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PROROGUES. COMPOSITION PHARMACEUTIOUE LES COMPRENANT ET
LEUR UTILISATION.
Objet de J'invention.
La présente invention, concerne des prodrogues, la compositlon phdrmaceutique Les comprenant et l'utilisation de celles-ci pour la préparation de médicaments destinés au traitement du cancer.
Etat de la technique et arrière-plan technologique à la base de l'invention.
De nombreux agents tumoraux, tels que les anthracycHnes et les alcaloïdes vinca, ont été développés ces dernières années et sont particulièrement efficaces pour le traitement des cancers. Cependant, ces molécules sont souvent caractérisées in vivo par une toxicité aiguë, en particulier une toxicité médullaire et muqueuse ainsi qu'une toxicité chronique cardiaque chez les anthracyclines et neurologique chez les alcaloides vinca.
Aussi, on a cherché à développer des agents antitumoraux plus spécifiques, de manière à ce qu'ils soient plus efficaces contre les cellules tumorales, et par conséquent, à diminuer les effets secondaires de ces produits (toxicité, destruction de cellules non tumorales,...).
Le brevet US-4,296, 105 décrit des dérivés de doxorubicine liés à un acide aminé, éventuellement substitué, qui possèdent in vitro une activité antitumorale plus élevée et une toxicité plus faible que la doxorubicine.
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Cependant, comme ces dérivés ont un site d'action intracellulaire, ces molécules sont encore susceptibles de pénétrer dans les cellules tumorales et dans les cellules normales.
Aussi, ces dernières années, de nouveaux agents thérapeutiques ont été proposés sous forme de prodrogues.
Les prodrogues sont des molécules susceptibles de se transformer en drogues (composés thérapeutiques actifs) par certaines modifications chimiques ou enzymatiques de leur structure.
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Buts de l'invention.
La présente invention vise à fournir des prodrogues comprenant un composé thérapeutique antitumoral, et qui présentent des propriétés thérapeutiques améliorées par rapport aux produits antitumoraux de l'état de la technique.
Un but particulier de la présente invention vise à obtenir des prodrogues qui présentent une spécificité d'action élevée, une toxicité réduite et une stabilité améliorée dans le sérum et le sang.
Eléments caractéristiques de la présente invention.
La présente invention concerne des prodrogues (M-Z) comprenant un composé thérapeutique antitumoral (M), possédant un site actif intracellulaire, lié à un ligant (Z) dans lequel la liaison entre le ligant (Z) et le composé thérapeutique antitumoral (M) empêche la pénétration cellulaire de la prodrogue (M-Z) et dans lequel la liaison est clivable sélectivement par des facteurs sécrétés par des cellules tumorales de manière à permettre la pénétration de l'agent thérapeutique (M) dans lesdites cellules tumorales.
On entend par facteurs sécrétés par des cellules tumorales, des enzymes telles que des protéases ou peptidases, sécrétées de. manière spécifique dans le milieu extracellulaire par des cellules tumorales.
Ces enzymes sont donc susceptibles de cliver sélectivement la liaison existant entre le composé thérapeutique antitumoral (M) et le ligant (Z) de manière à
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permettre la pénétration de l'agent thérapeutique (M) uniquement dans lesdites cellules tumorales, et d'assurer sélectivementleurdestruction.
De référence, la liaison entre le composé
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thérapeutique antitumoral (M) et le ligant (Z) consiste et un lien peptidique.
Avantageusement, le ligant (Z) comprend un peptide constitué d'au moins deux acides aminés (Y-X) éventuellement substitués.
Selon l'invention, l'agent thérapeutique (M) est choisi parmi le groupe constitué par les anthracyclines et les alcaloïdes vinca, la mitoxanthrone et la calichéamycine, éventuellement liés à un acide aminé substitué ou non.
De préférence, l'agent thérapeutique (M) est choisi parmi le groupe des anthracyclines constitué notamment par la doxorubicine et la daunorub1cine, éventuellement liées à
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un acide aminé substitué ou non.
Avantageusement, l'agent thérapeutique correspond
EMI3.3
à la formule générale OH 1 CO-CH2 -R OH 0 1 il 0 CH, 0 0 OH cH-cHOH-CH-CH, NU-RUZ 1 2 NH-R
EMI3.4
CHJ. J J. f'U. -LJ- - Ri est un atome d'hydrogène ou un groupement OH, - R2 est un radical de formule
EMI3.5
dans Laquelle : - R3 est un atome d'hydrogène ou un radical alkyle, éventuellement substitué,' - R4 représente un atome d'hydrogène ou forme avec R3 un radical alkylène comportant 3 ou 4 atomes de carbone.
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De préférence, R"est un radical de formule :
EMI4.2
\, t11 x CH--CH--CH--CO- (leucyle), ou un de ses CH NH2 isomères
EMI4.3
Les autres exemples d'agents thérapeutiques cités correspondent aux formules suivantes :
EMI4.4
C CH, 30 N VINCRISTINE C R = O=c-H < . -cnL--'\.
V, > L R = chez C R = CH 0=C-0-CWg H C) =C-O-CH R = CH3 Pa NHCH2CH2NHCH2CH20H MITOXANTRONE OH 0 NHCHCHNHCHCHOH 0 ÀHCO :, CH : j Ho-"r -"p-NHCHCH CMj 0.-Lj NH YY'z H 0 çr"oaOH cwa CH H HO--Y H04 0 CHsO OH Calicheamicin'' {11
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Afin d'augmenter la stabilité de la prodrogue dans le sérum et dans la circulation sanguine, la chaîne peptidique du composé thérapeutique antitumoral est allongée et le ligant (Z) comporte au moins un groupement (W) choisi parmi le groupe constitué par les acides aminés non présents chez les mammifères et les acides aminés D.
Selon une forme d'exécution préférée de l'invention, la prodrogue est La -L-Alanyl-L-LeucyL-L- Alanyl-L-Leucyl-Daunorubicine ou la ss-L-Alanyl-L-Leucyl-L- Alanyl-L-Leucyl-Doxorubicine.
Brève description des figures.
La figure 1 représente le mécanisme d'action de la prodrogue sur son site d'action (S. A.) dans une cellule tumorale (C. T.).
La figure 2 représente le mécanisme d'action de la prodrogues sur son mte d'action (S. A. ) dans une cellule normale (C. N. ).
Description d'une forme d'exécution préférée de l'invention.
La présente invention repose sur le concept qu'il est possible de rendre un composé thérapeutique antitumoral (M) inactif par La liaison avec un ligant (Z) qui empêche la pénétration intracellulaire du composé thérapeutique antitumoral (M) dans des cellules normales (C. N.) et des cellules tumorales (C. T.).
De manière inattendue, les cellules tumorales (C. T. ) libèrent dans le milieu extracellulaire des enzymes telles que des protéases ou des peptidases qui sont susceptibles d'hydrolyser sélectivement la liaison peptidique entre le ligant (Z) et le composé thérapeutique antitumoral (M), de manière à permettre la pénétration de l'agent thérapeutique (M) ou de son précurseur (M*) dans lesdites cellules tumorales (C. T. ). Dans la cellule tumorale, le composé thérapeutique (M) agit directement sur son site d'action intracellulaire spécifique (S. A. ) ou son précurseur (M*), et après une modification sous l'action de protéases intracellulaires, se modifie en composé thérapeutique (M) et
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tue la cellule tumorale (C. T.).
Comme les cellules normales ne libèrent pas ces enzymes, la prodrogue est maintenue inactive et ne pénètre pas dans les cellules normales. (Figure 2).
La prodrogue décrite dans la présente demande de brevet répond à ce mécanisme d'action, car elle remplit les critères nécessaires pour qu'une prodrogue puisse être administrée de manière efficace :
1. Le composé thérapeutique antitumoral : - possède un site d'action intracellulaire, - une haute activité spécifique, - un groupement chimique permettant une liaison covalente avec un acide aminé ou un peptide ; si le groupement chimique est essentiel à l'activité intracellulaire du composé thérapeutique anL1Lumoral, celui-ci peut être restitué intact après hydrolyse enzymatique de ladite liaison covalente ; si le groupement chimique requis n'est pas essentiel à l'activité du composé thérapeutique antitumoral, celui-ci ne doit pas être restitué intact après hydrolyse enzymatique de ladite liaison covalente.
2. La liaison avec le ligant (Z) empêche la pénétration intracellulaire de l'agent antitumoral tant dans les cellules normales que dans les cellules tumorales.
3. La prodrogue selon l'invention reste stable dans le sérum et dans le sang, et est insensible à l'action des peptidases circulantes et associées aux globules rouges.
4. La liaison covalente existant entre le composé thérapeutique antitumoral (M) et le ligant (Z) est dégradée partiellement ou totalement par les enzymes sécrétées par les cellules tumorales cibles.
5. Ces enzymes peuvent être des aminopeptidases, des carboxypeptidases, des endopeptidases ou des exopeptidases.
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6. La séquence des acides aminés du peptide ainsi que le mode de liaison du peptide ou de l'acide aminé au composé thérapeutique antitumoral (M) est déterminé en fonction des enzymes sécrétées par les cellules tumorales cibles.
7. La prodrogue (M-Z) est moins toxique in vivo que le médicament de départ. Cette diminution de toxicité concerne notamment les effets aigus tels que la toxicité médullaire et mucosale, ainsi que la toxicité cardiaque ou neurologique.
8. La prodrogue est généralement caractérisée par une plus grande activité sur les modèles de tumeurs solides (par exemple par injection des cellules tumorales par voie sous-cutanée) que sur les modèles de type"leucémique"obtenus après injection intraveineuse des cellules tumorales.
9. Les cellules tumorales injectées par voie sous- cutanée forment une tumeur solide à l'endroit de l'injection et la concentration locale des hydrolases sécrétées par ces cellules restera importante. Quand les cellules tumorales sont injectées par voie intraveineuse, les hydrolases qu'elles sécrètent seront immédiatement diluées dans le flux sanguin.
La présente invention sera décrite de manière plus détaillée dans les exemples suivants donnés à titre d'illustration non limitative de la présente invention.
Exemple 1.
Syntèsc de la N-L-Leucyl-Daunorubicine (Leu-DNR)
La L-Leucyl-Daunorubicine est synthétisée par réaction de la Daunorubicine sous forme de base (DNR) avec la L-Leucine protégée sur sa fonction amine par un groupe FMOC (fluorenyl-méthoxy-carbonyle) et dont la fonction carboxylique est activé par de l'IBCF (isobutylchloroformiate), puis déprotection de la fonction aminé.
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La DNR sous forme de base est préparée à partir de 200 mg de chlohydrate de Daunorubicune (R. Bellon) dissous dans 500 ul de DMF (dimethylformamide) auxquels on ajoute 1, 2 équivalents de de N-Methyle-Morpholine.
1, 2 equLvalents de FMOC-N-Leucine (NOVA BIOCHEM)
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sont dissous dans 500 ul de DMF (dimethylformamide), et 1, 2 équivalents de N-Methyle-Morpholine et 1,2 équivalents d'IBCF sont ajoutés à-20C. Après 15 minutes cette solution est ajoutée à celle de la DNR base et le mélange est laissé pendant 6 heures, sous agitation, à l'abri de La lumière.
La FMOC-N-L-Leucyl-Daunorubicine est précipitée dans 150 ml d'un mélange 1 : 1 d'éther et d'éther de pétrole (40-60 C) puis filtrée sur verre fritte n 4. Le produit est purifié par chromatographie sur colonne de silice (silice Si- 60 70-230 mesh de E. MERCK) éluée par du chloroforme. La DNR résiduelle est éluee par 10 de Methanol. Les fractions contenant la FMOC-N-L-Leucyl-DNR sont rotavapées, le produit repris dans 500 pi de DMF. La déprotection est réalisée en ajoutant 5 équivalents de diethyleamine (LAB SCAN) à -20 C.
Après 1 heure la N-L-Leucyl-DNR est précipitée par
EMI8.2
un mélange 1 : 1 d'éther et d'éther de pétrole (40-60oC), puis filtrée sur verre fritté n 4. Le produit est repris dans un mélange chloroforme/méthanol (4 : 1 en volume) et la diethylamine est neutralisée par un équivalent d'cl
Le produit est ensuite purifié par chromatographie sur colonne de silice (silice Si-60 70-230 mesh de E. MERCK) éluée par du chloroforme, puis du choroforme contenant zu de Methanol. Les fractions contenant la N-L-Leucyl-DNR sont rotavapées le produit repris dans de l'eau distillée et le chlorhydrate formé par ajustement du pH à 7 par de l'HCl IN.
Le produit est ensuite filtré sur gel de silice modifié (seppak C18 de WATERS) 1 - le chlorhydrate de N-L-LeucylDaunorubicine est élué par du méthanol puis rotavapé. Le rendement habituel est de 70 à zu
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Synhcise de la N-L-Alanyl-I,-Leucyl-Daunorubicine {Ala-LeuIJNR) La N-L-Alanyl-L-Leucyl-Daunorubicine (Ala-Leu-DNR) est : 3Yl1thétlsée de la même facon que la N-L-LeucylDaullorubicjne (Leu-DNR) mais en partant de la Leu-DNR au lieu de la DNR.
Caractcrstiques des produis.
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<tb>
<tb>
Composé <SEP> Formule <SEP> Point <SEP> Rf <SEP> TLC <SEP> Tr
<tb> fusion <SEP> HPLC
<tb> ( C)
<tb> DNR <SEP> C27H29NO10,HCL <SEP> 189 <SEP> 0,05 <SEP> 0,67
<tb> L-Leu-DNR <SEP> C33H40N8O11,HCL <SEP> 201 <SEP> 0,31 <SEP> 0, <SEP> 48
<tb> L-Ala-L-Leu-DNR <SEP> C36H45N3O12,HCL <SEP> 205 <SEP> 0,17 <SEP> 0,64
<tb>
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Rf TLC : système chloroforme : methanol : eau (120 : 20 : 1, en volume) Tr IIPLC : temps de rétention par rapport à la duxorubi. cine, sytème HPLC : colonne Si-60, éluée par un mélange Cloroforme : methanol : acide acétique : sol. aqueuse de MgCl2 0, 3 mM (1440 : 420 : 80 : 60, en volume). ynce cG d -L-Lcucy-ooruce.
La synthèse de la N-L-Leucyl-Doxorubicine est décrite dans le brevet US 4, 296, 105. Elle peut également être synthétisée comme décrit pour la synthèse de la N-L-LeucylDaunorubicine (exemple 1) à partir de la Doxorubicine.
Synthèse de la -L-Alanl-L-Leucyl-L-Alanine.
La ss-L-Alanyl-L-Leucyl-L-Alanine est préparée par synthèse en phase solide selon la technique de merrifield.
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Synthèsc dc la ss-L-Alanyl-L-Leucyl-L-Alanyl-L-LeucylDaunorubicine.
La ss-L-Alanyl-L-Leucyl-L-ALanyl-L-Leucyl- Daunorubicine esL synthétisée par greffage de la Fmoc-ss-L- Alanyl-L-Leucyl-L-Alanine, préparée par synthèse en phase solide, sur la N-L-Leucyl-Daunorubicine.
A la Fmoc-ss-L-alanyl-L-Leucyl-L-Alanine (1,5 équivalents) dissoute dans la DMF sont ajoutés 1, 5 équivalents (éq. ) de N-méthyle-morpholine et 1, 5 éq. d'isobutyl chloroformiate. Après 10 minutes à -20 C, 1,5 éq. d'HOBT sont ajoutés. Puis après 5 minutes, 1 éq. de N-L- Leucy 1- Da unorublc ine base dissous dans la DMF est ajouté.
Après réaction, la Fmoc-H-L-Alanyl-L-Leucyl-L-Alanyl-L- Leucyl-Daunorubicine est précipitée à l'éther, puis déprotégée par la diéthyleamjne. La ss-L-Alanyl-L-Leucyl-LAlanyl-L-Leucyl-Daunorubicine est purifiée par chromatographie sur colonne de silice et le chlorhydrate formé par addition d'HCl 1N.
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f 1-L-Alanyl-L-Leuc" Synthèec de la 3-L-Alanyl-L-Leucy DoxorubicineLa ss-L-Alanyl-L-Leucyl-L-Alanyl-L-Leucyl- Doxorubicille est synthétisée par greffage de la ss-L-Alanyl-L- Leucyl-L-Alanine, préparée par synthèse en phase solide, sur la N-L-Leucyl-Doxorubicine, tel que décrit pour la synthèse de la -L-Alanyl-L-Leucyl-L-Alanyl-L-Leucyl-Daunorubicine.
Exemple 2.
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Activité des dérivés au niveau moléculaire déterminée par l'affinité pour l'ADN.
L'ADN constitue la cible intracellulaire des anthracyclines telles que la Daunorubicine.
Les constantes d'affinité pour l'ADN (Ka) et le nombre de sites de fixation par paire de base (nmax), ont été
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déterminés, par spectrophotométrie, à 25C dans du tampon phosphate physiologique (FBS) à pH 7, 4.
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<tb>
<tb> composé <SEP> Ka <SEP> x <SEP> 10-6 <SEP> (M-1) <SEP> nmax
<tb> DNR <SEP> 0, <SEP> 31 <SEP> 0, <SEP> 16
<tb> L-Leu-UNR <SEP> 0, <SEP> 130, <SEP> 20
<tb> L-Ala-L-Leu-DNR <SEP> 0,02 <SEP> 0,17
<tb>
Ces résultats indiquent que l'interaction de la LAla-L-Leu-DNR avec l'ADN sera 15 Cois plus faible que celle entre la DNR et l'ADN.
Exemple 3.
Stabilité dans les milieux extracellulaires.
Stabilité en présence de sérum
La sensibilité des dérivés à l'hydrolyse dans du sérum a été déterminée en incubant ceux-ci à une concentration Finale de 17,7 M, à 37 C dans du sérum humain. L'hydrolyse est suivie par HPLC et fluorimétrie au cours du temps après extraction d'aliquots.
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<tb>
<tb>
1 <SEP> composé <SEP> 1 <SEP> hydrolysé <SEP> en <SEP> Leu- <SEP> hydrolysé <SEP> en <SEP> DNR
<tb> DNR <SEP> après <SEP> l <SEP> h <SEP> après <SEP> 1 <SEP> h
<tb> DNR
<tb> L-Ala-L-Leu-6. <SEP> 9 <SEP> 0
<tb> DNR
<tb>
L'Ala-Leu-DNR s'hydrolyse rapidement, à 37 C, en L-Leu-DNR, dans le sérum humain.
La Leu-DNR est stable dans le sérum humain.
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Stabilité en présence de sang humain.
Bien que stable en présence de sérum, la N-L- Leucyl-Daunorubicine et la N-L-Leucyl-Doxorubicine s'hydrolisent rapidement en Daunorubicine et Doxorubicine en présence de sang humain. Il en est de même quand la N-L-AlaL-Leu-DNR est incubée à 370C en présence de sang humain pendant 1 heure.
Afin d'augmenter la stabilité dans le sang de la N-L-Ala-L-Leu-DNR, toute une série de dérivés ont été synthétisés (voir tableau).
L'addition d'un acide aminé, tel que la L-Alanine, la L-Leucine ou la L-norleuclne, n'empêche pas l'hydrolyse dans le sang.
L'addition d'un groupe succinyle ou pyroglutamyle empêche l'hydrolyse des dérivés peptldiques de la DNR par les protéases sécrétées dans le milieu conditionné ds cellules MCF7/6.
L'addition d'un acide aminé D, soit bloque et l'hydrolyse sanguine et l'hydrolyse dans le milieu conditionné, soit n'empêche aucune des deux hydrolyses, suivant La Jongueur de la chaîne peptidique greffée sur la DNR.
La seule séquence bloquant spécifiquement l'hydrolyse au niveau du sang, sans empêcher l'hydrolyse au niveau du milieu conditionné des cellules de la tumeur
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mammaire, est la séquence ss-L-Alanyl-L-Leucyl-L-Alanyl-LLeucine. En effet, aussi bien la ss-L-Alanyl-L-Leucyl-LAlanyl-L-Leucyl-Daunorubicine, la ss-L-Alanyl-L-Leucyl-LAlanyl-L-Leucyl-Doxorubicine et la R-L-Alanyl-L-Leucyl-LAL1 :
iyJ-L-Leucyl-Coumarine sont stables en présence de sang humain à 370C pendant 1 heure, et sont hydrolysées respectivement en N-L-Leucyl-Daunorubicine, N-L-LeucylDoxorubicine et N-L-Leucyl-Coumarine dans le milieu conditionné des cellules MCF7/6.
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HYDROLYSE DE DERIVES DE LA DAUNORUBICINE (DNR)
ET DE LA DOXORUBICINE (DOX)
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<tb>
<tb> COMPOSE <SEP> Sang <SEP> Milieu
<tb> Humain <SEP> Conditionne
<tb> MC <SEP> F- <SEP> 7/6
<tb> 1 <SEP> a-L-Leu-DNR <SEP> + <SEP> + <SEP> Hydrolyse <SEP> en <SEP> L-Leu-DNR
<tb> L-ala-L-Ala-L-Leu-DNR <SEP> Hydrolyse <SEP> en <SEP> L-Leu-DNF
<tb> I.-NLeu-L-Ala-L-Leu-DNR <SEP> + <SEP> +
<tb> L-Leu-L-Ala-L-Leu-DNR <SEP> + <SEP> +
<tb> L <SEP> ala-L-Leu-L-Ala-L-Leu-DNR <SEP> + <SEP> +
<tb> Succ-L-Ala-L-Leu-DNR-Suce-L-Leu-L-Ala-L-Leu-DNR <SEP> - <SEP> - <SEP> "
<tb> Suce-L-Ala-L-Leu-L-Ala <SEP> L-Leu-DNR <SEP> (+)
<SEP> - <SEP> "
<tb> pGlu-L-Ala-L-Leu-L-Ala-L-Leu-DOX <SEP> + <SEP> - <SEP> Hydrolyse <SEP> en <SEP> L-Leu-DOX
<tb> D-Leu-L-ala-L-Leu-DNR <SEP> - <SEP> - <SEP> Hydrolyse <SEP> en <SEP> L-Leu-DNR
<tb> D-Ala-L-Leu-L-Ala-L-Leu-DNR <SEP> (+)
<tb> D-Leu-L-Ala-L-Leu-L-Ala-L-Leu-DNR <SEP> + <SEP> +
<tb> D-Leu-L-Ala-L-Leu-L-Ala-L-Leu-DNR <SEP> (+) <SEP> (+)
<tb> ss-L-Ala-L-Leu-DNR <SEP> - <SEP> L-NLeu-ss-L-Ala-L-Leu-DNR <SEP> + <SEP> +
<tb> ss-Ala-L-Ala-L-Leu-DNR <SEP> - <SEP> R-ALa-L <SEP> Leu-L-ALa-L-Leu-DNR-+ <SEP> Hydrolyse <SEP> en <SEP> L-Leu-DNF
<tb> ss-Ala-L-leu-L-Ala-L-Leu-DOX <SEP> - <SEP> + <SEP> Hydrolyse <SEP> en <SEP> L-Leu-DOX
<tb> ss-Ala-L-Leu-L-ala-L-Leu-COU+ <SEP> - <SEP> + <SEP> Hydrolyse <SEP> en <SEP> L-Leu-COU
<tb>
* COU : coumarine
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Exemple 4.
Pharmacologie cellulaire et taux réduit de pénétration lntracellulaire.
EMI14.1
Accumulation intracellulaire par des cellules normales (fibroblastes de rat)
L'accumulation intracellulaire des dérivés
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-int 1 anthracycliniqucs par des cellules normales est déterminée en uLjLisant comme modèle expérimental les fibroblastes d'embryons de rat, cultivés in vitro dans du milieu Eagle/Dulbecco contenant 10 de sérum de veau.
Les cellules confluentes sont incubées a 37 C dans ce milieu contenant les dérivés a 17, 7 uM. Après incubation, les cellules sont lavees 3 fois avec du PBS, reprises dans du PBS, soniquées et les anthracyclines extraites à pH 9 par un mélange chloroforme : methanol (4 : 1, en volume).
L'accumulation est suivie par HPLC et fluorlmétrie, au cours du temps.
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<tb>
<tb> composé <SEP> Quantité <SEP> accumulée <SEP> Quantité <SEP> accumulée
<tb> après <SEP> 1 <SEP> h <SEP> après <SEP> 6 <SEP> h
<tb> (nMoles/mg <SEP> (nMoles/mg
<tb> prot. <SEP> cell <SEP> ;) <SEP> prot. <SEP> cell <SEP> ;)
<tb> DNR <SEP> 18, <SEP> 8 <SEP> 36,1
<tb> L-Leu-DNR <SEP> 12, <SEP> 2 <SEP> 26,2
<tb> L-Ala-L-Leu- <SEP> 1,2 <SEP> 7,1
<tb> DNR
<tb>
L'Ala-Leu-DNR, avant qu'elle ne soit hydrolysée dans le milieu extracellulaire en Leu-DNR, rentre 15 fois moins vite (après 1 h) que la DNR dans les cellules normales.
Accumulation intracellulaire par des cellules tumorales L1210 (leucémiemurine)
L'accumulation intracellulaire des dérivés est déterminée en utilisant, comme modèle expérimental de
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cellules tumorales, les cellules de la leucémie murine L1210, cultivées ln vitro dans du milieu RPMI 1640 contenant 10 de sérum de veau foetal.
Les cellules confluentes sont incubées à 370C dans ce milieu contenant Les dérivés à 17, 7 pM. Après incubation, les cellules sont lavées 3 fois avec du PBS, reprises dans du peu, soniquées et les anthracyclines extraites à pH 9 par un mélange chloroforme : methanoL (4 : 1, en volume).
L'accumulation est suivie par HPLC et fluorimétrie, au cours du temps.
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<tb>
<tb> composé <SEP> Quantité <SEP> accumulée <SEP> Quantité <SEP> accumulée
<tb> après <SEP> 1 <SEP> h <SEP> après <SEP> 6 <SEP> h
<tb> (uMoles/mg <SEP> (nMoles/mg
<tb> prot.cell;) <SEP> prot.cell;)
<tb> DNR <SEP> 33, <SEP> 0 <SEP> 43,9
<tb> T.-Ijpu-DNR <SEP> 18, <SEP> 3 <SEP> 32, <SEP> 0
<tb> L-Ala-L-Leu-1, <SEP> 5 <SEP> 4,7
<tb> DNR
<tb>
L'Ala-Leu-DNR pénètre 10 à 20 fois moins bien dans les cellules L1210 que la DNR.
Exemple 5.
Activation par les enzymes sécrétées par les cellules de carcinome mammaire.
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//yc/jroly < ? C/C. S dérivés par du milieu conditionné de cellules tumorales MCF7 {cancer du sein)
Les cellules MCF7/6 confluentes ont été cultivées in vitro dans du milieu DMEM F12 contenant de la BSA (0,2 mg/ml), de la transferrine (10 pg/ml) et de l'insuline (0,25 g/ml) et des oestrogènes (10 nM).
Le milieu a ensuite été concentré 18 fois. Les
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anthracyclines, à la concentration de] 7, 7 uM) ont été incubées à 370C à pH 7,3 dans ce milieu conditionné et les anthracyclines ont été extraites sur des aliquots prélevées au cours du temps, à pH 9 par un mélange chloroforme : methanol (4 : 1, en volume). L'accumulation est suivie par HPLC et fluorimetne.
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<tb>
<tb>
1 <SEP> composé <SEP> 1 <SEP> hydrolysé <SEP> après <SEP> hydrolysé <SEP> après
<tb> composé <SEP> hydrolysé <SEP> après <SEP> hydrolysé <SEP> après
<tb> 1 <SEP> h <SEP> 2 <SEP> h
<tb> DNR <SEP> - <SEP> L-Leu-DNR <SEP> en <SEP> DNR <SEP> 1,4 <SEP> en <SEP> DNR <SEP> 10,2
<tb> L-Ala-L-Leu- <SEP> en <SEP> DNR <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> en <SEP> DNR <SEP> 10,7
<tb> DNR <SEP> en <SEP> L-Leu-DNR <SEP> 87, <SEP> 6 <SEP> en <SEP> L-Leu-DNR <SEP> 86,2
<tb>
L'Ala-Leu-DNR est rapidement hydrolysée en L-LeuDNR dans du milieu conditionné, ce qui implique que les cellules tumorales ont secrété dans le milieu une peptidase ou une protéase capable de rompre le lien peptidique entre l'Alanine et la Leucine de l'Ala-Leu-DNR.
La L-Ala-L-Ala-DNR, la L-Ala-L-Norleu-DNR et la L- f-Ala-L-Leu-DNR ne sont pas hydrolysées dans le milieu conditionné.
EMI16.2
Iydrolyse"intracellulaire"par les hydrolases lysosomiales Il ydrQI y"intracellula-ire"i2ar les hyLr
La sensibilité des dérivés à l'hydrolyse lysosomiale a été déterminée en incubant à 370C 0,75 ml de tampon 0, 2M à pH 4,5 contenant 0,035 umoles de composé et 0, 25 ml d'une fraction soluble d'enzymes lysosomiaux purifiés à partir de foie de rats et ayant une concentration protéique de 3 mg/ml. L'hydrolyse est suivie par IIPLC et fluorimétrie, au cours du temps après extraction d'aliquots.
<Desc/Clms Page number 17>
EMI17.1
<tb>
<tb> composé <SEP> hydrolysé <SEP> en <SEP> DNR <SEP> hydrolysé <SEP> en <SEP> DNR
<tb> aprèr <SEP> 1 <SEP> h <SEP> après <SEP> 6 <SEP> h
<tb> DNR <SEP> - <SEP> L-Leu-DNR <SEP> 35 <SEP> 91
<tb> L-Ala-L-Leu-DNR <SEP> 83 <SEP> > <SEP> 90
<tb>
Vu l'ubiquité de la présence de lysosomes dans les cellules normales et tumorales, ces résultats indiquent que les cellules possèdent la machinerie enzymatique pour régénérer intracellulairement la DNR A partir de la L-Leu-DNR formée extracellulairement à partir de la L-Ala-L-Leu-DNR ou a partir dela ss-L-ala-L-leu-L-Ala-L-Leu-DNr.
Exemple 6.
Activité in vitro.
Cytotoxicité sur cellules tumorales L1210 en culture.
La cytotoxicité des dérivés anthracycliniques est déterminée en utilisant, comme modèle expérimental de cellules tumorales, les cellules de la leucémie murine L1210, cultivees in vitro dans du milieu RPMI 1640 contenant 10A de sérum de veau foetal.
Les cellules en croissance (9 105 cellules) sont pré-incubées dans 3 ml de milieu RPMI contenant 10'.'due sérum de veau foetal puis les dérivés sont ajoutés au milieu à une concentration finale de 17, 7 uM. Après 24 h ou 72 h d'incubation, l'évolution de la population cellulaire est déterminée par dosage des protéines selon la méthode de Lowry.
Les résultats sont exprimés en de croissance par rapport à des cellules contrôles incubées en absence de dérivés.
<Desc/Clms Page number 18>
EMI18.1
<tb>
<tb> composé <SEP> Croissance <SEP> Croissance
<tb> cellulaire <SEP> (', <SEP> des <SEP> cellulaire <SEP> ('- <SEP> des
<tb> contrôles <SEP> au <SEP> our <SEP> 1) <SEP> contrôles <SEP> au <SEP> jour <SEP> 3)
<tb> DNR-45-63
<tb> L-ala-L-Leu-DNR <SEP> 72 <SEP> - <SEP> 9
<tb>
L'Ala-Leu-DNR au jour 1 n'est pratiquement pas cytotoxique vis-à-vis des cellules L1210 en culture. Elle devient cytotoxique au jour 3.
Exemple 7.
Toxicité aiguë.
EMI18.2
Toxicité in vivo chez la souris La toxicité in vivo des dérivés anthracycliniques est déterminée après injection intra-veineuse à des souris et détermination de la perte de poids au jour 8.
EMI18.3
<tb>
<tb> composé <SEP> Dose <SEP> injectée <SEP> variation <SEP> de <SEP> poids
<tb> (mg/kg) <SEP> au <SEP> jour <SEP> 8 <SEP> (',)
<tb> DNR <SEP> 10 <SEP> - <SEP> 4, <SEP> 3
<tb> 11 <SEP> - <SEP> 5, <SEP> 9
<tb> 12 <SEP> - <SEP> 6, <SEP> 3
<tb> L-Ala-L-Leu-DNR <SEP> 53-5, <SEP> 0
<tb> 60-8, <SEP> 2
<tb> 6623, <SEP> 4
<tb>
Les doses équitoxiques de Ala-Leu-DNR et de DNR sont respectivement de 53 et Il mg/kg.
<Desc/Clms Page number 19>
EMI19.1
Exemple 8.
Activite antitumorale in vivo.
Activité ciiim-iothérap-iciue sous-la formc-intrave-ineuse de la leucémie L1210
L'activité chimiothérapeutique des dérivés anthracycliniques, sous la forme intraveineuse de la leucémie L1210 a été déterminée en inoculant des souris DBA2 femelles au jour 0 avec 104 cellules leucémiques. Les produits sont administrés par voie T. V. aux jours 1 et 2. L'activité est exprimée en d'augmentation de survie (ILS) et en nombre de survivants à lonq terme.
EMI19.2
<tb>
<tb> composé <SEP> Dose <SEP> ILS <SEP> () <SEP> survivants/
<tb> injectée <SEP> total <SEP> au
<tb> (mq/kq) <SEP> jour <SEP> 30
<tb> DNR <SEP> 10 <SEP> 42 <SEP> 0/18
<tb> 11 <SEP> 66 <SEP> 0/37
<tb> 12 <SEP> 123 <SEP> 6/34
<tb> L-Ala-L-Leu-42 <SEP> 25 <SEP> 0/8
<tb> DNR
<tb>
EMI19.3
L ia-Leu-ui\t\ a ues uus'-) Lu-i-b pj-U. = t, j. HvHù.
(doses équitoxiques) que la DNR, n'est pas significativement active sur la forme intraveineuse de la leucémie murine L1210.
Activité chimiothérapique sous la forme sous-cutanée de la leucémie L1210
L'activité chimiothérapeutique des dérivés anthracycliniques, sous la forme sous-cutanée de la leucémie L1210 a été déterminée en inoculant, par voie sous-cutanée, des souris DBA2 femelles au jour 0 avec 105 cellules leucémiques. Les produits sont administrés par voie I. V. aux jours 1 et 2.
L'activité est exprimée en ? d'augmentation de survie (ILS) et en nombre de survivants à long terme.
<Desc/Clms Page number 20>
EMI20.1
<tb>
<tb> composé <SEP> Dose <SEP> ILS <SEP> (A) <SEP> survivants <SEP> /
<tb> injectée <SEP> total <SEP> au
<tb> (mg/kq) <SEP> jour <SEP> 30
<tb> DNR <SEP> 10 <SEP> 65 <SEP> 0/58
<tb> Il <SEP> 67 <SEP> 3/37
<tb> 12 <SEP> 83 <SEP> 3/36
<tb> L-Ala-L-Leu-53 <SEP> 168 <SEP> 12/34
<tb> DNR <SEP> 60 <SEP> 193 <SEP> 18/33
<tb> 66 <SEP> 73 <SEP> 1 <SEP> / <SEP> 10
<tb>
L'Ala-Leu-DNR à des doses 4 fois plus élevées (doses équitoxiques) que la DNR, est significativement plus active que la DNR, sur la forme sous-cutanée de la leucémie murine L1210.
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PROROGUES. PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THE SAME AND
THEIR USAGE.
Object of the invention.
The present invention relates to prodrugs, pharmaceutical composition comprising them and the use thereof for the preparation of medicaments for the treatment of cancer.
State of the art and technological background underlying the invention.
Many tumor agents, such as anthracycHnes and vinca alkaloids, have been developed in recent years and are particularly effective for the treatment of cancers. However, these molecules are often characterized in vivo by acute toxicity, in particular spinal and mucosal toxicity as well as chronic cardiac toxicity in anthracyclines and neurological in vinca alkaloids.
Also, we have sought to develop more specific anti-tumor agents, so that they are more effective against tumor cells, and therefore, to reduce the side effects of these products (toxicity, destruction of non-tumor cells. ..).
Patent US-4,296,105 describes doxorubicin derivatives linked to an amino acid, optionally substituted, which have in vitro a higher anti-tumor activity and a lower toxicity than doxorubicin.
<Desc / Clms Page number 2>
However, as these derivatives have an intracellular site of action, these molecules are still capable of penetrating into tumor cells and into normal cells.
Also, in recent years, new therapeutic agents have been proposed in the form of prodrugs.
Prodrugs are molecules that can transform into drugs (active therapeutic compounds) by certain chemical or enzymatic changes in their structure.
EMI2.1
Aims of the invention.
The present invention aims to provide prodrugs comprising an anti-tumor therapeutic compound, and which have improved therapeutic properties compared to the anti-tumor products of the prior art.
A particular object of the present invention is to obtain prodrugs which have a high specificity of action, reduced toxicity and improved stability in serum and blood.
Characteristic elements of the present invention.
The present invention relates to prodrugs (MZ) comprising an anti-tumor therapeutic compound (M), having an intracellular active site, linked to a ligant (Z) in which the binding between the ligant (Z) and the anti-tumor therapeutic compound (M) cell penetration of the prodrug (MZ) and in which the bond is selectively cleavable by factors secreted by tumor cells so as to allow the penetration of the therapeutic agent (M) into said tumor cells.
By factors secreted by tumor cells is meant enzymes such as proteases or peptidases secreted from. specifically in the extracellular medium by tumor cells.
These enzymes are therefore capable of selectively cleaving the bond existing between the anti-tumor therapeutic compound (M) and the ligant (Z) so as to
<Desc / Clms Page number 3>
allow the therapeutic agent (M) to penetrate only into said tumor cells, and to selectively assure their destruction.
For reference, the bond between the compound
EMI3.1
anti-tumor therapy (M) and the ligant (Z) consists of and a peptide link.
Advantageously, the ligant (Z) comprises a peptide consisting of at least two amino acids (Y-X) optionally substituted.
According to the invention, the therapeutic agent (M) is chosen from the group consisting of anthracyclines and vinca alkaloids, mitoxanthrone and calichéamycin, optionally linked to a substituted or unsubstituted amino acid.
Preferably, the therapeutic agent (M) is chosen from the group of anthracyclines constituted in particular by doxorubicin and daunorubin, optionally linked to
EMI3.2
a substituted or unsubstituted amino acid.
Advantageously, the therapeutic agent corresponds
EMI3.3
to the general formula OH 1 CO-CH2 -R OH 0 1 il 0 CH, 0 0 OH cH-cHOH-CH-CH, NU-RUZ 1 2 NH-R
EMI3.4
CHJ. J J. f'U. -LJ- - Ri is a hydrogen atom or an OH group, - R2 is a radical of formula
EMI3.5
in which: - R3 is a hydrogen atom or an alkyl radical, optionally substituted, '- R4 represents a hydrogen atom or forms with R3 an alkylene radical containing 3 or 4 carbon atoms.
<Desc / Clms Page number 4>
EMI4.1
Preferably, R "is a radical of formula:
EMI4.2
\, t11 x CH - CH - CH - CO- (leucyle), or one of its CH NH2 isomers
EMI4.3
The other examples of therapeutic agents mentioned correspond to the following formulas:
EMI4.4
C CH, 30 N VINCRISTINE C R = O = c-H <. -cnL - '\.
V,> LR = at CR = CH 0 = C-0-CWg HC) = CO-CH R = CH3 Pa NHCH2CH2NHCH2CH20H MITOXANTRONE OH 0 NHCHCHNHCHCHOH 0 ÀHCO:, CH: j Ho- "r -" p-NHCHCH CMj 0. -Lj NH YY'z H 0 çr "oaOH cwa CH H HO - Y H04 0 CHsO OH Calicheamicin '' {11
<Desc / Clms Page number 5>
In order to increase the stability of the prodrug in serum and in the blood circulation, the peptide chain of the anti-tumor therapeutic compound is lengthened and the ligant (Z) comprises at least one group (W) chosen from the group consisting of amino acids not present in mammals and amino acids D.
According to a preferred embodiment of the invention, the prodrug is La -L-Alanyl-L-LeucyL-L- Alanyl-L-Leucyl-Daunorubicine or ss-L-Alanyl-L-Leucyl-L- Alanyl- L-Leucyl-Doxorubicin.
Brief description of the figures.
FIG. 1 represents the mechanism of action of the prodrug at its site of action (S.A.) in a tumor cell (C.T.).
FIG. 2 represents the mechanism of action of the prodrug on its action mete (S. A.) in a normal cell (C. N.).
Description of a preferred embodiment of the invention.
The present invention is based on the concept that it is possible to make an anti-tumor therapeutic compound (M) inactive by binding with a ligant (Z) which prevents intracellular penetration of the anti-tumor therapeutic compound (M) into normal cells (CN). and tumor cells (CT).
Unexpectedly, tumor cells (CT) release into the extracellular medium enzymes such as proteases or peptidases which are capable of selectively hydrolyzing the peptide bond between the ligant (Z) and the therapeutic anti-tumor compound (M), so as to allow the therapeutic agent (M) or its precursor (M *) to penetrate into said tumor cells (CT). In the tumor cell, the therapeutic compound (M) acts directly on its specific intracellular site of action (SA) or its precursor (M *), and after a modification under the action of intracellular proteases, changes into a therapeutic compound ( M) and
<Desc / Clms Page number 6>
kills the tumor cell (C. T.).
Since normal cells do not release these enzymes, the prodrug is kept inactive and does not enter normal cells. (Figure 2).
The prodrug described in this patent application responds to this mechanism of action, because it fulfills the criteria necessary for a prodrug to be administered effectively:
1. The anti-tumor therapeutic compound: - has an intracellular action site, - a high specific activity, - a chemical group allowing a covalent bond with an amino acid or a peptide; if the chemical group is essential to the intracellular activity of the therapeutic compound anL1Lumoral, it can be restored intact after enzymatic hydrolysis of said covalent bond; if the required chemical group is not essential for the activity of the anti-tumor therapeutic compound, it must not be returned intact after enzymatic hydrolysis of said covalent bond.
2. The binding with the ligant (Z) prevents intracellular penetration of the antitumor agent both in normal cells and in tumor cells.
3. The prodrug according to the invention remains stable in serum and in the blood, and is insensitive to the action of circulating peptidases and associated with red blood cells.
4. The covalent bond existing between the anti-tumor therapeutic compound (M) and the ligant (Z) is partially or totally degraded by the enzymes secreted by the target tumor cells.
5. These enzymes can be aminopeptidases, carboxypeptidases, endopeptidases or exopeptidases.
<Desc / Clms Page number 7>
6. The amino acid sequence of the peptide as well as the mode of binding of the peptide or of the amino acid to the anti-tumor therapeutic compound (M) is determined as a function of the enzymes secreted by the target tumor cells.
7. The prodrug (M-Z) is less toxic in vivo than the starting drug. This reduction in toxicity relates in particular to acute effects such as spinal and mucosal toxicity, as well as cardiac or neurological toxicity.
8. The prodrug is generally characterized by greater activity on solid tumor models (for example by injection of tumor cells subcutaneously) than on "leukemic" type models obtained after intravenous injection of tumor cells.
9. The tumor cells injected subcutaneously form a solid tumor at the site of the injection and the local concentration of the hydrolases secreted by these cells will remain high. When tumor cells are injected intravenously, the hydrolases they secrete will be immediately diluted in the blood stream.
The present invention will be described in more detail in the following examples given by way of non-limiting illustration of the present invention.
Example 1.
N-L-Leucyl-Daunorubicin Syntèsc (Leu-DNR)
L-Leucyl-Daunorubicin is synthesized by reaction of Daunorubicin in base form (DNR) with L-Leucine protected on its amine function by an FMOC group (fluorenyl-methoxy-carbonyl) and whose carboxylic function is activated by IBCF (isobutylchloroformiate), then deprotection of the amino function.
<Desc / Clms Page number 8>
The DNR in the base form is prepared from 200 mg of Daunorubicune hydrochloride (R. Bellon) dissolved in 500 μl of DMF (dimethylformamide) to which 1.2 equivalents of N-Methyl-Morpholine are added.
1, 2 equivalents of FMOC-N-Leucine (NOVA BIOCHEM)
EMI8.1
are dissolved in 500 µl of DMF (dimethylformamide), and 1.2 equivalents of N-Methyl-Morpholine and 1.2 equivalents of IBCF are added at -20C. After 15 minutes, this solution is added to that of the base DNR and the mixture is left for 6 hours, with stirring, protected from light.
FMOC-NL-Leucyl-Daunorubicin is precipitated in 150 ml of a 1: 1 mixture of ether and petroleum ether (40-60 C) then filtered through sintered glass No. 4. The product is purified by chromatography on silica column (Si-60 silica 70-230 mesh from E. MERCK) eluted with chloroform. The residual DNR is eluted with 10 of Methanol. The fractions containing FMOC-N-L-Leucyl-DNR are rotavaped, the product taken up in 500 μl of DMF. Deprotection is carried out by adding 5 equivalents of diethyleamine (LAB SCAN) at -20 C.
After 1 hour the N-L-Leucyl-DNR is precipitated by
EMI8.2
a 1: 1 mixture of ether and petroleum ether (40-60oC), then filtered through sintered glass no 4. The product is taken up in a chloroform / methanol mixture (4: 1 by volume) and the diethylamine is neutralized by an equivalent of cl
The product is then purified by chromatography on a silica column (Si-60 silica 70-230 mesh of E. MERCK) eluted with chloroform, then choroform containing zu of Methanol. The fractions containing N-L-Leucyl-DNR are rotavapée the product taken up in distilled water and the hydrochloride formed by adjusting the pH to 7 with IN HCl.
The product is then filtered on modified silica gel (seppak C18 from WATERS) 1 - N-L-LeucylDaunorubicin hydrochloride is eluted with methanol and then rotavaped. The usual yield is 70 to zu
<Desc / Clms Page number 9>
EMI9.1
Synchronization of NL-Alanyl-I, -Leucyl-Daunorubicin (Ala-LeuIJNR) NL-Alanyl-L-Leucyl-Daunorubicin (Ala-Leu-DNR) is: 3Yl1thétlsée in the same way as NL-LeucylDaullorubicjne (Leu- DNR) but starting from Leu-DNR instead of DNR.
Product characteristics.
EMI9.2
<tb>
<tb>
Compound <SEP> Formula <SEP> Point <SEP> Rf <SEP> TLC <SEP> Tr
<tb> fusion <SEP> HPLC
<tb> (C)
<tb> DNR <SEP> C27H29NO10, HCL <SEP> 189 <SEP> 0.05 <SEP> 0.67
<tb> L-Leu-DNR <SEP> C33H40N8O11, HCL <SEP> 201 <SEP> 0.31 <SEP> 0, <SEP> 48
<tb> L-Ala-L-Leu-DNR <SEP> C36H45N3O12, HCL <SEP> 205 <SEP> 0.17 <SEP> 0.64
<tb>
EMI9.3
Rf TLC: chloroform system: methanol: water (120: 20: 1, by volume) Tr IIPLC: retention time compared to duxorubi. cine, HPLC system: Si-60 column, eluted with a Cloroform mixture: methanol: acetic acid: sol. 0.3 mM aqueous MgCl2 (1440: 420: 80: 60, by volume). ynce cG d -L-Lcucy-ooruce.
The synthesis of N-L-Leucyl-Doxorubicin is described in US Patent 4,296,105. It can also be synthesized as described for the synthesis of N-L-LeucylDaunorubicin (Example 1) from Doxorubicin.
Synthesis of -L-Alanl-L-Leucyl-L-Alanine.
Ss-L-Alanyl-L-Leucyl-L-Alanine is prepared by solid phase synthesis using the merrifield technique.
<Desc / Clms Page number 10>
EMI10.1
Synthesis of ss-L-Alanyl-L-Leucyl-L-Alanyl-L-LeucylDaunorubicin.
Ss-L-Alanyl-L-Leucyl-L-ALanyl-L-Leucyl- Daunorubicin esL synthesized by grafting Fmoc-ss-L- Alanyl-L-Leucyl-L-Alanine, prepared by synthesis in solid phase, on NL-Leucyl-Daunorubicin.
To the Fmoc-ss-L-alanyl-L-Leucyl-L-Alanine (1.5 equivalents) dissolved in DMF are added 1.5 equivalents (eq.) Of N-methyl-morpholine and 1.5 eq. isobutyl chloroformate. After 10 minutes at -20 C, 1.5 eq. of HOBT are added. Then after 5 minutes, 1 eq. of N-L-Leucy 1- Da unorublc ine base dissolved in DMF is added.
After reaction, the Fmoc-H-L-Alanyl-L-Leucyl-L-Alanyl-L-Leucyl-Daunorubicin is precipitated with ether, then deprotected with diethyleamyne. The ss-L-Alanyl-L-Leucyl-LAlanyl-L-Leucyl-Daunorubicin is purified by chromatography on a silica column and the hydrochloride formed by addition of 1N HCl.
EMI10.2
f 1-L-Alanyl-L-Leuc "Synthesis of 3-L-Alanyl-L-Leucy Doxorubicin The ss-L-Alanyl-L-Leucyl-L-Alanyl-L-Leucyl- Doxorubicil is synthesized by grafting the ss -L-Alanyl-L- Leucyl-L-Alanine, prepared by solid phase synthesis, on NL-Leucyl-Doxorubicin, as described for the synthesis of -L-Alanyl-L-Leucyl-L-Alanyl-L -Leucyl-Daunorubicin.
Example 2.
EMI10.3
Derivative activity at the molecular level determined by affinity for DNA.
DNA is the intracellular target of anthracyclines such as Daunorubicin.
The DNA affinity constants (Ka) and the number of binding sites per base pair (nmax), were
<Desc / Clms Page number 11>
EMI11.1
determined, spectrophotometrically, at 25C in physiological phosphate buffer (FBS) at pH 7.4.
EMI11.2
<tb>
<tb> compound <SEP> Ka <SEP> x <SEP> 10-6 <SEP> (M-1) <SEP> nmax
<tb> DNR <SEP> 0, <SEP> 31 <SEP> 0, <SEP> 16
<tb> L-Leu-UNR <SEP> 0, <SEP> 130, <SEP> 20
<tb> L-Ala-L-Leu-DNR <SEP> 0.02 <SEP> 0.17
<tb>
These results indicate that the interaction of LAla-L-Leu-DNR with DNA will be 15% weaker than that between DNR and DNA.
Example 3.
Stability in extracellular media.
Stability in the presence of serum
The sensitivity of the derivatives to hydrolysis in serum was determined by incubating them at a final concentration of 17.7 M, at 37 ° C. in human serum. The hydrolysis is followed by HPLC and fluorimetry over time after extraction of aliquots.
EMI11.3
<tb>
<tb>
1 <SEP> compound <SEP> 1 <SEP> hydrolyzed <SEP> in <SEP> Leu- <SEP> hydrolyzed <SEP> in <SEP> DNR
<tb> DNR <SEP> after <SEP> l <SEP> h <SEP> after <SEP> 1 <SEP> h
<tb> DNR
<tb> L-Ala-L-Leu-6. <SEP> 9 <SEP> 0
<tb> DNR
<tb>
Ala-Leu-DNR hydrolyzes rapidly, at 37 C, to L-Leu-DNR, in human serum.
Leu-DNR is stable in human serum.
<Desc / Clms Page number 12>
Stability in the presence of human blood.
Although stable in the presence of serum, N-L-Leucyl-Daunorubicin and N-L-Leucyl-Doxorubicin rapidly hydrolyze into Daunorubicin and Doxorubicin in the presence of human blood. The same is true when N-L-AlaL-Leu-DNR is incubated at 370C in the presence of human blood for 1 hour.
In order to increase the stability in blood of N-L-Ala-L-Leu-DNR, a whole series of derivatives have been synthesized (see table).
The addition of an amino acid, such as L-Alanine, L-Leucine or L-norleuclne, does not prevent hydrolysis in the blood.
The addition of a succinyl or pyroglutamyl group prevents hydrolysis of the peptide derivatives of DNR by the proteases secreted in the conditioned medium of MCF7 / 6 cells.
The addition of an amino acid D, either blocks and hydrolyses blood and hydrolyses in the conditioned medium, or does not prevent either of the two hydrolyses, according to La Jongueur of the peptide chain grafted on the DNR.
The only sequence specifically blocking hydrolysis in the blood, without preventing hydrolysis in the conditioned medium of tumor cells
EMI12.1
mammary, is the sequence ss-L-Alanyl-L-Leucyl-L-Alanyl-LLeucine. Indeed, both ss-L-Alanyl-L-Leucyl-LAlanyl-L-Leucyl-Daunorubicin, ss-L-Alanyl-L-Leucyl-LAlanyl-L-Leucyl-Doxorubicine and RL-Alanyl-L- Leucyl-LAL1:
iyJ-L-Leucyl-Coumarin are stable in the presence of human blood at 370C for 1 hour, and are hydrolyzed respectively to N-L-Leucyl-Daunorubicin, N-L-LeucylDoxorubicin and N-L-Leucyl-Coumarin in the conditioned medium of MCF7 / 6 cells.
<Desc / Clms Page number 13>
HYDROLYSIS OF DAUNORUBICIN DERIVATIVES (DNR)
AND DOXORUBICIN (DOX)
EMI13.1
<tb>
<tb> COMPOUND <SEP> Blood <SEP> Middle
<tb> Human <SEP> Conditions
<tb> MC <SEP> F- <SEP> 7/6
<tb> 1 <SEP> a-L-Leu-DNR <SEP> + <SEP> + <SEP> Hydrolysis <SEP> to <SEP> L-Leu-DNR
<tb> L-ala-L-Ala-L-Leu-DNR <SEP> Hydrolysis <SEP> to <SEP> L-Leu-DNF
<tb> I.-NLeu-L-Ala-L-Leu-DNR <SEP> + <SEP> +
<tb> L-Leu-L-Ala-L-Leu-DNR <SEP> + <SEP> +
<tb> L <SEP> ala-L-Leu-L-Ala-L-Leu-DNR <SEP> + <SEP> +
<tb> Succ-L-Ala-L-Leu-DNR-Suce-L-Leu-L-Ala-L-Leu-DNR <SEP> - <SEP> - <SEP> "
<tb> Suck-L-Ala-L-Leu-L-Ala <SEP> L-Leu-DNR <SEP> (+)
<SEP> - <SEP> "
<tb> pGlu-L-Ala-L-Leu-L-Ala-L-Leu-DOX <SEP> + <SEP> - <SEP> Hydrolysis <SEP> to <SEP> L-Leu-DOX
<tb> D-Leu-L-ala-L-Leu-DNR <SEP> - <SEP> - <SEP> Hydrolysis <SEP> to <SEP> L-Leu-DNR
<tb> D-Ala-L-Leu-L-Ala-L-Leu-DNR <SEP> (+)
<tb> D-Leu-L-Ala-L-Leu-L-Ala-L-Leu-DNR <SEP> + <SEP> +
<tb> D-Leu-L-Ala-L-Leu-L-Ala-L-Leu-DNR <SEP> (+) <SEP> (+)
<tb> ss-L-Ala-L-Leu-DNR <SEP> - <SEP> L-NLeu-ss-L-Ala-L-Leu-DNR <SEP> + <SEP> +
<tb> ss-Ala-L-Ala-L-Leu-DNR <SEP> - <SEP> R-ALa-L <SEP> Leu-L-ALa-L-Leu-DNR- + <SEP> Hydrolysis <SEP > in <SEP> L-Leu-DNF
<tb> ss-Ala-L-leu-L-Ala-L-Leu-DOX <SEP> - <SEP> + <SEP> Hydrolysis <SEP> to <SEP> L-Leu-DOX
<tb> ss-Ala-L-Leu-L-ala-L-Leu-COU + <SEP> - <SEP> + <SEP> Hydrolysis <SEP> to <SEP> L-Leu-COU
<tb>
* NECK: coumarin
<Desc / Clms Page number 14>
Example 4.
Cellular pharmacology and reduced rate of intracellular penetration.
EMI14.1
Intracellular accumulation by normal cells (rat fibroblasts)
Intracellular accumulation of derivatives
EMI14.2
-int 1 anthracyclines by normal cells is determined by using as an experimental model the fibroblasts of rat embryos, cultured in vitro in Eagle / Dulbecco medium containing 10 calf serum.
The confluent cells are incubated at 37 ° C. in this medium containing the derivatives at 17.7 μM. After incubation, the cells are washed 3 times with PBS, taken up in PBS, sonicated and the anthracyclines extracted at pH 9 with a chloroform: methanol mixture (4: 1, by volume).
The accumulation is followed by HPLC and fluorimetry, over time.
EMI14.3
<tb>
<tb> compound <SEP> Amount <SEP> accumulated <SEP> Amount <SEP> accumulated
<tb> after <SEP> 1 <SEP> h <SEP> after <SEP> 6 <SEP> h
<tb> (nMoles / mg <SEP> (nMoles / mg
<tb> prot. <SEP> cell <SEP>;) <SEP> prot. <SEP> cell <SEP>;)
<tb> DNR <SEP> 18, <SEP> 8 <SEP> 36.1
<tb> L-Leu-DNR <SEP> 12, <SEP> 2 <SEP> 26.2
<tb> L-Ala-L-Leu- <SEP> 1,2 <SEP> 7.1
<tb> DNR
<tb>
Ala-Leu-DNR, before it is hydrolyzed in the extracellular medium to Leu-DNR, returns 15 times slower (after 1 h) than DNR in normal cells.
Intracellular accumulation by L1210 tumor cells (leukemiamurine)
The intracellular accumulation of the derivatives is determined using, as an experimental model of
<Desc / Clms Page number 15>
tumor cells, murine leukemia cells L1210, cultured in vitro in RPMI 1640 medium containing 10 fetal calf serum.
The confluent cells are incubated at 370C in this medium containing the derivatives at 17.7 pM. After incubation, the cells are washed 3 times with PBS, taken up in small quantities, sonicated and the anthracyclines extracted at pH 9 with a chloroform: methanoL mixture (4: 1, by volume).
The accumulation is followed by HPLC and fluorimetry, over time.
EMI15.1
<tb>
<tb> compound <SEP> Amount <SEP> accumulated <SEP> Amount <SEP> accumulated
<tb> after <SEP> 1 <SEP> h <SEP> after <SEP> 6 <SEP> h
<tb> (uMoles / mg <SEP> (nMoles / mg
<tb> prot.cell;) <SEP> prot.cell;)
<tb> DNR <SEP> 33, <SEP> 0 <SEP> 43.9
<tb> T.-Ijpu-DNR <SEP> 18, <SEP> 3 <SEP> 32, <SEP> 0
<tb> L-Ala-L-Leu-1, <SEP> 5 <SEP> 4.7
<tb> DNR
<tb>
Ala-Leu-DNR penetrates 10 to 20 times less well in L1210 cells than DNR.
Example 5.
Activation by enzymes secreted by breast carcinoma cells.
EMI15.2
// yc / jroly <? CC. S derived from conditioned medium of MCF7 tumor cells (breast cancer)
The confluent MCF7 / 6 cells were cultured in vitro in DMEM F12 medium containing BSA (0.2 mg / ml), transferrin (10 pg / ml) and insulin (0.25 g / ml ) and estrogens (10 nM).
The medium was then concentrated 18 times. The
<Desc / Clms Page number 16>
anthracyclines, at a concentration of 7, 7 μM) were incubated at 370C at pH 7.3 in this conditioned medium and the anthracyclines were extracted from aliquots taken over time, at pH 9 with a chloroform: methanol mixture (4: 1, by volume). Accumulation is followed by HPLC and fluorimetne.
EMI16.1
<tb>
<tb>
1 <SEP> compound <SEP> 1 <SEP> hydrolyzed <SEP> after <SEP> hydrolyzed <SEP> after
<tb> compound <SEP> hydrolyzed <SEP> after <SEP> hydrolyzed <SEP> after
<tb> 1 <SEP> h <SEP> 2 <SEP> h
<tb> DNR <SEP> - <SEP> L-Leu-DNR <SEP> in <SEP> DNR <SEP> 1.4 <SEP> in <SEP> DNR <SEP> 10.2
<tb> L-Ala-L-Leu- <SEP> in <SEP> DNR <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> in <SEP> DNR <SEP> 10.7
<tb> DNR <SEP> in <SEP> L-Leu-DNR <SEP> 87, <SEP> 6 <SEP> in <SEP> L-Leu-DNR <SEP> 86.2
<tb>
Ala-Leu-DNR is rapidly hydrolyzed to L-LeuDNR in conditioned medium, which means that tumor cells have secreted into the medium a peptidase or a protease capable of breaking the peptide link between Alanine and Leucine. the Ala-Leu-DNR.
L-Ala-L-Ala-DNR, L-Ala-L-Norleu-DNR and L-f-Ala-L-Leu-DNR are not hydrolyzed in the conditioned medium.
EMI16.2
"Intracellular" hydrolysis by lysosomal hydrolases There is ydrQI y "intracellula-ire" i2ar les hyLr
The sensitivity of the derivatives to lysosomal hydrolysis was determined by incubating at 370C 0.75 ml of 0.2 M buffer at pH 4.5 containing 0.035 μmol of compound and 0.25 ml of a soluble fraction of purified lysosomal enzymes from rat liver and having a protein concentration of 3 mg / ml. The hydrolysis is followed by IIPLC and fluorimetry, over time after extraction of aliquots.
<Desc / Clms Page number 17>
EMI17.1
<tb>
<tb> compound <SEP> hydrolyzed <SEP> in <SEP> DNR <SEP> hydrolyzed <SEP> in <SEP> DNR
<tb> after <SEP> 1 <SEP> h <SEP> after <SEP> 6 <SEP> h
<tb> DNR <SEP> - <SEP> L-Leu-DNR <SEP> 35 <SEP> 91
<tb> L-Ala-L-Leu-DNR <SEP> 83 <SEP>> <SEP> 90
<tb>
Given the ubiquity of the presence of lysosomes in normal and tumor cells, these results indicate that the cells have the enzymatic machinery to regenerate DNR intracellularly From L-Leu-DNR formed extracellularly from L-Ala- L-Leu-DNR or from ss-L-ala-L-leu-L-Ala-L-Leu-DNr.
Example 6.
In vitro activity.
Cytotoxicity on L1210 tumor cells in culture.
The cytotoxicity of the anthracycline derivatives is determined using, as an experimental model of tumor cells, the murine leukemia cells L1210, cultured in vitro in RPMI 1640 medium containing 10 A of fetal calf serum.
The growing cells (9,105 cells) are pre-incubated in 3 ml of RPMI medium containing 10 μl of fetal calf serum and then the derivatives are added to the medium at a final concentration of 17.7 μM. After 24 h or 72 h of incubation, the evolution of the cell population is determined by assaying the proteins according to the Lowry method.
The results are expressed in terms of growth relative to control cells incubated in the absence of derivatives.
<Desc / Clms Page number 18>
EMI18.1
<tb>
<tb> compound <SEP> Growth <SEP> Growth
<tb> cell <SEP> (', <SEP> of <SEP> cell <SEP> (' - <SEP> of
<tb> <SEP> checks at <SEP> or <SEP> 1) <SEP> <SEP> checks at <SEP> day <SEP> 3)
<tb> DNR-45-63
<tb> L-ala-L-Leu-DNR <SEP> 72 <SEP> - <SEP> 9
<tb>
The Ala-Leu-DNR on day 1 is practically not cytotoxic with respect to L1210 cells in culture. It becomes cytotoxic on day 3.
Example 7.
Acute toxicity.
EMI18.2
In vivo toxicity in mice The in vivo toxicity of anthracyclinic derivatives is determined after intravenous injection in mice and determination of weight loss on day 8.
EMI18.3
<tb>
<tb> compound <SEP> Dose <SEP> injected <SEP> variation <SEP> of <SEP> weight
<tb> (mg / kg) <SEP> on <SEP> day <SEP> 8 <SEP> (',)
<tb> DNR <SEP> 10 <SEP> - <SEP> 4, <SEP> 3
<tb> 11 <SEP> - <SEP> 5, <SEP> 9
<tb> 12 <SEP> - <SEP> 6, <SEP> 3
<tb> L-Ala-L-Leu-DNR <SEP> 53-5, <SEP> 0
<tb> 60-8, <SEP> 2
<tb> 6623, <SEP> 4
<tb>
The equitoxic doses of Ala-Leu-DNR and DNR are 53 and 11 mg / kg respectively.
<Desc / Clms Page number 19>
EMI19.1
Example 8.
In vivo anti-tumor activity.
Ciiim-iothérap-iciue activity under the intravenous form of leukemia L1210
The chemotherapeutic activity of anthracycline derivatives, in the intravenous form of L1210 leukemia was determined by inoculating female DBA2 mice on day 0 with 104 leukemia cells. The products are administered by the VT route on days 1 and 2. The activity is expressed in increase in survival (ILS) and in number of long-term survivors.
EMI19.2
<tb>
<tb> compound <SEP> Dose <SEP> ILS <SEP> () <SEP> survivors /
<tb> injected <SEP> total <SEP> at
<tb> (mq / kq) <SEP> day <SEP> 30
<tb> DNR <SEP> 10 <SEP> 42 <SEP> 0/18
<tb> 11 <SEP> 66 <SEP> 0/37
<tb> 12 <SEP> 123 <SEP> 6/34
<tb> L-Ala-L-Leu-42 <SEP> 25 <SEP> 0/8
<tb> DNR
<tb>
EMI19.3
L ia-Leu-ui \ t \ a ues uus'-) Lu-i-b pj-U. = t, j. HvHù.
(equitoxic doses) that DNR is not significantly active on the intravenous form of murine leukemia L1210.
Chemotherapy activity in the subcutaneous form of leukemia L1210
The chemotherapeutic activity of anthracyclinic derivatives, in the subcutaneous form of L1210 leukemia was determined by inoculating, subcutaneously, female DBA2 mice on day 0 with 105 leukemia cells. The products are administered by the I.V route on days 1 and 2.
The activity is expressed in? increase in survival (ILS) and in number of long-term survivors.
<Desc / Clms Page number 20>
EMI20.1
<tb>
<tb> compound <SEP> Dose <SEP> ILS <SEP> (A) <SEP> survivors <SEP> /
<tb> injected <SEP> total <SEP> at
<tb> (mg / kq) <SEP> day <SEP> 30
<tb> DNR <SEP> 10 <SEP> 65 <SEP> 0/58
<tb> It <SEP> 67 <SEP> 3/37
<tb> 12 <SEP> 83 <SEP> 3/36
<tb> L-Ala-L-Leu-53 <SEP> 168 <SEP> 12/34
<tb> DNR <SEP> 60 <SEP> 193 <SEP> 18/33
<tb> 66 <SEP> 73 <SEP> 1 <SEP> / <SEP> 10
<tb>
Ala-Leu-DNR at doses 4 times higher (equitoxic doses) than DNR, is significantly more active than DNR, on the subcutaneous form of murine leukemia L1210.