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Die vorliegende Anmeldung betrifft ein Verfahren zur Diagnose eines zystischen Ovarialkarzi- noms in einem Individuum oder einer Zellkultur.
Das Ovarialkarzinom ist eine Tumorerkrankung, die vermehrt in der weissen Bevölkerung in Eu- ropa auftritt. Pro Jahr erkranken etwa 15 von 100 000 Frauen am Ovarialkarzinom, wobei diese Erkrankung die Hauptursache für die Mortalität unter allen gynäkologischen Erkrankungen darstellt.
Die Zahl der Fälle der Erkrankungen an Ovarialkarzinomen nimmt mit dem Alter zu, wobei etwa 3% der Frauen unter 30,25% der Frauen zwischen 40 und 50 und 35% der Frauen über 50 diese Tumorart aufweisen.
Trotz bereits gut entwickelter Verfahren zur Diagnose und Therapie, sind Ovarialkarzino- merkrankungen nur schlecht prognostizierbar. Frühe Symptome, die zur Identifizierung dieser Erkrankung in einem frühen Stadium herangezogen werden könnten, sind nicht bekannt. In den meisten Fällen treten die Symptome erst in einem späten Stadium der Krankheit auf und sind unspezifisch. Üblicherweise kommt es zu einer Vermehrung der Abdomenmasse aufgrund von Asziten. Die allgemein übliche therapeutische Behandlung umfasst operative Tumorentfernung zusammen mit einer Chemotherapie, wobei die Überlebensrate von dem Ausmass, in dem sich der Tumor im Abdomen und Pelvis verbreitet hat, abhängt.
Ovarialkarzinome werden aufgrund von histopathologischen Graden klassifiziert: G1 = stark dif- ferenziert, G2 = mässig differenziert, G3 = wenig differenziert, GB = Grenztumor (borderline tumor), Gx = der Grad kann nicht bestimmt werden. Die Verteilung des Tumors wird gemäss FIGO (Interna- tional Federation of Gynecology and Obstetrics) in Stadien I bis IV klassifiziert, wobei die Stadien I bis lll in Untergruppen a, b und c unterteilt werden. Die histologische Typisierung von Ovarialtumo- ren erfolgt entsprechend der WHO (Weltgesundheitsorganisation). Die drei Hauptkategorien sind Epitheltumor, Genitalgrat - Stromatumore und Keimzellen-Tumore. Zusätzlich zu diesen Gruppen existieren andere histologisch definierte Tumore, wobei diese jedoch selten im Bereich des Eier- stocks vorkommen.
Von allen Ovarialtumoren tritt der Epitheltumor am häufigsten auf (55%). Etwa 30% aller Tumo- re sind serös und 15% muzinös, 75% sind benign, 15% malign und 10% sind Grenztumore.
Um das Tumorgewebe und die Tumorverbreitung zu klassifizieren und analysieren, sind histo- logische und zytologische Evaluierungen der Asziten notwendig. Aufgrund von zytogenetischen Ergebnissen von Eierstocktumoren konnte gefunden werden, dass diese häufig in Verbindung mit DNA-Amplifikation der chromosomalen Region 20 q12-q13 auftritt, ähnlich der bereits bekannten Amplifikation in Brustkrebs. Zusätzlich wurde die Genamplifikation von c-erbB-2 und FGF-3 (INT-2) mit onkogenen Prozessen in Verbindung gebracht.
Weiters können Ovarialtumore mit Hilfe verschiedener Tumormarker, wie beispielsweise CA 125, CA 19-9, AFP, Neopterin, Interleukin-8, Interleukin-12 und hCG, detektiert werden.
Zusätzlich zu diesen recht unspezifischen Proteinmarkern wurde die Forschung auf neue Mar- ker mit diagnostischem Wert konzentriert, um zwischen malignen und benignen Ovarialtumoren unterscheiden zu können und um Ovarialkrebs bereits in einem frühen Stadium detektieren zu können. Lösliche Zeiladhäsionsmoleküle, wie das sCD44-Protein, sE-Cadherin und sICAM-1 wurden sowohl in Ovarialkrebs als auch im Serum von Patienten gefunden. Neuere Untersuchun- gen zeigten, dass die Abwesenheit des c-Kit-Proteins in Ovarialkrebs mit einer sehr niedrigen Überlebensrate in Zusammenhang gebracht wird, wobei Patienten mit c-Kit im Tumorgewebe eine höhere Überlebensrate zeigen.
Die Cytosolwerte von uPA, PAI-1 und VEGF zeigen eine signifikante Korrelation mit malignen Entwicklungen und einer geringen Überlebensrate. Es wurden im Serum von Patienten mit malig- nen Ovarialkarzinomen erhöhte VEGF- und suPAR-Werte gefunden. Dennoch führte eine weitere Untersuchung der Seren von Patienten mit Ovarialkarzinomen im Hinblick auf uPA, PAI-1, HER-2 und VEGF nicht zur Detektion eines verlässlichen Tumorindikators, der zur diagnostischen Tu- mormarkierung in einem frühen Stadium verwendet werden könnte. Die Aussagekraft von Apopto- sis-assoziierten Proteinen (ARP), wie FAS und dessen Liganden FAS-L, in Ovarialkrebs im Hin- blick auf Tumorentwicklung und allgemeine Überlebensrate wurde untersucht. Es wurde dabei festgestellt, dass eine Korrelation zwischen den hohen Werten von FAS-L und einer geringen Überlebensrate besteht.
Dasselbe scheint für den Fall eines erhöhten Serumgehalts von FAS zu gelten. Weiters waren die FAS-Serummengen höher in Patienten mit Ovarialkrebs als in Patienten mit benignen Ovarialzysten. Eine ähnliche Korrelation wurde für p53 (ein weiteres ARP) gezeigt, da
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erhöhte p53-Werte mit Ovarialkrebs in Zusammenhang gebracht wurden, und geringe p53-Werte mit Ovarialzysten. Der weite Bereich von p53-Konzentrationen erschwert jedoch die prognostische Evaluierung. Ähnliche Unterschiede der p53-Konzentrationen mit einem ähnlich weiten Konzentra- tionsbereich wurden im Serum von Patienten mit malignen Ovarialtumoren gefunden, verglichen mit dem Serum von Patienten mit benignen Ovarialzysten.
Es wurde keine Korrelation zwischen der p53-Expression in Ovarialkrebs und der Expression des p21-Proteins (ein Cyclin-abhängiger Kinaseinhibitor) gefunden.
Es besteht somit die Notwendigkeit eines Tumormarkers, der auf zuverlässige Weise eine Ova- rialtumorerkrankung bereits im frühen Stadium detektieren kann bzw. die Prognose der Entwick- lung eines solchen Tumors erlaubt. Weiters ist es für eine sinnvolle Diagnose mit anschliessender Therapie notwendig, rasch und zuverlässig mit Hilfe eines Markers zwischen benignen, malignen und semimalignen Ovarialtumoren zu unterscheiden.
Diese Aufgabe wird nun erfindungsgemäss durch das eingangs angeführte Verfahren gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es die Schritte umfasst: - Bestimmen der Konzentration von Calgranulin A und/oder Calgranulin B in einer dem Indivi- duum entnommenen Probe oder der Zellkultur, - Vergleichen der ermittelten Konzentration (en) zumindest einem Referenzwert, wobei ein zystisches Ovarialkarzinom diagnostiziert wird, wenn die ermittelte(n) Konzentration (en) über dem Referenzwert liegt (liegen).
Es wurde nun zum ersten Mal gefunden, dass ein Zusammenhang zwischen der Konzentration von Calgranulin A bzw. Calgranulin B in einem Individuum und der Diagnose eines zystischen Ovarialkarzinoms besteht : Wird ein zystisches Ovarialkarzinom diagnostiziert, so wurde in diesem Individuum ebenfalls eine Überexpression von Calgranulin A und/oder Calgranulin B gefunden im Vergleich zu gesunden Individuen bzw. Individuen mit benignen Ovarialtumoren. Damit wird nun erstmals ein Marker für ein zystisches Ovarialkarzinom zur Verfügung gestellt, der spezifisch und reproduzierbar nicht nur zwischen gesunden Personen und Personen, die an zystischen Ovarial- karzinomen erkrankt sind, unterscheiden kann, sondern auch zwischen malignen und benignen Ovarialtumoren.
Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung wird unter "diagnostizieren" auch die Unterscheidung zwischen semimalignen und benignen bzw. semimalignen und malignen Ovarialtumoren verstan- den : Patienten mit semimalignen Ovarialtumoren zeigen eine höhere Konzentration von Calgranu- lin A und/oder Calgranulin B als Patienten mit benignen Ovarialtumoren oder gesunden Patienten.
Desgleichen zeigen Patienten mit malignen Ovarialkarzinomen eine höhere Konzentration an Calgranulin A und/oder Calgranulin B als Patienten mit semimalignen Ovarialkarzinomen. Obwohl semimaligne Ovarialkarzinome sehr selten vorkommen, ist die Diagnose eines solchen Grenzfalles wichtig. Mit Hilfe der Feststellung der Calgranulin A/B Konzentration wird die Diagnose wesentlich erleichtert und eine hochspezifische und rasche Diagnose wird nun mit Hilfe dieses neuen Verfah- rens ermöglicht.
Calgranulin A, auch MRP8 genannt, und Calgranulin B, auch MRP14 genannt, sind Myeloid- verwandte Proteine (myeloid-related proteins) und gehören zu der S100-Familie der Calcium- Bindungs-proteine. Calgranulin A und Calgranulin B werden coexprimiert und bilden ein Zellen- oberflächen- und Cytoskelett-assoziiertes Heterodimer nach Calciummobilisierung. Dieses Hetero- dimer wird im Cytoplasma von Granulozyten und einer Subpopulation von Blutmonozyten expri- miert.
Diese Proteine werden bereits in verschiedenen Analyseverfahren verwendet :
So beschreibt Hellmann et al. (Toxicol-Sci, 2001 Mai; 61 (1 ):154-63), dass MRP8 und MRP14 in Lungenkarzinomen unterexprimiert werden, verglichen mit normalen gesunden Lungenzellen.
In Fung et al. (Life-Sci. 2000 Juli 14 ; 67 (8):923-36) wird beschrieben, dass in malignen NPE- Zellen (nasopharyngealen Epithelzellen) die Expression von neuen Genen, u. a. von Calgranulin A und Calgranulin B, supprimiert war, wobei diese differenzierte Expression von Calgranulin A und Calgranulin B in nicht-malignen und malignen NPE-Zellen durch RT-PCR-Analysen bestätigt wurde.
In der Veröffentlichung von Jungblut et al. (Electrophoresis 1999 Juli; 20(10):2100-10) wird of- fenbart, dass Calgranulin B in colorectalen Krebszellen überexprimiert wird.
In Stulik et al. (Clin-Chim-Acta. 1997 Sept. 8; 265(1):41-55) wird eine Studie beschrieben, in
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der gefunden wurde, dass Calgranulin B in entzündeten preneoplastischen und neoplastischen Läsionen der Colonmucosa überexprimiert wird.
Endress et al. (Lung-Cancer 1997 Aug.; 18(1):35-46) berichten über die Rolle von Makropha- gen im menschlichen Lungenkarzinom, wobei gezeigt wurde, dass MRP8 und MRP14 positive Makrophagen in Lungenkarzinom in geringerer Anzahl vorhanden waren, während diese in 2710 positiven Zellen vermehrt vorhanden waren.
In Schluesener et al. (Acta-Neuropathol-(Berl). 1998 Dez.; 96 (6):575-80) beschrieben, dass MRP8 und MRP14 in mikroglialen Zellen in Patienten mit humaner zerebraler Malaria (CM) exprimiert werden.
Im Artikel von Schmid et al. (Hum-Pathol. 1995 März ; wird eine Untersuchung be- schrieben, in der festgestellt wurde, dass die Konzentrationen von MRP8 und MRP14 im Serum von Patienten mit aktiver Crohn-Krankheit erhöht sind, wobei angenommen wird, dass diese erhöh- ten Konzentrationen durch eine aktive Sekretion durch Granulozyten, Monozyten und Epithelzellen hervorgerufen werden.
In Koike et al. (J-Biochem-(Tokio) 1998 Juni; 123(6):1079-87) wird eine Studie beschrieben, in der die Proteine MRP8 und MRP14 (migration inhibitory factor-related proteins) in Zusammenhang mit 2 menschlichen Leukämie-Zellkulturen gebracht werden.
Die WO 00/26668 A2 offenbart ein Verfahren zur Diagnose von Krebs, wobei Werte von S 100-AG, S 100-A7, S 100-A8 bzw. S 100-A9 in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit einer Person gemessen werden und mit einem Kontrollwert verglichen werden. Eine erhöhte Konzentra- tion, zumindest eines dieser Proteine, lässt auf eine Krebserkrankung, insbesondere Brust-, Dick- darm- bzw. Lungenkrebs, schliessen.
In Y. LI et al., "Study on dendritic cell phenotypic antigens in human ovarien ephital carcinoma", Zhongguo Mianyxue Zazhi, 17 (10), 2001,-seuteb 567-568, CAPLUS Zusammenfassung, AN 2001:859303, erhalten über die CAPLUS Datenbank, STN-International, Karlsruhe (DE); wird beschrieben, dass die Anzahl von positiven dendritischen Zellen in Ovarialkarzinomen signifikant erhöht ist und die Expressionsstärke von CD1c und S 100 geringer in Ovarialkarzinomen als in normalen Ovarialgeweben ist.
E. C. ILG et al., "Expression Pattern of S 100 Calcium-Binding Proteins in Human Tumors", Int.
J. Cancer, 68,1996, Seiten 325-332 ; die Expression von S 100 Proteinen in Tumoren, wobei jedoch lediglich S 100-A1, S 100-A2, S 100-A4, S 100-A6 und S 100 B getestet wurden, nicht jedoch S 100-A8 und S 100-A9.
Auch in A. Mueller et al., "Subcellular distribution of S 100 proteins in tumor cells and their relo- cation in response to calcium activation ; Histochem. Cell. Biol., 111,1999, Seiten 453-459 ; zwar S 100 Proteine im Zusammenhang mit Tumorzellen gebracht, jedoch werden hier lediglich S 100-A6, S 100-A4 und S 100-A2 getestet, nicht jedoch S 100-A8 und S 100-A9.
Es sind demnach verschiedene Erkrankungen bekannt, die in einem Zusammenhang mit einer Über- oder Unterexpression von Calgranulin A bzw. Calgranulin B stehen. Es wurde jedoch ein Zusammenhang zwischen zystischen Ovarialkarzinomen und der Konzentration von Calgranulin A bzw. Calgranulin B bislang nicht erwähnt oder nahegelegt. Die nun neu entdeckte und überra- schende Tatsache, dass in Patienten mit zystischem Ovarialkarzinom Calgranulin A bzw. Calgra- nulin B überexprimiert wird bzw. werden, kann nun als Basis für neue, effiziente und stabile Marker für zystische Ovarialkarzinome verwendet werden.
Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung betreffen Calgranulin A und Calgranulin B Proteine der S 100-Familie der Calciumbindungsproteine, nämlich die Proteine MRP8 (S 100-A8) und MRP14 (S 100-A9) wie sie beispielsweise in Eue et al. (Int-Immunol. 2000 Nov; 12(11 ):1593-604) beschrieben sind.
Unter "Individuum" wird im Rahmen der vorliegenden Anmeldung insbesondere ein Mensch aber auch ein Säugetier verstanden, das an zystischem Ovarialkarzinom erkranken kann.
Die "Zellkultur" betrifft jegliche in vitro-Züchtung von Zellen, insbesondere Ovarialzellen, wobei diese beispielsweise aus einem gesunden Individuum entnommen worden sein können und die Entstehung bzw. Entwicklung eines zystischen Ovarialkarzinoms anhand dieser Zellkultur unter- sucht werden kann. Selbstverständlich kann die Zellkultur aber auch eine Kultur von Zellen sein, die aus einem Patienten mit einer positiven Diagnose für zystisches Ovarialkarzinom entnommen worden sind.
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Die Konzentration von Calgranulin A/B wird in einer dem Individuum entnommenen Probe be- stimmt, wobei die Probe vorzugsweise eine Körper- oder Organflüssigkeit bzw. eine Organ- oder Gewebeprobe ist, etwa Serum, Zystenflüssigkeit, Eierstockgewebe aber auch Urin, usw.. Im Falle der Zellkultur wird die Konzentration entweder in der Zellkultur direkt oder in einer der Zellkultur entnommenen Probe, z. B. Überstand oder die Zellen selbst, bestimmt.
Die Konzentration wird gemäss einem geeigneten Verfahren bestimmt, wobei das Verfahren je nach der Art der Probe, den labortechnischen Möglichkeiten, der Anzahl der zu bestimmenden Proben, aber auch nach der gewünschten Genauigkeit ausgewählt wird. Die Calgranulin A/B- Konzentration kann beispielsweise elektrophoretisch, chromatographisch, immunologisch, colori- mietrisch bzw. durch eine Kombination dieser Verfahren durchgeführt werden. Da bereits eine Reihe von anti-Calgranulin A/B-Antikörper zur Verfügung stehen, eignen sich immunologische Tests ausgesprochen gut, wobei diese entweder direkt an der Gewebsprobe durchgeführt werden können, oder aber auch in der Flüssigkeit, beispielsweise mit Hilfe von ELISA-Tests.
Zur Unterscheidung zwischen malignen bzw. semimalignen und benignen Ovarialtumoren bzw. gesunden Patienten ist der Referenzwert der Calgranulin A/B-Gehalt in einer entsprechenden "gesunden" oder "benignen" Probe oder Zellkultur, d. h. einer einem Individuum, das nicht an zystischem Ovarialkarzinom erkrankt ist, entnommenen Probe bzw. einer Zellkultur, die kein zysti- sches Ovarialkarzinom aufweist. Zur Unterscheidung zwischen malignen und semimalignen Ovari- alkarzinomen ist der Referenzwert der Calgranulin A/B-Gehalt z. B. in einer entsprechenden "se- mimalignen" Probe oder Zellkultur bzw. der Grenz-Calgranulin A/B-Gehalt, d. h. der maximale semimaligne bzw. minimale maligne Calgranulin A/B-Gehalt in einer entsprechenden Probe bzw.
Zellkultur. Solche Werte können beispielsweise aus Vergleichskurven oder -tabellen herausgele- sen werden bzw. können auch durch eine früher oder parallel durchgeführte Bestimmung ermittelt werden. Dabei soll der Referenzwert vorzugsweise aus einer entsprechenden Probe stammen, d. h., wird die Konzentration in Zystenflüssigkeit bestimmt, so sollte der Referenzwert ebenfalls von Zystenflüssigkeit sein.
Liegt nun die ermittelte Konzentration über dem Referenzwert, so bedeutet dies eine Überex- pression von Calgranulin A/B im Vergleich zum Referenz- bzw. Normalwert, wobei dies eine Er- krankung (malign oder semimalign) an zystischem Ovarialkarzinom bedeutet. Dabei kann entweder die Konzentration von Calgranulin A oder die von Calgranulin B oder auch die Konzentrationen beider Proteine bestimmt werden, wobei selbstverständlich der Referenzwert die entsprechende Konzentration sein soll, d. h. ebenfalls entweder Calgranulin A oder Calgranulin B oder beide zu- sammen. Es hat sich jedoch gezeigt, dass sich insbesondere die Calgranulin A-Konzentration für eine Diagnose eignet.
Vorzugsweise ist der Referenzwert die Konzentration von Calgranulin A und/oder Calgranulin B in einer einem gesunden Individuum entnommenen Probe oder in einer Karzinom-freien Zellkultur.
Dieser Referenzwert ist insbesondere günstig zur Unterscheidung von (semi)malignen und be- nignen Tumoren bzw. gesunden Personen. Dabei wird unter "einem gesunden Individuum" wie oben bereits festgestellt ein entsprechendes Individuum verstanden, das frei von zystischem Ovarialkarzinom ist. Selbstverständlich soll das Individuum, aus dem der Referenzwert bestimmt wird, dasselbe sein, wie das, in dem die Calgranulin A/B-Konzentration ermittelt wird. Das heisst, wird in einem Menschen die Konzentration bestimmt, so soll der Referenzwert ebenfalls in einem (anderen) Menschen in einer entsprechenden Probe bestimmt werden. Dasselbe gilt für die Zellkul- tur, wobei hier auf die Art des Gewebes bzw. das Wachstumsstadium der Zellen geachtet werden soll, um eine möglichst aussagekräftige und reproduzierbare Feststellung hinsichtlich des Krank- heitsgrades durchführen zu können.
Um Untersuchungsfehler auszuschalten, ist es dabei günstig, beide Bestimmungen gleichzeitig in Parallelversuchen durchzuführen. Dabei können auch mehrere Proben zur Bestimmung des Referenzwertes herangezogen werden, um einen Referenz-Mittelwert zu bilden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Anmeldung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der po- sitiven oder negativen Entwicklung eines zystischen Ovarialkarzinoms in einem Individuum oder einer Zellkultur, das die Schritte umfasst: - Bestimmen der Konzentration von Calgranulin A und/oder Calgranulin B in einer dem Individuum oder der Zellkultur entnommenen Probe, - Vergleichen der ermittelten Konzentration (en) dem entsprechenden Konzentrati-
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onswert einer zu einem früheren Zeitpunkt demselben Individuum oder derselben Zellkultur ent- nommenen Probe, wobei eine positive Entwicklung des zystischen Ovarialkarzinoms bestimmt wird, wenn die ermittelte(n) Konzentration (en) über dem Konzentrationswert der früher entnomme- nen Probe liegt (liegen).
Hier gelten dieselben Definitionen und bevorzugten Ausführungsformen wie oben bereits beschrieben. Dieses Verfahren erlaubt die Feststellung der Entwicklung der Erkrankung, wobei eine positive Entwicklung ein Ausbreiten bzw. Wachstum des zystischen Ovari- alkarzinoms bedeutet, d. h. eine Verschlechterung des Krankheitszustandes, und eine negative Entwicklung eine Verkleinerung bzw. gar Verschwinden des zystischen Ovarialkarzinoms, d. h. eine Verbesserung des Krankheitszustandes bedeutet.
Der frühere Zeitpunkt kann etwa der Konzentrationswert vor ein paar Tagen, einer Woche, Mo- naten oder gar Jahren sein. Dabei kann der Konzentrationswert jener sein, der zu dem früheren Zeitpunkt ermittelt wurde. Um mögliche Bestimmungsungenauigkeit zu verhindern, ist es jedoch auch möglich, den Konzentrationswert gleichzeitig an beiden Proben durchzuführen, wobei die zu dem früheren Zeitpunkt entnommene Probe in einer geeigneten Form, etwa in gefrorenem Zu- stand, konserviert wurde.
Mit diesem Verfahren ist es möglich, nicht nur die Entwicklung des zystischen Ovarialkarzi- noms an sich zu bestimmen, sondern auch den Einfluss von verschiedenen Substanzen, etwa Medikamenten, auf das zystische Ovarialkarzinom. Auf diese Weise können Therapien überwacht werden. Im Fall von Zellkulturen ist es weiters auch möglich, krebserregende Substanzen zu detektieren bzw. zu untersuchen.
Vorzugsweise ist die dem Individuum entnommene Probe ausgewählt aus der Gruppe beste- hend aus Zystenflüssigkeit, Zystengewebe, Serum und Harn. Insbesondere Zystenflüssigkeit und Serum haben sich als geeignet für das erfindungsgemässe Verfahren herausgestellt, wobei diese Proben auf einfache Weise im Laufe von Routineuntersuchungen entnommen werden können, was eine sehr unkomplizierte und nicht aufwendige Art der Detektion bzw. Untersuchung von zysti- schen Ovarialkarzinomen darstellt.
Ein besonders vorteilhaftes Verfahren besteht darin, dass die Konzentration von Calgranulin A und/oder Calgranulin B immunologisch bestimmt wird. Diese immunologischen Bestimmungen sind besonders günstig, da eine Reihe von polyklonalen als auch monoklonalen Antikörpern, die spezi- fisch für Calgranulin A und Calgranulin B sind, existieren. Immunologische Verfahren können sowohl in Flüssigkeit als auch auf Geweben durchgeführt werden. Beispiele solcher Verfahren sind Standard-ELISA, Sandwich-ELISA, immunohistochemische Verfahren, etc., wobei diese Verfahren nicht nur ein Detektieren von Calgranulin A/B ermöglichen, sondem auch ein genaues Quantifizie- ren.
Vorzugsweise wird die Konzentration von Calgranulin A und/oder Calgranulin B unter Verwen- dung von monoklonalen Antikörpern bestimmt. Monoklonale Antikörper sind hochspezifisch und können gemäss gängigen Methoden auf sehr einfache und kostengünstige Weise hergestellt wer- den. Andererseits existieren monoklonale Antikörper, die spezifisch für Calgranulin A/B sind, be- reits und sind leicht erhältlich.
Ein weiteres bevorzugtes Verfahren besteht darin, dass die Konzentration von Calgranulin A und/oder Calgranulin B durch Messen der entsprechenden mRNA oder Fragementen davon be- stimmt wird. Das Messen von mRNA-Molekülen kann nach jedem gängigen Verfahren durchge- führt werden, insbesondere durch Hybridisierungsreaktionen oder PCR, wobei es genügt, eine spezifische Region im mRNA-Molekül nachzuweisen. Auch dieses Verfahren kann direkt in der Probe durchgeführt werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Kit zur Detektion eines zystischen Ovarialkarzinoms in einem Individuum oder einer Zellkultur, das - ein Reagenz zum Bestimmen der Konzentration von Calgranulin A und/oder Calgranulin B und - ein Calgranulin A und/oder Calgranulin B Referenzmittel umfasst.
Das Reagens zur Bestimmung der Konzentration von Calgranulin A/B hängt dabei natürlich von dem jeweiligen Detektionsverfahren ab, wobei der Kit selbstverständlich auch zwei oder mehr Reagenzien umfassen kann, wenn diese für das Detektionsverfahren notwendig sind. Das Rea- gens kann z. B. Antikörper, Puffer mit Nachweissubstanzen und Ähnliches, umfassen. Zusätzlich können weitere Detektionsmittel, etwa fluoreszierende, radioaktive oder chromogene Substanzen bzw. auch sekundäre Antikörper vorgesehen sein.
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Das Referenzmittel ist beispielsweise eine Probe umfassend eine standardisierte Konzentrati- on von Calgranulin A/B, beispielsweise in einem Puffer oder auch in einer der jeweiligen Körper- flüssigkeit- oder Zellkultur-Probe entsprechenden Lösung. Das Referenzmittel kann aber auch aus einem einfachen Vergleichswert, einer Vergleichstabelle oder einer Vergleichskurve bestehen.
Vorzugsweise umfasst das Reagens zur Bestimmung der Konzentration von Calgranulin A und/oder Calgranulin B Antikörper, insbesondere monoklonale Antikörper. Dabei ist es von Vorteil, wenn die Antikörper in einer bestimmten Konzentration im Reagens vorliegen, wobei die anti- Calgranulin A- und anti-Calgranulin B-Antikörper getrennt voneinander aber auch zusammen im Reagens vorgesehen werden können. Die Antikörper können dabei an Marker gebunden sein, etwa an fluoreszierende, radioaktive oder chromogene Gruppen bzw. können im Kit weiter Sekun- därantikörper, die spezifisch für die Primärantikörper sind, vorgesehen sein.
Vorzugsweise sind die Antikörper an einem festen Träger immobilisiert. Dadurch wird ermög- licht, dass die Proben lediglich auf den festen Träger aufgetragen bzw. über diesen darüber fliessen können, wobei Calgranulin A/B über die Antikörper an dem festen Träger immobilisiert werden.
Anschliessend können Waschschritte durchgeführt werden und die Detektion entweder direkt am festen Träger oder nach einem Eluieren im Eluat. Der Träger kann beispielsweise eine Chroma- tographiesäule, ein Filter, eine Mikrotiterplatte, Well, etc. sein.
Weiters ist es günstig, wenn der Kit einen festen Träger zur Immobilisierung von Calgranulin A und/oder Calgranulin B umfasst. Dieser feste Träger kann beispielsweise mit den natürlichen Bindungspartnern von Calgranulin A/B, deren Analogen, Teilen von Antikörpern und Ähnlichem vorgesehen werden. Nach Immobilisierung von Calgranulin A/B kann die Detektion wiederum entweder direkt auf dem festen Träger, etwa mit Hilfe von markierten oder unmarkierten Antikör- pern, oder nach einem Elutionsschritt im Eluat durchgeführt werden. Auch hier kann als Träger einer der oben definierten Träger vorgesehen sein.
Besonders bevorzugt umfasst das Referenzmittel eine standardisierte Menge an Calgranulin A und/oder Calgranulin B. Dadurch wird ein Kit zur Verfügung gestellt, der eine Parallelbestimmung des Referenzwertes gewährleistet, wodurch mögliche Ungenauigkeiten beim Bestimmungsverfah- ren ausgeschaltet werden.
Eine weitere vorteilhafte Ausführungsform besteht darin, dass das Referenzmittel eine Reihe von standardisierten Calgranulin A und/oder Calgranulin B Proben umfasst. Diese Proben können z. B. bestimmte Krankheitsgrade darstellen, so dass mit Hilfe lediglich eines Bestimmungsverfah- rens das Ausmass bzw. Stadium der Erkrankung festgestellt werden kann.
Calgranulin A und/oder Calgranulin B-Inhibitoren können zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von zystischen Ovarialkarzinomen verwendet werden. Da die Konzentration von Calgranulin A und/oder Calgranulin B im direkten Zusammenhang mit einer Erkrankung an zysti- schen Ovarialkarzinomen steht, kann eine Verminderung der Konzentration von Calgranulin A/B bzw. ein völliges Ausschalten von Calgranulin A/B eine Erkrankung verhindern bzw. als Therapie für einen bereits an zystischen Ovarialkarzinomen erkrankten Patienten herangezogen werden.
Unter Calgranulin A und/oder Calgranulin B-Inhibitoren werden Substanzen, Moleküle oder Protei- ne verstanden, die beispielsweise die Expression von Calgranulin A/B auf Transkriptionsebene bzw. Translationsebene verhindert oder vermindert, bereits exprimierte Proteine spezifisch angrei- fen und gegebenenfalls zerstören, die Aktivität von exprimiertem Calgranulin A/B Proteinen blo- ckiert etc.. Insbesondere werden unter Calgranulin A/B-Inhibitoren Calgranulin A/B Antikörper verstanden, insbesondere monoklonale Antikörper sowie auch Antikörper-Fragmente. Weiters könnten auch nicht-aktive Calgranulin A/B-Analoga eingesetzt werden, die kompetitiv mit dem natürlichen Calgranulin A/B wirken. Weiters könnten als Calgranulin A/B-Inhibitoren solche einge- setzt werden, die in Gene-silencing, Knockout bzw. Antisense-Verfahren eingesetzt werden.
Selbstverständlich können hier wiederum entweder Calgranulin A- oder Calgranulin B-Inhibitoren verwendet werden. Es ist aber auch möglich, beide in einem abgestimmten Verhältnis zueinander in einem Medikament zu verwenden. Bei einer derartigen Behandlung eines Patienten mit zysti- schem Ovarialkarzinom wird dem Patienten eine ausreichende Menge an Calgranulin A und/oder Calgranulin B-Inhibitoren verabreicht. Hier gelten wiederum die oben genannten Definitionen und bevorzugten Ausführungsformen, wobei die Verabreichung insbesondere oral oder intravenös geschieht. Unter "Behandlung" wird sowohl die Behandlung von malignen oder semimalignen Karzinomen verstanden als auch die Verhinderung einer Verschlechterung der Erkrankung im Falle
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eines benignen Karzinoms.
Weiters wird auch die Verhinderung einer Erkrankung an einem gesunden Patienten verstanden.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der nachfolgenden Figuren und Beispiele, auf die sie jedoch nicht beschränkt sein soll, noch näher erläutert, wobei die Figuren 1 bis 3 die Ergebnisse von 2D-Gel-Elektrophorese-Untersuchungen verschiedener Proben und die Fig. 4 und 5 die Aminosäuresequenzen von MRP8 und MRP14 zeigen.
Beispiel 1
Flüssigkeiten von malignen, benignen und grenzwertigen Ovarialtumoren wurden während der Operation bzw. im Laufe einer Routineuntersuchung gesammelt. Nach dem Zentrifugieren wurden diese Proben in Aliquote eingeteilt und wie die Pellets eingefroren. Am selben Tag wurden weiters Blutproben derselben Patienten gesammelt, wobei die Überstände nach Zentrifugation ebenfalls in Pellets geteilt und eingefroren wurden.
Es wurde eine quantitative Analyse der Aliquoten der Flüssigkeitsproben durchgeführt, um die Gesamtmenge an Protein gemäss dem Lowry-Verfahren zu bestimmen. Für die analytischen Untersuchungen der Flüssigkeiten und der Seren mittels 2D-Gel-Elektrophorese wurden denaturierende Agenzien zu den Aliquoten zugesetzt, um die Proteine zu dissozieren und die DisulfidbrückenBindungen zu reduzieren.
In einem ersten Schritt wurde die Trennung der Proteine mittels IEF (isoelektrischer Fokussierung) in einem elektrischen Feld (pH 3-10) durchgeführt. Anschliessend wurde eine zweite Trennung der Proteine in einem Akrylamidgradientengel (9-16%) durchgeführt. Die Proteinspots, die in der zweiten Dimension positionieren, sind somit durch zwei unabhängige Parameter charakterisiert, einerseits durch die isoelektrische Fokussierung und andererseits durch das Molekulargewicht. Die Proteinspots auf dem 2D-Gel werden mit Hilfe einer modifizierten Silberfärbungsmethode gemäss Blum sichtbar gemacht. Dieses Verfahren erlaubt die Identifizierung von mehr als 100 Proteinen in der Flüssigkeit verschiedener Ovarialtumore und in dem Serum der Patienten, so dass die unterschiedlichen Proteinmuster miteinander verglichen werden können.
Beispiel 2
Es wurden 13 maligne und 13 benigne Ovarialtumore untersucht, wobei einerseits die zystische Flüssigkeit und andererseits das Serum dieser 26 Patienten durch 2D-Gel-Elektrophorese analysiert wurden. Um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, wurden die Proben mehrmals unter einzelnen Bedingungen durch 2D-Gel-Elektrophorese untersucht, insgesamt wurden 235 Gele durchgeführt (s. Tabellen 1 und 2).
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Tabelle 1: Maligne zystische Ovarialtumore
EMI8.1
<tb> Nr. <SEP> Diagnose <SEP> Malignitäts-Grad <SEP> 2D-Gele <SEP> Gesamtprotein:mg/ml
<tb> (FIGO) <SEP> Zysten <SEP> Serum <SEP> Zysten <SEP> Serum
<tb> 1 <SEP> 16191229 <SEP> Seröses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> II <SEP> IIb <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 55 <SEP> 61
<tb> Mucinöses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> II <SEP> IIb <SEP> 23 <SEP> 2 <SEP> 65 <SEP> 61
<tb> 2 <SEP> 40020252 <SEP> Endometriotisches <SEP> Zystadenokar- <SEP> II <SEP> Ia <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 45 <SEP> 50
<tb> zinom
<tb> 3 <SEP> 36130461 <SEP> Seröses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> I <SEP> Ib <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 19 <SEP> 49
<tb> 4 <SEP> 04010221 <SEP> Undifferenziertes <SEP> Zystadenokar- <SEP> II <SEP> Ib <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 19 <SEP> 38
<tb> zinom
<tb> 5 <SEP> 77270223 <SEP> Seröses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> III <SEP> Ia <SEP> 2
<SEP> 3 <SEP> 43 <SEP> 47
<tb> 6 <SEP> 94240661 <SEP> Mucinöses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> I <SEP> Ia <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 36 <SEP> 55
<tb> 7 <SEP> 95080861 <SEP> Mucinöses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> I <SEP> Ia <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 50 <SEP> 60
<tb> 8 <SEP> 63211146 <SEP> Undifferenziertes <SEP> Zystadenokar- <SEP> II <SEP> IIb <SEP> 27 <SEP> 2 <SEP> 63 <SEP> 42
<tb> zinom
<tb> 9 <SEP> 67230452 <SEP> 'Mucinöses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> II <SEP> IIa <SEP> 8 <SEP> 5 <SEP> 79 <SEP> 80
<tb> 10 <SEP> 45291053 <SEP> Seröses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> I <SEP> IIIb <SEP> 9 <SEP> 3 <SEP> 62 <SEP> 53
<tb> 11 <SEP> 97280346 <SEP> Seröses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> II <SEP> Ia <SEP> 19 <SEP> 5 <SEP> 69 <SEP> 70
<tb> 12 <SEP> 62070158 <SEP> Seröses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> II <SEP> IIIc <SEP> 10 <SEP> 2 <SEP> 75 <SEP> 76
<tb> 13 <SEP> 77030522 <SEP> Seröses <SEP>
Zystadenokarzinom <SEP> III <SEP> IIIC <SEP> 9 <SEP> 5 <SEP> 75 <SEP> 70
<tb> Total <SEP> 2D-Gele <SEP> 115 <SEP> 38'
<tb>
<Desc/Clms Page number 9>
5
10
15
20
25 30 35 40 45 50 55 Tabelle 2 : Nicht-maligne zystische Ovarialtumore
EMI9.1
<tb> Nr. <SEP> Diagnose <SEP> histologische <SEP> 2D-Gele <SEP> Gesamtproteine:
mg/ml
<tb> Untersuchung <SEP> Zysten <SEP> Serum <SEP> Zysten <SEP> Serum
<tb> 1 <SEP> 87150523 <SEP> Seröses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> keine <SEP> Malignität <SEP> 3 <SEP> 2 <SEP> 60 <SEP> 65
<tb> 2 <SEP> 24291249 <SEP> Seröses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> keine <SEP> Malignität <SEP> 5 <SEP> 78 <SEP> 63
<tb> 3 <SEP> 7310362 <SEP> Seröses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> keine <SEP> Malignität <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 70 <SEP> 60
<tb> 4 <SEP> 40270616 <SEP> Seröses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> keine <SEP> Malignität <SEP> 4 <SEP> 1 <SEP> 60 <SEP> 76
<tb> 5 <SEP> 55170949 <SEP> Seröses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> keine <SEP> Malignität <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 47 <SEP> 60
<tb> 6 <SEP> 58060165 <SEP> Seröses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> keine <SEP> Malignität <SEP> 10 <SEP> 1 <SEP> 79 <SEP> 71
<tb> 7 <SEP> 72110223 <SEP> Seröses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> keine <SEP>
Malignität <SEP> 6 <SEP> 2 <SEP> 74 <SEP> 67
<tb> 8 <SEP> 65201072 <SEP> Seröses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> keine <SEP> Malignität <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 70 <SEP> '65
<tb> 9 <SEP> 26060978 <SEP> Seröses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> keine <SEP> Malignität <SEP> 4 <SEP> 4 <SEP> 47 <SEP> 44
<tb> 10 <SEP> 77270135 <SEP> Seröses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> keine <SEP> Malignität <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> 106 <SEP> 81
<tb> 11 <SEP> 29191274 <SEP> Sactosalpinx <SEP> keine <SEP> Malignität <SEP> 7 <SEP> 3 <SEP> 47 <SEP> 60
<tb> 12 <SEP> 69130175 <SEP> Seröses <SEP> Zystadenokarzinom <SEP> keine <SEP> Malignität <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 90 <SEP> 65
<tb> 13 <SEP> 56030868 <SEP> Dermoide <SEP> Zysten <SEP> keine <SEP> Malignität <SEP> 6 <SEP> 2 <SEP> 41 <SEP> 63
<tb> Total <SEP> 2D-Gele <SEP> 38 <SEP> 24 <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 10>
In Fig.
1 bis 3 sind die Ergebnisse gezeigt, wobei Fig.la und 3a Proben aus einem Patienten mit muzinösem Zystenkarzinom Grad II/FIGO 11b, Fig. 2a eine Probe aus einem Patienten mit serösem Zystenkarzinom zeigen. "C" bedeutet Zystenflüssigkeit und "S" Serum. Die Ergebnisse zeigen, dass die Proteinmuster der Ovarialkrebs-Flüssigkeiten signifikant verschieden sind im Vergleich zu den Ovarialzysten-Flüssigkeiten. Insbesondere im unteren Molekularbereich zwischen 10 und 25 kD (s. breiter Pfeil in Figuren 1 bis 3) sind zahlreiche zusätzliche Proteinspots sowohl in der Zystenflüssigkeit als auch im Serum der Patienten mit Ovarialkrebs zu sehen (s. Figuren 1a bis 3a) verglichen mit Patienten mit benignen Ovarialzysten (s. Figuren 1 b bis 3b).
Mittels partieller Aminosäure-Sequenzanalyse wurden die Proteinspots 1 als Calgranulin A (Fig.4) und 2 als Calgranulin B (Fig.5) identifiziert, wobei die jeweilige Sequenz mit ihren Aminosäuren als auch als schematische Darstellung gezeigt ist, "M" die mittlere Masse, "S" Sequenz und "P" Position bedeu- ten. Die mit 100-300 ng Protein pro Spot vorliegende Proteinmenge bezogen auf die im 2D-Gel untersuchte Gesamt-Proteinmenge von 100 g ist auch für immunologische Tests ausreichend.
Die Lokalisierung dieser beiden Proteine im 2D-Gel wurde erstmalig durchgeführt.
Die Untersuchungen an Proben von Patienten zeigen zusätzliche Proteinspots, die nur bei Pa- tienten mit malignen Tumoren vorkommen. In einem der Patienten haben sich Abdomenasziten zusätzlich zum serösen Zystadenokarzinom im Laufe der Erkrankung entwickelt. In dieser Unter- suchung der Proteine mittels 2D-Gel-Elektrophorese sind die Zystenflüssigkeit und die Aszitenflüs- sigkeit einander sehr ähnlich.
Weiters wurden zusätzliche Proteine im unteren Molekularbereich zwischen 10 und 20 kD in den Serumproben der 13 Patienten mit Ovarialkrebs gefunden. Diese zusätzlichen Proteine im Serum zeigen starke Ähnlichkeiten in ihrer elektrophoretischen Positionierung mit denen, die in den Zystenflüssigkeiten der entsprechenden Ovarialkrebs-Patienten gefunden wurden. Im Serum von Patienten mit gutartigen Ovarialzysten sind diese zusätzlichen Proteine nicht nachweisbar vorhan- den.
PATENTANSPRÜCHE:
1. Verfahren zur Diagnose eines zystischen Ovarialkarzinoms in einem Individuum, insbe- sondere in einem Menschen oder in einem Säugetier, oder einer Zellkultur, dadurch ge- kennzeichnet, dass es die Schritte umfasst: - Bestimmen der Konzentration von Calgranulin A und/oder Calgranulin B in einer dem In- dividuum entnommenen Probe oder der Zellkultur, - Vergleichen der ermittelten Konzentration (en) zumindest einem Referenzwert, wobei ein zystisches Ovarialkarzinom diagnostiziert wird, wenn die ermittelte(n) Konzentrati- on(en) über dem Referenzwert liegt (liegen).