AT507056A1 - Immunochromatographisches verfahren und testsystem zur bestimmung von wenigstens einem analyten in einer zu untersuchenden testlösung - Google Patents

Description

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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein imraunochromatographisches Verfahren zur Bestimmung von wenigstens einem Ana-lyten in einer zu untersuchenden Testlösung, in welchem auf einer auf einem Träger festgelegten immunochromatographischen Membran eine für den Analyten spezifische Testzone aufgetragen wird, sowie auf ein Testsystem zur Bestimmung von wenigstens einem Analyten in einer zu untersuchenden Testlösung.

Immunochromatographische Verfahren sowie Testsysteme, in welchen Analyten, insbesondere biologische Analyten nachgewiesen werden können, sind in einer großen Anzahl bekannt, und die meisten dieser Verfahren und Testsysteme sind entweder zeitaufwendig oder erlauben entweder einen qualitativen, einen halb quantitativen oder quantitativen Nachweis einer zu untersuchenden Probe. Insbesondere ist eine Vielzahl von Verfahren und Testsystemen bekannt, bei welchen eine Dünnschichttechnik eingesetzt wird, bei welcher Teststreifen bzw. Testplatten und auf den Testplatten bzw. Teststreifen aufgebrachte, immunochromatographische Membranen mit einem Laufmittel, in welchem die untersuchende Probe zu transportieren ist, in Kontakt gebracht werden, um anschließend entweder durch einen direkten, optischen Vergleich oder mittels Eichkurven einer qualitativen, quantitativen oder auch halb quantitativen Auswertung unterzogen zu werden.

Des weiteren ist beispielsweise aus der WO 03/058242 ein System mit innerem Kalibrierungssystem für einen Durchflußtest bekannt geworden. Bei diesem System bzw. Verfahren wird eine poröse Membran eingesetzt, welche in Fluidwechse1wirkung mit Probenkonjugaten steht, welche ein spezifisches Bindungsglied für eine defekt ierbare Probe enthalten. Die poröse Membran definiert eine Detektionszone und eine Kalibrierungszone, wobei die Kalibrierungszone zwei oder mehrere Kalibrierungsbereiche beinhaltet, welche unterschiedliche Mengen eines Bindemittels enthalten, welche konfiguriert sind, um sich mit den Probenkonjugaten zu verbinden. Als ein Ergebnis werden Kalibrierungssignale generiert, welche leicht visuell, quantitativ oder dgl. mit einem Detek- 2 tionssignal verglichen werden können, um die Anwesenheit oder Menge eines Analyten in einer Testprobe zu bestimmen.

Aus der WO 2007/027231 Al ist ein Diagnosetestsystem für das genaue Detektieren eines Testanalyten über einen breiten Bereich von möglichen Konzentrationen bekannt geworden. Ein Merkmal dieses Systems ist, daß es fähig ist anzuzeigen, ob ein Analyt innerhalb des Bereichs einer Überschußkonzentration bzw. des Bereichs des "Hook Effekts" vorhanden ist. Die Analytenkonzentra-tion kann in diesem Fall unter Verwendung von einem Teil einer Dosisantwortkurve bestimmt werden.

Schließlich ist aus der EP 0 987 551 A2 ein Verfahren zum Bestimmen einer Analytenkonzentration in einem Sandwich-Immuno-assay mit lateralem Fluß bekannt geworden, welcher einen Hook Effekt bei hoher Dosis ausübt. In diesem Verfahren wird die Konzentration eines Analyten in einem fluiden Testmedium durch Verwendung eines immunochromatographischen Teststreifens bestimmt, wobei der Teststreifen wenigstens zwei Aufnahmebanden und gegebenenfalls eine oder mehrere Sammelbande(n) aufweist, welche markierte Antianalyten-Antikörper einfangen, um ein detektierbares Signal zur Verfügung zu stellen. Die Signale von der Markierung werden quantitativ in jeder der Banden detektiert, um ein Muster von Signalen zur Verfügung zu stellen, welches für die Konzentration des Analyten in dem Testfluid einzigartig ist. Das Muster der Signale wird in der Folge mathematisch kombiniert, um eine monotone Dosisantwortkurve auszubilden.

Die vorliegende Erfindung zielt nun darauf ab, ein einfaches und insbesondere schnelles Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit welchem es möglich ist, die Abwesenheit, die Anwesenheit oder eine Überschußkonzentration eines Analyten, nämlich den Hook Effekt zu bestimmen, ohne daß gleichzeitig komplizierte Rechenverfahren bzw. übermäßig komplizierte, immunochromatographische Membranen zur Verfügung gestellt werden müssen.

Zur Lösung dieser Aufgaben ist das erfindungsgemäße Verfahren im wesentlichen dadurch gekennzeichnet, daß auf der Membran gemäß einem immunochromotographischen Trennprinzip getrennt von der spezifischen Testzone für den Analyten eine spezifische Kon-trollzone für den Analyten aufgebracht wird, daß in die zu untersuchende Testlösung ein an eine eine Farbreaktion bewirkende Substanz gekoppelter bzw. damit markierter Antikörper für den zu bestimmenden Analyten eingebracht wird, daß der Analyt und der markierte Antikörper von der immunochromatographisehen Membran aus der Testlösung aufgenommen werden und über die spezifische Testzone und die spezifische Kontrollzone laufen gelassen werden und daß aus dem Vergleich der Intensität, insbesondere der Farbintensität oder Fluoreszenzintensität zwischen der spezifischen Testzone und der spezifischen Kontrollzone die Abwesenheit, die Anwesenheit oder eine Überschußkonzentration des Analyten bestimmt wird. Indem auf der immunochromatographischen Membran neben einer spezifischen Testzone für den zu bestimmenden Analyten auch eine spezifische Kontrollzone aufgebracht ist bzw. wird, welche auf den zu untersuchenden Analyten exakt abgestimmt ist, gelingt es einfach und ohne komplizierte, mathematische Rechensysteme lediglich durch Zusatz eines mit einer eine Farbreaktion bewirkenden Substanz versetzen bzw. damit markierten Antikörpers für den zu bestimmenden Analyten zu bestimmen, ob der zu untersuchende bzw. zu bestimmende Analyt in der zu untersuchenden Testlösung vorhanden ist.

Bejahendenfalls, und sofern der zu untersuchende Analyt unterhalb einer für den Analyten definierten Konzentration in der Testlösung enthalten ist, wird eine Nachweislinie in der spezifischen Testzone durch den in der spezifischen Testzone festgelegten Antikörper sowie eine weitere in der spezifischen Kontrollzone, durch die in der spezifischen Kontrollzone festgelegte Substanz und den an eine eine Farbreaktion bewirkende Substanz gekoppelten bzw. damit markierten Antikörper ausgebildet. Im Falle einer Überschußkonzentration des zu untersuchenden Analyten wird weder in der spezifischen Testzone noch in der spezifischen Kontrollzone eine Farbreaktion bewirkt, da sämtliche Bindungs- 4 stellen der mit einer eine Farbreaktion bewirkende Substanz gekoppelten Antikörper, sowie die Bindungsstellen des in der spezifischen Testzone festgelegten Antikörpers mit dem zu untersuchenden Analyt belegt sind, wodurch die an die farbgebende Substanz gekoppelten Antikörper in Ermangelung freier Bindungsstellen sowohl über die spezifische Testzone, als auch über die spezifische Kontrollzone hinweg laufen, so daß in diesen Zonen eine Farbreaktion nicht mehr bewirkt werden kann.

Durch Anwendung dieses einfachen Verfahrens gelingt es, unmittelbar lediglich durch optischen Vergleich festzustellen, ob der zu untersuchende Analyt in einer zu untersuchenden Probe vorhanden war, nicht vorhanden war und bzw. ob eine Überschußkonzentration des Analyten in der Probe vorhanden war.

Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Verfahren so geführt, daß zusätzlich zu der zu untersuchenden Testlösung eine an eine eine Farbreaktion bewirkende Substanz gekoppelte bzw. damit markierte Kontrollsub-stanz zugesetzt wird und daß auf der immunochromatographischen Membran eine nicht spezifische Kontrollzone, enthaltend einen Antikörper für die Kontrollsubstanz vorgesehen wird. Dadurch, daß zusätzlich zu der zu untersuchenden Testlösung eine an eine eine Farbreaktion bewirkende Substanz gekoppelte bzw. markierte Kontrollsubstanz zugesetzt wird und weiters auf der immunochromatographischen Membran eine nicht spezifische Kontrollzone, enthaltend einen Antikörper für die Kontrollsubstanz aufgebracht ist, gelingt es, eine zusätzlich gefärbte Reaktionszone auf der immunochromatographischen Membran auszubilden, aus welcher unmittelbar ersehen werden kann, ob ein Test gültig ist oder nicht. Dadurch, daß das Laufmittel mit der an eine eine Farbreaktion bewirkende Substanz gekoppelten bzw. damit markierten Kontrollsubstanz bis zur nicht spezifischen Kontrollzone gelaufen ist, kann die Gültigkeit des Tests anhand der in dieser nicht spezifischen Kontrollzone stattfindenden Farbreaktion unmittelbar ohne jede weitere spezifische Auswertung bestimmt werden. In diesem Fall 5

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Um das immunochromatographische Verfahren gemäß der Erfindung insbesondere auch quantitativ führen zu können, ist das Verfahren dahingehend weitergebildet, daß sowohl die Menge des an eine eine Farbreaktion bewirkende Substanz gekoppelten bzw. damit markierten Antikörpers für den Analyten, als auch die Menge des Antikörpers des Analyten, die auf der immunochromatographischen Membran festgelegt wird, quantitativ bestimmt werden. Indem sowohl die Menge des an eine eine Farbreaktion bewirkende Substanz gekoppelten bzw. damit markierten Antikörpers für den Analyten als auch die Menge des Antikörpers des Analyten auf der immunochromatographischen Membran festgelegt sind, kann auch eine quantitative Umsetzung des zu untersuchenden Analyten einfach und ohne großen apparativen oder verfahrenstechnischen Aufwand erzielt werden.

Dadurch, daß in Laufrichtung der Testlösung auf der immunochromatographischen Membran zuerst die spezifische Testzone und nachgeschaltet die spezifische Kontrollzone sowie gegebenenfalls die nicht spezifische Kontrollzone angeordnet wird bzw. werden, wie dies einer weiteren bevorzugten Ausführungsform entspricht, können fehlerhafte Ergebnisse beim Auswerten der immunochromatographischen Membran insbesondere aufgrund eines unregelmäßigen Laufens der zu untersuchenden Testlösung mit Sicherheit hintangehalten werden. Durch die paarweise Anordnung von jeweils einer spezifischen Testzone und einer nachgeschalteten, spezifischen Kontrollzone ist die Wahrscheinlichkeit, daß bei einer positiven Farbreaktion der spezifischen Kontrollzone Fehler in der Membran auf getreten sind, verschwindend klein.

Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es, wie dies einer bevorzugten Weiterbildung des Verfahrens entspricht, problemlos möglich, eine Mehrzahl von zu untersuchenden Analyten gleichzeitig zu untersuchen. Hiebei werden jeweils Paare bestehend aus 6 spezifischer Testzone und spezifischer Kontrollzone hintereinander auf der immunochromatographischen Membran aufgebracht sowie gegebenenfalls eine nicht spezifische Kontrollzone in jenem Bereich der immunochromatographischen Membran aufgebracht, welche vom Startpunkt des Laufens der zu untersuchenden Substanz am weitesten entfernt liegt. In diesem Fall kann jeder der zu untersuchenden Analyten gesondert und ohne Beeinflussung durch den bzw. die anderen in einer zu untersuchenden Probelösung vorgelegten Analyten untersucht werden. In weiterer Folge können bei einer derartigen paarweisen Anordnung von spezifischer Test- und Kontrollzone auch in der Membran auftretende Fehler leicht erkannt und entweder die Membranen ausgeschieden werden oder der Versuch unmittelbar wiederholt werden.

Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird dieses so geführt, daß die immunochromato-graphische Membran 1 bis 20 Minuten, insbesondere 2 bis 15 Minuten in die zu untersuchende Testlösung eingetaucht wird. Indem die Laufzeit der zu untersuchenden Testlösung auf der immunochromatographischen Membran zwischen 1 und 20 Minuten gewählt wird, kann einerseits ein langsames und stetiges Laufen der zu untersuchenden Testlösung sichergestellt werden und andererseits können innerhalb kurzer Zeit spezifische und insbesondere sogar quantitative Ergebnisse erhalten werden, wodurch ein rasches und zuverlässiges Verfahren zur Bestimmung von wenigstens einem Analyten in einer zu untersuchenden Testlösung unabhängig von der Konzentration des Analyten in der Testlösung zur Verfügung gestellt werden kann.

Indem, wie dies einer bevorzugten Weiterbildung des Verfahrens entspricht, das Verfahren so geführt ist, daß zur Auswertung des Verfahrens zuerst die Gültigkeit des Testergebnisses durch Vergleichen der Farbintensität von entweder der bzw. den spezifischen Kontrollzone(n) und/oder der nicht spezifischen Kontrollzone mit einer Farbkarte bestimmt wird und/oder die Intensität, insbesondere die Färb- oder Fluoreszenzintensität der spezi- 7 fischen Testzone mit einer Farbkarte oder mittels photometrischen Meßgeräten verglichen oder gemessen wird, gelingt es, ohne komplizierte und aufwendige Rechenverfahren und insbesondere zuverlässig die Anwesenheit/Abwesenheit und/oder Überschußkonzentration eines Analyten nachzuweisen. Durch eine Überschußkonzentration könnte beispielsweise ein falsches Negativsignal bewirkt werden, obwohl der Analyt in übermäßig großer Menge in der zu untersuchenden Substanz enthalten ist. Durch Vergleich der photometrisch gemessenen Intensitäten der spezifischen Testzone oder der spezifischen Kontrollzone und nachfolgendes Vergleichen mit der Intensität einer Eichkurve gelingt es bei Kenntnis der aufgebrachten Menge des Antikörpers des Analyten auf der immunochroma-tographischen Membran sowie der an eine eine Farbreaktion bewirkende Substanz gekoppelten bzw. markierten Menge eines Antikörpers, rasch und zuverlässig quantitativ und somit aussagekräftig die Menge des zu untersuchenden Analyten zu bestimmen.

Im Falle einer Überschußkonzentration des zu untersuchenden Analyten, d.h. im Falle des Fehlens einer Farbreaktion sowohl an der spezifischen Testzone als auch der spezifischen Kontrollzone, d.h. bei Vorhandensein eines sogenannten Hook-Effekts, kann bzw. sollte in weiterer Folge die Probe entsprechend verdünnt werden und eine neuerliche Analyse durchgeführt werden, so daß es möglich ist, quantitativ die Menge des in der Probe vorhandenen Analyten zu bestimmen.

Die vorliegende Erfindung zielt weiters auf die Bereitstellung eines raschen und zuverlässig ansprechenden Testsystems zur Bestimmung der Anwesenheit, Abwesenheit oder Überschußkonzentration von wenigstens einem Analyten ab, mit welchem nicht nur schnell sondern auch zuverlässig und reproduzierbar Analyten in biologischen Proben nachgewiesen und identifiziert werden können.

Zu Lösung dieser Aufgaben ist das Testsystem zur Bestimmung von wenigstens einem Analyten in einer zu untersuchenden Testlösung im wesentlichen dadurch gekennzeichnet, daß ein Träger vorgesehen ist, auf welchem sich eine in der Dimension definierte, - 8 - • · • ··· ··· immunochromatographisehen Membran befindet, daß auf der immuno-chromatographisehen Membran eine spezifische Testzone, enthaltend insbesondere einen Antikörper für den Analyten, festgelegt ist, daß auf der immunochromatographi sehen Membran in Abstand von der spezifischen Testzone eine spezifische Kontrollzone, enthaltend den Analyten oder ein Homolog festgelegt ist, und daß ein photometrisches oder fluorometrisches Meßgerät zur Bestimmung eines durch die spezifische Testzone gelaufenen Analyten sowie des an eine eine Farbreaktion bewirkende Substanz gekoppelten bzw. damit markierten Antikörpers für den zu bestimmenden Analyten enthalten ist. Durch Vorsehen eines Testsystems zur Bestimmung von wenigstens einem Analyten in einer zu untersuchenden Lösung, bei welchem auf einer immunochromatographisehen Membran in spezifischen Testzonen Antikörper für den Analyten oder ein Homolog festgelegt sind und auf der immunochromatographischen Membran zusätzlich und in Abstand von der spezifischen Testzone eine spezifische Kontrolle enthaltend den Analyten festgelegt ist, gelingt es mittels eines an eine eine Farbreaktion bewirkende Substanz gekoppelten bzw. damit markierten Antikörpers für den zu bestimmenden Analyten rasch und zuverlässig eine aussagekräftige Farbreaktion auf der immunochromatographischen Membran zu erhalten, welche in weiterer Folge einfach und ohne komplizierte mathematische Verfahren mittels eines photometrischen oder fluorometischen Meßgeräts auswertbar ist, wodurch rasch und zuverlässig quantitative Messungen eines zu untersuchenden Analyten durchgeführt werden können.

Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung ist das Testsystem dadurch gekennzeichnet, daß als photometrisches oder fluoromet-risches Meßgerät ein photometrisches oder fluorometrisches Reflexionsgerät, ein Spektrometer oder eine CCD-Kamera eingesetzt ist. Indem ein photometrisches und f luorometrisches Meßgerät, ein photometrisches oder fluorometrisches Reflexionsgerät, ein Spektrometer oder eine CCD-Kamera eingesetzt ist, können feine Farb-unterschiede, insbesondere feine Unterschiede der Farbintensität eindeutig und reproduzierbar nachgewiesen werden und neben den 9 qualitativen Ergebnissen auch eindeutig reproduzierbare, quantitative Ergebnisse betreffend die Menge eines zu untersuchenden Analyten in einer Probe erhalten werden.

Indem zusätzlich auf dem Meßgerät eine Anzeige vorgesehen ist, welche das Meßergebnis unmittelbar anzeigt, wie dies einer bevorzugten Ausführungsform entspricht, kann das Testsystem gemäß der vorliegenden Erfindung für Schnelltests angewandt werden, wodurch rasch und eindeutig, beispielsweise pathogene Substanzen in Nahrungsmitteln, Futtermitteln oder dgl. nachgewiesen werden können.

Indem, wie dies einer bevorzugten Weiterbildung des Testsystems der vorliegenden Erfindung entspricht, das System derart ausgebildet ist, daß auf einer immunochromatographisehen Membran eine Mehrzahl von jeweils paarweise nebeneinander oder hintereinander angeordneten, spezifischen Testzonen und spezifischen Kon-trollzonen sowie wenigstens eine nicht spezifische Kontrollzone aufgebracht sind, kann gleichzeitig rasch und zuverlässig eine Mehrzahl von zu untersuchenden Analyten auf ein und derselben im-munochromatographischen Membran nachgewiesen werden, wodurch insbesondere auch eine Mehrzahl von zu untersuchenden Substanzen, wie beispielsweise Proteine, unerwünschte Inhaltsstoffe bzw. Kon-taminanten von agrarischen Produkten, genetisch veränderte Mikroorganismen und dgl., nachgewiesen werden kann, wie dies einer bevorzugten Verwendung der vorliegenden Erfindung entspricht.

Gemäß einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist das Testsystem dahingehend weitergebildet, daß es aus einer Mehrzahl von nebeneinander, gegebenenfalls voneinander trennbar angeordneten Teststreifen gebildet ist. Mit einer derartigen Ausführung gelingt es insbesondere, eine Vielzahl von Analyten gleichzeitig zu untersuchen oder aber gegebenenfalls einen Teil des Testsystems, welcher als gesonderter Teststreifen ausgebildet ist, von dem Testsystem abzutrennen und einzeln zur Anwendung bzw. Auswertung zu bringen. Dadurch gelingt es nicht nur, eine Vielzahl von Analyten gleichzeitig zu untersuchen, sondern im • ··· #··

Bedarfsfall auch die relativ kostenintensiven Testsysteme gezielt und sparsam einzusetzen.

Beim Auswerten derartiger Testsysteme kann zur Vereinfachung und um ein präziseres Testergebnis zu erzielen das Testsystem vor Auswertung in die Einzelstreifen getrennt werden, um diese einzeln beispielsweise mit Farbkarten oder dgl. zu vergleichen, so daß ein zuverlässiges und präzises Ergebnis erzielt werden kann. In gleicher Weise kann jedoch aus das gesamte Testsystem in einen Testkartenleser eingebracht werden und zur Gänze ausgelesen werden, wodurch das Testsystem nicht nur an eine Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten anpaßbar ist, sondern auch rasche und zuverlässige Ergebnisse liefern kann.

Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung ist das Testsystem so ausgebildet, daß zwischen den nebeneinander angeordneten Teststreifen Unterbrechungen, insbesondere Schlitze oder Perforierungen, ausgebildet sind, in welchem Fall es möglich ist, den Analyseansprüchen entsprechend entweder den Test für mehrere Analyten gleichzeitig einzusetzen oder, wie bereits ausgeführt, das Testsystem nach Durchführung des Tests in die einzelnen Streifen an den Perforationslinien zu trennen, worauf in weiterer Folge die Einzelstreifen gesondert ausgewertet werden können.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispielen näher erläutert, in welchen:

Fig. la schematisch eine Versuchsanordnung gemäß der vorliegenden Erfindung darstellt, in welcher in Fig. la ein valides, allerdings negatives Versuchergebnis dargestellt ist und Fig. lb dieselbe Versuchsordnung zeigt, bei welcher jedoch ein valides, negatives Versuchsergebnis dargestellt ist;

Fig. 2 eine ähnliche Versuchsanordnung darstellt, bei welcher jedoch zwei verschiedene, zu untersuchende Analyten in der Testlösung enthalten sind und zusätzlich auf der immunochromato-graphischen Membran eine nicht spezifische Kontrollzone aufgebracht ist, wobei ·· ·· ·· ·# ···· · ····· · · ·♦ • · · · ··· ··· · ♦ » · · ·· ·· · ♦ · «······♦# · ·· ·· ·« ·· · ··· - 11 -

Fig. 2a einen Versuch darstellt, welcher gültig ist, bei welchem ein erster Analyt ein valides und positives Ergebnis zeigt und ein zweiter zu untersuchender Analyt ein in Verdünnung zu wiederholendes, weil überladenes Ergebnis zeigt;

Fig. 2b einen Fall darstellt, bei welchem der Test gültig ist, aber sowohl der erste Analyt als auch der zweite Analyt ein valides, jedoch negatives Ergebnis zeigen;

Fig. 2c schließlich eine Versuchsanordnung darstellt, in welcher der Test gültig ist und Analyt 1 valid und positiv ist und Analyt 2 valid und negativ ist;

Fig. 3a das Beispiel einer Testkarte zeigt, auf welcher sich zwei Testlinien befinden;

Fig. 3b das Beispiel einer Karte zeigt, auf welcher sich drei Testlinien befinden;

Fig. 4 eine doppelt breit ausgebildete Testkarte darstellt, auf welcher in jedem Teil zwei Analyten nachgewiesen werden können;

Fig. 5a eine Testkarte zeigt, welche in drei Teile unter-teilbar ist, auf welchen drei Analyten nebeneinander aufgebracht werden können; und

Fig. 5b eine dreiteilbare Testkarte zeigt, in welcher drei Analyten, welche in einer Matrix Vorkommen können, gleichzeitig untersucht werden können.

Im Einzelnen ist in Fig. 1 mit 1 schematisch ein Gefäß dargestellt, in welchem eine zu untersuchende Testlösung 2 enthalten ist. In dieser Testlösung 2 ist einerseits mit 3 der zu untersuchende Analyt bezeichnet und andererseits ist mit 4 ein an eine eine Farbreaktion bewirkende Substanz gekoppelter bzw. damit markierter Antikörper bezeichnet. Im Einzelnen sind die in Fig. 1 gewählten Symbole auf dem Gebiet der Biochemie üblich und bedeuten folgendes: O Analyt

Y

Antikörper für den Analyt eine eine Farbreaktion bewirkende Substanz 12 • · · · ··· ♦·· · ······· · • · · ·· ·· ♦ · ·· ·· ·· ·· ·

an eine eine spezifische Farbreaktion bewirkende Substanz gekoppelter Antikörper für den Analyten

In das Reaktionsgefäß 1 wird in der Folge ein Teststreifen, welcher schematisch mit 5 bezeichnet ist, eingetaucht, auf welchem eine immunochromatographische Membran 6 aufgebracht ist. Auf der immunochromatographischen Membran 6 ist einerseits ein Antikörper 7 für einen zu untersuchenden Analyten 3 als spezifische Testzone in einer quantitativen Menge festgelegt und es ist andererseits in Abstand von dieser spezifischen Testzone 7 in einer spezifischen Kontrollzone 8 eine quantitative Menge eines in der Probe erwarteten Analyten bzw. dessen Homolog festgelegt.

Wenn die zu untersuchende Lösung 2 in Laufrichtung 9 des Teststreifens 5 läuft, wird in der spezifischen Testzone 7 im Falle eines positiven Nachweises an dem Antikörper für den Analyten einerseits der Analyt 3 und andererseits an dem Analyten 3 der an eine eine Farbreaktion bewirkende Substanz festgelegte Antikörper für den Analyten 4 festgelegt. Beim Weiterlaufen der Testlösung 2 in Laufrichtung 9 wird in weiterer Folge der an eine eine Farbreaktion bewirkende Substanz festgelegte Antikörper für einen Analyten 4, an welchen auch der Analyt 3 festgelegt ist, an der spezifischen Kontrollzone 8, nämlich dem auf der immunochromatographischen Membran 6 festgelegten Analyten festgehalten und eine Farbreaktion bewirken, in welchem Fall bei Auswertung des Teststreifens 5 zwei eine farbige Reaktion zeigende Balken nachgewiesen werden können, welche voneinander räumlich getrennt sind. Aus der Farbintensität kann in weiterer Folge auf die Konzentration des in der Testlösung 2 enthaltenen Analyten 3 geschlossen werden, da einerseits sowohl die Dimension der immunochromatographischen Membran 6 als auch die Menge des aufgebrachten Antikörpers 7 für den Analyten als auch die Menge des aufgebrachten Analyten oder Homologs 8 auf der immunochromatographischen Membran 6 ebenso wie die Menge des an eine eine Farbreaktion bewirkende Substanz festgelegten Antikörpers 4 in der • · • · • · · • ··· ·*· • ·· m ·· ·· ·· · · · ········· φ 99 tl Μ ·· · ···

Testlösung 2 bekannt waren, so daß durch einfachen Vergleich mit einer Eichkurve nicht nur die Gültigkeit des Versuchs sondern auch der positive Nachweis des in der Testlösung 2 enthaltenen Analyten 3 geführt werden können.

Fig. lb stellt den Fall dar, daß in der zu untersuchenden Testlösung 2 der Analyt 3 nicht enthalten ist, sondern lediglich der an eine eine Farbreaktion bewirkende Substanz gekoppelte Antikörper für den Analyten 4 enthalten ist. Wenn in diese Testlösung 2 der Teststreifen 5 eingetaucht wird und entlang der Laufrichtung 9 laufen gelassen wird, wird es an der Stelle 7, wo der Antikörper für den Analyten festgelegt ist, keinerlei Reaktion geben, da kein Analyt in der Probe 2 enthalten war. Darüber hinaus wird es an der Stelle 8, wo der Analyt oder sein Homolog auf der immunochromatographischen Membran 6 festgelegt ist, eine sehr intensive Farbreaktion des an eine eine Farbreaktion bewirkende Substanz gekoppelten Antikörpers für den Analyten 4 geben, so daß unmittelbar auf die Gültigkeit des Versuchs geschlossen werden kann und gleichzeitig festgehalten werden kann, daß der Versuch aufgrund des Fehlens einer Reaktion an der Stelle 7 negativ verlaufen ist.

Die Versuchsanordnung gemäß Fig. 2 ist ähnlich zu jener von Fig. 1, wobei jedoch in der Testlösung 2 neben dem Analyten 3 weitere Analyten 10, sowie jeweils ein an eine Farbreaktion bewirkende Substanz festgelegter Antikörper für den Analyten 3 bzw. 10, nämlich 4 bzw. 11 enthalten sind. Schließlich ist in der Testlösung 2 noch eine weitere Substanz 12 enthalten, welche wiederum ein an eine eine Farbreaktion bewirkende Substanz gekoppelter Antikörper 12 ist, wobei jedoch dieser Antikörper nicht spezifisch ist und somit lediglich dafür verwendet wird, um nachzuweisen, ob der Versuch bzw. Test gültig ist oder nicht.

Im Einzelnen sind die in Fig. 2 gewählten Symbole auf dem Gebiet der Biochemie üblich und bedeuten folgendes: O erster Analyt Y Antikörper für den Analyt O zweiter Analyt eine eine Farbreaktion bewirkende Substanz

Hr Hb erster an eine eine spezifische Farbreaktion bewirkende Substanz gekoppelter Antikörper für den Analyten zweiter an eine eine spezifische Farbreaktion bewirkende Substanz gekoppelter Antikörper für den Analyten

ein an eine eine spezifische Farbreaktion bewirkende Substanz gekoppelter Antikörper einer Kontrollsubstanz

Auf dem Teststreifen 5 sind sowohl in Fig. 2a, 2b als auch 2c hintereinander folgende Substanzen festgelegt: ein Antikörper 7 für den Analyten 3, der Analyt in der spezifischen Kontrollzone 8, ein Antikörper für den Analyten 10, welcher mit 13 bezeichnet ist, ein Analyt 14 in der spezifischen Kontrollzone, sowie ein Antikörper für den nichtspezifischen an eine eine Farbreaktion bewirkende Substanz festgelegten Analyten 12, welcher mit 15 bezeichnet ist. Wenn der Teststreifen 5 in die untersuchende Lösung 2 getaucht wird und entlang der Laufrichtung 9 die zu untersuchende Testlösung läuft, wird im Falle der Fig. 2a sich an den Antikörper 7 der Analyt 3 fest legen, sowie an den Analyten 3 der an eine eine Farbreaktion bewirkende Substanz gekoppelte Antikörper 4 anlagern. An den Analyt bzw. das Homolog 8 wird sich wiederum der an eine eine Farbreaktion bewirkende Substanz angelagerte bzw. gekoppelte Antikörper 4 festlegen, an welchen Antikörper 4 zusätzliche Analytenteilchen 3 gekoppelt sind. Schließlich wird an den Antikörper 13 der Analyt 10 gekoppelt und an dem Analyten 14 wird keine Reaktion stattfinden, da sämtliche Bindungsstellen des an eine eine Farbreaktion bewirkende Substanz gekop- pelten Antikörpers 11 durch Analytenteilchen 10 belegt sind, so daß eine Kopplung des an eine eine Farbreaktion bewirkende Substanz gekoppelten Antikörpers 11 und an den Analyten 14 nicht mehr möglich ist. Am Ende in der Laufrichtung 9 auf der immuno-chromatographischen Membran 6 wird eine Farbreaktion zwischen dem dort festgelegten Antikörper 15 und dem nicht spezifischen Analyten 12 stattfinden, welcher der Probe während des Versuchs zugesetzt wurde, um die Gültigkeit des Versuchs nachweisen zu können.

Der Test gemäß Fig. 2a ist somit in bezug auf den Analyten 3 valide und positiv und der Analyt 3 kann nachgewiesen werden. In bezug auf den Analyten 10 ist er nicht valid, da zuviel des Analyten 10 in der zu untersuchenden Testlösung 2 enthalten ist und somit weder in der spezifischen Testzone noch in der spezifischen Kontrollzone in bezug auf den Analyten 10 eine Farbreaktion beobachtet werden kann. Aus diesem Fehlen der Farbreaktion kann bei Auswertung des Tests auf die Überschußmenge des Analyten geschlossen werden und in weiterer Folge die Testlösung 2 entsprechend verdünnt werden und der Versuch mit einer entsprechend verdünnten Lösung wiederholt werden.

Die Auswertung des Versuches gemäß Fig. 2b zeigt einen gültigen Test, da die nicht spezifische KontrollSubstanz bzw. der Antikörper 15 für die nicht spezifische Kontrollsubstanz 12 eine Reaktion zeigt, an der spezifischen Testzone, nämlich an dem Antikörper 7 keine Reaktion stattfindet, an der spezifischen Kontrollzone 8 eine Reaktion mit einem an eine eine Farbreaktion bewirkende Substanz gekoppelten Antikörper für den Analyten stattfindet, an der zweiten spezifischen Testzone 13 keine Farbreaktion stattfindet, da auch der zweite, zu untersuchende Analyt 10 in der zu unersuchenden Testlösung 2 nicht enthalten ist, und in einer zweiten, spezifischen Kontrollzone 14 eine Farbreaktion nachgewiesen werden kann, da der an eine eine Farbreaktion bewirkende Substanz gekoppelte Antikörper 11 für den Analyten 10 an den auf der Position 14 festgelegten Analyten 10 gekoppelt hat. Der Test gemäß Fig. 2b ist daher gültig und sowohl in bezug auf den Analyten 3 als auch in bezug auf den Analyten 10 valide, jedoch negativ.

Schließlich zeigt Fig. 2c einen Fall, in welchem der Test, welcher wie oben beschrieben durchgeführt wurde, in bezug auf den Analyten 3 valide und positiv ist, und in bezug auf den Analyten 10 valide und negativ ist, da dieser in der untersuchenden Lösung 2 nicht enthalten ist.

Selbstverständlich können neben den Varianten mit ein und zwei zu untersuchenden Analyten auch beispielsweise fünf oder mehr Analyten in der zu untersuchenden Probe enthalten sein und, wie bereits ausgeführt, kann die Auswertung des Versuchsergebnisses sowohl optisch durch rein visuelle Auswertung der Farbintensitäten der erhaltenen Reaktionsbalken durchgeführt werden, als auch mittels entsprechender Meßgeräte und durch Vergleichen mit Eichkurven, beispielsweise quantitativ durchgeführt werden.

Fig. 3a zeigt einen Teststreifen, auf welchen eine immuno-chromatographische Membran 6 aufgebracht ist. In Laufrichtung 9 der Membran, welche mit einem Pfeil angedeutet ist, sind hintereinander zwei Testlinien für zu untersuchende Analyten Al/1 und A2/1 aufgebracht, mit welchen beispielsweise alpha-Laktalbumin (Analyt Al) und Kasein (Analyt A2) nachgewiesen werden kann.

In Abstand von den zwei Testlinien Al/1 und A2/1 sind die entsprechenden spezifischen Kontrollinien Al/1 und A2/2 aufgebracht . Am Ende des Teststreifens 5 ist die nicht spezifische Kontrollzone 12 aufgebracht.

In gleicher Weise zeigt Fig. 3b eine Testkarte 5, in welcher in Flußrichtung 9 drei Paare von Analyten samt spezifischer Kon-trollinie hintereinander aufgebracht sind. So zeigt beispielsweise Al/1 den zu untersuchenden Analyten, beispielsweise alpha-Laktalbumin, die Linie Al/2 zugehörige, spezifische Kontrollinien, die Linie A2/1 einen zweiten zu untersuchenden Analyten, wie beispielsweise Kasein, die Linie A2/2 die zugehörige, spezifische Kontrollinie und die Linie A3/1 einen dritten zu untersuchenden Analyten, wie beispielsweise beta-Laktoglobulin, und die • · · · · · ··# ··· 4 17

Linie A3/2 die zugehörige, spezifische Kontrollinie. Mit 12 ist wiederum die nicht spezifische Kontrollinie dargestellt.

Fig. 4 zeigt wiederum eine Testkarte 5, welche jedoch abweichend von den vorhergehenden Ausbildungen zweiteilig ausgebildet ist. Die Testkarte 5 ist hiebei in der Mitte entlang einer Perforationslinie 16 in zwei Teile 17 und 18 trennbar. Auf den zwei Teilen der Testkarte können nun jeweils zwei Analytenpaare aufgetragen werden, so daß mit ein und derselben Testkarte 5 insgesamt vier Analyten gleichzeitig untersucht werden können. Aufgrund einer derartigen Ausbildung können entweder alle vier Analyten gleichzeitig qualitativ ausgewertet werden oder nach Bedarf jeweils nur die beiden auf einem Streifen bzw. Teil 17 bzw. 18 der Testkarte 5 befindlichen Analyten. Je nach Verfügbarkeit der zur Verfügung stehenden Auswerteeinrichtungen kann weiterhin das Verfahren so geführt werden, daß auch eine quantitative Auswertung aller vier Analyten in einem entsprechenden Lesegerät gleichzeitig durchgeführt werden kann oder nach Trennung des Teststreifens 5 in die Teile 17 bzw. 18, welche jeweils eine immunochromatographische Membran 6 tragen, diese gesondert ausgewertet werden.

In gleicher Weise kann, wie dies in Fig. 5a und 5b dargestellt ist, die Testkarte auch aus mehreren Teilen, beispielsweise drei, wie in Fig. 5a und 5b dargestellt, ausgebildet sein. Die Testkarte 5 umfaßt in diesem Fall drei Teile 17, 18 und 19, wobei auf jedem Teil der Testkarte 5 jeweils ein Analyt sowie die zugehörige, spezifische Kontrollinie, nämlich Al/1 bzw. Al/2, A2/1 bzw. A2/2 und A3/1 bzw. A3/2, auf getragen sind.

Zur besseren Lesbarkeit ist in Fig. 5a hiebei jeweils die spezifische Test- und Kontrollinie in Abstand voneinander auf den Einzelkarten 17, 18 und 19 aufgebracht, so daß mit einem derartigen System nicht nur eine vereinfachte Lesbarkeit des Tests erreicht werden kann, sondern auch eine bessere Übersichtlichkeit erzielt wird. Zur Vervollständigung des Tests ist in allen drei - 18 - 18 • · · • · · • · · · · · · • · · · · · • · · · · ·

Teilkarten 17, 18, 19 des Teststreifens 5 jeweils eine nicht spezifische Kontrollinie 12 aufgebracht.

In diesem Fall ist es beispielsweise möglich, nach einem positiven Ergebnis auf einem der Streifen eine weitere Analyse mit einem weiteren Streifen durchzuführen, um ein verfeinertes Ergebnis zu erhalten.

Fig. 5b zeigt wiederum eine Testkarte 5, in welcher drei voneinander verschiedene Analyten untersucht werden können, wobei die Ausbildung gemäß Fig. 5b insbesondere für die Untersuchung von Analyten, welche in einer Matrix Vorkommen, geeignet ist, beispielsweise kann hier Milch angeführt werden, in welcher verschiedene allergene Komponenten, wie alpha-Laktalbumin, Kasein oder beta-Laktalbumin, enthalten sein können. Die Testkarte 5 ist hiebei wiederum in drei Teile 17, 18 und 19 unterteilt und in Laufrichtung 9 des Flußmittels sind sämtliche, spezifischen Test-und Kontrollinien auf selber Höhe ebenso wie eine nicht spezifische Kontrollinie 12 aufgebracht. Die Testkarte 5 gemäß Fig. 5b ist im Unterschied zu jener von Fig. 5a dahingehend weitergebildet, daß lediglich eine Perforierung 21 im oberen Teil, insbesondere im Griffbereich 20, der Testkarte vorgesehen ist, so daß die Streifen leicht voneinander abgerissen werden können. Die Teststreifen 17, 18 und 19 sind im unteren Bereich, d.h. im Bereich, wo der Test durchgeführt wird, vollständig voneinander getrennt ausgebildet und weisen keine Perforierungen auf.

Bei einer derartigen Ausbildung können insbesondere einzelne Streifen 17, 18 oder 19 von der Testkarte 5 ohne Beschädigung des Versuchs sicher und zuverlässig abgetrennt werden.

Selbstverständlich kann das System dahingehend weitergebildet sein, daß auf der Testkarte 5 lediglich ein einziger Analyt in verschiedenen Bereichen 17, 18 oder 19 der Testkarte detek-tiert wird, wobei beispielsweise in den einzelnen Streifen der Testkarte 5 unterschiedliche Konzentrationen von ein und demselben Analyten aufgebracht werden, um unmittelbar ein quantitatives, sicheres und zuverlässiges Ergebnis zu erzielen.

Claims (17)

19 • · • · • · ♦ · Ansprüche : 1. Immunochromatographisches Verfahren zur Bestimmung von wenigstens einem Analyten in einer zu untersuchenden Testlösung, in welchem auf einer auf einem Träger festgelegten immunochroma-tographischen Membran eine für den Analyten spezifische Testzone aufgetragen wird, dadurch gekennzeichnet, daß auf der Membran (6) gemäß einem immunochromatographischen Trennprinzip getrennt von der spezifischen Testzone (7, 13) für den Analyten (3, 10) eine spezifische Kontrollzone (8, 14) für den Analyten aufgebracht wird, daß in die zu untersuchende Testlösung (2) ein an eine eine Farbreaktion bewirkende Substanz gekoppelter bzw. damit markierter Antikörper (4, 11) für den zu bestimmenden Analyten (3, 10) eingebracht wird, daß der Analyt (3, 10) und der markierte Antikörper (4, 11) von der immunochromatographischen Membran (6) aus der Testlösung (2) auf genommen werden und über die spezifische Testzone (7, 13) und die spezifische Kontrollzone (8, 14) laufen gelassen werden und daß aus dem Vergleich der Intensität, insbesondere der Farbintensität oder Fluoreszenzintensität zwischen der spezifischen Testzone (7, 13) und der spezifischen Kontrollzone (8, 14) die Abwesenheit, die Anwesenheit oder eine Überschußkonzentration des Analyten (3, 10) bestimmt wird.

2. Immunochromatographisches Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich zu der zu untersuchenden Testlösung (2) eine an eine eine Farbreaktion bewirkende Substanz gekoppelte bzw. damit markierte Kontrollsubstanz (12) zugesetzt wird und daß auf der immunochromatographischen Membran (6) eine nicht spezifische Kontrollzone (15), enthaltend einen Antikörper für die Kontrollsubstanz (12) vorgesehen wird.

3. Immunochromatographisches Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sowohl die Menge des an eine eine Farbreaktion bewirkende Substanz gekoppelten bzw. damit markierten Antikörpers (4, 11) für den Analyten (3, 10), als auch die Menge des Antikörpers des Analyten, die auf der immunochromato- graphischen Membran (6) festgelegt wird, quantitativ bestimmt werden.

4. Immunochromatographisches Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß in Laufrichtung (9) der Testlösung (2) auf der immunochromatographischen Membran (6) zuerst die spezifische Testzone (7, 13) und nachgeschaltet die spezifische Kontrollzone (8, 14) sowie gegebenenfalls die nicht spezifische Kontrollzone (15) angeordnet wird bzw. werden.

5. Immunochromatographisches Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine Mehrzahl von zu untersuchenden Analyten (3, 10) gleichzeitig untersucht wird.

6. Immunochromatographisches Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß bei gleichzeitiger Untersuchung einer Mehrzahl von zu untersuchenden Analyten (3, 10) an die zu untersuchenden Analyten (3, 10) angepaßten spezifischen Test- (7, 13) und Kontrollzonen (8, 14) jeweils paarweise hintereinander oder nebeneinander angeordnet werden.

7. Immunochromatographisches Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die immunochromato-graphische Membran (6) 1 bis 20 Minuten, insbesondere 2 bis 15 Minuten in der zu untersuchenden Testlösung (2) eingetaucht wird.

8. Immunochromatographisches Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß zur Auswertung des Verfahrens zuerst die Gültigkeit des Testergebnisses durch Vergleichen der Farbintensität von entweder der bzw. den spezifischen Kontrollzone(n) (8, 14) und/oder der nicht spezifischen Kontrollzone (15) mit einer Farbkarte bestimmt wird und/oder durch die Intensität, insbesondere die Färb- oder FluoreszenzIntensität der spezifischen Testzone mit einer Farbkarte oder mittels photometrischen Meßgeräten verglichen oder gemessen wird.

9. Immunochromatographisches Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß zur quantitativen Bestimmung des wenigstens einen zu bestimmenden Analyten (3, 10) die Intensität der spezifischen Testzone (7, 14) und jene der - 21 ·· ·· ·♦ ···· spezifischen Kontrollzone (8, 14) photometrisch gemessen werden und mit einer Eichkurve verglichen werden.

10. Testsystem zur Bestimmung von wenigstens einem Analyten in einer zu untersuchenden Testlösung, dadurch gekennzeichnet, daß ein Träger (5) vorgesehen ist, auf welchem sich eine in der Dimension definierte, immunochromatographische Membran (6) befindet, daß auf der immunochromatographi sehen Membran (6) eine spezifische Testzone (7, 13), enthaltend insbesondere einen Antikörper für den Analyten (3, 10), festgelegt ist, daß auf der im-munochromatographischen Membran (6) in Abstand von der spezifischen Testzone (7, 13) eine spezifische Kontrollzone (8, 14) , enthaltend den Analyten oder ein Homolog festgelegt ist, und daß ein photometrisches oder fluorometrisches Meßgerät zur Bestimmung eines durch die spezifische Testzone (7, 13) gelaufenen Analyten (3, 10) sowie des an eine eine Farbreaktion bewirkende Substanz gekoppelten bzw. damit markierten Antikörpers (4, 11) für den zu bestimmenden Analyten (3, 10) enthalten ist.

11. Testsystem nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß als photometrisches oder fluorometrisches Meßgerät ein photometrisches oder fluorometrisches Reflexionsgerät, ein Spektrometer oder eine CCD-Kamera eingesetzt ist.

12. Testsystem nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß eine Anzeige zum Anzeigen des Meßgerätergebnisses vorge s ehen ist.

13. Testsystem nach Anspruch 10, 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß auf einer immunochromatographisehen Membran (6) eine Mehrzahl von jeweils paarweise nebeneinander oder hintereinander angeordneten, spezifischen Testzonen (7, 13), spezifischen Kontrollzonen (8, 14) und wenigstens eine nicht spezifische Kontrollzone (15) aufgebracht sind.

14. Testsystem nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Testsystem aus einer Mehrzahl von nebeneinander, gegebenenfalls voneinander trennbar angeordneten Test-streifen gebildet ist. 22 ·· ·

15. Testsystem nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen den nebeneinander angeordneten Teststreifen Unterbrechungen, insbesondere Schlitze oder Perforierungen, ausgebildet sind.

16. Verwendung eines Testsystems zur Bestimmung von wenigstens einem Analyten (3, 10) in einer zu untersuchenden Testlösung (2) , zum Nachweis von Allergenen, Proteinen, unerwünschten Inhaltsstoffen von agrarischen Produkten, genetisch veränderten Mikroorganismen und dgl. Wien,

17. Juni 2008 Erber Aktiengesellschaft

durch: Patentanwälte Miküovsky & Pollh i