BE1022949B1

BE1022949B1 - IMMUNOGENIC COMPOSITION

Info

Publication number: BE1022949B1
Application number: BE2015/5390A
Authority: BE
Inventors: Cindy Castado
Original assignee: Glaxosmithkline Biologicals S.A.
Priority date: 2014-06-25
Filing date: 2015-06-25
Publication date: 2016-10-21
Also published as: JP2017520573A; PL3160500T3; CN106536544B; DK3160500T3; EP3636278A2; BE1022949A1; EP3160500A1; WO2015197737A1; JP2020100625A; JP6688233B2; CA2952118A1; US20170218031A1; EP3160500B1; ES2749701T3; BR112016030096A8; PT3160500T; LT3160500T; HRP20191864T1; CN106536544A; CY1122145T1

Abstract

La présente invention concerne des compositions immunogËnes comprenant la CDTb isolée de Clostridium difficile. En particulier, la protéine CDTb isolée de Clostridium difficile a été mutée pour modifier la capacité de former des pores, pour modifier la capacité d'heptamèrisation, ou est une protéine CDTb tronquée avec le peptide signal et le prodomaine éliminés et également le domaine de liaison aux récepteurs éliminé et/ou le domaine de liaison t la CDTa éliminé. L'invention concerne également des protéines de fusion comprenant une protéine CDTa et une protéine CDTb. Des vaccins comprenant de telles compositions immunogËnes et leurs utilisations thérapeutiques forment également une partie de l'invention.The present invention relates to immunogenic compositions comprising CDTb isolated from Clostridium difficile. In particular, the CDTb protein isolated from Clostridium difficile has been mutated to modify the ability to form pores, to modify the capacity for heptamerization, or is a truncated CDTb protein with the signal peptide and prodomain removed and also the binding domain. at the receptors removed and / or the CDTα binding domain removed. The invention also relates to fusion proteins comprising a CDTa protein and a CDTb protein. Vaccines comprising such immunogenic compositions and their therapeutic uses also form part of the invention.

Description

COMPOSITION IMMUNOGENEIMMUNOGENIC COMPOSITION

ContexteContext

Clostridium difficile (C. difficile) est la cause la plus importante des infections intestinales nosocomiales et est la cause majeure de la colite pseudomembraneuse chez les êtres humains (Bartlett et al., Am. J. Clin. Nutr. 11 suppl: 2521-6 (1980)) . Le taux de mortalité global associé pour les individus infectés par C. difficile a été calculé comme étant de 5,99 % dans les 3 mois du diagnostic, avec une mortalité supérieure associée à un âge avancé, de 13,5 % chez les patients âgés de plus de 80 ans (Karas et al., Journal of Infection 561: 1-9 (2010)) . Le traitement actuel pour une infection à C. difficile est l'administration d'antibiotiques (métronidazole et vancomycine) ; toutefois, il a été mis en évidence des souches qui sont résistantes à ces antibiotiques (Shah et al., Expert Rev. Anti Infect. Ther. 8(5), 555-564 (2010)). Par conséquent, il existe un besoin de compositions immunogènes capables d'induire des anticorps contre, et/ou une réponse immunitaire protectrice contre, C. difficile. L'entérotoxicité de C. difficile est principalement due à l'action de deux toxines, la toxine A et la toxine B. Ce sont toutes les deux des cytotoxines puissantes (Lyerly et al., Current Microbiology 21: 29-32 (1990).Clostridium difficile (C. difficile) is the most important cause of nosocomial intestinal infections and is the major cause of pseudomembranous colitis in humans (Bartlett et al., Am., J. Clin Nutr., 11 suppl: 2521-6 (1980)). The overall associated mortality rate for C. difficile-infected individuals was calculated as 5.99% within 3 months of diagnosis, with higher mortality associated with older age, 13.5% in elderly patients over 80 years old (Karas et al., Journal of Infection 561: 1-9 (2010)). The current treatment for C. difficile infection is the administration of antibiotics (metronidazole and vancomycin); however, strains that are resistant to these antibiotics have been identified (Shah et al., Expert Rev. Anti Infect Ther 8 (5), 555-564 (2010)). Therefore, there is a need for immunogenic compositions capable of inducing antibodies against, and / or a protective immune response against, C. difficile. The enterotoxicity of C. difficile is primarily due to the action of two toxins, toxin A and toxin B. Both are potent cytotoxins (Lyerly et al., Current Microbiology 21: 29-32 (1990) .

Il a été démontré que des fragments de la toxine A, en particulier des fragments du domaine C-terminal, peuvent mener à une réponse immunitaire protectrice chez des hamsters (Lyerly et al, Current Microbiology 21: 29-32 (1990)), WO 96/12802 et WO 00/61762.It has been demonstrated that fragments of toxin A, particularly fragments of the C-terminal domain, can lead to a protective immune response in hamsters (Lyerly et al, Current Microbiology 21: 29-32 (1990)), WO 96/12802 and WO 00/61762.

Certaines souches, mais pas toutes, expriment également la toxine binaire de Clostridium difficile (CDT). Similaire à de nombreuses autres toxines binaires, la CDT est composée de deux composants - un composant actif du point de vue enzymatique (« toxine binaire A » ou « CDTa ») et un composant de transport et de liaison inerte du point de vue catalytique (« toxine binaire B » ou « CDTb ») . Le composant inerte du point de vue catalytique facilite la translocation de la CDTa dans la cellule cible.Some, but not all, strains also express the binary toxin Clostridium difficile (CDT). Similar to many other binary toxins, CDT is composed of two components - an enzymatically active component ("binary toxin A" or "CDTa") and a catalytically inert, transport and binding component ( "Binary toxin B" or "CDTb"). The catalytically inert component facilitates the translocation of CDTa into the target cell.

La CDTa est dotée d'une activité ADP-ribosylante, qui transfère le radical ADP-ribose du NAD/NADPH à l'actine monomère (actine G) dans la cellule cible et empêchant ainsi sa polymérisation en actine F et entraînant la rupture du cytosquelette et la mort éventuelle de la cellule (Sundriyal et al., Protein expression and Purification 74 (2010) 42-48).CDTa is endowed with ADP-ribosylating activity, which transfers the ADP-ribose radical of NAD / NADPH to actin monomer (actin G) in the target cell and thus prevents its polymerization in actin F and leading to cytoskeletal rupture. and eventual death of the cell (Sundriyal et al., Protein expression and Purification 74 (2010) 42-48).

Le document WO 2013/112867 (Merck) décrit des vaccins dirigés contre Clostridium difficile comprenant des protéines recombinantes de toxine A, toxine B et CDTa de C. difficile, comprenant toutes des mutations définies spécifiquement par rapport aux séquences natives des toxines qui sont décrites comme réduisant ou éliminant substantiellement la toxicité, en combinaison avec la toxine binaire B (CDTb).WO 2013/112867 (Merck) discloses vaccines directed against Clostridium difficile comprising recombinant toxin A, toxin B and CDTa proteins of C. difficile, all including mutations defined specifically with respect to the native sequences of the toxins which are described as Substantially reducing or eliminating toxicity, in combination with B-toxin (CDTb).

Les présents inventeurs ont découvert que les protéines CDTb comprenant des mutations conçues pour modifier la capacité de former des pores de la CDTb ou pour modifier la capacité d'heptamérisation de la CDTb présentent des caractéristiques améliorées. Résumé de 1'inventionThe present inventors have found that CDTb proteins comprising mutations designed to modify the ability to form CDTb pores or to modify the heptamerization capacity of CDTb exhibit improved characteristics. Summary of the invention

Dans un premier aspect de l'invention, il est proposé une composition immunogène comprenant une protéine CDTb isolée de Clostridium difficile, où la protéine CDTb isolée de Clostridium difficile a été mutée pour modifier la capacité de former des pores.In a first aspect of the invention there is provided an immunogenic composition comprising a CDTb protein isolated from Clostridium difficile, wherein the CDTb protein isolated from Clostridium difficile has been mutated to modify the ability to form pores.

Dans un deuxième aspect de l'invention, il est proposé une composition immunogène comprenant une protéine CDTb isolée de Clostridium difficile qui est une protéine CDTb tronquée avec le peptide signal et le prodomaine éliminés et également le domaine de liaison au récepteur éliminé et/ou le domaine de liaison à la CDTa éliminé.In a second aspect of the invention there is provided an immunogenic composition comprising a CDTb protein isolated from Clostridium difficile which is a truncated CDTb protein with deleted signal peptide and prodomain and also the eliminated receptor binding domain and / or the CDTa binding domain eliminated.

Dans un troisième aspect de l'invention, il est proposé une composition immunogène comprenant une protéine CDTb de Clostridium difficile, où la protéine CDTb isolée de Clostridium difficile a été mutée pour modifier la capacité d'heptamérisation.In a third aspect of the invention, there is provided an immunogenic composition comprising a Clostridium difficile CDTb protein, wherein the CDTb protein isolated from Clostridium difficile has been mutated to modify the heptamerization capacity.

Dans un quatrième aspect de l'invention, il est proposé une composition immunogène comprenant une protéine de fusion comprenant une protéine CDTa pleine longueur et une protéine CDTb.In a fourth aspect of the invention, there is provided an immunogenic composition comprising a fusion protein comprising a full-length CDTa protein and a CDTb protein.

Dans un cinquième aspect, la présente invention propose un vaccin comprenant la composition immunogène de l'un quelconque des quatre premiers aspects et un excipient pharmaceutiquement acceptable.In a fifth aspect, the present invention provides a vaccine comprising the immunogenic composition of any one of the first four aspects and a pharmaceutically acceptable excipient.

Dans un sixième aspect, la présente invention propose la composition immunogène de l'un quelconque des quatre premiers aspects ou le vaccin du cinquième aspect, pour une utilisation dans le traitement ou la prévention d'une maladie, par exemple d'une maladie à C. difficile.In a sixth aspect, the present invention provides the immunogenic composition of any one of the first four aspects or the vaccine of the fifth aspect, for use in the treatment or prevention of a disease, e.g. . difficult.

Dans un septième aspect, la présente invention propose l'utilisation de la composition immunogène de l'un quelconque des quatre premiers aspects ou du vaccin du cinquième aspect dans la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'une maladie, par exemple d'une maladie à C. difficile.In a seventh aspect, the present invention provides the use of the immunogenic composition of any one of the first four aspects or the fifth aspect vaccine in the preparation of a medicament for the prevention or treatment of a disease, for example, a C. difficile disease.

Dans un huitième aspect, la présente invention propose un procédé de prévention ou de traitement d'une maladie à C. difficile comprenant l'administration d'une composition immunogène de l'un quelconque des quatre premiers aspects ou du vaccin du cinquième aspect à un sujet mammifère.In an eighth aspect, the present invention provides a method of preventing or treating a C. difficile disease comprising administering an immunogenic composition of any one of the first four aspects or the vaccine of the fifth aspect to a mammal subject.

Dans un neuvième aspect, la présente invention propose de nouveaux polypeptides et nucléotides tels que définis ici.In a ninth aspect, the present invention provides novel polypeptides and nucleotides as defined herein.

Dans un autre aspect, la présente invention propose un procédé pour le traitement ou la prévention d'une affection ou d'une maladie provoquée en totalité ou en partie par C. difficile. Le procédé comprend l'administration à un sujet en ayant besoin d'une quantité thérapeutiquement efficace des protéines telles que décrites ici, de la composition immunogène de l'invention ou des vaccins de l'invention.In another aspect, the present invention provides a method for treating or preventing an ailment or disease caused in whole or in part by C. difficile. The method comprises administering to a subject in need of a therapeutically effective amount of the proteins as described herein, the immunogenic composition of the invention or vaccines of the invention.

BREVE DESCRIPTION DES DESSINSBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

Figure 1 - Cytotoxicité de CDTb candidates seules sur des cellules HT29 : données de l'exemple 7. Les C37, C123, C124, C126 et C128 auxquelles il est fait référence sur la figure 1 sont les protéines CDTb telles que décrites dans les exemples 2, 4 et 6, dont les séquences sont présentées dans le résumé des séquences (tableau A) .Figure 1 - Cytotoxicity of candidate CDTb alone on HT29 cells: data of example 7. The C37, C123, C124, C126 and C128 referred to in FIG. 1 are the CDTb proteins as described in examples 2 , 4 and 6, whose sequences are presented in the sequence summary (Table A).

Figure 2 - Cytotoxicité de CDTb candidates mélangées avec de la CDTa entière sur des cellules HT29 : données de l'exemple 7. Les C37, C123, C124, C126 et C128 auxquelles il est fait référence sur la figure 1 sont les protéines CDTb telles que décrites dans les exemples 2, 4 et 6, dont les séquences sont présentées dans le résumé des séquences (tableau A). La « CDTa entière » est la protéine CDTa C34 dont la séquence est présentée dans le résumé des séquences (tableau A).Figure 2 - Cytotoxicity of candidate CDTb mixed with whole CDTa on HT29 cells: data of Example 7. The C37, C123, C124, C126 and C128 referred to in Figure 1 are CDTb proteins such as described in Examples 2, 4 and 6, the sequences of which are presented in the sequence summary (Table A). The "whole CDTa" is the CDTa C34 protein whose sequence is presented in the sequence summary (Table A).

Figure 3 - Mesures de la diffusion dynamique de la lumière du rayon hydrodynamique des constructions de CDTb KO pour la formation de pores C123, C126 et de la construction de CDTb KO pour 1'heptamérisation C128. Le rayon moyen donne une indication de l'homogénéité de l'échantillon, alors que le pic du rayon 1 est une estimation du rayon hydrodynamique de la protéine d'intérêt.Figure 3 - Dynamic light scattering measurements of hydrodynamic radius of CDTb KO constructs for pore formation C123, C126 and CDTb KO construct for C128 heptamerization. The mean radius gives an indication of the homogeneity of the sample, while the peak of radius 1 is an estimate of the hydrodynamic radius of the protein of interest.

Figure 4 - Diagramme montrant une immunogénicité anti-CDTb chez des souris immunisées avec la CDTa de C. difficile ou.la CDTb de C. difficile, formulée dans les deux cas avec un adjuvant.Figure 4 - Diagram showing anti-CDTb immunogenicity in mice immunized with C. difficile CDTa or C. difficile CDTb, both formulated with adjuvant.

Figure 5 - Diagramme montrant une immunogénicité anti-CDTa chez des souris immunisées avec la CDTa de C. difficile ou la CDTb de C. difficile, formulée dans les deux cas avec un adjuvant.Figure 5 - Diagram showing anti-CDTa immunogenicity in mice immunized with C. difficile CDTa or C. difficile CDTb, both formulated with adjuvant.

Figure 6 - Titres d'inhibition de la cytotoxicité dans des cellules HCT116 provenant de souris immunisées avec la CDTa de C. difficile ou la CDTb de C. difficile, formulée dans les deux cas avec un adjuvant.Figure 6 - Titers for inhibition of cytotoxicity in HCT116 cells from mice immunized with C. difficile CDTa or C. difficile CDTb, both formulated with adjuvant.

Figure 7 - Titres d'inhibition de la cytotoxicité dans des cellules HT29 provenant de souris immunisées avec la CDTa de C. difficile ou la CDTb de C. difficile, formulée dans les deux cas avec un adjuvant.Figure 7 - Titers for inhibition of cytotoxicity in HT29 cells from mice immunized with C. difficile CDTa or C. difficile CDTb, both formulated with adjuvant.

Figure 8 - Cytotoxicité de CDTb candidates seules (figure 8a) ou mélangées avec la CDTa entière (figure 8b) sur des cellules HT29 : données provenant de l'exemple 7. Les C37, C123, C124, C126 et C128 sont les protéines CDTb telles que décrites dans les exemples 2, 4 et 6, dont les séquences sont présentées dans le résumé des séquences (tableau A). La « CDTa entière » est la protéine CDTa C34 dont la séquence présentée dans le résumé des séquences (tableau A) . Les C149, C152, C164, C166, C116, C117 sont les protéines CDTb telles que décrites dans les exemples 4 et 5 .FIG. 8 - Cytotoxicity of candidate CDTbs alone (FIG. 8a) or mixed with the entire CDTa (FIG. 8b) on HT29 cells: data from example 7. The C37, C123, C124, C126 and C128 are the CDTb proteins such as as described in Examples 2, 4 and 6, whose sequences are presented in the sequence summary (Table A). The "whole CDTa" is the CDTa C34 protein whose sequence is presented in the sequence summary (Table A). C149, C152, C164, C166, C116, C117 are the CDTb proteins as described in Examples 4 and 5.

Figure 9 - Cytotoxicité de CDTb candidates seules (figure 9a) ou mélangées avec la CDTa entière (figure 9b) sur des cellules HCT116 (telles que décrites dans l'exemple 12).Figure 9 - Cytotoxicity of candidate CDTb alone (Figure 9a) or mixed with the entire CDTa (Figure 9b) on HCT116 cells (as described in Example 12).

Figure 10 - Cytotoxicité de protéines de fusion CDTa-CDTb mélangées avec la CDTa entière activée sur des cellules HT29 (telles que décrites dans l'exemple 13).Figure 10 - Cytotoxicity of CDTa-CDTb fusion proteins mixed with whole CDTa activated on HT29 cells (as described in Example 13).

Figure 11 - Cytotoxicité de protéines de fusion CDTa-CDTb mélangées avec la CDTb entière sur des cellules HT29 (telles que décrites dans l'exemple 13).Figure 11 - Cytotoxicity of CDTa-CDTb fusion proteins mixed with whole CDTb on HT29 cells (as described in Example 13).

Figure 12 - Diagramme montrant l'immunogénicité anti-CDTa chez des souris immunisées avec des protéines CDTb ou des fusions CDTa-CDTb (voir l'exemple 14).Figure 12 - Diagram showing anti-CDTa immunogenicity in mice immunized with CDTb proteins or CDTa-CDTb fusions (see Example 14).

Figure 13 - Diagramme montrant l'immunogénicité anti-CDTb chez des souris immunisées avec des protéines CDTb ou des fusions CDTa-CDTb (voir l'exemple 14).Figure 13 - Diagram showing anti-CDTb immunogenicity in mice immunized with CDTb proteins or CDTa-CDTb fusions (see Example 14).

Figure 14 - Titres d'inhibition de la cytotoxicité dans des cellules HT29 et HCT116, des souris immunisées avec des protéines CDTb ou des fusions CDTa-CDTb (voir l'exemple 15).Figure 14 - Titers of inhibition of cytotoxicity in HT29 and HCT116 cells, mice immunized with CDTb proteins or CDTa-CDTb fusions (see Example 15).

Description détailléedetailed description

La toxine binaire de Clostridium difficile comprend deux protéines différentes, CDTa et CDTb. La CDTa comprend deux domaines, le domaine C-terminal qui est responsable de l'activité ADP-ribosyl-transférase alors que le domaine N-terminal est responsable de l'interaction avec la CDTb.The binary toxin Clostridium difficile comprises two different proteins, CDTa and CDTb. CDTa comprises two domains, the C-terminal domain which is responsible for ADP-ribosyl-transferase activity while the N-terminal domain is responsible for the interaction with CDTb.

Durant une infection, la CDTb est activée par un clivage protéolytique avec une protéase de type chymotrypsine pour produire une protéine CDTb à laquelle il manque le prodomaine (qualifiée de CDTb"). Veuillez noter qu'il manque également à la CDTb" la séquence signal de la CDTb. Une protéine CDTb à laquelle il manque la séquence signal mais à laquelle il ne manque pas le prodomaine est qualifiée de CDTb'. Après l'activation protéolytique, la CDTb s'oligomérise et se lie à la CDTa pour former la toxine binaire complète de C. difficile (CDT) . La liaison de la toxine binaire aux récepteurs cellulaires mène à l'endocytose médiée par les récepteurs. Lorsque l'endosome s'acidifie, le domaine de liaison de la CDTb subit des changements conformationnels qui permettent à l'oligomère de la CDTb de former un pore, la formation des pores déclenche la translocation du domaine de 1'ADP-ribosyl-transférase (CDTa) dans la cellule cible.During infection, CDTb is activated by proteolytic cleavage with a chymotrypsin-like protease to produce a CDTb protein lacking the prodomain (termed CDTb-) Please note that CDTb also lacks the signal sequence. of the CDTb. A CDTb protein which lacks the signal sequence but which does not miss the prodomaine is called CDTb '. After proteolytic activation, CDTb becomes oligomerized and binds to CDTa to form the complete C. difficile (CDT) binary toxin. The binding of binary toxin to cellular receptors leads to receptor-mediated endocytosis. As the endosome becomes acidic, the CDTb binding domain undergoes conformational changes that allow the CDTb oligomer to form a pore, and pore formation triggers the translocation of the ADP-ribosyl transferase domain. (CDTa) in the target cell.

Dans un aspect, la présente invention propose une composition immunogène comprenant une protéine CDTb isolée de Clostridium difficile qui a été mutée pour modifier la capacité de formation des pores.In one aspect, the present invention provides an immunogenic composition comprising a CDTb protein isolated from Clostridium difficile that has been mutated to alter the pore-forming ability.

Le terme « protéine CDTb qui a été mutée pour modifier la capacité de formation des pores » se rapporte à une protéine CDTb qui a été mutée pour modifier la capacité de la protéine CDTb à former un pore.The term "CDTb protein that has been mutated to alter the pore-forming ability" refers to a CDTb protein that has been mutated to alter the ability of the CDTb protein to form a pore.

Dans un mode de réalisation, la protéine CDTb isolée de Clostridium difficile a été mutée pour réduire la capacité de formation des pores.In one embodiment, the CDTb protein isolated from Clostridium difficile has been mutated to reduce the pore-forming ability.

La capacité de formation des pores peut être analysée selon les procédés décrits dans The J. of Biol. Chem. 2001, vol. 276 : 8371-8376, PNAS 2004, vol. 101 : 16756-16761, ou The J. of Biol. Chem. 2008, vol. 283 : 3904-3914The ability of pore formation can be analyzed according to the methods described in The J. of Biol. Chem. 2001, vol. 276: 8371-8376, PNAS 2004, vol. 101: 16756-16761, or The J. of Biol. Chem. 2008, vol. 283: 3904-3914

Dans cet aspect, la protéine CDTb isolée de Clostridium difficile peut avoir été mutée pour éviter la formation de la structure en tonneau bêta qui est composée de brins bêta partagés par chacun des monomères de la CDTb contenus dans l'heptamère qui se forme lors de 1 ' oligomérisation de la CDTb. Dans cet aspect, la protéine CDTb peut être une protéine CDTb tronquée avec le peptide signal éliminé. Dans cet aspect, la protéine CDTb peut être une protéine CDTb tronquée avec le peptide signal éliminé et le prodomaine éliminé.In this aspect, the CDTb protein isolated from Clostridium difficile may have been mutated to avoid formation of the beta-barrel structure which is composed of beta strands shared by each of the CDTb monomers contained in the heptamer that forms in 1 oligomerization of CDTb. In this aspect, the CDTb protein may be a truncated CDTb protein with the deleted signal peptide. In this aspect, the CDTb protein may be a truncated CDTb protein with the signal peptide removed and the prodomaine removed.

Le terme « protéine CDTb tronquée avec le peptide signal éliminé » se rapporte à une protéine CDTb avec essentiellement la totalité du peptide signal éliminé (par conséquent qui ne comprend pas les acides aminés correspondant à essentiellement la totalité du peptide signal). Par exemple, le terme « protéine CDTb tronquée avec le peptide signal éliminé » se rapporte à une protéine CDTb avec au moins 25 des acides aminés du peptide signal éliminés. Il peut rester quelques acides aminés du peptide signal. Par exemple, 2, 5, 10, 15 ou 20 acides aminés du peptide signal peuvent demeurer.The term "truncated CDTb protein with deleted signal peptide" refers to a CDTb protein with substantially all of the signal peptide removed (therefore, which does not include amino acids corresponding to substantially all of the signal peptide). For example, the term "truncated CDTb protein with the deleted signal peptide" refers to a CDTb protein with at least 25 amino acids of the signal peptide removed. There may be a few amino acids in the signal peptide. For example, 2, 5, 10, 15 or 20 amino acids of the signal peptide may remain.

Le terme « protéine CDTb tronquée avec le peptide signal éliminé et le prodomaine éliminé » se rapporte à une protéine CDTb avec essentiellement la totalité du peptide signal et du prodomaine éliminés (par conséquent qui ne comprend pas les acides aminés correspondant à essentiellement la totalité du peptide signal et essentiellement la totalité du prodomaine). Par exemple, le terme « protéine CDTb tronquée avec le peptide signal éliminé et le prodomaine éliminé » se rapporte à une protéine CDTb avec la totalité du peptide signal éliminé et au moins 85 des acides aminés du prodomaine éliminés. Il peut rester quelques acides aminés du peptide signal et/ou du prodomaine. Par exemple, 2, 5, 10, 15 ou 20 acides aminés du peptide signal peuvent demeurer. Par exemple, 2, 5, 10, 15 ou 20 acides aminés du prodomaine peuvent demeurer. Le peptide signal de la CDTb correspond aux acides aminés 1 à 48 (englobant les acides aminés 1 à 42) de SEQ ID NO : 3 ou leurs équivalents dans une protéine de toxine binaire isolée d'une souche différente de C. difficile, par exemple les acides aminés 1 à 42 de la séquence d'acides aminés de la CDTb provenant de la souche CD196 (Perelle, M. et al., Infect. Immun., 65 (1997), pp. 1402-1407). Le prodomaine de la CDTb correspond aux acides aminés 48 à 211 (englobant les acides aminés 48 à 166) de SEQ ID NO : 3 ou leurs équivalents dans une protéine de toxine binaire isolée d'une souche différente de C. difficile.The term "truncated CDTb protein with deleted signal peptide and deleted prodomain" refers to a CDTb protein with essentially all of the signal peptide and prodomain removed (therefore, which does not include amino acids corresponding to substantially all of the peptide signal and essentially the entire prodomaine). For example, the term "truncated CDTb protein with deleted signal peptide and deleted prodomain" refers to a CDTb protein with all of the deleted signal peptide and at least 85 of the prodomain amino acids removed. There may be a few amino acids of the signal peptide and / or prodomain. For example, 2, 5, 10, 15 or 20 amino acids of the signal peptide may remain. For example, 2, 5, 10, 15 or 20 amino acids of the prodomaine may remain. The signal peptide of CDTb corresponds to amino acids 1 to 48 (encompassing amino acids 1 to 42) of SEQ ID NO: 3 or their equivalents in a binary toxin protein isolated from a strain different from C. difficile, for example amino acids 1 to 42 of the CDTb amino acid sequence from strain CD196 (Perelle, M. et al., Infect Immun., 65 (1997), pp. 1402-1407). The CDTb prodomain corresponds to amino acids 48 to 211 (encompassing amino acids 48 to 166) of SEQ ID NO: 3 or their equivalents in a binary toxin protein isolated from a strain different from C. difficile.

Dans un mode de réalisation, la protéine CDTb isolée de Clostridium difficile comprend une mutation au niveau de la position 455 de SEQ ID NO : 3 ou son équivalent dans une souche différente de C. difficile. Dans un autre mode de réalisation de cet aspect, la protéine CDTb isolée de Clostridium difficile comprend une mutation au niveau de la position 426 de SEQ ID NO : 3 ou son équivalent dans une souche différente de C. difficile. Dans un autre mode de réalisation de cet aspect, la protéine CDTb isolée de Clostridium difficile comprend une mutation au niveau de la position 453 de SEQ ID NO : 3 ou son équivalent dans une souche différente de C. difficile. Dans un autre mode de réalisation de cet aspect, la protéine CDTb isolée de Clostridium difficile comprend une mutation au niveau de la position 426 et une mutation au niveau de la position 453 de SEQ ID NO : 3 ou son équivalent dans une souche différente de C. difficile.In one embodiment, the CDTb protein isolated from Clostridium difficile comprises a mutation at position 455 of SEQ ID NO: 3 or its equivalent in a different strain of C. difficile. In another embodiment of this aspect, the CDTb protein isolated from Clostridium difficile comprises a mutation at position 426 of SEQ ID NO: 3 or its equivalent in a different strain of C. difficile. In another embodiment of this aspect, the CDTb protein isolated from Clostridium difficile comprises a mutation at position 453 of SEQ ID NO: 3 or its equivalent in a different strain of C. difficile. In another embodiment of this aspect, the CDTb protein isolated from Clostridium difficile comprises a mutation at position 426 and a mutation at position 453 of SEQ ID NO: 3 or its equivalent in a strain different from C . difficult.

Dans un mode de réalisation, la protéine CDTb isolée de Clostridium difficile comprend au moins une mutation choisie dans le groupe constitué de F455R, F455G, E426A et D453A. « F455R » signifie que la phénylalanine (F) au niveau de la position 455 de la séquence de la CDTb dans SEQ ID NO : 3 est mutée en arginine (R). « F455G » signifie que la phénylalanine (F) au niveau de la position 455 de la séquence de la CDTb dans SEQ ID NO : 3 est mutée en glycine (G). « E426A » signifie que le glutamate (E) au niveau de la position 426 de la séquence de la CDTb dans SEQ ID NO : 3 est muté en alanine (A) . « D453A » signifie que l'aspartate (D) au niveau de la position 453 de la séquence de la CDTb dans SEQ ID NO : 3 est muté en alanine (A). Dans un mode de réalisation de cet aspect, la protéine CDTb isolée de Clostridium difficile comprend la mutation F455R ou son équivalent dans une souche différente de C. difficile. Dans un mode de réalisation de cet aspect, la protéine CDTb isolée de Clostridium difficile comprend la mutation F455G ou son équivalent dans une souche différente de C. difficile. Dans un mode de réalisation de cet aspect, la protéine CDTb isolée de Clostridium difficile comprend les mutations E426A et D453A ou leurs équivalents dans une souche différente de C. difficile.In one embodiment, the CDTb protein isolated from Clostridium difficile comprises at least one mutation selected from the group consisting of F455R, F455G, E426A and D453A. "F455R" means that phenylalanine (F) at position 455 of the CDTb sequence in SEQ ID NO: 3 is mutated to arginine (R). "F455G" means that phenylalanine (F) at position 455 of the CDTb sequence in SEQ ID NO: 3 is mutated to glycine (G). "E426A" means that glutamate (E) at position 426 of the CDTb sequence in SEQ ID NO: 3 is mutated to alanine (A). "D453A" means that aspartate (D) at position 453 of the CDTb sequence in SEQ ID NO: 3 is mutated to alanine (A). In one embodiment of this aspect, the CDTb protein isolated from Clostridium difficile comprises the F455R mutation or its equivalent in a strain different from C. difficile. In one embodiment of this aspect, the CDTb protein isolated from Clostridium difficile comprises the F455G mutation or its equivalent in a strain different from C. difficile. In one embodiment of this aspect, the CDTb protein isolated from Clostridium difficile comprises mutations E426A and D453A or their equivalents in a different strain of C. difficile.

Dans un mode de réalisation, la protéine CDTb isolée deIn one embodiment, the CDTb protein isolated from

Clostridium difficile est ou comprend (i) SEQ ID NO : 10 ou SEQ ID NO : 11 ou SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 26 ; ou (ii) un variant de la CDTb présentant au moins 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100% d'identité de séquence avec SEQ ID NO : 10 ou SEQ ID NO : 11 ou SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 26 ; ou (iii) un fragment de la CDTb comportant au moins 30, 50, 80,Clostridium difficile is or comprises (i) SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 26; or (ii) a variant of CDTb exhibiting at least 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 98%, 99%, 100% sequence identity with SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 26; or (iii) a fragment of CDTb comprising at least 30, 50, 80,

100, 120, 150, 200, 250 ou 300 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 10 ou SEQ ID NO : 11 ou SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 26.100, 120, 150, 200, 250 or 300 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 26.

Clostridium difficile est ou comprend (i) SEQ ID NO : 43 ou SEQ ID NO : 44 ; ou (ii) un variant de la CDTb présentant au moins 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % d'identité de séquence avec SEQ ID NO : 43 ou SEQ ID NO : 44 ; ou (iii) un fragment de la CDTb comportant au moins 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250 ou 300 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 43 ou SEQ ID NO : 44.Clostridium difficile is or comprises (i) SEQ ID NO: 43 or SEQ ID NO: 44; or (ii) a variant of CDTb exhibiting at least 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 98%, 99%, 100% sequence identity with SEQ ID NO: 43 or SEQ ID NO: 44; or (iii) a fragment of CDTb comprising at least 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250 or 300 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 43 or SEQ ID NO: 44.

Dans un tel aspect, il est proposé une composition immunogène dans laquelle la protéine CDTb isolée de Clostridium difficile est un variant de la CDTb présentant au moins 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % d'identité de séquence avec SEQ ID NO : 10 ou SEQ ID NO : 11 ou SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 26.In such an aspect, there is provided an immunogenic composition in which the CDTb protein isolated from Clostridium difficile is a variant of CDTb exhibiting at least 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 98%, 99%, 100% sequence identity with SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 26.

Dans un tel aspect, il est proposé une composition immunogène dans laquelle la protéine CDTb isolée de Clostridium difficile est un variant de la CDTb présentant au moins 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % d'identité de séquence avec SEQ ID NO : 43 ou SEQ ID NO : 44.In such an aspect, there is provided an immunogenic composition in which the CDTb protein isolated from Clostridium difficile is a variant of CDTb exhibiting at least 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 98%, 99%, 100% sequence identity with SEQ ID NO: 43 or SEQ ID NO: 44.

Dans un autre aspect, il est proposé une composition immunogène dans laquelle la protéine CDTb isolée de Clostridium difficile est un fragment de la CDTb comportant au moins 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800 ou 850 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 10 ou SEQ ID NO : 11 ou SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 26.In another aspect, there is provided an immunogenic composition wherein the CDTb protein isolated from Clostridium difficile is a fragment of CDTb comprising at least 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350, 400. , 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800 or 850 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 26.

Dans un autre aspect, il est proposé une composition immunogène dans laquelle la protéine CDTb isolée de Clostridium difficile est un fragment de la CDTb comportant au moins 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 ou 650 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 43 ou SEQ ID NO : 44.In another aspect, there is provided an immunogenic composition wherein the CDTb protein isolated from Clostridium difficile is a fragment of CDTb comprising at least 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350, 400. , 450, 500, 550, 600 or 650 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 43 or SEQ ID NO: 44.

La présente invention propose également une composition immunogène comprenant une protéine CDTb isolée de Clostridium difficile qui est une protéine CDTb tronquée avec le peptide signal et le prodomaine éliminés et également le domaine de liaison aux récepteurs éliminé et/ou le domaine de liaison à la CDTa éliminé.The present invention also provides an immunogenic composition comprising a CDTb protein isolated from Clostridium difficile which is a truncated CDTb protein with deleted signal peptide and prodomain and also the eliminated receptor binding domain and / or CDTa binding domain removed. .

Le terme « protéine CDTb tronquée avec le peptide signal et le prodomaine éliminés et également le domaine de liaison aux récepteurs et/ou' le domaine de liaison à la CDTa éliminés » signifie une protéine CDTb tronquée avec le peptide signal et le prodomaine éliminés, dans laquelle également le domaine de liaison aux récepteurs et/ou le domaine de liaison à la CDTa ont été éliminés. Il se rapporte à SEQ ID NO : 3 ou à un fragment ou variant de celle-ci avec essentiellement la totalité du peptide signal et du prodomaine éliminés (par conséquent, qui ne comprend pas les acides aminés correspondant à essentiellement la totalité du peptide signal et essentiellement la totalité du prodomaine) et aussi essentiellement la totalité du domaine de liaison aux récepteurs éliminé et/ou essentiellement la totalité du domaine de liaison à la CDTa éliminé (par conséquent, qui ne comprend pas les acides aminés correspondant à essentiellement la totalité du domaine de liaison aux récepteurs et/ou qui ne comprend pas les acides aminés correspondant à essentiellement la totalité du domaine de liaison à la CDTa) . Par exemple, le terme « protéine CDTb tronquée avec le peptide signal éliminé et le prodomaine éliminé » se rapporte à une protéine CDTb avec la totalité du peptide signal éliminé et au moins 85 des acides aminés du prodomaine éliminés. Il peut rester quelques acides aminés du peptide signal, du prodomaine, du domaine de liaison aux récepteurs ou du domaine de liaison à la CDTa. Par exemple, 2, 5, 10, 15 ou 20 acides aminés du peptide signal peuvent demeurer. Par exemple, 2, 5, 10, 15 ou 20 acides aminés du prodomaine peuvent demeurer. Par exemple, 2, 5, 10, 15 ou 20 acides aminés du domaine de liaison aux récepteurs peuvent demeurer. Par exemple, 2, 5, 10, 15 ou 20 acides aminés du domaine de liaison à la CDTa peuvent demeurer.The term "deleted truncated CDTb protein with the signal peptide and prodomain and also the deleted receptor binding domain and / or CDTa binding domain" means a truncated CDTb protein with the signal peptide and prodomain removed, in which also the receptor binding domain and / or the CDTa binding domain have been eliminated. It refers to SEQ ID NO: 3 or a fragment or variant thereof with essentially all of the signal peptide and prodomain removed (therefore, which does not include amino acids corresponding to substantially all of the signal peptide and essentially all of the prodomain) and also substantially all of the receptor binding domain removed and / or substantially all of the deleted CDTa binding domain (therefore, which does not include amino acids corresponding essentially to the entire domain receptor binding and / or does not include amino acids corresponding essentially to the entire CDTa binding domain). For example, the term "truncated CDTb protein with deleted signal peptide and deleted prodomain" refers to a CDTb protein with all of the deleted signal peptide and at least 85 of the prodomain amino acids removed. There may be a few amino acids of the signal peptide, prodomain, receptor binding domain, or CDTa binding domain. For example, 2, 5, 10, 15 or 20 amino acids of the signal peptide may remain. For example, 2, 5, 10, 15 or 20 amino acids of the prodomaine may remain. For example, 2, 5, 10, 15 or 20 amino acids of the receptor binding domain may remain. For example, 2, 5, 10, 15 or 20 amino acids of the CDTa binding domain may remain.

Le peptide signal de la CDTb correspond aux acides aminés 1 à 48 (englobant les acides aminés 1 à 42) de SEQ ID NO : 3 ou leurs équivalents dans une protéine de toxine binaire isolée d'une souche différente de C. difficile, par exemple, les acides aminés 1 à 42 de la séquence d'acides aminés de la CDTb provenant de la souche CD196 (Perelle, M. et al., Infect. Immun., 65 (1997), pp. 1402-1407).The signal peptide of CDTb corresponds to amino acids 1 to 48 (encompassing amino acids 1 to 42) of SEQ ID NO: 3 or their equivalents in a binary toxin protein isolated from a strain different from C. difficile, for example amino acids 1 to 42 of the CDTb amino acid sequence from strain CD196 (Perelle, M. et al., Infect Immun., 65 (1997), pp. 1402-1407).

Le prodomaine de la CDTb correspond aux acides aminés 48 à 211 (englobant les acides aminés 48 à 166) de SEQ ID NO : 3 ou leurs équivalents dans une protéine de toxine binaire isolée d'une souche différente de C. difficile.The CDTb prodomain corresponds to amino acids 48 to 211 (encompassing amino acids 48 to 166) of SEQ ID NO: 3 or their equivalents in a binary toxin protein isolated from a strain different from C. difficile.

Dans un mode de réalisation, le domaine de liaison aux récepteurs ' de la CDTb correspond aux acides aminés 620 à 87 6 de SEQ ID NO : 3, ou leurs équivalents dans une protéine de toxine binaire isolée d'une souche différente de C. difficile. Dans un autre mode de réalisation, le domaine de liaison aux récepteurs correspond aux acides aminés 636 à 876 de SEQ ID NO : 3 ou leurs équivalents dans une protéine de toxine binaire isolée d'une souche différente de C. difficile.In one embodiment, the CDTb receptor binding domain corresponds to amino acids 620 to 876 of SEQ ID NO: 3, or their equivalents in a binary toxin protein isolated from a strain different from C. difficile. . In another embodiment, the receptor binding domain corresponds to amino acids 636 to 876 of SEQ ID NO: 3 or their equivalents in a binary toxin protein isolated from a strain different from C. difficile.

Le domaine de liaison à la CDTa de la CDTb correspond aux acides aminés 212 à 296 de SEQ ID NO : 3 ou leurs équivalents dans une protéine de toxine binaire isolée d'une souche différente de C. difficile.The CDTa binding domain of CDTb corresponds to amino acids 212 to 296 of SEQ ID NO: 3 or their equivalents in a binary toxin protein isolated from a strain different from C. difficile.

Dans un mode de réalisation de cet aspect, la composition immunogène comprend une protéine CDTb isolée de Clostridium difficile qui est une protéine CDTb tronquée avec le peptide signal et le prodomaine éliminés et également soit le domaine de liaison aux récepteurs éliminé soit le domaine de liaison à la CDTa éliminé.In one embodiment of this aspect, the immunogenic composition comprises a CDTb protein isolated from Clostridium difficile which is a truncated CDTb protein with deleted signal peptide and prodomain and also either the deleted receptor binding domain or the CDTa eliminated.

Dans un autre mode de réalisation de cet aspect, la composition immunogène comprend une protéine CDTb isolée de Clostridium difficile qui est une protéine CDTb tronquée avec le peptide signal et le prodomaine éliminés et également le domaine de liaison aux récepteurs éliminé et le domaine de liaison à la CDTa éliminé.In another embodiment of this aspect, the immunogenic composition comprises a CDTb protein isolated from Clostridium difficile which is a truncated CDTb protein with deleted signal peptide and prodomain and also the eliminated receptor binding domain and the binding domain. CDTa eliminated.

De façon appropriée, la protéine CDTb isolée de Clostridium difficile est ou comprend (i) SEQ ID NO : 8 ou SEQ ID NO : 9 ou SEQ ID NO : 37 ; (ii) un variant de la CDTb présentant au moins 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % d'identité de séquence avec SEQ ID NO : 8 ou SEQ ID NO : 9 ou SEQ ID NO : 37 ; ou (iii) un fragment de la CDTb comportant au moins 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750 ou 800 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 8 ou SEQ ID NO : 9 ou SEQ ID NO : 37.Suitably, the CDTb protein isolated from Clostridium difficile is or comprises (i) SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 37; (ii) a variant of CDTb exhibiting at least 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 98%, 99%, 100% sequence identity with SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 37; or (iii) a fragment of CDTb comprising at least 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750 or 800 acids consecutive amines of SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 37.

De façon appropriée, la protéine CDTb isolée de Clostridium difficile est ou comprend (i) SEQ ID NO : 8 ou SEQ ID NO : 9 ou SEQ ID NO : 37 ; (ii) un variant de la CDTb présentant au moins 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % d'identité de séquence avec SEQ ID NO : 8 ou SEQ ID NO : 9 ou SEQ ID NO : 37 ; ou (iii) un fragment de la CDTb comportant au moins 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350 ou 400 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 8 ou au moins 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 ou, 550 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 9 ou au moins 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250 ou 300 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 37.Suitably, the CDTb protein isolated from Clostridium difficile is or comprises (i) SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 37; (ii) a variant of CDTb exhibiting at least 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 98%, 99%, 100% sequence identity with SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 37; or (iii) a fragment of CDTb comprising at least 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350 or 400 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 8 or at least 30, 50, 80 , 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 or 550 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 9 or at least 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250 or 300 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 37.

Dans un tel aspect, il est proposé une composition immunogène dans laquelle la protéine CDTb isolée de Clostridium difficile est un variant de la CDTb présentant au moins 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % d'identité de séquence avec SEQ ID NO : 8 ou SEQ ID NO : 9 ou SEQ ID NO : 37.In such an aspect, there is provided an immunogenic composition in which the CDTb protein isolated from Clostridium difficile is a variant of CDTb exhibiting at least 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 98%, 99%, 100% sequence identity with SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 37.

Dans un autre aspect, il est proposé une composition immunogène dans laquelle la protéine CDTb isolée de Clostridium difficile est un fragment de la CDTb comportant au moins 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 8 ou SEQ ID NO : 9 ou SEQ ID NO : 37.In another aspect, there is provided an immunogenic composition wherein the CDTb protein isolated from Clostridium difficile is a fragment of CDTb comprising at least 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350, 400. , 450, 500, 550 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 37.

Dans un troisième aspect de l'invention, il est proposé une composition immunogène comprenant une protéine CDTb isolée de Clostridium difficile où la protéine CDTb isolée de Clostridium difficile a été mutée pour modifier la capacité d'heptamérisation.In a third aspect of the invention, there is provided an immunogenic composition comprising a CDTb protein isolated from Clostridium difficile where the CDTb protein isolated from Clostridium difficile has been mutated to modify the heptamerization capacity.

La protéine CDTb qui a été mutée pour modifier la capacité d'heptamérisation signifie que la protéine CDTb a été mutée pour modifier sa capacité à s'auto-assembler en un repliement heptamère. Cette heptamérisation est permise par le partage des brins bêta provenant de chaque monomère de la CDTb afin de former une structure en tonneau bêta. Dans cet aspect, la protéine CDTb peut être une protéine CDTb tronquée avec le peptide signal éliminé. Dans cet aspect, la protéine CDTb peut être une protéine CDTb tronquée avec le peptide signal éliminé et le prodomaine éliminé.The CDTb protein that has been mutated to alter the heptamerization capacity means that the CDTb protein has been mutated to alter its ability to self-assemble into a heptamer fold. This heptamerization is enabled by sharing the beta strands from each monomer of the CDTb to form a beta barrel structure. In this aspect, the CDTb protein may be a truncated CDTb protein with the deleted signal peptide. In this aspect, the CDTb protein may be a truncated CDTb protein with the signal peptide removed and the prodomaine removed.

Dans un mode de réalisation, la protéine CDTb isolée de Clostridium difficile a été mutée pour réduire la capacité d'heptamérisation.In one embodiment, the CDTb protein isolated from Clostridium difficile has been mutated to reduce the heptamerization capacity.

La capacité de la protéine CDTb à s ' heptamériser peut être mesurée en utilisant une technique telle que la diffusion dynamique de la lumière (DLS) . La DLS peut être utilisée pour évaluer le rayon hydrodynamique en solution des protéines CDTb purifiées, en plus de fournir des informations sur l'homogénéité et pour détecter la présence d'agrégats de poids moléculaire élevé (comme les heptamères) au sein d'un échantillon de protéines. Ceci est basé sur le calcul du coefficient de diffusion des différentes espèces qui sont obtenues en mesurant la fluctuation de la diffusion de la lumière, qui dépend de la taille moléculaire et de la forme des protéines, et des autres constituants mineurs de l'échantillon.The ability of the CDTb protein to heptamerize can be measured using a technique such as dynamic light scattering (DLS). DLS can be used to evaluate the hydrodynamic radius in solution of purified CDTb proteins, in addition to providing information on homogeneity and for detecting the presence of high molecular weight aggregates (such as heptamers) within a sample of proteins. This is based on the calculation of the diffusion coefficient of the different species that are obtained by measuring the fluctuation of light scattering, which depends on the molecular size and shape of the proteins, and the other minor constituents of the sample.

En se basant sur une analyse profonde d'un modèle structural tridimensionnel obtenu pour la CDTb, une boucle dans le domaine d'oligomérisation peut être potentiellement impliquée dans 1 ' heptamérisation de la CDTb. Dans cette boucle, il a été identifié quatre acides aminés présentant des interactions électrostatiques potentielles avec des acides aminés contenus dans d'autres monomères de la CDTb heptamère. Ces résidus sont Asp537, Glu539, Asp540 et Lys541 de SEQ ID NO : 3.Based on a deep analysis of a three-dimensional structural model obtained for CDTb, a loop in the oligomerization domain may be potentially involved in the heptamerization of CDTb. In this loop, four amino acids were identified with potential electrostatic interactions with amino acids contained in other monomers of the heptamer CDTb. These residues are Asp537, Glu539, Asp540 and Lys541 of SEQ ID NO: 3.

Dans un mode de réalisation, la protéine CDTb isolée de Clostridium difficile comprend au moins une mutation et/ou une troncature dans le domaine d'oligomérisation qui modifie la capacité d'heptamérisation.In one embodiment, the CDTb protein isolated from Clostridium difficile comprises at least one mutation and / or truncation in the oligomerization domain that modifies the heptamerization capacity.

Le domaine d'oligomérisation correspond aux acides aminés 297 à 619 de SEQ ID NO : 3, ou leurs équivalents dans une protéine CDTb isolée d'une souche différente de C. difficile.The oligomerization domain corresponds to amino acids 297 to 619 of SEQ ID NO: 3, or their equivalents in a CDTb protein isolated from a strain different from C. difficile.

Dans un mode de réalisation, la protéine CDTb isolée de Clostridium difficile comprend au moins une mutation et/ou une troncature dans la région de la CDTb comprenant les acides aminés 533 à 542 de SEQ ID NO : 3 ou dans la région équivalente dans une souche différente de C. difficile.In one embodiment, the CDTb protein isolated from Clostridium difficile comprises at least one mutation and / or truncation in the region of CDTb comprising amino acids 533 to 542 of SEQ ID NO: 3 or in the equivalent region in a strain. different from C. difficile.

Dans un mode de réalisation, la protéine CDTb isolée de Clostridium difficile comprend au moins une mutation au niveau de Asp537, Glu539, Asp540 et Lys541 de SEQ ID NO : 3 ou leurs équivalents dans une souche différente de C. difficile. Dans un mode de réalisation, de façon appropriée l'un quelconque ou plusieurs de Asp537, Glu539, Asp540 et/ou Lys541 est/sont muté (s) en Gly ou un autre petit résidu.In one embodiment, the CDTb protein isolated from Clostridium difficile comprises at least one mutation at Asp537, Glu539, Asp540 and Lys541 of SEQ ID NO: 3 or their equivalents in a different strain of C. difficile. In one embodiment, suitably any one or more of Asp537, Glu539, Asp540 and / or Lys541 is / are mutated to Gly or other small residue.

Dans un autre mode de réalisation, le domaine d'oligomérisation est tronqué. Par exemple, les acides aminés 533 à 542 de SEQ ID NO : 3, ou leurs équivalents dans une protéine CDTb isolée d'une souche différente de C. difficile, peuvent être délétés et éventuellement remplacés par d'autres résidus, par exemple par 3, 4, 5 résidus Gly et/ou Ala ou plus. Dans un mode de réalisation, les acides aminés 533 à 542 de SEQ ID NO : 3, ou leurs équivalents dans une protéine CDTb isolée d'une souche différente de C. difficile, peuvent être délétés et éventuellement remplacés par 3 résidus Gly ou 3 résidus Ala.In another embodiment, the oligomerization domain is truncated. For example, the amino acids 533 to 542 of SEQ ID NO: 3, or their equivalents in a CDTb protein isolated from a different strain of C. difficile, can be deleted and possibly replaced by other residues, for example by 3 , 4, 5 Gly and / or Ala residues or more. In one embodiment, the amino acids 533 to 542 of SEQ ID NO: 3, or their equivalents in a CDTb protein isolated from a different strain of C. difficile, can be deleted and possibly replaced by 3 residues Gly or 3 residues. To the.

Dans un mode de réalisation, la protéine CDTb isolée de Clostridium difficile comprend des mutations dans quatre acides aminés. Par exemple, la protéine CDTb comprend la mutation D537G-E539G-D540G-K541G ou leurs équivalents dans une souche différente de C. difficile. « D537G » signifie que l'aspartate au niveau de la position 537 de la séquence de la CDTb dans SEQ ID NO : 3 est muté en glycine. « E539G » signifie que le glutamate au niveau de la position 539 de la séquence de la CDTb dans SEQ ID NO : 3 est muté en glycine. « D540G » signifie que l'aspartate au niveau de la position 540 de la séquence de la CDTb dans SEQ ID NO : 3 est muté en glycine. « K541G » signifie que la lysine au niveau de la position 541 de la séquence de la CDTb dans SEQ ID NO : 3 est mutée en glycine.In one embodiment, the CDTb protein isolated from Clostridium difficile comprises mutations in four amino acids. For example, the CDTb protein comprises the D537G-E539G-D540G-K541G mutation or their equivalents in a strain different from C. difficile. "D537G" means that aspartate at position 537 of the CDTb sequence in SEQ ID NO: 3 is mutated to glycine. "E539G" means that glutamate at position 539 of the CDTb sequence in SEQ ID NO: 3 is mutated to glycine. "D540G" means that the aspartate at position 540 of the CDTb sequence in SEQ ID NO: 3 is mutated to glycine. "K541G" means that the lysine at position 541 of the CDTb sequence in SEQ ID NO: 3 is mutated to glycine.

Dans un autre mode de réalisation de cet aspect, la protéine CDTb isolée de Clostridium difficile comprend une mutation dans laquelle les acides aminés 533 à 542 de SEQ ID NO : 3, ou leurs équivalents dans une protéine CDTb isolée d'une souche différente de C. difficile, sont remplacés par 3 résidus Gly.In another embodiment of this aspect, the CDTb protein isolated from Clostridium difficile comprises a mutation in which amino acids 533 to 542 of SEQ ID NO: 3, or their equivalents in a CDTb protein isolated from a different strain of C difficult, are replaced by 3 Gly residues.

Dans un mode de réalisation, la protéine CDTb isolée de Clostridium difficile est ou comprend (i) SEQ ID NO : 12 ou SEQ ID NO : 13 ; ou (ii) un variant de la CDTb présentant au moins 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % d'identité de séquence avec SEQ ID NO : 12 ou SEQ ID NO : 13 ; ou (iii) un fragment de la CDTb comportant au moins 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800 ou 850 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 12 ou SEQ ID NO : 13.In one embodiment, the CDTb protein isolated from Clostridium difficile is or comprises (i) SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 13; or (ii) a variant of CDTb exhibiting at least 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 98%, 99%, 100% sequence identity with SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 13; or (iii) a fragment of CDTb comprising at least 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800 or 850 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 13.

Dans un tel aspect, il est proposé une composition immunogène dans laquelle la protéine CDTb isolée de Clostridium difficile est un variant de la CDTb présentant au moins 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % d'identité de séquence avec SEQ ID NO : 12 ou SEQ ID NO : 13.In such an aspect, there is provided an immunogenic composition in which the CDTb protein isolated from Clostridium difficile is a variant of CDTb exhibiting at least 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 98%, 99%, 100% sequence identity with SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 13.

Dans un autre aspect, il est proposé une composition immunogène dans laquelle la protéine CDTb isolée de Clostridium difficile est un fragment de la CDTb comportant au moins 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800 ou 850 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 12 ou SEQ ID NO : 13.In another aspect, there is provided an immunogenic composition wherein the CDTb protein isolated from Clostridium difficile is a fragment of CDTb comprising at least 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350, 400. , 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800 or 850 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 13.

Les protéines CDTb et CDTa varient dans la séquence d'acides aminés entre les différentes souches, pour cette raison la numérotation des acides aminés peut différer entre les souches. Pour cette raison, le terme « équivalents dans une souche différente » se rapporte aux acides aminés qui correspondent à ceux d'une souche de référence (par exemple, C. difficile R20291 à partir de laquelle SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 3 sont dérivées), mais qui sont trouvés dans une toxine provenant d'une souche différente et qui peuvent être ainsi numérotés différemment. Une région d'acides aminés « équivalents » peut être déterminée par l'alignement des séquences des toxines provenant des souches différentes. Les exemples de souches de C. difficile produisant des toxines binaires comprennent CD196, CCUG 20309, R8637, IS81, IS93, IS51, IS58, R6786, R7605, R10456 et R5989. Sauf indication contraire, les numéros des acides aminés fournis ici se rapportent à ceux de la souche de référence R20291, telle que représentée par SEQ ID NO : 1 (CDTa) et SEQ ID NO : 3 (CDTb).The CDTb and CDTa proteins vary in the amino acid sequence between the different strains, for this reason the numbering of amino acids may differ between strains. For this reason, the term "equivalents in a different strain" refers to amino acids that correspond to those of a reference strain (for example, C. difficile R20291 from which SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 are derived), but which are found in a toxin from a different strain and which can thus be numbered differently. An "equivalent" amino acid region can be determined by the alignment of toxin sequences from different strains. Examples of C. difficile strains producing binary toxins include CD196, CCUG 20309, R8637, IS81, IS93, IS51, IS58, R6786, R7605, R10456 and R5989. Unless otherwise indicated, the amino acid numbers provided herein refer to those of the reference strain R20291, as represented by SEQ ID NO: 1 (CDTa) and SEQ ID NO: 3 (CDTb).

Dans un mode de réalisation, la protéine CDTb isolée de Clostridium difficile est un monomère de CDTb. Dans un autre mode de réalisation, la protéine CDTb isolée de Clostridium difficile est un multimère de CDTb. Dans un autre mode de réalisation, la protéine CDTb isolée de Clostridium difficile est un heptamère de CDTb.In one embodiment, the CDTb protein isolated from Clostridium difficile is a CDTb monomer. In another embodiment, the CDTb protein isolated from Clostridium difficile is a CDTb multimer. In another embodiment, the CDTb protein isolated from Clostridium difficile is a heptamer of CDTb.

Dans un mode de réalisation, la composition immunogène ne comprend pas/ne comprend pas en outre une protéine CDTa isolée de Clostridium difficile.In one embodiment, the immunogenic composition does not further include / understand a CDTa protein isolated from Clostridium difficile.

La présente invention propose une composition immunogène comprenant une protéine CDTb isolée de Clostridium difficile comme seul antigène de C. difficile. Tel qu'utilisé ici, le terme « comme seul antigène de C. difficile » signifie que la composition immunogène ne comprend pas également un autre antigène provenant de C. difficile, par exemple une composition immunogène ne comprenant pas également une protéine de toxine A, toxine B ou CDTa.The present invention provides an immunogenic composition comprising a CDTb protein isolated from Clostridium difficile as the only C. difficile antigen. As used herein, the term "as the only C. difficile antigen" means that the immunogenic composition also does not include another antigen from C. difficile, for example an immunogenic composition also not comprising a toxin A protein, toxin B or CDTa.

Dans un mode de réalisation, la composition immunogène comprend/comprend en outre une protéine CDTa isolée de Clostridium difficile.In one embodiment, the immunogenic composition further comprises a CDTa protein isolated from Clostridium difficile.

De façon appropriée, la protéine CDTa isolée de Clostridium difficile est une protéine CDTa tronquée. « Une protéine CDTa tronquée » telle qu'utilisée ici signifie une protéine CDTa qui n'atteint pas sa pleine longueur ou sa forme correcte, et ainsi à laquelle il manque certains des résidus d'acides aminés qui sont présents dans la CDTa pleine longueur de SEQ ID NO : 1 ou un équivalent dans une souche différente, et qui ne peut pas effectuer la fonction pour laquelle elle a été prévue parce que sa structure en est incapable, par exemple l'activité ADP-ribosyl-transférase et/ou l'interaction avec la CDTb. Un dosage approprié de l'activité ADP-ribosyl-transférase est décrit dans PLOS pathogens 2009, vol 5(10) : el000626.Suitably, the CDTa protein isolated from Clostridium difficile is a truncated CDTa protein. "Truncated CDTa protein" as used herein means a CDTa protein that does not reach its full length or correct form, and thus lacks some of the amino acid residues that are present in the full-length CDTA. SEQ ID NO: 1 or an equivalent in a different strain, and which can not perform the function for which it was intended because its structure is incapable, for example the ADP-ribosyl-transferase activity and / or the interaction with the CDTb. An appropriate assay for ADP-ribosyl transferase activity is described in PLOS pathogens 2009, vol 5 (10): el000626.

De façon appropriée, la protéine CDTa isolée de Clostridium difficile est une protéine CDTa tronquée qui ne comprend pas le domaine C-terminal. Le terme « protéine CDTa tronquée qui ne comprend pas le domaine C-terminal » se rapporte à un fragment ou un variant de SEQ ID NO : 1 qui ne comprend pas une partie substantielle du domaine C-terminal, il peut rester quelques acides aminés du domaine C-terminal, par exemple, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 ou 50 acides aminés du domaine C-terminal peuvent demeurer. Le domaine C-terminal correspond aux acides aminés 269 à 463 de SEQ ID NO : 1 ou leurs équivalents dans une protéine CDTa isolée d'une souche différente de C. difficile. Dans ce mode de réalisation, la protéine CDTa tronquée de Clostridium difficile est ou comprend de façon appropriée (i) SEQ ID NO : 18 ou SEQ ID NO : 19 ; (i) un variant de la CDTa présentant au moins 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % d'identité de séquence avec SEQ ID NO : 18 ou SEQ ID NO : 19 ; ou (iii) un fragment de la CDTa comportant au moins 30, 50, 80, 100, 120, 150, ou 190 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 18 ou SEQ ID NO : 19.Suitably, the CDTa protein isolated from Clostridium difficile is a truncated CDTa protein that does not include the C-terminal domain. The term "truncated CDTa protein that does not include the C-terminal domain" refers to a fragment or variant of SEQ ID NO: 1 that does not comprise a substantial portion of the C-terminal domain, there may remain some amino acids of the C-terminal domain, for example, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 or 50 amino acids of the C-terminal domain may remain. The C-terminal domain corresponds to amino acids 269 to 463 of SEQ ID NO: 1 or their equivalents in a CDTa protein isolated from a strain different from C. difficile. In this embodiment, the truncated CDTa protein of Clostridium difficile is or suitably comprises (i) SEQ ID NO: 18 or SEQ ID NO: 19; (i) a variant of CDTa having at least 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 98%, 99%, 100% sequence identity with SEQ ID NO: 18 or SEQ ID NO: 19; or (iii) a fragment of CDTa comprising at least 30, 50, 80, 100, 120, 150, or 190 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 18 or SEQ ID NO: 19.

Dans un mode de réalisation, la protéine CDTa tronquée qui ne comprend pas le domaine C-terminal est un variant de la CDTa présentant au moins 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % d'identité de séquence avec SEQ ID NO : 20. Dans un autre mode de réalisation, la protéine CDTa tronquée qui ne comprend pas le domaine C-terminal est un variant de la CDTa comportant au moins 30, 50, 80, 100, 120, 150, ou 190 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 20.In one embodiment, the truncated CDTa protein that does not include the C-terminal domain is a variant of CDTa having at least 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 98%, 99 %, 100% sequence identity with SEQ ID NO: 20. In another embodiment, the truncated CDTa protein that does not include the C-terminal domain is a variant of CDTa comprising at least 30, 50, 80 , 100, 120, 150, or 190 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 20.

Dans un autre mode de réalisation de l'un quelconque des aspects de l'invention, la protéine CDTa isolée de Clostridium difficile contient de façon appropriée une mutation qui réduit son activité ADP-ribosyl-transférase. Par exemple, la protéine CDTa isolée de Clostridium difficile comporte une mutation de glutamate en un autre acide aminé au niveau de la position 428 de SEQ ID NO : 1 ou une mutation équivalente dans une autre souche de C. difficile. Le terme « comporte une mutation au niveau de la position 428 » se rapporte à des protéines CDTa qui comportent une mutation au niveau de cet emplacement exact mais également à une protéine CDTa qui est isolée d'une souche différente et qui comporte une mutation au niveau d'une position équivalente. La protéine CDTa varie dans la séquence des acides aminés entre les différentes souches, pour cette raison la numérotation des acides aminés peut différer entre les souches, ainsi une protéine CDTa provenant d'une souche différente peut comporter un glutamate correspondant qui n'est pas le numéro 428 dans la séquence. Dans un mode de réalisation, la protéine CDTa isolée de Clostridium difficile comporte une mutation de glutamate en glutamine au niveau de la position 428 de SEQ ID NO : 1.In another embodiment of any aspect of the invention, the CDTa protein isolated from Clostridium difficile suitably contains a mutation that reduces its ADP-ribosyl transferase activity. For example, CDTa protein isolated from Clostridium difficile has a glutamate mutation at another amino acid at position 428 of SEQ ID NO: 1 or an equivalent mutation in another strain of C. difficile. The term "mutation at position 428" refers to CDTa proteins that contain a mutation at that exact location but also to a CDTa protein that is isolated from a different strain and that has a mutation at the an equivalent position. The CDTa protein varies in the amino acid sequence between different strains, for this reason the amino acid numbering may differ between strains, so a CDTa protein from a different strain may have a corresponding glutamate that is not the same. number 428 in the sequence. In one embodiment, the CDTa protein isolated from Clostridium difficile has a glutamine to glutamine mutation at position 428 of SEQ ID NO: 1.

Dans un autre mode de réalisation de l'un quelconque des aspects de l'invention, la protéine CDTa isolée de Clostridium difficile comporte de façon appropriée une mutation de glutamate en un acide aminé différent au niveau de la position 430 de SEQ ID NO : 1 ou une mutation équivalente dans une autre souche de C. difficile. Le terme « comporte une mutation au niveau de la position 430 » se rapporte à des protéines qui comportent cet emplacement exact mais également à une protéine CDTa qui est isolée d'une souche différente et qui comporte une mutation au niveau d'une position équivalente. Dans un mode de réalisation, la protéine CDTa isolée de Clostridium difficile comporte une mutation de glutamate en glutamine au niveau de la position 430 de SEQ ID NO : 1.In another embodiment of any aspect of the invention, the CDTa protein isolated from Clostridium difficile suitably has a glutamate mutation to a different amino acid at position 430 of SEQ ID NO: 1. or an equivalent mutation in another strain of C. difficile. The term "mutation at position 430" refers to proteins that have this exact location but also to a CDTa protein that is isolated from a different strain and that has a mutation at an equivalent position. In one embodiment, the CDTa protein isolated from Clostridium difficile has a glutamine to glutamine mutation at position 430 of SEQ ID NO: 1.

Dans un autre mode de réalisation de l'un quelconque des aspects de l'invention, la protéine CDTa isolée de Clostridium difficile est ou comprend de façon appropriée (i) SEQ ID NO : 21 ; SEQ ID NO : 22 ; SEQ ID NO : 23 ; ou SEQ ID NO : 24 ; ou (ii) un variant de la CDTa présentant au moins 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % d'identité de séquence avec SEQ ID NO : 21 ; SEQ ID NO : 22 ; SEQ ID NO : 23 ; ou SEQ ID NO : 24 ; ou (iii) un fragment de la CDTa comportant au moins 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350 ou 400 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 21 ; SEQ ID NO : 22 ; SEQ ID NO : 23 ; ou SEQ ID NO : 24.In another embodiment of any aspect of the invention, the CDTa protein isolated from Clostridium difficile is or suitably comprises (i) SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; or SEQ ID NO: 24; or (ii) a variant of CDTa having at least 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 98%, 99%, 100% sequence identity with SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; or SEQ ID NO: 24; or (iii) a fragment of CDTa comprising at least 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350 or 400 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; or SEQ ID NO: 24.

Dans un autre mode de réalisation de l'un quelconque des aspects de l'invention, la protéine CDTa isolée de Clostridium difficile est ou comprend de façon appropriée (i) SEQ ID NO : 22 ; ou (ii) un variant de la CDTa présentant au moins 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % d'identité de séquence avec SEQ ID NO : 22 ; ou (iii) un fragment de la CDTa comportant au moins 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350 ou 400 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 22.In another embodiment of any aspect of the invention, the CDTa protein isolated from Clostridium difficile is or suitably comprises (i) SEQ ID NO: 22; or (ii) a variant of CDTa having at least 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 98%, 99%, 100% sequence identity with SEQ ID NO: 22; or (iii) a fragment of CDTa comprising at least 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350 or 400 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 22.

Protéines de fusion comprenant une protéine CDTa et une protéine CDTbFusion Proteins Comprising a CDTa Protein and a CDTb Protein

Dans un autre aspect, l'invention propose des compositions immunogènes comprenant une protéine de fusion comprenant une protéine CDTa pleine longueur et une protéine CDTb. Dans cet aspect, « CDTa pleine longueur » signifie la CDTa pleine longueur de SEQ ID NO : 36 ou l'équivalent dans une autre souche de C. difficile, ou un variant de CDTa présentant au moins 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % d'identité de séquence avec SEQ ID NO : 36In another aspect, the invention provides immunogenic compositions comprising a fusion protein comprising a full-length CDTa protein and a CDTb protein. In this aspect, "full-length CDTa" means the full-length CDTa of SEQ ID NO: 36 or the equivalent in another strain of C. difficile, or a CDTa variant exhibiting at least 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 98%, 99%, 100% sequence identity with SEQ ID NO: 36

Un « polypeptide de fusion » ou une « protéine de fusion » se rapporte à une protéine comportant au moins deux polypeptides hétérologues (par exemple, au moins deux polypeptides de Clostridium difficile) liés de façon covalente, soit directement soit par l'intermédiaire d'un lieur (« linker ») d'acides aminés. Cela peut également se rapporter à une protéine comportant au moins deux polypeptides hétérologues liés de façon non covalente. Les polypeptides formant la protéine de fusion sont généralement liés de l'extrémité C-terminale à l'extrémité N-terminale, bien qu'ils puissent être liés de l'extrémité C-terminale à l'extrémité C-terminale, de l'extrémité N-terminale à l'extrémité N-terminale, ou de l'extrémité N-terminale à l'extrémité C-terminale. Les polypeptides de la protéine de fusion peuvent être dans un ordre quelconque. Ce terme se rapporte également à des variants modifiés de façon conservative, des variants polymorphes, des allèles, des mutants, des fragments immunogènes, et des homologues interespèces des antigènes qui constituent la protéine de fusion.A "fusion polypeptide" or "fusion protein" refers to a protein having at least two heterologous polypeptides (e.g., at least two Clostridium difficile polypeptides) covalently linked, either directly or via a linker ("linker") of amino acids. This can also refer to a protein comprising at least two non-covalently linked heterologous polypeptides. Polypeptides forming the fusion protein are generally C-terminally linked at the N-terminus, although they may be C-terminal to C-terminally related to the C-terminus. N-terminus at the N-terminus, or N-terminus at the C-terminus. The polypeptides of the fusion protein may be in any order. This term also refers to conservatively modified variants, polymorphic variants, alleles, mutants, immunogenic fragments, and inter-species homologs of the antigens that make up the fusion protein.

Le terme « fusionné » se rapporte à la liaison, par exemple la liaison covalente entre deux polypeptides dans une protéine de fusion. Les polypeptides sont généralement joints par l'intermédiaire d'une liaison peptidique, soit directement l'un à l'autre soit par l'intermédiaire d'un lieur (« linker ») d'acides aminés. Eventuellement, les peptides peuvent être joints par l'intermédiaire de liaisons covalentes non peptidiques connues de l'homme du métier.The term "fused" refers to the linkage, for example the covalent linkage between two polypeptides in a fusion protein. The polypeptides are generally joined via a peptide bond, either directly to each other or via a linker ("linker") of amino acids. Optionally, the peptides may be joined via nonpeptide covalent bonds known to those skilled in the art.

Une séquence de lieur (« linker ») peptidique peut être employée pour séparer les premier et second composants peptidiques d'une distance suffisante pour assurer que chaque polypeptide se replie dans ses structures secondaire et tertiaire. Une telle séquence de lieur (« linker ») peptidique est incorporée dans la protéine de fusion en utilisant des techniques classiques bien connues de l'état de l'art. Les séquences appropriées des lieurs (« linker ») peptidiques peuvent être choisies en se basant sur les facteurs suivants : (1) leur capacité à adopter une conformation étendue flexible ; (2) leur incapacité à adopter une structure secondaire qui pourrait interagir avec les épitopes fonctionnels sur les premier et second polypeptides ; et (3) le manque de résidus hydrophobes ou chargés qui pourraient réagir avec les épitopes fonctionnels des polypeptides. Les séquences des lieurs (« linker ») peptidiques préférées contiennent des résidus Gly, Asn et Ser. D'autres acides aminés presque neutres, tels que Thr et Ala, peuvent être également utilisés dans la séquence du lieur (« linker »). Les séquences d'acides aminés qui peuvent être employées de façon utile en tant que lieurs (« linker ») comprennent celles divulguées dans Maratea et al., Gene 40: 39-46 (1985) ; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8258-8262 (1986) ; brevet US No. 4 935 233 et brevet US No. 4 751 180. La séquence du lieur (« linker ») peut généralement avoir une longueur de 1 à environ 50 acides aminés, par exemple 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 ou 40 acides aminés en longueur. Des séquences de lieurs (« linker ») ne sont pas requises lorsque les premier et second polypeptides comportent des régions d'acides aminés N-terminales non essentielles qui peuvent être utilisées pour séparer les domaines fonctionnels et empêcher les interférences stériques.A peptide linker sequence can be employed to separate the first and second peptide components a sufficient distance to ensure that each polypeptide folds into its secondary and tertiary structures. Such a peptide linker sequence is incorporated into the fusion protein using standard techniques well known in the art. The appropriate sequences of the peptide linkers can be selected based on the following factors: (1) their ability to adopt a flexible extended conformation; (2) their inability to adopt a secondary structure that could interact with functional epitopes on the first and second polypeptides; and (3) the lack of hydrophobic or charged residues that could react with the functional epitopes of the polypeptides. The sequences of the preferred peptide linkers contain Gly, Asn and Ser residues. Other near-neutral amino acids, such as Thr and Ala, can also be used in the linker sequence. Amino acid sequences that can be usefully employed as linkers include those disclosed in Maratea et al., Gene 40: 39-46 (1985); Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8258-8262 (1986); U.S. Patent No. 4,935,233 and US Patent No. 4,751,180. The linker sequence may generally be from 1 to about 50 amino acids in length, for example 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 or 40 amino acids in length. Linker sequences are not required when the first and second polypeptides have non-essential N-terminal amino acid regions that can be used to separate functional domains and prevent steric interference.

Dans cet aspect, la protéine de fusion peut comprendre de façon appropriée un lieur (« linker ») . Un exemple d'un lieur (« linker ») approprié comprend ou est constitué de six résidus Gly consécutifs.In this aspect, the fusion protein may suitably include a linker. An example of a suitable linker comprises or consists of six consecutive Gly residues.

Dans cet aspect, la protéine CDTa est de façon appropriée la première dans la fusion. Ceci signifie que la protéine CDTa est placée en position N-terminale de la protéine de fusion par rapport à la position de la protéine CDTb. Ceci améliore l'aptitude au traitement de la fusion CDTa-CDTb.In this aspect, the CDTa protein is suitably first in fusion. This means that the CDTa protein is placed in the N-terminal position of the fusion protein with respect to the position of the CDTb protein. This improves the processability of the CDTa-CDTb fusion.

Dans un mode de réalisation, la protéine CDTa comporte une mutation de la cystéine en un autre acide aminé au niveau de la position 45 de SEQ ID NO : 1 ou l'acide aminé équivalent dans une autre souche de C. difficile. Le terme « comporte une mutation au niveau de la position 45 » se rapporte aux protéines CDTa qui comportent une mutation au niveau de cet emplacement exact de SEQ ID NO : 1 mais également à une protéine CDTa qui est isolée d'une souche différente et qui comporte une mutation au niveau d'une position équivalente. Dans un mode de réalisation, la protéine CDTa comporte une mutation de cystéine en tyrosine au niveau de la position 45. Cette mutation est réalisée afin de prévenir/éviter la formation d'un pont disulfure entre deux protéines CDTa.In one embodiment, the CDTa protein comprises a mutation of cysteine to another amino acid at position 45 of SEQ ID NO: 1 or the equivalent amino acid in another strain of C. difficile. The term "mutation at position 45" refers to CDTa proteins that have a mutation at this exact location of SEQ ID NO: 1 but also to a CDTa protein that is isolated from a different strain and that has a mutation at an equivalent position. In one embodiment, the CDTa protein has a cysteine tyrosine mutation at position 45. This mutation is performed to prevent / avoid the formation of a disulfide bridge between two CDTa proteins.

Dans un mode de réalisation, la protéine CDTa pleine longueur comprend une ou plusieurs mutations qui réduisent son activité ADP-ribosyl-transférase.In one embodiment, the full-length CDTa protein comprises one or more mutations that reduce its ADP-ribosyl transferase activity.

Par exemple, la protéine CDTa peut comporter l'un quelconque des ensembles de mutations divulgués dans le document WO 2013/112867. Par exemple, la protéine CDTa peut comprendre au moins deux mutations choisies parmi les mutations suivantes au niveau des positions 2, 67, 69, 253, 255, 258, 302, 307, 342, 345, 356, 359, 382, 385 et 387 (correspondant aux positions 3, 68, 70, 254, 256, 259, 303, 308, 343, 346, 357, 360, 383, 386 et 388 de la séquence de SEQ ID NO : 36 de la présente demande :) C2A, Y67A, Y69A, Y253A, R255A, Y258A, R302A, Q307E, N342A, S345F, F356A, R359A, Y382A, E385Q, E385A, E387Q, et E387D telles que divulguées dans le document WO2013/112867. « C2A » signifie que la cystéine au niveau de la position 2 de la séquence de la protéine CDTb divulguée dans le document WO 2013/112867 (correspondant à la position 3 de SEQ ID NO : 36 de la présente demande) est mutée en alanine, et les autres mutations énumérées dans ce groupe devront être comprises de façon similaire. Dans certains modes de réalisation, les mutations de CDTa sont choisies parmi : C2A, R302A, S345F, E385Q, E385A, E387Q, et E387D. Dans des modes de réalisation de cet aspect de l'invention, la protéine CDTa comprend un ensemble de mutations choisies dans le groupe constitué de : (a) S345F, E385Q et E387Q ; (b) R302A, E385A, E387D ; (c) C2A, S345F, E385Q et E387Q ; (d) R302A, S345F, E385Q et E387Q ; (e) Y67A, Y69A, et R255A ; (f) R359A, Y67A, et Q307E ; (g) Y258A, F356A, S345F ; et (h) N342A, Y253A et Y382A.For example, the CDTa protein may comprise any of the sets of mutations disclosed in WO 2013/112867. For example, the CDTa protein may comprise at least two mutations selected from the following mutations at positions 2, 67, 69, 253, 255, 258, 302, 307, 342, 345, 356, 359, 382, 385 and 387 (corresponding to positions 3, 68, 70, 254, 256, 259, 303, 308, 343, 346, 357, 360, 383, 386 and 388 of the sequence of SEQ ID NO: 36 of the present application :) C2A, Y67A, Y69A, Y253A, R255A, Y258A, R302A, Q307E, N342A, S345F, F356A, R359A, Y382A, E385Q, E385A, E387Q, and E387D as disclosed in WO2013 / 112867. "C2A" means that cysteine at position 2 of the CDTb protein sequence disclosed in WO 2013/112867 (corresponding to position 3 of SEQ ID NO: 36 of the present application) is mutated to alanine, and the other mutations listed in this group will have to be understood in a similar way. In some embodiments, CDTa mutations are selected from: C2A, R302A, S345F, E385Q, E385A, E387Q, and E387D. In embodiments of this aspect of the invention, the CDTa protein comprises a set of mutations selected from the group consisting of: (a) S345F, E385Q and E387Q; (b) R302A, E385A, E387D; (c) C2A, S345F, E385Q and E387Q; (d) R302A, S345F, E385Q and E387Q; (e) Y67A, Y69A, and R255A; (f) R359A, Y67A, and Q307E; (g) Y258A, F356A, S345F; and (h) N342A, Y253A and Y382A.

Dans un mode de réalisation, la protéine CDTa comprend une mutation qui réduit son activité ADP-ribosyl-transférase.In one embodiment, the CDTa protein comprises a mutation that reduces its ADP-ribosyl transferase activity.

Le terme « la protéine CDTa comprend une mutation qui réduit son activité ADP-ribosyl-transférase » se rapporte à une protéine CDTa qui comprend une mutation au niveau d'une seule position qui seule est prévue pour réduire son activité ADP-ribosyl-transférase. La protéine CDTa peut comprendre éventuellement d'autres mutations non prévues spécifiquement pour réduire son activité ADP-ribosyl-transférase. Les mutations prévues spécifiquement pour réduire l'activité ADP-ribosyl-transférase comprennent E428Q et E430Q (numérotation des acides aminés en référence à SEQ ID NO : 1) ou C2A, Y67A, Y69A, Y253A, R255A, Y258A, R302A, Q307E, N342A, S345F, F356A, R359A, Y382A, E385Q, E385A, E387Q, et E387D telles que divulguées dans le document WO 2013/112867 (numérotation des acides aminés correspondant aux positions 3, 68, 70, 254, 256, 259, 303, 308, 343, 346, 357, 360, 383, 386 et 388 en référence à SEQ ID NO : 36).The term "the CDTa protein comprises a mutation that reduces its ADP-ribosyl transferase activity" refers to a CDTa protein that includes a mutation at a single position that is only intended to reduce its ADP-ribosyl transferase activity. The CDTa protein may optionally include other mutations not specifically intended to reduce its ADP-ribosyl transferase activity. Mutations specifically intended to reduce ADP-ribosyl transferase activity include E428Q and E430Q (amino acid numbering with reference to SEQ ID NO: 1) or C2A, Y67A, Y69A, Y253A, R255A, Y258A, R302A, Q307E, N342A. , S345F, F356A, R359A, Y382A, E385Q, E385A, E387Q, and E387D as disclosed in WO 2013/112867 (amino acid numbering corresponding to positions 3, 68, 70, 254, 256, 259, 303, 308 , 343, 346, 357, 360, 383, 386 and 388 with reference to SEQ ID NO: 36).

Par exemple, la protéine CDTa comporte une mutation du glutamate en un autre acide aminé au niveau de la position 428 de SEQ ID NO : 1 ou l'acide aminé équivalent dans une autre souche de C. difficile. Le terme « comporte une mutation au niveau de la position 428 » se rapporte aux protéines CDTa qui comporte une mutation au niveau de cet emplacement exact de SEQ ID NO : 1 mais également à une protéine CDTa qui est isolée d'une souche différente et qui comporte une mutation au niveau d'une position équivalente. La protéine CDTa varie dans la séquence d'acides aminés entre les différentes souches, pour cette raison la numérotation des acides aminés peut différer entre les souches, ainsi une protéine CDTa provenant d'une souche différente peut comporter un glutamate correspondant qui n'est pas le numéro 428 dans la séquence. Dans un mode de réalisation, la protéine CDTa comporte une mutation du glutamate en glutamine au niveau de la position 428. Dans un autre mode de réalisation, la protéine CDTa comporte de façon appropriée une mutation du glutamate en un acide aminé différent au niveau de la position 430 de SEQ ID NO : 1 ou l'acide aminé équivalent dans une autre souche de C. difficile. Le terme « comporte une mutation au niveau de la position 430 » se rapporte aux protéines qui comportent cet emplacement exact mais également à une protéine CDTa qui est isolée d'une souche différente et qui comporte une mutation au niveau d'une position équivalente. Dans un mode de réalisation, la protéine CDTa comporte une mutation du glutamate en glutamine au niveau de la position 430.For example, the CDTa protein has a mutation of glutamate to another amino acid at position 428 of SEQ ID NO: 1 or the equivalent amino acid in another strain of C. difficile. The term "mutation at position 428" refers to CDTa proteins that have a mutation at this exact location of SEQ ID NO: 1 but also to a CDTa protein that is isolated from a different strain and that has a mutation at an equivalent position. The CDTa protein varies in the amino acid sequence between the different strains, for this reason the amino acid numbering may differ between strains, so a CDTa protein from a different strain may have a corresponding glutamate that is not the number 428 in the sequence. In one embodiment, the CDTa protein has a mutation of glutamate to glutamine at position 428. In another embodiment, the CDTa protein suitably includes a mutation of glutamate to a different amino acid at the position 430 of SEQ ID NO: 1 or the equivalent amino acid in another strain of C. difficile. The term "mutation at position 430" refers to proteins that have this exact location but also to a CDTa protein that is isolated from a different strain and that has a mutation at an equivalent position. In one embodiment, the CDTa protein has a mutation of glutamate to glutamine at position 430.

Dans un mode de réalisation, la protéine CDTa pleine longueur est ou comprend de façon appropriée (i) SEQ ID NO : 39 ; ou (ii) un variant de la CDTa présentant au moins 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % d'identité de séquence avec SEQ ID NO : 39 ; ou (iii) un fragment de la CDTa comportant au moins 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350 ou 400 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 39.In one embodiment, the full-length CDTa protein is or suitably comprises (i) SEQ ID NO: 39; or (ii) a variant of CDTa having at least 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 98%, 99%, 100% sequence identity with SEQ ID NO: 39; or (iii) a fragment of CDTa comprising at least 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350 or 400 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 39.

Dans un autre mode de réalisation, la protéine CDTa pleine longueur est ou comprend de façon appropriée . (i) une séquence d'acides aminés tels que représentée par SEQ ID NO : 40, 42 ou 67 dans le document WO 2013/112867 ; ou (ii) un variant de la CDTa présentant au moins 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % d'identité de séquence avec l'une quelconque des séquences en (i) ; ou (iii) un fragment de la CDTa comportant au moins 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350 ou 400 acides aminés consécutifs de l'une quelconque des séquences en (i) .In another embodiment, the full-length CDTa protein is or suitably comprises. (i) an amino acid sequence as represented by SEQ ID NO: 40, 42 or 67 in WO 2013/112867; or (ii) a variant of CDTa having at least 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 98%, 99%, 100% sequence identity with any of the sequences in (i); or (iii) a fragment of CDTa comprising at least 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350 or 400 consecutive amino acids of any of the sequences in (i).

Dans un mode de réalisation, la protéine CDTb est une protéine CDTb pleine longueur. Dans cet aspect, « CDTb pleine longueur » signifie la CDTb pleine longueur de SEQ ID NO : 7, c'est-à-dire la CDTb avec le prodomaine éliminé.In one embodiment, the CDTb protein is a full-length CDTb protein. In this aspect, "full-length CDTb" means the full-length CDTb of SEQ ID NO: 7, i.e. CDTb with the eliminated prodomaine.

Dans ce mode de réalisation de cet aspect, la protéine de fusion comprenant une protéine CDTa pleine longueur et une protéine CDTb est ou comprend de façon appropriée (i) SEQ ID NO : 14 ; ou (ii) une protéine de fusion variante présentant au moins 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % d'identité de séquence avec SEQ ID NO : 14 ; ou (iii) un fragment comportant au moins 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800 ou 850 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 14.In this embodiment of this aspect, the fusion protein comprising a full-length CDTa protein and a CDTb protein is or suitably comprises (i) SEQ ID NO: 14; or (ii) a variant fusion protein having at least 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 98%, 99%, 100% sequence identity with SEQ ID NO: 14; or (iii) a moiety of at least 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800 or 850 amino acids consecutive of SEQ ID NO: 14.

Dans un autre mode de réalisation, la protéine CDTb est une protéine CDTb tronquée avec le domaine de liaison à la CDTa éliminé. Le terme « avec le domaine de liaison à la CDTa éliminé » se rapporte à un fragment ou un variant de SEQ ID NO : 3, ou son équivalent dans une autre souche de C. difficile, avec essentiellement la totalité du domaine de liaison à la CDTa éliminé (par conséquent, qui ne comprend pas les acides aminés correspondant à essentiellement la totalité du domaine de liaison à la CDTa) . Par exemple, le terme « protéine CDTb tronquée avec le domaine de liaison à la CDTa éliminé » se rapporte à une protéine CDTb comportant au moins 65 des acides aminés du domaine de liaison à la CDTa éliminés. Il peut rester quelques acides aminés du domaine de liaison à la CDTa. Par exemple, 2, 5, 10, 15 ou 20 acides aminés du domaine de liaison à la CDTa peuvent demeurer.In another embodiment, the CDTb protein is a truncated CDTb protein with the CDTa binding domain removed. The term "with the CDTa binding domain removed" refers to a fragment or variant of SEQ ID NO: 3, or its equivalent in another strain of C. difficile, with essentially the entire binding domain at the same time. CDTa eliminated (therefore, which does not include amino acids corresponding to essentially the entire CDTa binding domain). For example, the term "truncated CDTb protein with deleted CDTa binding domain" refers to a CDTb protein having at least 65 amino acids of the CDTa binding domain removed. There may still be a few amino acids in the CDTa binding domain. For example, 2, 5, 10, 15 or 20 amino acids of the CDTa binding domain may remain.

Le domaine de liaison à la CDTa de la CDTb correspond aux acides aminés 212 à 295 de SEQ ID NO : 3 ou leurs équivalents dans une protéine de toxine binaire isolée d'une souche différente de C. difficile.The CDTa binding domain of CDTb corresponds to amino acids 212 to 295 of SEQ ID NO: 3 or their equivalents in a binary toxin protein isolated from a strain different from C. difficile.

Dans ce mode de réalisation, la protéine CDTb tronquée avec le domaine de liaison à la CDTa éliminé est ou comprend de façon appropriée (i) SEQ ID NO : 9 ; ou (ii) une protéine de fusion variante présentant au moins 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % d'identité de séquence avec SEQ ID NO : 9 ; ou (iii) un fragment comportant au moins 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350 ou 400 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 9.In this embodiment, the truncated CDTb protein with the removed CDTa binding domain is or suitably comprises (i) SEQ ID NO: 9; or (ii) a variant fusion protein having at least 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 98%, 99%, 100% sequence identity with SEQ ID NO: 9; or (iii) a fragment comprising at least 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350 or 400 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 9.

Dans ce mode de réalisation, la protéine de fusion comprenant une protéine CDTa pleine longueur et une protéine CDTb tronquée avec le domaine de liaison à la CDTa éliminé est ou comprend de façon appropriée (i) SEQ ID NO : 15 ; ou (ii) une protéine de fusion variante présentant au moins 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % d'identité de séquence avec SEQ ID NO : 15 ; ou (iii) un fragment comportant au moins 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800 ou 850 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 15.In this embodiment, the fusion protein comprising a full length CDTa protein and a truncated CDTb protein with the removed CDTa binding domain is or suitably comprises (i) SEQ ID NO: 15; or (ii) a variant fusion protein having at least 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 98%, 99%, 100% sequence identity with SEQ ID NO: 15; or (iii) a moiety of at least 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800 or 850 amino acids consecutive of SEQ ID NO: 15.

Dans un autre mode de réalisation, la protéine CDTb est une protéine CDTb tronquée comprenant le domaine de liaison aux récepteurs. Le terme « protéine CDTb tronquée comprenant le domaine de liaison aux récepteurs » se rapporte à un fragment ou un variant de SEQ ID NO : 3, ou ses équivalents dans une autre souche de C. difficile, avec essentiellement la totalité sauf le domaine de liaison aux récepteurs éliminée (par conséquent qui ne comprend pas les acides aminés correspondant à essentiellement la totalité de la protéine sauf le domaine de liaison aux récepteurs), il peut rester quelques acides aminés en plus du domaine de liaison aux récepteurs, par exemple, 2, 5, 10, 15 ou 20 acides aminés sauf/en plus du domaine de liaison aux récepteurs. Dans une version, le domaine de liaison aux récepteurs correspond aux acides aminés 620 à 87 6 de SEQ ID NO : 3, ou leurs équivalents dans une protéine de toxine binaire isolée d'une souche différente de C. difficile. Dans une autre version, le domaine de liaison aux récepteurs correspond aux acides aminés 636 à 876 de SEQ ID NO : 3 ou leurs équivalents dans une protéine de toxine binaire isolée d'une souche différente de C. difficile.In another embodiment, the CDTb protein is a truncated CDTb protein comprising the receptor binding domain. The term "truncated CDTb protein comprising the receptor binding domain" refers to a fragment or variant of SEQ ID NO: 3, or its equivalents in another strain of C. difficile, with essentially all but the binding domain. at the eliminated receptors (therefore, which does not include amino acids corresponding to essentially all of the protein except the receptor binding domain), there may remain a few amino acids in addition to the receptor binding domain, for example, 2, 5, 10, 15 or 20 amino acids except / in addition to the receptor binding domain. In one version, the receptor binding domain corresponds to amino acids 620 to 876 of SEQ ID NO: 3, or their equivalents in a binary toxin protein isolated from a strain different from C. difficile. In another version, the receptor binding domain corresponds to amino acids 636 to 876 of SEQ ID NO: 3 or their equivalents in a binary toxin protein isolated from a strain different from C. difficile.

Dans ce mode de réalisation, la protéine CDTb est ou comprend de façon appropriée (i) SEQ ID NO : 27 ou SEQ ID NO : 28 ; ou (i) un variant de la CDTb présentant au moins 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % d'identité de séquence avec SEQ ID NO : 27 ou SEQ ID NO : 28 ; ou (iii) un fragment de la CDTb comportant au moins 30, 50, 80, 100, 120, 150 ou 200 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 27 ou SEQ ID NO : 28.In this embodiment, the CDTb protein is or suitably comprises (i) SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 28; or (i) a variant of CDTb exhibiting at least 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 98%, 99%, 100% sequence identity with SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 28; or (iii) a fragment of CDTb comprising at least 30, 50, 80, 100, 120, 150 or 200 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 28.

Dans ce mode de réalisation, la protéine de fusion comprenant une protéine CDTa pleine longueur et une protéine CDTb tronquée comprenant le domaine de liaison aux récepteurs est ou comprend de façon appropriée (i) SEQ ID NO : 16 ou SEQ ID NO : 17 ; ou (ii) une protéine de fusion variante présentant au moins 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % d'identité de séquence avec SEQ ID NO : 16 ou SEQ ID NO : 17 ; ou (iii) un fragment comportant au moins 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350 ou 400 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 16 ou SEQ ID NO : 17.In this embodiment, the fusion protein comprising a full length CDTa protein and a truncated CDTb protein comprising the receptor binding domain is or suitably comprises (i) SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 17; or (ii) a variant fusion protein having at least 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 98%, 99%, 100% sequence identity with SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 17; or (iii) a fragment comprising at least 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 350 or 400 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 17.

Dans un autre aspect, l'invention propose de nouveaux polypeptides et nucléotides tels que définis ici.In another aspect, the invention provides novel polypeptides and nucleotides as defined herein.

Dans un mode de réalisation, l'invention propose un polypeptide comprenant une séquence d'acides aminés représentée par l'une quelconque de SEQ ID NO : 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 25, 26, 37, 43, 44, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 66, 67 ou 71.In one embodiment, the invention provides a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 25, 26, 37, 43, 44, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 66, 67 or 71.

Dans un mode de réalisation de l'un quelconque des aspects de l'invention, la composition immunogène déclenche des anticorps qui neutralisent la CDTa ou la CDTb ou les deux. Dans un autre mode de réalisation, la composition déclenche des anticorps qui neutralisent la toxine binaire. Si une composition déclenche des anticorps contre une toxine, ceux-ci peuvent être mesurés en immunisant des souris avec la composition immunogène, en prélevant les sérums et en analysant les titres anti-toxine des sérums en utilisant un test ELISA. Les sérums devront être comparés à un échantillon de référence obtenu à partir de souris qui n'ont pas été immunisées. La composition de l'invention déclenche des anticorps qui neutralisent la CDTa si les sérums dirigés contre le polypeptide donnent un résultat ELISA de plus de 10 %, 20 %, 30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 %, ou 100 % supérieur à l'échantillon de référence.In one embodiment of any aspect of the invention, the immunogenic composition elicits antibodies that neutralize CDTa or CDTb or both. In another embodiment, the composition triggers antibodies that neutralize the binary toxin. If a composition triggers antibodies against a toxin, these can be measured by immunizing mice with the immunogenic composition, collecting the sera and analyzing the anti-toxin titers of the sera using an ELISA. The sera should be compared to a reference sample obtained from mice that have not been immunized. The composition of the invention elicits antibodies which neutralize CDTa if the sera directed against the polypeptide give an ELISA result of more than 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, or 100%. % higher than the reference sample.

Dans un autre mode de réalisation, la composition immunogène de l'invention déclenche une réponse immunitaire protectrice chez un hôte mammifère contre des souches de C. difficile. Dans un mode de réalisation, l'hôte mammifère est choisi dans le groupe constitué de souris, de lapins, de cobayes, de primates non humains, de singes et d'êtres humains. Dans un mode de réalisation, l'hôte mammifère est une souris. Dans un autre mode de réalisation, l'hôte mammifère est un être humain.In another embodiment, the immunogenic composition of the invention elicits a protective immune response in a mammalian host against C. difficile strains. In one embodiment, the mammalian host is selected from the group consisting of mice, rabbits, guinea pigs, non-human primates, monkeys, and humans. In one embodiment, the mammalian host is a mouse. In another embodiment, the mammalian host is a human being.

Si une composition immunogène déclenche une réponse immunitaire protectrice chez un hôte mammifère contre des souches de C. difficile, celle-ci peut être déterminée en utilisant un test de stimulation (« challenge ») . Dans un tel test, l'hôte mammifère est vacciné avec la composition immunogène et stimulé (« challenge ») par exposition à C. difficile, le temps pendant lequel le mammifère survit après la stimulation (« challenge ») est comparé au temps pendant lequel le mammifère de référence qui n'a pas été immunisé avec la composition immunogène survit. Une composition immunogène déclenche une réponse immunitaire protectrice si un mammifère immunisé avec la composition immunogène survit au moins 10 %, 20 %, 30 %, 50 %, 80 %, 80 %, 90 %, ou 100 % plus longtemps qu'un mammifère de référence qui n'a pas été immunisé après la stimulation (« challenge ») avec C. difficile.If an immunogenic composition elicits a protective immune response in a mammalian host against C. difficile strains, it can be determined using a challenge test. In such a test, the mammalian host is vaccinated with the immunogenic and stimulated composition ("challenge") by exposure to C. difficile, the time during which the mammal survives after stimulation ("challenge") is compared to the time during which the reference mammal that has not been immunized with the immunogenic composition survives. An immunogenic composition elicits a protective immune response if a mammal immunized with the immunogenic composition survives at least 10%, 20%, 30%, 50%, 80%, 80%, 90%, or 100% longer than a mammal. reference that was not immunized after stimulation ("challenge") with C. difficile.

Toxine A et Toxine BToxin A and Toxin B

Dans un mode de réalisation de l'un quelconque des aspects de l'invention, les compositions immunogènes de l'invention comprennent en outre une protéine de toxine A isolée de Clostridium difficile et/ou une protéine de toxine B isolée de C. difficile.In one embodiment of any aspect of the invention, the immunogenic compositions of the invention further comprise toxin A protein isolated from Clostridium difficile and / or toxin B protein isolated from C. difficile.

Le terme « protéine de toxine A isolée de Clostridium difficile » se rapporte à une protéine avec la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 2 9, ou à un fragment ou un variant de SEQ ID NO : 29. Dans un mode de réalisation, la protéine de toxine A isolée de Clostridium difficile est un fragment comprenant 50, 100, 150, 200, 250, 300, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000 ou 2500 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 29. Dans un mode de réalisation, la protéine de toxine A isolée de Clostridium difficile est un variant présentant 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité avec SEQ ID NO : 29.The term "toxin A protein isolated from Clostridium difficile" refers to a protein with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, or a fragment or variant of SEQ ID NO: 29. In one embodiment, the toxin A protein isolated from Clostridium difficile is a fragment comprising 50, 100, 150, 200, 250, 300, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000 or 2500 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 29. In one embodiment, toxin A protein isolated from Clostridium difficile is a variant having 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 98%, 99% or 100% identity with SEQ ID. NO: 29.

Le terme « protéine de toxine B isolée de Clostridium difficile » se rapporte à une protéine avec la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 30, ou à un fragment ou un variant de SEQ ID NO : 30. Dans un mode de réalisation, la protéine de toxine B isolée de Clostridium difficile est un fragment comprenant 50, 100, 150, 200, 250, 300, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750 ou 2000 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 30. Dans un mode de réalisation, la protéine de toxine B isolée de Clostridium difficile est un variant présentant 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité avec SEQ ID NO : 30.The term "toxin B protein isolated from Clostridium difficile" refers to a protein with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, or a fragment or variant of SEQ ID NO: 30. In one embodiment , toxin B protein isolated from Clostridium difficile is a fragment comprising 50, 100, 150, 200, 250, 300, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750 or 2000 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 30. one embodiment, toxin B protein isolated from Clostridium difficile is a variant having 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 98%, 99% or 100% identity with SEQ ID NO: 30 .

Dans un mode de réalisation, la protéine de toxine A isolée de Clostridium difficile comprend un fragment de domaine répétitif. Le terme « domaine répétitif de la toxine A » se rapporte au domaine C-terminal de la protéine de toxine A provenant de C. difficile, comprenant des séquences répétées. Le domaine répétitif de la toxine A se rapporte aux acides aminés 1832 à 2710 de la toxine A provenant de la souche VPI10463 (ATCC43255) et leurs équivalents dans une souche différente. La séquence des acides aminés 1832 à 2710 provenant de la souche VPI10463 (ATCC43255) correspond aux acides aminés 1832 à 2710 de SEQ ID NO : 29.In one embodiment, toxin A protein isolated from Clostridium difficile comprises a repetitive domain fragment. The term "repetitive domain of toxin A" refers to the C-terminal domain of toxin A protein from C. difficile, including repeats. The repetitive domain of toxin A refers to amino acids 1832 to 2710 of toxin A from strain VPI10463 (ATCC43255) and their equivalents in a different strain. The amino acid sequence 1832 to 2710 from strain VPI10463 (ATCC43255) corresponds to amino acids 1832 to 2710 of SEQ ID NO: 29.

Dans un autre mode de réalisation, la protéine de toxine A isolée de Clostridium difficile comprend un fragment du domaine N-terminal de la toxine A. Le domaine N-terminal de la toxine A se rapporte aux acides aminés 1 à 1831 de la toxine A provenant de la souche VPI10463 (ATCC43255) et leurs équivalents dans une souche différente. La séquence des acides aminés 1 à 1831 de la toxine A provenant de la souche VPI10463 (ATCC43255) correspond aux acides aminés 1 à 1831 de SEQ ID NO : 29.In another embodiment, the toxin A protein isolated from Clostridium difficile comprises a fragment of the N-terminal domain of toxin A. The N-terminal domain of toxin A relates to amino acids 1 to 1831 of toxin A from strain VPI10463 (ATCC43255) and their equivalents in a different strain. The amino acid sequence 1 to 1831 of toxin A from strain VPI10463 (ATCC43255) corresponds to amino acids 1 to 1831 of SEQ ID NO: 29.

Dans un mode de réalisation, la protéine de toxine B isolée de Clostridium difficile comprend un fragment de domaine répétitif de la toxine B. Le terme « domaine répétitif de la toxine B » se rapporte au domaine C-terminal de la protéine de toxine B provenant de C. difficile. Ce domaine se rapporte aux acides aminés 1834 à 2366 provenant de la souche VPI10463 (ATCC43255) et leurs équivalents dans une souche différente. La séquence des acides aminés 1834 à 2366 provenant de la souche VPI10463 (ATCC43255) correspond aux acides aminés 1834 à 2366 de SEQ ID NO : 30.In one embodiment, toxin B protein isolated from Clostridium difficile comprises a repetitive domain fragment of toxin B. The term "repetitive domain of toxin B" refers to the C-terminal domain of toxin B protein from from C. difficile. This field relates to amino acids 1834 to 2366 from strain VPI10463 (ATCC43255) and their equivalents in a different strain. The amino acid sequence 1834 to 2366 from strain VPI10463 (ATCC43255) corresponds to amino acids 1834 to 2366 of SEQ ID NO: 30.

Dans un autre mode de réalisation, la protéine de toxine B isolée de Clostridium difficile comprend un fragment du domaine N-terminal de la toxine B. Le domaine N-terminal de la toxine B se rapporte aux acides aminés 1 à 1833 de la toxine B provenant de la souche VBI10463 (ATCC43255) et leurs équivalents dans une souche différente. La séquence des acides aminés 1 à 1833 de la toxine B provenant de la souche VBI10463 (ATCC43255) correspond aux acides aminés 1 à 1833 de SEQ ID NO : 30.In another embodiment, the toxin B protein isolated from Clostridium difficile comprises a fragment of the N-terminal domain of toxin B. The N-terminal domain of toxin B refers to amino acids 1 to 1833 of toxin B from strain VBI10463 (ATCC43255) and their equivalents in a different strain. The amino acid sequence 1 to 1833 of toxin B from strain VBI10463 (ATCC43255) corresponds to amino acids 1 to 1833 of SEQ ID NO: 30.

Les toxines A et B de C. difficile sont des protéines conservées, toutefois, la séquence diffère dans une petite quantité entre les souches, en outre la séquence d'acides aminés pour les toxines A et B dans les différentes souches peut différer dans le nombre des acides aminés.C. difficile toxins A and B are conserved proteins, however, the sequence differs in a small amount between strains, in addition the amino acid sequence for toxins A and B in different strains may differ in the number amino acids.

Pour ces raisons, les termes domaine répétitif de la toxine A et/ou domaine répétitif de la toxine B peuvent se rapporter à une séquence qui est un variant présentant 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité de séquence avec les acides aminés 1832 à 2710 de SEQ ID NO : 29 ou un variant présentant 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité de séquence avec des acides aminés 1834 à 2366 de SEQ ID NO : 30. De façon similaire, les termes domaine N-terminal de la toxine A et/ou domaine N-terminal de la toxine B se rapportent à une séquence qui est un variant présentant 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité de séquence avec les acides aminés 1 à 1831 de SEQ ID NO : 29 ou un variant présentant 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité de séquence avec les acides aminés 1 à 1833 de SEQ ID NO : 30.For these reasons, the terms repetitive domain of toxin A and / or repetitive domain of toxin B may refer to a sequence which is a variant having 90%, 95%, 98%, 99% or 100% identity of sequence with amino acids 1832 to 2710 of SEQ ID NO: 29 or a variant having 90%, 95%, 98%, 99% or 100% sequence identity with amino acids 1834 to 2366 of SEQ ID NO: 30 Similarly, the terms N-terminal domain of toxin A and / or N-terminal domain of toxin B refer to a sequence which is a variant having 90%, 95%, 98%, 99% or 100% sequence identity with amino acids 1 to 1831 of SEQ ID NO: 29 or a variant having 90%, 95%, 98%, 99% or 100% sequence identity with amino acids 1 to 1833 of SEQ ID NO: 30

En outre, la numérotation des acides aminés peut différer entre les domaines C-terminaux de la toxine A (ou de la toxine B) provenant d'une souche et de la toxine A (ou de la toxine B) provenant d'une autre souche. Pour cette raison, le terme « équivalents dans une souche différente » se rapporte aux acides aminés qui correspondent à ceux d'une souche de référence (par exemple, C. difficile VPI10463) , mais qui se trouvent dans une toxine provenant d'une souche différente et qui peuvent ainsi être numérotés différemment. Une région d'acides aminés « équivalents » peut être déterminée en alignant les séquences des toxines provenant des souches différentes. Les numéros des acides aminés fournis ici se rapportent à ceux de la souche VPI10463 (et sont tels que représentés par SEQ ID NO : 29 et SEQ ID NO : 30) .In addition, the amino acid numbering may differ between the C-terminal domains of toxin A (or toxin B) from one strain and toxin A (or toxin B) from another strain. . For this reason, the term "equivalents in a different strain" refers to amino acids that correspond to those of a reference strain (eg, C. difficile VPI10463), but found in a toxin from a strain different and which can thus be numbered differently. An "equivalent" amino acid region can be determined by aligning toxin sequences from different strains. Amino acid numbers provided herein refer to those of strain VPI10463 (and are as represented by SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30).

Dans un autre mode de réalisation de l'un quelconque des aspects de l'invention, la protéine de toxine A isolée de C. difficile et la protéine de toxine B isolée de C. difficile forment une protéine de fusion. Dans un mode de réalisation, la protéine de fusion est identique à 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 % avec une séquence choisie dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 31, 32, 33, 34, et 35. Dans un autre mode de réalisation, la protéine de fusion est un fragment d'au moins 800, 850, 900 ou 950 acides aminés consécutifs d'une séquence choisie dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 31, 32, 33, 34, et 35.In another embodiment of any aspect of the invention, the toxin protein A isolated from C. difficile and the toxin protein B isolated from C. difficile form a fusion protein. In one embodiment, the fusion protein is 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% or 100% identical with a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 31, 32, 33, 34, and 35. In another embodiment, the fusion protein is a fragment of at least 800, 850, 900 or 950 consecutive amino acids of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 31 , 32, 33, 34, and 35.

Fragmentsfragments

Le terme « fragment » tel que défini ici peut se rapporter à un fragment comprenant un épitope de lymphocyte T. Les épitopes de lymphocytes T sont des séquences courtes consécutives d'acides aminés qui sont reconnues par les lymphocytes T (par exemple, les lymphocytes T CD4+ ou CD8+). L'identification des épitopes de lymphocytes T peut être obtenue à l'aide d'expériences de cartographie des épitopes qui sont bien connues de l'homme du métier (voir, par exemple, Paul, Fundamental Immunology, 3rd ed., 243-247 (1993) ; Beipbarth et al. Bioinformatics 2005 21(Suppl. 1): Î29-Î37).The term "fragment" as defined herein may refer to a fragment comprising a T cell epitope. T cell epitopes are short consecutive sequences of amino acids that are recognized by T cells (e.g., T cells). CD4 + or CD8 +). The identification of T cell epitopes can be obtained using epitope mapping experiments which are well known to those skilled in the art (see, for example, Paul, Fundamental Immunology, 3rd ed., 243-247 (1993), Beipbarth et al., Bioinformatics 2005 21 (Suppl 1): 29-37).

Le terme « fragment » lorsqu'il est utilisé en relation avec un polypeptide comprenant un marqueur histidine comprend le polypeptide sans le marqueur histidine, par exemple à partir duquel le marqueur histidine a été clivé. Par exemple, des fragments appropriés de polypeptides comprenant une séquence d'acides aminés représentée par l'une quelconque des séquences ID NO : 5, 7 à 28 ou 36 à 42 (dont chacune comprend un marqueur histidine) comprennent le polypeptide correspondant sans le marqueur histidine représenté par les séquences ID NO : 47 à 76, tels que présentés dans la concordance suivante :The term "fragment" when used in connection with a polypeptide comprising a histidine tag comprises the polypeptide without the histidine tag, for example from which the histidine tag has been cleaved. For example, suitable fragments of polypeptides comprising an amino acid sequence represented by any of ID NO: 5, 7-28 or 36-42 (each of which comprises a histidine tag) include the corresponding polypeptide without the marker histidine represented by sequences ID NO: 47 to 76, as presented in the following agreement:

De façon appropriée, les fragments de l'invention sont des fragments immunogènes. Les « fragments immunogènes » selon la présente invention comprendront généralement au moins 9 acides aminés consécutifs provenant de la séquence polypeptidique pleine longueur (par exemple, au moins 10) , comme au moins 12 acides aminés consécutifs (par exemple, au moins 15 ou au moins 20 acides aminés consécutifs), en particulier au moins 50 acides aminés consécutifs, comme au moins 100 acides aminés consécutifs (par exemple, au moins 200 acides aminés consécutifs). De façon appropriée, les fragments immunogènes comporteront au moins 20 %, comme au moins 50 %, au moins 70 % ou au moins 80 % de la longueur de la séquence polypeptidique pleine longueur.Suitably, the fragments of the invention are immunogenic fragments. The "immunogenic fragments" according to the present invention will generally comprise at least 9 consecutive amino acids from the full-length (e.g., at least 10) polypeptide sequence, such as at least 12 consecutive amino acids (e.g., at least 15 or more 20 consecutive amino acids), in particular at least 50 consecutive amino acids, such as at least 100 consecutive amino acids (for example, at least 200 consecutive amino acids). Suitably, the immunogenic fragments will comprise at least 20%, such as at least 50%, at least 70% or at least 80% of the length of the full-length polypeptide sequence.

Il faudra comprendre que dans une population non consanguine diversifiée, comme les êtres humains, les différents types HLA signifient que des épitopes spécifiques peuvent ne pas être reconnus par tous les membres de la population. Par conséquent, pour maximiser le taux de reconnaissance et l'échelle de la réponse immunitaire contre un polypeptide, il est généralement souhaitable qu'un fragment immunogène contienne une pluralité des épitopes provenant de la séquence pleine longueur (de façon appropriée tous les épitopes).It should be understood that in a diverse non-consanguineous population, such as humans, the different HLA types mean that specific epitopes may not be recognized by all members of the population. Therefore, to maximize the recognition rate and scale of the immune response against a polypeptide, it is generally desirable that an immunogenic fragment contain a plurality of epitopes from the full-length sequence (suitably all epitopes).

Variants « Variants » ou « variants modifiés de façon conservative » s'applique à des séquences à la fois d'acides aminés et d'acide nucléique. En ce qui concerne des séquences d'acide nucléique particulières, les variants modifiés de façon conservatives se rapportent à ces acides nucléiques qui codent pour des séquences d'acides aminés identiques ou essentiellement identiques. Lorsque l'acide nucléique ne code pas pour une séquence d'acides aminés, « variants modifiés de façon conservative » se rapportent à des séquences essentiellement identiques.Variants "Variants" or "conservatively modified variants" apply to both amino acid and nucleic acid sequences. With respect to particular nucleic acid sequences, the conservatively modified variants refer to those nucleic acids that encode identical or substantially identical amino acid sequences. When the nucleic acid does not encode an amino acid sequence, "conservatively modified variants" refer to essentially identical sequences.

En ce qui concerne les variants d'une séquence de protéine, l'homme du métier comprendra que des substitutions, des délétions ou des additions individuelles sur le polypeptide, qui modifient, ajoutent ou délètent un seul acide aminé ou un petit pourcentage d'acides aminés est un « variant modifié de façon conservative » où la/les modification(s) entraîne(nt) la substitution d'un acide aminé par un acide aminé fonctionnellement similaire ou la substitution/délétion/ addition de résidus qui n'ont pas d'impact substantiel sur la fonction biologique du variant.With regard to variants of a protein sequence, those skilled in the art will understand that individual substitutions, deletions, or additions to the polypeptide that modify, add, or delete a single amino acid or a small percentage of acids is a "conservatively modified variant" where the modification (s) result (s) in the substitution of an amino acid by a functionally similar amino acid or the substitution / deletion / addition of residues that do not have substantial impact on the biological function of the variant.

Les tableaux de substitutions conservatives fournissant des acides aminés fonctionnellement similaires sont bien connus de l'état de l'art. De tels variants modifiés de façon conservative sont en plus de et n'excluent pas les variants polymorphes, les homologues inter-espèces, et les allèles de l'invention.Conservative substitution tables providing functionally similar amino acids are well known in the state of the art. Such conservatively modified variants are in addition to and do not exclude the polymorphic variants, interspecies homologues, and alleles of the invention.

Un polypeptide de l'invention (comme une protéine CDTa ou une protéine CDTb) peut contenir un certain nombre de substitutions conservatives (par exemple, 1 à 50, comme 1 à 25, en particulier 1 à 10, et spécialement 1 résidu d'acide aminé peut être modifié) lors d'une comparaison à la séquence de référence. En général, de telles substitutions conservatives se situent au sein de l'un des groupements d'acides aminés précisés ci-dessous, bien que dans certaines circonstances d'autres substitutions puissent être possibles sans affecter substantiellement les propriétés immunogènes de l'antigène. Les huit groupes suivants contiennent chacun des acides aminés qui sont généralement des substitutions conservatives à un autre : 1) Alanine (A), Glycine (G) ; 2) Acide aspartique (D), Acide glutamique (E) ; 3) Asparagine (N), Glutamine (Q) ; 4) Arginine (R), Lysine (K) ; 5) Isoleucine (I), Leucine (L), Méthionine (M), Valine (V) ; 6) Phénylalanine (F), Tyrosine (Y), Tryptophane (W) ; 7) Sérine (S), Thréonine (T) ; et 8) Cystéine (C), Méthionine (M) (voir, par exemple, Creighton, Proteins 1984).A polypeptide of the invention (such as a CDTa protein or a CDTb protein) may contain a number of conservative substitutions (for example, 1 to 50, such as 1 to 25, especially 1 to 10, and especially 1 acid residue amine can be modified) when compared to the reference sequence. In general, such conservative substitutions are within one of the amino acid groups specified below, although under certain circumstances other substitutions may be possible without substantially affecting the immunogenic properties of the antigen. The following eight groups each contain amino acids that are typically conservative substitutions to another: 1) Alanine (A), Glycine (G); 2) Aspartic acid (D), Glutamic acid (E); 3) Asparagine (N), Glutamine (Q); 4) Arginine (R), Lysine (K); 5) Isoleucine (I), Leucine (L), Methionine (M), Valine (V); 6) Phenylalanine (F), Tyrosine (Y), Tryptophan (W); 7) Serine (S), Threonine (T); and 8) Cysteine (C), Methionine (M) (see, e.g., Creighton, Proteins 1984).

De façon appropriée, de telles substitutions ne surviennent pas dans la région d'un épitope, et par conséquent, elles n'ont pas d'impact significatif sur les propriétés immunogènes de 1'antigène.Suitably, such substitutions do not occur in the region of an epitope, and therefore do not have a significant impact on the immunogenic properties of the antigen.

Les variants de polypeptides peuvent également comprendre ceux dans lesquels des acides aminés supplémentaires sont insérés comparativement à la séquence de référence, par exemple, de telles insertions peuvent survenir au niveau de 1 à 10 emplacements (comme 1 à 5 emplacements, de façon appropriée 1 ou 2 emplacements, en particulier 1 emplacement) et peuvent, par exemple, impliquer l'addition de 50 acides aminés au moins au niveau de chaque emplacement (comme 20 ou moins, en particulier 10 ou moins, spécialement 5 ou moins) . De façon appropriée, de telles insertions ne surviennent pas dans la région d'un épitope, et par conséquent, n'ont pas d'impact significatif sur les propriétés immunogènes de l'antigène. Un exemple d'insertion comprend une séquence courte de résidus d'histidine (par exemple, 2 à 6 résidus) pour aider l'expression et/ou la purification de l'antigène en question.Polypeptide variants may also include those in which additional amino acids are inserted relative to the reference sequence, for example, such insertions may occur at 1 to 10 locations (such as 1 to 5 locations, suitably 1 or 2 locations, particularly 1 location) and may, for example, involve the addition of at least 50 amino acids at each location (such as 20 or less, especially 10 or less, especially 5 or less). Conveniently, such insertions do not occur in the region of an epitope, and therefore do not have a significant impact on the immunogenic properties of the antigen. An exemplary insertion includes a short sequence of histidine residues (eg, 2 to 6 residues) to assist the expression and / or purification of the antigen in question.

Les variants de polypeptides comprennent ceux dans lesquels des acides aminés ont été délétés comparativement à la séquence de référence, par exemple, de telles délétions peuvent survenir au niveau de 1 à 10 emplacements (comme 1 à 5 emplacements, de façon appropriée 1 ou 2 emplacements, en particulier 1 emplacement) et peuvent, par exemple, impliquer la délétion de 50 acides aminés ou moins au niveau de chaque emplacement (comme 20 ou moins, en particulier 10 ou moins, spécialement 5 ou moins). De façon appropriée, de telles délétions ne surviennent pas dans la région d'un épitope, et par conséquent, n'ont pas d'impact significatif sur les propriétés immunogènes de 1'antigène. L'homme du métier comprendra qu'un variant de polypeptide particulier peut comprendre des substitutions, des délétions et des additions (ou l'une quelconque de leurs combinaisons).Polypeptide variants include those in which amino acids have been deleted compared to the reference sequence, for example, such deletions may occur at 1 to 10 locations (such as 1 to 5 locations, suitably 1 or 2 locations in particular 1 location) and may, for example, involve deletion of 50 amino acids or less at each location (such as 20 or less, especially 10 or less, especially 5 or less). Suitably, such deletions do not occur in the region of an epitope, and therefore do not have a significant impact on the immunogenic properties of the antigen. It will be understood by those skilled in the art that a particular polypeptide variant may include substitutions, deletions, and additions (or any combination thereof).

Les variants présentent de préférence au moins environ 70 % d'identité, de manière davantage préférée au moins environ 80 % d'identité et de façon préférée entre toutes au moins environ 90 % d'identité (comme au moins environ 95 %, au moins environ 98 % ou au moins environ 99 %) avec la séquence de référence associée.The variants preferably have at least about 70% identity, more preferably at least about 80% identity, and most preferably at least about 90% identity (as at least about 95%, at least about 98% or at least about 99%) with the associated reference sequence.

Les termes « identique » ou pourcentage « d'identité », dans le contexte de deux séquences ou plus d'acides nucléiques ou de polypeptides, se rapportent à deux séquences ou sous-séquences ou plus qui sont identiques ou qui comportent un pourcentage précisé de résidus d'acides nucléiques ou de nucléotides qui sont identiques (c'est-à-dire, 70 % d'identité, éventuellement 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % ou 99 % d'identité sur une région précisée), lors d'une comparaison et d'un alignement pour une correspondance maximale sur une fenêtre de comparaison, ou une région désignée telle que mesurée en utilisant, par exemple, des algorithmes de comparaison de séquence ou par un alignement manuel et un examen visuel. De telles séquences sont alors dites être « essentiellement identiques ». Cette définition se rapporte également au complémentaire d'une séquence à tester. Eventuellement, l'identité existe sur une région qui a une longueur d'au moins environ 25 à environ 50 acides aminés ou nucléotides, ou éventuellement sur une région qui a une longueur de 75 à 100 acides aminés ou nucléotides. De façon appropriée, la comparaison est effectuée sur une fenêtre correspondant à la longueur entière de la séquence de référence.The terms "identical" or "identity" in the context of two or more nucleic acid or polypeptide sequences refer to two or more sequences or subsequences that are identical or that contain a specified percentage of Nucleic acid or nucleotide residues that are identical (ie, 70% identity, possibly 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% or 99% identity over a specified region), when comparing and aligning for maximum match on a comparison window, or a designated region as measured using, for example, sequence comparison algorithms or manual alignment and a visual examination. Such sequences are then said to be "essentially identical". This definition also relates to the complement of a sequence to be tested. Optionally, the identity exists over a region that is at least about 25 to about 50 amino acids or nucleotides in length, or optionally at a region that is 75 to 100 amino acids or nucleotides in length. Suitably, the comparison is made on a window corresponding to the entire length of the reference sequence.

Pour une comparaison de séquences, généralement une séquence agit comme une séquence de référence, à laquelle les séquences à tester sont comparées. Lors de l'utilisation d'un algorithme de comparaison de séquences, les séquences à tester et de référence sont entrées dans un ordinateur, les coordonnées des sous-séquences sont désignées, si nécessaire, et les paramètres du programme de l'algorithme des séquences sont désignés. Les paramètres par défaut du programme peuvent être utilisés, ou des variantes de paramètres peuvent être désignées. L'algorithme de comparaison de séquences calcule alors les pourcentages d'identité des séquences pour les séquences à tester par rapport à la séquence de référence, en se basant sur les paramètres du programme.For sequence comparison, generally a sequence acts as a reference sequence, to which the test sequences are compared. When using a sequence comparison algorithm, the test and reference sequences are entered into a computer, the sub-sequence coordinates are designated, if necessary, and the program parameters of the sequence algorithm. are designated. The program's default settings can be used, or alternative parameters can be designated. The sequence comparison algorithm then calculates the sequence identity percentages for the test sequences relative to the reference sequence, based on the program parameters.

Une « fenêtre de comparaison », telle qu'utilisée ici, fait référence à un segment dans lequel une séquence peut être comparée à une séquence de référence du même nombre de positions consécutives après que les deux séquences sont alignées de façon optimale. Les procédés d'alignement de séquences pour comparaison sont bien connus de l'état de l'art. L'alignement optimal de séquences pour comparaison peut être conduit, par exemple, par l'algorithme des homologies locales de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), par l'algorithme d'alignement des homologies de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), par le procédé de recherche de similarités de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), par des mises en œuvre informatisées de ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA, et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou par un alignement manuel et un examen visuel (voir, par exemple, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplément)).A "comparison window" as used herein refers to a segment in which a sequence can be compared to a reference sequence of the same number of consecutive positions after the two sequences are optimally aligned. The sequence alignment methods for comparison are well known in the state of the art. The optimal alignment of sequences for comparison can be conducted, for example, by the local homology algorithm of Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), by the Needleman & homology alignment algorithm. Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), by the Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), by computerized implementations of these algorithms (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), or by a manual alignment and visual examination (see, for example, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1995 supplement)).

Un exemple d'un algorithme utile est PILEUP. PILEUP crée un alignement de séquences multiples provenant d'un groupe de séquences apparentées en utilisant des alignements progressifs par paires pour montrer la relation et le pourcentage d'identité de séquence. Il trace également un arbre ou dendogramme montrant les relations de regroupement utilisées pour créer l'alignement. PILEUP utilise une simplification du procédé d'alignement progressif de Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35: 351-360 (1987). Le procédé utilisé est similaire au procédé décrit par Higgins & Sharp, CABIOS 5: 151-153 (1989). Le programme peut aligner jusqu'à 300 séquences, chacune d'une longueur maximale de 5000 nucléotides ou acides aminés. La procédure d'alignements multiples débute avec l'alignement par paires des deux séquences les plus similaires, produisant un groupe de deux séquences alignées. Ce groupe est ensuite aligné avec la séquence suivante la plus apparentée ou le groupe de séquences alignées. Deux groupes de séquences sont alignés par une simple extension de l'alignement par paires de deux séquences individuelles. L'alignement final est obtenu par une série d'alignements progressifs par paires. Le programme est exécuté en désignant des séquences spécifiques et leurs coordonnées d'acides aminés ou de nucléotides pour des régions de comparaison de séquences et en désignant les paramètres du programme. En utilisant PILEUP, une séquence de référence est comparée à d'autres séquences à tester pour déterminer la relation du pourcentage d'identité de séquence en utilisant les paramètres suivants : poids de brèche par défaut (3,00), poids de longueur de brèche par défaut (0,10), et brèches des extrémités pondérées. PILEUP peut être obtenu à partir du progiciel d'analyse de séquences GCG, par exemple, version 7.0 (Devereaux et al., Nue. Acids Res. 12: 387-395 (1984) .An example of a useful algorithm is PILEUP. PILEUP creates an alignment of multiple sequences from a group of related sequences using progressive pairwise alignments to show the relationship and percentage of sequence identity. It also traces a tree or dendogram showing the clustering relationships used to create the alignment. PILEUP uses a simplification of the progressive alignment process of Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35: 351-360 (1987). The process used is similar to the process described by Higgins & Sharp, CABIOS 5: 151-153 (1989). The program can align up to 300 sequences, each with a maximum length of 5000 nucleotides or amino acids. The multiple alignment procedure begins with the pairwise alignment of the two most similar sequences, producing a group of two aligned sequences. This group is then aligned with the next most related sequence or group of aligned sequences. Two groups of sequences are aligned by a simple extension of the pairwise alignment of two individual sequences. The final alignment is obtained by a series of progressive alignments in pairs. The program is executed by designating specific sequences and their amino acid or nucleotide coordinates for sequence comparison regions and designating the parameters of the program. Using PILEUP, a reference sequence is compared to other test sequences to determine the relationship of percent sequence identity using the following parameters: default gap weight (3.00), gap length weight default (0.10), and weighted extremity gaps. PILEUP can be obtained from the GCG sequence analysis package, for example, version 7.0 (Devereaux et al., Acid Res., 12: 387-395 (1984).

Un autre exemple d'algorithme qui est approprié pour déterminer le pourcentage d'identité de séquence et la similarité de séquence consiste en les algorithmes BLAST et BLAST 2.0, qui sont décrits dans Altschul et al., Nue. Acids Res. 25: 33893402 (1977) et Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990), respectivement. Le logiciel pour effectuer les analyses BLAST est disponible au public par l'intermédiaire du National Center for Biotechnology Information (site web à www.ncbi.nlm.nih.gov/). Cet algorithme implique d'abord l'identification des paires de séquences de score élevé (HSP) en identifiant des mots courts d'une longueur W dans la séquence de requête, qui soit correspondent soit satisfont un certain score de seuil à valeur positive T lorsqu'ils sont alignés avec un mot de la même longueur dans une séquence de la base de données. Il est fait référence à T comme au seuil de score du mot voisin (Altschul et al., ci-dessus). Ces correspondances initiales de mots voisins agissent comme des semences pour initier des recherches afin de trouver des HSP plus longues les contenant. Les correspondances des mots sont étendues dans les deux directions le long de chaque séquence aussi loin que le score d'alignement cumulatif peut être augmenté. Les scores cumulatifs sont calculés en utilisant, pour les séquences nucléotidiques, les paramètres M (score de récompense pour une paire de résidus correspondants ; toujours >0) et N (score de pénalité pour les résidus ne correspondant pas ; toujours < 0) . Pour les séquences d'acides aminés, une matrice de score est utilisée pour calculer le score cumulatif. L'extension des correspondances des mots dans chaque direction est stoppée lorsque : le score d'alignement cumulatif se situe d'un quantité X en dehors de sa valeur maximale obtenue ; le score cumulatif va jusqu'à zéro ou en dessous, à cause de l'accumulation d'un ou de plusieurs alignements de résidus à score négatif ; ou l'extrémité de l'une ou l'autre séquence est atteint. Les paramètres W, T, et X de l'algorithme BLAST déterminent la sensibilité et la vitesse de l'alignement. Le programme .BLASTN (pour les séquences nucléotidiques) utilise par défaut une longueur de mots (W) de 11, une espérance (E) de 10, M = 5, N = -4 et une comparaison des deux brins. Pour les séquences d'acides aminés, le programme BLASTP utilise par défaut une longueur de mots de 3, et une espérance (E) de 10, et la matrice de score BLOSUM62 (voir Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)), des alignements (B) de 50, une espérance (E) de 10, M = 5, N = -4, et une comparaison des deux brins. L'algorithme BLAST effectue également une analyse statistique de la similarité entre deux séquences (voir, par exemple, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)). Une mesure de similarité fournie par l'algorithme BLAST est la plus petite somme des probabilités (P(N)), qui fournit une indication de la probabilité selon laquelle une correspondance entre deux séquences nucléotidiques ou d'acides aminés pourrait survenir par hasard. Par exemple, un acide nucléique est considéré comme similaire à une séquence de référence si la plus petite somme des probabilités dans une comparaison de l'acide nucléique à tester à l'acide nucléique de référence est inférieure à environ 0,2, de manière davantage préférée inférieure à environ 0,01, et de manière préférée entre toutes inférieure à environ 0,001.Another example of an algorithm that is suitable for determining percent sequence identity and sequence similarity is the BLAST and BLAST 2.0 algorithms, which are described in Altschul et al., Nue. Acids Res. 25: 33893402 (1977) and Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990), respectively. The BLAST analysis software is available to the public through the National Center for Biotechnology Information (website at www.ncbi.nlm.nih.gov/). This algorithm first involves identifying high score sequence pairs (HSPs) by identifying short words of length W in the request sequence, which either match or satisfy a certain positive value threshold score T when they are aligned with a word of the same length in a sequence of the database. T is referred to as the score threshold of the neighboring word (Altschul et al., Supra). These initial matches of neighboring words act like seeds to initiate searches to find longer HSPs containing them. The word matches are extended in both directions along each sequence as far as the cumulative alignment score can be increased. The cumulative scores are calculated using, for the nucleotide sequences, the parameters M (reward score for a pair of corresponding residues, always> 0) and N (penalty score for the residues that do not correspond, always <0). For amino acid sequences, a scoring matrix is used to calculate the cumulative score. The extension of the word matches in each direction is stopped when: the cumulative alignment score is an amount X outside its maximum value obtained; the cumulative score goes to zero or below because of the accumulation of one or more negative-scoring residue alignments; or the end of one or the other sequence is reached. The parameters W, T, and X of the BLAST algorithm determine the sensitivity and speed of the alignment. The .BLASTN program (for nucleotide sequences) uses by default a word length (W) of 11, an expectation (E) of 10, M = 5, N = -4 and a comparison of the two strands. For amino acid sequences, the BLASTP program uses by default a word length of 3, and an expectation (E) of 10, and the score matrix BLOSUM62 (see Henikoff & Henikoff, Proc Natl Acad Sci USA 89: 10915 (1989)), alignments (B) of 50, expectation (E) of 10, M = 5, N = -4, and comparison of both strands. The BLAST algorithm also performs a statistical analysis of the similarity between two sequences (see, for example, Karlin & Altschul, Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873-5787 (1993)). A measure of similarity provided by the BLAST algorithm is the smallest sum of the probabilities (P (N)), which provides an indication of the probability that a match between two nucleotide or amino acid sequences might occur by chance. For example, a nucleic acid is considered to be similar to a reference sequence if the smallest sum of the probabilities in a comparison of the nucleic acid to be tested with the reference nucleic acid is less than about 0.2, more preferably preferred less than about 0.01, and most preferably less than about 0.001.

IDENTIFICATION ET CARACTERISATION DES POLYNUCLEOTIDESIDENTIFICATION AND CHARACTERIZATION OF POLYNUCLEOTIDES

Les polynucléotides codant pour les protéines CDTa, CDTb, de toxine A et de toxine B de Clostridium difficile de l'invention peuvent être identifiés, préparés et/ou manipulés en utilisant l'une quelconque de toute une diversité de techniques bien établies. Par exemple, un polynucléotide peut être identifié, comme il est décrit plus en détail ci-dessous, par criblage d'une micropuce d'ADNc. De tels criblages peuvent être effectués, par exemple, en utilisant une micropuce Synteni (Palo Alto, CA) selon les instructions du fabricant (et essentiellement comme il est décrit par Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 10614-10619 (1996) et Heller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 2150-2155 (1997)). En variante, les polynucléotides peuvent être amplifiés à partir d'ADNc préparé à partir de cellules exprimant les protéines décrites ici, comme des cellules de M. tuberculosis. Ces polynucléotides peuvent être amplifiés par l'intermédiaire d'une réaction en chaîne de la polymérase (PCR). Pour cette approche, des amorces spécifiques des séquences peuvent être conçues en se basant sur les séquences fournies ici, et elles peuvent être achetées ou synthétisées.Polynucleotides encoding CDTa, CDTb, toxin A and Clostridium difficile toxin B proteins of the invention may be identified, prepared and / or manipulated using any of a variety of well-established techniques. For example, a polynucleotide can be identified, as described in more detail below, by screening a cDNA microarray. Such screens may be performed, for example, using a Synteni microchip (Palo Alto, CA) according to the manufacturer's instructions (and essentially as described by Schena et al., Proc Natl Acad Sci USA 93: 10614-10619 (1996) and Heller et al., Proc Natl Acad Sci USA 94: 2150-2155 (1997)). Alternatively, the polynucleotides can be amplified from cDNA prepared from cells expressing the proteins described herein, such as M. tuberculosis cells. These polynucleotides can be amplified via a polymerase chain reaction (PCR). For this approach, sequence-specific primers can be designed based on the sequences provided herein, and can be purchased or synthesized.

Une partie amplifiée d'un polynucléotide peut être utilisée pour isoler un gène pleine longueur à partir d'une banque appropriée (par exemple, une banque d'ADNc de M. tuberculosis) en utilisant des techniques bien connues. Dans ces techniques, une banque (d'ADNc ou génomique) est criblée en utilisant une ou plusieurs sondes ou amorces polynucléotidiques appropriées pour l'amplification. De préférence, une banque est choisie par la taille pour inclure des molécules plus grosses. Des banques amorcées de façon aléatoire peuvent être également préférées pour l'identification des régions en 5' et en amont des gènes.An amplified portion of a polynucleotide can be used to isolate a full length gene from a suitable library (eg, a M. tuberculosis cDNA library) using well known techniques. In these techniques, a library (cDNA or genomic) is screened using one or more polynucleotide probes or primers suitable for amplification. Preferably, a library is chosen by size to include larger molecules. Randomly initiated libraries may also be preferred for identifying regions 5 'and upstream of the genes.

Les banques génomiques sont préférées pour obtenir des introns et étendre les séquences en 5'.Genomic libraries are preferred for obtaining introns and extending sequences in 5 '.

Pour les techniques d'hybridation, une séquence partielle peut - être marquée (par exemple, par déplacement de coupure ou marquage des extrémités par 32P) en utilisant des techniques bien connues. Une banque bactérienne ou de bactériophages est alors généralement criblée par hybridation de filtres contenant des colonies bactériennes dénaturées (ou de tapis contenant des plaques de phages) avec la sonde marquée (voir Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2000)). Les colonies ou les plaques s'hybridant sont sélectionnées et soumises à une expansion, et l'ADN est isolé pour une autre analyse. Les clones d'ADNc peuvent être analysés pour déterminer la quantité de séquence supplémentaire, par exemple, par PCR en utilisant une amorce issue de la séquence partielle et une amorce issue du vecteur. Des cartes de restriction et des séquences partielles peuvent être générées pour identifier un ou plusieurs clones se chevauchant. La séquence complète peut être ensuite déterminée en utilisant des techniques classiques, qui peuvent impliquer la production d'une série de clones de délétion. Les séquences chevauchantes résultantes peuvent être ensuite assemblées en une seule séquence contiguë. Une molécule d'ADNc pleine longueur peut être produite par ligature des fragments appropriés, en utilisant des techniques bien connues.For hybridization techniques, a partial sequence may be labeled (eg by cleavage displacement or end labeling by 32P) using well known techniques. A bacterial or bacteriophage library is then generally screened by hybridizing filters containing denatured bacterial colonies (or mats containing phage plaques) with the labeled probe (see Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2000)). . The hybridizing colonies or plaques are selected and expanded, and the DNA is isolated for further analysis. The cDNA clones can be analyzed to determine the amount of additional sequence, for example, by PCR using a primer derived from the partial sequence and a primer derived from the vector. Restriction maps and partial sequences can be generated to identify one or more overlapping clones. The complete sequence can then be determined using standard techniques, which may involve the production of a series of deletion clones. The resulting overlapping sequences can then be assembled into a single contiguous sequence. A full length cDNA molecule can be produced by ligation of the appropriate fragments, using well known techniques.

En variante, il existe de nombreuses techniques d'amplification pour l'obtention d'une séquence codante pleine longueur à partir d'une séquence d'ADNc partielle. Dans ces techniques, l'amplification est généralement réalisée par l'intermédiaire d'une PCR. L'un quelconque de toute une diversité de kits disponibles dans le commerce peut être utilisé pour effectuer l'étape d'amplification. Les amorces peuvent être conçues en utilisant, par exemple, un logiciel bien connu de l'état de l'art. Les amorces ont de préférence une longueur de 22 à 30 nucléotides, présentent une teneur en GC d'au moins 50 % et s'hybrident à la séquence cible à des températures d'environ 68 °C à 72 °C. La région amplifiée peut être séquencée comme il a été décrit ci-dessus, et les séquences chevauchantes sont assemblées en une séquence contiguë.Alternatively, there are many amplification techniques for obtaining a full-length coding sequence from a partial cDNA sequence. In these techniques, amplification is generally performed via PCR. Any of a variety of commercially available kits can be used to perform the amplification step. The primers can be designed using, for example, well-known software of the state of the art. The primers are preferably 22 to 30 nucleotides long, have a GC content of at least 50% and hybridize to the target sequence at temperatures of about 68 ° C to 72 ° C. The amplified region can be sequenced as described above, and the overlapping sequences are assembled into a contiguous sequence.

Une telle technique d'amplification est la PCR inverse (voir Triglia et al., Nucl. Acids Res. 16: 8186 (1988)), qui utilise des enzymes de restriction pour produire un fragment dans la région connue du gène. Le fragment est ensuite circularisé par ligature intramoléculaire et utilisé en tant que matrice pour la PCR avec des amorces divergentes dérivées de la région connue. Dans cette variante d'approche, les séquences adjacentes à une séquence partielle peuvent être récupérées par amplification avec une amorce spécifique d'une séquence lieur (« linker ») et une amorce spécifique d'une région connue. Les séquences amplifiées sont généralement soumises à une seconde série d'amplification avec la même amorce du lieur (« linker ») et une seconde amorce spécifique de la région connue. Une variation de cette procédure, qui emploie deux amorces qui initient l'extension dans des directions opposées à partir de la séquence connue, est décrite dans le document WO 96/38591. Une autre technique de ce type est connue comme « l'amplification rapide des extrémités d'ADNc » ou RACE. Cette technique implique l'utilisation d'une amorce interne et d'une amorce externe, qui s'hybride à une région polyA ou une séquence de vecteur, pour identifier les séquences qui sont en 5' et 3' d'une séquence connue. D'autres techniques comprennent la PCR de capture (Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1: 111-19 (1991)) et la walking-PCR (Parker et al., Nucl. Acids. Res. 19: 3055-60 (1991)). D'autres procédés employant une amplification peuvent être également employés pour obtenir une séquence d'ADNc pleine longueur.One such amplification technique is reverse PCR (see Triglia et al., Nucl Acids Res 16: 8186 (1988)), which uses restriction enzymes to produce a fragment in the known region of the gene. The fragment is then circularized by intramolecular ligation and used as a template for PCR with divergent primers derived from the known region. In this approach variant, the sequences adjacent to a partial sequence can be recovered by amplification with a primer specific for a linker sequence and a primer specific for a known region. The amplified sequences are generally subjected to a second amplification series with the same linker primer ("linker") and a second specific primer of the known region. A variation of this procedure, which employs two primers that initiate extension in opposite directions from the known sequence, is described in WO 96/38591. Another technique of this type is known as "rapid amplification of cDNA ends" or RACE. This technique involves the use of an internal primer and an outer primer, which hybridizes to a polyA region or a vector sequence, to identify sequences that are 5 'and 3' of a known sequence. Other techniques include capture PCR (Lagerstrom et al., PCR Methods Applicant 1: 111-19 (1991)) and walking-PCR (Parker et al., Nucl Acids Res 19: 3055-60). (1991)). Other methods employing amplification may also be employed to obtain a full-length cDNA sequence.

Dans certains cas, il est possible d'obtenir une séquence d'ADNc pleine longueur par analyse des séquences fournies dans une base de données de marqueurs de séquences exprimées (EST), telle que celle disponible auprès de GenBank. Les recherches d'EST chevauchants peuvent être généralement réalisées en utilisant des programmes bien connus (par exemple, les recherches de NCBI BLAST) , et ces EST peuvent être utilisés pour générer une séquence pleine longueur contiguë. Les séquences d'ADN pleine longueur peuvent être également obtenues par analyse de fragments génomiques.In some cases, it is possible to obtain a full-length cDNA sequence by sequence analysis provided in an expressed sequence marker (EST) database, such as that available from GenBank. Overlapping EST searches may be generally performed using well-known programs (eg, NCBI BLAST searches), and these ESTs may be used to generate a contiguous full-length sequence. Full length DNA sequences can also be obtained by genomic fragment analysis.

EXPRESSION DES POLYNUCLEOTIDES DANS DES CELLULES HOTESEXPRESSION OF POLYNUCLEOTIDES IN HOST CELLS

Les séquences polynucléotidiques ou des fragments de celles-ci qui codent pour les protéines CDTa, CDTb, de toxine A et de toxine B de Clostridium difficile, ou des protéines de fusion ou leurs équivalents fonctionnels, peuvent être utilisées dans des molécules d'ADN recombinant pour diriger l'expression d'un polypeptide dans des cellules hôtes appropriées. Du fait de la dégénérescence intrinsèque du code génétique, d'autres séquences d'ADN qui codent pour essentiellement la même séquence d'acides aminés ou une séquence d'acides aminés fonctionnellement équivalente peuvent être produites et ces séquences peuvent être utilisées pour cloner et exprimer un polypeptide donné.Polynucleotide sequences or fragments thereof that encode clostridium difficile CDTa, CDTb, toxin A, and toxin B proteins, or fusion proteins or their functional equivalents, may be used in recombinant DNA molecules. to direct the expression of a polypeptide in appropriate host cells. Due to the intrinsic degeneracy of the genetic code, other DNA sequences that encode substantially the same amino acid sequence or a functionally equivalent amino acid sequence can be produced and these sequences can be used to clone and express a given polypeptide.

Comme le comprendra l'homme du métier, il peut être avantageux dans certains cas de produire des séquences nucléotidiques codant pour des polypeptides qui possèdent des codons n'existant pas à l'état naturel. Par exemple, les codons préférés par un hôte procaryote ou eucaryote particulier peuvent être sélectionnés pour augmenter le taux d'expression de la protéine ou pour produire un transcrit d'ARN recombinant doté de propriétés souhaitables, comme une demi-vie qui est plus longue que celle d'un transcrit produit à partir de la séquence existant à l'état naturel.As will be appreciated by those skilled in the art, it may be advantageous in some cases to produce nucleotide sequences encoding polypeptides that have non-naturally occurring codons. For example, codons preferred by a particular prokaryotic or eukaryotic host may be selected to increase the level of expression of the protein or to produce a recombinant RNA transcript with desirable properties, such as a half-life that is longer than that of a transcript produced from the sequence existing in the natural state.

En outre, les séquences polynucléotidiques peuvent être modifiées en utilisant des procédés généralement connus de l'état de l'art afin de modifier les séquences codant pour les polypeptides pour diverses raisons, y compris mais sans y être limités, des changements qui modifient le clonage, le traitement, et/ou l'expression du produit génique. Par exemple, la réorganisation d'ADN par fragmentation aléatoire et un réassemblage par PCR des fragments géniques et des oligonucléotides synthétiques peuvent être utilisés pour modifier les séquences nucléotidiques. En outre, une mutagenèse dirigée peut être utilisée pour insérer de nouveaux sites de restriction, modifier les profils de glycosylation, changer la préférence des codons, produire des variants d'épissage, ou introduire des mutations, et ainsi de suite.In addition, the polynucleotide sequences may be modified using methods generally known in the art to modify the polypeptide coding sequences for a variety of reasons, including but not limited to, changes that alter cloning. , the treatment, and / or the expression of the gene product. For example, DNA rearrangement by random fragmentation and PCR reassembly of gene fragments and synthetic oligonucleotides can be used to modify nucleotide sequences. In addition, site-directed mutagenesis can be used to insert new restriction sites, modify glycosylation patterns, change codon preference, produce splice variants, or introduce mutations, and so on.

Des séquences d'acide nucléique naturelles, modifiées, ou recombinantes peuvent être ligaturées en une séquence hétérologue pour coder pour une protéine de fusion. Par exemple, pour cribler des banques de peptides à la recherche d'inhibiteurs d'une activité de polypeptide, il peut être utile de coder pour une protéine chimérique qui peut être reconnue par un anticorps disponible dans le commerce. Une protéine de fusion peut être également modifiée pour contenir un site de clivage localisé entre la séquence codante du polypeptide et la séquence de la protéine hétérologue, si bien que le polypeptide peut être clivé et purifié à distance du radical hétérologue.Natural, modified, or recombinant nucleic acid sequences can be ligated into a heterologous sequence to encode a fusion protein. For example, to screen peptide libraries for inhibitors of polypeptide activity, it may be useful to code for a chimeric protein that can be recognized by a commercially available antibody. A fusion protein may also be modified to contain a cleavage site located between the coding sequence of the polypeptide and the sequence of the heterologous protein, so that the polypeptide may be cleaved and purified away from the heterologous radical.

Les séquences codant pour un polypeptide souhaité peuvent être synthétisées, en totalité ou en partie, en utilisant des procédés chimiques bien connus de l'état de l'art (voir Caruthers, M. H. et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. pp. 215223 (1980), Horn et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. pp. 225232 (1980)) . En variante, la protéine elle-même peut être produite en utilisant des procédés chimiques pour synthétiser la séquence d'acides aminés d'un polypeptide, ou d'une partie de celle-ci. Par exemple, la synthèse de peptides peut être effectuée en utilisant diverses techniques sur phase solide (Roberge et al., Science 269: 202-204 (1995)) et une synthèse automatisée peut être obtenue, par exemple, en utilisant le synthétiseur de peptides ABI 431A (Perkin Elmer, Palo Alto, CA).Sequences encoding a desired polypeptide may be synthesized, in whole or in part, using well-known chemical methods of the state of the art (see Caruthers, MH et al., Nucl Acids Res, Symp Ser. pp. 215223 (1980), Horn et al., Nucl Acids Res Symp., Ser., pp. 225232 (1980)). Alternatively, the protein itself can be produced using chemical methods to synthesize the amino acid sequence of a polypeptide, or part thereof. For example, peptide synthesis can be performed using various solid phase techniques (Roberge et al., Science 269: 202-204 (1995)) and automated synthesis can be achieved, for example, using the peptide synthesizer ABI 431A (Perkin Elmer, Palo Alto, CA).

Un peptide nouvellement synthétisé peut être essentiellement purifié par une chromatographie liquide haute performance préparative (par exemple, Creighton, Proteins, Structures and Molecular Principles (1983)) ou d'autres techniques comparables disponibles dans l'état de l'art. La composition des peptides synthétiques peut être confirmée par l'analyse des acides aminés ou le séquençage (par exemple, la procédure de dégradation d'Edman). En variante, la séquence d'acides aminés d'un polypeptide, ou d'une partie quelconque de celle-ci, peut être modifiée durant la synthèse directe et/ou combinée en utilisant des procédés chimiques avec des séquences provenant d'autres protéines, ou d'une partie quelconque de celles-ci, pour produire un polypeptide variant.A newly synthesized peptide may be substantially purified by preparative high performance liquid chromatography (eg Creighton, Proteins, Structures and Molecular Principles (1983)) or other comparable techniques available in the state of the art. The composition of the synthetic peptides can be confirmed by amino acid analysis or sequencing (e.g., the Edman degradation procedure). Alternatively, the amino acid sequence of a polypeptide, or any part thereof, may be modified during direct and / or combined synthesis using chemical methods with sequences from other proteins, or any part thereof, to produce a variant polypeptide.

Afin d'exprimer un polypeptide souhaité, les séquences nucléotidiques codant pour le polypeptide, ou des équivalents fonctionnels, peuvent être insérées dans un vecteur d'expression approprié, c'est-à-dire, un vecteur qui contient les éléments nécessaires à la transcription et la traduction de la séquence codante insérée. Les procédés qui sont bien connus de l'homme du métier peuvent être utilisés pour construire des vecteurs d'expression contenant des séquences contenant les séquences codant pour un polypeptide d'intérêt et les éléments de contrôle de la transcription et de la traduction appropriés. Ces procédés comprennent les techniques d'ADN recombinant in vitro, les techniques de synthèse, et la recombinaison génétique in vivo. Ces techniques sont décrites dans Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2000), et Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (mis à jour annuellement).In order to express a desired polypeptide, the nucleotide sequences coding for the polypeptide, or functional equivalents, may be inserted into an appropriate expression vector, i.e., a vector that contains the elements necessary for transcription and translating the inserted coding sequence. The methods that are well known to those skilled in the art can be used to construct expression vectors containing sequences containing the coding sequences for a polypeptide of interest and the appropriate transcriptional and translational control elements. These methods include in vitro recombinant DNA techniques, synthetic techniques, and in vivo genetic recombination. These techniques are described in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2000), and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (updated annually).

Divers systèmes de vecteur d'expression/hôte peuvent être utilisés pour contenir et exprimer des séquences polynucléotidiques. Ceux-ci comprennent, mais sans y être limités, des micro-organismes comme des bactéries transformées par des vecteurs d'expression d'ADN recombinant de bactériophage, de plasmide ou de cosmide ; des levures transformées par des vecteurs d'expression de levures ; des systèmes de cellules d'insectes infectées par des vecteurs d'expression de virus (par exemple, des baculovirus) ; des systèmes de cellules végétales transformées par des vecteurs d'expression de virus (par exemple, le virus de la mosaïque du chou-fleur, CaMV ; le virus de la mosaïque du tabac, TMV) ou par des vecteurs d'expression bactériens (par exemple, les plasmides Ti ou pBR322) ; ou des systèmes de cellules animales.Various expression vector / host systems can be used to contain and express polynucleotide sequences. These include, but are not limited to, microorganisms such as bacteria transformed with bacteriophage, plasmid or cosmid recombinant DNA expression vectors; yeasts transformed with yeast expression vectors; insect cell systems infected with virus expression vectors (e.g., baculoviruses); plant cell systems transformed with virus expression vectors (eg, cauliflower mosaic virus, CaMV, tobacco mosaic virus, TMV) or by bacterial expression vectors (eg for example, Ti or pBR322 plasmids); or animal cell systems.

Les « éléments de contrôle » ou les « séquences régulatrices » présents dans un vecteur d'expression sont ces régions non traduites du vecteur - amplificateurs, promoteurs, régions non traduites en 5' et 3' - qui interagissent avec les protéines cellulaires de l'hôte pour réaliser la transcription et la traduction. Ces éléments peuvent varier en force et spécificité. Selon le système de vecteur et l'hôte utilisés, un nombre quelconque d'éléments de contrôle de la transcription et de la traduction appropriés, y compris des promoteurs constitutifs et inductibles, peuvent être utilisés. Par exemple, lors d'un clonage dans des systèmes bactériens, des promoteurs inductibles, tels que le promoteur hybride lacZ du phagemide PBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, Californie) ou du plasmide PSP0RT1 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) et analogues peuvent être utilisés. Dans les systèmes de cellules de mammifères, des promoteurs provenant de gènes de mammifères ou de virus de mammifères sont généralement préférés. S'il est nécessaire de produire une lignée cellulaire qui contient des copies multiples de la séquence codant pour un polypeptide, des vecteurs basés sur le SV40 ou l'EBV peuvent être utilisés de façon avantageuse avec un marqueur sélectionnable approprié.The "control elements" or "regulatory sequences" present in an expression vector are those untranslated regions of the vector - amplifiers, promoters, 5 'and 3' untranslated regions - which interact with the cellular proteins of the host for transcription and translation. These elements can vary in strength and specificity. Depending on the vector system and host used, any number of suitable transcriptional and translational control elements, including constitutive and inducible promoters, may be used. For example, upon cloning into bacterial systems, inducible promoters, such as the PBLUESCRIPT phagemid lacZ hybrid promoter (Stratagene, La Jolla, Calif.) Or the PSP0RT1 plasmid (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) and the like may be used. In mammalian cell systems, promoters from mammalian genes or mammalian viruses are generally preferred. If it is necessary to produce a cell line that contains multiple copies of the polypeptide coding sequence, vectors based on SV40 or EBV can be advantageously used with an appropriate selectable marker.

Dans les systèmes bactériens, un certain nombre de vecteurs d'expression peuvent être sélectionnés selon l'utilisation prévue pour le polypeptide exprimé. Par exemple, lorsque de grandes quantités sont nécessaires, par exemple pour l'induction d'anticorps, des vecteurs qui dirigent une expression à taux élevés de protéines de fusion qui sont facilement purifiées, peuvent être utilisés. Ces vecteurs comprennent, mais n'y sont pas limités, les vecteurs de clonage et d'expression multifonctionnels d'E. coli comme BLUESCRIPT (Stratagene), dans lesquels la séquence codant pour le polypeptide d'intérêt peut être ligaturée dans le vecteur dans le cadre de lecture avec des séquences pour la Met amino-terminale et les 7 résidus subséquents de la β-galactosidase si bien qu'il est produit une protéine hybride ; les vecteurs pIN (Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 264: 5503-5509 (1989)) ; et analogues. Les vecteurs pGEX (Promega, Madison, Wis ; GE Healthcare) peuvent être également utilisés pour exprimer des polypeptides étrangers sous la forme de protéines de fusion avec de la glutathion-S-transférase (GST). En général, ces protéines de fusion sont solubles et peuvent être facilement purifiées à partir des cellules lysées par adsorption sur des billes de glutathion-agarose suivie d'une élution en présence de glutathion libre. Les protéines fabriquées dans ces systèmes peuvent être conçues pour inclure des sites de clivage de l'héparine, de la thrombine, de la protéase facteur XA si bien que le polypeptide d'intérêt cloné peut être libéré du radical GST à volonté.In bacterial systems, a number of expression vectors may be selected according to the intended use for the expressed polypeptide. For example, when large amounts are needed, for example for induction of antibodies, vectors that direct high-level expression of fusion proteins that are easily purified, can be used. These vectors include, but are not limited to, multifunctional cloning and expression vectors of E. coli such as BLUESCRIPT (Stratagene), in which the coding sequence for the polypeptide of interest can be ligated into the vector in the reading frame with sequences for the amino-terminal Met and the subsequent 7 residues of β-galactosidase, although that a hybrid protein is produced; pIN vectors (Van Heeke & Schuster, J. Biol Chem 264: 5503-5509 (1989)); and the like. The pGEX vectors (Promega, Madison, Wis, GE Healthcare) can also be used to express foreign polypeptides in the form of fusion proteins with glutathione S-transferase (GST). In general, these fusion proteins are soluble and can be easily purified from lysed cells by adsorption on glutathione-agarose beads followed by elution in the presence of free glutathione. The proteins made in these systems may be designed to include heparin, thrombin, factor XA protease cleavage sites so that the cloned polypeptide of interest may be released from the GST moiety at will.

Dans les levures, Saccharomyces cerevisiae ou Pichia comme Pichia pastoris par exemple, un certain nombre de vecteurs contenant des promoteurs constitutifs ou inductibles comme le facteur alpha, l'alcool oxydase, et le PGH, peuvent être utilisés. D'autres vecteurs contenant des promoteurs constitutifs ou inductibles comprennent GAP, PGK, GAL et ADH. Pour des descriptions, voir Ausubel et al. (ci-dessus) et Grant et al., Methods Enzymol. 153: 516-544 (1987) et Romas et al. Yeast 8 423-88 (1992).In yeasts, Saccharomyces cerevisiae or Pichia as Pichia pastoris for example, a number of vectors containing constitutive or inducible promoters such as alpha factor, alcohol oxidase, and PGH can be used. Other vectors containing constitutive or inducible promoters include GAP, PGK, GAL and ADH. For descriptions, see Ausubel et al. (above) and Grant et al., Methods Enzymol. 153: 516-544 (1987) and Romas et al. Yeast 8,423-88 (1992).

Dans les cas où des vecteurs d'expression végétaux sont utilisés, l'expression des séquences codant pour les polypeptides peut être dirigée par l'un quelconque de tout un nombre de promoteurs. Par exemple, des promoteurs viraux comme les promoteurs 35S et.19S du CaMV peuvent être utilisés seuls ou en combinaison avec la séquence de tête oméga issue du TMV (Takamatsu, EMBO J. 6: 307-311 (1987)). En variante, des promoteurs végétaux comme la petite sous-unité de RUBISCO ou des promoteurs de choc thermique peuvent être utilisés (Coruzzi et al., EMBO J. 3: 1671-1680 (1984) ; Broglie et al., Science 224: 838-843 (1984) ; et Winter et al., Results Probl. Cell Differ. 17: 85-105 (1991)). Ces constructions peuvent être introduites dans des cellules végétales par transformation directe d'ADN ou transfection médiée par un agent pathogène. Ces techniques sont décrites dans un certain nombre de descriptions généralement disponibles (voir, par exemple, Hobbs dans McGraw Hill Yearbook of Science and Technology pp. 191-196 (1992)).In cases where plant expression vectors are used, the expression of the coding sequences for the polypeptides may be directed by any one of a number of promoters. For example, viral promoters such as 35S and 19S promoters of CaMV may be used alone or in combination with the TMV-derived omega leader (Takamatsu, EMBO J. 6: 307-311 (1987)). Alternatively, plant promoters such as the small subunit of RUBISCO or heat shock promoters can be used (Coruzzi et al., EMBO J. 3: 1671-1680 (1984), Broglie et al., Science 224: 838 843 (1984) and Winter et al., Results Probl Cell Differ 17: 85-105 (1991)). These constructs can be introduced into plant cells by direct DNA transformation or pathogen-mediated transfection. These techniques are described in a number of generally available descriptions (see, for example, Hobbs in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology pp. 191-196 (1992)).

Un système d'insectes peut être également utilisé pour exprimer un polypeptide d'intérêt. Par exemple, dans un tel système, le virus de la polyédrose nucléaire d'Autographa californica (AcNPV) est utilisé en tant que vecteur pour exprimer des gènes étrangers dans des cellules de Spodoptera frugiperda ou dans des larves de Trichoplusia. Les séquences codant pour le polypeptide peuvent être clonées dans une région non essentielle du virus, comme le gène de la polyédrine, et placées sous le contrôle du promoteur de la polyédrine. Une insertion réussie de la séquence codant pour le polypeptide rendra le gène de la polyédrine inactif et produira un virus recombinant auquel il manque la protéine de l'enveloppe. Les virus recombinants peuvent être ensuite utilisés pour infecter, par exemple, des cellules de S. frugiperda ou des larves de Trichoplusia dans lesquelles le polypeptide d'intérêt peut être exprimé (Engelhard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91 : 3224-3227 (1994)).An insect system may also be used to express a polypeptide of interest. For example, in such a system, Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) is used as a vector to express foreign genes in Spodoptera frugiperda cells or in Trichoplusia larvae. The coding sequences for the polypeptide may be cloned into a non-essential region of the virus, such as the polyhedrin gene, and placed under the control of the polyhedrin promoter. Successful insertion of the coding sequence for the polypeptide will render the polyhedrin gene inactive and produce a recombinant virus lacking the envelope protein. The recombinant viruses can then be used to infect, for example, S. frugiperda cells or Trichoplusia larvae in which the polypeptide of interest can be expressed (Engelhard et al., Proc Natl Acad Sci USA 91 3224-3227 (1994)).

Dans des cellules hôtes de mammifères, un certain nombre de systèmes d'expression à base de virus sont généralement disponibles. Par exemple, dans les cas où un adénovirus est utilisé en tant que vecteur d'expression, les séquences codant pour un polypeptide d'intérêt peuvent être ligaturées dans un complexe de transcription/traduction de l'adénovirus constitué du promoteur tardif et de la séquence de tête tripartite. L'insertion dans une région non essentielle El ou E3 du génome viral peut être utilisée pour obtenir un virus viable qui est capable d'exprimer le polypeptide dans des cellules hôtes infectées (Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 3655-3659 (1984)). En outre, des amplificateurs de la transcription, comme l'amplificateur du virus du sarcome de Rous (RSV), peuvent être utilisés pour augmenter l'expression dans des cellules hôtes de mammifères. Des procédés et des protocoles pour travailler avec des vecteurs d'adénovirus sont décrits dans Wold, Adenovirus Methods and Protocols, 1998. Des références supplémentaires concernant l'utilisation de vecteurs d'adénovirus peuvent être trouvées dans Adenovirus: A Medical Dictionary, Bibliography, and Annotated Research Guide to Internet References, 2004.In mammalian host cells, a number of virus-based expression systems are generally available. For example, in cases where an adenovirus is used as an expression vector, the sequences coding for a polypeptide of interest can be ligated into a transcription / translation complex of the adenovirus consisting of the late promoter and the sequence tripartite head. Insertion into an E1 or E3 non-essential region of the viral genome can be used to obtain a viable virus that is capable of expressing the polypeptide in infected host cells (Logan & Shenk, Proc Natl Acad Sci USA 81: 3655-3659 (1984)). In addition, transcriptional enhancers, such as the Rous Sarcoma Virus (RSV) enhancer, can be used to increase expression in mammalian host cells. Methods and protocols for working with adenovirus vectors are described in Wold, Adenovirus Methods and Protocols, 1998. Additional references regarding the use of adenovirus vectors can be found in Adenovirus: A Medical Dictionary, Bibliography, and Annotated Research Guide to Internet References, 2004.

Des signaux d'initiation spécifiques peuvent être également utilisés pour obtenir une traduction plus efficace des séquences codant pour un polypeptide d'intérêt. Ces signaux comprennent le codon d'initiation ATG et les séquences adjacentes. Dans les cas où des séquences codant pour le polypeptide, son codon d'initiation, et des séquences en amont sont insérés dans le vecteur d'expression approprié, aucun signal de contrôle de la transcription ou de la traduction supplémentaire n'est nécessaire. Toutefois, dans les cas où seulement une séquence codante, ou une partie de celle-ci, est insérée, des signaux de contrôle de la traduction exogènes y compris le codon d'initiation ATG, devront être fournis. En outre, le codon d'initiation devra être dans le cadre de lecture correct pour assurer la traduction de l'insert entier. Les éléments de la traduction exogènes et les codons d'initiation peuvent être d'origines diverses, à la fois naturelles et synthétiques. L'efficacité de l'expression peut être amplifiée par l'inclusion d'amplificateurs qui sont appropriés pour le système cellulaire particulier qui est utilisé, comme ceux décrits dans la littérature (Scharf. et al., Results Probl. Cell Differ. 20: 125-162 (1994)) .Specific initiation signals can also be used to obtain a more efficient translation of the sequences encoding a polypeptide of interest. These signals include the ATG initiation codon and the adjacent sequences. In cases where sequences encoding the polypeptide, its initiation codon, and upstream sequences are inserted into the appropriate expression vector, no additional transcriptional or translation control signal is required. However, in cases where only a coding sequence, or a portion thereof, is inserted, exogenous translation control signals including the ATG initiation codon will have to be provided. In addition, the initiation codon should be in the correct reading frame to ensure translation of the entire insert. The elements of the exogenous translation and initiation codons can be of various origins, both natural and synthetic. The efficiency of expression can be enhanced by the inclusion of enhancers that are appropriate for the particular cellular system that is used, such as those described in the literature (Scharf, et al., Results Probl Cell Differ. 125-162 (1994)).

En outre, une souche de cellules hôtes peut être choisie pour sa capacité à moduler l'expression des séquences insérées ou à traiter la protéine exprimée de la façon souhaitée. Ces modifications du polypeptide comprennent, mais n'y sont pas limitées, l'acétylation, la carboxylation, la glycosylation, la phosphorylation, la lipidation, et l'acylation. Un traitement post-traductionnel qui clive une forme « prépro » de la protéine peut être également utilisé pour faciliter l'insertion, le repliement et/ou la fonction corrects. Différentes cellules hôtes comme CHO, HeLa, MDCK, HEK293, et WI38, qui comportent une machinerie cellulaire spécifique et des mécanismes caractéristiques de telles activités post-traductionnelles, peuvent être choisies pour assurer la modification et le traitement corrects de la protéine étrangère.In addition, a host cell strain may be chosen for its ability to modulate the expression of inserted sequences or to process the expressed protein in the desired manner. Such modifications of the polypeptide include, but are not limited to, acetylation, carboxylation, glycosylation, phosphorylation, lipidation, and acylation. Post-translational processing that cleaves a "prepro" form of the protein can also be used to facilitate proper insertion, folding and / or function. Different host cells such as CHO, HeLa, MDCK, HEK293, and WI38, which include specific cell machinery and mechanisms characteristic of such post-translational activities, may be chosen to ensure the correct modification and processing of the foreign protein.

Pour une production à rendement élevé sur le long terme de protéines recombinantes, une expression stable est généralement préférée. Par exemple, des lignées cellulaires qui expriment de façon stable un polynucléotide d'intérêt peuvent être transformées en utilisant des vecteurs d'expression qui peuvent contenir des origines de réplication virales et/ou des éléments d'expression endogènes et un gène de marqueur sélectionnable sur le même vecteur ou sur un vecteur séparé. A la suite de l'introduction du vecteur, les cellules peuvent être laissées pour se développer pendant 1 à 2 jours dans un milieu enrichi avant de les passer à un milieu sélectif. L'objectif du marqueur sélectionnable est de conférer une résistance à la sélection, et sa présence permet la croissance et la récupération de cellules qui expriment avec succès les séquences introduites. Les clones résistants des cellules transformées de façon stable peuvent être soumis à une prolifération en utilisant des techniques de culture tissulaire appropriées au type cellulaire.For long-term high yield production of recombinant proteins, stable expression is generally preferred. For example, cell lines that stably express a polynucleotide of interest can be transformed using expression vectors that can contain viral origins of replication and / or endogenous expression elements and a selectable marker gene on the same vector or on a separate vector. Following the introduction of the vector, the cells can be left to grow for 1 to 2 days in enriched medium before passing them to a selective medium. The objective of the selectable marker is to confer resistance to selection, and its presence allows the growth and recovery of cells that successfully express the introduced sequences. Resistant clones of stably transformed cells can be proliferated using tissue culture techniques appropriate to the cell type.

Un nombre quelconque de systèmes de sélection peuvent être utilisés pour récupérer des lignées cellulaires transformées. Ceux-ci comprennent, mais n'y sont pas limités, les gènes de la thymidine kinase du virus herpès simplex (Wigler et al., Cell 11: 223-32 (1977)) et de l'adénine phosphoribosyl-transférase (Lowy et al., Cell 22: 817-23 (1990)) qui peuvent être employés dans des cellules tk.sup. ou aprt.sup., respectivement. En outre, une résistance à des antimétabolites, des antibiotiques ou des herbicides peut être utilisée comme la base de la sélection ; par exemple, dhfr qui confère une résistance au méthotrexate (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77: 3567-70 (1980)) ; npt, qui confère une résistance aux aminoglycosides, néomycine et G-418 (Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150: 1-14 (1981)) ; et als ou pat, qui confèrent une résistance au chlorsulfuron et à la phosphinotricine acétyltransférase, respectivement (Murry, ci-dessus). D'autres gènes sélectionnables ont été décrits, par exemple, trpB, qui permet aux cellules d'utiliser l'indole à la place du tryptophane, ou hisD, qui permet aux cellules d'utiliser l'histinol à la place de l'histidine (Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 8047-51 (1988)). Récemment, l'utilisation de marqueurs visibles a gagné une certaine popularité avec des marqueurs tels que des anthocyanines, la β-glucuronidase et son substrat GUS, et la luciférase et son substrat la luciférine, étant largement utilisés non seulement pour identifier des transformants, mais également pour quantifier la quantité d'expression d'une protéine transitoire ou stable attribuable à un système de vecteur spécifique (Rhodes et al., Methods Mol. Biol. 55: 121-131 (1995)).Any number of selection systems can be used to recover transformed cell lines. These include, but are not limited to, herpes simplex virus thymidine kinase genes (Wigler et al., Cell 11: 223-32 (1977)) and adenine phosphoribosyl transferase (Lowy et al. al., Cell 22: 817-23 (1990)) which can be employed in tk.sup cells. or after, respectively. In addition, resistance to antimetabolites, antibiotics or herbicides can be used as the basis for selection; for example, dhfr which confers resistance to methotrexate (Wigler et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 77: 3567-70 (1980)); npt, which confers resistance to aminoglycosides, neomycin and G-418 (Colbere-Garapin et al., J. Mol Biol 150: 1-14 (1981)); and als or pat, which confer resistance to chlorsulfuron and phosphinotricin acetyltransferase, respectively (Murry, supra). Other selectable genes have been described, for example, trpB, which allows cells to use indole instead of tryptophan, or hisD, which allows cells to use histinol instead of histidine. (Hartman & Mulligan, Proc Natl Acad Sci USA 85: 8047-51 (1988)). Recently, the use of visible markers has gained some popularity with markers such as anthocyanins, β-glucuronidase and its substrate GUS, and luciferase and its substrate luciferin, being widely used not only to identify transformants but also to quantify the amount of expression of a transient or stable protein attributable to a specific vector system (Rhodes et al., Mol Mol Methods 55: 121-131 (1995)).

Bien que la présence/1'absence de l'expression du gène marqueur suggère que le gène d'intérêt est également présent, sa présence et son expression peuvent avoir à être confirmées. Par exemple, si la séquence codant pour un polypeptide est insérée au sein de la séquence d'un gène marqueur, les cellules recombinantes contenant des séquences peuvent être identifiées par l'absence de la fonction du gène marqueur. En variante, un gène marqueur peut être placé en tandem avec une séquence codant pour un polypeptide sous le contrôle d'un seul promoteur. L'expression du gène marqueur en réponse à une induction ou une sélection indique habituellement aussi bien l'expression du gène en tandem.Although the presence / absence of marker gene expression suggests that the gene of interest is also present, its presence and expression may need to be confirmed. For example, if the coding sequence for a polypeptide is inserted within the sequence of a marker gene, the recombinant cells containing sequences can be identified by the absence of marker gene function. Alternatively, a marker gene may be placed in tandem with a coding sequence for a polypeptide under the control of a single promoter. Expression of the marker gene in response to induction or selection usually indicates both gene expression in tandem.

En variante, les cellules hôtes qui contiennent et expriment une séquence polynucléotidique souhaitée peuvent être identifiées par diverses procédures connues de l'homme du métier. Ces procédures comprennent, mais n'y sont pas limitées, des hybridations ADN-ADN ou ADN-ARN et des techniques de dosages biologiques ou immunologiques de protéines qui comprennent des technologies basées sur des membranes, des solutions ou des puces pour la détection et/ou la quantification d'acides nucléiques ou de protéines.Alternatively, host cells that contain and express a desired polynucleotide sequence can be identified by various procedures known to those skilled in the art. These procedures include, but are not limited to, DNA-DNA or DNA-RNA hybridizations and biological or immunological protein assay techniques that include membrane-based technologies, solutions or chips for detection and / or or the quantification of nucleic acids or proteins.

Divers protocoles de détection et de mesure de l'expression de produits codés par des polynucléotides, utilisant des anticorps soit polyclonaux soit monoclonaux spécifiques du produit sont connus de l'état de l'art. Les exemples comprennent un test ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), un test radioimmunologique (RIA), et le tri des cellules activées par fluorescence (FACS). Un test immunologique basé sur des anticorps monoclonaux à deux sites utilisant des anticorps monoclonaux réactifs contre deux épitopes non interférant sur un polypeptide donné peut être préféré pour certaines applications, mais un test de liaison compétitive peut être également employé. Ces tests et d'autres sont décrits, entre autres, dans Hampton et al., Serological Methods, a Laboratory Manual (1990) et Maddox et al., J. Exp. Med. 158: 1211-1216 (1983).Various protocols for detecting and measuring the expression of products encoded by polynucleotides, using either polyclonal or monoclonal antibodies specific for the product, are known from the state of the art. Examples include enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), and fluorescence activated cell sorting (FACS). An immunoassay based on two-site monoclonal antibodies using monoclonal antibodies reactive against two non-interfering epitopes on a given polypeptide may be preferred for some applications, but a competitive binding assay may also be employed. These and other tests are described, inter alia, in Hampton et al., Serological Methods, Laboratory Manual (1990) and Maddox et al., J. Exp. Med. 158: 1211-1216 (1983).

Une large diversité de marqueurs et de techniques de conjugaison sont connus de l'homme du métier et peuvent être utilisés dans divers tests pour des acides nucléiques et des acides aminés. Les moyens de production de sondes d'hybridation ou de PCR marquées pour la détection de séquences apparentées à des polynucléotides comprennent l'oligomarquage, le déplacement de coupure, le marquage des extrémités ou l'amplification par PCR en utilisant un nucléotide marqué. En variante, les séquences, ou des parties quelconques de celles-ci, peuvent être clonées dans un vecteur pour la production d'une sonde d'ARNm. De tels vecteurs sont connus de l'état de l'art, sont disponibles dans le commerce, et peuvent être utilisés pour synthétiser des sondes d'ARN in vitro par l'addition d'une ARN polymérase appropriée telle que T7, T3, ou SP6 et des nucléotides marqués. Ces procédures peuvent être conduites en utilisant divers kits disponibles dans le commerce. Les molécules rapporteurs ou les marqueurs appropriés, qui peuvent être utilisés, comprennent des radionucléides, des enzymes, des agents fluorescents, chimioluminescents ou chromogènes ainsi que des substrats, des cofacteurs, des inhibiteurs, des particules magnétiques, et analogues.A wide variety of markers and conjugation techniques are known to those skilled in the art and can be used in various assays for nucleic acids and amino acids. The means for producing hybridization probes or labeled PCRs for the detection of polynucleotide-related sequences include oligolabeling, cleavage displacement, end labeling, or PCR amplification using a labeled nucleotide. Alternatively, the sequences, or any portions thereof, may be cloned into a vector for the production of an mRNA probe. Such vectors are known in the state of the art, are commercially available, and can be used to synthesize RNA probes in vitro by the addition of an appropriate RNA polymerase such as T7, T3, or SP6 and labeled nucleotides. These procedures can be conducted using various commercially available kits. Suitable reporter molecules or labels, which may be used, include radionuclides, enzymes, fluorescent, chemiluminescent or chromogenic agents as well as substrates, cofactors, inhibitors, magnetic particles, and the like.

Les cellules hôtes transformées avec une séquence polynucléotidique d'intérêt peuvent être cultivées dans des conditions appropriées pour l'expression et la récupération de la protéine à partir de la culture cellulaire. La protéine produite par une cellule recombinante peut être sécrétée ou contenue au niveau intracellulaire selon la séquence et/ou le vecteur utilisé. Comme le comprendra l'homme du métier, des vecteurs d'expression contenant des polynucléotides peuvent être conçus pour contenir des séquences signal qui dirigent la sécrétion du polypeptide codé à travers la membrane d'une cellule procaryote ou eucaryote. D'autres constructions recombinantes peuvent être utilisées pour joindre des séquences codant pour un polypeptide d'intérêt à une séquence nucléotidique codant pour un domaine de polypeptide qui facilitera la purification des protéines solubles. De tels domaines facilitant la purification comprennent, mais n'y sont pas limités, des peptides chélateurs de métaux tels que des modules histidine-tryptophane qui permettent la purification sur des métaux immobilisés, des domaines de protéine A qui permettent la purification sur des immunoglobulines immobilisées, et le domaine utilisé dans le système de purification par extension/affinité FLAGS (Immunex Corp., Seattle, Wash.). L'inclusion de séquences lieurs (« linker ») clivables telles que celles spécifiques du facteur XA ou de 1 ' entérokinase (Invitrogen. San Diego, Californie) entre le domaine de purification et le polypeptide codé peut être utilisée pour faciliter la purification. Un tel vecteur d'expression permet l'expression d'une protéine de fusion contenant un polypeptide d'intérêt et un acide nucléique codant pour 6 résidus d'histidine précédant un site de clivage de thiorédoxine ou d'entérokinase. Les résidus d'histidine facilitent la purification sur IMIAC (chromatographie d'affinité sur ions métalliques immobilisés) comme il est décrit dansHost cells transformed with a polynucleotide sequence of interest can be cultured under conditions suitable for expression and recovery of the protein from the cell culture. The protein produced by a recombinant cell can be secreted or contained intracellularly according to the sequence and / or the vector used. As will be understood by those skilled in the art, expression vectors containing polynucleotides may be designed to contain signal sequences that direct the secretion of the encoded polypeptide through the membrane of a prokaryotic or eukaryotic cell. Other recombinant constructs can be used to join sequences encoding a polypeptide of interest to a nucleotide sequence encoding a polypeptide domain that will facilitate the purification of soluble proteins. Such purification-facilitating domains include, but are not limited to, metal-chelating peptides such as histidine-tryptophan modules that allow purification on immobilized metals, protein A domains that allow purification on immobilized immunoglobulins. and the domain used in the FLAGS extension / affinity purification system (Immunex Corp., Seattle, Wash.). The inclusion of cleavable linker sequences such as those specific for factor XA or enterokinase (Invitrogen, San Diego, California) between the purification domain and the encoded polypeptide can be used to facilitate purification. Such an expression vector allows the expression of a fusion protein containing a polypeptide of interest and a nucleic acid encoding 6 histidine residues preceding a thioredoxin or enterokinase cleavage site. Histidine residues facilitate purification on IMIAC (immobilized metal ion affinity chromatography) as described in

Porath et al., Prot. Exp. Purif. 3: 263-281 (1992) alors que le site de clivage de 1'entérokinase fournit un moyen de purifier le polypeptide souhaité à partir de la protéine de fusion. Une discussion sur les vecteurs qui contiennent des protéines de fusion est fournie dans Kroll et al., DNA Cell Biol. 12: 441453 (1993)) .Porath et al., Prot. Exp. Purif. 3: 263-281 (1992) while the enterokinase cleavage site provides a means of purifying the desired polypeptide from the fusion protein. A discussion of vectors that contain fusion proteins is provided in Kroll et al., DNA Cell Biol. 12: 441453 (1993)).

COMPOSITIONS DE POLYPEPTIDESPOLYPEPTIDE COMPOSITIONS

En général, un polypeptide pour l'utilisation dont fait l'invention (par exemple, les protéines CDTa, CDTb, de toxine A et de toxine B de Clostridium difficile) sera un polypeptide isolé (c'est-à-dire, séparé de ces composants avec lesquels il peut être habituellement trouvé dans la nature).In general, a polypeptide for use in the invention (eg, CDTa, CDTb, toxin A, and Clostridium difficile toxin B proteins) will be an isolated polypeptide (i.e., separated from these components with which it can be usually found in nature).

Par exemple, une protéine existant à l'état naturel est isolée si elle est séparée de certains ou de la totalité des matériaux coexistants dans le système naturel. De préférence, de tels polypeptides sont au moins purs à environ 90 %, de manière davantage préférée au moins purs à environ 95 % et de manière préférée entre toutes au moins purs à environ 99 %. Un polynucléotide est considéré comme étant isolé si, par exemple, il est cloné dans un vecteur qui ne fait pas partie de l'environnement naturel.For example, a naturally occurring protein is isolated if it is separated from some or all of the coexisting materials in the natural system. Preferably, such polypeptides are at least about 90% pure, more preferably at least about 95% pure, and most preferably at least about 99% pure. A polynucleotide is considered isolated if, for example, it is cloned into a vector that is not part of the natural environment.

Les polypeptides peuvent être préparés en utilisant l'une quelconque de diverses techniques bien connues. Les polypeptides recombinants codés par des séquences d'ADN comme il a été décrit ci-dessus peuvent être facilement préparés à partir des séquences d'ADN en utilisant l'un quelconque de divers vecteurs d'expression connus de l'homme du métier. L'expression peut être obtenue dans une cellule hôte appropriée quelconque qui a été transformée ou transfectée avec un vecteur d'expression contenant une molécule d'ADN qui code pour un polypeptide recombinant. Les cellules hôtes appropriées comprennent des procaryotes, des levures, et des cellules eucaryotes supérieures, comme des cellules de mammifères et des cellules végétales. De préférence, les cellules hôtes employées sont E. coli, des levures ou une lignée cellulaire de mammifère comme COS ou CHO. Les surnageants provenant des systèmes hôte/vecteur appropriés qui sécrètent la protéine ou le polypeptide recombinant dans le milieu de culture peuvent être d'abord concentrés en utilisant un filtre disponible dans le commerce. A la suite de la concentration, le concentré peut être appliqué sur une matrice de purification appropriée comme une matrice d'affinité ou une résine échangeuses d'ions. Finalement, une ou plusieurs étapes de CLHP en phase inverse peuvent être employées pour encore purifier un polypeptide recombinant.The polypeptides can be prepared using any of a variety of well-known techniques. Recombinant polypeptides encoded by DNA sequences as described above can be readily prepared from the DNA sequences using any of a variety of expression vectors known to those skilled in the art. Expression may be obtained in any suitable host cell that has been transformed or transfected with an expression vector containing a DNA molecule that encodes a recombinant polypeptide. Suitable host cells include prokaryotes, yeasts, and higher eukaryotic cells, such as mammalian cells and plant cells. Preferably, the host cells employed are E. coli, yeast or a mammalian cell line such as COS or CHO. Supernatants from the appropriate host / vector systems that secrete the recombinant protein or polypeptide into the culture medium can be first concentrated using a commercially available filter. Following concentration, the concentrate may be applied to a suitable purification matrix such as an affinity matrix or an ion exchange resin. Finally, one or more reverse phase HPLC steps may be employed to further purify a recombinant polypeptide.

Les polypeptides pour une utilisation dans l'invention, leurs fragments immunogènes, et d'autres variants comportant moins d'environ 100 acides aminés, et généralement moins d'environ 50 acides aminés, peuvent être également produits par des moyens de synthèse, en utilisant des techniques bien connues de l'homme du métier. Par exemple, de tels polypeptides peuvent être synthétisés en utilisant l'une quelconque des techniques en phase solide disponibles dans le commerce, comme le procédé de synthèse sur phase solide de Merrifield, où des acides aminés sont ajoutés séquentiellement à une chaîne d'acides aminés croissante. Voir Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2146 (1963). L'appareillage pour la synthèse automatisée de polypeptides est disponible dans le commerce auprès de fournisseurs tels que Perkin Elmer/Applied BioSystems Division (Foster City, CA) , et il peut fonctionner selon les instructions du fabricant.The polypeptides for use in the invention, their immunogenic fragments, and other variants having less than about 100 amino acids, and generally less than about 50 amino acids, may also be produced by synthetic means, using techniques well known to those skilled in the art. For example, such polypeptides can be synthesized using any of the commercially available solid phase techniques, such as the Merrifield solid phase synthesis method, wherein amino acids are added sequentially to an amino acid chain growing. See Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2146 (1963). Apparatus for automated synthesis of polypeptides is commercially available from suppliers such as Perkin Elmer / Applied BioSystems Division (Foster City, CA), and can operate according to the manufacturer's instructions.

Au sein de certains modes de réalisation spécifiques, un polypeptide peut être une protéine de fusion qui comprend de multiples polypeptides tels que décrits ici, ou qui comprend au moins un polypeptide tel que décrit ici et une séquence non apparentée, des exemples de telles protéines comprenant des protéines du tétanos, de la tuberculose et de l'hépatite (voir, par exemple, Stoute et al., New Engl. J. Med. 336: 86-91 (1997)). Un partenaire de fusion peut, par exemple, aider à fournir des épitopes auxiliaires T (un partenaire de fusion immunologique), de préférence des épitopes auxiliaires T reconnus par les êtres humains, ou il peut aider à exprimer la protéine (un amplificateur d'expression) à des rendements supérieurs par rapport à la protéine recombinante native. Certains partenaires de fusion préférés sont des partenaires de fusion à la fois immunologiques et amplificateurs de l'expression. D'autres partenaires de fusion peuvent être choisis de façon à augmenter la solubilité de la protéine ou à permettre à la protéine d'être ciblée vers des compartiments intracellulaires souhaités. Encore d'autres partenaires de fusion comprennent des marqueurs d'affinité, qui facilitent la purification de la protéine.In certain specific embodiments, a polypeptide may be a fusion protein that comprises multiple polypeptides as described herein, or that comprises at least one polypeptide as described herein and an unrelated sequence, examples of such proteins comprising tetanus, tuberculosis and hepatitis proteins (see, for example, Stoute et al., New Engl J. Med 336: 86-91 (1997)). A fusion partner can, for example, help provide T helper epitopes (an immunological fusion partner), preferably T helper epitopes recognized by humans, or it can help express the protein (an expression enhancer ) at higher yields compared to the native recombinant protein. Some preferred fusion partners are both immunological and expression enhancer fusion partners. Other fusion partners may be chosen to increase the solubility of the protein or to allow the protein to be targeted to desired intracellular compartments. Still other fusion partners include affinity markers, which facilitate the purification of the protein.

Les protéines de fusion peuvent être généralement préparées en utilisant des techniques classiques, y compris une conjugaison chimique. De préférence, une protéine de fusion est exprimée sous la forme d'une protéine recombinante, permettant la production de taux accrus, par rapport à une protéine non fusionnée, dans un système d'expression. En bref, des séquences d'ADN codant pour les composants polypeptidiques peuvent être assemblées séparément, et ligaturées dans un vecteur d'expression approprié. L'extrémité 3' de la séquence d'ADN codant pour un composant polypeptidique est ligaturée, avec ou sans lieur (« linker ») peptidique, à l'extrémité 5' d'une séquence d'ADN codant pour le second composant polypeptidique de telle façon que les cadres de lecture des séquences sont en phase. Ceci permet la traduction en une seule protéine de fusion qui conserve l'activité biologique des deux composants polypeptidiques.Fusion proteins can be generally prepared using standard techniques, including chemical conjugation. Preferably, a fusion protein is expressed as a recombinant protein, allowing the production of increased levels, relative to an unfused protein, in an expression system. Briefly, DNA sequences encoding the polypeptide components can be assembled separately, and ligated into an appropriate expression vector. The 3 'end of the DNA sequence encoding a polypeptide component is ligated, with or without a peptide linker, to the 5' end of a DNA sequence encoding the second polypeptide component of the polypeptide. in such a way that the reading frames of the sequences are in phase. This allows translation into a single fusion protein that retains the biological activity of both polypeptide components.

Une séquence de lieur (« linker ») peptidique peut être employée pour séparer les premier et second composants polypeptidiques d'une distance suffisante pour s'assurer que chaque polypeptide se replie dans ses structures secondaire et tertiaire. Une telle séquence de lieur (« linker ») peptidique est incorporée dans la protéine de fusion en utilisant des techniques classiques bien connues de l'état de l'art. Des séquences de lieurs (« linker ») peptidiques appropriées peuvent être choisies en se basant sur les facteurs suivants : (1) leur capacité à adopter une conformation étendue flexible ; (2) leur incapacité à adopter une structure secondaire qui pourrait interagir avec des épitopes fonctionnels sur les premier et second polypeptides ; et (3) le manque de résidus hydrophobes ou chargés qui pourraient réagir avec les épitopes fonctionnels des polypeptides. Les séquences de lieurs (« linker ») peptidiques préférées contiennent des résidus Gly, Asn et Ser. D'autres acides aminés presque neutres, comme Thr et Ala, peuvent être également utilisés dans la séquence lieur(« linker ») . Les séquences d'acides aminés qui peuvent être employées utilement en tant que lieurs (« linker ») comprennent celles divulguées dans Maratea et al., Gene 40: 39-46 (1985) ; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8258-8262 (1986) ; brevet US No. 4 935 233 et brevet US No. 4 751 180. La séquence lieur (« linker ») peut généralement avoir une longueur de 1 à environ 50 acides aminés. Des séquences lieurs (« linker ») ne sont pas nécessaires lorsque les premier et second polypeptides comportent des régions d'acides aminés N-terminales non essentielles qui peuvent être utilisées pour séparer les domaines fonctionnels et prévenir les interférences stériques.A peptide linker sequence may be employed to separate the first and second polypeptide components a sufficient distance to ensure that each polypeptide folds into its secondary and tertiary structures. Such a peptide linker sequence is incorporated into the fusion protein using standard techniques well known in the art. Suitable peptide linker sequences may be selected based on the following factors: (1) their ability to adopt a flexible extended conformation; (2) their inability to adopt a secondary structure that could interact with functional epitopes on the first and second polypeptides; and (3) the lack of hydrophobic or charged residues that could react with the functional epitopes of the polypeptides. Preferred peptide linker sequences contain Gly, Asn and Ser residues. Other nearly neutral amino acids, such as Thr and Ala, may also be used in the linker sequence. Amino acid sequences that can be usefully employed as linkers include those disclosed in Maratea et al., Gene 40: 39-46 (1985); Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8258-8262 (1986); U.S. Patent No. 4,935,233 and U.S. Patent No. 4,751,180. The linker sequence can generally be from 1 to about 50 amino acids in length. Linker sequences are not needed when the first and second polypeptides have non-essential N-terminal amino acid regions that can be used to separate functional domains and prevent steric interference.

Adjuvantsadmixtures

Dans un autre mode de réalisation de l'un quelconque des aspects de l'invention, la composition immunogène comprend en outre un adjuvant. Dans un mode de réalisation, l'adjuvant comprend de 1'hydroxyde d'aluminium ou du phosphate d'aluminium. En variante, la composition immunogène de l'invention peut comprendre un adjuvant exempt d'aluminium, la composition immunogène est formulée avec un adjuvant qui est exempt d'aluminium ou de sels d'aluminium, c'est-à-dire, un adjuvant ou un système d'adjuvant exempt d'aluminium.In another embodiment of any aspect of the invention, the immunogenic composition further comprises an adjuvant. In one embodiment, the adjuvant comprises aluminum hydroxide or aluminum phosphate. Alternatively, the immunogenic composition of the invention may comprise an aluminum-free adjuvant, the immunogenic composition is formulated with an adjuvant that is free of aluminum or aluminum salts, i.e., an adjuvant or an aluminum-free adjuvant system.

Dans certains modes de réalisation, la composition immunogène est formulée avec un adjuvant comprenant une fraction de saponine immunologiquement active présentée sous la forme d'un liposome. L'adjuvant peut comprendre en outre un lipopolysaccharide. L'adjuvant peut comprendre du QS21. Par exemple, dans un mode de réalisation, l'adjuvant contient du QS21 dans une formulation liposomiale. Dans un mode de réalisation, le système d'adjuvant comprend du 3D-MPL et du QS21. Par exemple, dans un mode de réalisation, l'adjuvant contient du 3D-MPL et du QS21 dans une formulation liposomiale. Eventuellement, le système d'adjuvant contient également du cholestérol. Dans un mode de réalisation spécifique, l'adjuvant comprend du QS21 et du cholestérol. Eventuellement, le système d'adjuvant contient de la 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DOPC). Par exemple, un système d'adjuvant spécifique contient du cholestérol, de la DOPC, du 3D-MPL et du QS21.In some embodiments, the immunogenic composition is formulated with an adjuvant comprising an immunologically active saponin fraction presented as a liposome. The adjuvant may further comprise a lipopolysaccharide. The adjuvant may comprise QS21. For example, in one embodiment, the adjuvant contains QS21 in a liposomal formulation. In one embodiment, the adjuvant system comprises 3D-MPL and QS21. For example, in one embodiment, the adjuvant contains 3D-MPL and QS21 in a liposomal formulation. Optionally, the adjuvant system also contains cholesterol. In a specific embodiment, the adjuvant comprises QS21 and cholesterol. Optionally, the adjuvant system contains 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC). For example, a specific adjuvant system contains cholesterol, DOPC, 3D-MPL, and QS21.

Dans un exemple spécifique, la composition immunogène comprend un adjuvant formulé dans une dose qui comprend : d'environ 0,1 à environ 0,5 mg de cholestérol ; d'environ 0,25 à environ 2 mg de DOPC ; d'environ 10 pg à environ 100 pg de 3D-MPL ; et d'environ 10 pg à environ 100 pg de QS21. Dans un autre exemple spécifique, la composition immunogène comprend un adjuvant formulé dans une dose qui comprend : d'environ 0,1 à environ 0,5 mg de cholestérol ; d'environ 0,25 à environ 2 mg de DOPC ; d'environ 10 pg à environ 70 pg de 3D-MPL ; et d'environ 10 pg à environ 70 pg de QS21. Dans une formulation spécifique, l'adjuvant est formulé dans une seule dose qui contient : environ 0,25 mg de cholestérol ; environ 1,0 mg de DOPC ; environ 50 pg de 3D-MPL ; et environ 50 pg de QS21. Dans d'autres modes de réalisation, la composition immunogène est formulée avec une dose fractionnée (c'est-à-dire, une dose qui est une fraction des formulations à doses simples précédentes, comme une moitié de la quantité précédente des composants (cholestérol, DOPC, 3D-MPL et QS21), 1/4 de la quantité précédente des composants, ou une autre dose fractionnée (par exemple, 1/3, 1/6, etc.) de la quantité précédente des composants.In a specific example, the immunogenic composition comprises an adjuvant formulated in a dose that comprises: from about 0.1 to about 0.5 mg cholesterol; from about 0.25 to about 2 mg of DOPC; from about 10 μg to about 100 μg of 3D-MPL; and from about 10 μg to about 100 μg of QS21. In another specific example, the immunogenic composition comprises an adjuvant formulated in a dose that comprises: from about 0.1 to about 0.5 mg cholesterol; from about 0.25 to about 2 mg of DOPC; from about 10 μg to about 70 μg of 3D-MPL; and from about 10 μg to about 70 μg of QS21. In a specific formulation, the adjuvant is formulated in a single dose that contains: about 0.25 mg cholesterol; about 1.0 mg of DOPC; about 50 μg of 3D-MPL; and about 50 μg of QS21. In other embodiments, the immunogenic composition is formulated with a fractionated dose (i.e., a dose that is a fraction of the previous single dose formulations, such as one-half of the previous amount of the components (cholesterol , DOPC, 3D-MPL and QS21), 1/4 of the previous amount of the components, or another fractionated dose (e.g. 1/3, 1/6, etc.) of the previous amount of the components.

Dans un mode de réalisation, les compositions immunogènes selon l'invention comprennent un adjuvant contenant des combinaisons de lipopolysaccharide et de saponines de Quillaja qui ont été divulguées auparavant, par exemple dans le document EP 0671948. Ce brevet a démontré une forte synergie lorsqu'un lipopolysaccharide (3D-MPL) a été combiné avec une saponine de Quillaja (QS21). L'adjuvant peut comprendre en outre des oligonucléotides immunostimulants (par exemple, CpG) ou un support.In one embodiment, the immunogenic compositions according to the invention comprise an adjuvant containing combinations of lipopolysaccharide and Quillaja saponins which have been disclosed previously, for example in the document EP 0671948. This patent has demonstrated a strong synergy when Lipopolysaccharide (3D-MPL) was combined with a Quillaja saponin (QS21). The adjuvant may further comprise immunostimulatory oligonucleotides (eg, CpG) or a carrier.

Une saponine particulièrement appropriée pour une utilisation dans la présente invention est Quil A et ses dérivés. Quil A est une préparation de saponine isolée de l'arbre d'Amérique du Sud Quillaja Saponaria Molina et elle a été décrite pour la première fois par Dalsgaard et al. en 1974 ("Saponin adjuvants", Archiv. für die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p243-254) comme étant dotée d'une activité d'adjuvant. Il a été isolé de Quil A par CLHP des fragments purifiés qui conservent l'activité d'adjuvant sans la toxicité associée à Quil A (EP 0 362 278), par exemple QS7 et QS21 (également connus en tant que QA7 et QA21) . QS21 est une saponine naturelle dérivée de l'écorce de Quillaja saponaria Molina, qui induit les lymphocytes T cytotoxiques CD8+ (LTC), les cellules Thl et une réponse prédominante en anticorps IgG2a et elle représente une saponine préférée dans le contexte de la présente invention.A particularly suitable saponin for use in the present invention is Quil A and its derivatives. Quil A is a saponin preparation isolated from the South American tree Quillaja Saponaria Molina and has been described for the first time by Dalsgaard et al. in 1974 ("Saponin adjuvants", Archiv für die gesamte Virusforschung, Vol 44, Springer Verlag, Berlin, p243-254) as having an adjuvant activity. Quil A was isolated by HPLC from purified fragments which retain adjuvant activity without Quil A-associated toxicity (EP 0 362 278), for example QS7 and QS21 (also known as QA7 and QA21). QS21 is a natural saponin derived from the bark of Quillaja saponaria Molina, which induces CD8 + cytotoxic T lymphocytes (CTLs), Th1 cells and a predominant IgG2a antibody response and is a preferred saponin in the context of the present invention.

Lorsque l'adjuvant comprend une fraction de saponine immunologiquement active présentée sous la forme d'un liposome, l'adjuvant peut comprendre en outre un stérol. De façon appropriée, le stérol est fourni dans un rapport de saponine/stérol de 1/1 à 1/100 p/p, comme de 1/1 à 1/10 p/p ; ou 1/1 à 1/5 p/p.When the adjuvant comprises an immunologically active saponin fraction presented in the form of a liposome, the adjuvant may further comprise a sterol. Suitably, the sterol is provided in a ratio of saponin / sterol of 1/1 to 1/100 w / w, such as 1/1 to 1/10 w / w; or 1/1 to 1/5 p / p.

Dans un mode de réalisation spécifique, QS21 est fourni dans sa composition la moins réactogène où il est neutralisé par un stérol exogène, comme le cholestérol par exemple. Il existe plusieurs formes particulières de compositions moins réactogènes dans lesquelles QS21 est neutralisé par un cholestérol exogène. Dans un mode de réalisation spécifique, la saponine/stérol est sous la forme d'une structure liposomiale (WO 96/33739, exemple 1) . Dans ce mode de réalisation, les liposomes contiennent de façon appropriée un lipide neutre, par exemple la phosphatidylcholine, qui est de façon appropriée non cristalline à température ambiante, par exemple la phosphatidylcholine de jaune d'œuf, la dioléoyl-phosphatidylcholine (DOPC) ou la dilauryl-phosphatidylcholine. Les liposomes peuvent également contenir un lipide chargé qui augmente la stabilité de la structure liposome-QS21 pour des liposomes composés de lipides saturés. Dans ces cas, la quantité de lipide chargé est de façon appropriée de 1 à 20 % p/p, de préférence 5 à 10 %. Le rapport du stérol sur le phospholipide est de 1 à 50 % (mol/mol) , de façon appropriée 20 à 25 %.In a specific embodiment, QS21 is provided in its least reactogenic composition where it is neutralized by an exogenous sterol, such as cholesterol for example. There are several particular forms of less reactogenic compositions in which QS21 is neutralized by exogenous cholesterol. In a specific embodiment, the saponin / sterol is in the form of a liposomal structure (WO 96/33739, Example 1). In this embodiment, the liposomes suitably contain a neutral lipid, for example phosphatidylcholine, which is suitably non-crystalline at room temperature, for example egg yolk phosphatidylcholine, dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) or dilauryl-phosphatidylcholine. The liposomes may also contain a charged lipid which enhances the stability of the liposome-QS21 structure for liposomes composed of saturated lipids. In these cases, the amount of lipid loaded is suitably 1 to 20% w / w, preferably 5 to 10%. The ratio of sterol to phospholipid is 1 to 50% (mol / mol), suitably 20 to 25%.

Les stérols appropriés comprennent le β-sitostérol, le stigmastérol, 1'ergostérol, 1'ergocalciférol et le cholestérol. Dans un mode de réalisation particulier, la composition de l'adjuvant comprend du cholestérol en tant que stérol. Ces stérols sont bien connus de l'état de l'art, par exemple le cholestérol est divulgué dans l'Index Merck, llème édition, page 341, comme un stérol existant à l'état naturel trouvé dans la graisse animale.Suitable sterols include β-sitosterol, stigmasterol, ergosterol, ergocalciferol and cholesterol. In a particular embodiment, the composition of the adjuvant comprises cholesterol as sterol. These sterols are well known in the state of the art, for example cholesterol is disclosed in the Merck Index, 11th Edition, page 341, as a naturally occurring sterol found in animal fat.

Lorsque la fraction de saponine active est QS21, le rapport du QS21/stérol sera généralement de l'ordre de 1/100 à 1/1 (p/p), de façon appropriée entre 1/10 et 1/1 (p/p) , et de préférence 1/5 à 1/1 (p/p) . De façon appropriée, un excès de stérol est présent, le rapport du QS21/stérol étant au moins de 1/2 (p/p). Dans un mode de réalisation, le rapport du QS21/stérol est de 1/5 (p/p). Le stérol est de façon appropriée du cholestérol.When the active saponin fraction is QS21, the ratio of QS21 / sterol will generally be in the range of 1/100 to 1/1 (w / w), suitably 1/10 to 1/1 (w / w) ), and preferably 1/5 to 1/1 (w / w). Suitably, an excess of sterol is present, the ratio of QS21 / sterol being at least 1/2 (w / w). In one embodiment, the ratio of QS21 / sterol is 1/5 (w / w). Sterol is appropriately cholesterol.

Dans un mode de réalisation, l'invention fournit une dose d'une composition immunogène comprenant de la saponine immunologiquement active, de préférence du QS21, à un taux d'environ 1 à environ 70 pg par dose, par exemple dans une quantité d'environ 50 pg.In one embodiment, the invention provides a dose of an immunogenic composition comprising immunologically active saponin, preferably QS21, at a level of about 1 to about 70 μg per dose, for example in an amount of about 50 pg.

Dans un mode de réalisation, l'invention propose une dose d'une composition immunogène comprenant de la saponine immunologiquement active, de préférence du QS21, à un taux de 60 pg ou inférieur, par exemple entre 1 et 60 pg. Dans un mode de réalisation, la dose de la composition immunogène comprend du QS21 à un taux approximativement autour de 50 pg, par exemple entre 45 et 55 pg, de façon appropriée entre 46 et 54 pg ou entre 47 et 53 pg ou entre 48 et 52 pg ou entre 49 et 51 pg, ou 50 pg.In one embodiment, the invention provides a dose of an immunogenic composition comprising immunologically active saponin, preferably QS21, at a level of 60 μg or lower, for example between 1 and 60 μg. In one embodiment, the dose of the immunogenic composition comprises QS21 at a rate of approximately around 50 μg, for example between 45 and 55 μg, suitably between 46 and 54 μg or between 47 and 53 μg or between 48 and 52 μg or between 49 and 51 μg, or 50 μg.

Dans un autre mode de réalisation, la dose de la composition immunogène comprend du QS21 à un taux autour de 25 pg, par exemple entre 20 et 30 pg, de façon appropriée entre 21 et 29 pg . ou entre 22 et 28 pg ou entre 23 et 27 pg ou entre 24 et 26 pg, ou 25 pg.In another embodiment, the dose of the immunogenic composition comprises QS21 at a level around 25 μg, for example between 20 and 30 μg, suitably between 21 and 29 μg. or between 22 and 28 pg or between 23 and 27 pg or between 24 and 26 pg, or 25 pg.

Dans un autre mode de réalisation, la dose de la composition immunogène comprend du QS21 à un taux autour de 10 pg, par exemple entre 5 et 15 pg, de façon appropriée entre 6 et 14 pg, par exemple entre 7 et 13 pg ou entre 8 et 12 pg ou entre 9 et 11 pg, ou 10 pg.In another embodiment, the dose of the immunogenic composition comprises QS21 at a level around 10 μg, for example between 5 and 15 μg, suitably between 6 and 14 μg, for example between 7 and 13 μg or between 8 and 12 μg or between 9 and 11 μg, or 10 μg.

De façon spécifique, un volume de dose vaccinale de 0,5 ml contient 25 pg ou 50 pg de QS21 par dose. De façon spécifique, un volume de dose vaccinale de 0,5 ml contient 50 pg de QS21 par dose.Specifically, a 0.5 ml vaccine dose volume contains 25 μg or 50 μg of QS21 per dose. Specifically, a 0.5 ml vaccine dose volume contains 50 μg of QS21 per dose.

Dans des compositions comprenant un lipopolysaccharide, le lipopolysaccharide peut être présent dans une quantité d'environ 1 à environ 70 pg par dose, par exemple dans une quantité d'environ 50 pg.In compositions comprising a lipopolysaccharide, the lipopolysaccharide may be present in an amount of from about 1 to about 70 μg per dose, for example in an amount of about 50 μg.

Le lipopolysaccharide peut être un dérivé non toxique du lipide A, particulièrement le monophosphoryl-lipide A ou plus particulièrement le monophosphoryl-lipide A 3-désacylé (3D-MPL).The lipopolysaccharide may be a nontoxic derivative of lipid A, particularly monophosphoryl lipid A or more particularly monophosphoryl lipid A 3-deacylated (3D-MPL).

Le 3D-MPL est vendu sous le nom de MPL par GlaxoSmithKline Biologicals S.A. et il est fait référence à ce dernier par MPL ou 3D-MPL. Voir, par exemple, les brevets US No. 4 436 727 ; 4 877 611 ; 4 866 034 et 4 912 094. Le 3D-MPL favorise principalement les réponses des lymphocytes T CD4+ avec un phénotype IFN-γ (Thl). Le 3D-MPL peut être produit selon les procédés divulgués dans le document GB 2 220 211 A. Du point de vue chimique, il s'agit d'un mélange de monophosphoryl-lipide A 3-désacylé avec 3, 4, 5 ou 6 chaînes acylées. De préférence, dans les compositions de la présente invention, du 3D-MPL à petites particules est utilisé. Le 3D-MPL à petites particules a une taille de particule telle qu'il peut être stérilisé par filtration à travers un filtre de 0,22 μιη. De telles préparations sont décrites dans le document WO 94/21292.3D-MPL is sold under the name of MPL by GlaxoSmithKline Biologicals S.A. and reference is made to it by MPL or 3D-MPL. See, for example, U.S. Patent Nos. 4,436,727; 4,877,611; 4,866,034 and 4,912,094. 3D-MPL primarily promotes CD4 + T cell responses with an IFN-γ (Th1) phenotype. 3D-MPL can be produced according to the methods disclosed in GB 2 220 211 A. From the chemical point of view, it is a mixture of monophosphoryl lipid A 3-deacylated with 3, 4, 5 or 6 acylated chains. Preferably, in the compositions of the present invention, small particle 3D-MPL is used. The small particle 3D-MPL has a particle size such that it can be sterilized by filtration through a 0.22 μιη filter. Such preparations are described in WO 94/21292.

Par conséquent, l'invention fournit une dose d'une composition immunogène comprenant du lipopolysaccharide, de préférence le 3D-MPL, à un taux de 75 pg ou inférieur, par exemple entre 1 et 60 pg.Therefore, the invention provides a dose of an immunogenic composition comprising lipopolysaccharide, preferably 3D-MPL, at a level of 75 μg or lower, for example between 1 and 60 μg.

Dans un mode de réalisation, la dose de la composition immunogène comprend du 3D-MPL à un taux autour de 50 pg, par exemple entre 45 et 55 pg, de façon appropriée entre 46 et 54 pg ou entre 47 et 53 pg ou entre 48 et 52 pg ou entre 49 et 51 pg, ou 50 pg.In one embodiment, the dose of the immunogenic composition comprises 3D-MPL at a rate around 50 μg, for example between 45 and 55 μg, suitably between 46 and 54 μg or between 47 and 53 μg or between 48 and 50 μg. and 52 μg or between 49 and 51 μg, or 50 μg.

Dans un mode de réalisation, la dose de la composition immunogène comprend du 3D-MPL à un taux autour de 25 pg, par exemple entre 20 et 30 pg, de façon appropriée entre 21 et 29 pg ou entre 22 et 28 pg ou entre 23 et 27 pg ou entre 24 et 26 pg, ou 25 pg.In one embodiment, the dose of the immunogenic composition comprises 3D-MPL at a rate of around 25 μg, for example between 20 and 30 μg, suitably between 21 and 29 μg or between 22 and 28 μg or between 23 and 25 μg. and 27 μg or between 24 and 26 μg, or 25 μg.

Dans un autre mode de réalisation, la dose de la composition immunogène comprend du 3D-MPL à un taux autour de 10 pg, par exemple entre 5 et 15 pg, de façon appropriée entre 6 et 14 pg, par exemple entre 7 et 13 pg ou entre 8'et 12 pg ou entre 9 et 11 pg, ou 10 pg.In another embodiment, the dose of the immunogenic composition comprises 3D-MPL at a level around 10 μg, for example between 5 and 15 μg, suitably between 6 and 14 μg, for example between 7 and 13 μg. or between 8 and 12 pg or between 9 and 11 pg, or 10 pg.

Dans un mode de réalisation, le volume de la dose est de 0,5 ml. Dans un autre mode de réalisation, la composition immunogène est dans un volume approprié pour une dose dont le volume est supérieur à 0,5 ml, par exemple 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1 ml. Dans un autre mode de réalisation, la dose humaine- est située entre 1 ml et 1,5 ml.In one embodiment, the dose volume is 0.5 ml. In another embodiment, the immunogenic composition is in a volume suitable for a dose having a volume greater than 0.5 ml, for example 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 or 1 ml. In another embodiment, the human dose is between 1 ml and 1.5 ml.

De façon spécifique, un volume de dose vaccinale de 0,5 ml contient 25 pg ou 50 pg de 3D-MPL par dose. De façon spécifique, un volume de dose vaccinale de 0,5 ml contient 50 pg de 3D-MPL par dose.Specifically, a 0.5 ml vaccine dose volume contains 25 μg or 50 μg of 3D-MPL per dose. Specifically, a 0.5 ml vaccine dose volume contains 50 μg of 3D-MPL per dose.

La dose de la composition immunogène selon un aspect quelconque de l'invention se rapporte de façon appropriée à une dose humaine. Par le terme « dose humaine », il est signifié une dose qui est dans un volume approprié pour un usage humain. De façon générale, celle-ci se situe entre 0,3 et 1,5 ml. Dans un mode de réalisation, une dose humaine est de 0,5 ml. Dans un autre mode de réalisation, une dose humaine est supérieure à 0,5 ml, par exemple 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1 ml. Dans un autre mode de réalisation, une dose humaine se situe entre 1 ml et 1,5 ml.The dose of the immunogenic composition according to any aspect of the invention is suitably related to a human dose. By the term "human dose" is meant a dose that is in a volume suitable for human use. In general, this is between 0.3 and 1.5 ml. In one embodiment, a human dose is 0.5 ml. In another embodiment, a human dose is greater than 0.5 ml, for example 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 or 1 ml. In another embodiment, a human dose is between 1 ml and 1.5 ml.

Les compositions appropriées de l'invention sont celles dans lesquelles des liposomes sont préparés initialement sans MPL (comme il est décrit dans le document WO 96/33739) , et le MPL est ensuite ajouté, de façon appropriée sous la forme de petites particules de moins de 100 nm ou des particules susceptibles d'être soumises à une stérilisation par filtration à travers une membrane de 0,22 pm. Par conséquent, le MPL n'est pas contenu au sein de la membrane vésiculaire (connu comme le MPL à l'extérieur). Les compositions dans lesquelles le MPL est contenu au sein de la membrane vésiculaire (connu comme le MPL à l'intérieur) forment également un aspect de l'invention. Le polypeptide comprenant un fragment de la toxine A de C. difficile et/ou un fragment de la toxine B de C. difficile peut être contenu au sein de la membrane vésiculaire ou contenu à l'extérieur de la membrane vésiculaire.Suitable compositions of the invention are those in which liposomes are initially prepared without MPL (as described in WO 96/33739), and the MPL is then suitably added in the form of small particles less 100 nm or particles capable of being sterilized by filtration through a 0.22 μm membrane. Therefore, MPL is not contained within the vesicular membrane (known as the MPL on the outside). Compositions in which MPL is contained within the vesicular membrane (known as MPL on the inside) also form one aspect of the invention. The polypeptide comprising a fragment of C. difficile toxin A and / or a C. difficile toxin B fragment may be contained within the vesicular membrane or contained outside the vesicular membrane.

Dans un mode de réalisation spécifique, le QS21 et le 3D-MPL sont présents dans la même concentration finale par dose de la composition immunogène, c'est-à-dire que le rapport du QS21/3D-MPL est de 1/1. Dans un aspect de ce mode de réalisation, une dose de composition immunogène comprend un taux final de 25 pg de 3D-MPL et de 25 pg de QS21 ou de 50 pg de 3D-MPL et de 50 pg de QS21.In a specific embodiment, QS21 and 3D-MPL are present in the same final concentration per dose of the immunogenic composition, i.e. the ratio of QS21 / 3D-MPL is 1/1. In one aspect of this embodiment, a dose of immunogenic composition comprises a final level of 25 μg 3D-MPL and 25 μg QS21 or 50 μg 3D-MPL and 50 μg QS21.

Dans un mode de réalisation, l'adjuvant comprend une émulsion huile dans l'eau. Dans un mode de réalisation, l'adjuvant comprend une émulsion huile dans l'eau, où l'émulsion huile dans l'eau comprend une huile métabolisable, un tocol et un émulsifiant. Par exemple, l'émulsion huile dans l'eau peut comprendre une phase huileuse qui incorpore une huile métabolisable, et un composant supplémentaire de la phase huileuse, comme un tocol. L'émulsion huile dans l'eau peut également contenir un composant aqueux, comme une solution saline tamponnée (par exemple, la solution tampon phosphate). En outre, l'émulsion huile dans l'eau contient généralement un émulsifiant. Dans un mode de réalisation, l'huile métabolisable est le squalène. Dans un mode de réalisation, le tocol est 1'alpha-tocophérol. Dans un mode de réalisation, l'émulsifiant est un émulsifiant tensioactif non ionique (comme le monooléate de polyoxyéthylène sorbitane, Polysorbate® 80, TWEEN80™). Dans des exemples de modes de réalisation, l'émulsion huile dans l'eau contient du squalène et de 1'alpha-tocophérol dans un rapport qui est égal ou inférieur à 1 (p/p). L'huile métabolisable dans l'émulsion huile dans l'eau peut être présente dans une quantité de 0,5 à 10 mg. Le tocol dans l'émulsion huile dans l'eau peut être présent dans une quantité de 0,5 à 11 mg. L'agent émulsifiant peut être présent dans une quantité de 0,4 à 4 mg.In one embodiment, the adjuvant comprises an oil-in-water emulsion. In one embodiment, the adjuvant comprises an oil-in-water emulsion, wherein the oil-in-water emulsion comprises a metabolizable oil, a tocol, and an emulsifier. For example, the oil-in-water emulsion may include an oily phase that incorporates a metabolizable oil, and an additional component of the oily phase, such as a tocol. The oil-in-water emulsion may also contain an aqueous component, such as buffered saline (e.g., phosphate buffer solution). In addition, the oil-in-water emulsion generally contains an emulsifier. In one embodiment, the metabolizable oil is squalene. In one embodiment, the tocol is alpha-tocopherol. In one embodiment, the emulsifier is a nonionic surfactant emulsifier (such as polyoxyethylene sorbitan monooleate, Polysorbate® 80, TWEEN80 ™). In exemplary embodiments, the oil-in-water emulsion contains squalene and alpha-tocopherol in a ratio that is equal to or less than 1 (w / w). The metabolizable oil in the oil-in-water emulsion can be present in an amount of 0.5 to 10 mg. The tocol in the oil-in-water emulsion may be present in an amount of 0.5 to 11 mg. The emulsifying agent may be present in an amount of 0.4 to 4 mg.

Pour qu'une composition huile dans l'eau quelconque soit appropriée pour une administration à un être humain, la phase huileuse du système de l'émulsion doit comprendre une huile métabolisable. La signification du terme huile métabolisable est bien connue de l'état de l'art. Métabolisable peut être défini comme « pouvant être transformé par le métabolisme » (Dorland's Illustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company, 25th édition (1974)). L'huile peut être toute huile végétale, huile de poisson, huile animale ou huile de synthèse, qui n'est pas toxique envers le receveur et qui peut être transformée par le métabolisme. Les noix, les graines, et les grains sont des sources communes d'huiles végétales. Les huiles de synthèse font également partie de cette invention et peuvent comprendre des huiles disponibles dans le commerce comme NEOBEE® (triglycérides capryliques/capriques fabriqués en utilisant du glycérol provenant de sources d'huiles végétales et d'acides gras à chaîne moyenne (MCT) provenant des huiles de noix de coco ou huile de palme) et d'autres. Une huile métabolisable particulièrement appropriée est le squalène. Le squalène (2,6,10,15,19,23-hexaméthyl-2,6,10,14,18,22-tétracôsahexaène) est une huile insaturée qui se trouve dans de grandes quantités dans l'huile de foie de requin, et dans des quantités inférieures dans l'huile d'olive, l'huile de germe de blé, l'huile de son de riz, et les levures, et elle est une huile particulièrement préférée pour une utilisation dans cette invention. Le squalène est une huile métabolisable en vertu du fait qu'il est un intermédiaire dans la biosynthèse du cholestérol (Index Merck index, lOème Edition, entrée no. 8619).In order for any oil-in-water composition to be suitable for administration to a human, the oily phase of the emulsion system must include a metabolizable oil. The meaning of the term metabolizable oil is well known in the state of the art. Metabolizable can be defined as "metabolizable by metabolism" (Dorland's Illustrated Medical Dictionary, W. B. Sanders Company, 25th edition (1974)). The oil can be any vegetable oil, fish oil, animal oil or synthetic oil, which is not toxic to the recipient and can be metabolized. Nuts, seeds, and grains are common sources of vegetable oils. Synthetic oils are also part of this invention and may include commercially available oils such as NEOBEE® (caprylic / capric triglycerides made using glycerol from vegetable oil sources and medium chain fatty acids (MCT). from coconut oils or palm oil) and others. A particularly suitable metabolizable oil is squalene. Squalene (2,6,10,15,19,23-hexamethyl-2,6,10,14,18,22-tetracoshehexaene) is an unsaturated oil found in large amounts in shark liver oil and in lower amounts in olive oil, wheat germ oil, rice bran oil, and yeasts, and is a particularly preferred oil for use in this invention. Squalene is a metabolizable oil because it is an intermediate in the biosynthesis of cholesterol (Index Merck Index, 10th Edition, entry No. 8619).

De façon appropriée, l'huile métabolisable est présente dans la composition de l'adjuvant dans une quantité de 0,5 à 10 mg, de préférence 1 à 10, 2 à 10, 3 à 9, 4 à 8, 5 à 7, ou 5 à 6 mg (par exemple 2 à 3, 5 à 6, ou 9 à 10 mg) , de façon spécifique environ 5,35 mg ou environ 2,14 mg par dose.Suitably, the metabolizable oil is present in the adjuvant composition in an amount of 0.5 to 10 mg, preferably 1 to 10, 2 to 10, 3 to 9, 4 to 8.5 to 7, or 5 to 6 mg (eg 2 to 3, 5 to 6, or 9 to 10 mg), typically about 5.35 mg or about 2.14 mg per dose.

Les tocols sont bien connus de l'état de l'art et sont décrits dans le document EP 0382271. De façon appropriée, le tocol est . 1'alpha-tocophérol ou l'un de ses dérivés comme le succinate d'alpha-tocophérol (également connu sous le nom de succinate de vitamine E). Ledit tocol est de façon appropriée présent dans une quantité de 0,5 à 11 mg, de préférence 1 à 11, 2 à 10, 3 à 9, 4à8, 5à7, 5à6mg (par exemple 10 à 11, 5 à 6, 2,5 à 3,5 ou 1 à 3 mg) . Dans un mode de réalisation spécifique, le tocol est présent dans une quantité d'environ 5,94 mg ou environ 2,38 mg par dose. L'émulsion huile dans l'eau comprend en outre un agent émulsifiant. L'agent émulsifiant peut être de façon appropriée du monooléate de polyoxyéthylène sorbitane. Dans un mode de réalisation particulier, l'agent émulsifiant peut être leThe tocols are well known in the state of the art and are described in EP 0382271. Suitably, the tocol is. Alpha-tocopherol or a derivative thereof such as alpha-tocopherol succinate (also known as vitamin E succinate). Said tocol is suitably present in an amount of 0.5 to 11 mg, preferably 1 to 11, 2 to 10, 3 to 9, 4 to 8.5 to 7.5 to 6 mg (for example 10 to 11, 5 to 6, 2, 5 to 3.5 or 1 to 3 mg). In a specific embodiment, the tocol is present in an amount of about 5.94 mg or about 2.38 mg per dose. The oil-in-water emulsion further comprises an emulsifying agent. The emulsifier may suitably be polyoxyethylene sorbitan monooleate. In a particular embodiment, the emulsifying agent may be the

Polysorbate® 80 (monooléate de polyoxyéthylène (20) sorbitane) ou le Tween® 80.Polysorbate® 80 (polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate) or Tween® 80.

Ledit agent émulsifiant est présent de façon appropriée dans la composition de l'adjuvant dans une quantité de 0,1 à 5, 0,2 à 5, 0,3 à 4, 0,4 à 3 ou 2 à 3 mg (par exemple 0,4 à 1,2, 2 à 3 ou 4 à 5 mg) d'agent émulsifiant. Dans un mode de réalisation spécifique, l'agent émulsifiant est présent dans une quantité d'environ 0,97 mg ou environ 2,425 mg.Said emulsifying agent is suitably present in the composition of the adjuvant in an amount of 0.1 to 5, 0.2 to 5, 0.3 to 4, 0.4 to 3 or 2 to 3 mg (e.g. 0.4 to 1.2, 2 to 3 or 4 to 5 mg) of emulsifier. In a specific embodiment, the emulsifier is present in an amount of about 0.97 mg or about 2.425 mg.

Dans un mode de réalisation, les quantités des composants spécifiques présents dans la composition sont les quantités présentes dans une dose humaine de 0,5 ml. Dans un autre mode de réalisation, la composition immunogène est dans un volume approprié pour une dose humaine, lequel volume est supérieur à 0,5 ml, par exemple 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1 ml. Dans un autre mode de réalisation, la dose humaine se situe entre 1 ml et 1,5 ml.In one embodiment, the amounts of the specific components present in the composition are the amounts present in a human dose of 0.5 ml. In another embodiment, the immunogenic composition is in a volume suitable for a human dose, which volume is greater than 0.5 ml, for example 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 or 1 ml. . In another embodiment, the human dose is between 1 ml and 1.5 ml.

Lorsque l'adjuvant est sous une forme liquide et qu'il doit être combiné à une forme liquide d'une composition polypeptidique, la composition de l'adjuvant dans une dose humaine sera une fraction du volume final prévu de la dose humaine, par exemple approximativement la moitié du volume final prévu de la dose humaine, par exemple un volume de 350 μΐ pour une dose humaine prévue de 0,7 ml, ou un volume de 250 μΐ pour une dose humaine prévue de 0,5 ml. La composition de l'adjuvant est diluée lorsqu'elle est combinée avec la composition de l'antigène polypeptidique pour fournir la dose humaine finale du vaccin. Le volume final d'une telle dose dépendra naturellement du volume initial de la composition de l'adjuvant et du volume de la composition de l'antigène polypeptidique ajoutée à la composition de l'adjuvant. Dans une variante de mode de réalisation, un adjuvant liquide est utilisé pour reconstituer une composition polypeptidique lyophilisée. Dans ce mode de réalisation, la dose humaine de la composition de l'adjuvant est approximativement égale au volume final de la dose humaine. La composition de l'adjuvant liquide est ajoutée au flacon contenant la composition polypeptidique lyophilisée. La dose humaine finale peut varier entre 0,5 et 1,5 ml.When the adjuvant is in liquid form and is to be combined with a liquid form of a polypeptide composition, the composition of the adjuvant in a human dose will be a fraction of the expected final volume of the human dose, for example approximately half of the expected final volume of the human dose, for example a volume of 350 μΐ for a predicted human dose of 0.7 ml, or a volume of 250 μΐ for a predicted human dose of 0.5 ml. The composition of the adjuvant is diluted when combined with the composition of the polypeptide antigen to provide the final human dose of the vaccine. The final volume of such a dose will naturally depend on the initial volume of the adjuvant composition and the volume of the composition of the polypeptide antigen added to the adjuvant composition. In an alternative embodiment, a liquid adjuvant is used to reconstitute a freeze-dried polypeptide composition. In this embodiment, the human dose of the adjuvant composition is approximately equal to the final volume of the human dose. The composition of the liquid adjuvant is added to the vial containing the freeze-dried polypeptide composition. The final human dose may vary between 0.5 and 1.5 ml.

Le procédé de production d'émulsions huile dans l'eau est bien connu de l'homme du métier. De façon courante, le procédé comprend le mélange de la phase huileuse contenant le tocol avec un tensioactif comme une solution de PBS/monooléate de polyoxyéthylène sorbitane, suivi d'une homogénéisation en utilisant un homogénéiseur. Il sera clair pour l'homme du métier qu'un procédé comprenant le passage du mélange deux fois à travers une aiguille de seringue sera approprié pour homogénéiser des petits volumes de liquide. Egalement, le procédé d'émulsification dans un microfluidiseur (machine M110S Microfluidics, maximum de 50 passages, pendant une période de 2 minutes à une pression maximale d'entrée de 6 bars (pression de sortie d'environ 850 bars)) pourra être adapté par l'homme du métier pour produire des volumes inférieurs ou supérieurs d'émulsions. L'adaptation pourra être obtenue par une expérimentation de routine comprenant la mesure de l'émulsion résultante jusqu'à l'obtention d'une préparation avec des gouttelettes d'huile du diamètre requis.The process for producing oil-in-water emulsions is well known to those skilled in the art. Commonly, the process comprises mixing the oily phase containing the tocol with a surfactant such as a PBS / polyoxyethylene sorbitan monooleate solution followed by homogenization using a homogenizer. It will be clear to those skilled in the art that a process comprising passing the mixture through a syringe needle twice will be suitable for homogenizing small volumes of liquid. Also, the emulsification process in a microfluidizer (machine M110S Microfluidics, maximum of 50 passages, for a period of 2 minutes at a maximum inlet pressure of 6 bar (outlet pressure of about 850 bar)) can be adapted by those skilled in the art to produce lower or higher volumes of emulsions. The adaptation may be obtained by routine experimentation including measuring the resulting emulsion until a preparation with oil droplets of the required diameter is obtained.

Dans une émulsion huile dans l'eau, l'huile et l'émulsifiant devront être dans un support aqueux. Le support aqueux peut être, par exemple, de la solution tampon phosphate.In an oil-in-water emulsion, the oil and the emulsifier should be in an aqueous carrier. The aqueous carrier may be, for example, phosphate buffer solution.

De préférence, les systèmes d'émulsion huile dans l'eau de la présente invention présentent une petite taille de gouttelettes d'huile située dans la plage submicronique. De façon appropriée, les tailles des gouttelettes se situeront dans la plage de 120 à 750 nm, de manière davantage préférée des tailles de 120 à 600 nm de diamètre. De manière préférée entre toutes, l'émulsion huile dans l'eau contient des gouttelettes d'huile dont au moins 70 % en intensité sont inférieures à 500 nm de diamètre, de manière davantage préférée au moins 80 % en intensité sont inférieures à 300 nm de diamètre, de manière davantage préférée au moins 90 % en intensité se situent dans la plage de 120 à 200 nm de diamètre.Preferably, the oil-in-water emulsion systems of the present invention have a small oil droplet size in the submicron range. Suitably, the droplet sizes will be in the range of 120 to 750 nm, more preferably sizes of 120 to 600 nm in diameter. Most preferably, the oil-in-water emulsion contains oil droplets of which at least 70% in intensity are less than 500 nm in diameter, more preferably at least 80% in intensity are less than 300 nm. in diameter, more preferably at least 90% in intensity are in the range of 120 to 200 nm in diameter.

Dans un mode de réalisation, la composition immunogène n'est pas 3 pg ou 10 pg de l'une quelconque de SEQ ID NO : 1 à 7 combinés avec un adjuvant comprenant une émulsion huile dans l'eau comportant 0,125 ml d'émulsion SB62 (volume total), 5,35 mg de squalène, 5,94 mg de DL-a-tocophérol et 2,425 mg de polysorbate 80 par dose de 0,5 ml dose. Dans un mode de réalisation, la composition immunogène n'est pas 3 pg ou 10 pg de l'une quelconque de SEQ ID NO : 1 à 7 combinés avec un adjuvant comprenant une émulsion huile dans l'eau comportant 5,35 mg de squalène, 5,94 mg de DL-a-tocophérol et 2,425 mg de polysorbate 80 par dose de 0,5 ml. Dans un mode de réalisation, la composition immunogène ne contient pas un adjuvant comprenant une émulsion huile dans l'eau comportant du squalène, du DL-a-tocophérol et du polysorbate 80.In one embodiment, the immunogenic composition is not 3 μg or 10 μg of any of SEQ ID NO: 1 to 7 combined with an adjuvant comprising an oil-in-water emulsion comprising 0.125 ml of SB62 emulsion. (total volume), 5,35 mg of squalene, 5,94 mg of DL-α-tocopherol and 2,425 mg of polysorbate 80 per dose of 0.5 ml dose. In one embodiment, the immunogenic composition is not 3 μg or 10 μg of any of SEQ ID NO: 1 to 7 combined with an adjuvant comprising an oil-in-water emulsion comprising 5.35 mg of squalene 5.94 mg of DL-α-tocopherol and 2.425 mg of polysorbate 80 per 0.5 ml dose. In one embodiment, the immunogenic composition does not contain an adjuvant comprising an oil-in-water emulsion comprising squalene, DL-α-tocopherol and polysorbate 80.

Compositions immunogènes et vaccins de l'inventionImmunogenic compositions and vaccines of the invention

Dans un mode de réalisation, la composition immunogène a un volume de 0,5 à 1,5 ml.In one embodiment, the immunogenic composition has a volume of 0.5 to 1.5 ml.

Dans un mode de réalisation, la composition immunogène comprend en outre des antigènes supplémentaires. Dans un mode de réalisation, les antigènes supplémentaires sont des antigènes dérivés d'une bactérie choisie dans le groupe constitué de S. pneumoniae, H. influenzae, N. meningitidis, E. coli, M. catarrhalis, Clostridium tetani (tétanos), Corynebacterium diphtheriae (diphtérie), Bordetella pertussis (coqueluche), S. epidermidis, entérocoques, S. aureus, et Pseudomonas aeruginosa.In one embodiment, the immunogenic composition further comprises additional antigens. In one embodiment, the additional antigens are antigens derived from a bacterium selected from the group consisting of S. pneumoniae, H. influenzae, N. meningitidis, E. coli, M. catarrhalis, Clostridium tetani (tetanus), Corynebacterium. diphtheriae (diphtheria), Bordetella pertussis (whooping cough), S. epidermidis, enterococci, S. aureus, and Pseudomonas aeruginosa.

Dans un autre mode de réalisation, la composition immunogène de l'invention peut comprendre d'autres antigènes de C. difficile, par exemple, les protéines de la couche S (WO 01/73030) . Eventuellement, la composition immunogène comprend en outre un saccharide de C. difficile.In another embodiment, the immunogenic composition of the invention may comprise other C. difficile antigens, for example, the S-layer proteins (WO 01/73030). Optionally, the immunogenic composition further comprises a C. difficile saccharide.

Il est en outre fourni un vaccin comprenant une composition immunogène de l'invention et un excipient pharmaceutiquement acceptable.There is further provided a vaccine comprising an immunogenic composition of the invention and a pharmaceutically acceptable excipient.

Les préparations vaccinales contenant des compositions immunogènes de la présente invention peuvent être utilisées pour protéger un mammifère sensible à une infection par C. difficile ou pour traiter un mammifère souffrant d'une infection par C. difficile, au moyen de l'administration dudit vaccin par voie systémique ou mucosale. Ces administrations peuvent comprendre une injection par les voies intramusculaire, intrapéritonéale, intradermique ou sous-cutanée ; ou par une administration mucosale aux systèmes oral/alimentaire, respiratoire, urogénital. Bien que le vaccin de l'invention puisse être administré sous la forme d'une dose simple, ses composants peuvent être également coadministrés ensemble en même temps ou à des temps différents (par exemple, des conjugués saccharidiques pneumococciques pourront être administrés séparément, en même temps ou 1 à 2 semaines après l'administration de l'un quelconque des composants protéiniques bactériens du vaccin pour une coordination des réponses immunitaires l'une par rapport à l'autre). En plus d'une seule voie d'administration, 2 voies différentes d'administration peuvent être utilisées. Par exemple, les saccharides ou les conjugués saccharidiques peuvent être administrés par voie intramusculaire (IM) ou intradermique (ID) et les protéines bactériennes peuvent être administrées par voie intranasale (IN) ou intradermique (ID) . En outre, les vaccins de l'invention peuvent être administrés par IM pour les doses de sensibilisation et IN pour les doses de rappel.Immunogenic preparations containing immunogenic compositions of the present invention can be used to protect a mammal susceptible to C. difficile infection or to treat a mammal suffering from C. difficile infection, by administering said vaccine by systemic or mucosal route. Such administrations may include intramuscular, intraperitoneal, intradermal or subcutaneous injection; or by mucosal administration to the oral / food, respiratory, urogenital systems. Although the vaccine of the invention may be administered as a single dose, its components may also be coadministered together at the same time or at different times (for example, pneumococcal saccharide conjugates may be administered separately, at the same time time or 1 to 2 weeks after administration of any of the bacterial protein components of the vaccine for coordination of immune responses relative to each other). In addition to a single route of administration, two different routes of administration may be used. For example, saccharides or saccharide conjugates can be administered intramuscularly (IM) or intradermally (ID) and the bacterial proteins can be administered intranasally (IN) or intradermally (ID). In addition, the vaccines of the invention can be administered by IM for sensitization doses and IN for booster doses.

La teneur en toxines dans le vaccin se situera généralement dans la plage de 1 à 250 pg, de préférence 5 à 50 pg, le plus généralement dans la plage de 5 à 25 pg. A la suite d'une vaccination initiale, les sujets peuvent recevoir une ou plusieurs immunisations de rappel espacées de façon adéquate. La préparation de vaccins est décrite de façon générale dans Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plénum Press New York). L'encapsulation au sein de liposomes est décrite par Fullerton, brevet US 4 235 877.The toxin content in the vaccine will generally be in the range of 1 to 250, preferably 5 to 50, most usually in the range of 5 to 25. Following an initial vaccination, subjects may receive one or more booster immunizations spaced appropriately. Vaccine preparation is generally described in Vaccine Design ("The Subunit and Adjuvant Approach" (Eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York). The encapsulation within liposomes is described by Fullerton, U.S. Patent 4,235,877.

Dans un aspect de l'invention, il est proposé un kit vaccinal, comprenant un flacon contenant une composition immunogène de l'invention, éventuellement sous forme lyophilisée, et comprenant en outre un flacon contenant un adjuvant tel que décrit ici. Il est envisagé dans cet aspect de l'invention, que l'adjuvant soit utilisé pour reconstituer la composition immunogène lyophilisée.In one aspect of the invention there is provided a vaccine kit, comprising a vial containing an immunogenic composition of the invention, optionally in lyophilized form, and further comprising a vial containing an adjuvant as described herein. It is contemplated in this aspect of the invention that the adjuvant is used to reconstitute the freeze-dried immunogenic composition.

Un autre aspect de l'invention est un procédé de prévention ou de traitement d'une infection par C. difficile comprenant l'administration à l'hôte d'une dose immunoprotectrice de la composition immunogène ou du vaccin ou du kit de l'invention.Another aspect of the invention is a method of preventing or treating a C. difficile infection comprising administering to the host an immunoprotective dose of the immunogenic composition or vaccine or kit of the invention. .

Dans un mode de réalisation, il est proposé un procédé de prévention ou de traitement d'épisodes primaires et/ou -de récurrence d'une infection par C. difficile comprenant l'administration à l'hôte d'une dose immunoprotectrice de la composition immunogène ou du vaccin ou du kit de l'invention.In one embodiment, there is provided a method of preventing or treating primary episodes and / or recurrence of C. difficile infection comprising administering to the host an immunoprotective dose of the composition. immunogen or vaccine or kit of the invention.

Dans un mode de réalisation de l'invention, il est proposé une composition immunogène ou un vaccin de l'invention pour une utilisation dans le traitement ou la prévention d'une affection ou d'une maladie provoquée par C. difficile. Une « maladie de C. difficile » signifie une maladie provoquée en totalité ou en partie par C. difficile. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, il est proposé une composition immunogène ou un vaccin de l'invention pour une utilisation dans le traitement ou la prévention d'une affection ou d'une maladie provoquée en totalité ou en partie par une souche de C. difficile choisie dans le groupe constitué de 078, 019, 023, 027, 033, 034, 036, 045, 058, 059, 063, 066, 075, 078, 080, 111, 112, 203, 250 et 571. De préférence, la souche est la souche 078.In one embodiment of the invention, there is provided an immunogenic composition or vaccine of the invention for use in the treatment or prevention of C. difficile disease or disease. "C. difficile disease" means disease caused in whole or in part by C. difficile. In another embodiment of the invention, there is provided an immunogenic composition or vaccine of the invention for use in the treatment or prevention of an ailment or disease caused in whole or in part by a C. difficile strain selected from the group consisting of 078, 019, 023, 027, 033, 034, 036, 045, 058, 059, 063, 066, 075, 078, 080, 111, 112, 203, 250 and 571. Preferably, the strain is strain 078.

Tel qu'utilisé ici, « traitement » signifie la prévention de l'apparition des symptômes de l'affection ou de la maladie chez un sujet, la prévention de la récurrence des symptômes de l'affection ou de la maladie chez un sujet, le retard de la récurrence des symptômes de l'affection ou de la maladie chez un sujet, la diminution de la gravité ou de la fréquence des symptômes de l'affection ou de la maladie chez un sujet, le ralentissement ou l'élimination de la progression de l'affection et l'élimination partielle ou totale des symptômes de la maladie ou de l'affection chez un sujet.As used herein, "treatment" means preventing the occurrence of the symptoms of the condition or disease in a subject, preventing the recurrence of the symptoms of the condition or disease in a subject, the delay in the recurrence of the symptoms of the condition or illness in a subject, decrease in the severity or frequency of the symptoms of the condition or disease in a subject, slowing or elimination of progression of the condition and the partial or total elimination of the symptoms of the disease or condition in a subject.

Dans un autre aspect de l'invention, il est proposé une utilisation d'une composition immunogène ou d'un vaccin de l'invention dans la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'une maladie de C. difficile. Dans un autre mode de réalisation, la maladie est une maladie provoquée par une souche de C. difficile choisie dans le groupe constitué de 078, 019, 023, 027, 033, 034, 036, 045, 058, 059, 063, 066, 075, 078, 080, 111, 112, 203, 250 et 571. De préférence, la souche est la souche 078.In another aspect of the invention, there is provided a use of an immunogenic composition or vaccine of the invention in the preparation of a medicament for the prevention or treatment of C. difficile disease. . In another embodiment, the disease is a disease caused by a C. difficile strain selected from the group consisting of 078, 019, 023, 027, 033, 034, 036, 045, 058, 059, 063, 066, 075, 078, 080, 111, 112, 203, 250 and 571. Preferably, the strain is strain 078.

Dans un autre aspect de l'invention, il est proposé un procédé de prévention ou de traitement d'une maladie de C. difficile comprenant l'administration de la composition immunogène de l'invention ou du vaccin de l'invention à un sujet mammifère comme un sujet humain. Dans un autre mode de réalisation, la maladie est une maladie provoquée par une souche de C. difficile choisie dans le groupe constitué de 078, 019, 023, 027, 033, 034, 036, 045, 058, 059, 063, 066, 075, 078, 080, 111, 112, 203, 250 et 571. De préférence, la souche est la souche 078. Généralités « Autour » ou « approximativement » sont définis comme se situant à plus ou moins 10 % du chiffre donné pour les objectifs de 1'invention.In another aspect of the invention there is provided a method of preventing or treating a C. difficile disease comprising administering the immunogenic composition of the invention or vaccine of the invention to a mammalian subject as a human subject. In another embodiment, the disease is a disease caused by a C. difficile strain selected from the group consisting of 078, 019, 023, 027, 033, 034, 036, 045, 058, 059, 063, 066, 075, 078, 080, 111, 112, 203, 250 and 571. Preferably, the strain is strain 078. General "Around" or "approximately" are defined as being within plus or minus 10% of the given figure for objectives of the invention.

Le terme « comprend » signifie « inclut ». Ainsi, sauf si le contexte requiert le contraire, le mot « comprend », et des variations telles que « comprennent » et « comprenant » seront compris comme impliquant l'inclusion d'un composé ou d'une composition indiquée (par exemple, acide nucléique, polypeptide, antigène) ou d'une étape, ou d'un groupe de composés ou d'étapes, mais pas l'exclusion de tout autre composé, composition, étape, - ou groupe de ceux-ci. L'abréviation, « e.g. » est dérivée du latin exempli gratia, et est utilisée ici pour indiquer un exemple non limitatif. Ainsi, l'abréviation « e.g. » est synonyme du terme « par exemple ».The term "includes" means "includes". Thus, unless the context requires otherwise, the word "includes", and variations such as "include" and "comprising" will be understood to imply the inclusion of a specified compound or composition (eg, acid nucleic acid, polypeptide, antigen) or a step, or a group of compounds or steps, but not the exclusion of any other compound, composition, step, or group thereof. The abbreviation, "e.g." is derived from the Latin exempli gratia, and is used here to indicate a non-limiting example. Thus, the abbreviation "e.g." is synonymous with the term "for example".

La numérotation des acides aminés utilisée ici est dérivée des séquences pour la CDTa, la CDTb, la toxine A et la toxine B présentées ici en tant que SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 29 et SEQ ID NO : 30, respectivement, qui doivent être considérées comme des séquences de référence pour ces protéines.The amino acid numbering used herein is derived from the sequences for CDTa, CDTb, toxin A and toxin B presented herein as SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 29 and SEQ ID. NO: 30, respectively, which should be considered as reference sequences for these proteins.

Les modes de réalisation ici concernant les « compositions vaccinales » de l'invention sont également applicables aux modes de réalisation concernant les « compositions immunogènes » de l'invention, et vice versa.The embodiments herein relating to "vaccine compositions" of the invention are also applicable to embodiments relating to "immunogenic compositions" of the invention, and vice versa.

Sauf indication contraire, tous les termes techniques et scientifiques utilisés ici ont la même signification que celle couramment comprise par l'homme du métier dans le domaine auquel cette divulgation appartient. Les définitions des termes courants en biologie moléculaire peuvent se trouver dans Benjamin Lewin, Genes V, publié par Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9) ; Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publié par Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9) ; et Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publié par VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081569-8).Unless otherwise indicated, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by those skilled in the art to which this disclosure belongs. Definitions of common terms in molecular biology can be found in Benjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); and Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081569-8).

Les termes au singulier « un », « une », « le » et « la » comprennent les articles pluriels sauf si le contexte indique clairement le contraire. De façon similaire, le terme « ou » est censé comprendre « et » sauf si le contexte indique clairement le contraire. Le terme « pluralité » se rapporte à deux ou plus. Il doit en outre être compris que toutes les tailles de bases ou tailles d'acides aminés, et toutes les valeurs de poids moléculaire ou de masse moléculaire, données pour les acides nucléiques ou les polypeptides sont approximatives, et sont fournies pour la description. En outre, les limitations numériques données en ce qui concerne les concentrations ou les taux d'une substance, comme un antigène, peuvent être approximatives.The terms singular "one", "one", "the" and "the" include plural articles unless the context clearly indicates otherwise. Similarly, the term "or" is meant to include "and" unless the context clearly indicates otherwise. The term "plurality" refers to two or more. It should further be understood that all base sizes or amino acid sizes, and all molecular weight or molecular weight values, given for the nucleic acids or polypeptides are approximate, and are provided for the description. In addition, the numerical limitations given with respect to the concentrations or levels of a substance, such as an antigen, may be approximate.

Toutes les références ou les demandes de brevet citées au sein de ce mémoire de brevet sont incorporées par référence ici dans leur intégralité.All references or patent applications cited in this patent specification are incorporated by reference herein in their entirety.

Pour que cette invention soit mieux comprise, les exemples suivants sont présentés. Ces exemples ont uniquement des objectifs d'illustration, et ils ne doivent pas être interprétés comme limitant la portée de l'invention d'une manière quelconque.For this invention to be better understood, the following examples are presented. These examples are for illustrative purposes only and should not be construed as limiting the scope of the invention in any way.

EXEMPLES L'adjuvant AS01B auquel il est fait référence est un adjuvant contenant 50 pg de QS21 présenté sous la forme d'un liposome, 50 pg de 3D-MPL, 0,25 mg de cholestérol et 1,0 mg de DOPC par dose de 0,5 ml. Une dose de 50 pl appropriée pour immuniser des souris contient 5 pg de QS21, 5 pg de 3D-MPL, 0,025 mg de cholestérol et 0,1 mg de DOPC.EXAMPLES The AS01B adjuvant referred to is an adjuvant containing 50 μg of QS21 presented as a liposome, 50 μg of 3D-MPL, 0.25 mg of cholesterol and 1.0 mg of DOPC per dose of 0.5 ml. A 50 μl dose suitable for immunizing mice contains 5 μg of QS21, 5 μg of 3D-MPL, 0.025 mg of cholesterol and 0.1 mg of DOPC.

Exemple 1 - Conception des antigènes de toxine binaireExample 1 - Design of Binary Toxin Antigens

La toxine binaire (autre nom : toxine ADP-ribosyl-transférase) est composée de deux composants : le composant enzymatique, nommé CDTa et le composant de transport et de liaison, nommé CDTb.The binary toxin (other name: ADP-ribosyl-transferase toxin) is composed of two components: the enzymatic component, named CDTa, and the transport and binding component, named CDTb.

En se basant sur les données de la littérature et les informations disponibles pour les composants d'autres toxines binaires bactériennes, la CDTb a pu être divisée en cinq domaines. Le premier est le prodomaine, son clivage par une enzyme dotée d'une activité chymotrypsine permet 1'heptamérisation de la protéine mature. Le deuxième domaine permet la liaison à la CDTa. Les troisième et quatrième sont impliqués dans 1'oligomérisation et l'insertion membranaire. Finalement, le dernier domaine est le domaine de liaison aux récepteurs de la cellule hôte. CDTb matureBased on literature data and available information for components of other bacterial binary toxins, CDTb could be divided into five domains. The first is the prodomain, its cleavage by an enzyme with chymotrypsin activity allows the heptamerization of the mature protein. The second domain allows linking to CDTa. The third and fourth are involved in oligomerization and membrane insertion. Finally, the last domain is the receptor binding domain of the host cell. Mature CDTb

Afin d'éviter l'étape d'activation par la chymotrypsine dans le traitement de la CDTb, il a été tenté d'exprimer seulement la protéine CDTb mature (sans son peptide signal et son prodomaine).In order to avoid the activation step by chymotrypsin in the treatment of CDTb, it has been attempted to express only the mature CDTb protein (without its signal peptide and prodomain).

Dans la littérature (Protein Expression and Purification, 2010, vol. 74 : 42-48), la CDTb mature a été décrite comme démarrant au niveau de la Leucine 210 de SEQ ID NO : 3. Cette CDTb mature a été nommée CDTb". D'autres données expérimentales suggèrent que la CDTb démarre au niveau de la Sérine 212 de SEQ ID NO : 3. Ce résultat a été supporté par l'analyse d'une structure tridimensionnelle modélisée de la CDTb. Ce modèle a été construit en utilisant SwissModel (Bioinformatics, 2006, vol. 22 : 195-201). La matrice utilisée pour la modélisation par homologie a été le composant B de Bacillus anthracis, nommé antigène protecteur ou PA (numéro d'accession de la banque de données des protéines : 3TEW).In the literature (Protein Expression and Purification, 2010, vol 74: 42-48), mature CDTb was described as starting at Leucine 210 of SEQ ID NO: 3. This mature CDTb was named CDTb ". Other experimental data suggest that CDTb starts at Serine 212 of SEQ ID NO: 3. This result was supported by the analysis of a modeled three-dimensional structure of CDTb.This model was constructed using SwissModel (Bioinformatics, 2006, vol.22: 195-201) The template used for homology modeling was component B of Bacillus anthracis, named protective antigen or PA (accession number of the protein database: 3TEW ).

Domaine de liaison aux récepteurs seul de la CDTbSingle receptor binding domain of CDTb

Le modèle de structure tridimensionnelle par homologie obtenu pour la CDTb en utilisant l'antigène PA provenant de B. anthraxis est exact pour les quatre premiers domaines de la CDTb mais pas pour le domaine de liaison aux récepteurs (ces domaines de la CDTb et du PA sont trop différents). Pour concevoir des constructions exprimant le domaine de liaison aux récepteurs seul, la partie C-terminale du quatrième domaine a été analysée sur le modèle de structure tridimensionnelle afin de décider où le dernier domaine démarrera.The three-dimensional homology structure model obtained for CDTb using PA antigen from B. anthraxis is accurate for the first four domains of CDTb but not for the receptor binding domain (these domains of CDTb and PA are too different). To design constructs expressing the receiver-only domain, the C-terminal portion of the fourth domain was analyzed on the three-dimensional structure model to decide where the last domain will start.

Deux versions du domaine de liaison aux récepteurs de la CDTb ont été conçues. Dans la première, ce domaine démarre juste après la structure tridimensionnelle modélisée du quatrième domaine. Dans cette version, le domaine de liaison aux récepteurs de la CDTb comportera probablement un long peptide flexible dans sa partie N-terminale. La seconde version du domaine de liaison aux récepteurs démarre où les structures bidimensionnelles prédites effectuées sur la partie C-terminale de la CDTb (prédictions faites en utilisant le programme Psipred, Bioinformatics, 2000, vol. 16 : 404-405) deviennent plus compactes après un manque de structures secondaires prédites. Ceci pourrait indiquer le début d'un nouveau domaine structural. Dans cette seconde version, aucun peptide flexible n'est présent au niveau de la partie N-terminale du domaine de liaison aux récepteurs isolé de la CDTb.Two versions of the CDTb receptor binding domain have been designed. In the first, this domain starts just after the modeled three-dimensional structure of the fourth domain. In this version, the receptor binding domain of CDTb will likely have a long, flexible peptide in its N-terminus. The second version of the receptor binding domain starts where predicted two-dimensional structures on the C-terminal part of the CDTb (predictions made using the Psipred program, Bioinformatics, 2000, vol 16: 404-405) become more compact after a lack of predicted secondary structures. This could indicate the beginning of a new structural domain. In this second version, no flexible peptide is present at the N-terminal portion of the receptor binding domain isolated from CDTb.

Mutations du motif de liaison au Ca2+ de la CDTbMutations of the Ca2 + binding motif of CDTb

En suivant les informations de la littérature, des mutations dans le domaine de liaison au Ca2+ du composant B de la toxine Iota de Clostridium perfringens (Ib) abolissent la liaison avec le composant A de cette toxine binaire (la) . Ces mutations pourraient être très intéressantes dans le cas d'une composition vaccinale contenant un mélange de protéine CDTb mature et de protéine CDTa de type sauvage.By following the literature, mutations in the Ca2 + binding domain of component B of the Iota toxin of Clostridium perfringens (Ib) abolish the binding with component A of this binary toxin (Ia). These mutations could be very interesting in the case of a vaccine composition containing a mixture of mature CDTb protein and wild-type CDTa protein.

En utilisant un alignement de séquences de protéines multiples, ces mutations ont été localisées sur la séquence de la CDTb et mutées. Cela concerne les résidus Asp220, Asp222 et Asp224 de SEQ ID NO : 3. Ils ont été mutés sur les résidus Ala.Using multiple protein sequence alignment, these mutations were localized to the CDTb sequence and mutated. This concerns the Asp220, Asp222 and Asp224 residues of SEQ ID NO: 3. They were mutated on the Ala residues.

Prodomaine de la CDTbProdomaine of the CDTb

Afin de tenter de diminuer les problèmes de dégradation observés avec la construction C55 (CDTb avec le prodomaine éliminé) dans du gel, quelques tests de coexpression ont été évalués. L'hypothèse de travail en effectuant ceci est d'améliorer le repliement de la CDTb mature.In an attempt to reduce the degradation problems observed with the C55 construct (CDTb with the prodomaine removed) in gel, some coexpression tests were evaluated. The working hypothesis in doing this is to improve the folding of the mature CDTb.

Deux limites du prodomaine ont été proposées. La première démarre au niveau du résidu 43 de la CDTb de SEQ ID NO : 3 (après le clivage du peptide signal) et finit au niveau du résidu Met211 (étant donné que le premier résidu déterminé expérimentalement de la CDTb mature est Ser212) . Le second prodomaine a été conçu en se basant sur la structure tridimensionnelle prédite de la CDTb. Le lieur (« linker ») existant entre le prodomaine et le premier domaine structural de la protéine CDTb mature est éliminé dans cette construction.Two limits of the prodomaine have been proposed. The first starts at residue 43 of the CDTb of SEQ ID NO: 3 (after cleavage of the signal peptide) and ends at the Met211 residue (since the first experimentally determined residue of the mature CDTb is Ser212). The second prodomain was designed based on the predicted three-dimensional structure of CDTb. The linker between the prodomain and the first structural domain of the mature CDTb protein is eliminated in this construct.

Exemple 2 - Clonage, expression et purification de la protéine CDTb de C. difficileExample 2 Cloning, Expression and Purification of C. difficile CDTb Protein

Plasmide d'expression et souche recombinante : C37 et C55 (telles que présentées dans le tableau A).Expression plasmid and recombinant strain: C37 and C55 (as shown in Table A).

Les gènes codant pour la protéine tronquée de CDTb sans le peptide signal (Pro-CDTb', C37) et un marqueur His à l'extrémité C-terminale ont été clonés dans le vecteur d'expression pGEX-6pl (GE Healthcare) en utilisant les sites de restrictionThe genes encoding the truncated CDTb protein without the signal peptide (Pro-CDTb ', C37) and a His-tag at the C-terminus were cloned into the pGEX-6pl expression vector (GE Healthcare) using restriction sites

BamHI/Xhol en utilisant des procédures classiques. Ce vecteur comprenait de la GST (glutathion-S-transférase) en tant que partenaire de fusion à l'extrémité N-terminale de la CDTb' (GST-Pro-CDTb') . La construction finale a été produite par la transformation de la souche d'E. coli BL21 (DE3) avec le vecteur d'expression recombinant selon le procédé classique avec des cellules traitées au CaCl2 (Hanahan D. « Plasmid transformation by Simanis. » Dans Glover, D. M. (Ed) , DNA cloning. IRL Press London. (1985): p. 109-135.).BamHI / XhoI using standard procedures. This vector included GST (glutathione-S-transferase) as a fusion partner at the N-terminus of CDTb '(GST-Pro-CDTb'). The final construction was produced by the transformation of the strain of E. coli BL21 (DE3) with the recombinant expression vector according to the conventional method with CaCl2-treated cells (Hanahan D. "Plasmid transformation by Simanis." In Glover, DM (Ed), DNA cloning, IRL Press London. (1985) ): pp. 109-135.).

Les gènes codant pour la protéine tronquée de CDTb sans peptide signal ni prodomaine (CDTb" : C55) et un marqueur His à l'extrémité C-terminale ont été clonés dans le vecteur d'expression pET24b(+) (Novagen) en utilisant les sites de restriction Ndel/Xhol en utilisant des procédures classiques. Les constructions finales ont été produites par la transformation de la souche modifiée d'E. coli B834 (DE3) avec les vecteurs d'expression recombinants appropriés selon le procédé classique avec des cellules traitées au· CaCl2 (Hanahan D. « Plasmid transformation by Simanis. » Dans Glover, D. M. (Ed), DNA cloning. IRL Press London. (1985): p. 109-135.).The genes encoding the truncated CDTb protein without signal peptide nor prodomain (CDTb-: C55) and a His-tag at the C-terminus were cloned into the pET24b (+) expression vector (Novagen) using the NdeI / XhoI restriction sites using standard procedures The final constructs were produced by transforming the modified strain of E. coli B834 (DE3) with the appropriate recombinant expression vectors according to the conventional method with treated cells. to CaCl2 (Hanahan D. "Plasmid transformation by Simanis." In Glover, DM (Ed), DNA cloning, IRL Press London (1985): pp. 109-135.).

Souche hôte BL21(DE3). BL21(DE3) est un dérivé non auxotrophe pour la méthionine de B834. Les souches avec la désignation (DE3) sont lysogènes pour un prophage λ qui contient une T7 ARN polymérase inductible par IPTG. Les lysogènes λ DE3 sont conçus pour l'expression de protéines à partir de vecteurs pET. Cette souche est également déficiente en protéases Ion et ompT. Génotype : souche E. coli BL21::DE3, F" ompT hsdSB(rB_ mB~) gai dcm (DE3). B834 est la souche parentale pour BL21. Ces hôtes déficients en protéases sont auxotrophes pour la méthionine. Les lysogènes λ DE3 sont conçus pour l'expression de protéines à partir de vecteurs pET. Cette souche est également déficiente en protéases Ion et ompT.Host strain BL21 (DE3). BL21 (DE3) is a non-auxotrophic derivative for B834 methionine. Strains with the designation (DE3) are lysogenic for λ prophage which contains an IPTG-inducible T7 RNA polymerase. Λ DE3 lysogens are designed for the expression of proteins from pET vectors. This strain is also deficient in proteases Ion and ompT. Genotype: E. coli strain BL21 :: DE3, F "ompT hsdSB (rB_ mB ~) gai dcm (DE3) B834 is the parent strain for BL21 These protease deficient hosts are auxotrophic for methionine. designed for the expression of proteins from pET vectors.This strain is also deficient in proteases Ion and ompT.

Modification : inclusion du gène PGL pour éviter la phosphogluconoylation dans le locus de la biotine (la souche est auxotrophe pour la biotine). Génotype : souche B834::DE3, F- ompT hsdSB{xB - mB-) gai dcm met (DE3)Modification: inclusion of the PGL gene to avoid phosphogluconoylation in the biotin locus (the strain is auxotrophic for biotin). Genotype: strain B834 :: DE3, F- ompT hsdSB {xB - mB-) gai dcm met (DE3)

Modification : Δ(bioA-bioD) : :PGL Expression des protéines recombinantes :Modification: Δ (bioA-bioD):: PGL Expression of recombinant proteins:

Des transformants d'E. coli ont été prélevés d'une plaque de gélose et utilisés pour inoculer 200 ml de bouillon LBT ± 1 % (p/v) de glucose +/- kanamycine (50 pg/ml) ou ampicilline (100 pg/ml) pour obtenir une D.0.6oonm entre 0,1 et 0,2. Les cultures ont été incubées pendant une nuit à 37 °C, 250 tr/min.Transformants of E. coli were taken from an agar plate and used to inoculate 200 ml LBT broth ± 1% (w / v) glucose +/- kanamycin (50 μg / ml) or ampicillin (100 μg / ml) to obtain a D.0.6 cm between 0.1 and 0.2. The cultures were incubated overnight at 37 ° C, 250 rpm.

Les cultures d'une nuit ont été diluées au 1/20 dans 500 ml de milieu LBT contenant +/- kanamycine (50 pg/ml) ou ampicilline (100 pg/ml) et cultivées à 37 °C à une vitesse d'agitation de 250 tr/min pour atteindre une D.O.620 de 0,5/0,6. A une D.O. à 600 nm autour de 0,6, les cultures ont été refroidies avant l'induction de l'expression de la protéine recombinante par l'addition de 1 mM d'isopropyl-p-D-l-thiogalactopyranoside (IPTG ; EMD Chemicals Inc., numéro de catalogue : 5815) et incubées pendant une nuit à 23 °C, 250 tr/min.Overnight cultures were diluted 1:20 in 500 ml LBT medium containing +/- kanamycin (50 μg / ml) or ampicillin (100 μg / ml) and cultured at 37 ° C at a stirring rate. 250 rpm to reach an OD620 of 0.5 / 0.6. At OD at 600 nm around 0.6, cultures were cooled prior to induction of recombinant protein expression by the addition of 1 mM isopropyl-pD1-thiogalactopyranoside (IPTG; EMD Chemicals Inc. catalog number 5815) and incubated overnight at 23 ° C, 250 rpm.

Après les inductions pendant une nuit (autour de 16 heures), les D.O. à 600 nm ont été évaluées après l'induction et les cultures ont été centrifugées à 14 000 tr/min pendant 15 minutes et les culots ont été congelés à -20 °C séparément.After overnight inductions (around 16 hours), the OD at 600 nm were evaluated after induction and the cultures were centrifuged at 14,000 rpm for 15 minutes and the pellets were frozen at -20 ° C. C separately.

Purification C37 (SEQ ID NO: 5)Purification C37 (SEQ ID NO: 5)

Le culot bactérien a été remis en suspension dans 50 mM de tampon bicine (pH 8,0) contenant 500 mM de NaCl, 5 mM de TCEP (Thermo Scientific Pierce, chlorhydrate de (2-carboxyéthyl)-phosphine) et un mélange d'inhibiteurs de protéases (Complété, Roche). Les bactéries ont été lysées en utilisant un système de presse de French 3 X 20 000 PSI. Les composants solubles (surnageant) et insolubles (culot) ont été séparés par centrifugation à 20 000 g pendant 30 min à 4 °C.The bacterial pellet was resuspended in 50 mM bicine buffer (pH 8.0) containing 500 mM NaCl, 5 mM TCEP (Thermo Scientific Pierce, (2-carboxyethyl) -phosphine hydrochloride) and a mixture of protease inhibitors (Completed, Roche). The bacteria were lysed using a French 3 X 20 000 PSI press system. Soluble (supernatant) and insoluble (pellet) components were separated by centrifugation at 20,000 xg for 30 min at 4 ° C.

La protéine marquée par 6-His a été purifiée dans des conditions natives sur IMAC. Les composants solubles ont été chargés sur une colonne GE Histrap de 5 ml (GE) pré-équilibrée avec le même tampon que celui utilisé pour la remise en suspension des bactéries. Après le chargement sur la colonne, la colonne a été lavée avec un tampon bicine à 50 mM pH 8,0, contenant 150 mM de NaCl, 25 mM d'imidazole, 1 mM de TCEP. L'élution a été effectuée en utilisant un tampon bicine à 50 mM pH 8,0 contenant 150 mM de NaCl, 250 mM d'imidazole, 1 mM de TCEP.The 6-His tagged protein was purified under native conditions on IMAC. The soluble components were loaded onto a 5 ml GE Histrap (GE) column pre-equilibrated with the same buffer used for resuspension of the bacteria. After loading on the column, the column was washed with 50 mM bicine buffer pH 8.0, containing 150 mM NaCl, 25 mM imidazole, 1 mM TCEP. Elution was performed using a 50 mM bicine buffer pH 8.0 containing 150 mM NaCl, 250 mM imidazole, 1 mM TCEP.

Après une étape de dessalage (BIORAD Bio-Gel P6 Desalting) dans 50 mM de tampon bicine pH 8,0 contenant 150 mM de NaCl et 1 mM de TCEP, le produit a été traité (pendant une nuit à 4°C) avec des protéases PreScission (GE-Healthcare) afin de cliver le marqueur GST. Après un traitement d'une nuit, 0,2 % de Tween 20 a été ajouté au mélange de digestion.After a desalting step (BIORAD Bio-Gel P6 Desalting) in 50 mM bicine buffer pH 8.0 containing 150 mM NaCl and 1 mM TCEP, the product was treated (overnight at 4 ° C) with PreScission proteases (GE-Healthcare) in order to cleave the GST marker. After overnight treatment, 0.2% Tween 20 was added to the digestion mixture.

Ensuite la protéine a été passée à travers une colonne d'affinité pour la GST (GE GSTrap FF) pré-équilibrée avec du tampon bicine à 50 mM pH 8,0 contenant 150 mM de NaCl, 1 mM de TCEP, 0,2 % de Tween 20 et 20 mM de glutathion réduit, afin d'éliminer le marqueur clivé, la protéine de fusion non clivée et les protéases PreScission.Then the protein was passed through a GST affinity column (GE GSTrap FF) pre-equilibrated with 50 mM bicine buffer pH 8.0 containing 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 0.2% Tween 20 and 20 mM reduced glutathione to remove the cleaved marker, uncleaved fusion protein and PreScission proteases.

La protéine dépourvue de la GST a été recueillie dans la fraction non retenue et chargée à nouveau sur une colonne GE Histrap de 5 ml (GE) pré-équilibrée avec 50 mM de tampon bicine pH 8,0 contenant 150 mM de NaCl, 1 mM de TCEP, 0,2 % de Tween20. Après le chargement sur la colonne, la colonne a été lavée avec du tampon bicine à 50 mM pH 8,0, contenant 150 mM de NaCl, 0,2 % de Tween 20, 1 mM de TCEP et 10 mM d'imidazole. L'élution a été effectuée en utilisant un tampon bicine à 50 mM pH 8,0 contenant 150 mM de NaCl, 0,2 % de Tween 20, 1 mM de TCEP et 500 mM d'imidazole.The GST-free protein was collected in the non-retained fraction and refilled on a 5 ml GE Histrap (GE) column pre-equilibrated with 50 mM bicine buffer pH 8.0 containing 150 mM NaCl, 1 mM. of TCEP, 0.2% Tween20. After loading onto the column, the column was washed with 50 mM bicine buffer pH 8.0, containing 150 mM NaCl, 0.2% Tween 20, 1 mM TCEP and 10 mM imidazole. Elution was performed using a 50 mM bicine buffer pH 8.0 containing 150 mM NaCl, 0.2% Tween 20, 1 mM TCEP and 500 mM imidazole.

Après une étape de dessalage (BIORAD Bio-Gel P6 Desalting) dans 50 mM de tampon bicine pH 8,0 contenant 150 mM de NaCl, 1 mM de TCEP et 0,2 % de Tween 20, le produit a été traité avec de l'a-chymotrypsine (provenant de pancréas bovin - Sigma), ceci suivi d'un traitement par un inhibiteur de la trypsine (provenant de blanc d'œuf - Sigma) . L'activation complète de la CDTb par la chymotrypsine a été suivie par SDS-PAGE.After a desalting step (BIORAD Bio-Gel P6 Desalting) in 50 mM of bicine buffer pH 8.0 containing 150 mM NaCl, 1 mM TCEP and 0.2% Tween 20, the product was treated with water. a-chymotrypsin (from bovine pancreas - Sigma), followed by treatment with a trypsin inhibitor (from egg white - Sigma). Complete activation of CDTb by chymotrypsin was followed by SDS-PAGE.

Le produit totalement activé a été chargé sur une chromatographie SEC (SUPERDEX™ 75) dans 50 mM de tampon bicine pH 8,0 contenant 300 mM de NaCl, 1 mM de TCEP. Les fractions contenant l'antigène CDTb ont été sélectionnées sur la base de la pureté par SDS-PAGE. La concentration de la protéine a été déterminée en utilisant le dosage des protéines de Lowry RC/DC de Bio-Rad. Le vrac purifié a été stérilisé par filtration sur 0,22 μπι et stocké à -80 °C. C55 (SEQ ID NO: 7)The fully activated product was loaded on SEC (SUPERDEX ™ 75) chromatography in 50mM bicine buffer pH 8.0 containing 300mM NaCl, 1mM TCEP. Fractions containing the CDTb antigen were selected on the basis of purity by SDS-PAGE. The concentration of the protein was determined using the Bio-Rad Lowry RC / DC protein assay. The purified bulk was sterilized by filtration over 0.22 μπι and stored at -80 ° C. C55 (SEQ ID NO: 7)

Le culot bactérien a été remis en suspension dans 50 mM de tampon bicine (pH 8,0) contenant 150 mM de NaCl, 5 mM de TCEP (Thermo Scientific Pierce, chlorhydrate de (2-carboxyéthyl)-phosphine) , 0,4 % d'Empigen et un mélange d'inhibiteurs de protéases (Complété, Roche). Les bactéries ont été lysées en utilisant un système de presse de French 3 X 20 000 PSI. Les composants solubles (surnageant) et insolubles (culot) ont été séparés par centrifugation à 20 000 g pendant 30 min à 4 °C.The bacterial pellet was resuspended in 50 mM bicine buffer (pH 8.0) containing 150 mM NaCl, 5 mM TCEP (Thermo Scientific Pierce, (2-carboxyethyl) -phosphine hydrochloride), 0.4% of Empigen and a mixture of protease inhibitors (Completed, Roche). The bacteria were lysed using a French 3 X 20 000 PSI press system. Soluble (supernatant) and insoluble (pellet) components were separated by centrifugation at 20,000 xg for 30 min at 4 ° C.

La protéine marquée par 6-His a été purifiée dans des conditions natives sur IMAC. Les composants solubles ont été chargés sur une colonne GE Histrap de 5 ml (GE) pré-équilibrée avec 50 mM de tampon bicine (pH 8,0) contenant 150 mM de NaCl, 0,15 % d'Empigen, 1 mM de TCEP. Après le chargement sur la colonne, la colonne a été lavée avec un tampon bicine à 50 mM pH 8,0, contenant 150 mM de NaCl, 0,2 % de Tween 20, 20 mM d'imidazole et 1 mM de TCEP. L'élution a été effectuée en utilisant un tampon bicine à 50 mM pH 8,0 contenant 150 mM de NaCl, 0,2 % de Tween 20, 500 mM d'imidazole et 1 mM de TCEP.The 6-His tagged protein was purified under native conditions on IMAC. The soluble components were loaded onto a 5 ml GE Histrap (GE) column pre-equilibrated with 50 mM bicine buffer (pH 8.0) containing 150 mM NaCl, 0.15% Empigen, 1 mM TCEP. . After loading onto the column, the column was washed with 50 mM bicine buffer pH 8.0, containing 150 mM NaCl, 0.2% Tween 20, 20 mM imidazole and 1 mM TCEP. Elution was performed using a 50 mM bicine buffer pH 8.0 containing 150 mM NaCl, 0.2% Tween 20, 500 mM imidazole and 1 mM TCEP.

Après l'étape de dessalage (BIORAD Bio-Gel P6 Desalting) dans du tampon bicine à 50 mM pH 8,0 contenant 300 mM de NaCl, 1 mM de TCEP, le produit a été chargé sur une chromatographie SEC (SUPERDEX™ 75) dans le même tampon. Les fractions contenant l'antigène CDTb ont été sélectionnées sur la base de la pureté par SDS-PAGE. La concentration de la protéine a été déterminée en utilisant le dosage de protéines de Lowry RC/DC de Bio-Rad. Le vrac purifié a été stérilisé par filtration sur 0,22 pm et stocké à -80 0C.After the desalting step (BIORAD Bio-Gel P6 Desalting) in 50 mM bicine buffer pH 8.0 containing 300 mM NaCl, 1 mM TCEP, the product was loaded on SEC (SUPERDEX ™ 75) chromatography. in the same buffer. Fractions containing the CDTb antigen were selected on the basis of purity by SDS-PAGE. The concentration of the protein was determined using the Bio-Rad Lowry RC / DC protein assay. The purified bulk was sterilized by filtration over 0.22 μm and stored at -80 ° C.

Exemple 3 - Clonage, expression et purification de la protéine CDTaExample 3 Cloning, Expression and Purification of the CDTa Protein

Plasmide d'expression et souche recombinante : CDTa pleine longueur (C34, C44, C49, C50, C54, C67, C68, C69, C107, C108, C110 telles que présentées dans le tableau A)Expression Plasmid and Recombinant Strain: Full-length CDTa (C34, C44, C49, C50, C54, C67, C68, C69, C107, C108, C110 as shown in Table A)

Les gènes codant pour la protéine pleine longueur sans peptide signal de la CDTa avec et sans mutations (voir le tableau A) et un marqueur His à l'extrémité C-terminale ont été clonés dans le vecteur d'expression pET24b( + ) (Novagen) en utilisant les sites de restriction Ndel/Xhol en utilisant des procédures classiques. Les constructions finales ont été produites par la transformation de la souche dΈ. coli HMS174 (DE3) ou BLR (DE3) pLysS (C34) avec chaque vecteur d'expression recombinant selon le procédé classique avec des cellules traitées au CaCl2 (Hanahan D. « Plasmid transformation by Simanis. » In Glover, D. M. (Ed) , DNA cloning. IRL Press London. (1985): p. 109-135.).The genes encoding the full-length protein without CDTa signal peptide with and without mutations (see Table A) and a His-tag at the C-terminus were cloned into the pET24b (+) expression vector (Novagen ) using the NdeI / XhoI restriction sites using standard procedures. The final constructions were produced by the transformation of the strain dΈ. coli HMS174 (DE3) or BLR (DE3) pLysS (C34) with each recombinant expression vector according to the conventional method with CaCl2-treated cells (Hanahan D. "Plasmid transformation by Simanis." In Glover, DM (Ed), DNA cloning, IRL Press London (1985): pp. 109-135.

Souche hôte : HMS 174 (DE3). Les souches HMS174 fournissent la mutation recA dans un contexte K-12. Les souches avec la désignation (DE3) sont lysogènes pour un prophage λ qui contient une T7 ARN polymérase inductible par IPTG. Les lysogènes λ DE3 sont conçus pour l'expression de protéines à partir de vecteurs pET. Génotype : F” recAl hsdR (rKi2‘ mKi2+) (Rif R) . BLR(DE3) pLysS. BLR est un dérivé recA de BL21. Les souches avec la désignation (DE3) sont lysogènes pour un prophage λ qui contient une T7 ARN polymérase inductible par IPTG. Les lysogènes λ DE3 sont conçus pour l'expression de protéines à partir de vecteurs pET. Cette souche est également déficiente en protéases Ion et ompT, les souches pLysS expriment le T7 lysozyme qui supprime en outre l'expression de base de la T7 ARN polymérase avant l'induction. Génotype : souche E. coli BLR::DE3, F' ompT hsdSB(rs~ me-) gai dcm (DE3) Δ (srl-recA) 306 : : Tnl 0 pLysS (CamR, TetR) .Host strain: HMS 174 (DE3). HMS174 strains provide the recA mutation in a K-12 context. Strains with the designation (DE3) are lysogenic for λ prophage which contains an IPTG-inducible T7 RNA polymerase. Λ DE3 lysogens are designed for the expression of proteins from pET vectors. Genotype: F "recAl hsdR (rKi2 'mKi2 +) (Rif R). BLR (DE3) pLysS. BLR is a recA derivative of BL21. Strains with the designation (DE3) are lysogenic for λ prophage which contains an IPTG-inducible T7 RNA polymerase. Λ DE3 lysogens are designed for the expression of proteins from pET vectors. This strain is also deficient in proteases Ion and ompT, pLysS strains express T7 lysozyme which further suppresses the basic expression of T7 RNA polymerase before induction. Genotype: E. coli strain BLR :: DE3, F 'ompT hsdSB (rs ~ me-) gal dcm (DE3) Δ (srl-recA) 306:: TnI 0 pLysS (CamR, TetR).

Expression des protéines recombinantes :Expression of recombinant proteins:

Les transformants d'E. coli ont été prélevés sur une plaque de gélose et utilisés pour inoculer 200 ml de bouillon LBT ± 1 % (p/v) de glucose + kanamycine (50 pg/ml) pour obtenir une D. 0.6oonm entre 0,1 et 0.2. Les cultures ont été incubées pendant une nuit à 37 °C, 250 tr/min.The transformants of E. coli were collected on an agar plate and used to inoculate 200 ml of LBT broth ± 1% (w / v) glucose + kanamycin (50 μg / ml) to obtain a D. 0.6oonm between 0.1 and 0.2. The cultures were incubated overnight at 37 ° C, 250 rpm.

Chaque culture d'une nuit a été diluée au 1/20 dans 500 ml de milieu LBT contenant de la kanamycine (50 pg/ml) et cultivée à 37 °C à une vitesse d'agitation de 250 tr/min jusqu'à l'obtention d'une D.O. 620 de 0,5/0,6. A une D.0.6oonm autour de 0,6, les cultures ont été refroidies avant l'induction de l'expression de la protéine recombinante par l'addition de 1 mM d'isopropyl-p-D-l-thiogalactopyranoside (IPTG ; EMD Chemicals Inc., numéro de catalogue : 5815) et incubées pendant une nuit à 23 °C, 250 tr/min. ’Each overnight culture was diluted 1/20 in 500 ml of LBT medium containing kanamycin (50 μg / ml) and cultured at 37 ° C at a stirring speed of 250 rpm until the reaction was complete. obtaining an OD 620 of 0.5 / 0.6. At a D0.6oo around 0.6, the cultures were cooled prior to induction of recombinant protein expression by the addition of 1 mM isopropyl-pDl-thiogalactopyranoside (IPTG; EMD Chemicals Inc. catalog number 5815) and incubated overnight at 23 ° C, 250 rpm. '

Après une induction pendant une nuit (autour de 16 heures), les D. 0.6oonm ont été évaluées après l'induction et les cultures ont été centrifugées à 14 000 tr/min pendant 15 minutes et les culots ont été congelés à -20 °C séparément.After overnight induction (around 16 hours), the D. 0.6oonm was evaluated after induction and the cultures were centrifuged at 14,000 rpm for 15 minutes and the pellets were frozen at -20 ° C. C separately.

Plasmide d'expression et souche recombinante : extrémité N-terminale de la CDTa (C49 et C50 telles que présentées dans le tableau A)Expression plasmid and recombinant strain: N-terminal end of CDTa (C49 and C50 as shown in Table A)

Les gènes codant pour la protéine de l'extrémité N-terminale, sans le peptide signal de la CDTa (voir le tableau A) et un marqueur His à l'extrémité C-terminale ont été clonés dans le vecteur d'expression pET24b(+) (Novagen) en utilisant les sites de restriction Ndel/Xhol en utilisant des procédures classiques. Les constructions finales ont été produites par la transformation de la souche d'E. coli HMS174 (DE3) avec chaque vecteur d'expression recombinant séparément selon le procédé classique avec des cellules traitées au CaCl2 (Hanahan D. « Plasmid transformation by Simanis. » Dans Glover, D. M. (Ed), DNA cloning. IRL Press London. (1985): p. 109-135.).The genes encoding the N-terminus protein, without the CDTa signal peptide (see Table A) and a His-tag at the C-terminus were cloned into the pET24b expression vector (+ ) (Novagen) using the NdeI / XhoI restriction sites using standard procedures. The final constructions were produced by the transformation of the strain of E. coli HMS174 (DE3) with each recombinant expression vector separately according to the conventional method with CaCl2-treated cells (Hanahan D. "Plasmid transformation by Simanis." In Glover, DM (Ed), DNA cloning, IRL Press London. 1985): pp. 109-135.).

Souche hôte :Host strain:

HMS 174 (DE3). Les souches HMS174 fournissent la mutation recA dans un contexte K-12. Les souches avec la désignation (DE3) sont lysogènes pour un prophage λ qui contient une T7 ARN polymérase inductible par IPTG. Les lysogènes λ DE3 sont conçus pour l'expression de protéines à partir de vecteurs pET. Génotype : F- recAl hsdR(ΐκΐ2~ πΐκΐ2+) (Rif R) .HMS 174 (DE3). HMS174 strains provide the recA mutation in a K-12 context. Strains with the designation (DE3) are lysogenic for λ prophage which contains an IPTG-inducible T7 RNA polymerase. Λ DE3 lysogens are designed for the expression of proteins from pET vectors. Genotype: F-recAl hsdR (ΐκΐ2 ~ πΐκΐ2 +) (Rif R).

Expression des protéines recombinantes :Expression of recombinant proteins:

Les transformants d'E. coli ont été prélevés à partir d'une plaque de gélose et utilisés pour inoculer 200 ml de bouillon LBT ± 1 % (p/v) de glucose + kanamycine (50 pg/ml) pour obtenir une D.O. 600nm entre 0,1 et 0,2. Les cultures ont été incubées pendant une nuit à 37 °C, 250 tr/min.The transformants of E. coli were taken from an agar plate and used to inoculate 200 ml LBT broth ± 1% (w / v) glucose + kanamycin (50 μg / ml) to obtain an OD 600nm between 0.1 and 0. 2. The cultures were incubated overnight at 37 ° C, 250 rpm.

Cette culture d'une nuit a été diluée au 1/20 dans 500 ml de milieu LBT contenant de la kanamycine (50 pg/ml) et cultivée à 37 °C à une vitesse d'agitation de 250 tr/min jusqu'à l'obtention d'une D.O. 620 de 0,5/0,6. A une D.O. 600nm autour de 0,6, la culture a été refroidie avant l'induction de l'expression de la protéine recombinante par l'addition de 1 mM d ' isopropyl^-D-l-thiogalactopyranoside ( IPTG ; EMD Chemicals Inc., numéro de catalogue : 5815) et incubée pendant une nuit à 23 °C, 250 tr/min.This overnight culture was diluted 1/20 in 500 ml of LBT medium containing kanamycin (50 μg / ml) and cultured at 37 ° C at a stirring speed of 250 rpm until the reaction was complete. obtaining an OD 620 of 0.5 / 0.6. At an OD 600nm around 0.6, the culture was cooled prior to induction of recombinant protein expression by the addition of 1 mM isopropyl-D1-thiogalactopyranoside (IPTG; EMD Chemicals Inc., catalog number 5815) and incubated overnight at 23 ° C, 250 rpm.

Après une incubation d'une nuit (autour de 16 heures), la D. 0.6oonm a été évaluée après induction et la culture a été centrifugée à 14 000 tr/min pendant 15 minutes et les culots ont été congelés à -20 °C séparément.After overnight incubation (around 16 hours), D. 0.6oonm was evaluated after induction and the culture was centrifuged at 14,000 rpm for 15 minutes and the pellets were frozen at -20 ° C. separately.

PurificationPurification

La procédure suivante a été utilisée pour purifier les constructions C34, C44, C49, C50, C54, C67, C69, C107 et C110. Les culots bactériens ont été remis en suspension dans des tampons bicine à 20 mM ou 50 mM (pH 7,5 ou pH 8,0), contenant 500 mM de NaCl, 0 mM ou 5 mM de TCEP (Thermo Scientific Pierce, (chlorhydrate de 2-carboxyéthyl)phosphine)) et un mélange d'inhibiteurs de protéases (Complété, Roche, sans EDTA). Les bactéries ont été lysées en utilisant un système de presse de French 3 X 20 000 PSI. Les composants solubles (surnageant) et insolubles (culot) ont été séparés par centrifugation à 20 000 g pendant 30 min à 4 °C.The following procedure was used to purify constructions C34, C44, C49, C50, C54, C67, C69, C107 and C110. The bacterial pellets were resuspended in 20 mM or 50 mM bicine buffers (pH 7.5 or pH 8.0), containing 500 mM NaCl, 0 mM or 5 mM TCEP (Thermo Scientific Pierce, Hydrochloride). 2-carboxyethyl) phosphine)) and a mixture of protease inhibitors (Complete, Roche, EDTA-free). The bacteria were lysed using a French 3 X 20 000 PSI press system. Soluble (supernatant) and insoluble (pellet) components were separated by centrifugation at 20,000 xg for 30 min at 4 ° C.

Les protéines marquées par 6-His ont été purifiées dans des conditions natives sur IMAC. Les composants solubles ont été chargés sur une colonne GE Histrap de 5 ml (GE) pré-équilibrée avec le même tampon que celui utilisé pour la remise en suspension des bactéries. Après le chargement sur la colonne, la colonne a été lavée avec un tampon bicine à 20 mM ou 50 mM (pH 7,5 ou pH 8,0), contenant 500 mM de NaCl, 10 mM d'imidazole, 5 mM de TCEP. L'élution a été effectuée en utilisant un tampon bicine à 50 mM pH 7,6, 500 mM de NaCl, 1 mM de TCEP et de l'imidazole (250 mM ou 500 mM).The 6-His-tagged proteins were purified under native conditions on IMAC. The soluble components were loaded onto a 5 ml GE Histrap (GE) column pre-equilibrated with the same buffer used for resuspension of the bacteria. After loading onto the column, the column was washed with 20 mM or 50 mM bicine buffer (pH 7.5 or pH 8.0), containing 500 mM NaCl, 10 mM imidazole, 5 mM TCEP . Elution was performed using a 50 mM bicine buffer pH 7.6, 500 mM NaCl, 1 mM TCEP and imidazole (250 mM or 500 mM).

Après les étapes de dessalage (BIORAD Bio-Gel P6 Desalting) et de concentration (Amicon Ultra 10 kDa) , le produit a été chargé sur une chromatographie SEC (SUPERDEX™ 75 ou 200) dans du tampon bicine à 20 mM ou 50 mM (pH 7,5 ou pH 8,0), 150 mM de NaCl, 1 mM de TCEP, pour une autre étape de purification.After desalting (BIORAD Bio-Gel P6 Desalting) and concentration (Amicon Ultra 10 kDa), the product was loaded on SEC (SUPERDEX ™ 75 or 200) chromatography in 20 mM or 50 mM bicine buffer ( pH 7.5 or pH 8.0), 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, for another purification step.

Les fractions contenant l'antigène CDTa ont été sélectionnées sur la base de la pureté par SDS-PAGE. La concentration des protéines a été déterminée en utilisant le dosage de protéines de Lowry RC/DC de Bio-Rad. Le vrac purifié a été stérilisé par filtration sur 0,22 pm et stocké à -80 °C.Fractions containing the CDTa antigen were selected on the basis of purity by SDS-PAGE. Protein concentration was determined using the Bio-Rad Lowry RC / DC protein assay. The purified bulk was sterilized by 0.22 μm filtration and stored at -80 ° C.

Exemple 4 - Conception, clonage, expression et purification de la protéine CDTb de C. difficile avec une capacité à former des pores modifiéeExample 4 - Design, Cloning, Expression and Purification of C. difficile CDTb Protein with Modified Pore Capability

Une première stratégie a été évaluée afin de diminuer la cytotoxicité observée pour la CDTb seule : éviter la possibilité pour la CDTb de modifier sa structure dans un endosome afin de former un pore dans la membrane de cet endosome. Les deux stratégies suivies dans cette approche ont été basées sur des données de publications disponibles pour les composants B provenant de la toxine binaire de Bacillus anthracis (C123 et C149) et de Clostridium botulinum (C126, C152, C164 et C166). Les protéines CDTb suivantes ont été conçues :A first strategy was evaluated in order to reduce the cytotoxicity observed for CDTb alone: to avoid the possibility for CDTb to modify its structure in an endosome in order to form a pore in the membrane of this endosome. The two strategies followed in this approach were based on available literature data for B components from the binary toxin Bacillus anthracis (C123 and C149) and Clostridium botulinum (C126, C152, C164 and C166). The following CDTb proteins have been designed:

*Prend en compte le codon de départ Met et le marqueur His Clonage et production* Takes into account the starting codon Met and the His Cloning and Production tag

Marqueur His à l'extrémité C-terminale / clonage dans le vecteur pGEX-6pl dans le site BamHl-Xhol / Souches B834(DE3) : génotype : souche d'E. coli BL21::DE3, F- ompT hsdSB(rB- mB-) gai dcm (DE3) .His tag at the C-terminus / cloning in the pGEX-6pl vector in the BamH1-XhoI / B834 strain (DE3): genotype: E. coli BL21 :: DE3, F-ompT hsdSB (rB- mB-) gd dcm (DE3).

B834 est la souche parentale pour BL2. Ces hôtes déficients en protéases sont auxotrophes pour la méthionine. Les lysogènes λ DE3 sont conçus pour l'expression de protéines à partir de vecteurs pET et pGEX. Cette souche est également déficiente en protéases Ion et ompT. Antibiotique de la sélection : ampicilline : 50 pg/ml/ production pendant une nuit à 16 °CB834 is the parental strain for BL2. These protease deficient hosts are auxotrophic for methionine. Λ DE3 lysogens are designed for the expression of proteins from pET and pGEX vectors. This strain is also deficient in proteases Ion and ompT. Antibiotic selection: ampicillin: 50 μg / ml / overnight production at 16 ° C

Purification (C123, C126, C149 et C152) :Purification (C123, C126, C149 and C152):

Presse de French avec tampon de lyse : 50 mM de Bicine - 500 mM de NaCl - 5 mM de TCEP - Complété - pH 8,0 Ni-NTA GE Histrap 5 ml (profinia) + dessalageFrench press with lysis buffer: 50 mM Bicine - 500 mM NaCl - 5 mM TCEP - Completed - pH 8.0 Ni-NTA GE Histrap 5 ml (profinia) + desalting

Equilibrée : 50 mM de Bicine - 500 mM de NaCl, 1 mM de TCEP -pH 8,0Equilibrated: 50 mM Bicine - 500 mM NaCl, 1 mM TCEP -pH 8.0

Lavage : 50 mM de Bicine - 150 mM de NaCl, 1 mM de TCEP - imidazole 0 mM - pH 8,0Wash: 50 mM Bicine - 150 mM NaCl, 1 mM TCEP - Imidazole 0 mM - pH 8.0

Elution : 50 mM de Bicine - 150 mM de NaCl, 1 mM de TCEP - imidazole 250 mM - pH 8,0Elution: 50 mM Bicine - 150 mM NaCl, 1 mM TCEP - Imidazole 250 mM - pH 8.0

Dessalage : 50 mM de Bicine - 150 mM de NaCl - 1 mM de TCEP -pH 8, 0Desalting: 50 mM Bicine - 150 mM NaCl - 1 mM TCEP -pH 8, 0

Clivage par Prescission (marqueur GST) : .+ 375 μΐ (500 UI/ 250 μΐ) : 750 UIPrescission cleavage (GST marker): + 375 μΐ (500 IU / 250 μΐ): 750 IU

Une nuit à 4 °C + addition de Tween 20 à 0,2 % de concentration finale . GSTrap FF (1 ml)One night at 4 ° C + addition of Tween 20 at 0.2% final concentration. GSTrap FF (1 ml)

Equilibrée dans le tampon : 50 mM de Bicine - 150 mM de NaCl -1 mM de TCEP - 0,2 % de Tween 20 - pH 8,0 Maintenir la FTEquilibrated in the buffer: 50 mM Bicine - 150 mM NaCl -1 mM TCEP - 0.2% Tween 20 - pH 8.0 Maintain the FT

Tampon de lavage : identique au tampon d'équilibrageWash Buffer: Same as Balancing Buffer

Tampon de dilution : 50 mM de Bicine - 150 mM de NaCl - 1 mM de TCEP - 0,2 % de Tween 20 - 250 mM d'imidazole - pH 8,0 IMAC GE 5 ml + dessalageDilution buffer: 50 mM Bicine - 150 mM NaCl - 1 mM TCEP - 0.2% Tween 20 - 250 mM imidazole - pH 8.0 IMAC GE 5 ml + desalting

Equilibrée dans le tampon : 50 mM de Bicine - 150 mM de NaCl -1 mM de TCEP - 0,2 % de Tween 20 - pH 8,0Balanced in buffer: 50 mM Bicine - 150 mM NaCl -1 mM TCEP - 0.2% Tween 20 - pH 8.0

Tampon de lavage : 50 mM de Bicine - 150 mM de NaCl - 1 mM de TCEP - 10 mM d'imidazole - 0,2 % de Tween20 - pH 8,0Wash Buffer: 50mM Bicine - 150mM NaCl - 1mM TCEP - 10mM Imidazole - 0.2% Tween20 - pH 8.0

Tampon de dilution : 50 mM de Bicine - 150 mM de NaCl- 1 mM de TCEP - 250 mM d'imidazole - 0,2 % de Tween 20 - pH 8,0Dilution buffer: 50 mM Bicine - 150 mM NaCl - 1 mM TCEP - 250 mM imidazole - 0.2% Tween 20 - pH 8.0

Tampon de dessalage : 50 mM de Bicine - 150 mM de NaCl - 1 mM de TCEP - 0,2 % de Tween 20 - pH 8,0Desalting Buffer: 50 mM Bicine - 150 mM NaCl - 1 mM TCEP - 0.2% Tween 20 - pH 8.0

Dosage RC/DCRC / DC dosing

Activation : traitement à la chymotrypsine :Activation: chymotrypsin treatment:

100 pg de chymotrypsine (1 pg/μΐ) activent 1 mg de protéine (42 mg + 3,6 mg de chymotrypsine dans 12,5 ml de volume final) 50 min à TA + inactivation : inhibiteur de la chymotrypsine 12,6 mg SEC Superdex 200100 μg of chymotrypsin (1 μg / μΐ) activate 1 mg of protein (42 mg + 3.6 mg of chymotrypsin in 12.5 ml of final volume) 50 min at RT + inactivation: chymotrypsin inhibitor 12.6 mg SEC Superdex 200

Equilibrée : 50 mM de Bicine - 150 mM de NaCl - 1 mM de TCEP -pH 8,0 'Equilibrated: 50 mM Bicine - 150 mM NaCl - 1 mM TCEP - pH 8.0

Concentration sur IMAC GE 1 ml + dessalageConcentration on IMAC GE 1 ml + desalting

Equilibrée dans le tampon : 50 mM de Bicine - 150 mM de NaCl -1 mM de TCEP - pH 8,0Equilibrated in buffer: 50 mM Bicine - 150 mM NaCl -1 mM TCEP - pH 8.0

Tampon de lavage : 50 mM de Bicine - 150 mM de NaCl - 1 mM de TCEP - pH 8,0Wash buffer: 50 mM Bicine - 150 mM NaCl - 1 mM TCEP - pH 8.0

Tampon dilution : 50 mM de Bicine - 150 mM de NaCl - 1 mM de TCEP - 250 mM d'imidazole - pH 8,0Buffer dilution: 50 mM Bicine - 150 mM NaCl - 1 mM TCEP - 250 mM imidazole - pH 8.0

Tampon de dessalage : 50 mM de Bicine - 150 mM de NaCl - 1 mM de TCEP - pH 8,0Desalting buffer: 50 mM Bicine - 150 mM NaCl - 1 mM TCEP - pH 8.0

Filtration sur 0,22 pm, dosage RC/DC0.22 μm filtration, RC / DC dosing

La purification de C164 a été réalisée conformément au schéma 1 suivant :The purification of C164 was carried out in accordance with the following scheme 1:

Presse de French avec le tampon de lyse : 50 mM de Bicine - 500 mM de NaCl - 5 mM de TCEP - Complété - pH 8,0 -benzonaseFrench Press with lysis buffer: 50 mM Bicine - 500 mM NaCl - 5 mM TCEP - Completed - pH 8.0 -Benzonase

Ni-NTA GE Histrap 5mlNi-NTA GE Histrap 5ml

Equilibrée : 50 mM de Bicine -150 mM de NaCl, 1 mM de TCEP - pH 8,0 Lavage : 50 mM de Bicine -150 mM de NaCl -1 mM de TCEP - imidazole 10 mM - pH 8,0 Elution : 50 mM de Bicine -150 mM de NaCl, 1 mM de TCEP - imidazole 250 mM - pH 8,0Equilibrated: 50 mM Bicine -150 mM NaCl, 1 mM TCEP - pH 8.0 Wash: 50 mM Bicine -150 mM NaCl -1 mM TCEP - imidazole 10 mM - pH 8.0 Elution: 50 mM Bicine -150 mM NaCl, 1 mM TCEP - Imidazole 250 mM - pH 8.0

Groupe A = lavage 10 mM Groupe B = élution 250 mMGroup A = washing 10 mM Group B = elution 250 mM

SEC Superdex 200 SEC Superdex 200SEC Superdex 200 SEC Superdex 200

Equilibrée : 50 mM de Bicine - Equilibrée : 50 mM de Bicine -Balanced: 50 mM Bicine - Equilibrated: 50 mM Bicine -

150 mM de NaCl -1 mM de TCEP 150 mM de NaCl -1 mM de TCEP - pH 8,0 - pH 8,0150 mM NaCl -1 mM TCEP 150 mM NaCl -1 mM TCEP - pH 8.0 - pH 8.0

Filtration sur 0,22 μπι, dosage RC/DC Filtration sur 0,22 pm, dosage RC/DC0.22 μπι filtration, RC / DC dosing 0.22 μm filtration, RC / DC dosing

Schéma 1Diagram 1

La purification de C166 a été réalisée conformément au schéma 2 suivant :Purification of C166 was performed according to Scheme 2 below:

Presse de French avec le tampon de lyse : 50 mM de Bicine - 500 mM de NaCI - 5 mM de TCEP - pH 7,5French press with lysis buffer: 50 mM Bicine - 500 mM NaCl - 5 mM TCEP - pH 7.5

Nr-NTA GE HistraplmlNr-NTA GE Histraplml

Equilibrée : 50 mM de Bicine - 500 mM de NaCI, 1 mM de TCEP - pH 7,5 Lavage : 50 mM de Bicine -500 mM de NaCI, 1 mM de TCEP - imidazole 10 mM - pH 7,5 Elution : 50 mM de Bicine -150 mM de NaCI -1 mM de TCEP - 500 mM d'imidazole - pH 7,5Equilibrated: 50 mM Bicine - 500 mM NaCl, 1 mM TCEP - pH 7.5 Wash: 50 mM Bicine - 500 mM NaCl, 1 mM TCEP - Imidazole 10 mM - pH 7.5 Elution: 50 mM Bicine -150 mM NaCl -1 mM TCEP - 500 mM Imidazole - pH 7.5

SEC : Superdex 200 xk16/60 120ml 50 mM de Bicine -150 mM de NaCI -1 mM de TCEP - pH 7,5SEC: Superdex 200 xk16 / 60 120ml 50mM Bicine -150mM NaCl -1 mM TCEP - pH 7.5

0,22μπι0,22μπι

* Dosage de Lowry RC/DC* Lowry RC / DC dosing

Schéma 2Figure 2

Caractérisation :Characterization :

La diffusion dynamique de la lumière est utilisée pour évaluer le rayon hydrodynamique en solution des protéines CDTb purifiées, en plus de fournir des informations sur l'homogénéité et de détecter la présence d'agrégats de poids moléculaire élevé au sein d'un échantillon de protéines. Ceci est basé sur le calcul du coefficient de diffusion des différentes espèces qui sont obtenues en mesurant la fluctuation de la diffusion de la lumière, qui dépend de la taille moléculaire et de la forme des protéines, et des autres constituants mineurs de l'échantillon.Dynamic light scattering is used to evaluate the hydrodynamic radius in solution of purified CDTb proteins, in addition to providing information on homogeneity and detecting the presence of high molecular weight aggregates within a protein sample. . This is based on the calculation of the diffusion coefficient of the different species that are obtained by measuring the fluctuation of light scattering, which depends on the molecular size and shape of the proteins, and the other minor constituents of the sample.

Les échantillons des protéines ont été analysés sur un lecteur de plaque Dynapro (Wyatt technology), en utilisant cinq acquisitions de 15 secondes à 25 °C.Protein samples were analyzed on a Dynapro plate reader (Wyatt technology), using five 15-second acquisitions at 25 ° C.

Tampon a : 50 mM de Bicine - 150 mM de NaCl - 1 mM de TCEP - pH 8, 0Buffer a: 50 mM Bicine - 150 mM NaCl - 1 mM TCEP - pH 8.0

Les résultats sont présentés sur la figure 3.The results are shown in Figure 3.

Exemple 5 - Conception, clonage, expression et purification de la protéine CDTb de C. difficile avec le peptide signal et le prodomaine éliminés et également le domaine de liaison aux récepteurs éliminé et/ou le domaine de liaison à la CDTa éliminéExample 5 - Design, cloning, expression and purification of C. difficile CDTb protein with removed signal peptide and prodomain and also eliminated receptor binding domain and / or CDTa binding domain removed

La raison d'exprimer les différents domaines structuraux de la CDTb seuls a été de comprendre lequel mène au problème de dégradation et d'agrégation. Deux domaines ont été évalués en utilisant cette stratégie : le domaine de liaison aux récepteurs et le domaine de liaison à la CDTa ont été éliminés sur la construction C116 et C117, respectivement. Les domaines « d'oligomérisation » et « d'insertion membranaire » de la CDTb n'ont pas été exprimés séparément parce qu'ils sont potentiellement associés au niveau structural. Les protéines CDTb suivantes ont été conçues :The reason for expressing the different structural domains of CDTb alone has been to understand which leads to the problem of degradation and aggregation. Two domains were evaluated using this strategy: the receptor binding domain and the CDTa binding domain were removed on the C116 and C117 constructs, respectively. The "oligomerization" and "membrane insertion" domains of CDTb have not been expressed separately because they are potentially associated at the structural level. The following CDTb proteins have been designed:

*Prend en compte le codon de départ de Met et le marqueur His Clonage et production* Takes into account the start codon of Met and the His Cloning and Production counter

Marqueur His à l'extrémité C-terminale / clonage dans le vecteur pET24b dans le site Ndel-Xhol / Souches B834(DE3): génotype : souche d'E. coli BL21::DE3, F- ompT hsdSB(rB- mB-) gai dcm (DE3). B834 est la souche parentale pour BL2. Ces hôtes déficients en protéases sont auxotrophes pour la méthionine. Les lysogènes λ DE3 sont conçus pour l'expression de protéines à partir de vecteurs pET. Ce vecteur est également déficient en protéasesHis tag at the C-terminus / cloning in the pET24b vector in the NdeI-XhoI site / B834 strain (DE3): genotype: strain of E. coli coli BL21 :: DE3, F-ompT hsdSB (rB- mB-) gd dcm (DE3). B834 is the parental strain for BL2. These protease deficient hosts are auxotrophic for methionine. Λ DE3 lysogens are designed for the expression of proteins from pET vectors. This vector is also deficient in proteases

Ion et ompT. Antibiotique de la sélection : kanamycine : 50 pg/ml/ production pendant une nuit à 16 °C.Ion and ompT. Antibiotic selection: kanamycin: 50 μg / ml / overnight production at 16 ° C.

Purification et caractérisation C116Purification and characterization C116

Presse de FrenchFrench Press

Tampon de lyse : 50 mM de Bicine - 500 mM de NaCl - 5 mM de TCEP - Complété - pH 8,0 Ni-NTA GE Histrap 5 mlLysis buffer: 50 mM Bicine - 500 mM NaCl - 5 mM TCEP - Completed - pH 8.0 Ni-NTA GE Histrap 5 ml

Equilibrée : 8 M d'urée - 50 mM de Bicine - 500 mM de NaCl - 1 mM de TCEP - pH 8,0 .Equilibrated: 8 M urea - 50 mM Bicine - 500 mM NaCl - 1 mM TCEP - pH 8.0.

Lavage : 8 M d'urée - 50 mM de Bicine - 500 mM de NaCl - 1 mM de TCEP - 5 mM d'imidazole - pH 8,0 Repliement sur colonne HistrapWash: 8 M urea - 50 mM Bicine - 500 mM NaCl - 1 mM TCEP - 5 mM imidazole - pH 8.0 Fold over Histrap column

Gradient : 100 min à 1 ml/min : 8M à 50 mM de Bicine - 150 mM de NaCl - 1 mM de TECP - pH 8,0 1 mM de TCEP à 0 M d'urée 50 mM de Bicine - 150 mM de NaCl - 1 mM de TECP - pH 8,0Gradient: 100 min at 1 ml / min: 8M at 50 mM Bicine - 150 mM NaCl - 1 mM TECP - pH 8.0 1 mM TCEP at 0 M urea 50 mM Bicine - 150 mM NaCl - 1 mM TECP - pH 8.0

Elution 50 mM de Bicine - 150 mM de NaCl - 1 mM de TCEP - imidazole 500 mM - pH 7,5 SEC : Superdex 200Elution of 50 mM Bicine - 150 mM NaCl - 1 mM TCEP - Imidazole 500 mM - pH 7.5 SEC: Superdex 200

50 mM de Bicine - 150 mM de NaCl - 1 mM de TCEP - pH 7,5 0,22 μτη - Dosage de Lowry RC/DC C11750 mM Bicine - 150 mM NaCl - 1 mM TCEP - pH 7.5 0.22 μτη - Lowry RC / DC assay C117

Presse de French avec le tampon,de lyse : 50 mM de Bicine - 500 mM de NaCl - 5 mM de TCEP, Complété - pH 8,0 Ni-NTA GE Histrap 5 ml (profinia)French press with buffer, lysis: 50 mM Bicine - 500 mM NaCl - 5 mM TCEP, Completed - pH 8.0 Ni-NTA GE Histrap 5 ml (profinia)

Equilibrée : 50 mM de Bicine - 500 mM de NaCl - 1 mM de TCEP -pH 8, 0Equilibrated: 50 mM Bicine - 500 mM NaCl - 1 mM TCEP - pH 8, 0

Lavage : 50 mM de Bicine - 500 mM de NaCl - 1 mM de TCEP - imidazole 0 mM - pH 8,0Wash: 50 mM Bicine - 500 mM NaCl - 1 mM TCEP - Imidazole 0 mM - pH 8.0

Elution : 50 mM de Bicine - 150 mM de NaCl - 1 mM de TCEP - imidazole 500 mM - pH 7,5 SEC Superdex 200Elution: 50 mM Bicine - 150 mM NaCl - 1 mM TCEP - Imidazole 500 mM - pH 7.5 SEC Superdex 200

Equilibrée : 50 mM de Bicine - 150 mM de NaCl - 1 mM de TCEP -pH 7,5Balanced: 50 mM Bicine - 150 mM NaCl - 1 mM TCEP -pH 7.5

Filtration sur 0,22 pm, dosage RC/DC0.22 μm filtration, RC / DC dosing

Exemple 6 - Conception, clonage, expression et purification de la protéine CDTb de C. difficile avec la capacité d'heptamérisation modifiéeExample 6 - Design, Cloning, Expression and Purification of C. difficile CDTb Protein with Modified Heptamerization Capability

Une seconde stratégie a été utilisée afin de diminuer la cytotoxicité observée pour la CDTb seule : éviter 1'heptamérisation de la CDTb. Un modèle tridimensionnel d'un complexe heptamère de la CDTb a été conçu. En utilisant ce modèle, une boucle a été identifiée comme interagissant potentiellement entre les monomères. Deux approches ont été évaluées : l'élimination de cette boucle (C127) ou la mutation des résidus contenus dans cette boucle qui sont probablement impliqués dans l'interaction entre les monomères (C128). Les protéines suivantes ont été conçues :A second strategy was used to reduce the cytotoxicity observed for CDTb alone: avoid heptamerization of CDTb. A three-dimensional model of a heptamer complex of CDTb was designed. Using this model, a loop has been identified as potentially interacting between the monomers. Two approaches have been evaluated: the elimination of this loop (C127) or the mutation of the residues contained in this loop which are probably involved in the interaction between the monomers (C128). The following proteins have been designed:

*Prend en compte le codon de départ de Met et le marqueur His* Takes into account the start codon of Met and the His marker

Clonage et productionCloning and production

Marqueur His à l'extrémité C-terminale / clonage dans le vecteur pET24b dans le site Ndel-Xhol / Souches B834(DE3) : génotype : souche d'E. coli BL21::DE3, F- ompT hsdSB(rB- mB-) gai dcm (DE3) . B834 est la souche parentale pour BL2. Ces hôtes déficients en protéases sont auxotrophes pour la méthionine. Les lysogènes λ DE3 sont conçus pour l'expression de protéines à partir de vecteurs pET. Cette souche est également déficiente en protéases Ion et ompT. Antibiotique de la sélection : kanamycine : 50 yg/ml/ production pendant une nuit à 16 °C.His tag at the C-terminus / cloning in the pET24b vector in the NdeI-XhoI site / B834 strain (DE3): genotype: strain of E. coli coli BL21 :: DE3, F-ompT hsdSB (rB- mB-) gd dcm (DE3). B834 is the parental strain for BL2. These protease deficient hosts are auxotrophic for methionine. Λ DE3 lysogens are designed for the expression of proteins from pET vectors. This strain is also deficient in proteases Ion and ompT. Antibiotics of Selection: Kanamycin: 50 μg / ml / overnight production at 16 ° C.

Purification et caractérisation Presse de French avec le tampon de lyse : 50 mM de Bicine - 150 mM de NaCl - 0,4 % d'Empigen - 5 mM de TCEP - Complété - pH 8,0 Ni-NTA GE Histrap 1 ml (profinia)Purification and characterization French press with lysis buffer: 50 mM Bicine - 150 mM NaCl - 0.4% Empigen - 5 mM TCEP - Completed - pH 8.0 Ni-NTA GE Histrap 1 ml (profinia )

Equilibrée : 50 mM de Bicine - 150 mM de NaCl - 0,15 % d'Empigen - 1 mM de TCEP - pH 8,0Equilibrated: 50 mM Bicine - 150 mM NaCl - 0.15% Empigen - 1 mM TCEP - pH 8.0

Lavage : 50 mM de Bicine - 150 mM de NaCl - 0,2 % de Tween 20 -1 mM de TCEP - imidazole 10 mM - pH 8,0Wash: 50 mM Bicine - 150 mM NaCl - 0.2% Tween 20 -1 mM TCEP - Imidazole 10 mM - pH 8.0

Elution : 50 mM de Bicine - 150 mM de NaCl - 0,2 % de Tween 20 -1 mM de TCEP - imidazole 500 mM - pH 8,0Elution: 50 mM Bicine - 150 mM NaCl - 0.2% Tween 20 -1 mM TCEP - Imidazole 500 mM - pH 8.0

Dessalage G-25 : 50 mM de Bicine - 150 mM de NaCl - 0,2 % de Tween 20 - 1 mM de TCEP - pH 8,0Desalting G-25: 50 mM Bicine - 150 mM NaCl - 0.2% Tween 20 - 1 mM TCEP - pH 8.0

Activation par chymotrypsine SEC : Superdex 200 XK16/60 (120 ml)Activation with chymotrypsin SEC: Superdex 200 XK16 / 60 (120 ml)

Equilibrée : 50 mM de Bicine - 150 mM de NaCl - 1 mM de TCEP -pH 8,0Equilibrated: 50 mM Bicine - 150 mM NaCl - 1 mM TCEP - pH 8.0

Concentration : GE-HisTrap (1 ml) + dessalage 50 mM de Bicine - 150 mM de NaCl - 1 mM de TCEP - pH 8,0 0,22 μιη - Dosage de Lowry RC/DC Caractérisation :Concentration: GE-HisTrap (1 ml) + desalting 50 mM Bicine - 150 mM NaCl - 1 mM TCEP - pH 8.0 0,22 μιη - Lowry RC / DC assay Characterization:

Les échantillons des protéines ont été analysés sur un lecteur de plaque Dynapro (Wyatt technology), en utilisant cinq acquisitions de 15 secondes à 25 °CProtein samples were analyzed on a Dynapro plate reader (Wyatt technology), using five 15-second acquisitions at 25 ° C

Tampon a : 50 mM de Bicine - 150 mM de NaCl - 1 mM de TCEP - pH 8,0.Buffer a: 50 mM Bicine - 150 mM NaCl - 1 mM TCEP - pH 8.0.

Exemple 7 - Cytotoxicité des protéines CDTb sur des cellules HT29Example 7 Cytotoxicity of CDTb Proteins on HT29 Cells

Les sous-unités de la CDTb activées par la chymotrypsine (C37) seules apparaissent cytotoxiques sur des cellules HT29. Ceci suggère que la formation des pores pourrait être responsable de la cytotoxicité.Chymotrypsin (C37) activated CDTb subunits alone appear cytotoxic on HT29 cells. This suggests that pore formation could be responsible for cytotoxicity.

Une seconde génération de conception d'antigène a été produite afin d'inhiber l'étape de formation des pores en perturbant les interactions hydrophobes entre les feuillets bêta des protéines individuelles.A second generation of antigen design has been produced to inhibit the pore formation step by disrupting hydrophobic interactions between beta sheets of individual proteins.

Cette sous-unité B de la toxine binaire (partie liant les cellules) des toxines binaires a été ajoutée seule ou mélangée avec la sous-unité A (partie enzymatique) sur des cellules épithéliales de côlon humain (cellules HT29) pour évaluer leur cytotoxicité résiduelle.This B-subunit of the binary toxin (cell-binding part) of the binary toxins was added alone or mixed with the subunit A (enzymatic part) on human colon epithelial cells (HT29 cells) to evaluate their residual cytotoxicity. .

La cytotoxicité des C123, C126, C128, C164, C166, C116, C117, C149 et C152 candidates a été testée sur des lignées cellulaires HT2 9.The cytotoxicity of the candidate C123, C126, C128, C164, C166, C116, C117, C149 and C152 was tested on HT2 9 cell lines.

Test de cytotoxicité de la toxine binaireCytotoxicity test of the binary toxin

Des cellules épithéliales de côlon humain (cellules HT29) ont été cultivées à 37 °C avec 5 % de CO2 dans du DMEM + 10 % de sérum bovin foetal + 1 % de glutamine + 1 % d'antibiotiques (pénicilline-streptomycine-amphotéricine) et elles ont été ensemencées dans des plaques de culture tissulaire noires de 96 puits (Greiner Bio-one, référence : 655090) à une densité de 4 x 103 cellules/puits pour les HT29.Human colon epithelial cells (HT29 cells) were cultured at 37 ° C with 5% CO 2 in DMEM + 10% fetal bovine serum + 1% glutamine + 1% antibiotics (penicillin-streptomycin amphotericin) and were seeded in 96-well black tissue culture plates (Greiner Bio-one, reference: 655090) at a density of 4 x 103 cells / well for HT29.

Après 24 h, 50 μΐ du milieu cellulaire ont été prélevés des puits.After 24 h, 50 μl of the cell medium were taken from the wells.

Les toxines binaires candidates à caractériser ont été diluées afin d'atteindre 2 pg/ml de CDTa et 6 pg/ml de CDTb. En outre, des dilutions au 1/3 ont été réalisées dans la microplaque (NUNC, référence : 163320). 50 μΐ des dilutions en série des préparations des toxines binaires ont été ajoutés aux plaques noires et les microplaques ont été incubées à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 6 jours.The candidate binary toxins to be characterized were diluted to achieve 2 μg / ml CDTa and 6 μg / ml CDTb. In addition, 1/3 dilutions were made in the microplate (NUNC, reference: 163320). 50 μl of the serial dilutions of the binary toxin preparations were added to the black plates and the microplates were incubated at 37 ° C with 5% CO2 for 6 days.

Après 6 jours, le mélange de la toxine binaire et du milieu a été prélevé des puits et 100 μΐ de colorant Hoechst (BD Pharmingen, référence : 561908) dilué au 1/500 dans de la solution tampon phosphate (PBS) ont été ajoutés dans chaque puits pendant 2 heures dans l'obscurité à température ambiante.After 6 days, the mixture of the binary toxin and the medium was taken from the wells and 100 μl of Hoechst dye (BD Pharmingen, reference: 561908) diluted 1/500 in phosphate buffer solution (PBS) were added to each well for 2 hours in the dark at room temperature.

Après la coloration, le colorant Hoechst a été éliminé des puits et la fluorescence des cellules a été mesurée en utilisant un micros'cope Axiovision.After staining, the Hoechst stain was removed from the wells and the fluorescence of the cells was measured using an Axiovision microscope.

La cytotoxicité est exprimée en pourcentage de surface couverte de coloration fluorescente dans chaque puits. Aucun effet cytotoxique (100 % de récupération) n'est obtenu avec les cellules seules. Et un taux supérieur de cytotoxicité est obtenu avec la toxine binaire totalement activée (CDTa C34 + CDTb C37) . Les résultats sont présentés sur la figure 1, la figure 2 et la figure 8.The cytotoxicity is expressed as a percentage of surface area covered by fluorescent staining in each well. No cytotoxic effect (100% recovery) is obtained with cells alone. And a higher level of cytotoxicity is obtained with fully activated binary toxin (CDTa C34 + CDTb C37). The results are shown in Figure 1, Figure 2 and Figure 8.

Exemple 8 - Analyse des protéines CDTb par DLSExample 8 - Analysis of CDTb Proteins by DLS

La diffusion dynamique de la lumière (DLS) a été utilisée pour évaluer le rayon hydrodynamique en solution des protéines CDTb purifiées C123, C126 et C128, en plus de fournir des informations sur l'homogénéité et de détecter la présence d'agrégats de poids moléculaire élevé au sein d'un échantillon de protéines. Ceci est basé sur le calcul du coefficient de diffusion des différentes espèces qui sont obtenues en mesurant la fluctuation de la diffusion de la lumière, qui dépend de la taille moléculaire et de la forme des protéines, et des autres constituants mineurs de l'échantillon.Dynamic Light Diffusion (DLS) was used to evaluate the hydrodynamic radius in solution of the purified CDTb C123, C126 and C128 proteins, in addition to providing information on homogeneity and detecting the presence of molecular weight aggregates. elevated within a protein sample. This is based on the calculation of the diffusion coefficient of the different species that are obtained by measuring the fluctuation of light scattering, which depends on the molecular size and shape of the proteins, and the other minor constituents of the sample.

Les échantillons de protéines suivants ont été analysés sur un lecteur de plaque Dynapro (Wyatt technology), en utilisant cinq acquisitions de 15 secondes à 25 °C.The following protein samples were analyzed on a Dynapro plate reader (Wyatt technology), using five 15-second acquisitions at 25 ° C.

Toutes les protéines sont dans un tampon composé de 50 mM de Bicine - 150 mM de NaCl - 1 mM de TCEP - pH 8,0. Les mesures ont été effectuées sur le vrac purifié maintenu à 4 °C qui n'avait pas été congelé.All proteins are in a buffer composed of 50 mM Bicine - 150 mM NaCl - 1 mM TCEP - pH 8.0. The measurements were made on the purified bulk kept at 4 ° C which had not been frozen.

Comme il est montré sur la figure 3, à la fois la construction C126 KO pour la formation des pores et la construction C128 KO pour 1'heptamérisation présentent un rayon hydrodynamique de la population principale autour de 3 nm ce qui pourrait être cohérent avec un monomère. La construction C123 KO pour 1'heptamérisation est trouvée sous la forme d'un oligomère ou d'un agrégat homogène de poids moléculaire élevé, avec un rayon hydrodynamique de 15,7 nm.As shown in Fig. 3, both the C126 KO construct for pore formation and the C128 KO construct for heptamerization have a hydrodynamic radius of the main population around 3 nm which could be consistent with a monomer . The C123 KO construct for heptamerization is found as a high molecular homogeneous oligomer or aggregate with a hydrodynamic radius of 15.7 nm.

Le fait que les rayons hydrodynamiques moyens des échantillons totaux sont proches du rayon des populations principales, conjointement avec leur faible polydispersité, suggèrent que les protéines purifiées marquées par his C123, C126 et C128 présentent une distribution homogène des tailles.The fact that the average hydrodynamic radii of the total samples are close to the radius of the main populations, together with their low polydispersity, suggest that purified proteins labeled with his C123, C126 and C128 have a uniform size distribution.

Exemple 9 - Conception, clonage, expression et purification d'une protéine de fusion de CDTb de C. difficile comprenant une protéine CDTa pleine longueur et une protéine CDTbExample 9 - Design, Cloning, Expression and Purification of a C. difficile CDTb Fusion Protein Comprising a Full-Length CDTa Protein and a CDTb Protein

Il y a deux avantages majeurs pour une fusion de CDTa et de CDTb : le premier est un seul traitement pour obtenir 2 protéines. Le second : la CDTa est plus facile que la CDTb à produire -> le placement de la CDTa comme premier partenaire de la fusion pourrait potentiellement avoir un effet positif sur l'aptitude globale au traitement de la fusion. Dans la C139, les deux protéines matures CDTa (sans son peptide signal) et CDTb (sans son peptide signal et sans son prodomaine) ont été fusionnées.There are two major advantages for CDTa and CDTb fusion: the first is a single treatment to obtain 2 proteins. The second: CDTa is easier than the CDTb to produce -> placing CDTa as the first fusion partner could potentially have a positive effect on the overall merger processing ability. In C139, the two mature proteins CDTa (without its signal peptide) and CDTb (without its signal peptide and without its prodomaine) were fused.

Dans la C139, le partenaire CDTa est muté au niveau de la position 428 (un glutamate est muté en une glutamine) afin de muter l'activité cytotoxique de la CDTa, et le partenaire CDTa de cette fusion est muté en position 45 (une Cys a été mutée en un résidu Tyr) afin d'éviter la dimérisation observée de la CDTa.In C139, the CDTa partner is mutated at position 428 (a glutamate is mutated to glutamine) to mutate the cytotoxic activity of CDTa, and the CDTa partner of this fusion is mutated at position 45 (a Cys). was mutated to a Tyr residue) to avoid observed dimerization of CDTa.

Dans la C145, la partie CDTa de la fusion est la même que pour la C139. Le domaine de liaison à la CDTa du partenaire CDTb a été éliminé afin d'éviter potentiellement l'interaction entre ce domaine et le partenaire CDTa. Entre les deux partenaires, un lieur(« linker ») /espaceur (6 résidus Gly) a été ajouté afin d'améliorer la flexibilité structurale entre les partenaires et de permettre un repliement correct indépendant des deux protéines.In C145, the CDTa portion of the fusion is the same as for C139. CDTb's CDTa binding domain has been removed to potentially avoid interaction between this domain and the CDTa partner. Between the two partners, a linker / spacer (6 Gly residues) was added to improve the structural flexibility between the partners and to allow an independent correct folding of the two proteins.

Le domaine de liaison aux récepteurs de la CDTb présente un très bon rendement d'expression, est homogène mais moins immunogène que la CDTb mature. Nous avons essayé d'augmenter 1''immunogénicité de ce domaine en le fusionnant au partenaire CDTa mature. Deux limites différentes ont été conçues pour ce domaine de liaison aux récepteurs si bien que 2 fusions ont été évaluées. Dans la C155 et la C156, le partenaire CDTa est le même que pour la C139 et la C145. Dans la C156, entre les deux partenaires de la fusion, un espaceur/lieur (« linker ») a été ajouté (6 résidus Gly) . Ce lieur (« linker ») n'a pas été nécessaire dans la construction C155 parce que le domaine de liaison aux récepteurs de la CDTb utilisé dans la C155 débute par un long peptide non structuré et flexible qui pourra être utilisé en tant que lieur(« linker ») /espaceur.The CDTb receptor binding domain has a very good expression efficiency, is homogeneous but less immunogenic than mature CDTb. We have tried to increase the immunogenicity of this domain by fusing it to the mature CDTa partner. Two different limits were designed for this receptor binding domain so that 2 fusions were evaluated. In C155 and C156, the CDTa partner is the same as for C139 and C145. In C156, between the two partners of the fusion, a spacer / linker ("linker") was added (6 Gly residues). This linker was not needed in construct C155 because the CDTb receptor binding domain used in C155 begins with a long unstructured and flexible peptide that can be used as a linker ( "Linker") / spacer.

Les protéines de fusion suivantes ont été conçues :The following fusion proteins have been designed:

Clonage et production Comme pour 1'exemple 5.Cloning and production As for Example 5.

Exemple 10 - Evaluation du poids moléculaire des constructions de CDTb et de fusion CDTa-CDTb L'ultracentrifugation analytique peut être utilisée pour déterminer l'homogénéité et la distribution des tailles en solution des différentes espèces au sein d'un échantillon de protéines en mesurant la vitesse à laquelle les molécules se déplacent en réponse à une force centrifuge. Ceci est basé sur le calcul des coefficients de sédimentation des différentes espèces qui sont obtenues par une expérience de vitesse de sédimentation, qui dépendent de leur forme et masse moléculaire. 1. Les échantillons des protéines sont centrifugés dans une ultracentrifugeuse analytique Beckman-Coulter ProteomeLab XL-1 à 8000 tr/min, 25000 tr/min ou 42000 tr/min selon la taille de la protéine cible, après que la centrifugeuse AN-βθΤί a été équilibrée à 15 °C. 2. Pour le recueil des données, des balayages sont enregistrés à 280 nm toutes les 5 minutes. 3. L'analyse des données est effectuée en utilisant le programme SEDFIT pour la détermination de la distribution C(S). La détermination du volume partiel spécifique des protéines est effectuée avec le logiciel SEDNTERP pour leur séquence d'acides aminés. Sednterp peut être également utilisé pour déterminer la viscosité et la densité du tampon. 4. Le poids moléculaire des différentes espèces peut être déterminé à partir du tracé de la distribution C(S) (concentration en fonction du coefficient de sédimentation), en considérant qu'il s'agit d'une meilleure représentation des données brutes que la distribution C (M) (concentration en fonction du poids moléculaire) pour caractériser la distribution des tailles d'un mélange.Example 10 - Evaluation of the molecular weight of CDTb and CDTa-CDTb fusion constructs Analytical ultracentrifugation can be used to determine the homogeneity and size distribution of different species in a protein sample by measuring the the rate at which molecules move in response to centrifugal force. This is based on the calculation of the sedimentation coefficients of the different species that are obtained by a sedimentation rate experiment, which depend on their shape and molecular mass. 1. The protein samples are centrifuged in a Beckman-Coulter ProteomeLab XL-1 analytical ultracentrifuge at 8000 rpm, 25000 rpm or 42000 rpm depending on the size of the target protein, after the AN-βθΤί centrifuge has was equilibrated at 15 ° C. 2. For data collection, scans are recorded at 280 nm every 5 minutes. 3. The data analysis is performed using the SEDFIT program for the determination of the C (S) distribution. Determination of the specific partial volume of the proteins is performed with the SEDNTERP software for their amino acid sequence. Sednterp can also be used to determine the viscosity and density of the buffer. 4. The molecular weight of the different species can be determined from the plot of the C (S) distribution (concentration versus sedimentation coefficient), considering that it is a better representation of the raw data than the C (M) distribution (concentration versus molecular weight) to characterize the size distribution of a mixture.

Exemple 11 - Immunisation de souris avec des protéines sous-unitaires CDTa et CDTb de C. difficile dans une formulation d'ASOlBExample 11 Immunization of mice with C. difficile difficile CDTa and CDTb subunit proteins in an ASOlB formulation

Immunisation des sourisImmunization of mice

Des groupes de 25 souris Balb/C femelles ont été immunisées par IM aux jours 0, 14 et 28 avec 5 pg des sous-unités purifiées de la toxine binaire CDTa et CDTb. Ces antigènes ont été injectés dans une formulation d'ASOlB.Groups of 25 female Balb / C mice were immunized with IM at days 0, 14 and 28 with 5 μg of the purified subunits of the CDTa and CDTb binary toxin. These antigens were injected into an ASOlB formulation.

Les titres ELISA anti-CDTa et anti-CDTb ont été déterminés dans des sérums individuels prélevés au jour 42 (14 Post-III) . Les résultats sont présentés sur les figures 4 et 5.Anti-CDTa and anti-CDTb ELISA titers were determined in individual sera taken at day 42 (14 Post-III). The results are shown in Figures 4 and 5.

Un test d'inhibition de la cytotoxicité de la toxine binaire a été également effectué sur les sérums Post-III groupés (jour 42). Les résultats sont présentés sur les figures 6 et 7. Réponse ELISA anti-CDTa et anti-CDTb : Protocole Les sous-unités CDTa entière (C34) ou CDTb entière (C37) ont été déposées à 1 pg/ml (pour la CDTa) ou 2 pg/ml (pour la CDTb) dans de la solution tampon phosphate (PBS) sur des plaques de microtitrage à liaison élevée (Nunc MAXISORP™) , pendant une nuit à 4 °C. Les plaques ont été bloquées avec du PBS-BSA à 1 % pendant 30 min à TA sous agitation. Les antisérums des souris sont prédilués au 1/500 dans du PBS-BSA à 0,2 %-TWEEN™ à 0,05 % et ensuite, d'autres dilutions au demi ont été réalisées dans les microplaques et incubées à TA pendant 30 min. Après lavage, les anticorps de souris liés ont été détectés en utilisant des anticorps anti-souris conjugués à de la peroxydase de Jackson ImmunoLaboratories Inc. (référence : 115-035-003) dilués au 1/5000 dans du PBS-BSA à 0,2 %-Tween à 0,05 %. Les anticorps de détection ont été incubés pendant 30 min à température ambiante (TA) sous agitation. La couleur a été développée en utilisant 4 mg d'O-phénylènediamine (OPD) + 5 μΐ de H2O2 pour 10 ml de 0,1 M de tampon citrate pH 4,5 pendant 15 minutes dans l'obscurité à température ambiante. La réaction a été stoppée avec 50 μΐ de HCl, et la densité optique (DO) a été lue à 490 nm par rapport à 620 nm.A cytotoxicity inhibition test of the binary toxin was also performed on the pooled Post-III sera (day 42). The results are shown in Figures 6 and 7. Anti-CDTa and anti-CDTb ELISA response: Protocol Whole CDTa (C34) or full CDTb (C37) subunits were deposited at 1 μg / ml (for CDTa) or 2 μg / ml (for CDTb) in phosphate buffer solution (PBS) on high-binding microtiter plates (Nunc MAXISORP ™) overnight at 4 ° C. Plates were blocked with 1% PBS-BSA for 30 min at RT with shaking. The antisera of the mice are prediluted at 1/500 in 0.2% PBS-BSA-TEWEEN ™ at 0.05% and then other half dilutions were made in the microplates and incubated at RT for 30 min. . After washing, the bound mouse antibodies were detected using peroxidase-conjugated anti-mouse antibodies of Jackson ImmunoLaboratories Inc. (ref .: 115-035-003) diluted 1/5000 in PBS-BSA at 0, 2% -Tween at 0.05%. The detection antibodies were incubated for 30 min at room temperature (RT) with shaking. The color was developed using 4 mg of O-phenylenediamine (OPD) + 5 μl of H2O2 per 10 ml of 0.1 M citrate buffer pH 4.5 for 15 minutes in the dark at room temperature. The reaction was stopped with 50 μl of HCl, and the optical density (OD) was read at 490 nm against 620 nm.

Les taux des anticorps anti-CDTa ou anti-CDTb sont exprimés en titres intermédiaires. Un GMT a été calculé pour les 25 échantillons dans chaque groupe de traitement.The levels of anti-CDTa or anti-CDTb antibodies are expressed as intermediate titres. A GMT was calculated for the 25 samples in each treatment group.

Test d'inhibition de la cytotoxicité de la toxine binaire Des cellules épithéliales de côlon humain (cellules HT29 ou HCT-116) ont été cultivées à 37 °C avec 5 % de CO2 dans du DMEM + 10 % de sérum bovin fœtal + 1 % de glutamine + 1 % d'antibiotiques (pénicilline-streptomycine-amphotéricine) et elles ont été ensemencées dans des plaques de culture tissulaire noires de 96 puits (Greiner Bio-one, référence : 655090) à une densité de 4.104 cellules/puits pour les HT29 et 1.104 cellules/puits pour les HCT116.Test for inhibition of the cytotoxicity of the binary toxin Human colon epithelial cells (HT29 or HCT-116 cells) were cultured at 37 ° C. with 5% CO 2 in DMEM + 10% fetal bovine serum + 1% of glutamine + 1% of antibiotics (penicillin-streptomycin amphotericin) and were seeded into 96-well black tissue culture plates (Greiner Bio-one, reference: 655090) at a density of 4.104 cells / well for HT29 and 1.104 cells / well for HCT116.

Après 24 h, le milieu cellulaire a été prélevé des puits.After 24 h, the cell medium was removed from the wells.

Les antisérums des souris ont été prédilués au 1/50 dans le milieu cellulaire et ensuite, d'autres dilutions au tiers ont été réalisées dans la microplaque (NUNC, référence : 163320) . 50 μΐ des dilutions en série des antisérums de souris groupés ont été ajoutés aux plaques noires. 50 μΐ d'un mélange de CDTa (25 ng/ml) et de CDTb activée par chymotrypsine (75 ng/ml) ont été ensuite ajoutés et les plaques noires ont été incubées à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 6 jours.The antisera of the mice were prediluted at 1:50 in the cell medium and then further third dilutions were made in the microplate (NUNC, reference: 163320). 50 μl serial dilutions of pooled mouse antisera were added to the black plates. 50 μl of a mixture of CDTa (25 ng / ml) and chymotrypsin-activated CDTb (75 ng / ml) were then added and the black plates were incubated at 37 ° C with 5% CO2 for 6 days.

Après 6 jours, le mélange des antisérums et de la toxine a été prélevé des puits et 100 μΐ de colorant Hoescht (BD Pharmingen, référence : 561908) dilué au 1/500 dans de la solution tampon phosphate (PBS) ont été ajoutés dans chaque puits pendant 2 heures dans l'obscurité à température ambiante.After 6 days, the mixture of antisera and toxin was taken from the wells and 100 μl of Hoescht dye (BD Pharmingen, reference: 561908) diluted 1/500 in phosphate buffer solution (PBS) were added to each well for 2 hours in the dark at room temperature.

Après la coloration, le colorant Hoescht a été éliminé des puits et la fluorescence des cellules a été mesurée en utilisant un microscope Axiovision.After staining, the Hoescht dye was removed from the wells and the fluorescence of the cells was measured using an Axiovision microscope.

La surface couverte par la coloration fluorescente a été déterminée dans chaque puits et les titres d'inhibition de la cytotoxicité ont été définis comme l'inverse de la dilution induisant une inhibition de 50 % du signal fluorescent.The area covered by the fluorescent staining was determined in each well and the cytotoxicity inhibition titers were defined as the reciprocal of the dilution inducing a 50% inhibition of the fluorescent signal.

Exemple 12 - Cytotoxicité des protéines CDTb sur des cellules HCT116Example 12 Cytotoxicity of CDTb Proteins on HCT116 Cells

Les sous-unités CDTb activées par chymotrypsine (C37) seules apparaissent cytotoxiques sur des cellules HCT116. Ceci suggère que la formation des pores pourrait être responsable de la cytotoxicité.The chymotrypsin (C37) activated CDTb subunits alone appear cytotoxic on HCT116 cells. This suggests that pore formation could be responsible for cytotoxicity.

Une seconde génération de conception d'antigène a été produite afin d'inhiber l'étape de formation des pores par perturbation des interactions hydrophobes entre les feuillets bêta des protéines individuelles.A second generation of antigen design has been produced to inhibit the pore formation step by disrupting hydrophobic interactions between beta sheets of individual proteins.

Cette sous-unité B de la toxine binaire (partie liant les cellules) des toxines binaires a été ajoutée seule ou mélangée avec la sous-unité A de la toxine binaire (partie enzymatique) sur des cellules épithéliales de côlon humain (HCT116) pour évaluer leur cytotoxicité résiduelle.This B-subunit of the binary toxin (cell binding portion) of the binary toxins was added alone or mixed with the binary toxin subunit A (enzymatic portion) on human colon epithelial cells (HCT116) to evaluate their residual cytotoxicity.

La cytotoxicité des C123, C126, C128, C164, C166, C116, C117, C149 et C152 candidates a été testée sur des lignées cellulaires HCT116.The cytotoxicity of the candidate C123, C126, C128, C164, C166, C116, C117, C149 and C152 was tested on HCT116 cell lines.

Test de cytotoxicité de la toxine binaireCytotoxicity test of the binary toxin

Des cellules épithéliales de côlon humain (cellules HCT116) ont été cultivées à 37 °C avec 5 % de CO2 dans du DMEM + 10 % de sérum bovin fœtal + 1 % de glutamine + 1 % d'antibiotiques (pénicilline-streptomycine-amphotéricine) et elles ont été ensemencées dans des plaques de culture tissulaire noires de 96 puits (Greiner Bio-one, référence : 655090) à une densité de 103 cellules/puits pour les HCT116.Human colon epithelial cells (HCT116 cells) were cultured at 37 ° C with 5% CO 2 in DMEM + 10% fetal bovine serum + 1% glutamine + 1% antibiotics (penicillin-streptomycin amphotericin) and seeded in 96-well black tissue culture plates (Greiner Bio-one, reference: 655090) at a density of 103 cells / well for HCT116.

Les toxines binaires candidates à caractériser ont été diluées afin d'atteindre 2 pg/ml de la CDTa et 6 pg/ml de la CDTb. D'autres dilutions au tiers ont été réalisées dans la microplaque (NUNC, référence : 163320) . 50 μΐ des dilutions en série des préparations de toxines binaires ont été ajoutés aux plaques noires et les microplaques ont été incubées à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 6 jours.Candidate binary toxins to be characterized were diluted to achieve 2 μg / ml CDTα and 6 μg / ml CDTb. Other 1/3 dilutions were made in the microplate (NUNC, reference: 163320). 50 μl of the serial dilutions of the binary toxin preparations were added to the black plates and the microplates were incubated at 37 ° C with 5% CO2 for 6 days.

Après 6 jours, les mélanges de toxine binaire et de milieu ont été prélevés des puits et 100 μΐ de colorant Hoechst (BD Pharmingen, référence : 561908) dilué au 1/500 dans de la solution tampon phosphate (PBS) ont été ajoutés dans chaque puits pendant 2 heures dans l'obscurité à température ambiante.After 6 days, the mixture of binary toxin and medium were taken from the wells and 100 μl of Hoechst dye (BD Pharmingen, reference: 561908) diluted 1/500 in phosphate buffer solution (PBS) were added to each well for 2 hours in the dark at room temperature.

Après la coloration, le colorant Hoechst a été éliminé des puits et la fluorescence des cellules a été mesurée en utilisant un microscope Axiovision.After staining, the Hoechst stain was removed from the wells and the fluorescence of the cells was measured using an Axiovision microscope.

La cytotoxicité est exprimée en pourcentage de surface couverte de coloration fluorescente dans chaque puits. Aucun effet cytotoxique (100 % de récupération) n'est obtenu avec les cellules seules. Et un taux supérieur de cytotoxicité est obtenu avec la toxine binaire entière activée (CDTa C34 + CDTb C37). Les résultats sont présentés sur la figure 9.The cytotoxicity is expressed as a percentage of surface area covered by fluorescent staining in each well. No cytotoxic effect (100% recovery) is obtained with cells alone. And a higher level of cytotoxicity is obtained with the activated whole binary toxin (CDTa C34 + CDTb C37). The results are shown in Figure 9.

Exemple 13 - Cytotoxicité des protéines de fusion CDTa-CDTb sur des cellules HT29Example 13 Cytotoxicity of CDTa-CDTb Fusion Proteins on HT29 Cells

La cytotoxicité des fusions C139, C145, C155 et C156 a été testée sur des lignées cellulaires HT29. La cytotoxicité résiduelle potentielle associée à la sous-unité CdtB a été évaluée par surcharge avec de la sous-unité CdtA entière. La cytotoxicité résiduelle potentielle associée à la sous-unité CdtA a été évaluée par surcharge avec la sous-unité CdtB entière. L CDTa pleine longueur et la CDTb pleine longueur ont été utilisées en tant que témoins.Cytotoxicity of C139, C145, C155 and C156 fusions was tested on HT29 cell lines. Potential residual cytotoxicity associated with the CdtB subunit was evaluated by overloading with whole CdtA subunit. The potential residual cytotoxicity associated with the CdtA subunit was evaluated by overload with the entire CdtB subunit. Full-length CDTa and full-length CDTb were used as controls.

Test de cytotoxicité de la toxine binaireCytotoxicity test of the binary toxin

Des cellules épithéliales de côlon humain (cellules HT29) ont été cultivées à 37 °C avec 5 % de CO2 dans du DMEM + 10 % de sérum bovin fœtal + 1 % de glutamine + 1 % d'antibiotiques (pénicilline-streptomycine-amphotéricine) et elles ont été ensemencées dans des plaques de culture tissulaire noires de 96 puits (Greiner Bio-one, référence : 655090) à une densité de 4 x 103 cellules/puits pour les HT29.Human colon epithelial cells (HT29 cells) were cultured at 37 ° C with 5% CO 2 in DMEM + 10% fetal bovine serum + 1% glutamine + 1% antibiotics (penicillin-streptomycin amphotericin) and were seeded in 96-well black tissue culture plates (Greiner Bio-one, reference: 655090) at a density of 4 x 103 cells / well for HT29.

Les toxines binaires candidates à caractériser ont été diluées afin d'atteindre 2 μg/ml de la CDTa et 6 pg/ml de la CDTb. D'autres dilutions au tiers ont été réalisées dans la microplaque (NUNC, référence : 163320). 50 μΐ des dilutions en série des préparations des toxines binaires ont été ajoutés aux plaques noires et les microplaques ont été incubées à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 6 jours.The candidate binary toxins to be characterized were diluted in order to reach 2 μg / ml of CDTa and 6 μg / ml of CDTb. Other 1/3 dilutions were made in the microplate (NUNC, reference: 163320). 50 μl of the serial dilutions of the binary toxin preparations were added to the black plates and the microplates were incubated at 37 ° C with 5% CO2 for 6 days.

Après 6 jours, le mélange de la toxine binaire et du milieu a été prélevé du puits et 100 μΐ de colorant Hoechst (BD Pharmingen, référence : 561908) dilué au 1/500 dans de la solution tampon phosphate (PBS) ont été ajoutés dans chaque puits pendant 2 heures dans l'obscurité à température ambiante.After 6 days, the mixture of the binary toxin and the medium was taken from the well and 100 μl of Hoechst dye (BD Pharmingen, reference: 561908) diluted 1/500 in phosphate buffer solution (PBS) was added to each well for 2 hours in the dark at room temperature.

La cytotoxicité est exprimée en pourcentage de surface couverte de coloration fluorescente dans chaque puits. Aucun effet cytotoxique (100 % de récupération) n'est obtenu avec les cellules seules. Et un taux supérieur de cytotoxicité est obtenu avec la toxine binaire entière activée (CDTa C34 + CDTb C37). Aucune des fusions n'a été cytotoxique et il n'a été observé aucune cytotoxicité résiduelle associée à la sous-unité CDTb des fusions. Il n'a été observé aucune cytotoxicité résiduelle associée à la sous-unité CDTa dans la fusion CdtA entière-CDTb entière (C139). Une cytotoxicité résiduelle très faible associée à la sous-unité CDTa a été observée avec les 3 fusions n' incluant pas la CdtB pleine longueur (C145, C155, C156).The cytotoxicity is expressed as a percentage of surface area covered by fluorescent staining in each well. No cytotoxic effect (100% recovery) is obtained with cells alone. And a higher level of cytotoxicity is obtained with the activated whole binary toxin (CDTa C34 + CDTb C37). None of the fusions were cytotoxic and no residual cytotoxicity associated with the CDTb subunit of fusions was observed. No residual cytotoxicity associated with the CDTa subunit was observed in the whole CdtA-whole CDTb (C139) fusion. A very low residual cytotoxicity associated with the CDTa subunit was observed with the 3 fusions not including the full length CdtB (C145, C155, C156).

Les résultats sont présentés sur les figures 10 et 11.The results are shown in Figures 10 and 11.

Exemple 14 - Immunisation de souris avec des protéines CDTb ou des fusions CDTa-CDTb de C. difficile dans une formulation d'ASOlBExample 14 - Immunization of mice with CDTb proteins or CDTa-CDTb fusions of C. difficile in an ASOlB formulation

Immunisation des sourisImmunization of mice

Des groupes de 12 souris Balb/C femelles ont été immunisées par IM aux jours 0, 14 et 28 avec 1 pg des sous-unités purifiées de la toxine binaire CDTa et CDTb mais avec 2 pg des fusions CDTa-CDTb. Ces antigènes ont été injectés dans une formulation d'ASOlB.Groups of 12 female Balb / C mice were immunized with IM at days 0, 14 and 28 with 1 μg of the purified subunits of the CDTa and CDTb binary toxin but with 2 μg of CDTa-CDTb fusions. These antigens were injected into an ASOlB formulation.

Les titres ELISA anti-CDTa et anti-CDTb ont été déterminés dans des sérums individuels prélevés au jour 42 (14 Post-III). Les résultats sont présentés sur les figures 12 et 13.Anti-CDTa and anti-CDTb ELISA titers were determined in individual sera taken at day 42 (14 Post-III). The results are shown in Figures 12 and 13.

Un test d'inhibition de la cytotoxicité de la toxine binaire a été également réalisé sur des sérums Post-III groupés (jour 42) sur des lignées cellulaires HT29 et HCT116. Les résultats sont présentés sur la figure 14. Réponse ELISA anti-CDTa et anti-CDTb : Protocole Les sous-unités CDTa mutée E-428 (C44) ou CDTb non activée (C46) ont été déposées à 1 pg/ml dans de la solution tampon phosphate (PBS) sur des plaques de microtitrage à liaison élevée (Nunc MAXISORP™) , pendant une nuit à 4 °C. Les plaques ont été bloquées avec du PBS-BSA à 1 % pendant 30 min à TA sous agitation. Les antisérums des souris sont prédilués au 1/500 dans du PBS-BSA à 0,2 %-TWEEN™ à 0,05 % et ensuite, d'autres dilutions au demi ont été réalisées dans les microplaques et incubées à TA pendant 30 min. Après le lavage, l'anticorps de souris lié a été détecté en utilisant un anticorps anti-souris conjugué à de la peroxydase de Jackson ImmunoLaboratories Inc. (référence : 115035-003) dilué au 1/5000 dans du PBS-BSA à 0,2 %-Tween à 0,05 %. Les anticorps de détection ont été incubés pendant 30 min à température ambiante (TA) sous agitation. La couleur a été développée en utilisant 4 mg d'O-phénylènediamine (OPD) + 5 μΐ de H2O2 pour 10 ml de tampon citrate à 0,1 M pH 4,5 pendant 15 minutes dans l'obscurité à température ambiante. La réaction a été stoppée avec 50 μΐ de HCl, et la densité optique (DO) a été lue à 490 nm par rapport à 620 nm.A cytotoxicity inhibition test of the binary toxin was also performed on pooled Post-III sera (day 42) on HT29 and HCT116 cell lines. The results are shown in FIG. 14. Anti-CDTa and anti-CDTb ELISA response: Protocol The mutated CDTa subunits E-428 (C44) or non-activated CDTb (C46) were deposited at 1 μg / ml in phosphate buffer solution (PBS) on high-binding microtiter plates (Nunc MAXISORP ™) overnight at 4 ° C. Plates were blocked with 1% PBS-BSA for 30 min at RT with shaking. The antisera of the mice are prediluted at 1/500 in 0.2% PBS-BSA-TEWEEN ™ at 0.05% and then other half dilutions were made in the microplates and incubated at RT for 30 min. . After washing, bound mouse antibody was detected using peroxidase-conjugated anti-mouse antibody from Jackson ImmunoLaboratories Inc. (ref .: 115035-003) diluted 1/5000 in PBS-BSA at 0, 2% -Tween at 0.05%. The detection antibodies were incubated for 30 min at room temperature (RT) with shaking. The color was developed using 4 mg of O-phenylenediamine (OPD) + 5 μl of H2O2 per 10 ml of 0.1 M citrate buffer pH 4.5 for 15 minutes in the dark at room temperature. The reaction was stopped with 50 μl of HCl, and the optical density (OD) was read at 490 nm against 620 nm.

Le taux des anticorps anti-CDTa ou anti-CDTb’ est exprimé en titres intermédiaires. Un GMT a été calculé pour les 12 échantillons dans chaque groupe de traitement.The level of anti-CDTa or anti-CDTb 'antibodies is expressed as intermediate titres. A GMT was calculated for the 12 samples in each treatment group.

Les titres en anticorps anti-CdtA obtenus sont représentés sur la figure 12.The anti-CdtA antibody titers obtained are shown in FIG.

Les titres en anticorps anti-CdtB obtenus sont représentés sur la figure 13.The anti-CdtB antibody titres obtained are shown in FIG. 13.

Exemple 15 - Test d'inhibition de la cytotoxicité de la CDTb et de la fusion CDTa-CDTbExample 15 - Inhibition Test for the Cytotoxicity of CDTb and CDTa-CDTb Fusion

Test d'inhibition de la cytotoxicité de la toxine binaire Des cellules épithéliales de côlon humain (cellules HT29 ou HCT-116) ont été cultivées à 37 °C avec 5 % de CO2 dans du DMEM + 10 % de sérum bovin fœtal + 1 % de glutamine + 1 % d'antibiotiques (pénicilline-streptomycine-amphotéricine) et elles ont été ensemencées dans des plaques de culture tissulaire noires de 96 puits (Greiner Bio-one, référence : 655090) à une densité de 4.103 cellules/puits pour les HT29 et 1.103 cellules/puits pour les HCT116.Test for inhibition of the cytotoxicity of the binary toxin Human colon epithelial cells (HT29 or HCT-116 cells) were cultured at 37 ° C. with 5% CO 2 in DMEM + 10% fetal bovine serum + 1% of glutamine + 1% of antibiotics (penicillin-streptomycin amphotericin) and were seeded in 96-well black tissue culture plates (Greiner Bio-one, reference: 655090) at a density of 4.103 cells / well for HT29 and 1.103 cells / well for HCT116.

Les antisérums des souris ont été prédilués au 1/50 dans du milieu cellulaire et ensuite, d'autres dilutions au tiers ont été réalisées dans la microplaque (NUNC, référence : 163320) . 50 μΐ des dilutions en série des antisérums de souris groupés ont été ajoutés aux plaques noires. 50 μΐ d'un mélange de CDTa (25 ng/ml) et de CDTb activée par chymotrypsine (75 ng/ml) ont été ensuite ajoutés et les plaques noires ont été incubées à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 6 jours.The antisera of the mice were prediluted at 1:50 in cell medium and then further third dilutions were made in the microplate (NUNC, reference: 163320). 50 μl serial dilutions of pooled mouse antisera were added to the black plates. 50 μl of a mixture of CDTa (25 ng / ml) and chymotrypsin-activated CDTb (75 ng / ml) were then added and the black plates were incubated at 37 ° C with 5% CO2 for 6 days.

La surface couverte de coloration fluorescente a été déterminée dans chaque puits et les titres d'inhibition de la cytotoxicité ont été définis comme l'inverse de la dilution induisant une inhibition de 50 % du signal fluorescent.The area covered by fluorescent staining was determined in each well and the cytotoxicity inhibition titers were defined as the reciprocal of the dilution inducing a 50% inhibition of the fluorescent signal.

Les résultats sont présentés sur la figure 14. Résumé des séquences (tableau A)The results are shown in Figure 14. Sequence Summary (Table A)

LISTAGE DE SEQUENCES SEQ ID 1 - Séquence polypeptidique pleine longueur de la CDTaSEQ IDENTIFICATION SEQ ID 1 - Full length polypeptide sequence of CDTa

MKKFRKHKRISNCISILLILYLTLGGLLPNNIYAQDLQSYSEKVCNTTYKAPIERPEDFLKDMKKFRKHKRISNCISILLILYLTLGGLLPNNIYAQDLQSYSEKVCNTTYKAPIERPEDFLKD

KEKAKEWERKEAERIEQKLERSEKEALESYKKDSVEISKYSQTRNYFYDYQIEANSREKEYKKEKAKEWERKEAERIEQKLERSEKEALESYKKDSVEISKYSQTRNYFYDYQIEANSREKEYK

ELRNAISKNKIDKPMYVYYFESPEKFAFNKVIRTENQNEISLEKFNEFKETIQNKLFKQDGFELRNAISKNKIDKPMYVYYFESPEKFAFNKVIRTENQNEISLEKFNEFKETIQNKLFKQDGF

KDISLYEPGKGDEKPTPLLMHLKLPRNTGMLPYTNTNNVSTLIEQGYSIKIDKIVRIVIDGKKDISLYEPGKGDEKPTPLLMHLKLPRNTGMLPYTNTNNVSTLIEQGYSIKIDKIVRIVIDGK

HYIKAEASVVSSLDFKDDVSKGDSWGKANYNDWSNKLTPNELADVNDYMRGGYTAINNYLISHYIKAEASVVSSLDFKDDVSKGDSWGKANYNDWSNKLTPNELADVNDYMRGGYTAINNYLIS

NGPVNNPNPELDSKITNIENALKREPIPTNLTVYRRSGPQEFGLTLTSPEYDFNKLENIDAFNGPVNNPNPELDSKITNIENALKREPIPTNLTVYRRSGPQEFGLTLTSPEYDFNKLENIDAF

KSKWEGQALSYPNFISTSIGSVNMSAFAKRKIVLRITIPKGSPGAYLSAIPGYAGEYEVLLNKSKWEGQALSYPNFISTSIGSVNMSAFAKRKIVLRITIPKGSPGAYLSAIPGYAGEYEVLLN

HGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIP SEQ ID 2 - Séquence polynucléotidique pleine longueur de la CDTaHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIP SEQ ID 2 - Full length polynucleotide sequence of CDTa

ATGAAAAAATTTAGGAAACATAAAAGGATTAGTAATTGTATATCTATATTGTTGATATTATAATGAAAAAATTTAGGAAACATAAAAGGATTAGTAATTGTATATCTATATTGTTGATATTATA

TCTAACTTTAGGTGGTTTGTTACCTAATAACATTTATGCACAAGACTTACAAAGCTATAGTGTCTAACTTTAGGTGGTTTGTTACCTAATAACATTTATGCACAAGACTTACAAAGCTATAGTG

AAAAAGTTTGCAATACTACTTACAAGGCTCCTATAGAAAGACCAGAAGATTTTCTTAAAGATAAAAAGTTTGCAATACTACTTACAAGGCTCCTATAGAAAGACCAGAAGATTTTCTTAAAGAT

AAAGAAAAGGCTAAAGAATGGGAAAGAAAAGAAGCAGAAAGAATAGAGCAAAAACTTGAAAGAAAGAAAAGGCTAAAGAATGGGAAAGAAAAGAAGCAGAAAGAATAGAGCAAAAACTTGAAAG

ATCTGAAAAAGAAGCATTAGAATCATATAAAAAAGATTCTGTAGAAATAAGTAAATATTCTCATCTGAAAAAGAAGCATTAGAATCATATAAAAAAGATTCTGTAGAAATAAGTAAATATTCTC

AGACAAGAAATTAT T T T TAT GAT TATCAAATAGAAGCAAAT TC TC GAGAAAAAGAATATAAAAGACAAGAAATTAT T T TAT GAT TATCAAATAGAAGCAAAT TC TC GAGAAAAAGAATATAAA

GAACTTCGAAATGCTATATCAAAAAATAAAATAGATAAACCTATGTATGTCTATTATTTTGAGAACTTCGAAATGCTATATCAAAAAATAAAATAGATAAACCTATGTATGTCTATTATTTTGA

ATCTCCAGAAAAATTTGCATTTAATAAAGTAATAAGAACAGAAAATCAAAACGAAATTTCATATCTCCAGAAAAATTTGCATTTAATAAAGTAATAAGAACAGAAAATCAAAACGAAATTTCAT

TAGAAAAATTTAATGAGTTTAAAGAAACTATACAAAACAAATTATTTAAGCAAGATGGATTTTAGAAAAATTTAATGAGTTTAAAGAAACTATACAAAACAAATTATTTAAGCAAGATGGATTT

AAAGATATTTCTTTATATGAACCTGGAAAAGGTGATGAAAAACCTACACCATTACTTATGCAAAAGATATTTCTTTATATGAACCTGGAAAAGGTGATGAAAAACCTACACCATTACTTATGCA

CTTAAAATTACCTAGAAATACTGGTATGTTACCATATACAAATACTAACAATGTAAGTACAT TAATAGAGCAAGGATATAGTATAAAAATAGATAAAATTGTTCGTATAGTTATAGATGGGAAG ,CTTAAAATTACCTAGAAATACTGGTATGTTACCATATACAAATACTAACAATGTAAGTACAT TAATAGAGCAAGGATATAGTATAAAAATAGATAAAATTGTTCGTATAGTTATAGATGGGAAG,

CACTATATTAAAGCAGAAGCATCTGTTGTAAGTAGTCTTGATTTTAAAGATGATGTAAGTAACACTATATTAAAGCAGAAGCATCTGTTGTAAGTAGTCTTGATTTTAAAGATGATGTAAGTAA

GGGGGATTCTTGGGGTAAAGCAAATTATAATGATTGGAGTAATAAATTAACACCTAATGAACGGGGGATTCTTGGGGTAAAGCAAATTATAATGATTGGAGTAATAAATTAACACCTAATGAAC

TTGCTGATGTAAATGATTATATGCGTGGAGGATATACTGCAATTAATAATTATTTAATATCATTGCTGATGTAAATGATTATATGCGTGGAGGATATACTGCAATTAATAATTATTTAATATCA

AATGGTCCAGTAAATAATCCTAACCCAGAATTAGATTCTAAAATCACAAACATTGAAAATGCAATGGTCCAGTAAATAATCCTAACCCAGAATTAGATTCTAAAATCACAAACATTGAAAATGC

ATTAAAACGTGAACCTATTCCAACTAATTTAACTGTATATAGAAGATCTGGTCCTCAAGAATATTAAAACGTGAACCTATTCCAACTAATTTAACTGTATATAGAAGATCTGGTCCTCAAGAAT

TTGGTTTAACTCTTACTTCCCCTGAATATGATTTTAACAAACTAGAAAATATAGATGCTTTTTTGGTTTAACTCTTACTTCCCCTGAATATGATTTTAACAAACTAGAAAATATAGATGCTTTT

AAATCAAAATGGGAAGGACAAGCACTGTCTTATCCAAACTTTATTAGTACTAGTATTGGTAGAAATCAAAATGGGAAGGACAAGCACTGTCTTATCCAAACTTTATTAGTACTAGTATTGGTAG

TGTGAATATGAGTGCATTTGCTAAAAGAAAAATAGTACTACGTATAACTATACCTAAAGGTTTGTGAATATGAGTGCATTTGCTAAAAGAAAAATAGTACTACGTATAACTATACCTAAAGGTT

CTCCTGGAGCTTATCTATCAGCTATTCCAGGTTATGCAGGTGAATATGAAGTGCTTTTAAATCTCCTGGAGCTTATCTATCAGCTATTCCAGGTTATGCAGGTGAATATGAAGTGCTTTTAAAT

CATGGAAGCAAATTTAAAATCAATAAAATTGATTCTTACAAAGATGGTACTATAACAAAATTCATGGAAGCAAATTTAAAATCAATAAAATTGATTCTTACAAAGATGGTACTATAACAAAATT

AATTGTTGATGCAACATTGATACCTTAA SEQ ID 3 - Séquence polypeptidique pleine longueur de la CDTbAATTGTTGATGCAACATTGATACCTTAA SEQ ID 3 - Full length polypeptide sequence of CDTb

MKIQMRNKKVLSFLTLTAIVSQALVYPVYAQTSTSNHSNKKKEIVNEDILPNNGLMGYYFTD EHFKDLKLMAPIKDGNLKFEEKKVDKLLDKDKSDVKSIRWTGRIIPSKDGEYTLSTDRDDVL MQVNTESTISNTLKVNMKKGKEYKVRIELQDKNLGSIDNLSSPNLYWELDGMKKIIPEENLF LRDYSNIEKDDPFIPNNNFFDPKLMSDWEDEDLDTDNDNIPDSYERNGYTIKDLIAVKWEDS FAEQGYKKYVSNYLESNTAGDPYTDYEKASGSFDKAIKTEARDPLVAAYPIVGVGMEKLIIS TNEHASTDQGKTVSRATTNSKTESNTAGVSVNVGYQNGFTANVTTNYSHTTDNSTAVQDSNG ESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTNLVLDGDTLSTIKAQENQIGNNLS PGDTYPKKGLSPLALNTMDQFSSRLIPINYDQLKKLDAGKQIKLETTQVSGNFGTKNSSGQI VTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAKNLQDPEDKTPELTIGEAIEKAFGAT KKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDNTANKIKDSLKTLSDKKIYNVKLERGMNILIKTPTYFT NFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQGSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGYSKDPLTSN ' SIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTYLDNLSITELNST PEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEALDYIQKYRV EATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRIYAITPDDR ELLVLSVD SEQ ID 4 - Séquence polynucléotidique pleine longueur de la CDTbMKIQMRNKKVLSFLTLTAIVSQALVYPVYAQTSTSNHSNKKKEIVNEDILPNNGLMGYYFTD EHFKDLKLMAPIKDGNLKFEEKKVDKLLDKDKSDVKSIRWTGRIIPSKDGEYTLSTDRDDVL MQVNTESTISNTLKVNMKKGKEYKVRIELQDKNLGSIDNLSSPNLYWELDGMKKIIPEENLF LRDYSNIEKDDPFIPNNNFFDPKLMSDWEDEDLDTDNDNIPDSYERNGYTIKDLIAVKWEDS FAEQGYKKYVSNYLESNTAGDPYTDYEKASGSFDKAIKTEARDPLVAAYPIVGVGMEKLIIS TNEHASTDQGKTVSRATTNSKTESNTAGVSVNVGYQNGFTANVTTNYSHTTDNSTAVQDSNG ESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTNLVLDGDTLSTIKAQENQIGNNLS PGDTYPKKGLSPLALNTMDQFSSRLIPINYDQLKKLDAGKQIKLETTQVSGNFGTKNSSGQI VTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAKNLQDPEDKTPELTIGEAIEKAFGAT KKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDNTANKIKDSLKTLSDKKIYNVKLERGMNILIKTPTYFT NFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQGSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGYSKDPLTSN 'SIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTYLDNLSITELNST PEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEALDYIQKYRV EATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRIYAITPDDR ELLVLSVD SEQ ID 4 - polynucleotide sequence full length of the cdtB

AT GAAAATACAAAT GAGGAATAAAAAGGTAT TAAGT T TT TTAACAC T TACAGCTATAGT TAG TCAAGCACTAGTATATCCTGTATATGCTCAAACTAGTACAAGTAATCATTCTAATAAGAAAA AAGAAATTGTAAATGAAGATATACTCCCAAACAATGGATTAATGGGATATTATTTCACAGAT GAGCACTTTAAAGATTTAAAATTAATGGCACCCATAAAAGATGGTAATTTAAAATTTGAAGA AAAGAAAG TAGATAAAC T T C T GGATAAAGACAAAT CAGATG TAAAAT C TATAC GAT GGACAG GAAGAATAATTCCTTCTAAGGATGGTGAATATACATTATCAACTGATAGAGATGATGTCTTA ATGCAAGTAAATACTGAGAGTACTATATCAAATACACTTAAAGTTAATATGAAAAAGGGTAA AGAATATAAAGTTAGAATAGAGC TACAAGATAAAAAT T TAGGTTCAATAGATAATT TATCAT CACCTAATCTTTATTGGGAATTAGATGGTATGAAGAAAATTATACCAGAAGAAAATTTATTC TTAAGAGATTATTCTAATATAGAAAAAGATGATCCATTTATCCCAAATAACAATTTCTTTGA CCCAAAGTTGATGTCTGATTGGGAAGACGAAGATTTGGATACAGATAATGATAATATACCAGAT GAAAATACAAAT GAGGAATAAAAAGGTAT TAAGT T TT T TTAACAC TACAGCTATAGT TAG TCAAGCACTAGTATATCCTGTATATGCTCAAACTAGTACAAGTAATCATTCTAATAAGAAAA AAGAAATTGTAAATGAAGATATACTCCCAAACAATGGATTAATGGGATATTATTTCACAGAT GAGCACTTTAAAGATTTAAAATTAATGGCACCCATAAAAGATGGTAATTTAAAATTTGAAGA AAAGAAAG TAGATAAAC T T C T C GGATAAAGACAAAT CAGATG TAAAAT TATAC GAT GGACAG GAAGAATAATTCCTTCTAAGGATGGTGAATATACATTATCAACTGATAGAGATGATGTCTTA ATGCAAGTAAATACTGAGAGTACTATATCAAATACACTTAAAGTTAATATGAAAAAGGGTAA AGAATATAAAGTTAGAATAGAGC TACAAGATAAAAAT T TAGGTTCAATAGATAATT TATCAT CACCTAATCTTTATTGGGAATTAGATGGTATGAAGAAAATTATACCAGAAGAAAATTTATTC TTAAGAGATTATTCTAATATAGAAAAAGATGATCCATTTATCCCAAATAACAATTTCTTTGA CCCAAAGTTGATGTCTGATTGGGAAGACGAAGATTTGGATACAGATAATGATAATATACCAG

ATTCATATGAACGAAATGGATATACTATTAAGGACTTAATTGCAGTTAAGTGGGAAGATAGT TTTGCAGAACAAGGCTATAAGAAATATGTATCAAATTATTTAGAGTCAAATACTGCTGGAGA TCCATATACAGATTATGAAAAAGCTTCAGGTTCTTTTGACAAGGCTATAAAGACTGAAGCAA GAGATCCGTTAGTTGCAGCATATCCAATTGTTGGAGTAGGTATGGAAAAATTAATTATATCT ACAAATGAACATGCCTCTACTGATCAAGGTAAAACTGTTTCCAGAGCTACTACTAACAGTAA AACTGAATCTAATACAGCTGGTGTGTCTGTTAATGTAGGATATCAAAATGGATTCACAGCTA AT GTAAC TACAAAT TAT T CCCATACAACAGATAAT T CAAC TGC T GTT CAAGATAGTAATGGA GAATCATGGAATACTGGATTAAGTATAAACAAAGGAGAATCTGCATATATAAATGCAAATGT TAGATATTACAACACAGGTACTGCACCTATGTACAAAGTGACACCAACAACAAATTTAGTGT TAGATGGAGATACATTATCAACTATCAAAGCACAAGAAAATCAAATTGGCAATAATCTATCT CCTGGAGATACTTATCCCAAAAAAGGGCTTTCACCTCTAGCTCTTAACACAATGGATCAATT TAGCTCTAGACTGATTCCTATAAATTATGATCAATTAAAAAAATTAGATGCTGGAAAGCAAA TTAAATTAGAAACAACACAAGTAAGTGGAAATTTTGGTACAAAAAATAGTTCTGGACAAATA GTAACAGAAGGAAATAGTTGGTCAGACTATATAAGTCAAATTGACAGTATTTCTGCATCTAT TATATTAGATACAGAGAATGAATCTTACGAAAGAAGAGTTACTGCTAAAAATTTACAGGATC CAGAAGATAAAACACCTGAACTTACAATTGGAGAAGCAATTGAAAAAGCTTTTGGCGCTACT AAAAAAGATGGTTTGTTATATTTTAATGATATACCAATAGATGAAAGTTGTGTTGAACTCAT ATTTGATGATAATACAGCCAATAAGATTAAAGATAGTTTAAAAACTTTGTCTGATAAAAAGA TATATAATGTTAAACTTGAAAGAGGAATGAATATACTTATAAAAACACCAACTTACTTTACT AATTTTGATGATTATAATAATTACCCTAGTACATGGAGTAATGTCAATACTACGAATCAAGA TGGTTTACAAGGCTCAGCAAATAAATTAAATGGTGAGACGAAGATTAAAATCCCTATGTCTG AGCTAAAACCTTATAAACGTTATGTTTTTAGTGGATATTCAAAGGATCCTTTAACATCTAAT TCAATAATTGTAAAGATAAAAGCAAAAGAAGAGAAAACGGATTATTTGGTACCAGAACAAGG ATATACAAAAT T TAGT TAT GAAT T T GAAAC TAC T GAAAAAGAT T C T T C TAATATAGAGATAA CATTAATTGGTAGTGGTACAACATACTTAGATAACTTATCTATTACAGAGCTAAATAGTACT CCTGAAATACTTGATGAACCAGAAGTTAAAATTCCAACTGACCAAGAAATAATGGATGCACA TAAAATATATTTTGCAGATTTAAATTTTAATCCAAGTACAGGAAATACTTATATAAATGGTA TGTATTTTGCACCAACACAAACTAATAAAGAAGCTCTCGATTATATCCAAAAATATAGAGTT GAAGCTACTTTACAATATTCTGGATTTAAAGATATTGGAACTAAAGATAAAGAAATGCGTAA TTATTTAGGAGATCCAAATCAGCCTAAAACTAATTATGTTAATCTTAGGAGTTATTTTACAG GTGGAGAAAATATTATGACATACAAGAAATTAAGAATATATGCAATTACTCCAGACGATAGA GAGTTATTAGTTCTTAGTGTTGATTAG SEQ ID 5 - Construction de CDTb C37. Séquence polypeptidique de la CDTb' (moins le peptide signal) ligaturée à la protéine glutathion-S-transférase (GST soulignée)ATTCATATGAACGAAATGGATATACTATTAAGGACTTAATTGCAGTTAAGTGGGAAGATAGT TTTGCAGAACAAGGCTATAAGAAATATGTATCAAATTATTTAGAGTCAAATACTGCTGGAGA TCCATATACAGATTATGAAAAAGCTTCAGGTTCTTTTGACAAGGCTATAAAGACTGAAGCAA GAGATCCGTTAGTTGCAGCATATCCAATTGTTGGAGTAGGTATGGAAAAATTAATTATATCT ACAAATGAACATGCCTCTACTGATCAAGGTAAAACTGTTTCCAGAGCTACTACTAACAGTAA AACTGAATCTAATACAGCTGGTGTGTCTGTTAATGTAGGATATCAAAATGGATTCACAGCTA AT GTAAC TACAAAT CCCATACAACAGATAAT TAT T T T GTT TGC CAAC CAAGATAGTAATGGA GAATCATGGAATACTGGATTAAGTATAAACAAAGGAGAATCTGCATATATAAATGCAAATGT TAGATATTACAACACAGGTACTGCACCTATGTACAAAGTGACACCAACAACAAATTTAGTGT TAGATGGAGATACATTATCAACTATCAAAGCACAAGAAAATCAAATTGGCAATAATCTATCT CCTGGAGATACTTATCCCAAAAAAGGGCTTTCACCTCTAGCTCTTAACACAATGGATCAATT TAGCTCTAGACTGATTCCTATAAATTATGATCAATTAAAAAAATTAGATGCTGGAAAGCAAA TTAAATTAGAAACAACACAAGTAAGTGGAAATTTTGGTACAAAAAATAGTTCTGGACAAATA GTAACAGAAGGAAATAGTTGGTCAGACTATATAAGTCAAATTGACAGTATTTCTGCATCTAT TATATTAGATACAGAGAATGAATCTTACGAAAGAAGAGTTACTGCTAAAAATTTACAGGATC CAGAAGATAAAACACCTGAACTTACAATTGGAGAAGCAATTGAA AAAGCTTTTGGCGCTACT AAAAAAGATGGTTTGTTATATTTTAATGATATACCAATAGATGAAAGTTGTGTTGAACTCAT ATTTGATGATAATACAGCCAATAAGATTAAAGATAGTTTAAAAACTTTGTCTGATAAAAAGA TATATAATGTTAAACTTGAAAGAGGAATGAATATACTTATAAAAACACCAACTTACTTTACT AATTTTGATGATTATAATAATTACCCTAGTACATGGAGTAATGTCAATACTACGAATCAAGA TGGTTTACAAGGCTCAGCAAATAAATTAAATGGTGAGACGAAGATTAAAATCCCTATGTCTG AGCTAAAACCTTATAAACGTTATGTTTTTAGTGGATATTCAAAGGATCCTTTAACATCTAAT TCAATAATTGTAAAGATAAAAGCAAAAGAAGAGAAAACGGATTATTTGGTACCAGAACAAGG ATATACAAAAT tagt T T T GAAAC GAAT TAT TAC GAAAAAGAT T T C T T C TAATATAGAGATAA CATTAATTGGTAGTGGTACAACATACTTAGATAACTTATCTATTACAGAGCTAAATAGTACT CCTGAAATACTTGATGAACCAGAAGTTAAAATTCCAACTGACCAAGAAATAATGGATGCACA TAAAATATATTTTGCAGATTTAAATTTTAATCCAAGTACAGGAAATACTTATATAAATGGTA TGTATTTTGCACCAACACAAACTAATAAAGAAGCTCTCGATTATATCCAAAAATATAGAGTT GAAGCTACTTTACAATATTCTGGATTTAAAGATATTGGAACTAAAGATAAAGAAATGCGTAA TTATTTAGGAGATCCAAATCAGCCTAAAACTAATTATGTTAATCTTAGGAGTTATTTTACAG GTGGAGAAAATATTATGACATACAAGAAATTAAGAATATATGCAATTACTCCAGACGATAGA GAGTTATTAGTTCTTAGTGT TGATTAG SEQ ID 5 - Construction of CDTb C37. Polypeptide sequence of CDTb '(minus signal peptide) ligated to glutathione-S-transferase protein (GST underlined)

MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGD νΚΕΤΟΞΜΑΙΙΕΥΙΑΡΚΗΝΜΙ^ΟΡΚΕΡΑΕΙΕΜΕΕΰΑνΕΡΙΡΥΰνΒΕΙΑΥΞΚΡΡΕΤΈΚνΡΓΕΞ KLPEMLKMFEPRLCHKTYLNGDHVTHPPFMLYDALPWLYMDPMCLPAFPKLVCFKKRIEAI PQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGPHPPKSPLEVLFQGPLGSHMEIVNEDILPNNGLMG YYFTDEHFKDLKLMAPIKPGNLKFEEKKVDKLLPKPKSPVKSIRWTGRIIPSKDGEYTLSTP RDDVLMQVNTESTISNTLKVNMKKGKEYKVRIELQDKNLGSIDNLSSPNLYWELPGMKKIIP EENLFLRPYSNIEKDPPFIPNNNFFPPKLMSDWEPEDLPTDNDNIPPSYERNGYTIKDLIAV KWEPSFAEQGYKKYVSNYLESNTAGPPYTPYEKASGSFPKAIKTEARPPLVAAYPIVGVGME KLIISTNEHASTPQGKTVSRATTNSKTESNTAGVSVNVGYQNGFTANVTTNYSHTTPNSTAV QDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTNLVLDGDTLSTIKAQENQI GNNLSPGPTYPKKGLSPLALNTMPQFSSRLIPINYPQLKKLPAGKQIKLETTQVSGNFGTKN SSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAKNLQDPEDKTPELTIGEAIEK AFGATKKDGLLYFNDIPIPESCVELIFDDNTANKIKPSLKTLSPKKIYNVKLERGMNILIKT PTYFTNFPPYNNYPSTWSNVNTTNQPGLQGSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGYSKD PLTSNSIIVKIKAKEEKTPYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTYLDNLSIT ELNSTPEILPEPEVKIPTPQEIMPAHKIYFADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEALPYI QKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRIYAI TPDPRELLVLSVPHHHHHH SEQ ID 6 - Construction de CDTb C37. Séquence polynucléotidique de la CDTb' (moins le prodomaine) ligaturée à la protéine glutathion-S-transférase (GST soulignée) atgtcccctatactaqgttattqqaaaattaaqgqccttqtqcaacccactcqacttctttt qqaatatcttqaaqaaaaatatqaagagcatttqtatqaqcqcqatqaaqqtqataaatqqc gaaacaaaaagtttgaattgggtttgqaqtttcccaatcttccttattatattgatqqtqat gttaaattaacacagtctatggccatcatacgttatataqctgacaagcacaacatqttggg tqqttqtccaaaaqaqcqtgcaqagatttcaatgcttqaaqqaqcggttttgqatattaqat acqqtqtttcqagaattgcatatagtaaagactttqaaactctcaaagttgattttcttagc aaqctacctqaaatqctgaaaatqttcgaagatcqtttatqtcataaaacatatttaaatgg tgatcatgtaacccatcctgacttcatgttgtatgacqctcttgatgttgttttatacatgg acccaatgtgcctggatgcgttcccaaaattagtttgttttaaaaaacgtattgaagctatc ccacaaattgataagtacttgaaatccagcaagtatatagcatggcctttgcagggctggca agccacgtttggtggtggcgaccatcctccaaaatcggatctggaagttctgttccaggggc ccctgggatcccatatggaaattgtgaatgaagatattctgccgaataatggtctgatggga tactactttaccgatgaacattttaaagatctgaaactgatggcaccgattaaagatggcaa tctgaaatttgaagaaaaaaaagtggataaactgctggataaagataaaagtgatgtgaaaa gcattcgttggaccggtcgtattattccgagcaaagatggtgaatacaccctgagcaccgat cgtgatgatgttctgatgcaggttaataccgaaagcaccattagcaataccctgaaagtgaa tatgaaaaaaggcaaagaatataaagtgcgcattgaactgcaggataaaaatctgggtagca ttgataatctgagcagcccgaatctgtattgggaactggatggtatgaaaaaaatcattccg gaagaaaacctgtttctgcgcgattatagcaatattgaaaaagatgatccgtttattccgaa taataacttttttgatccgaaactgatgagcgattgggaagatgaagatctggataccgata atgataatattccggatagctatgaacgcaatggctataccattaaagatctgattgccgtg aaatgggaagatagctttgcagaacagggctataagaaatatgtgagcaattatctggaaag caataccgcaggcgatccgtataccgattatgaaaaagcaagcggcagctttgataaagcca ttaaaaccgaagcacgtgatccgctggttgcagcatatccgattgttggtgttggtatggaa aaactgattattagcaccaatgaacatgcaagcaccgatcagggtaaaaccgttagccgtgc aaccaccaatagcaaaaccgaaagcaatacagccggtgttagcgttaatgttggttatcaga atggttttaccgccaatgtgaccaccaattatagccataccaccgataatagcaccgcagtt caggatagcaatggtgaaagctggaataccggtctgagcattaacaaaggtgaaagcgcata tatcaatgccaatgtgcgctattataacaccggcaccgcaccgatgtataaagttaccccga ccaccaatctggttctggatggtgataccctgagtaccattaaagcacaagaaaatcagatt ggcaataatctgagtccgggtgatacctatccgaaaaaaggtctgagtccgctggcactgaa taccatggatcagtttagcagccgtctgattccgattaactatgatcagctgaaaaaactgg atgccggtaaacaaatcaaactggaaaccacccaggttagcggtaattttggcaccaaaaat tcaagcggtcagattgttaccgaaggtaatagctggtcagattatatcagccagattgatag cattagcgccagcattattctggatacagaaaatgaaagctatgaacgtcgtgtgaccgcaa aaaatctgcaggacccggaagataaaacaccggaactgaccattggtgaagcaattgaaaaa gcatttggtgccaccaaaaaagatggcctgctgtattttaacgatattccgattgatgaaag ctgcgtggaactgatttttgatgataataccgccaataaaatcaaagatagcctgaaaaccc tgagcgacaaaaaaatctataatgtgaaactggaacgcggtatgaatattctgattaaaacc ccgacctattttaccaattttgatgattataacaattatccgagcacttggagcaatgtgaa taccaccaatcaggatggtctgcagggtagcgcaaataaactgaatggtgaaaccaaaatca aaattccgatgagcgaactgaaaccgtataaacgttatgtgtttagcggctatagcaaagat ccgctgaccagcaatagcattattgtgaaaatcaaagccaaagaagaaaaaaccgattatct ggttccggaacagggttataccaaatttagctatgaatttgaaaccaccgaaaaagatagca gtaatattgaaattaccctgattggtagcggcaccacctatctggataatctgagtattacc gaactgaatagcacaccggaaattctggatgaaccggaagtgaaaattccgaccgatcaaga aattatggatgcccataaaatctattttgccgatctgaactttaatccgagcaccggcaata cctatattaacggcatgtattttgcaccgacccagaccaataaagaagccctggattatatt cagaaatatcgtgttgaagccaccctgcagtatagcggttttaaagatattggcaccaaaga taaagaaatgcgtaattatctgggcgatccgaatcagccgaaaaccaattatgttaatctgc gcagctattttaccggtggcgaaaacattatgacctacaaaaaactgcgcatttatgccatt acaccggatgatcgtgaactgctggttctgagcgttgatcaccaccatcatcatcattaa SEQ ID NO : 7 - Séquence d'acides aminés de la CDTb avec le prodomaine éliminé (CDTb", aa 212 à 876) (C55) MSDWEDEDLDTDNDNIPDSYERNGYTIKDLIAVKWEDSFAEQGYKKYVSNYLESNTAGDPYT DYEKASGSFDKAIKTEARDPLVAAYPIVGVGMEKLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTES NTAGVSVNVGYQNGFTANVTTNYSHTTDNSTAVQDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYY NTGTAPMYKVTPTTNLVLDGDTLSTIKAQENQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQFSSR LIPINYDQLKKLDAGKQIKLETTQVSGNFGTKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILD TENESYERRVTAKNLQDPEDKTPELTIGEAIEKAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDD NTANKIKDSLKTLSDKKIYNVKLERGMNILIKTPTYFTNFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQ GSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGYSKDPLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTK FSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTYLDNLSITELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIY FADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEALDYIQKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLG DPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVDHHHHHH ' SEQ ID NO : 8 - C116MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGD νΚΕΤΟΞΜΑΙΙΕΥΙΑΡΚΗΝΜΙ ^ ΟΡΚΕΡΑΕΙΕΜΕΕΰΑνΕΡΙΡΥΰνΒΕΙΑΥΞΚΡΡΕΤΈΚνΡΓΕΞ KLPEMLKMFEPRLCHKTYLNGDHVTHPPFMLYDALPWLYMDPMCLPAFPKLVCFKKRIEAI PQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGPHPPKSPLEVLFQGPLGSHMEIVNEDILPNNGLMG YYFTDEHFKDLKLMAPIKPGNLKFEEKKVDKLLPKPKSPVKSIRWTGRIIPSKDGEYTLSTP RDDVLMQVNTESTISNTLKVNMKKGKEYKVRIELQDKNLGSIDNLSSPNLYWELPGMKKIIP EENLFLRPYSNIEKDPPFIPNNNFFPPKLMSDWEPEDLPTDNDNIPPSYERNGYTIKDLIAV KWEPSFAEQGYKKYVSNYLESNTAGPPYTPYEKASGSFPKAIKTEARPPLVAAYPIVGVGME KLIISTNEHASTPQGKTVSRATTNSKTESNTAGVSVNVGYQNGFTANVTTNYSHTTPNSTAV QDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTNLVLDGDTLSTIKAQENQI GNNLSPGPTYPKKGLSPLALNTMPQFSSRLIPINYPQLKKLPAGKQIKLETTQVSGNFGTKN SSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAKNLQDPEDKTPELTIGEAIEK AFGATKKDGLLYFNDIPIPESCVELIFDDNTANKIKPSLKTLSPKKIYNVKLERGMNILIKT PTYFTNFPPYNNYPSTWSNVNTTNQPGLQGSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGYSKD PLTSNSIIVKIKAKEEKTPYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTYLDNLS IT ELNSTPEILPEPEVKIPTPQEIMPAHKIYFADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEALPYI QKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRIYAI TPDPRELLVLSVPHHHHHH SEQ ID 6 - Construction of CDTb C37. polynucleotide sequence of the cdtB '(minus the prodomain) ligated to the protein glutathione-S-transferase (GST underlined) atgtcccctatactaqgttattqqaaaattaaqgqccttqtqcaacccactcqacttctttt qqaatatcttqaaqaaaaatatqaagagcatttqtatqaqcqcqatqaaqqtqataaatqqc gaaacaaaaagtttgaattgggtttgqaqtttcccaatcttccttattatattgatqqtqat gttaaattaacacagtctatggccatcatacgttatataqctgacaagcacaacatqttggg tqqttqtccaaaaqaqcqtgcaqagatttcaatgcttqaaqqaqcggttttgqatattaqat acqqtqtttcqagaattgcatatagtaaagactttqaaactctcaaagttgattttcttagc aaqctacctqaaatqctgaaaatqttcgaagatcqtttatqtcataaaacatatttaaatgg tgatcatgtaacccatcctgacttcatgttgtatgacqctcttgatgttgttttatacatgg acccaatgtgcctggatgcgttcccaaaattagtttgttttaaaaaacgtattgaagctatc ccacaaattgataagtacttgaaatccagcaagtatatagcatggcctttgcagggctggca agccacgtttggtggtggcgaccatcctccaaaatcggatctggaagttctgttccaggggc ccctgggatcccatatggaaattgtgaatgaagatattctgccgaataatggtctgatggga tactactttaccgatgaacattttaaagatctgaaactgatggcaccgattaaagatggcaa tctgaaatttgaagaaaaaaaagtggataaactgctggataaagataa aagtgatgtgaaaa gcattcgttggaccggtcgtattattccgagcaaagatggtgaatacaccctgagcaccgat cgtgatgatgttctgatgcaggttaataccgaaagcaccattagcaataccctgaaagtgaa tatgaaaaaaggcaaagaatataaagtgcgcattgaactgcaggataaaaatctgggtagca ttgataatctgagcagcccgaatctgtattgggaactggatggtatgaaaaaaatcattccg gaagaaaacctgtttctgcgcgattatagcaatattgaaaaagatgatccgtttattccgaa taataacttttttgatccgaaactgatgagcgattgggaagatgaagatctggataccgata atgataatattccggatagctatgaacgcaatggctataccattaaagatctgattgccgtg aaatgggaagatagctttgcagaacagggctataagaaatatgtgagcaattatctggaaag caataccgcaggcgatccgtataccgattatgaaaaagcaagcggcagctttgataaagcca ttaaaaccgaagcacgtgatccgctggttgcagcatatccgattgttggtgttggtatggaa aaactgattattagcaccaatgaacatgcaagcaccgatcagggtaaaaccgttagccgtgc aaccaccaatagcaaaaccgaaagcaatacagccggtgttagcgttaatgttggttatcaga atggttttaccgccaatgtgaccaccaattatagccataccaccgataatagcaccgcagtt caggatagcaatggtgaaagctggaataccggtctgagcattaacaaaggtgaaagcgcata tatcaatgccaatgtgcgctattataacaccggcaccgcaccgatgtataaagttaccccga ccaccaatctggttctggatggtgataccctgagtaccat taaagcacaagaaaatcagatt ggcaataatctgagtccgggtgatacctatccgaaaaaaggtctgagtccgctggcactgaa taccatggatcagtttagcagccgtctgattccgattaactatgatcagctgaaaaaactgg atgccggtaaacaaatcaaactggaaaccacccaggttagcggtaattttggcaccaaaaat tcaagcggtcagattgttaccgaaggtaatagctggtcagattatatcagccagattgatag cattagcgccagcattattctggatacagaaaatgaaagctatgaacgtcgtgtgaccgcaa aaaatctgcaggacccggaagataaaacaccggaactgaccattggtgaagcaattgaaaaa gcatttggtgccaccaaaaaagatggcctgctgtattttaacgatattccgattgatgaaag ctgcgtggaactgatttttgatgataataccgccaataaaatcaaagatagcctgaaaaccc tgagcgacaaaaaaatctataatgtgaaactggaacgcggtatgaatattctgattaaaacc ccgacctattttaccaattttgatgattataacaattatccgagcacttggagcaatgtgaa taccaccaatcaggatggtctgcagggtagcgcaaataaactgaatggtgaaaccaaaatca aaattccgatgagcgaactgaaaccgtataaacgttatgtgtttagcggctatagcaaagat ccgctgaccagcaatagcattattgtgaaaatcaaagccaaagaagaaaaaaccgattatct ggttccggaacagggttataccaaatttagctatgaatttgaaaccaccgaaaaagatagca gtaatattgaaattaccctgattggtagcggcaccacctatctggataatctgagtattacc gaactgaatagcacaccggaaattctggatga accggaagtgaaaattccgaccgatcaaga aattatggatgcccataaaatctattttgccgatctgaactttaatccgagcaccggcaata cctatattaacggcatgtattttgcaccgacccagaccaataaagaagccctggattatatt cagaaatatcgtgttgaagccaccctgcagtatagcggttttaaagatattggcaccaaaga taaagaaatgcgtaattatctgggcgatccgaatcagccgaaaaccaattatgttaatctgc gcagctattttaccggtggcgaaaacattatgacctacaaaaaactgcgcatttatgccatt acaccggatgatcgtgaactgctggttctgagcgttgatcaccaccatcatcatcattaa SEQ ID NO: 7 - Amino acid sequence of the cdtB removed with the prodomain (cdtB ', aa 212-876) (C55) MSDWEDEDLDTDNDNIPDSYERNGYTIKDLIAVKWEDSFAEQGYKKYVSNYLESNTAGDPYT DYEKASGSFDKAIKTEARDPLVAAYPIVGVGMEKLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTES NTAGVSVNVGYQNGFTANVTTNYSHTTDNSTAVQDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYY NTGTAPMYKVTPTTNLVLDGDTLSTIKAQENQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQFSSR LIPINYDQLKKLDAGKQIKLETTQVSGNFGTKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILD TENESYERRVTAKNLQDPEDKTPELTIGEAIEKAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDD NTANKIKDSLKTLSDKKIYNVKLERGMNILIKTPTYFTNFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQ GSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGYSKDPLTSNSI IVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTK FSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTYLDNLSITELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIY FADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEALDYIQKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLG DPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVDHHHHHH 'SEQ ID NO: 8 - C116

MSDWEDEDLDTDNDNIPDSYERNGYTIKDLIAVKWEDSFAEQGYKKYVSNYLESNTAGDPYT DYEKASGSFDKAIKTEARDPLVAAYPIVGVGMEKLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTES NTAGVSVNVGYQNGFTANVTTNYSHTTDNSTAVQDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYY NTGTAPMYKVTPTTNLVLDGDTLSTIKAQENQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQFSSR LIPINYDQLKKLDAGKQIKLETTQVSGNFGTKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDMSDWEDEDLDTDNDNIPDSYERNGYTIKDLIAVKWEDSFAEQGYKKYVSNYLESNTAGDPYT DYEKASGSFDKAIKTEARDPLVAAYPIVGVGMEKLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTES NTAGVSVNVGYQNGFTANVTTNYSHTTDNSTAVQDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYY NTGTAPMYKVTPTTNLVLDGDTLSTIKAQENQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQFSSR LIPINYDQLKKLDAGKQIKLETTQVSGNFGTKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILD

TENESYERRVTAKNLQDPEDKTPELTIGEAIEKAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDTENESYERRVTAKNLQDPEDKTPELTIGEAIEKAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDD

NTANKIKDSLKTLSDKKIYNVKLERGMNILIKTPGGHHHHHH SEQ ID NO : 9 - C117NTANKIKDSLKTLSDKKIYNVKLERGMNILIKTPGGHHHHHH SEQ ID NO: 9 - C117

MAYPIVGVGMEKLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTESNTAGVSVNVGYQNGFTANVTTNMAYPIVGVGMEKLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTESNTAGVSVNVGYQNGFTANVTTN

YSHTTDNSTAVQDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTNLVLDGDTYSHTTDNSTAVQDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTNLVLDGDT

LSTIKAQENQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQFSSRLIPINYDQLKKLDAGKQIKLETLSTIKAQENQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQFSSRLIPINYDQLKKLDAGKQIKLET

TQVSGNFGTKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAKNLQDPEDKTTQVSGNFGTKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAKNLQDPEDKT

PELTIGEAIEKAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDNTANKIKDSLKTLSDKKIYNVKPELTIGEAIEKAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDNTANKIKDSLKTLSDKKIYNVK

LERGMNILIKTPTYFTNFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQGSANKLNGETKIKIPMSELKPYLERGMNILIKTPTYFTNFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQGSANKLNGETKIKIPMSELKPY

KRYVFSGYSKDPLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEITLIGSKRYVFSGYSKDPLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEITLIGS

GTTYLDNLSITELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYINGMYFAPGTTYLDNLSITELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYINGMYFAP

TQTNKEALDYIQKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFTGGENITQTNKEALDYIQKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFTGGENI

MTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVDHHHHHH SEQ ID NO : 10 - Séquence de la CDTb C123 avec la mutation F455R.MTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVDHHHHHH SEQ ID NO: 10 - CDTb C123 sequence with the F455R mutation.

MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGD VKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLS KLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDWLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAI PQIDKYl·KSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLEVLFQGPLGSHMEIVNEDILPNNGLMG YYFTDEHFKDLKLMAPIKDGNLKFEEKKVDKLLDKDKSDVKSIRWTGRIIPSKDGEYTLSTD RDDVLMQVNTESTISNTLKVNMKKGKEYKVRIELQDKNLGSIDNLSSPNLYWELDGMKKIIP EENLFLRDYSNIEKDDPFIPNNNFFDPKLMSDWEDEDLDTDNDNIPDSYERNGYTIKDLIAV KWEDSFAEQGYKKYVSNYLESNTAGDPYTDYEKASGSFDKAIKTEARDPLVAAYPIVGVGME KLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTESNTAGVSVNVGYQNGFTANVTTNYSHTTDNSTAV QDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTNLVLDGDTLSTIKAQENQI GNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQRSSRLIPINYDQLKKLDAGKQIKLETTQVSGNFGTKN SSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAKNLQDPEDKTPELTIGEAIEK AFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDNTANKIKDSLKTLSDKKIYNVKLERGMNILIKT PTYFTNFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQGSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGYSKD PLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTYLDNLSIT ELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEALDYIMSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGD VKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLS KLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDWLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAI PQIDKYl · KSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLEVLFQGPLGSHMEIVNEDILPNNGLMG YYFTDEHFKDLKLMAPIKDGNLKFEEKKVDKLLDKDKSDVKSIRWTGRIIPSKDGEYTLSTD RDDVLMQVNTESTISNTLKVNMKKGKEYKVRIELQDKNLGSIDNLSSPNLYWELDGMKKIIP EENLFLRDYSNIEKDDPFIPNNNFFDPKLMSDWEDEDLDTDNDNIPDSYERNGYTIKDLIAV KWEDSFAEQGYKKYVSNYLESNTAGDPYTDYEKASGSFDKAIKTEARDPLVAAYPIVGVGME KLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTESNTAGVSVNVGYQNGFTANVTTNYSHTTDNSTAV QDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTNLVLDGDTLSTIKAQENQI GNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQRSSRLIPINYDQLKKLDAGKQIKLETTQVSGNFGTKN SSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAKNLQDPEDKTPELTIGEAIEK AFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDNTANKIKDSLKTLSDKKIYNVKLERGMNILIKT PTYFTNFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQGSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGYSKD PLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTYLDNLSIT ELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQT NKEALDYI

QKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRIYAIQKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRIYAI

TPDDRELLVLSVDHHHHHH SEQ ID NO : 11 - Séquence de la CDTb C126 dans laquelle les résidus 426 (Glutamate) et 453 (Aspartate) ont été tous les deux mutés en alanine.TPDDRELLVLSVDHHHHHH SEQ ID NO: 11 - C126 CDTb sequence in which residues 426 (Glutamate) and 453 (Aspartate) were both mutated to alanine.

MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDMSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGD

VKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFl·SVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFl · S

KLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDWLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDWLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAI

PQIDKYl·KSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLEVLFQGPLGSHMEIVNEDILPNNGLMG· PQIDKYl KSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLEVLFQGPLGSHMEIVNEDILPNNGLMG

YYFTDEHFKDLKLMAPIKDGNLKFEEKKVDKLLDKDKSDVKSIRWTGRIIPSKDGEYTLSTD rddvlmqvntestisntlkvnmkkGkeykvrielqdknlgsidnlsspnlyweldgmkkiipYYFTDEHFKDLKLMAPIKDGNLKFEEKKVDKLLDKDKSDVKSIRWTGRIIPSKDGEYTLSTD rddvlmqvntestisntlkvnmkkGkeykvrielqdknlgsidnlsspnlyweldgmkkiip

EENLFLRDYSNIEKDDPFIPNNNFFDPKLMSDWEDEDLDTDNDNIPDSYERNGYTIKDLIAV KWEDSFAEQGYKKYVSNYLESNTAGDPYTDYEKASGSFDKAIKTEARDPLVAAYPIVGVGME KLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTESNTAGVSVNVGYQNGFTANVTTNYSHTTDNSTAV QDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTNLVLDGDTLSTIKAQANQI GNNLS PGDTYPKKGLS PLALNTMAQFS SRLIPINYDQLKKLDAGKQIKLETTQVSGNFGTKN SSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAKNLQDPEDKTPELTIGEAIEK AFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDNTANKIKDSLKTLSDKKIYNVKLERGMNILIKT PTYFTNFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQGSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGYSKD PLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTYLDNLSIT ELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEALDYI QKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRIYAI TPDDRELLVLSVDHHHHHH SEQ ID NO : 12 - C127EENLFLRDYSNIEKDDPFIPNNNFFDPKLMSDWEDEDLDTDNDNIPDSYERNGYTIKDLIAV KWEDSFAEQGYKKYVSNYLESNTAGDPYTDYEKASGSFDKAIKTEARDPLVAAYPIVGVGME KLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTESNTAGVSVNVGYQNGFTANVTTNYSHTTDNSTAV QDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTNLVLDGDTLSTIKAQANQI GNNLS PGDTYPKKGLS PLALNTMAQFS SRLIPINYDQLKKLDAGKQIKLETTQVSGNFGTKN SSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAKNLQDPEDKTPELTIGEAIEK AFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDNTANKIKDSLKTLSDKKIYNVKLERGMNILIKT PTYFTNFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQGSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGYSKD PLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTYLDNLSIT ELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEALDYI QKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRIYAI TPDDRELLVLSVDHHHHHH SEQ ID NO: 12 - C127

MEIVNEDILPNNGLMGYYFTDEHFKDLKLMAPIKDGNLKFEEKKVDKLLDKDKSDVKSIRWT GRIIPSKDGEYTLSTDRDDVLMQVNTESTISNTLKVNMKKGKEYKVRIELQDKNLGSIDNLS SPNLYWELDGMKKIIPEENLFLRDYSNIEKDDPFIPNNNFFDPKLMSDWEDEDLDTDNDNIP DSYERNGYTIKDLIAVKWEDSFAEQGYKKYVSNYLESNTAGDPYTDYEKASGSFDKAIKTEA RDPLVAAYPIVGVGMEKLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTESNTAGVSVNVGYQNGFTA VTTNYSHTTDNSTAVQDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTNLVL DGDTLSTIKAQENQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQFSSRLIPINYDQLKKLDAGKQIMEIVNEDILPNNGLMGYYFTDEHFKDLKLMAPIKDGNLKFEEKKVDKLLDKDKSDVKSIRWT GRIIPSKDGEYTLSTDRDDVLMQVNTESTISNTLKVNMKKGKEYKVRIELQDKNLGSIDNLS SPNLYWELDGMKKIIPEENLFLRDYSNIEKDDPFIPNNNFFDPKLMSDWEDEDLDTDNDNIP DSYERNGYTIKDLIAVKWEDSFAEQGYKKYVSNYLESNTAGDPYTDYEKASGSFDKAIKTEA RDPLVAAYPIVGVGMEKLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTESNTAGVSVNVGYQNGFTA VTTNYSHTTDNSTAVQDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTNLVL DGDTLSTIKAQENQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQFSSRLIPINYDQLKKLDAGKQI

' KLETTQVSGNFGTKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAgggPEL TIGEAIEKAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDNTANKIKDSLKTLSDKKIYNVKLER GMNILIKTPTYFTNFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQGSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRY VFSGYSKDPLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTT YLDNLSITELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQT NKEALDYIQKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTY KKLRIYAITPDDRELLVLSVDHHHHHH SEQ ID NO : 13 - C128'KLETTQVSGNFGTKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAgggPEL TIGEAIEKAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDNTANKIKDSLKTLSDKKIYNVKLER GMNILIKTPTYFTNFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQGSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRY VFSGYSKDPLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTT YLDNLSITELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQT NKEALDYIQKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTY KKLRIYAITPDDRELLVLSVDHHHHHH SEQ ID NO: 13 - C128

MEIVNEDILPNNGLMGYYFTDEHFKDLKLMAPIKDGNLKFEEKKVDKLLDKDKSDVKSIRWTMEIVNEDILPNNGLMGYYFTDEHFKDLKLMAPIKDGNLKFEEKKVDKLLDKDKSDVKSIRWT

GRIIPSKDGEYTLSTDRDDVLMQVNTESTISNTLKVNMKKGKEYKVRIELQDKNLGSIDNLSGRIIPSKDGEYTLSTDRDDVLMQVNTESTISNTLKVNMKKGKEYKVRIELQDKNLGSIDNLS

SPNLYWELDGMKKIIPEENLFLRDYSNIEKDDPFIPNNNFFDPKLMSDWEDEDLDTDNDNIPSPNLYWELDGMKKIIPEENLFLRDYSNIEKDDPFIPNNNFFDPKLMSDWEDEDLDTDNDNIP

DSYERNGYTIKDLIAVKWEDSFAEQGYKKYVSNYLESNTAGDPYTDYEKASGSFDKAIKTEADSYERNGYTIKDLIAVKWEDSFAEQGYKKYVSNYLESNTAGDPYTDYEKASGSFDKAIKTEA

RDPLVAAYPIVGVGMEKLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTESNTAGVSVNVGYQNGFTARDPLVAAYPIVGVGMEKLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTESNTAGVSVNVGYQNGFTA

NVTTNYSHTTDNSTAVQDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTNLVNVTTNYSHTTDNSTAVQDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTNLV

LDGDTLSTIKAQENQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQFSSRLIPINYDQLKKLDAGKQ IKLETTQVSGNFGTKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAKNLQgLDGDTLSTIKAQENQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQFSSRLIPINYDQLKKLDAGKQ IKLETTQVSGNFGTKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAKNLQg

PgggTPELTIGEAIEKAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDNTANKIKDSLKTLSDKKPgggTPELTIGEAIEKAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDNTANKIKDSLKTLSDKK

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TLIGSGTTYLDNLSITELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYINGTLIGSGTTYLDNLSITELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYING

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GGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVDHHHHHH SEQ ID NO : 14 - C139GGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVDHHHHHH SEQ ID NO: 14 - C139

MVYNTTYKAPIERPEDFLKDKEKAKEWERKEAERIEQKLERSEKEALESYKKDSVEISKYSQMVYNTTYKAPIERPEDFLKDKEKAKEWERKEAERIEQKLERSEKEALESYKKDSVEISKYSQ

TRNYFYDYQIEANSREKEYKELRNAISKNKIDKPMYVYYFESPEKFAFNKVIRTENQNEISLTRNYFYDYQIEANSREKEYKELRNAISKNKIDKPMYVYYFESPEKFAFNKVIRTENQNEISL

EKFNEFKETIQNKLFKQDGFKDISLYEPGKGDEKPTPLLMHLKLPRNTGMLPYTNTNNVSTLEKFNEFKETIQNKLFKQDGFKDISLYEPGKGDEKPTPLLMHLKLPRNTGMLPYTNTNNVSTL

IEQGYSIKIDKIVRIVIDGKHYIKAEASWSSLDFKDDVSKGDSWGKANYNDWSNKLTPNELIEQGYSIKIDKIVRIVIDGKHYIKAEASWSSLDFKDDVSKGDSWGKANYNDWSNKLTPNEL

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GLTLTSPEYDFNKLENIDAFKSKWEGQALSYPNFISTSIGSVNMSAFAKRKIVLRITIPKGSGLTLTSPEYDFNKLENIDAFKSKWEGQALSYPNFISTSIGSVNMSAFAKRKIVLRITIPKGS

PGAYLSAIPGYAGQYEVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIPSDWEDEDLDTDNDPGAYLSAIPGYAGQYEVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIPSDWEDEDLDTDND

NIPDSYERNGYTIKDLIAVKWEDSFAEQGYKKYVSNYLESNTAGDPYTDYEKASGSFDKAIKNIPDSYERNGYTIKDLIAVKWEDSFAEQGYKKYVSNYLESNTAGDPYTDYEKASGSFDKAIK

TEARDPLVAAYPIVGVGMEKLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTESNTAGVSVNVGYQNGTEARDPLVAAYPIVGVGMEKLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTESNTAGVSVNVGYQNG

FTANVTTNYSHTTDNSTAVQDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTFTANVTTNYSHTTDNSTAVQDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTT

NLVLDGDTLSTIKAQENQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQFSSRLIPINYDQLKKLDANLVLDGDTLSTIKAQENQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQFSSRLIPINYDQLKKLDA

GKQIKLETTQVSGNFGTKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAKNGKQIKLETTQVSGNFGTKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAKN

LQDPEDKTPELTIGEAIEKAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDNTANKIKDSLKTLSLQDPEDKTPELTIGEAIEKAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDNTANKIKDSLKTLS

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PMSELKPYKRYVFSGYSKDPLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNPMSELKPYKRYVFSGYSKDPLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSN

IEITLIGSGTTYLDNLSITELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYIEITLIGSGTTYLDNLSITELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTY

INGMYFAPTQTNKEALDYIQKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSINGMYFAPTQTNKEALDYIQKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRS

YFTGGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVDGGHHHHHH SEQ ID NO : 15 - C145YFTGGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVDGGHHHHHH SEQ ID NO: 15 - C145

MVYNTTYKAPIERPEDFLKDKEKAKEWERKEAERIEQKLERSEKEALESYKKDSVEISKYSQ TRNYFYDYQIEANSREKEYKELRNAISKNKIDKPMYVYYFESPEKFAFNKVIRTENQNEISL EKFNEFKETIQNKLFKQDGFKDISLYEPGKGDEKPTPLLMHLKLPRNTGMLPYTNTNNVSTL IEQGYSIKIDKIVRIVIDGKHYIKAEASWSSLDFKDDVSKGDSWGKANYNDWSNKLTPNEL ADVNDYMRGGYTAINNYLISNGPVNNPNPELDSKITNIENALKREPIPTNLTVYRRSGPQEF GLTLTSPEYDFNKLENIDAFKSKWEGQALSYPNFISTSIGSVNMSAFAKRKIVLRITIPKGS PGAYLSAIPGYAGQYEVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIPGGGGGGAYPIVGV GMEKLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTESNTAGVSVNVGYQNGFTANVTTNYSHTTDNS TAVQDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTNLVLDGDTLSTIKAQE NQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQFSSRLIPINYDQLKKLDAGKQIKLETTQVSGNFG TKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAKNLQDPEDKTPELTIGEA IEKAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDNTANKIKDSLKTLSDKKIYNVKLERGMNIL IKTPTYFTNFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQGSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGY SKDPLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTYLDNL SITELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEAL DYIQKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRI YAITPDDRELLVLSVDGGHHHHHH SEQ ID NO : 16 - C155MVYNTTYKAPIERPEDFLKDKEKAKEWERKEAERIEQKLERSEKEALESYKKDSVEISKYSQ TRNYFYDYQIEANSREKEYKELRNAISKNKIDKPMYVYYFESPEKFAFNKVIRTENQNEISL EKFNEFKETIQNKLFKQDGFKDISLYEPGKGDEKPTPLLMHLKLPRNTGMLPYTNTNNVSTL IEQGYSIKIDKIVRIVIDGKHYIKAEASWSSLDFKDDVSKGDSWGKANYNDWSNKLTPNEL ADVNDYMRGGYTAINNYLISNGPVNNPNPELDSKITNIENALKREPIPTNLTVYRRSGPQEF GLTLTSPEYDFNKLENIDAFKSKWEGQALSYPNFISTSIGSVNMSAFAKRKIVLRITIPKGS PGAYLSAIPGYAGQYEVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIPGGGGGGAYPIVGV GMEKLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTESNTAGVSVNVGYQNGFTANVTTNYSHTTDNS TAVQDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTNLVLDGDTLSTIKAQE NQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQFSSRLIPINYDQLKKLDAGKQIKLETTQVSGNFG TKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAKNLQDPEDKTPELTIGEA IEKAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDNTANKIKDSLKTLSDKKIYNVKLERGMNIL IKTPTYFTNFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQGSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGY SKDPLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTYLDNL SITELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEAL DYIQKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMT YKKLRI YAITPDDRELLVLSVDGGHHHHHH SEQ ID NO: 16 - C155

PGAYLSAIPGYAGQYEVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIPTNFDDYNNYPSTWPGAYLSAIPGYAGQYEVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIPTNFDDYNNYPSTW

SNVNTTNQDGLQGSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGYSKDPLTSNSIIVKIKAKEEKSNVNTTNQDGLQGSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGYSKDPLTSNSIIVKIKAKEEK

TDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTYLDNLSITELNSTPEILDEPEVKIPTDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTYLDNLSITELNSTPEILDEPEVKIP

TDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEALDYIQKYRVEATLQYSGFKDITDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEALDYIQKYRVEATLQYSGFKDI

GTKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVDGGHHGTKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVDGGHH

HHHH SEQ ID NO : 17 - C156HHHH SEQ ID NO: 17 - C156

ADWDYMRGGYTAINNYLISNGPVNNPNPELDSKITNIENALKREPIPTNLTVYRRSGPQEFADWDYMRGGYTAINNYLISNGPVNNPNPELDSKITNIENALKREPIPTNLTVYRRSGPQEF

PGAYLSAIPGYAGQYEVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIPGGGGGGNTTNQDGPGAYLSAIPGYAGQYEVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIPGGGGGGNTTNQDG

LQGSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGYSKDPLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYLQGSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGYSKDPLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGY

TKFSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTYLDNLSITELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKTKFSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTYLDNLSITELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHK

IYFADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEALDYIQKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYIYFADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEALDYIQKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNY

LGDPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVDGGHHHHHH SEQ ID NO : 18 - C49LGDPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVDGGHHHHHH SEQ ID NO: 18 - C49

MVCNTTYKAPIERPEDFLKDKEKAKEWERKEAERIEQKLERSEKEALESYKKDSVEISKYSQMVCNTTYKAPIERPEDFLKDKEKAKEWERKEAERIEQKLERSEKEALESYKKDSVEISKYSQ

IEQGYSIKIDKIVRIVIDGKHYIKAEASWSSLDFKDDVSHHHHHH SEQ ID NO : 19 - C50IEQGYSIKIDKIVRIVIDGKHYIKAEASWSSLDFKDDVSHHHHHH SEQ ID NO: 19 - C50

IEQGYSIKIDKIVRIVIDGKHYIKAEASWSSHHHHHH SEQ ID NO : 20 - Séquence polypeptidique du domaine N-terminal de la CDTa (résidu 44 au résidu 240) .IEQGYSIKIDKIVRIVIDGKHYIKAEASWSSHHHHHH SEQ ID NO: 20 - Polypeptide sequence of the N-terminal domain of CDTa (residue 44 to residue 240).

IEQGYSIKIDKIHHHHHH SEQ ID NO : 21 - C67IEQGYSIKIDKIHHHHHH SEQ ID NO: 21 - C67

PGAYLSAIPGYAG3Y3VLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIPHHHHHH SEQ ID NO : 22 - C69PGAYLSAIPGYAG3Y3VLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIPHHHHHH SEQ ID NO: 22 - C69

ADVNDYMRGGYTAINNYLISNGPVNNPNPELDSKITNIENALKREPIPTNLTVYARSGPAEFADVNDYMRGGYTAINNYLISNGPVNNPNPELDSKITNIENALKREPIPTNLTVYARSGPAEF

GLTLTSPEYDFNKLENIDAFKSKWEGQALSYPAFIFTSIGSVNMSAFAKAKIVLRITIPKGSGLTLTSPEYDFNKLENIDAFKSKWEGQALSYPAFIFTSIGSVNMSAFAKAKIVLRITIPKGS

PGAYLSAIPGYAGQYQVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIPHHHHHH SEQ ID NO : 23 - C107PGAYLSAIPGYAGQYQVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIPHHHHHH SEQ ID NO: 23 - C107

PGAYLSAIPGYAGEYEVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIPHHHHHH SEQ ID NO : 24 - C108PGAYLSAIPGYAGEYEVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIPHHHHHH SEQ ID NO: 24 - C108

PGAYLSAIPGYAGEYQVLLNHGSKFKINPGAYLSAIPGYAGEYQVLLNHGSKFKIN

KIDSYKDGTITKLIVDATLIPHHHHHH SEQ ID NO : 25 - C149KIDSYKDGTITKLIVDATLIPHHHHHH SEQ ID NO: 25 - C149

MEIVNEDILPNNGLMGYYFTDEHFKDLKLMAPIKDGNLKFEEKKVDKLLDKDKSDVKSIRWT GRIIPSKDGEYTLSTDRDDVLMQVNTESTISNTLKVNMKKGKEYKVRIELQDKNLGSIDNLS SPNLYWELDGMKKIIPEENLFLRDYSNIEKDDPFIPNNNFFDPKLMSDWEDEDLDTDNDNIP DSYERNGYTIKDLIAVKWEDSFAEQGYKKYVSNYLESNTAGDPYTDYEKASGSFDKAIKTEA RDPLVAAYPIVGVGMEKLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTESNTAGVSVNVGYQNGFTA NVTTNYSHTTDNSTAVQDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTNLV LDGDTLSTIKAQENQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQRSSRLIPINYDQLKKLDAGKQ IKLETTQVSGNFGTKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAKNLQD PEDKTPELTIGEAIEKAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDNTANKIKDSLKTLSDKK IYNVKLERGMNILIKTPTYFTNFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQGSANKLNGETKIKIPMS ELKPYKRYVFSGYSKDPLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEI TLIGSGTTYLDNLSITELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYING MYFAPTQTNKEALDYIQKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFT GGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVDHHHHHH SEQ ID NO : 26 - C152MEIVNEDILPNNGLMGYYFTDEHFKDLKLMAPIKDGNLKFEEKKVDKLLDKDKSDVKSIRWT GRIIPSKDGEYTLSTDRDDVLMQVNTESTISNTLKVNMKKGKEYKVRIELQDKNLGSIDNLS SPNLYWELDGMKKIIPEENLFLRDYSNIEKDDPFIPNNNFFDPKLMSDWEDEDLDTDNDNIP DSYERNGYTIKDLIAVKWEDSFAEQGYKKYVSNYLESNTAGDPYTDYEKASGSFDKAIKTEA RDPLVAAYPIVGVGMEKLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTESNTAGVSVNVGYQNGFTA NVTTNYSHTTDNSTAVQDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTNLV LDGDTLSTIKAQENQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQRSSRLIPINYDQLKKLDAGKQ IKLETTQVSGNFGTKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAKNLQD PEDKTPELTIGEAIEKAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDNTANKIKDSLKTLSDKK IYNVKLERGMNILIKTPTYFTNFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQGSANKLNGETKIKIPMS ELKPYKRYVFSGYSKDPLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEI TLIGSGTTYLDNLSITELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYING MYFAPTQTNKEALDYIQKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFT GGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVDHHHHHH SEQ ID NO: 26 - C152

LDGDTLSTIKAQANQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMAQFSSRLIPINYDQLKKLDAGKQLDGDTLSTIKAQANQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMAQFSSRLIPINYDQLKKLDAGKQ

IKLETTQVSGNFGTKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAKNLQDIKLETTQVSGNFGTKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAKNLQD

PEDKTPELTIGEAIEKAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDNTANKIKDSLKTLSDKKPEDKTPELTIGEAIEKAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDNTANKIKDSLKTLSDKK

IYNVKLERGMNILIKTPTYFTNFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQGSANKLNGETKIKIPMSIYNVKLERGMNILIKTPTYFTNFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQGSANKLNGETKIKIPMS

ELKPYKRYVFSGYSKDPLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEIELKPYKRYVFSGYSKDPLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEI

GGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVDHHHHHH SEQ ID NO : 27 - C52GGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVDHHHHHH SEQ ID NO: 27 - C52

MTNFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQGSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGYSKDPLTMTNFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQGSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGYSKDPLT

SNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTYLDNLSITELNSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTYLDNLSITELN

STPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEALDYIQKYSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEALDYIQKY

RVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRIYAITPDRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRIYAITPD

DRELLVLSVDGGHHHHHH SEQ ID NO : 28 - C53DRELLVLSVDGGHHHHHH SEQ ID NO: 28 - C53

MNTTNQDGLQGSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGYSKDPLTSNSIIVKIKAKEEKTDMNTTNQDGLQGSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGYSKDPLTSNSIIVKIKAKEEKTD

YLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTYLDNLSITELNSTPEILDEPEVKIPTDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTYLDNLSITELNSTPEILDEPEVKIPTD

QEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEALDYIQKYRVEATLQYSGFKDIGTQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEALDYIQKYRVEATLQYSGFKDIGT

KDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVDGGHHHHKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVDGGHHHH

HHHH

SEQ ID NO : 29 - Séquence d'acides aminés de la toxine ASEQ ID NO: 29 - Amino acid sequence of toxin A

MSLISKEELIKLAYSIRPRENEYKTILTNLDEYNKLTTNNNENKYLQLKKLNESIDVFMN KYKTSSRNRALSNLKKDILKEVILIKNSNTSPVEKNLHFVWIGGEVSDIALEYIKQWADI NAEYNIKLWYDSEAFLVNTLKKAIVESSTTEALQLLEEEIQNPQFDNMKFYKKRMEFIYDMSLISKEELIKLAYSIRPRENEYKTILTNLDEYNKLTTNNNENKYLQLKKLNESIDVFMN KYKTSSRNRALSNLKKDILKEVILIKNSNTSPVEKNLHFVWIGGEVSDIALEYIKQWADI NAEYNIKLWYDSEAFLVNTLKKAIVESSTTEALQLLEEEIQNPQFDNMKFYKKRMEFIYD

RQKRFINYYKSQINKPTVPTIDDIIKSHLVSEYNRDETVLESYRTNSLRKINSNHGIDIR ANSLFTEQELLNIYSQELLNRGNLAAASDIVRLLALKNFGGVYLDVDMLPGIHSDLFKTI SRPSSIGLDRWEMIKLEAIMKYKKYINNYTSENFDKLDQQLKDNFKLIIESKSEKSEIFS KLENLNVSDLEIKIAFALGSVINQALISKQGSYLTNLVIEQVKNRYQFLNQHLNPAIESD NNFTDTTKIFHDSLFNSATAENSMFLTKIAPYLQVGFMPEARSTISLSGPGAYASAYYDF INLQENTIEKTLKASDLIEFKFPENNLSQLTEQEINSLWSFDQASAKYQFEKYVRDYTGG .SLSEDNGVDFNKNTALDKNYLLNNKIPSNNVEEAGSKNYVHYIIQLQGDDISYEATCNLF SKNPKNSIIIQRNMNESAKSYFLSDDGESILELNKYRIPERLKNKEKVKVTFIGHGKDEF NTSEFARLSVDSLSNEISSFLDTIKLDISPKNVEVNLLGCNMFSYDFNVEETYPGKLLLS IMDKITSTLPDVNKNSITIGANQYEVRINSEGRKELLAHSGKWINKEEAIMSDLSSKEYI FFDSIDNKLKAKSKNIPGLASISEDIKTLLLDASVSPDTKFILNNLKLNIESSIGDYIYY EKLEPVKNIIHNSIDDLIDEFNLLENVSDELYELKKLNNLDEKYLISFEDISKNNSTYSV RFINKSNGESVYVETEKEIFSKYSEHITKEISTIKNSIITDVNGNLLDNIQLDHTSQVNT LNAAFFIQSLIDYSSNKDVLNDLSTSVKVQLYAQLFSTGLNTIYDSIQLVNLISNAVNDT INVLPTITEGIPIVSTILDGINLGAAIKELLDEHDPLLKKELEAKVGVLAINMSLSIAAT VASIVGIGAEVTIFLLPIAGISAGIPSLVNNELILHDKATSVVNYFNHLSESKKYGPLKT EDDKILVPIDDLVISEIDFNNNSIKLGTCNILAMEGGSGHTVTGNIDHFFSSPSISSHIP SLSIYSAIGIETENLDFSKKIMMLPNAPSRVFWWETGAVPGLRSLENDGTRLLDSIRDLY PGKFYWRFYAFFDYAITTLKPVYEDTNIKIKLDKDTRNFIMPTITTNEIRNKLSYSFDGA GGTYSLLLSSYPISTNINLSKDDLWIFNIDNEVREISIENGTIKKGKLIKDVLSKIDINK NKLIIGNQTIDFSGDIDNKDRYIFLTCELDDKISLIIEINLVAKSYSLLLSGDKNYLISN LSNTIEKINTLGLDSKNIAYNYTDESNNKYFGAISKTSQKSIIHYKKDSKNILEFYNDST LEFNSKDFIAEDINVFMKDDINTITGKYYVDNNTDKSIDFSISLVSKNQVKVNGLYLNES VYSSYLDFVKNSDGHHNTSNFMNLFLDNISFWKLFGFENINFVIDKYFTLVGKTNLGYVE FICDNNKNIDIYFGEWKTSSSKSTIFSGNGRNVWEPIYNPDTGEDISTSLDFSYEPLYG IDRYINKVLIAPDLYTSLININTNYYSNEYYPEIIVLNPNTFHKKVNINLDSSSFEYKWS TEGSDFILVRYLEESNKKILQKIRIKGILSNTQSFNKMSIDFKDIKKLSLGYIMSNFKSF NSENELDRDHLGFKIIDNKTYYYDEDSKLVKGLININNSLFYFDPIEFNLVTGWQTINGK KYYFDINTGAALTSYKIINGKHFYFNNDGVMQLGVFKGPDGFEYFAPANTQNNNIEGQAI VYQSKFLTLNGKKYYFDNNSKAVTGWRIINNEKYYFNPNNAIAAVGLQVIDNNKYYFNPD TAIISKGWQTVNGSRYYFDTDTAIAFNGYKTIDGKHFYFDSDCWKIGVFSTSNGFEYFA PANTYNNNIEGQAIVYQSKFLTLNGKKYYFDNNSKAVTGLQTIDSKKYYFNTNTAEAATG WQTIDGKKYYFNTNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTAIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQRQKRFINYYKSQINKPTVPTIDDIIKSHLVSEYNRDETVLESYRTNSLRKINSNHGIDIR ANSLFTEQELLNIYSQELLNRGNLAAASDIVRLLALKNFGGVYLDVDMLPGIHSDLFKTI SRPSSIGLDRWEMIKLEAIMKYKKYINNYTSENFDKLDQQLKDNFKLIIESKSEKSEIFS KLENLNVSDLEIKIAFALGSVINQALISKQGSYLTNLVIEQVKNRYQFLNQHLNPAIESD NNFTDTTKIFHDSLFNSATAENSMFLTKIAPYLQVGFMPEARSTISLSGPGAYASAYYDF INLQENTIEKTLKASDLIEFKFPENNLSQLTEQEINSLWSFDQASAKYQFEKYVRDYTGG .SLSEDNGVDFNKNTALDKNYLLNNKIPSNNVEEAGSKNYVHYIIQLQGDDISYEATCNLF SKNPKNSIIIQRNMNESAKSYFLSDDGESILELNKYRIPERLKNKEKVKVTFIGHGKDEF NTSEFARLSVDSLSNEISSFLDTIKLDISPKNVEVNLLGCNMFSYDFNVEETYPGKLLLS IMDKITSTLPDVNKNSITIGANQYEVRINSEGRKELLAHSGKWINKEEAIMSDLSSKEYI FFDSIDNKLKAKSKNIPGLASISEDIKTLLLDASVSPDTKFILNNLKLNIESSIGDYIYY EKLEPVKNIIHNSIDDLIDEFNLLENVSDELYELKKLNNLDEKYLISFEDISKNNSTYSV RFINKSNGESVYVETEKEIFSKYSEHITKEISTIKNSIITDVNGNLLDNIQLDHTSQVNT LNAAFFIQSLIDYSSNKDVLNDLSTSVKVQLYAQLFSTGLNTIYDSIQLVNLISNAVNDT INVLPTITEGIPIVSTILDGINLGAAIKELLDEHDPLLKKELEAKVGVLAINMSLSIAAT VASIVGIGAEVTIFLLPIAGISAGIPSLVNNELILHDKATSVVNYFNHLSESKKYGPLKT EDDKILVPIDDLVISEIDFNNNS IKLGTCNILAMEGGSGHTVTGNIDHFFSSPSISSHIP SLSIYSAIGIETENLDFSKKIMMLPNAPSRVFWWETGAVPGLRSLENDGTRLLDSIRDLY PGKFYWRFYAFFDYAITTLKPVYEDTNIKIKLDKDTRNFIMPTITTNEIRNKLSYSFDGA GGTYSLLLSSYPISTNINLSKDDLWIFNIDNEVREISIENGTIKKGKLIKDVLSKIDINK NKLIIGNQTIDFSGDIDNKDRYIFLTCELDDKISLIIEINLVAKSYSLLLSGDKNYLISN LSNTIEKINTLGLDSKNIAYNYTDESNNKYFGAISKTSQKSIIHYKKDSKNILEFYNDST LEFNSKDFIAEDINVFMKDDINTITGKYYVDNNTDKSIDFSISLVSKNQVKVNGLYLNES VYSSYLDFVKNSDGHHNTSNFMNLFLDNISFWKLFGFENINFVIDKYFTLVGKTNLGYVE FICDNNKNIDIYFGEWKTSSSKSTIFSGNGRNVWEPIYNPDTGEDISTSLDFSYEPLYG IDRYINKVLIAPDLYTSLININTNYYSNEYYPEIIVLNPNTFHKKVNINLDSSSFEYKWS TEGSDFILVRYLEESNKKILQKIRIKGILSNTQSFNKMSIDFKDIKKLSLGYIMSNFKSF NSENELDRDHLGFKIIDNKTYYYDEDSKLVKGLININNSLFYFDPIEFNLVTGWQTINGK KYYFDINTGAALTSYKIINGKHFYFNNDGVMQLGVFKGPDGFEYFAPANTQNNNIEGQAI VYQSKFLTLNGKKYYFDNNSKAVTGWRIINNEKYYFNPNNAIAAVGLQVIDNNKYYFNPD TAIISKGWQTVNGSRYYFDTDTAIAFNGYKTIDGKHFYFDSDCWKIGVFSTSNGFEYFA PANTYNNNIEGQAIVYQSKFLTLNGKKYYFDNNSKAVTGLQTIDSKKYYFNTNTAEAATG WQTIDGKKYYFNTNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTAIASTGYTIINGK HFYFNTDGIMQ

IGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQNEFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGWRIINNKIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQNEFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGWRIINNK

KYYFNPNNAIAAIHLCTINNDKYYFSYDGILQNGYITIERNNFYFDANNESKMVTGVFKGKYYFNPNNAIAAIHLCTINNDKYYFSYDGILQNGYITIERNNFYFDANNESKMVTGVFKG

PNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDGKKYYFNLPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDGKKYYFNL

NTAEAATGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFYNTAEAATGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFY

FNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVT

GLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYYFNTNTSIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYYFNTNTSIASTGYTIISGKHFYFNTDGIM

QIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLYLHDNIYYFGNNSKAATGWVTIDGQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLYLHDNIYYFGNNSKAATGWVTIDG

NRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGVFKGSNGFEYFAPANTDANNIEGQAINRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGVFKGSNGFEYFAPANTDANNIEGQAI

RYQNRFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINGKVYYFMPDTAMAAAGGLFEIDGVIYFFGVRYQNRFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINGKVYYFMPDTAMAAAGGLFEIDGVIYFFGV

DGVKAPGIYGDGVKAPGIYG

SEQ ID NO : 30 - Séquence d'acides aminés de la toxine BSEQ ID NO: 30 - Amino acid sequence of toxin B

MSLVNRKQLEKMANVRFRTQEDEYVAILDALEEYHNMSENTVVEKYLKLKDINSLTDIYI DTYKKSGRNKALKKFKEYLVTEVLELKNNNLTPVEKNLHFVWIGGQINDTAINYINQWKD VNSDYNVNVFYDSNAFLINTLKKTVVESAINDTLESFRENLNDPRFDYNKFFRKRMEIIY DKQKNFINYYKAQREENPELIIDDIVKTYLSNEYSKEIDELNTYIEESLNKITQNSGNDV RNFEEFKNGESFNLYEQELVERWNLAAASDILRISALKEIGGMYLDVDMLPGIQPDLFES IEKPSSVTVDFWEMTKLEAIMKYKEYIPEYTSEHFDMLDEEVQSSFESVLASKSDKSEIF SSLGDMEASPLEVKIAFNSKGIINQGLISVKDSYCSNLIVKQIENRYKILNNSLNPAISE DNDFNTTTNTFIDSIMAEANADNGRFMMELGKYLRVGFFPDVKTTINLSGPEAYAAAYQD LLMFKEGSMNIHLIEADLRNFEISKTNISQSTEQEMASLWSFDDARAKAQFEEYKRNYFE GSLGEDDNLDFSQNIVVDKEYLLEKISSLARSSERGYIHYIVQLQGDKISYEAACNLFAK TPYDSVLFQKNIEDSEIAYYYNPGDGEIQEIDKYKIPSIISDRPKIKLTFIGHGKDEFNT DIFAGFDVDSLSTEIEAAIDLAKEDISPKSIEINLLGCNMFSYSINVEETYPGKLLLKVK DKISELMPSISQDSIIVSANQYEVRINSEGRRELLDHSGEWINKEESIIKDISSKEYISF NPKENKITVKSKNLPELSTLLQEIRNNSNSSDIELEEKVMLTECEINVISNIDTQIVEER IEEAKNLTSDSINYIKDEFKLIESISDALCDLKQQNELEDSHFISFEDISETDEGFSIRF INKETGESIFVETEKTIFSEYANHITEEISKIKGTIFDTVNGKLVKKVNLDTTHEVNTLN AAFFIQSLIEYNSSKESLSNLSVAMKVQVYAQLFSTGLNTITDAAKWELVSTALDETID LLPTLSEGLPIIATIIDGVSLGAAIKELSETSDPLLRQEIEAKIGIMAVNLTTATTAIIT SSLGIASGFSILLVPLAGISAGIPSLVNNELVLRDKATKWDYFKHVSLVETEGVFTLLD DKIMMPQDDLVISEIDFNNNSIVLGKCEIWRMEGGSGHTVTDDIDHFFSAPSITYREPHL SIYDVLEVQKEELDLSKDLMVLPNAPNRVFAWETGWTPGLRSLENDGTKLLDRIRDNYEGMSLVNRKQLEKMANVRFRTQEDEYVAILDALEEYHNMSENTVVEKYLKLKDINSLTDIYI DTYKKSGRNKALKKFKEYLVTEVLELKNNNLTPVEKNLHFVWIGGQINDTAINYINQWKD VNSDYNVNVFYDSNAFLINTLKKTVVESAINDTLESFRENLNDPRFDYNKFFRKRMEIIY DKQKNFINYYKAQREENPELIIDDIVKTYLSNEYSKEIDELNTYIEESLNKITQNSGNDV RNFEEFKNGESFNLYEQELVERWNLAAASDILRISALKEIGGMYLDVDMLPGIQPDLFES IEKPSSVTVDFWEMTKLEAIMKYKEYIPEYTSEHFDMLDEEVQSSFESVLASKSDKSEIF SSLGDMEASPLEVKIAFNSKGIINQGLISVKDSYCSNLIVKQIENRYKILNNSLNPAISE DNDFNTTTNTFIDSIMAEANADNGRFMMELGKYLRVGFFPDVKTTINLSGPEAYAAAYQD LLMFKEGSMNIHLIEADLRNFEISKTNISQSTEQEMASLWSFDDARAKAQFEEYKRNYFE GSLGEDDNLDFSQNIVVDKEYLLEKISSLARSSERGYIHYIVQLQGDKISYEAACNLFAK TPYDSVLFQKNIEDSEIAYYYNPGDGEIQEIDKYKIPSIISDRPKIKLTFIGHGKDEFNT DIFAGFDVDSLSTEIEAAIDLAKEDISPKSIEINLLGCNMFSYSINVEETYPGKLLLKVK DKISELMPSISQDSIIVSANQYEVRINSEGRRELLDHSGEWINKEESIIKDISSKEYISF NPKENKITVKSKNLPELSTLLQEIRNNSNSSDIELEEKVMLTECEINVISNIDTQIVEER IEEAKNLTSDSINYIKDEFKLIESISDALCDLKQQNELEDSHFISFEDISETDEGFSIRF INKETGESIFVETEKTIFSEYANHITEEISKIKGTIFDTVNGKLVKKVNLDTTHEVNTLN AAFFIQSLIEYNSSKESLSNLSVA MKVQVYAQLFSTGLNTITDAAKWELVSTALDETID LLPTLSEGLPIIATIIDGVSLGAAIKELSETSDPLLRQEIEAKIGIMAVNLTTATTAIIT SSLGIASGFSILLVPLAGISAGIPSLVNNELVLRDKATKWDYFKHVSLVETEGVFTLLD DKIMMPQDDLVISEIDFNNNSIVLGKCEIWRMEGGSGHTVTDDIDHFFSAPSITYREPHL SIYDVLEVQKEELDLSKDLMVLPNAPNRVFAWETGWTPGLRSLENDGTKLLDRIRDNYEG

EFYWRYFAFIADALITTLKPRYEDTNIRINLDSNTRSFIVPIITTEYIREKLSYSFYGSG GTYALSLSQYNMGINIELSESDVWIIDVDNWRDVTIESDKIKKGDLIEGILSTLSIEEN KIILNSHEINFSGEVNGSNGFVSLTFSILEGINAIIEVDLLSKSYKLLISGELKILMLNS NHIQQKIDYIGFNSELQKNIPYSFVDSEGKENGFINGSTKEGLFVSELPDWLISKVYMD DSKPSFGYYSNNLKDVKVITKDNVNILTGYYLKDDIKISLSLTLQDEKTIKLNSVHLDES GVAEILKFMNRKGNTNTSDSLMSFLESMNIKSIFVNFLQSNIKFILDANFIISGTTSIGQ FEFICDENDNIQPYFIKFNTLETNYTLYVGNRQNMIVEPNYDLDDSGDISSTVINFSQKY LYGIDSCVNKWISPNIYTDEINITPVYETNNTYPEVIVLDANYINEKINVNINDLSIRY VWSNDGNDFILMSTSEENKVSQVKIRFVNVFKDKTLANKLSFNFSDKQDVPVSEIILSFT PSYYEDGLIGYDLGLVSLYNEKFYINNFGMMVSGLIYINDSLYYFKPPVNNLITGFVTVG DDKYYFNPINGGAASIGETIIDDKNYYFNQSGVLQTGVFSTEDGFKYFAPANTLDENLEG EAIDFTGKLIIDENIYYFDDNYRGAVEWKELDGEMHYFSPETGKAFKGLNQIGDYKYYFN SDGVMQKGFVSINDNKHYFDDSGVMKVGYTEIDGKHFYFAENGEMQIGVFNTEDGFKYFA HHNEDLGNEEGEEISYSGILNFNNKIYYFDDSFTAWGWKDLEDGSKYYFDEDTAEAYIG LSLINDGQYYFNDDGIMQVGFVTINDKVFYFSDSGIIESGVQNIDDNYFYIDDNGIVQIG VFDTSDGYKYFAPANTVNDNIYGQAVEYSGLVRVGEDVYYFGETYTIETGWIYDMENESD KYYFNPETKKACKGINLIDDIKYYFDEKGIMRTGLISFENNNYYFNENGEMQFGYINIED KMFYFGEDGVMQIGVFNTPDGFKYFAHQNTLDENFEGESINYTGWLDLDEKRYYFTDEYI AATGSVIIDGEEYYFDPDTAQLVISE SEQ ID NO : 31 - FlEFYWRYFAFIADALITTLKPRYEDTNIRINLDSNTRSFIVPIITTEYIREKLSYSFYGSG GTYALSLSQYNMGINIELSESDVWIIDVDNWRDVTIESDKIKKGDLIEGILSTLSIEEN KIILNSHEINFSGEVNGSNGFVSLTFSILEGINAIIEVDLLSKSYKLLISGELKILMLNS NHIQQKIDYIGFNSELQKNIPYSFVDSEGKENGFINGSTKEGLFVSELPDWLISKVYMD DSKPSFGYYSNNLKDVKVITKDNVNILTGYYLKDDIKISLSLTLQDEKTIKLNSVHLDES GVAEILKFMNRKGNTNTSDSLMSFLESMNIKSIFVNFLQSNIKFILDANFIISGTTSIGQ FEFICDENDNIQPYFIKFNTLETNYTLYVGNRQNMIVEPNYDLDDSGDISSTVINFSQKY LYGIDSCVNKWISPNIYTDEINITPVYETNNTYPEVIVLDANYINEKINVNINDLSIRY VWSNDGNDFILMSTSEENKVSQVKIRFVNVFKDKTLANKLSFNFSDKQDVPVSEIILSFT PSYYEDGLIGYDLGLVSLYNEKFYINNFGMMVSGLIYINDSLYYFKPPVNNLITGFVTVG DDKYYFNPINGGAASIGETIIDDKNYYFNQSGVLQTGVFSTEDGFKYFAPANTLDENLEG EAIDFTGKLIIDENIYYFDDNYRGAVEWKELDGEMHYFSPETGKAFKGLNQIGDYKYYFN SDGVMQKGFVSINDNKHYFDDSGVMKVGYTEIDGKHFYFAENGEMQIGVFNTEDGFKYFA HHNEDLGNEEGEEISYSGILNFNNKIYYFDDSFTAWGWKDLEDGSKYYFDEDTAEAYIG LSLINDGQYYFNDDGIMQVGFVTINDKVFYFSDSGIIESGVQNIDDNYFYIDDNGIVQIG VFDTSDGYKYFAPANTVNDNIYGQAVEYSGLVRVGEDVYYFGETYTIETGWIYDMENESD KYYFNPETKKACKGINLIDDIKYYFDEK GIMRTGLISFENNNYYFNENGEMQFGYINIED KMFYFGEDGVMQIGVFNTPDGFKYFAHQNTLDENFEGESINYTGWLDLDEKRYYFTDEYI AATGSVIIDGEEYYFDPDTAQLVISE SEQ ID NO: 31 - Fl

MGWQTIDGKKYYFNTNTAIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANMGWQTIDGKKYYFNTNTAIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDAN

NIEGQAILYQNEFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGWRIINNKKYYFNPNNAIAAIHLCTINNDKYNIEGQAILYQNEFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGWRIINNKKYYFNPNNAIAAIHLCTINNDKY

YFSYDGILQNGYITIERNNFYFDANNESKMVTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQYFSYDGILQNGYITIERNNFYFDANNESKMVTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQ

NKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNLNTAEAANKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNLNTAEAA

TGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANTGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDAN

NIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKY

YFNTNTSIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNYFNTNTSIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQN

RFLYLHDNIYYFGNNSKAATGWVTIDGNRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGVRFLYLHDNIYYFGNNSKAATGWVTIDGNRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGV

FKGSNGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINGKVYYFMFKGSNGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINGKVYYFM

PDTAMAAAGGLFEIDGVIYFFGVDGVKAPGFVSINDNKHYFDDSGVMKVGYTEIDGKHFYFAPDTAMAAAGGLFEIDGVIYFFGVDGVKAPGFVSINDNKHYFDDSGVMKVGYTEIDGKHFYFA

ENGEMQIGVFNTEDGFKYFAHHNEDLGNEEGEEISYSGILNFNNKIYYFDDSFTAWGWKDLENGEMQIGVFNTEDGFKYFAHHNEDLGNEEGEEISYSGILNFNNKIYYFDDSFTAWGWKDL

EDGSKYYFDEDTAEAYIGLSLINDGQYYFNDDGIMQVGFVTINDKVFYFSDSGIIESGVQNIEDGSKYYFDEDTAEAYIGLSLINDGQYYFNDDGIMQVGFVTINDKVFYFSDSGIIESGVQNI

DDNYFYIDDNGIVQIGVFDTSDGYKYFAPANTVNDNIYGQAVEYSGLVRVGEDVYYFGETYTDDNYFYIDDNGIVQIGVFDTSDGYKYFAPANTVNDNIYGQAVEYSGLVRVGEDVYYFGETYT

IETGWIYDMENESDKYYFNPETKKACKGINLIDDIKYYFDEKGIMRTGLISFENNNYYFNENIETGWIYDMENESDKYYFNPETKKACKGINLIDDIKYYFDEKGIMRTGLISFENNNYYFNEN

GEMQFGYINIEDKMFYFGEDGVMQIGVFNTPDGFKYFAHQNTLDENFEGESINYTGWLDLDEGEMQFGYINIEDKMFYFGEDGVMQIGVFNTPDGFKYFAHQNTLDENFEGESINYTGWLDLDE

KRYYFTDEYIAATGSVIIDGEEYYFDPDTAQLVISE SEQ ID NO : 32 - F2KRYYFTDEYIAATGSVIIDGEEYYFDPDTAQLVISE SEQ ID NO: 32 - F2

MGWQTIDGKKYYFNTNTAIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDAN NIEGQAILYQNEFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGWRIINNKKYYFNPNNAIAAIHLCTINNDKY YFSYDGILQNGYITIERNNFYFDANNESKMVTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQ NKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNLNTAEAA TGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDAN NIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKY YFNTNTSIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQN RFLYLHDNIYYFGNNSKAATGWVTIDGNRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGV FKGSNGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINGKVYYFM PDTAMAAAGGLNQIGDYKYYFNSDGVMQKGFVSINDNKHYFDDSGVMKVGYTEIDGKHFYFA ENGEMQIGVFNTEDGFKYFAHHNEDLGNEEGEEISYSGILNFNNKIYYFDDSFTAWGWKDL EDGSKYYFDEDTAEAYIGLSLINDGQYYFNDDGIMQVGFVTINDKVFYFSDSGIIESGVQNI DDNYFYIDDNGIVQIGVFDTSDGYKYFAPANTVNDNIYGQAVEYSGLVRVGEDVYYFGETYT IETGWIYDMENESDKYYFNPETKKACKGINLIDDIKYYFDEKGIMRTGLISFENNNYYFNEN GEMQFGYINIEDKMFYFGEDGVMQIGVFNTPDGFKYFAHQNTLDENFEGESINYTGWLDLDE KRYYFTDEYIAATGSVIIDGEEYYFDPDTAQLVISE SEQ ID NO : 33 - F3MGWQTIDGKKYYFNTNTAIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDAN NIEGQAILYQNEFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGWRIINNKKYYFNPNNAIAAIHLCTINNDKY YFSYDGILQNGYITIERNNFYFDANNESKMVTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQ NKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNLNTAEAA TGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDAN NIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKY YFNTNTSIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQN RFLYLHDNIYYFGNNSKAATGWVTIDGNRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGV FKGSNGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINGKVYYFM PDTAMAAAGGLNQIGDYKYYFNSDGVMQKGFVSINDNKHYFDDSGVMKVGYTEIDGKHFYFA ENGEMQIGVFNTEDGFKYFAHHNEDLGNEEGEEISYSGILNFNNKIYYFDDSFTAWGWKDL EDGSKYYFDEDTAEAYIGLSLINDGQYYFNDDGIMQVGFVTINDKVFYFSDSGIIESGVQNI DDNYFYIDDNGIVQIGVFDTSDGYKYFAPANTVNDNIYGQAVEYSGLVRVGEDVYYFGETYT IETGWIYDMENESDKYYFNPETKKACKGINLIDDIKYYFDEKGIMRTGLISFENNNYYFNEN GEMQFGYINIEDKMFYFGEDGVMQIGVFNTPDGFKYFAHQNTLDENFEGESINYTGWLDLDE KRYYFTDEYIAATGSVIIDGEEYYFDPDTAQLVISE SEQ ID NO: 33 - F3

MGWQTIDGKKYYFNTNTAIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDAN NIEGQAILYQNEFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGWRIINNKKYYFNPNNAIAAIHLCTINNDKY YFSYDGILQNGYITIERNNFYFDANNESKMVTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQ NKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNLNTAEAA TGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDAN NIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKY YFNTNTSIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQN RFLYLHDNIYYFGNNSKAATGWVTIDGNRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGVMGWQTIDGKKYYFNTNTAIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDAN NIEGQAILYQNEFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGWRIINNKKYYFNPNNAIAAIHLCTINNDKY YFSYDGILQNGYITIERNNFYFDANNESKMVTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQ NKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNLNTAEAA TGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDAN NIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKY YFNTNTSIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQN RFLYLHDNIYYFGNNSKAATGWVTIDGNRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGV

FKGSNGFEYFAHHNEDLGNEEGEEISYSGILNFNNKIYYFDDSFTAWGWKDLEDGSKYYFD EDTAEAYIGLSLINDGQYYFNDDGIMQVGFVTINDKVFYFSDSGIIESGVQNIDDNYFYIDD NGIVQIGVFDTSDGYKYFAPANTVNDNIYGQAVEYSGLVRVGEDVYYFGETYTIETGWIYDM ENESDKYYFNPETKKACKGINLIDDIKYYFDEKGIMRTGLISFENNNYYFNENGEMQFGYIN IEDKMFYFGEDGVMQIGVFNTPDGFKYFAHQNTLDENFEGESINYTGWLDLDEKRYYFTDEY IAATGSVIIDGEEYYFDPDTAQLVISE SEQ ID NO : 34 - F4FKGSNGFEYFAHHNEDLGNEEGEEISYSGILNFNNKIYYFDDSFTAWGWKDLEDGSKYYFD EDTAEAYIGLSLINDGQYYFNDDGIMQVGFVTINDKVFYFSDSGIIESGVQNIDDNYFYIDD NGIVQIGVFDTSDGYKYFAPANTVNDNIYGQAVEYSGLVRVGEDVYYFGETYTIETGWIYDM ENESDKYYFNPETKKACKGINLIDDIKYYFDEKGIMRTGLISFENNNYYFNENGEMQFGYIN IEDKMFYFGEDGVMQIGVFNTPDGFKYFAHQNTLDENFEGESINYTGWLDLDEKRYYFTDEY IAATGSVIIDGEEYYFDPDTAQLVISE SEQ ID NO: 34 - F4

MGWQTIDGKKYYF.NTNTAIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDAN NIEGQAILYQNEFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGWRIINNKKYYFNPNNAIAAIHLCTINNDKY YFSYDGILQNGYITIERNNFYFDANNESKMVTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQ NKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNLNTAEAA TGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDAN NIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKY YFNTNTSIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQN RFLYLHDNIYY FGNN S KAATGWVTIDGNRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGV FKGSNGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINGKVYYFM PDTAMAAAGGETIIDDKNYYFNQSGVLQTGVFSTEDGFKYFAPANTLDENLEGEAIDFTGKL IIDENIYYFDDNYRGAVEWKELDGEMHYFSPETGKAFKGLNQIGDYKYYFNSDGVMQKGFVS INDNKHYFDDSGVMKVGYTEIDGKHFYFAENGEMQIGVFNTEDGFKYFAHHNEDLGNEEGEE ISYSGILNFNNKIYYFDDSFTAWGWKDLEDGSKYYFDEDTAEAYIGLSLINDGQYYFNDDG IMQVGFVTINDKVFYFSDSGIIESGVQNIDDNYFYIDDNGIVQIGVFDTSDGYKYFAPANTV NDNIYGQAVEYSGLVRVGEDVYYFGETYTIETGWIYDMENESDKYYFNPETKKACKGINLID DIKYYFDEKGIMRTGLISFENNNYYFNENGEMQFGYINIEDKMFYFGEDGVMQIGVFNTPDG FKYFAHQNTLDENFEGESINYTGWLDLDEKRYYFTDEYIAATGSVIIDGEEYYFDPDTAQLV ISE SEQ ID NO : 35 - F5MGWQTIDGKKYYF.NTNTAIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDAN NIEGQAILYQNEFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGWRIINNKKYYFNPNNAIAAIHLCTINNDKY YFSYDGILQNGYITIERNNFYFDANNESKMVTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQ NKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNLNTAEAA TGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDAN NIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKY YFNTNTSIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQN RFLYLHDNIYY FGNN S KAATGWVTIDGNRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGV FKGSNGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINGKVYYFM PDTAMAAAGGETIIDDKNYYFNQSGVLQTGVFSTEDGFKYFAPANTLDENLEGEAIDFTGKL IIDENIYYFDDNYRGAVEWKELDGEMHYFSPETGKAFKGLNQIGDYKYYFNSDGVMQKGFVS INDNKHYFDDSGVMKVGYTEIDGKHFYFAENGEMQIGVFNTEDGFKYFAHHNEDLGNEEGEE ISYSGILNFNNKIYYFDDSFTAWGWKDLEDGSKYYFDEDTAEAYIGLSLINDGQYYFNDDG IMQVGFVTINDKVFYFSDSGIIESGVQNIDDNYFYIDDNGIVQIGVFDTSDGYKYFAPANTV NDNIYGQAVEYSGLVRVGEDVYYFGETYTIETGWIYDMENESDKYYFNPETKKACKGINLID DIKYYFDEKGIMRTGLISFENNNYYFNENGEMQFGYINIEDKMFYFGEDGVM QIGVFNTPDG FKYFAHQNTLDENFEGESINYTGWLDLDEKRYYFTDEYIAATGSVIIDGEEYYFDPDTAQLV ISE SEQ ID NO: 35 - F5

NIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKY YFNTNTSIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQN RFLYLHDNIYYFGNNSKAATGWVTIDGNRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGV FKGSNGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINGKVYYFM PDTAMAAAGGLFEIDGVIYFFGVDGVKAPGIYGGGFVSINDNKHYFDDSGVMKVGYTEIDGK HFYFAENGEMQIGVFNTEDGFKYFAHHNEDLGNEEGEEISYSGILNFNNKIYYFDDSFTAVV GWKDLEDGSKYYFDEDTAEAYIGLSLINDGQYYFNDDGIMQVGFVTINDKVFYFSDSGIIES GVQNIDDNYFYIDDNGIVQIGVFDTSDGYKYFAPANTVNDNIYGQAVEYSGLVRVGEDVYYF GETYTIETGWIYDMENESDKYYFNPETKKACKGINLIDDIKYYFDEKGIMRTGLISFENNNY YFNENGEMQFGYINIEDKMFYFGEDGVMQIGVFNTPDGFKYFAHQNTLDENFEGESINYTGW LDLDEKRYYFTDEYIAATGSVIIDGEEYYFDPDTAQLVISE SEQ ID NO : 36 - Séquence polypeptidique de la construction de CDTa C34NIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKY YFNTNTSIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQN RFLYLHDNIYYFGNNSKAATGWVTIDGNRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGV FKGSNGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINGKVYYFM PDTAMAAAGGLFEIDGVIYFFGVDGVKAPGIYGGGFVSINDNKHYFDDSGVMKVGYTEIDGK HFYFAENGEMQIGVFNTEDGFKYFAHHNEDLGNEEGEEISYSGILNFNNKIYYFDDSFTAVV GWKDLEDGSKYYFDEDTAEAYIGLSLINDGQYYFNDDGIMQVGFVTINDKVFYFSDSGIIES GVQNIDDNYFYIDDNGIVQIGVFDTSDGYKYFAPANTVNDNIYGQAVEYSGLVRVGEDVYYF GETYTIETGWIYDMENESDKYYFNPETKKACKGINLIDDIKYYFDEKGIMRTGLISFENNNY YFNENGEMQFGYINIEDKMFYFGEDGVMQIGVFNTPDGFKYFAHQNTLDENFEGESINYTGW LDLDEKRYYFTDEYIAATGSVIIDGEEYYFDPDTAQLVISE SEQ ID NO: 36 - Sequence of polypeptide CDTA C34 construction

PGAYLSAIPGYAGEYEVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIPHHHHHH SEQ ID NO : 37 - Construction de CDTb C118. CDTb sans le peptide signal, sans le prodomaine, sans le domaine de liaison à la CDTa et sans le domaine de liaison aux récepteurs MAYPIVGVGMEKLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTESNTAGVSVNVGYQNGFTANVTTN YSHTTDNSTAVQDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTNLVLDGDT LSTIKAQENQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQFSSRLIPINYDQLKKLDAGKQIKLET TQVSGNFGTKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAKNLQDPEDKT PELTIGEAIEKAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDNTANKIKDSLKTLSDKKIYNVK LERGMNILIKTPGGHHHHHH - SEQ ID NO : 38 - Construction de CDTb C46. Séquence polypeptidique de la CDTb' (moins le peptide signal)PGAYLSAIPGYAGEYEVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIPHHHHHH SEQ ID NO: 37 - Construction of CDTb C118. CdtB without the signal peptide, without the prodomain, without the binding domain to the CDTA and without the binding domain receptor MAYPIVGVGMEKLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTESNTAGVSVNVGYQNGFTANVTTN YSHTTDNSTAVQDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTNLVLDGDT LSTIKAQENQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQFSSRLIPINYDQLKKLDAGKQIKLET TQVSGNFGTKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAKNLQDPEDKT PELTIGEAIEKAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDNTANKIKDSLKTLSDKKIYNVK LERGMNILIKTPGGHHHHHH - SEQ ID NO: 38 - Construction of cdtB C46. Polypeptide sequence of CDTb '(minus signal peptide)

MEIVNEDILPNNGLMGYYFTDEHFKDLKLMAPIKDGNLKFEEKKVDKLLDKDKSDVKSIRWT GRIIPSKDGEYTLSTDRDDVLMQVNTESTISNTLKVNMKKGKEYKVRIELQDKNLGSIDNLS SPNLYWELDGMKKIIPEENLFLRDYSNIEKDDPFIPNNNFFDPKLMSDWEDEDLDTDNDNIP DSYERNGYTIKDLIAVKWEDSFAEQGYKKYVSNYLESNTAGDPYTDYEKASGSFDKAIKTEA RDPLVAAYPIVGVGMEKLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTESNTAGVSVNVGYQNGFTA NVTTNYSHTTDNSTAVQDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTNLV LDGDTLSTIKAQENQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQFSSRLIPINYDQLKKLDAGKQ IKLETTQVSGNFGTKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAKNLQD PEDKTPELTIGEAIEKAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDNTANKIKDSLKTLSDKK IYNVKLERGMNILIKTPTYFTNFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQGSANKLNGETKIKIPMS ELKPYKRYVFSGYSKDPLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEI TLIGSGTTYLDNLSITELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYING MYFAPTQTNKEALDYIQKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFT GGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVDHHHHHH SEQ ID NO : 39 - Construction C44. Séquence polypeptidique de la CDTa avec la mutation E428Q.MEIVNEDILPNNGLMGYYFTDEHFKDLKLMAPIKDGNLKFEEKKVDKLLDKDKSDVKSIRWT GRIIPSKDGEYTLSTDRDDVLMQVNTESTISNTLKVNMKKGKEYKVRIELQDKNLGSIDNLS SPNLYWELDGMKKIIPEENLFLRDYSNIEKDDPFIPNNNFFDPKLMSDWEDEDLDTDNDNIP DSYERNGYTIKDLIAVKWEDSFAEQGYKKYVSNYLESNTAGDPYTDYEKASGSFDKAIKTEA RDPLVAAYPIVGVGMEKLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTESNTAGVSVNVGYQNGFTA NVTTNYSHTTDNSTAVQDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTNLV LDGDTLSTIKAQENQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQFSSRLIPINYDQLKKLDAGKQ IKLETTQVSGNFGTKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAKNLQD PEDKTPELTIGEAIEKAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDNTANKIKDSLKTLSDKK IYNVKLERGMNILIKTPTYFTNFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQGSANKLNGETKIKIPMS ELKPYKRYVFSGYSKDPLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEI TLIGSGTTYLDNLSITELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYING MYFAPTQTNKEALDYIQKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFT GGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVDHHHHHH SEQ ID NO: 39 - Construction C44. Polypeptide sequence of CDTa with the E428Q mutation.

PGAYLSAIPGYAGqYEVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIPHHHHHH SEQ ID NO : 40 - Construction C54. Séquence polypeptidique de la CDTa avec la mutation E430Q.PGAYLSAIPGYAGqYEVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIPHHHHHH SEQ ID NO: 40 - Construction C54. Polypeptide sequence of CDTa with the E430Q mutation.

PGAYLSAIPGYAGEYqVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIPHHHHHH SEQ ID NO : 41 - C68PGAYLSAIPGYAGEYqVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIPHHHHHH SEQ ID NO: 41 - C68

GLTLTSPEYDFNKLENIDAFKSKWEGQALSYPAFISTSIGSVNMSAFAKAKIVLRITIPKGSGLTLTSPEYDFNKLENIDAFKSKWEGQALSYPAFISTSIGSVNMSAFAKAKIVLRITIPKGS

PGAYLSAIPGYAGgYgVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIPHHHHHH SEQ ID NO : 42 - Séquence d'acides aminés de la CDTa sans le peptide signal, avec six mutations (R345A, Q350A, N385A, R402A, S388F, E428Q, aa 44 à 463) (C110)PGAYLSAIPGYAGgYgVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIPHHHHHH SEQ ID NO: 42 - Amino acid sequence of CDTa without the signal peptide, with six mutations (R345A, Q350A, N385A, R402A, S388F, E428Q, aa 44-463) (C110)

MVCNTTYKAPIERPEDFLKDKEKAKEWERKEAERIEQKLERSEKEALESYKKDSVEISKYSQ TRNYFYDYQIEANSREKEYKELRNAISKNKIDKPMYVYYFES PEKFAFNKVIRTENQNEISL EKFNEFKETIQNKLFKQDGFKDISLYEPGKGDEKPTPLLMHLKLPRNTGMLPYTNTNNVSTL IEQGYSIKIDKIVRIVIDGKHYIKAEASWSSLDFKDDVSKGDSWGKANYNDWSNKLTPNEL ADVNDYMRGGYTAINNYLISNGPVNNPNPELDSKITNIENALKREPIPTNLTVYARSGPAEF GLTLTSPEYDFNKLENIDAFKSKWEGQALSYPAFIFTSIGSVNMSAFAKAKIVLRITIPKGS PGAYLSAIPGYAGQYEVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIPHHHHHH SEQ ID NO : 43 - Séquence d'acides aminés de C164 (KO pour la formation des pores avec la mutation F455R sur la CdtB sans prodomaine)MVCNTTYKAPIERPEDFLKDKEKAKEWERKEAERIEQKLERSEKEALESYKKDSVEISKYSQ TRNYFYDYQIEANSREKEYKELRNAISKNKIDKPMYVYYFES PEKFAFNKVIRTENQNEISL EKFNEFKETIQNKLFKQDGFKDISLYEPGKGDEKPTPLLMHLKLPRNTGMLPYTNTNNVSTL IEQGYSIKIDKIVRIVIDGKHYIKAEASWSSLDFKDDVSKGDSWGKANYNDWSNKLTPNEL ADVNDYMRGGYTAINNYLISNGPVNNPNPELDSKITNIENALKREPIPTNLTVYARSGPAEF GLTLTSPEYDFNKLENIDAFKSKWEGQALSYPAFIFTSIGSVNMSAFAKAKIVLRITIPKGS PGAYLSAIPGYAGQYEVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIPHHHHHH SEQ ID NO: 43 - Amino acid sequence of C164 (KO for pore formation with the F455R mutation in the CdtB without prodomain)

MSDWEDEDLDTDNDNIPDSYERNGYTIKDLIAVKWEDSFAEQGYKKYVSNYLESNTAGDPYTMSDWEDEDLDTDNDNIPDSYERNGYTIKDLIAVKWEDSFAEQGYKKYVSNYLESNTAGDPYT

DYEKASGSFDKAIKTEARDPLVAAYPIVGVGMEKLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTESDYEKASGSFDKAIKTEARDPLVAAYPIVGVGMEKLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTES

NTAGVSVNVGYQNGFTANVTTNYSHTTDNSTAVQDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTAGVSVNVGYQNGFTANVTTNYSHTTDNSTAVQDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYY

NTGTAPMYKVTPTTNLVLDGDTLSTIKAQENQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQRSSRNTGTAPMYKVTPTTNLVLDGDTLSTIKAQENQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQRSSR

LÏPINYDQLKKLDAGKQIKLETTQVSGNFGTKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDLÏPINYDQLKKLDAGKQIKLETTQVSGNFGTKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILD

NTANKIKDSLKTLSDKKIYNVKLERGMNILIKTPTYFTNFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQNTANKIKDSLKTLSDKKIYNVKLERGMNILIKTPTYFTNFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQ

GSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGYSKDPLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTKGSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGYSKDPLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTK

FSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTYLDNLSITELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIYFSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTYLDNLSITELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIY

FADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEALDYIQKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLGFADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEALDYIQKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLG

DPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVD SEQ ID NO : 44 - Séquence d'acides aminés de C166 (KO pour la formation des pores avec les mutations E426A-D453A sur la CdtB sans le prodomaine)DPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVD SEQ ID NO: 44 - Amino acid sequence of C166 (KO for pore formation with E426A-D453A mutations on CdtB without the prodomain)

MSDWEDEDLDTDNDNIPDSYERNGYTIKDLIAVKWEDSFAEQGYKKYVSNYLESNTAGDPYT DYEKASGSFDKAIKTEARDPLVAAYPIVGVGMEKLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTES NTAGVSVNVGYQNGFTANVTTNYSHTTDNSTAVQDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYY NTGTAPMYKVTPTTNLVLDGDTLSTIKAQANQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMAQFSSR LIPINYDQLKKLDAGKQIKLETTQVSGNFGTKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILD TENESYERRVTAKNLQDPEDKTPELTIGEAIEKAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDD NTANKIKDSLKTLSDKKIYNVKLERGMNILIKTPTYFTNFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQ GSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGYSKDPLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTK FSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTYLDNLSITELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIY FADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEALDYIQKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLG DPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVD SEQ ID NO : 45 - Séquence d'acide nucléique de C164 (KO pour la formation des pores avec la mutation F455R sur la CdtB sans prodomaine)MSDWEDEDLDTDNDNIPDSYERNGYTIKDLIAVKWEDSFAEQGYKKYVSNYLESNTAGDPYT DYEKASGSFDKAIKTEARDPLVAAYPIVGVGMEKLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTES NTAGVSVNVGYQNGFTANVTTNYSHTTDNSTAVQDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYY NTGTAPMYKVTPTTNLVLDGDTLSTIKAQANQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMAQFSSR LIPINYDQLKKLDAGKQIKLETTQVSGNFGTKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILD TENESYERRVTAKNLQDPEDKTPELTIGEAIEKAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDD NTANKIKDSLKTLSDKKIYNVKLERGMNILIKTPTYFTNFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQ GSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGYSKDPLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTK FSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTYLDNLSITELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIY FADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEALDYIQKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLG DPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVD SEQ ID NO: 45 - Nucleic acid sequence of C164 (KO for pore formation with the F455R mutation in the CdtB without prodomain)

ATGAGCGATTGGGAAGATGAAGATCTGGATACCGATAATGATAATATTCCGGATAGCTATGAATGAGCGATTGGGAAGATGAAGATCTGGATACCGATAATGATAATATTCCGGATAGCTATGA

ACGCAATGGCTATACCATTAAAGATCTGATTGCCGTGAAATGGGAAGATAGCTTTGCAGAACACGCAATGGCTATACCATTAAAGATCTGATTGCCGTGAAATGGGAAGATAGCTTTGCAGAAC

AGGGCTATAAGAAATATGTGAGCAATTATCTGGAAAGCAATACCGCAGGCGATCCGTATACCAGGGCTATAAGAAATATGTGAGCAATTATCTGGAAAGCAATACCGCAGGCGATCCGTATACC

GATTATGAAAAAGCAAGCGGCAGCTTTGATAAAGCCATTAAAACCGAAGCACGTGATCCGCTGATTATGAAAAAGCAAGCGGCAGCTTTGATAAAGCCATTAAAACCGAAGCACGTGATCCGCT

GGTTGCAGCATATCCGATTGTTGGTGTTGGTATGGAAAAACTGATTATTAGCACCAATGAACGGTTGCAGCATATCCGATTGTTGGTGTTGGTATGGAAAAACTGATTATTAGCACCAATGAAC

ATGCAAGCACCGATCAGGGTAAAACCGTTAGCCGTGCAACCACCAATAGCAAAACCGAAAGCATGCAAGCACCGATCAGGGTAAAACCGTTAGCCGTGCAACCACCAATAGCAAAACCGAAAGC

AATACAGCCGGTGTTAGCGTTAATGTTGGTTATCAGAATGGTTTTACCGCCAATGTGACCACAATACAGCCGGTGTTAGCGTTAATGTTGGTTATCAGAATGGTTTTACCGCCAATGTGACCAC

CAATTATAGCCATACCACCGATAATAGCACCGCAGTTCAGGATAGCAATGGTGAAAGCTGGACAATTATAGCCATACCACCGATAATAGCACCGCAGTTCAGGATAGCAATGGTGAAAGCTGGA

ATACCGGTCTGAGCATTAACAAAGGTGAAAGCGCATATATCAATGCCAATGTGCGCTATTATATACCGGTCTGAGCATTAACAAAGGTGAAAGCGCATATATCAATGCCAATGTGCGCTATTAT

AACACCGGCACCGCACCGATGTATAAAGTTACCCCGACCACCAATCTGGTTCTGGATGGTGAAACACCGGCACCGCACCGATGTATAAAGTTACCCCGACCACCAATCTGGTTCTGGATGGTGA

TACCCTGAGTACCATTAAAGCACAAGAAAATCAGATTGGCAATAATCTGAGTCCGGGTGATATACCCTGAGTACCATTAAAGCACAAGAAAATCAGATTGGCAATAATCTGAGTCCGGGTGATA

CCTATCCGAAAAAAGGTCTGAGTCCGCTGGCACTGAATACCATGGATCAGCGCAGCAGCCGTCCTATCCGAAAAAAGGTCTGAGTCCGCTGGCACTGAATACCATGGATCAGCGCAGCAGCCGT

CTGATTCCGATTAACTATGATCAGCTGAAAAAACTGGATGCCGGTAAACAAATCAAACTGGACTGATTCCGATTAACTATGATCAGCTGAAAAAACTGGATGCCGGTAAACAAATCAAACTGGA

AACCACCCAGGTTAGCGGTAATTTTGGCACCAAAAATTCAAGCGGTCAGATTGTTACCGAAGAACCACCCAGGTTAGCGGTAATTTTGGCACCAAAAATTCAAGCGGTCAGATTGTTACCGAAG

GTAATAGCTGGTCAGATTATATCAGCCAGATTGATAGCATTAGCGCCAGCATTATTCTGGATGTAATAGCTGGTCAGATTATATCAGCCAGATTGATAGCATTAGCGCCAGCATTATTCTGGAT

ACAGAAAATGAAAGCTATGAACGTCGTGTGACCGCAAAAAATCTGCAGGACCCGGAAGATAAACAGAAAATGAAAGCTATGAACGTCGTGTGACCGCAAAAAATCTGCAGGACCCGGAAGATAA

AACACCGGAACTGACCATTGGTGAAGCAATTGAAAAAGCATTTGGTGCCACCAAAAAAGATG GCCTGCTGTATTTTAACGATATTCCGATTGATGAAAGCTGCGTGGAACTGATTTTTGATGAT 'AACACCGGAACTGACCATTGGTGAAGCAATTGAAAAAGCATTTGGTGCCACCAAAAAAGATG GCCTGCTGTATTTTAACGATATTCCGATTGATGAAAGCTGCGTGGAACTGATTTTTGATGAT '

AATACCGCCAATAAAATCAAAGATAGCCTGAAAACCCTGAGCGACAAAAAAATCTATAATGTAATACCGCCAATAAAATCAAAGATAGCCTGAAAACCCTGAGCGACAAAAAAATCTATAATGT

GAAATTAGAACGCGGTATGAATATTCTAATTAAAACCCCGACCTATTTTACCAATTTTGATGGAAATTAGAACGCGGTATGAATATTCTAATTAAAACCCCGACCTATTTTACCAATTTTGATG

ATTATAACAATTATCCGAGCACTTGGAGCAATGTGAATACCACCAATCAGGATGGTCTGCAGATTATAACAATTATCCGAGCACTTGGAGCAATGTGAATACCACCAATCAGGATGGTCTGCAG

GGTAGCGCAAATAAACTGAATGGTGAAACCAAAATCAAAATTCCGATGAGCGAACTGAAACCGGTAGCGCAAATAAACTGAATGGTGAAACCAAAATCAAAATTCCGATGAGCGAACTGAAACC

GTATaAACGTTATGTGTTTAGCGGCTATAGCAAAGATCCGCTGACCAGCAATAGCATTATTGGTATaAACGTTATGTGTTTAGCGGCTATAGCAAAGATCCGCTGACCAGCAATAGCATTATTG

TGAAAATCAAAGCCAAAGAAGAAAAAACCGATTATCTGGTTCCGGAACAGGGTTATACCAAATGAAAATCAAAGCCAAAGAAGAAAAAACCGATTATCTGGTTCCGGAACAGGGTTATACCAAA

TTTAGCTATGAATTTGAAACCACCGAAAAAGATAGCAGTAATATTGAAATTACCCTGATTGGTTTAGCTATGAATTTGAAACCACCGAAAAAGATAGCAGTAATATTGAAATTACCCTGATTGG

TAGCGGCACCACCTATCTGGATAATCTGAGTATTACCGAACTGAATAGCACACCGGAAATTCTAGCGGCACCACCTATCTGGATAATCTGAGTATTACCGAACTGAATAGCACACCGGAAATTC

TGGATGAACCGGAAGTGAAAATTCCGACCGATCAAGAAATTATGGATGCCCATAAAATCTATTGGATGAACCGGAAGTGAAAATTCCGACCGATCAAGAAATTATGGATGCCCATAAAATCTAT

TTTGCCGATCTGAACTTTAATCCGAGCACCGGCAATACCTATATTAACGGCATGTATTTTGCTTTGCCGATCTGAACTTTAATCCGAGCACCGGCAATACCTATATTAACGGCATGTATTTTGC

ACCGACCCAGACCAATAAAGAAGCCCTGGATTATATTCAGAAATATCGTGTTGAAGCCACCC TGCAGTATAGCGGTTTTAAAGATATTGGCACCAAAGATAAAGAAATGCGTAATTATCTGGGC .ACCGACCCAGACCAATAAAGAAGCCCTGGATTATATTCAGAAATATCGTGTTGAAGCCACCC TGCAGTATAGCGGTTTTAAAGATATTGGCACCAAAGATAAAGAAATGCGTAATTATCTGGGC.

GATCCGAATCAGCCGAAAACCAATTATGTTAATCTGCGCAGCTATTTTACCGGTGGCGAAAAGATCCGAATCAGCCGAAAACCAATTATGTTAATCTGCGCAGCTATTTTACCGGTGGCGAAAA

CATTATGACCTACAAAAAACTGCGCATTTATGCCATTACACCGGATGATCGTGAACTGCTGGCATTATGACCTACAAAAAACTGCGCATTTATGCCATTACACCGGATGATCGTGAACTGCTGG

TTCTGAGCGTTGATCA SEQ ID NO : 46 - Séquence d'acide nucléique de C166 (KO pour la formation des pores avec les mutations E426A-D453A sur la CdtB sans prodomaine)TTCTGAGCGTTGATCA SEQ ID NO: 46 - C166 nucleic acid sequence (KO for pore formation with E426A-D453A mutations on CdtB without prodomain)

TACCCTGAGTACCATTAAAGCACAAGCRAATCAGATTGGCAATAATCTGAGTCCGGGTGATATACCCTGAGTACCATTAAAGCACAAGCRAATCAGATTGGCAATAATCTGAGTCCGGGTGATA

CCTATCCGAAAAAAGGTCTGAGTCCGCTGGCACTGAATACCATGGCGCAGTTTAGCAGCCGTCCTATCCGAAAAAAGGTCTGAGTCCGCTGGCACTGAATACCATGGCGCAGTTTAGCAGCCGT

AACACCGGAACTGACCATTGGTGAAGCAATTGAAAAAGCATTTGGTGCCACCAAAAAAGATGAACACCGGAACTGACCATTGGTGAAGCAATTGAAAAAGCATTTGGTGCCACCAAAAAAGATG

GCCTGCTGTATTTTAACGATATTCCGATTGATGAAAGCTGCGTGGAACTGATTTTTGATGATGCCTGCTGTATTTTAACGATATTCCGATTGATGAAAGCTGCGTGGAACTGATTTTTGATGAT

ACCGACCCAGACCAATAAAGAAGCCCTGGATTATATTCAGAAATATCGTGTTGAAGCCACCCACCGACCCAGACCAATAAAGAAGCCCTGGATTATATTCAGAAATATCGTGTTGAAGCCACCC

TGCAGTATAGCGGTTTTAAAGATATTGGCACCAAAGATAAAGAAATGCGTAATTATCTGGGCTGCAGTATAGCGGTTTTAAAGATATTGGCACCAAAGATAAAGAAATGCGTAATTATCTGGGC

TTCTGAGCGTTGATCAC SEQ ID 47 - Construction CDTb C37. Séquence polypeptidique de la CDTb' (moins le peptide signal) ligaturée à la protéine glutathion-S-transférase (GST soulignée), sans le marqueur his.TTCTGAGCGTTGATCAC SEQ ID 47 - CDTb C37 construction. Polypeptide sequence of CDTb '(minus signal peptide) ligated to glutathione-S-transferase protein (GST underlined), without the his tag.

VKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLS

PQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLEVLFQGPLGSHMEIVNEDILPNNGLMG YYFTDEHFKDLKLMAPIKDGNLKFEEKKVDKLLDKDKSDVKSIRWTGRIIPSKDGEYTLSTD RDDVLMQVNTESTISNTLKVNMKKGKEYKVRIELQDKNLGSIDNLSSPNLYWELDGMKKIIP EENLFLRDYSNIEKDDPFIPNNNFFDPKLMSDWEDEDLDTDNDNIPDSYERNGYTIKDLIAV KWEDSFAEQGYKKYVSNYLESNTAGDPYTDYEKASGSFDKAIKTEARDPLVAAYPIVGVGME KLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTESNTAGVSVNVGYQNGFTANVTTNYSHTTDNSTAV QDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTNLVLDGDTLSTIKAQENQI GNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQFSSRLIPINYDQLKKLDAGKQIKLETTQVSGNFGTKN SSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAKNLQDPEDKTPELTIGEAIEK AFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDNTANKIKDSLKTLSDKKIYNVKLERGMNILIKT PTYFTNFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQGSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGYSKD PLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTYLDNLSIT ELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEALDYI QKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRIYAI TPDDRELLVLSVD SEQ ID NO : 48 - Séquence d'acides aminés de la CDTb avec le prodomaine éliminé (CDTb", aa 212 à 876) (C55) , sans le marqueur hisPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLEVLFQGPLGSHMEIVNEDILPNNGLMG YYFTDEHFKDLKLMAPIKDGNLKFEEKKVDKLLDKDKSDVKSIRWTGRIIPSKDGEYTLSTD RDDVLMQVNTESTISNTLKVNMKKGKEYKVRIELQDKNLGSIDNLSSPNLYWELDGMKKIIP EENLFLRDYSNIEKDDPFIPNNNFFDPKLMSDWEDEDLDTDNDNIPDSYERNGYTIKDLIAV KWEDSFAEQGYKKYVSNYLESNTAGDPYTDYEKASGSFDKAIKTEARDPLVAAYPIVGVGME KLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTESNTAGVSVNVGYQNGFTANVTTNYSHTTDNSTAV QDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTNLVLDGDTLSTIKAQENQI GNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQFSSRLIPINYDQLKKLDAGKQIKLETTQVSGNFGTKN SSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAKNLQDPEDKTPELTIGEAIEK AFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDNTANKIKDSLKTLSDKKIYNVKLERGMNILIKT PTYFTNFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQGSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGYSKD PLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTYLDNLSIT ELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEALDYI QKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRIYAI TPDDRELLVLSVD SEQ ID NO: 48 - Amino acid sequence of the cdtB removed with the prodomain (cdtB "aa 212-87 6) (C55), without the marker his

MSDWEDEDLDTDNDNIPDSYERNGYTIKDLIAVKWEDSFAEQGYKKYVSNYLESNTAGDPYT DYEKASGSFDKAIKTEARDPLVAAYPIVGVGMEKLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTES NTAGVSVNVGYQNGFTANVTTNYSHTTDNSTAVQDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYY NTGTAPMYKVTPTTNLVLDGDTLSTIKAQENQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQFSSR LIPINYDQLKKLDAGKQIKLETTQVSGNFGTKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILD TENESYERRVTAKNLQDPEDKTPELTIGEAIEKAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDD NTANKIKDSLKTLSDKKIYNVKLERGMNILIKTPTYFTNFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQ GSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGYSKDPLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTK FSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTYLDNLSITELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIY FADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEALDYIQKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLG DPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVD SEQ ID NO : 49 - C116 sans le marqueur hisMSDWEDEDLDTDNDNIPDSYERNGYTIKDLIAVKWEDSFAEQGYKKYVSNYLESNTAGDPYT DYEKASGSFDKAIKTEARDPLVAAYPIVGVGMEKLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTES NTAGVSVNVGYQNGFTANVTTNYSHTTDNSTAVQDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYY NTGTAPMYKVTPTTNLVLDGDTLSTIKAQENQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQFSSR LIPINYDQLKKLDAGKQIKLETTQVSGNFGTKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILD TENESYERRVTAKNLQDPEDKTPELTIGEAIEKAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDD NTANKIKDSLKTLSDKKIYNVKLERGMNILIKTPTYFTNFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQ GSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGYSKDPLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTK FSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTYLDNLSITELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIY FADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEALDYIQKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLG DPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVD SEQ ID NO: 49 - C116 without his tag

MSDWEDEDLDTDNDNIPDSYERNGYTIKDLIAVKWEDSFAEQGYKKYVSNYLESNTAGDPYT DYEKASGSFDKAIKTEARDPLVAAYPIVGVGMEKLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTES NTAGVSVNVGYQNGFTANVTTNYSHTTDNSTAVQDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYY NTGTAPMYKVTPTTNLVLDGDTLSTIKAQENQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQFSSR LIPINYDQLKKLDAGKQIKLETTQVSGNFGTKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILD TENESYERRVTAKNLQDPEDKTPELTIGEAIEKAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDD NTANKIKDS LKTLS DKKIYNVKLERGMNILIKT PGG SEQ ID NO : 50 - C117 sans le marqueur hisMSDWEDEDLDTDNDNIPDSYERNGYTIKDLIAVKWEDSFAEQGYKKYVSNYLESNTAGDPYT DYEKASGSFDKAIKTEARDPLVAAYPIVGVGMEKLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTES NTAGVSVNVGYQNGFTANVTTNYSHTTDNSTAVQDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYY NTGTAPMYKVTPTTNLVLDGDTLSTIKAQENQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQFSSR LIPINYDQLKKLDAGKQIKLETTQVSGNFGTKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILD TENESYERRVTAKNLQDPEDKTPELTIGEAIEKAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDD NTANKIKDS LKTLS DKKIYNVKLERGMNILIKT PGG SEQ ID NO: 50 - C117 without his tag

MAYPIVGVGMEKLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTESNTAGVSVNVGYQNGFTANVTTN YSHTTDNSTAVQDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTNLVLDGDT LSTIKAQENQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQFSSRLIPINYDQLKKLDAGKQIKLET TQVSGNFGTKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAKNLQDPEDKT PELTIGEAIEKAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDNTANKIKDSLKTLSDKKIYNVK LERGMNILIKTPTYFTNFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQGSANKLNGETKIKIPMSELKPY KRYVFSGYSKDPLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEITLIGS GTTYLDNLSITELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYINGMYFAP TQTNKEALDYIQKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFTGGENI MTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVD SEQ ID NO : 51 - Séquence de la CDTb C123 avec la mutation F455R, sans le marqueur his.MAYPIVGVGMEKLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTESNTAGVSVNVGYQNGFTANVTTN YSHTTDNSTAVQDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTNLVLDGDT LSTIKAQENQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQFSSRLIPINYDQLKKLDAGKQIKLET TQVSGNFGTKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAKNLQDPEDKT PELTIGEAIEKAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDNTANKIKDSLKTLSDKKIYNVK LERGMNILIKTPTYFTNFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQGSANKLNGETKIKIPMSELKPY KRYVFSGYSKDPLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEITLIGS GTTYLDNLSITELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYINGMYFAP TQTNKEALDYIQKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFTGGENI MTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVD SEQ ID NO: 51 - Sequence of the cdtB C123 with the F455R mutation without the His tag.

MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGD VKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFl·S KLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDWLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAI PQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLEVLFQGPLGSHMEIVNEDILPNNGLMG YYFTDEHFKDLKLMAPIKDGNLKFEEKKVDKLLDKDKSDVKSIRWTGRIIPSKDGEYTLSTD RDDVLMQVNTESTISNTLKVNMKKGKEYKVRIELQDKNLGSIDNLSSPNLYWELDGMKKIIP EENLFLRDYSNIEKDDPFIPNNNFFDPKLMSDWEDEDLDTDNDNIPDSYERNGYTIKDLIAV KWEDSFAEQGYKKYVSNYLESNTAGDPYTDYEKASGSFDKAIKTEARDPLVAAYPIVGVGME KLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTESNTAGVSVNVGYQNGFTANVTTNYSHTTDNSTAV QDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTNLVLDGDTLSTIKAQENQI GNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQRSSRLIPINYDQLKKLDAGKQIKLETTQVSGNFGTKNMSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGD VKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFl · S KLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDWLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAI PQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLEVLFQGPLGSHMEIVNEDILPNNGLMG YYFTDEHFKDLKLMAPIKDGNLKFEEKKVDKLLDKDKSDVKSIRWTGRIIPSKDGEYTLSTD RDDVLMQVNTESTISNTLKVNMKKGKEYKVRIELQDKNLGSIDNLSSPNLYWELDGMKKIIP EENLFLRDYSNIEKDDPFIPNNNFFDPKLMSDWEDEDLDTDNDNIPDSYERNGYTIKDLIAV KWEDSFAEQGYKKYVSNYLESNTAGDPYTDYEKASGSFDKAIKTEARDPLVAAYPIVGVGME KLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTESNTAGVSVNVGYQNGFTANVTTNYSHTTDNSTAV QDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTNLVLDGDTLSTIKAQENQI GNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQRSSRLIPINYDQLKKLDAGKQIKLETTQVSGNFGTKN

SSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAKNLQDPEDKTPELTIGEAIEKSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAKNLQDPEDKTPELTIGEAIEK

AFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDNTANKIKDSLKTLSDKKIYNVKLERGMNILIKTAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDNTANKIKDSLKTLSDKKIYNVKLERGMNILIKT

PTYFTNFPPYNNYPSTWSNVNTTNQPGLQGSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGYSKPPTYFTNFPPYNNYPSTWSNVNTTNQPGLQGSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGYSKP

PLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTYLDNLSITPLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTYLDNLSIT

ELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEALDYIELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEALDYI

TPDDRELLVLSVD SEQ ID NO : 52 - Séquence de la CDTb C126 dans laquelle les résidus 426 (Glutamate) et 453 (Aspartate) ont été tous les deux mutés en alanine, sans le marqueur his.TPDDRELLVLSVD SEQ ID NO: 52 - C126 CDTb sequence in which residues 426 (Glutamate) and 453 (Aspartate) were both mutated to alanine without the his tag.

MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGD νΚΣ,ΤαΞΜΑΙΙΕΥΙΑΡΚΗΝΜΕΰΰΟΡΚΕΡΑΕΙΕΜΕΕΰΑνΕΡΙΡΥΰνΞΕΙΑΥΕΙ^ΕΤΕΚνΡΓΙΕ KLPEMLKMFEPRLCHKTYLNGPHVTHPPFMLYPALPWLYMPPMCLPAFPKLVCFKKRIEAI PQIPKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGPHPPKSPLEVLFQGPLGSHMEIVNEPILPNNGLMG YYFTPEHFKPLKLMAPIKPGNLKFEEKKVPKLLPKPKSPVKSIRWTGRIIPSKPGEYTLSTP RPPVLMQVNTESTISNTLKVNMKKGKEYKVRIELQPKNLGSIPNLSSPNLYWELPGMKKIIP EENLFLRPYSNIEKPPPFIPNNNFFPPKLMSPWEPEPLPTPNPNIPPSYERNGYTIKPLIAV KWEPSFAEQGYKKYVSNYLESNTAGPPYTPYEKASGSFPKAIKTEARPPLVAAYPIVGVGME KLIISTNEHASTPQGKTVSRATTNSKTESNTAGVSVNVGYQNGFTANVTTNYSHTTPNSTAV QPSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTNLVLPGPTLSTIKAQANQI GNNLSPGPTYPKKGLSPLALNTMAQFSSRLIPINYPQLKKLPAGKQIKLETTQVSGNFGTKN SSGQIVTEGNSWSPYISQIPSISASIILPTENESYERRVTAKNLQPPEPKTPELTIGEAIEK AFGATKKPGLLYFNPIPIPESCVELIFPPNTANKIKPSLKTLSPKKIYNVKLERGMNILIKT PTYFTNFPPYNNYPSTWSNVNTTNQPGLQGSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGYSKP PLTSNSIIVKIKAKEEKTPYLVPEQGYTKFSYEFETTEKPSSNIEITLIGSGTTYLPNLSIT ELNSTPEILPEPEVKIPTPQEIMPAHKIYFAPLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEALPYI QKYRVEATLQYSGFKPIGTKPKEMRNYLGPPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRIYAI TPPPRELLVLSVP SEQ ID NO : 53 - C127 sans le marqueur hisMSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGD νΚΣ, ΤαΞΜΑΙΙΕΥΙΑΡΚΗΝΜΕΰΰΟΡΚΕΡΑΕΙΕΜΕΕΰΑνΕΡΙΡΥΰνΞΕΙΑΥΕΙ ^ ΕΤΕΚνΡΓΙΕ KLPEMLKMFEPRLCHKTYLNGPHVTHPPFMLYPALPWLYMPPMCLPAFPKLVCFKKRIEAI PQIPKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGPHPPKSPLEVLFQGPLGSHMEIVNEPILPNNGLMG YYFTPEHFKPLKLMAPIKPGNLKFEEKKVPKLLPKPKSPVKSIRWTGRIIPSKPGEYTLSTP RPPVLMQVNTESTISNTLKVNMKKGKEYKVRIELQPKNLGSIPNLSSPNLYWELPGMKKIIP EENLFLRPYSNIEKPPPFIPNNNFFPPKLMSPWEPEPLPTPNPNIPPSYERNGYTIKPLIAV KWEPSFAEQGYKKYVSNYLESNTAGPPYTPYEKASGSFPKAIKTEARPPLVAAYPIVGVGME KLIISTNEHASTPQGKTVSRATTNSKTESNTAGVSVNVGYQNGFTANVTTNYSHTTPNSTAV QPSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTNLVLPGPTLSTIKAQANQI GNNLSPGPTYPKKGLSPLALNTMAQFSSRLIPINYPQLKKLPAGKQIKLETTQVSGNFGTKN SSGQIVTEGNSWSPYISQIPSISASIILPTENESYERRVTAKNLQPPEPKTPELTIGEAIEK AFGATKKPGLLYFNPIPIPESCVELIFPPNTANKIKPSLKTLSPKKIYNVKLERGMNILIKT PTYFTNFPPYNNYPSTWSNVNTTNQPGLQGSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGYSKP PLTSNSIIVKIKAKEEKTPYLVPEQGYTKFSYEFETTEKPSSNIEITLIGSGTTYLPNL SIT ELNSTPEILPEPEVKIPTPQEIMPAHKIYFAPLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEALPYI QKYRVEATLQYSGFKPIGTKPKEMRNYLGPPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRIYAI TPPPRELLVLSVP SEQ ID NO: 53 - C127 without the his marker

MEIVNEPILPNNGLMGYYFTPEHFKPLKLMAPIKPGNLKFEEKKVPKLLPKPKSPVKSIRWTMEIVNEPILPNNGLMGYYFTPEHFKPLKLMAPIKPGNLKFEEKKVPKLLPKPKSPVKSIRWT

GRIIPSKPGEYTLSTPRPPVLMQVNTESTISNTLKVNMKKGKEYKVRIELQPKNLGSIPNLSGRIIPSKPGEYTLSTPRPPVLMQVNTESTISNTLKVNMKKGKEYKVRIELQPKNLGSIPNLS

VTTNYSHTTDNSTAVQDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTNLVLVTTNYSHTTDNSTAVQDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTNLVL

DGDTLSTIKAQENQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQFSSRLIPINYDQLKKLDAGKQIDGDTLSTIKAQENQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQFSSRLIPINYDQLKKLDAGKQI

KLETTQVSGNFGTKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAgggPELKLETTQVSGNFGTKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAgggPEL

TIGEAIEKAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDNTANKIKDSLKTLSDKKIYNVKLERTIGEAIEKAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDNTANKIKDSLKTLSDKKIYNVKLER

GMNILIKTPTYFTNFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQGSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYGMNILIKTPTYFTNFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQGSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRY

VFSGYSKDPLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTVFSGYSKDPLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTT

YLDNLSITELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTYLDNLSITELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQT

NKEALDYIQKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYNKEALDYIQKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTY

KKLRIYAITPDDRELLVLSVD SEQ ID NO : 54 - C128 sans le marqueur hisKKLRIYAITPDDRELLVLSVD SEQ ID NO: 54 - C128 without the his marker

GGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVD SEQ ID NO : 55 - C139 sans le marqueur hisGGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVD SEQ ID NO: 55 - C139 without the his marker

YFTGGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVDGG SEQ ID NO : 56 - C145 sans le marqueur hisYFTGGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVDGG SEQ ID NO: 56 - C145 without the his marker

PGAYLSAIPGYAGQYEVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIPGGGGGGAYPIVGVPGAYLSAIPGYAGQYEVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIPGGGGGGAYPIVGV

GMEKLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTESNTAGVSVNVGYQNGFTANVTTNYSHTTDNSGMEKLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTESNTAGVSVNVGYQNGFTANVTTNYSHTTDNS

TAVQDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTNLVLDGDTLSTIKAQETAVQDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTNLVLDGDTLSTIKAQE

NQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQFSSRLIPINYDQLKKLDAGKQIKLETTQVSGNFGNQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQFSSRLIPINYDQLKKLDAGKQIKLETTQVSGNFG

TKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAKNLQDPEDKTPELTIGEATKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAKNLQDPEDKTPELTIGEA

IEKAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDNTANKIKDSLKTLSDKKIYNVKLERGMNILIEKAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDNTANKIKDSLKTLSDKKIYNVKLERGMNIL

IKTPTYFTNFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQGSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGYIKTPTYFTNFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQGSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGY

SKDPLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTYLDNLSKDPLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTYLDNL

SITELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEALSITELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEAL

DYIQKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRIDYIQKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRI

YAITPDDRELLVLSVDGG SEQ ID NO : 57 - C155 sans le marqueur hisYAITPDDRELLVLSVDGG SEQ ID NO: 57 - C155 without the his marker

MVYNTTYKAPIERPEDFLKDKEKAKEWERKEAERIEQKLERSEKEALESYKKDSVEISKYSQ TRNYFYDYQIEANSREKEYKELRNAISKNKIDKPMYVYYFESPEKFAFNKVIRTENQNEISL EKFNEFKETIQNKLFKQDGFKDISLYEPGKGDEKPTPLLMHLKLPRNTGMLPYTNTNNVSTL IEQGYSIKIDKIVRIVIDGKHYIKAEASWSSLDFKDDVSKGDSWGKANYNDWSNKLTPNEL ADVNDYMRGGYTAINNYLISNGPVNNPNPELDSKITNIENALKREPIPTNLTVYRRSGPQEF GLTLTSPEYDFNKLENIDAFKSKWEGQALSYPNFISTSIGSVNMSAFAKRKIVLRITIPKGS PGAYLSAIPGYAGQYEVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIPTNFDDYNNYPSTW SNVNTTNQDGLQGSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGYSKDPLTSNSIIVKIKAKEEK TDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTYLDNLSITELNSTPEILDEPEVKIP TDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEALDYIQKYRVEATLQYSGFKDI GTKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVDGG SEQ ID NO : 58 - C156 sans le marqueur hisMVYNTTYKAPIERPEDFLKDKEKAKEWERKEAERIEQKLERSEKEALESYKKDSVEISKYSQ TRNYFYDYQIEANSREKEYKELRNAISKNKIDKPMYVYYFESPEKFAFNKVIRTENQNEISL EKFNEFKETIQNKLFKQDGFKDISLYEPGKGDEKPTPLLMHLKLPRNTGMLPYTNTNNVSTL IEQGYSIKIDKIVRIVIDGKHYIKAEASWSSLDFKDDVSKGDSWGKANYNDWSNKLTPNEL ADVNDYMRGGYTAINNYLISNGPVNNPNPELDSKITNIENALKREPIPTNLTVYRRSGPQEF GLTLTSPEYDFNKLENIDAFKSKWEGQALSYPNFISTSIGSVNMSAFAKRKIVLRITIPKGS PGAYLSAIPGYAGQYEVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIPTNFDDYNNYPSTW SNVNTTNQDGLQGSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGYSKDPLTSNSIIVKIKAKEEK TDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTYLDNLSITELNSTPEILDEPEVKIP TDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEALDYIQKYRVEATLQYSGFKDI GTKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVDGG SEQ ID NO: 58 - C156 without his tag

MVYNTTYKAPIERPEDFLKDKEKAKEWERKEAERIEQKLERSEKEALESYKKDSVEISKYSQ TRNYFYDYQIEANSREKEYKELRNAISKNKIDKPMYVYYFESPEKFAFNKVIRTENQNEISL EKFNEFKETIQNKLFKQDGFKDISLYEPGKGDEKPTPLLMHLKLPRNTGMLPYTNTNNVSTL IEQGYSIKIDKIVRIVIDGKHYIKAEASWSSLDFKDDVSKGDSWGKANYNDWSNKLTPNEL ADVNDYMRGGYTAINNYLISNGPVNNPNPELDSKITNIENALKREPIPTNLTVYRRSGPQEF GLTLTSPEYDFNKLENIDAFKSKWEGQALSYPNFISTSIGSVNMSAFAKRKIVLRITIPKGS PGAYLSAIPGYAGQYEVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIPGGGGGGNTTNQDG LQGSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGYSKDPLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGY TKFSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTYLDNLSITELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHK IYFADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEALDYIQKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNY LGDPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVDGG SEQ ID NO : 59 - C49 sans le marqueur hisMVYNTTYKAPIERPEDFLKDKEKAKEWERKEAERIEQKLERSEKEALESYKKDSVEISKYSQ TRNYFYDYQIEANSREKEYKELRNAISKNKIDKPMYVYYFESPEKFAFNKVIRTENQNEISL EKFNEFKETIQNKLFKQDGFKDISLYEPGKGDEKPTPLLMHLKLPRNTGMLPYTNTNNVSTL IEQGYSIKIDKIVRIVIDGKHYIKAEASWSSLDFKDDVSKGDSWGKANYNDWSNKLTPNEL ADVNDYMRGGYTAINNYLISNGPVNNPNPELDSKITNIENALKREPIPTNLTVYRRSGPQEF GLTLTSPEYDFNKLENIDAFKSKWEGQALSYPNFISTSIGSVNMSAFAKRKIVLRITIPKGS PGAYLSAIPGYAGQYEVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIPGGGGGGNTTNQDG LQGSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGYSKDPLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGY TKFSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTYLDNLSITELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHK IYFADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEALDYIQKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNY LGDPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVDGG SEQ ID NO: 59 - C49 without his tag

IEQGYSIKIDKIVRIVIDGKHYIKAEASWSSLDFKDDVS SEQ ID NO : 60 - C50 sans le marqueur hisIEQGYSIKIDKIVRIVIDGKHYIKAEASWSSLDFKDDVS SEQ ID NO: 60 - C50 without the his marker

IEQGYSIKIDKIVRIVIDGKHYIKAEASWSS SEQ ID NO : 61 - Séquence polypeptidique du domaine N-terminal de la CDTa (résidu 44 au résidu 240) sans le marqueur his.IEQGYSIKIDKIVRIVIDGKHYIKAEASWSS SEQ ID NO: 61 - Polypeptide sequence of the N-terminal domain of CDTa (residue 44 to residue 240) without the his tag.

IEQGYSIKIDKI SEQ ID NO : 62 - C67 sans le marqueur hisIEQGYSIKIDKI SEQ ID NO: 62 - C67 without the marker his

PGAYLSAIPGYAG3Y3VLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIP SEQ ID NO : 63 - C69 sans le marqueur hisPGAYLSAIPGYAG3Y3VLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIP SEQ ID NO: 63 - C69 without the his marker

MVCNTTYKAPIERPEDFLKDKEKAKEWERKEAERIEQKLERSEKEALESYKKDSVEISKYSQ TRNYFYDYQIEANSREKEYKELRNAISKNKIDKPMYVYYFESPEKFAFNKVIRTENQNEISL EKFNEFKETIQNKLFKQDGFKDISLYEPGKGDEKPTPLLMHLKLPRNTGMLPYTNTNNVSTL IEQGYSIKIDKIVRIVIDGKHYIKAEASWS SLDFKDDVSKGDSWGKANYNDWSNKLTPNEL ADVNDYMRGGYTAINNYLISNGPVNNPNPELDSKITNIENALKREPIPTNLTVYARSGPAEF GLTLTSPEYDFNKLENIDAFKSKWEGQALSYPAFIFTSIGSVNMSAFAKAKIVLRITIPKGS PGAYLSAIPGYAGQYQVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIP SEQ ID NO : 64 - C107 sans le marqueur hisMVCNTTYKAPIERPEDFLKDKEKAKEWERKEAERIEQKLERSEKEALESYKKDSVEISKYSQ TRNYFYDYQIEANSREKEYKELRNAISKNKIDKPMYVYYFESPEKFAFNKVIRTENQNEISL EKFNEFKETIQNKLFKQDGFKDISLYEPGKGDEKPTPLLMHLKLPRNTGMLPYTNTNNVSTL IEQGYSIKIDKIVRIVIDGKHYIKAEASWS SLDFKDDVSKGDSWGKANYNDWSNKLTPNEL ADVNDYMRGGYTAINNYLISNGPVNNPNPELDSKITNIENALKREPIPTNLTVYARSGPAEF GLTLTSPEYDFNKLENIDAFKSKWEGQALSYPAFIFTSIGSVNMSAFAKAKIVLRITIPKGS PGAYLSAIPGYAGQYQVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIP SEQ ID NO: 64 - C107 without his tag

PGAYLSAIPGYAGEYEVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIP SEQ ID NO : 65 - Cl08 sans le marqueur hisPGAYLSAIPGYAGEYEVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIP SEQ ID NO: 65 - Cl08 without the his marker

PGAYLSAIPGYAGEYQVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIP SEQ ID NO : 66 - Cl49 sans le marqueur hisPGAYLSAIPGYAGEYQVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIP SEQ ID NO: 66 - Cl49 without the his marker

LDGDTLSTIKAQENQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQRSSRLIPINYDQLKKLDAGKQLDGDTLSTIKAQENQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQRSSRLIPINYDQLKKLDAGKQ

GGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVD SEQ ID NO : 67 - C152 sans le marqueur hisGGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVD SEQ ID NO: 67 - C152 without the his marker

GRIIPSKDGEYTLS TDRDDVLMQVNTESTISNTLKVNMKKGKEYKVRIELQDKNLGSIDNLSGRIIPSKDGEYTLS TDRDDVLMQVNTESTISNTLKVNMKKGKEYKVRIELQDKNLGSIDNLS

LDGDTLSTIKAQANQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMAQFSSRLIPINYDQLKKLDAGKQ IKLETTQVSGNFGTKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAKNLQD 'LDGDTLSTIKAQANQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMAQFSSRLIPINYDQLKKLDAGKQ IKLETTQVSGNFGTKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAKNLQD '

GGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVD SEQ ID NO : 68 - C52 sans le marqueur his MTNFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQGSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGYSKDPLT SNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTYLDNLSITELN STPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEALDYIQKY RVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRIYAITPD DRELLVLSVDGG . SEQ ID NO : 69 - C53 sans le marqueur hisGGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVD SEQ ID NO: 68 - C52 without the His tag MTNFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQGSANKLNGETKIKIPMSELKPYKRYVFSGYSKDPLT SNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEITLIGSGTTYLDNLSITELN STPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYINGMYFAPTQTNKEALDYIQKY RVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRIYAITPD DRELLVLSVDGG. SEQ ID NO: 69 - C53 without the marker his

KDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVDGG SEQ ID NO : 70 - Séquence polypeptidique de la construction de CDTa C34 sans le marqueur hisKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFTGGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVDGG SEQ ID NO: 70 - Polypeptide sequence of the construction of CDTa C34 without the marker his

PGAYLSAIPGYAGEYEVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIP SEQ ID NO : 71 - Construction de CDTb C118. CDTb sans le peptide signal, sans le prodomaine, sans le domaine de liaison à la CDTa et sans le domaine de liaison aux récepteurs, sans le marqueur hisPGAYLSAIPGYAGEYEVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIP SEQ ID NO: 71 - Construction of CDTb C118. CDTb without the signal peptide, without the prodomain, without the CDTα binding domain and without the receptor binding domain, without the his tag

MAYPIVGVGMEKLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTESNTAGVSVNVGYQNGFTANVTTN YSHTTDNSTAVQDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTNLVLDGDT LSTIKAQENQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQFSSRLIPINYDQLKKLDAGKQIKLET TQVSGNFGTKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAKNLQDPEDKT PELTIGEAIEKAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDNTANKIKDSLKTLSDKKIYNVK LERGMNILIKTPGG SEQ ID NO : 72 - Construction de CDTb C46. Séquence polypeptidique de la CDTb' (moins le peptide signal) sans le marqueur his .MAYPIVGVGMEKLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTESNTAGVSVNVGYQNGFTANVTTN YSHTTDNSTAVQDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTNLVLDGDT LSTIKAQENQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQFSSRLIPINYDQLKKLDAGKQIKLET TQVSGNFGTKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAKNLQDPEDKT PELTIGEAIEKAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDNTANKIKDSLKTLSDKKIYNVK LERGMNILIKTPGG SEQ ID NO: 72 - Construction of cdtB C46. Polypeptide sequence of CDTb '(minus signal peptide) without his tag.

MEIVNEDILPNNGLMGYYFTDEHFKDLKLMAPIKDGNLKFEEKKVDKLLDKDKSDVKSIRWT GRIIPSKDGEYTLSTDRDDVLMQVNTESTISNTLKVNMKKGKEYKVRIELQDKNLGSIDNLS SPNLYWELDGMKKIIPEENLFLRDYSNIEKDDPFIPNNNFFDPKLMSDWEDEDLDTDNDNIP DSYERNGYTIKDLIAVKWEDSFAEQGYKKYVSNYLESNTAGDPYTDYEKASGSFDKAIKTEA RDPLVAAYPIVGVGMEKLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTESNTAGVSVNVGYQNGFTA NVTTNYSHTTDNSTAVQDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTNLV LDGDTLSTIKAQENQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQFSSRLIPINYDQLKKLDAGKQ IKLETTQVSGNFGTKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAKNLQD PEDKTPELTIGEAIEKAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDNTANKIKDSLKTLSDKK IYNVKLERGMNILIKTPTYFTNFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQGSANKLNGETKIKIPMS ELKPYKRYVFSGYSKDPLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEI TLIGSGTTYLDNLSITELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYING MYFAPTQTNKEALDYIQKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFT GGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVD ' SEQ ID NO : 73 - Construction C44. Séquence polypeptidique de la CDTa avec la mutation E428Q, sans le marqueur his.MEIVNEDILPNNGLMGYYFTDEHFKDLKLMAPIKDGNLKFEEKKVDKLLDKDKSDVKSIRWT GRIIPSKDGEYTLSTDRDDVLMQVNTESTISNTLKVNMKKGKEYKVRIELQDKNLGSIDNLS SPNLYWELDGMKKIIPEENLFLRDYSNIEKDDPFIPNNNFFDPKLMSDWEDEDLDTDNDNIP DSYERNGYTIKDLIAVKWEDSFAEQGYKKYVSNYLESNTAGDPYTDYEKASGSFDKAIKTEA RDPLVAAYPIVGVGMEKLIISTNEHASTDQGKTVSRATTNSKTESNTAGVSVNVGYQNGFTA NVTTNYSHTTDNSTAVQDSNGESWNTGLSINKGESAYINANVRYYNTGTAPMYKVTPTTNLV LDGDTLSTIKAQENQIGNNLSPGDTYPKKGLSPLALNTMDQFSSRLIPINYDQLKKLDAGKQ IKLETTQVSGNFGTKNSSGQIVTEGNSWSDYISQIDSISASIILDTENESYERRVTAKNLQD PEDKTPELTIGEAIEKAFGATKKDGLLYFNDIPIDESCVELIFDDNTANKIKDSLKTLSDKK IYNVKLERGMNILIKTPTYFTNFDDYNNYPSTWSNVNTTNQDGLQGSANKLNGETKIKIPMS ELKPYKRYVFSGYSKDPLTSNSIIVKIKAKEEKTDYLVPEQGYTKFSYEFETTEKDSSNIEI TLIGSGTTYLDNLSITELNSTPEILDEPEVKIPTDQEIMDAHKIYFADLNFNPSTGNTYING MYFAPTQTNKEALDYIQKYRVEATLQYSGFKDIGTKDKEMRNYLGDPNQPKTNYVNLRSYFT GGENIMTYKKLRIYAITPDDRELLVLSVD 'SEQ ID NO: 73 - Construction C44. Polypeptide sequence of CDTa with the E428Q mutation, without the his tag.

PGAYLSAIPGYAGqYEVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIP SEQ ID NO : 74 - Construction C54. Séquence polypeptidique de la CDTa avec la mutation E430Q, sans le marqueur his.PGAYLSAIPGYAGqYEVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIP SEQ ID NO: 74 - Construction C54. Polypeptide sequence of CDTa with the E430Q mutation, without the his tag.

PGAYLSAIPGYAGEYqVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIP SEQ ID NO : 75 - C68 sans le marqueur hisPGAYLSAIPGYAGEYqVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIP SEQ ID NO: 75 - C68 without the his marker

PGAYLSAIPGYAGQYQVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIP SEQ ID NO : 76 - Séquence d'acides aminés de la CDTa sans le peptide signal, avec six mutations (R345A, Q350A, N385A, R402A, S388F, E428Q, aa 44 à 463) (C110 sans le marqueur his)PGAYLSAIPGYAGQYQVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIP SEQ ID NO: 76 - Amino acid sequence of CDTa without the signal peptide, with six mutations (R345A, Q350A, N385A, R402A, S388F, E428Q, aa 44-463) (C110 without the his tag)

PGAYLSAIPGYAGQYEVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIPPGAYLSAIPGYAGQYEVLLNHGSKFKINKIDSYKDGTITKLIVDATLIP

Claims

REVENDICATIONS

1. Composition immunogène comprenant une protéine CDTb isolée de Clostridium difficile où la protéine CDTb isolée de Clostridium difficile a été mutée par une mutation au niveau de la position 426 et une mutation au niveau de la position 453, pour modifier la capacité à former des pores dans laquelle la protéine CDTb isolée de Clostridium difficile comprend (i) SEQ ID NO : 10 ou SEQ ID NO : 11 ou SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 26 ; ou (ii) un variant de la CDTb présentant au moins 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % d'identité de séquence avec SEQ ID NO : 10 ou SEQ ID NO : 11 ou SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 26 ; ou (iii) un fragment de la CDTb comportant au moins 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250 ou 300 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 10 ou SEQ ID NO : 11 ou SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 26 ; ou (iv) SEQ ID NO : 43 ou SEQ ID NO : 44 ; ou (V) un variant de la CDTb présentant au moins 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % d'identité de séquence avec SEQ ID NO : 43 ou SEQ ID NO : 44 ; ou (vi) un fragment de la CDTb comportant au moins 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250 ou 300 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 43 ou SEQ ID NO : 44.An immunogenic composition comprising a CDTb protein isolated from Clostridium difficile wherein the CDTb protein isolated from Clostridium difficile was mutated by a mutation at position 426 and a mutation at position 453 to modify the ability to form pores wherein the CDTb protein isolated from Clostridium difficile comprises (i) SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 26; or (ii) a variant of CDTb exhibiting at least 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 98%, 99%, 100% sequence identity with SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 26; or (iii) a fragment of CDTb comprising at least 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250 or 300 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 26; or (iv) SEQ ID NO: 43 or SEQ ID NO: 44; or (V) a variant of CDTb having at least 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 98%, 99%, 100% sequence identity with SEQ ID NO: 43 or SEQ ID NO: 44; or (vi) a fragment of CDTb comprising at least 30, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 250 or 300 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 43 or SEQ ID NO: 44.

2. Composition immunogène selon la revendication 1, dans laquelle la protéine CDTb isolée de Clostridium difficile comprend au moins une mutation choisie dans le groupe constitué de F455R, F455G, E426A et D453A.The immunogenic composition according to claim 1, wherein the CDTb protein isolated from Clostridium difficile comprises at least one mutation selected from the group consisting of F455R, F455G, E426A and D453A.

3. Composition immunogène selon la revendication 1, dans laquelle la protéine CDTb isolée de Clostridium difficile comprend les mutations E426A et D453A.An immunogenic composition according to claim 1, wherein the CDTb protein isolated from Clostridium difficile comprises mutations E426A and D453A.

4. Composition immunogène selon l’une quelconque des revendications précédentes comprenant en outre une protéine CDTa isolée de Clostridium difficileAn immunogenic composition according to any one of the preceding claims further comprising a CDTa protein isolated from Clostridium difficile

5. Composition immunogène selon l’une quelconque des revendications précédentes, où la composition déclenche des anticorps qui neutralisent la CDTa ou la CDTb ou les deux.An immunogenic composition according to any one of the preceding claims wherein the composition elicits antibodies that neutralize CDTa or CDTb or both.

6. Composition immunogène selon l’une quelconque des revendications précédentes, où la composition déclenche des anticorps qui neutralisent la toxine binaire.An immunogenic composition according to any one of the preceding claims wherein the composition elicits antibodies that neutralize the binary toxin.

7. Composition immunogène selon l’une quelconque des revendications précédentes, où la composition immunogène comprend en outre une protéine de toxine A isolée de Clostridium difficile et/ou une protéine de toxine B isolée de C. difficile.An immunogenic composition according to any one of the preceding claims, wherein the immunogenic composition further comprises toxin A protein isolated from Clostridium difficile and / or toxin B protein isolated from C. difficile.

8. Composition immunogène selon la revendication 7, où la composition immunogène comprend une protéine de toxine A isolée de Clostridium difficile et une protéine de toxine B isolée de C. difficile où la protéine de toxine A isolée de Clostridium difficile et la protéine de toxine B isolée de C. difficile forment une protéine de fusion et dans laquelle la protéine de fusion est (i) SEQ ID NO : 32 ; ou (ii) un variant présentant au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % d’identité de séquence avec SEQ ID NO : 32; ou (iii) un fragment d’au moins 800, 850, 900 ou 950 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 32.The immunogenic composition of claim 7, wherein the immunogenic composition comprises toxin A protein isolated from Clostridium difficile and toxin B protein isolated from C. difficile where toxin A protein isolated from Clostridium difficile and toxin B protein. isolated from C. difficile form a fusion protein and wherein the fusion protein is (i) SEQ ID NO: 32; or (ii) a variant having at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% sequence identity with SEQ ID NO: 32; or (iii) a fragment of at least 800, 850, 900 or 950 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 32.

9. Composition immunogène selon l’une quelconque des revendications précédentes, où la composition immunogène comprend en outre un adjuvant.An immunogenic composition according to any one of the preceding claims, wherein the immunogenic composition further comprises an adjuvant.

10. Composition immunogène selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre des antigènes supplémentaires.An immunogenic composition according to any one of the preceding claims, further comprising additional antigens.

11. Composition immunogène selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre un saccharide de C. difficile.Immunogenic composition according to any one of the preceding claims, further comprising a saccharide of C. difficile.

12. Vaccin comprenant la composition immunogène selon l’une quelconque des revendications précédentes et un excipient pharmaceutiquement acceptable.A vaccine comprising the immunogenic composition of any one of the preceding claims and a pharmaceutically acceptable excipient.

13. Composition immunogène selon l’une quelconque des revendications 1 à 11 ou vaccin selon la revendication 12 pour une utilisation dans le traitement ou la prévention d’une maladie de C. difficile.An immunogenic composition according to any one of claims 1 to 11 or a vaccine according to claim 12 for use in the treatment or prevention of C. difficile disease.

14. Composition immunogène selon l’une quelconque des revendications 1 à 11 ou vaccin selon la revendication 12 pour une utilisation dans le traitement ou la prévention d’une maladie provoquée par une souche de C. difficile choisie dans le groupe constitué de 078, 019, 023, 027, 033, 034, 036, 045, 058, 059, 063, 066, 075, 078, 080, 111, 112, 203, 250 et 571.An immunogenic composition according to any one of claims 1 to 11 or a vaccine according to claim 12 for use in the treatment or prevention of a disease caused by a strain of C. difficile selected from the group consisting of 078, 019 , 023, 027, 033, 034, 036, 045, 058, 059, 063, 066, 075, 078, 080, 111, 112, 203, 250 and 571.

15. Composition immunogène selon l’une quelconque des revendications 1 à 11 ou vaccin selon la revendication 12 pour une utilisation dans le traitement ou la prévention d’une maladie provoquée par la souche 078 de C. difficile.15. An immunogenic composition according to any one of claims 1 to 11 or vaccine according to claim 12 for use in the treatment or prevention of a disease caused by C. difficile strain 078.

16. Utilisation de la composition immunogène selon l’une quelconque des revendications 1 à 11 ou du vaccin selon la revendication 12 dans la préparation d’un médicament destiné à la prévention ou au traitement d’une maladie de C. difficile.16. Use of the immunogenic composition according to any one of claims 1 to 11 or the vaccine of claim 12 in the preparation of a medicament for the prevention or treatment of C. difficile disease.

17. Utilisation selon la revendication 16, où la maladie est une maladie provoquée par une souche de C. difficile choisie dans le groupe constitué de 078, 019, 023, 027, 033, 034, 036, 045, 058, 059, 063, 066, 075, 078, 080, 111, 112, 203, 250 et 571.The use according to claim 16, wherein the disease is a disease caused by a C. difficile strain selected from the group consisting of 078, 019, 023, 027, 033, 034, 036, 045, 058, 059, 063, 066, 075, 078, 080, 111, 112, 203, 250 and 571.

18. Utilisation selon la revendication 16, où la maladie est une maladie provoquée par la souche 078 de C. difficile.18. Use according to claim 16, wherein the disease is a disease caused by C. difficile strain 078.

19. Protéine CDTb isolée de Clostridium difficile telle que définie dans l’une quelconque des revendications 1 à 4.19. CDTb protein isolated from Clostridium difficile as defined in any one of claims 1 to 4.