<Desc/Clms Page number 1>
WERKWIJZE VOOR DE WINNING VAN EEN
B-LACTAM ANTIBIOTICUM
De uitvinding betreft een werkwijze voor de winning van een ss-lactam antibioticum uit een mengsel dat het ammoniumzout van de overeenkomstige ss-lactamkern en het ammoniumzout van het ss-lactam antibioticum bevat.
Bij de bereiding van een ss-lactam antibioticum, waarbij een overeenkomstige ss-lactamkern wordt geacyleerd met behulp van een geschikt acyleringsmiddel, is de winning van het ss-lactam antibioticum en de opwerking van het reaktiemengsel in het algemeen moeilijk. In het reaktiemengsel zijn naast het ss-lactam antibioticum vaak nog waardevolle componenten aanwezig zoals bijvoorbeeld de ss-lactamkern. Om te komen tot een commercieel aantrekkelijk proces is het derhalve noodzakelijk het gevormde ss-lactam antibioticum nagenoeg zuiver te winnen en tegelijkertijd de verliezen aan ss-lactamkern en sslactam antibioticum te minimaliseren.
Het doel van de uitvinding is dan ook een werkwijze te verschaffen die het mogelijk maakt het sslactam antibioticum voldoende zuiver te winnen en het resterende mengsel eenvoudig en zonder significante verliezen aan ss-lactamkern en ss-lactam antibioticum op te werken dan wel te recirculeren.
Dit wordt volgens de uitvinding bereikt door het mengsel te onderwerpen aan een fysische behandeling waarbij ammoniak uit de aanwezige ammoniumzouten wordt vrijgemaakt en als zodanig wordt afgevoerd en het neerslag van het vrijkomende ss-lactam antibioticum wordt gewonnen.
Gebleken is namelijk dat in de werkwijze volgens de uitvinding het vrije ss-lactam antibioticum selectief neerslaat terwijl de ss-lactam kern in oplossing achterblijft. Op deze wijze bleek het mogelijk het gevormde ss-lactam antibioticum met een zuiverheid groter
<Desc/Clms Page number 2>
dan 90% berekend als drooggewicht, in het bijzonder groter dan 98%, te winnen.
De term fysische behandeling staat in het kader van deze uitvinding tegenover chemische behandeling bijvoorbeeld de chemische reakties waarbij met behulp van sterk zuur anorganische ammonium zouten worden gevormd.
Voorbeelden van geschikte fysische behandelingen waaraan het mengsel kan worden onderworpen zijn een stripbehandeling met stoom of een inert gas zoals bijvoorbeeld beschreven in R. H. Perry, D. Green, Perry's Chemical Engineering Handbook 2* druk (1985), (stoom) destillatie onder verlaagde druk in het bijzonder dunne-film verdamping zoals bijvoorbeeld beschreven in Mutzenberg e. a., Chem. Eng. 72, 175-190 (1965), afdampen in een sproeitoren zoals bijvoorbeeld beschreven in Mehta en Shorma, Br. Chem. Eng. 15 1440,1465 (1970), gasmembraanscheiding, zoals bijvoorbeeld beschreven in D. J. Brose and P. v. Eikeren, Appl. Biochem. and Biotech., 24/25 (1990), 457-468 en electrodialyse, zoals bijvoorbeeld beschreven in de bovengenoemde referentie van R. H. Perry et al.
De werkwijze volgens de uitvinding kan geschikt worden toegepast bij de bereiding van bekende ss-lactam antibiotica, zoals bijvoorbeeld cefalexine, amoxicilline, ampicilline, cefaclor, cefradine, cefadroxyl en cefotaxim.
De temperatuur waarbij de behandeling wordt uitgevoerd ligt meestal tussen 0 en 40 C, bij voorkeur tussen 5 en 30 C.
De pH van het te behandelen mengsel hangt af van de aard en de concentratie van de afzonderlijke componenten. In verband met de stabiliteit van de sslactamkern en het ss-lactam antibioticum wordt de behandeling meestal bij een pH lager dan 8, 5, in het bijzonder bij een pH tussen 5, 5 en 8, 5, bij voorkeur bij een pH tussen 6 en 8 uitgevoerd. Gedurende de behandeling wordt ammoniak verwijderd, waardoor de pH omlaag gaat.
<Desc/Clms Page number 3>
Door de intensiteit en de duur van de behandeling te sturen is het mogelijk de pH aan het einde van de behandeling te varieren. De optimale eind-pH hang af van de samenstelling van het mengsel en wordt zo gekozen dat een optimale scheiding tussen ss-lactamkern en ss-lactam antibioticum wordt verkregen. De optimale eind-pH is in de praktijk een compromis tussen enerzijds hoge zuiverheid van het gewonnen antibioticum die wordt bereikt wanneer de pH relatief weinig wordt verlaagd zodat het ss-lactam antibioticum nog gedeeltelijk en de ss-lactamkern nog volledig in oplossing is ; en anderzijds hoge opbrengst die wordt bereikt wanneer de pH zo ver wordt verlaagd dat het ss-lactam antibioticum nagenoeg volledig is neergeslagen maar waarbij tegelijkertijd ook een deel van de sslactamkern is neergeslagen.
De deskundige is eenvoudig in staat de voor zijn situatie optimale eind-pH vast te stellen.
De werkwijze volgens de uitvinding is in het bijzonder geschikt om te worden toegepast op het reaktiemengsel verkregen na een enzymatische acyleringsreaktie waarin een ss-lactam antibioticum wordt bereid door enzymatische acylering van de overeenkomstige ss-lactam kern met een geschikt acyleringsmiddel.
Geschikte voorbeelden van ss-lactamkernen die kunnen worden toegepast in de werkwijze volgens de uitvinding zijn penicillinezuurderivaten, bijvoorbeeld 6aminopenicillinezuur (6-APA), en cefalosporinezuur derivaten, bijvoorbeeld 7-aminocefalosporinezuur (7-ACA), 7-aminodesacetoxycefalosporinezuur (7-ADCA) en 7-amino-3chloorcefalosporinezuur (7-ACCA).
Geschikte acyleringsmiddelen die kunnen worden toegepast in de werkwijze volgens de uitvinding zijn bijvoorbeeld a-aminozuurderivaten, in het bijzonder amiden en esters van fenylglycine, p-hydroxyfenylglycine en dihydrofenylglycine.
Als enzym kan in principe elk enzym worden
<Desc/Clms Page number 4>
toegepast dat geschikt is als katalysator in de koppelingsreaktie. Dergelijke enzymen zijn bijvoorbeeld de enzymen die bekend zijn onder de algemene aanduiding penicilline amidase of penicilline acylase. Voorbeelden van geschikte enzymen zijn enzymen afgeleid van Acetobacter, Aeromones, Aphanocladium, Bacillus so., Cephalosporium, Escherichia, Flavobacterium, Kluvvera, Mvcoplana, Protaminobacter, Pseudomonas en Xanthomonas, in het bijzonder Acetobacter Dasteurianum, Bacillus
EMI4.1
meqaterium, Escherichia coli en Xanthomonas citrii.
Bij voorkeur wordt een geimmobiliseerd enzym toegepast, aangezien het enzym dan eenvoudig hergebruikt kan worden. Geimmobiliseerde enzymen zijn op zich bekend en commercieel verkrijgbaar. Bijzonder geschikt zijn gebleken het Escherichia coli enzym van Boehringer Mannheim GmbH dat onder de naam Enzygele commercieel verkrijgbaar is en het geimmobiliseerde Penicilline-G acylase van Recordati.
De temperatuur waarbij de enzymatische acyleringsreaktie wordt uitgevoerd ligt meestal tussen 5 en 35OC, bij voorkeur tussen 20 en 28 C.
De pH waarbij de acyleringsreaktie plaatsvindt ligt meestal tussen 6 en 8, 5. De optimale pH is ondermeer afhankelijk van het antibioticum aangezien de stabiliteit en de oplosbaarheid van zowel het ss-lactam antibioticum als van de ss-lactamkern afhankelijk is van de pH. Wanneer als acyleringsmiddel een fenylglycinederivaat wordt toegepast ligt de pH bij voorkeur tussen 7 en 8 ; wanneer een p-hydroxyfenylglycinederivaat als acyleringsmiddel wordt gebruikt ligt de pH bij voorkeur tussen 6 en 7.
Daarnaast is ook de enzymaktiviteit pH-afhankelijk.
De acyleringsreaktie wordt in de praktijk meestal uitgevoerd in water. Desgewenst kan het reaktiemengsel ook een organisch oplosmiddel of een mengsel van organische oplosmiddelen bevatten, bij voorkeur minder dan 30 vol. %. Voorbeelden van organische
<Desc/Clms Page number 5>
oplosmiddelen die kunnen worden toegepast zijn alcoholen met 1-7 C-atomen, bijvoorbeeld een monoalcohol, in het bijzonder methanol of ethanol ; een diol, in het bijzonder ethyleenglycol of een triol, in het bijzonder glycerol.
In de bekende enzymatische acyleringsprocessen waarin de ss-lactamkern wordt geacyleerd met behulp van amide als acyleringsmiddel, wordt een mengsel van de ammoniumzouten van het ss-lactam antibioticum en de sslactamkern verkregen. In deze acyleringsprocessen wordt in het algemeen de pH op een constante waarde gehouden door titratie met een sterk zuur. Hierbij worden echter anorganische zouten gevormd die de opwerking van het reaktiemengsel bemoeilijken en waarvan aanvraagster bovendien gebleken is dat ze de stabiliteit van het enzym verlagen zodat het relatief kostbare enzym minder vaak kan worden hergebruikt.
Bij voorkeur wordt de werkwijze volgens de uitvinding toegepast op een mengsel dat verkregen is door enzymatische acylering van een ss-lactamkern met behulp van een amide als acyleringsmiddel waarin de concentratie anorganische zouten in het reaktiemengsel lager is dan 1000 : n mM waarbij n de valentie van het anion is. Bij voorkeur wordt in een dergelijke werkwijze als acyleringsmiddel een vrij amide gebruikt en een molaire verhouding acyleringsmiddel tot ss-lactamkern tussen 0, 5 : 1 en 2 : 1 gekozen. Een dergelijke werkwijze kan bij relatief hoge concentraties worden uitgevoerd ; de som van de concentraties van het ss-lactam antibioticum en de sslactamkern ligt bijvoorbeeld tussen 200 en 800 mM, bij voorkeur tussen 300 en 600 mM.
Gebleken is dat onder dergelijke condities de pH tijdens de acyleringsreaktie voldoende laag blijft zodat tijdens de acyleringsreaktie geen pH-controle via titratie nodig is. Deze voorkeurswerkwijze heeft als voordeel dat tijdens het gehele proces in essentie geen anorganische zouten worden gevormd zodat het na de acyleringsreaktie verkregen reaktiemengsel, na
<Desc/Clms Page number 6>
de fysische behandeling, waarbij ammoniak wordt vrijgemaakt en verwijderd, en na de afscheiding van het neergeslagen ss-lactam antibioticum, als zodanig kan worden teruggevoerd naar de acyleringsreaktie. In een dergelijke werkwijze gaan derhalve in essentie geen ss-lactamkern en geen ss-lactam antibioticum verloren.
In de bekende enzymatische acyleringsprocessen waarin de ss-lactamkern wordt geacyleerd met behulp van een ester wordt in het algemeen de pH op een constante waarde gehouden door titratie met ammonia waardoor eveneens een mengsel van de ammoniumzouten van het ss-lactam antibioticum en de ss-lactamkern wordt verkregen. Bij voorkeur wordt in een dergelijke werkwijze als acyleringsmiddel een vrije ester gebruikt. Een dergelijke werkwijze kan bij relatief hoge concentraties worden uitgevoerd ; de som van de concentraties van het ss-lactam antibioticum en de ss-lactamkern ligt bijvoorbeeld tussen 200 en 800 mM, bij voorkeur tussen 300 en 600 mM.
Deze voorkeurswerkwijze heeft als voordeel dat tijdens het gehele proces in essentie geen anorganische zouten worden gevormd zodat het na de acyleringsreaktie verkregen reaktiemengsel, na de fysische behandeling, waarbij ammoniak wordt vrijgemaakt en verwijderd, en na de afscheiding van het neergeslagen ss-lactam antibioticum, als zodanig kan worden teruggevoerd naar de acyleringsreaktie. Ook in een dergelijk proces gaan in essentie geen ss-lactamkern en geen ss-lactam antibioticum verloren.
Daarnaast is gebleken dat in een dergelijke werkwijze waarin de winning van het ss-lactam antibioticum wordt toegepast op het reaktiemengsel verkregen na de enzymatische acyleringsreaktei als hierboven beschreven, het enzym vele malen kan worden hergebruikt, zonder dat de aktiviteit sterk afneemt.
De uitvinding wordt verder toegelicht aan de hand van de voorbeelden zonder evenwel daartoe te worden
<Desc/Clms Page number 7>
beperkt.
Afkortinaen : CEX = cefalexine
EMI7.1
CEX. cefalexine-monohydraat 7-ADCA = aminodesacetoxycefalosporinezuur D-PGA = D-fenylglycineamide D-PG = D-fenylglycine Voorbeeld I
Aan een mengsel van 50 mmol (10, 7 g) 7-ADCA, 50 mmol (18, 2 g) CEX. H2O en 25 mmol D-PGA in 215 ml water werd bij 210C 6 ml 25 massa-% ammonia (78 mmol) toegevoegd. De pH van de heldere oplossing was 7, 92 bij 21 C. Achtereenvolgens werden bij een druk van 12 mm Hg 125 ml afgedestilleerd, 125 ml water toegevoegd, 130 ml afgedestilleerd en 130 ml water toegevoegd. De pH van de resulterende suspensie was 7, 55 bij 21 C.
De CEX werd afgefiltreerd, nagewassen met 2x10 ml methanol en 2x10 ml aceton en gedroogd bij 20 mm Hg/20 C.
Opbrengst : 7, 8 g CEX. H2O als vaste stof. Het gehalte aan CEX, berekend op watervrije basis, bedroeg 99, 2 massa-% (HPLC).
Voorbeeld II
Als uitgangsmengsel werd toegepast een mengsel verkregen na de enzymatische acyleringsreaktie van 7-ADCA en D-PGA dat 50 mmol (10. 7 g) 7-ADCA, 50 mmol (18, 2 g) CEX. H2O en 25 mmol D-PGA (3, 8 g), 26 mmol D-PG (3, 9 g) 220 ml water, en ammoniak (77 mmol) grotendeels aanwezig als ammoniumzout van CEX. H2O, 7-ADCA en D-PG, bevatte.
De pH van de heldere oplossing was 7, 90 bij 21 C.
Achtereenvolgens werd bij een druk van 12 mm Hg 140 ml afgedestilleerd en 140 ml water toegevoegd. De pH van de resulterende suspensie was 7, 38 bij 21 C.
De CEX werd afgefiltreerd, nagewassen met 2 x 10 ml
<Desc/Clms Page number 8>
methanol en 2 x 10 ml aceton en gedroogd bij 20 mm Hg/20 C. Opbrengst : 8, 7 9 CEX. H2O als vaste stof.
HPLC-analyse : CEX 92, 8 massa-% 7-ADCA 0, 08 massa-% D-PGA 0, 19 massa-% en D-PG 0, 1 massa-%.
Watergehalte : 6, 0 massa-% (Karl-Fischer titratie).
Het gehalte aan CEX, berekend op watervrije basis, bedroeg 98, 7 massa-%.
Voorbeeld III 218, 6 g (zuiverheid : 99%) CEX. H2O, 128, 7 g (zuiverheid : 98, 3%) 7-ADCA, 63, 8 g 25 wt. % NH OH en 2640 g demi-water ; totaal 3051 g werden toegevoegd aan een vacuümkristallisator. De pH bedroeg 8, 06. De temperatuur was 20, 5 C. Er ontstond een heldere vloeistof. De concentraties van CEX. H2O en 7-ADCA waren resp. 195 en 191 mM. Afdamping werd gestart door evacuatie naar 24 mbar (ca. 28 C). Door suppletie van demi-water werd het niveau constant gehouden. De temperatuur van het verwarmingselement werd ingesteld op 45 C. Op deze wijze werd in 65 minuten 3056 g condensaat verzameld (gemiddeld indampsnelheid : 2820 g/uur). Onder deze omstandigheid bedroeg de superficiële dampsnelheid ca. 2 m/s.
Tijdens het indampen trad kristallisatie op. Na het stoppen van de indamping werd de slurry ca. 1 uur nagekristalliseerd.
De eind-pH bedroeg 7, 42 (T = 20, 5 C). De slurry werd zonder problemen gefiltreerd over een glasfilter. Het gewicht van de wetcake bedroeg 197, 1 g.
Na wassing met 3x50 ml aceton en droging gedurende ca. 16 uur bij 300C en een relatieve vochtigheid van 30% werd 110, 1 g CEX. H20 verkregen. Deze stof bestond uit naaldvormige kristallen met een gemiddelde lengte van 150 pm en een gemiddelde diameter van 10-15 pm.
<Desc/Clms Page number 9>
Het gehalte aan CEX, berekend op watervrije basis, bedroeg 98, 4 massa-%.
Voorbeeld IV 218, 6 g (zuiverheid : 99%) CEX. H2O, 130, 8 g (zuiverheid : 98, 3%) 7-ADCA, 64, 9 g 25 wt. % NH OH en 2641 g demi-water ; totaal 3055 g werden toegevoegd aan een vacuümkristallisator. De pH bedroeg 8, 06, de temperatuur bedroeg 20 C. Er ontstond een heldere vloeistof. De concentraties van CEX. H2O en 7-ADCA waren resp. 194 en 194 mM. Afdamping werd gestart door evacuatie naar 22 mbar (ca. 25 C). De temperatuur van het verwarmingselement werd ingesteld op 45 C. Op deze wijze werd in 34 minuten 1602 g condensaat verzameld (gemiddeld indampsnelheid : 2830 g/uur). Onder deze omstandigheid bedroeg de superficiöle dampsnelheid ca. 2 m/s.
Tijdens het indampen trad kristallisatie op.
Vervolgens werd 1500 g demi-water toegevoerd en de indamping hervat. In 21 minuten werd 1437 g condensaat verzameld (gemiddelde indampsnelheid : 4106 g/uur, dampsnelheid ca. 3 m/s).
De eind-pH bedroeg 7, 19 (T = 23, 4 C). De slurry werd zonder problemen gefiltreerd over een glasfilter. Het gewicht van de wetcake bedroeg 197, 9 g.
EMI9.1
Na wassing met 1x100 ml demi-water, 1x100 ml 80 vol% aceton en droging gedurende ca. 16 uur bij 300C en een relatieve vochtingheid van 30% werd 110, 5 9 CEX. H2O verkregen. Deze stof bestond uit naaldvormige kristallen met een gemiddelde lengte van 150 pm en een gemiddelde diameter van 10-15 pm.
Het gehalte aan CEX, berekend op watervrije basis, bedroeg 98, 1 massa-%.
<Desc / Clms Page number 1>
METHOD FOR EXTRACTING ONE
B-LACTAM ANTIBIOTIC
The invention relates to a method for the recovery of an ss-lactam antibiotic from a mixture containing the ammonium salt of the corresponding ss-lactam core and the ammonium salt of the ss-lactam antibiotic.
In the preparation of an ss-lactam antibiotic, in which a corresponding ss-lactam core is acylated using a suitable acylating agent, recovery of the ss-lactam antibiotic and work-up of the reaction mixture is generally difficult. In addition to the ss-lactam antibiotic, the reaction mixture often contains valuable components such as, for example, the ss-lactam core. Therefore, in order to achieve a commercially attractive process, it is necessary to recover the ss-lactam antibiotic formed substantially pure and at the same time minimize the losses of ss-lactam nucleus and sslactam antibiotic.
The object of the invention is therefore to provide a method which makes it possible to recover the sslactam antibiotic sufficiently pure and to work up or recycle the residual mixture simply and without significant losses of ss-lactam core and ss-lactam antibiotic.
This is achieved according to the invention by subjecting the mixture to a physical treatment in which ammonia is released from the ammonium salts present and is discharged as such and the precipitate of the released ss-lactam antibiotic is recovered.
Namely, it has been found that in the method according to the invention the free ss-lactam antibiotic selectively precipitates while the ss-lactam core remains in solution. In this way, it appeared possible that the ss-lactam antibiotic formed had a purity greater
<Desc / Clms Page number 2>
than 90% calculated as dry weight, in particular greater than 98%.
For the purposes of this invention, the term physical treatment is opposed to chemical treatment, for example, the chemical reactions in which salts are formed using strong acid inorganic ammonium.
Examples of suitable physical treatments to which the mixture can be subjected are a stripping treatment with steam or an inert gas as described, for example, in RH Perry, D. Green, Perry's Chemical Engineering Handbook 2 * pressure (1985), (steam) distillation under reduced pressure in particularly thin film evaporation as described, for example, in Mutzenberg e. a., Chem. Scary. 72, 175-190 (1965), evaporation in a spray tower as described, for example, in Mehta and Shorma, Br. Chem. Scary. 15, 1440, 1465 (1970), gas membrane separation, as described, for example, in D. J. Brose and P. v. Eikeren, Appl. Biochem. and Biotech., 24/25 (1990), 457-468 and electrodialysis, as described, for example, in the above reference of R. H. Perry et al.
The method of the invention can be suitably used in the preparation of known ss-lactam antibiotics, such as, for example, cefalexin, amoxicillin, ampicillin, cefaclor, cefradine, cefadroxyl and cefotaxime.
The temperature at which the treatment is carried out is usually between 0 and 40 ° C, preferably between 5 and 30 ° C.
The pH of the mixture to be treated depends on the nature and the concentration of the individual components. Due to the stability of the sslactam core and the ss-lactam antibiotic, the treatment is usually at a pH below 8.5, especially at a pH between 5.5 and 8.5, preferably at a pH between 6 and 5.5. 8 performed. During the treatment, ammonia is removed, which lowers the pH.
<Desc / Clms Page number 3>
By controlling the intensity and duration of the treatment, it is possible to vary the pH at the end of the treatment. The optimal final pH depends on the composition of the mixture and is chosen so that an optimal separation between ss-lactam core and ss-lactam antibiotic is obtained. In practice, the optimum final pH is a compromise between high purity of the recovered antibiotic, which is achieved when the pH is lowered relatively little so that the ss-lactam antibiotic is still partly and the ss-lactam core is still completely in solution; and, on the other hand, a high yield which is achieved when the pH is lowered so far that the ss-lactam antibiotic is almost completely precipitated, but at the same time also a part of the sslactam core is precipitated.
The skilled person is easily able to determine the optimum final pH for his situation.
The method of the invention is particularly suitable for application to the reaction mixture obtained after an enzymatic acylation reaction in which an ss-lactam antibiotic is prepared by enzymatic acylation of the corresponding ss-lactam core with a suitable acylating agent.
Suitable examples of ss-lactam nuclei that can be used in the method according to the invention are penicillic acid derivatives, for example 6-aminopenicillic acid (6-APA), and cephalosporic acid derivatives, for example 7-aminocephalosporic acid (7-ACA), 7-aminodesacetoxycephalosporic acid (7-ADCA) 7-amino-3-chlorocephalosporic acid (7-ACCA).
Suitable acylating agents that can be used in the method according to the invention are, for example, α-amino acid derivatives, in particular amides and esters of phenylglycine, p-hydroxyphenylglycine and dihydrophenylglycine.
In principle, any enzyme can become an enzyme
<Desc / Clms Page number 4>
suitable as a catalyst in the coupling reaction. Such enzymes are, for example, the enzymes known under the general term penicillin amidase or penicillin acylase. Examples of suitable enzymes are enzymes derived from Acetobacter, Aeromones, Aphanocladium, Bacillus so., Cephalosporium, Escherichia, Flavobacterium, Kluvvera, Mvcoplana, Protaminobacter, Pseudomonas and Xanthomonas, in particular Acetobacter Dasteurianum, Bacillus
EMI4.1
meqaterium, Escherichia coli and Xanthomonas citrii.
Preferably, an immobilized enzyme is used, since the enzyme can then easily be reused. Immobilized enzymes are known per se and commercially available. The Escherichia coli enzyme from Boehringer Mannheim GmbH, which is commercially available under the name Enzygele, and the immobilized Penicillin-G acylase from Recordati have proved particularly suitable.
The temperature at which the enzymatic acylation reaction is carried out is usually between 5 and 35 ° C, preferably between 20 and 28 ° C.
The pH at which the acylation reaction takes place is usually between 6 and 8.5. The optimum pH depends, inter alia, on the antibiotic, since the stability and solubility of both the ss-lactam antibiotic and the ss-lactam core depend on the pH. When a phenylglycine derivative is used as acylating agent, the pH is preferably between 7 and 8; when a p-hydroxyphenylglycine derivative is used as an acylating agent, the pH is preferably between 6 and 7.
In addition, the enzyme activity is also pH-dependent.
In practice, the acylation reaction is usually carried out in water. If desired, the reaction mixture may also contain an organic solvent or a mixture of organic solvents, preferably less than 30 vol. %. Examples of organic
<Desc / Clms Page number 5>
solvents that can be used are alcohols with 1-7 carbon atoms, for example a monoalcohol, in particular methanol or ethanol; a diol, especially ethylene glycol or a triol, especially glycerol.
In the known enzymatic acylation processes in which the ss-lactam core is acylated using amide as an acylating agent, a mixture of the ammonium salts of the ss-lactam antibiotic and the sslactam core is obtained. In these acylation processes, the pH is generally kept at a constant value by titration with a strong acid. However, inorganic salts are formed here which complicate the work-up of the reaction mixture and which, moreover, have been found by the applicant to decrease the stability of the enzyme, so that the relatively expensive enzyme can be reused less often.
Preferably, the method according to the invention is applied to a mixture obtained by enzymatic acylation of an ss-lactam core using an amide as an acylating agent in which the concentration of inorganic salts in the reaction mixture is less than 1000: n mM, where n is the valence of it is anion. Preferably, in such a process, a free amide is used as the acylating agent and a molar ratio of acylating agent to ss-lactam core is selected between 0.5: 1 and 2: 1. Such a method can be carried out at relatively high concentrations; for example, the sum of the concentrations of the ss-lactam antibiotic and the sslactam core is between 200 and 800 mM, preferably between 300 and 600 mM.
It has been found that under such conditions the pH remains sufficiently low during the acylation reaction that no pH control via titration is required during the acylation reaction. This preferred method has the advantage that essentially inorganic salts are not formed during the entire process, so that the reaction mixture obtained after the acylation reaction, after
<Desc / Clms Page number 6>
the physical treatment, whereby ammonia is released and removed, and after separation of the precipitated ss-lactam antibiotic, as such, can be returned to the acylation reaction. In such a method, therefore, essentially no ss-lactam core and no ss-lactam antibiotic are lost.
In the known enzymatic acylation processes in which the ss-lactam core is acylated with the aid of an ester, the pH is generally kept at a constant value by titration with ammonia, which also results in a mixture of the ammonium salts of the ss-lactam antibiotic and the ss-lactam core is obtained. A free ester is preferably used as acylating agent in such a process. Such a method can be carried out at relatively high concentrations; for example, the sum of the concentrations of the ss-lactam antibiotic and the ss-lactam core is between 200 and 800 mM, preferably between 300 and 600 mM.
This preferred method has the advantage that essentially inorganic salts are not formed during the whole process, so that the reaction mixture obtained after the acylation reaction, after the physical treatment, releasing and removing ammonia, and after the deposition of the precipitated ss-lactam antibiotic, as such can be recycled to the acylation reaction. Also in such a process essentially no ss-lactam core and no ss-lactam antibiotic are lost.
In addition, it has been found that in such a method in which the recovery of the ss-lactam antibiotic is applied to the reaction mixture obtained after the enzymatic acylation reaction as described above, the enzyme can be reused many times, without greatly decreasing the activity.
The invention is further elucidated by means of the examples without, however, becoming so
<Desc / Clms Page number 7>
limited.
Abbreviations: CEX = cephalexin
EMI7.1
CEX. cephalexin monohydrate 7-ADCA = aminodesacetoxycephalosporic acid D-PGA = D-phenylglycine amide D-PG = D-phenylglycine Example I
To a mixture of 50mmol (10.7g) 7-ADCA, 50mmol (18.2g) CEX. H2O and 25mmol D-PGA in 215ml water was added at 210C 6ml 25 mass% ammonia (78mmol). The pH of the clear solution was 7.92 at 21 ° C. 125 ml distilled, 125 ml water, 130 ml distilled and 130 ml water were added successively at a pressure of 12 mm Hg. The pH of the resulting suspension was 7.55 at 21 ° C.
The CEX was filtered off, re-washed with 2x10 ml methanol and 2x10 ml acetone and dried at 20 mm Hg / 20 C.
Yield: 7.8 g CEX. H2O as a solid. The content of CEX, calculated on an anhydrous basis, was 99.2 mass% (HPLC).
Example II
As a starting mixture, a mixture obtained after the enzymatic acylation reaction of 7-ADCA and D-PGA containing 50 mmol (10.7 g) 7-ADCA, 50 mmol (18.2 g) CEX was used. H2O and 25mmol D-PGA (3.8g), 26mmol D-PG (3.9g) 220ml water, and ammonia (77mmol) largely present as ammonium salt of CEX. H2O, 7-ADCA and D-PG.
The pH of the clear solution was 7.90 at 21 ° C.
Successively 140 ml of distilled off and 140 ml of water were added at a pressure of 12 mm Hg. The pH of the resulting suspension was 7.38 at 21 ° C.
The CEX was filtered off, washed with 2 x 10 ml
<Desc / Clms Page number 8>
methanol and 2 x 10 ml acetone and dried at 20 mm Hg / 20 C. Yield: 8.7 9 CEX. H2O as a solid.
HPLC analysis: CEX 92.8 mass% 7-ADCA 0.08 mass% D-PGA 0.19 mass% and D-PG 0.1 mass%.
Water content: 6.0 mass% (Karl-Fischer titration).
The content of CEX, calculated on an anhydrous basis, was 98.7 mass%.
Example III 218.6 g (purity: 99%) CEX. H2O, 128.7 g (purity: 98.3%) 7-ADCA, 63.8 g 25 wt. % NH OH and 2640 g demi water; total 3051 g were added to a vacuum crystallizer. The pH was 8.06. The temperature was 20.5 C. A clear liquid formed. The concentrations of CEX. H2O and 7-ADCA were resp. 195 and 191 mM. Evaporation was started by evacuation to 24 mbar (approx. 28 C). The level was kept constant by supplementing demineralised water. The temperature of the heating element was adjusted to 45 ° C. In this way, 3056 g of condensate was collected in 65 minutes (average evaporation rate: 2820 g / hour). Under this condition, the superficial vapor velocity was about 2 m / s.
Crystallization occurred during evaporation. After the evaporation was stopped, the slurry was recrystallized for about 1 hour.
The final pH was 7.42 (T = 20.5 C). The slurry was filtered through a glass filter without any problem. The weight of the wet cake was 197.1 g.
After washing with 3x50 ml acetone and drying for about 16 hours at 300C and a relative humidity of 30%, 110.1 g CEX. H2 O obtained. This material consisted of needle-shaped crystals with an average length of 150 µm and an average diameter of 10-15 µm.
<Desc / Clms Page number 9>
The content of CEX, calculated on an anhydrous basis, was 98.4 mass%.
Example IV 218.6 g (purity: 99%) CEX. H2O, 130.8 g (purity: 98.3%) 7-ADCA, 64.9 g, 25 wt. % NH OH and 2641 g demi water; total 3055 g were added to a vacuum crystallizer. The pH was 8.06, the temperature was 20 C. A clear liquid was formed. The concentrations of CEX. H2O and 7-ADCA were resp. 194 and 194 mM. Evaporation was started by evacuation to 22 mbar (approx. 25 C). The temperature of the heating element was adjusted to 45 ° C. In this way, 1602 g of condensate was collected in 34 minutes (average evaporation rate: 2830 g / hour). Under this condition, the superficial vapor velocity was about 2 m / s.
Crystallization occurred during evaporation.
Then, 1500 g of demineralized water were added and the evaporation resumed. 1437 g of condensate were collected in 21 minutes (average evaporation speed: 4106 g / hour, vapor speed approx. 3 m / s).
The final pH was 7.19 (T = 23.4 C). The slurry was filtered through a glass filter without any problem. The weight of the wet cake was 197.9 g.
EMI9.1
After washing with 1x100 ml demineralised water, 1x100 ml 80 vol% acetone and drying for about 16 hours at 300C and a relative humidity of 30%, 110.5 9 CEX. H2O obtained. This material consisted of needle-shaped crystals with an average length of 150 µm and an average diameter of 10-15 µm.
The content of CEX, calculated on an anhydrous basis, was 98.1% by mass.