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PEPTIDESANTITHROMBOTIQUES.
L'invention concerne l'utilisation d'un peptide composé d'une bétoine associée à un acide aminé par une liaison peptidique, afin d'éliminer ou de prévenir les atteintes physiopathologiques vasculaires résultant de l'ischémie et de la thrombose.
Selon l'invention les acides aminés pouvant être associés à la bétaine par une liaison peptidique sont : l'aspartate, glutamate, lysine, arginine, histidine, sérine, threonine, aspargine, glutamine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, méthionine, phénylalanine, glycine, cystéine, tyrosine et tryptophane.
L'invention se rapporte à l'activité curative et préventive de ce peptide dans la pathogénie des maladies thromboemboliques et hémostatiques d'origine artérielles ou veineuses. En effet il apparait que l'administration d'un peptide, composé d'une bétaine associée à un acide aminé par une liason peptidique, évite la formation du thrombus veineux ou artériel et exerce une puissante action thrombolytique et fibrinolytique en dissolvant le caillot ou le thrombus déjà formé.
L'invention consiste en ce que le peptide exerce une activité tant à l'état préthrombotique qu'à l'état post-thrombotique. En effet, le peptide a une activité préventive en empêchant la formation des thrombi et une activité curative en inhibant la thrombose. L'intérêt de l'invention réside dans le fait que l'utilisation de ce peptide ne présente aucun risque hémorragique par opposition aux molécules et traitements actuellement utilisés.
Les thromboses vasculaires sont une réponse de l'organisme face à l'agression de la paroi du vaisseau et de son contenu cellulaire et plasmatique. La thrombose est une masse organisée d'éléments sanguins (plaquettes, globules rouges et globules blancs), de fibrine et d'autres protéines plasmatiques, qui est déposée à la surface ou qui obstrue la lumière du système cardio-vasculaire. Les mécanismes de la thrombose ressemblent à ceux de l'hémostase, mais sont pathologiques par la localisation intravasculaire anormale.
Les thromboses et les embolies sont la cause principale des complications cliniques des maladies cardio-vasculaires et de l'athérosclérose.
Il existe plusieurs types de thromboses qui peuvent survenir au niveau des artères, des veines, de la microcirculation des organes, des cavités du coeur et des surfaces artificielles en contact avec le sang. Les thromboses vasculaires sont une réponse de l'organisme à l'agression de la paroi du vaisseau et de son contenu cellulaire et plasmatique. La thrombose est une masse organisée d'éléments sanguins (plaquettes, globules rouges et globules blancs), de fibrine et d'autres protéines plasmatiques, qui est déposée à la surface ou qui obstrue la lumière du système cardio-vasculaire. Les mécanismes de la thrombose ressemblent à ceux de l'hémostase, mais sont pathologiques par la localisation intravasculaire anormale.
Les thromboses et les embolies sont la cause principale des complications cliniques des maladies cardio-vasculaires et de l'athérosclérose.
D'après Virchow, au moins trois types de facteurs thrombogènes déterminent la localisation, l'extension et la régression d'une thrombose
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- Les facteurs hémodynamiques et rhéologiques ; - La lésion endothéliale ; - L'activation des constituants du sang, en particulier des plaquettes et de la coagulation qui aboutit à la formation de thrombine.
La maladie thromboembolique, d'origine artérielle ou veineuse reste la cause principale de décès dans les pays développés.
La thrombose artérielle est souvent une complication de l'athérosclérose alors que la thrombose veineuse résulte plus fréquemment d'un déficit en un inhibiteur de la coagulation et de la fibrinolyse ou d'une stase. En effet, si tous les deux résultent d'une interaction entre le sang et la paroi vasculaire, la formation d'une thrombose veineuse et/ou par une anomalie de l'hémostase. La thrombose artérielle est le plus souvent secondaire à une anomalie pariétale et implique principalement les plaquettes sanguines. Elle contribue à une large variété de tableaux cliniques selon les lits artériels intéressés par l'interruption de la vascularisation. La thrombose peut atteindre principalement les artères cardiaques (coronaires), les artères des membres inférieurs, cérébrales ou digestives.
Ainsi, la maladie artérielle favorise la formation du thrombus lui même responsable de la majorité des occlusions vasculaires terminales. De plus la participation du désordre de l'hémostase et du thrombus formé à d'autres lésions vasculaires est manifeste : aggravation des lésions de la paroi, ischémie et troubles de la microcirculation.
On peut distinguer trois stratégies thérapeutiques dans la prévention des accidents liés aux thromboses.
Les anticoagulants. Ils constituent l'élément majeur de la prise en charge d'un patient présentant une affection thromboembolique. L'héparine et ses dérivées sont couramment utilisés. Cependant, l'utilisation des héparines peut engendrer deux complications majeures, l'hémorragie ou la thrombopenie.
Les anti-vitamines K (AVK). Prescrites pour des traitements au long cours, elles ne peuvent être utilisées dans l'urgence et ne peuvent être prescrites simultanément avec d'autres anti-agrégants dont elles potentialisent l'effet hémorragique.
Les anti-agrégants plaquetaires. Prescrits pour prévenir la thrombose artérielle liée à l'athérosclérose. Actuellement les principaux inhibiteurs du fonctionnement plaquetaire prescrits sont : l'aspirine, la ticlopidine, le dipyridamole, et certains anti-inflammatoires non stéroïdiens comme le flurbiprofène, la prostacycline. Ces traitements possèdent une réelle efficacité toute en présentant des effets indésirables sur les patients à terrains allergiques ou hémorragiques.
Tous ces traitements malgré leurs efficacité nécessitent des précautions particulières dans leurs utilisations, telles que l'administration d'antidotes, les problèmes de surdosages et les effets secondaires non désirables. Il était donc intéressant de trouver une molécule à haut potentiel antithrombotique sans effets indésirables.
La bétaine est connue pour son rôle osmoprotecteur, il est apparu de manière tout à fait inattendue qu'en associant un acide aminé par une liaison peptidique à la bétaine, le peptide ainsi obtenu possédait un haut potentiel d'efficacité contre les risques thromboemboliques et ischémiques tout en ne présentant aucun effet indésirable.
En effet, les résultats expérimentaux liés à la toxicité de la molécule démontrent sa parfaite innocuité
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Il apparaît donc que le peptide peut être utilisée pour diverses applications cliniques telles que les maladies cardio-vasculaires (infarctus, angine de poitrine, anévrisme, athérosclérose, embolie pulmonaire, phlébite, insuffisance cardiaque), - Les accidents de circulation sanguine dans le cerveau et leur prévention, - les chocs post-traumatiques d'origine chirurgicale ou non.
- La prévention des accidents de microcirculation dans les cas suivants : diabète, hémophilie, chimiothérapie, âge, contraception orale par les oestrogènes, obésité, tabagisme, prothèse.
La prévention des risques liés à l'administration des produits de contraste ioniques et non ioniques.
MATERIELETMETHODE
Al Principe
Dans ce modèle, la lésion de la paroi vasculaire est induite par un faisceau laser. Ce faisceau d'un diamètre de 2 micromètres, entraîne une lésion limitée de l'endothélium vasculaire (seulement 1 à 2 cellules sont détruites). La mise a nu du sous-endothélium, surface thrombogène, amène l'adhésion des plaquettes par l'intermédiaire de la glycoprotéine Ib. Cette adhésion des plaquettes est suivie par leur activation. Elle forment des pseudopodes et sécrètent le contenu de leurs granules. Cette activation entraîne l'apparition de la glycoprotéine IIb-IDa nécessaire à l'agrégation des plaquettes entre elles. Cela en présence du fibrinogène.
Cette lésion est induite au niveau de la microcirculation mésentérique du rat. Elle est immédiatement suivie par la formation d'un thrombus (quelques secondes). Ce thrombus qui grossit rapidement, sous l'effet du flux sanguin, embolise avant de se former à nouveau.
B/Méthode b : Animaux Cette étude nécessite des rats Wistar mâles. Leur poids est compris entre 250 et 300 grammes.
L'évaluation de l'effet du peptide a été mené conjointement à l'étude de deux molécules pharmacologiquement actives utilisées comme référence : l'acide acétylsalicylique et l'héparine.
Après une période de stabulation de 8 jours, les rats sont soumis à un jeûne de 12 heures. Ils sont ensuite anesthésiés. Une laparotomie médiane est effectuée et le mésentère peut alors être dégagé, puis placé sur la platine du microscope. Trois artérioles et une veinule, d'un diamètre compris entre 15 et 25 um, sont visualisées puis analysées pour chaque rat. Au cours de l'expérience, le mésentère sera régulièrement humidifié avec une solution isotonique de chlorure de sodium à 0.9% maintenue à 37 C, afin d'éviter son dessèchement. En effet, l'éclairement de la préparation est réalisé grâce à une lampe halogène puissante qui peut assécher le mésentère. La puissance du faisceau laser à la sortie du tube est de 120 mW, et ce faisceau est appliqué sur l'artériole pendant 1/15éme de seconde.
Ces paramètres ont fait l'objet d'études préliminaires et ont été validés.
Dans les exemples suivants on étudiera le peptide glycine-bétaïne dont la formule est :
EMI3.1
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EXEMPLES : Exemple 1 : Evaluation du nombre d'emboles et de la durée d'embolisation après altération vasculaire par les tirs lasers
EMI4.1
<tb>
<tb> Nombre <SEP> d'emboles <SEP> Durée <SEP> d'embolisation
<tb> (minutes)
<tb> Témoin <SEP> négatif <SEP> (NaCl <SEP> 5. <SEP> 33 <SEP> ¯0.58 <SEP> 2 <SEP> ¯ <SEP> 0
<tb> 0.
<SEP> 9%)
<tb> Glycine-bétaïne <SEP> 5mg/kg <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 0
<tb> Acide <SEP> acétylsalicylique <SEP> 11 <SEP> 0,33 <SEP> 0, <SEP> 58
<tb> 100mg/kg
<tb> Héparine <SEP> 2 <SEP> mg/kg <SEP> 2,67 <SEP> 0, <SEP> 58 <SEP> 1 <SEP> 0
<tb>
Les résultats montrent que le peptide réduit d'une façon significative le nombre d'emboles et le temps d'embolisation après altération vasculaire par des tirs lasers.
Exemple 2 : Evaluation du temps d'hémorragie provoquée
EMI4.2
<tb>
<tb> THP <SEP> (secondes)
<tb> Témoin <SEP> négatif <SEP> (NaCt101. <SEP> 52 <SEP> 5. <SEP> 7
<tb> 0.9%)
<tb> Glycine-bétaïne <SEP> 5mg/kg <SEP> 95 <SEP> 5
<tb> Acide <SEP> acétylsalicylique <SEP> 276,67 <SEP> 20, <SEP> 82
<tb> 100mg/kg
<tb> Héparine <SEP> 2 <SEP> mglkg <SEP> 313, <SEP> 33 <SEP> 20
<tb>
Les résultats montrent que le peptide diminue significativement le temps d'hémorragie provoquée comparativement aux témoins positifs.
Exemple 3 : Evaluation de l'agrégation plaquetaire après altération vasculaire par les tirs lasers
EMI4.3
<tb>
<tb> Amplitude <SEP> (Ohms) <SEP> Vélocité <SEP> (Ohms/min)
<tb> Témoin <SEP> (NaCI <SEP> 0.9%) <SEP> 13 <SEP> 19T
<tb> Glycine-bétaïe <SEP> 5mg/kg <SEP> 0. <SEP> 66115 <SEP> 1. <SEP> 66 <SEP> ¯ <SEP> 1. <SEP> 15
<tb> Acide <SEP> acétylsalicylique <SEP> 2, <SEP> 33 <SEP> ¯ <SEP> 2.08 <SEP> 2 <SEP> ¯ <SEP> 1
<tb> IQOmg/kg
<tb> Héparine <SEP> 2 <SEP> mg/kg <SEP> 4.33 <SEP> 0. <SEP> 57 <SEP> 2.66 <SEP> 0. <SEP> 50
<tb>
<Desc/Clms Page number 5>
Les résultats montrent que le peptide diminue significativement les paramètres de l'agrégation plaquetaire comparativement aux témoins positifs.
Exemple 4 : Evaluation de l'effet de la vis à vis des cellules sanguines a/Dénombrement des plaquettes
EMI5.1
<tb>
<tb> Nombre <SEP> de <SEP> plaquettes <SEP> zu
<tb> Témoin <SEP> négatif <SEP> (NaCl <SEP> 788 <SEP> ¯ <SEP> 30. <SEP> 14
<tb> 0.9%)
<tb> Glycine-bétaine <SEP> 5mg/kg804. <SEP> 67 <SEP> 20.03
<tb> Acide <SEP> acétylsalicylique <SEP> 855.33 <SEP> # <SEP> 63.17
<tb> 100mg/kg
<tb> Héparine <SEP> 2 <SEP> mg/kg <SEP> 777.33 <SEP> ¯ <SEP> 6.43
<tb>
EMI5.2
b/Dénombrement des globules blancs
EMI5.3
<tb>
<tb> Nombre <SEP> des <SEP> globules <SEP> blancs
<tb> (109)
<tb> Témoin <SEP> négatif <SEP> (NaCI <SEP> 5 <SEP> 03 <SEP> 0. <SEP> 20
<tb> 0.9%)
<tb> Glycine-bétaïne <SEP> 5mg/kg <SEP> 4. <SEP> 43¯0 <SEP> 32
<tb> Acide <SEP> acétylsalicylique <SEP> 4. <SEP> 33 <SEP> 1. <SEP> 00
<tb> 100mg/kg
<tb> Héparine <SEP> 2 <SEP> mg/kg <SEP> 5.
<SEP> 80 <SEP> : <SEP> f <SEP> : <SEP> 0. <SEP> 10
<tb>
ci Dénombrement des globules rouges
EMI5.4
<tb>
<tb> Nombre <SEP> des <SEP> globules
<tb> rouges <SEP> (09)
<tb> Témoin <SEP> négatif <SEP> (NaCl <SEP> 6.56 <SEP> 0. <SEP> 15
<tb> 0.9%)
<tb> Glycine-bétaïne <SEP> 5mg/kg <SEP> 6 <SEP> 19 <SEP> ¯ <SEP> 0 <SEP> 25
<tb> Acide <SEP> acétylsalicylique <SEP> 6 <SEP> 15 <SEP> 0 <SEP> 31
<tb> 100mg/kg
<tb> Héparine <SEP> 2 <SEP> mg/kg <SEP> 6. <SEP> 20 <SEP> ¯ <SEP> 0 <SEP> 20
<tb>
<Desc/Clms Page number 6>
Exemple 5 :
Bilan biologique a/Temps de Quick
EMI6.1
<tb>
<tb> TQ <SEP> (secondes)
<tb> Témoin <SEP> négatif <SEP> (NaCt171
<tb> 0.9%)
<tb> Glycine-bétaïne <SEP> 5mg/kg <SEP> 16.9 <SEP> 1. <SEP> 05
<tb> Acide <SEP> acétylsalicylique <SEP> 18. <SEP> 33 <SEP> ¯ <SEP> 2. <SEP> 08
<tb> 100mg/kg
<tb> Héparine <SEP> 2 <SEP> mg/kg <SEP> 29. <SEP> 50 <SEP> 0 <SEP> 52
<tb>
bl Temps de céphaline activée (TCA)
EMI6.2
<tb>
<tb> TCA <SEP> (secondes)
<tb> Témoin <SEP> négatif <SEP> (NaCI <SEP> 20. <SEP> 5 <SEP> ¯ <SEP> 0. <SEP> 5
<tb> 0.9%)
<tb> Glycine-bétaïne <SEP> 5mg/kg <SEP> 39. <SEP> 9 <SEP> ¯ <SEP> 1. <SEP> 05
<tb> Acide <SEP> acétylsalicylique <SEP> 27. <SEP> 26 <SEP> ¯ <SEP> 1.1
<tb> 100mglkg
<tb> Héparine <SEP> 2 <SEP> mg/kg <SEP> 39.
<SEP> 46 <SEP> ¯ <SEP> 1.36
<tb>
c/Dosage du fibrinogène
EMI6.3
<tb>
<tb> Fibrinogène <SEP> (g/l)
<tb> Témoin <SEP> négatif <SEP> (NaCt2. <SEP> 45 <SEP> ¯ <SEP> 0. <SEP> 19
<tb> 0. <SEP> 9%)
<tb> Glycine-bétaïne5mg/kg <SEP> 1. <SEP> 7 <SEP> 0. <SEP> 1
<tb> Acide <SEP> acétylsalicylique <SEP> 2. <SEP> 19 <SEP> ¯ <SEP> 0.33
<tb> 100mg/kg
<tb> Héparine <SEP> 2 <SEP> mg/kg <SEP> 2. <SEP> 13 <SEP> 0 <SEP> 25
<tb>
<Desc/Clms Page number 7>
d/Dosage de l'alpha.2-Antiplasmine (α2AP)
EMI7.1
<tb>
<tb> a <SEP> 2AP <SEP> (%)
<tb> Témoin <SEP> négatif <SEP> (Na <SEP> CI <SEP> 30. <SEP> 160. <SEP> 85
<tb> 0.9%)
<tb> Glycine-bétaine <SEP> 5mg/kg <SEP> 29. <SEP> 7 <SEP> 0 <SEP> 68
<tb> Acide <SEP> acétylsalicylique <SEP> 29. <SEP> 36 <SEP> : <SEP> : <SEP> 1 <SEP> :
<SEP> 0. <SEP> 92
<tb> 100mg/kg
<tb> Héparine <SEP> 2 <SEP> mg/kg <SEP> 29 <SEP> 4 <SEP> 101
<tb>
e/Dosage de l'Antithrombine 3 (AT3)
EMI7.2
<tb>
<tb> AT3 <SEP> (%)
<tb> Témoin <SEP> négatif <SEP> (NaCI <SEP> 863
<tb> 0.9%)
<tb> Glycine-bétaïne <SEP> 5mg/kg <SEP> 89. <SEP> 5 <SEP> 1. <SEP> 37
<tb> Acide <SEP> acétylsalicylique <SEP> 85. <SEP> 33 <SEP> 351
<tb> 100mg/kg
<tb> Héparine <SEP> 2 <SEP> mg/kg <SEP> 77.66 <SEP> : <SEP> ! <SEP> : <SEP> 1. <SEP> 52
<tb>
Commentaire : Dans les études menées sur la base du modèle de thrombose expérimentale induite par lésion endothéliale, l'application d'un tir laser sur la paroi vasculaire provoque une destruction limitée de quelques cellules endothéliales.
Cette destruction provoque l'activation du complexe plaquette-paroi vasculaire qui est immédiatement suivie par l'activation de l'hémostase plasmatique déclenchant ainsi le processus d'apparition d'une thrombose. Rappelons que ce modèle expérimental, largement utilisé par ailleurs (Seiffge D. et coll., 1989 ; Weichter W. et coll., 1983), est régulé par des inhibiteurs endogènes de l'agrégation plaquetaire : prostacycline et ses analogues (Maraganore J. M., 1993). D'où l'intérêt représenté par l'utilisation de ce modèle pour étudier les effets des produits de contraste, car il permet l'observation directe de la formation du thrombus au site de la lésion vasculaire. Ces résultats expliquent l'apparition d'occlusions thrombotiques lors des angioplasties, surtout chez des patients, dont l'endothélium est déjà endommagé ou lésé.
L'angioplastie coronaire cause une dénudation de l'endothélium, exposant le collagène, l'élastine et les cellules musculaires lisses au sang circulant, en analogie avec le
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modèle de thrombose expérimentale utilisé. Ainsi, l'apparition de nouveaux thrombi est plus élevée chez des patients présentant un infarctus du myocarde récent ou une plaque coronaire excentrique.
Le traitement avec le peptide inhibe les complications thromboemboliques déclenchées par les tirs lasers. En effet, ce traitement avec le peptide, avant les tirs lasers diminue l'adhésion des plaquettes et leur agrégation au niveau vasculaire.
Le traitement avec le peptide inhibe les complications thromboemboliques. En effet, ce traitement avec le peptide, avant l'induction de la thrombose, a montré un haut potentiel antithrombotique au niveau de tous les paramètres entrant en jeu dans le processus de la formation du thrombus. De plus, les résultats des paramètres biologiques démontrent la parfaite innocuité du peptide qui contrairement aux produits de référence utilisés (aspirine et héparine), n'induit aucun effet secondaire (voir exemples). Ces caractéristiques confèrent au peptide, en plus de son efficacité démontrée, la particularité de pouvoir être administré aux personnes à risque (diabétiques, hémophiles, allergiques).
Le peptide selon l'exemple 1 réduit très significativement le nombre d'emboles par rapport au témoin. Le peptide n'a pas d'activité hémorragique (exemple 2). L'exemple 3 démontre l'activité anti-agrégante du peptide. Les résultats de l'exemple 4 démontrent qu'il n'y a pas de différence dans le dénombrement des cellules sanguines par rapport au témoin. Le résultat expérimental de l'exemple 5, c, démontre un haut potentiel fibrinolytique et antiinflammatoire du peptide.
Il est à noter que, dans les mêmes conditions expérimentales, pour la conservation du sang le peptide est apparu comme possédant un haut pouvoir anti-coagulant comparativement à des tubes héparinés ou contenant de l'E. D. T. A. Les doses actives du peptide sont apparues entre 3 et 5 mg par tube à hémolyse. Ce résultat expérimental démontre un haut potentiel anticoagulant du peptide. L'utilisation du peptide comme anticoagulant peut être revendiquée, tant pour le traitement du corps humain, in vivo, que pour la conservation du sang ex vivo, pour la circulation extracorporelle en chirurgie ainsi que la conservation d'organes pour les transplantations.
Dans le cadre de la recherche sur les effets anti-thrombotiques et dans le souci de compléter l'approche de l'efficacité du peptide glycine-bétaine, nous avons évalué l'effet de ce peptide sur l'augmentation des risques thromboemboliques liés à l'utilisation des produits de contraste connus pour leurs pouvoirs prothrombotiques.
Deux produits de contrastes ont été étudiés : Hexabrix@ (ionique) et Iopamidol @ (non ionique)
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Exemple 6 : Evaluation du nombre d'emboles et de la durée d'embolisation après altération vasculaire par les tirs lasers et administration des produits de contrastes.
EMI9.1
<tb>
<tb>
Nombre <SEP> d'emboles <SEP> Durée <SEP> d'embolisation
<tb> (minutes)
<tb> Témoin <SEP> négatif <SEP> (NaCl <SEP> 5. <SEP> 33 <SEP> 0. <SEP> 58 <SEP> 2 <SEP> ¯ <SEP> 0
<tb> 0.9%)
<tb> Hexabrix# <SEP> 8 <SEP> # <SEP> 1 <SEP> 3.67 <SEP> # <SEP> 0. <SEP> 58
<tb> Iopamidol# <SEP> 11.67¯0.50 <SEP> 6.33 <SEP> ¯ <SEP> 0, <SEP> 52
<tb> Glycine-bétaine <SEP> 5mg/kg <SEP> + <SEP> 4 <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> ¯ <SEP> 0
<tb> Hexabrix#
<tb> Glycine-bétaïne <SEP> 5mg/kg <SEP> + <SEP> 5 <SEP> 33 <SEP> ¯ <SEP> 0.58 <SEP> 2.33 <SEP> ¯ <SEP> 0 <SEP> 48
<tb> Iopamidol#
<tb>
Exemple 7 :
Evaluation du temps d'hémorragie provoquée (THP)
EMI9.2
<tb>
<tb> THP <SEP> (secondes)
<tb> Témoin <SEP> négatif <SEP> (NaCl <SEP> 101.52 <SEP> ¯ <SEP> 5. <SEP> 7
<tb> 0.9%)
<tb> Hexabrix# <SEP> 195 <SEP> 13. <SEP> 23
<tb> Iopamido <SEP> ! <SEP> @ <SEP> 128 <SEP> 7.64
<tb> Glycine-bétaïne <SEP> 5mg/kg <SEP> + <SEP> 150 <SEP> ¯ <SEP> 5
<tb> Hexabrix#
<tb> Glycine-bétaïne <SEP> 5mg/kg <SEP> + <SEP> 111 <SEP> ¯ <SEP> 6.60
<tb> Iopamido <SEP> ! <SEP> @
<tb>
Exemple 8 :
Evaluation de l'agrégation plaquetaire après altération vasculaire par les tirs lasers
EMI9.3
<tb>
<tb> Amplitude <SEP> (Ohms) <SEP> Velocité <SEP> (Ohms/min)
<tb> Témoin <SEP> négatif <SEP> (NaCl <SEP> 13 <SEP> zu
<tb> 0.9%)
<tb> Hexabrix# <SEP> 6 <SEP> ¯ <SEP> 1 <SEP> 5.66 <SEP> ¯ <SEP> 0. <SEP> 57
<tb> Iopamidol@ <SEP> 15 <SEP> ¯ <SEP> 2 <SEP> 64 <SEP> 12. <SEP> 33 <SEP> 0, <SEP> 50
<tb> Glycine-bétaïne <SEP> 5mg/kg <SEP> + <SEP> 2 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 5 <SEP> 0
<tb> Hexabrix#
<tb> Glycine-bétaïne <SEP> 5mg/kg <SEP> + <SEP> 4 <SEP> 66 <SEP> ¯0 <SEP> 52 <SEP> 9 <SEP> 33 <SEP> ¯ <SEP> 0. <SEP> 8
<tb> Iopamidol#
<tb>
<Desc/Clms Page number 10>
Exemple 9 :
Evaluation de l'effet du peptide vis à vis des cellules sanguines al Dénombrement des plaquettes
EMI10.1
<tb>
<tb> Nombre <SEP> plaquettes <SEP> (109)
<tb> Témoin <SEP> négatif <SEP> (NaCI <SEP> 788. <SEP> 33 <SEP> ¯ <SEP> 30. <SEP> 14
<tb> 0. <SEP> 9%)
<tb> Hexabrix# <SEP> 620 <SEP> :
<SEP> 10
<tb> Iopamidol <SEP> 585. <SEP> 67 <SEP> ¯ <SEP> 23 <SEP> 54
<tb> Glycine-bétaïne <SEP> 5mg/kg <SEP> + <SEP> 669.67 <SEP> ¯ <SEP> 7.37
<tb> Hexabrix#
<tb> Glycine-bétaïne <SEP> 5mg/kg <SEP> + <SEP> 704.33 <SEP> ¯ <SEP> 92.33
<tb> Iopamidol@
<tb>
b/Dénombrement des globules blancs
EMI10.2
<tb>
<tb> Nombre <SEP> globules <SEP> blancs
<tb> (109)
<tb> Témoin <SEP> négatif <SEP> (NaCl <SEP> 5.03 <SEP> ¯ <SEP> 0 <SEP> 20
<tb> 0.9%)
<tb> Hexabrix# <SEP> 2.96 <SEP> 0. <SEP> 21
<tb> Iopamido <SEP> 3. <SEP> 06 <SEP> 3. <SEP> 0. <SEP> ¯ <SEP> 0.35
<tb> Glycine-bétaine <SEP> 5mg/kg <SEP> + <SEP> 4. <SEP> 20 <SEP> 0.
<SEP> 1
<tb> Hexabrix <SEP> (S)
<tb> Glycine-bétaïne <SEP> 5mg/kg <SEP> + <SEP> 3.9 <SEP> ¯ <SEP> 0 <SEP> 3
<tb> Iopamidol#
<tb>
c/Dénombrement des globules rouges
EMI10.3
<tb>
<tb> Nombre <SEP> globules <SEP> rouges
<tb> (109)
<tb> Témoin <SEP> négatif <SEP> (NaCl <SEP> 6 <SEP> 56 <SEP> ¯ <SEP> 0.15
<tb> 0.9%)
<tb> Hexabrix# <SEP> 5 <SEP> 43 <SEP> ¯ <SEP> 0 <SEP> 47
<tb> Iopamidol <SEP> @ <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> 36
<tb> Glycine-bétaïne <SEP> 5mg/kg <SEP> + <SEP> 6 <SEP> 5 <SEP> ¯ <SEP> 0. <SEP> 15
<tb> Hexabrix#
<tb> Glycine-bétaïne <SEP> 5mg/kg <SEP> + <SEP> 6 <SEP> 6 <SEP> ¯ <SEP> 0 <SEP> 19
<tb> Iopamidol@
<tb>
<Desc/Clms Page number 11>
Exemple 10 :
Bilan biologique al Temps de Quick
EMI11.1
<tb>
<tb> TQ <SEP> (secondes)
<tb> Témoin <SEP> négatif <SEP> (Nacl <SEP> 17 <SEP> ¯ <SEP> 1
<tb> 0.9%)
<tb> Hexabrix# <SEP> 24. <SEP> 13 <SEP> ¯ <SEP> 1
<tb> Iopamidol@ <SEP> 28 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 75
<tb> Glycine-bétaïne <SEP> 5mg/kg <SEP> + <SEP> 16. <SEP> 36 <SEP> 0 <SEP> 56
<tb> Hexabrix#
<tb> Glycine-bétaïne <SEP> 5mg/kg <SEP> + <SEP> 17.83 <SEP> ¯ <SEP> 1.2
<tb> Iopamidol#
<tb>
bl Temps de céphaline activé (TCA)
EMI11.2
<tb>
<tb> TCA <SEP> (secondes)
<tb> Témoin <SEP> négatif <SEP> (NaCI20. <SEP> 5 <SEP> ¯ <SEP> 0. <SEP> 5
<tb> 0.9%)
<tb> Hexabrixg <SEP> 49. <SEP> 3 <SEP> ¯ <SEP> 1. <SEP> 85
<tb> Iopamidol# <SEP> 41.33 <SEP> ¯ <SEP> 0. <SEP> 8
<tb> Glycine-bétaïne <SEP> 5mg/kg <SEP> + <SEP> 25. <SEP> 4 <SEP> ¯ <SEP> 0.61
<tb> Hexabrix@
<tb> Glycine-bétaïne <SEP> 5mg/kg <SEP> + <SEP> 22. <SEP> 4 <SEP> 0.7
<tb> Iopamidol#
<tb>
cl Dosage du fibrinogène
EMI11.3
<tb>
<tb> Fibrinogène <SEP> (g/1)
<tb> Témoin <SEP> négatif <SEP> (NaCl <SEP> 2.45¯ <SEP> 0 <SEP> 19
<tb> 0. <SEP> 9%)
<tb> Hexabr <SEP> i <SEP> x# <SEP> 1 <SEP> 49¯0. <SEP> 18
<tb> Iopamidol@ <SEP> 1 <SEP> 5 <SEP> ¯ <SEP> 0 <SEP> 8
<tb> Glycine-bétaïne <SEP> 5mg/kg <SEP> + <SEP> 1 <SEP> 7 <SEP> ¯ <SEP> 0 <SEP> 09
<tb> Hexabrix#
<tb> Glycine-bétaïne <SEP> 5mg/kg <SEP> + <SEP> 1 <SEP> 9 <SEP> ¯ <SEP> 0 <SEP> 1
<tb> Iopamidol@
<tb>
<Desc/Clms Page number 12>
dl Dosage de l'alpha. 2-Antiplasmine (α2AP)
EMI12.1
<tb>
<tb> α2AP <SEP> (%)
<tb> Témoin <SEP> négatif <SEP> (NaCl <SEP> 30.16 <SEP> ¯ <SEP> 0. <SEP> 85
<tb> 0.9%)
<tb> Hexabrix@ <SEP> 23.26 <SEP> : <SEP> ! <SEP> :
<SEP> 1. <SEP> 06
<tb> Iopamidol# <SEP> 25. <SEP> 23 <SEP> 0. <SEP> 95
<tb> Glycine-bétaïne <SEP> 5mg/kg <SEP> + <SEP> 25.66 <SEP> ¯ <SEP> 0.64
<tb> Hexabrix#
<tb> Glycine-bétaine <SEP> 5mg/kg <SEP> + <SEP> 28.13 <SEP> ¯ <SEP> 0.8
<tb> Iopamidol < µ'
<tb>
el Dosage de l'Antithrombine 3 (AT3)
EMI12.2
<tb>
<tb> AT3 <SEP> (%)
<tb> Témoin <SEP> négatif <SEP> (NaC <SEP> ! <SEP> 86.3 <SEP> 3
<tb> 0.9%)
<tb> Hexabrix# <SEP> 81.63 <SEP> ¯0. <SEP> 66
<tb> Iopamidol@ <SEP> 70. <SEP> 6 <SEP> ¯1. <SEP> 51
<tb> Glycine-bétaïne <SEP> 5mg/kg <SEP> + <SEP> 79. <SEP> 1 <SEP> ¯1. <SEP> 05
<tb> Hexabrix#
<tb> Glycine-bétaine <SEP> 5mg/kg <SEP> + <SEP> 87. <SEP> 26 <SEP> i <SEP> : <SEP> 0. <SEP> 9
<tb> lopamidolg
<tb>
Commentaire : L'administration des produits de contraste, diminue le nombre de globules blancs, le nombre de globules rouges et le nombre de plaquettes.
Les produits de contraste interagissent avec les leucocytes, induisent la libération de leukotriènes, augmentent ainsi la perméabilité vasculaire et exercent un effet chimiotactique. De plus, les produits de contraste agissent sur le contrôle de l'expression de la P-selectine et provoquent l'adhésion des globules blancs à l'endothélium vasculaire. Il a été suggéré que l'utilisation des produits de contraste était associée avec l'apparition de thrombus d'importance variable en fonction du produit utilisé. Cela signifie que l'effet de ces produits sur la fonction plaquetaire est différent et que les résultats obtenus dans les études expérimentales doivent avoir une importance en Clinique Humaine.
<Desc/Clms Page number 13>
Le traitement avec le peptide inhibe les complications thromboemboliques associées à l'utilisation des produits de contraste. En effet, ce traitement avec le peptide, avant ou pendant l'injection des produits de contraste, diminue l'adhésion des plaquettes et leur agrégation au niveau vasculaire. Ces résultats démontrent l'effet anti-thrombotique et thrombolytique du peptide glycine-bétaine. Il est à noter que les produits de contraste peuvent avoir d'autres effets secondaires telle que la stase sanguine au niveau des cathéters et les lésions endothéliales causées par les procédures d'administrations elles-mêmes. Le peptide remédie à ces effets indésirables.
CONCLUSION
Le peptide glycine-bétaine possède les mêmes, voire de meilleures, caractéristiques thérapeutiques que les anti-coagulants et les anti-agrégants étudiés (acide acétylsalicylique et l'héparine), tout en ne présentant aucun effet indésirable.
Les performances supérieures en terme d'efficacité thérapeutique du peptide glycinebétaine par rapport à ces deux molécules (acide acétylsalicylique et héparine) incitent à la formulation d'un médicament ayant pour principe thérapeutiquement actif un peptide comme décrit par l'invention soit : une bétaine associée à un des acides aminés cités. Ce médicament revendiquant, pour le moins, l'indication anti-coagulant et l'indication anti-agrégant.
L'efficacité de ces peptides ne se limitant pas aux exemples décrits.
De plus le haut potentiel anticoagulant du peptide, et selon les résultats expérimentaux, permet une conservation efficace du sang.
Ces résultats démontrés pour le peptide glycine-bétaine ainsi que ses propriétés thérapeutiques peuvent être revendiqués pour les autres peptides comme décrits et selon l'invention.
<Desc/Clms Page number 14>
Exemplell : Evaluation de l'effet du peptide glycine-bétaine vis-à-vis de la thrombose veineuse induite par stase.
1. But de l'étude Il est d'étudier l'effet du peptide glycine-bétaine vis-à-vis de la thrombose veineuse induite par stase. Le modèle de thrombose expérimentale induite par stase a été développé dans le but d'étudier la thrombose profonde, les mécanismes impliqués et leur traitement. Ce modèle a été réalisé dans le but d'évaluer l'activité anti-thrombotique et thrombolytique de la glycine bétaine.
2. Protocole expérimental Rats Wistar d'un poids compris entre 250 g et 300 g.
Nombre de rats : 3 rats/lot - Les rats ont été anesthésiés à la étamine et après une laparotomie médiane la veine cave inférieure (juste au dessus de la veine rénale gauche), a été isolée.
- ligature à TO - injection sous cutanée du produit a) Première expérience : injection du produit à TO + 2 h ; prélèvement des caillots à TO + 3 h, TO + 4 h et TO + 6h (tableau 1). b) Deuxième expérience : injection du produit à TO + 4 h ; prélèvement des caillots à TO + 5 h et TO + 6 h (tableau 2).
Après prélèvement et séchage pendant 24 h à température ambiante, les caillots sont pesés.
L'effet du produit est évalué par rapport au poids des caillots comparativement au poids des caillots contrôle.
<Desc/Clms Page number 15>
3. Résultats
Tableau 1 - Ligature à TO - Injection de la glycine bétaine à TO + 2 h - Prélèvement des caillots à TO + 3 h, à TO + 4 h et à TO + 6 h
EMI15.1
<tb>
<tb> T0 <SEP> + <SEP> 3h <SEP> T0 <SEP> + <SEP> 4h <SEP> T0 <SEP> + <SEP> 6h
<tb> contrôle <SEP> 2,5 <SEP> 0, <SEP> 75 <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 92 <SEP> 5, <SEP> 1 <SEP> ¯ <SEP> 1, <SEP> 02
<tb> glycine <SEP> bétaine <SEP> 2 <SEP> ¯ <SEP> 0, <SEP> 58 <SEP> 1,2 <SEP> 0, <SEP> 81 <SEP> 0,7 <SEP> 0, <SEP> 15
<tb> 2, <SEP> 5 <SEP> mg/kg
<tb> glycine <SEP> bétaine <SEP> 1, <SEP> 92 <SEP> 0,31 <SEP> 0, <SEP> 9 <SEP> 0, <SEP> 15 <SEP> 0,65 <SEP> 0, <SEP> 2
<tb> 5mg/kg
<tb>
Les valeurs sont exprimées en mg.
Tableau 2 - Ligature à TO - Injection de la glycine bétaine à TO + 4 h - Prélèvement des caillots à TO + 5 h et à TO + 6 h
EMI15.2
<tb>
<tb> T0 <SEP> + <SEP> 5h <SEP> T0 <SEP> + <SEP> 6h
<tb> contrôle <SEP> 42 <SEP> 0, <SEP> 13 <SEP> 6 <SEP> db <SEP> 0,48
<tb> glycine <SEP> bétaine <SEP> 3, <SEP> ¯ <SEP> 0, <SEP> 27 <SEP> 2,2 <SEP> 0, <SEP> 32
<tb> 2, <SEP> 5mg/kg
<tb> glycine <SEP> bétaine <SEP> 2,9 <SEP> 0, <SEP> 88 <SEP> 1,8 <SEP> 0, <SEP> 72
<tb> 5mg/kg
<tb>
Conclusion : Les résultats démontrent la puissante activité anti-thrombotique et thrombolytique du peptide glycine-bétaine qui induit une lyse presque compléte des caillots.
<Desc / Clms Page number 1>
PEPTIDESANTITHROMBOTIQUES.
The invention relates to the use of a peptide composed of a betoine associated with an amino acid by a peptide bond, in order to eliminate or prevent vascular pathophysiological damage resulting from ischemia and thrombosis.
According to the invention, the amino acids which can be associated with betaine by a peptide bond are: aspartate, glutamate, lysine, arginine, histidine, serine, threonine, aspargine, glutamine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, methionine , phenylalanine, glycine, cysteine, tyrosine and tryptophan.
The invention relates to the curative and preventive activity of this peptide in the pathogenesis of thromboembolic and hemostatic diseases of arterial or venous origin. Indeed it appears that the administration of a peptide, composed of a betaine associated with an amino acid by a peptide bond, avoids the formation of the venous or arterial thrombus and exerts a powerful thrombolytic and fibrinolytic action by dissolving the clot or the thrombus already formed.
The invention consists in that the peptide exerts an activity both in the pre-thrombotic state and in the post-thrombotic state. Indeed, the peptide has a preventive activity by preventing the formation of thrombi and a curative activity by inhibiting thrombosis. The advantage of the invention lies in the fact that the use of this peptide does not present any haemorrhagic risk as opposed to the molecules and treatments currently used.
Vascular thrombosis is an organism response to the aggression of the vessel wall and its cell and plasma content. Thrombosis is an organized mass of blood elements (platelets, red blood cells and white blood cells), fibrin and other plasma proteins, which is deposited on the surface or obstructs the lumen of the cardiovascular system. The mechanisms of thrombosis resemble those of hemostasis, but are pathological due to abnormal intravascular localization.
Thrombosis and embolism are the main cause of clinical complications of cardiovascular disease and atherosclerosis.
There are several types of thrombosis that can occur in arteries, veins, microcirculation of organs, heart chambers and artificial surfaces in contact with blood. Vascular thrombosis is an organism response to the aggression of the vessel wall and its cell and plasma content. Thrombosis is an organized mass of blood elements (platelets, red blood cells and white blood cells), fibrin and other plasma proteins, which is deposited on the surface or obstructs the lumen of the cardiovascular system. The mechanisms of thrombosis resemble those of hemostasis, but are pathological due to abnormal intravascular localization.
Thrombosis and embolism are the main cause of clinical complications of cardiovascular disease and atherosclerosis.
According to Virchow, at least three types of thrombogenic factors determine the location, extension and regression of a thrombosis
<Desc / Clms Page number 2>
- Hemodynamic and rheological factors; - The endothelial lesion; - Activation of the constituents of the blood, in particular platelets and coagulation which leads to the formation of thrombin.
Thromboembolic disease, arterial or venous, remains the main cause of death in developed countries.
Arterial thrombosis is often a complication of atherosclerosis while venous thrombosis is more frequently the result of a deficiency in a coagulation inhibitor and fibrinolysis or stasis. Indeed, if both result from an interaction between the blood and the vascular wall, the formation of venous thrombosis and / or by an abnormality of hemostasis. Arterial thrombosis is most often secondary to a parietal abnormality and mainly involves blood platelets. It contributes to a wide variety of clinical pictures depending on the arterial beds interested in interrupting the vascular supply. Thrombosis can mainly affect the cardiac (coronary) arteries, arteries of the lower limbs, cerebral or digestive.
Thus, arterial disease promotes the formation of the thrombus itself responsible for the majority of terminal vascular occlusions. In addition, the involvement of the hemostasis disorder and the thrombus formed in other vascular lesions is manifest: worsening of the lesions of the wall, ischemia and microcirculation disorders.
Three therapeutic strategies can be distinguished in the prevention of accidents linked to thromboses.
Anticoagulants. They are the major element in the care of a patient with a thromboembolic disease. Heparin and its derivatives are commonly used. However, the use of heparins can cause two major complications, hemorrhage or thrombocytopenia.
Anti-vitamin K (AVK). Prescribed for long-term treatments, they cannot be used urgently and cannot be prescribed simultaneously with other anti-aggregating agents, of which they potentiate the hemorrhagic effect.
Antiplatelet agents. Prescribed to prevent arterial thrombosis linked to atherosclerosis. Currently, the main inhibitors of platelet function prescribed are: aspirin, ticlopidine, dipyridamole, and certain nonsteroidal anti-inflammatory drugs such as flurbiprofen, prostacyclin. These treatments have a real effectiveness while presenting undesirable effects on patients with allergic or hemorrhagic grounds.
All these treatments despite their effectiveness require special precautions in their uses, such as the administration of antidotes, overdose problems and undesirable side effects. It was therefore interesting to find a molecule with high antithrombotic potential without adverse effects.
Betaine is known for its osmoprotective role, it appeared completely unexpectedly that by associating an amino acid by a peptide bond with betaine, the peptide thus obtained had a high potential of effectiveness against the thromboembolic and ischemic risks. while having no side effects.
Indeed, the experimental results linked to the toxicity of the molecule demonstrate its perfect safety
<Desc / Clms Page number 3>
It therefore appears that the peptide can be used for various clinical applications such as cardiovascular diseases (infarction, angina pectoris, aneurysm, atherosclerosis, pulmonary embolism, phlebitis, heart failure), - Accidents of blood circulation in the brain and their prevention, - post-traumatic shock of surgical or non-surgical origin.
- The prevention of microcirculation accidents in the following cases: diabetes, hemophilia, chemotherapy, age, oral contraception by estrogens, obesity, smoking, prosthesis.
Prevention of risks linked to the administration of ionic and non-ionic contrast media.
MATERIAL AND METHOD
Al Principle
In this model, the lesion of the vascular wall is induced by a laser beam. This beam with a diameter of 2 micrometers, leads to a limited lesion of the vascular endothelium (only 1 to 2 cells are destroyed). The exposure of the subendothelium, a thrombogenic surface, brings about the adhesion of the platelets via the glycoprotein Ib. This adhesion of the platelets is followed by their activation. They form pseudopods and secrete the content of their granules. This activation leads to the appearance of the glycoprotein IIb-IDa necessary for the aggregation of the platelets between them. This in the presence of fibrinogen.
This lesion is induced in the mesenteric microcirculation of the rat. It is immediately followed by the formation of a thrombus (a few seconds). This rapidly growing thrombus, under the effect of blood flow, embolizes before forming again.
B / Method b: Animals This study requires male Wistar rats. Their weight is between 250 and 300 grams.
The evaluation of the effect of the peptide was carried out jointly with the study of two pharmacologically active molecules used as reference: acetylsalicylic acid and heparin.
After an 8-day housing period, the rats are fasted for 12 hours. They are then anesthetized. A midline laparotomy is performed and the mesentery can then be removed and placed on the microscope stage. Three arterioles and a venule, with a diameter between 15 and 25 µm, are visualized and then analyzed for each rat. During the experiment, the mesentery will be regularly moistened with an isotonic solution of 0.9% sodium chloride maintained at 37 C, in order to avoid drying out. Indeed, the lighting of the preparation is carried out thanks to a powerful halogen lamp which can dry the mesentery. The power of the laser beam at the outlet of the tube is 120 mW, and this beam is applied to the arteriole for 1 / 15th of a second.
These parameters have been the subject of preliminary studies and have been validated.
In the following examples, the glycine-betaine peptide whose formula is:
EMI3.1
<Desc / Clms Page number 4>
EXAMPLES: Example 1: Evaluation of the number of emboli and the duration of embolization after vascular damage by laser shots
EMI4.1
<tb>
<tb> Number <SEP> of emboli <SEP> Duration <SEP> of embolization
<tb> (minutes)
<tb> Negative <SEP> control <SEP> (NaCl <SEP> 5. <SEP> 33 <SEP> ¯0.58 <SEP> 2 <SEP> ¯ <SEP> 0
<tb> 0.
<SEP> 9%)
<tb> Glycine-betaine <SEP> 5mg / kg <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 0
<tb> Acid <SEP> acetylsalicylic acid <SEP> 11 <SEP> 0.33 <SEP> 0, <SEP> 58
<tb> 100mg / kg
<tb> Heparin <SEP> 2 <SEP> mg / kg <SEP> 2.67 <SEP> 0, <SEP> 58 <SEP> 1 <SEP> 0
<tb>
The results show that the peptide significantly reduces the number of emboli and the embolization time after vascular damage by laser shots.
Example 2: Evaluation of the time of induced hemorrhage
EMI4.2
<tb>
<tb> THP <SEP> (seconds)
<tb> Negative <SEP> control <SEP> (NaCt101. <SEP> 52 <SEP> 5. <SEP> 7
<tb> 0.9%)
<tb> Glycine-betaine <SEP> 5mg / kg <SEP> 95 <SEP> 5
<tb> Acid <SEP> acetylsalicylic acid <SEP> 276.67 <SEP> 20, <SEP> 82
<tb> 100mg / kg
<tb> Heparin <SEP> 2 <SEP> mglkg <SEP> 313, <SEP> 33 <SEP> 20
<tb>
The results show that the peptide significantly reduces the time of induced hemorrhage compared to the positive controls.
Example 3: Evaluation of platelet aggregation after vascular damage by laser shots
EMI4.3
<tb>
<tb> Amplitude <SEP> (Ohms) <SEP> Velocity <SEP> (Ohms / min)
<tb> Control <SEP> (NaCI <SEP> 0.9%) <SEP> 13 <SEP> 19T
<tb> Glycine-betaïe <SEP> 5mg / kg <SEP> 0. <SEP> 66115 <SEP> 1. <SEP> 66 <SEP> ¯ <SEP> 1. <SEP> 15
<tb> Acid <SEP> acetylsalicylic <SEP> 2, <SEP> 33 <SEP> ¯ <SEP> 2.08 <SEP> 2 <SEP> ¯ <SEP> 1
<tb> IQOmg / kg
<tb> Heparin <SEP> 2 <SEP> mg / kg <SEP> 4.33 <SEP> 0. <SEP> 57 <SEP> 2.66 <SEP> 0. <SEP> 50
<tb>
<Desc / Clms Page number 5>
The results show that the peptide significantly decreases the parameters of platelet aggregation compared to the positive controls.
EXAMPLE 4 Evaluation of the Effect of Vis-à-vis Blood Cells a / Enumeration of Platelets
EMI5.1
<tb>
<tb> Number <SEP> of <SEP> platelets <SEP> zu
<tb> Negative <SEP> control <SEP> (NaCl <SEP> 788 <SEP> ¯ <SEP> 30. <SEP> 14
<tb> 0.9%)
<tb> Glycine-betaine <SEP> 5mg / kg804. <SEP> 67 <SEP> 20.03
<tb> Acid <SEP> acetylsalicylic acid <SEP> 855.33 <SEP> # <SEP> 63.17
<tb> 100mg / kg
<tb> Heparin <SEP> 2 <SEP> mg / kg <SEP> 777.33 <SEP> ¯ <SEP> 6.43
<tb>
EMI5.2
b / Enumeration of white blood cells
EMI5.3
<tb>
<tb> Number <SEP> of <SEP> white <SEP> cells
<tb> (109)
<tb> Negative <SEP> control <SEP> (NaCI <SEP> 5 <SEP> 03 <SEP> 0. <SEP> 20
<tb> 0.9%)
<tb> Glycine-betaine <SEP> 5mg / kg <SEP> 4. <SEP> 43¯0 <SEP> 32
<tb> Acid <SEP> acetylsalicylic acid <SEP> 4. <SEP> 33 <SEP> 1. <SEP> 00
<tb> 100mg / kg
<tb> Heparin <SEP> 2 <SEP> mg / kg <SEP> 5.
<SEP> 80 <SEP>: <SEP> f <SEP>: <SEP> 0. <SEP> 10
<tb>
ci Enumeration of red blood cells
EMI5.4
<tb>
<tb> Number <SEP> of <SEP> cells
<tb> red <SEP> (09)
<tb> Negative <SEP> control <SEP> (NaCl <SEP> 6.56 <SEP> 0. <SEP> 15
<tb> 0.9%)
<tb> Glycine-betaine <SEP> 5mg / kg <SEP> 6 <SEP> 19 <SEP> ¯ <SEP> 0 <SEP> 25
<tb> Acid <SEP> acetylsalicylic acid <SEP> 6 <SEP> 15 <SEP> 0 <SEP> 31
<tb> 100mg / kg
<tb> Heparin <SEP> 2 <SEP> mg / kg <SEP> 6. <SEP> 20 <SEP> ¯ <SEP> 0 <SEP> 20
<tb>
<Desc / Clms Page number 6>
Example 5:
Biological assessment a / Quick time
EMI6.1
<tb>
<tb> TQ <SEP> (seconds)
<tb> Negative <SEP> control <SEP> (NaCt171
<tb> 0.9%)
<tb> Glycine-betaine <SEP> 5mg / kg <SEP> 16.9 <SEP> 1. <SEP> 05
<tb> Acid <SEP> acetylsalicylic acid <SEP> 18. <SEP> 33 <SEP> ¯ <SEP> 2. <SEP> 08
<tb> 100mg / kg
<tb> Heparin <SEP> 2 <SEP> mg / kg <SEP> 29. <SEP> 50 <SEP> 0 <SEP> 52
<tb>
bl Activated partial thromboplastin time (TCA)
EMI6.2
<tb>
<tb> TCA <SEP> (seconds)
<tb> Negative <SEP> control <SEP> (NaCI <SEP> 20. <SEP> 5 <SEP> ¯ <SEP> 0. <SEP> 5
<tb> 0.9%)
<tb> Glycine-betaine <SEP> 5mg / kg <SEP> 39. <SEP> 9 <SEP> ¯ <SEP> 1. <SEP> 05
<tb> Acid <SEP> acetylsalicylic acid <SEP> 27. <SEP> 26 <SEP> ¯ <SEP> 1.1
<tb> 100mglkg
<tb> Heparin <SEP> 2 <SEP> mg / kg <SEP> 39.
<SEP> 46 <SEP> ¯ <SEP> 1.36
<tb>
c / Determination of fibrinogen
EMI6.3
<tb>
<tb> Fibrinogen <SEP> (g / l)
<tb> Negative <SEP> control <SEP> (NaCt2. <SEP> 45 <SEP> ¯ <SEP> 0. <SEP> 19
<tb> 0. <SEP> 9%)
<tb> Glycine-betaine 5mg / kg <SEP> 1. <SEP> 7 <SEP> 0. <SEP> 1
<tb> Acid <SEP> acetylsalicylic acid <SEP> 2. <SEP> 19 <SEP> ¯ <SEP> 0.33
<tb> 100mg / kg
<tb> Heparin <SEP> 2 <SEP> mg / kg <SEP> 2. <SEP> 13 <SEP> 0 <SEP> 25
<tb>
<Desc / Clms Page number 7>
d / Determination of alpha. 2-Antiplasmin (α 2AP)
EMI7.1
<tb>
<tb> a <SEP> 2AP <SEP> (%)
<tb> Negative <SEP> control <SEP> (Na <SEP> CI <SEP> 30. <SEP> 160. <SEP> 85
<tb> 0.9%)
<tb> Glycine-betaine <SEP> 5mg / kg <SEP> 29. <SEP> 7 <SEP> 0 <SEP> 68
<tb> Acid <SEP> acetylsalicylic acid <SEP> 29. <SEP> 36 <SEP>: <SEP>: <SEP> 1 <SEP>:
<SEP> 0. <SEP> 92
<tb> 100mg / kg
<tb> Heparin <SEP> 2 <SEP> mg / kg <SEP> 29 <SEP> 4 <SEP> 101
<tb>
e / Determination of Antithrombin 3 (AT3)
EMI7.2
<tb>
<tb> AT3 <SEP> (%)
<tb> Negative <SEP> control <SEP> (NaCI <SEP> 863
<tb> 0.9%)
<tb> Glycine-betaine <SEP> 5mg / kg <SEP> 89. <SEP> 5 <SEP> 1. <SEP> 37
<tb> Acid <SEP> acetylsalicylic <SEP> 85. <SEP> 33 <SEP> 351
<tb> 100mg / kg
<tb> Heparin <SEP> 2 <SEP> mg / kg <SEP> 77.66 <SEP>: <SEP>! <SEP>: <SEP> 1. <SEP> 52
<tb>
Comment: In the studies carried out on the basis of the experimental thrombosis model induced by endothelial lesion, the application of a laser shot on the vascular wall causes a limited destruction of some endothelial cells.
This destruction causes the activation of the platelet-vascular wall complex which is immediately followed by the activation of plasma hemostasis thus triggering the process of the appearance of thrombosis. Recall that this experimental model, widely used elsewhere (Seiffge D. et al., 1989; Weichter W. et al., 1983), is regulated by endogenous inhibitors of platelet aggregation: prostacyclin and its analogues (Maraganore JM, 1993). Hence the interest represented by the use of this model to study the effects of contrast products, because it allows direct observation of the formation of the thrombus at the site of the vascular lesion. These results explain the appearance of thrombotic occlusions during angioplasties, especially in patients, whose endothelium is already damaged or injured.
Coronary angioplasty causes endothelium stripping, exposing collagen, elastin, and smooth muscle cells to circulating blood, in analogy to
<Desc / Clms Page number 8>
experimental thrombosis model used. Thus, the appearance of new thrombi is higher in patients with a recent myocardial infarction or an eccentric coronary plaque.
Treatment with the peptide inhibits thromboembolic complications triggered by laser fire. Indeed, this treatment with the peptide, before the laser shots decreases the adhesion of the platelets and their aggregation at the vascular level.
Treatment with the peptide inhibits thromboembolic complications. Indeed, this treatment with the peptide, before the induction of thrombosis, showed a high antithrombotic potential in all the parameters involved in the process of thrombus formation. In addition, the results of the biological parameters demonstrate the perfect safety of the peptide which, unlike the reference products used (aspirin and heparin), does not induce any side effects (see examples). These characteristics give the peptide, in addition to its proven effectiveness, the particularity of being able to be administered to people at risk (diabetics, hemophiliacs, allergics).
The peptide according to Example 1 very significantly reduces the number of emboli compared to the control. The peptide has no hemorrhagic activity (Example 2). Example 3 demonstrates the anti-aggregating activity of the peptide. The results of Example 4 demonstrate that there is no difference in the count of blood cells compared to the control. The experimental result of Example 5, c, demonstrates a high fibrinolytic and anti-inflammatory potential of the peptide.
It should be noted that, under the same experimental conditions, for the preservation of blood, the peptide appeared to have a high anti-coagulant power compared to heparinized tubes or containing E. D. T. A. The active doses of the peptide appeared between 3 and 5 mg per hemolysis tube. This experimental result demonstrates a high anticoagulant potential of the peptide. The use of the peptide as an anticoagulant can be claimed, both for the treatment of the human body, in vivo, and for the storage of blood ex vivo, for extracorporeal circulation in surgery as well as the conservation of organs for transplants.
In the context of research on anti-thrombotic effects and in order to complete the approach to the efficacy of the glycine-betaine peptide, we evaluated the effect of this peptide on the increase in thromboembolic risks linked to l use of contrast media known for their prothrombotic powers.
Two contrast products have been studied: Hexabrix @ (ionic) and Iopamidol @ (non-ionic)
<Desc / Clms Page number 9>
Example 6: Evaluation of the number of emboli and the duration of embolization after vascular alteration by laser shots and administration of contrast products.
EMI9.1
<tb>
<tb>
Number <SEP> of emboli <SEP> Duration <SEP> of embolization
<tb> (minutes)
<tb> Negative <SEP> control <SEP> (NaCl <SEP> 5. <SEP> 33 <SEP> 0. <SEP> 58 <SEP> 2 <SEP> ¯ <SEP> 0
<tb> 0.9%)
<tb> Hexabrix # <SEP> 8 <SEP> # <SEP> 1 <SEP> 3.67 <SEP> # <SEP> 0. <SEP> 58
<tb> Iopamidol # <SEP> 11.67¯0.50 <SEP> 6.33 <SEP> ¯ <SEP> 0, <SEP> 52
<tb> Glycine-betaine <SEP> 5mg / kg <SEP> + <SEP> 4 <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> ¯ <SEP> 0
<tb> Hexabrix #
<tb> Glycine-betaine <SEP> 5mg / kg <SEP> + <SEP> 5 <SEP> 33 <SEP> ¯ <SEP> 0.58 <SEP> 2.33 <SEP> ¯ <SEP> 0 <SEP> 48
<tb> Iopamidol #
<tb>
Example 7:
Assessment of the time of induced hemorrhage (THP)
EMI9.2
<tb>
<tb> THP <SEP> (seconds)
<tb> Negative <SEP> control <SEP> (NaCl <SEP> 101.52 <SEP> ¯ <SEP> 5. <SEP> 7
<tb> 0.9%)
<tb> Hexabrix # <SEP> 195 <SEP> 13. <SEP> 23
<tb> Iopamido <SEP>! <SEP> @ <SEP> 128 <SEP> 7.64
<tb> Glycine-betaine <SEP> 5mg / kg <SEP> + <SEP> 150 <SEP> ¯ <SEP> 5
<tb> Hexabrix #
<tb> Glycine-betaine <SEP> 5mg / kg <SEP> + <SEP> 111 <SEP> ¯ <SEP> 6.60
<tb> Iopamido <SEP>! <SEP> @
<tb>
Example 8:
Assessment of platelet aggregation after vascular damage by laser fire
EMI9.3
<tb>
<tb> Amplitude <SEP> (Ohms) <SEP> Velocity <SEP> (Ohms / min)
<tb> Negative <SEP> control <SEP> (NaCl <SEP> 13 <SEP> zu
<tb> 0.9%)
<tb> Hexabrix # <SEP> 6 <SEP> ¯ <SEP> 1 <SEP> 5.66 <SEP> ¯ <SEP> 0. <SEP> 57
<tb> Iopamidol @ <SEP> 15 <SEP> ¯ <SEP> 2 <SEP> 64 <SEP> 12. <SEP> 33 <SEP> 0, <SEP> 50
<tb> Glycine-betaine <SEP> 5mg / kg <SEP> + <SEP> 2 <SEP>: <SEP> 1 <SEP> 5 <SEP> 0
<tb> Hexabrix #
<tb> Glycine-betaine <SEP> 5mg / kg <SEP> + <SEP> 4 <SEP> 66 <SEP> ¯0 <SEP> 52 <SEP> 9 <SEP> 33 <SEP> ¯ <SEP> 0. <SEP> 8
<tb> Iopamidol #
<tb>
<Desc / Clms Page number 10>
Example 9:
Evaluation of the effect of the peptide on blood cells al Enumeration of platelets
EMI10.1
<tb>
<tb> Number <SEP> plates <SEP> (109)
<tb> Negative <SEP> control <SEP> (NaCI <SEP> 788. <SEP> 33 <SEP> ¯ <SEP> 30. <SEP> 14
<tb> 0. <SEP> 9%)
<tb> Hexabrix # <SEP> 620 <SEP>:
<SEP> 10
<tb> Iopamidol <SEP> 585. <SEP> 67 <SEP> ¯ <SEP> 23 <SEP> 54
<tb> Glycine-betaine <SEP> 5mg / kg <SEP> + <SEP> 669.67 <SEP> ¯ <SEP> 7.37
<tb> Hexabrix #
<tb> Glycine-betaine <SEP> 5mg / kg <SEP> + <SEP> 704.33 <SEP> ¯ <SEP> 92.33
<tb> Iopamidol @
<tb>
b / Enumeration of white blood cells
EMI10.2
<tb>
<tb> Number <SEP> white <SEP> cells
<tb> (109)
<tb> Negative <SEP> control <SEP> (NaCl <SEP> 5.03 <SEP> ¯ <SEP> 0 <SEP> 20
<tb> 0.9%)
<tb> Hexabrix # <SEP> 2.96 <SEP> 0. <SEP> 21
<tb> Iopamido <SEP> 3. <SEP> 06 <SEP> 3. <SEP> 0. <SEP> ¯ <SEP> 0.35
<tb> Glycine-betaine <SEP> 5mg / kg <SEP> + <SEP> 4. <SEP> 20 <SEP> 0.
<SEP> 1
<tb> Hexabrix <SEP> (S)
<tb> Glycine-betaine <SEP> 5mg / kg <SEP> + <SEP> 3.9 <SEP> ¯ <SEP> 0 <SEP> 3
<tb> Iopamidol #
<tb>
c / Enumeration of red blood cells
EMI10.3
<tb>
<tb> Number <SEP> red <SEP> cells
<tb> (109)
<tb> Negative <SEP> control <SEP> (NaCl <SEP> 6 <SEP> 56 <SEP> ¯ <SEP> 0.15
<tb> 0.9%)
<tb> Hexabrix # <SEP> 5 <SEP> 43 <SEP> ¯ <SEP> 0 <SEP> 47
<tb> Iopamidol <SEP> @ <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> 36
<tb> Glycine-betaine <SEP> 5mg / kg <SEP> + <SEP> 6 <SEP> 5 <SEP> ¯ <SEP> 0. <SEP> 15
<tb> Hexabrix #
<tb> Glycine-betaine <SEP> 5mg / kg <SEP> + <SEP> 6 <SEP> 6 <SEP> ¯ <SEP> 0 <SEP> 19
<tb> Iopamidol @
<tb>
<Desc / Clms Page number 11>
Example 10:
Biological assessment at Quick Time
EMI11.1
<tb>
<tb> TQ <SEP> (seconds)
<tb> Negative <SEP> control <SEP> (Nacl <SEP> 17 <SEP> ¯ <SEP> 1
<tb> 0.9%)
<tb> Hexabrix # <SEP> 24. <SEP> 13 <SEP> ¯ <SEP> 1
<tb> Iopamidol @ <SEP> 28 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 75
<tb> Glycine-betaine <SEP> 5mg / kg <SEP> + <SEP> 16. <SEP> 36 <SEP> 0 <SEP> 56
<tb> Hexabrix #
<tb> Glycine-betaine <SEP> 5mg / kg <SEP> + <SEP> 17.83 <SEP> ¯ <SEP> 1.2
<tb> Iopamidol #
<tb>
bl Activated partial thromboplastin time (TCA)
EMI11.2
<tb>
<tb> TCA <SEP> (seconds)
<tb> Negative <SEP> control <SEP> (NaCI20. <SEP> 5 <SEP> ¯ <SEP> 0. <SEP> 5
<tb> 0.9%)
<tb> Hexabrixg <SEP> 49. <SEP> 3 <SEP> ¯ <SEP> 1. <SEP> 85
<tb> Iopamidol # <SEP> 41.33 <SEP> ¯ <SEP> 0. <SEP> 8
<tb> Glycine-betaine <SEP> 5mg / kg <SEP> + <SEP> 25. <SEP> 4 <SEP> ¯ <SEP> 0.61
<tb> Hexabrix @
<tb> Glycine-betaine <SEP> 5mg / kg <SEP> + <SEP> 22. <SEP> 4 <SEP> 0.7
<tb> Iopamidol #
<tb>
cl Determination of fibrinogen
EMI11.3
<tb>
<tb> Fibrinogen <SEP> (g / 1)
<tb> Negative <SEP> control <SEP> (NaCl <SEP> 2.45¯ <SEP> 0 <SEP> 19
<tb> 0. <SEP> 9%)
<tb> Hexabr <SEP> i <SEP> x # <SEP> 1 <SEP> 49¯0. <SEP> 18
<tb> Iopamidol @ <SEP> 1 <SEP> 5 <SEP> ¯ <SEP> 0 <SEP> 8
<tb> Glycine-betaine <SEP> 5mg / kg <SEP> + <SEP> 1 <SEP> 7 <SEP> ¯ <SEP> 0 <SEP> 09
<tb> Hexabrix #
<tb> Glycine-betaine <SEP> 5mg / kg <SEP> + <SEP> 1 <SEP> 9 <SEP> ¯ <SEP> 0 <SEP> 1
<tb> Iopamidol @
<tb>
<Desc / Clms Page number 12>
dl Determination of alpha. 2-Antiplasmin (α 2AP)
EMI12.1
<tb>
<tb> α 2AP <SEP> (%)
<tb> Negative <SEP> control <SEP> (NaCl <SEP> 30.16 <SEP> ¯ <SEP> 0. <SEP> 85
<tb> 0.9%)
<tb> Hexabrix @ <SEP> 23.26 <SEP>: <SEP>! <SEP>:
<SEP> 1. <SEP> 06
<tb> Iopamidol # <SEP> 25. <SEP> 23 <SEP> 0. <SEP> 95
<tb> Glycine-betaine <SEP> 5mg / kg <SEP> + <SEP> 25.66 <SEP> ¯ <SEP> 0.64
<tb> Hexabrix #
<tb> Glycine-betaine <SEP> 5mg / kg <SEP> + <SEP> 28.13 <SEP> ¯ <SEP> 0.8
<tb> Iopamidol <µ '
<tb>
el Dosage of Antithrombin 3 (AT3)
EMI12.2
<tb>
<tb> AT3 <SEP> (%)
<tb> Negative <SEP> control <SEP> (NaC <SEP>! <SEP> 86.3 <SEP> 3
<tb> 0.9%)
<tb> Hexabrix # <SEP> 81.63 <SEP> ¯0. <SEP> 66
<tb> Iopamidol @ <SEP> 70. <SEP> 6 <SEP> ¯1. <SEP> 51
<tb> Glycine-betaine <SEP> 5mg / kg <SEP> + <SEP> 79. <SEP> 1 <SEP> ¯1. <SEP> 05
<tb> Hexabrix #
<tb> Glycine-betaine <SEP> 5mg / kg <SEP> + <SEP> 87. <SEP> 26 <SEP> i <SEP>: <SEP> 0. <SEP> 9
<tb> lopamidolg
<tb>
Comment: The administration of contrast media decreases the number of white blood cells, the number of red blood cells and the number of platelets.
Contrast media interact with leukocytes, induce the release of leukotrienes, thereby increase vascular permeability and exert a chemotactic effect. In addition, the contrast agents act on the control of the expression of P-selectin and cause the adhesion of the white blood cells to the vascular endothelium. It has been suggested that the use of contrast agents is associated with the appearance of thrombi of varying importance depending on the product used. This means that the effect of these products on platelet function is different and that the results obtained in experimental studies must be of importance in Human Clinic.
<Desc / Clms Page number 13>
Treatment with the peptide inhibits thromboembolic complications associated with the use of contrast media. Indeed, this treatment with the peptide, before or during the injection of the contrast products, decreases the adhesion of the platelets and their aggregation at the vascular level. These results demonstrate the anti-thrombotic and thrombolytic effect of the glycine-betaine peptide. It should be noted that contrast agents can have other side effects such as blood stasis in the catheters and endothelial damage caused by the administration procedures themselves. The peptide overcomes these side effects.
CONCLUSION
The glycine-betaine peptide has the same, or even better, therapeutic characteristics than the anti-coagulants and anti-aggregants studied (acetylsalicylic acid and heparin), while exhibiting no undesirable effects.
The superior performance in terms of therapeutic efficacy of the glycine betaine peptide compared to these two molecules (acetylsalicylic acid and heparin) encourage the formulation of a medicament having as a therapeutically active principle a peptide as described by the invention, namely: an associated betaine to one of the amino acids mentioned. This drug claiming, at the very least, the anti-coagulant indication and the anti-aggregating indication.
The effectiveness of these peptides is not limited to the examples described.
In addition, the high anticoagulant potential of the peptide, and according to the experimental results, allows effective storage of the blood.
These results demonstrated for the glycine-betaine peptide as well as its therapeutic properties can be claimed for the other peptides as described and according to the invention.
<Desc / Clms Page number 14>
Example: Evaluation of the effect of the glycine-betaine peptide against stasis-induced venous thrombosis.
1. Aim of the study It is to study the effect of the glycine-betaine peptide vis-à-vis the venous thrombosis induced by stasis. The experimental stasis-induced thrombosis model was developed with the aim of studying deep thrombosis, the mechanisms involved and their treatment. This model was carried out with the aim of evaluating the anti-thrombotic and thrombolytic activity of glycine betaine.
2. Rats Wistar experimental protocol weighing between 250 g and 300 g.
Number of rats: 3 rats / lot - The rats were anesthetized with cheesecloth and after a median laparotomy the inferior vena cava (just above the left renal vein), was isolated.
- ligature to TO - subcutaneous injection of the product a) First experience: injection of the product at TO + 2 h; clots removed at TO + 3 hrs, TO + 4 hrs and TO + 6 hrs (Table 1). b) Second experiment: injection of the product at TO + 4 h; clots removed at TO + 5 h and TO + 6 h (Table 2).
After removal and drying for 24 h at room temperature, the clots are weighed.
The effect of the product is evaluated relative to the weight of the clots compared to the weight of the control clots.
<Desc / Clms Page number 15>
3. Results
Table 1 - Ligation at TO - Injection of glycine betaine at TO + 2 h - Collection of clots at TO + 3 h, at TO + 4 h and at TO + 6 h
EMI15.1
<tb>
<tb> T0 <SEP> + <SEP> 3h <SEP> T0 <SEP> + <SEP> 4h <SEP> T0 <SEP> + <SEP> 6h
<tb> control <SEP> 2,5 <SEP> 0, <SEP> 75 <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 92 <SEP> 5, <SEP> 1 <SEP> ¯ <SEP> 1, <SEP> 02
<tb> glycine <SEP> betaine <SEP> 2 <SEP> ¯ <SEP> 0, <SEP> 58 <SEP> 1,2 <SEP> 0, <SEP> 81 <SEP> 0.7 <SEP> 0 , <SEP> 15
<tb> 2, <SEP> 5 <SEP> mg / kg
<tb> glycine <SEP> betaine <SEP> 1, <SEP> 92 <SEP> 0.31 <SEP> 0, <SEP> 9 <SEP> 0, <SEP> 15 <SEP> 0.65 <SEP> 0, <SEP> 2
<tb> 5mg / kg
<tb>
The values are expressed in mg.
Table 2 - Ligation at TO - Injection of glycine betaine at TO + 4 h - Collection of clots at TO + 5 h and at TO + 6 h
EMI15.2
<tb>
<tb> T0 <SEP> + <SEP> 5h <SEP> T0 <SEP> + <SEP> 6h
<tb> control <SEP> 42 <SEP> 0, <SEP> 13 <SEP> 6 <SEP> db <SEP> 0.48
<tb> glycine <SEP> betaine <SEP> 3, <SEP> ¯ <SEP> 0, <SEP> 27 <SEP> 2,2 <SEP> 0, <SEP> 32
<tb> 2, <SEP> 5mg / kg
<tb> glycine <SEP> betaine <SEP> 2.9 <SEP> 0, <SEP> 88 <SEP> 1.8 <SEP> 0, <SEP> 72
<tb> 5mg / kg
<tb>
Conclusion: The results demonstrate the powerful anti-thrombotic and thrombolytic activity of the glycine-betaine peptide which induces almost complete lysis of clots.