BE1021813B1

BE1021813B1 - Interface ce-ms

Info

Publication number: BE1021813B1
Application number: BE2014/0097A
Authority: BE
Inventors: Johann Far; Jean-Bernard Falmagne; L'escaille François De
Original assignee: Analis Sa
Priority date: 2014-02-13
Filing date: 2014-02-13
Publication date: 2016-01-19
Also published as: EP3105776A1; WO2015121366A1

Abstract

La présente invention se rapporte à une interface de couplage d'électrophorèse capillaire à un spectromètre de masse (CE-MS) comprenant : • un capillaire ayant une section d'entrée et une section de sortie, la section de sortie ayant un diamètre externe compris entre 100 pm et 400 pm ; une aiguille creuse conductrice entourant la section de sortie du capillaire, le ratio du diamètre interne de l'aiguille sur le diamètre externe du capillaire étant compris entre 1,05 et 2,5 de façon à laisser une lumière entre ces deux diamètres pour permettre en utilisation le passage d'un liquide de gaine conducteur à débit microfluidique, et dans laquelle ladite section de sortie du capillaire dépassant de l'aiguille d'au moins la valeur du diamètre externe du capillaire.

Description

Interface CE-MS

Objet de l'invention [0001] La présente invention se rapporte à une interface de couplage d’électrophorèse capillaire à un spectromètre de masse et une méthode d’analyse utilisant la dite interface.

Etat de la technique I L’électrophorèse [0002] L’électrophorèse est une technique basée sur la différence de mobilité des ions en solution soumis à un champ électrique de polarité choisie (normal ou inverse), à pH, concentration en électrolyte de migration (BGE pour BackGround Electrolyte) et à viscosité donnés. En électrophorèse capillaire (CE pour Capillary Electrophoresis), les électrolytes sont contenus dans un tube de quelques dizaines de micromètres de diamètre interne, généralement en silice. Outre les quantités extrêmement faibles en électrolytes et en échantillon nécessaires à l’analyse, la surface en silice du capillaire est plus ou moins ionisée (donc chargée) en fonction de divers paramètres dont principalement le pH de l’électrolyte et sa force ionique. Dans le cas des capillaires en silice non modifiés, le pKa moyen des silanols présents à la surface des capillaires («4) est souvent inférieur au pH de l’électrolyte de migration. De ce fait, cette surface est généralement chargée négativement. La valeur de densité de charge à la surface est appelée potentiel zêta ζ. Lors de l’application du champ électrique dans le capillaire, un flux de liquide se crée spontanément et est notamment fonction de la valeur de ce potentiel ζ. Ce flux de liquide appelé flux électroosmotique (EOF) permet de compenser l’accumulation de charge des électrolytes chargés positivement à la surface du capillaire de silice chargé négativement. Le sens du flux de l’EOF dépend en fait de la direction du champ électrique appliqué dans le capillaire et du potentiel ζ du capillaire. Il est possible de modifier le sens du flux électroosmotique en modifiant l’état de surface du capillaire, et de façon générale son potentiel ζ (c’est-à-dire en imposant la densité de charges et leur signe à la surface du capillaire).

[0003] La modification du potentiel ζ du capillaire est possible soit en modifiant le pH et la force ionique de l’électrolyte comme indiqué plus haut, mais également par modification chimique du capillaire. Ces modifications peuvent être le greffage covalent de polymère tel que le revêtement (coating) neutre de Beekman Coulter qui permet au capillaire d’obtenir un potentiel ζ qui tend vers zéro, c’est-à-dire sans flux électroosmotique, ou par l’adsorption de couche(s) de polymère à la surface du capillaire, ou revêtement dynamique. Ce type de revêtement permet de choisir la valeur du potentiel ζ du capillaire et donc de choisir le sens et l’intensité du flux électroosmotique dans le capillaire. Le revêtement dynamique permet donc d’adapter la stratégie analytique aux contraintes expérimentales lorsque la CE est utilisée comme technique séparative. Cette possibilité est extrêmement intéressante dans le cas du couplage de la CE avec la spectrométrie de masse (Mass Spectrometry : MS).

[0004] La migration électrophorétique des ions est due aux phénomènes d’attractions / répulsions de charges des ions au sein du champ électrique. La mobilité apparente d’un ion en CE est la somme des mobilités électrophorétiques et de l’EOF. Le sens du flux de l’EOF et des ions en migration peuvent être ou non de même signe (sens), permettant une importante souplesse dans la mise au point de stratégies analytiques. De plus, plusieurs modes de séparation sont également disponibles en CE (CZE, ITP, CEC, MEKC, IEF, MW...)

Il, La spectrométrie de masse [0005] La spectrométrie de masse est une technique analytique destructive permettant de mesurer la masse d’un ion en phase gazeuse. Dans l’absolu, un spectromètre de masse détermine des rapports masse sur charge (m/z, avec m la masse de l’ion et z le nombre de charges portées par l’ion en valeur absolue) et non la masse directement. Toutefois, il est aisé d’accéder aux valeurs de z et donc de déterminer la masse de l’ion dit parent ou pseudomoléculaire. La formation et le transfert des analytes de la phase solvatée vers la phase gaz est permis grâce à une source d’ionisation. L’intensité du signal mesuré est proportionnelle à la quantité d’ions formés en source ayant atteint le détecteur du spectromètre de masse. La détermination des rapports m/z est le rôle de ou des analyseurs de masse, fonctionnant dans un vide plus ou moins poussé. Les sources équipant les spectromètres de masse peuvent atomiser et ioniser la matière (MS élémentaire), ou seulement conférer aux analytes une ou plusieurs charges sans destruction, voire sans modification notable de leurs structures tridimensionnelles (MS moléculaire ou pseudomoléculaire).

[0006] La notion d’ion pseudomoléculaire renvoie au fait que la molécule « M » analysée par ionisation douce (comme les sources électrospray) couplée à la MS est chargée soit par « n » adduits de protons ou de cations afin d’obtenir des ions du type [M+nH]n+ ou encore [M+nNa]n+, [M+nK]n+ ou [M+nNH4]n+ par exemple et en ce qui concerne le mode positif d’ionisation. Le mode négatif d’ionisation consiste la plupart du temps à arracher un ou plusieurs protons labiles lors du processus d’ionisation pour conduire à des ions de type [M-nH]n‘ bien que la formation d’adduit d’anion comme l’acétate soit possible.

[0007] Cet ion pseudomoléculaire est également appelé ion parent. La notion d’ion parent renvoie à la structure de la molécule et de ses adduits une fois transférée en phase gazeuse. Selon l’instrument utilisé, il peut être possible de réaliser la spectrométrie de masse dit en tandem, qui consiste brièvement en l’association de plusieurs types d’analyseur en masse, qui sont eux-mêmes associés à un ou plusieurs dispositifs permettant de sélectionner et de fragmenter l’ion parent. L’interprétation manuelle ou automatisée de ces spectres de fragmentation conduit à la détermination de la structure de l’ion parent et son identification.

[0008] Les performances des spectromètres de masse sont exprimables avec quelques valeurs caractéristiques qui sont le duty cycle, la résolution, la précision et la justesse en masse (mass accuracy). Le duty cycle est le temps nécessaire à un instrument pour réaliser toutes les actions demandées (spectres fullscan, MSn...), la résolution est la possibilité de discriminer deux ions aux rapports m/z voisins, la précision en masse est le nombre de chiffre significatif que l’analyseur de masse peut donner sur la détermination des rapports m/z, et la justesse en masse est l’écart de la masse mesurée par rapport à la masse théorique de l’ion. III la source d’ion : électrosprav (ESI) [0009] La source électrospray (ESI) est une source d’ionisation douce permettant de former des adduits non covalents d’ions sur une molécule pour former un ion pseudomoléculaire. L’ionisation par électrospray se réalise en 4 étapes, schématisées également à la Figure 1 : 1 ) formation du cône de Taylor à l’extrémité du capillaire soumis à une haute tension, 2) formation de microgouttelettes s’échappant du cône de Taylor, 3) explosion coulombienne, 4) désolvatation des ions et transfert en phase gaz.

[0010] Dans le cône de Taylor, une ségrégation des ions selon leur charge se crée selon la tension appliquée au capillaire : positive (ESI en mode positif) ou négative (ESI en mode négatif). En mode positif, le capillaire devient le siège d’oxydations où sont retenus les anions tandis que les cations sont repoussés dans l’extrémité du cône de Taylor. Ensuite, des microgouttelettes s’échappent du cône de Taylor par répulsion électrostatique. Le volume de ces gouttes se réduit par évaporation du solvant sous l’effet de la température. Lorsque ces gouttes se réduisent à une taille critique, les charges sont concentrées dans un faible volume et les répulsions électrostatiques sont telles que ces gouttes explosent : c’est l’explosion coulombienne. Ce processus perdure jusqu’à ce que les ions pseudo-moléculaires soient désolvatés avant d’être introduit dans le spectromètre de masse.

[0011] Le mécanisme de formation des ions pseudomoléculaires n’est pas encore tout à fait élucidé. Cependant, deux modèles coexistent pour expliquer la formation et le transfert en phase gaz des ions pseudomoléculaires :

Charged Residue Mechanism, ou modèle CRM proposé par Dole en 1968 (Dole et al., 1968). Ce modèle explique qu’une série d’explosion coulombienne forme une « nano-gouttelette » contenant un seul ion pseudomoléculaire. Le reste de solvant est évaporé par le gaz rideau (curtain gas) permettant le transfert de l’ion en phase gaz.

Ion Evaporation Mechanism, ou modèle IEM proposé par Iribarne et Thomson en 1976 (Iribarne & Thomson, 1976). Ce modèle explique qu’une nanogouttelette d’environ 10nm de rayon possède une tension de surface suffisamment élevée pour que des ions pseudomoléculaires s’en échappent spontanément par répulsion électrostatique. Le transfert en phase gazeuse a lieu par désolvatation à l’aide d’un gaz de nébulisation (curtain gas).

[0012] Le modèle IEM a été mis en évidence par le transfert en phase gaz de grosses molécules alors que le modèle CRM s’applique aux petits ions (mono ou polyatomiques). Il semble admis aujourd’hui que le processus de transfert des ions pseudomoléculaires en phase gaz soit la résultante des deux modèles.

Couplage CE-MS

[0013] Deux types de stratégies ont été poursuivis dans l’art antérieur pour coupler la sortie de l’électrophorèse capillaire à un électrospray.

[0014] Dans une première stratégie, le capillaire de séparation est insérée dans une aiguille concentrique où un liquide additionnel (de gaine) dit Sheath Liquid permet de fermer le pont électrolytique entre l’extrémité de ce capillaire et l’aiguille concentrique reliée à un générateur haute tension du spectromètre de masse. Le liquide de gaine et le liquide issu du capillaire de séparation se mélangent avant de former le cône de Taylor, constituant la source ionique de l’interface. Le flux élevé de liquide de gaine nécessite l’utilisation d’un gaz dit gaz de nébulisation (nebulization gaz, concentrique lui aussi) permettant de vaporiser plus efficacement le liquide émis au bord du cône de Taylor. L’utilisation de liquide de gaine présente néanmoins de nombreux inconvénients parmi lesquels : une dilution des analytes dégradants le rapport signal/bruit, un effet d’aspiration sur le capillaire, réduisant la capacité de séparation de la CE, ...

[0015] Une seconde stratégie consiste à utiliser des sources dites nanospray dans lesquelles le pont électrolytique est fermé dans le capillaire avec l’utilisation d’une quantité négligeable de liquide conducteur dit de gaine. Ce sont les interfaces dites « sheathless interface ». Plusieurs solutions existent dans l’art antérieur pour permettre la création d’un pont électrolytique avec ce régime de débit. Brièvement le pont électrolytique peut être assuré à l’aide d’une micro-incision (gap junction) dans le capillaire de séparation (ou dans une pièce en silice jouant le rôle de connecteur sans volume mort) avec un angle bien précis. La légère différence de viscosité empêche le BGE (background electrolyte) et les analytes de quitter le capillaire de séparation. Cette méthode nécessite un usinage très précis de l’interface pour être fonctionnelle. Une autre solution, utilisée par Beekman Coulter dans son interface OptiMS pour le CESI8000, consiste à rendre l’extrémité du capillaire de séparation poreux. Cette partie poreuse baigne dans un electrolyte compatible avec la BGE afin d’assurer la fermeture du circuit électrique. L’attaque chimique du capillaire pour rendre le capillaire poreux nécessite une optimisation des différentes étapes de fabrication dont l’attaque de la silice du capillaire avec l’acide fluorhydrique. Toutefois cette stratégie semble gêner l’utilisation d’agents de revêtement en venant partiellement boucher les porosités créées.

[0016] Ces derniers procédés permettent un apport minimum de liquide de gaine au prix d’un usinage très précis des diverses parties des interfaces CE-MS de type sheathless. Enfin, ce type d’interface présente l’inconvénient de nécessiter un débit électroosmotique (EOF) important, ce qui dégrade la capacité de séparation de l’électrophorèse capillaire.

Buts de l'invention [0017] La présente invention vise à proposer une interface CE-MS et une méthode d’analyse utilisant la dite interface qui ne présentent pas les inconvénients de l’état de la technique, en particulier une interface améliorant le rapport signal/bruit, et la capacité de séparation de la CE. Un autre objectif de la présente invention est de simplifier la fabrication de l’interface et de proposer un dispositif et une méthode robuste, et peu sensible aux paramètres dimensionnels. Résumé de l'invention [0018] La présente invention se rapporte à une interface de couplage d’électrophorèse capillaire à un spectromètre de masse (CE-MS) comprenant : • un capillaire, généralement en silice (fondu), ayant une section d’entrée et une section de sortie, la section de sortie ayant un diamètre externe compris entre 100 pm et 400 pm, de préférence entre 150 et 380 pm ; • une aiguille creuse conductrice entourant la section de sortie du capillaire, le ratio du diamètre interne de l’aiguille sur le diamètre externe du capillaire étant compris entre 1,05 et 1,55, de préférence de 1,1 à 1,45, de façon à laisser une lumière entre la paroi externe du capillaire et la paroi interne de l’aiguille pour permettre en utilisation le passage d’un liquide de gaine conducteur, ladite section de sortie du capillaire dépassant de l’aiguille d’au moins la valeur du diamètre externe du capillaire.

[0019] Selon des modes préférés de l'invention, l’interface de l'invention comprend en outre une ou plusieurs combinaisons appropriées d'au moins deux des caractéristiques suivantes: • l’aiguille creuse conductrice et le capillaire sont couplés via un connecteur en « T » (Té) isolant, le Té connecte également la lumière entre l’aiguille et le capillaire à une pompe alimentant en utilisation un liquide de gaine ; • la pompe est couplée au Té via un connecteur conducteur, ledit connecteur étant mis à la terre de l’électrophorèse capillaire et du spectromètre de masse via une résistance ; • la résistance de mise à la terre est comprise entre 100 et 600 ΜΩ, de préférence environ 400 ΜΩ ; • le capillaire comprend de la silice (fondue) et/ou de préférence un polymère, de préférence le capillaire comprend du PEEK ; • l’interface comprend des moyens pour déplacer la section de sortie du capillaire par rapport à l’extrémité de l’aiguille.

[0020] Un autre aspect de l'invention concerne une méthode d’analyse CE-MS utilisant l’interface selon l’invention comprenant les étapes suivantes : • injecter un échantillon à analyser à la section d’entrée du capillaire dans le liquide à analyser ; • plonger la section d’entrée du capillaire dans le bain d’électrolyte (BGE) ; • imposer une différence de potentiel entre l’aiguille et le bain d’électrolyte ; • imposer une différence de potentiel entre l’aiguille et l’entrée d’un spectromètre de masse placée devant la sortie de l’aiguille ; • injecter un débit constant de liquide de gaine compris entre 0.1 pl et 5μΙ dans la lumière comprise entre le capillaire et l’aiguille ; • mesurer l’évolution temporelle du spectre de masse obtenu en fonction du temps.

[0021] Avantageusement, la méthode d’analyse CE-MS de l’invention comprend une étape de régénération du capillaire (ex : circulation d’une solution d’une base forte tel que du NaOH), une étape de nettoyage (ex : circulation d’une solution d’un acide fort tel que du HCl) et/ou une étape de modification des propriétés du capillaire (coating) avant le début des sessions analytique ou pendant ; [0022] Lors de l’étape de nettoyage du capillaire, on pourra avantageusement calibrer en masse le spectromètre de masse. Par exemple, dans le cas d’un nettoyage au NaOH, il est possible de procéder à cette calibration à l’aide de cluster décrit dans la littérature (ex : (CH3COONa)xNa+) x allant de 1 à plusieurs dizaines selon l’analyseur de masse employé ; [0023] De préférence, la composition du BGE et du liquide de gaine sont identiques.

[0024] Avantageusement, la méthode de l’invention comprend en outre une étape d’initialisation comprenant une étape de réglage de l’intensité du champ électrique à l’extrémité du capillaire de façon à observer un cône de Taylor stable englobant la section de sortie du capillaire et l’extrémité de l’aiguille.

[0025] De préférence, le champ électrique induit par la différence de potentiel entre l’aiguille et l’entrée du spectromètre de masse est compris entre 0,5 et 2,5 kV/mm. Brève description des figures [0026] La Figure 1 représente schématiquement le principe d’une source d’électrospray.

[0027] La figure 2 représente schématiquement un exemple d’interface CE-MS selon l’invention (détail de la section de sortie de la CE et entrée de la MS).

[0028] La figure 3 représente schématiquement un exemple d’interface CE-MS selon l’invention.

[0029] La figure 4 illustre des exemples de détection décrits dans les exemples A, B et C. Légende des figures 1. Capillaire 2. Aiguille 3. Cône de Taylor

4. Source de tension de la MS 5. Gaz de couverture (curtain gas) 6. Gouttelettes (formées selon les mécanismes IEM et/ou CRM) 7. « Té » 8. Flux de liquide de gaine 9. Résistance de mise à la terre 10. et 10’ : Connecteur(s)/conducteur(s) 11. Seringue (i.e. pompe micro fluidique)

12. Réservoir de BGE 13. Source de tension de l’électrophorèse 14. Connecteur (nut), manchon (liner) et embout (ferrule) (généralement en polymère) adaptés au diamètre externe du capillaire de séparation.

Description détaillée de l'invention [0030] La présente invention se rapporte à une interface CEMS compatible avec les sources nanospray et utilisant des débits de liquide de gaine micro à nano-fluidique (quelques microlites par minute, ce débit dépend de plusieurs paramètres développés un peu plus tard). A ce débit de liquide le phénomène d’électronébulisation se suffit à lui-même et l’utilisation d’un gaz de nébulisation n’est plus nécessaire.

[0031] L’interface de couplage d’électrophorèse capillaire à un spectromètre de masse selon l’invention comprend : • un capillaire 1 ayant une section d’entrée et une section de sortie; • une aiguille creuse conductrice 2 entourant la section de sortie du capillaire 1.

[0032] Selon l’invention, le circuit électrique de l’électrophorèse capillaire est fermé par un pont électrolytique formé entre le liquide de gaine et le liquide de l’électrophorèse, au sein du cône de Taylor, à proximité de la section de sortie du capillaire. Le potentiel du liquide de gaine est imposé par une source de tension 4 électriquement connectée à l’aiguille conductrice 2. L’autre extrémité du capillaire est connectée à une autre source de tension 13 électriquement connectée à un réservoir de BGE dans lequel plonge la section d’entrée du capillaire.

[0033] Afin de produire un cône stable, et de minimiser le flux de liquide de gaine, le ratio du diamètre interne de l’aiguille sur le diamètre externe du capillaire est compris entre 1,05 et 2.5, avantageusement compris entre 1,05 et 1,55 , de préférence compris entre 1,1 et 1,45, de façon à laisser une lumière entre ces deux diamètres et permettre le passage du liquide de gaine. Un tel rapport de diamètre permet de minimiser l’apport de liquide de gaine sans dégrader la stabilité de l’électrospray et du cône de Taylor. Idéalement, le rapport de diamètre est compris entre 1,3 et 1,5. En deçà de cette valeur, il devient en effet difficile d’introduire le capillaire, tandis qu’au-delà de cette valeur, l’apport de liquide de gaine devient trop important. Le tableau 1 reprend des valeurs de diamètres d’aiguilles et de capillaires utilisés dans des exemples de réalisation de l’invention.

Tableau 1

[0034] La section de sortie du capillaire dépasse avantageusement de l’aiguille d’au moins la valeur du diamètre externe du capillaire. Cette valeur permet de fermer le circuit d’électrophorèse capillaire au sein du cône de Taylor en minimisant l’apport de liquide de gaine, de façon à améliorer le rapport signal/bruit de la spectrométrie de masse.

[0035] L’apport de liquide de gaine doit être juste suffisant pour former un cône de Taylor stable, induisant une émission ionique suffisante pour le spectromètre de masse. Lorsque le débit est trop important, des gouttes croissent et se détachent à l’extrémité du dispositif et l’émission devient intermittente. Pour des débits insuffisants, le cône de Taylor ne se prolonge plus jusqu’à l’aiguille conductrice, et le pont électrolytique est rompu. Ce réglage du débit de liquide de gaine permet en outre de minimiser le phénomène d’aspiration sur le capillaire.

[0036] L’absence de gaz de nébulisation permet de simplifier le design de l’interface de l’invention, comparé au modèle des interfaces comprenant une source de gaz de nébulisation concentrique. Avantageusement, l'absence de dispositif concentrique d’ajout de gaz de nébulisation permet d’éviter la déformation de la surface du liquide à la sortie de l’aiguille, ce qui permet de former un cône de Taylor débutant à l’extrémité de l’aiguille et encapsulant la section de sortie du capillaire de séparation.

[0037] De préférence, aucun objet pouvant déformer la surface du liquide par capillarité n’est placé à proximité de la section de sortie du capillaire et de l’aiguille. En particulier, l’absence de dispositif concentrique d’apport de gaz de nébulisation permet un meilleur contrôle de la formation du cône de Taylor.

[0038] Avantageusement, l’aiguille peut être connectée à la masse électrique de la CE par l’intermédiaire d’une résistance de plusieurs mega-Ohms 9, via un connecteur conducteur 10 apportant le débit microfluidique de liquide de gaine en plus de la résistance. Ce système à l’avantage d’empêcher la fuite de courant vers la seringue (ou tout autre dispositif) délivrant le liquide de gaine, rendant la manipulation de cette seringue totalement sûre même si le système CEMS est sous tension.

[0039] L’application d’une différence de potentiel de l’ordre du kV sur une aiguille conductrice crée spontanément un cône de Taylor, dû aux forces de répulsion de charges électriques qui repoussent la pointe de phase mobile vers le premier cône du spectromètre de masse (généralement relié à la masse électrique). La présente invention exploite les propriétés du cône de Taylor afin de l’utiliser comme un pont électrolytique. En effet, l’extrémité du capillaire, gainée par une aiguille conductrice (de préférence sans pointe), dépasse d’environ un demi-millimètre de cette aiguille (contrairement à l’art antérieur). Le cône de Taylor se crée dès qu’une différence de potentiel est appliquée. Le cône de Taylor recouvre alors l’extrémité du capillaire où la fermeture du circuit électrique a lieu.

[0040] Il est intéressant de noter que, contrairement à l’art antérieur, les paramètres géométriques de l’aiguille et du capillaire, et leur disposition relative sont telles qu’en l’absence de différence de potentiel appliquée sur l’aiguille conductrice (et donc en absence du cône de Taylor), le circuit de CE n’est pas fermé.

[0041] Le débit de liquide de gaine nécessaire est plus important que ce qui est décrit dans l’art antérieur pour les interfaces sheathless. Toutefois, en fonction du diamètre externe du capillaire de séparation, il est possible de choisir une aiguille conductrice dont les dimensions (notamment le diamètre interne de l’aiguille) ou le volume de la lumière entre l’extérieur du capillaire de séparation et la paroi interne de l’aiguille soient optimum, permettant de diminuer le débit de liquide de gaine, et donc d’augmenter globalement la sensibilité du système (diminution du rapport S/N). La composition du liquide de gaine influe également sur le débit de liquide de gaine nécessaire au fonctionnement de cette interface (par exemple : la viscosité). Le principal avantage de l’interface de l’invention est qu’elle ne nécessite pas d’usinage précis ni de l’aiguille, ni du capillaire de séparation. L’extrémité du capillaire étant ouverte, il n’existe virtuellement aucune contrainte quant à l’utilisation des agents de revêtement du capillaire (ce qui a par ailleurs été vérifié pour des revêtements dynamiques). De plus, cette interface est pleinement fonctionnelle tant en ionisation positive qu’en ionisation négative. Un autre avantage est que le cône de Taylor est suffisamment alimenté en phase mobile. Il n’existe donc pas de phénomène d’auto-aspiration du BGE présent dans le capillaire de séparation qui détériore la qualité de séparation dans les interfaces sheatless ou faisant usage d’un gaz de nébulisation dans l’art antérieur.

[0042] La présence de liquide de gaine même à débit microfluidique permet de réaliser toutes les étapes de rinçage, de revêtement dynamique ou de régénération du capillaire (avec de la soude puis HCl si besoin, ou quoique ce soit d’autre) en ligne avec le spectromètre de masse sans jamais avoir à arrêter l’électronébulisation ou l’acquisition de données. Enfin la fabrication de l’interface est simple mais l’interface est robuste. Une tolérance importante est permise par l’interface de l’invention en termes de position du capillaire de séparation à la sortie de l’aiguille métallique, de la gamme de débit en BGE et en liquide de gaine, tout comme les tensions de séparation (CE) ou d’ionisation (ESI).

[0043] Un système de connecteur en « T » (Té) permet l’apport du liquide de gaine. Le capillaire de séparation traverse ce connecteur en « T » ainsi que l’aiguille métallique, le liquide de gaine passant dans la lumière entre le capillaire de séparation et la paroi interne de l’aiguille. Cette aiguille est électriquement connectée à un générateur haute tension de la source électrospray du spectromètre de masse.

[0044] Afin de faciliter le positionnement optimum du capillaire par rapport à l’aiguille, l’interface de l’invention comprend avantageusement des moyens de réglage de la position du capillaire par rapport à l’aiguille, tel que par exemple un système d’ajustement par vis micrométrique.

[0045] L’invention concerne aussi une procédure d’initialisation de l’interface selon l’invention comprenant les étapes suivantes : 1) mise sous tension de l’électrolyte de séparation (BGE) dans lequel plonge la section d’entrée du capillaire ; 2) injection d’un débit prédéfini de liquide de gaine dans la lumière entre l’aiguille et le capillaire ; 3) réglage de l’intensité du champ électrique à l’extrémité du capillaire de façon à observer un cône de Taylor stable englobant la section de sortie du capillaire et l’extrémité de l’aiguille.

[0046] Le réglage de l’intensité du champ électrique à la pointe du dispositif pourra être effectué soit en variant la tension appliquée à l’aiguille, soit en approchant ou en éloignant l’ensemble formé par l’aiguille et le capillaire de l’électrode de masse du spectromètre de masse.

[0047] Le débit prédéfini de liquide de gaine est avantageusement compris entre 0,1 et 5 μΙ/min, de préférence entre 1 et 3pl/min.

[0048] Les exemples de valeurs de champs électriques en fonction du débit de liquide de gaine résultant de la procédure d’initialisation selon l’invention sont repris au tableau 2.

Tableau 2

Exemple A

[0049] La partie électrophorèse capillaire utilisée pour l’exemple est un dispositif P/ACE™ MDQ commercialisé par Beekman Coulter. Le capillaire est un capillaire de silice (fused silica) de 80cm ayant un diamètre interne de 50pm et un diamètre externe de 375 pm.

[0050] L’interface à gaz de nébulisation de type sheath liquid dupliquée depuis l’art antérieur est une aiguille de Hamilton de gauge 20 ayant un diamètre interne de 600 pm gainé par un tube en PEEK (1,5875mm OD x 1,397mm ID) délivrant un gaz axial de nébulisation.

[0051] Le spectromètre de masse et un modèle ESI TOF MS micrOTOF commercialisé par la société Bruker Daltonics.

[0052] La BGE et le liquide de gaine sont des solutions à 10% en volume d’acide acétique. Le liquide de gaine est enrichi avec 50% d’isopropanol en volume.

[0053] Le débit de liquide de gaine était de 6,7 pl/min, la tension entre la MS et l’aiguille était de +5 kV et la distance séparant l’aiguille du spectromètre est de 15 à 20mm.

[0054] Ces conditions ont permis d’obtenir un spray pneumatiquement assisté stable. Une solution comprenant cinq marqueurs présentant des points isoélectriques distincts ont été analysés dans ces conditions. Ces marqueurs sont des oligopeptides synthétiques dont la composition (séquence) est décrite au tableau 3 (peptides synthétiques pl clEF markers de Beekman, référence A584811).

Tableau 3

Les résultats obtenus sont représentés à la figure 4A Exemples B et C

[0055] Les résultats obtenus à l’aide de l’interface de l’exemple A ont été comparé au résultat obtenu à l’aide d’une interface CE-MS Near-Sheathless utilisé avec un spectromètre de masse LTQ FT Ultra (ESI LTQ FT ICR de Thermo Finnigan). Dans les exemples B et C, il n’y a pas d’assistance pneumatique, ni de tube permettant l’arrivée d’un gaz coaxial délivrant un gaz de nébulisation. Une tension de +2kV était appliquée sur l’aiguille de l’interface. La distance séparant l’aiguille du spectromètre est de 1 à 2mm. Dans l’exemple B, le même capillaire de diamètre interne de 50pm a été utilisé avec une aiguille de gauge 22, le débit de liquide de gaine était de 2pL/min. Dans l’exemple C, le capillaire a été remplacé par un capillaire de diamètre interne de 30pm et une aiguille de gauge 26, le débit de liquide de gaine était de 1 pL/min. Tous les autres paramètres sont identiques à l’exemple A.

[0056] Le tableau 4 reprend les masses des ions moléculaires caractéristiques des marqueurs utilisés et les temps de migration mesurés pour ces ions.

Tableau 4

[0057] La figure 4 reprend l’intensité de ces signaux en fonction du temps de migration. On remarquera immédiatement une meilleure capacité de pics en fonction du temps et un signal d’intensité plus importante dans le cas de l’interface sans gaz de nébulisation (exemples B et C).

Claims

Revendications

1. Interface de couplage d’électrophorèse capillaire à un spectromètre de masse (CE-MS) comprenant : • un capillaire (1) ayant une section d’entrée et une section de sortie, la section de sortie ayant un diamètre compris entre 100 pm et 400 pm ; • une aiguille creuse conductrice (2) entourant la section de sortie du capillaire (1), le ratio du diamètre interne de l’aiguille (2) sur le diamètre externe du capillaire (1 ) étant compris étant compris entre 1,05 et 2,50, de façon à laisser une lumière entre la paroi externe du capillaire et la paroi interne de l’aiguille pour permettre en utilisation le passage d’un liquide de gaine conducteur, ladite section de sortie du capillaire dépassant de l’aiguille d’au moins la valeur du diamètre externe du capillaire.
2. Interface CE-MS selon la revendication 1 dans laquelle l’aiguille creuse conductrice (2) et le capillaire (1) sont couplés via un Té isolant (7), le Té connectant la lumière entre l’aiguille (2) et le capillaire (1) à une pompe (11) alimentant en utilisation un liquide de gaine.
3. Interface CE-MS selon la revendication 2 dans laquelle la pompe (11) est couplée au Té via un connecteur conducteur (10 ,10’), ledit connecteur étant mis à la terre via une résistance.
4. Interface CEMS selon la revendication 3 dans laquelle la résistance de mise à la terre est comprise entre 100 et 600 ΜΩ, de préférence environ 400 ΜΩ.
5. Interface CE-MS selon l’une quelconque des revendications précédentes dans laquelle le ratio du diamètre interne de l’aiguille (2) sur le diamètre externe du capillaire (1) est compris entre 1,05 à 1,55.
6. Interface CE-MS selon l’une quelconque des revendications précédentes dans laquelle le capillaire (1) comprend un polymère.
7. Interface CE-MS selon l’une quelconque des revendications précédentes dans laquelle le capillaire (1) comprend du PEEK.
8. Interface CE-MS selon l’une quelconque des revendications précédentes comprenant des moyens pour déplacer la section de sortie du capillaire (1) par rapport à l’extrémité de l’aiguille (2).
9. Méthode d’analyse CE-MS utilisant l’interface selon l’une quelconque des revendications précédentes comprenant les étapes suivantes : • injecter un échantillon à analyser à la section d’entrée du capillaire ; • plonger la section d’entrée du capillaire (1) dans un bain d’électrolyte (BGE) (12) ; • imposer une différence de potentiel entre l’aiguille (2) et le bain d’électrolyte (13) ; • imposer une différence de potentiel entre l’aiguille (2) et l’entrée d’un spectromètre de masse placée devant la sortie de l’aiguille ; • injecter un débit constant de liquide de gaine compris entre 0,1 et 5μΙ dans la lumière comprise entre le capillaire (1) et l’aiguille (2) ; et • mesurer l’évolution temporelle du spectre de masse de l’échantillon obtenu en fonction du temps.
10. Méthode d’analyse selon la revendications 9 comprenant en outre une étape d’initialisation par un réglage de l’intensité du champ électrique à l’extrémité du capillaire (1) de façon à observer un cône de Taylor stable englobant la section de sortie du capillaire (1) et l’extrémité de l’aiguille (2).
11. Méthode d’analyse selon l’une quelconque des revendications précédentes 9 à 10 où le champ électrique induit par la différence de potentiel entre l’aiguille (2) et l’entrée du spectromètre de masse est compris entre 0,5 et 2,5 kV/mm.