B. De façon similaire, dans certains modes de réalisation, la réduction d'une réponse immunitaire au vecteur peut être accomplie par des délétions dans les gènes E2B et/ou de 1'ADN polymérase. Les vecteurs adénoviraux peuvent également contenir d'autres mutations dans le génome adénoviral, par exemple, des mutations sensibles à la température ou des délétions dans d'autres gènes. Dans d'autres modes de réalisation, il est souhaitable de conserver une région E1A et/ou E1B intacte dans les vecteurs adénoviraux. Une telle région El intacte peut être localisée dans son emplacement natif dans le génome adénoviral ou placée dans le site d'une délétion dans le génome adénoviral natif (par exemple, dans la région E3) .
Dans la construction des vecteurs adénoviraux pour l'administration d'un gène à une cellule de mammifère (tel qu'un être humain), il peut être employé tout un éventail de séquences d'acide nucléique d'adénovirus modifiées dans les vecteurs. Par exemple, la totalité ou une partie du gène précoce retardé E3 d'adénovirus peut être éliminée de la séquence adénovirale qui forme une partie du virus recombinant. On pense que la fonction de E3 est sans rapport avec la fonction et la production de la particule virale recombinante. Les
BE2016/5434 vecteurs adénoviraux peuvent être également construits en comportant une délétion d'au moins la région de l'ORF6 du gène E4, et de façon davantage souhaitée, à cause de la redondance dans la fonction de cette région, la région E4 entière. Encore un autre vecteur de 1'invention contient une délétion dans le gène précoce retardé E2A. Des délétions peuvent être également réalisées dans l'un quelconque des gènes tardifs L1 à L5 du génome adénoviral. De façon similaire, des délétions dans les gènes intermédiaires IX et IVa2 peuvent être utiles pour certains objectifs. D'autres délétions peuvent être réalisées dans les autres gènes adénoviraux structuraux ou non structuraux. Les délétions discutées ci-dessus peuvent être utilisées individuellement, c'est-à-dire, une séquence d'adénovirus pour une utilisation telle que décrite ici peut contenir des délétions dans seulement une seule région. En variante, des délétions de gènes entiers ou de parties de ceux-ci efficaces pour détruire leur activité biologique peuvent être utilisées dans une combinaison quelconque. Par exemple, dans un exemple de vecteur, la séquence adénovirale peut comporter des délétions des gènes El et du gène E4, ou des gènes El, E2A et E3, ou des gènes El et E3, ou des gènes El, E2A et E4, avec ou sans délétion de E3, et ainsi de suite. L'un quelconque ou plusieurs des gènes E peuvent être remplacés de façon appropriée par un gène E (ou un ou plusieurs cadres de lecture ouverts des gènes E) provenant d'une souche d'adénovirus différente. De façon particulièrement appropriée, les gènes El et E3 du ChAdl55 sont délétés et le gène E4 du ChAdl55 est
BE2016/5434 remplacé par l'orfö de E4 de l'Ad5. Comme il a été discuté ci-dessus, de telles délétions et/ou substitutions peuvent être utilisées en combinaison avec d'autres mutations, telles que des mutations sensibles à la température, pour obtenir un résultat souhaité.
Un vecteur adénoviral auquel il manque une ou plusieurs séquences adénovirales essentielles (par exemple, EIA, ElB, E2A, E2B, ORF6 de E4, Ll, L2, L3, L4 et L5) peut être cultivé en présence des produits géniques adénoviraux manquants qui sont nécessaires à l'infectivité virale et à la propagation d'une particule adénovirale. Ces fonctions auxiliaires peuvent être fournies en cultivant le vecteur adénoviral en présence d'une ou de plusieurs constructions auxiliaires (par exemple, un plasmide ou un virus) ou d'une cellule hôte d'encapsidation.
Complémentation de vecteurs incompétents pour la réplication
Pour produire des adénovirus recombinants délétés dans l'un quelconque des gènes décrits ci-dessus, la fonction de la région du gène délété, si elle est essentielle à la réplication et à l'infectivité du virus, doit être fournie au virus recombinant par un virus auxiliaire ou une lignée cellulaire, c'est-à-dire, une lignée cellulaire de complémentation ou d'encapsidation.
Virus auxiliaires
Selon la teneur en gènes adénoviraux des vecteurs viraux employés pour porter le minigène, un adénovirus auxiliaire ou un fragment de virus ne se répliquant pas
BE2016/5434 peut être utilisé pour fournir des séquences de gènes adénoviraux suffisantes nécessaires pour produire une particule virale recombinante infectieuse contenant le minigène. Les virus auxiliaires utiles contiennent des séquences de gènes adénoviraux choisies qui ne sont pas présentes dans la construction de vecteurs adénoviraux et/ou qui ne sont pas exprimées par la lignée cellulaire d'encapsidation dans laquelle le vecteur est transfecté. Dans un mode de réalisation, le virus auxiliaire est déficient pour la réplication et il contient des gènes adénoviraux en plus, de façon appropriée, d'une ou de plusieurs des séquences décrites ici. Un tel virus auxiliaire est utilisé de façon appropriée en combinaison avec une lignée cellulaire exprimant El (et exprimant éventuellement en outre E3).
Un virus auxiliaire peut contenir éventuellement un gène rapporteur. Un certain nombre de ces gènes rapporteurs sont connus dans l'art ainsi que décrits ici. La présence d'un gène rapporteur sur le virus auxiliaire qui est différent du transgène sur le vecteur adénoviral permet de contrôler indépendamment à la fois le vecteur adénoviral et le virus auxiliaire. Ce rapporteur est utilisé pour permettre la séparation entre le virus recombinant résultant et le virus auxiliaire lors de la purification.
Lignées cellulaires de complémentation
Dans de nombreuses circonstances, une lignée cellulaire exprimant les un ou plusieurs gènes manquants qui sont essentiels à la réplication et à l'infectivité du virus, tels que le El humain, peut
BE2016/5434 être utilisée pour trans-complémenter un vecteur d'adénovirus de chimpanzé. Ceci est particulièrement avantageux parce que, à cause de la diversité entre les séquences d'adénovirus de chimpanzé de l'invention et les séquences d'adénovirus humains trouvés dans les cellules d'encapsidation actuellement disponibles, l'utilisation des cellules actuelles contenant le El humain empêche la production d'adénovirus compétents pour la réplication durant le processus de réplication et de production.
En variante, si c'est souhaité, on peut utiliser les séquences fournies ici pour produire une cellule ou une lignée cellulaire d'encapsidation qui exprime, au minimum, le gène El à partir du ChAdl55 sous le contrôle transcriptionnel d'un promoteur pour une expression dans une lignée cellulaire parentale choisie Des promoteurs inductibles ou constitutifs peuvent être
employés pour cet objectif. Les exemples de ces
promoteurs sont décrits en détail ailleurs dans ce
document. Une cellule parente est choisie pour la
production d'une nouvelle lignée cellulaire exprimant tout gène souhaité du ChAdl55. Sans limitation, une telle lignée cellulaire parente peut consister en des cellules HeLa [No. d'accession ATCC CCL 2], A549 [No. d'accession ATCC CCL 185], HEK 293, KB [CCL 17], Detroit [par exemple, Detroit 510, CCL 72] et WI-38 [CCL 75], entre autres. Ces lignées cellulaires sont toutes disponibles auprès de 1'American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209.
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De telles lignées cellulaires exprimant El sont utiles dans la production de vecteurs adénoviraux recombinants délétés de El. En outre, ou en variante, des lignées cellulaires qui expriment un ou plusieurs produits de gènes adénoviraux, par exemple, EIA, E1B, E2A, E3 et/ou E4, peuvent être construites en utilisant essentiellement les mêmes procédures que celles utilisées dans la production de vecteurs viraux recombinants. De telles lignées cellulaires peuvent être utilisées pour trans-complémenter des vecteurs adénoviraux délétés dans les gènes essentiels qui codent pour ces produits, ou pour fournir des fonctions auxiliaires nécessaires à 1'encapsidation d'un virus auxiliaire-dépendant (par exemple, un virus adénoassocié). La préparation d'une cellule hôte implique des techniques telles que l'assemblage de séquences d'ADN choisies.
Dans une autre variante, les produits des gènes adénoviraux essentiels sont fournis en trans par le vecteur adénoviral et/ou le virus auxiliaire. Dans un tel cas, une cellule hôte appropriée peut être choisie à partir de tout organisme biologique, y compris des cellules procaryotes (par exemple, bactériennes) , et des cellules eucaryotes, y compris, des cellules d'insectes, des cellules de levures et des cellules de mammifères.
Les cellules hôtes peuvent être choisies parmi toute espèce de mammifère, y compris, sans limitation, des cellules telles que des cellules A549, WEHI, 3T3, 10T1/2, HEK 293 ou Per.C6 (les deux exprimant un El adénoviral fonctionnel) [Fallaux, FJ et al (1998),
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Hum Gene Ther, 9: 1909-1917], Saos, C2C12, des cellules L, HT1080, HepG2 et des cellules primaires de fibroblastes, d'hépatocytes et de myoblastes dérivées de mammifères y compris l'être humain, le singe, la souris, le rat, le lapin, et le hamster.
Une lignée cellulaire de complémentation particulièrement appropriée est la lignée cellulaire Procell92. La lignée cellulaire Procell92 est basée sur des cellules HEK 293 qui expriment des gènes adénoviraux El, transfectée avec le répresseur Tet sous le contrôle du promoteur de la phosphoglycérate kinase-1 (PGK) humaine, et le gène de résistance au G418 (Vitelli et al. PLOS One (2013) 8 (e55435) : 1-9). Procell92.S est adaptée pour une croissance dans des conditions de suspension et elle est utile pour produire des vecteurs adénoviraux exprimant des protéines toxiques (www.okairos.com/e/inners.php?m= 00084, dernière consultation le 13 avril 2015) .
Assemblage d'une particule virale et transfection d'une lignée cellulaire
Généralement, lors de l'administration du vecteur comprenant le minigène par transfection, le vecteur est administré dans une quantité d'environ 5 pg à environ 100 pg d'ADN, et de préférence environ 10 à environ 50 pg d'ADN à environ 1 x 104 cellules à environ 1 x 1013 cellules, et de préférence environ 105 cellules Toutefois, les quantités relatives d'ADN de vecteur administrées aux cellules hôtes peuvent être ajustées, en prenant en considération des facteurs tels que le vecteur choisi, le procédé d'administration et les cellules hôtes choisies.
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L'introduction dans la cellule hôte du vecteur peut être obtenue par tout moyen connu dans l'art, y compris la transfection, et l'infection. Un ou plusieurs des gènes adénoviraux peuvent être intégrés de façon stable dans le génome de la cellule hôte, exprimés de façon stable sous la forme d'épisomes, ou exprimés de façon transitoire. Les produits géniques peuvent être tous exprimés de façon transitoire, sur un épisome ou intégrés de façon stable, ou certains des produits géniques peuvent être exprimés de façon stable alors que d'autres sont exprimés de façon transitoire.
L'introduction de vecteurs dans la cellule hôte peut être également accomplie en utilisant des techniques connues de l'homme du métier. De façon appropriée, des techniques classiques de transfection sont utilisées, par exemple, la transfection avec du CaPC ou 1'électroporation.
L'assemblage des séquences d'ADN choisies de 1'adénovirus (ainsi que le transgène et d'autres éléments du vecteur) dans divers plasmides intermédiaires, et l'utilisation des plasmides et des vecteurs pour produire une particule virale recombinante sont tous obtenus en utilisant des techniques traditionnelles. Ces techniques comprennent des techniques traditionnelles de clonage d'ADNc, l'utilisation de séquences oligonucléotidiques se chevauchant des génomes adénoviraux, la réaction en chaîne de la polymérase, et tout procédé approprié qui fournit la séquence nucléotidique souhaitée. Des techniques classiques de transfection et de cotransfection sont employées, par exemple, des
BE2016/5434 techniques de précipitation avec du CaPC. D'autres procédés traditionnels employés comprennent la recombinaison homologue des génomes viraux, le plaquage de virus sur une gélose de recouvrement, des procédés de mesure de la production de signaux, et analogues.
Par exemple, à la suite de la construction et de l'assemblage du vecteur viral contenant le minigène souhaité, le vecteur est transfecté in vitro en présence d'un virus auxiliaire dans la lignée cellulaire d'encapsidation . Une recombinaison homologue se produit entre les séquences de l'auxiliaire et du vecteur, ce qui permet aux séquences de 1 ' adénovirustransgène d'être répliquées et encapsidées dans des capsides de virions, aboutissant à des particules de vecteur viral recombinant. Les adénovirus recombinants résultants sont utiles dans le transfert d'un transgène choisi à une cellule choisie. Dans des expériences in vivo avec le virus recombinant développé dans les lignées cellulaires d'encapsidation, les vecteurs adénoviraux recombinants délétés de El de l'invention démontrent une utilité dans le transfert d'un transgène à une cellule de mammifère non simien, de préférence d'un être humain.
Transgènes
Le transgène est une séquence d'acide nucléique, hétérologue aux séquences du vecteur flanquant le transgène, qui code pour une protéine d'intérêt. La séquence codante d'acide nucléique est liée de façon fonctionnelle à des composants régulateurs d'une manière qui permet la transcription, la traduction et/ou l'expression du transgène dans une cellule hôte.
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La composition de la séquence du transgène dépendra de l'utilisation à laquelle le vecteur résultant sera affecté. Par exemple, le transgène peut être un transgène thérapeutique ou un transgène immunogène. En variante, une séquence de transgène peut comprendre une séquence rapporteur, qui lors de l'expression produit un signal détectable. De telles séquences rapporteurs comprennent, sans limitation, des séquences d'ADN codant pour la ß-lactamase, la ßgalactosidase (LacZ), la phosphatase alcaline, la thymidine kinase, la protéine fluorescente verte (GFP), la chloramphénicol acétyltransférase (CAT), la luciférase, des protéines liées à la membrane y compris, par exemple, CD2, CD4, CD8, la protéine hémagglutinine du virus de la grippe, et d'autres bien connues dans l'art, contre lesquelles des anticorps de haute affinité sont dirigés et existent ou peuvent être produits par des moyens traditionnels, et des protéines de fusion comprenant une protéine liée à la membrane fusionnée de façon appropriée à un domaine marqueur d'antigène provenant, entre autres, de 1'hémagglutinine ou de Myc. Ces séquences codantes, lorsqu'elles sont associées à des éléments régulateurs qui dirigent leur expression, fournissent des signaux détectables par des moyens traditionnels, y compris des tests enzymatiques, radiographiques, colorimétriques, de fluorescence ou autres spectrographiques, des tests de tri de cellules activées par fluorescence et des tests immunologiques, y compris un test ELISA (enzyme linked immunosorbent), un test radioimmunologique (RIA), et une immunohistochimie.
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Dans un mode de réalisation, le transgène est une séquence non marqueur codant pour un produit qui est utile en biologie et en médecine, tel qu'un transgène thérapeutique ou un transgène immunogène comme des protéines, de l'ARN, des enzymes, ou des ARN catalytiques. Les molécules d'ARN souhaitables comprennent l'ARNt, l'ARNdb, l'ARN ribosomial, les ARN catalytiques, et les ARN antisens. Un exemple d'une séquence d'ARN utile est une séquence qui neutralise l'expression d'une séquence d'acide nucléique ciblée chez l'animal traité.
Le transgène peut être utilisé pour le traitement, par exemple, d'anomalies génétiques, comme un agent thérapeutique ou un vaccin anticancéreux, pour l'induction d'une réponse immunitaire, et/ou pour des objectifs de vaccins prophylactiques. Telle qu'utilisée ici, l'induction d'une réponse immunitaire se rapporte à la capacité d'une protéine d'induire un lymphocyte T et/ou une réponse immunitaire humorale contre la protéine.
Eléments régulateurs
En plus du transgène, le vecteur comprend également des éléments de contrôle traditionnels qui sont liés de façon fonctionnelle au transgène d'une manière qui permet sa transcription, sa traduction et/ou son expression dans une cellule transfectée avec le vecteur plasmidique ou infectée avec le virus produit par l'invention. Telles qu'utilisées ici, les séquences « liées de façon fonctionnelle » comprennent à la fois des séquences de contrôle de l'expression qui sont contiguës aux gènes d'intérêt et des séquences de
BE2016/5434 contrôle de l'expression qui agissent en trans ou à distance pour contrôler le gène d'intérêt.
Les séquences de contrôle de l'expression comprennent des séquences d'initiation, de terminaison, promoteurs et amplificateurs de la transcription ; des signaux de traitement de l'ARN efficaces tels que les signaux d'épissage et de polyadénylation (poly A) y compris la séquence polyA de la bêta-globine de lapin ; des séquences qui stabilisent l'ARNm cytoplasmique ; des séquences qui amplifient l'efficacité de la traduction (par exemple, la séquence consensus de Kozak) ; des séquences qui amplifient la stabilité de la protéine ; et lorsque c'est souhaité des séquences qui amplifient la sécrétion du produit codé. Parmi d'autres séquences, des introns chimériques peuvent être utilisés.
Dans certains modes de réalisation, l'élément régulateur posttranscriptionnel du virus de l'hépatite de la marmotte (WPRE) (Zuffrey et al. (1999) J Virol ; 73(4): 2886-9) peut être lié de façon fonctionnelle au transgène. Un exemple de WPRE est fourni dans SEQ ID NO : 26.
Un « promoteur » est une séquence nucléotidique qui permet la liaison de l'ARN polymérase et qui dirige la transcription d'un gène. Généralement, un promoteur est localisé dans la région non codante en 5' d'un gène, en position proximale par rapport au site de départ de la transcription du gène. Les éléments des séquences au sein des promoteurs qui fonctionnent dans 1'initiation de la transcription sont souvent caractérisés par des séquences nucléotidiques consensus. Les exemples de
BE2016/5434 promoteurs comprennent, mais n'y sont pas limités, des promoteurs provenant de bactéries, de levures, de végétaux, de virus, et de mammifères (y compris des êtres humains). Un grand nombre de séquences de contrôle de l'expression, y compris des promoteurs qui sont internes, natifs, constitutifs, inductibles et/ou spécifiques des tissus, sont connus dans l'art et peuvent être utilisés.
Les exemples de promoteurs constitutifs comprennent, sans limitation, le promoteur de la TBG, le promoteur des LTR rétrovirales du virus du sarcome de Rous (éventuellement avec l'amplificateur), le promoteur du cytomégalovirus (CMV) (éventuellement avec l'amplificateur du CMV, voir, par exemple, Boshart et al., Cell, 41: 521-530 (1985)), le promoteur CASI, le promoteur du SV40, le promoteur de la dihydrofdate réductase, le promoteur de la ß-actine, le promoteur de la phosphoglycérol kinase (PGK), et le promoteur EFla ( Invitrogen) .
Dans certains modes de réalisation, le promoteur est un promoteur CASI (voir, par exemple, WO 2012/115980). Le promoteur CASI est un promoteur de synthèse qui contient une partie de l'amplificateur du CMV, une partie du promoteur de la bêta-actine du poulet et une partie de l'amplificateur UBC. Dans certains modes de réalisation, le promoteur CASI peut comprendre une séquence d'acide nucléique présentant au moins environ 90 %, au moins environ 95 %, au moins environ 96 %, au moins environ 97 %, au moins environ 98 %, au moins environ 99 %, ou plus, d'identité de séquence avec SEQ ID NO : 12. Dans certains modes de
BE2016/5434 réalisation, le promoteur comprend ou est constitué d'une séquence d'acide nucléique de SEQ ID NO : 12.
Les promoteurs inductibles permettent la régulation de l'expression des gènes et peuvent être régulés par des composés fournis de façon exogène, des facteurs environnementaux tels que la température, ou la présence d'un état physiologique spécifique, par exemple, la phase aiguë, d'un état de différenciation particulier de la cellule, ou dans des cellules en réplication uniquement. Les promoteurs inductibles et les systèmes inductibles sont disponibles auprès de diverses sources commerciales, y compris, sans limitation, Invitrogen, Clontech et Ariad. De nombreux autres systèmes ont été décrits et peuvent être facilement choisis par l'homme du métier. Par exemple, les promoteurs inductibles comprennent le promoteur de la métallothionéine (MT) du mouton inductible par le zinc (MT) et le promoteur du virus de la tumeur mammaire de la souris (MMTV) inductible par la dexaméthasone (Dex). D'autres systèmes inductibles comprennent le système du promoteur de la T7 polymérase (WO 98/10088) ; le promoteur de l'ecdysone d'insecte (No et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93: 3346-3351 (1996)), le système répressible par la tétracycline (Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89: 55475551 (1992)), le système inductible par la tétracycline (Gossen et al., Science, 378: 1766-1769 (1995), voir également Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol, 2: 512-518 (1998)). D'autres systèmes comprennent le dimère FK506, VP16 ou p65 utilisant le castradiol, le diphénol murislérone, le système inductible par
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RU486 (Wang et al., Nat. Biotech., 15: 239-243 (1997) et Wang et al., Gene Ther., 4: 432-441 (1997)) et le système inductible par la rapamycine (Magari et al., J. Clin. Invest., 100: 2865-2872 (1997)). L'efficacité de certains promoteurs inductibles augmente avec le temps. Dans de tels cas, on peut amplifier l'efficacité de ces systèmes en insérant des répresseurs multiples en tandem, par exemple, TetR lié à un TetR par un 1RES.
Dans un autre mode de réalisation, il sera utilisé le promoteur natif pour le transgène. Le promoteur natif peut être préféré lorsque l'on souhaite que l'expression du transgène mime l'expression native. Le promoteur natif peut être utilisé lorsque l'expression du transgène doit être régulée temporairement ou selon le développement, ou d'une manière spécifique du tissu, ou en réponse à des stimuli transcriptionnels spécifiques. Dans un autre mode de réalisation, d'autres éléments de contrôle de l'expression native, tels que des éléments amplificateurs, des sites de poiyadénylation ou des séquences consensus de Kozak peuvent être également utilisés pour mimer l'expression native.
Le transgène peut être lié de façon fonctionnelle à un promoteur spécifique du tissu. Par exemple, si l'expression dans le muscle squelettique est souhaitée, il devra être utilisé un promoteur actif dans le muscle Ceux-ci comprennent des promoteurs provenant de gènes codant pour la ß-actine squelettique, la chaîne légère 2A de la myosine, la dystrophine, la créatine kinase musculaire, ainsi que des promoteurs musculaires de synthèse avec des activités supérieures aux
BE2016/5434 promoteurs existant à l'état naturel (voir Li et al.,
Nat. Biotech., 17: 241-245 (1999)). Des exemples de promoteurs qui sont spécifiques des tissus sont connus pour le foie (albumine, Miyatake et al., J. Virol, 71: 5124-32 (1997) ; le promoteur du core du virus de l'hépatite B, Sandig et al., Gene Ther., 3: 1002-9 (1996) ; 1'alpha-fœtoprotéine (AFP), Arbuthnot et al.,
Hum. Gene Ther., 7: 1503-14 (1996)), 1'ostéocalcine osseuse (Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24: 185-96 (1997)) ; la sialoprotéine osseuse (Chen et al., J.
Bone Miner. Res., 11: 654-64 (1996)), les lymphocytes (CD2, Hansal et al., J. Immunol, 161: 1063-8 (1998) ;
la chaîne lourde d'immunoglobuline ; la chaîne des récepteurs des lymphocytes T) , un promoteur neuronal tel que le promoteur de l'énolase spécifique des neurones (NSE) (Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol, 13: 503-15 (1993)), le gène de la chaîne légère des neurofilaments (Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88: 5611-5 (1991)), le gène du vgf spécifique des neurones (Piccioli et al., Neuron, 15: 373-84 (1995)), entre autres.
Eventuellement, des vecteurs portant des transgènes codant pour des produits thérapeutiquement utiles ou immunogènes peuvent également comprendre des marqueurs sélectionnables ou des gènes rapporteurs qui peuvent comprendre des séquences codant pour la résistance à la généticine, 1'hygromycine ou la puromycine, entre autres. De tels rapporteurs sélectionnables ou gènes marqueurs (de préférence localisés en dehors du génome viral à encapsider dans une particule virale) peuvent être utilisés pour
BE2016/5434 signaler la présence des plasmides dans des cellules bactériennes, comme la résistance à l'ampicilline. D'autres composants du vecteur peuvent comprendre une origine de réplication.
Ces vecteurs sont produits en utilisant les techniques et les séquences fournies ici, conjointement avec des techniques connues de l'homme du métier. De telles techniques comprennent des techniques traditionnelles de clonage d'ADNc telles que celles décrites dans des textes, l'utilisation de séquences oligonucléotidiques se chevauchant des génomes d'adénovirus, la réaction en chaîne de la polymérase, et tout procédé approprié qui fournit la séquence nucléotidique souhaitée.
Agents thérapeutiques et prophylaxie
Les vecteurs recombinants basés sur le ChAdl55 sont utiles pour le transfert de gènes à un être humain ou à un mammifère non simien in vitro, ex vivo, et in vivo.
Les vecteurs adénoviraux recombinants décrits ici peuvent être utilisés en tant que vecteurs d'expression pour la production des produits codés par les transgènes hétérologues 1'adénovirus recombinant in vitro. Par incompétent exemple, pour la réplication contenant un transgène peut être transfecté dans une lignée cellulaire de complémentation comme il a été décrit ci-dessus.
Un vecteur adénoviral recombinant dérivé du ChAdl55 fournit un véhicule de transfert de gènes efficace qui peut administrer un transgène choisi à une cellule hôte choisie in vivo ou ex vivo même lorsque
BE2016/5434 obj ectifs y compris l'organisme possède des anticorps neutralisants contre un ou plusieurs sérotypes d'adénovirus. Dans un mode de réalisation, le vecteur et les cellules sont mélangés ex vivo ; les cellules infectées sont cultivées en utilisant des méthodologies traditionnelles ; et les cellules transduites sont reperfusées chez le patient. Ces techniques sont particulièrement bien adaptées à l'administration de gènes pour des thérapeutiques et pour une immunisation, l'induction d'une immunité protectrice.
Transgènes immunogènes
Les vecteurs ChAdl55 recombinants peuvent être également administrés dans des compositions immunogènes. Une composition immunogène telle que décrite ici est une composition comprenant un ou plusieurs vecteurs ChAdl55 recombinants capables d'induire une réponse immunitaire, par exemple une réponse humorale (par exemple, des anticorps) et/ou à médiation cellulaire (par exemple, des lymphocytes T cytotoxiques), contre un produit de transgène administré par le vecteur à la suite d'une administration à un mammifère, de façon appropriée un être humain. Un adénovirus recombinant peut comprendre (de façon appropriée dans l'une quelconque de ses délétions de gènes) un gène codant pour un immunogène souhaité et peut donc être utilisé dans un vaccin. Les adénovirus recombinants peuvent être utilisés en tant que vaccins prophylactiques ou thérapeutiques contre tout agent pathogène pour lequel l'antigène crucial/les antigènes cruciaux pour l'induction d'une réponse immunitaire et capables de
BE2016/5434 limiter la propagation de l'agent pathogène ont été identifiés et pour lequel l'ADNc est disponible.
De telles compositions vaccinales ou autres immunogènes peuvent être formulées dans un véhicule d'administration approprié. De façon générale, les doses pour les compositions immunogènes se situent dans les plages définies ci-dessous dans la section Procédés d'administration et dosage. Les taux d'immunité du gène choisi peuvent être suivis pour déterminer le besoin, le cas échéant, de rappels. Après l'estimation des titres en anticorps dans le sérum, des immunisations de rappel éventuelles peuvent être souhaitées.
Eventuellement, une composition vaccinale ou immunogène de 1'invention peut être formulée pour contenir d'autres composants, y compris, par exemple, des adjuvants, des stabilisants, des agents d'ajustement du pH, des conservateurs et analogues. Des exemples d'adjuvants appropriés sont fournis ci-dessous dans la section Adjuvants. Un tel adjuvant peut être administré avec un vaccin à ADN de sensibilisation codant pour un antigène pour amplifier la réponse immunitaire spécifique de l'antigène comparativement à la réponse immunitaire produite lors de la sensibilisation avec un vaccin à ADN codant pour l'antigène seul. En variante, un tel adjuvant peut être administré avec un antigène polypeptidique qui est administré dans un régime d'administration impliquant les vecteurs ChAdl55 de l'invention (tels que décrits ci-dessous dans la section Régimes d'administration).
Les adénovirus recombinants sont administrés dans une quantité immunogène, c'est-à-dire, une quantité
BE2016/5434 d'adénovirus recombinant qui est efficace dans une voie d'administration pour transfecter les cellules cibles souhaitées et pour fournir des taux d'expression suffisants du gène choisi pour induire une réponse immunitaire. Lorsqu'une immunité protectrice est fournie, les adénovirus recombinants sont considérés comme des compositions vaccinales utiles dans la prévention d'une infection et/ou d'une maladie récurrente.
On s'attend à ce que les vecteurs recombinants décrits ici soient hautement efficaces dans l'induction des lymphocytes T cytotoxiques et des anticorps dirigés contre la protéine antigénique hétérologue insérée exprimée par le vecteur.
Les immunogènes exprimés par les vecteurs de l'invention qui sont utiles pour immuniser un animal humain ou non humain contre d'autres agents pathogènes comprennent, par exemple, des bactéries, des champignons, des micro-organismes parasitaires ou des parasites multicellulaires qui infectent les vertébrés humains et non humains, ou contre une cellule cancéreuse ou une cellule tumorale. Par exemple, les immunogènes peuvent être choisis parmi diverses familles virales. Les exemples de familles virales contre lesquelles une réponse immunitaire serait souhaitable comprennent les virus respiratoires tels que le virus respiratoire syncytial (RSV) et d'autres paramyxovirus tels que le métapneumovirus humain, hMPV, et les virus para-influenza (PIV).
Les antigènes appropriés du RSV qui sont utiles en tant qu'immunogènes pour immuniser un animal humain ou
BE2016/5434 non humain peuvent être choisis parmi : la protéine de fusion (F) , la protéine de fixation (G) , la protéine matricielle (M2) et la nucléoprotéine (N) . Le terme « protéine F » ou « protéine de fusion » ou « polypeptide de la protéine F » ou « polypeptide de la protéine de fusion » se rapporte à un polypeptide ou à une protéine comportant la totalité ou une partie d'une séquence d'acides aminés d'un polypeptide de la protéine de fusion du RSV. De façon similaire, le terme « protéine G » ou « polypeptide de la protéine G » se rapporte à un polypeptide ou à une protéine comportant la totalité ou une partie d'une séquence d'acides aminés d'un polypeptide de la protéine de fixation du RSV. Le terme « protéine M » ou « protéine matricielle » ou « polypeptide de la protéine M » se rapporte à un polypeptide ou à une protéine comportant la totalité ou une partie d'une séquence d'acides aminés d'une protéine matricielle du RSV et il peut comprendre l'un ou l'autre ou les deux des produits des gènes M2-1 (qui peut être écrit ici M2.1) et M2-2. De la même façon, le terme « protéine N » ou « protéine de la nucléocapside » ou « polypeptide de la protéine N » se rapporte à un polypeptide ou à une protéine comportant la totalité ou une partie d'une séquence d'acides aminés d'une nucléoprotéine du RSV.
Deux groupes de souches du RSV humain ont été décrits, les groupes A et B, basés principalement sur des différences d'antigénicité de la glycoprotéine G. De nombreuses souches du RSV ont été isolées à ce jour, toutes étant appropriées dans le contexte des antigènes des combinaisons immunogènes divulguées ici. Les
BE2016/5434 exemples de souches indiquées par un numéro d'accession de GenBank et/ou EMBL peuvent se trouver dans la demande US publiée numéro 2010/0203071 (WO 2008114149), qui est incorporée ici en référence dans l'objectif de divulguer les séquences d'acide nucléique et polypeptidique des protéines F et G du RSV appropriées pour une utilisation dans la présente invention. Dans un mode de réalisation, la protéine F du RSV peut être un ectodomaine d'une protéine F du RSV (FATM).
Des exemples d'acides nucléiques et de séquences de protéine des protéines M et N peuvent se trouver, par exemple, dans la demande US publiée numéro 2014/0141042 (WO 2012/089833), qui est incorporée ici dans l'objectif de divulguer les séquences d'acide nucléique et polypeptidique des protéines M et N du RSV appropriées pour une utilisation dans la présente invention.
De façon appropriée, pour une utilisation dans la présente invention, un acide nucléique code pour un antigène F du RSV et les antigènes M et N du RSV. De façon plus spécifique, l'acide nucléique code pour un antigène FATM du RSV et les antigènes M2-1 et N du RSV, lorsqu'un site d'auto-clivage est incorporé entre l'antigène FATM du RSV et l'antigène M2-1 du RSV et un lieur flexible est incorporé entre les antigènes M2-1 et N du RSV. Dans un mode de réalisation, un acide nucléique approprié code pour le polypeptide représenté par SEQ ID NO : 37.
Dans un mode de réalisation, l'immunogène peut provenir d'un rétrovirus, par exemple un lentivirus tel que le virus de l'immunodéficience humaine (VIH). Dans
BE2016/5434 un tel mode de réalisation, les immunogènes peuvent être dérivés du VIH-1 ou du VIH-2.
Le génome du VIH code pour un certain nombre de protéines différentes, dont chacune peut être immunogène dans son intégralité ou sous la forme d'un fragment lors d'une expression par des vecteurs de la présente invention. Les protéines de l'enveloppe comprennent la gpl20, la gp40 et le précurseur Env gpl60, par exemple. Les protéines non-enveloppe du VIH comprennent, par exemple, des protéines structurales internes telles que les produits des gènes gag et pol et d'autres protéines non structurales telles que Rev, Nef, Vif et Tat. Dans un mode de réalisation, le vecteur de l'invention code pour un ou plusieurs polypeptides comprenant Gag du VIH.
Le gène Gag est traduit sous la forme d'une polyprotéine précurseur qui est clivée par une protéase pour produire des produits qui comprennent la protéine matricielle (pl7), la capside (p24), la nucléocapside (p9) , p6 et deux peptides d'espace, p2 et pl, tous étant des exemples de fragments de Gag.
Le gène Gag donne naissance à la protéine précurseur de Gag de 55 kilodaltons (kD) , également appelée p55, qui est exprimée à partir de 1'ARNm viral non épissé. Durant la traduction, l'extrémité Nterminale de p55 est myristoylée, déclenchant son association avec l'aspect cytoplasmique des membranes cellulaires. La polyprotéine Gag associée à la membrane recrute deux copies de 1'ARN génomique viral accompagnées d'autres protéines virales et cellulaires, ce qui déclenche le bourgeonnement de la particule
BE2016/5434 toutes étant des
Dans un mode de virale à partir de la surface d'une cellule infectée. Après le bourgeonnement, p55 est clivée par la protéase codée par le virus (un produit du gène pol) durant le processus de maturation virale en quatre protéines plus petites nommées MA (matrice [pl7]), CA (capside [p24]), NC (nucléocapside [p9]), et p6, exemples de fragments de Gag.
réalisation, les vecteurs de la présente invention comprennent un polypeptide Gag de SEQ ID NO : 38.
Adj uvants
Un « adjuvant » tel qu'utilisé ici se rapporte à une composition qui amplifie la réponse immunitaire à un immunogène. Les exemples de tels adjuvants comprennent, mais n'y sont pas limités, des adjuvants inorganiques (par exemple, des sels de métaux inorganiques tels que le phosphate d'aluminium ou 1'hydroxyde d'aluminium), des adjuvants organiques (par exemple, des saponines, telles que QS21, ou le squalène), des adjuvants à base d'huiles (par exemple, l'adjuvant complet de Freund et l'adjuvant incomplet de Freund), des cytokines (par exemple, IL-lß, IL-2, IL-7,
IL-12, IL-18, particulaires immunostimulants
GM-CFS, et INF-γ) , des adjuvants (par exemple, des complexes (ISCOM), des liposomes, ou des microsphères biodégradables), des virosomes, des adjuvants bactériens (par exemple, le monophosphoryllipide A, tels que le monophosphoryl-lipide A 3-dés-Oacylé (3D-MPL), ou les muramyl-peptides), des adjuvants de synthèse (par exemple, des copolymères séquencés non ioniques, des analogues de muramyl-peptides, ou un lipide A de synthèse), des adjuvants polynucléotidiques
BE2016/5434 de synthèse (par exemple, la polyarginine ou la polylysine) et des oligonucléotides immunostimulants contenant des dinucléotides CpG non méthylés (« CpG »).
Un adj uvant approprié est le monophosphoryl-
lipide A (MPL), en particulier le monophosphoryl-
lipide A 3-dés-O- acylé (3D-MPL). D ' un point de vue
chimique, il est souvent fourni sous la forme d'un
mélange de monophosphoryl-lipide A 3-dés-O-acylé avec soit 4 soit 5 soit 6 chaînes acylées. Il peut être purifié et préparé par les procédés enseignés dans le document GB 2122204B, laquelle référence divulgue également la préparation de diphosphoryl-lipide A, et de ses variants 3-O-désacylés. D'autres lipopolysaccharides purifiés et de synthèse ont été décrits (brevet US No. 6 005 099 et EP 0 729 473 B1 ; Hilgers et al., 1986, Int. Arch. Allergy. Immunol., 79(4): 392-6 ; Hilgers et al., 1987, Immunology, 60(1): 141-6 ; et EP 0 549 074 Bll).
Les saponines sont également des adjuvants appropriés (voir Lacaille-Dubois, M and Wagner H, A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedecine vol 2 pp 363-386 (1996)). Par exemple, la saponine Quil A (dérivée de l'écorce de l'arbre d'Amérique latine Quillaja Saponaria Molina), et ses fractions, sont décrites dans le brevet US No. 5 057 540 et Kensil, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 1996, 12: 1-55 ; et EP 0 362 279 B1. Des fractions purifiées de Quil A sont également connues en tant qu ' immunostimulants, comme QS21 et QS17 ; des procédés pour leur production sont divulgués dans le brevet US No. 5 057 540 et EP 0 362 279 B1. Est
BE2016/5434 également décrit dans ces références QS7 (une fraction non hémolytique de Quil-A). L'utilisation de QS21 est en outre décrite dans Kensil et al. (1991, J. Immunology, 146: 431-437). Des combinaisons de QS21 et de polysorbate ou de cyclodextrine sont également connues (WO 99/10008). Des systèmes d'adjuvants particulaires comprenant des fractions de QuilA, comme QS21 et QS7, sont décrits dans les documents WO 96/33739 et WO 96/11711.
Un autre adjuvant est un oligonucléotide immunostimulant contenant des dinucléotides CpG non méthylés (« CpG ») (Krieg, Nature 374: 546 (1995)). CpG est une abréviation pour des motifs dinucléotidiques de cytosine-guanosine présents dans l'ADN. CpG est connu en tant qu'adjuvant lorsqu'il est administré par les voies à la fois systémique et mucosale (WO 96/02555, EP 468520, Davis et al., J. Immunol, 1998, 160: 870876 ; McCluskie and Davis, J. Immunol., 1998, 161: 4463-6) . CpG, lorsqu'il est formulé dans des vaccins, peut être administré en solution libre conjointement avec l'antigène libre (WO 96/02555) ou conjugué de façon covalente à un antigène (WO 98/16247), ou formulé avec un support tel que 1'hydroxyde d'aluminium (Brazolot-Millan et al., Proc. Natl. Acad. Sei., EtatsUnis, 1998, 95: 15553-8) .
Des adjuvants tels que ceux décrits ci-dessus peuvent être formulés conjointement avec des supports, tels que des liposomes, des émulsions huile dans l'eau, et/ou des sels métalliques (y compris des sels d'aluminium tels que 1'hydroxyde d'aluminium). Par exemple le 3D-MPL peut être formulé avec de 1'hydroxyde
BE2016/5434 d'aluminium (EP 0 689 454) ou des émulsions huile dans l'eau (WO 95/17210) ; QS21 peut être formulé avec des liposomes contenant du cholestérol (WO 96/33739), des émulsions huile dans l'eau (WO 95/17210) ou de l'alun (WO 98/15287) ; le CpG peut être formulé avec de l'alun (Brazolot-Millan, ci-dessus) ou avec d'autres supports cationiques.
Des combinaisons d'adjuvants peuvent être utilisées dans la présente invention, en particulier une combinaison d'un monophosphoryl-lipide A et d'un dérivé de saponine (voir, par exemple, les documents
WO 94/00153 ; WO 95/17210 ; WO 96/33739 ; WO 98/56414 ; WO 99/12565 ; WO 99/11241), plus particulièrement la combinaison de QS21 et de 3D-MPL telle que divulguée dans le document WO 94/00153, ou une composition où le QS21 est neutralisé dans des liposomes contenant du cholestérol (DQ) telle que divulguée dans le document WO 96/33739. En variante, une combinaison de CpG plus une saponine telle que QS21 est un adjuvant approprié pour une utilisation dans la présente invention. Une formulation d'adjuvant puissante impliquant du QS21, du 3D-MPL et du tocophérol dans une émulsion huile dans l'eau est décrite dans le document WO 95/17210 et est une autre formulation pour une utilisation dans la présente invention. Les adjuvants de saponines peuvent être formulés dans un liposome et combinés avec un oligonucléotide immunostimulant. Ainsi, les systèmes adjuvants appropriés comprennent, par exemple, une combinaison de monophosphoryl-lipide A, de préférence du 3D-MPL, conjointement avec un sel d'aluminium (par exemple, comme il est décrit dans le document
BE2016/5434
WO 00/23105) . Un autre exemple d'adjuvant comprend du QS21 et/ou ou du MPL et/ou du CpG. Le QS21 peut être neutralisé dans des liposomes contenant du cholestérol comme il est divulgué dans le document WO 96/33739.
D'autres adjuvants appropriés comprennent des phosphates d'alkyl-glucosaminide (AGP) tels que ceux divulgués dans le document WO 9850399 ou le brevet US No. 6 303 347 (des procédés de préparation d'AGP sont également divulgués), ou des sels pharmaceutiquement acceptables d'AGP tels que divulgués dans le brevet US No. 6 764 840. Certains AGP sont des agonistes de TLR4, et certains sont des antagonistes de TLR4. On pense que les deux sont utiles en tant qu'adjuvants.
Il a été découvert (WO 2007/062656, lequel a été publié en tant que US 2011/0293704 et est incorporé en référence dans l'objectif de divulguer des séquences de chaînes invariantes) que la fusion de la chaîne invariante à un antigène qui est compris par un système d'expression utilisé pour une vaccination augmente la réponse immunitaire contre ledit antigène, si elle est administrée avec un adénovirus. Par conséquent, dans un mode de réalisation de l'invention, le transgène immunogène peut être coexprimé avec une chaîne invariante dans un vecteur viral ChAdl55 recombinant.
Dans un autre mode de réalisation, l'invention fournit l'utilisation de la capside (éventuellement, une particule virale recombinante ou une capside vide est utilisée) pour induire une réponse à effet immunomodulateur, ou pour amplifier ou adjuver une réponse des lymphocytes T cytotoxiques contre un autre agent actif par du ChAdl55 intacte ou
BE2016/5434 l'administration d'une capside de ChAdl55 à un sujet. La capside du ChAdl55 peut être administrée seule ou dans un régime combiné avec un agent actif pour amplifier la réponse immunitaire contre celle-ci. De façon avantageuse, l'effet souhaité peut être obtenu sans infecter l'hôte avec un adénovirus.
Régimes d'administration
De façon commune, les vecteurs adénoviraux recombinants ChAdl55 seront utilisés pour l'administration de molécules thérapeutiques ou immunogènes (comme des protéines). Il sera facilement compris pour les deux applications, que les vecteurs adénoviraux recombinants de 1'invention sont particulièrement bien adaptés à une utilisation dans des régimes impliquant une administration répétée de vecteurs adénoviraux recombinants. De tels régimes impliquent généralement l'administration d'une série de vecteurs viraux dans laquelle les capsides virales sont alternées. Les capsides virales peuvent être changées pour chaque administration subséquente, ou après un nombre préchoisi d'administrations d'une capside d'un sérotype particulier (par exemple, une, deux, trois, quatre ou plus). Ainsi, un régime peut impliquer l'administration d'un adénovirus recombinant avec une première capside, l'administration avec un adénovirus recombinant avec une deuxième capside, et l'administration avec un adénovirus recombinant avec une troisième capside. Divers autres régimes qui utilisent les capsides d'adénovirus de l'invention seules, en combinaison avec une autre, ou en combinaison avec d'autres adénovirus (qui de préférence
BE2016/5434 ne présentent aucune réactivité croisée immunologique) seront évidents pour l'homme du métier. Eventuellement, un tel régime peut impliquer l'administration d'un adénovirus recombinant avec des capsides d'autres adénovirus de primates non humains, d'autres adénovirus d'êtres humains, ou des séquences artificielles telles que celles décrites ici.
Les vecteurs adénoviraux de 1 ' invention sont particulièrement bien adaptés à des régimes thérapeutiques dans lesquels des administrations multiples médiées par des adénovirus de transgènes sont souhaitées, par exemple, dans des régimes impliquant une nouvelle administration du même transgène ou dans des régimes combinés impliquant l'administration d'autres transgènes. De tels régimes peuvent impliquer l'administration d'un vecteur adénoviral ChAdl55, dans lesquels la source des séquences de la capside adénovirale du vecteur administré dans la première administration diffère de la source des séquences de la capside adénovirale du vecteur viral utilisé dans une ou plusieurs des administrations subséquentes. Par exemple, un régime thérapeutique implique l'administration d'un vecteur ChAdl55 et une administration répétée avec un ou plusieurs vecteurs adénoviraux du même sérotype ou de sérotypes différents
Dans un autre exemple, un régime thérapeutique implique l'administration d'un vecteur adénoviral suivie de l'administration répétée avec un vecteur ChAdl55 qui a une capside qui diffère de la source de la capside dans le premier vecteur adénoviral administré, et éventuellement en outre l'administration
BE2016/5434 avec un autre vecteur qui est le même ou, de préférence, qui diffère de la source de la capside adénovirale du vecteur dans les étapes d'administration antérieures. Ces régimes ne sont pas limités à l'administration de vecteurs adénoviraux construits en utilisant les séquences du ChAdl55. Plutôt, ces régimes peuvent facilement utiliser d'autres séquences adénovirales, y compris, sans limitation, d'autres séquences adénovirales y compris d'autres séquences adénovirales de primates non humains, ou d'autres séquences adénovirales d'êtres humains, en combinaison avec les vecteurs ChAdl55.
Dans un autre exemple, un régime thérapeutique peut impliquer l'administration soit simultanée (comme une coadministration) soit séquentielle (comme une sensibilisation-rappel) (i) d'un ou de plusieurs vecteurs adénoviraux ChAdl55 et (il) d'un autre composant comme des vecteurs non adénoviraux, des vecteurs non viraux, et/ou divers autres composés ou molécules thérapeutiquement utiles comme des protéines antigéniques administrées éventuellement simultanément avec l'adjuvant. Les exemples de coadministration comprennent la coadministration homolatérale et la coadministration controlatérale (décrite en outre cidessous dans la section Procédés d'administration et dosage).
Les vecteurs non adénoviraux appropriés pour une utilisation dans une administration simultanée ou particulièrement dans une administration séquentielle (comme une sensibilisation-rappel) avec un ou plusieurs vecteurs adénoviraux ChAdl55 comprennent un ou
BE2016/5434 plusieurs vecteurs poxviraux. De façon appropriée, le vecteur poxviral appartient à la sous-famille des chordopoxvirinés, de façon plus appropriée à un genre dans ladite sous-famille choisi dans le groupe constitué des virus orthopox, parapox, yatapox, avipox (de façon appropriée canarypox (ALVAC) ou fowlpox (FPV)) et molluscipox. De façon même davantage appropriée, le vecteur poxviral appartient aux virus orthopox et est choisi dans le groupe constitué du virus de la vaccine, le NYVAC (dérivé de la souche Copenhague de la vaccine), la vaccine Ankara modifiée (MVA), le cowpoxvirus et le virus monkeypox. De la façon la plus appropriée, le vecteur poxviral est le MVA.
Une administration « simultanée » se rapporte de façon appropriée à la même réponse immunitaire en cours. De préférence, les deux composants sont administrés en même temps (comme l'administration simultanée à la fois d'ADN et de protéines), toutefois, un composant pourra être administré à quelques minutes (par exemple, lors du même rendez-vous médical ou de la même visite à un docteur), à quelques heures. Une telle administration est également appelée coadministration. Dans certains modes de réalisation, la coadministration peut se rapporter à l'administration d'un vecteur adénoviral, d'un adjuvant et d'un composant protéinique. Dans d'autres modes de réalisation, la coadministration se rapporte à l'administration d'un vecteur adénoviral et d'un autre vecteur viral, par exemple un second vecteur adénoviral ou un poxvirus tel que le MVA. Dans d'autres modes de réalisation, la coadministration se rapporte à
BE2016/5434 l'administration d'un vecteur adénoviral et d'un composant protéinique, qui est éventuellement adjuvé.
Un régime de sensibilisation-rappel peut être utilisé. Sensibilisation-rappel se rapporte à deux réponses immunitaires distinctes : (i) une sensibilisation initiale du système immunitaire suivie (ii) d'une sensibilisation secondaire ou d'un rappel du système immunitaire de nombreuses semaines ou de nombreux mois après que la réponse immunitaire primaire a été établie.
Un tel régime peut impliquer l'administration d'un vecteur ChAdl55 recombinant pour sensibiliser le système immunitaire à une seconde administration,
rappel, avec un antigène traditionnel, comme une
protéine (éventuellement coadministrée avec un
adjuvant) , ou d'un virus recombinant portant les
séquences codant pour un tel antigène (par exemple, WO 00/11140). En variante, un régime d'immunisation peut impliquer l'administration d'un vecteur ChAdl55 recombinant pour activer la réponse immunitaire contre un vecteur (soit viral soit à base d'ADN) codant pour un antigène. Dans une autre variante, un régime d'immunisation implique l'administration d'une protéine suivie d'un rappel avec un vecteur ChAdl55 recombinant codant pour l'antigène. Dans un exemple, le régime de sensibilisation-rappel peut fournir une réponse immunitaire protectrice contre le virus, la bactérie ou un autre organisme à partir duquel l'antigène est dérivé. Dans un autre mode de réalisation, le régime de sensibilisation-rappel fournit un effet thérapeutique qui peut être mesuré en utilisant des tests
BE2016/5434 traditionnels pour la détection de la présence de l'affection pour laquelle le traitement est administré.
De préférence, une composition de rappel est administrée environ 2 à environ 27 semaines après l'administration de la composition de sensibilisation au sujet. L'administration de la composition de rappel est accomplie en utilisant une quantité efficace d'une composition de rappel contenant ou capable d'administrer le même antigène ou un antigène différent de celui administré par le vaccin de sensibilisation. La composition de rappel peut être composée d'un vecteur viral recombinant dérivé de la même source virale ou d'une autre source.
En variante, la composition de rappel peut être une composition contenant le même antigène que celui codé dans le vaccin de sensibilisation, mais sous la forme d'une protéine, laquelle composition induit une réponse immunitaire chez l'hôte. Les exigences principales de la composition de rappel sont que l'antigène de la composition est le même antigène, ou un antigène présentant une réactivité croisée, comme celui codé par la composition de sensibilisation.
Procédés d'administration et dosage
Le vecteur peut être préparé pour une administration en suspension ou dissous dans un support pharmaceutiquement ou physiologiquement acceptable tel que le sérum physiologique ; une solution de sels isotoniques ou d'autres formulations qui seront évidentes pour l'homme du métier. Le support approprié sera évident pour l'homme du métier et dépendra en grande partie de la voie d'administration. Les
BE2016/5434 compositions décrites ici peuvent être administrées à
un mammifère dans une formulation à libération
prolongée en utilisant un polymère biocompatible
biodégradable, ou par une administration au site en
utilisant des micelles, des gels et des liposomes.
Dans certains modes de réalisation, 1'adénovirus recombinant de l'invention est administré à un sujet par une injection intramusculaire, une injection intravaginale, une injection intraveineuse, une injection intrapéritonéale, une injection sous-cutanée, une administration épicutanée, une administration
intradermique, une administration nasale ou une
administration orale.
Si le régime thérapeutique implique la
coadministration d'un ou de plusieurs vecteurs adénoviraux ChAdl55 et d'un autre composant, chacun formulé dans des compositions différentes, ils sont administrés de façon favorable de manière colocalisée au niveau ou près du même site. Par exemple, les composants peuvent être administrés (par exemple, par une voie d'administration choisie parmi intramusculaire,
transdermique, intradermique, sous-cutanée) du même
côté ou à la même extrémité (administration
« colatérale ») i ou à des côtés ou des extrémités
opposés (administration « controlatérale »).
Les dosages du vecteur viral dépendront principalement de facteurs tels que l'affection traitée, l'âge, le poids et l'état de santé du patient, et ils peuvent ainsi varier parmi les patients. Par exemple, un dosage thérapeutiquement efficace pour un être humain adulte ou en médecine vétérinaire du vecteur
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viral contient généralement 1 X 105 à 1 x 1015
particules virales, , comme de 1 X 10 8 à 1 x 1012 (par
exemple, 1 x 108, 2 ,5 x 108, 5 x 108 1 x 109, 1,5 x 109,
2,5 x 109, 5 x 109, , 1 x 1010, 1,5 X 1010, 2 , 5 x 1010,
5 x 1010, 1 x 1011, 1,5 x 1011, 2 ,5 x 1011, 5 x 1011,
1 x 1012 particules) En variante, un vecteur viral
peut être administré dans une dose qui est généralement de 1 x 105 à 1 x 1010 unités formant une plaque (PFU) ,
comme 1 x 105 PFU, 2,5 X 105 PFU, 5 X 105 PFU,
1 x 10 6 PFU, 2,5 x 106 PFU, 5 x 106 PFU, 1 X 107 PFU,
2,5 x 107 PFU, 5 x 107 PFU, 1 X 108 PFU, 2,5 X 108 PFU,
5 x 10 8 PFU, 1 x 109 PFU, 2,5 X 109 PFU, 5 x 109 PFU , ou
x 1010 PFU. Les dosages varieront selon la taille de l'animal et la voie d'administration. Par exemple, un dosage approprié pour un être humain ou en médecine vétérinaire (pour un animal d'environ 80 kg) pour une injection intramusculaire se situe dans la plage d'environ 1 x 109 à environ 5 x 1012 particules par ml, pour un seul site. Eventuellement, il peut être utilisé des sites multiples d'administration. Dans un autre exemple, un dosage approprié pour un être humain ou en médecine vétérinaire peut se situer dans la plage d'environ 1 x 1011 à environ 1 x 1015 particules pour une formulation orale.
Le vecteur viral peut être quantifié par une analyse par PCR quantitative (Q-PCR), par exemple avec des amorces et une sonde conçues sur une région du promoteur du CMV en utilisant une courbe d'étalonnage de dilutions en série de l'ADN plasmidique contenant le génome du vecteur avec une cassette d'expression comprenant le promoteur du HCMV. Le nombre de copies
BE2016/5434 dans l'échantillon à tester est déterminé par le procédé d'analyse des droites parallèles. Des variantes de procédés pour la quantification des particules du vecteur peuvent être la CLHP analytique ou un procédé spectrophotométrique basé sur 1Ά260 nm.
Une quantité immunologiquement efficace d'un acide nucléique peut se situer de façon appropriée entre 1 ng et 100 mg. Par exemple, une quantité appropriée peut être de 1 pg à 100 mg. Une quantité appropriée de l'acide nucléique particulier (par exemple, du vecteur) peut être facilement déterminée par l'homme du métier. Les exemples de quantité efficace d'un composant d'acide nucléique peuvent se situer entre 1 ng et 100 pg, comme entre 1 ng et 1 pg (par exemple, 100 ng à pg) , ou entre 1 pg et 100 pg, comme 10 ng, 50 ng, 100 ng, 150 ng, 200 ng, 250 ng, 500 ng, 750 ng, ou 1 pg Les quantités efficaces d'un acide nucléique peuvent également comprendre de 1 pg à 500 pg, comme entre 1 pg et 200 pg, comme entre 10 et 100 pg, par exemple 1 pg, pg, 5 pg, 10 pg, 20 pg, 50 pg, 75 pg, 100 pg, 150 pg, ou 200 pg. En variante, un exemple de quantité efficace d'un acide nucléique peut se situer entre 100 pg et
1 mg, comme de 100 pg à 500 pg, par exemple, 100
150 pg , 200 HU, 250 HU, 300 pg, 400 pg , 500 pg, 600
7 0 0 pg , 800 900 pg ou 1 mg.
Généralement, une dose humaine sera dans un volume situé entre 0,1 ml et 2 ml. Ainsi, la composition décrite ici peut être formulée dans un volume de, par exemple, 0,1, 0,15, 0,2, 0,5, 1,0, 1,5 ou 2,0 ml de dose humaine par composant individuel ou composants immunogènes combinés.
100
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L'homme du métier peut ajuster ces doses, selon la voie d'administration et l'application thérapeutique ou vaccinale pour laquelle le vecteur recombinant est employé. Les taux d'expression du transgène, ou pour un adjuvant, le taux d'anticorps circulants, peuvent être surveillés pour déterminer la fréquence d'administration des doses.
Si une ou plusieurs étapes de sensibilisation et/ou de rappel sont utilisées, cette étape peut comprendre une dose unique qui est administrée toutes les heures, tous les jours, toutes les semaines ou tous les mois, ou tous les ans. A titre d'exemple, des mammifères peuvent recevoir une ou deux doses contenant entre environ 10 pg et environ 50 pg de plasmide dans un support. La quantité ou le site d'administration est choisi de façon souhaitable en se basant sur l'identité et la condition du mammifère.
Les taux thérapeutiques de, ou le taux de réponse immunitaire contre, la protéine codée par le transgène choisi peuvent être surveillés pour déterminer le besoin, le cas échéant, de rappels. A la suite de l'estimation de la réponse des lymphocytes T CD8+, ou éventuellement, des titres en anticorps, dans le sérum, des immunisations de rappel éventuelles peuvent être souhaitées. Eventuellement, les vecteurs ChAdl55 recombinants peuvent être administrés en une seule administration ou dans divers régimes de combinaison, par exemple, en combinaison avec un régime ou un cours de traitement impliquant d'autres principes actifs ou dans un régime de sensibilisation-rappel.
101
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La présente invention va être en outre à présent décrite au moyen des exemples non limitatifs suivants.
Exemples décrire
Exemple 1 - Isolement du ChAdl55
L'adénovirus de chimpanzé du type 155 de type sauvage (ChAdl55) a été isolé à partir d'un jeune chimpanzé en bonne santé logé dans l'établissement du New Iberia Research Center (New Iberia Research Center ; The University of Louisiana à Lafayette) en utilisant des procédures classiques telles que décrites dans Colloca et al. (2012) et le document WO 2010086189, qui est incorporé ici en référence dans l'objectif de techniques d'isolement et de les caractérisation d'adénovirus.
Exemple 2 - Construction du vecteur ChAdl55
Le génome viral du ChAdl55 a été ensuite cloné dans un plasmide ou dans un vecteur BAC et ensuite modifié (figure 2) pour réaliser les modifications suivantes dans différentes régions du génome viral du ChAdl55 :
a) délétion de la région El (de la pb 449 à la pb 3529) du génome viral ;
b) délétion de la région E4 (de la pb 34731 à la pb 37449) du génome viral ;
c) insertion de l'orf6 de E4 dérivé de l'Ad5 humain.
2.1 - Délétion de la région El : construction de BAC/ChAdl55 ΔΕ1 TetO hCMV RpsL-Kana No. 1375
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Le génome viral du ChAdl55 a été cloné dans un vecteur BAC par recombinaison homologue dans des cellules compétentes pour 1 ' électroporation de la souche BJ5183 d'E. coli (Stratagene, No. de catalogue 2000154) cotransformées avec l'ADN viral du ChAdl55 et le vecteur BAC navette du sous-groupe C (No. 1365) . Comme il est montré sur le schéma de la figure 3, le vecteur navette du sous-groupe C est un vecteur BAC dérivé de pBeloBACll (GenBank U51113, NEB) et qui est dédié au clonage de ChAd appartenant à l'espèce C et qui contient donc le gène pIX et des fragments d'ADN dérivés des extrémités de droite et de gauche (y compris les ITR de droite et de gauche) des virus ChAd de l'espèce C.
Le vecteur BAC navette de l'espèce C contient également une cassette RpsL-Kana insérée entre l'extrémité de gauche et le gène pIX. En outre, une cassette de sélection Amp-LacZ-SacB, flanquée par des sites de restriction IScel, est présente entre le gène pIX et l'extrémité de droite du génome viral. En particulier, le vecteur BAC navette comprenait les caractéristiques suivantes : ITR de gauche : pb 27 à 139, cassette hCMV(tetO) RpsL-Kana : pb 493 à 3396, gène pIX : pb 3508 à 3972, sites de restriction IScel : pb 3990 et 7481, cassette de sélection Amp-LacZ-SacB : pb 4000 à 7471, ITR de droite : pb 7805 à 7917.
Des cellules BJ5183 ont été cotransformées par électroporation avec de l'ADN viral purifié de ChAdl55 et le vecteur BAC navette du sous-groupe C digéré avec l'enzyme de restriction IScel et ensuite purifié à partir de gel. La recombinaison homologue survenant
103
BE2016/5434 entre le gène pIX et les séquences ITR de droite (présentes aux extrémités de 1'ADN linéarisé du vecteur BAC navette de l'espèce C) et des séquences homologues présentes dans l'ADN viral du ChAdl55 mènent à l'insertion de l'ADN génomique viral du ChAdl55 dans le vecteur BAC navette. En même temps, la région virale El a été délétée et substituée par la cassette RpsL-Kana, produisant BAC/ChAdl55 ΔΕ1/ TetO hCMV RpsL-Kana No. 1375.
2.2 - Construction de plasmides par recombinaison homologue dans E. coli BJ5183
2.2.1 - Délétion de la région E4 : construction de pChAdl55 ΔΕ1, E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV RpsL-Kana (No. 1434)
Pour améliorer la propagation du vecteur, une délétion de la région E4 couvrant les nucléotides 34731 à 37449 (séquence de type sauvage du ChAdl55) a été introduite dans le squelette du vecteur en remplaçant la région E4 native par la séquence codante de l'orf6 de E4 de l'Ad5 en utilisant une stratégie impliquant plusieurs étapes de clonage et de recombinaison homologue dans E. coli. La région codante de E4 a été complètement délétée alors que le promoteur natif et le signal de polyadénylation de E4 ont été conservés. Dans cet objectif, un vecteur navette a été construit pour permettre l'insertion de l'orf6 de l'Ad5 en remplaçant la région E4 native du ChAdl55 par une recombinaison homologue dans E. coli BJ5183 comme il est détaillé cidessous .
Construction de pARS espèce C Ad5E4orf6-l
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Un fragment d'ADN contenant l'orf6 de 1'Ad5 a été obtenu par PCR en utilisant 1'ADN de 1'Ad5 en tant que matrice, avec les oligonucléotides 5'-ATACGGACTAGTGGAG AAGTACTCGCCTACATG-3' (SEQ ID NO : 13) et 5'-ATACGGAAGAT CTAAGACTTCAGGAAATATGACTAC-3' (SEQ ID NO : 14). Le fragment de PCR a été digéré avec BglII et Spel et cloné dans le vecteur navette de l'espèce C RLD-EGFP digéré avec BglII et Spel, produisant le plasmide pARS espèce C Ad5orf6-1. Des détails concernant le vecteur navette peuvent être trouvés dans Colloca et al., Sei. Transi. Med. (2012) 4: 115ra.
Construction de pARS espèce C Ad5E4orf6-2
Pour déléter la région E4, un fragment d'ADN de 177 pb couvrant la pb 34586 à la pb 34730 de la séquence de type sauvage du ChAdl55 (SEQ ID NO : 10) a été amplifié par PCR en utilisant le plasmide BAC/ChAdl55 AEl_TetO hCMV RpsL-Kana (No. 1375) comme matrice avec les oligonucléotides suivants : 5'-ATTCAGT GTACAGGCGCGCCAAAGCATGACGCTGTTGATTTGATTC-3' (SEQ ID NO : 15) et 5'-ACTAGGACTAGTTATAAGCTAGAATGGGGCT
TTGC-3' (SEQ ID NO : 16). Le fragment de PCR a été
digéré avec BsrGI et Spel et cloné dans pARS SOUS-
groupe C Ad5orf6-1 digéré avec BsrGI et Spel,
produisant (No. 1490) le plasmide pARS espèce C Ad5orf6-2 Un diagramme schématique de ce plasmide navette est fourni sur la figure 4. En particulier, le plasmide navette comprenait les caractéristiques suivantes : ITR de gauche : pb 1 à 113, 460 premières pb de l'espèce C : pb 1 à 460, ChAdl55 de type sauvage (pb 34587 à pb 34724 de SEQ ID NO : 10) : pb 516 à 650, orf6 d'Ad5 : pb 680 et 1561, 393 dernières pb de
105
BE2016/5434 l'espèce C : pb 1567 à 1969, ITR de droite : pb 1857 à 1969.
Construction de pChAdl55 ΔΕ1, E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV RpsL-Kana (No. 1434)
Le plasmide résultant pARS sous-groupe C Ad5orf6-2 a été ensuite utilisé pour remplacer la région E4 au sein du squelette du ChAdl55 par l'orf6 de l'Ad5. Dans cet objectif, le plasmide BAC/ChAdl55 AEl_TetO hCMV RpsL-Kana (No. 1375) a été digéré avec Pacl/Pmel et cotransformé dans des cellules BJ5183 avec le plasmide pARS sous-groupe C Ad5orf6-2 BsrGI/AscI digéré, pour obtenir le plasmide pré-adéno pChAdl55 ΔΕ1, E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV RpsL-Kana (No. 1434) .
2.2.2 - Insertion d'une cassette d'expression du RSV : construction de pChAdl55 ΔΕ1, E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV RSV
Une cassette du RSV a été clonée dans un vecteur accepteur pré-adéno linéarisé par recombinaison homologue dans E. coli en exploitant l'homologie existant entre le promoteur du HCMV et les séquences polyA de la BGH. Le plasmide pvjTetOhCMV-bghpolyA_RSV a été clivé avec Sfil et Spel pour exciser le fragment de 4,65 kb contenant le promoteur du HCMV avec tetO, le RSV et la séquence polyA de la BGH. Le fragment résultant de 4,65 kb du RSV a été cloné par recombinaison homologue dans le vecteur accepteur pChAdl55 ΔΕ1, E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV RpsL-Kana (No. 1434) portant la cassette de sélection RpsL-Kana sous le contrôle du HCMV et de la pA de BGH. Le plasmide pré-adéno accepteur a été linéarisé avec l'endonucléase de restriction SnaBI. La construction
106
BE2016/5434 pChAdl55 ΔΕ1,
BAC par génie résultante était le vecteur E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV RSV (figure 5)
2.3 - Construction du vecteur génétique médié par recombinaison
2.3.1 - Délétion de la région E4 : construction de BAC/ChAdl55 ΔΕ1, E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV RpsL-Kana No. 1390
Une délétion de la région E4 couvrant les nucléotides 34731 à 37449 de la séquence du ChAdl55 de type sauvage a été introduite dans le squelette du vecteur en remplaçant cette région E4 native par la séquence codante de l'orfö de E4 de l'Ad5 en utilisant une stratégie impliquant deux étapes différentes de génie génétique médié par recombinaison dans des cellules compétentes d'E. coli SW102.
La première étape a abouti à l'insertion d'une cassette de sélection comprenant le gène suicide SacB, le gène de résistance l'ampicilline et lacZ (cassette de sélection Amp-LacZ-SacB) dans la région E4 du ChAdl55, dans l'objectif d'une sélection positive/ négative des recombinants.
Première étape - Substitution de la région E4 native du ChAdl55 par la cassette de sélection AmpLacZ-SacB
La cassette de sélection Amp-LacZ-SacB a été amplifiée par PCR en utilisant les oligonucléotides fournis ci-dessous contenant des séquences flanquant E4 pour permettre une recombinaison homologue : 1021 - FW E4 Del Stepl (5'-TTAATAGACACAGTAGCTTAATAGACCCAGTAGTGCAA AGCCCCATTCTAGCTTATAACCCCTATTTGTTTATTTTTCT-3') (SEQ ID NO : 17) et 1022 - RW E4 Del Stepl (5'-ATATATAC
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TCTCTCGGCACTTGGCCTTTTACACTGCGAAGTGTTGGTGCTGGTGCTGCGTTGA
GAGATCTTTATTTGTTAACTGTTAATTGTC-3') (SEQ ID NO : 18).
Le produit de PCR a été utilisé pour transformer des cellules compétentes d'E. Coli SW102 contenant le plasmide pAdéno BAC/ChAdl55 (DE1) tetO hCMV - RpsLKana No. 1375. La transformation des cellules SW102 a permis l'insertion de la cassette de sélection dans la région E4 du ChAdl55 par l'intermédiaire d'une recombinaison homologue médiée par lambda (λ) Red, obtenant ainsi BAC/ChAdl55 (DEI) TetOhCMV - RpsL Kana No. 1379 (y compris la cassette Amp-LacZ-SacB par substitution de la région E4 native du ChAdl55).
Seconde étape - Substitution de la cassette de sélection Amp-lacZ-SacB par la région de l'orf6 de E4 de 1'Ad5
Le plasmide résultant BAC/ChAdl55 (DE1) TetOhCMV RpsL Kana No. 1379 (avec la cassette Amp-LacZ-SacB à la place de la région E4 du ChAdl55) a été ensuite manipulé pour remplacer la cassette de sélection AmplacZ-SacB par l'orf6 d'Ad5 au sein du squelette du ChAdl55. Dans cet objectif, un fragment d'ADN contenant la région de l'orf6 d'Ad5 a été obtenu par PCR, en utilisant les oligonucléotides 1025 - FW E4 Del Step2 (5'-TTAATAGACACAGTAGCTTAATA-3') (SEQ ID NO : 19) et 1026 - RW E4 Del Step2 (5' -GGAAGGGAGTGTCTAGTGTT-3') (SEQ ID NO : 20) . Le fragment d'ADN résultant a été introduit dans des cellules compétentes d'E. coli SW102 contenant le plasmide pAdéno BAC/ChAdl55 (DE1) TetOhCMV - RpsL Kana No. 137 9, aboutissant à un plasmide final BAC/ChAdl55 (ΔΕΙ, E4 Ad5E4orf6)
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TetOhCMV - RpsL Kana No. 1390 contenant l'orf6 d'Ad5 substituant la région E4 native du ChAdl55.
2.3.2 - Insertion d'une cassette d'expression du RSV : construction de BAC/ChAdl55 ΔΕΙ, E4_Ad5E4orf6/ TetOhCMV RSV No. 1393
Un transgène du RSV a été cloné dans le vecteur BAC/ChAdl55 ΔΕ1, E4_Ad5E4orf6 /TetOhCMV RSV No. 1393 en substituant la cassette de sélection RpsL-Kana. La stratégie de construction a été basée sur deux étapes différentes de génie génétique médié par recombinaison dans des cellules compétentes d'E. coli SW102.
Première étape - Substitution de la cassette RpsLKana par la cassette de sélection Amp-LacZ-SacB
La cassette de sélection Amp-LacZ-SacB a été obtenue à partir du plasmide BAC/ChAdl55 (DEI) TetO hCMV Amp-LacZ-SacB No. 1342 par PCR en utilisant les oligonucléotides 91-SubMonte FW (5'-CAATGGGCGTGGATAGCGG TTTGAC-3') (SEQ ID NO : 21) et 890-BghPolyA RW (5'CAGCATGCCTGCTATTGTC-3') (SEQ ID NO : 22). Le produit a été transformé dans des cellules compétentes d'E. coli SW102 contenant le plasmide pAdéno BAC/ChAdl55 (DEI, E4 Ad5E4orf6) TetOhCMV - RpsL Kana No. 1390, aboutissant à BAC/ChAdl55 (DEI, E4 Ad5E4orf6) TetOhCMV - Amp-LacZSacB No. 1386.
Seconde étape - Substitution de la cassette de sélection Amp-lacZ-SacB par le transgène du RSV
Le transgène du RSV a été inséré dans le plasmide BAC/ChAdl55 (DEI, E4 Ad5E4orf6) TetOhCMV - Amp-LacZSacB No. 1386 en remplaçant la cassette de sélection Amp-lacZ-SacB par recombinaison homologue. Dans cet objectif, le plasmide pvjTetOhCMV-bghpolyA_RSV No. 1080
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BE2016/5434 (contenant une cassette d'expression du RSV) a été clivé avec Spel et Sfil pour exciser le fragment de 4,4 kb comprenant le promoteur du HCMV, le RSV et la polyA de la BGH. Le fragment résultant de 4,4 kb du RSV dans des cellules compétentes contenant le plasmide pAdéno a été transformé d'E. coli SW102
BAC/ChAdl55 (DEI, E4 Adr5E4orf6) TetOhCMV - Amp-LacZSacB No. 1386, aboutissant au plasmide final BAC/ChAdl55 ΔΕΙ, E4 Ad5E4orf6 / TetO hCMV Kana No. 1390.
BAC portant est illustrée sur la figure 6
ChAdl55/RSV comprenait de gauche du le
ChAdl55/RSV
En les de pb 467 à 1311,
La structure (SEQ ID NO : 11) particulier, le caractéristiques suivantes : ITR l'espèce C : pb 1 à 113, hCMV(tetO) gène du RSV : pb 1348 à 4785, polyA de la bgh : pb 4815 à 5032, orf6 de E4 de l'Ad5 : pb 36270 à 37151, ITR de droite de l'espèce C : pb 37447 à 37559.
Exemple 3 - Production de vecteurs
La productivité du ChAdl55 été évaluée comparativement aux ChAd3 et PanAd3 dans la lignée cellulaire Procell 92.
3.1 - Production transgène Gag du VIH
Des vecteurs exprimant la protéine Gag du VIH ont été préparés comme de il vecteurs comprenant un été décrit ci-dessus (ChAdl55/GAG) ou auparavant (ChAd3/GAG, Colioca et al., Sei. Transi. Med. (2012) 4: 115ra). Les vecteurs ChAd3/GAG et ChAdl55/GAG ont été récupérés et amplifiés dans des cellules Procell 92 jusqu'aux passages 3 (P3) , les lysats P3 ont été utilisés pour infecter 2 flacons
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T75 de cellules Procell 92 cultivées en monocouche avec chaque vecteur. Une multiplicité d'infection (MOI) de 100 pv/cellule a été utilisée pour les deux expériences d'infection. Les cellules infectées ont été récoltées lorsqu'un CPE total a été évident (72 heures après l'infection) et groupées ; les virus ont été libérés à partir des cellules infectées par 3 cycles de congélation/décongélation (-70 °C/37 °C) puis le lysat a été clarifié par centrifugation. Les lysats clarifiés ont été quantifiés par une analyse de PCR quantitative avec des amorces et une sonde complémentaires de la région du promoteur du CMV. Les séquences oligonucléotidiques sont les suivantes : CMVfor 5'CATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCA-3' (SEQ ID NO : 23), CMVrev 5'-GACTTGGAAATCCCCGTGAGT-3' (SEQ ID NO : 24), sonde CMVFAM-TAMRA 5'-ACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTT-3' (SEQ ID NO : 25) (les Q-PCR ont été exécutées sur un détecteur de séquences ABI Prism 7900 - Applied Biosystem). Les titres volumétriques résultants (pv/ml) mesurés sur les lysats clarifiés et la productivité spécifique exprimée en particules virales par cellule (pv/cellule) sont fournis dans le tableau 1 ci-dessous et illustrés sur la figure 7.
Tableau 1
Productivité des vecteurs à partir des lysats P3
Vecteur pv/ml pv totales (20 ml concentrés) pv/cellule
ChAd3/GAG 9,82E+09 1,96E+11 6,61E+03
ChAdl55/GAG 1,11E+10 2,22E+11 7,46E+03
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Pour confirmer la productivité supérieure du vecteur ChAdl55 exprimant le transgène Gag du VIH, une seconde expérience a été effectuée en utilisant des virus purifiés comme inoculum. Dans cet objectif, des cellules Procell 92 ont été ensemencées dans un flacon T25 et infectées avec ChAd3/GAG et ChAdl55/GAG lorsque la confluence des cellules a été d'environ 80 %, en utilisant une MOI = 100 pv/cellule d'infection. Les cellules infectées ont été récoltées lorsqu'un CPE total a été évident ; les virus ont été libérés à partir des cellules infectées par congélation/ décongélation et les lysats ont été clarifiés par centrifugation. Les lysats clarifiés ont été quantifiés par une analyse de PCR quantitative en utilisant les amorces et la sonde suivantes : CMVfor 5'CATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCA-3' (SEQ ID NO : 23), CMV rev GACTTGGAAATCCCCGTGAGT (SEQ ID NO : 24), sonde CMV FAM-TAMRA 5'-ACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTT-3 ' (SEQ ID NO : 25) complémentaire de la région du promoteur du CMV (les échantillons ont été analysés sur un détecteur de séquences ABI Prism 7900 - Applied
Biosystems). Les titres volumétriques résultants (pv/ml) mesurés sur les lysats clarifiés et la productivité spécifique exprimée en particules virales par cellule (pv/cellule) sont fournis dans le tableau 2 ci-dessous et illustrés sur la figure 8.
Tableau 2
Productivité des vecteurs à partir des virus purifiés
Vecteur pv/ml pv totales/flacon T25 (5 ml de lysat) pv/cellule
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ChAd3/GAG 1,00E+10 5,00E+10 1,67E+04
ChAdl55/GAG 1,21E+10 6,05E+10 2,02E+04
3.2 - Production de vecteurs comprenant un transgène du RSV
Un ensemble différent d'expériences a été effectué pour évaluer la productivité des vecteurs vaccinaux du RSV dans des cellules Procell 92.S cultivées en suspension. L'expérience a comparé PanAd3/RSV (décrit dans le document WO 2012/089833) et Chadl55/RSV en parallèle en infectant des cellules Procell 92. S à une densité cellulaire de 5 x 105 cellules/ml. Les cellules infectées ont été récoltées 3 jours après l'infection ; le virus a été libéré des cellules infectées par 3 cycles de congélation/décongélation et le lysat a été clarifié par centrifugation. Les lysats clarifiés ont été ensuite quantifiés par une analyse de PCR quantitative comme il a été rapporté ci-dessus. La productivité volumétrique et la productivité spécifique aux cellules sont fournis dans le tableau 3 ci-dessous et illustrés sur la figure 9.
Tableau 3
Virus Productivité volumétrique (pv/ml) pv totales Productivité spécifique aux cellules (pv/cellule)
PanAd3/RSV 5,82E+09 2,91E+11 1,16E+4
ChAdl55/RSV 3,16E+10 1,58E+12 6,31E+04
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Exemple 4 - Taux d'expression du transgène
4.1 - Taux d'expression du transgène Gag du VIH Les taux d'expression ont été comparés dans des expériences parallèles en infectant des cellules HeLa avec les vecteurs ChAd3 et ChAdl55 comprenant un transgène Gag du VIH. Les cellules HeLa ont été ensemencées dans des plaques de 24 puits et infectées en double avec des virus purifiés ChAd3/GAG et ChAdl55/GAG en utilisant une MOI = 250 pv/cellule. Les surnageants des cellules HeLa infectées ont été récoltés 48 heures après l'infection, et la production de la protéine GAG du VIH sécrétée a été quantifiée en utilisant un kit ELISA commercial (Kit ELISA HIV-1 p24, PerkinElmer Life Science). La quantification a été effectuée selon les instructions du fabricant en utilisant une courbe d'étalonnage de l'antigène P24 du VIH-1. Les résultats, exprimés en pg/ml de protéine GAG, sont illustrés sur la figure 10.
4.1 - Taux d'expression du transgène F du RSV Les taux d'expression ont été comparés dans des expériences parallèles en infectant des cellules avec les vecteurs PanAd3 et ChAdl55 décrits ci-dessus comprenant un transgène F du RSV. Dans cet objectif, les cellules HeLa ont été ensemencées dans des plaques de 6 puits et infectées en double avec les virus purifiés PanAd3/RSV et ChAdl55/RSV en utilisant une MOI = 500 pv/cellule. Les surnageants ont été récoltés 48 heures après l'infection, et la production de la protéine F du RSV a été quantifiée par un test ELISA. Cinq dilutions différentes des surnageants ont été transférées dans les puits de la microplaque qui sont
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BE2016/5434 revêtus d'un anticorps monoclonal anti-F du RSV de souris commercial. L'antigène capturé a été révélé en utilisant un antisérum secondaire de lapin anti-F du RSV suivi d'une IgG anti-lapin conjuguée à de la biotine, puis en ajoutant un conjugué streptavidine-AP (BD Pharmingen, No. de catalogue 554065) . La quantification a été effectuée en utilisant une courbe d'étalonnage de la protéine F du RSV (Sino Biological, No. de catalogue 11049-V08B). Les résultats obtenus, exprimés en pg/ml de protéine F du RSV, sont fournis dans le tableau 4 ci-dessous.
Tableau 4
Echantillon pg/ml de protéine F du RSV
ChAdl55/RSV 5, 9
PanAd3/RSV 4
Une analyse Western blot a été également effectuée pour confirmer le taux supérieur d'expression du transgène fourni par le vecteur ChAdl55 RSV par rapport au vecteur PanAd3 RSV. Des cellules HeLa déposées dans des plaques de 6 puits ont été infectées avec les virus purifiés PanAd3/RSV et ChAdl55/RSV en utilisant une MOI = 250 et 500 pv/cellule. Les surnageants des cellules HeLa infectées ont été récoltés et la production de la protéine F du RSV sécrétée a été analysée sur gel SDS dans des conditions non réductrices suivi d'une analyse Western blot. Des quantités équivalents des surnageants ont été chargées sur du gel SDS dans des conditions non réductrices ; après séparation par électrophorèse, les protéines ont
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BE2016/5434 été transférées sur une membrane de nitrocellulose pour être sondées avec un anticorps monoclonal de souris anti-F du RSV (clone RSV-F-3, No. de catalogue : ABIN308230 disponible sur antibodies-online.com (dernière consultation le 13 avril 2015). Après incubation avec l'anticorps primaire, la membrane a été lavée et ensuite incubée avec un anticorps secondaire anti-souris conjugué à de la HRP. Finalement, le test a été développé par électrochimioluminescence en utilisant des techniques classiques (réactif de détection d'ECL Pierce, No. de catalogue W3252282). Les résultats de l'analyse Western blot sont présentés sur la figure 11. Une bande d'environ 170 kD indiquée par la flèche a été révélée par l'anticorps monoclonal mAb 13 dirigé contre la protéine F, qui correspond au poids attendu de la protéine F trimère. On peut voir que le vecteur ChAdl55 RSV a produit une bande plus sombre à une MOI = 250 ainsi que 500 pv/cellule.
Exemple 5 - Evaluation de la puissance immunologique par des expériences d'immunisation de souris
5.1 - Immunogénicité des vecteurs comprenant le transgène Gag du VIH
L'immunogénicité du vecteur ChAdl55/GAG a été évaluée en parallèle avec le vecteur ChAd3/GAG chez des souris BALB/c (5 par groupe). L'expérience a été effectuée en injectant 106 particules virales par voie intramusculaire. La réponse en lymphocytes T a été mesurée 3 semaines après l'immunisation par un test ex vivo enzyme-linked immunospot (ELISpot) pour la détection de l'IFN-gamma en utilisant un épitope de GAG
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BE2016/5434 reconnu par les lymphocytes T CD8+ localisé chez les souris BALB/c. Les résultats sont présentés sur la figure 12, exprimés en cellules formant des spots (SFC) d'IFN-gamma par million de splénocytes. Chaque point représente la réponse chez une seule souris, et la ligne correspond à la moyenne de chaque groupe de dose. La dose injectée en nombre de particules virales et la fréquence des souris positives envers le peptide immunodominant CD8 sont présentées sur l'abscisse.
5.2 - Immunogénicité des vecteurs comprenant le transgène du RSV
La puissance immunologique des vecteurs PanAd3/RSV et ChAdl55/RSV a été évaluée chez des souris BALB/c. Les deux vecteurs ont été injectés par voie intramusculaire à des doses de 108, 107 et 3 x 106 pv. Trois semaines après la vaccination, les splénocytes des souris immunisées ont été isolés et analysés par un test ELISpot pour 1'IFN-gamma en utilisant en tant qu'antigène les épitopes des peptides immunodominants F et M localisés chez des souris BALB/c. Les taux des réponses immunitaires ont été réduits en ligne avec la diminution du dosage (comme on s'y attendait) mais les réponses immunitaires ont été clairement supérieures dans les groupes des souris immunisées avec le vecteur ChAdl55/RSV comparativement aux groupes équivalents des souris immunisées avec le vaccin PanAd3/RSV (figure 13) Sur la figure 13, les symboles montrent les données des souris individuelles, exprimées en cellules formant des spots (SFC) d'IFN-gamma/million de splénocytes, calculées par la somme des réponses aux trois épitopes immunodominants (F51-66, Fss-93 et M2-I282-290) et corrigées
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BE2016/5434 pour le bruit de fond. Les lignes horizontales représentent le nombre moyen de SFC d'IFN-gamma/million de splénocytes pour chaque groupe de dose.
Conclusion
Pris ensemble, les résultats rapportés ci-dessus ont démontré que le ChAdl55 est un vecteur adénoviral amélioré comparativement aux vecteurs ChAd3 et PanAd3. Il a été montré que le ChAdl55 est plus productif, facilitant donc le procédé de fabrication, capable d'exprimer un taux supérieur de transgène in vitro et également in vivo fournissant une réponse plus forte des lymphocytes T contre les antigènes exprimés dans les modèles animaux.
Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation ci-dessus décrits et représentés, à partir desquels on pourra prévoir d'autres modes et d'autres formes de réalisation, sans pour autant sortir du cadre de l'invention.
Description des séquences
SEQ ID NO : 1 - Séquence polypeptidique de la fibre du ChAdl55
TKCG^VLÄSVSVx.SVXOSi.Ä??S«rvrSAQiYU5iT>£NG\i.LSNV&i.»K{YWNyKKGTX.iXGlAy’i1VAV
NBTiQTSfSâFTîîsVIÂOS
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SEQ ID NO : 2 - Séquence polynucléotidique codant pour la fibre du ChAdl55
ATGAAGCGCACCAAAACGTCTGÄCGAGAGCTTCÄÄCCCCGTGTACCCCTATGACACGGAAAGCGGGC
CTCCCTCCGTCGCTTTCCTCACCCCTCGCTTCGTGTCTCCCGATGGATTCCAAGAAAGTCCCCCCGGGG
TCCTGTCTCTGAACCTGGCCGAGCCCCTGGTCACTTCCCACGGCATGCTCGCCCTGAAAATGGGAAGT
GGCCTCTCCCTGGACGACGCTGGCAACCTCACCTCTCAAGATATCACCACCGCTAGCCCTGCCCTCAA aaaaaccaagaccaacctcagcctagaaacctcatcccccctaactgtga«:acctcaggcgccctc
ACCGTäGCAGCCGCCGC-TCC.CCTGGCGGTGGCCGGGACCTCGCTCäCCATGC,AATGäGAGGC:CCCCC tgacagtacaggajgcaaaactcaccctggccäccäaaggccccctgaccgtgtctgäaggcäääct ggccttgcaaacatcggccccgctgacggccgctgacagcagcaccctcacagtxagtgccacacca
CCCCTTAGCACAAGCAATGGCAGCITGGGTATTGACATGCAAGCCCCCATTTACACCACCAATGGAA
AACTAGGACTTÄACTTTGGCGCTCCCCTGCATGTGGTAGACAGCCTÄAATGCÄCTGÄGTGTAGTTACr
GGCCAÄGGTCTrÄCGATAAACGGAÄCAGCCCTACAAACTAGAGTCTCAGGTGCCCTGÄACTATGACA cätcaggaaacctägaattgagägctgcagggggtatgcgägttgatgc*aaatggtcaacttätcct
TGATGTÄGCTTACCCÄTTTGATGCACAAAACÄATCTCAGCC'n'AGGCTTGGACAGGGÄCCCCTG'rrrG
TrAACTCTGCCCACÄÄCTTGGATG’rTAACTÄCAÄeAGÄGGGCTCTÄCCTGTTCÄCÄTCTGGAAA.TACC
AAAAAGCTAGAAGTTAATATCAAAACAGCCAAGGGTCTCATTTATGATGACACTGCTAIAGCAATCA
ATGCGGGTGATGGGCTACAGTTTGACTCAGGCTCAGATACAAATGCATTAAAAACTAAACTTGGATr aggäctggattatgactccagcagagccataättgctäaägtgggaäctggcctaagctttgacaac
ACAGGTGCXATCACAGTAGGCAACAAAAATGATGACAAGCTTAGGTTGTGGACCAGACCAGACGCAT
CCCCTAACTGTAGAATGTATRAGAGAAAGATGCTAAATTCACACTTGTTTrGACTAAATGCGGCAGT
CAGGTGTTGGCCAGCGTTTCTGTrTTATCTGTAAAAGGTAGGCTTGCGCCCATCAGTGGCACAGTAAC tagtgctcägattgtcctcagatttgatgaäaatggägttctäctaagcaattcttcccttgaccctc
AATACTGGAACTACAGAAAAGGTGACGTTACAGAGGGCACTGCATATACCAACGCAGTGGGATTrAT
GCCCääCCTCACäGCäTäCCCAAAAACäCäGAGCCAAACTGCTAAAAGCAACATTGTääGTCäGGTT tacttgaatggggacaäätccaäacccatgaccctcaccättaccctcaatggäactaatgäaacag gagatgccacagta_agcacttactccatgtcattctcätggaactggaatggaagtaattacattaa
TGÂAACGTTCCÂAAœAACTCCTTCÀCCTTCTCCrACATCGCŒAAGAA
SEQ ID NO : 3 - Séquence polypeptidique du penton du ChAdl55
MKJRAAMYQEGWPSYESWGAAAAAPSSPFASQLLEPFyVPPRYLSPTGGRNSISYSELÄPLfDTTKVYLV
DWSADVÄSLOT<>®HSNELTrviQTO®YSPSEASTQTMJ3DRSHWGGDLKlTUrnSWNVNEFMFrK
Ei^AKVMVS&SHTSEDiGvYLKYEWTCmÄGWSEIMnDIAecrArVSiYlKVGKQSGVLESDiGVKF
IJTSOTlUYiLDWTGLVMFGVYTWÄJHPDniAPGCGYnFrYSRLSNILGIRSRQPFQEGFKITYEnLEGG
NlPALLIWEÄYQDSLKEMEAGQEDTÄPÄÄSÄAAEQGEnAÄDTAAAJDGAEADPAMWEAPEQEEDMNDS
AA’SGDTR.YKGEEKQAEAEäAäEEKQLääAAAAAAIAAAEäESEGTKP.VKEPWKPLTEDSKKRSYNLL
KDSTOÎTÂYKSWYLAYNYGDPSTG\rRSWTLLCTPDYTCGSEQNGn¥SLPDÎ.âMQDPWES.STS.QVSNF?W
6ΑΕ11ΡΑΉ3Κ5Ε1Τ®ρΑ^5ρθΧρΕΤ8ΕΤΗνΈΝΚΕΡΕΝρΐΙΑΚΡΡΑΡΤΙΤ·η.τ5ΕΝ\’ΡΑΕΥ0Η611ΡΕ3ΪΝ510
GYQWTWDAJUmCimYKALGWSPKVLSSRTE
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SEQ ID NO : 4 - Séquence polynucléotidique codant pour le penton du ChAdl55
ATGC'GGCGCGCGGCGäTGTACCAGGAGGGACCTCCTCCCTCTTACGAGÄGCGTGGTGGGCGCGGCGG
CGGCGGCGCCCTCTTCTCCCTrTGCGTCGCAGCTGCTGGAGCCGC'CGTACGTGCCTCCGCGCTACCTG
CGGCCTACGGGGGGGAGAAACAGCATCCGTTACTCGGAGC'TGGCGCCCCTGTTCGACACCACtCGGG
TGTACCTGGTCa3ACÄ,4.CAÄGTCGGCGGACGTGGCXrrCCC~a4ÄCTÄCCAGÄACGÄC:CÄCAGG.AATTT tttgäccacggtcätccägääcaatgactäcagcccgagcgaggccagcäcccagäccatcaatctg
GäTGACCGGTCGC'ACTGGGGCGGCGACCTGAAäACCATCCTGCACäCCAäCATGCXX'AACGTGAAC
GAGTTCATGTTCACCAATAAGTrCAAGGCGCGGGTGATGGTGTCGCGCTCGCACACCAAGGAAGACC
GGGTGGAGCTGAAGTACGAGTGGGTGGAGTTCGAiGCTGCCÄGAGGGCAÄCTACTCCGAGACCATGÄ
CCATrGACCTGATGAACAACGGGATCGTGGAGCACTATCTGAAAGTGGGGAGGCAGAACGGGGTCCI ggagagcgacatcggggtcaagttcgacaccaggaacttccgcctggggctggaccccgtgaccgg
GC‘TGGTrATGCCCGGGGTGTACACCAACGAGGCCTTCCATCCCGACÄTCATCCTGCTGCCCGGCTGCG
GGGTGGAGTTCACTTACAGCCGCCTGAGCAACCTCCTGGGCATCCGCAAGC'GGCAGCCCTTCCAGGA
GGGCTTCAGGATCACCTäCGAGGäCCTGGAGGGGGGCAACATCCCCGCGCTCCTCGäTGTGGAGGCC
TACCAGGATAGCTrGA.4GGAAAATGAGGC;GGGACAGGAGGATACCGCCCCCGCCGCCTCCGC:CGCX·
GCCGÄGCAGGGCGAGGATGCTGCTGACACCGCGGCCGCGGACGGGGCAGAGGCCGACCCCGCtÄTG
GTGGTGGAGGCTCCCGAGCAGGAGGÄGGACATGA,4TGACäGTGCGGTGC:GCGCAGACACCTTCGTC
ACCCGGGGGGAGGAAÄÄGCAAGCGGAGGC‘CGAGGCCGCGGCCGäGGä.AAÄGGAACTGGCGGCAGC
AGCGGCGGCGGC'GGCGTTGGCGGC:GGC:GGAGGC‘TGäGTCTGAGGGGACCAAGCCCGCCäAGGAGCX·
CGTGAJTÄAGCCCCTGÄCCGAAGATAGCAAGAAGCÄAGTTAeÄACGTGCTCÄAGGA.CAGCAeCÄA
CACCGCGTÄCCGGAGCTGGTACCTGGC'CTÄCAACTACGGCGACCCGTCGÄCGGGGGTGCGCTCCTGG
ACCCTGCTGTGCACGCCGGäCGTGäCCTGCGGCTCGGäGCäGGTGTACTGGTCGC'TGCCCGäCÄTGA
TGC:A4GäCCCCGTGACCTTCCGCTCCACGCGGCäGGTCAGCäACTTCCCGGTGGTGGGCGCCGAGCT
GCrGCCCGTGCACTCCAÄGÄGCTTCTACAÄCGACCAGGCCGTCTAGTCCCAGCTCATCCGCCAGTTCA.
cctctctgäcccacgtgttcaätcgctttcctgagaäccägättctggcgcgcccgcccgcccccäcc ätcäccäccgtcagtgäaa.acgttcctgctctcäcagatcäcgggäcgctaccgctgcgcaacagcä
TCGGAGGAGTCCAGC-'GAGTGAGCG'rTACTGACGCCAGACGCCGCÄCCrGeGCCTACGTrrA.CÄÄGGC
CTTGGGCATAGTCTCGCCGCGCGTCCTTTCCäGCCGCACTTTT
SEQ ID NO : 5 - Séquence polypeptidique de l'hexon du ChAdl55
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MAXPSMMPQWSYMHISGQDASEYLSPGLVQFAKATDSYFSLSNKFSHPXY^APTHDVTTDRSQ&LTLSHP
WREDTAYSYKAIGnXAYGSNrYLDMASTYEDIRGVWRGPTFKPYSGTAYNSLAPKGAPNSCEWEQEE
TQTAEEÄQDEEEDEÄEÄEEEMPQEEQAPWXXHYYAQÄPLSGEKlTKDGLQIGTDÄTÄTEQKPrFADPTF
QPEPGIGESQ»XiEADASVAGGWLKKXTP&iRPCA’GSYARPXNANGGQGAXYEKDGGiaiESQY»iQFES
XSENAKœAWIQPKEVtYSEmXîMEXPDTHXSYKPÂRSDDNSKVMLGQQSMPNKPMYÏGFRDWÎGLMY
YNSTGmiGVLAGQASQLMAYTOIXJDRirreLSYGIiWSMGDSTKYFSMWQAVDSYDPDYRIXENHGT
EDELPNYCFPLGGiGVTDÎYpAMIXîGFïGi'îGGGNTTWTSDETFADENEÎGVGFBiFÂMEIFîLSAl&.WROT
LYS^AXALXXPDgXKYWSJnŒlSDHWXYDX^fieXWAPGLTOCYINLGÂRWSLDYiiDmGîPFNHHRN
AGLRYRSAiXLGNGRYY’PFHlQVPQKFFAiKNLX.LLPGSYTYEWNFRKD'VXafVL.QSSLGNDLRWGASIKF
ESICLYAXFFPMAHNXASTLEAMLSSDTNDQSFNDYLSAANMLYPIPANA'IWPiSIPSSNWAAFRGWAF
TRLKTKEXPSLGSGFDPYYTi’SGSIPYLDGTFYLNHTFKKVS\nTDSSVSlWGMDRIiTPFTEEEiKRSAX3GE
GlG7\-ÄGCPÖ,iTKDWFLIQAiE.omHGYQGFYIPESYKDgA-rYSFESNEGPAlSXQ\AnDETKYXDYQQVGn
HQHhX^SGFVGYtAPTMKEGQAYPANTPYPXIGKTAVBSVTQKRFLCDRIXWRIPFSSNFMSMGAiTDLG
QNELYÄNSAHÄLEMTFEYDPMnEPXLLYVLFEWDWKVHQPHRGYlEXYYLRTPFSÄGNATT
SEQ ID NO : 6 - Séquence polynucléotidique codant pour
1'hexon du ChAdl55
AXGGCGACCCCäTCGäTGäTGCCGCAGTGGTCGTACATGCÄCäTCTCGGGCCAGGäCGCCTCGGAGT
ACCTGAGCCCCGGGCTGGXGCAGXTCGC/CCGCGCCÄCCGAGAGCXÄCXTCAGCCYGAGTAACAäGTT taggaaccccacggtggcgcccacgc-acgatgxgaccaccgaccggtcxcagc:gcctgacgcxgcgg ttcaitcccgtggaccgcgaggäcäccgcgtäctcgtacaaggcgcggtxcaccctggccgtgggcg
ACAACGGCGXGCTGGACAXGGCCXCCACCTACTrTGAGAXCCGCGGGGXGCXGGACCGGGGTCCCAG
TTrCAAGCCClÄCTCXGGCACCGCCTÄCAÄCTCCCTGGCCCCCAAGGGCGCYCCCAACTCCTGCGAGT gggagc.aagaggääactcaggcägttgäagaägcagcaga.4.gaggaägaägaagätgctgacggt
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GÄAGCTGAGGÄAGAGCAAGCAGCTACCAÄAAÄGACTCATGTATÄTGCTCAGGCTCCCCTTTCTGGCG
AAAAAATTAGTAAAGATGGTCTGCAAATAGGAACGGACGCTACAGC”IACAGAAeAAAAACCTATTT
ATGCAGACCCTACATTCCAGCCCGAACXCCAAATCGGGGAGTGCCAGTGGAATGAGGCAGATGCXAC
AGTCGCCGGCGGTAGAGTGCTAAAGAAATCTACTCCCATGAAACCATGCTATGGTTGCTATGCAAGA cccacäaatgctaatggaggtcagggtgtactääcggcaaatgcccagggacagctagäätctcäg
GTTGAAATGCAATTCTrTTCAACTTCTGAAAACGCGCGTAACGAGGCTAACAACATTCAGCCCAAATT ggtgctgtatagtgaggatgtgcacatggagaccccggatacgcacctitcttacaagcgcgcaaaa ägcgatgäcäattcaäaäatcatgctgggtcagcägtccatgcccaacägäcctäättacätcggct
TCAGÄGÄCAACTrTATCGGCCTCÄTGTÄTTACAATAGCACTGGCAACÄTGGGAGTGCTTGCAGGTCÄ
GGCCTCTCAGTTGAÖGCAGTGGTGGACTTGCäAGACAGAääCACAGAACTGTCCTACCäGCTCTTG
CTTGATTGCäTGGGTGÄCAGAäCCäGäTäCTTTTCCäTGTGGAäTCAGGCAGTGGäCAGTTATGäCC
CÄGATGTrAGAAITATTGAAAATCATGGAÄCTGAAGACGAGCTCCCCAACTATTGTTrCCCTCTGGGT
GGCATÄGGGGTAACTGACACTrACCÄGGC:TGTTAAAA.CCAAC.AATGGCAAT.AACGGGGGC'CAGGTG
ACTTGGÄCÄA.4AGATG.GSACTTTTGCÄGATCGCÄATGAAA1AGGGGTGGGA4ACAXTTTCGCTÄTGG
AGATCAACCTCAGTGCCAÄCCTGTGGAGÄÄ.4.CTTCCTGTACTCXAACGTGGCGCTGTACCTACCÄGÄ
CAAGCTIAAGTÄCAÄCCCCTGCAATGTGGÄCArCTCTGACAACCCCÄÄCACCTAGGÄ'nACÄTGAÄC
AAGC:GAGTGGTGGCCC.CGGGGCTGGTGGACTGC-TA:CATCAACCTGGGCGCG€GCTGGTCGCTGGACT
ACATGGÄCAACGTCAACCCCTTCAACCACCÄCCGCAATGCGGGCCTGCGCTäCCGCTCCATGCTCCT gggcaacgggcggtacgtgccgttccacatcxaggtgccgcagaagttctttgccatcaagaacctc
CTcCTCCTGCCGGGCTCeTÄCÄCCTÄCGÄGTGG.AACTTCAGGAÄGGÄTGTCAACATGGTCCTCCAGÄ
GCTCTCTGGGTAACGäTCTCAGGGTGGACGGGGCCAGCATCAAGTTCGAGAGCATCTGCCTCTäCGC
CACCTTCrTCCCCA.TGGCCCACAACACGGCCTCCACGCTCGAGGCCATGCTCAGGAACGACACCAAC gaccagtccttcäatgactacctctccgccgccaacatgctctacccgatacccgccaacgccäccaa
CGTCCCCATCTCCATCCCCTCGCGCAACTGGGCGGCCTTCCGCGGCrGGGCCTTCACCCGCCTCAAGA ccääggägäccccctccctgggctcgggattcgäcccctactäcacctactcgggctccaitccctäc
CTGGACGGCACCTrCTACCTCAACCACACTTTCAAGAAGGTCTCGGTCACCTTCGACTCCTCGGTCAG ctggccgggcaacgaccgtctgc:tcacxx:cc.aacgagttcgagatcaagcgctcggtcgacggggag ggctaca.acgtggcccagtgc.aacätgaccaaggactggttcctggtgcägatgctggcxaactäca
AX’ATCGGC'TACCAGGGCTTCTACATCCCAGAGAGCTAC.AAGGACAGGATGTACTCCTTCTTCAGGAA
CTTCCAGCCCäTGAGCCGGCAGGTGGTGGÄCCAGACCäAGTACAAGGACTACCÄGGAGGTGGGCAT
CÄTCCÄCCAGCACAACÄACTCGGGCTTCGTGGGCTACCTCGCCCCCACCATGCGC’GAGGGACAGGCC tacccxgccaacttcccctatccgctcaiaggcaagäccgcggtcgacägcätcäcccägaäaaagt tcctctgcgaccgcaccctctggcgcatcgccttctccagcaaxttcatgtccatgggtgcgctctcg gacctgggccägaäcttgctctacgccaäctccgcccacgccctcgäcätgaccttcgäggtcgäcc ccatggacgagcccacccttctctaigttctgttcgaagtctttgacgtggtccgggtccaccagccg
SEQ ID NO : 7 - Séquence polynucléotidique codant pour la construction du squelette ChAdl55 No. 1434
CATC^CAATAÄlATACCTTATriTC»ATKMA<XX^TAT<^TAÄroAGATGGGCGGCXXXX3GßCG
GGGCGCGGGGCGGGÄGGCGGGTrrGGGGGCGGGCCGGCGGGCGGGGCGGTGTGGCGGAAGTGGÄC
TTTGTÄAGTGTGGCGGÄTGTGÄCTrGC.TAGTGCCGGGCGCGGTAAÄAGTGACGTTTTCCGTGCGCGA
CAACGCGCCCGGGAAGTGACATTTTTCtXGCGGTTTTTACCGGATGTTGTAGTGAATTTGGGCGTAAC
GAAGTX4GATTTGGCCATTTrCGC:GGGAAAACTGAAACGGGGAAGTGAAATCTGATTAATTTrGCGT
TÄGTCATÄCCGCGTAATÄTTTGTCTAGGGCCGAGGGACTTTGGCCGATTACGTGGAGGACrCGCXX'A
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GGTGTTTTrTGAGGTGAAXTTCCGCGXTCCGGGTCAAAGTCTGCGTTTTATTATXATAGGATATCCCAT
TGCATACGTTGTATCCATATCAIAATATGTAGATrTATATTGGCTCATGTCCAAGATTACCGCCATGTT
GACATTGArEAITGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATIAGTTCAIAGCCCATAIATG
GAGTTCCGCGTTACäTAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAäCGäCCCCCGCCCAT
TGACGTCAATÄA'rGACGTATGTrcCCAlAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGT ggagtatttäcggtääagtgcccacttggcagtägätcaägtgtätcatätgccaägtacgccccct
ATTGACGTCAATGACGCTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACGTTATGGGACmCC
TACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGC^AGTACATCA
ATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATrrCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAG
TTTGTTTTGGCÄCCAAAATCÄÄCGGGÄCTTTCCAA.AATGTCGTAACAÄCTCCGCCCCÄTTGACGCAAA
TGGGCGGTAGGCrGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCLAGAGCTCTCCCXATCAGTGATAGAGATCT
CCCTATCAGTGATAGAGäTCGTCGACGAGCTCGTTTAGTGAÄCCGTCAGATCGCCTGGAGACGCX'AT ccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgca
TTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGAGATCTTCCGTrTATCTAGGTÄCCGGGCCCCCCCTCGA
GGTCGÄCGGX4TCGÄTX4.GCTTCÄCGCTGCCGX‘AXGCACTCAGGGCGCAAGGGCTGCXA4ÄGGAAG
CGGäACACCTäGXAAGCCAGTCCGCAGAA.ACGGTGC:TGACCCCGGATGXATGTCAGCXäCTGGG€T
ÄTCTGGäCAAGGGAAAACGCAAGCGCAAAGAGAAÄGCAGGTAGCTTGCAGTGGGCTTACATGGCGA
TAGCTAGACnXXX^GGTITTATGGACAGCAAGCGAACOSGAAITGCCAGCTGGGGCGCCCrcTGGTA
ÄGGTTGGGAAGCCCTGCAAAGXAAACTGGATGGGTTrCTTGCCGCC.AAGGATCTGÄTGGXGCAGGGG
ATCAAGATCTXACCAGGAGCXATXrAATGGCXACAGTTAAC'CAGCTGGTACGC-AAACeACGTGCTCG
CAAAGTrGCGAAAAGCAACGrTGCCTGCGCTGGAAGCATCCCCGCAAAAACGTGGCGTATGTACTCGT
GTATATACTACCÄCTCCTÄAXAAACCGAÄCTCCGCGCTGCGXAAAGTATGCCGTGTTCGTCTGACTAA
CGGTTTCGÄAGTGACTTCCTACATCGGTGGTGÄÄGGTCACXAGCTGCÄGGÄGCACTCCGTGATCX-TG
ATCCGTGGCGGTCGTGTrAAAGÄCCTCCCGGGTGTrCGTTACCACACCGXACGTGGTGCGCTTGACTG
CTCCGGCGTTÄ.AAGACCGTAÄGCAGGCTCGTTCCÄÄGTATGGCGTGAAGCGTCCTAAGGCTXAATGG:
TAGATCTGATCAAGAGACAGGAXGÄCGGTCGTTrCGCATGCTTG.AACAAGATGGATTGCACGCAGGT
TCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCXATTCGGCXATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCrCTG
ATGCCGCCGTGXFCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGT gcc:ctgäätga.actgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggc.cacgäcgggcgttccttgc-g
CAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGÄÄGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAßTGCCGGGGCA
GGÄTCTCCTGTCÄTCTCÄiXTrGCTCCTGCCGAGAAAGTÄTCCATCAXGGCTGATGCAÄrGQäGCGGC
TGCAXICGCTTGÂTCCGGCTACCTGCCCÂTTCGÂCCACCÂAGCGAAACATCŒÂTCGAGCGAGCÂCG
TäCTCGGÄTGGAÄGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGÄÄGÄGCATCAGGGGCTCGCGCCÄ
GCCGX^CTGTTCGCCAGGCTCAAGGCœGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCG
AT<XCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGÄAA.4TGGXGGCTTTTCTGGATTCÄTCGACTGTGGCCGGCTG
GGTGTGGCGGÄCCGCTÄTCAGGACÄTAGC'GTTGGC'TACCCGTGAXATTGCTGAAGÄGC‘TTGGCGGCG
AATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCXrCTAT
CGCCTTCTTGACGAGTTCTrCTGAGCGGGACTCTGGGGXTCGAAAXGACCGACCAAGCGACGCCCAA
CCTGCCATCACGAGATTTCGATTC-CACCGCCGCCTrCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAA.TCGTTTTCC
GGGACGCCGGCTGGA’FGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCXFCGCCCACCCCGGGCT
CGATCCCCTCGGGGGGäÄTCAGääTTCAGTCGAGAGCGGCCGCGATCTGCTGTGCCTTCTAGTTGCC agccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctxf cctaataaaatgaggaaattgcaxcgcaitgtctgagtaggtctcattctattctggggggtgggct
GGGGCAGGäCäGCÄ.4GGGGGAGGATTGGGAAGäCäATAGC'AGGCÄTGCTGGGGATGC'GGTGGGCT
CXATGGCCGATCAGCGATCGCTGAGGTGGGTGAGTGGGC-GTGGCXTGGGGTGSTCATG.AAAATAX4X
AAGTTGGGGGTCTTAGGGTCTCTTXATTTGTGTTGCäGäGACCGCCGGAGCCATGäGCGGGäGCäGC
123
B E2016/5434 agcagcagcagtagcagcagcgccttggatggcagcatcgtgagccgttatttgacgacggggatgc
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CAGAGCAGGCTCTTGAGCGCGTAGAGCTTGGGGGCGAGGAÄGACCGATTCGGGGGAGTÄGGCGTCC
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5 TCCTGACGGGGGGGTATAÄÄAGGGGGTGGGGGCGC'GCTCGTCGTCACTCTCTTCCGCATCGCTGTCT
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GTCCATCTGGTCAGAÄAAC'ÄCGATCTrTrTÄTTGTCCÄGCTTGGTGGCGAACGACCCGTÄGAGGGCG
TTGGAGAGCAGCTTGGCGATGGäGCGCAGGGTCTGGTTCTTGTCCCTGTCGGCGCGCTCCTTGGCCGC·
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124
B E2016/5434
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GCGCAGGAAGACGTTGAAGCTGGCGTCCTGCAGGCCGäCGGCGTCGCGCACGAAGGÄGGCGTÄGGÄ gtcgcgcägcttgtgtaccägctcggcggtgäcctgcacgtcgagcgcgcagxägtcgägggtctcg gtctttccagtactcttggatcgggaaaccgtccggttccgaacggtxagagcgtagcatgtagaac
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TAGCTCTTCGTAGGTGÄGCTCCTCGGGCGAGGCGAGGCCGTGCTCGGCCÄGGGCCCÄGTCCGCGÄGG
TGCGGGTTGTCTCTGAGGAAGGACTTCCAGAGGTCGCGGGCCAGGAGGGTCTGCAGGCGGTCTC'TGA
ÄGGTCCTGAACTGGCGGCCCACGGCCATTrrTTCGGGGGTGATGCAGTÄGÄAGGTGÄGGGGGTCTTG
CTGCCAGCGGTCCCAGTCGAGCTGCAGGGCGAGGTCGCGCGCGGCGGTGACCAGGCGCTCGTCGCCC
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AGATGCACCTrrCGCCCGCGCÂCGAGGAAGCCGAGGGGÂAATCTGAGCCCCCCGCCTGGCTCGCGGC
ATGGCTGGTTCTCTTCTACXTrGGATGCGTGTCCGTCTCCGTCTGGCTCCTCGÄGGGGTGTTÄCGGTG
GAŒGGACCACCACŒCŒGCGÂGCCŒÂŒTCCAGATATCGGCŒGCGGCGGTeGGÂGTTTGATG
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AGTTCTTGCAGGTTCACCTCGCAGAGTCGGGCCAGGGCGCGGGGCAGGTCTÄGGTGGTACCTGATCT
CTAGGGGCGTGTTGGTGGCGGCGTCGATGGCTTGCAGGAGCCCGCAGCCCCGGGGGGCGACGACGG
TGCCCCGC:GGGGTGGTGGTGGTGGTGGCGGTGCAGCTCAGÄAGCGGTGCCGC'GGGCGGGCCX'CCGG
AGGTAGGGGGGGCTCCGGTCCCGCGGGCÄGGGGCGGCÄGCGGCACGTCGGCGTGGÄGCGCGGGCAG
GAGTrGGXGCTGTGCCCGGAGGTTGCTGGCGAAGGCGACGACGCGGCGGTTGATCXCCTGGATGT’GG
CGCCTCTGCGTGAAGACGACGGGCCCGGTGAGCTTGAACCTGAAAGAGAGTTCGACAGAATCAAICT
CGGTGTCATTGACCGCtASCCTGGCGCAGGAICTCCTGCACGTCTCCCGAGrTGTCTTGGTAGGCGATC
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CTGTAGACCACGCX'CCCCTGGTCATCGCGGGCGCGCATGACCACCTGCGCGAGGTTGAGCTCCACGT gccgcgcgaagacggcgtagttgc-gcagacgctggaagaggtagttgagggtggtggc:ggtgtgct
CGGCCACGAAGAAGTTCATGAC‘CCÄGCGGCGC.A4.CGTGGATTCGTTGA.TGTCCCCCäAGGCGTCCAG
CCGTTCCäTGGCCTCGTÄGÄAGTCCÄCGGCG.AAGTTGA4AAACTGGGAGTTGCGCGCCGACACGGTC
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GGATGTCTTCCTCCGCTAGCäTCAGCACGTCCTCCTCTTCCTCCTCTTCTGGCäCTTCCATGATGGCTT
CCTCCTCTTCGGGGGGTGGCGGCGGCGGGGGTGGGGGAGGGGGC'GC’TCTGCGCCGGCGGCGGCGCA
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B E2016/5434
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TAGTAGTCTrGCATGÄGCCTrrCCÄCCGGCACCTCTTCTCCTTCCrCTTCTGCTTCTTCCATGTCTGCTT
CGGCCCTGGGGCGGCGCCGCGCCCCCCTGCCCCCCATGGGCGTGACCCCGääCCCCCTGAGCGGTTG
GäGCAGGGCCÄGGTCGGCGACGACGCGCTCGGCCAGGATGGCCTGCTGGACCTGCGTGAGGGTGGT ttggaagtcätccäagtccacgäägcggtgctaggcgcccgtgttgätggtgtaggtgcagttggcc atgagggaccagttgacggtctggtggcccggttgcgacatctcggtgtacctgagtcgcgagtagg cgcgggagtcgaagacgtagtcgttgcaagtccgcaccaggtactggtagcccäccaggaägtgcg
GCGGCGGCTGGCGGTÄGAGGGGCCAGCGCAGGGTGGCGGGGGCITCCGGGGGCCAGGTCTrCCAGCA tgaggcggtggtaggcgtagatgtäcctggacatccaggtgatacccgcggcggtggtggaggcgc
GCGGG.AiGTCGCGCACCCGGTrCCAGATGTTGC'GCAGGGGCAGAAAGTGCTCCATGGTAGGCGTGCT
CTGTCCAGTC.AGACGCGCGCAGTCGTTGÄTACTCTAGACCÄGGGäAAA.CGÄAAGCCGGTC'AGCGGG
CÄCTCTTCCGTGGTCTGGTGAATÄGATGGCA.4GGGTATCATGGCGGAGGGCCTCGGTTCGAGCCCCG
GGTCCGGGCCGGäGGGTCCGCCATGATCCACGCGGTTÄCCGCCCGCGTGTCGAACCCAGGTGTGCGA
CGTCAGÄCÄACGGTGGAGTGTTCCTTTrGGCGTTTTTCTGGCCGGGCGCCGGCGCCGCGTA.AGAGÄC
TAAGCCGCGAÄÄGCGAAAGCAGTAAGTGGCTCGCTCCCCGTAGCCGGAGGGATCCTTGCTAAGGGTT
GCGTTGCGGCGAÄCCCCGGTrCGAATCCCGTACTCGGGCCGGCCGGACCCGCGGCTAAGGTGTTGGA ttggcctccccctcgtataäagaccccgcttgcggattgactccggacacggggacgagcccctttta
TTTTTGCTTTCCCCAGATGCATCCGGTGCTGCGGCäGATGCGCCCCCCGCCCCäGCAGGAGCAACAAC
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CGGCCACCTCGGCGTCCGGGGCCGTGTCTGGCGCCTGCGGCGGCGGCGGGGGGCCGGCTGÄCGACCC cgaggagcccccgcggcgcägggccagacagtäcctggäcctggäggägggcgagggcctggcgcg
GCTGGGGGCGCCGTCTCCCGAGCGCCAGCCGCGGGTGCAGCTGäAGCGCSäCTCGCGCGAGGCGTä cgtgcctcgggagaacctgttcagggaccgcgcgggc:gaggagcccgaggägatgcgggacaggag
GTTCAGCGCAGGGCGGGAGCTGCiSGCAGGGGCTGAACCGCGAGCGGCTGCTGCGCGAGGAGGACTr tgagcccgacgggcggacggggatcagccccgcgcgcgcgcacgtggcggccgccgacctggtgac
GGCGXACGAGGAGÄCGGTGAACCAGGAGÄTCAÄCTTCC.AAAAGAGTTTCAACAACCACGTGCGCAC
GCTGGTGGCGCGCGAGGäGGTGACCATCGGGC'TGATGCACCTGTGGGACTTTGTAAGCGCGCTGGTG
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GAGGCGTTTäGGGäCGCGCTGCTGAACäTCACCGAGCCCGAGGGTCGGTGGGTGCTGGACCTGATTÄ
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ÄGTÄCTCGÄTGCTGAGCCTGGGC.AAGTTTTACGCGCGC.AAGATCTACCAGACGC-CGTÄCGTGCGCAT
AGÂCAAGGâGGTGAAGâTCGACGGTTTÏTACâTGCGCATGGCGCTGAAGGIŒTCACCCTGÂGCGâC
GÄCCTGGGCGTGTÄCCGCX4CGAGCGCÄTCC4CAAGGCGGTGÄGCGTGÄGCCGGGGGCGCGAGCTG agcgaccgcgägctgätgcäcagcctgcagcgggcgctggcgggcgccggcagc^ggcgacagggäg
GCGGAGTCCTACTrCGATGCGGGGGCGGACCTGCGCTGGGCGCCCAGCCGGCGGGCCCTGGAGGCC gcgggggtccgcgaggacxvtgacgaggacggcgaggaggatgaggagtacgagctagaggaggg
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CGCTGCGGGCGGCTCTGCAGAGCCAGC-CGTCCGGCCTTääCTCCTCAGACGäCTGGCGACAGGTCäT
GGACCGCATCÄIGTCGCTGÄCGGCGCGTAACCCGGÄCGCGTTCCGGCAGCÄGCGGCAGGCCAA.CAG
GCTCTCCGCCATCCTGGÄGGCGGTGGTGCCTGCGCGCrCGAACCCCACGCACGAGAAGGTGCTGGCC
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126
B E2016/5434 gacgtgcgcgaggcggtggcgcagcgcgagc:gcgcggatcggcagggc.aacctgggctccatggtg
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GCGCATCTTGCGCTACGTGCAGCA.GAGCGTGAGCCTGAACCTGATGCGCGACGGGGTGACGGCCAGC
GTGGCIGCTGGACATGACCGC'GCGCääCATGGAäCCGGGGäTGTÄCGCCGCGCACCGGC'CTTACäTCA äCCGCCTGATGGACTäCCTGC/ATCGCGC/GGCGGCCGTGAACCCCGäGTACTTTACCääCGCCäTCCT
GAACCCGCAGTGGCTCCCGCCGCCCGGGTTCTACäGCGGGGGCTTCGAGGTCCCGGAGÄCCäACGäT
GGCrTGCTGTGGGACGACATGGACGACAGCGTGTTCTCCOCGCGGCCGCAGGCGCTGGCGGAÄGCGT ccctgctgcgtcccaagäaggäggaggaggaggaggcgagtcgccgcggcggcagcagcggcgtgg
CTTCTCTGTCCGÄGCTGGGGGCGGCAGCCGCCGCGCGCCCCGGGTCCCTGGGCGGCAGCCCCTTrCC gagcctggtggggtctgtgcacagcgagcgcaccäcccgccctcggctgctgggcgaggacgagtac
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CGCTCCGGCCGCCCACGCGGCGCCAGCGCCACGACCGGGAGCGGGGGCTGGTGTGGGäTGACGAGG äctccggggacgatägcagcgtggtggäcctgggagggagc:gggaacccgttcgcgcacctgcgc:cg
Œ<XXrTGGGGAGGAI<nTrrAAAAAAAAAAAAAAAAAŒAAGAAGCATGATGCAAAAATTAAÂTAA aactcaccaaggcgatggcgaccgagcgttggtttcttgtgttcccttcagtatgcggcgcgcggcg
ATGTACCAGGAGGGACCTCCTCCCTCTTACGAGAGCGTGGTGGGC.GC'GGCGGCGGCGGCGCCCTCTr
CTCCCrrTGCGTCGCAGCTGCTGGÄGCCGCCGTACGTGCCTCCGCGCTÄCCTGCGGCCTÄCGGGGGG
GAGäAACAGC'ATCCGTTACTCGGAGCTGGCGCCCCTGTTCGACACCACCCGGGTGTACCTGGTGGAC
ÄACAÄGTCGGCGGACGTGGCCTCCCTGÄACrACCAGAACGACGACÄGCAATTTTTTGACCACGGTCÄ tccägääcäatgactäcagc'ccgägcgaggccagcacccagaccätcäatctggätgaccggtcgc actggggc:ggcgacctgäaaaccatcctgcacäccaacätgcccäacgtgaacgägttcatgttcac cäätäagttcaa-ggcgcgggtgätggtgtcgcgctcgcäcäccaaggäägaccgggtggagctgaa
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ÄACA4CGCGATCGTGGAGC'ACTATCTGAAAGTGGGCAGGCAGAACGGGGTCCTGGAGäGGGäCATC
GGGGTCAAGTTCGÄCÄCCÄGGAACTTCCGCCTGGGGCTGGACCCCGTGÄCCGGGCTGG-rTÄTGCCCG
GGGTGTACÄCCäACGäGGCCTTCCATCCCGäCäTCATCGTGCTGCCCGGCTGCGGGGTGGACTTCAC
TTACAGCCGC.CTGAGC'AACCTCCTGGGCATCCGCAAGCGGC;AGCCCrrCCAGGAGGGCTrCAGGATC
ACCTÄCGÄGGACGTGGAGGGGGGCÄÄCÄTCCCCGCGCTCCTCGATGTGGAGGCCrACCAGGATAGCT
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AGGATGCTGCTGäCACCGCGGCCGCGGäCGGGGCAGAGGCCGäCCCCGCTATGGTGGTGGAGGCTC
CCGAGC'ÄGGÄGGAGGACÄTGAATGÄCAGTGGGGTGCGCGGAGACACCTTCGTCÄCCCGGGGGGAGG
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GCGTTGGCCGCGGCGGAGGCTGäGTCTGAGGGGACCAAGCXCGCCAAGGAGC'CCGTGATTAAGCCC
CTGÄCCGAAGÄTÄGCAÄGA.4GCGCAGTTÄCAACCTGCTCAAGGAGÄGCACCÄACÄCCGCGTACCGC
AGCTGGTACCTGGCCTACAACTACGGC-GACCCGTCGäCGGGGGTGCGCTCCTGGACCCTGCTGTGCA
CGCCGGACGTGACCTGCGGCTCGGAGCAGGTGTACTGGTCGCTGCCCGACäTGATGCAAGACCCCGT
GACCTTCCGCTCCACGCGGCÄGGTCACXÄACTTCCCGGTGGTGGGCGCCGAGCTGeTGCCCGTGCÄC
TCCAäGAGCTTCTÄCAACGACGAGGCCGTCTACTCCCAGCTCATCCGCCAGTTCACCTCTCTGACCCA
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CGTGTTCAATCGCTTTCCTGAGAACCAGATrCTGGCGCGGCCGCCCGCCCCCACCATCACCACCGTCA
GTGAAAACGTTCCTGCTCTCACAGÄTCÄCGGGÄCGCTÄCCGCTGCGCAACÄGCATCGGAGGAGTCCÄ gcgägtgaccgttactgacgccagäcgccgcäcctgcccctacgtttacääggccttgggcäiagtc tcgccgcgcgtcctttccagccgcactttttgagcaacaccagcatcatgtccatcctgatctcaccc agcaataagtccggctggggägtgctgcgcgcgcccagcaagatgttcggaggggcgaggaagcgt tccgägcagcaccccgtgcgcctgcgcgggcacttccgcgccccctggggägcgcacaaacgcggcc gcgcggggcgcaccaccgtggacgäcgccätcgactcggtggtggagcaggcgcgcaactacaggc
CCGCGGTCTCXÄCCGTGGACGCGGCCÄTCCAGÄCCGTGGTGCGGGGCGCGCGGCGGTACGCCAAGCT
GAAGAŒCGCCGGAAGCŒGTCAXCCGCCGeCACCGCCGCCGÂCCCGGGGCCGCCGCCÂAÂCGCGC ggccggggc-cctgcttcgccgggcc.aägcgcacgggccgccgcgccgccatgägggc:cgcgcgccgc
TTGGCCGCCGGCATCACCGCCGCXA.CCATGGCCCCCCGTACCCGA_AGACGCGCGGCCGCCGCCGGCG
CCGCXGC'CATCÄGTGÄCATGGC:CAGCAGGGGCCGGGGCX4.CGTGTACTGGGTGCGC:GÄCTCGGTGAC
CGGC.'ACGCGCGTGCCCGTGCGCTTCCGCCGGCCGCGGACTTGAGATGATGTGAAA.AAACXACäCTGA gtctcctgctgttgtgtgtatcccagcggcggcggcgcgc-gcagcgtcatgtccaagcgc:aäaätca aägaagagatgctccaggtcgtcgcgccggagatctatgggcccccgaagaäggaagägcaggatt cgäagccgcgcaagataäagcgggtcaaaaagaaaaagaaagätgatgacgatgccgätggggag
GTGGAGTTCCTŒGCGCCACGGCGCCCAGœGCXXGGTGCAGTGCAAGGGCCGGC-GCGTAÂAGGGC
GTCCTGCGCCCCGGCACCGCGGTGGTCTTCACGCCCGGCGAGCGCTCCACCCGGACTTTCÄAGCGCG
TCXATGACGAGGTGTACGGCGÄCGAAGACCTGCTGGAGCäGGCC.AACGAGC:GCTTCGGAGäGTTTGC‘
TTACGGGAA:G€GTCAGCGGGGGCTGGGG.AAGGAGGACCTGCTGGC-GCTGCCGCTGGAeCAGGGC.AA œŒACCCŒAGTCTGAAGCCCGTGACCCTGCAGCAGGTGCTGCCGAGGAGCGCACCeTeCGAGGCG .aagcggggtctga.agcgcgagggcggcgacctggc:gcccaccgtgcagctcatggtgcccaa«:gg
CAGAGGCTGGAGGATGTGCTGGAGAAAATGAAAGTAGACCGCGGTCTGCAGCCGGACATCAGGGTC
CGCCCCATCAÄGCAGGTGGCGCCGGGGGXCGGCGTGCAGACCGTGGAeGTGGTCATCCCCACCGGCÄ
ACrCCCCCGCCGCCGCCACCACXACCGCTGCCTCCACGGACATGGAGACACAGACCGATCCCGCCGC
AGCCGCÄGCCGCÄGCCGCCGCCGCGACCTCCTCGGC.GGÄGGTGCAGACGGACCCCTGGCTGCCGCCG
GCGATGTCAGCTCCCCGCGCGCGTCGCGGGCGC'äGGAAGTACGGCGCCGGCAäCGCGCTCGTGCCCG
AGTACXJCCTTGCATCCTTiXATCGCXSCCCACCCCCGGCTACCGAGGCTÄTACCTACCGCCCGCGAAG
ÄGCCAÄGGGTTCCACCCGCCGTCCCCGCCGACGCGCCGCCGCCACCACCCGCCGCCGCCGCCGCÄGÄ
CGCCAGCCCGCACTGGCTCCAGTCTCCGTGAGGAAAGTGGCGCGCGäCGGäCäCACCCTGGTGCTGC
CCAGGGCGCGCTACCACCCCAGCATCGTTTAAAAGCCTGTTGTGGTTCrrGCAGAIATGGCCCTCA.CT
TGCCGCCTCCGTTTCGCGGTGCCGGGATACCGÄGGAGGAäGÄTCGCGCCGC:AGGäGGGGTCTGGCCG gccgcggcctgagcggaggcagccgccgcgcgcaccggcggcgacgcgccaocagccgàcgcatgc
GCGGCGGGGTGCTGCCCCTGTTAA'TCCCœTGATasœGCGGCGATCGGCGCCGTGCCCGGGÂTCGC
CTCCGTGGCCTTGCAAGCGTCCCAGÄGGCATTGACäGACTTGCäAACTTGCAAAXAIGGAAAAAäAA
AœCCAATAAAAAAGTCTAGACrCTCACGCTCGCTTGGTCCTGTGACTATTTTGTAGAATGGAàGAC
ATCAACTrTGCGTCGCTGGCCCCGCGTCACGGCTCGCGCCCGrrCCTGGGACACTGGAAOSATA'rcG
GCACCAGCAACÄTGAGCGGTGGCGCC'rTCAGTTGGGGCTCTGTGTGGAGCGGCATTAAAAGTATCGG gtctgccgttaäaaattäcggctcccgggcgtcgaacagcagcacgggccägatgttgagagacaä
GTTGÄAAGAGCAGAACrrCCAGCAGAAGGTGGTGGAGGGCCTGGCCTCCGGCAXCAACGGGGTGGT
GGACCTGGCCAACXAGGCCGTGCAGAATAAGÄTCÄÄCAGXAGACTGGACCCCCGGCCGCKGGTGGA
GGAGGTGC'CGCCGGCGCTGGAGäCGGTGTCCCCCGATGGGCGTGGCGAGAäGCGCCCGCGGCCCGä
TAGGGAAGAGACCACTCTGGTCACGCAGACCGATGAGCCGCCCCCGTATGAGGAGGCCCTGääGCA
ÄGGTCTGCCCACCACGC'GGCCCATCGCGCCCATGGCCäCCGGGGTGGTGGGCCGCCACÄ.CCCCCGCC
ACGCrGGACTTGCCTCCGCCCGCCGATGTGGCGCAGCAGCAGAAGGCGGCAGAGCCGGGCCCGŒCG
CGäCCGCCTCCCGTTCCTCCGCCGGTCCTCTGCGCCGCGCGGCCäGCGGCCCCCGCGGGGGGGTCGC
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GäGGCACGGCAICTGGCÄGäGCÄCGCTGAACäGCATCGTGGGTCTCGGGGTGCGGTCCGTGAAGCG
CCGC€GATGCTA€TGAATAGCTTA^TA4CGTGTrGTATGTGTGTATGCGCC€TATGTCGCCGCCAGA
GGAGCTGCrGAGTCGC.:CGC:CGTTCGC:GCGCCCACC:ACCACCGC:CACTCCGCCCCTCAAGATGGCjGAC cccatcgatgatgccgcagtggtcgtacätgcäcätctcgggccäggacgcctcggagtacctgägc
GCCGGGCTGGTGCÄGTrCGCCCGCGCCACCGAGAGCTACTTCAGCCTGÄGTAACAAGTrrAGGAACC 5 CCACGGTGGCGCCCACGCACGATGTGACCACCGACCGGTCTCAGCGCCTGACGCTGCGGTTCATTCC
CGTGGACCGCGAGGACACCGCGTACTCGTACAAGGGGC'GGTTCACCCTGGCXGTGGGCGACAACCGC
GTGCTGGACATGGCCTCCACCTACTTTGACÄTCCGCGGGGTGCTGGACCGGGGTCCCACTTTCÄAGCC ctactctggcäccgcxtacäactccctggcccccäagggcgctcccääxtcctgcgagtgggagcäa
GAGGAAäCTCAGGC'AGTTGAAGAAGCAGCäGAäGAGGAAGäAGäAGATGCTGACGGTCAÄGCTGA
GGAAGÄGCAAGCAGCTÄCCAAÄAAGÄeTCÄTGTÄTÄTGCTCAGGCTCCCCTTrCTGGCGÄÄAÄÄATT
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3o CAGÄÄCXXGCXCXACGCCÄACTCCGCCCACGCCCTCGACATGACCXTCGAGGXCGACCCCAXGGACG
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0 GGCAGACGCÄACÄCCATCGCCCTCGGTCGCAGCCCCCTCGCCGGGGCCCCTGAAATCCTCCGAACCC
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0 TCACCGCCACGGCCCGCCäTAATCTCäACCCCCGAAAITGGCCXGCCGCCCTCGTGTACCAGGAAAC^
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GGGTGTTCTACGCTGGCCGCTGTGTCTGÄCCTGGAGGTAGACTGCCTCTCACCCTTCACTGTGTACCT j GCTXIACGGATXGGTCäCCCTCACXCTCäTCTGCAGCCTAATCACAGTAATCäTCGCCTTCAXCCAGT ί GCATTGÄTTäCATCTGTGXGCGCCTCGCATACTTCAGACACCACCCGCAGTACCGAGACAGGAACAT ; TGCCCAACTTCTAAGäCTGCTCTAATCATGCATAAGAGTGTGATCTGCCTTCTGATCCTCTGCäTCCT j GCCCACCCTCACCTCCXGCCAGTACÄCCÄCAAÄATCXCCGCGCAAAÄGACATGCCTCCXGCCGCTTCA ; CCCAACTGTGGAäTäTACCCAAATGC:TACAäCGAÄÄäGAGCGAGCTCTCCGAAGCTTGGCTGTäTGG I GGTCATCTGTGTCTTAGTrTTCTGCAGCÄCTGXCTTTGCCCTCAXAATCTACCCCTACTrTGÄTTTGGG : äTGGäACGCGAXCGäTGCCATGAATTACCCCACCTXTCCCGCACCCGAGAXAATXCCACTGCGACAA j GXTGTACCCGTTGTCGTXAATCAACGCCCCCCÄTCCCCTACGCCCÄCTGAAATCAGCXACXXXAÄCCT ' ÄÄCAGGCGGAGATGACTGACGC:CCTAGATCTÄGAAATGGACGGCATCAGTACCGÄGCäGCGTCTCCT i AGAGAGGCGCAGGCAGGGGGCTGAGCAAGAGCGCCTCAATCAGGAGCTCCGAGATCTCGTIAACCT ( GCACCÄGTGCAÄAäGAGGCATCTTTTGXCXGGXAAAGCAGGCCAAAGTCACCTÄCGAGAAGACCGG ; CÄACAGCCACCGCCTCÄGTTÄCAAATTGCCCACCCAGCGCCAGAAGCTGGTGCTCATGGTGGGTGÄG l aaxcccatcaccgtcacccagcacxcggtägägäccgaggggtgxcxgcactccccctgtcggggtc l CAGAÄGACCTCTGCäCCCTGGTAAÄGACCCTGTGCGGTCTCAGAGATXTAGTCCCCTTXAACTääTCA ä aacactggaätcaätaaäaagaatcacttacttääaätcägacagcaggtctctgtccagtttattc I ägcägcäcctgcttcccctcctcccaactctggtactccaaacgccttctggcggcaaacttcctcca ; eÄCCCXGAAGGGAAXGTCAGAXXCXTGCXCCTGTCCCTCCGCACCCACTATCTTCATGTrGTTGCAGA { TGAAGCGCACCAÄAACGTCTGACGAGAGCTTCAÄCCCCGTGTACCCCTATGACAGGGAAÄGCGGCCC ί TCCCTCCGTCCCTTTCCTCACCCCTCCCTrüGTGTCTCCCGATGGATTCCAÄGAAÄGTCCCCCCGGGGT { CCTGTCTCTGAACCTGGGCGAGCCCCTGGTCACTTCCCÄCGGCATGCTCGCCCTGäAAAXGGGAAGT j GGCCTCTCCCTGGACGACGCTGGCÄACCTCÄCCTCTCÄAGÄTÄTCÄCCACCGCTÄGCCCTCCCCTCAA ( aääaaccaagaccäaccxcagcctagaaacctcäiccccgcxaäcxgtgagcacctcaggcgcccic ! ÂCCGTAGCAGCCGCÇGCXCCCCTGGCGGTGGCCGGCACCTCCCTCACCATGGÂATCAGAGGCCCCCC i tgä£:ägtacäggätgcäaaäctcaccctggccaccaaaggcgccctgaccgtgtctgaaggcaaäct j ggc:cxxgcäaacaxcggccccgctgacggccgctgacagcagcäccctcacagxcagtgcgacacca ί ccccttagcäcäagcaatggcägcttgggtättgagatgcaagcgcccatttäcaccäccäätggaa i AACXAGGACXXAACTTTGGCGCrrCCCCXGCATGTGGXAGACAGGCTAAATGCACTGACTGXAGXXACT _ î ggccaaggxctiacgatäaäcggäacagccctacaääcxagagtctcaggtgccctcaactäxgaca I caxcaggäaäcctägäattgagagcxgcagggggtatgcgagttgätgcaaatggtcaactxatccx ! XGATGTAGCTTÄCCCÄITrGATGGACAAAACAATCTCAGCCTXAGGCTTGGACAGGGÄCCCCTGXXTG . | rrAACXCTGCCCACAACTTGGATGTTAACTACAACAGAGGCCTCTACCTGTXCACAXCXGGAAAXACC j AÄAÄAGCTäGAAGTTÄATATCAAÄACAGCCÄAGGGTCTCATTTAXGATGACACXGCTATAGC'AÄXCA l ATGCGGGTGäTGGGCTACAGTXTGAGXCAGGCTCAGAXACäääXCCäTTääAAACTAAACTIGGAXT Ï
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AŒACTGGATrATGACTCCAGCAGAGCCATÂATTGCEAAACKX3GAACrGGCCTAAGCTTTGACAAC
ÄCAGGTGCCATCACAGTAGGCAAC’AAÄAÄTGÄTGACAÄGCrTACCTXGTGGACCAGACCAGÄCCCÄT
CCCCTAACTGTAGAATCTATTCÄGAGAAAGÄTGCTAAAITCACACTTGTTrTGACTAAÄTGCGGCAGT
CAGGTGTTG<X3CAGCGrTTCTGTTTTATCTGTAAAAGGTAeCCTTGCG<XCATCAGTGGCACAGTAAC
TAGTGCKAfiATrGTCCTCAGATTTGAIGAAAATGGAGTTCTACTAAGCAATrcrTCCCTTCACCCTG
AATÄCTGGAäCTÄCÄGAÄAAGGTGäCCTTACäGAGGGCäCTGCATÄTACCAACGCÄGTGGGAXTTÄT 5 gcccaacctcägagcatacccäaäaacacagagccääactgctaaaagcaacattgtaagtcaggtt !
XÂCTTGAATGGGGAC.AAÂTGCAAACCCATGACCCTCACCÂTTÂCCCTCAÂXGGAÂCXAAXGAèACAG
GAGATGCCACAGTAAGCACTrACTCCATGTCArrCTCATGGAACTGGAATGGAAGTAATTACATTAÂ
TGAAACGXTGCAAäCCAACTCGTTCÄCGTTCTCCTACäTCGCCCAÄGAATAAAAäGCATGACGCTGXT j
GATrrGAÏTCÂATGTGTTTCTGTITrÂTTTXCÂAGCAGAACÂÂAATŒTTCÂAGTGÂTTCXTCCATCTT ‘
AGCTTAATAGACACAGTAGCTTAAXAGACCCAGTAGTGCAAAGCCCCATTCTAGCTTATAACTAGTG j
GAGAAGTACTCGCCTACAT«3GGGTAGAGTCATAATCGTGCATCAGGATAGGGCGGTGGTGCTGCAG =
CAGCGCGœAATAAACrGCTGCCGOCGCCGCTCCGTCCTGCAGGAATACAACATGGCAGTGGTCTCC j θ TCAGCGATGATTCGCACCGCCCGCAGCATAAGGGGCCTXGTCCTCCGGGCACAGCAGCGCACCCTGA ;
TCTCACTTAAAIC'AGCACAGIAACTGCAGGACAGCACCACAATATTGTTCAAAATCCCACAGTGCAA · j ggcgctgtatccaaägctcatggcggggäccacagäacccäcgtggccatcätaccäcaagcgcäg *
GXAGAXTAÄGTGGCGäCCCCTCATAAACACGCTGGACATAAAGÄTXÄCCTG'TTTTGGCäTGTXGTäAT ;
TCACCACCICCCGGTACCATATAAACCTCTGATTAAACATGGCGCCATCCACC AGG ATCCTAAACCÄG |
CrGGCCAAAACCTGCCCGCCGGCTATACACTGCAGGGAACCGGGACTGGAACAATGACAGTGGAGA · gcccaggactcgtaaccatggatcatcatgctggtcätgaxätcaätgttggcagaacacäggcäca 3 _ CGTGCATACACTTCCTCAGGATTACAÂŒTCCTCCCGCGTTAGAACCATATŒCAGGGAACAACCCA I
TTCCTGAATCAGCGTAAATCCCACACTGCAGGGAAGAŒTOGCACGTAACTCACGTTGTGCATTGTC 3
AAAGTGTTACAXTCGGGCAGCäGCGGäTGATCCTCCäGTÄTGGTAGCGCGGGTTTCTGTCTCAAAAG »
GAGGTAGACGATCCCTACTGTACGGAGTGCGCCGAGACÄACCGAGATCGTGTTGGTCGTAGTGTCAT j
GCCAAATGGAACGCCGGACGTAGTCATATrTCCTGAAGTCTTAGAIGTCTCAACGCAGCACCAGCAC . î
CÄÄCACXTCGCÄGTGTAAAÄGGCCAÄGTGCCGAGÄGAGTATÄXATAGGAÄTAÄÄÄAGTGACGTÄAA 5 eGGGCAAAGTCCAAAAAACGCCCAGAAAAAeCGCACGCGAACCTACGCCCeGAAACGAAAGCCAAA j
ÄAACACTAGACACT€CCrrCCGGCGrCAAC:'rrCCGCTr~CCCACGCTACGTCACTTGCCCCAGTCAAA j
0 CAAACTÄCATATCCCGAAGTTCCAAGTCGCCACGCCCAAAACACCGC’CTACACCTCCCCGCCCGCCG j
GCCOGCXXXXAAMXCGOCTœCGCCOaXrGCCCCGCCCCGCGCCGCCCATCTCATrATCAîATTGGC j
TTCAAXCCAAAATAAGGTAIAXTATTGATGATGGXTTAAACGGAXCCAATTCTTGAAGACGAAAGGG ;
CXrroGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGrCAGGTGGCA I
CZZinCGGGGAAXTGrGC.GCGGAACCCCZATTrTGTTZATriTT'CZAAA'TACATTCAAATATGTATCCCC J
TCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTA’rrCAACA ;
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SEQ ID NO : 8 - Séquence polynucléotidique codant pour la construction du squelette ChAdl55 No. 1390
CATCATCAATAATATACCTrATTTTGGATPSàAGCCAATATGAIAATGAGATGGGCGGCGCGGGGCG gggcgcggggcgggaggcgggtttgggggcgggccggcïgggcggggcggtgtggcggaâgtggac
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5 TÄCTrGGCAGTACATCTACGTÄTTAGTCATCGCXATTÄCCÄTGGTGÄTGCGGTTTTGGCAGTACATCA ATGGGC“GTGGÄ.TAGt3GGTTTGACTCACGGGGATTrCCAAGTCTCCACCCCATTGAGGTCAATGGGAG TTrGTrrTGGCACCÄÄÄÄTCAÄCGGGACTTTCCAÄAATGTCGTÄACAÄCTCCGCCCCATTGACGCAAÄ tgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctccctatcagtgatagagatct ccgtatcagtgatagagatcgtcgäcgagctcgtttägtgaaccgtcagatcgcctggägacgccät CCACGCTGTTTTGäCCTCCAIAGAAGACACCGGGäCCGÄTCCAGC‘€TCCGCGGCCGGGAA.CGGTG€*A TTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGAGATCTTCCGTTTäTCTAGGTACCGGGCCCCCCCTCGä GGTCGÄCGGTATCGAIAAGCTTCACGCTGCCGCAAGCACTCAGGGCGCAAGGGCTGCTAAAGGäAG cggääcäcgtagäaagccagtccgcägaaäcggtgctgäccccggatgäätgtcägctactggggt
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CCTAATAAAATGÄGGAAArrGCÄTCGC'ÄTrGTCTGAGTAGGTGTCATTCTArrCTGGGGGGTGGGGT ggggcäggacägcaagggggaggattgggaagacäätagcaggcätgctggggätgcggtgggct
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GCCACCGCAGCCGCCTCGGCCGTGCGCÄGCCTGGCCACGGÄCTTrGCATTCCTGGGACCACTGGCGA
CAGGGGC'TÄCTTC'TCGGGC'CGCTGCTGCCGCCGTrCGCGATGÄCAAGCTGACCGCCCTGCTGGCGCA
GTrGGATGCGGTrACTCGGGAACTGGGTGACCTTTCTCAGCAGGTCATGGCXXTGCGCGAGC’AGGTCT
CCTCCCTGCAAGCTGGCGGGAATGCTTCTCCCACAA.ATGCCGTTTXAGATAAATAAAACCAGACTCT
GTrTGGAXT.AAAGAA,AAGTAGCAAGTGCATTGC:TCTCTTTATTTCATAATTTTCCGCGCGCGÄTAGGC cctagäccägcgttctcggtcgttgägggtgcggtgtatcttctccaggacgtggtagaggtggctct
GGACGTTGAGAXAGATGGGCATGAGCCCGTCCCGGGGGTGGAGGTAGCACCACTGCAGAGCTrCATG
CTCCGGGGTGGTGTTGTAGAXGATCCAGTCGTAGCAGGAGCGCTGGGCATGGTGCCTAAÄAATGTCC
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GCGAGGGCCAGCTGCTGGGGTGAGTATTCCCTCTCGAAGGCGGGCATGACCTCCGCGCTGAGGTrGT CAGTITtXIAAAÄÄCGÄGGAGGATTTGATGTTCACCTGTCCCGAGGTGATACCTTrGAGGGTACCCGC .
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CGAGCTGGGTCTCGTCCGGGGGGTCCGCGTCCACGGTGAAAäGCCCGGGGCGCAGGCGC'GCGTCGA ï
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TGATGTTGTGGCCCACGATGTAGAGTTCCAGGAAGCGGGGCCGGCCCTTTACGGTGGGC-AGCTTCTT
3A.GCTCTTCGTAGGTGÄGCTCCTCGGGCGAGGCGÄGGCCGTGCTCGGCCAGGGCCCAGTCGGCGAGG
TGCGGGTTGTCrCTGAGGAÄGGACTICGAGAGGTCGC’GGGCCAGGAGGGTCTGCÄGGGGGTCTCTGA
AGGTCCTGAACTGGCGGCCCACGGCCATTTTTrCGGGGGTGATGCAGTAGAAGGTGAGGGGGTCTrG ctgc:cägcggtcccagtcgagctgcägggcgäggtcgc:gcgcggc:ggtgaccäggcgctcgtcgccc ccgäatttcatgäccagcatgaägggcacgagctgctttccgaäggcccccatccäagtgtaggtct ctacatcgtäggtgäcaaägaggcggtccgtgcgaggätgcgagccgätcgggaägaactggatct cccgccaccagttggaggagtggctgttgatgtggtggaagtagaägtcccgtcgccgggccgäaca
CTCGTGCTGGCTTTTGTä.AA4GCGAGCGC:AGTACTGGCAGCG€TGC'ACGGGC‘TGTACCTCATGCACG
AGATGCACCTTTCGCCCGCGCÄCGAGGAAGCCGÄGGGGAAATCTGAGCCCCGCGCCTGGCTCGCGGC
ATGGCXGGTTCTCTTCTÄCTTrGGÄTGCGTGTCCGTCTCCGTCTGGCTCCTCGÄGGGGTGTTACGGTG gagcggaccäccäcgccgcgcgägcggcäggtccägatatcggcgcgcggcggtcggagtttgätg
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TGCCCCGCGGGGTGGTGGTGGTGGTGGC.GGTGCÄGC‘TCAGAAGCGGTGCCGCGGGCGGGCCCCCGG aggtagggggggctccggtcccgcgggc:aggggcggcagc:gg€acgtcggcgtggagcgcgggc.ag gagttggtgctgtgcgcggaggttgctggggaäggcgäcgacgcggcggttgatctcctggatctgg
CGCCTCTGCGTGAA.GACGÄCGGGCCCGGTGAGCTrGAACCTGAAAGÄGAGTTCGÄCÄGAATCAATCT
CGGTGTCATTGÄCCGCGGCCTGGCGCAGGATCTCCTGCAGGTCTCCCGAG’n'GTGTTGGTAGGCGÄTC
TCGGCCATGAACTGCTCGATCTCTTCCTCCTGGAGGTCTCCGC-GTCCGGGGCGTTCCÄCGGTGGCCGC· cäggtcgttggägatgcgccccatgagctgcgagaäggcgttgägtccgccctcgttccägactcgg ctgtagäccacgcccccctggtcätcgcgggcgcgcätgaccacctgc:gc:gaggttgagctccäcgt gccgcgcgaägacggcgtagttgcgcagacgctggäagaggtagttgägggtggtggcggtgtgct
CGGCCACGAAGäAGTTCäTGACCCAGCGGCGCAAC-GTGGäTTCGTTGATGTCCCCCäAGGCCTCCAG
CCGTTCCATGGCCTCGTAGÄAGTCCÄCGGCGAAGXFGAAAÄACTGGGAGTTGCGCGCCGACÄCGGTC
AACTCCTCCTCCäGAAGACGGäTGÄGCTCGGCGACGGTGTCGCGCäCCTCGCGCTCGAAGGCTÄTGG
GGATCTCTTCCTCCGCXAGCATCACCACCTCCrCCTCTTCCTCCTCTTGTGGCACTTCCATGATGGCTT
CCTCCTCTTCGGGGGGTGGCGGCGGCGGCGGTGGGGGÄGGGGGC-GCTCTGC-GCCGGCGGCGGCGCÄ
CCGGGAGGCGGTCGACGÄÄGCGCGCGÄTCATCTCCCCGCGGCGGCGGCGCÄTGGTCTCGGTGÄCGGC
GC:GGCCGTTCTCCCGGGGGCGCAGTTGGA.4GA€GC:CGCCGGAGATCTGGTGCTGGGGC:GGGTGGCCG
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AÄGGTÄGGCTGAGCACCGTGGCGGGCGGCGGGGGGTGGGGGGÄGTGTCTGGCGGAGGTGCTGCTGA tgatgxaattgäägtaggcggacttgacäcggcggatggtcgacaggagcaccätgtcctfgggtcc
GGCCTGCTGGÄTGCGGAGGCGCTCGGCrATGCCCCAGGCnXGTTCTGGCATCGGCGCÄGGTCCTTG
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CGGCCCTGGGGCGGCGCCGCGCCCCCCTGCCCCCCATGCGCGTGAGCCCGAAGCCCCTGAGCGGTTG
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TTGGA.4GTCATGCAAGTCCACGÄAGGGGTGGIAGGCGCCCGTGTTGÄTGGTGTÄGGTGCAG7TGGCC
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CGCGGGAG’TCGääGÄCGTAGTCGTTGCäAGTCCGCACCÄGGTACTGGTÄGCCCACCÄGGAAGTGCG
GC^GGCGGCTGGCGGTAGAGGGGCCÄGCGGAGGGTGGCGGGGGCTCCGGGGGCCAGGTCTTCCAGCä
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CGTCAGACÄÄCGGXGGÄGTGTXCCTXTrGGCGTTXTTCXGGCCGGGCWCGGCGCCGCGT.AAGÄGAC
TAAGCCGC-GÄÄAGCGAAÄGCAGTAAGTGGCTCGCTCCCCGTAGCCGGAGGGATCCTTGCTAAGGGTT GCGTTGCGGCGAACCCCGGTTGGAATCCCGTACTCGGGCCGGCCGGÄCCCGCGGCTAAGGTGTTGGA ttggcgtccccctcgtat.aaagaccccgcttgc:ggät~gactccggacäcggggaggagcccctttta TTTTTGCTTTCCCCAGATGCATCCGGTGC'TGCGGCAGATGCGCCCCCCGCCCCAGCAGC'AGGäACAAC ACCAGCA.AGAGCGGCAGCAACÄGCAGCGGGÄGTCATGGAGGGCCCCCTCACCCACCCTCGGCGGGC CGGCCäCCTCGGCGTCCGCGGCCGTGTCTGGC’GCCTGCGGCGGCGGCGGGGGGCX'GGCTGACGACCC CGAGGÄGCCXXXGX'GGCGCAGGGCCAGACACTACCTGGACCTGGAGGäGGGCGäGGGGCTGGCGCG GC:TGGGGGCGCCGTCTCGCGAGCGGCäCCCGGGGGTGCAGCTGAAGCGCGACTC‘GCGCGÄGGCOTä θ CGXGCCTCGGCäGAACCXGXTCAGGGACCGCGCGGGCGAGGAGCXCGAGGäGAXGCGGGäCAGGAG
GTTCAGCGCAGGGCGGGAGCTGCGGC’AGGGGCTGA-ACCGGGAGCGGCTGCTGCGCGAGGAGGACTr
TGAGCCCGACGCGCGGACGGGGATCAGCCCCGCGCGCGCGCÄCGTGGCGGCXGCCGACCTGGTGAC
GGCGTAXGAGCAGACGGTGAACCAGGAßÄTCAACrrcCÄAÄAGAGTTTCAACAAGCACGTGCGGAC
GCTGGTGGCGC.GCGAGGAGGTGACCATCGGGCTGÄTGCACCTGTGGGÄCTn'GTAAGCGCGCXGGTG
CÄGAACCCCAACAGCAAGCCTCTGACGGCGCAGCTGTTCCXGATAGTGCAGCACAGCAGGGACAAC
GÄGGCGTTTAGGGACGCGCTGCTGAÄC'ÄTCACCGAGGXCGÄGGGTCGGTGGCTGCTGGACCTGÄTTA
X 5 ÄCATCCTGC‘AGAGCATAGTGGTGCAGGAGCGGäGCCTGAGCX'TGGCCGÄCÄÄGGTGGC:GGCCATCA ACTACTCGATGGTGäGCCTGGGGAAGTTTTACGCGCGCAäGÄTCTäCCäGACGCCGTÄCGTGC'CCÄT AGÄC.XAGGAGGTGAAGATCGACGGTTTTTACATGCGCATGGCGCTGAÄGGTGCTCACCCTGäGCGAC gacctgggcgtgtäccgcäacgagcgcatccacaäggccgtgagcgtgägccggcggcgcgägctg ägcgaccgcgägctgatgcäcagcc.tgcagc:gggc.gctggc:gggcgcxggcagcggcgacägggäg GC'GGAGTCCTÄCTTCGATGCGGGGGCGGACCTGCGC'TGGGC'GCXXAGCCGGCGGGCCCTGGAGGCC GCGGGGGTCCGCGÄGGACXATGACGAGGACGGCGAGGAGGATGäGGAGTACGÄGCTÄGAGGAGGG CGAGTÄC€XGGÄCTAAACCGCGGGTGGTGTTrcCGGTAGAIG€ÄAGAC€CGAÄ€GTGGT&GACCCGG θ CGCTGCGGGCGGCTCTGCAGAGCCÄGCCGTCCGGCCTTAAGTCCTCÄGÄCGACTGGCGACAGGTGAT
GGÄCCGCATCATGTCGC:TGACGGCGCXtTAACCCGGÄCGCGTTCCGGCÄGCäGCCGCäGGCX:ääCÄG
GCTCTCCXCCAIXXtGGAGGCGGTGGTGGCTGCGCGCTCGAACCCCACGCACGAfiÄÄGGTGCTGGCC
ATÄGTGAÄCGCGCTGGCCGAGAACAGGGCCATCCGCCCGGACGAGGCCGGGCTGGTGTACGACGCG
CTGCTGCAGCGCGTGGCCCGCTÄCA.ACAGCGGCA.ACGTGCAGACCÄACXTGGACCGGCTGGTGGGG
GACGTGGGC'GAGGCGGTGGC-GCAGCGCGÄGCGCGCGGATCGGCäGGGCAACCTGGGCTCCATGGTG
GCGCTGÄÄTGCCTrcCTGAGCACGC-AGCCGGCCAACGTGXXGC'GGGGGCÄGGAAGACTÄCACCXAC
5 xttgtgägcgcgctgcggctgatggtgaccgagaccccccägagcgaggxgtaccagtcgggcccgg ÄCXÄCTXCTTCCAGACXAGCAGACAGGGCCTGCAGACGGTGAACCTGAGCCAGGCXTTCAAGäÄCCT GCGGGGGCTGTGGGGGGTGAÄGGCGCeCÄCCGGCGÄCCGGGCGÄCGGTGTCXÄGeCTGCTGAeGCC CÄACTCGCGCXXGCTGCTGCTGCTGAXCGCGCCGTTCACGGACAGCGGCAGCGTGTCCCGGGACACC täcctggggcäcctgctgäccctgtaccgcgaggccatcgggcaggcgcasgtggäcgägcacacct TCCAGGÄGATCACCAGCGTGÄGGCGCGCGC'TGGGGCÄGGAGGACäCGäGCAGCCTGGAGGCGACTC . xgaäcxacctgcxgaccaaccggcggcagaägättccctcgctgcacägcxtgaccxccgäggäggä gcgcatcttgxgctacgtgcägcagagcgtgägcctgäacctgaxgcgcgacggggxgacgcccagc.
-ä
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GTGGCGC'TGGACATGACCGCGCGCÄÄCATGGAACCGGGCATGTACGCCGCGCACCGGCCXTÄCÄTCA accgccxgatggactaccxgcaicgcgcggcggccgig.aaccccgagtacxttaccaacgcxaxcct gaacccggactggctcccgccgcccgggttctacagcgggggcttcgaggtcccggagaccaacgax
GGC:’rrCCTGTGGGACGACATGGACGACÄ«:GTGTTCTCCCCGCGGCGGCÄGGCG€TGGCGGAAGCGT ccctgctgcgtcccäagäaggaggäggaggäggagcxgagtcgccgccgcggcagcagcggcgtgg
CTXCTCTGXCCGäGC:TGGGGGCGGCäGCCGCCGCGCG€CCCGGGTCCCTGGGCGGCAGCXCCXXTCC
GAGCCTGGTGGGGTCTCTGCACAGCGAGCGCACCäCCCGCCCTCGGCTGCTGGGCGAGGAGGAGTäC
CTGAäTäAXXCCCXGCTGCäGCCGGXGCGGGAGAAAAACCTGCCTCCGGCCTTXCCCäACAACGGGA
TAGäGAGCCTGGTGGACAAGÄTGAGCAGÄTGGAAGACCTäTGCGC'äGGAGCACAGGGACGC;GCCTG cgcxccggccgcccacgcggcgccägcgccacgagcgcxagcggggggtggtgxgggatgacgagg
ÂCTCCGCGGACGÂTAGCAGGGTGCTGGACCTGGGAGGGAGCGGCAACCCGTrCGCGCACCTŒGCCC
CCGCCTGGGGAGGATGTTTEAAAAAAAAAAAAAAAAAGCAAGAAGCATGATGCAAAAATXAAAIAA
AACTCACCAÂGœCAXGGCGACCGAGGGTTGGTTrCTTGTGTTCCCTTeAGTÂIGCGGCGCGCGGeG
ATGTACCAGGAGGGÂCCXCCTCCCTCXXACGèGAGCGTGGTGGGC’GCGGC’GGCGGCGGC'GCCCXCTT
CTCCCTTrGCGTCGCÄGCTGC'TGGAGCCGCCGXACGTGCCTCCGCGCXACCTGCGGCCTACGGGGGG
GAGAX4CA:GCATCCGTXäCT€GGäGCTGGCGCCCCXGTXCGACACCäCCCGGGXGXACCTGGTGGAC
AACAAGTCGGC'GGACGTGGCCTCCCTGAAGrACCAGAACGÄGCÄCAGCAATTTTrrGACCÄCGGTCA
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140
B E2016/5434 gäägagccgccggaagcgcgtggcccgccgccäccgccgccgacccggggccgccgccaaacgcgc
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GGAGGTGCCGCCGGCGCXGGAGACGGXGTCCCCCGATGGCKGTGGCGAGAAGCGCCCGCGGCCCGA
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141
B E2016/5434
CGTGGACC'GCGAGGACACCGCGTACTCGTACA.AGGCGCGGTrCACCCTGGCCGTGGGCGACA.A.CCGC
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GTGGCCCCGGGGCTGGTGGACTGCIACATCAACCTGGGCGCGCGCTGGTCGCrGGACTACATGGACA
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CGGGCTCCTAGACCTACGAGTGGAACTTCAGGAAGGATGTCAACATGGTCCTCCAGAGCTCTCTGGG taacgätctcagggtggäcggggccagcatcaagttcgagägcätctgcctctäcgccaccttcttc
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CAäCäGCGCCGGGTGC’TTCäCG-CTGGCCÄGC:ACGC:TGCGGTCGGAGÄXCAGCTCGGCGTCCAGGTCC tccgcgttgctcagcgcgäacggggtcätcttgggcacttgccgccccaggaagggcgcgtgccccg
GTrFCGAGTTGCAGTCGCAGCGCAGCGGGATCAGCAGGTGCCCGTGC'CCGGACTCGGCGTTGGGGTA
CAGCGCGCGCATGAAGGCCTGCäTCTGGC.'GGAAGGCCATCTGGGCCTTGGC:GCCCTCCGAGAAGAAC
ÄTGCCGCAGGÄCTTGCCCGÄGAACXGGTTTGCGGGGCAGGTGGCGTCGTGCÄGGeAGCAGCGCGCGT
CGGTGTTGGCGATCTGCACCÄCGTTGGGCCCCCACCGGTTCTTCACGATCTTGGCCTTGGACGÄTTGC
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CTGCTGCCGTGCÄGACACTTCAGCTCGCCCTCCGTCTCGGTGCAGCGGTGCTGCCACAGCGCGCAGC ccgtgggctcgaaagacttgtaggtcacctccgcgaaggäctgcaggtacccctgcaaaaagcggcc
CäTGäTGGTCäCGAAGGTCTTGTTGCTGCTGAAGGTCäGCTGCAGCCCGCGGTGCTCGX'CGTTCAGCC
AGGTCTTGCÄCÄGGGCCGCCäGCGC’CTCCACCTGGTCGGGCAGCATCTTGAAGTTCACCTTCAGCGCä
TTCTCCACGTGGTACTTGTCCATCAGCGTGCGCGCCGCCTCCATGCCCTTCTCCCÄGGCCGACÄCCAG
CGGCAGGCTCACGGGGTTCTTCACCÄI'C'ÄCCGTGGGCGCCGCXXCCGCCGGGCTTTCGGTTrCCGCCC
CGGTGTrCTCTTCCTCTTCCTCCTCTTGCTCGCCGCCGCCCACTCGCAGCCCCCGCÄCCÄCGGGGTCGT
CTTCCTGCAGGCGCTGCACCTTGCGCTTGCCGTTGCGCCCCTGCTTGATGCGGACGGGCGGGTrGCTG
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GGGGGTrGGTCArCCTCAGTACCGAGGCACGCTTCTTTTTCTTCCTGGGGGCGTTCGCCAGCTCCGCG
GCrGCGGCCGCTGCCGAGGTCGAAGGCCGAGGGGTGGGCGTGCGCGGCÄCCAGCGCGTCCTGCGAG
CCGTCCTCGTCCTCCTCGGACTCGAGACGGAGGCGGGC:CCGGrTCTTCGGGGGC:GC'GCGGGGCGGC:G
GAGGCGGCGGCGGCGACGGAGäCGGGGACGAGAGÄTCGTCCAGGGTGGGTGGACGGCGGGCCGCG ccgcgtccgcgctcgggggtggtctcgc.gctggtcctcttcccgäctggccätctcccäctgc:tcctt
CTCCTATAGGCAGAAÄGÄGATCA'rGGAGTCTCTCATGCGAGTCGAGAAGGÄGGAGGACAGCCTÄAC
CGCCC’CCTCTGAGC’CCTCCACCACCGCCGCCACCACCGCCAATGCCGCCGCGGACGACGCGCCCACC
GAGACCäCCGCCAGTACCACCCTCCCCäGCGACGCACCCCCGCTCGAGAATGAAGTGCTGÄTCGAGC
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CGGGCGGGGGÄACGGAAGCCÄTGATGGTGÄTGÄCGGCTACCTAGACGTGGGAGÄCGACGTGCTGCr
XAAGCACCTGCACCGCCAGTGCGTCÄTCGTCTGCGACGCGCTGCAGGAGCGCTGCGAAGTGCC.CCTG gäcgtggc:ggaggtcägccgcgcctaggagcggcacctcttcgcgccgc:acgtgc:cccccaagc:gcg
GGGAGAACGGCÄCCTGCGÄGCCCAACCCGCGTCTCAÄCTTCTACCCGGTCTTCGCGGTACCCGÄGGT gctggccacctaccacä.tctttttccaaäactgcäagatccccctctcctgccgcgccaaccgcaccc
GCGCCGACAAAÄCCCTGACCCTGCGGCÄGGGCGCCCÄCATAGCTGÄTÄTCGCCTCTCTGGÄGGiAAGT eXCAAGA.'rcTTCGAßGGTCTCGGTCGCGACtäAGÄAACGGGCGGCGAÄCGCTCTGCACGGAGACAG
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CGAAAACGAGAGTCACTCGGGGGTGCTGGTGGAGCTaSAGGGCGACAACGCGCGCCTGGCCGIACT
CAAGCGCAGCATAGAGGTCACCCACTTTGCX‘TACCCGGC:GCTCAACCTGCGCCCCAAGGTCATGAGT gtggtcatgggcgagctcatcatgcfgccgcgccxacxcxxtggccgcggatgcaaacttgcaagagt
CCTCCGAGGAAGGCCTGCCCGCGGTCAGCGACGAGCAGCTGGCGCGXTGGCTGGAGACCCGCGACC
CCGCGCAGCTGGAGGAGCGGCGCAAGCTCATGATGGCCGCGGTGCTGGTCACCGTGGAGC'TCGAGT
GTCTGCäGCGCTTCTTCGCGGACCCCGäGATGCAGCGCAAGGTCGAGGAGACCCTGCACTACACCTT
CCGCCÄGGGCTACGTGCGCCAGGCCTGCAÄGAXCTCCÄACGTGGAGCTCTGCAACCTGGTCTCCTÄC CTGGGCÄTCCrGXAGGÄGAACCGCCTCGGGCÄGAACGTCCTGCACTCCACCCTCAAAGGGGAGGCGC gccgcgäctäcatccgcgäctgcgcctacctcttcctctgctacacctggcagacggccatgggggtc TGGC AGC AGTgC C TGGAGGAgC vC AAC t TC AAGGAG«. TGGAAAAGCTCCTCAAGCGCACCCTCA<X5 GAC C TCTGGAC GGGCTTCAAC G AGC GC TC GGTGGC C GC C GCGCTGGCGGÄCATCÄTCTTTCCCGAGC GC r TGC TC 4AGAC C C TGXAGC 4GGGC C TGC C C GAt TTC AC C AGCCAGÄGCATGCTGCAGÄACTTCAG GACTTTCATCCTGGAGCGCTCGGGCATCCTGCCGGC'CACTTGCTGCGCGCTGCCCÄGCGACTTCGTGC CCATCAÄGTACAGGGAGTGCCCGCCGXCGCTCTGGGGCCACTGCTACCTCTTCCAGCTGGCCAACTA
CCTCGCCTÄCCÄCTCGGÄCCTCÄTGGAAGACGTGÄGCGGCGAGGGCCTGCTCGAGTGCCÄCTGCCGC tgcaacctctgcacgccccäccgctctctagtctgcaacccgcagctgctcägcgägägtcagattat CGGTACCTTCGAGCTGCAGGGTCCCTCGXCTGACGAGAÄGTCCGCGGCTCCAGGGCTGAAACTCACT ccggggctgtggacttccgcctacctacgcaaatttgtacctgaggactaccacgcccacgagatca GGTTCTÄCGA.AGACCAATCCCGCCCGCCCÄÄGGCGGÄGCTCACCGCCTGCGTCATCACCCAGGGGCA CATCCTGGGCCAATTGCAAGCXATCAACAAäGCCCGC'CGAGAGTTCTTGCTGAAAAäGGGTCGGGGG GTGTACCTGGACCCCCAGTCCGGCGAGGAGC-TAAACCCGCTÄCCCCCGCCGCCGCCCCAGCAGCGGG 5 ACCTTGCTTCCCAGGATGGCACCCAGAAAGAAGCAGCAGCCGCCGCCGCCGCCGCAGCCÄTACATGC TTCTGGäGGAAGAGGAGGäGGACTGGGACÄGTCAGGCAGAGGAGGTTTCGGACGÄGGäGCAGGAG gägatgatggaagactgggäggäggacagcagcctägacgäggäagcttcagaggccgaagaggt ggcägacgcaäcaccatcgccctcggtcgcagccccctcgccggggcccctgaäatcctccgaaccc agcaccagcgctataacctccgctcctccggcgccggcgccacccgcccgcagacccaaccgtagat GGGACACCACAGGAACCGGGGTCGGTAAGTCCAAGTCXXCGCCGCCGCCACCGCAGCAGCäGCAGC ägcägcgccagggctaccgctcgtggcgcgggcacaagaacgccatägtcgcctgcttgcaagactg CGGGGG^ACATCTCTTrCGCCCGCCGCTTCCTGCTATrCCACCACGGGCTCGCCTTTCOCCGCAATG
0 tcc:tgcattäctaccgtcätctctäcagcxcctäctgcagcggc:gacccagaggcggcagcg«ägc CACAGCGGCGACCACCA£XTAGGAAGATATCCieCGCGGGCAAGACAGCGGCAGCA.GCGGCCAGGA GäCCCGCGGCäGCäGCGGXGGGAGCGGTGGGCGCACTGCGCCTCTCGCCCAäCGAACCCCTCTCGAC CCCGGAGCTCAGACACAGGATCTTCCCCACTTTGTATGCCATCTrCCAACAGAGCAGAGGCCAGGAG cäggagctgäaäätaaaaäacagätctctgcgctccctcacccgcagctgtctgtätcacääaägcg AÂGATCAGXTTCGGCGCACGCTGGAGGÂCGCGGAGGCACTCTTCAGC.AAATAÇTGCGCGCTCACTCT TÄAAGACTAGCTCCGCGCCCTTCTCGAATTTAGGCGGGAGÄAÄAC’TACGTCÄTCGCCGGCCGCCGCC cagcccgcccagccgägatgägcaäagägättgccacgccatacatgtggagctaccägccgcagä TGGGACTCGCGGCiGGGAGCGGCCCAGGACTACTCCACCCGCATGAACTACATGAGCGCGGGACCCC ACäTGATCTCäCAGGTCäACGGGäTCCGC-GCCCAGXGAAACCAÄATäCTGCTGGAACAGGCGGCCA TCäCCGCCACGCCCCGCCäTAATCTCAäCCCCCGAAATTGGCCCGCCGCCCTCGTGIACCAGGAAAC CCCCTCCGCCÄCCACCGTACTACTTCCGCGTGÄCGCCCÄGGCCGAÄGTCCAGATGACTAÄCTCäGGG GCGCAGCTCGCGGGCGGCTTTCGTCäCGGGGCGCGGCCGGTCCGACCäGGTATAAGACÄC'CTGATGA TCAGAGGCCGAGGTATCCAGCTCÄ.ACGACGÄGTCGGTGÄGCTCTTCGCTCGGTCTCCGTCCGGACGG AACTTTCCAGCTCGCCGGATCCGGCGGCTCTTCGTTCACGCCCCGCCAGGCGTACCTGACTCTGCAGA
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GTCTACTTCAACCCCTTCTCGGGACCTCCCGGACGCTACCCCGACCAGTTCArrCCGAACTTTG,ACGC ggtgaaggactcggc:ggacggctacgactgäatgtgaggtgtcgäggcägagcagc:ttcgcctgag
ACACCTCGAGCACTGCCGCX‘GC:CAC.A4GTGCTTCGCCCGCGGTTCTGGTGAGTTCTGCTACTTTCAGC tacccgäggägcataccgaggc-gccggcgcacggcgtccgcgtgaccacccagggcgäggttäcct gttccctcatccgggagtttaccctccgtcccgtgctagtggagcgggagcggggtccctgtgtccta
ACTATCGCXTGC.AACTGGCCTAACCCTGGATTAGATCAAGATCTrTGCTGTCATCTCTGTGCTGAGTTT aataaacgctgägatcägäätctactggggctcctgtcgccatcctgtgaacgccaccgtcttcaccc accccgaccäggcccaggcgaacctcacctgcggtctgcatcggägggccaagäagtäcctcäcctg gtäcttcaacggcäccccctttgtggtttäcaacagcttcgäcggggacggagtctccctgaaagac cagctctccggtctcagctäctccätccacaägaacaccaccctccaactcttccctccctacctgcg
GGGAACCTACGAGTGCGTCACCGGCCGCTGCACCCACCrCACCCGCCTGATCGTAAACCAGAGCTTT
CCGGGAACAGAIAACTCCCTCTTCCCCAGäACAGGAGGTGäGCTCäGGääACTCCCCGGGGäCCAG
GGCGGAßACGTACCTTCGACCCTTGTGGGGTTAGGÄTTTTTTATTACCGGGTTGCTGGCTCTTrTAAT
CAAAGTTTCCTTGAGATTTGTrCTTTCCTTCTACGTGTATG.AACACCTCAÄCCTCC,AATAACTCTACCC
TrTCTTCGGAATCÄGGTGACTTCTCTGÄAÄTCGGGC’TTGGTGTGCTGCTTACTCTGTTGÄTrTTrrTCC
TTATCATÄCTCÄGCCTTCTGTGCCTCAGGCTCGCCGCCTGCTGCGCACACÄTCTATATCTACTGCTGGT
TGCTCAAGTGCAGGGGTCGCX*ACCCAAGATGAACAGGTACATGGTCCTATCGATCCTAGGC'CTGCTG
GGCCTGGOGGOCTGCAGCGOCGCCAAAÄAAGAGATTAJCCTrPGAGGAGCCCGCTrGCAATGTAACTr
TCAäGCCCGäGGGTGACCAATGCACCACCCTCGTCAAATGCGTTACCAäTCATGAGäGGCTGCGCAT
CGÄCXÄCÄÄÄAACÄAAACTGGCCÄGTTTGCGGTCTATÄGTGTGTTrACGCCCGGAGÄCCCCTCXAAC
TACTCTGTCACeGTCTTCCAGGGCGGACAGTCTAAGATATTCAATTACACTTTCCCTTTTTATGAGTTA
TGCGATGCGGTCATGTACATGTCAAAACAGXACAACCTGTGGCCTXCCTCTCCCCAGGCGTGTGTGG
AAAATACTGGGTCrrACTGCTGIATGGCTTTCGCAATCÄCTACGCTCGCTCTAÄTCTGCACGGTGCTA
TACÄTAÄÄATTCÄGGCÄGÄGGCGÄATCTnATCGATGÄAAÄGÄAÄATGXCTTGATCGCTAACÄCCGG
CTTTCTATCTGCAGAAXGAATGCAATCACCTCCCTACTAATCACCACCACCCTCCTTGCGATrGCCCA
TGGGTrGACACGAÄTCGAAGTGCCÄGTGGGGTCCAATGTCACCATGGTGGGCCCCGCX'GGC.AATTCC
ACCCTCATGTGGGAAAAATrTGTCCGCAATCAATGGGTTCATTrCTGCTCTAACCGAATCAGTATCAA
GCCCAGAGCCATCTGCGATGGGCAAAATCTAACTCTGATCAATGTGCAAATGATGGATGCTGGGTAC •EATrACGGGCAGCGGGGAGAAATCATTAATTACTGGCGACCCCACAÄGGACTACATCCTOCATGTAG
TCGAGGCACTTCCCACTACCACCCCCACTACCACCTCXCCCACCACCAGCACCACTACTACTACTACT
ACTACTACTACrACTAGTAIXACTACCGGTGaXGCCATACCCGCAAAAGCACCATGATTAGCACAA
AGGCCCCTCGTGCTCACrCCCÄCGGCGGCGGGCCCAXCGGTGCGACCXGÄGAAÄCCACCGAGCTrrG
CTTCTGCCAATGCACTAACGGCAGCGCTCATGAACTGTTCGACCTGGAGAATGAGGATGTCCAGCAG
AGCrCCGCTrGCCTGÄCCCAGGAGGCTGTGGAÖCCCGTTGCCCTGAAGCAGATCGGTGATTCAATAA
TTGÄCTCTTCTTCTTTTGCXÄCTCCCGAATÄCCCXCCCGATTCTACrTTCGACÄTCACGGGTACCAAAG
AGCXTAACCTCTCTTrCTACCTGATGCTGCTGCTCTGTATCTCrGTGGTCTCTTCCGCGCTGATGTTAC
XGGGGÄTGTTCTGCXGCXXGATCTGCCGCAGÄAAGÄGAAAAGCTCGCTCTCAGGGCCAACCACTGAT
GC'CCTrCCCCTÄCCCCCCGGATTTTGCÄGATAACAAGATATGAGCTCGGTGCTGACACTAACCGCrTT
ACTAGCCTGCGGTCTAACCCTTGTCGCTTGCGACTCGäGATTCCäCAATGTCACAGCTGTGGCäGGäG .aaaatgttäctttcaacxccacggccgatacccägtggtcgtggagtggctcäggtägctacxtaäct
ATCTGCAATAGCTCCÄCTTCCCCCGGCATAICCCCÄÄCeAAGTACCAATGCAAXGCCÄGCCTGTTXAC
CCTCäXCAACGXTTCCACCCTGGäCäATGGäCTCTATGTAGGCTATGTACCCTTTGGTGGGCAäGGAA
AGACCCACGCTTACAÄCCXGGAAGTTCGCCAGCCCAGAACCACTACCCAÄGCTrCTCCCACCACCAC
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CACCACCACCACGATCACCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCCACAGCAGCAGCAGCAGATTAXTGAC
XTTGGTXXTGGCCA.GCXCÄTCTGCCGCTACCCAGGCCATCTACAGCXCTGTGCCCGAAÄCCÄCTCAGA tccaccgcccagaaacgaccaccgcc'ägcaccctäcäcacctcgägcgatcägatgccgäccaäcat
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TCCGCXCXCGTC.AAXGÄCTGGGCGGGGCXGGGAATGTGGTGGTTCGCXATAGGCATGAXGGCGCXCT
GCCTGCXTCXGCTCTGGCXCATCTGCXGCCXCCACCGCAGGCGAGCCAGACCCCCCAXCXATAGACCC
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TXXTACAGTäXGäTAÄATTGAGACäTGCCTCGCATTXXCXTGTäCÄIGTXCCTXCICCCACCTXXXCTG
GGGTGTTCXACGCTGGCCGCTGTGXCXCACCXGGAGGTAGACTGCCTCTCACCCXXCACTGTCTACCT
GCTTEACGGATTGGTCACCCTCACrCTCATCTGCAGCCTAATCACAGTAATCATCGCCTTCATCCAGT ,
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GCCCACCCTCÄCCTCCTGCCAGTACACCACAAAATCTCCGCGCAAAAGACATGCCTCCTGCCGCTTCA
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GGXCATCTGTGTCTTAGXXTXCTGCAGCACTGXCTTXGGXCXCATÄATCTÄC'CCCXÄCTTXGAIXTGGG atggaaggcgatcgätgccätgaattäccccacctttcccgcacccgagätaaxtccacxgc:gacaa
GTTGTACCCGTTGTCGTTAäTCAACGCCCCGCATCCCCTäCGCCCäCTGäAATCäGCTACTTTAACCT
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GCÄCCAGTGCAAAAGAGGCATCTTTTGTCTGGTAA.AGCAGGCCAAAGTCACCTACGAGAAGACCGG
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TCCCTCCGTCCCTTXCCTCäCCCCTCCCXXCGTGTCTCCCGAXGGäTTCC AAGAAAGTCC CCXCGGGGT
CCTGXCXCTGAACCXGGCCGÄGCCCCTGGXCÄCTXeCCÄCGGCAXGCTCGCtXT&AAAAXGGGAAGX
GGCCTCTCCCTGGACGäCGCXGGCAACCTCÄCCXCTCAAGAXATCÄCCACCGCXAGCCCTCCCCTCAä ääaaäccaagaccaäcctcagcctägaaacctcatcccccctaactgtgagcacctcaggcgccctc
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CCCCTXAGCÄCAAGCAAXGGCAGCXXGGGTAXTGACAXGCAAGCCCCCATXTÄCACCÄCCAÄXGGAA
AACTÄGGACXXAÄCTrrGGGGCTCCCCTG€ATGTGGTAGACAGC-CXA.GATGCACTGACTGTAGTXÄCT ggccaaggxctxacgäxaaacggaacagcccxacäaactagägxctcaggtgcxgtcäactätgäca
CAXCAGGAAACCTAGAäIXGAGAGCTGCAGGGGGTATGCGAGXTGATGCAAATGGTCAäCTIäTCCT
TGATGTAGCTTACCCATTTGATGCACAXAACAATCTCAGCCTrAGGGTXGGACAGGGACCCCTGTTTG
XTAACTCXGCCCACAACTXGGATGTrAACTACAACAGAGGCCTCTACCTGTTCACATCTGGAAATACC aaaaagcxagaägtxxaxatcaaaacagccaagggtcxcattxatgaxgacacxgctäxagcaaxgä
ATtÄGGGreATCGGCTACAGTrrGACTCAGGCrCAGATACAAATCCATTAAAAACrAAACTrCGATT
AG^CTGGàTiATCACTCCAGCAGAGCCÂTAATiœTAAACTGœAACTGGCCTÂAGCTTrGACAAC
ACAGGTGŒATCACACTAGGCAACAAAAATGATXîACÂAGCrrACCTTGTGGACCACACCAGACœAT
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CCCCXAACTGTAGAA.TCTATTCäGäGAAäGäTGCTAAATTCÄCACTTGTTTTGäCTäAATGCGGCAGT cäggtgttggccagcgtttctgttttatctgtaaa,aggtagccttgcgcccatcagtggca€ägtaac
TAGTGC'TCAGÄTTGTCCTCÄGÄITTGATGAAAATGGAGTTCTACTAAGCAATrCTTCCCTTGACCCTC
ÄÄTACTGGAACTACAGAAÄAGGIGACCTTACÄGAGGGCACTGCATATACCÄACGCAGTGGGATTrAT
GCCC.AäCCTCACAGGATACCCAAAAACACAGAGC'CA.AACTGCTÄÄäAGC.AÄCATTGTAäGTCAGGTT
TACTrGAATGGGGACAAATCCAAACCCATGACCCTCACCATTACCCTCAATGGAACTAATGAAACAG
GAGATGCCACAGTAAGCACTTACTCCATGrCATrCTCATGGAACTGGAATGGAAGTAATTACATTAA
TGAAACGTTŒAAACCXACrCCTrCACCTTCTCCTACATCGCCCAAGAATAAAAAGCATGWGCTGTT
GATrTGÄTTCAATGTGTrTCTGTTTTA.TTrTCAAGC'ACAACAAA4TCÄTTCAAGTCÄTTCTTCCATCTT
AGCTTAATÄGACACAGTÄGCTTAAXÄGACCCAGTÄGTGCAAÄGCCCCATTCTÄGCrrATAACTAGTG gagaagtactcgcctacatgggggxagagtcaiäätcgtgcätcaggatagggcggtggtgctgcag
CÄGCGCGCGAATAAACTGCTGCCGCCGCCGCTGCGTCCTGCAGGAATACAACÄTGGCAGTGGTCTCC
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GGCGCTGTATCCAäAGCTCÄTGGCGGGGACCACAGAACCCAGGTGGGCATCATACCACäAGCGCäG
GTAGATTAAGTGGCGACCCCTCATAAACACGCTGGACATAAACATTACCTCTTrrGGCATGTTGTAAT
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CTGGCGAAAACCTGCCCGCCGGCTÄTÄCACTGCÄGGGÄACCGGGACTGGÄÄCAÄTGÄCAGTGGAGA gcccaggäctcgtäaccätggätcatcätgctcgtcatgatätcäatgttggcagäacacägggaca
CGTGCATACACTTCCTCAGGATTACAAGCTCCTCCCGCGTrAGAACCATATCCCAGGGAACAACCCA
TTCCTGAATCAGCGTAAAICCCACACTGCAGGGAAGACCTCGCACGTAACTCACGrrGTGCATTGTC
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GAGGTAGACGATCCCTACTGIACGGAGTGCGCCGAGÄCAAGCGAGÄTCGTGTTGGTCGTÄGTGTCAT
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CAACACrrCGCAGTGTAAAAGGCCAAGTGOCGAGAGAGTAIATATAGGAATAAAAAGTGACGTAAA
CGGGCÄAAGTCCAAAAAACGCCC-ÄGAÄAAACCGCACGCGAACGTACGCCCCGAAACGAAAGC’CÄAÄ
AAACACTAGACACTCCCTTCCGGCGTCAACTTCCGCTTrCCCAGGCTACGTCACTTGCCCCAGTCAAA
CäAäCTACATATCCCGAACTTCCAAGTCGCCäCGCCCAAAACACCGCCTäCACCTCCCCGCCCGCCG
GCCCGCCCCCAAACCCGCCTCCCGCCCXGGGCCCCGCCCCGCGCCGCCCATCTCArrATCATATTGGC
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ATGCAAGCTrGAGTATTCTATAGTGTCACCTAAATAGCTIGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTrrCCT
GTGTGAAÄTTGTTATCCGCTGAGÄATTCCAGÄCÄACATACGÄGCCGGÄÄGCATAAAGTGTÄAAGCCT
GGGGTGCCrAATGACTGÄGCTAACTCACATTAAXTGCGTTGCGCTCÄCTGC-CCGCTTTCCAGTCGGGA aäcctgtcgtgccagctgcättäaxgaätcggccaacgggaaccgcttgcggccgcccgggccgtcg
ACCAATrCTCATOTTTGACAGCTTÄTCATCGAATTTCTGCCAITCAlCCGCTrArrÄTCACTTÄTTCAG catcgcagtactgttgtaattcattaägcättctggcgacatggaagccätcäcaaacggcätgätg aacctgaatcgccagcggcaxcagcaccttgtcgccttgcgtataaiatttgcccatggtgaaaacg
GGGGCGAAGAAGTTGTCCATAXTGGCCACGTTTAAATCAAAACTGGTGAAACTCACCCAGGGATrGG
CTGÄGÄCGAAAAACÄTATTCTCÄÄTAAA.CCGTTTAGGGAAÄXAGGCCAGGTTrTCÄCCGTÄÄCÄCGC cacätcttgcgaaiaxatgtgtagaäactgcgggäaatggtcgtggtättcäctccägagcgätgää
AACGTTTCÄGTrXGCTCAXGGAAAÄCGGTGTAÄCÄAGGGTGÄACÄCrÄTCCCÄTÄTCÄCCÄGCTCÄC cgtctttcättgccätacggaattccggätgagcattcatcäggcggggaägäatgtgäaiaaäggc
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AACGTCTCATTTTCGCCAAAÄGTTGGCCCAGGGCTTCCCGGTATCAACÄGGGACÄCCAGGÄTTTATTr
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CäCäGGAAGGACäGAGAAäGCGCGGäTCTGGGAäGTGACGGACAGAACGGTCäGGACCTGGATTG cgccattcctätgcgatgcäcatgctgiatgccggtätaccgctgaaagttctgcäaagcctgatgg
GÄCATÄAGTCCATCÄGTTCAACGGAAGTCTACACGÄAGGTTnTGCGCTGGATGTGGCTGCCCGGCÄ ccgggtgcägtttgcgätgccggägtctgatgcggttgcgatgctgäaacäattätcctgägaätaa
GCTGGCTGTTÄTCC.ACTGAGAAGCGAACGAAACAGTCGGGAÄAATCTCCCATTATCGTÄGAGATCCG
CÄTTÄTTÄATCTCAGGÄGCCTGTGTACXGTTTAIAGGAAGTAGTG’n'CTGTCÄTGÄTGCCTGC.AAGCG
GTXACGÄAAACGATrTGAATATGCCTTCAGGAACAATÄGAAÄTCTTCGTGCGGTGTTÄCGTTGAÄGT
GGAGCGGATrATCTCAGCAATGGACAGAACA.ACCTAATGAACACAGAA€CATGATGTGGTCTGTCCT
TrrACAGCCAGTAGTGCTCGCCGCAGTCGAGCGACAGGGCGAAGCCCTCGAGTGAGCGAGGAÄGCA
CCAGGGAACAGCACTTATATATrCTGCITAeACACGATGCCTGAAÄÄAACTrCCCTrGGGGTEATCCA
TAGGCCnTATCCATGC'TGGTTCTAGAGAAGGTGTTGTGACAAATTGCCCTTTCAGTGTGACAAATCA
CCCTCAAATGACäGTCCTGTCTGTGäCAAATTGCCCTTÄACCCTGTGäCAAäTTGCCCTCAGäAGäA
GCTGTTTTTTCACÄAAGTTATCCCTGCTTATTGACTC'n'TTrrArrTAGTGTGACAÄTCTÄÄAAACTTG
TCACACnCACATGGATCTGTCATGGCGGAAACAGCGGTTATCAATCACAAGAAACGTAAAAATAGC
CCGCßAATCXxTCCAGTCAAACGACCTCACTGAGGCGGCATATAGIGTCTCCCGGGATCAAAAACGTA
IXXnxnATCTGTrCGTTGACCAGATCAGAAAATCTGATGGCACCCTACAGGAACATGACGGTATCTG
CGÄGATGCäTGTTGCTAAATATGCTGAAATATTCGGATTGACCTCTGC'GGAAGCCäGTAA,GGATATA.
CGGCAGGCATTGAÄGAGTTTCGCGGGGAAGG.AAGTGGTTTTTrATCGCCCTGAÄGAGGATGCCGGGG
ATCAAAAAGGCTATGAAICTTTTCCTTGGTTTATCAAACGTGCGCACAGTCCATCXAGAGGGCnTAC
AGTGTACÄTATCAACCCATATCTCÄTTCCCTTCTTTÄTCGGGTTACAGAÄCCGGTTrACGCAG’TTTCG
GCTTAGTGAAACAAAAGAAATCACCAATCCGTATGCCATGCGTrrATACGAATCœTGTGTCAGTAT cgtaagccggatggc:tcaggcätcgtctgtctgä.aa.atcgactggatcatagägcgttaccägctgc
CTCAAAGTTAGCAGCGTATGCCTGAC'n'CCGCCGGCGCTTCCTGCAGGTCTGTGTrÄATGAGATCAAC
ÄGCÄGAÄCTGCAATGCGCCTCTCÄTACÄTTGÄGÄAAAAGAAÄGGGCGCCAGACGACTGATATCGTAT
TTTCCTTCe^GATATCACTrCCATGACGACAGGATAGTeTGAG^TTATCTGTCACAGATTreAGGG
IGGTOCGTCÄCÄTTTGTTCTGAeCTÄGTGAGGGTAATXTGTCACÄGTrTTGCTGTrTecrrCAGCCTGe
ÄTGGÄTrTTCTCÄTACTTTTTGAACTGT.AATTTTTAA:GG,AÄGCC.AAATTTGAGGGCAGTTTGTCÄCAG
TTGÄTTTCCTrCTCTTTCCCTTCGTCATGTGACCTGÄTATCGGGGGTTAGTTCGTCÄTCÄTTGATGAGG
GTTGATTÄTCACÄG'rrTATTACTCTGAA.TTGGCTATCCGCGTGTGTACCTCTACGTGGAGTT'rrrCCCA
CGGTGGÄTÄTTTCTTCTTGCGCTGAGCGTAAGAGCTÄTCTGACÄGAACAGTTCrrCTTTGCTTCCTCG
CCAGrrCGCTCGCTATGCTCGGTrACACGGCTGœGCGAGCGCTACTGATAATAAGTGACTGAGGTA
TGTGCTCTTCTTATGTCCTTrTGTAGTGTTGCTCTTATTTTAAACÄÄCTTTGCGGTTTTTTGATGACTTT
GCGATTTTGTTGTrGCTTTGCAGTAAATrGCAAGATTTAATAAAAAAAC.GCAAAGCAATGATIAAAG
GATGTrCAGAATGAAACTCATGGAAACACTTAACCAGTGCATAAACGCTGGTCÄTGAAAXGACGAAG
GCTATCGCCATTGCACAGTTTAATGATGACAGCCCGGAAGCGAGGAAAATAACCCGGGGCrGGAGA
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GäCXACCGCACCCGGäTäTGGääATTCGAGGACGGGTTGäGCAACGTGXTGGTXÄTäCÄATTGAACA
AATTAATCATATGCGTGATGTGTTTGGTACGCGAXTGCGACGTGCTGAAGAGGTATTTCXACCGGTGA
TCGGGGTTGCTGCCCATääAGGTGGC’GTTTACAAAÄCCTCAGTTTCTGTXCATCTXGCTCAGGäXCXG
GCTCTGAAGGGGCTACGTGTTXTGCTCGTGGäAGGXA4CGäCCCCCAGGGAACäGCCXCÄATGTATC äcggätgggxaccägatcttcatattcäxgcagaagäcäcxctcctgccttxgxätctxggggäaäag
GACGATGXCACTTATGCAATAXXGCCCACTTGCTGGCCGGGGCXTGACATTATTCCTTCCTGTCTGGC tctgcäccgtaxtgäaäctgägttaatgggcaaatxtgäxgaäggxäaactgcccaccgatccäcäc CTGATGCTCCGÄCTGGCCATTGAAÄCTGTrGCTCÄTGACXAXGATGXCAIAGTTATTGACAGCGCGCC xaacctgggtatcggcäcgäxxääxgtcgtäxgtgcxgctgaxgxgcxgattgttcccacgcctgctg agttgtttgacxäcacctccgcäcxgcagtxxttcgäxatgcttcgtgatctgctcaagaacgxxgat CTXAAAGGGTTCGAGC'CXGAXGXACGTAXTXXGCTXäCCAXLXAC'AGCAÄTAGTAATGGCTCTCAGXC CCX’GXGGATGGAGGAGGAÄATTCGGGATGCCTGGGGAAGCATGGXXCTAAAäAATGTTGTAGGTGAA ACGGAXGAAGTTGGTA.AAGGTCäGäTCCGGATGAGAACXGTTTTXG.AACAGGCXATTGAXCAÄCGC'X CTTCAACTGGTGCCXGGAGAAATGCXCTTXCTATTTGGGäACCTGTCTGCAATGAAAITTXCGATCGT
CTGATTAAÄCXACGCXGGGAGATXAGAXAATGAAGCGTGCGCCTGTTATTCCÄAÄÄCÄXÄCGCTCAA TACTCAACCGGTTGAAGAXACrrCGTTÄTCGACACCAGCTGCCCCGAXGGTGGATTCGTTAATTGGGC gcgtäggagxaätggctcgcggtaätgccattacxttgccxgtätgtggxcgggatgxgaägxxxact eXTGAAGXGCTCCGGGGTGATAGTGTTGAGÄAGÄCCTCTCGGGXATGGTCAGGXÄATGAACGTGACC AGGAGCTGC:TTACTGAGGACGCACTGGATGATCXCAXCCCXTCTXTTCTACXGäCTGGTCAACAGäCA CCGGCGTrCGGXCGAAGAGXATCTGGXGTeAXAGAAATXGeCGATGGGAGTCGeCGTCGTAAAGCTG CTGCACTTACCGäA,XGXGäTTATCGTGTTCTGGTTGGCGAGGTGGATGATGäGCäGATGGCTGCATT ATCCAGArrGGGX,AÄCGATXATCGCCCAACÄAGXG£XTÄXGÄACGTGGTCAGCGTTATGCÄAGCXGA TTGCAG.AXXG.XlTrrGCTGGAAATATTTCTGCGCTGGCXGA.TGCGGAAAAXAXTTCACGXAAGATTAT
ATCTGCCCGGTCAGGTGATGCACTTCAAAA4GCCTTTACäGATAAAGAGGAAXTACTTääGCAGCAG
GCATCTAACCTTCATCtAGCAGAAAAAAGCTGöGöTGATATTTGAAGCrGAAGAAGTrATCAiCTCTTT
TAMTKrTCTGCnAAAACGTCATCTGCATCAAGAACTAGTTTAAGCTCACGACAIXAGTTTGCnXCT
GGAGCGACAGTATTGTATXAGGGCGATAAAATGGTGCrTAACCTGGACÄGGTCTCGrGrrCXAACTG
AGTGTÄTAGAGAAAATTGAGGCCArrCTTAAGGAACTTGÄÄAAGCXÄGCACCCTGATGCGACCACGT
0 TTTAGTCTACGTTXATCTGTCXXTACTXAAIGTCCTXTGXTACAGGCCAGAAAGCATAACXGGCCTGAA XATTCTCTCTGGGCCCACTGTrCCACXTGTAXCGTCGGTCTGATÄATCAGACTGGGACCACGGTCCCA CTCGXäTCGXCGGXCTGäXTäXXäGTCTGGGACCäCGGTCCCACTCGTATCGXCGGTCTGATXATXäG tcxgggaccacggtcccactcgxätcgtcggtctgätäätcagactgggaccacggtcccagtcgtax cgxcggtcxgatxätxagxctgggacxatggtcccäctcgxatcgxcggtcxgäxtatxägtctggga CCäCGGTCCCACTCGTATCGTCGGTCTGATTATTAGTCTGGAäCCACGGTCCCäCTCGTäTCGXCGGT CTGATXATTAGXCXGGGACCACGGXCXCACTCGTäTCGTCGGTCTGATTATTAGTCTGGGACCACGAT
CCCACTCGTGTTGTeGGTCTGATTAXCGGTCTGGGACCACGGTCCCACTTGTATXGTCGAXCAGACTA
5
TCAGGGTGAGÄCTACGäTTCCATCAäTGC‘CTGTCX4GGGCAAGTATTGÄCäTGTCGXCGTAACXTGT
AGAACGGAGTAäCCTCGGTGTGCGGTTGTATGCCTGCXGTGGATTGCTGC'TGTGTCCTGCTTATCCäC
AACÄTTTTGGGCäCGGXTÄTGTGGACXAAXXACCTGGTTACCCAGGCCGTGCXGGCACGTXAACCGG
GCTGCATeCGÄTGCAÄGTGTGXCGCTGTCGACGÄGCTCGCGAGCTCGGÄCAIGÄGGXTGCCeCGTAT
TCAGTGTCGCTGATTTGXÄTTGTCTGA.AGTTGTTXTTACGTXAAGTTGATGCAGATCÄATTAATACGÄT
ÄCCTGCGTCÄXÄ.ATTGATTAXTXGÄCGXGGXTTGATGGCCXCCACGCACGTXGXGATATGTAGATGÄT
ÄATCäTTATGäCTTXäCGGGTCCTXTCXGGTGäTCCGACäGGTTACGGGGCGGCGACCTCGCGGGTTT
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TCGC*XAXTTATGAA.AATTrTCCGGTTXAA:GGCGXTTCCGXTCTXCTXCGTCATAACTTAAXGTXTTXAXT
XÄÄÄAIACeCTCXGAAAASAAAGGÄAÄCGACXGGTGCTGÄAAGCGAGCTTrTTGGCeXCrGXCGTXT
C'ATACAXXAXACGäAGXTäXäXXCGAXGCGGCX*GCäAGGGGTTCGC‘GTCAGCGGGTGXTGGXGGGTG
TCGGGGCTGGCTTAAGTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCAIATGC'GGTGTGAA
ATACCGCACAGÄTGCGXAAGGAGAAäATäCCGCATCAGGCGCXATXCGCCATTCAGGCTGCGXAACT
GTTGGGAäGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTäTTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGC AAGGCGäTTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAA TTGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATrŒAGCTCGCTACCCGGGGA.TœTCGTrrAAAC
SEQ ID NO : 9 - Séquence polynucléotidique codant pour la construction du squelette ChAdl55 No. 1375 10 CAXGATCAATAATATACCTXATTrTGGATTGAAGCCAATATGATAATGAGATGGGCGGCGCGGGGCG
GGGCGCGGGGC’GGGAGGCGGGTTTGGGGGCGGGCCGGCGGGCGGGGCGGTGTGGCGGAAGTGGAX' TTXGTAAGTGTGGCGGATGTGACXXGCTAGXGCXGGGCGCGGXAAAAGTGACGTTXTCCGXGCGCGA CÄÄCGCXXCCGGGÄAGTGAGATTTTTCCCGCGGTTXTTÄCCGGATGTTGTAGTGAAXTTGGGCGTÄÄC GÄÄGXAÄGÄTTTGGCXAXTTTCGCGGGAAAACTG.AAACGGGGAÄGTGAAATCTGÄTTA4.XTXTGCGT tägtcaxaccgcgxaatätxtgxctägggccgägggactxtggcx:gaxtacgxggaggäctcgccca GGTGTTTTTXGAGGTGAATTTCGGCGTTCCGGGTCAAAGTCTGCGXTTTATTAITATAGGATATCCCAT
TGCATACGTTGTAXCCATATCATAAXATGTAGATTTATAXTGGCTCAXGTCCAACAXXACCGCCATGTX gacättgättatxgäctägttättaatagtaatcaätxacggggtcattagttcatägcccätätätg GACTTCCXCGTTMATAÄCrtMrGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCiXAACGACCCXXGCCXÄT TGACGTCAATAATGÄCGXATGTXCCCATAGXAACGCCAATAGGGACTXXCCATXGÄCGTCAÄXGGGT
GGÄGTÄTTTACGGIAÄACTGCCCÄCTTGGCAGTACAXCÄAGTGXATCATÄTGCCAAGTACGCCCCCT ATTGACGTCäATGäCGGTXAXTGGCCCGCGTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTAIGGGäCTTTCC TäCTTGGCAGTACAXCXACGTÄTTAGTCATCGCXAXXACCAXGGTGATGCGGTTXTGGCäGTäCATC‘A atgggcgtggatagcggtttgäctcacggggaxttccäagtctccaccccattgäcgtcxatgggäg
0 TTTGTTTTGGC'ÄCCäAääTCAÄCGGGäCTTXCCAAAATGTCGTAACAA.CTCCGCCCCäTTGACGCAAA tgggcggxaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctcccxätcagtgatägagatct c-cctatcagtgatagagätcgtcgacgagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggägacgccät ccacgctgttxtgacctccätägaägäcäccgggaccgatccagcctgcgcgsccgggaacggxgca TTGGAÄCGCGGÄTTCCCGGTGCCAAGÄGTGAGATCTrCCGTTTATCTÄGGTACCGGGCCCCCCCTCGÄ ggxcgacggtatcgäxaagc;ttcacgctgccgcaagcäctcagggcgcaaggggxgcxaa.aggääg CGGAAC’ÄCGTäGAAAGCCAGTCCGCAGAAACGGXGX'TGACCCCGGAXGääTGTCAGCTäCTGGGCT
5 ATCTGGACÄÄGGGAAAACGCAäGCGCAAAGAGAAAGCÄGGTÄGCXTGCAGTGGGCTIACÄXGGCGA
TAGCTäGäCTGGGCGGTTTXAXGGACAGCAäGC'GäACCGGAATTGCCAGCTGGGGX'GC’CCTCTGGTä
AGGXXGGGAAGCCCTGC.AAAGX.AAACTGGATGGCTrTCTXGCCGCCAAGGAICTGATGGCGCAGG€G atcäagätctäaccaggagctätttäatggcaacagttäaccagctggxacgcaääccäcgtgcxcg
CäAäGTTGCGäAAäGGAACGTGCCTGXGCTGGäAGCATGCCCGCäAAAACGTGGC-GTäTGTACTCGX
GTAXATÄCTACCÄCTCCTAAAAÄÄCCGAACTCCGCGCTGCGTAÄÄGXATGCCGTGXTCGXCTGACTAA cggtttcg.aagtgäcxtcctacätgggtggtgaaggtcäcääcctgcäggägcactccgtgätcctg
ÄTCX:GTGGC‘GGTCGTGTr.AAAGACCTCCCGGGTGTTCGXTÄCCÄCÄCCGTACGTGGXGCGCTTGÄCTG
0 ctccggcgttäaagaccgtaägcaggctcgxtccaägxätggc;gtgäagc:gxccxaaggcttaätgg tägatctgaxcaagagacaggaxgacggtcgtxtcgcaxgcttgaacäagatggattgcäcgcaggt tcxccggccgctxgggtggagaggctattcggcxatgäctgggcäcaacagacaatcggctgctctg
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ATGCGGCCGTGTXCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCXTrTTGXCAÂGACC'GACCXGTCCGGT
GCXXXGAÄTGAACTGCAGGACGAGGCAGCGC'GGCTÄTCGTGGCTGGCCACGAGGGGCGXTCCTTGCG
CAGCTGTGCTCGACGTrGTCACTGAÄGCGGGAAGGGACXGGCTGXXÄ'XTGGGC'GAAGTGCCGGGGC'A ggaxctccxgtcaxctcagctxgcacctgccgaga.aagtätccatcaxggctgatgc;aatgcggcggc
TGCATACGCTTGATCCGGCTAXCXGCCCATTCGACCACXAAGXGAAACATCGCATCGAGCGAGCACG tägtcggätgga.4.gccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggc:tcgcgccä
GCGG.AACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATGTCGTCGTGACCCAXGGCG
ÄXGCCXGCTrGCCGAATATCAXGGTGGAÄAATGGCCGCTTrrCTGGATTCATCGÄCTGTGGCCGGCTG
GGXGXGGCGGäCCGGXAXGAGGACäTäGCGTTGGCXACCCGTGATäTXGCTGäAGAGCTTGGCGGCG äatgggctgaccgc;ttcctcgtgctxxagggtäicgccgctcccgattggcägcgcatcgccttcxät
CGCCXXCTTGACGAGXXCTXCXGAGCGGGACXCTGGGGXXCGAÄÄTGäCCGACCAAGCGACGCCCÄÄ
CCTGCCÄTCACGAGATTXCGÄTTCCÄCCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGÄATCGTTrrCC
GGGACGCCGGCXGGATGAXCCTCCAGCGCGGGGÄTCTCÄXGCTGGAGXXCXXCGCCCACCCCGGGCX
CGATCCCCTCGGGGGGAAXCAGAATTCäGTCGACäGCGGGCGCGATCXGCTGTGCCTTCTAGTTGCX’ ägccätctgitgxxtgcccgtcccccgtgcctxcctxgacccxggaaggtgxcäcxcccäcxgtccttt
CCTAATA.AAATGÄGGAAATTGCATCGCÄTTGTCTGAGTAGGXGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGT
GGGGCäGGACAGCAAGGGGGAGGäTTGGGAAGACäATäGGAGGXATGCXGGGGäTGCGGTGGGCX ctatggccgaxcagcgatcgctgäggxgggtgägtgggcgtggcctggggxggtcätgäaaatäxai aägxxgggggtcxtagggtcxcxtxattxgtgttgcagägaccgccggägcxätgagggggägcagc agcägcagcagtagcäggagcgccttggatggcagcatcgtgagcccttatttgäcgäcgcggätgc
CCCACTGGGCCGGGGXGCGTCäGAAXGXGäTGGGCXCCAGCAXCGACGGCCGACCCGTCCTGCCCGC
AAÄTTCCGCCACGCXGÄCCTArGCGÄCCGTCGCGGGGAGGCCGTTGGACGCCÄCCGCCGCCGCCGCC
GCCACCGCAGCCGCCXCGGCXGXGCGCAGCCXGGCCACGGÄCTXXGCAXXCCXGGGACCACTGGCGA
CÄC-GGGCTACATCTCGGGCXGCTGCAGGX'GXCGXTCGCGAXGAC.AAGCXGACCGGXXTGCTGGCGCA
GrrGGÂlGC'GCTXAC'TCGGGAACXGGGXGACCXXTCXCAGGAGGXCATGGCCCXŒGCCAGCAGGTCX
CCTeCCTGCAAGCAGGCGGGAÄTGCTTCrCCCACAAAXGCCGTTTAÄGAXAAAIÄÄÄACCAGÄCTCT
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TCCäAGAGCTTCTACAACGACCAGGCCGXCXACTCCCÄGCXCAXCCGCCäGTTCACCTCTCTGACCCA
CGTGTrCAATCGCTTTCCTGAGAACCAGATTCTGGCGCGC’CCGCCCGCCCCCACCAXCACCACCGTCA
GTGAAAAGGTTCCTGCXCTCACAGATCACGGGACGCXACCGC^TGCGCAACAGCATCGGAGGAGTCCA
GCGÄGTGACCGTTÄCXGACGCCÄGACGCCGCÄCCTGCCCCTACGTTTÄCÄÄGGCCTTGGGCATAGTC
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CGCCCCäTGAäGCäGGTGGCGCCGGGCCTGGGCGTGCAGACCGTGGACGTGGTCäTCCCCACCGGCA
AGTCCCCCGCCGCCGCCACCäCTACCGCTGCCTCCäCGGäCäTGGAGACÄCAGACCGATCCCGGCGC
AGCCGCAGCCGGAGCXGCCGCCGXGACCTCCTCGGCGGAGGXGCAGACGGACCCCXGGCTGCCGCCG
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GGCGCGGCCTGAGCGGäGGCAGCCGCCGCGCGGACCGGCGGCGACGCGCXACCAGCCGACGCATGC
GCGGC'GGGGTGCTGCCCCTGTTAATCCCCCTGATCGCCGCGGCGÄTCGGCGCCGTGCXCGGGATCGC
CTCCGXGGCCTXGCAA:GCGTCCCAGÄGGCATXGACAGACTIGCAÄACXTGCAAAXATGGAAAAAAAÄ
ACCCCA4TÄAAAA.4GTCTAGACTCTCACGCTCGCTTGGTCCTGTGACTATTTTGTAGA4TGGAA&4C
ATGAACTTTGCGTCGCTGGCCCCGCGTCACGGCTCGCGCCCGTTCCTGGGÄCACTGGAACGATAXCG
GCACCAGCAACAXGAGCtGGTGCXGCCTXCAGTTGGGGCTCTCTGTGGAGCGGCATTAAAAGTATCGG
GTCTGCXGTTAAAAATTACGGCTCCX'GGGCXTGGAACAGCAGCÄCGGGCCAGATGTTGAGAGACAA
GTTGAAAGAGCAGAACTTGCAGCAGAAGGrGGTGGAGGGCCTGGCCTCCGGCATCAACGGGGTGCT
GGACCTGGGCAACCAGGCCGTGCAGAAXAAGÄTCAACAGCAGACXGGACCCCCGGCXGCCGGTGGÄ
GGAGGTGCCGCCGGCGCTGGA.GäCGGTGTCCX:CCGA.TGGGCGTGGCGAG.AAGCGCCCGCGG€XCGA
TAGGGAAGAGACCäCTCTGGXCACGCAGÄCCGAIGAGCCGCCCCCGTATGAGGAGGCCCTGAAGCA
AGGTCTGCCCACCÄGGCGGCCCATCGCGCCCAXGGCCACCGGGGTGGTGGGCXGCCÄCACCCCCGCC äCGCTGGäCTTGCCTCCGCCCGCCGäXGTGCCGCAGCAGCAGAäGGCGGCAGAGCCGGGCCCGCCCG
CGACCGCCTCCCGTTCCTCCGCCGGTCCTCTGCGCXGCGCGGCCA.GC‘GGCXXCCGC‘GGGGGGGTCGC
GAGGGACGGC.4ÄCXGGCAGAGCACGCTGA4CÄGCATCGTGGGTXTGGGGGTGCXA3TCCGTGAÄGCG
CCGCCGATGCTACTGAXrAGCTrAGCTAACGTGTTGTATGTGTGTATGCGCCCTATGXCGCCGCCAGA
GGAGCTGCTGAGTCGCCGCCGTTCGC:GCGCCCäCCACCACCGCCäCTCCGCCCCTCA4GÄTGGCGäC
GCCATCGÂXGAXGCCGCAGXGGTCGXACATGCACATCTCGGGCCAGGACGCCTCGGAGTACCTGAGC
CCCGGGCTGGTGCAGTTCGCXXGCGCXäCCGAGäGCXäCTTCAGCCTGAGXAACAAGTTTAGGAACC
CCäCGGTGGCGCCCäCGCäCGÄTGTGACCACCGäCCGGTCTCAGCGCCTGACGCTGCGGTTXATTCC
CGTGGACCGCGÄGGäCACCGCGTACTCGTACAAGGCGCGGTXC:ACCCTGGCCGTGGGCGäCA4CCGC
GTGCTGGACATGGCCTCCACCTACTTTGACATCCGC-GGGGTCCTGGäXCGGGGTCCCACTTTCAAGCX·
CXäCTCTGGCACCGCCTACäACTCCCTGGCCCCCAAGGGCGCTCCCääC'TCCTGCGAGTGGGÄGGAA <^<X5AAACTCAGGCÄGTTGAAGAAGCAGCAGÄAGAGGAACAAGAAGATGCTGACGGICAA3CTGA
GGAAGAGCAAGCAGCIAGCAAAAAGACTCATGTAXATGCTCAGGGTCCCCXTICXGGCGAAÄAAATr
AGTAAAGATGGTCTGCAAATAGGAACGGA«XrrACAGCTACAGAACAAAAACCTÄTnATGCAGAC
CCTACAXTCCAGCCCGAACCCCääATCGGGGAGTCCCAGXGGAATGAGGCäGATGCTACAGTCGCCG
GCGGTÄGÄGTGCTAAAGAAATCXACTCCCATGÄAACCATGCTATGGTTCCXÄTGCÄAGACCCACA.AA
TCCrAATGGAGGTCAGGGTCTACrAACGGCAAATGCCCAGGGACAGCTAGAATCTCAGGTTGAAATG
CAAXTCTTTTCAÄCTTGTGAAAACGCCCGTAACGÄGGCTAACAÄXATXCAGCCCAAATTGGiXSCTGXÄ
TAGTGAGGATGTGCACATGGAGÂœCCœATACGCACCTTTCrTACAAGCCCGCAAAAAGCGATGAC
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0 AAAATGTTACTTrCAACTCCACGGCCGA.TACCCACTGGTCGTGGAGTGGCTCAGGTAGCTACrTAACr
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TGAAGCGCACCAAAACGTCTGACGAGAGCTTCAACCCCGXGTACCCCTATGACACGGAAAGCGGCCC tccctccgtccctttcctcacccctcccttcgtgtctcccgatggattccaagaaagtcccccxggggt
CCTGTCTCTG.AACCTGGCXGAGCCCCTGGTCAC'rTCCCÄCGGCATGC'TCGCCCTGAAALTGGGAÄGT ggcctctccctggäcgacgctggcäacctcacctctcaagatätcaxcäcxgctagccctcccctcäa aaaaaccaagaccaacctcagcctagaaacctcatcccccctaactgtgagcacctcaggcgccctc accgtagcägccgccgctcccctggcggtggccggcacctccctcaccatgcaatcagaggcccckc
TGACAGTACAGGATGCÄAAACTCÄCCCTGGCCAGCAÄÄGGCCCCCTGÄCCGTGTCTGAÄGGCAAACT ggccttgcaaxcatcggccccgctgäcggccgctgacagcagcäccctcacägtcägtgcgagäcca
CCCCTTAGCACAAGCAATGGCAGCTTGGGTATrGACATGCAAGOCCCCA'rTTACAOCACCAATGGAA
ÂACTAœACTrAACrrTGœGCTCCŒTGCATGTGGTAGACAGCCTAAATGCACTGACTGTAGTTACT ggccaaggtcttäcgätaäacggäagagccctacaaactägagtctcaggtgccgtcaäctatgäcä
CATCÄGGAAACCTAG.AATTGAGAGCTGCAGGGGGTATGCGAGTTGATGCÄÄATGGTCAAC'nAXCCT
TGATGTÄGCTrACCCÄTTTGATGCACAAAACÄÄTCTCAGCX'TTAGGCTTGGACAGGGAGCCCTGTTTG ttaactctgcccacääcttggätgtt.lactäcaacägäggcxtctacctgttcacätctggäaätacc aaäaagctaga.agtt.xaxatcaaäacägccäagggtctcatttätgätgäcactgctätagcaatcä
ATGCGGGTGATGGGCrACAGTTroACTCAGGCTCAjGÄTACAAATOCATTAAAAACTAAACTTGGATT
AGGACTGGATTÄTQACrcCAGCAGAGCCATAATTCCTAAACTGGßAACTGGCCTÄAGCTTTGACAAC
ÄCÄGGTGCCÄTCACAGTAGGCAÄC.AÄAAÄTGATGAGAAGCTTACCTTGTGGÄCCACACCÄGÄCCGAT
CCCCTAACTGTAGAATCTATTCAGAGAAAGäXGCXAAATTCACACTTGTTTTGäCTAAATGCGGCäGT cäggtgttggccagcgtttctgttttatctgtäaäaggtägccttgcgcccatcagtggcacagtääc tagtgc:tcagattgtcctcägatttgatgaa.aatggagttctäcta4gcaattcttcccttgäccctc aatactggaactacagaaaaggtgaccttacagagggcactgcaxatacxaacgcagtgggatttat gcccaäcgtcacagcätacccäaaäacacägagccaäactgctäaaagcäacättgtäägtcäggtt tacttgäatggggacaaatccaääcccatgaccctcaccattäccctcaaxggaäctäätgaäacäg gägatgccäcagtaägcacttaxtccatgtcattctcätggaactggäatggäagtäattäcattäa tgäaacgttcxaaagca.actccttcaccttctcctäcätcgcxcaaga.a.taaäaagcatgacgctgtt
GATTrGArrC.AÄTGTGTTTCTGTrTTATTTrCÄAGCACAACAAAATCATTCAÄGTCÄTTGTTCCÄTCTT
AtXXTAATAGACACAGTÄXXTIAATAGACCCÄGTACTGCÄAAGGCCCATTCTAGCrTATAGATCAGA
CÄGTGATÄÄTTÄÄCCÄCCÄCCÄCCACCATÄCCTmGÄTrCAGGÄAATCATGATGATCAGÄGGÄlCCT
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AXAACACCATCTGGXTGGTCACAGACATGTrCTXAGGGGTTATATTCCACACGGTCTCCTGCCGCGCC aggcgctcgtcggtgatgttgätaaactctcccggcagctcgctcaagttcacgtcgctgtccagcgg
CTGAACCTCCGGCTGACtaCGATAACTGTGCGACCGGCTGKTGGACGAACGGAGGCCGCGCCTACAAG ggggtagagtcatäatcctcggtcaggatägggcggtgatgcägca.gc:agc:gagcgaaäcätctgc xgccgccgccgcxccgtccggcaggäaaagaacäcgccggxggxctcctccgcgataatccgcaccg
CCCGCAGCATGÄGCTXGCTCGTTCTCGGCGGGCäGCACCTCÄCCCXTAXCTCGCTCAAÄTGGGGGCAG
TAGGTAGAGCACAGCACCACGATGTTATrCATGATCCrACACTGCAGGGCGGTGTATCCAAAGCTCA tggcgggaaccaccgcccccacgxggccatcgtaccacaagcgcacgtaaaxcaagtgtcgacccct catgaacgcgctggacacaaacatxacttcctxgggcatgxtgtaätxcaccacctcccggtäccagä
TÄAACCTCXGGTTGAACäGGGCACCTXCCACGACCAXCCTGAACCAAGäGGCCAGAACGTGCCCACC
GGCTATGCACTGCAGGGAACCCGßG?rrGGAACAATGÄCAATGCAGACTCCAAGGCTCCTAACCGTG
GATCäTCCGGCTGCTGAäGGCäTCGäTGTTGGCACäACACAGACÄCACGTGCAXGCACXTTCTCäTG
AXTAGCAGCTCTTCCCXCGTCAGGAieAXATCCCAAGGAATAACCCAXTCTTGAATCAACGTAAAACC
CACACAGCAGGGÄAGGCCTCGCACAXAÄCXCACGTTGTGCATGGTCAGGGTGTTGCATXCCGGAAAC
AGCGGATGATCCXCCÄGXATCGAGGCGCGGGTCTCCTTCTCACAGGGAGGXAAAGGGTCCCTGCXGT acggactgcgccgggacgäccgagätcgtgttgagcgtagxgtcaxggaaaagggaacgccggacg
TGGTGäTACTTCTTGAAGCAGäACCAGGTTCGCGCGTGGCAGGCCXCCTTGCGTCTGCGGTCTCGCCG
TCTAGCTCGCTCCGTGTGATAGTTGTAGTACAGCCACTCCCGCAGAGCGTCGAGGCGCACCCTGGCTr ccggatcxaxgiagacxgcgxcttgcaccgcggcccxgataatätccäccaccgxagaaiaagcaäc acccägccäägcaätacactcgctcxgcgagcggcagacaggaggagcgggcagagätggga^gaac
CATGAXAAAAAACTTTTrXTAAAGAAIATTTTCCAAXTCiTTCGAAAGTAAGATCTAICAAGTGGCAGC
GCTCCCCTCCACTGGCGCGGTCAAACTCTACGGCCAAAGCACÄGÄCÄACGGCAXXTCXAAGÄTGTTC cttaatggcgtccaaaagacacaccgctctcäagttgcaötaäacxatgaaxgaaaacccatccggc
XGAXTrTCGÄATATAGACGCGCCGGCAGCGTCCACCAAACCCAGÄTAATTTXCTTCTCXCCAGCGGXT tacgaxctgxcxaägcaaätccctxaxätcaagxccgaccätgccaääaatctgctcaägagcgccct
CCACCTXCÄTGTÄCAÄGCÄGCGCÄTCäXGATTGCAAAÄAXTCäGGTXCTTCAGAGACCTGTäTAäGÄ ttcaaaatgggäacättaacaaaäattcctctgtcgcgcagatcccttcgcagggcäagctgaacat aatcagäcäggtccgäacggaccagxgaggccäaatccccaccaggaaccagatccagagacocxa tacxgattatgacgcgcatacxcggggctatgctgaccagcgxagcgccgaxgtaggcgtggxgcax gggcggcgagäiaaa.4Igc.aaagtgctggxtaaaaaaxcaggcaaagc:ctcgcgcaaaaaagcxaä eACÄTCATAATCAXGCTCATGC'AGGXAGTTGCAGGTAAGCTCÄGGÄÄCCÄÄÄACGGAATAACÄCÄCG
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gtgxaaaaggccaagtgcggagagagxaiäxaxaggaataaaaagxgäcgtaääcgggcaaagtcc aaaäaacgcccagaaäaaccgcacgcgaacctacgccccgaaäcgaaagccaäaaääcactagac
ACXCCCTTCCGGCGTCAACTTCCGCXXXCCCACGCTACGTCACXTGCCCCäGTCäAACAAACTACäTA tcccgaacxtccaägtcgccacgcccaaaacaccgcctacäcctccccgcccgccggcccgccccca
162
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AACCCGCCTCCCGCCCCGCGCCCCGCCCCGCGCCGCCCATCTCATTATCATATTGGCTTCÄATCCAAA
ATAAGGXAXATXATTGATGATGGTrTAAACGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGC'AAGCTTG
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TTGCTCATGGAAAACGGTGTAACAAGGGTGAÄCACTATCCCAXATCACCÄGCTCÄCCGTCTTTCäTTG ccatäcggäattccggatgagcattcatcaggcgggcaagäatgtgaaxaäaggccggataaaäct
TGXGCTrAXTTTTCTTTACGGXCTTXAAAAAGGCXGX.AATATCCAGCTGAACGGTCTGGTXATAGGTA cattgagcaäctgactgaaatgcctcäaaatgttctttacgatgcgattgggaxatatcaäcggxggt
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GTGäXCTTCCGTCäCAGGTATTTäTXCGCGATääGCTCATGGäGCGGCGXAACCGTCGCäCAGGAAG
GACÄGAGAAAGCGC'GGATCTGGGAÄGXGACGGACAGAACGGTCAGGÄCCXGGÄTTGGGGÄGGXGGX
TGCCGCCGCTGCTGCTGACGGTGTGÄCGTTCXCXGTTCCGGTCACACCACATACGTTCCGCCATTCCT
ÂTœGÂTGCÂCATGCTGTATŒeGGTATACCGCTGAAAGTTCTGCÂAAGCCTGÂTGGGACATAAGTC
CATCAGTTCAAGGGAAGTCTACACGAAGGTTTTTGCGCTGGATGTGGCTGCXCGGCACCGGGTGCAG tttgcgatgccggagtctgatgcggtxgcgatgctgaaacaattätcctgagaatäaatggcttggc
CTXXÄTAXGGAAATGTGGAACTGAGTGGÄTäXGCTGTXXTTGTCTGTT.XXACAGAGAAGC'TGGCTGTT
ATCCÄCTGÄGAXGCGXACGAÄÄCÄGTCGGGÄÄÄAXCTCeCÄTTÄTCGTÄGÄGAICCGCÄTTATTÄAT
CTCAGGAGCCTGTGTAGCGTTTATAGGAAGIAGTGTTCTGTCATGATGCCTGCAAGCGGTAACGAAA
ACGATrTGAATATGCGTTCAGGAACAATAGAAATCTTCGTGCGGTGTTACGTTGAAGTGGAGCGGAT
TATGTCAGCAATGGACAGAACAACCTAAXGAACACAGAACCATGATGXGGTCTGTCCTTTTAeAGCG
AGTAGTGCTCGCCGCAGTCGAGCGACAGGGCGAAGCCCTCGAGTGAGCGAGGAAGCACCAGGGAAC
AGCACTTATAXATXCTGCTTACACACGAXGCCTGAAAAAACTrCCCTTGGGGTTATCCACTTATCCAC äxccatgctggttcxagagäaggxgttgtgacaaattgccctxtcagxgxgacaaätcäccctcääat
GACAGTŒ’XGTCTGTGACAAATTGCCCTrAACCCTGTGACAAATTGCCCTCAGAAGÂAGCTGTTTXTT
CACAAAGTTATCCCTGCTTATTGACTCTTrTTrATTTAGTGTGACAATCTAAAAACXTGTCACACXTCA caxggatctgtcätggcggääacagcggttatcaatcäcäagaaäcgtaaaääxaggccgcgääxc
GTCCäGTCAAACGACCTCACTGAGGCGGCÄXÄXAGTCTCXCCCGGGATCAAAAACGTäTGCTGTÄTC tgttcgttgaccagaxcagaaaatctgätggcacccxacaggaacatgacggtätctgcgagatcca
TGTTGCTAAAIATGCTGAXATATXeGGATTGACCTCTGCGGAAGCCAGTAAGGATATACGGeAGGeA
TTGAAGAGTTTCGCGGGGAAGGAAGTGGTTTTTTATCGCCCTG-AAGAGGATGCCGGCGATGAAAAAG
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ATCAACCCATATCXCATTCCCTTCTTTATCGGGTXACAGAACCGGTTTACGCAGTTTCGGCTrAGTGA
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ÄACAAAAGÄAATCACCAATCCGTATGCCATGCGXTrATACGAÄTCCCTGTGTCAGTATCGTÄAGCCG gatggctcaggcaxcgtctcxctgaaaatcgactggatcaxagagcg'Ttaccagctgcx'tcaaagtt
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CCAATGCGCCTCTCAXACATXGAGAAAAAGAAAGGCCGCCAGACGACTCAXATCGTATTrXCCXTCC
GCGATArCACTXXCATGACGACAGGATAGTCTGAGGGTXAXCTGTCAXAGATTTGAGGGTGGTTCGTC
ACATTTGTTCTGACCTACTGAGGGTAA'TTTGTCAGAGTTTrGCTGTrTCCTTCAGCCTGCAIGGATTTT
CTCATACTTTTTGAACTGTAATXTTTAAGGAAGXCAAATXTGAGGGCAGTXTGXCACAGXTGATTTGC TTCXCTTTCCCTrCGTCATGXGACCTGAXATCGGGGGTTAGTTCGXCAXCATTGATGAGGGITGATXAT CACAGTTTA.rrACTCTGAArrGGCXATCCGCGTGTGTACCTCTACCTGGAGTrTTTCCCACGGTGGAT ÂlTTCTrCTTGCGCTGAGCGTAAGAGCTAÎCTGACAGAACAGTTCTrCTrFGCTTCCTGGCCÀGTTCGC TCGCTATGCTCGGTXACACGGCTGCGGC'GAGCGCTAGTGATAAXAAGTGACTGA:GGTATGTGCTCTTC TTATCTCCTTTTGTAGTGTTGCTCTTATTTT.XAACA.ACTTTGCGGTTTTTTGATGACTTrGCGATTTTGT TGTTGCTTTGCAGTAAATTGCAAGATTTAATAAAAAAACGCAAAGCAATGATTAAAGGAXGTrCAGA ATGAAACTCATGGAAAGACTTAACCAGTGCATAAACGCTGGTCATGAAATGACGAAGGCTATCGCCA θ TTGCACAGTTrAATGATGACAGCCCGGAAGCGAGGAAAATAACCCGGCGCTGGAGAATAGGTGAAG CAGCGGAITTAGTTGGGGTTTCTXCTCAGGCXATCAC-AGAXGCCGAGAA.AGCAGGGCGACTACCGCA CCCGGÄTAXGGAAATTCGAGGACGGGTTGA&GAÄCGTG:TTGGXTÄXACÄATTG.AACA,GATTAATCAT ATGCGTGATGTGTTTGGTACGCGATTGCGÄCGTGCTGXAGACGTATTTCCACCGGTGATCGGGGTTGC TGCeCATAXAGGTGGCe-TTTACAAAACCTCAGTXTCTGTTCATCXTGCTCAGGATCTGGCTCTGAAGG GGCTACGTGTXTTGCTCGTGGAAGGXÄACGACCCCC-AGGGAÄCÄGCCTCAATCTAXCÄCGGAIGGGT äccagatcttcätattcätgcagäagacactctcctgcctttctätcttggggaaaaggacgätgxcä
5 CXTATGCäATAAAGCCCACTTGCTGGCCGGGGC'XT'GACAXTäTTCCTTCCTGTCTGGCTCTGCAXCGT ATTGAAACTGAGTTAATGGGCAAATTrGATGAAGGTAAACTGCCCACCGATXXACACCTGATGCTCC GACTGGCCArrGA„AACTGTTGCTCATGACTATGATGTCATAGTTAXTGACAGCGCGCCTAACCTGGGT ATCGGCACGATTä.4TGTCGTäTGXGC‘TGCTGAXGXGCTGATXGTTCCCACGCCTGCTGAGTTGTTTGA CTACACCTCCGCACTGCÄGTTTTTCGATAXGCTTCGTGÄTCXGCTGAAGAACGTTGATCTTAAAGGGT. tcgagcctgaxgtäcgtättttgcxtaccaääiacagcaatagtäätggctctcagxccccgtggatg GÄGGAGGAAATTCGGGATGCCTGGGGAAGCATGGTTCTAAAAAATGTTGTACGTGAÄACGGATGAA GTrGGTÄAAGGTCAGÄTCCGGATGAGAACTGTTTTTGAACAGGGCATrGÄTCAAGGCTCTTCAACTG gxgcctggagaaatgctctttctatttgggäacctgtctgcaatgäaäxx'ttcgäxcgtctgattaaä <XACGCTGGGAGATTAGATAATGAAGO3TGCGCCTGTEA3TCCAAAACATACGCTCAATACTCAACC ggttgaagaiacttcgttatcgacacxagctgccccgatggtggatxcgxxaattgcgcgcgtagga GTAATGGCTCGCGGTAATGCCATTACTTrGCCrGTAXGTGGTCGGGAXGXGAAGTTTACTCTrGAAGT GXTCCGGGGTGATAGTGTTGAGAAGACCTCTCGGGXAXGGTCAGGTAATGAACGTGACX'AGGAGCTG CTTACTGAGGACGCACTGGAXGATCTCATCXXTrcrTTTCTACTGACTGGTCAACAGACAeCGGCGTT CGGTCGAAGAGTäTCTGGTGTCATAGAAOTGCCGATGGGAGXGGCCGTCGXÄAäGCTGCXGCACTT accgaäagtgätxäxcgxgxtctggttggcgägctggätgätgagcagaxggcxgcaxtaxxcagat tgggtäacgattatcgcccäacaagtgcttäxgaäcgtggtgägcgttatgcäagccgättgcagaa TGäATXTGCTGGäAAXäTTTCTGCGCTGGCTGäTGCGGäAAÄXATTTCACGXX4GAITA'TTäCCCGCX
GGTCAGGTGATGCACTTCÄA.AAAGCCTTTACAGATÄA.AGAGGÄ.ATTACTTAAGCAGCÄGGCATCTÄA
CGTTCATGAGCAGäAAAA.AGCTGGGGTGATäTTTGAAGCTGA.4GAAGTTATCACTCTTTXääCTTCTG
TGCTrAAAACGTCAXCTGCAXCAAGAACTAGTrrAAGCTCACGACATCAGTrTGCTCCTGGAGCGACA
GTA.TTGXATAAGGGCGATAÄAÄTGGTGGTT.AACXTGGACAGGTCTCGTGXTCCÄACTGAGTGTAXÄG
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ÄGAAAÄTTGAGGCCÄTTCTTAAGGAACTrGAAÄAGCCAGCACCCTGATGCGAOCACGTTTTAGTCTA
CGTTTATCTGTCTTrACTTÄATGTCGTTTGTTACÄGGCCAGAAAGCÄT.AACTGGCCTG.AÄTA'rrCTCTC
TGGGCCCACTCTTCCACTTGTATCGTCGGTCTGATAATCAGAiCTÖSGACJCACGGTOXACTOarATCG
TCGGTCTGATTATTAGTCTGGGA.ee A.CGGTCCCACTCGTA.TCGTCGGTCTGATTäTTäGTCTGGGäCC äcggtcccäctcgtatcgtcggtctgatäatcagäctgggäccäcggtcccäctcgtätcgtcggtct gattattagtctgggaccatggtcccactcgtaxcgtcggtctgattattagtctgggaccacggtcc
CACTCGXATCGTCGGTCTGATTÄIXAGXCTGGAACCäCGGTCCCACTCGXÄICGTCGGTCTGATXÄTT agtctgggaccacggtcccäctcgtatcgtcggtctgättattägtctgggäccacgatcccäctcgt gtxgtcggtctgattaxcggtctgggaccacggtcccacttgtättgtcgatcägactatcagcgxgä GACTACGATTCCATCAATGCCTGTCAAGGGCAAGXAXTGACATGXCGTCGTAACCTGTAGAACGGAG TAACCTCGGTGTGCGGTTGTÄTGCCTGCTGTGGATTGCTGCTGTGTCCTGCTTATCCÄCÄ,4CÄTrTTGC GCACGGTTAIGTGGACAAAäXACCTGGTTACCCäGGCCGTGCCGGCACGTXÄACCGGGCTGCATCCG atgcaägtgtgtcgctgtcgäcgagctcgcgagctcggacatgaggttgccccgtattcagtgtcgc tgätttgtättgtctg.aagttgtttttäcgttaagttgatgcägatcäattaaiacgätacctgcgtc 1 θ ATAÄTTGäTXATITGACGTGGTXTGÄTGGCCXCCACGCACGXTGTGATAXGTAGAXGATAäTCATXAT CACrrTACGGGTCCTTTCCGGTGATCCGACAGGTTAŒGGGCGGCGACCTCGCGGGTrrTCGCTATTr ATGAAAATTTTCCGGTTTAAGGCGTTTCCGTTCTTCTTCGTCATAACTTAATGTTTTTATTTAAAATäC CCTCTGAAAAGAAAGGAAÄCGÄCAGGTGCTGAÄAGCGÄGCTTTTrGGCCTCTGTCGTrTCCTTTCTCT gtttttgtccgtggaatgaäcaätggaagtccgagctcatcgctäataäcttcctataggaiacattä TACGAAGTTäTÄTTCGATGCGGCC:GCAAGGGGTTCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTG GCTTAACTäTGCGGCATCAGAGCAGäTTGTACTGAGÄGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCAC
AGATGCGTAAGGÄGAAAATäCCGCATCÄGGCGCCATTCGCCATTCäGGCTGCGCAÄCTGTTGGGAAG GGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAÄAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGäTT AAGTTGGGTAACGCX'AGGGTTTTCCCAGTCACGÄCGTTGTAAAACGACGGCCÄGTGAAXTGXAATAC GACTCACTATAGGGCGAäTTCGÄGCTCGGTACCCGGGGATCCTCGTTTAAAC
SEQ ID NO : 10 - Séquence polynucléotidique codant pour
2Q le ChAdl55 de type sauvage
CATCATCAATX4TATACCTTATTTTGGATTGA4GCeA4IATGATAATGAGATGGG€«3GCG€GGGGCG
GGAGGCGGGTCCGGGGGCGGGCCGGCG&GCGGGGCGGTGTGGCGGAAGTGGäCTTTGTAAGTGTGG
CGGATGTGACnGCTAGTGCCGGGCGCGffrAAAAGtTGACGnTrCCGTGOSCGACAACGCCCACGGG
ÄAGTGACATTrTTCCCGCGGTTTTTÄCCGGATGTTGTAGTGAATTTGGGCGTAACGAAGTÄAGÄTTTG gccattttcgcgggaaaäctgaaacggggaagtgaaätctgättäätttcgcgttagtcatäccgcg
TAATATTTGTCGÄGGGCX'GAGGGACTTTGGCCGäTTACGTGGäGGACTCGCCCÄGGTGTTTTTTGAG
3 GTGAATTrCCGCXTTCCGGGTCAAAGTCTCCGTTTTATTATTATAGTCAGCTGAOGCGGAGTGTATTT ätaccctctgatctcgtcaagtggccactcttgagtgcxägcgagtägagttttctcctctgccgctc TCCGCrCCGCTCCGCTCGGCTCTGACACCGGGGAAAAAATGAGACATTrCACCTACGATGGCGGTGT GCTCACCGGCCAGCTGGCTGCTGAAGTCCTGGACAiCCCTGATCGAGGAßGTATTGGCXaSATAATTAT cctccctcgactccttttgägccacctacacttcacgaactctacgatctggatgtggtggggcccag CGATCCGAACGAGCAGGCCJGTTTCCAGTrmTrCCAGAGTCCATGTTGTTGGCCAGCCAGGAGGGG GTCGA4CTTGAGACCCCTCCTCCGATCGTGGArrCCCCCGATCCGCX-GC‘AGCTGACTAGGCAGCCCG AGCGCTGTGCGGGACCTGAGACTATGeCCCAGCTGCTACCTGAGGTGATCGATCTCACGTGTAATGA
GTCTGGTTTTCCACCCÄGCGAGGÄTGÄGGACGA4GAGGGTGÄGCAGTTTGTGTTAGATTCTGTGGAA caacccgggcgaggatgcaggtcttgtcaatatcaccggaaaaacacaggagactcccagaxtatgt
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GTTCTCTGTGTTATATGAAGATGACCTGTATGTTTATTTACAGXAAGTTTATCATCTGTGGGCAGGTG
GGCTA'TAGTGTGGGTGGTGGTCTn'GGGGGGTrTTTTAATATATGTCAGGGGTTATGGTGAAGACTTT
TTrATTGTGATTTTTAAAGGTCCAGTGTCTGAGCCCGAGCAAGAACCTGAACCGGAGCCTGAGCCTTC tcgc:cccaggagaaaggctgtaatctta,actagacccagcgcaccggtagcgagaggcctcagcagc
GCGGAGACCACCGAC‘TCCGGTGC:TTCCTCäTCACCCCCGGAGäTTCÄCCCCCTGGTGCCCCTGTGTCC
CGTTAAGGCCGTTGCCGTGAGAGTCAGTGGGCGGCGGrCTGCTGTGGAGTGCArrGAGGACTTGCTT
TTTGATTCACAGGAACCTTTGGACTTGAGCTTGAAACGCCCCAGGCATTAAACCTGGTCACCTGGACT
GAATGAGlTGACGCCTATGTrTGCTTTTGAATGACTTAATGTGTATAGATAATAAAGAGTGAGATAAT
GTrTTAATTGiCATGGTGTGTTrAA.CTTGGGCGGAGTCTGCTGGGTATATAAGCTTGCCTGGGCTAAAC
TTGGTTACÄCTTGACCTCATGGAGGCXTGGGAGTGTTTGGAGAACTTTGCCGGAGTTCGTGCXtTGCT
GGÄCGAGÄGCTCTX4CAATACCTCTTGGTGGTGGÄGGTÄTTTGTGGGGCTCTCCCCA.GGGXAÄGTTÄ
GTrrGTAGtAATOAAGGÄGGATTACA»AGTGGGAATTTGAAGAGC:TTTTGAAATCCTGTGGTGÄGCTÄT
TGGATTCTTTGÄATCrAGGCCACCAGGCTCTCTTCCAGGAGAÄGGTCATCÄGGÄCTTTGGATrTTTCC
ATACCCXXiïGCGCATTGGàGCCGCGGTTGCTTTTCTAGCÏTnTrGAAGGÂTAGATGGÂGCGAAGAGA
CAAGAACAGGCTGCAACTGTTGTCTTCCGTCCGCCCGTTGCTGAXTCCGGCGGAGGAGCAACAGGCC
GGGTCAGAGGACCGGGCXCGTCGGGATCCGGAGGAGAGGGCACCGAGGCCGGGCGAGAGGAGCGC
GCTGAACCTGGGAACCGGGCTGÄGCGGCCATCCACATCGGGAGTGÄÄTGTCGGGCAGGTGGTGGAT
CTTTTTCCAGAACTGCGGCGGATTTTGACTATTAGGGAGGATGG<XAATTTGTTAAGGGTCTTA.AGAG
GGAGAGGGGGGCTTCTGAGCATAACGAGGAGGCCAGTAATrTAGCrrTTAGCTTGATGACCAGACAC
CGTC€ÄGAGTGCÄTCACTTrrCAGC:AGATTAAGGACAATTGTGC:CAATGAGTrGGATCTGTTGGGTCA
GAAGTATAGCATAGAGCA.GCTGACCACTTACTGGC'TGCAGC'CGGGTGATGAXCTGGAGGAAGCTATT
AGGGTGTATGCTÄAGGTGGCCCTGCGGCCCGÄTTGCAÄGTACÄAGCTC.AAGGGGCTGGTGAÄTATCÄ
GGAATTGTTGCTACATTTCTGGCAACGGGGCGGAGGTGGAGATAGAGACCGAAGACAGGGTGGCTrr cägatgcägcatgätgaätatgtggcggggggtgctgggcfatggacggggtggtgättatgäätgtg aggttcacggggccxäactttaacggcacggtgtttttggggaacaccaäcctggtcctggacgggg
TGAGCTrCTÄTGGGTrTAAC.AÄCACCTGTGTGGAGGCXTGGACCGATGTGAAGGTCCGCGGTrGC'GC
CTrTTÄTGGÄTGTTGGAÄGGC'CATAGTGÄGCCGCXGTXAGAGCAGGAGTTCCÄrrAAGAAATGCTTG
TTrGÄGAGGTGCACCTTGGGGATCCTGGCCGAGGGC.AACTGCAGGGTGCGCCÄCAATG'TGGCCTCCG
AGTGCGGTTGCTTCATGCTAGTCAAGAGCGTGGCGGTAATCAAGCAXALTATGGTGTGC-GGCAACAG
CGAGGACäAGGCCTCACAGÄTGCTGACCTGCACGGATGGCäACTGCCäCTTGCTGAAGACCATCCAT
GTAACXAGCCÄ:CAGCCGGAÄGGCCTGGCCCGTGTTCGAGCÄCAÄCTrGCTGÄCCCGCTGCTCCTTGC.
ATCTGGGCAACAGGCGGGGGGTGTTCCTGCCCTäTGAATGCAACTTTAGTCACÄCCAAGATCTTGCT
AGAGCCCGÄGAGCÄTGTCCÄAGGTGAACTTGÄACGGGGTGTTTGACATGÄCCÄTGÄAGÄTCTGGAÄ ggtgctgaggtacgacgagaccaggtcccggtgcagaccctgcgagtgcgggggcaagcatatgag gaaccagcccgtgatgctggatgtgaccgäggägctgaggacagäccacttggttctggcctgcäcc agggccgagtttggttctagcgatgaagaxäcagattgaggtgggtgagtgggcgtggcctggggt
GGTCÄTGAAÄÄTÄTÄTAAGTTGGGGGTCTlÄGGGTCTCTTTATrTGTGTTGCAGAGACCGCCGGAGCC atgagcgggagcagcagcagcägcagtägcägcagcgccttggätggcagcatggtgagcccttät
TTGACGAeGCGGATGCCCCACTGGGCCGGGGTGCGTCAGAATGTGATGGGCTCCAGCATCGACGGCC
GACCCGTCCTGCCCGCÄA,4TTCCGC’CACGGTGäCCTATGC:gäCCGTCGCGGGGACGCCGTTGGäCGC
CACCGCCGCCGCCGCCGCCACCGCAGCCGCCTCGGCCGTGCGCAGCCTGGCCACGGACTrTGCATTC
CTGGGACCÄCTGGCGACAGGGGCTACTTCTCGGGCCGCTGCTGCCGCCGTTCGCGäTGACAÄGCTGA
CCGCCCTGCTGGCGCAGTTGGATGCGCTTäCTCGGGAACTGGGTGACCTTTCTCAGCAGGTCÄTGGCC
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CTGCGCC'äGC'AGGTCTCCTCCCTGC'.äAGCTGGC‘GGGAATGCTTCTCCCACAAATGCCGTTTäAGATA
AATAAAACCAGäCTCTGTTTGGäTTAAäGAAAAGTäGCAAGTGCATTGCTCTCTTTÄTXTCATAATTT tccgcgcgcgäxäggccctägaccagcgttgtcggtcgttgagggtgcggtgtatcttctccaggäc
GTGGTAGAGGTGGCTCTGGACGTrGAGATACATGGGCATGAGCCCGTCCCGGGGGTGGAGGTAGC'A
CCACTGCäGAGCTTCAT&CTCCGGGGTGGTGTTGTäGATGATCCAGTCGTAGCAGGAGCGCTGGGCA
TGGTGCCTäAääATGTGCTTCAGCAGCAGGCCGATGGCCAGGGGGAGGCCCTTGGTGTAAGTGTTTA
CäAAÄCGGTXAAGTXGGGAAGGGTGCATXCGGGGAGAGATGATGTGCAXCTXGGACTGTäXTXTIAG AXTGGCGATGTTXCCGCCCÄGÄTC'CCTTCTGGGATTCATGTTGTGCAGGACCÄCCAGXäCAGTGXAXC CGGXGCÄCTTGGGGAÄXrTGTCÄXGCÄGCTTAGÄÜGGÄÄAÄGCGTGGÄAGAACXTGGAGACGCeXTX' GXGGCCXCCCAGATTXTCCÄXGCATTCGTCCATGATGATGGCAATGGGCCCGCGGGÄGGCAGCXXGG GCAAAGAXATTTCTGGGGTCGCTGACGTCGTAGTTGTGTTCCAGGGTGÄGGTCGTCATÄGGCKATTTT' TACAAÄGCGCGGGCGGAGGGTGCCCGACTGGGGGAXGATGGiCCCCTCTGGCCCTGGGGCGTAGTrGi GCXTCGCAGATCTGCATnOCCAGGCCTTAATCTCGGAGGGGGGAATCATATCCACCTGCGGGGCGA TGAAGAAAACGGTTTCCGGAGCCGGGGAGäTTAACTGGGATGAGäGCAGGTTTCTA.AGCAGCTGTG 10 ATrTTCCACAACCGGTGGGCCCÄTAÄATAACACCTAT.AACCGGTTGCAGCTGGTAGTnAGA.GAGCT gcagctgccgtcgtcccggaggaggggggcxacctcgttgagcatgtccctgaggcgcatgttctcc CCGACCAGATCCGCCAGAAGGCGCTCGCCGCCCAGGGACAGCAGC'TCTTGCAÄGGAAGCAAAGTTTT TCAGCGGCXXGÄGGCCGTCCGCCGTGGGCATGTXTTrCAGGGTCTGGCTCAGCAGCTCCAGGCGGTCC: CAGäGCTCGGTGÄCGTGCACTACGGCATCXCTAXCCAGCAXATCTCCTCGTTTCGCGGGTTGGGGCGA. CTTTCGCTGTAGGGCÄCCAÄGCGGTGGTCGTCCAGCGGGGCGAGAGTCATGTCCTTCCATGGGCGCA GGGTCCTCGTCAGGGTGGTCTGGGTCACGGTGAAGGGGTGC:GCTCCGGGCTGAGCGC'TTGCC.AAGGT
GC;GCTTGäGGCTGGTTCTGCTGGTGCTGAAGC:GC'TGCCGGTCTTCGCCCTGC‘GC'GTCGGCCAGGTAGC' ATTTGÄCCATGGTGTCÄTAGTCCAGCCCCTCCGCGGCGTGTCCCTTGGCGCGCAGCTTGCCCTTGGAG gtggcgccgcacgaggggcagagcaggctcttgagcgcgtagagcttgggggcgaggaagaccgat TCGGGGGAGTâGGCGXCCGCGCCŒAGACCCCGCACACGGXCXCGCACTCCACCAGCCâGGTGAGCT' CGGGGCGCGCCGGGTCAAAAACCAGGTTTCCCCCATGCTnTrGATGGGTTrCTTACCTCGGGTCTCC äTGAGGTGGTGTCCCCGCTCGGTGACGAAGAGGCTGTCCGTGTCTCCGTAGAGCGACTTGAGGGGTC TTTTCTCCAGGGGGGTCCCTCGGTCTTCCTCGTAGAGGAACTCGGäCCACTCTGAGACGAÄGGCCCG CGXCCAGGCCAGGACGAAGGAGGCXÄXGTGGGAGGGGTAGCGGTCGTrGTCCACTAGGGGGTCCAC CTXCTCCAÄGGTGTGAÄGACACAJGTCGCCTTCCXCGGCGTCCAGGÄÄGGTGATXGGCXTGXAGGXGT’ AGGCX'äCGXGACCGGGGGTXCCTGACGGGGGGGTATAAAAGGGGGTGGGGGX'GC'GCTCGTCGTCäC TCTCrrCCGC:AXCGC-TGTCTGC‘GAGGGXCAGCTGCTGGGGTGAGTATTCCeTCTCGAAGGCGGGCATGi ÄCCTCCGCGC'TGÄGGTTGTCAGTTTCCAAAAÄCGAGGAGGATrTGÄTGTTCAC-CTGTCCCGAGGTGÄ TACCTTTGAGGGTAXGCGCGTCCATCTGGTCAGAAAACACGATCTTTTrATTGTCCAGCTTGGTGGCG AACGACCCGTÄGAGGGCGTTGGAGAGCAGCTTGGCGATGGAGCGCAGGGTCTGGTTCTTGTCCCTGT CGGCGCGCTCCTTGGCCGC:GATGTTGAGCTGCACGTäCTCGCGCGCGäCGCäGCGC'€ACTCGGGGAÄ
GAXGGTGGTGCGCTCGTCGGGCACCAGGCGCACŒGCCAGCCGCGGTTGTGCAGGGTGACCAGGTCC ÄCGCTGGTGGCGACC’TCGCCGCGCÄGGCGCTCGTTGGTCCÄGCAGÄGäCGGCCGCCCTTGCGCGAGC AGAAGGGGGGCAGGGGGTCGAGCTGGGTCTCGTCCGGGGGGTCCGCGTCCÄCGGTGÄAAACCCCGG GGCGCAGGCGCGCGTCGAAGTAGTCTäTCTTGCAACCTTGCäTGTCCAGCGCCTGCTGCCAGTCGCG GGCGGCGAGCGCGXGCTCGTAGGGGTTGäGGGGCGGGCCCCAGGGCÄTGGGGTGGGTGAGTGCGGA GGCXJTACATGGCGCAGAXGTCATAGACGTAGAGGGGCTCCCGeAGGACCCCGAXGTAGGTGGGGTA GCAGCGGCCGCCGCGGATGCTGGCGCGCACGTÄGTCATACAGCTCGTGCGAGGGGGCGAGGAGGTC GGGGCC-CAGGTTGGTGCGGGC’GGGGCGCTCCGCGCGGäAGACGATCTGCCTGAVGATGGCäXGCGA
167
B E2016/5434 gttggaagagätggtggggcgctggaägäcgttgäaggtggcgtcctgcaggccgacggcgtcgcg
CACGAAGGAGGCGTäGGAGTCGCGCAGCTTCTGTACCAGCTCGGCGGTGACCTGCäCGTCGAGCGC
GCAGTAGTCGAGGGTCTCGCGGÄTGÄTGTCÄTÄTTTÄGCCIGCCCCTTCrrTTTCCÄCAGCTCGCGGT
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16Ö
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GTACGAGCTÄGAGGAGGGCGAGTACCTGGACTAAACCGCGGGTGGTGTrrCCGGTAGATGCTAAGÄC
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0 ACCCGCCGCCGCCGCCGCAGACGCGÄGCCCGCACTGGCTCCAGTCTCCGTGAGGAÄÄGTGGCGCGCG acggagacaccctggtgctgcccagggcgcgctaccaccccagcatcgtttaaaagcctgttgtggt TCTTœAGATATGGœCKACTTGCCGCCTCCGTTrcCCGGTGœGGGATACCGAGGAGGAAGATCG cgccgcaggaggggtctggccggccgcggcctgagcggaggcägccgccgcgcgcaccggcggcga CGCGCCÄCCAGCCGACGC-ÄTGC:GCGGC:GGGGTGCTGCCCCTGTT.A.4TCCCCCTGäTCGCCGCGGCGä tcggc:gccgtgcccgggatcgcctccgtggccttgcaaœgtcccagaggcattgacagacttgc:aa acttgcäaatatggaaäaaääaaccccäataäaaäagtctagactctcacgctcgcttggtcctgtg o r- ACTATTTTGTAGAATGGAAGACATCAACTTTGCGTCGCTGGCCCCGCGTCACGGCTCGCGCCCGTTCC
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AGGCAGATGCTACAGTŒCCGGCGGTAGAGTGCTAAAGAAATCTACTCCCATGAAACCATGCTATGG TTCCTATGCAAGACCCACAAATGCTAATGGAGGTCAGGGTGTACTAACGGCAAATGCCCAGGGACAG CTAGAATCTCAGGTrGAAATGCAATTCTrTTCAACTrCTGAAAACGCCCGTAACGAGGC3TAACAACA TXCAGCCCAAATTGGTGCTGTäTäGXGäGGATGTGCäCAXGGäGACCCCGGAXÄCGCACCTTTCTTäC AAGCCOXAAAAAGCGATGACAATTCAAAAATCATGCTGGGTCAGCAGTCCATGCCCAACAGACCT AATTAGATCGGCTTCAGAGACAACTTTATCGGCCTCÄTGTÄTXACAAXAGCACTGGCÄACATGGGAG tgctxgcaggtcagggctctcagttg.aatgcagtggtggacttgc:aagacagaaacacagaactgtc C'rAC.CAGCTCTTGCrTGATTCCATGGGTGAGAGiAACCAGATAGT’TTTCCATGTGGAATCAGGCAGTGG ACAGTTATGACCCAGATGTTAGAATTATTGAAAATCATGGAACTGAAGACGAGCTCCCCAACTATTG TTTCCCTCTGGGTGGCÄTAGGGGTAACTGACACTTACCAGGCTGTTAAAACCAACAATGGCAATAAC GGGGGCCAGGTGACTTGGACAAAAGATGAAACTTTTGCAGATCGCAATGAAATAGGGGTGGGAAAC .4ÄTTTCGCTÄTGGAGATGÄA€CTCÄGTGCCAACCTGTGGAGA.AACTTCCTGTACTCCA.ACGTGGCGCX GTACCTACCAGACAAGCTTAAGTACAACeCCTCCAATGTGGACATCTCTGACAACCCCAACACCTAC GATTACATGÄACAÄGCGAGTGGTGGCX'CCGGGGCTGGTGGACTGCTACATCAACCTGGGXGCGCGCT
0 ggtcgctggactacatggacaacgtcaaccccttgaaccäccaccgcaäxgcgggcctgcggtaccg CTCCATGCTCCTCGGCAAC«KÏCGCTACGTGCCCTTœACAT<XA«yrGCCCCAGAAGTTCTTrGCCA tcaägäacctcctcctccxgccgggctcctacäcctacgägxggaäcttcaggaaggätgtgaacät ggtcx tc caga&c xc tctgg&taac gaxctc agggtggaxg&ggcc AGCATt aagttcgagagx ax c XGCC TCXAC GC CACCXXCTXC CCX AXGGCXX AC ÄACACG&C C XCC ACGC TC GAGGC C AT&C TCAGGAA CGACAC CAAC GACCAGIC C TTC AAT&ACTACCTCTCCGC C GCCAAC ATGCTCTAC CCX ATAC CC GC C A ACGCXACCAACGTCCCCATCTCCÄTCCCCTCGCGCAACTGGGCGGCCTTCCGCGGCTGGGCCTTCACC
5 cgcctcäagaccääggägaccccctccctgggctcgggättcgaccccxacxacacctactcgggct CCATTGCXXACCTGGACGGCACCTTCTACCTCAAiXACACTn'CAAGAAGGTCTCGGTCACCTTCGAC TCGTCGGTCAGCXGGCCGGGCä,4.CGACCGTCTGCXCACCCCCAACGAGTTCGAGATCAAGCGCTCGG TCGACGGGGAGGGCTACAACGTGGCCCAGXGCAACÄXGäCCäAGGACTGGXTCGTGGTCXAGATGCX ggccaacxaxaacaxcggctaccägggcttctacätcccagagagctacaaggäcäggätgtactcc txcttcäggaäcxtccagcccaxgägccggcaggtggxggäccagaccaagtacaaggaxxaccagg aggtgggcatcatccaccagcacaäcäactcgggcttcgtgggctacctcgcccccäccätgcgcgä gggäcäggcctäccccgcc.äa.ctxccc:ctätccgctcätaggcaägäcc‘gcggtcgäcagcätcacc
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CAGAAAAAGTTCCrCTGCGACCGCACCCTCTGGCGCATCCCCTTCTCCAGCAACTTCATGTCCATGGG
TGC:GCTCTCGGACCTGGGGCAGAACTrGCTCTACGCCAACT€CGCCCACGCCCTCGACATGACCTrCG
ÄGGTCGACCCCATGGACGAGCCCACCCTTCTCTATGTTCTGTTCGAAGTCTn'GACGTGGTCCGGGTC
CACGAGCCGCACCGCGGCGTCATCGAGACCGTGIACCTGCGTACGCCCTrCTCGGCCGGCAACGCCA
CCÄCCTAAAGAAGGAAGCCGCAGTCATCGCCGCCTGCATGCXGTCGGGTTCCACCGÄGCAAGAGCTC
ÄGGGCGÄTCGTCAGÄGACCTGGGÄTGC-GGGCCCTATTrTTrGGGGAXCTTCGACAAGCGCTTCCCTG gc:tttgtctccccacacäagc:tggcctgcgccatcgtc.aacäcggccggccgcgagaccgggggcgt
GCACrGGCXGGCCTTCGCCTGGAACCCGCGCTCCAAAACATGCTTCCTCTTTGACCCCTTCGGCITTTT
CGGACCAGCGGCrCAÄGCAAATCTACGAGTTCGAGTACGAGGGCTTGCTGCGTCGCÄGCGCCÄTCGC
CTCCTCGCCCGÄCCGCTGCGTCÄCCCTCGAAAAGTCCACCCAGÄCCGTGCAGGGGCCCGACTCGGeC
GCCTGCGGTCTCTTCTGCTGCATGTTTCTGCÄCGCCrrTGTGCÄCTGGCCTCÄGAGTCCCATGGACCG
CAACCCCÄCCÄTGAACTTGCTGACGGGGGTGCCCAACTCCÄTGCTCCÄGAGCCCCCAGGTCGAGCCC
ACCCTGCGCCGC,A%CCAGGAGCAGCTCTACAGCTTCCTGGAGCGCCäCTCGCX:TTäCTTCCGCCGC:C
ÄCÄGCGCÄCAGATGAGGAGGGCCACCTCCTTCTGCCACTTGCAAGAGATGCAÄGÄAGGGTAATAAC
CCCACCACCACCCGCCGrrGTCGCCATCTGGCTCTATTTAGAAATCGAAAGGGTTCTGCCGGGAGTCG
CCGTGCGCCACGGGCAGGGACACGTTGCGATACTGGTAGCGGGTGCGCCACTTGAACTaSGGCACCA
CCAGGCGAGGCAGCTCGGGGÄÄGTTrTCGCTGC'ACAGGCTGCGGGTCAGCACCAGCGCGTTCATCAG gtcgggcgccgägätcttgaagtcgcägttggggccgccgc:cctgcgcgcgcgägttgcggtacacc
GGGTTGCAGCACTGGAACÄCCAACAGCGGCGGGTGCTTCACGCTGGCCAGCACGCTGCGGTCGGäG äTCAGCTCGGCGTCCÄGGTCCTCCG€GTTGCCÄGC'GCGA_ACGGGGTCATCTTGGGCACTTGCCGCCC
CAGGAAGGGCGCGTGCCCCGGTTTCGAGTTGCAGTCGCAGCGCäGCGGGATCAGCAGGTGCCCGTGC ccggäctcggc:gttggggtacägcgcgcgcatgä,aggcctgcätctggcggäaggcx‘ätctgggcct
TGGCGCCCTCCGAGA;AGAACATGCCGCAGGÄCTrGCCCGAGÄÄCTGGTTrGCGGGGCAGCTGGCGTC
GTGC3AGGCAGCAGC:GC:GC:GTCGGTGTTGGCGATCTGCiAGCA.CGTTGeGCCCCCÄCCGGTTCTTCACG
ATCTTGGCCTTGGACGÄTTGCTCCTTCAGCGCGCGCTGCCCGTTCTGGCXGGTCACÄTCCÄTCTCGAT
CACÄTGTTCCrrGTTCACCÄTGCTGCTGCCGTGCAGÄCÄCTTCÄGCTCGCCCTCCGTCTCGGTGGAGC
GGTGCTGCC:ACäGCGCGCAGCCCGTGGGCTCGAAAGACTTGTAGGTCACCTCCGCGAAGGACTGC’AG
GTACCCCTGCA.AAA4GCGGCCCÄTCÄTGGTCACGAAGGTCTTGTTGCTGGTGAAGGTCAGCTGCAGC
CCGCGGTGCTCCTCGTTCAGC‘CAGGTCTTGCACACGGCCGCCAGCGC:CTCCÄCCTGGTCGGGCÄGCÄ
TCTTGAAGTTCACCTTCAGCTCArrCTCCACGTGGTACTTGTCCATCAGCGTGCGCGCCGCCTCCATG
CCCTTCTCCCÄGGCCGÄCACCÄGCGGCAGGCTCACGGGGTrCTTCÄCCATCACCGTGGCCGCCGCCTC
CGCXGCGCTTTCGCTTTCCGCCCCGCTGTTCTCTTCCTCTTCCTGCTCTrCCTCGCCGCCGCCCACTCGC
AGeCCCCGCACCÄCGGGGTCGTCTTCCTGCÄGGCGCTGCACCTTGCGC'TTGCCGTTGCGCCCCTGCTT
GATGCGCÄCGGGCGGGTTGCTGAAGCCCACCATCÄCCÄGCGCGGCCTeTTCTrGCXCGTCCTCGCTGT
GGGGCGTTCGCCAGCTCCGCGGCTGCGGCCGCTGCCGAGGTCGAAGGCCGAGGGCTGGGC’GTGCGC ggcäccagcgcgtcctgcgagc:cgtcctcgtcctcctcggäctcgagacggaggcgggc:ccgc.ttct
TCGGGGGCGCGCGGGGCGGCGGAGGCGGCGGCGGCGäCGGAGACGGGGACGäGACATCGTCCäGG
GTGGGTGGACGGCGGGCCGCGCCGCGTCGGCGCTCGGGGGTGGTCTCGCGCTGGTCCTCTTCCCGAC tggccätctcccagtgctccttctcctätäggcagäaagagatcatggagtctctcatgcgägtcgag
AAGGAGGAGGACAGCCTAACCGCXXX'CTCTGAGCCGTCCACCACCGCCGCXAGCACCGCCAATGCCG
CCGCGGACGACGCGCOCACCGAGACCACCGCCAGIAGCACCCTCCCCAGCGACGCACCCCCGCTCGA
GAATGAAGTGGTGATCGAGCAGGACCCGGGTTTTGTGAGCGGAGAGGAGGATGAGGTgGATGAGAA
173
B E2016/5434
GQAGAAGGAGGAGGTCGCCGCCTCAGTGCCAAAAGAGGATAAAAAGCAAGACCAGGACXSACGCAG
ATAAGGATGAGACAGCAGTCGGGCGGGGGAÄCGGAAGCCATGATGCXGATGACGGCIACCTAGACG
TGGGAGACGACGTGCXGCTTÄAGCACCTGCAGCGCCAGTGCGTCäTCGTCTGCGACGCGCTGCAGGA
GCGCTGCGAAGTGCCCCTGGACGTGGCGGAGGTCAGCCGCGCCTÄCGÄGCGGCÄCCTCTTCGCGCCG
CACGTGCCCCCCÄAGCGCCGGGAGAACGGCACCTGCGAGCCGAACCCGCGTCTCÄACTTCTACC'CGG
TCTTCGCîàGTACCCGAGGrTGCTGGCCACCTACCACAXCTTrn'CCAAAACTGCAA.GATCOCCCTCTCC
TGCGGCGCCAACGGCACCCGCGCCGACAAAACCCTGACCCTGCGGCÄGGGCGGCCACATACCTGÄTA TCGCCTCTCTGGAGGAAGTGCCCAAGATCrrCGAGGGTCTCGGTCGCGACGAGAAACGGGC:GGCGAA CGCTCTGCACGGAGACAGCGAAAACGAGAGTCACTCGGGGGTGCTGGTGGAGCTCGAGGGCGACAA cgc:gcgcctggccgtactcäagcgcägcatägaggtcacgcactttgcctacccggcgctcaacctg CCCCCCAAGGTCAXGAGTGTGGTCÄTGGGCGAGCTCArCATGCGCCGCGCCCAGCCCCTGGCCGCGG ATGCAAÄCTTGCA.AGAGTCCTCCGAGGAAGGCCTGCCGGCGGTCAGGGACGAGCÄGCTGGCGCGCT GGCTGGAGACCCGCGACCCCGCGCAGCTGGAGGAGCGGCGCAäGGTCAXGäJGGCCGCGGTGCTGG TCACCGTGGAGCTCGÄGTGTCTGGAGCGCTTCTTCGCGGÄCCCCGAGATGCAGCGCAAGCTCGAGGA o GACGCTGCACTACACCTTGCGCCAGGGCTäCGTGCGCCÄGGCCTGGAAGATCTCCAäCGTGGAGCTG
TGCAACCTGGTCTCCTACCTGGGCATCCTGCACGAGAACCGCCTCGGGCAGAACGTCCTGCACTCCA
CCCTCAAÄGGGGAGGCGCGCCGCGAGTACATCCGCGÄCTGCGCCTACCTCTTeCTCTGCTÄCACCrG
GCAGACGGCCATGGGGGTCTGGCAGCÄGTGCCTGGAGGAGCGCAACCTCAAGGAGCTGGAA.GAGCT
CCTCÄAGCGCACCCTCAGGGACCTCTGGACGGGCTrCAACGAGCGCTCGGTGGCCGGCGCGCTCGCG
GACATCATCTTTGCCGAGCGCCTGCTCAAGäGCCTGCAGCAGGGCCTGCCCGACTTCACCAGCCAGA
GCATGCTGCAGAACTTCAGGACTTrCATCCTGGAGCGCTCGGGCAXCCTGCCGGCCAeTTGCTCCGCG . _ CTGCCCAGCGäCTTCGTGCCCATCÄAGTACAGGGAGTGCCCGCGGCCGCTCTGGGGCCACTGC'TÄCC
TCTTCCAGCTGGCCAACTACCTCGCCTACCÄCTCGGACCTCATGGAAGACGTGAGCGGCGAGGGCCT
GCrCGAGTGCCACTGCCGCXGCAACCTCÄGCACGCCCCÄCCGCTCTCTAGTCTGCAACCCGCAGCTGC
TCAGCGAGAGTCAGATTAXCGGTäCCTTCGAGCTGCAGGGTCCCTCGCCTGACGAGAAGTCCGCGGC
TCCAGGGCTGAAÄCTCACTCCGGGGCTGTGGACTTCCGCCTACCTACGCAAATTTGTäCCTGAGGACT
ACCACGCGCACGAGATCAGGTTCTäCGAAGÄCCAATCCCGCCCGCCCAAGGCGGAGCTCACCGCCTG
CGTCATCACCCAGGGGCäCATCCTGGGCCAATTGCAAGCCATCAACÄAAGCCCGCCGAGäGTTCTTG
CTGAAAAAGGGTCGŒGGGTGTACCTGGACCCCCAGTeCGGCGAGGÂŒXAAÂCeCGCTACCCCCG
0 CCGCCGCCCGAGCAGCGGGACCTTGCTTCCCAGGATGGCACCCAGAAAGAAGCAGCAGCCGCCGCC
GCCGCCGCAGCCATäCäTGCTTCTGGAGGAAGAGGAGGAGGACTGGGAC’AGTCAGGCAGäGGAGGT
TTCGGACGAGGAGCAGGAGGAGATGATGGAAGACTGGGAGGAGGACAGCÄGCCTAGACGAGGAäG cttcagaggccgaagaggtggcagacgcaacaccätcgccctcggtcgcagccccctcgccggggcc
CCTGÄÄATCCTCCGAÄCCCAGCÄCCAGeGCTATAACCTCCGCTCCTCCGGCGCCGGCGCCÄCCCGCC cgcagaccgaäccgtägatgggacaccacaggaaccggggtcggtaägtccaagtgcccgccgckg
CCACCGCAGCAGCAGCAGCAGCAiSCGCCAGGGCTACCGCTCGTGGCGCGGGCACAAGAACGCCATA
GTCGCCTGC'TTGCAAGACTGCGGGGGCAACATCTCTTTCGCCCGCCGCTTGCTGCTATTCCACCACGG
GGTCGCCTTTCCCCGCAATGTCCTGCATTACTACCGTCATCTCTACAGCCCCTACTGCAGCGGCGACC
CäGAGGGGGCAGCGGCAGCCACAGCGGCGACCACCACCTäGGAAGATATGCTCCGCGGGCAAGäCA gcggcagcagc:ggccaggägäcccgcggcagcägcggcgggagcggtgggcgcäctgcgcctctcg
CCCAACGÄACCCCTCTCGÄCCCGGGAGCTCÄGACACAGGATCTrCCCCACTTTGTÄTGCCAXCTTCCA
ACÄGÄGCAGAGGCCAGGAGCAGGAGCTGAÄAATAA.AÄÄ.ACAGATCTCTGCGCTCCCTCACCCGCAG
CTGTCK5TATCACAAAAGCGAAGATCAGCTTCGCCGCACGCTGGAGGACGCGGAGGCACTCTTCAGC
AÄÄTÄCTGCGCGCTCÄCTCTTAÄAGACTAGCTCCGCGCCCTTCTCGAATTTÄGGCGGGÄGAAAAGTA
174
B E2016/5434
CGTCATCGCCGGCCGCCGCCCAGCCCGCCCäGCCGAGATGAGCääAGAGATXCCCäCGCCATACäXG tggägctaccaggxgcagatgggactcgcggcgggagcggcccaggactactccacccgcatgaäc
TÄCAXGäGCGCGGGACCCXACäXGAXCTCAC.AGGXCAäCGGGäTCXGC'GCCCäGCGAXACC-AAÄXA
CTGCTGGAACAGGCGGCCAXCACCGCCACGCCCCGCCATAATCTCAACCCCCGAAATTGGCCCGCCG
CCCTCGTGTACCAGGA.AACXCCCTCCGCCACCACCGTACTACTTCCGCGTGACGCXCAGGCCGAAGT ccaga.tgact.aactcaggggcgcagctcgcgggc:ggctttcgtcacggggcgc‘gg:cgctccgac.ca ggtataagäcacctgätgatcägaggcxgaggxäxccagctcäacgäcgagtcggtgägctcxtcgc
TCGGTCTCCGTCCGGACGGAACTTTCCAGCXCGCCGGATCCGGCCGCTCTTCGITCACGCCXCGCCAG gcgxäcctgactctgcagaccxcgtcctcggägccccgctccggcggcatcggaaccctccägttcgt
GGAGGAGTTCGTGCCCTCGGTCTACrrCAACCCCTTCTCGGGACCTCCCGGACGCTACCCCGÄCCÄGT
TCäTTCCGAACTTTGäCGCGGTGAAGGäCTCGGC'GGäCGGCTÄCGACTGAATGTCAGGTGTCGAGGC
AGAGCAGCTTCGCCTGAGACAGCTCGAGCACTGCCGCCGCCACAAGTGCXTCGCCCGCGGTTCTGGX
GAGTTCTGCXACTTXCAGCTACCCGAGGAGCATACCGAGGGGCCGGCŒACGGCGTCCGCCTGACCA
CGCAGGGCGAGGTTAGCTGTTCCCrCÄTCCGGGAGTTTACCCTCGGTCCCCTGGTAGTGGAGCGGGÄG
CGGGGTCCCTGTGTCCTAÄCTATCGCCTGCAACTGCCCTAACCCTGGATXACAXCAAGATCTTTGCTG
TCATCTCTGTGCTGAGTTTAATAÄACGCTGAGATCAGAA.TCTACXGGGGCTCCTGXCGCCATCCTGXG äacgccäccgtcttcacccaccccgaccaggcccaggcgaäcctcacctgcggtctgcatcggäggg
CX'XAGAAGTACCTCACCTGGTAGTTCAACGGC'ÄCCCCCTTTGTGGTTTACAACAGCTTCGÄCGGGGä
CGGAGTCTCCCTGAAAGäCCAGGTCTCCGGTCTCAGCXAXTCCATCCACAAGAACÄCCACCCTCCAA
CTCTTCXCTCCCTäCCTGCCGGGAACCTACGäGTGCGTCäCCGGCCGCXGCACCCACCTCAXCCGCCT
GAXCGTAAACCAGAGCTTTCCGGGAACAGATAACTCCCTCTTCCCCAGAACAGGAGGTGAGCTCAGG
AAACTCC'CCGGGGACCAGGGCGGAGACGTACCTrCGACCCTrGTGGGGXTAGGAXTTTTXAXXACCG
GGTXGGTGGCTCTTTrAAIGÄÄÄGTTrCCTTGAGÄTTTGTTCTTTCCTTCXÄCGXGTÄTGÄÄCACCTGÄ
ACCrCCÄATAÄCrCTACCCTTTCTrCGGAATCAGGTGACTrCTCTGAÄÄTCGGGCrrGGTGTGCTGCT
TACTCTGTTGATTTTTTTCCXTAXCATACTCAGCCTTCTGTGCCTCAGGCTCGCCGCCTGCTGCGCACA catctatatctactgctggttgc:tcä.agtgcaggggtcgccacccä.agäxgaacäggtacatggtcc
TATCGATCCTAGGCCTGCXGGCCeTGGCGGCCTGCAGCGCCGCCAAAAA.AGÄGÄJTACC'rTTGAGGA
GCCCGCTTGCAATGTAACTTTCääGCCCGAGGGTGACCääTGCAGCACCCTCGTCAAATGCGTTAGC
AATCATGAGAGGCTœGCATCGACrAQUtAAACAAAACTGGCCAÔTTTœ<Xn,CTATAGrGTGTTTA
CGCCCGGAGACCCCTCTAACTACTGTGTCACCGTCTTCCAGGGCGGACAGTCTAAGAIATrCAAXTAC
ACTTTCCCTTTXTAIGAGTTATGCGATGCGGTCATGXACAXGTCAAAACAGTACAACCTGTGGCCTCC
CTCTCCCCÄGGCGTGTGTGGÄAAÄTÄCTGGGTCTTACTGCTGTÄTGGCTTTCGCAAXCACTACGCTCG
CTCTAÄTCTGCACGGTGCTÄTAGATAAÄArrCAGGCAGÄGGCGAATCTTTATCGÄTGAAÄAGAAAAT
GtXTTGATCGCTÄACACCXGCrrTCTATCTGCAGAATGAATGCAATCACCTCCXrrACTAATCACCACC accgtccttgcgättgcccatgggttgacäcgaätcgäagtgccägtggggtccaatgxcaccatgg
XGGGCCCCGCCGGGÄATTCCACCCTCATGTGGGäAAAATXXGTCCGCAAXCAäXGGGTTCATTTCTGC tctaaccgaätgagtatcaagcccagägccatctgcgatgggcaaäatcxaactctgätcaaxgtgc aaatgatggatgctgggtactattacgggcagcggggagaaatcattaattactggcgaccccacaa ggacxacatgctgcatgtagtcgaggcactxcccacxaccacccccacxaccacctctcccaccacca ccäccactactactäctacxactactagxactactacxaccactaccgcxgcccgccatacccgcaäa agcaccaxgatxägcacaaagccccctcgtgctcactcccäcgcgggcgggcccatcggtgcgacct cagaaäccäccgägcttxgcttctgccaatgcactäacgccägcgctcatgäactgttcgacctggä
GÂATGAGGATGTCCAGCÂGÂGCTCeŒTTGCCTGACCCAGGAGGCTGTGGAGCCCGTTGCCCTGÂAG
CAGATCGGTGATTCAATAATTGACXCTTC'TTCTTTTGCCACTCCCGAAXACCXXCCCGATTCTACTXTC
175
B E2016/5434 cäcatcäcgggxaccaäagäccctaacctctctttctaggtgatgcxgctgctgtgxatctctgtggt
CTCTTCCGCGCTGATGTTAGTGGGGATGTrCXGCTGeCTGAXCTGCCGCAGAAAGAGAAAAGCTCGCT
CTCAGGGCCAACCACTGATGC'CCTrCCCCTACCCCCCGGATTTTGCAGATAACAÄGATATGAGCTCGC.:
TGCXGACACXAACCGCTrTÄCTÄGCCXGCGCTCXÄÄCCGTXGXCGCTTGCGACTCGAGATTCCACAAT
GXCACäGCTGTGGCAGGäGäääATGTTACTTTCAACTCCACGGCCGAIACCCäGTGGTCGTGGäGTG <XnXAGGTAGCTACTrXACTATCTGCAATAGCTCCACTTCCCCCGGCATATCCCCAACCAAGTACCAA
TGCÄÄTGCCAGCCTGTTCACCCTCATCAACGCXXCCACCCTGGACAATGGACTCTAXGXAGGGTAXGT ACCCTXTGGTGGGCÄÄGGäAÄGACCCACGCTTÄCÄACCTGGÄÄGTTCGCGAGCCCAGAäCCÄXTACC cäagcttctcccaccäccaccaccaccaccaccatcaccagcagcagcägc:agcagcagccacagcä GCÄGCAGCAGAXTATTGACTTXGGTTTTGGCCÄGCTCAXCTGCCGCXÄCCCAGGCCAXCTACAGCXCT GTGCCCGAAÄOCACTCAGATCCACCGCCCAGääACGäCCäCCGCCACCACCCTACACAGCTCCäGCG ATCAGATGCCGACCAACATCAGCCCGTTGGCTCTrCAAATGGGACTTACAAGCCCCACTCCAAAACC AGTGGAXŒœcCGAGGTCTCCGCCCTCGTCAÂTGACTGGGCGGGGCTGGGAATGXGGXGGTTGGCC AÏAGGCÂTGATGGC’GCTGTGCCTŒTXCTGCXCTGGCTCATCTGCTGC'CTCCACCGCAGGCGAGCCAG o ACCCCCCATCTATAGACCCATCATTGTCCXGAACCCCGAIAATGAXGGGATCCAXAGATXGGATGGCX
CCTTCTCCCÄCCTTXTCTGGGGTGXTCTÄCGXTGGCCGC.TGXGTCTCACCTGGAGGTAGACTGCCTCTC äCCCTXCACTGXCTAXCXGCTXTACGGAXTGGTCACCCTCACTCTCATCXGXAGCCTäAXCäCAGTAAT
CATCGCCTTCAXCCAGTGCAXTGäTXACAXCTGTGTGCGCCTCGCATACTTCAGACACCACCCGCAGT
ACCGAGAGäGGAäCäXTGCCCäACTTCTAAGACTGCTCTAäTCäTGCATAäGACTGTGATCTGCCTTC
TGAICCTCTGCäICCTGCCCAXCCTCACCTCCTGCCAGTACACCäCÄAAAXCTCCGCGCAAAAGACAT
- r gcctcctgccgcttcäcccaäcxgxggaaxätäcccaaatgctaxaäcgaaäagagcgagctctccg
AA.GCTTGGCTGTATGGGGTCATCTGTGTCTTAGTTTrCTGCAGCACTGTCTTTGG'CCTCATAATCTACC
CCTACTTrGATrrGGGATGGAAGGC'GATCGATGCCAXGAATTACCCCACCTTTCCCGCACCCGAGATA
ATTCCäCTGCGäCAAGTTGTACCCGXTGTCGTTAATCÄACGCC'CCCCATCCCCTACGCCGACTGAAäT
CAGCTACTTrAWCTAACAGGCGGAGATGACTGACGCX’CTAGATCTAGAAATGGACGGCATCAGTAC
CGAGCAGCGXCXCCXAGAGAGGCGCAGGCÄGGCGGCrGAGCAAGAGCGCXTCAATCÄGGÄGCTCCG äGATCTCGTTAACCTGCACXAGXGCAAÄAGAGGCäTGTTTTGTCXGGXAäAGCäGGCCAA4GTCACC
TACGAGAAGACCGGC.A4GAGCCACCGCCTCAGTXACAA4TXGCXCÄCXCAGCGCCäGAAGCTGGTGC
0 tgaxggtgggtgägaatcccäxcäccgtcacccägcactcggxagägäccgaggggtgtcxgcactc
CCCCTGTCGGGGTCCAGA4GACCTCTGCACCCTGGTAAÄGACCCTGTGCGGTCTCÄGAGATTTAGTC cccxxxaactaatcaaacactggaatcaataaaaagaatcacxtacttaaaaxcagacagcaggtcx
CTGTCCAGTTTATXCAGCAGCACCTCCTTCCCCTCCTCCCAACXCrGGTACXCCAAAXGCCTIXTGGCG
GCAAACTTCCTXCACACCCTGAAGGGAATGTCAGATTCTrGCTCCTGTCXCTCCGCACCCACTATCTT
CATGTTGTTGCAGATGAAGCGCACCAAAACGTCTGACGAGAGCTrCAAGCCCGXGTACCCCXATGAC
ÄGGGAAAGCGGCCCTCCCTCCGTCCCTTTCCXCACCCCTCCCTrCGTGTCXCCCGATGGAITCCÄAGA 2 5 tgaaaaxgggaagtggccxctccctggacgacgcxggcääcctcacctctcäägatätcaccaccgc tägccctccccxcäaäaaaaccaagaccaäcctcagcctägaaacctcaxcccccctaäctgxgägc ACCTCAGGCGCCCTCACCGTAGCAGCCGCX'GCTCXCCTGGCGGTGGCCGGCÄCCTCCCTCäCCAXGC aätcagaggcccccctgacagxacäggäxgcaäaactcacccxggccaccaaaggcxccctgäccgt gxctg,xaggcaaactggccttgcaaacatcggccccgctgacggccgctgacagcagcaccctcäcä GTCAGTGCXÄCACCACCCCTTAGC’ACAAGCAATGGCAGCTTGGGTATTGÄCAXGCAAGCCCCCATTT ACACCACCAÄTGGAAAACTAGGÄCTTAÄCTTTGGCGCTCCCCXGCAIGTGGTAGACÄGCCXAAAXGC
176
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ACTCiACTGTAGTTACTGGCCAAGGTCTTACGATAAACGGAACAGCXXTACAAACTAGAGTCTCAGGr
GCCCTCAACTATGACACATCAGGAAACCTAGAATTGAGAGCTCKAGGGGGTATGCGAGTTGATGCAA ätggtcäacttätccttgatgtägcttäcccatttgatgcäcäaaäcaätctcagccttaggcttgga
CAGGGACGCCTGTTTGTrA.4CTCTGCCCACA_<CTTC-GATGTTAACTAC.AACAGAGGCCTCTACCTGTT
CACATCrGGAAATACCAAAAAGCTAGAAGTTAATATCAAAACAGCCAAGGGTCTCATTrATGATGAC äctgctätagcaatcaatgcgggtgatgggctacägtttgactgaggctcagätacaaatccaitäa
AAACTAAACrTGGATrAGGACTGGATTATGACTCCAGCAGAGCCATAATTGCTAAACTGGGAACTGG
CCTAAGCTTTGACAACAC‘AGGTGCCATCACAGTAGGCAACAAAAATGATGACAAGCTiACCTTGTGG
ACCÄCACCAGACCCATCCCCTÄÄiCTGTAGAÄTCTATTCAGAGÄÄAGATGCTÄAAÄTCÄCAGTTGTTn'
GACTAAÂTGCGGCAGTCAGGTGTTGGCCAGCGTTTCTGrrTTATCTGTAAAAGGTAiGCCTTGCGCCCA tcagtggcacagtaactägtgctcagättgtcctcägätttgatgaaaätggagttctactaagcaa
TTCTTCCGTTGACCCTCäATäCTGGAACTACAGAAAäGGTGACGTTäCAGAGGGCACTGCäTATäCC
AACGCAGTGGGAmATGCCCAACCTCACÄGCATACCCAAAÄACACAGAGCCÄAACK5CTAAAA<5C aacaxtgtaagtcaggtttacttgaatggggacaaatccaaäcccatgaccctcaccattaccctca
ATGGAACTAATGAAACAGGAGATGCCAGAGTAAGCACTrACTCCAIGTCATrcTCATGGAACTGGAA
TGGÄAGTAATTACÄTTAÄTGAAACGTTCCAÄACCAACTCCTrCACCTTCTCCTACATCGCCCÄÄGAÄT
AAAAAGCATCACGCTGTTGATtTGATTCAATGTGTlTIvrGTITrATTTTCAAGCACAACAAAATCATr
CAAGTCATTCTTCCAXCTTAGCTXAAXAGACACAGTAGCTIAAXAGACCCAGTäGTGCäAAGCX'CCäT
TCTÄGCTTATAGATCAGACÄGTGATAÄTTAACCACCAGCACGACCATACCTTrTGÄTTCÄGGAAATCÄ
XGÄTCATCACAGGÄTGCTÄGTCTTCAGGCCGCCCCCTCCCTCCCAAGÄCACAGAATACACÄGTCCTCT
CCCGCCGACTGGCTTTAAATAACACCATCTGGTrGGTCACAGACAIGTTCTTAGGGGTTATATTCCÄC
ACGGTCTCeTŒeGCGCCÂGGeGCTCGTCGGTGAÏGTTGÂTAAACTCTeCCGGCAGeTCGCTCÂAGTT
CACGTCGC'TGTCCAGCGGGXGAACCTCCGGC’TGACGCGATäACTGTGCGACCGGCXGCTGGACG.AäC
GGAGGCCGCGCCTACAAGGGGGTAGAGTCATAATOCTGGGTCAGGATAGGGC«3TGATGCAGCAGC
AGCGAGCGAAACÄTCTGCTGCCGCCGCCGCTCCGTCCGGCAGGAÄAACäACACGCCGGTGGTCTCXT
CCGCGATAATCCGCACCGCCCGCAGCATCäGCTTCCTCGTTCTC'CGCGCGCAGCACCTCäCXCTTATC
TCGCrCAAATCGGCGCAGTAGGTACAGCACAGCACCÄCGATGTTATTCATGATCXXACAGTGCAGGG
CGCTGTATCCAAAGCTCäTGCCGGGAACCACCGCCCCCACGTGGCCATCGTACCACAAGGGCACGTA
AATCAAGTGTCGACCCCTCATGAACGCGC'TGGAGACÄAACÄTTACTrCCTTGGGCÄTGTTGTAATTCA
CCACCTCCCGGTÄCCAGÄTÄA.4CCTCTGGTTGAÄCAGGGCACCTTCGACCACCATCCTGAACGAAGA
GGCCAGAACCTGCCCACCGGCTATGCACTGCAGGGAACCCGGGTTGGAäCAäTGACääTGCAGäCT
CCAÄGGCTCGTAAXCGTGGATCÄTCCGGCTGCTGAAGGCATCGATCTTGGCACäACACAGACACäCG
TGCATGCACTXTCTCATGAXTAGCAGCTCXTCCCTCGTCAGGATGATAJCCCAÄGGAATÄACCCATTC
TTGAATCAACGTAAAACCCACACAGC AGGGÄAGGCCTCGCACATAACTCACGTTGTGCATGGXCAGC
GTGTTGCATXCCGGAAÄCäGCGGäTGAXCCXXCÄGXAXCGAGGCGCGGCTCTCCTIXTCACAGGGAG
GTAA.4GGGTCCCTGC“GTACGGÄCTGCGCCGGGACGACCGÄGÄXCGTGTTGÄGCGTÄGTGTCATGGÄ
ÄAAGGGAÄCGCCGGACGTGGTCAXACTTCTTGAAGCAGäACCAGGXXGGCGCGTGGCAGGCCTGC'TT
GCGTCTGCGGTCTCGCCGXGXAGCTCGCTCCGTGTGAXAGTTGTAGTACAGCCACTCiXGCAGAGCGT
CGAGGCGCACCCTGGCTTCCGGATCTATGIAGACTCCGTCTTGCACCGCGGCXCTGATAATATCCACC äccgtagaaiaagcaacäcccagccaagcaatäcactcgctctgcgagcggcägacaggaggägcg
GGGAGAGATGGGAGAACCATGATAAAXXAGTTTrTTTAAAGAATATTmXAAXTCTTCGAAAGTAA gatctatcaagtggcagcgctcccctccactggcgcggtcaaactctacggccäaagcacagacaac
GGCAXTTCTAAGATGTTCCTTAAXGGCGTCCAAAAGACACACCGCCTCAAGTTGCAGIAAACIA.TG
AATGAAAACCCATCCGGCTGATTTrCCAAXATAGACGCGCCGGC’AGCGTCCACCAAACCCAGATAAT
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TXTCTTCXCTCCAGCGGTTTACGATCTGTCXAAGCAAATCCCXXäIAXCAAGTCCGACCATGCGAAAA
ÄTCTGCTCAAGAGGGCCCTCCAGCTrCÄTGTACAAGCAGCGCÄTCATGATTGCAAÄAATXCAGGTTCX
TCAGÄGACCTGTÄTAAGäTTCAÄAATGGGAWATTAACAAA-LATTCCTCTGTCGCGCAGäXCCCTTC
ŒAGGGCAâGCTGAACâTAATCAGACAGGTCCGAACGGACCAGTGâGGCCAAÂTCCCCACXAGGAA
CCAGATCCAGAGACCCXATACTGATXATGACGCGCATAeTCGGGGCTAXGCTGACCAGCGTAGCGCC
GATGTAGGCGTGCXGCATGGGCGGCGAGAT.AAAATGCAAAGXCXTGGTrAAAAAATCAGGCAAAGC
CTCGCGCAÄÄAAAGCTAACACATCATAÄTCAXGCTCÄTGCAGGXAGTTGCÄGGTAAGCXCAGGAÄCG AAAÄCGGAAXAACACACGATTXXCCTCTCAAACAIGACXTCGC'GGATACXGCGXAAAACAAAAÄATT ATAAATAÄAAÄATTAATTAAATÄACTT.AAACATTGGAAGCCTGTCTCACAAGAGGAAAAACCACrTT AäTCAACATAAGACGGGCCACGGGCATGCCGGCATAGCCGXAAAAAAATTGGTCCCCGTGATTääC AAGTACCACAGACAGCXCCCCGGTCAXGTCGGGGGTCÄXCATGXGAGACXCTGTATACAGGTCTGGA ttgtgaacatcägacäaacaaagaaatcgagccäcgxägcccggaggtataatcacccgcäggcgg aggtacagcaaaacgacccccataggaggaatcacaaaaxtagtaggagaaaaaaaxacataaaca ccagaaaaaccctgxtgctgaggcaaaaxagcgcccxcccgatccaaaacaacataaagcgcttcca caggagcagccataacäaagacccgagtcxtaccagxaaaagaaaaaägaxctctcaacgcägcäc cagcaccaacacttcgcagtgtaaaaggccaagtgccgagagagtatatataggaätaaaaagtga CffTAAACGGGGAAAGTCCAAAAAACGCCCAGAAAAAOCGCACGCGAÄCCTACGCCCCXSAAACGAAA gccäaaaäacäctagäcactcccttccggcgtcäacxtccgctttcgcacgctacgxcacttcccccg gtcaaacaaactacaxatcccgaacttccaägtcgccacgcccaääacaccgcctacacctccccgc CCGCCGGCCCGCCCCCGGACCCGCCTCCCGCCCCGCGCCGCCCATCXCÄTXÄTCAXArrGGCTTCAAT CCAAAATAäGGXATÄTTATTGATGäIG
SEQ ID NO : 11 - Séquence polynucléotidique codant pour le ChAdl55/RSV
CATCA-K^TAATATACCTTATTTTGGATTGAAGCCAATATGATAATGAGATGCGCGGCGCGGGGCG
GGGCGCGGGGCGGGAGGCGGGTTXGGGGGCGGGCCGGCGGGCGGGGCXGXGTGGCGGAAGTGGAC
XTTGTAACTGTGGCGGAlGTGACrTOCrAGTGCCGGGCGCGGTAAAACTGACGITTXCCGTGCGCGA
0 CAAeGCCCCCGGGAAGXGAeATrXXTCCCGCGGTTXTTACCGGATGTTGTAGTGAATTTGGGCGTAAC cäägtäagatttggccatxttcgcgggäaaacxgaaacggggaagxgäa,atcxgättääxtttgcgt TAGXCATACCGGGX.AATAXTrGTCXAGGGCCGAGGGACTTTGGC’CGÄXTÄCGTGGAGGACTCGCCCA GGTGTTTm’GAGGXGAATTTCCGCGTTCCGGGTCAAAGTCTGCGTTrrATXATTATAGGATATCCCAT TGC-ATACGTTGXATCCAXATCAXAATATGTACäXTXATAXTGGCXCATGXCCAACÄTXACCGCGAXGTX gacattgatxattgacxagttatx.aatagtaatcaattacggggtcattagxxcatagcccatataig GÄGTTOCGCGXTACATAACTTACÖGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGOCCAT TGÄeGTCAATXATGÄCGTATGTTCCCAXAGTAACGCCAAXAGGGACTTXCCÄTTGÄCGTCAÄTGGGT J ggägtatxxäcggxaaacxgcccäcttggcagtacaxcaagxgtatcatatgccaagtacgccccct ArrGACGTCAATGACGGXAAATGGCCCGCCTGGCAXXÄTGC:CCÄGTACATGACCTTATGGGACTTTCC tacxxggcägt.acatctacgtattagtcatcgcxätxaccatggtgatgcggttxtggcägtacatca AXGGGCXTGGAXAGCGGTrXGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAG xttgttttggcaccäaaätcaacgggacxttccaaaätgtcgtäacäactccgccccaxxgäcgcääa TGGGCGGTAGGCGTGTAeGGTGGGAGGTCTATAXAAGCAGAGCTCTCCCTATCAGTGATAGAGATCT ccctaicagtgätägagatcgtcgacgagc:tcgxttagtgääccgtcagatcgcctggagacgccax
3Q CCACGCTGTTTTGACCTCCATAGääGACACCGGGACCGATCGAGC’CTCCGCGGCCGGGAACGGTGCA TTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCÄAGäGTGAGäTCXTCCGXTTäXCTäGGXACCAGAXäXCGCCACCA tggaactgctgäxcctgaaggc:cäacgccätcaccaccätcctgaccgccgtgacgxtctgc:xxcgcc i
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AGCGGCCAGAACATCACCGäGGAATTCTÄCCAGAGGACCTGTAGCGCCGTGAGCA4GGGCTACCTG
AGCGCCCTGAGAACCGGCTGGTäCäCCäGCGTGäTCÄCCATCGAGCUGäGCAACATCAAXGAAAAC
ÄÄGTGCAAGGGGÄCCGACGCCAAÄGTGAAGCTGATCAÄGCÄGGÄACTGGÄCÄAGTACÄÄGAÄCGCC
GTGACCGAGCTGCAGCTGCTGATGCAGAX-CACCCCCGCCACCAACAACCGGGCCAGACGGGäGCTG
CCCCGGTTCATGAACTACACCCTGAACAA<X5CCAAAAAGACCAACGTGACOCTGA<3CAA<3AAGCGG
AAGCGGCGGTTCCTGGGCTTTCTGCTGGGCGTGGGCAGCGCCAITGCCAGCGGCGTGGCCGTGTCTA aggtgctgcaccttcäaggcgaagtgäacaagatcaagagcgccctgctgaocaccaacaaggccg
TGGTGTCCCTGAGCAACGGCGTGAGCGTGCTGACCAGCAAGGTGCTGGATCTGAäGAACTÄCATCGä
OAAGCAGCTGCTGCCCATCGTGAACAAGCAGAGCTGCAGCATCAGCAACATCGAGACAGTGÄTCGA
GTTCCAGCAGAAGAACAACCGGCTCCTGGAAATCACCXGGGAGTTCAGCGTGAACGCCGGCGTGAC cacccctgtgtccacctacätgctgäccaacägcgagctgctgagcctgatcaacgacatgcccätc
ACCAACGACCAGAAAAAGCTGATGAGCAACAACGTGCAGATCGTGCGGCAGCAGAGCTACTCCATC
ATGTCCÄTCATCA4AGAAGÄGGTGCTGGCCTÄCGTGGTGGÄGCTGCCCCTGTACGGCGTGATCGÄCA ccccctgctggaagctgcacaccägccccctgtgcaccaccaacaccaäagagggcagcaacaxctg
CCTGACCCGGACCGACAGAGGCTGGTACTGCGÄCAACGCCGGCAGCGTGTCATTCTTTCCACAGGCC ,
GAGACATGCAAGGTGCAGÄGCAAGCGGGTGTTCTGCGACACCÄTGAACAGCCTGACCCTGCCCTCCG I aagtgaacctgtgcaäcgtggacatcttcaaccccaagtäcgäctgcaagatcatgacctccaagäc j
CGACGTGTCCAGCTCCGTGATCACCTCCCTGGGCGCCATCGTGTCCTGCTACGGCAAGACCAAGTGC ί
ACCGCCAGCAACAAGAACCGGGGCATCATCAAGACCTTCAGCAACGGCTGCGACTACGTGTCCAAC
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GCGCGCCGACACGGTCAACTCCTœrCCAGÂAGACGGATGAGCTCGGCGACœTGTCGCGCACCTCG
CGCTCGAAGGCTATGGGGATCTCTTCCTCCGCTAGCÄTCACCACCTCCTCCTXTTCCTCCTCTTCTGGC
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CGGAGGTGCTGCTGATGATGTAATTGAAGTAGGCGGACTTGACAXGGCGGATGGTCGäCAGGAGGA
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CGGC:GCAGGTCCTTGTAGTAGTCTTGCATGÄGCCTTTCCÄCCGGCÄCCTCTTCTCCTrCCTCTTCTGCT
TCTrCCÄTGTCTGCTTCGGCCCTGGGGCGGCGCCGCGCCCCCCTGCCCCCCATGCGCGTGACCCCGAA
CCCCCXGÄGCGGTTGGAGCAGGGCCAGGTCGGCGACGACGCGCTCGGCCAGGATGGGCTGCTGCACC
TGCGTGAGGGTGGTTTGGäAGTCäTCCäAGTCCACGAAGCGGTGGTAGGCGGCCGTGTTGATGGTGT
AGGTGCäGTTGGCCATGÄGGGACCAGITGACGGTCTGGTGGCCCGGTTGCGACäTCTCGGTGTACCT
GAGTCGCGAGTAGGCGCGGGÄGTCGAäGäCGTäGTCGTTGCA4GTCCGCACCAGGTACTGGTAGC:C
CACCAGGAAGTGC'GGCGGCGGCTGGCGGTäGAGGGGCCäGCGCAGGGTGGCGGGGGCTCCGGGGGC
CAGGTCTTCCAGCäTGÄGGXGGTGGTäGGCGTAGATGTACCTGGÄCäTCCÄGGTGATACCCGCGGCG
GTGGTGGäGGCGCGXGGGAAGTCGCGCACCCGGTTCCAGATGTTGCGCäGGGGCÄGAAAGTGCTCC
ATGGTAGGCGTGCTCTGTCCÄßTCAGACGCGCGCAGTCGTrGÄXACTCTAGACCAGGGAAAACGAAA
GCCGGTCAGCGGGCACTCTrCCGTGGTCTGGTGAATAGATCGCÄAGGGTATCÄTGGCGGAGGGCCTC
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CGCGTAAGAGACTAAGCCGCGAAAGCGAAAGCAGTAAGTGGCTCGCTCœCGTAGCCGGAGGGATC
CTTGCTAAGGGTrGCGTTGCGGCGAACCCCGGTTCGAATCCCGTÄCTCGGGCCGGCCGGACCCGCGG
CTAAGGTGTTGGATTGGCCTCCCCCTCGTATAAAGACCCCGGTTGCGGATrGACTCCGGACACGGGG
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GCAGCAGCAACAACACCAGCAAGAGCGGCAGCAACAGCAGCGGGAGTCATGCAGGGCCCCCTCACC
CACCCTCGGCGGGCCGGCCACCTCGGCGTCCGCGGCCGTGTGTGGCGCCTGCGGCGGCGGCGGGGGG
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ÄGCXAGAGGäGGGCGAGTACCTGGA,CXAAACCGCGGGXGGXGTTTCCGGXäGATGCääGACCCGäA cgtggtggacccggcgctgcgggcggctctgcagagccagccgtccggcctxaagtcctcagacgäc tggcgacaggtcaxggaccgcaxcaxgtœctgâcggcgcgxaacçcggacgcgttçcggcagcagc cgcaggcx-aäcaggctctccgccatcctggagggggtggtgcctgc:gcgctcgaaccccacgc:acga
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GACGAGCäCäCCTTCCAGGAGATCäCCäGCGTGÄGCCGCGCG-CTGGGGCAGGAGGACACGAGCAGC cxggaggc-gäcxctgaäc:tacctgcxgaccaaccggcggcaga4.gattccctcgc:xgcacagcx-xga cctccgaggaggagcgcatcttgcgctacgtgcagcagagcgtgagcctgaacctgatgcgcgacgg ggxgacgcccâgcgxgœgcxggagaîgâccgcgxgcaacaxggaaccgggcaxgiacgccgcgca ccggccttäcatcaaccgcctgaxggactäcctgcatcgcgcggcggccgxgaaccccgägtacttt äcca_4cgccaxccxgaacccgcäctggctcc:cgccgcccgggttctacagc;gggggc;txcgaggxcc
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TTTGACCACGGTCäTCCAGAACAATGACTäCAGCCCGAGCXAGGC'CAGCACXXAGäCCAXCAäTCTG
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GATGACCGGTCGCACTGGGGCGGCGÄCCTGAÄ.A,4.CCÄTCCTGCACACCAACATGCGC.AACGTGA.4C
GÄGTTCATGTTCACCAÄT.AAGTTCäAGGC*GCGGGTGATGGTGTCGCGCTCGCäCäCCAÄGGAAGACC gggtggagctgaägtacgagtgggtggagttcgagctgccagagggcaactäctccgagaccätgä
CCA'TTGACCTGATG.A4C.AACGCGATCGTGGAGCACTATCTGAAAGTGGGC:aGGCAGAACGGGGTCCT
GGAGÄGCGÄCÄTCGGGGTC.4AGTTCGACACCAGGAACTTCCGCCTGGGGCTGGAGCCCGTGACCGG
GCTGGTTÄTGCCCGGGGTGTACACCA.ACGAGGCCTrCCATCCCGÄCAXCATCCTGCXGCCCGGC*TGCG c GGGTGGACTTCACTTACAGC.‘CGCCTGAGCAäCCTCCTGGGG'äTCCGCAäGCGGCAGCCCTTCCAGGä 5
GGGCTrCAGGATCACCTACGAGGACCTGGAGGGGGGCAACATCCCCGCGCTCCTCGATGTGGAGGCC
TACCAGGATAGCTTGAAGGAAAATGAGGCGGGACAGGAGGATACCGCCCCCGCCGC'CTCCGCCGCC
GCCGAGGäGGGCGAGGÄTGCTGCTGACACCGCGGCCGCGGAGGGGGCAGAGGCCGACCCCGCTATG
GTGGTGGAGGCTCCGGäGCAGGAGGAGGACATGXWGACäGTGCGGTGCGCGGAGACACCTTCGTC
ACCCGGGGGGAGG.AAA4GCA4GCGGAGGC:CGAGGCCGCGGCCGAGGAÄAAGCAACTGGCGGCAGC:
äGCGGCGGCGGCGGCGTTGGCCGCGGCGGAGGCTGäGTCTGAGGGGACCääGCXCGCCAAGGAGCC
CGTGATTAAGCCCCTGACCGAAGÄTÄGCAÄGAAGCGCAGTTACAÄCCTGCTCAÄGGACAGCACCAÄ
CäCCGCGTACCGCAGCTGGTACCTGGCGTäCAACTACGGCGACCCGTCGACGGGGGTGCGCXCCTGC AGCCTGCTGTGCACGCCGGACGTGACCTGCGGCTCGGAGCAGGTGTACTGGTCGCTGCGCGACATGA TGCAAGACCCCGTGACCTTCCGCTCCACGCX-GCÄGGTCÄGGAACTTCCCGGTGGTGGGCGCCGAGCT GCTGCGCGTGCACTCCAAGAGCTTCIACAAGGACCAGGCCGTCTACTCCCAGCTCATCCGCCAGTTCA CCTCTCTGACCCACGTGTrCAATCGCTTTCCTGAGAACCAGATrCTGGCGCGCCCGCCCGCCCCCACC ATC AC CACC GTCAGTGAAAACGTrCCTGCTCTCACAGATCACGGGACGCTACCGCTGCGCAACAGCA TCGGAGGAGTC C AGC GAGTGACCGTTACTGACGCCAGACGCCGGACCTGCCCCTACGTTrACAAGGC
CTTGGGCäTäGTCTCGCCGCGCGTCCTTTCGAGC'CGCäCTTTTTGAGCAACACCACCAXCATGTCCäT
CXTGATCTCAOCCAGCAATAACTCCGGCTGGeiGACTGCRXtXJGOSCCCAGCAAGATGTrCGGAGGG
GCGAGGA.<GCGTTCCGAGCÄGCACCCCGTGCGCGTGCGCGGCCÄCTTCCGCGCCCCCTGGGGAGCGC
ACAAACaSCGGCœCGCGGGœGCACCACCGTGGAOGACGCCATCGACTCGGTGGTGGAGCAGGCGC
GGAACTACAGGCCCGCGGTCTCTACCGTGGACGCGGCCÄTCCAGäCCGTGGTGCGGGGCGCGCGGCG
GTACGCCAAGCreAAGAGCCGCCGGAAGCGCGTGGCCCGCCGCCASXGCCGCCGACCCGGGGCCXîC
CGCCA.A4CGCGCCGCCGCGGCGCTGCTTCGCCGGGCCAÄGCGCACGGGCCGCCGCGCCGCGATGÄG
G«XGCGCGCC<XTTGGCCGCCGGCATCACCGCCGCCACCATGGCCCCCCCTACCCGÄAGACGCGCG
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B E2016/5434 tggagatcaacctcagtgccaaxctgtggagaaacttcxtgtactccaacgtggcgctgtacctacc agacaagcttaagtacaacccctccaatgtggacatctctgacaaccccaacacctacgattacatg aacaagcgagtggtggccccggggc/tggtggactgctacatcaacctgggcgcgc'gctggtcgctgg
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2Q CTTGCääGAGTCCTCCGAGGAäGGCCTGCCCGCGGTCäGC:GäCGAGCAGCTGGCGCGCTGGXTGGä gacccgcgaccccgcgxägctggaggägcggcgcaagctcatgätggccgcggtgctggtcaccgt GGAGCTCGAGTGTCTGCAGCGCTTCTTCGCGGACCCCGAGATGCAGCGCAAGCTCGAGGAGACCCTG cactacäccttccgccagggctacgtgcgccäggcctgcaägatctccäacgtggägctctgcäacc tggtctcctacctgggcatcctgcäcgagaaccgcctcgggcagaäcgtcctgcactccaccctc,aa A.GGGGAGCX:GCGCCGC‘GACTACÄTCCGC:GACTGC:GCXGACCTCTTCXTCTGCTACACCTGGCäGACG GCCATGGGGGTCTGGCAGCAGTGCCTGGÄGGAGCGC.AACCTCAAGGAGCTGGAAAÄGCTCCTCAAG cgcaccctcagggacctctggacgggc:ttc.aacgägcgctcggtggccgccgc:gctggcggacätca.
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5 ACÄGGAACAXXGCCCAÄCTTCTAAGACTGCTXXAATCAXGGATAAGACTGTGATCXGCCTTCXGATCC TCTGCAXCCTGCXCÄCCCXCACCTCCTGCXAGXACACCACÄAÄATCTCCGCGCAAAAGACAXGCCTCC tgccgcticacccaacxgtggäatatacccaäaxgcxaxaäcgaaaagägcgägctctccgaagctt GGCTGXATGGGGTCATCTGTGXCTTAGTTTTCXGCAGCACTGTCXrrGCCCXCAXAATCTACCCCTACX TTGATXTGGGATGGAACGCGAXCGAXGCCATGAATXACCCCACCTTrCCCGCACCCGAGATAAXTCCA CXGCGÄCAAGTXGTACCCGTXGXCGTTAATCAACGCCCCCCäTCCXCTACGGCCäCXGAAATCAGCTA CTTrAACCTAÄCAGGCGGAGATGACTGACGCXXXÄGAXCTÄGAAATGGACGGGÄXCAGTACCGAGGA
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AATGGAÄÄAGTÄGGACTTAÄCTTTGGCGCTCCCCTGCATGTGGXAGAGAGCCTAAAXGCACTGACTG tägttactggccaaggtctxacgatäaacggaacägccctacaäactagagtctcaggtgcccxcäa
CTATGACACATCAGGAAAeCTÂGAÂTTGAGAœTGeAGGGGGTÂiœGÂG'rrGATGCAAATGG'nCA
ACTTATCCTTGATGTAGCXTACCCATTTGATGCACAAAACAATCTCAGCCTXAGGCTrGGACAGGGAC . _ CCCTGTTTGTTAACrCTGCCCACAACXTGGATGTTAAGTACAACAGAGGCCTCTACCTGXTCACATCT lb
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0 ttgaccctcaatactggaactacagaaaaggtgaccttacagagggcactgcatataccaacgcagt gggatttatgcccaacctcacägcatacccaaaaacacägägcxaaactgctaaaagcaacattgta
AGTCÄGGTTTACTTGAATGGGGÄCAAATCCAA.ACCCATGÄCCCTCACCATTACCCTCAATGGA.ACTA
AXGAAACAGGAGÄTGCCACÄGTAÄGCACTXACTCCATGTCÄTTCTCATGGAÄCTGGAÄTGGAÄGTÄA
TTACATTA.ATGÄÄACGTTCC.AAACCÄ.4CTCCTTCÄCCTTCTCCXACAICGC:CCAAGAAX.AAAAAGCÄT
GACGCIXOT'GATTTCATrCAATGTCnTrcrGTTTTATmCAAGCACAACAAAArCATTCAAGTCATrC
TTCeATCTTAGCTTAATAGACACAGTAGCTFAATAGACCCAGTAGTGCAAAGGCeCATrCTAGCrTAT aactagtggagaagtactcgccxacatgggggtagagtcataatcgtgcatcaggatagggcggtg
5 gtgctggagcägcgcgcgaataaacxgctgccgcggcggctccgtcctgcaggaatäcaäcätggcä
GTGGTGTCCTCAGCGATGATTCGCACCGCCCGCÄGCATAAGGCGCCTTGTCCTCCGGGCACAGeAGC gcäccctgatctcäcttaaatcägcacagtaacxgcagcacagcäccacaätattgttcäaaatcgc
ACAGTGCAAGGCGCTGTAICCAAAGCiTGAXGGCGGGGACCACAGAACCCACGTGGCCATCATACCAC
AAGCGCAGGTÄGATrÄAGTGGCGÄCCCCTCÄTAAACACGCTGGÄCATÄÄACATXACCTCTTTTGGCÄ
TGTTGTAATTCACCACXrrCOCGGTÄCCATATAAACCTCTGATTAAACATGGCGCCATCCACCACCATC
CXAAACCAGC'TGGCCAAAACCTGCCCGCCGGCTATACÄCTGCAGGGÄACCGGGACTGGAÄCÄAXGA
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CAGTGGAGAGCCXAGGACTCGTAACCATGGATCAICATGCTCGTCATGATATC'AATGTrGGCACAAC
ACAGGCACACGTGCATACACTTCCTCAGGATTACAAGCrccrCCCGCGTTAGAAC C ATATCC CAGGG
AACAACCCATTCCTGAATCAGCGTAAATCCCACACTGCAGGGAAGACCTCGC AC GTAAC TC ACGTTG
TGCATTGTCAAAGTGTrACATTCGGGCAGCAGCGGATGATCCTCCAGTATGGIAGCGCGGGTTTCTGT
CTCÄAAAGGAGGTAGACGATCCCTACTGTACGGAGTGCGCCGAGA.CAACCGAGÄTCGTGTTGGTCGT
AGTGTCATG<XÄAATGGAACGCCGGACGTAGTCATATrTCCTGAÄ.GTCTTAGATCTCTCAACGCAGC
ACCAGCACCAACACTTCGCAGTGTAAAAGGCCAAGTGCCGAGAGAGTATATATAGGAATAAAÄAGT
GACGTAAACGGGCAAAGTCCAAAAAACGCCCAGAAAAA<XGCACGCGAACCTACGCCCCGAAACGA
AAGCCAAAAAACACTAGACACTCCCTTCCGGCGTCAACTTCCGCTTTCCCACGCTAOGTCACTTGCCC cägtxaäacaaactacatatcccgaacttccäagtcgccäcgcccaaaacaccgcxtacacctcccc gcccgccggcccgcccccaaacccgcctcccgccccgcgccccgccccgcgccgcccatctcattatc
ATATTGGCTTCAATCCAAAATAAGGTATATTATTGATGATG
SEQ ID NO : 12 - Séquence polynucléotidique codant pour le promoteur CASI
GGÄGTTCCGCGTrACATAACTTÄCGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCÄÄCGACCCCCGCCCÄ
TTGACGKAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACXÎCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGT
GGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATAIGCCÀAGTACGCCCXCT
ATTGACGTCAATGACGGT.AAATGGCCCGCCTGGCÂTTATGCCCÂGTÂCATGACCTTÀTGGGACTTTCC täcttggcagtäcatctäcgtattagtcätcgctättaccatggtcgäggtgagccccäcgttctgct
5
TCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCrœCCACCCCCAATrTTGTATTTATTTATTrrTTÂATTATTTTGTGC agcgätgggggcgggggggggggggggcgcgcgccaggcggggc:ggggcggggcgäggggcgggg
CGGGGC:GAGGCGGAGAGGTGC'GGC:GGCäGCCAATCAGAGCGGCGC3GCTCCGAAAGTTTCCTTTTäT
GGCGAGQCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAÀAAGCGAA.GCGCTCCCTATCAGTGATAGAGÀTCTCC
CTATCäGTGäTÄGAGATCGTCGACGAGCTCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCC
GTGCCCCGCTCCGCXGCCGCCTCGCGCCGCXXGCCCCGGCTCTGACTGäCCGCGTTACTAAAACAGG
TÄAGTCCGGCCTCCGCGCCGGGTTTTGGCGCCTCCCGCGGGCGCCCCCCTCCTCÄCGGCGÄGCGCXGC
0 CACGTCAGACX3AAGGGCGCAGCGAGCGTCCTGATCCTTCCGCCCGGÄCGCTCAGGACAGCGGCCCGC
TGCTCATAAGACTCGGCCTTAGAACCCCAGTATCAGCAGAAGGACATTTTAGGACGGGACTTGGGTG actctagggcäctggttttctttccagägagcggäacaggcgaggaaaagtägtcccttctcggcgä ttctgcggagggatctccgtggggcggtgaacgccgatgatgcctctactaaccatgttcatgttttc
TrTTTTTTTCTACAGGTCCTGGGTGACGAACAG
SEQ ID NO : 13 - Séquence polynucléotidique de l'amorce 1 de l'Ad5orf6 atacggactägtggagaagtactcgcctäcätg
SEQ ID NO : 14 - Séquence polynucléotidique de l'amorce 2 de l'Ad5orf6 ätacggaagatgtaägacitcägxaäataigactac
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SEQ ID NO : 15 - Séquence polynucléotidique de l'amorce 1 de BAC/CHAdl55 AEl_TetO. hCMV RpsL-Kana
ÄTTCAGTGTÄCÄGGCGCGCCAAAGCATGACGCTGTTGATTTGÄTTC
SEQ ID NO : 16 - Séquence polynucléotidique de l'amorce 2 de BAC/CHAdl55 AEl__TetO hCMV RpsL-Kana (No. 1375)
ÄCTAGGAC.TAGrrATAÄGXTAGA,A“GGGGCTTTGC
SEQ ID NO : 17 - Séquence polynucléotidique de l'amorce 1021-FW E4 Del Stepl
ITAATAGACACAGTAGCTTAAIAGACCCAGTAGTGCAAAGCGCCXrrCTAGCTTAIAACCeGTATTrG
ITIATTTTTCT
SEQ ID NO : 18 - Séquence polynucléotidique de l'amorce 1022-RW E4 Del Stepl
ATATATACTCTCTCGGCACTTGGCCTTTTACACTGCGAAGTGTTGGTGCTGGTGCTGCGTTGAGAGAT
CTTTATTrGTTAACTGTTAATTGTC
SEQ ID NO : 19 - Séquence polynucléotidique de l'amorce
1025- FW E4 Del Step2
TTAATAGÄCACAGTAGCTTAATA
SEQ ID NO : 20 - Séquence polynucléotidique de l'amorce
1026- RW E4 Del Step2
GGAAGGGAGTGTCTAGTGTT
SEQ ID NO : 21 - Séquence polynucléotidique de l'amorce 91-SubMonte FW
CAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGAC
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SEQ ID NO : 22 - 90-BghPolyA RW CÄGCATGCCTGCXATTGTC Séquence polynucléotidique de 1' amorce
SEQ ID NO : 23 - Séquence CMVfor CATCTACGTATTÄGTCATCGCTATTACCA polynucléotidique de 1 ' amorce
SEQ ID NO : 24 - CMVrev GACTTGGAAATCCCCGTGAGT Séquence polynucléotidique de 1' amorce
SEQ ID NO : 25 - Séquence polynucléotidique de la sonde
de qPCR CMVFAM-TAMRA
ACATCAATGGGCGTGGATAGGGGTT
SEQ ID NO : 26 - Séquence polynucléotidique de l'élément régulateur posttranscriptionnel du virus de l'hépatite de la marmotte (WPRE)
XA«CA4.CCTCTGGATTACAA.A%TTTGTGAA4GÄxTGÄCTGGXA.TTCrTÄACTATGTTGCTCCTTTTÄC
GCTATGTGGATACGCTGC:TrTAATGCCTTrGTATCATGCTATTGCTTCCCGTAXGGC:TTTCATTTTCTC
CTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTXATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCG
TGGTGTGCACTGTGTTTGC'TGACGC.AACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCÄCCACGTGTCÄGCTCCTT
TCCGGGACTrrCGCXrTCGCCCTCCCXATTGCCÄCGGCGGA4.CTCÄTCGC'CGCCTG€CTTGCCCGCTG
CTGGACÄGGGGCTCGGCrGTrGGGCkACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTC
CTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTrCrGCTACGTCCCrTCGGCCC
TCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTC
GCXCTCAGACGAGTCGGATCTCCXrFTGGGCCGCCTCCCCGCCT
SEQ ID NO : 27 - Séquence d'acides aminés de. la fibre du ChAd3
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MSXTKTSDESFWVYPYDTESGPPSVPFETPPFVSPDGFQESPPGVLSLNLAEPLVTSHGMLALKMGSGES
LDDAGlttXSQDCTTASPPiXKTKTMESLXXSSPLTVSTSGALTVAAAAPLAVAGTSETMqSEAPETVQDAK
LTLATSGPETVSEGiCLAL.QTSAPLXAADSSXLWSATPPINX'SSGSLGLDMEDP&iYXHDGKEGIXIGGPLS.
VWSLHTLTVVTGNGLTWNNALQTSATGAWOTrSGNLQLRAAGGMBIDANGqLILWAYlTOAqNN
LSLRI.GQGPLYWroHNLDLNOiRGLTTrrraNTKKLETBISSGLDY'DWGAniKLGTGLSFDNTGALn''
GNXGDDKLTLWTTPDPSPSCRIHSDKDCKFTLYLTK.CGSQILASYAALAYSGM,ASITGTVASYTIELBED 5 (^GYIAffiNSSWRQYWYFKNGNSTmAPYXmVCTMPKLAAYPKTQSQTAiCeilYSQYYLSGDKSKP XfTETIXLNGTNESSEXSQVSHYSMSFTWAWESGQYATEXrAINSFrFSYIAEQ
SEQ ID NO : 28 - Séquence d’acides aminés de la fibre du PanAd3
MKRAKXSDETFNPVYPYDXENGPPSYPFLT?PFVSPDGîqESPPGYLSLRI.SEPLYXSHGiiEALKM:GNGLS 10 LDDAGfmTSqDWTVTPPlXKTKTXLSLQTSAPLTVSSGSLTVAAAAPLAVAGTSLTMQSQAPETVqnAK
LGLATQGPLTVSEGKXTLQTSAPETAADSSTLTVGTTPPISVSSGSLGEDMEDP&fyTHDG.KXGIKGGPLQ
VVDSOîTLTVYrGNGïTVAKîfALQTKVÂGAIÆYDSSGcNLEtRAAGtaiRIOTGGQLILDVAYSroAQNM·
SUOXX^M.YVmNHNW13îOœC2.TrrTSSîraXX£TWS<aj>YNANGÂÎIAKLGrŒTn»ÎTGAnVG
NTGDDKLTEWTTPDPSPNCR2ÎADKDgETLYLTKCGSQIXASYAAEÂVSGNLSSMTGTVSSYnEEREDÇe«i
GVLEiENSSLDKEYWHFRNGéîSTNAXPYTXlÂVGFXiPSLSAYPKTQSQTAKNNIYSEYYXHGDKSKPMïEX rnniGTNESSETSQVSHYSMSFTWSTOSGKYATETFATRSFrFSYIAEQ
SEQ ID NO : 29 - Séquence d'acides aminés de la fibre du ChAdl7 mKTKTSDESFWYWWTESGPPSVPFLTFPFVSFDGXQESPPGVLSWlAEPLVTSBGMLALKMGSGLS
LDDAGHLTSQDÎTSXXPPLKKTKTNLSEETSSPLTYSTSGALW.AAAAPLÂVÀGTSLIMQSEÂPI.ÂYQDÂK.
LTIAXSGPLTVSEGKLALQTSÄPLTAADSSTLXYSSTPPISYSSGSEGLDMEDPMYTHDGKLGIBJGGPLRY q VDSLHTLTYVTGNGLTVDKNALQTS.VTGALGYDTSGNLQIXAAGGMRmAYGQLÎLDVÂYPFDAQWîE:
SLKLGQGPLYYNTDHSLDLNCMRGLrrTTTWTKKLETKISSGLDYDXNGAVHSX,GTGLSFDWTGALTV
GNTGBDKETLSrTT?DPSWCWHSDKDCKÎTXYETKCGSQîLASYAÂLÂVSGNLASiTGTVÂSVTIELRED
QNGTCMENSSWKGYVNFWGKSTNAAFYTNAVGFMFNtAAYPKTQSQXAOmWSqWLNGDKSKP
AnXTIILNGTYESSETSQVSHYSMSFraiA3W,SGQYATETFATNSFTFSYY4EQ
SEQ ID NO : 30 - Séquence d'acides aminés de la fibre 25 du ChAdl9
MKiOKTSI«SFNWYPYDlENGÎWVm.TPm^HXÏ3FQE»PG\TJSlÂAH^VTSH<2ÆAlJmGSGLS
LDDAGNIXSQDVTTTXPPEKKTKTNLSLETSAPLTVSXSGALTLAAAAPLAVAGTSETMQSEAPLTYQDA
KLTLÂTRGPLTVSEGKLALQTSAPLTAADSS’rLWSATPPïSYSSGSLGLDMEDPKlYTHDGKLGIRIGGPLR
V¥DSLH3XTWTGNGiAYBNNAlQTRVTGALGYDTSGW.QLRAAGGMKinAMGQUEDYAYPFDAQW
LSERXGQGPLYA’NTDHNLDEKCWS.GLTTTTTNNTKKLETKIGSGEDYDWGAyTIKLGTGVSFDSTGALS
YGNTGDDKLTEWXPDPSPMCRfiîSDKDCKFTLWTSCGSQH,4SVA4LÂYSG»LASITGWSSXmFLSiS θ qKGVLMENSSLDKQYWOTSliGHSYMAIPYTSAVGFSiPlff.AAypiCTQSQTAiCG«VSq4YlNGOKSKP
MIXTIILNGXNESSETSQYSHYSMSFTWAWSGQYATEXEAXNSFTFSYIAEQ
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SEQ ID NO : 31 - Séquence d'acides aminés de la fibre du ChAd2 4
ÄOSnXTSIJESiCWYPYOTENGPPSVPEtTPPFVSPDGFQESPPGr’LSLXLAEÄVTSHGMLAIJÖtfGSGLS
LDDAGÎÎLTSQDYTTTTPPLKKTKTNLSLETSÂPLWSTSGALTLAAAÂPIA.VAGTSLTXiQSEAPLWQDA
KXTLATKGPLXVSEGELALQXSAPI.TAADSSTLTYSATPPINVSSGSLGLDMENPMYTHDGKXGÄIGGPL
RYTOSUXn.TWTGNGIA\X3WALQTSYTGALGYDTSGM.qLRAAGGMRIDANGQLILIArAYPFDAQN
KXSUlLtSQGPLY\YfTDHNLDLNC‘mGLTTTTXXWrKKLETKIGSGLDTOTNGAXXIKLGTG’vSFDSTGAL
SVGNTGDDKLTrWXTPDPSPNCSIHSDKDCKFTLVLTKCGSQîLASVAALÂXXGTÎLASITGWSSVTIFLKF
DQNGVLMENSSLDKQYWÎFSXGXSTNAXPYIXÎAVGFMPNLÂAYPKTQSQXAKNWVSQVYINGDKSKP
AÎILTITEXGTNESSETSQXXHYSMSFTWAWESGQYATEXFATMSFTFSYIÂEQ
SEQ ID NO : 32 - Séquence d'acides aminés de la fibre du ChAdll
MXRIKTSDESFOTVYPYDTENGPIWFFLXFFFVSPDGFqESPPGVLSUXLAEPîAYSHGMMAKMGSGLS
LDnAGKLTSQDVTrrFPPLKKTKTWLSLETSAPLTVSTSGALTLAAAVPLÄVÄGTSLTNIQSEAPLTVQDA
KXWLIXi^TVSB^XALQrSAÄTAADSSTLWATPPlSrSiiGSLtmMQAmTmcaa/aNFGÄaH
VVTKO<ALTVVT<X^WGTAU^VSGAU<YDSSGNI£IXAAGGMRWANG«iiœVAYPFDAQNN
LSLRlGQGPLF^XîSAHNLDl’NnCiRGLX'XPTSGXnXKXEXXŒKTAKGLn’DDnAI.AÏNPGEXÎLEEGSGSDTS
PLKTKLGLGLEYDS.SRAflAKLGXGLSEDWGAm’GMKNDDRLXLUm'PDPSPNCSlYSEKnAKFTLXAT
KCGSqVLASVSVLSVKGSLAPISGTVTSÄQULSiDESGYLLSMSSEDPQYWNYRKGOLTEGTÄX'TNAVGF &JPNLXAX?PKTQSQTAXSFGX*SQXA'rNGDKSKP&lILTnr.NGTNETGDAXV'STYSMSFS'U''iMWiiGSNYlNET
FqXNSFTFSYÎAQE
SEQ ID NO : 33 - Séquence d'acides aminés de la fibre du ChAd20
XiSK.TKTSDESFN?\A'PYDTESGPPSVPFLTPPFVSPDGFqESPPGXiLSLXL,AEPLYYSHGMLÄKMGSGl.S
LDDÄGNl,TSQDrrTASPPLKKTRXNLSLETSSPLTVSTSGALTVAAAÄPEA¥AGXSE.XMQSEÄPLXVQnAR
LTLATSGPLWSEGKrALQTSAPLTAADSSTLWSATPPLSTSNGSLGIDMQAPm~XMGKlGrXFGAPLii \XT}5LNALIYXXGQGLTINGmALqTOV5GALXYDTSGAXELKAAGGMKXXXANXGLILDYAYFroAQN>i
LSLSXGQGPLFXiNSAHW.DXXGt’XäB.GLY’XFTSGNXKRLEWIKXÄEGLn'DDTAlAJNÄGDGLqFDSGSDT
Wl.KTEXGLGLDYDSSBÄBAKLGTGLSF13FrrGÄrrVGHKNDDKLXI,WTrPDPSFGäCSIYSEKBÄZFTLVL
TSCGSQVLASVSVLSYKGSLAPiSGTWSAQIVlRinENGYLLSXISSLDPQYWNYgXGDLTEGTAYTKAV
GFMENrTAYPKTQSQXÄKSMVSQXYXNGDKSKPMXLTITLNGTNETGDATVSTYSMSFSWNWNGSNYI.
NETFQWSFTFSYXÄQE
SEQ ID NO : 34 - Séquence d'acides aminés de la fibre du ChAd31
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AiKRTKTSDESFNP\rYPYDTESG?PSYPFLTPPFVSPDGFqESPPGVLSENLAEPLVTSHGMIALKAIGSGES
U>DAGM.TSQDïrFASPP5_KKXKTîîLSLETSSPLTVSTSGALTVAAAAPLAVAGTStTMQSEAH.TV<ÿ5AK
LTLATKGPLTVSEGKLALQTSAPLTAADSSTLTYSATPPLSTSNGSLGroKtQAPiyTrNGSLGENFGAPLa
VTOSTNALTWTG^LroXTALQTmXGALNYBTSGPXEUtAAGGMRVDATGQLILDVAYPFDAQNN
LSLFXGQGPLiAYiSÂHNLDWn’YS.GLl’LFTSGNTKKLEYSîST-AKGLIYDDTALAINÂGDGEQEDSGSDT
NPLKTKLGLGEDYBSSSAttAKLGTGESFDNTGAIWGSiiNDDKLTLWTPDPSPHCRIYSEKDAKFTLXX 5 TKCGSqVLASVSXYSVKGSLAPISGTVTSAQIYUŒDEMÎYXASNSSLDPQYWmXKGDLTEGTÂYTNAV GFMPMAAYPXTQSQTAKSOTCSQWICiWRSKPMTLTmÄnWTGDATVSTYSMSFSWmVNGSNYI NETFqTNSFTFSYXAQE
SEQ ID NO : 35 - Séquence d'acides aminés de la fibre du PanAdl
MRRAETSDETFYPVYPYDTENGPPSVPFLYPPFVSPDGFQESPPGYtSLSLSEPLVTSHGàSAlKMGFiGLS LnDAGNLTSQDVTTVTPPlKSTKTM.SEQTSAPLTVSSGSLTVAAAAPLAVAGTSLTMQSQAPET«5DAK LGEATQGPLTVSEGXLCTQTSAPLTAASSSTLWSATPPLSTSMGSESIDMQAPHTTNGSXXLMGAPLHV VDTLKALTVAmGQGLTINGSALQTKWGAl.SYDTEGNIQEQAGGGiiRIDNNGQLILOTAyPFDAQNNLS LiU.GQGPLIWSAHNLDU<LMRGLYLFrSGNTKKLEVNirrASGLFYDGTAIAINAGDGLQFGSGSDTOPL QTKLGIXSIiTOSNKAnTKLGTGLSfnNTGArA'GNKNDDgXTLWTTRDPSFSCKDiSEKDAKLTI.VLTKC GSQVIASVSYLSVKGSIAPISGTVTSAQlYLRFDENGW.LSXSSLDPqYWNYRKGDSTEGIAyTVAVGFM ]_5 PNLTÄPXKTQSQTAKXNWSQynXNGDKTKPMTLIITLNGTN'ETGDAWSWSiiSFS’ÄWftGfGSNYIHDTP QWSFTFSYIAQE
SEQ ID NO : 36 - Séquence d'acides aminés de la fibre du PanAd2
MKSAKTSDETRGA’YPY'DTENGPPSYfPFLTPPFVSPDGFQESPPGXT.SLRLSEPLVTSHGAiLALKMGNGI.S
0 LDDAGHL’rSQDYTTVTPPLKKTKTNLSLQTSAPLWSSGSLTYAAAAPLAYAGTSLIMQSQAPLTVQnAX
LGLATQGPEWSEGKLTLQTSAPLTAADSSTLWSATPPESTSNGSLSIDMQAPIYTENGSXALNIGAPLHV
TOTUtALTVVTG<^Wi3hm.QTRVHGAl^Wffi<M[QLQAG<XîMWWGQUU<VAïnProAQNNLS
LKLGQGPlJATSAHNLDLSIAiS.GLYLFTSGYTXKLEY?NIKTÂiÎGrFYDGTA14IYAGDGLqFGSGSDTNPL
QTKLGLGLEYDSNKABTKLGTGLSEDNTGArrVG>iKNDDKLTL\VTTPDPSPNCRINSEKDAKLTLVI,TKC
GSQ\XASVSVl^VKGSIAHSGTVTSAQrVUŒDSî<mASNSSIJOK?YWYRKGDSTEGTAYnîAVGM
P>aTAYPKTQSQTASS>WSQ\nn-NGDSlXPMTLTlTIAiGTSETGDATVSTYSMSFSWNWKGSSYWDTF
QTKSFTFSYIAQE
SEQ ID NO : 37 - Séquence d'acides aminés du RSV FATM
MELLILKANAITnLTÂ’vTTCEASGQTïTEEFYQSTCSAVSKGYXSÂRTG^n’TSCTTIELSNDÎESKŒGTD
AKWLlKGELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNSSARSElPKFMNYTLiWAKSTWTl.SSSRKRRFLGFlL
GA’GSAIASGYAYSKYXHLEGEY’NKIKSALLSTHSAWSLSNGVSAXTSKYCDLKNYTDKQLLPnZNKQSCS
ISMETVIEFQQKHbmEETREFSWÄGVTTPVSIYMLn«ELLSLNDMPrWDQKKLMSWVqiVB.QQSY
0 SBiSÎSŒEYEAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTDÎTîŒGSBICLTRTDRGWYCDNAGSYSFFPQÂET
CKY’QSYX.YTCDT^iNXLTLPSEY'NLCWDIFWKYDCKMTSKTDVSSSt'ITSLGAn?SCYGKTKCTASNKN
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RGWIFSNGCDWSNKGWWSVGNTLTYAXîKQEGRSLYVKGEPIBîFYDPLATPSDEFDASïSQWIEKK
QSLAFSKSDELEîESAGiAGKSTÎNRKRSAPT^XQTLNFDLEiiLÂGDXXSWGPMALSKTrKLMDTIiîKDQL.
LSSSK'OIQMSTGDSIDTPNYDVQKHrMKLCGWAITEDAMKFrGEKîMLYAMSRLGRED'nKILRDAGY
HYKANGWYTTHSQDINGKEMKFEVLTLASLTTE:IQSvîEIESRKSYKKMLKEiiGEVAPEYRHDSPDCGM
IÏLCIAALVnMLAÂœgSGLTÂ\TSSASmtI.ÎQŒMKRYKGELPRDIÂNS
FT’EATEK'YPHEîDATYHFGIAGSSTRGGSRWGffAGLEAiNAY’GAGQVN-a.RWGA’LÂKSVKNSiLGHÂSV
QÄEMEQWEVYEYÄGRLGGEAGFYHnGGiPRASELSEXQFPHFSSWLGHAAGLGE,iGEYRCTPgMJDL
T'D.AAKAYAEQLKESGATNYSVLDET.AEELEÂîRHqLNPKDNDVELGGGGSGGGGMSRXFffCRFEIRGHC
LHGKRCHFSHHYFEWPHALLYSqWMOïRa-KSMDKSIDTLSEISGAAEUMTEEYAEGWGVLESYIGS lAWTRQSACVAMSKLLTELNSDDKREWiŒELNSPKISA'YYGn.WïTESÎs’SXSNKQTÎHLLKSXPADAXR
KTIKMTLDIHKSrriNNPKESWSDTKDHAKNNDTr
SEQ ID NO : 38 - Séquence polynucléotidique de Gag du VIH
ATGGGTGCTAGGGCTTCTGTGCTGTCTGGTGGTGAGCTGGAGAAGTGGGAGAAGATeAGGCTGAGGC
CTGGTGGCAAGAAGÄAGTACAÄGCTÄäAGCÄC'ATTGTGTGGGCCTCCAGGGäGCTGGAGAGGTTTG
CTGTGÄACCCTGGGCTGCTGGAGÄCCTCTGAGGGGTGCAGGCAGATCCTGGGCCAGCTCCÄGCCCTC
CCTGCAAACAGGCTCTGAGGAGCTGAGGTCCCTGTACAACACAGTGGCTACCCTGTäCTGTGTGCAC cagaagattga.tgtgaaggacaccaaggaggccctggagaägattgaggaggagcagaac.aagtcc aägäägaaggcccagcäggctgctgctggcacaggcaäctccagccaggtgtcccagaactacccc attgtgcagaacctcgagggccägatggtgcaccaggccatctccccccggaccctgaatgcctggg
TGAAGGTGGTGGAGGAGAGGCCTTCTCCC'CTGAGGTGäICCCCäTGTTCTCTGGCCTGTCTGAGGGTG
CCACCCCCCAGGACCTGAACACCÄTGCTGAACAGAGTGGGGGGCCATCAGGCTGCCÄTGCAGATGCT
GAAGGÄGÄCCATCAATGAGGAGGCTGCTG.AGTGGGAGAGGCTGCÄTCCTGTGCACGCTGGC'CCCATT
GC‘CCCCGGCCAGäXGAGGGAGCCCAGGGGCTCTGACATTGCTGGCACCACCTCCACCCTCCAGGAGC
AGATTGGCTGGATGACCAACAACCCCCCCATCCCTGTGGGGGAAATCXACÄAGAGGTGGäTCATCCT gggcctgaäcaagattgtgaggatgtäctgccccacctccatcctggäcatcäggcagggcgccaag
GäGCCCTTCAGGGACTATGTGGACAGGTTCTäCAAGACCGTGAGGGCTGAGCAGGCCTCCCäGGAGG
TGAAGAACTCGATGAîCAGAGACCCTGCTGGTGCAGAATGCCAACCCTGACTGCAAGACCATOCTGAA
GGCCCTGGGC’CCTGCTGCCACCCTGGäGGA.GATGäTGAGAGCCTGCCAGG-GGGTGGGGGGCCCTGGT
CACAAGGeCAGGGTGCTGGCTGAGGCCATGTeCCAGGTGACCAACTCeGCCACCATCATGAIGCAGA
GGGGCAACTrcAGGAACCAGAGGAÄßACAGTGAAGTGCTTCAACTGTGGCAAGGTGGGCCACATTG
CCAAGAACTGTAGGGCCCCCAGGäAGAAGGGCTGCTGGAäGTGTGGCA^AGGäGGGCCACCAGäTGA aggactgcaatgagaggcaggccaacttcctgggcaaaatctggccctcccacäagggcaggcctg
GCAÄCTrCCTCCAGTCCAGGCCTGAGCCCACAGCCCCTCCCGAGGAGTCCTTCAGGXTTGGGGÄGGA gaagaccäcccccagccägaagcaggagcccättgacaaggagctgtaccccctggcctccctgag
GTCCCTGTTTGGCÄACGACCCCTCCTCCCAGTAA
197
BE2016/5434

Claims (64)

  1. REVENDICATIONS
    1. Polynucléotide isolé, le polynucléotide codant pour un polypeptide choisi dans le groupe constitué de :
    (a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1, et (c) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3.
  2. 2. Polynucléotide recombinant comprenant un polynucléotide choisi dans le groupe constitué de :
    (a) un polynucléotide qui code pour un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, (b) un polynucléotide qui code pour un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1, et (c) un polynucléotide qui code pour un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3.
  3. 3. Vecteur recombinant comprenant un polynucléotide choisi dans le groupe constitué de :
    (a) un polynucléotide qui code pour un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, (b) un polynucléotide qui code pour un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1, et
    198
    BE2016/5434 (c) un polynucléotide qui code pour un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3.
  4. 4. Adénovirus recombinant comprenant au moins un polynucléotide ou un polypeptide choisi dans le groupe constitué de :
    (a) un polynucléotide qui code pour un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, (b) un polynucléotide qui code pour un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1, (c) un polynucléotide qui code pour un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3, (d) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, (e) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1, et (f) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3.
  5. 5. Composition comprenant au moins l'un des suivants :
    (a) un polynucléotide qui code pour un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, (b) un polynucléotide qui code pour un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1, (c) un polynucléotide qui code pour un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3,
    199
    BE2016/5434 (d) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, (e) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1, (f) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3, (g) un vecteur selon la revendication 3, et (h) un adénovirus recombinant selon la revendication 4, et un excipient pharmaceutiquement acceptable.
  6. 6. Cellule comprenant au moins l'un des suivants :
    (a) un polynucléotide qui code pour un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, (b) un polynucléotide qui code pour un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1, (c) un polynucléotide qui code pour un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3, (d) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, (e) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1, (f) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3, (g) un vecteur selon la revendication 3, et (h) un adénovirus recombinant selon la revendication 4, et un excipient pharmaceutiquement acceptable.
    200
    BE2016/5434
  7. 7. Polypeptide adénoviral isolé choisi dans le groupe constitué de :
    (a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1, et (c) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3.
  8. 8. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, le polynucléotide codant pour un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1.
  9. 9. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon la revendication 8, le polynucléotide ayant une séquence selon SEQ ID NO : 2.
  10. 10. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon l'une quelconque des revendications 1 à polynucléotide codant pour un dérivé fonctionnel polypeptide ayant la séquence d'acides aminés
    SEQ ID NO : 1, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1.
  11. 11. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon la revendication 10, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 89,0 %, comme au moins identique à 99,0 %, comme au moins identique à 99,6 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1.
  12. 12. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou
    6, le d ' un selon cellule selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, comprenant en outre un polynucléotide codant pour :
    201
    BE2016/5434 (a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3 ; ou (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 50,0 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 3, ou (a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5 ; ou (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 50 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 5.
  13. 13. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, comprenant en outre un polynucléotide codant pour :
    (a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3 ; ou (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 50,0 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 3, et (a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5 ; ou (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 50 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 5.
    202
    BE2016/5434
  14. 14. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon la revendication soit 12 soit 13, où le dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3 a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 70,0 %, comme au moins identique à 90,0 %, comme au moins identique à 99 % sur sa lonqueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 3.
  15. 15. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, où le dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5 a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 70,0 %, comme au moins identique à 90,0 %, comme au moins identique à 99 % sur sa lonqueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 5.
  16. 16. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, le polynucléotide codant pour un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3.
  17. 17. Polynucléotide, vecteur, adénovirus recombinant, composition ou cellule selon la revendication 16, le polynucléotide ayant une séquence polynucléotidique selon SEQ ID NO : 5.
  18. 18. Polynucléotide, vecteur, adénovirus recombinant, composition ou cellule selon la revendication soit 16 soit 17, comprenant en outre un polynucléotide codant pour :
    (a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1 ; ou (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 50 % sur sa lonqueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1, ou
    203
    BE2016/5434 (a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5 ; ou (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 50 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 5.
  19. 19. Polynucléotide, vecteur, adénovirus recombinant, composition ou cellule selon la revendication soit 16 soit 17, comprenant en outre un polynucléotide codant pour :
    (a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1 ; ou (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 50 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1, et (a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5 ; ou (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 50 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 5.
  20. 20. Polynucléotide, vecteur, adénovirus recombinant, composition ou cellule selon la revendication soit 18 soit 19, où le dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1 a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 70,0 %, comme au moins identique à 90,0 %, comme au moins identique à 99,4 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1.
  21. 21. Polynucléotide, vecteur, adénovirus recombinant, composition ou cellule selon l'une quelconque des
    204
    BE2016/5434 revendications 18 à 20, où le dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5 a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 70,0 %, comme au moins identique à 99,0 %, comme au moins identique à 99 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 5.
  22. 22. Polypeptide, adénovirus recombinant, composition ou cellule selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, le polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1 .
  23. 23. Polypeptide, adénovirus recombinant, composition ou cellule selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, le polypeptide étant un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 80 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1.
  24. 24. Polypeptide, adénovirus recombinant, composition ou cellule selon la revendication 23, le dérivé fonctionnel ayant une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 89,0 %, comme au moins identique à 99,0 %, comme au moins identique à 99,6 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1.
  25. 25. Polypeptide, adénovirus recombinant, composition ou cellule selon l'une quelconque des revendications 22 à 24, comprenant en outre :
    (a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3 ; ou (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 50,0 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 3, ou
    205
    BE2016/5434 (a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5 ; ou (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 50 % sur sa lonqueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 5.
  26. 26. Polypeptide, adénovirus recombinant, composition ou cellule selon l'une quelconque des revendications 22 à 24, comprenant en outre :
    (a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3 ; ou (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 50,0 % sur sa lonqueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 3, et (a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5 ; ou (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 50 % sur sa lonqueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 5.
  27. 27. Polypeptide, adénovirus recombinant, composition ou cellule selon la revendication soit 25 soit 26, où le dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3 a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 70,0 %, comme au moins identique à 90,0 %, comme au moins identique à 99 % sur sa lonqueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 3.
  28. 28. Polypeptide, adénovirus, composition ou cellule selon l'une quelconque des revendications 25 à 27, où le dérivé
    206
    BE2016/5434 fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5 a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 70,0 %, comme au moins identique à 90,0 %, comme au moins identique à 99 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 5.
  29. 29. Polypeptide, adénovirus, composition ou cellule selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, le polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 3.
  30. 30. Polypeptide, adénovirus, composition ou cellule selon la revendication 29, comprenant en outre :
    (a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1 ; ou (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 50 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1, ou (a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5 ; ou (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 50 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 5.
  31. 31. Polypeptide, adénovirus, composition ou cellule selon la revendication 29, comprenant en outre :
    (a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1 ; ou (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 50 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1,
    207
    BE2016/5434 et (a) un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5 ; ou (b) un dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5, où le dérivé fonctionnel a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 50 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 5.
  32. 32. Polypeptide, adénovirus, composition ou cellule selon la revendication soit 30 soit 31, où le dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 1 a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 70,0 %, comme au moins identique à 99,0 %, comme au moins identique à 99,4 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 1.
  33. 33. Polypeptide, adénovirus, composition ou cellule selon l'une quelconque des revendications 30 à 32, où le dérivé fonctionnel d'un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés selon SEQ ID NO : 5 a une séquence d'acides aminés qui est au moins identique à 70,0 %, comme au moins identique à 90,0 %, comme au moins identique à 99 % sur sa longueur entière à la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 5.
  34. 34. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon l'une quelconque des revendications 1 à 21, le polynucléotide comprenant au moins l'un des suivants :
    (a) une extrémité 5' adénovirale, de préférence une répétition terminale inversée en 5' adénovirale ;
    (b) une région E1A adénovirale, ou l'un de ses fragments, choisie parmi les régions E1A_28OR et E1A_243R ;
    (c) une région EIB ou IX adénovirale, ou l'un de ses fragments, choisie dans le groupe constitué des régions E1B_19K,
    EIB 55K ou IX ;
    208
    BE2016/5434 (d) une région E2B adénovirale, ou l'un de ses fragments, choisie dans le groupe constitué des régions E2B_pTP, E2B_polymérase et E2B_IVa2 ;
    (e) une région LI adénovirale, ou l'un de ses fragments, ledit fragment codant pour une protéine adénovirale choisie dans le groupe constitué des protéines Ll_13,6K, L1_52K et Ll_IIIa ;
    (f) une région L2 adénovirale, ou l'un de ses fragments, ledit fragment codant pour une protéine adénovirale choisie dans le groupe constitué de la protéine L2_penton selon la revendication 3, la protéine L2_pVII, la protéine L2_V et la protéine L2_pX ;
    (g) une région L3 adénovirale, ou l'un de ses fragments, ledit fragment codant pour une protéine adénovirale choisie dans le groupe constitué de la protéine L3_pVI, la protéine L3_hexon selon la revendication 2 et la protéine L3_protéase ;
    (h) une région E2A adénovirale ;
    (i) une région L4 adénovirale, ou l'un de ses fragments, ledit fragment codant pour une protéine adénovirale choisie dans le groupe constitué de la protéine L4_100k, la protéine L4_33k et la protéine L4_VIII ;
    (j) une région E3 adénovirale, ou l'un de ses fragments, choisie dans le groupe constitué de l'ORFl de E3, 1'ORF2 de E3, de 1 ' ORF3 de E3, 1 ' ORF4 de de E3, 1 ' ORF5 de E3, 1ORF6 de E3,
    1 ' ORF7 de E3, 1ORF8 de E3, et 1ORF9 de E3 ;
    (k) une région L5 adénovirale, ou l'un de ses fragments, ledit fragment codant pour la protéine fibre L5_fibre selon la revendication 1 ;
    (l) une région E4 adénovirale, ou l'un de ses fragments, choisie dans le groupe constitué de 1'ORF7 de E4, l'ORF6 de E4,
    1'ORF4 de E4, 1'ORF3 de E4, 1'ORF2 de E4, et l'ORFl de E4 ;
    (m) une extrémité 3' adénovirale, de préférence une répétition terminale inversée en 3' adénovirale ; et/ou (n) une région d'ARN VAI ou VAII adénovirale, de préférence une région d'ARN VAI ou VAII adénovirale provenant d'un
    209
    BE2016/5434 adénovirüs autre que ChAdl55, de façon davantage préférée provenant de l'Ad5.
  35. 35. Polynucléotide, vecteur, adénovirüs, composition ou cellule selon la revendication 34, le polynucléotide comprenant au moins l'un des suivants :
    (a) une extrémité 5' adénovirale, de préférence une répétition terminale inversée en 5' adénovirale ;
    (e) une région L1 adénovirale, ou l'un de ses fragments, ledit fragment codant pour une protéine adénovirale choisie dans le groupe constitué des protéines Ll_13,6K, L1_52K et Ll_IIIa ;
    (f) une région L2 adénovirale, ou l'un de ses fragments, ledit fragment codant pour une protéine adénovirale choisie dans le groupe constitué de la protéine L2_penton selon la revendication 3, la protéine L2_pVII, la protéine L2_V et la protéine L2_pX ;
    (g) une région L3 adénovirale, ou l'un de ses fragments, ledit fragment codant pour une protéine adénovirale choisie dans le groupe constitué de la protéine L3_pVI, la protéine hexon L3_hexon selon la revendication 2 et la protéine L3_protéase ;
    (i) une région L4 adénovirale, ou l'un de ses fragments, ledit fragment codant pour une protéine adénovirale choisie dans le groupe constitué de la protéine L4_100k, la protéine L4_33k et la protéine L4_VIII ;
    (k) une région L5 adénovirale, ou l'un de ses fragments, ledit fragment codant pour la protéine fibre L5_fibre selon la revendication 1 ;
    (m) une extrémité 3' adénovirale, de préférence une répétition terminale inversée en 3' adénovirale.
  36. 36. Polynucléotide, vecteur, adénovirüs, composition ou cellule selon l'une quelconque des revendications 1 à 21, le polynucléotide comprenant une région d'ARN VAI ou VAII adénovirale.
    210
    BE2016/5434
  37. 37. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon la revendication 36, dans lesquels la région d'ARN VAI ou VAII provient d'un adénovirus autre que le ChAdl55.
  38. 38. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon la revendication 37, dans lesquels la région d'ARN VAI ou VAII provient de l'Ad5.
  39. 39. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon l'une quelconque des revendications 1 à 21, le polynucléotide comprenant ou étant constitué d'un polynucléotide qui est au moins identique à 98,6 % sur sa longueur entière à une séquence de référence qui est constituée essentiellement de SEQ ID NO : 6, 7 ou 8.
  40. 40. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon la revendication 39, le polynucléotide comprenant ou étant constitué d'un polynucléotide qui est au moins identique à 99 % sur sa longueur entière à la séquence de référence.
  41. 41. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon la revendication 40, le polynucléotide comprenant ou étant constitué d'un polynucléotide qui est au moins identique à 99,5 % sur sa longueur entière à la séquence de référence.
  42. 42. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon l'une quelconque des revendications 39 à 41, le polynucléotide comprenant ou étant constitué d'un polynucléotide qui est identique sur sa longueur entière à la séquence de référence.
  43. 43. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon la revendication 42, la séquence de référence étant SEQ ID NO : 7.
  44. 44. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon la revendication 42, la séquence de référence étant SEQ ID NO : 8.
  45. 45. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon la revendication 42, la séquence de référence étant SEQ ID NO : 8 ou 9.
    211
    BE2016/5434
  46. 46. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon l'une quelconque des revendications 1 à 21, le polynucléotide comprenant une mutation ou une délétion qui rend non fonctionnel au moins un qène d'une réqion qénomique choisie dans le qroupe constitué de EIA, E1B, E2A, E2B, E3 et E4.
  47. 47. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon la revendication 46, où il manque au polynucléotide au moins un qène d'une réqion qénomique choisie dans le qroupe constitué de EIA, E1B, E2A, E2B, E3 et/ou E4.
  48. 48. Polynucléotide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon la revendication soit 46 soit 47, les réqions qénomiques étant E1A et/ou E1B.
  49. 49. Adénovirus selon l'une quelconque des revendications 4 et 8 à 48, 1'adénovirus recombinant étant compétent pour la réplication.
  50. 50. Adénovirus selon l'une quelconque des revendications 4 et 8 à 48, 1'adénovirus recombinant étant incompétent pour la réplication.
  51. 51. Adénovirus selon l'une quelconque des revendications 4 et 8 à 50, 1'adénovirus recombinant comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine, la séquence d'acide nucléique étant liée de façon fonctionnelle à une ou plusieurs séquences qui diriqent l'expression de ladite protéine dans une cellule hôte.
    52 . Adénovirus selon la revendication 51, dans lequel la protéine est une protéine antiqénique ou 1' un de ses fraqments. 53. Adénovirus selon la revendication 52, dans lequel la protéine est une protéine hétéroloque ou 1' un de ses fraqments. 54 . Adénovirus selon la revendication 53, dans lequel la protéine est dérivée d ' un virus. 55. Adénovirus selon l'une quelconque des revendications 49
    à 54, dans lequel les une ou plusieurs séquences qui diriqent l'expression dudit produit dans une cellule hôte comprennent une séquence choisie parmi une ou plusieurs du qroupe constitué : de
    212
    BE2016/5434 séquences d'initiation de la transcription, de terminaison de la transcription, promoteurs et amplificateurs.
  52. 56. Adénovirus selon la revendication 55, dans lequel les une ou plusieurs séquences qui dirigent l'expression dudit produit dans une cellule hôte comprennent une séquence promoteur.
  53. 57. Adénovirus selon la revendication 56, dans lequel la séquence promoteur est choisie dans le groupe constitué d'un promoteur interne, un promoteur natif, le promoteur des LTR du RSV, le promoteur du CMV, le promoteur du SV40, le promoteur de la dihydrof date réductase, le promoteur de la ß-actine, le promoteur de la PGK, le promoteur EFla et le promoteur CASI.
  54. 58. Adénovirus selon l'une quelconque des revendications 4 et 8 à 57, 1'adénovirus présentant une séroprévalence inférieure à 10 % chez des sujets humains et de préférence aucune séroprévalence chez des sujets humains.
  55. 59. Adénovirus selon l'une quelconque des revendications 4 et 8 à 58, 1'adénovirus étant capable d'infecter une cellule de mammifère.
  56. 60. Composition selon l'une quelconque des revendications 5 et 8 à 48, dans laquelle l'adjuvant est choisi à partir de la liste constituée : d'adjuvants inorganiques (par exemple, des sels de métaux inorganiques tels que le phosphate d'aluminium ou 1'hydroxyde d'aluminium), d'adjuvants organiques (par exemple, des saponines, comme QS21, ou le squalène), d'adjuvants à base d'huiles (par exemple, l'adjuvant complet de Freund et l'adjuvant incomplet de Freund), de cytokines (par exemple, ILlß, IL-2, IL-7, IL-12, IL-18, GM-CFS, et INF-γ), d'adjuvants particulaires (par exemple, des complexes immunostimulants (ISCOM), des liposomes, ou des microsphères biodégradables), de virosomes, d'adjuvants bactériens (par exemple, le monophosphoryl-lipide A, tel que le monophosphoryl-lipide A 3dés-O-acylé (3D-MPL), ou des muramyl-peptides), d'adjuvants de synthèse (par exemple, des copolymères séquences non ioniques,
    213
    BE2016/5434 des analogues de muramyl-peptides, ou un lipide A de synthèse), d'adjuvants à base de polynucléotides de synthèse (par exemple, la polyarginine ou la polylysine) et d'oligonucléotides immunostimulants contenant des dinucléotidiques CpG non méthylés (« CpG »).
  57. 61. Composition selon la revendication 60, dans laquelle l'adjuvant est un 3D-MPL et/ou QS21.
  58. 62. Cellule selon l'une quelconque des revendications 6 et 8 à 48, la cellule étant une cellule hôte qui exprime au moins un gène adénoviral choisi dans le groupe constitué de EIA, E1B,
    E2A, E2B, E3, E4, Ll, L2, L3, L4 et L5.
  59. 63. Cellule selon la revendication 62, la cellule hôte étant cultivée en suspension.
  60. 64. Polynucléotide, polypeptide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon l'une quelconque des revendications 1 à 63, pour une utilisation en tant que médicament.
  61. 65. Polynucléotide, polypeptide, vecteur, adénovirus, composition ou cellule selon la revendication 64, pour une utilisation en tant que vaccin.
  62. 66. Utilisation du polynucléotide, du polypeptide, du vecteur, de 1'adénovirus, de la composition ou de la cellule selon l'une quelconque des revendications 1 à 63 pour le traitement ou la prophylaxie d'une maladie.
  63. 67. Procédé d'induction d'une réponse immunitaire chez un sujet comprenant l'administration du polynucléotide, du polypeptide, du vecteur, de 1'adénovirus, de la composition ou de la cellule au sujet.
  64. 68. Polynucléotide isolé comprenant ou étant constitué de la séquence selon SEQ ID NO : 6.
    214
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