<Desc/Clms Page number 1>
Verdunner voor de bewaring van vers en diepgevroren sperma
Werkgebied van de uitvinding De voorgestelde uitvinding is gebaseerd op de beschermende werking van melkeiwitten voor de verbetering van de leefbaarheid van spermacellen en hun beschikbaarheid voor bevruchting, in afwachting van kunstmatige inseminatie.
Achtergrond van de uitvinding Met de huidige technieken voor kunstmatige inseminatie, geeft de bewaring van het sperma in afwachting van het inseminatieproces een probleem.
Na afname verliest het sperma zeer snel zijn bevruchtingscapaciteit. Om dus de mogelijkheid te hebben om het sperma te bewaren tot op het ogenblik van de inseminatie, moet men zo vlug mogelijk na afname van het sperma gebruik maken van een aangepast medium en verdunningsmiddel.
De bewaringsduur die bereikt kan worden, hangt af van de verdunner en de bewaringscondities. Over het algemeen kan de bewaringsduur fluctueren tussen enkele uren en enkele dagen. Voor enkele species is het mogelijk om de bewaringsduur te verlengen door het sperma in te vriezen. Deze techniek kan echter ook resulteren in een vernietiging of inactivatie van het sperma en zodanig tot een verminderde fertiliteit leiden.
Er zijn andere verdunners bekend voor het bewaren van vers en diepgevroren sperma ; al deze verdunners bevatten voedingsstoffen, een buffer en minerale zouten.
De verdunners verzekeren een betere en comfortabelere bewaring en behouden de bevruchtingscapaciteit van het sperma.
Onder de verdunners die bekend zijn voor de bewaring van sperma van verschillende species, bijvoorbeeld schapen, runderen, varkens en paarden, vinden we regelmatig verdunners op basis van melk.
De temperatuur speelt ook een belangrijke rol bij de bewaring. Het metabolisme is compleet verschillend bij 50C ten opzichte van 20 C. Ondanks het feit dat er verscheidene studies naar dit onderwerp zijn geweest, gebruik makend van verschillende verdunners, lopen de resultaten sterk uiteen. Bijvoorbeeld, Varner et a/. [Theriogenology, (32)515-525,
<Desc/Clms Page number 2>
EMI2.1
(1989)] gebruikt"Kenny" en vindt geen enkel verschil in de vruchtbaarheid tussen sperma bewaard bij en bij 20 C.
Squires et al. [Proc 11th Congress on Animal Reproduction and Al, Oublin, Ireland, (3) 297, (1988) ] gebruiken dezelfde verdunner and verkrijgen een betere vruchtbaarheid met sperma dat bewaard is bij 5 C, maar ook deze resultaten gelden slechts voor bepaalde hengsten.
Aangezien de meeste transportfirma's en veeartsen hun diensten ingesteld hebben op de bewaring van vers sperma. bij een temperatuur van 5 C, voorziet de huidige uitvinding onder andere een verdunner te vinden op die basis.
De lengte van de bewaringstijd is ook een controversieel punt. Bepaalde auteurs [DouglasHamilton et al., Theriogenology, (22) 291-304, (1984)] gebruiken doses tussen 6 en 24 uur na collectie en krijgen drachtige merries als resultaat. Anderen squires et al., Proc. 11th International congress on Animal Reproduction and Al, Dublin, Ireland, (3) 297, (1988)] verkrijgen geen enkele drachtigheid met sperma dat gedurende 48 uur bewaard was bij 20 C. Een recentere studie [Heiskanten et al., Theriogenology (42) 1043-1051 (1994)] gebruikte sperma dat gedurende 70-80 uren bewaard was bij 5 C in de aangepaste "Kenney" verdunner en verkreeg een drachtigheidspercentage tussen 57% en 77% per cyclus.
Er zijn dus vele studies geweest met betrekking tot de vruchtbaarheidsratio van sperma met verschillende verdunners, maar door de kleinschaligheid van de experimenten en de vele verschillen tussen de experimenten, is het zeer moeilijk een correcte conclusie te trekken. De hierboven beschreven experimenten tonen een grote variatie tussen de experimentopbouw of hebben verschillende inseminatie tijdstippen.
Er is nood aan verdunningsmiddelen die de leefbaarheid van sperma cellen bewaren, en die bij voorkeur eenvoudig te gebruiken en te bewaren zijn.
Samenvatting van de uitvinding De uitvinding heeft betrekking op een vloeibare samenstelling (van eender welk volume) omvattende de volgende samenstelling per liter :
EMI2.2
<tb>
<tb> Glucose <SEP> monohydraat <SEP> 0, <SEP> 1-50 <SEP> g, <SEP> bij <SEP> voorkeur <SEP> 21-33g, <SEP>
<tb> Lactose <SEP> monohydraat <SEP> 0, <SEP> 1-50 <SEP> g, <SEP> bij <SEP> voorkeur <SEP> 1-2g, <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 3>
EMI3.1
<tb>
<tb> Natriumcitraat <SEP> dihydraat <SEP> 0, <SEP> 1-1 <SEP> g, <SEP> bij <SEP> voorkeur <SEP> 0, <SEP> 2-0, <SEP> 4 <SEP> g,
<tb> Kaliumcitraat <SEP> 0, <SEP> 1-1 <SEP> g, <SEP> bij <SEP> voorkeur <SEP> 0, <SEP> 3-0, <SEP> 6 <SEP> g,
<tb> Hepes <SEP> 0, <SEP> 1-10g, <SEP> bij <SEP> voorkeur <SEP> 3, <SEP> 5-5, <SEP> 1 <SEP> g, <SEP>
<tb> Mager <SEP> melkpoeder <SEP> 40-60 <SEP> g, <SEP> bij <SEP> voorkeur <SEP> 45-55 <SEP> g,
<tb> optioneel <SEP> glycerol <SEP> 30-50 <SEP> g, <SEP> bij <SEP> voorkeur <SEP> 40 <SEP> g,
<tb> optioneel, <SEP> antibiotica <SEP> 10-100 <SEP> mg, <SEP> bij <SEP> voorkeur <SEP> 37-78 <SEP> mg, <SEP> en,
<tb> water <SEP> (tot <SEP> 1 <SEP> liter).
<tb>
De hoeveelheid Glucose monohydraat kan zijn 0, 5, 1, 3, 12, 17, 21,33, 40,45 of 50 g.
De hoeveelheid Lactose monohydraat kan zijn 0, 5, 1, 3, 12, 17, 21,33, 40,45 of 50 g.
De hoeveelheid Natiumcitraat dihydraat kan zijn 0, 2, 0, 3, 0, 4, 0, 5, 0, 6, 0, 7, 0, 8, 0, 9 of 1 g.
De hoeveelheid Kaliumcitraa. t kan zijn 0, 2, 0, 3, 0, 4, 0, 5, 0, 6, 0, 7, 0, 8, 0, 9 of 1 g.
De hoeveelheid Hepes kan zijn 0, 3, 0, 5, 1, 1, 2, 2, 3, 3, 5, 4, 9, 5, 1, 7, 5 of 10 g.
De hoeveelheid mager melkpoeder kan zijn 45, 47, 53,55, 56,58 of 60 g De optionele hoeveelheid glycerol kan zijn 10,20, 30,40, 50 g De optionele hoeveelheid antibiotica kan zijn 15,23, 37,42, 56,78, 92 of 100 mg.
Elke specifieke combinatie van de hierboven vermelde, individuele hoeveelheden van glucose monohydraat, lactose monohydraat, natriumcitraat dihydraat, kaliumcitraat, Hepes, mager melkpoeder, de optionele hoeveelheid glycerol en de optionele hoeveelheid antibiotica is opgenomen in de voorgestelde uitvinding.
Volgens een specifieke uitvoering, heeft de uitvinding betrekking op een vloeibare samenstelling (van eender welk volume) omvattende per liter :
EMI3.2
<tb>
<tb> Glucose <SEP> monohydraat <SEP> 27, <SEP> 2 <SEP> g,
<tb> Lactose <SEP> monohydraat <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> g, <SEP>
<tb> Natriumcitraat <SEP> dihydraat <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> g,
<tb> Kaliumcitraat <SEP> 0, <SEP> 41 <SEP> g,
<tb> Hepes <SEP> 4, <SEP> 75 <SEP> g, <SEP>
<tb> Mager <SEP> melkpoeder <SEP> 50 <SEP> g,
<tb> optioneel <SEP> glycerol <SEP> 40 <SEP> g,
<tb> optioneel <SEP> antibiotica <SEP> 50 <SEP> mg, <SEP> en,
<tb> water <SEP> (tot <SEP> 1 <SEP> liter).
<tb>
<Desc/Clms Page number 4>
Het vermelde melkpoeder in de vermelde vloeibare samenstelling kan Gloria@ geproduceerd door Nest) zijn.
Volgens een verdere uitvoering is het vermelde water in de beschreven vloeibare oplossing gedemineraliseerd ; en bij voorkeur gesteriliseerd.
Volgens een verdere uitvoering is het vermelde antibioticum gentamycine. Gentamycine is een ideaal antibioticum voor het gebruik met levende culturen, daar het een breed antibacterieel spectrum en een anti-mycoplasmale activiteit heeft zonder een celtoxiciteit te hebben. Het heeft biologische en biochemische eigenschappen die superieur zijn over het gebruik van penicilline en streptomycine. Normaliter wordt gentamycine gebruikt in een concentratierange van 25-50 jJg/ml. Behalve dat het actief is tegen velerlei gram-positieve en gram-negatieve organismen, is gentamycine actief tegen stammen van Proteus en Staphylococcen, die soms resistent kunnen zijn tegen een mix van penicillinestreptomycine. In tegenstelling tot penicilline en streptomycine, is gentamycine actief tegen Pseudomonas stammen.
Gentamycine is stabiel over een pH bereik van 2 tot 10, hetgeen dus ideaal is voor de verdunner. Gentamycine is stabiel in een groot temperatuurbereik en kan autoclaveren weerstaan. Gentamycine kan dus toegevoegd worden vóór sterilisatie van de oplossing ; andere antibiotica zoals penicilline en streptomycine worden geactiveerd of hebben een vermindering van activiteit van ongeveer 50% bij autoclavering. Gentamycine is ideaal voor transport van klinische stalen waarin een overgroei van bacteriën moet worden vermeden.
Volgens een verdere uitvoering heeft de vloeibare samenstelling een pH tussen 6, 3 en 7, 0.
Mogelijk is de pH 6, 3, 6, 4, 6., 5, 6, 6, 6, 7, 6, 8, 6, 9 or 7, 0.
De huidige uitvinding heeft betrekking op een poedersamenstelling, die bij het oplossen in water een vloeibare samenstelling geeft zoals hierboven beschreven. De vermelde poedersamenstelling kan bewaard worden in een donkere omgeving bij een temperatuur tussen 15 en 25 C, voor een onbepaalde tijd.
Het is wel te verstaan dat om 1 liter vloeibare oplossing van de voorgestelde uitvinding te maken, het poeder volgende componenten omvat
EMI4.1
<tb>
<tb> Glucose <SEP> monohydraat <SEP> 0, <SEP> 1-50 <SEP> g, <SEP> bij <SEP> voorkeur <SEP> 21-33 <SEP> g,
<tb> Lactose <SEP> monohydraat <SEP> 0, <SEP> 1-50 <SEP> g, <SEP> bij <SEP> voorkeur <SEP> 1-2 <SEP> g,
<tb> Natriumcitraat <SEP> dihydraat <SEP> 0, <SEP> 1-1 <SEP> g, <SEP> bij <SEP> voorkeur <SEP> 0, <SEP> 2-0, <SEP> 4 <SEP> g,
<tb>
<Desc/Clms Page number 5>
EMI5.1
<tb>
<tb> Kaliumcitraat <SEP> 0, <SEP> 1-1 <SEP> g, <SEP> bij <SEP> voorkeur <SEP> 0, <SEP> 3-0, <SEP> 6 <SEP> g, <SEP>
<tb> Hepes <SEP> 0, <SEP> 1-10g, <SEP> bij <SEP> voorkeur <SEP> 3, <SEP> 5-5, <SEP> 1 <SEP> g, <SEP>
<tb> Mager <SEP> melkpoeder <SEP> 40-60 <SEP> g, <SEP> bij <SEP> voorkeur <SEP> 45-55 <SEP> g,
<tb> optioneel <SEP> glycerol <SEP> 30-50 <SEP> g, <SEP> bij <SEP> voorkeur <SEP> 40 <SEP> g,
<tb> optioneel, <SEP> antibiotica <SEP> 10-100 <SEP> mg, <SEP> bij <SEP> voorkeur <SEP> 37-78 <SEP> mg.
<tb>
Bij voorkeur omvat de poedersamenstelling
EMI5.2
<tb>
<tb> Glucose <SEP> monohydraat <SEP> 27, <SEP> 2 <SEP> g,
<tb> Lactose <SEP> monohydraat <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> g,
<tb> Natriumcitraat <SEP> dihydraat <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> g,
<tb> Kaliumcitraat <SEP> 0, <SEP> 41 <SEP> g,
<tb> Hepes <SEP> 4, <SEP> 75 <SEP> g,
<tb> Mager <SEP> melkpoeder <SEP> 50 <SEP> g,
<tb> optioneel <SEP> glycerol <SEP> 40 <SEP> g,
<tb> optioneel <SEP> antibiotica <SEP> 50 <SEP> mg,
<tb>
De vakman zal inzien dat om meer of minder van de vloeibare samenstelling van de voorgestelde uitvinding te maken, de hoeveelheden van de individuele bestanddelen van de poedersamenstelling mutatis mutandis aangepast moeten worden.
Bijvoorbeeld, de hierboven vermelde hoeveelheden van de poedersamenstelling moeten door 2 gedeeld worden indien enkel 0, 5 liter van de vloeibare samenstelling van de huidige uitvinding gemaakt wordt.
De uitvinding heeft ook betrekking op een vloeibare samenstelling bereid door het oplossen van de poedersamenstelling zoals hierboven is vermeid, gebruik makend van water, preferentieel gedemineraliseerd en/of gesteriliseerd water.
Volgens een verdere uitvoering kan de vloeibare samenstelling van de voorgestelde uitvinding gesteriliseerd worden door gebruik te maken van een Ultra Hoge Temperatuur (UHT) behandeling.
Volgens een verdere uitvoering wordt de vermelde vioeibare samenstelling zoals ze hierboven beschreven is, bewaard bij ongeveer 5 C. Bij voorkeur gebeurt dit gedurende maximaal 7 dagen.
<Desc/Clms Page number 6>
EMI6.1
Volgens een verdere uitvoering wordt de vermelde vloeibare ze hierboven beschreven is, bewaard tussen bij voorkeur bij Bovendien heeft de uitvinding betrekking op de vloeibare ze hier beschreven is, waarbij de vermelde samenstelling in porties verdeeld is alvorens ze te bewaren.
Volgens een verdere uitvoering laat men de vloeibare samenstelling zoals ze hierboven vermeid is stabiliseren bij kamertemperatuur, bijvoorbeeld bij 150C to 25 C, gedurende minstens 30 min. Wanneer ze gebruikt wordt voor de primaire verdunning van het ruw sperma en het centrifugeren, kan de vloeibare samenstelling verwarmd worden tot ongeveer 37 C. Voor gebruik na de centrifugatiestap wordt de vloeibare samenstelling bij voorkeur gebruikt bij kamertemperatuur.
De uitvinding heeft ook betrekking op een vloeibare samenstelling zoals hierboven vermeid is, gemengd met sperma.
Volgens een verdere uitvoering gebeurt de vermelde menging door het ronddraaien van het recipiënt tijdens de eerste stap van het verwerkingsproces van het sperma, nadat de doses gemaakt zijn. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van een langzaam draaiende rollerbank.
Volgens een verdere uitvoering is het vermelde sperma van dierlijke of humane oorsprong.
Volgens een verdere uitvoering wordt het vermelde dier gekozen uit de groep van schapen, runderen, varkens en paarden.
Volgens een verdere uitvoering is het vermelde sperma gefiltreerd, alvorens het te mengen met bovenvermelde vloeibare samenstelling.
Volgens een verdere uitvoering is het vermelde sperma gefiltreerd, gecentrifugeerd en geconcentreerd alvorens het te mengen met de vloeibare samenstelling zoals hierboven is gedefinieerd.
Volgens een verdere uitvoering wordt er voor de vermelde filtratie van het sperma een gaasdoekje gebruikt.
<Desc/Clms Page number 7>
Volgens een verdere uitvoering is het vermelde sperma gecentrifugeerd, en het bekomen supernatans wordt gedecanteerd of verwijderd door afzuiging na menging met een vloeibare samenstelling zoals hierboven is vermeid.
De sperma bevattende samenstelling kan onmiddellijk gebruikt worden of bewaard worden tussen 2-10 C. Het vermelde sperma kan verdund worden in de vloeibare samenstelling zoals hierboven is beschreven tot een spermacelconcentratie tussen 20-60x106 cellen/ml, bij voorkeur tot 40x106 cellen/ml. Hogere concentraties geven geen probleem, enkel de duur van de bewaarperiode zal korter worden, daar de aanwezige voedingsstoffen sneller uitgeput zullen zijn.
Volgens een verdere uitvoering kan de vermelde sperma bevattende samenstelling onmiddellijk gebruikt worden voor de bevruchting van eicellen, of wordt de oplossing bewaard tussen 2-10 C, bij voorkeur bij ongeveer 5 C in anaërobe condities, door deze langzaam af te koelen bij een snelheid van 0. 2-0. 5 C per minuut.
Het sperma kan voor langere tijd bewaard worden bij temperaturen beneden 0 C, i. e. het sperma wordt bewaard in bevroren toestand. Voor de bewaring beneden 0 C, bevat de hier beschreven vloeibare samenstelling glycerol. Omwille van verschillende redenen, onder andere de bewaringsefficiëntie, is de spermacelconcentratie in de bevroren toestand hoger dan bij de niet-bevroren toestand. Dienovereenkomstig heeft de uitvinding ook betrekking op een vloeibare samenstelling als hier beschreven is, waarbij het vermelde sperma kan verdund worden in de vloeibare samenstelling tot een spermacelconcentratie van ongeveer 80-120x106 spermacellen/ml, bij voorkeur ongeveer 100x106 spermacellen/ml. De spermacelconcentratie kan opnieuw bepaald worden na ontdooien.
Bovendien heeft de uitvinding betrekking op een vioeibare samenstelling die glycerol bevat zoals beschreven infra, waarbij de vermelde samenstelling geconserveerd wordt in vloeibare stikstof bij ongeveer -196oe, bijvoorkeur na een computergestuurd vriesproces.
Dit computergestuurd vriesproces kan uitgevoerd worden door langzaam te koelen met een snelheid van 0. 2-0. 5 C per minuut tot-20 C, waarna het op zeer korte tijd bevroren wordt tot-196 C.
De uitvinding heeft ook betrekking op het gebruik van een samenstelling (vloeibaar of poeder) als spermaverdunner.
<Desc/Clms Page number 8>
De uitvinding heeft ook betrekking op het gebruik van bovenvermelde samenstellingen voor de bewaring van vers sperma.
De uitvinding heeft ook betrekking op het gebruik van bovenvermelde oplossingen voor de bewaring van bevroren sperma, waarbij de vermelde oplossing glycerol bevat.
De uitvinding heeft ook betrekking op het gebruik van bovenvermelde samenstellingen voor het bevruchten van oöcyten.
Verder heeft de uitvinding betrekking op de methode voor de aanmaak van een verdunner voor de bewaring van bevroren sperma omvattende de volgende stappen : a) preparen van een vloeibare samenstelling zoals hierboven gedefinieerd, en, b) optioneel, het maken van een poeder van de vermelde samenstelling voor de lange termijn bewaring van dit poeder, bij voorkeur door gebruik te maken van een vriesdroogproces.
Verder heeft de uitvinding betrekking op een methode voor de bereiding van een spermaoplossing voor de bevruchting van oöcyten omvattende de volgende stappen : a) voorzien van een vloeibare samenstelling zoals hierboven beschreven, of een poedersamenstelling zoals hierboven beschreven, b) indien een poedersamenstelling voorzien is, het poeder oplossen in water, bij voorkeur gedemineraliseerd en/of gesteriliseerd water, waarbij een vloeibare samenstelling bekomen wordt, c) optioneel, de vermelde vloeibare samenstelling bewaren bij ongeveer 4 C voor een maximum van 7 dagen, of bevroren bij -20oC, d) indien de vermelde samenstelling bevroren geweest is, de oplossing laten stabiliseren voor ongeveer 30 minuten bij 18 tot 25 C, na ontdooien, e)
opwarmen van de vermelde vloeibare samenstelling tot werktemperatuur of 37 C gedurende ongeveer 15 minuten per 100 ml, f) voorzien van sperma, g) optioneel, het sperma filtreren, bij voorkeur door gebruik te maken van een gaasdoekje, h) de samenstelling uit stap e) mengen met het sperma van stap f) of g), bij voorkeur tot een concentratie van ongeveer 20-60x106 cellen/ml, bij voorkeur tot 40x106 cellen/ml is bereikt, i) optionele centrifugatie van de oplossing in stap h),
<Desc/Clms Page number 9>
j) optionele verwijdering van het supernatans verkregen bij stap i) door decantateren of afzuiging, k) optioneel verlagen van de temperatuur bij een snelheid van 0. 2-0.
5 C per minuut tot ongeveer 50C bereikt is, en, I) optioneel bewaren van de vermelde samenstelling bij ongeveer 5 C in een anaëroob milieu.
Bovendien heeft de uitvinding betrekking op een methode zoals hierboven is beschreven, waarin de samenstelling in stap e) gemengd wordt met sperma van stap f) of g) tot een spermacelconcentratie van ongeveer 20-60x106 spermacellen/ml, bij voorkeur tot ongeveer 40x1 06 spermacellen/ml.
De huidige uitvinding heeft ook betrekking op een methode voor de bereiding van een sperma-oplossing voor de bevruchting van oöcyten, omvattende de volgende stappen : a) voorzien van een vloeibare samenstelling zoals hierboven beschreven, waarbij de vloeibare samenstelling glycerol bevat, b) optioneel, bewaren van de vermelde vloeibare samenstelling bij ongeveer 4 C gedurende maximaal 7 dagen, of bevroren bij ongeveer-20 C, c) indien de vermelde samenstelling bevroren is geweest, de oplossing laten stabiliseren voor ongeveer 30 minuten bij 18 tot 25 C, na ontdooien, d) de vioeibare samenstelling opwarmen tot werktemperatuur gedurende ongeveer 15 minuten per 100 ml, e) sperma voorzien, f) optioneel het sperma filtreren, bij voorkeur door gebruik te maken van een gaasdoekje, g) de samenstelling van stap d)
mengen met het sperma van stap e) of f), h) optionele centrifugatie van de samenstelling van stap g), i) optionele verwijdering van het supernatans bekomen bij stap h) door decantateren of afzuiging, en het spermacellen bevattende pellet resuspenderen in de vloeibare samenstelling zoals hierboven beschreven, waarbij de vermelde vioeibare samenstelling glycerol omvat, en j) bewaren van de vermelde samenstelling bij ongeveer-196 C, bij voorkeur na een computergecontroleerde invriesprocedure.
Bovendien heeft de uitvinding betrekking op een methode zoals hierboven beschreven, waarbij de vermelde samenstelling in porties verdeeld wordt alvorens te bewaren.
<Desc/Clms Page number 10>
Het mengen van het sperma met de samenstelling van de uitvinding kan op twee tijdstippen gedaan worden tijdens de dosispreparatie. De eerste keer, kan de verdunner voor het bewaren van het vers sperma toegevoegd worden na filtratie van het ejaculaat.
De tweede keer kan de verdunner na centrifugatie en verwijdering van het supernatans toegevoegd worden. Deze keer wordt het spermapellet lichtjes opgeroerd en de verdunner wordt toegevoegd aan de proefbuis. De oplossing voor de tweede behandeling moet opgewarmd worden tot de spermatemperatuur, hetgeen in dit geval ongeveer kamertemperatuur zal zijn. De oplossing is dus lang genoeg op voorhand op kamertemperatuur gezet, om de gewenste temperatuur te bereiken (ongeveer 15 minuten per 100 ml vertrekkende met een oplossing van 37 C, of 30 minuten per 100 ml vertrekkende van een oplossing van 5 C).
Bovendien heeft de voorgestelde uitvinding betrekking op een methode voor het bevruchten van oöcyten, omvattende de stappen zoals hierboven beschreven voor het klaarmaken van de sperma-oplossing voor het bevruchten van de oöcyten, en bovendien optioneel, de samenstelling opwarmen tot ongeveer 20 C tot 37 C en vermelde samenstelling gebruiken voor het bevruchten van oöcyten.
Volgens een verdere uitvoering gebeurt de bevruchting in vitro of in vivo.
De uitvinding heeft ook betrekking op een flesje dat een vloeibare samenstelling omvat zoals hierboven vermeid of een poedersamenstelling zoals hierboven vermeid. Het is wel te verstaan dat de glycerol in een apart flesje verpakt kan zijn, bijkomend bij het flesje met de poedersamenstelling. In dit opzicht kunnen het flesje met de poedersamenstelling en het flesje met het glycerol apart of gecombineerd verkregen worden. Een vakman zal beseffen dat de term"flesje" elk geschikt verpakkingsmateriaal voor het glycerol, de vloeibare samenstelling of de poedersamenstelling volgens de huidige uitvinding kan betekenen, zoals bijvoorbeeld potjes, flesjes, zakken en soortgelijke die gekend zijn in de bedrijfstak.
Volgens een verdere uitvoering omvat het vermelde flesje genoeg vloeistof of poeder om een oplossing te maken die nodig is om sperma te bewaren voor tenminste een oöcyt bevruchting.
<Desc/Clms Page number 11>
Volgens een verdere vormgeving is het vermelde flesje gemaakt van glas, plastic of aluminium.
De uitvinding heeft ook betrekking op een methode om een flesje te bereiden zoals bovenvermeld omvattende de volgende stappen : a) voorzien van een vioeibare samenstelling, zoals hierboven beschreven, of een poedersamenstelling zoals hierboven beschreven en, b) toevoegen van vermelde samenstelling volgens stap a) in een geschikt fiesje.
Gedetailleerde beschrijving Het zal duidelijk zijn dat de hoeveelheden van de vloeibare samenstellingen in de claims per liter gegeven zijn. Met andere woorden, de huidige uitvinding heeft betrekking op vloeibare samenstellingen van eender welk volume, omvattende de hoeveelheden van de componenten zoals beschreven in de conclusies per liter. De hoeveelheid water wordt aangepast tot 1 liter als andere of optionele componenten toegevoegd worden in de vloeibare samenstelling zoals beschreven in de conclusies, bijvoorbeeld, als glycerol en/of antibiotica toegevoegd worden.
Melk heeft effectieve kwaliteiten in zijn gebruik als verdunner. Het is een gebufferd medium en bevat bestanddelen die bescherming aan spermatozoïden of spermacellen bieden, zoals vetten, proteïnen en lactose.
De verdunner beschreven in de huidige uitvinding is bedoeld voor inwendig gebruik. Het is dus essentieel dat men een hygiënische of gezuiverde en veilige oplossing gebruikt.
Deze verdunner biedt een relatieve bevrediging. De verdunner is makkelijk te bereiden en is helder van eigenschap. Sterilisatie van de oplossing na aanmaak is niet nodig, indien de bereiding van de verdunner uitgevoerd wordt in omstandigheden waarbij contaminatie vermeden of voorkomen wordt.
Indien gewenst kan de verdunner gebruikt worden zonder toevoegingen van antibiotica daar deze een effect kunnen hebben op de beweeglijkheid en de vruchtbaarheid van het sperma.
<Desc/Clms Page number 12>
Alvorens het sperma toe te voegen kan sterilisatie van de verdunner door middel van membraanfiltratie overwogen worden. De vloeibare verdunnersamenstelling voor vers sperma (zonder sperma) kan gesteriliseerd worden door gebruik te maken van de Ultra High Temperatuur (UHT) methode, die welbekend is in de industrie.
Lange termijn bewaring van de verdunner kan gebeuren in kleine hoeveelheden bij -20oC.
Het vriesdrogen van de'Verdünner van de voorgestelde uitvinding biedt enkele interessante voordelen. De kans op contaminatie is herleid tot een minimum aangezien enkel de benodigde hoeveelheid opgewarmd wordt net voor gebruik. Een bijkomend voordeel van de verdunner in gevriesdroogde of poedervorm is de haast ongelimiteerde houdbaarheid.
Het vereiste volume van de verdunner kan ook elke dag vers gemaakt worden ; minstens een half uur op voorhand, om zeker te zijn dat het een homogene, gebufferde oplossing is. Bijkomende sterilisatie van de verdunner is niet nodig, wanneer gebruik wordt gemaakt van steriel water en gesteriliseerde recipiënten. Vloeibare verdunneroplossing zoals hierboven beschreven kan onmiddellijk bewaard worden bij 5 C en de vereiste hoeveelheden kunnen opgewarmd worden voor gebruik. Het overschot van de oplossing kan in de koelkast bewaard worden voor minstens 7 dagen, op voorwaarde dat de oplossing niet opgewarmd is geweest. Het overschot van de verdunner die reeds opgewarmd is kan niet herbruikt worden, tenzij gedurende diezelfde dag.
De verdunner van de voorgestelde uitvinding biedt de mogelijkheid het aantal van levensvatbare spermacellen te optimaliseren. Dit betekent dat een aanzienlijke hoeveelheid van doses gemaakt kan worden die een minimale hoeveelheid aan spermatozoïden bevatten die nog steeds oöcyten kunnen bevruchten met een aanvaardbare slagingskans.
De lactose- en glucosehoeveelheden in de vloeibare verdunnersamenstelling zoals hierboven beschreven kunnen aangepast worden. De bewegingsduur van het sperma is voornamelijk afhankelijk van deze hoeveelheden.
Zoals met alle buffers, heeft de verdunner van de huidige uitvinding minstens 30 minuten stabilisatietijd nodig voor gebruik.
<Desc/Clms Page number 13>
Naast het onmiddellijk of semi-direct gebruik, bijvoorbeeld binnen de week, van de sperma-oplossing om eicellen te bevruchten, kan de sperma-oplossing voor langere periodes bewaard worden in bevroren toestand. Over het algemeen wordt het bevroren sperma bewaard bij -196OC, in vloeibare stikstof.
Indien bevroren sperma gebruikt wordt, is de opvolging van de merrie van essentieel belang. Bij voorkeur moet de merrie minstens twee maal per dag gecontroleerd worden.
Inseminatie zou op de ovulatie of zo dicht mogelijk erbij moeten gebeuren.
De volgende voorbeelden van de uitvinding zijn enkel voorbeelden en moeten in geen geval als limiterend gezien worden.
Figuur legendes Figuur 1.
Vergelijking van verschillende verdunners zoals beschreven in voorbeeld 1 (Gentse verdunner (Allmed), Ovusper verdunner (Virbac) en de verdunner van de voorgestelde uitvinding genaamd "Zangersheide" verdunner voor de hengsten Campary Z (A), Zandor Z (B) en Ulrich Z (C).
In de vergelijkende studie is het % rechtlijnigheid groter dan 40% uitgezet voor verschillende incubatietijden van het sperma in de respectievelijke verdunners. De lineariteit of rechtlijnigheid (LIN) is gelijk aan VSLNCL. VSL wijst op de "Straight-line velocity" ofwel de rechtlijnige snelheid en VCL verwijst naar de "Curvilinear velocity" ofwel de kromlijnige of gebogen snelheid. De "curvilinear velocity" (VCL) is gekarakteriseerd als het traject tussen 2 centroiden, en de snelheid op dit traject. De "straight-line velocity" (VSL) is gekarakteriseerd als het lineaire traject tussen het eerste en het laatste centroide in de sequentie, en de snelheid op dit traject.
Figuur 2.
Vergelijking van verschillende verdunners zoals beschreven in voorbeeld 1 (Gentse verdunner (Allmed), Ovusper verdunner (Virbac) en de verdunner van de voorgestelde uitvinding genaamd "Zangersheide" verdunner voor de hengsten Campary Z (A), Zandor Z (B) en Ulrich Z (C).
<Desc/Clms Page number 14>
In de vergelijkende studie is het % "straightness" ofwel rechtheid van de beweging groter dan 50% uitgezet voor verschillende incubatietijdstippen van het sperma in de respectievelijke verdunners. "Straightness" of rechtheid (STR) is gelijk aan VSLNAP. VSL wijst op de "Straight-line velocity" ofwel de rechtlijnige snelheid en VAP wijst op de gemiddelde traject snelheid.
De gemiddelde traject snelheid is gekarakteriseerd als het afgeronde traject tussen twee centroiden, berekend door een van de vele afzwakkingsaigoritmen, en de snelheid langs dit traject. De "straight-line velocity" (VSL) is gekarakteriseerd als het lineaire traject tussen het eerste en het laatste centroide in de sequentie, en de snelheid op dit traject.
Figuur 3.
Vergelijking van verschillende verdunners zoals beschreven in voorbeeld 1 (Gentse verdunner (Allmed), Ovusper verdunner (Virbac) en de verdunner van de voorgestelde uitvinding genaamd "Zangersheide" verdunner voor de hengsten Campary Z (A), Zandor Z (B) en Ulrich Z (C).
In de vergelijkende studie is het % van snelle cellen (met een VSL van meer dan 30 um/s) uitgezet voor verschillende incubatietijdstippen voor de respectievelijke verdunners. De "straight-line velocity" (VSL) is gekarakteriseerd als het lineaire traject tussen het eerste en het laatste centroide in de sequentie, en de snelheid op dit traject Figuur 4.
Overzicht van de drachtige merries. Sperma van verschillende hengsten was verdund in "Zangersheide" verdunner alvorens te insemineren zoals beschreven in voorbeeld 3. Het aantal geïnsemineerde merries is tussen haakjes gegeven. Het aantal merries drachtig na eerste cyclus, tweede of derde tot vijfde cyclussen is aangegeven.
Figuur 5.
Vergelijking van drachtige merries na inseminatie met sperma verdund in ovusper/gentse verdunner of "Zangersheide" verdunner. Sperma van verschillende hengsten was verdund in ovusper/gentse verdunner of "Zangersheide" verdunner voor inseminatie zoals beschreven in voorbeeld 3. Het aantal geïnsemineerde merries is tussen haakjes weergegeven. Het aantal merries drachtig na eerste cyclus, tweede of derde tot vijfde cyclussen is aangegeven.
<Desc/Clms Page number 15>
Tabel.
Vergelijking van drachtige merries na inseminatie met sperma verdund in ovusper/gentse verdunner of "Zangersheide" verdunner. Sperma van verschillende hengsten was verdund in ovusper/gentse verdunner of "Zangersheide" verdunner voor inseminatie zoals beschreven in voorbeeld-3. Het aantal geïnsemineerde merries is tussen haakjes weergegeven. Het aantal merries drachtig na eerste cyclus, tweede of derde tot vijfde cyclussen is aangegeven.
Tabel 2.
Percentages van drachtige merries. Sperma van verschillende hengsten was verdund in "Zangersheide" verdunner alvorens te insemineren zoals beschreven in voorbeeld 3. Het aantal geïnsemineerde merries is tussen haakjes gegeven. Het aantal merries drachtig na eerste cyclus, tweede of derde tot vijfde cyclussen is aangegeven.
Voorbeelden Voorbeeld 1. Bereiding van de gebruikte verdunners gebruikt in de vergelijkende studie De verdunners die gebruikt werden voor de vergelijking met de verdunner van de voorgestelde uitvinding zijn aangekochte verdunners.
Ovusper verdunner voor paardensperma op basis van eigeel wordt verdeeld via VIRBAC (VIRBAC, The Netherlands BV, Barneveld, Nederland). Gentse verdunner, op basis van melk en eigeel, wordt gemaakt op de RUG (RUG Faculteit Diergeneeskunde, Merelbeke, België) en wordt verdeeld door Allmed (Allmed Bvba, Pulle, België).
De volgende verdunnersamenstelling volgens de voorgestelde uitvinding werd gebruikt.
Glucose monohydraat 27, 2 g, Lactose monohydraat 1, 5 g, Natriumcitraat dihydraat 0, 25 g,
EMI15.1
Kaliumcitraat 0, g, Hepes 4, 75 g, Magere melk in poedervorm 50 g, optioneel, antibiotica 50 mg, en, water tot 1 liter.
<Desc/Clms Page number 16>
Voorbeeld 2. Effect van de verschillende verdunners op de beweeglijkheid van de spermatozoïden in vitro Vijf hengsten werden gebruikt in een vergelijkende studie met minstens 3 hengsten per experiment. Na afname werd het sperma gefiltreerd door een gaas, gecentrifugeerd en verdund tot een concentratie van 40x106 cellen per ml in de verschillende geteste verdunners. Vervolgens werden alle stalen bewaard bij 5 C, in een anaëroob milieu.
De analyse van de stalen werd uitgevoerd na een 5 minuten durende opwarming van het staal op 37 C. De kwaliteit van het sperma werd geëvalueerd door middel van een automatische analyse van de spermacellen (Hamilton Thorne Motility Analyzer IVOS ; Orange Medical, Tilburg, Nederland). De spermacellen werden gecontroleerd op 4h, 24h, 48h, 72h, 96h en 120h. Als referentie criterium werd er gebruik gemaakt van de snelle spermatozoïden, dit wil zeggen de spermatozoïden met een snelheid groter dan SO/vm/s.
De resultaten van de vergelijkende experimenten zijn te zien in de figuren 1 tot 3.
In de vroegere vakliteratuur is er geen vraag naar de rechtheid van de spermacellen opgekomen. Op het eerste zicht geeft de verdunner van de onderhavige uitvinding een betere rechtlijnigheid dan de andere verdunners (figuur 2). In het algemeen is er geen opmerkelijk verschil in de snelheid tussen de drie geteste verdunners gedurende de eerste 24 uur. Op latere tijdstippen echter, presteerden de spermacellen in de"Zangersheide" verdunner aanzienlijk beter dan de spermacellen in de gentse verdunner. De rechtlijnigheid (figuur1) kan een belangrijkere parameter zijn dan de snelheid, daar het belangrijkste is dat de spermacellen gaan waar ze nodig zijn, bij de eicel, meer dan de snelheid waarmee ze hun doel bereiken.
Voorbeeld 3. Effect van de verschillende verdunners op de vruchtbaarheid in vivo Dit in vivo experiment wordt uitgevoerd met inseminaties elke 48 uur, vertrekkende met een follikel van 33 mm tot op ovulatie.
<Desc/Clms Page number 17>
Om een hoog drachtigheidspercentage te bekomen, worden de inseminaties preferentieel op de eisprong uitgevoerd.
Het vermogen van de"Zangersheide" verdunners om een stijging in het aantal drachtige merries te krijgen, werd onderzocht. Sperma van verschillende hengsten en van verschillende ejaculaten van deze hengsten werd verdund in"Zangersheide" verdunner zoals aangegeven in voorbeeld 1. Deze oplossingen werden in merries geïnsemineerd, waarna ze opgevolgd werden. Indien de merrie niet drachtig was, werd ze een tweede en indien nodig en derde, vierde of vijfde keer geïnsemineerd. Het aantal drachtigheden werd na elke inseminatie vastgesteld (tabel 2). In totaal werden ejaculaten van 23 hengsten beoordeeld, met een totaal van 1512 inseminaties. De resultaten zijn grafisch weergegeven in figuur 4.
Gebaseerd op deze resultaten is het duidelijk dan het in "Zangersheide"Verdünner verdunde sperma bevredigende tot zeer goede drachtigheidsresultaten geeft.
Vervolgens werd er een vergelijking gemaakt tussen de verdunners om te zien of er een verhoging van drachtigheidspercentage mogelijk was. Sperma van verschillende hengsten en van verschillende ejaculaten van deze hengsten werden bereid in de 3 verschillende verdunners zoals beschreven in voorbeeld 1. Deze samenstellingen werden geïnsemineerd in merries, die nadien werden opgevolgd. Indien de merrie niet drachtig was, werd ze een tweede en indien nodig en derde, vierde of vijfde keer geïnsemineerd.
Het aantal drachtigheden werd na elke inseminatie vastgesteld (tabel 1). In totaal werden ejaculaten van 11 hengsten onderzocht, met een totaal van 1883 inseminaties. De resultaten zijn grafisch voorgesteld in figuur 5. Gebaseerd op deze resultaten is het duidelijk dat het sperma verdund in de"Zangersheide" verdunner resulteert in een hoger drachtigheidspercentage dan de andere geteste verdunners.
<Desc/Clms Page number 18>
TABEL 1
EMI18.1
<tb>
<tb> naam <SEP> hengst <SEP> aantal <SEP> cyclus <SEP> aantal <SEP> cyclus <SEP> cyclus <SEP> cyclus <SEP> totaal <SEP> totaal <SEP>
<tb> dekseizoen <SEP> aantal <SEP> 1ste <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> de <SEP> 2 <SEP> 3+4+5 <SEP> 3+4+5 <SEP> aantal <SEP> %
<tb> (aantal <SEP> merries) <SEP> merries <SEP> cyclus <SEP> % <SEP> cyclus <SEP> % <SEP> totaal <SEP> % <SEP> drachtig <SEP> drachtig <SEP>
<tb> drachtig <SEP> drachtig <SEP> drachtig <SEP> drachtig <SEP> drachtig <SEP> drachtig
<tb> A <SEP> 2001 <SEP> (2) <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 50 <SEP> 1 <SEP> 50 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 100
<tb> A <SEP> 2002 <SEP> (16) <SEP> 16 <SEP> 7 <SEP> 44 <SEP> 5 <SEP> 31 <SEP> 2 <SEP> 13 <SEP> 14 <SEP> 88
<tb> B <SEP> 2001 <SEP> (89) <SEP> 89 <SEP> 33 <SEP> 37 <SEP> 21 <SEP> 24 <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 60 <SEP> 67
<tb> B <SEP> 2002 <SEP> (50)
<SEP> 50 <SEP> 16 <SEP> 32 <SEP> 8 <SEP> 16 <SEP> 9 <SEP> 18 <SEP> 35 <SEP> 70
<tb> C <SEP> 2001 <SEP> (131) <SEP> 131 <SEP> 55 <SEP> 42 <SEP> 24 <SEP> 18 <SEP> 4 <SEP> 3 <SEP> 94 <SEP> 72
<tb> C <SEP> 2002 <SEP> (94) <SEP> 94 <SEP> 50 <SEP> 53 <SEP> 18 <SEP> 19 <SEP> 10 <SEP> 11 <SEP> 79 <SEP> 84
<tb> D <SEP> 2001 <SEP> (98) <SEP> 98 <SEP> 19 <SEP> 19 <SEP> 11 <SEP> 11 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 37 <SEP> 38
<tb> D <SEP> 2002 <SEP> (142) <SEP> 142 <SEP> 56 <SEP> 39 <SEP> 22 <SEP> 15 <SEP> 31 <SEP> 22 <SEP> 111 <SEP> 78
<tb> E <SEP> 2001 <SEP> (246) <SEP> 246 <SEP> 110 <SEP> 45 <SEP> 52 <SEP> 21 <SEP> 5 <SEP> 2 <SEP> 178 <SEP> 72
<tb> E <SEP> 2002 <SEP> (273) <SEP> 273 <SEP> 148 <SEP> 54 <SEP> 63 <SEP> 23 <SEP> 14 <SEP> 5 <SEP> 227 <SEP> 83
<tb> F <SEP> 2001 <SEP> (27) <SEP> 27 <SEP> 12 <SEP> 44 <SEP> 6 <SEP> 22 <SEP> 1 <SEP> 4 <SEP> 20 <SEP> 74
<tb> F <SEP> 2002 <SEP> (26)
<SEP> 26 <SEP> 13 <SEP> 50 <SEP> 5 <SEP> 19 <SEP> 5 <SEP> 19 <SEP> 23 <SEP> 88
<tb> G <SEP> 2001 <SEP> (164) <SEP> 164 <SEP> 48 <SEP> 29 <SEP> 22 <SEP> 13 <SEP> 5 <SEP> 3 <SEP> 89 <SEP> 54
<tb> G <SEP> 2002 <SEP> (189) <SEP> 189 <SEP> 67 <SEP> 35 <SEP> 37 <SEP> 20 <SEP> 30 <SEP> 16 <SEP> 142 <SEP> 75
<tb> H <SEP> 2001 <SEP> (56) <SEP> 56 <SEP> 21 <SEP> 38 <SEP> 12 <SEP> 21 <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> 41 <SEP> 73
<tb> H <SEP> 2002 <SEP> (23) <SEP> 23 <SEP> 13 <SEP> 57 <SEP> 2 <SEP> 9 <SEP> 2 <SEP> 9 <SEP> 17 <SEP> 74
<tb> 1 <SEP> 2001 <SEP> (29) <SEP> 29 <SEP> 7 <SEP> 24 <SEP> 8 <SEP> 28 <SEP> 2 <SEP> 7 <SEP> 18 <SEP> 62
<tb> I <SEP> 2002 <SEP> (53) <SEP> 53 <SEP> 10 <SEP> 19 <SEP> 12 <SEP> 23 <SEP> 8 <SEP> 15 <SEP> 32 <SEP> 60
<tb> J <SEP> 2001 <SEP> (29) <SEP> 29 <SEP> 16 <SEP> 55 <SEP> 3 <SEP> 10 <SEP> 1 <SEP> 3 <SEP> 21 <SEP> 72
<tb> J <SEP> 2002 <SEP> (72)
<SEP> 72 <SEP> 34 <SEP> 47 <SEP> 15 <SEP> 21 <SEP> 9 <SEP> 13 <SEP> 58 <SEP> 81
<tb> K <SEP> 2001 <SEP> (36) <SEP> 36 <SEP> 16 <SEP> 44 <SEP> 8 <SEP> 22 <SEP> 1 <SEP> 3 <SEP> 26 <SEP> 72
<tb> K <SEP> 2002 <SEP> (38) <SEP> 38 <SEP> 16 <SEP> 42 <SEP> 14 <SEP> 37 <SEP> 2 <SEP> 5 <SEP> 32 <SEP> 84
<tb>
<Desc/Clms Page number 19>
TABEL2
EMI19.1
<tb>
<tb> naam <SEP> hengst <SEP> aantal <SEP> cyclus <SEP> aantal <SEP> cyclus <SEP> cyclus <SEP> cyclus <SEP> aantal <SEP> aantal <SEP> aantal <SEP> totaal <SEP> totaal <SEP>
<tb> dekseizoen <SEP> aantal <SEP> 1ste <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> de <SEP> 2 <SEP> 3+4+5 <SEP> 3+4+5 <SEP> drachtig <SEP> drachtig <SEP> drachtig <SEP> aantal <SEP> %
<tb> (aantal <SEP> merries)
<SEP> merries <SEP> cyclus <SEP> % <SEP> cyclus <SEP> % <SEP> totaal <SEP> % <SEP> cyclus <SEP> cyclus <SEP> cyclus <SEP> drachtig <SEP> drachtig
<tb> drachtig <SEP> drachtig <SEP> drachtig <SEP> drachtig <SEP> drachtig <SEP> drachtig <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP>
<tb> L <SEP> (97) <SEP> 97 <SEP> 54 <SEP> 56 <SEP> 18 <SEP> 19 <SEP> 9 <SEP> 9 <SEP> 7 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 81 <SEP> 84
<tb> M <SEP> (90) <SEP> 90 <SEP> 38 <SEP> 42 <SEP> 18 <SEP> 20 <SEP> 12 <SEP> 13 <SEP> 8 <SEP> 4 <SEP> 0 <SEP> 70 <SEP> 78
<tb> N <SEP> (16) <SEP> 16 <SEP> 10 <SEP> 63 <SEP> 2 <SEP> 13 <SEP> 1 <SEP> 6 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 13. <SEP> 81 <SEP>
<tb> 0 <SEP> (19) <SEP> 19 <SEP> 7 <SEP> 37 <SEP> 5 <SEP> 26 <SEP> 1.
<SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 13 <SEP> 68
<tb> P <SEP> (17) <SEP> 17 <SEP> 8 <SEP> 47 <SEP> 4 <SEP> 24 <SEP> 3 <SEP> 18 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 15 <SEP> 88
<tb> Q <SEP> (154) <SEP> 154 <SEP> 76 <SEP> 49 <SEP> 31 <SEP> 20 <SEP> 18 <SEP> 12 <SEP> 13 <SEP> 4 <SEP> 1 <SEP> 129 <SEP> 84
<tb> R <SEP> (15) <SEP> 15 <SEP> 6 <SEP> 40 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 13 <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 9 <SEP> 60
<tb> S <SEP> (43) <SEP> 43 <SEP> 18 <SEP> 42 <SEP> 5 <SEP> 12 <SEP> 6 <SEP> 14 <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 29 <SEP> 67
<tb> T <SEP> (28) <SEP> 28 <SEP> 18 <SEP> 64 <SEP> 4 <SEP> 14 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 22 <SEP> 79
<tb> U <SEP> (1) <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 100 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 100
<tb> V <SEP> (39)
<SEP> 39 <SEP> 13 <SEP> 33 <SEP> 12 <SEP> 31 <SEP> 3 <SEP> 8 <SEP> 3 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 28 <SEP> 72
<tb> A <SEP> (16) <SEP> 16 <SEP> 7 <SEP> 44 <SEP> 5 <SEP> 31 <SEP> 2 <SEP> 13 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 14 <SEP> 88
<tb> B <SEP> (50) <SEP> 50 <SEP> 16 <SEP> 32 <SEP> 8 <SEP> 16 <SEP> 9 <SEP> 18 <SEP> 7 <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 35 <SEP> 70
<tb> C <SEP> (94) <SEP> 94 <SEP> 50 <SEP> 53 <SEP> 18 <SEP> 19 <SEP> 10 <SEP> 11 <SEP> 7 <SEP> 3 <SEP> 0 <SEP> 79 <SEP> 84
<tb> D <SEP> (142) <SEP> 142 <SEP> 56 <SEP> 39 <SEP> 22 <SEP> 15 <SEP> 31 <SEP> 22 <SEP> 27 <SEP> 4 <SEP> 0 <SEP> 111 <SEP> 78
<tb> E <SEP> (273) <SEP> 273 <SEP> 148 <SEP> 54 <SEP> 63 <SEP> 23 <SEP> 14 <SEP> 5 <SEP> 10 <SEP> 4 <SEP> 0 <SEP> 227 <SEP> 83 <SEP>
<tb> W <SEP> (17) <SEP> 17 <SEP> 5 <SEP> 29 <SEP> 4 <SEP> 24 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 9 <SEP> 53
<tb> F <SEP> (26)
<SEP> 26 <SEP> 13 <SEP> 50 <SEP> 5 <SEP> 19 <SEP> 5 <SEP> 19 <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 23 <SEP> 88
<tb> G <SEP> (189) <SEP> 189 <SEP> 67 <SEP> 35 <SEP> 37 <SEP> 20 <SEP> 30 <SEP> 16 <SEP> 27 <SEP> 3 <SEP> 0 <SEP> 142 <SEP> 75
<tb> H <SEP> (23) <SEP> 23 <SEP> 13 <SEP> 57 <SEP> 2 <SEP> 9 <SEP> 2 <SEP> 9 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 17 <SEP> 74
<tb> l <SEP> (53) <SEP> 53 <SEP> 10 <SEP> 19 <SEP> 12 <SEP> 23 <SEP> 8 <SEP> 15 <SEP> 6 <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 32 <SEP> 60
<tb> J <SEP> (72) <SEP> 72 <SEP> 34 <SEP> 47 <SEP> 15 <SEP> 21 <SEP> 9 <SEP> 13 <SEP> 6 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 58 <SEP> 81
<tb> K <SEP> (38) <SEP> 38 <SEP> 16 <SEP> 42 <SEP> 14 <SEP> 37 <SEP> 2 <SEP> 5 <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 32 <SEP> 84
<tb>