AT394208B - Process for the preparation of vectors - Google Patents

Abstract

Processes for the preparation of replicable vectors which bring about in microorganisms the expression of polypeptides with the amino acid sequence of a mature human leukocyte interferon are described and comprise linking a first DNA sequence which encodes these polypeptides operably to a second DNA sequence which contains the codons necessary for expression.

Description

AT 394 208 BAT 394 208 B

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der rekombinanten DNS-Technologie, d. h. Verfahren, die im weitesten Sinne zur Herstellung von rekombinanten Proteinen durch Mikroorganismen führen.The present invention relates to the field of recombinant DNA technology, i. H. Processes which, in the broadest sense, lead to the production of recombinant proteins by microorganisms.

Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung das Gebiet der Herstellung von reifen Human-Leukozyten-Interferonen mittels rekombinanter DNS-Technologie und insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von Expressions-Vektoren (im folgenden kurz Vektoren genannt), die eine für reifes Human-Leukozyten-Interferon koderende DNS-Sequenz enthalten.More specifically, the present invention relates to the field of producing mature human leukocyte interferons by means of recombinant DNA technology, and in particular to a method for producing expression vectors (hereinafter referred to as vectors for short) which end one coding for mature human leukocyte interferon DNA sequence included.

Hintergrund der ErfindungBackground of the Invention

Human-Leukozyten-Interferon (LelF) wurde zuerst von Isaacs and Lindenmann (Proc, R. Soc. B 147,258-267 [1957]; U.S.P. 3.699.222) entdeckt und in Form der rohen Präzipitate hergestellt. Die seit dieser Zeit andauernden Anstrengungen, das Material zu reinigen und zu charakterisieren, haben zur Herstellung relativ homogener Leukozyten-Interferone aus normalen Leukozyten oder aus Leukozyten von leukämischen Spendern geführt (z. B. DE-OS 2.947.134). Diese Interferone gehören zu einer Familie von Proteinen, die die bekannte Eigenschaft besitzen, bestimmten Zellen einen Virus-resistenten Zustand zu verleihen. Darüberhinaus kann Interferon die Zell-Proliferation hemmen und die Immunantwort modulieren. Diese Eigenschaften haben dazu geführt, daß Leukozyten-Interferon klinisch als therapeutisches Mittel zur Behandlung viraler Infektionen und Krankheiten eingesetzt wurde.Human leukocyte interferon (LelF) was first discovered by Isaacs and Lindenmann (Proc, R. Soc. B 147,258-267 [1957]; U.S.P. 3,699,222) and prepared in the form of the crude precipitates. Efforts to clean and characterize the material since then have led to the production of relatively homogeneous leukocyte interferons from normal leukocytes or from leukocytes from leukemic donors (e.g. DE-OS 2,947,134). These interferons belong to a family of proteins which have the known property of imparting a virus-resistant state to certain cells. In addition, interferon can inhibit cell proliferation and modulate the immune response. These properties have led to leukocyte interferon being used clinically as a therapeutic agent for the treatment of viral infections and diseases.

In der Vergangenheit wurden Leukozyten-Interferone im wesentlichen bis zur Homogenität gereinigt (Rubinstein et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 26, 640-644 [1979]; Zoon et al., ibid. 26, 5601-5605 [1979]). Die berichteten Molekulargewichte liegen im Bereich von etwa 17,500 bis etwa 21,000. Die spezifischen Aktivitäten dieser Präparate sind bemerkenswert hoch mit 2 x 10 bis 1 x 10 Einheiten pro mg Protein, aber die aus den Zellkulturen erhaltenen Ausbeuten sind bisher entmutigend niedrig. Trotzdem gelang durch verfeinerte Proteinsequenzierungsmethoden die Bestimmung von Aminosäurepartialsequenzen (Zoon et al., Science 207.527 [1980]; Levy et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 22, 5102-5104 [1980]). Die Frage der Glycosylierung der verschiedenen Leukozyten-Interferone ist bis jetzt noch nicht völlig abgeklärt, aber es ist soviel klar, daß Unterschiede in den Molekulargewichten nicht allein durch Glykosylierung hervorgerufen werden. Es ist auch klar, daß die Leukozyten-Interferone deutlich unterschieden sind voneinander durch unterschiedliche Aminosäurezusammensetzung und -sequenz und die Aminosäurehomologie ist in manchen Fällen niedriger als 80 %. Während das aus Spender-Leukozyten isolierte homogene Leukozyten-Interferon ausreichte zur partiellen Charakterisierung und zu limitierten klinischen Studien, reicht diese Quelle bei weitem nicht aus für die Gewinnung derjenigen Mengen an Interferon, die für breite klinische Prüfungen und die anschließende prophylaktische und/oder therapeutische Verwendung notwendig sein werden. Tatsächlich bediente man sich bei den bisherigen klinischen Untersuchungen zur Evaluation des Human-Leukozyten-Interferons in Antitumor- und antiviralen Testen hauptsächlich rohen Materials (Reinheit &lt; 1 %) und die langen Zeiten, die nötig sind, um genügende Mengen reinen Materials zu erhalten haben zu einer starken Verzögerung von Untersuchungen in größerem Maßstab geführtIn the past, leukocyte interferons have been substantially purified to homogeneity (Rubinstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 26, 640-644 [1979]; Zoon et al., Ibid. 26, 5601-5605 [ 1979]). The reported molecular weights range from about 17,500 to about 21,000. The specific activities of these preparations are remarkably high at 2 x 10 to 1 x 10 units per mg protein, but the yields obtained from the cell cultures have so far been discouragingly low. Nonetheless, refined protein sequencing methods succeeded in determining amino acid partial sequences (Zoon et al., Science 207,527 [1980]; Levy et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 22, 5102-5104 [1980]). The question of glycosylation of the various leukocyte interferons has not yet been completely clarified, but it is so clear that differences in molecular weights are not caused by glycosylation alone. It is also clear that the leukocyte interferons are clearly distinguished from one another by a different amino acid composition and sequence and the amino acid homology is in some cases lower than 80%. While the homogeneous leukocyte interferon isolated from donor leukocytes was sufficient for partial characterization and limited clinical studies, this source is by no means sufficient for obtaining those amounts of interferon that are suitable for wide clinical trials and the subsequent prophylactic and / or therapeutic use will be necessary. In fact, previous clinical trials to evaluate human leukocyte interferon in antitumor and antiviral testing used primarily raw material (purity <1%) and the long times required to obtain sufficient amounts of pure material led to a large delay in large-scale investigations

Durch rekombinante DNS-Technologie ist es jedoch inzwischen gelungen, eine große Anzahl wertvoller Polypeptide kontrolliert mikrobiell herzustellen. So existieren inzwischen bereits Bakterien, die durch diese Technologie so modifiziert wurden, daß sie die Herstellung von Polypeptiden wie Somatostatin, den A und B Ketten des Human-Insulins und Human-Wachstumshormon gestatten (Itakura et al., Science 198.1056-1063 [1977]; Goeddel et al., Nature 281.544-548 [1979]). Kürzlich gelang durch die Anwendung der rekombinanten DNS-Technik die bakterielle Herstellung von Proinsulin und Thymosin alpha 1 und verschiedene Autoren haben berichtet, daß es ihnen gelungen ist Human-Leukozyten-Interferon kodierende DNS und entsprechende Proteine mit Leukozyten-Interferonaktivität zu erhalten (Nagata et al., Nature 2M&gt; 316-320 [1980]; Mantei et al., Gene 10,1-10 [1980]; Taniguchi et al., Nature 285.547-549 [1980]).However, recombinant DNA technology has meanwhile succeeded in producing a large number of valuable polypeptides in a controlled microbial manner. Bacteria, which have been modified by this technology to allow the production of polypeptides such as somatostatin, the A and B chains of human insulin and human growth hormone (Itakura et al., Science 198.1056-1063 [1977] ; Goeddel et al., Nature 281.544-548 [1979]). Recently, the recombinant DNA technique was used to produce proinsulin and thymosin alpha 1 bacterially, and various authors have reported that they have succeeded in obtaining DNA encoding human leukocyte interferon and corresponding proteins with leukocyte interferon activity (Nagata et al ., Nature 2M> 316-320 [1980]; Mantei et al., Gene 10.1-10 [1980]; Taniguchi et al., Nature 285.547-549 [1980]).

Das Zugpferd der rekombinanten DNS-Technologie ist das Plasmid, eine nicht-chromosomale Schleife doppelsträngiger DNS, die in Bakterien und anderen Mikroben oft in vielen Kopien pro Zelle vorliegt. Die in der Plasmid-DNS enthaltene Information umfaßt diejenige zur Reproduktion des Plasmids in Tochterzellen (d. h. ein &quot;Replicon&quot;) und gewöhnlich ein oder mehrere Selektions-Charakteristiken wie, im Fall von Bakterien, die Resistenz gegenüber Antibiotika, die es erlauben, Klone der Wirts-Zelle, die das interessierende Plasmid enthalten, zu erkennen und in einem ausgewählten Medium selektiv zu züchten. Die Nützlichkeit der Plasmide liegt in der Tatsache, daß sie spezifisch durch die eine oder andere Restriktions-Endonuclease (auch Restriktionsenzym genannt) gespalten werden können, wobei jede Endonuclease eine andere Stelle der Plasmid-DNS erkennt. Heterologe Gene oder Genfragmente können in das Plasmid an den Spaltstellen oder anschließend an die Spaltstellen rekonstruierte Enden eingefügt werden. Die DNS-Rekombination wird außerhalb der Zelle durchgeführt aber das erhaltene rekombinante Plasmid wird durch einen Vorgang, der als Transformation bekannt ist, in die Zelle eingeführt und große Mengen an heterologe Gene enthaltenden, rekombinierten Plasmiden können durch Kultivierung der transformierten Zellen erhalten werden. Ist das heterologe Gen in richtiger Weise (d. h. operabel) bezüglich derjenigen Teile des Plasmids eingefügt, die für die Transcription und Translation der kodierten DNS-Nachricht verantwortlich sind, dann kann das erhaltene rekombinierte Plasmid (Expressionsvektor, Vektor) zur Herstellung des Polypeptids verwendet werden, das durch das heterologe Gen kodiert wird. -2- ΑΤ 394 208 ΒThe driving force behind recombinant DNA technology is the plasmid, a non-chromosomal loop of double-stranded DNA that is often found in many copies per cell in bacteria and other microbes. The information contained in the plasmid DNA includes that relating to the reproduction of the plasmid in daughter cells (ie a &quot; replicon &quot;) and usually one or more selection characteristics such as, in the case of bacteria, resistance to antibiotics which allow clones to be cloned Recognize host cells containing the plasmid of interest and selectively grow in a selected medium. The usefulness of the plasmids lies in the fact that they can be cleaved specifically by one or the other restriction endonuclease (also called restriction enzyme), each endonuclease recognizing a different site of the plasmid DNA. Heterologous genes or gene fragments can be inserted into the plasmid at the cleavage sites or subsequently reconstructed ends at the cleavage sites. DNA recombination is carried out outside the cell, but the recombinant plasmid obtained is introduced into the cell by a process known as transformation, and recombinant plasmids containing large amounts of heterologous genes can be obtained by culturing the transformed cells. If the heterologous gene is inserted correctly (ie operably) with respect to those parts of the plasmid which are responsible for the transcription and translation of the encoded DNA message, the recombinant plasmid obtained (expression vector, vector) can be used to produce the polypeptide, which is encoded by the heterologous gene. -2- ΑΤ 394 208 Β

Dieser Prozeß wird als Expression bezeichnet.This process is called expression.

Die Expression wird ausgelöst in der Promoter-Region, die durch RNS-Polymerase erkannt und gebunden wird. In einigen Fällen, wie z. B. beim Tryptophan- oder &quot;trp&quot;-Promoter, der in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bevorzugt ist, werden Promotor-Regionen von sogenannten Operator-Regionen überlappt und bilden dann einen kombinierten Promotor-Operator. Operatoren sind DNS-Sequenzen, die von sogenannten Repressor-Proteinen erkannt werden, die wiederum die Frequenz des Transkriptionsbeginns an einem speziellen Promotor regulieren. Die Polymerase wandert an der DNS entlang und überschreibt die Information, die der kodierende Strang enthält, vom 5'- zum 3'-Ende in mRNS, die dann wiederum in das Polypeptid mit der durch die DNS kodierten Aminosäuresequenz übersetzt wird. Jede Aminosäure eines Polypeptids wird innerhalb des sogenannten Strukturgens durch ein Nukleotid-Triplett oder Codon kodiert Nach der Bindung an den Promotor transkribiert die RNS-Polymerase zunächst Nukleotide, die eine Ribosomen-Bindungsstelle kodieren, dann ein Translations-Startsignal (gewöhnlich ATG, das in der mRNS zu AUG wird) und schließlich die Nukleotid Sequenzen des Strukturgens selbst Am Ende des Strukturgens werden sogenannte Stopcodons transkribiert, nach denen die Polymerase noch weitere mRNS-Sequenzen bilden kann, die aber wegen des vorhandenen Stopsignals von den Ribosomen nicht mehr übersetzt werden. Die Ribosomen lagern sich an die vorgesehene Bindungsstelle der mRNS an, in Bakterien gewöhnlich während diese entsteht und stellen dann ihrerseits das kodierte Polypeptid her, beginnend am Translations-Startsignal und endend mit dem bereits erwähnten Stopsignal. Das gewünschte Produkt wird hergestellt wenn die Sequenzen, die die Ribosomen-Bindungsstelle kodieren richtig liegen in Bezug auf das AUG-Startsignal und wenn alle übrigen Kodons mit dem Startsignal in Phase sind. Das gewünschte Polypeptid kann erhalten werden durch Lyse der Wirts-Zelle, Abtrennung von anderen Bakterienproteinen und Reinigung in üblicher Weise.Expression is triggered in the promoter region which is recognized and bound by RNA polymerase. In some cases, such as B. in the tryptophan or "trp" promoter, which is preferred in connection with the present invention, promoter regions are overlapped by so-called operator regions and then form a combined promoter operator. Operators are DNA sequences that are recognized by so-called repressor proteins, which in turn regulate the frequency of the start of transcription on a special promoter. The polymerase migrates along the DNA and overwrites the information contained in the coding strand from the 5 'to the 3' end in mRNA, which in turn is then translated into the polypeptide with the amino acid sequence encoded by the DNA. Each amino acid of a polypeptide is encoded within the so-called structural gene by a nucleotide triplet or codon. After binding to the promoter, the RNA polymerase first transcribes nucleotides that encode a ribosome binding site, then a translation start signal (usually ATG, which is in the mRNA becomes AUG) and finally the nucleotide sequences of the structural gene itself. At the end of the structural gene, so-called stop codons are transcribed, according to which the polymerase can form further mRNA sequences, which, however, are no longer translated by the ribosomes due to the existing stop signal. The ribosomes attach to the intended binding site of the mRNA, usually in bacteria as it arises, and then in turn produce the encoded polypeptide, starting at the translation start signal and ending with the stop signal already mentioned. The desired product is made when the sequences encoding the ribosome binding site are correct with respect to the AUG start signal and when all other codons are in phase with the start signal. The desired polypeptide can be obtained by lysis of the host cell, separation from other bacterial proteins and purification in a conventional manner.

Der vorliegenden Erfindung lag der Gedanke zugrunde, daß die Anwendung der rekombinanten DNS-Techno-logie (d. h. die Einfügung von Interferongenen in mikrobielle Vektoren und deren Expression unter der Kontrolle mikrobieller genregulatorischer Elemente) der wirkungsvollste Weg zur Gewinnung großer Mengen Leukozyteninterferon wäre, welches trotz der Tatsache, daß es nicht glykosyliert ist wie vielleicht das natürliche, zur klinischen Behandlung vieler viraler und neoplastischer Erkrankungen verwendet werden könnte.The present invention was based on the idea that the use of recombinant DNA technology (ie the insertion of interferon genes in microbial vectors and their expression under the control of microbial gene regulatory elements) would be the most effective way of obtaining large amounts of leukocyte interferon, which despite the The fact that it is not glycosylated like perhaps the natural one could be used for the clinical treatment of many viral and neoplastic diseases.

Ein erstes Leukozy ten-Interferon-Gen wurde erfmdungsgemäß durch die folgenden Maßnahmen erhalten: (1) Aminosäurepartialsequenzen von homogenem Humanleukozyten-Interferon wurden verwendet, um synthetische DNS-Sonden zu konstruieren, deren Codons insgesamt alle möglichen Nucleotidkombi-nationen repräsentierten, durch die die Aminosäurepartialsequenzen kodiert werden können. (2) Es wurden Bänke von Bakterienkolonien hergestellt, die komplementäre DNS (cDNS) aus induzierter mRNS enthielten. Andere induzierte und radioaktiv maririerte mRNS wurde mit Plasmid-cDNS aus dieser Bank hybridisiert Hybridisierende mRNS wurde eluiert und auf Translation in Interferon im Oozyten-Test getestet. Plasmid-DNS aus Kolonien, die in diesem Test Interferonaktivität besaßen, wurden ferner auf Hybridisierung mit Sonden die nach (1) erhalten wurden, getestet (3) Parallel zu dem Vorgehen unter (2) wurde mittels induzierter mRNS erhaltene cDNS in Plasmiden dazu verwendet, eine unabhängige Bank transformierter Kolonien zu bilden. Die gemäß (1) erhaltenen Sonden wurden als Starter für die Synthese radiomarkierter einsträngiger cDNS verwendet, die wiederum als Hybridisierungssonden benutzt wurden. Die synthetischen Sonden hybridisierten mit induzierter mRNS als Matrize und wurden ferner mittels reverser Transkription dazu verwendet, induzierte, radiomarkierte cDNS zu bilden. In dieser Weise erhaltene Klone der Koloniebank, die mit radiomarkierter cDNS hybridisierten, wurden weiterhin untersucht auf das Vorliegen eines Interferon vollständig kodierenden Gens. Jedes gemäß (1) oder (2) erhaltene, möglicherweise eine Teilsequenz des Interferons kodierende Genfiagment kann als Sonde für ein ungekürztes Gen verwendet werden. (4) Das so erhaltene ungekürzte Gen wurde maßgeschneidert unter Verwendung synthetischer DNS, um jegliche Leader-Sequenz, die die mikrobielle Expression des reifen Polypeptids verhindern könnte, auszuschließen und um es in einem Vektor in die richtige Position bringen zu können bezüglich der Startsignale und der Ribosomenbindungsstelle eines mikrobiellen Promoters. Das exprimierte Interferon wurde soweit gereinigt, daß es charakterisiert und seine Aktivität bestimmt werden konnte. (5) Das auf diese Weise erhaltene Interferon-Genfragment konnte seinerseits als Sonde für die Isolierung (mittels Hybridisierung) von weiteren Genen für andere, teilweise homologe Leukozyten-Interferone verwendet werden.A first leukocyte interferon gene was obtained according to the invention by the following measures: (1) amino acid partial sequences of homogeneous human leukocyte interferon were used to construct synthetic DNA probes, the codons of which represented all possible nucleotide combinations by which the amino acid partial sequences can be encoded. (2) Banks of bacterial colonies were prepared that contained complementary DNA (cDNA) from induced mRNA. Other induced and radioactively marinated mRNA was hybridized with plasmid cDNA from this library. Hybridizing mRNA was eluted and tested for translation into interferon in the oocyte test. Plasmid DNA from colonies which had interferon activity in this test were also tested for hybridization with probes obtained according to (1). (3) In parallel to the procedure under (2), cDNA obtained by means of induced mRNA was used in plasmids to to form an independent bank of transformed colonies. The probes obtained in (1) were used as starters for the synthesis of radiolabeled single-stranded cDNA, which in turn were used as hybridization probes. The synthetic probes hybridized with induced mRNA as a template and were also used by reverse transcription to form induced, radiolabeled cDNA. Clones of the colony bank obtained in this way, which hybridized with radiolabeled cDNA, were further examined for the presence of a gene fully coding for interferon. Any gene segment obtained according to (1) or (2), possibly encoding a partial sequence of the interferon, can be used as a probe for an unabridged gene. (4) The unabridged gene thus obtained was tailored using synthetic DNA to exclude any leader sequence that could prevent microbial expression of the mature polypeptide and to be able to position it in a vector in relation to the start signals and the Ribosome binding site of a microbial promoter. The expressed interferon was purified to the extent that it could be characterized and its activity determined. (5) The interferon gene fragment obtained in this way could in turn be used as a probe for the isolation (by means of hybridization) of further genes for other, partially homologous leukocyte interferons.

Durch die Anwendung der vorstehend kurz beschriebenen Methoden der rekombinanten DNS-Technologie, wurde die mikrobielle Herstellung der Familie homologer Leukozyten-Interferone (in nicht-glykosylierter Form) als reife Polypeptide, d. h. im wesentlichen frei von entsprechenden Präsequenzen oder Teilen davon, erreicht Diese Interferone können direkt exprimiert, isoliert und soweit gereinigt werden, daß sie für die Verwendung zur Behandlung viraler und bösartiger Krankheiten von Tieren und Menschen geeignet sind.By using the recombinant DNA technology methods briefly described above, the microbial production of the family of homologous leukocyte interferons (in non-glycosylated form) as mature polypeptides, i.e. H. essentially free of corresponding pre-sequences or parts thereof. These interferons can be directly expressed, isolated and purified to the extent that they are suitable for use in the treatment of viral and malignant diseases in animals and humans.

Einzelne Glieder der Interferon-Familie, soweit sie exprimiert wurden, waren in in vitro-Tests wirksam und, in einem ersten derartigen Versuch, ebenfalls in einem in vivo-Test, wobei es sich bei letzterem um die Prüfung des ersten mikrobiell hergestellten reifen Leukozyten-Interferons handelte. -3-Individual members of the interferon family, as far as they were expressed, were effective in in vitro tests and, in a first such attempt, also in an in vivo test, the latter being the test of the first microbial mature leukocyte. Interferons acted. -3-

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Der Ausdruck &quot;reifes Leukozyten-Interferon&quot;, der im Zusammenhang mit der vorliegenden Anmeldung verwendet wird, definiert ein mikrobiell (z. B. bakteriell) hergestelltes Interferonmolekül, das keine Glykosyl-gruppen trägt. Reifes Leukozyten-Interferon, gemäß vorliegender Erfindung, wird von einem Translations-Startsignal (ATG) direkt vor dem ersten Aminosäurecodon des natürlichen Produktes exprimiert. Das &quot;reife&quot; Polypeptid kann daher als erste Aminosäure seiner Sequenz Methionin (für das ATG codiert) enthalten, ohne daß damit sein Charakter wesentlich geändert würde. Andererseits kann der mikrobielle Wirt aus dem unmittelbaren Translationsprodukt das Methionin abspalten. Reifes Leukozyten-Interferon kann zusammen mit einem konjugierten Protein, das nicht ein üblicher Leader ist, exprimiert werden, wobei das Konjugat spezifisch intra-oder extrazellulär gespalten werden kann (vergleiche britische Patentanmeldung Publikations-Nr. 2007676A). Schließlich kann das reife Interferon zusammen mit einem mikrobiellen &quot;Signal-Peptid&quot; hergestellt werden, das das Konjugat an die Zellwand transportiert, wo die Signalsequenz abgespalten und das reife Polypeptid sezemiert wird. Expression von reifem Leukozyten-Interferon bedeutet bakterielle oder andere mikrobielle Herstellung eines Interferonmoleküls, das weder Glykosylgruppen noch eine Präsequenz enthält.The term "mature leukocyte interferon" used in the context of the present application defines a microbially (e.g. bacterially) produced interferon molecule which does not carry any glycosyl groups. Mature leukocyte interferon, according to the present invention, is expressed by a translation start signal (ATG) immediately before the first amino acid codon of the natural product. The &quot; mature &quot; Polypeptide can therefore contain methionine (encoded for the ATG) as the first amino acid of its sequence, without this significantly changing its character. On the other hand, the microbial host can split off the methionine from the immediate translation product. Mature leukocyte interferon can be expressed together with a conjugated protein, which is not a common leader, whereby the conjugate can be cleaved specifically intracellularly or extracellularly (see British patent application publication number 2007676A). Finally, the mature interferon can be combined with a microbial &quot; signal peptide &quot; which transports the conjugate to the cell wall, where the signal sequence is cleaved and the mature polypeptide is secreted. Expression of mature leukocyte interferon means bacterial or other microbial production of an interferon molecule that contains neither glycosyl groups nor a presequence.

Die Aminosäuresequenzen der einzelnen Leukozyten-Interferone (Figuren 4 und 9) wurden auf Grund der DNS-Sequenzen der entsprechenden Gene (Figuren 3 und 8) ermittelt Für alle diese einzelnen Leukozyten-Interferone existieren natürliche, von Individuum zu Individuum unterschiedliche allelische Varianten. Diese Varianten können gekennzeichnet sein durch Austausch (Substitution, Inversion), Deletion oder Insertion einzelner oder mehrerer Aminosäuren in der Sequenz. Derartige allelische Variationen der erfindungsgemäßen Leukozyten-Interferone A bis J sind von den jeweiligen Formeln (LelF A bis LelF J) mitumfaßt und ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.The amino acid sequences of the individual leukocyte interferons (FIGS. 4 and 9) were determined on the basis of the DNA sequences of the corresponding genes (FIGS. 3 and 8). Allelic variants which differ from individual to individual exist for all these individual leukocyte interferons. These variants can be characterized by exchange (substitution, inversion), deletion or insertion of one or more amino acids in the sequence. Such allelic variations of the leukocyte interferons A to J according to the invention are included in the respective formulas (LelF A to LelF J) and are also the subject of the present invention.

Beschreibung der FigurenDescription of the figures

Figur 1 beschreibt zwei Aminosäurepartialsequenzen, die allen Interferonspezies, die aus menschlichen Leukozyten isoliert und bis zur Homogenität gereinigt wurden, gemeinsam sind. Sie sind T-l und T-13 bezeichnet. Es sind alle möglichen mRNS-Sequenzen, die diese Peptide kodieren, dargestellt, ebenso wie die entsprechenden cDNS-Sequenzen. Die Buchstaben A, T, G, C und U bezeichnen die Nucleotide mit den Basen Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin und Uracil. Der Buchstabe N bedeutet A, G, C oder U. Die Polynucleotide sind vom 5'-Ende (links) zum 3'-Ende (rechts) angegeben und wo sie doppelsträngig dargestellt sind, ist die untere DNS (nicht-kodierender Strang) von 3’- in 5’-Richtung wiedergegeben.FIG. 1 describes two amino acid partial sequences which are common to all interferon species which have been isolated from human leukocytes and purified to homogeneity. They are labeled T-1 and T-13. All possible mRNA sequences encoding these peptides are shown, as are the corresponding cDNA sequences. The letters A, T, G, C and U denote the nucleotides with the bases adenine, thymine, guanine, cytosine and uracil. The letter N means A, G, C or U. The polynucleotides are indicated from the 5'-end (left) to the 3'-end (right) and where they are shown double-stranded, the lower DNA (non-coding strand) is from 3'- reproduced in the 5 'direction.

Figur 2 stellt ein Autoradiogramm dar, das die Hybridisierung von möglichen LeDF-Plasmiden mit •^P-markierten synthetischen Deoxyoligonukleotiden zeigt.FIG. 2 shows an autoradiogram which shows the hybridization of possible LeDF plasmids with • ^ P-labeled synthetic deoxyoligonucleotides.

Figur 3 gibt die Nukleotidsequenzen (kodierende Stränge) von acht isolierten Genfragmenten (bezeichnet A-H) wieder, die für die Expression von Leukozyten-Interferonen verwendet werden können. Der ATG Translations-Start-Codon und die Stoptripletts für jedes LelF sind unterstrichen. Auf die Stoptripletts folgen unübersetzte Sequenzen. Dem vollständigen Gen für LelF A fehlt ein Codon in der Position 200 bis 202, der bei den anderen LelFs vorhanden ist. Vor der Leader-Sequenz liegen ebenfalls unübersetzte Sequenzen. Dem isolierten Fragment E fehlt die volle Leader-Präsequenz, aber es enthält das vollständige Gen für ein etwaiges reifes LelF E. Dem isolierten Fragment G hingegen fehlt ein Teil der kodierenden Sequenz.FIG. 3 shows the nucleotide sequences (coding strands) of eight isolated gene fragments (designated A-H) which can be used for the expression of leukocyte interferons. The ATG Translations start codon and stop triplets for each LelF are underlined. Untranslated sequences follow the stop triplets. The complete gene for LelF A lacks a codon in position 200 to 202 that is present in the other LelFs. Before the leader sequence there are also untranslated sequences. The isolated fragment E lacks the full leader presequence, but it contains the complete gene for any mature LelF E. The isolated fragment G, on the other hand, lacks part of the coding sequence.

Figur 4 gibt einen Überblick über die aus den bestimmten Nukleotidsequenzen abgeleiteten Aminosäuresequenzen von 8 Leukozyten-Interferonen (A bis H). Die für die Bezeichnung der einzelnen Aminosäuren verwendeten großen Buchstaben sind die von der IUPAC-IUB Kommission für biochemische Nomenklatur empfohlenen. Es bedeuten: A Alanin; C Cystein; D Asparaginsäure; E Glutaminsäure; F Phenylalanin; G Glycin; H Histidin; I Isoleucin; K Lysin; L Leucin; M Methionin; N Asparagin; P Prolin; Q Glutamin; R Arginin; S Serin; T Threonin; V Valin; W Tryptophan; und Y Tyrosin. Die Zahlen geben die Position der Aminosäuren an (S bezieht sich auf das Signal-Peptid). Der Bindestrich in der 165 Aminosäuren umfassenden Sequenz von LelF A in Position 44 wurde eingeführt, um die Sequenz des LelF A in Übereinstimmung mit den 166 Aminosäuren der anderen Leukozyten-Interferone zu bringen. Für die Festlegung der Aminosäuresequenz des LelF E wurde das Nukleotid in Position 187 (Figur 3) nicht berücksichtigt. Die Sterne (Sequenz von LelF E) stellen in-Phase-befindliche Stopcodons dar. Aminosäuren, die allen LelFs (mit Ausnahme des Pseudogens LelF E) gemeinsam sind, sind in Zeile &quot;All&quot; dargestellt. Die unterstrichenen Reste sind Aminosäuren, die auch im Human-Fibroblasten-Interferon Vorkommen.FIG. 4 gives an overview of the amino acid sequences of 8 leukocyte interferons (A to H) derived from the determined nucleotide sequences. The capital letters used to denote the individual amino acids are those recommended by the IUPAC-IUB Commission for Biochemical Nomenclature. It means: A alanine; C cysteine; D aspartic acid; E glutamic acid; F phenylalanine; G glycine; H histidine; I isoleucine; K lysine; L leucine; M methionine; N asparagine; P proline; Q glutamine; R arginine; S serine; T threonine; V valine; W tryptophan; and Y tyrosine. The numbers indicate the position of the amino acids (S refers to the signal peptide). The hyphen in the 165 amino acid sequence of LelF A at position 44 was introduced to align the sequence of LelF A with the 166 amino acids of the other leukocyte interferons. The nucleotide in position 187 (FIG. 3) was not taken into account for determining the amino acid sequence of the LelF E. The asterisks (sequence of LelF E) represent in-phase stop codons. Amino acids that are common to all LelFs (with the exception of the pseudogen LelF E) are shown in line &quot; All &quot; shown. The underlined residues are amino acids that also occur in human fibroblast interferon.

Figur 5 gibt die Restriktionsendonuclease-Karten der Monierten cDNSs von 8 verschiedenen Leukozyten-Interferonen wieder (A bis H). Die hybriden Plasmide wurden nach der dC:dG-Tailing-Methode (Goeddel, D. V. et al, Nature 287.411-416 [1980]) hergestellt. Die cDNS-Einsätze können daher mit Pstl herausgeschnitten werden. Die Linien an den Enden jedes cDNS-Einsatzes stellen die anschließenden homopolymeren dC:dG-Schwänze dar. Die Lage der PvuII-, EcoRI- und Bglll-Restriktionsstellen sind angegeben. Schattierte Regionen in der Figur stellen kodierende Sequenzen für reife LelFs dar; die schräg-gestrichelten Regionen bezeichnen kodierende Sequenzen für Signalpeptide, während die weißen Regionen nicht-kodierende Sequenzen darstellen.FIG. 5 shows the restriction endonuclease maps of the cloned cDNAs from 8 different leukocyte interferons (A to H). The hybrid plasmids were produced by the dC: dG tailing method (Goeddel, D.V. et al, Nature 287.411-416 [1980]). The cDNA inserts can therefore be cut out with Pstl. The lines at the ends of each cDNA insert represent the subsequent homopolymeric dC: dG tails. The position of the PvuII, EcoRI and BglII restriction sites are indicated. Shaded regions in the figure represent coding sequences for mature LelFs; the slanted-dashed regions denote coding sequences for signal peptides, while the white regions represent non-coding sequences.

In Figur 6 wird schematisch die Konstruktion eines Gens, das die direkte mikrobielle Synthese von reifem LelF A kodiert, dargestellL Es werden die Restriktionsstellen (Pstl, usw.) sowie die verwendeten Bruchstücke gezeigt. Die Abkürzung &quot;b.p.&quot; bedeutet Basenpaare. -4-FIG. 6 shows schematically the construction of a gene which encodes the direct microbial synthesis of mature LelF A. The restriction sites (Pstl, etc.) and the fragments used are shown. The abbreviation &quot; b.p. &quot; means base pairs. -4-

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Figur 7 (nicht maßstabsgerecht) stellt schematisch die Restriktions-Karte von 2 Genfragmenten dar, die zur Expression von reifem LelF B verwendet wurden. Die bezeichneten Nukleotid-Codons sind die Enden der kodierenden Stränge, die durch Behandlung mit dem Restriktionsenzym Sau3a in den beiden dargestellten Fällen entstehen.Figure 7 (not to scale) schematically represents the restriction map of 2 gene fragments that were used to express mature LelF B. The designated nucleotide codons are the ends of the coding strands which result from treatment with the restriction enzyme Sau3a in the two cases shown.

Die Figuren 8 und 9 geben die DNS- und Aminosäuresequenzen der Leukozyten-Interferone A, C, Η, I und J wieder. In Figur 9 bedeutet der Stern einen Stopcodon in der entsprechenden DNS-Sequenz, während der Bindestrich in der Sequenz von LelF A die benachbarten Aminosäuren, Phenylalanin und Glycin miteinander verbindetFigures 8 and 9 show the DNA and amino acid sequences of the leukocyte interferons A, C, Η, I and J again. In Figure 9, the asterisk means a stop codon in the corresponding DNA sequence, while the hyphen in the sequence of LelF A connects the adjacent amino acids, phenylalanine and glycine with one another

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen A. Die verwendeten MikroorganismenDescription of the Preferred Embodiments A. The Microorganisms Used

Die beiden folgenden Mikroorganismen wurden verwendet: E. coli x 1776, wie beschrieben in US-PS 4.190.495, und E. coli K-12 Stamm 294 (end A, thi&quot;, hsr&quot;, hsmjc+), wie in der britischen Patentanmeldung Publikations-Nr. 2055382 A beschrieben. Beide Organismen wurden bei der American Type Culture Collection deponiert unter den ATCC Nr. 31537 und 31446. Die gesamte Arbeit wurde unter Beachtung der Richtlinien des National Institute of Health durchgeführt.The following two microorganisms were used: E. coli x 1776 as described in U.S. Patent 4,190,495 and E. coli K-12 strain 294 (end A, thi &quot;, hsr &quot;, hsmjc +) as in the UK patent application Publication no. 2055382 A. Both organisms were deposited at the American Type Culture Collection under ATCC Nos. 31537 and 31446. All work was done in accordance with the guidelines of the National Institute of Health.

Außer den beiden oben genannten E. coli-Stämmen können aber auch andere Stämme, beispielsweise E. coli B oder weitere Mikroben-Stämme, verwendet werden, von denen die meisten an einem Depositorium, wie der American Type Culture Collection, hinterlegt worden sind und allgemein zugänglich sind; vergleiche auch die DE-OS 2644432. Weitere Mikroorganismen, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind z.B. Bacilli, wie Bacillus subtilis und andere Enterobacteriaceae, unter denen vor allem Salmonella typhimurium und Serratia marcescens zu nennen wären, die unter Verwendung von replikablen Plasmiden heterologe Gene zur Expression bringen können. Auch in Hefen, beispielsweise in Saccharomyces cerevisiae, können Interferongene zur Expression gebracht werden unter der Kontrolle eines Hefepromotors.In addition to the two E. coli strains mentioned above, other strains, for example E. coli B or other microbe strains, can also be used, most of which have been deposited at a depository, such as the American Type Culture Collection, and in general are accessible; compare also DE-OS 2644432. Other microorganisms that can be used according to the invention are e.g. Bacilli, such as Bacillus subtilis and other Enterobacteriaceae, including Salmonella typhimurium and Serratia marcescens, which can express heterologous genes using replicable plasmids. Interferon genes can also be expressed in yeasts, for example in Saccharomyces cerevisiae, under the control of a yeast promoter.

B. Quelle und Reinigung von LelF mRNSB. Source and purification of LelF mRNA

LelF mRNS kann von Human-Leukozyten (normalerweise von CML-Patienten), die zur Produktion von Interferon mit Sendai-Virus oder NDV, wie beispielsweise in der deutschen Offenlegungsschrift Nr. 2947134 beschrieben, angeregt wurden, erhalten werden. Eine besonders bevorzugte und für die vorliegende Arbeit verwendete Quelle ist eine Zellinie, die KG-1 bezeichnet ist und sich von einem Patienten mit akuter myelogener Leukämie ableitet. Die Zellinie, beschrieben von Koeffler, Η. P. und Golde, D. W., Science 200.1153 (1978), wächst schnell in einem Medium enthaltend RPMI (Rosewell Park Memorial Institute) 1640 mit 10 % FCS (fötales Kälberserum), hitzeinaktiviert, 25 mM HEPES-Puffer (N-2-Hydroxyethyl-piperazin-N’-2-ethan-sulfonsäure) und 50 μg/ml Gentamycin. Die Zellen können in dem vorstehend beschriebenen Medium nach Zusatz von 10 % Dimethylsulfoxid eingefroren werden. Die KG-1 Linie ist bei der American Type Culture Collection unter der ATCC Nr. CRL 8031 deponiert worden.LelF mRNA can be obtained from human leukocytes (usually from CML patients) that have been stimulated to produce interferon with Sendai virus or NDV, as described, for example, in German Offenlegungsschrift No. 2947134. A particularly preferred source used for the present work is a cell line called KG-1, which is derived from a patient with acute myelogenous leukemia. The cell line, described by Koeffler, Η. P. and Golde, DW, Science 200.1153 (1978), grows rapidly in a medium containing RPMI (Rosewell Park Memorial Institute) 1640 with 10% FCS (fetal calf serum), heat inactivated, 25 mM HEPES buffer (N-2-hydroxyethyl piperazin-N'-2-ethanesulfonic acid) and 50 μg / ml gentamycin. The cells can be frozen in the medium described above after adding 10% dimethyl sulfoxide. The KG-1 line has been deposited with the American Type Culture Collection under ATCC No. CRL 8031.

Die KG-l-Zellen wurden nach der von Rubinstein et al. in (Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 7£, 640-644 [1979]) beschriebenen Weise mit Sendai-Virus oder NDV zur Produktion von Leukozyten-Interferon-mRNS angeregt. Die Zellen wurden 5 Stunden nach der Induktion geerntet und die mRNS wurde nach der Guanidinthiocyanat-Guanidinhydrochlorid-Methode (Chirgwin et al., Biochemistry iS, 5294-5299 [1979]) hergestellt. RNS aus nicht-induzierten Zellen wurde in der gleichen Weise isoliert. Oligo-deoxythymidin (dT)-Cellulose-Chromatographie und Saccharose-Gradient-Ultrazentrifugation wurden benutzt, um die 12S Fraktion von Poly(A)-mRNS, wie von Green et al. (Arch. Biochem. Biophys. 172. 74-89 [1976]) und Okuyuma et al. (Arch. Biochem. Biophys. 188.98-104 [1989]) beschrieben, zu erhalten. Diese mRNS hatte einen Interferontiter von 8000-10,000 Einheiten pro Microgramm im Xenopus laevis Oozytentest (Cavalieri et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 74, 3287-3291 [1977]). C. Herstellung von Koloniebänken. dieLelF-cDNS-Sequenzen enthalten. 5 pg mRNS wurde zur Herstellung doppelsträngiger cDNS nach Standardmethoden (Wickens et al., J. Biol. Chem. 253.2483-2495 [1978] und Goeddel et al., Nature 281.544-548 [1979]) verwendet. Die cDNS wurde der Größe nach Auktioniert durch Elektrophorese an einem 6 % Polyacrylamidgel und 230 ng des Materials mit 500-1500 Basenpaaren wurden durch Elektroelution isoliert. 100 ng dieser cDNS wurden mit Deoxycytidin (dC)-Resten nach der von Chang et al. (Nature 275.617-624 [1978]) beschriebenen Methode verlängert, verbunden mit 470 ng des Plasmids pBR322, welches mit Deoxyguanosin (dG)-Resten an der Pstl-Spaltstelle (Bolivar et al., Gene 2,95-113 [1977]) verlängert worden war und zur Transformation von E. coli x 1776 verwendet Es wurden etwa 130 Tetracyclin-resistente, Ampicillin-empfindliche Transformanten pro ng cDNS erhalten.The KG-1 cells were designed according to the method described by Rubinstein et al. in (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 7 £, 640-644 [1979]) with Sendai virus or NDV to produce leukocyte interferon mRNA. The cells were harvested 5 hours after induction and the mRNA was prepared according to the guanidine thiocyanate-guanidine hydrochloride method (Chirgwin et al., Biochemistry iS, 5294-5299 [1979]). RNA from non-induced cells was isolated in the same way. Oligo-deoxythymidine (dT) cellulose chromatography and sucrose gradient ultracentrifugation were used to isolate the 12S fraction of poly (A) mRNA as described by Green et al. (Arch. Biochem. Biophys. 172, 74-89 [1976]) and Okuyuma et al. (Arch. Biochem. Biophys. 188.98-104 [1989]). This mRNA had an interferon titer of 8000-10,000 units per microgram in the Xenopus laevis oocyte test (Cavalieri et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 3287-3291 [1977]). C. Manufacture of colony banks. containing theLELF cDNA sequences. 5 pg mRNA was used to produce double-stranded cDNA according to standard methods (Wickens et al., J. Biol. Chem. 253.2483-2495 [1978] and Goeddel et al., Nature 281.544-548 [1979]). The cDNA was size-auctioned by electrophoresis on a 6% polyacrylamide gel and 230 ng of the 500-1500 base pair material was isolated by electroelution. 100 ng of these cDNA were treated with deoxycytidine (dC) residues according to the method described by Chang et al. (Nature 275.617-624 [1978]), combined with 470 ng of the plasmid pBR322, which contains deoxyguanosine (dG) residues at the Pstl site (Bolivar et al., Gene 2.95-113 [1977]) had been extended and used to transform E. coli x 1776. About 130 tetracycline-resistant, ampicillin-sensitive transformants were obtained per ng of cDNA.

In einem zweiten ähnlichen Experiment wurden etwa 1000 Tetracyclin-resistente, Ampicillin-empfindliche E. coli K-12 Stamm 294-Transformanten pro ng cDNS erhalten. In diesem Falle lag die Größe des fraktionierten cDNS-Materials zwischen 600 und 1300 Basenpaaren. Es wurde durch Elektroelution für die Verlängerung mit -5-In a second similar experiment, approximately 1000 tetracycline-resistant, ampicillin-sensitive E. coli K-12 strain 294 transformants were obtained per ng of cDNA. In this case the size of the fractionated cDNA material was between 600 and 1300 base pairs. It was by electroelution for the extension with -5-

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Deoxycytidin (dC) gewonnen. D. Herstellung synthetischer Oligonucleotide und deren VerwendungDeoxycytidine (dC) obtained. D. Preparation of synthetic oligonucleotides and their use

Die Kenntnis der Aminosäuresequenzen verschiedener tryptischer Fragmente von humanen Leukozyten-Interferonen erlaubte die Synthese von Deoxyoligonukleotiden, die bestimmten Regionen der LelF mRNS komplementär waren. Die beiden tryptischen Peptide TI und T13 wurden ausgewählt, weil ihre Aminosäuresequenzen die Synthese von nur 12 bzw. 4 Undecameren erforderte, um alle möglichen Nucleotidsequenzen zu erfassen (Figur 1). 4 Sätze von Deoxynukleotidsonden wurden für jede Sequenz synthetisiert, die entweder 3 (T-1A, B, C, D) oder ein (T-13A, B, C, D) Oligonucleotid enthielten. Die bezeichneten komplementären Deoxyoligonucleotide aus jeweils 11 Basen wurden chemisch synthetisiert nach der Phosphortriestermethode (Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 25, 5765-5769 [1978]). In der T-13 Serie wurden 4 individuelle Sonden hergestellt. Die zwölf T-l Sonden wurden in vier Pools zu 3 Sonden, wie in Figur 1 gezeigt, hergestellt.Knowledge of the amino acid sequences of various tryptic fragments of human leukocyte interferons allowed the synthesis of deoxyoligonucleotides that were complementary to certain regions of the LelF mRNA. The two tryptic peptides TI and T13 were chosen because their amino acid sequences required the synthesis of only 12 and 4 undecamers, respectively, in order to capture all possible nucleotide sequences (FIG. 1). 4 sets of deoxynucleotide probes were synthesized for each sequence, containing either 3 (T-1A, B, C, D) or one (T-13A, B, C, D) oligonucleotide. The designated complementary deoxyoligonucleotides of 11 bases each were chemically synthesized according to the phosphortriester method (Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 25, 5765-5769 [1978]). 4 individual probes were manufactured in the T-13 series. The twelve T-1 probes were prepared in four pools of 3 probes as shown in Figure 1.

Die vier individuellen Sonden der T-13 Serie und die zwölf T-l Sonden, hergestellt in je vier Gruppen zu 3 Sonden, wurden verwendet, um die Synthese radiomarkierter einsträngiger cDNS zum Gebrauch als Hybridisierungssonden zu starten. Die Matrizen-mRNS war entweder 12S RNS von mit Sendai-Virus induzierten KG-1 Zellen (8000 Einheiten IF-Aktivität per pg) oder gesamte Poly(A)-mRNS aus nicht induzierten Ύ1The four individual T-13 series probes and the twelve T-1 probes, made in four groups of 3 probes each, were used to start the synthesis of radiolabeled single-stranded cDNA for use as hybridization probes. The template mRNA was either 12S RNA from Sendai virus-induced KG-1 cells (8000 units of IF activity per pg) or total poly (A) mRNA from non-induced Ύ1

Leukozyten (10 Einheiten pro pg). P-markierte cDNS wurde aus diesen Startern hergestellt unter Verwendung bekannter Reaktionsbedingungen (Noyes et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 76, 1770-1774 [1979]). Die 60 pl-Reaktionen wurden durchgeführt in 20 mM Tris-HCl (pH 8,3), 20 mM KCl, 8 mM MgCl2 und 30 mM ß-Mercaptoethanol, jeweils mit 1 pg jedes Starters (d. h. 12 pg insgesamt für die T-l Serie, 4 pg insgesamt für die T-13 Serie), 2 pg induzierter 12S mRNS (oder 10 pg nicht induzierter Poly (A)-mRNS), 0,5 mM dATP, dCTP, dTTP, 200 pCi (a^P)dCTP (Amersham, 2-3000 Ci/mmole) und 60 Einheiten reverser Transkriptase (Bethesda Research Laboratories). Das Produkt wurde von nicht-markiertem Material durch Gelfiltrationen an einer 10 ml-Sephadex® G-50 Säule getrennt, 30 Minuten bei 70 °C mit 0,3N NaOH, zur Zerstörung der RNS, behandelt und mit HCl neutralisiert. Die Hybridisierungen wurden wie von Kafatos et al. (Nucleic Acids Res. 7, 1541-1552 [1979]) beschrieben, durchgeführt. E. Identifizierung der Klone pLl -pL30Leukocytes (10 units per pg). P-labeled cDNA was made from these initiators using known reaction conditions (Noyes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 1770-1774 [1979]). The 60 pl reactions were carried out in 20 mM Tris-HCl (pH 8.3), 20 mM KCl, 8 mM MgCl2 and 30 mM β-mercaptoethanol, each with 1 pg of each starter (ie 12 pg in total for the Tl series, 4 pg total for the T-13 series), 2 pg induced 12S mRNA (or 10 pg non-induced poly (A) mRNA), 0.5 mM dATP, dCTP, dTTP, 200 pCi (a ^ P) dCTP (Amersham , 2-3000 Ci / mmole) and 60 units of reverse transcriptase (Bethesda Research Laboratories). The product was separated from unlabelled material by gel filtration on a 10 ml Sephadex® G-50 column, treated with 0.3N NaOH for 30 minutes at 70 ° C. to destroy the RNA and neutralized with HCl. The hybridizations were carried out as described by Kafatos et al. (Nucleic Acids Res. 7, 1541-1552 [1979]). E. Identification of clones pLl-pL30

Die Methode von Birnboim et al., Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523 (1979), zur schnellen Isolierung von Plasmiden wurde verwendet, um 1 pg Plasmid-DNS aus jeder der 500 individuellen E. coli K-12 Stamm 294-Transformanten (vergleiche C) zu gewinnen. Jede DNS-Probe wurde denaturiert und auf Nitrocellulosefilter in dreifacher Ausführung, nach der Methode von Kafatos et al. (siehe oben), aufgebracht.The method of Birnboim et al., Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523 (1979), for the rapid isolation of plasmids was used to convert 1 pg of plasmid DNA from each of the 500 individual E. coli K-12 strain 294 transformants (compare C) to win. Each DNA sample was denatured and triplicated on nitrocellulose filters using the method of Kafatos et al. (see above).

Die drei Sätze der Nitrocellulosefilter, die 500 Plasmidproben enthielten, wurden hybridisiert mit a) induzierter cDNS, gestärkt mit einem T-l Startersatz, b) T-13 gestarteter induzierter cDNS und c) nicht induzierter cDNS, hergestellt unter Verwendung beider Startersätze. Klone wurden als positiv angesehen, wenn sie stärker hybridisierten mit einer oder beiden der induzierten cDNS-Sonden als mit der gesamten nicht induzierten Sonde. 30 positive Klone (pLl-pL30) wurden aus den 500 zur weiteren Analyse ausgesucht F. Identifikation der Klone pL-31-nL39.The three sets of nitrocellulose filters containing 500 plasmid samples were hybridized with a) induced cDNA strengthened with a T-1 starter set, b) T-13 started induced cDNA and c) uninduced cDNA prepared using both starter sets. Clones were considered positive if they hybridized more strongly to one or both of the induced cDNA probes than to the entire uninduced probe. 30 positive clones (pLl-pL30) were selected from the 500 for further analysis. F. Identification of clones pL-31-nL39.

Isolierung eines Plasmids fNr. 1041. das ein LelF-Genfragment enthielt.Isolation of a plasmid fNr. 1041. which contained an LelF gene fragment.

Transformanten von E. coli x 1776 wurden nach der Koloniehybridisierungsmethode von Grunstein und Hogness (Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 22, 3961-3965 [1975]) getestet, unter Verwendung von ^P-markierter induzierter mRNS als Sonde (Lillenhaug et al., Biochemistry, 15, 1858-1865 [1976]). Nichtmarkierte mRNS von nicht-induzierten Zellen wurde mit der Sonde in einem Verhältnis von 200:1 gemischt, um zu konkurrieren Ύ) mit in dem J P-markierten Präparat vorhandener nicht-induzierter mRNS. Die Hybridisierung markierter mRNS sollte vorwiegend bei Kolonien erfolgen, die induzierte Sequenzen enthalten. Drei Klassen von Transformanten wurden erhalten: (1) 2-3 % der Kolonien hybridisierten sehr stark mit ^P-mRNS, (2) 10 % hybridisierten signifikant schwächer als die erste Klasse und (3) der Rest lieferte kein erkennbares Hybridisierungssignal.E. coli x 1776 transformants were tested by the colony hybridization method of Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 22, 3961-3965 [1975]) using ^ P-labeled induced mRNA as a probe (Lillenhaug et al., Biochemistry, 15, 1858-1865 [1976]). Unlabelled mRNA from non-induced cells was mixed with the probe in a ratio of 200: 1 to compete Ύ) with uninduced mRNA present in the J P-labeled preparation. The hybridization of labeled mRNA should mainly take place in colonies that contain induced sequences. Three classes of transformants were obtained: (1) 2-3% of the colonies hybridized very strongly with ^ P-mRNA, (2) 10% hybridized significantly weaker than the first class and (3) the rest gave no discernible hybridization signal.

Die positiven Kolonien (Klassen (1) und (2)) wurden auf die Anwesenheit Interferon-spezifischer Sequenzen mittels eines Assays geprüft, der auf der spezifischen Hybridisierung von Interferon-mRNS an Plasmid-DNS beruht. Zunächst wurden 60 der stark positiven Kolonien (Klasse (1)) individuell in 100 ml M9-Medium, das -6-The positive colonies (classes (1) and (2)) were checked for the presence of interferon-specific sequences by means of an assay which is based on the specific hybridization of interferon-mRNA to plasmid DNA. First, 60 of the highly positive colonies (class (1)) were individually in 100 ml M9 medium, the -6-

AT 394 208 B ergänzt war mit Tetracyclin (20 pg/ml), Diaminopimelinsäure (100 pg/ml), Thymidin (20 pg/ml) und d-Biotin (1 μg/ml), gezüchtet. Das M9-Medium enthält pro Liter: Na2HPC&gt;4 (6 g), KH2P04 (3 g), NaCl (0,5 g) und NH4CI (1 g). Nach Autoklavieren wurde 1 ml steriles IM MgS04 und 10 ml steriles 0,01M CaCl2 zugesetzt. Jeweils 10 der 60 Kulturen wurden zusammengefaßt und die Plasmid-DNS wurde, wie von Clewell et al., Biochemistry £,4428-440 [1970], beschrieben, isoliert. 10 pg jedes Plasmid-DNS-Pools wurden mit Hindlll gespalten, denaturiert und kovalent an DBM-Papier (Diazobenzyloxymethylpapier) gebunden. 1 pg gereinigter mRNS aus induzierten Zellen wurde an jedes Filter hybridisiert Nicht-hybridisierte mRNS wurde durch Waschen entfernt. Die spezifisch hybridisierte mRNS wurde eluiert und in Xenopus laevis Oozyten überführt In diesem Assay waren alle sechs Pools negativ. Aus 59 schwach positiven Kolonien (Klasse (2)) wurden fünf Pools zu je 10 Kolonien und 1 Pool zu 9 Kolonien gebildet und nach der oben beschriebenen Methode geprüft. Unter den sechs Pools hybridisierte einer (K10) jedesmal, wenn er geprüft wurde, signifikant stärker als die übrigen. Um den spezifischen Interferon-cDNS -Klon zu identifizieren, wurde aus jeder der im Pool K10 zusammengefaßten neun Kolonien Plasmid-DNS hergestellt und individuell geprüft Zwei der neun Plasmide (Nr. 101 und 104) banden Interferon-mRNS stärker als die anderen. Aus dem Plasmid Nr. 104 wurde ein besonderes Bgl II- γ)AT 394 208 B was supplemented with tetracycline (20 pg / ml), diaminopimelic acid (100 pg / ml), thymidine (20 pg / ml) and d-biotin (1 μg / ml). The M9 medium contains per liter: Na2HPC> 4 (6 g), KH2P04 (3 g), NaCl (0.5 g) and NH4CI (1 g). After autoclaving, 1 ml of sterile IM MgS04 and 10 ml of sterile 0.01M CaCl2 were added. In each case 10 of the 60 cultures were combined and the plasmid DNA was isolated as described by Clewell et al., Biochemistry £, 4428-440 [1970]. 10 pg of each plasmid DNA pool were cleaved with HindIII, denatured and covalently bound to DBM paper (diazobenzyloxymethyl paper). 1 pg of purified mRNA from induced cells was hybridized to each filter. Non-hybridized mRNA was removed by washing. The specifically hybridized mRNA was eluted and transferred to Xenopus laevis oocytes. In this assay, all six pools were negative. Five pools of 10 colonies each and 1 pool of 9 colonies were formed from 59 weakly positive colonies (class (2)) and tested according to the method described above. Of the six pools, one (K10) hybridized significantly more than the rest each time it was tested. To identify the specific interferon cDNA clone, plasmid DNA was prepared from each of the nine colonies pooled in pool K10 and tested individually. Two of the nine plasmids (Nos. 101 and 104) bound interferon mRNA more than the others. A special Bgl II- γ) was made from plasmid No. 104

Restriktionsfragment, das 260 Basenpaare enthielt, isoliert, P-markiert nach der von Taylor et al., Biochim. Biophys. Acta 442. 324-330 (1976), beschriebenen Methode und als Sonde verwendet, um 400 E. coli 294-Transformanten nach einem in situ-Kolonie-Screeningverfahren (Grunstein und Hogness, Proc. Naü. Sei. U.S.A. 22, 3961-3965 [1975]) zu testen. Neun Kolonien (pL31-pL39) wurden identifiziert, die in verschieden starkem Maße mit dieser Sonde hybridisierten.Restriction fragment containing 260 base pairs isolated, P-labeled according to that of Taylor et al., Biochim. Biophys. Acta 442, 324-330 (1976), and used as a probe to transform 400 E. coli 294 transformants by an in situ colony screening method (Grunstein and Hogness, Proc. Naü. Sci. USA 22, 3961-3965 [1975]) to test. Nine colonies (pL31-pL39) were identified that hybridized to varying degrees with this probe.

Zusätzlich wurde das markierte 260-Basenpaar-Fragment verwendet, um 4000 E. coli 294-Transformanten in derselben Weise zu testen. 50 Kolonien konnten identifiziert werden, die in unterschiedlichem Maße mit dieser Sonde hybridisierten. Eine enthielt das LelF G-Fragment, eine enthielt das LelF H-Fragment und eine enthielt ein Fragment, das als LelF Hl bezeichnet wurde (offensichtlich ein Allel von LelF H). Die hybriden Plasmide, die erhalten wurden, wurden &quot;LelF G&quot;, &quot;pLelF H&quot;, usw., bezeichnet G. Isolierung und Sequenzierung eines ersten vollständigen LelF Gens.In addition, the labeled 260 base pair fragment was used to test 4000 E. coli 294 transformants in the same way. 50 colonies were identified that hybridized to different degrees with this probe. One contained the LelF G fragment, one contained the LelF H fragment and one contained a fragment called LelF Hl (apparently an allele of LelF H). The hybrid plasmids obtained were called &quot; LelF G &quot;, &quot; pLelF H &quot;, etc., G. Isolation and sequencing of a first complete LelF gene.

Plasmid DNS wurde aus allen 39 potentiellen LelF-cDNS-Klonen hergestellt und nochmals mit der gleichen 260 Basenpaare-enthaltenden DNS-Sonde getestet unter Verwendung des Hybridisierungsprozederes von Kafatos et al. (siehe oben). Drei Plasmide (pL4, pL31, pL34) gaben sehr starke Hybridisierungssignale, vier (pL13, pL30, pL32, pL36) hybridisierten mittelmäßig, während drei (pL6, pL8, pL14) nur schwach mit der Sonde hybridisierten.Plasmid DNA was prepared from all 39 potential LelF cDNA clones and tested again with the same 260 base pair DNA probe using the hybridization procedure of Kafatos et al. (see above). Three plasmids (pL4, pL31, pL34) gave very strong hybridization signals, four (pL13, pL30, pL32, pL36) hybridized moderately, while three (pL6, pL8, pL14) hybridized only weakly with the probe.

Die 39 potentiellen LelF cDNS Rekombinant-Plasmide wurden ebenfalls unter Verwendung der ^P-markierten synthetischen Undecameren (individuelle T-l Starterpools oder individuelle T-13 Starter) als Hybridisierungssonden getestet. Die Hybridisierungsbedingungen wurden so ausgewählt daß eine perfekte Basen-Paarung notwendig war, um feststellbare Hybridisierungssignale zu erhalten (Wallace et al., Nucleic Acids Res. £, 3543-3557 [1979]). Auf diese Weise wurde Plasmid-DNS aus den 39 Klonen nach einer Standardmethode (Clewell et al., siehe oben) hergestellt und mittels Biorad Agarose A-50 Säulenchromatographie gereinigt. Proben von je 3 pg jedes Präparats wurden durch Behandlung mit EcoRI linearisiert, mit Alkali denaturiert und auf 2 Nitrocellulosefilter getüpfelt (1,5 pg/Fleck) wie von Kafatos et al., (siehe oben) beschrieben. Die individuellen synthetischen Deoxyoligonucleotid-Starter und Starterpools wurden mit (γ^Ρ)ΑΤΡ folgendermaßen phosphoryliert: 50 pmol Oligonucleotid und 100 pMol γ^Ρ ATP (New England Nuclear, 2500 Ci/mMol) wurden mit 30 μΐ 50 mMol Tris-HCl, 10 mMol MgCl2 und 15 mMol ß-Mercaptoethanol versetzt. Es wurden 2 Einheiten T4 Polynucleotid-Kinase zugesetzt und nach 30 Minuten bei 37 °C wurden die ^P-markierten Starter durch Chromatographie an 10 ml Sephadex G-50-Säulen gereinigt. Die Hybridisierungen wurden unterThe 39 potential LelF cDNA recombinant plasmids were also tested using the ^ P-labeled synthetic undecamers (individual T-1 starter pools or individual T-13 starters) as hybridization probes. The hybridization conditions were selected so that perfect base pairing was necessary to obtain detectable hybridization signals (Wallace et al., Nucleic Acids Res. £, 3543-3557 [1979]). In this way, plasmid DNA was prepared from the 39 clones by a standard method (Clewell et al., See above) and purified by means of Biorad Agarose A-50 column chromatography. Samples of 3 pg of each preparation were linearized by treatment with EcoRI, denatured with alkali and spotted on 2 nitrocellulose filters (1.5 pg / stain) as described by Kafatos et al. (See above). The individual synthetic deoxyoligonucleotide starters and starter pools were phosphorylated with (γ ^ Ρ) ΑΤΡ as follows: 50 pmol oligonucleotide and 100 pmol γ ^ Ρ ATP (New England Nuclear, 2500 Ci / mmol) were washed with 30 μΐ 50 mmol Tris-HCl, 10 mmol of MgCl2 and 15 mmol of β-mercaptoethanol were added. 2 units of T4 polynucleotide kinase were added and after 30 minutes at 37 ° C. the ^ P-labeled starters were purified by chromatography on 10 ml Sephadex G-50 columns. The hybridizations were under

Verwendung von 10® cpm Starter T-13C oder 3 x 10® cpm Starterpool T-1C durchgeführt und zwar bei 15 °C während 14 Stunden in 6 x SSC [1 x SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,2], 10 x Denhardt's Lösung [0,2 % Rinderserumalbumin, 0,2 % Polyvinylpyrolidon, 0,2 % Ficoll], wie von Wallace et al. (siehe oben) beschrieben. Die Filter wurden während 5 Minuten bei 0 °C in 6 x SSC gewaschen, getrocknet und Röntgenfilm ausgesetzt. Die Ergebnisse sind in Figur 2 für -^P-Starterpool T-13C und Starter T-1C dargestellt.Use of 10® cpm starter T-13C or 3 x 10® cpm starter pool T-1C carried out at 15 ° C for 14 hours in 6 x SSC [1 x SSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M sodium citrate, pH 7 , 2], 10 x Denhardt's solution [0.2% bovine serum albumin, 0.2% polyvinyl pyrolidone, 0.2% Ficoll] as described by Wallace et al. (see above). The filters were washed in 6 x SSC for 5 minutes at 0 ° C., dried and exposed to X-ray film. The results are shown in Figure 2 for - ^ P starter pool T-13C and starter T-1C.

Die Plasmid-DNS aus Klon 104 lieferte bemerkenswerte Hybridisation mit Starterpool T-1C und Starter T-13C, während Hybridisation mit den anderen Undecameren nicht festgestellt werden konnte. Wie in Figur 2 dargestellt, hybridisierten verschiedene der 39 potentiellen LelF-Plasmide (pL2,4,13,17,20,30, 31, 34) mit diesen beiden Sonden. Die Restriktionsanalyse zeigte jedoch, daß nur 1 der Plasmide, pL31, auch ein 260 Basenpaare-enthaltendes Bglll-Fragment enthielt. Pstl-Behandlung von pL31 zeigte, daß die Größe des cDNS-Abschnittes etwa 1000 Basenpaare war.The plasmid DNA from clone 104 provided remarkable hybridization with starter pool T-1C and starter T-13C, while hybridization with the other undecamers was not found. As shown in Figure 2, several of the 39 potential LelF plasmids (pL2,4,13,17,20,30, 31, 34) hybridized with these two probes. Restriction analysis showed, however, that only 1 of the plasmids, pL31, also contained a BglII fragment containing 260 base pairs. PstI treatment of pL31 showed that the size of the cDNA segment was about 1000 base pairs.

Der gesamte Pstl Abschnitt von pL31 wurde sowohl nach der chemischen Methode von Maxam-Gilbert (Methods Enzymol. 65,499-560 [1980]) wie nach der Dideoxy-Kettenbruchmethode (Smith, Methods Enzymol. 65. 560-580 [1980]) durchgeführt, nachdem die Sau3a-Fragmente in einen M13-Vektor unterkloniert worden -7-The entire Pstl section of pL31 was carried out both according to the chemical method of Maxam-Gilbert (Methods Enzymol. 65,499-560 [1980]) and according to the dideoxy chain breaking method (Smith, Methods Enzymol. 65,560-580 [1980]), after the Sau3a fragments have been subcloned into an M13 vector -7-

AT 394 208 B waren. Die DNS-Sequenz ist in Figur 3 (&quot;A&quot;) gezeigt. Aus dieser Sequenz wurde die gesamte Aminosäuresequenz des LelF A vorhergesagt, einschließlich des Prä- oder Signalpeptids. Der erste ATG Translations-Startcodon befindet sich 60 Nukleotide vom 5'-Ende der Sequenz entfernt und wird nach 188 Codons von einem TGA Stoptriplett gefolgt. Es gibt 342 nicht übersetzte Nucleotide am 3'-Ende, die schließlich von einer Poly (A)-Sequenz gefolgt werden. Das mutmaßliche Signalpeptid (wahrscheinlich beteiligt an der Sekretion von reifem LelF aus Leukozyten) ist 23 Aminosäuren lang. Das aus 165 Aminosäuren bestehende reife LelF A hat ein berechnetes Molekulargewicht von 19,390. Der Figur 4 kann entnommen werden, daß die tryptischen Peptide T-l und T-13 den Aminosäuren 145-149 und 57-61 des LelF A entsprechen. Die tatsächlichen DNS-Sequenzen, die in diesen beiden Regionen gefunden wurden, werden durch den Starterpool Tl-C und den Starter T13-C (Figur 8) dargestellt. H. Direkte Expression von reifem Leukozvten-Interferon A (LelF Al I. AllgemeinesAT 394 208 B. The DNA sequence is shown in Figure 3 (&quot; A &quot;). From this sequence, the entire amino acid sequence of the LelF A was predicted, including the pre- or signal peptide. The first ATG Translations start codon is located 60 nucleotides from the 5 'end of the sequence and is followed by a TGA stop triplet after 188 codons. There are 342 untranslated nucleotides at the 3 'end, which are eventually followed by a poly (A) sequence. The putative signal peptide (probably involved in the secretion of mature LelF from leukocytes) is 23 amino acids long. The mature LelF A, which consists of 165 amino acids, has a calculated molecular weight of 19.390. It can be seen from FIG. 4 that the tryptic peptides T-1 and T-13 correspond to amino acids 145-149 and 57-61 of LelF A. The actual DNA sequences found in these two regions are represented by the starter pool Tl-C and the starter T13-C (Figure 8). H. Direct expression of mature leukocyte interferon A (LelF Al I. General

Die Methode, nach der das reife LelF A direkt exprimiert wurde, ist eine Variante der früher bereits für das menschliche Wachstumshormon angewandten (Goeddel et al., Nature 281. 544-548 [1979]), insofern es eine Kombination von synthetischer (N-terminal) und komplementärer DNS darstellte.The method by which the mature LelF A was directly expressed is a variant of that previously used for human growth hormone (Goeddel et al., Nature 281, 544-548 [1979]) in that it is a combination of synthetic (N- terminal) and complementary DNA.

Wie in Figur 6 gezeigt, befindet sich zwischen den Codons 1 und 3 von LelF A eine Sau3a-Restriktions-endonuclease-S teile. Es wurden 2 synthetische Deoxyolinucleotide geschaffen, die einen ATG-Translations-Startcodon enthalten, den Codon für die Aminosäure 1 (Cystein) wiederherstellen und ein EcoRI kohäsives Ende schaffen. Diese Oligomeren wurden an ein Sau3a-AvaII Fragment von pL31, das aus 34 Basenpaaren bestand, gehängt. Das entstandene 45 Basenpaare-enthaltende Produkt wurde an 2 zusätzliche DNS-Fragmente gehängt, so daß ein künstlich-natürliches Hybridgen aus 865 Basenpaaren entstand, das LelF A kodierte und welches durch EcoRI- und Pstl-Restriktionsstellen begrenzt ist. Dieses Gen wurde zwischen die EcoRI- und Pstl-Restriktionsstellen des Plasmids pBR322 eingefügt und lieferte das Plasmid pLelF Al. 2. Konstruktion des Trvptophan-Kontrollelements [enthaltend den E. coli trp Promoter. Operator und die trp-As shown in Figure 6, there is a Sau3a restriction endonuclease fragment between codons 1 and 3 of LelF A. Two synthetic deoxyolinucleotides were created that contain an ATG translation start codon, restore the codon for amino acid 1 (cysteine) and create an EcoRI cohesive end. These oligomers were attached to a Sau3a-AvaII fragment of pL31, which consisted of 34 base pairs. The resulting 45 base pair-containing product was attached to 2 additional DNA fragments, so that an artificial-natural hybrid gene of 865 base pairs was formed, which encoded LelF A and which is limited by EcoRI and PstI restriction sites. This gene was inserted between the EcoRI and PstI restriction sites of the plasmid pBR322 and gave the plasmid pLelF Al. 2. Construction of the Trvptophan control element [containing the E. coli trp promoter. Operator and the trp-

Leader-Ribosomenhindungsstelle ohne die ATG-Sequenz für den TranslationshefrinnVLeader ribosome binding site without the ATG sequence for the translation hefrinnV

Das Plasmid pGMI trägt das E. coli-Tryptophan-Operon mit der Deletion ALE1413 (Miozzari et al.,The plasmid pGMI carries the E. coli tryptophan operon with the deletion ALE1413 (Miozzari et al.,

J. Bacteriology 133.1457-1466 [1978]) und exprimiert daher ein Fusionsprotein mit den ersten 6 Aminosäuren des trp-Leaders und etwa dem letzten Drittel des trp E-Polypeptids (im folgenden LE’ genannt), sowie dem vollständigen trp D-Polypeptid, und zwar unter der Kontrolle des trp-Promotor-Operator-Systems. Das Plasmid (20 pg) wurde mit dem Restriktionsenzym PvuII an 5 Stellen gespalten. Die Genfragmente wurden dann mit EcoRI-Verbindungssequenzen (bestehend aus einer selbstkomplementären Polynukleotidsequenz pCATGAATTCATG) kombiniert, um eine EcoRI-Spaltstelle für das spätere Klonieren in ein Plasmid mit einer solchen EcoRI-Spaltstelle zu schaffen. Die 20 pg der aus pGMI erhaltenen DNS-Fragmente wurden mit 10 Einheiten T4 DNS-Ligase in Gegenwart von 200 pMol des 5'-phosphorylierten synthetischen Oligonucleotids pCATGAATTCATG in 20 pl T4 DNS-Ligase-Puffer (20 mMol Tris, pH 7,6, 0,5 mMol ATP, 10 mMol MgC^, 5 mMol Dithiothreit) bei 4 °C über Nacht behandelt. Die Lösung wurde dann 10 Minuten auf 70 °C erwärmt. Die Verbindungssequenzen wurden mit EcoRI gespalten und die Fragmente, die nun EcoRI-Enden enthielten, wurden mittels 5 % Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) aufgetrennt. Die drei größten Fragmente wurden aus dem Gel isoliert. Dazu wurde zunächst mit Ethidiumbromid angefarbt, die lokalisierten Fragmente wurden unter UV-Licht ausgemacht und die betreffenden Regionen aus dem Gel herausgeschnitten. Jedes Gelfragment wurde mit 300 Microliter 0,1 x TBE in eine Dialysetasche gebracht und während 1 Stunde in 0,1 x TBE-Puffer der Elektrophorese bei 100 Volt ausgesetzt (TBE-Puffer enthält: 10,8 g Tris-Base, 5,5 g Borsäure, 0,09 g Na2EDTA in 1 Liter H2O). Die wäßrige Lösung wurde gesammelt, mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und 0,2M an Natriumchlorid gemacht. Die DNS wurde nach Ethanolfällung in wäßriger Lösung erhalten. Das den trp-Promoter-Operator enthaltende Gen mit EcoRI kohäsiven Enden wurde nach der im folgenden beschriebenen Methode identifiziert, die darin besteht, daß man Fragmente in ein Tetracyclin-empfindliches Plasmid einbaut, die durch Einbau eines Promotor-Operators Tetracyclin-resistent werden.J. Bacteriology 133.1457-1466 [1978]) and therefore expresses a fusion protein with the first 6 amino acids of the trp leader and about the last third of the trp E polypeptide (hereinafter referred to as LE ') and the complete trp D polypeptide, under the control of the trp promoter-operator system. The plasmid (20 pg) was cleaved at 5 sites with the restriction enzyme PvuII. The gene fragments were then combined with EcoRI connection sequences (consisting of a self-complementary polynucleotide sequence pCATGAATTCATG) in order to create an EcoRI cleavage site for later cloning into a plasmid with such an EcoRI cleavage site. The 20 pg of the DNA fragments obtained from pGMI were treated with 10 units of T4 DNA ligase in the presence of 200 pMol of the 5'-phosphorylated synthetic oligonucleotide pCATGAATTCATG in 20 pl of T4 DNA ligase buffer (20 mmol Tris, pH 7.6, 0.5 mmol ATP, 10 mmol MgC ^, 5 mmol Dithiothreit) treated at 4 ° C overnight. The solution was then heated to 70 ° C for 10 minutes. The connecting sequences were digested with EcoRI and the fragments, which now contained EcoRI ends, were separated by means of 5% polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). The three largest fragments were isolated from the gel. For this purpose, staining was first carried out with ethidium bromide, the localized fragments were identified under UV light and the regions concerned were cut out of the gel. Each gel fragment was placed in a dialysis bag with 300 microliters of 0.1 x TBE and subjected to electrophoresis at 100 volts for 1 hour in 0.1 x TBE buffer (TBE buffer contains: 10.8 g of Tris base, 5.5 g boric acid, 0.09 g Na2EDTA in 1 liter H2O). The aqueous solution was collected, extracted with phenol, extracted with chloroform and made 0.2M in sodium chloride. The DNA was obtained in aqueous solution after ethanol precipitation. The gene containing the trp promoter operator with EcoRI cohesive ends was identified by the method described below, which consists in inserting fragments into a tetracycline-sensitive plasmid which become tetracycline-resistant by incorporating a promoter operator.

Das Plasmid pBRHI (Rodriguez et al., Nucleic Acids Res. 6, 3267-3287 [1979]) exprimiert Ampicillinresistenz und enthält das Gen für Tetracyclinresistenz, aber, weil kein zugehöriger Promoter existiert, exprimiert diese Resistenz nicht Das Plasmid ist daher Tetracyclin-empfindlich. Durch Einfügung eines Promoter-Operator-Systems an der EcoRI-Spaltstelle kann das Plasmid Tetracyclin-resistent gemacht werden. pBRHI wurde mit EcoRI behandelt und das Enzym durch Phenolextraktion und Chloroformextraktion enfemt. Das nach Ethanolpräzipitation in Wasser erhaltene DNS-Molekül wurde in getrennten Reaktionsgemischen kombiniert mit jedem der drei DNS-Fragmente, die oben erhalten wurden und mit T4 DNS-Ligase, wie bereits beschrieben, verbunden. Die DNS des Reaktionsgemisches wurde zur Transformation kompetenter E. coli K-12 Stamm 294-Organismen nach Standardmethoden (Hershfield et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 71.3455-3459 [1974]) verwendet Die Bakterien wurden auf LB (Luria-Bertani)-Platten gebracht, die 20 pg/ml -8-The plasmid pBRHI (Rodriguez et al., Nucleic Acids Res. 6, 3267-3287 [1979]) expresses ampicillin resistance and contains the gene for tetracycline resistance, but, because there is no associated promoter, does not express this resistance. The plasmid is therefore sensitive to tetracycline . The plasmid can be made resistant to tetracycline by inserting a promoter-operator system at the EcoRI site. pBRHI was treated with EcoRI and the enzyme removed by phenol extraction and chloroform extraction. The DNA molecule obtained after ethanol precipitation in water was combined in separate reaction mixtures with each of the three DNA fragments obtained above and linked with T4 DNA ligase as already described. The DNA of the reaction mixture was used to transform competent E. coli K-12 strain 294 organisms by standard methods (Hershfield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71.3455-3459 [1974]). The bacteria were analyzed on LB (Luria -Bertani) plates brought the 20 pg / ml -8-

AT 394 208 BAT 394 208 B

Ampicillin und 5 μ^πιΐ Tetracyclin enthielten. Es wurden verschiedene Tretacyclin-resistente Kolonien ausgewählt, die Plasmid-DNS isoliert und das Vorhandensein des gewünschten Fragmentes durch Restriktionsenzymanalysen bestätigt. Das entstandene Plasmid wurde pBRHtrp genanntAmpicillin and 5 μ ^ πιΐ tetracycline contained. Various tretacycline-resistant colonies were selected, the plasmid DNA isolated and the presence of the desired fragment confirmed by restriction enzyme analyzes. The resulting plasmid was called pBRHtrp

Ein EcoRI und BamHI Digestionsprodukt des Genoms des Hepatitis B-Virus wurde nach bekannten Methoden erhalten und in die EcoRI und BamHI Spaltstellen des Plasmids pGH6 eingefügt (Goeddel et al., Nature 281.544 [1979]), wodurch das Plasmid pHS32 entstand. Das Plasmid pHS32 wurde mit Xbal gespalten, mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und der Ethanolpräzipitation unterworfen. Es wurde dann mit 1 μΐ E. coli DNS-Polymerase I, Klenow Fragment (Boehringer-Mannheim), in 30 μΐ Polymerase-Puffer (50 mM Kaliumphosphat, pH 7,4, 7 mM MgC^, 1 mM ß-Mercaptoethanol), enthaltend 0,1 mM dTTP und 0,1 mM dCTP, während 30 Minuten bei 0 °C und 2 Stunden bei 37 °C behandelt. Durch diese Behandlung wurde die Xbal Spaltstelle folgendermaßen verändert 5' CTAGA— 5' CTAGA- 3' T— 3’ TCT-An EcoRI and BamHI digestion product of the genome of the hepatitis B virus was obtained by known methods and inserted into the EcoRI and BamHI cleavage sites of the plasmid pGH6 (Goeddel et al., Nature 281.544 [1979]), whereby the plasmid pHS32 was formed. The plasmid pHS32 was digested with Xbal, extracted with phenol, extracted with chloroform and subjected to ethanol precipitation. It was then mixed with 1 μE of E. coli DNA polymerase I, Klenow fragment (Boehringer-Mannheim), in 30 μE of polymerase buffer (50 mM potassium phosphate, pH 7.4, 7 mM MgC ^, 1 mM β-mercaptoethanol), containing 0.1 mM dTTP and 0.1 mM dCTP, treated for 30 minutes at 0 ° C and 2 hours at 37 ° C. This treatment changed the Xbal cleavage site as follows 5 'CTAGA— 5' CTAGA- 3 'T— 3 ’TCT-

Dieser lineare Rest des Plasmids pHS32 (nach Phenol- und Chloroform-Extraktion und Ethanolpräzipitation in Wasser) wurde mit EcoRI gespalten. Das große Plasmidfragment wurde vom kleinen EcoRI-Xbal-Fragment abgetrennt durch PAGE und nach Elektroelution isoliert. Dieses DNS-Fragment von pHS32 (0,2 μg) wurde unter ähnlichen Bedingungen wie den obenbeschriebenen an das EcoRI-Taql-Fragment des Tryptophanoperons (etwa 0,01 μg) aus pBRHtrp gebunden. Dabei geschieht folgendes: -T ~AG£ CTAGA— + TCT-- -TCTAGA- ~AG£TCT“ mit der ungewöhnlichen Basenpaarung T-C. Ein Teil des Reaktionsgemisches wurde in E. coli 294-Zellen transformiert, hitzebehandelt und auf LB-Platten, die Ampicillin enthielten, gebracht. Es wurden 24 Kolonien ausgewählt, in 3 ml LB-Medium aufgezogen und das Plasmid isoliert. Es wurde festgestellt, daß sechs davon die Xbal-Spaltstellen im E. coli durch katalysierte DNS-Ausbesserung und Replikation regeniert hatten in folgender Weise: —TCTAGA— —TCTAGA— -&gt; —AG£TCT— —AGATCT—This linear residue of the plasmid pHS32 (after phenol and chloroform extraction and ethanol precipitation in water) was cleaved with EcoRI. The large plasmid fragment was separated from the small EcoRI-Xbal fragment by PAGE and isolated after electroelution. This DNA fragment of pHS32 (0.2 µg) was bound to the EcoRI-Taql fragment of tryptophan operon (about 0.01 µg) from pBRHtrp under conditions similar to those described above. The following happens: -T ~ AG £ CTAGA— + TCT-- -TCTAGA- ~ AG £ TCT ”with the unusual base pairing T-C. A portion of the reaction mixture was transformed into E. coli 294 cells, heat treated and placed on LB plates containing ampicillin. 24 colonies were selected, grown in 3 ml LB medium and the plasmid isolated. Six of these were found to have regenerated the Xbal cleavage sites in E. coli by catalyzed DNA repair and replication in the following manner: —TCTAGA— —TCTAGA— - &gt; —AG £ TCT— —AGATCT—

Diese Plasmide konnten auch mit EcoRI und Hpal gespalten werden und lieferten die erwarteten Restriktionsfragmente. Ein Plasmid, pTrpl4 bezeichnet, wurde für die Expression heterologer Peptide, wie im folgenden beschrieben, verwendet.These plasmids could also be cleaved with EcoRI and Hpal and gave the expected restriction fragments. A plasmid, designated pTrpl4, was used for the expression of heterologous peptides as described below.

Das Plasmid pHGH 107 (Goeddel et al., Nature 281. 544, [1979]) enthält ein Gen für das menschliche Wachstumshormon, bestehend aus 23 synthetisch hergestellten Aminosäurecodons und 153 Aminosäurecodons, die von cDNS über reverse Transcription der mRNS erhalten wurde. Dieses Gen, obgleich es den Codon der Präsequenz des menschlichen Wachstumshormons nicht enthält, besitzt ein ATG-Translations-Startcodon. Das Gen wurde aus 10 μg pHGH 107 isoliert nach Behandlung mit EcoRI und E. coli DNA Polymerase I Klenow-Fragment, sowie dTTP und dATP, wie oben beschrieben. Nach Phenol- und Chloroformextraktion sowie Ethanolpräzipitation wurde das Plasmid mit BamHI behandelt.The plasmid pHGH 107 (Goeddel et al., Nature 281, 544, [1979]) contains a gene for human growth hormone, consisting of 23 synthetically produced amino acid codons and 153 amino acid codons, which was obtained from cDNA via reverse transcription of the mRNA. This gene, although it does not contain the pre-sequence human growth hormone codon, has an ATG translation start codon. The gene was isolated from 10 μg pHGH 107 after treatment with EcoRI and E. coli DNA polymerase I Klenow fragment, as well as dTTP and dATP, as described above. After phenol and chloroform extraction and ethanol precipitation, the plasmid was treated with BamHI.

Das das HGH-Gen enthaltende Fragment wurde durch PAGE und Elektroelution isoliert. Das erhaltene DNS-Fragment enthält auch die ersten 350 Nukleotide des Tetracyclinresistenz-verleihenden Strukturgens, aber es fehlt ihm das Tetracyclin Promoter-Operator-System, so daß, wenn es anschließend in ein Expressionsplasmid kloniert wird, diejenigen Plasmide, die diesen Abschnitt enthalten, durch die wiedergewonnene Tetracyclinresistenz identifiziert werden können. Weil das EcoRI-Ende des Fragments aufgefüllt wurde nach dem Klenow-Polymerase I-Verfahren, hat das Fragment ein stumpfes Ende und ein kohäsives Ende, wodurch die richtige Orientierung gesichert ist, wenn es später in ein Expressionsplasmid eingefügt wird.The fragment containing the HGH gene was isolated by PAGE and electroelution. The DNA fragment obtained also contains the first 350 nucleotides of the structural gene conferring tetracycline resistance, but lacks the tetracycline promoter-operator system, so that when it is subsequently cloned into an expression plasmid, those plasmids which contain this section pass through the recovered tetracycline resistance can be identified. Because the EcoRI end of the fragment was filled in according to the Klenow polymerase I method, the fragment has a blunt end and a cohesive end, which ensures correct orientation when it is later inserted into an expression plasmid.

Als nächstes wurde das Plasmid pTrpl4 für den Empfang des das HGH-Gen enthaltende Fragment, das oben hergestellt wurde, vorbereitet. pTrpl4 wurde mit Xbal behandelt und die entstehenden kohäsiven Enden wurden -9-Next, the plasmid pTrpl4 was prepared to receive the HGH gene-containing fragment prepared above. pTrpl4 was treated with Xbal and the resulting cohesive ends became -9-

AT 394 208 B nach dem Klenow-Polymerase I-Verfahren unter Verwendung von dATP, dTTP, dGTP und dCTP aufgefüllt. Nach Phenol- und Chloroform-Extraktion sowie Ethanolpräzipitation wurde die erhaltene DNS mit BamHI behandelt und das entstandene große Plasmidfragment wurde durch PAGE und Elektroelution eluiert. Dieses Fragment besaß ein stumpfes und ein kohäsives Ende und erlaubte die Rekombination in der richtigen Richtung mit dem das HGH-Gen enthaltenden Fragment, dessen Herstellung oben beschrieben wurde.AT 394 208 B by the Klenow polymerase I method using dATP, dTTP, dGTP and dCTP. After phenol and chloroform extraction and ethanol precipitation, the DNA obtained was treated with BamHI and the resulting large plasmid fragment was eluted by PAGE and electroelution. This fragment had a blunt and a cohesive end and allowed recombination in the correct direction with the fragment containing the HGH gene, the production of which was described above.

Das das HGH-Gen enthaltende Fragment und das pTrpl4 AXba-BamHI-Fragment wurden kombiniert und miteinander verbunden unter ähnlichen Bedingungen wie diejenigen, die vorstehend beschrieben sind. Durch die Verbindung der aufgefüllten Xbal- und EcoRI-Enden wurden die Xbal- und EcoRI-Restriktionsstellen wieder hergestellt:The fragment containing the HGH gene and the pTrpl4 AXba-BamHI fragment were combined and linked together under conditions similar to those described above. By connecting the filled Xbal and EcoRI ends, the Xbal and EcoRI restriction sites were restored:

Xbal aufgefüllt EcoRI aufgefüllt HGH-Gen-Anfang —TCTAG AATTCTATG— —TCTAGAATTCTATG— + -&gt; —AGATC TTAAGATAC— —AGATCTTAAGATAC—Xbal padded EcoRI padded HGH gene beginning —TCTAG AATTCTATG— —TCTAGAATTCTATG— + - &gt; —AGATC TTAAGATAC— —AGATCTTAAGATAC—

Xbal EcoRIXbal EcoRI

Durch diese Konstruktion wurde auch das Tetracyclinresistenz-Gen wiederhergestellt. Weil das Plasmid pHGH 107 Tetracyclinresistenz von einem Promoter, der stromaufwärts vom HGH-Gen (Lac-Promoter) liegt, exprimiert, erlaubt das vorstehend konstruierte Plasmid, bezeichnet pHGH 207, die Expression des Gens für Tetracyclinresistenz unter der Kontrolle des Tryptophan-Promoter-Operators. Das erhaltene Gemisch wurde in E. coli 294 transformiert und die Kolonien wurden auf LB-Platten, die 5 pg/ml Tetracyclin enthielten, selektionierLThis construction also restored the tetracycline resistance gene. Because the plasmid pHGH 107 expresses tetracycline resistance from a promoter upstream of the HGH gene (Lac promoter), the plasmid constructed above, designated pHGH 207, allows expression of the tetracycline resistance gene under the control of the tryptophan promoter operator . The resulting mixture was transformed into E. coli 294 and the colonies were selected on LB plates containing 5 pg / ml tetracycline

Das Plasmid pHGH 207 wurde mit EcoRI behandelt und ein 300 Basenpaare-enthaltendes Fragment wurde durch PAGE und Elektroelution erhalten, das den trp-Promoter, Operator und die trp-Leader-Ribosomenbindungs-stelle enthielt, dem aber eine ATG-Sequenz für den Start der Translation fehlte. Dieses DNS-Fragment wurde in die EcoRI-Spaltstelle von pLelF A kloniert. Expressionsplasmide, die das so modifizierte trp-Regulon (E. coli-Operon, dem die Attenuator-Sequenz fehlt, so daß die Expression erhöht ist) können bis zu vorgegebenen Konzentrationen herangezüchtet werden in einem Medium, das genügend Tryptophan enthält, um das Promoter-Operatorsystem zu unterdrücken. Wird dann das Tryptophan entzogen und das System entblockiert, so wird das gewünschte Produkt exprimiertThe plasmid pHGH 207 was treated with EcoRI and a fragment containing 300 base pairs was obtained by PAGE and electroelution, which contained the trp promoter, operator and the trp leader ribosome binding site, but which had an ATG sequence for the start of the Translation was missing. This DNA fragment was cloned into the EcoRI site of pLelF A. Expression plasmids which contain the modified trp regulon (E. coli operon, which lacks the attenuator sequence so that expression is increased) can be grown to predetermined concentrations in a medium which contains enough tryptophan to produce the promoter. Suppress operator system. If the tryptophan is then withdrawn and the system is unblocked, the desired product is expressed

Im vorliegenden Fall und wie in Figur 6 dargestellt, wurden 250 pg des Plasmids pL31 mit Pstl behandelt und das 1000 Basenpaare-enthaltende Teilstück durch Gelelektrophorese an einem 6 % Polyacrylamidgel isoliert. Es wurden etwa 40 pg des Teilstücks aus dem Gel durch Elektroelution erhalten und in 3 gleiche Teile für die weitere Behandlung aufgeteilt: a) Eine 16 pg-Probe des Fragments wurde teilweise gespalten mit 40 Einheiten von Bglll während 45 Minuten bei 37 °C und das Reaktionsgemisch wurde an einem 6 % Polyacrylamidgel gereinigt. Etwa 2 pg des gewünschten 670 Basenpaare-enthaltenden Fragments wurden erhalten, b) Eine andere Probe (8 pg) des 1000 Basenpaare-enthaltenden Pstl-Bruchstücks wurde mit Avall und Bglll behandelt. 1 pg des in Figur 6 gezeigten 150 Basenpaare-enthaltenden Fragments wurden nach Gelelektrophorese erhalten, c) 16 pg des 1000 Basenpaare-enthaltenden Fragments wurden mit Sau3a und Avall behandelt Nach Elektrophorese an 10 % Polyacrylamidgel wurden etwa 0,25 pg (10 pMol) des 34 Basenpaare-enthaltenden Fragments erhalten. Die zwei angegebenen Deoxyolinucleotide, 5'-dAATTCATGTGT (Fragment 1) und 5'-dGATCACACATG (Fragment 2) wurden nach der Phosphotriestermethode synthetisiert. Das Fragment 2 wurde folgendermaßen phosphoryliert: 200 pl (etwa 40 pM) von (γ^ρ) ATP (Amersham, 5000 Ci/mM) wurden zur Trockne gebracht und in 30 pl 60 mM Tris-HCl (pH 8), 10 mM MgC^, 15 mM ß-Mercaptoethanol, 100 pM des DNS-Fragments und 2 Einheiten T4 Polynukleotid-Kinase resuspendiert. Nach 15 Minuten bei 37 °C wurde 1 pl 10 mM ATP hinzugesetzt und die Reaktion weitere 15 Minuten laufengelassen. Das Gemisch wurde dann während 15 Minuten auf 70 °C erwärmt, mit 100 pM des 5'-OH-Fragments 1 und 10 pM des 34 Basenpaare-enthaltenden Sau3a-AvaII-Fragments versetzt. Die Verbindung wurde bei 4 °C während 5 Stunden in 50 ml 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgC^, 10 mM Dithiothreit, 0,5 mM ATP und 10 Einheiten T4 DNS-In the present case and as shown in FIG. 6, 250 pg of the plasmid pL31 were treated with Pstl and the section containing 1000 base pairs was isolated by gel electrophoresis on a 6% polyacrylamide gel. About 40 pg of the section from the gel were obtained by electroelution and divided into 3 equal parts for further treatment: a) A 16 pg sample of the fragment was partially digested with 40 units of BglII for 45 minutes at 37 ° C. and that The reaction mixture was purified on a 6% polyacrylamide gel. About 2 pg of the desired 670 base pair-containing fragment was obtained, b) Another sample (8 pg) of the 1000 base pair-containing PstI fragment was treated with Avall and Bglll. 1 pg of the 150 base pair-containing fragment shown in FIG. 6 was obtained after gel electrophoresis, c) 16 pg of the 1000 base pair-containing fragment were treated with Sau3a and Avall. After electrophoresis on 10% polyacrylamide gel, about 0.25 pg (10 pmol) of the Receive 34 base pair-containing fragment. The two indicated deoxyolinucleotides, 5'-dAATTCATGTGT (fragment 1) and 5'-dGATCACACATG (fragment 2) were synthesized according to the phosphotriester method. Fragment 2 was phosphorylated as follows: 200 pl (about 40 pM) of (γ ^ ρ) ATP (Amersham, 5000 Ci / mM) were brought to dryness and in 30 pl 60 mM Tris-HCl (pH 8), 10 mM MgC ^, 15 mM β-mercaptoethanol, 100 pM of the DNA fragment and 2 units of T4 polynucleotide kinase resuspended. After 15 minutes at 37 ° C, 1 μl of 10 mM ATP was added and the reaction was continued for a further 15 minutes. The mixture was then heated to 70 ° C. for 15 minutes, 100 pM of the 5'-OH fragment 1 and 10 pM of the 34 base pair-containing Sau3a-AvaII fragment were added. The compound was dissolved at 4 ° C for 5 hours in 50 ml of 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgC ^, 10 mM dithiothreitol, 0.5 mM ATP and 10 units of T4 DNA.

Ligase hergestellt. Das Gemisch wurde der Elektrophorese an einem 6 % Polyacrylamidgel unterworfen und das 45 Basenpaare-enthaltende Produkt wurde durch Elektroelution erhalten. Etwa 30 ng (1 pM) des 45 Basenpaare-enthaltenden Produkts wurden mit 0,5 pg (5 pM) des 150 Basenpaare-enthaltenden Avall - Bglll-Fragments und 1 pg (2 pM) des 670 Basenpaare-enthaltenden Bglll - Pstl-Fragments vereint. Die Bindung wurde bei 20 °C während 16 Stunden unter Verwendung von 20 Einheiten T4 DNS-Ligase hergestellt. Die Ligase wurde dann durch Erhitzen auf 65 °C während 10 Minuten inaktiviert und das Gemisch wurde mit EcoRI und Pstl behandelt zwecks Spaltung von Polymeren des Gens. Das Gemisch wurde dann durch PAGE (6 %) gereinigt. Es wurden etwa 20 ng (0,04 pM) des 865 Basenpaare-enthaltenden Produkts isoliert. Eine Hälfte davon (10 ng) wurde zwischen die EcoRI- und Pstl-Spaltstellen von pBR322 (0,3 pg) eingefügt. Die Transformation von E. coli 294 -10-Ligase produced. The mixture was subjected to electrophoresis on a 6% polyacrylamide gel and the product containing 45 base pairs was obtained by electroelution. About 30 ng (1 pM) of the 45 base pair-containing product was combined with 0.5 pg (5 pM) of the 150 base pair-containing Avall-Bglll fragment and 1 pg (2 pM) of the 670 base-pair Bglll - Pstl fragment united. Binding was made at 20 ° C for 16 hours using 20 units of T4 DNA ligase. The ligase was then inactivated by heating to 65 ° C for 10 minutes and the mixture was treated with EcoRI and Pstl to cleave polymers of the gene. The mixture was then purified by PAGE (6%). About 20 ng (0.04 pM) of the 865 base pair containing product was isolated. Half of it (10 ng) was inserted between the EcoRI and PstI sites of pBR322 (0.3 pg). The transformation of E. coli 294 -10-

AT 394 208 B lieferte 70 Tetracyclin-resistente, Ampicillin-empfindliche Transformanten.AT 394 208 B supplied 70 tetracycline-resistant, ampicillin-sensitive transformants.

Die aus 18 dieser Transformanten isolierte Plasmid-DNS wurde mit EcoRI und Pstl behandelt. 16 der 18 Plasmide besaßen ein EcoRI - Pstl-Fragment, das 865 Basenpaare lang war. 1 pg eines dieser Plasmide (pLelF Al) wurde mit EcoRI behandelt und an das 300 Basenpaare enthaltende EcoRI-Fragment (0,1 pg), das den E. coli trp-Promoter und die trp-Leader-Ribosomenbindungsstelle enthielt, gebunden. Die den ϋρ-Promoter enthaltenden Transformanten wurden unter Verwendung einer trp-Sonde nach der Grunstein-Hogness Kolonie-Screening-Methode identifiziert. Eine asymmetrisch sitzende Xbal-Spaltstelle in dem tip-Fragment erlaubte die Bestimmung von Rekombinanten, in denen der trp-Promoter in der Richtung des LelF A-Gens orientiert war.The plasmid DNA isolated from 18 of these transformants was treated with EcoRI and Pstl. 16 of the 18 plasmids had an EcoRI - PstI fragment that was 865 base pairs long. 1 pg of one of these plasmids (pLelF Al) was treated with EcoRI and bound to the 300 base pair EcoRI fragment (0.1 pg) containing the E. coli trp promoter and the trp leader ribosome binding site. The transformants containing the ϋρ promoter were identified using a trp probe according to the Grunstein-Hogness colony screening method. An asymmetrically located Xbal cleavage site in the tip fragment allowed the determination of recombinants in which the trp promoter was oriented in the direction of the LelF A gene.

I. In vitro und in vivo Aktivität von LelF AI. In vitro and in vivo activity of LelF A

Extrakte für den IF-Assay wurden folgendermaßen hergestellt: 1 ml-Kulturen wurden in L-Brühe, enthaltend 5 pg/ml Tetracyclin, bis zu einem A^g-Wert von etwa 1,0 aufgezogen, dann mit 25 ml M9-Medium, enthaltend 5 pg/ml Tetracyclin verdünnt. Wenn der A^g-Wert 1,0 erreicht hatte, wurden jeweils 10 ml-Proben zentrifugiert und die Zellkuchen in 1 ml 15%iger Saccharose, 50 ml-Tris-HCl (pH 8,0) und 50 mM EDTA suspendiert. 1 mg Lysozym wurde zugesetzt und nach 5-minütiger Aufbewahrung bei 0 °C wurden die Zellen durch Ulträbeschallung zerstört. Es wurde 10 Minuten zentrifugiert (15,000 U/Min) und die Interferon-Aktivität im Überstand wurde bestimmt durch Vergleich mit LelF-Standard nach dem CPE-Hemmtest. Zur Bestimmung der Anzahl von EF-Molekülen pro Zelle wurde eine spezifische LelF-Aktivität von 4 x 10^ Einheiten pro mg verwendetExtracts for the IF assay were prepared as follows: 1 ml cultures were grown in L broth containing 5 pg / ml tetracycline to an A ^ g value of approximately 1.0, then with 25 ml M9 medium, containing 5 pg / ml tetracycline diluted. When the A ^ g reached 1.0, 10 ml samples were centrifuged and the cell cake suspended in 1 ml of 15% sucrose, 50 ml-Tris-HCl (pH 8.0) and 50 mM EDTA. 1 mg lysozyme was added and after 5 minutes storage at 0 ° C the cells were destroyed by ultrasound. Centrifugation was carried out for 10 minutes (15,000 rpm) and the interferon activity in the supernatant was determined by comparison with LelF standard after the CPE inhibition test. To determine the number of EF molecules per cell, a specific LelF activity of 4 x 10 ^ units per mg was used

Wie in Tabelle 1 gezeigt, liefert Klon pLelF A trp 25, in dem der trp-Promoter in der richtigen Richtung orientiert ist, hohe Aktivitäten (bis zu 2,5 x 10^ Einheiten pro Liter). Wie in Tabelle 2 gezeigt, verhält sich das von E. coli K-12 Stamm 294/pLeIF A trp 25 hergestellte Interferon wie authentisches Human-LeBF; es ist bei pH 2 stabil und wird durch Kaninchen-anti-Human-Leukozyten-Antikörper neutralisiert. Das Interferon hat ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 20,000.As shown in Table 1, clone pLelF A trp 25, in which the trp promoter is oriented in the correct direction, provides high activity (up to 2.5 x 10 ^ units per liter). As shown in Table 2, the interferon produced by E. coli K-12 strain 294 / pLeIF A trp 25 behaves like authentic human LeBF; it is stable at pH 2 and is neutralized by rabbit anti-human leukocyte antibodies. The interferon has an apparent molecular weight of approximately 20,000.

Der Nachweis von in vivo-Akdvität von Interferon macht die Gegenwart von Makrophagen und natürlichen Killerzellen (NK) notwendig, und es scheint daß diese Zellen stimuliert werden. Es war daher möglich, daß das von E. coli 294/pLeIF A 25 produzierte Interferon, das im Zellkultur-Assay antivirale Aktivität zeigte, an infizierten Tieren inaktiv ist. Ferner ist es durchaus möglich, daß sich die antivirale in vivo-Aktivität des bakteriell hergestellten, nicht-glykosylierten LelF A von der des glykosylierten Interferons, das aus menschlichen Leukozyten gewonnen wird, unterscheidet. Es wurden daher die biologischen Aktivitäten von bakteriell hergestelltem LelF A (2 % rein) und von aus Leukozyten isoliertem LelF (8 % rein) miteinander verglichen und zwar an Hand der lethalen Enzephalomyocarditis (EMC) bei Totenkopfäffchen (Tabelle 3).Detection of interferon in vivo activity requires the presence of macrophages and natural killer (NK) cells, and these cells appear to be stimulated. It was therefore possible that the interferon produced by E. coli 294 / pLeIF A 25, which showed antiviral activity in the cell culture assay, is inactive in infected animals. Furthermore, it is entirely possible that the in vivo antiviral activity of the bacterially produced, non-glycosylated LelF A differs from that of the glycosylated interferon which is obtained from human leukocytes. The biological activities of bacterially produced LelF A (2% pure) and of LelF (8% pure) isolated from leukocytes were therefore compared using the lethal encephalomyocarditis (EMC) in squirrel monkeys (Table 3).

Tabelle 1Table 1

Interferon-Aktivität in Extrakten von E. coli E. coli K-12 Stamm 294 Zelldichte IF-Aktivität LelF-Moleküle transformiert durch (Zellen/ml) E/ml Kultur pro Zelle pLelF A trp 25 Ίλ X t—‘ o 00 36,000 9,000 pLelF A trp 25 1,8 X 109 250,000 12,000 -11- AT 394 208 B Tabelle 2Interferon activity in extracts from E. coli E. coli K-12 strain 294 cell density IF activity LelF molecules transformed by (cells / ml) E / ml culture per cell pLelF A trp 25 Ίλ X t - 'o 00 36,000 9,000 pLelF A trp 25 1.8 X 109 250,000 12,000 -11- AT 394 208 B Table 2

Vergleich der Aktivität von Extrakten aus E. coli 294/pLeIF A 25 mit Standard-LelF *)Comparison of the activity of extracts from E. coli 294 / pLeIF A 25 with standard LelF *)

Interferon-Aktivität (E/ml) unbehandelt pH 2 Kaninchen-anti-Human-Leukozyten- Antikörper 294/pLeIF A trp 25-Extrakt 500 500 &lt; 10 LelF-Standard 500 500 &lt; 10 *) Der 250,000 E/ml enthaltende Extrakt von E. coli 294/pLeIF A trp 25, der in Tabelle 1 beschrieben wird, wurde auf das 500-fache verdünnt mit Minimalmedium, so daß er eine spezifische Aktivität von 500 E/ml aufwies. Ein vorher gegen NIH-Leukozyten-Interferon-Standard titrierter Leukozyten-Interferon-Standard (Wadley Institute) wurde ebenfalls auf eine Endkonzentration von 500 E/ml verdünnt Aliquote Teile (jeweils 1 ml) wurden mit 1 N HCl auf pH 2 gebracht, 52 Stunden bei 4 °C inkubiert, durch Zusatz von NaOH neutralisiert und die IF-Aktivität nach dem Standard-CPE-Hemmtest bestimmt. Aliquote Teile (25 μΐ) der 500 E/ml-Proben (unbehandelt) wurden mit 25 μΐ Kaninchen-anti-Human-Leukozyten-Interferon während 60 Minuten bei 37 °C inkubiert, zentrifugiert mit 12,000 x g während 5 Minuten und der Überstand getestet.Interferon activity (U / ml) untreated pH 2 rabbit anti-human leukocyte antibody 294 / pLeIF A trp 25 extract 500 500 &lt; 10 LelF standard 500 500 &lt; The extract of E. coli 294 / pLeIF A trp 25 containing 250,000 U / ml, which is described in Table 1, was diluted 500-fold with minimal medium so that it had a specific activity of 500 U / ml . A leukocyte interferon standard (Wadley Institute) previously titrated against NIH leukocyte interferon standard was also diluted to a final concentration of 500 U / ml. Aliquots (1 ml each) were brought to pH 2 with 1N HCl, 52 hours Incubated at 4 ° C, neutralized by adding NaOH and the IF activity determined according to the standard CPE inhibition test. Aliquots (25 μΐ) of the 500 U / ml samples (untreated) were incubated with 25 μΐ rabbit anti-human leukocyte interferon for 60 minutes at 37 ° C., centrifuged at 12,000 × g for 5 minutes and the supernatant was tested.

Tabelle 3Table 3

Antiviraler Effekt verschiedener LelF-Präparate gegen EMC Virus-Infektionen bei TotenkopfäffchenAntiviral effect of various LelF preparations against EMC virus infections in squirrel monkeys

Behandlung Überlebende Serum PFU/ml Tag 2 Tag 3 Tag 4 Kontrolle 0/3 1° 1 3 x 104 io5l (Bakterienproteine) 0 &gt; 3 0 &quot; 104 1,200 } 3.4 x 104 oj 0 °J Bakterielles 3/3 0 0 0 LelF 0 0 0 0 0 0 LelF-Standard 3/3 0 0 0 0 0 0Treatment survivor serum PFU / ml day 2 day 3 day 4 control 0/3 1 ° 1 3 x 104 io5l (bacterial proteins) 0 &gt; 3 0 &quot; 104 1,200} 3.4 x 104 oj 0 ° J Bacterial 3/3 0 0 0 LelF 0 0 0 0 0 0 LelF standard 3/3 0 0 0 0 0 0

Alle Affen waren männlichen Geschlechts (mittleres Gewicht 713 g) und besaßen keine EMC Virus-Antikörper vor der Infektion. Die Affen wurden intramuskulär mit 100 x LD^q EMC-Virus (bestimmt an Mäusen) infiziert. Die Kontrolltiere starben 134, 158 und 164 Stunden nach der Infektion. Die Interferon-All monkeys were male (mean weight 713 g) and had no EMC virus antibodies prior to infection. The monkeys were infected intramuscularly with 100 x LD ^ q EMC virus (determined in mice). The control animals died 134, 158 and 164 hours after infection. The interferon

Behandlung mit 106 Einheiten erfolgte intravenös und zwar -4, +2,23,29,48,72,168 und 240 Stunden nach der Infektion. Bei dem bakteriellen Leukozyten-Interferon handelte es sich um eine Säulenchromatographie- -12-Treatment with 106 units was intravenous at -4, +2.23.29.48.72.168 and 240 hours after infection. The bacterial leukocyte interferon was a column chromatography- -12-

AT 394 208 BAT 394 208 B

Fraktion eines Lysats aus E. coli 294/pLeIF A 25 mit einer spezifischen Aktivität von 7,4 x 10® E/mg Protein. Die bei den Kontrollen verwendeten Bakterien-Proteine waren der Säulenfraktion des Lysats von E. coli 294/pBR322 bei doppelter Gesamtproteinkonzentration äquivalent. Bei dem Leukozyten-Interferon-Standard handelte es sich um durch Sendai-Virus induziertes Interferon aus normalen menschlichen Zellen, das chromatographisch auf eine spezifische Aktivität von 32 x 10® E/mg Protein gereinigt war.Fraction of a lysate from E. coli 294 / pLeIF A 25 with a specific activity of 7.4 x 10® U / mg protein. The bacterial proteins used in the controls were equivalent to the column fraction of the E. coli 294 / pBR322 lysate at twice the total protein concentration. The leukocyte interferon standard was Sendai virus-induced interferon from normal human cells, which was chromatographically purified to a specific activity of 32 x 10® U / mg protein.

Die KontroMere verloren das Gleichgewicht, zeigten progressive Lethargie, schlaffe Lähmung der hinteren Gliedmaßen und wässerige Augen, beginnend etwa 8 Stunden vor dem Tod. Die mit Interferon behandelten Affen zeigten keine dieser Abnormalitäten: sie blieben während der gesamten Zeit aktiv und entwickelten keine Virämie. Der eine Affe der Kontrollgruppe, der innerhalb von 4 Tagen keine Virämie entwickelte, starb zuletzt (164 Stunden nach der Infektion), aber zeigte nach dem Tode hohe Virus-Titer im Herzen und Gehirn. Die Interferon-behandelten Affen entwickelten keine Antikörper gegen EMC-Viren, was 14 und 21 Tage nach der Infektion festgestellt wurde. Die Ergebnisse zeigen somit, daß der antivirale Effekt der LelF-Präparate an den infizierten Tieren lediglich der Wirkung des Interferons zugeschrieben werden kann, da die kontaminierenden Proteine des bakteriellen und des aus Leukozyten gewonnenen Interferons völlig unterschiedlich sind. Außerdem deuten die Ergebnisse daraufhin, daß für eine in vivo antivirale Aktivität von LelF A eine Glykosylierung nicht notwendig ist. J. Isolierung von cDNS für weitere Leukozvten-Interferone DNS aus dem Plasmid, das DNS für das vollständige LelF A enthält, wurde mit Pstl herausgeschnitten, Ύ) elektrophoretisch isoliert und mitJ P markiert. Die erhaltene radioaktiv markierte DNS wurde als Sonde für das Screening von zusätzlichen E. coli 294-Transformanten verwendet, die in der gleichen Weise, wie in Teil C beschrieben, erhalten wurden [nach der in-situ-Kolonie-Testmethode von Grunstein und Hogness (siehe oben)]. Die mit der Sonde hybridisierenden Kolonien wurden isoliert. Plasmid-DNS aus diesen Kolonien sowie aus den zehn hybridisierenden Kolonien, die in Teil G oben erwähnt wurden, wurden durch Behandlung mit Pstl herausgeschnitten und nach drei verschiedenen Methoden charakterisiert. Zunächst wurden diese Pstl-Fragmente durch die Abbauprodukte, die durch Behandlung mit der Restriktions-Endonucleasen Bglll, PvuII und EcoRI entstanden, charakterisiert. Die Analyse erlaubte die Klass-Klassifizierung von mindestens acht unterschiedlichen Typen (LelF A, LelF B, LelF C, LelF D, LelF E, LelF F, LelF G und LelF H), dargestellt in Figur 5, wie einen Überblick über die Lage der verschiedenen Restriktionsstellen relativ zu der bis jetzt bekannten Präsequenz und der kodierenden Sequenz von LelF A gibt. Ein Typ von diesen, LelF D, ist anscheinend identisch mit dem von Nagata et al., Nature 284.316-320 (1980), beschriebenen LelF.The KontroMere lost their balance, showed progressive lethargy, limp paralysis of the hind limbs and watery eyes, beginning about 8 hours before death. The monkeys treated with interferon did not show any of these abnormalities: they remained active throughout and did not develop viremia. The one monkey in the control group who did not develop viremia within 4 days died last (164 hours after infection), but showed high virus titers in the heart and brain after death. The interferon-treated monkeys did not develop antibodies against EMC viruses, which was found 14 and 21 days after infection. The results thus show that the antiviral effect of the LelF preparations on the infected animals can only be attributed to the action of the interferon, since the contaminating proteins of the bacterial and of the leukocyte-derived interferon are completely different. In addition, the results indicate that glycosylation is not necessary for in vivo antiviral activity of LelF A. J. Isolation of cDNA for further leukocyte interferon DNA from the plasmid, which contains DNA for the complete LelF A, was cut out with Pstl, Ύ) electrophoretically isolated and labeled with J P. The resulting radiolabelled DNA was used as a probe for the screening of additional E. coli 294 transformants obtained in the same manner as described in Part C [by the in situ colony test method of Grunstein and Hogness ( see above)]. The colonies hybridizing with the probe were isolated. Plasmid DNA from these colonies, as well as from the ten hybridizing colonies mentioned in Part G above, were excised by treatment with PstI and characterized by three different methods. Initially, these PstI fragments were characterized by the degradation products that were generated by treatment with the restriction endonucleases BglII, PvuII and EcoRI. The analysis allowed the classification of at least eight different types (LelF A, LelF B, LelF C, LelF D, LelF E, LelF F, LelF G and LelF H), shown in Figure 5, as an overview of the location of the different restriction sites relative to the previously known pre-sequence and the coding sequence of LelF A. One type of these, LelF D, appears to be identical to the LelF described by Nagata et al., Nature 284.316-320 (1980).

Ferner wurden verschiedene DNSs mit dem von Cleveland et al. (Cell 2Ü, 95-105 [1980]) beschriebenen Hybridisations-Selektions-Test untersucht auf ihre Fähigkeit, LelF-mRNS selektiv von Poly-A enthaltender RNS aus KG-1 Zellen zu entfernen. In diesem Test waren LelF A, B, C und F positiv. Schließlich wurden letztere Pstl-Fragmente in Plasmide eingefügt, E. coli 294 wurde mit diesen Plasmiden transformiert und die Fragmente wurden exprimiert. Die exprimierten Produkte, von denen man annahm, daß sie Präinterferone wären, waren im CPE-Assay auf Interferon-Aktivität alle positiv, wobei nur das LelF F-Fragment geringfügige Aktivität aufwies. Im übrigen wurden alleLeEF-Typen sequenziert. K. Direkte Expression eines zweiten reifen Leukozvten-Interferons (LelF BlFurthermore, various DNAs with the Cleveland et al. (Cell 2Ü, 95-105 [1980]) described the hybridization selection test for their ability to selectively remove LelF-mRNA from RNA containing poly-A from KG-1 cells. In this test, LelF A, B, C and F were positive. Finally, the latter PstI fragments were inserted into plasmids, E. coli 294 was transformed with these plasmids and the fragments were expressed. The expressed products, which were thought to be preinterferons, were all positive in the CPE assay for interferon activity, with only the LelF F fragment showing minor activity. Incidentally, all LeEF types were sequenced. K. Direct expression of a second mature leukocyte interferon (LelF Bl

Die Sequenz des isolierten DNS-Fragements, welches das Gen für reifes LelF B enthält, zeigt, daß die ersten vierzehn Nucleotide für LelF A und B identisch sind. Folglich wurde ein Fragment aus pLelF A25, das den trp-Promoter-Operator, die Ribosomenbindungsstelle und den Beginn des LelF A (= B)-Gens enthielt, isoliert und mit dem Rest der B-Sequenz in einem Expressions-Plasmid kombiniert. Die Restriktionskarten für die Pst-Fragmente von pL4 (ein Plasmid, enthaltend das LelF B-Gen aus Figur 5) und pLelF A25 sind in den Figuren 7a und 7b dargestellt.The sequence of the isolated DNA fragment containing the mature LelF B gene shows that the first fourteen nucleotides for LelF A and B are identical. Thus, a fragment from pLelF A25 containing the trp promoter operator, the ribosome binding site and the beginning of the LelF A (= B) gene was isolated and combined with the rest of the B sequence in an expression plasmid. The restriction maps for the Pst fragments of pL4 (a plasmid containing the LelF B gene from FIG. 5) and pLelF A25 are shown in FIGS. 7a and 7b.

Um das etwa 950 (= Basenpaare) lange Sau3a-Pstl-Fragment aus der Sequenz, die in Figur 7a dargestellt ist, zu erhalten, waren mehrere Schritte notwendig wegen des Vorkommens weiterer, in diesem Bereich liegender Sau3a-Restriktionsstellen. Es wurde folgendermaßen vorgegangen: 1. Die folgenden Ragmente wurden isoliert: a) 110 b.p. aus Sau3a-EcoRI; b) 132 b.p. aus EcoRI-Xba; c) 700 b.p. aus Xba-Pst. 2. Die Fragmente (la) und (lb) wurden miteinander verbunden und mit Xba und Bgin behandelt, um Selbstpolymerisation über die Sau3a- und Xba-Enden zu verhindern (die entsprechende Sau3a-Spaltstelle lag innerhalb einer Bglll-Spaltstelle; Bglll-Schnitte hinterlassen ein Sau3a kohäsives Ende). Es wurde ein 242 b.p. enthaltendes Fragment isoliert -13- 5 5 10In order to obtain the approximately 950 (= base pairs) long Sau3a-PstI fragment from the sequence shown in FIG. 7a, several steps were necessary because of the occurrence of further Sau3a restriction sites located in this area. The procedure was as follows: 1. The following fragments were isolated: a) 110 b.p. from Sau3a-EcoRI; b) 132 b.p. from EcoRI-Xba; c) 700 b.p. from Xba-Pst. 2. Fragments (la) and (lb) were joined together and treated with Xba and Bgin to prevent self-polymerization over the Sau3a and Xba ends (the corresponding Sau3a cleavage site was within a Bglll cleavage site; Bglll cuts left) a Sau3a cohesive end). A 242 b.p. containing fragment isolated -13- 5 5 10

I JI J

J 35 40J 35 40

AT 394 208 B 3. Das Produkt von (2) wurde mit (lc) verbunden und mit Pstl und Bglll behandelt, wieder um Selbstpolymerisation zu verhindern. Ein etwa 950 b.p. enthaltendes Fragment, Sau3a-Pstl (siehe Figur 7a) wurde isoliert. Dieses Fragment enthielt denjenigen Teil des LelF B-Gens, der keine Entsprechung beim LelF A hatte. 4. Ein etwa 300 b.p. enthaltendes Fragment (HindIII-Sau3a), das den trp-Promoter-Operator, die Ribosomenbindungsstelle, das ATG-Startsignal und den Cystein-Codon von LelF A enthielt, wurde aus pLelF A25 isoliert. 5. Ein etwa 3600 b.p. enthaltendes Fragment (Pstl-Hindlll) wurde aus pBR322 isoliert. Es enthielt das Replikon, das Tetracyclin-Resistenz, nicht aber Ampicillin-Resistenz kodiert. 6. Die Fragmente, die gemäß 3, 4 und 5 erhalten wurden, wurden miteinander verbunden und mit dem resultierenden Plasmid wurde E. coli K-12 Stamm 294 transformiert.AT 394 208 B 3. The product of (2) was combined with (lc) and treated with Pstl and Bglll, again to prevent self-polymerization. An approximately 950 b.p. containing fragment, Sau3a-Pstl (see Figure 7a) was isolated. This fragment contained that part of the LelF B gene which had no equivalent in the LelF A. 4. An approximately 300 b.p. Containing fragment (HindIII-Sau3a) containing the trp promoter operator, the ribosome binding site, the ATG start signal and the cysteine codon of LelF A was isolated from pLelF A25. 5. An approximately 3600 b.p. containing fragment (Pstl-Hindlll) was isolated from pBR322. It contained the replicon encoding tetracycline resistance but not ampicillin resistance. 6. The fragments obtained according to 3, 4 and 5 were joined together and E. coli K-12 strain 294 was transformed with the resulting plasmid.

Die Transformanten wurden einem Minitest unterzogen (Bimboim et al., Nucleic Acids Res. 2.1513-1523 [1979]) und Plasmidproben wurden mit EcoRI behandelt. Der Abbau lieferte folgende drei Fragmente: 1) Ein 15 EcoRI-EcoRI trp Promoter-Fragment; 2) das innere EcoRI-EcoRI-Fragment von pL4 und 3) das Fragment vom Translations-Startsignal bis zur EcoRI-Spaltstelle von pL4.The transformants were subjected to a mini test (Bimboim et al., Nucleic Acids Res. 2.1513-1523 [1979]) and plasmid samples were treated with EcoRI. Degradation provided the following three fragments: 1) a 15 EcoRI-EcoRI trp promoter fragment; 2) the inner EcoRI-EcoRI fragment of pL4 and 3) the fragment from the translation start signal to the EcoRI site of pL4.

Im CPE-Assay zeigen Bakterienextrakte aus Klonen, die in der vorstehend beschriebenen Weise erhalten werden, Aktivitäten von 10 x 10^ Einheiten Interferon pro Liter bei A^q = 1. Ein repräsentativer Klon, der in dieser Weise hergestellt wurde, ist E. coli 294/pLeIF B trp 7. 20 L. Direkte Expression weiterer reifer Leukozyten Interferone (LelF C. D. F. Η. I und JjIn the CPE assay, bacterial extracts from clones obtained in the manner described above show activities of 10 × 10 ^ units of interferon per liter at A ^ q = 1. A representative clone that was produced in this way is E. coli 294 / pLeIF B trp 7. 20 L. Direct expression of further mature leukocyte interferons (LelF CDF Η. I and Jj

Weitere Genfragmente in voller Länge von anderen LelF-Typen können geschneidert und in Vektoren eingebaut werden zwecks Expression in Analogie zu der für das LelF A beschriebenen Weise. Durch vollständige Sequenzierung in konventioneller Weise kann festgestellt werden, ob eine Restriktionsstelle genügend nahe an 25 dem ersten Aminosäurecodon des reifen Interferons liegt, so daß die im Teil H beschriebene Methode für die Expression von reifem LelF A verwendet werden kann, d. h. die Eliminierung der Präsequenz durch einen Restriktionsschnitt und Ersatz der aminoendständig zusammen mit der Präsequenz verlorenen Aminosäurecodons durch Anhängen eines synthetischen DNS-Fragments. Sollte dies nicht der Fall sein, so kann die folgende Methode angewandt werden. Hierbei wird das die Präsequenz kodierende Fragment präzis an der Stelle abgetrennt, 30 an der der Codon für die erste Aminosäure des reifen Polypeptids beginnt, und zwar dadurch, daß 1. in der Umgebung dieses Punktes die doppelsträngige DNS in einsträngige DNS übergeführt wird; 2. die im ersten Schritt gebildete einsträngige Region mit einer komplementären Starter-Sequenz einer einsträngigen DNS hybridisiert wird, deren 5'-Ende gegenüber dem Nukleotid liegt, das an die beabsichtigte Spaltstelle grenzt; 3. derjenige Teil des in 3'-Richtung des Starters liegenden zweiten Stranges, der in (1) eliminiert wurde, durch Umsetzung mit DNS-Polymerase in Gegenwart von Adenin-, Thymin-, Guanin- und Cytosinhaltigen Deoxynucelotid-triphosphaten wieder hergestellt wird und 4. die verbleibende einsträngige DNS-Sequenz, die über die beabsichtigte Spaltstelle hinausreicht, abgebaut wird.Additional full length gene fragments from other LelF types can be tailored and incorporated into vectors for expression in analogy to the manner described for LelF A. Complete sequencing in a conventional manner can determine whether a restriction site is sufficiently close to the first amino acid codon of the mature interferon so that the method described in Part H can be used for the expression of mature LelF A, i. H. the elimination of the presequence by a restriction cut and replacement of the amino acid codons lost together with the presequence by appending a synthetic DNA fragment. If this is not the case, the following method can be used. Here, the fragment encoding the pre-sequence is separated precisely at the point where the codon for the first amino acid of the mature polypeptide begins, namely by 1. converting the double-stranded DNA into single-stranded DNA in the vicinity of this point; 2. the single-stranded region formed in the first step is hybridized with a complementary starter sequence of a single-stranded DNA, the 5 'end of which is opposite the nucleotide which borders on the intended cleavage site; 3. That part of the second strand lying in the 3 'direction of the starter which was eliminated in (1) is restored by reaction with DNA polymerase in the presence of deoxynucelotide triphosphates containing adenine, thymine, guanine and cytosine, and 4. the remaining single-stranded DNA sequence, which extends beyond the intended cleavage site, is degraded.

Eine kurze synthetische DNS-Sequenz, die am 3'-Ende des kodierenden Stranges mit dem Translations-Startsignal ATG endet, kann dann verbunden werden, z. B. über stumpfe Enden, mit dem zurechtgeschnittenen Gen für die reifen Interferone. Die Gene können in ein Plasmid eingefügt und unter die Kontrolle eines Promoters 45 und seiner zugehörigen Ribosomenbindungsstelle gebracht werden.A short synthetic DNA sequence that ends at the 3 'end of the coding strand with the translation start signal ATG can then be linked, e.g. B. over blunt ends, with the trimmed gene for the mature interferons. The genes can be inserted into a plasmid and placed under the control of a promoter 45 and its associated ribosome binding site.

In ähnlicher Weise, wie es in Abschnitt K oben beschrieben ist, wurden Genfragmente, die für LelF C und LelF B kodieren aufgebaut, zwecks direkter Expression in Bakterien. Bei der Strategie, die zur Expression dieser weiteren Leukozyten-Interferone führte, wurde in jedem Falle auf das etwa 300 Basenpaare-enthaltende Fragment (Hindm-Sau3a), das den trp-Promoter-Operator, die Ribosomenbindungsstelle, das ATG Startsignal und den 50 Cystein-Codon von LelF A aus pLelF A25 enthielt, zurückgegriffen. Dieses Fragment wurde kombiniert mit den Fragmenten anderer Interferone, die die entsprechenden Aminosäuresequenzen, die auf den allen gemeinsamen Cysteinrest folgen, kodieren. Jedes erhaltene Plasmid wurde zur Transformation von E. coli K-12 Stamm 294 verwendet Für die einzelnen Gene waren folgende Schritte notwendig: 55In a similar manner to that described in Section K above, gene fragments encoding LelF C and LelF B were constructed for direct expression in bacteria. In the strategy that led to the expression of these further leukocyte interferons, the fragment containing approximately 300 base pairs (Hindm-Sau3a), the trp promoter operator, the ribosome binding site, the ATG start signal and the 50 cysteine was used in each case Contained codon of LelF A from pLelF A25. This fragment was combined with the fragments of other interferons which encode the corresponding amino acid sequences which follow the common cysteine residue. Each plasmid obtained was used to transform E. coli K-12 strain 294. The following steps were necessary for the individual genes: 55

LelFCLelFC

Isolierung der folgenden Fragmente aus pLelF C: (a) ein 35 Basenpaare-enthaltendes Fragment Sau3a-Sau96; 60 (b) ein mehr als 900 Basenpaare-enthaltendes Fragment Sau96-Pstl; -14-Isolation of the following fragments from pLelF C: (a) a 35 base pair fragment Sau3a-Sau96; 60 (b) a Sau96-Pstl fragment containing more than 900 base pairs; -14-

AT 394 208 B (c) Isolierung eines etwa 300 Basenpaare-enthaltenden Fragments (HindIII-Sau3a) aus pLelF A-25, wie in Teil K (4) oben beschrieben; (φ Isolierung des etwa 3600 Basenpaare-enthaltenden Fragments aus Abschnitt K (5) oben.AT 394 208 B (c) isolation of a fragment (HindIII-Sau3a) containing about 300 base pairs from pLelF A-25 as described in part K (4) above; (φ Isolation of the approximately 3600 base pair-containing fragment from section K (5) above.

Konstruktion: (1) Verbindung von (a) mit (c). Spaltung mit Bglll, Hindill und Isolierung des etwa 335 Basenpaare-enthaltenden Produktes. (2) Verbindung der unter (1), (b) und (d) erhaltenen Bruchstücke und Transformierung von E. coli mit dem resultierenden Plasmid.Construction: (1) connection of (a) with (c). Cleavage with BglII, Hindill and isolation of the product containing about 335 base pairs. (2) Connection of the fragments obtained under (1), (b) and (d) and transformation of E. coli with the resulting plasmid.

Ein repräsentativer Klon der auf diese Weise erhalten wurde, ist E. coli K-12 Stamm 294/pLeIF C trp 35.A representative clone obtained in this way is E. coli K-12 strain 294 / pLeIF C trp 35.

LelFDLelFD

Aus pLelF D wurden isoliert: a) ein 35 Basenpaare-enthaltendes Fragment (Sau3a-AvaII); b) ein 150 Basenpaare-enthaltendes Fragment (Avall-Bglll) und c) ein etwa 700 Basenpaare-enthaltendes Fragment (Bglll-Pstl).The following were isolated from pLelF D: a) a fragment containing 35 base pairs (Sau3a-AvaII); b) a fragment containing 150 base pairs (Avall-Bglll) and c) an approximately 700 base pair-containing fragment (Bglll-Pstl).

Aus pLelF A25 wurde isoliert: d) ein 300 Basenpaare-enthaltendes Fragment (HindIII-Sau3a).The following was isolated from pLelF A25: d) a fragment containing 300 base pairs (HindIII-Sau3a).

Aus pBR322 wurde isoliert: e) ein etwa 3600 Basenpaare-enthaltendes Fragment (Hindül-Pstl).The following was isolated from pBR322: e) an approximately 3600 base pair-containing fragment (Hindül-Pstl).

Konstruktion (1) Die Verbindung von (a) mit (b), Spaltung mit Bglll und Reinigung liefert ein 185 Basenpaare-enthaltendes Produkt (2) Die Verbindung von (1) mit (d), Spaltung mit Hindill und Bglll und Reinigung liefert ein etwa 500 Basenpaare enthaltendes Produkt (3) Die Fragmente (2), (c) und (e) wurden miteinander verbunden und E. coli mit dem erhaltenen Plasmid transformiertConstruction (1) The association of (a) with (b), cleavage with BglII and purification provides a 185 base pair product (2) The association of (1) with (d), cleavage with Hindill and BglII and purification provides product containing about 500 base pairs (3) Fragments (2), (c) and (e) were joined together and E. coli was transformed with the plasmid obtained

Ein in dieser Weise erhaltener repräsentativer Klon ist E. coli K-12 Stamm 294/pLeIF D trp 11.A representative clone obtained in this way is E. coli K-12 strain 294 / pLeIF D trp 11.

LelFFLelFF

Bei der Konstruktion eines vollständigen LelF F Gens und der direkten Expression des entsprechenden Interferons kann man sich die Homologie der Aminosäuren 1-13 zwischen LelF B und LelF F zunutze machen. Ein den trp Promotor enthaltendes Fragment (A) mit geeignet konstruierten Enden wird aus pHGH207 erhalten, das oben beschrieben ist, über die Behandlung mit Pst I und Xba I und anschließende Isolierung eines ca. 1050 Basenpaare enthaltenden Fragments. Ein zweites Fragment (B) steht in dem größeren der beiden durch Behandlung des Plasmids pHky 10 mit Pstl und Bglll entstandenen Fragmente zur Verfügung. Das Fragment A enthält etwa das halbe die Ampicillinresistenz kodierende Gen, während Fragment B den Rest dieses Gens und das vollständige Gen für die Tetracyclinresistenz bis auf den zugehörigen Promotor enthält Die Fragmente A und B werden mittels T4 Ligase kombiniert und das erhaltene Produkt wird mit Xbal und Bglll behandelt, um Dimerisierungen auszuschließen. So entsteht das Fragment (c), welches den trp Promoter-Operator, sowie die Gene für die Tetracyclin- und Ampicillin-Resistenz enthältThe homology of amino acids 1-13 between LelF B and LelF F can be used in the construction of a complete LelF F gene and the direct expression of the corresponding interferon. A fragment (A) containing the trp promoter with suitably constructed ends is obtained from pHGH207, which is described above, by treatment with Pst I and Xba I and subsequent isolation of a fragment containing approximately 1050 base pairs. A second fragment (B) is available in the larger of the two fragments created by treating plasmid pHky 10 with Pstl and Bglll. Fragment A contains about half the gene encoding ampicillin resistance, while fragment B contains the rest of this gene and the complete gene for tetracycline resistance except for the associated promoter. Fragments A and B are combined using T4 ligase and the product obtained is combined with Xbal and Bglll treated to exclude dimerizations. This creates fragment (c), which contains the trp promoter operator and the genes for tetracycline and ampicillin resistance

Ein Fragment (d) mit etwa 580 Basenpaaren wird durch Behandlung von pLelF F mit Avall und Bglll erhalten. Dieses Fragment enthält die Codons für die Aminosäuren 14-166 von LelF F.A fragment (d) of about 580 base pairs is obtained by treating pLelF F with Avall and Bglll. This fragment contains the codons for amino acids 14-166 of LelF F.

Ein Fragment (e) (49 Basenpaare) wird durch Behandlung von pLelF B mit Xbal und Avall erhalten. Dieses Fragment kodiert die Aminosäuren 1-13 von LelF F.A fragment (s) (49 base pairs) is obtained by treating pLelF B with Xbal and Avall. This fragment encodes amino acids 1-13 of LelF F.

Die Fragmente (c), (d) und (e) werden in Gegenwart von T4 Ligase miteinander verbunden. Die kohäsiven Enden der entsprechenden Fragmente sind so beschaffen, daß das entstehende Plasmid in der richtigen Weise gebildet wird, wobei das Gen für Tetracyclin-Resistenz unter die Kontrolle des trp Promoter-Operators gebracht wird, zusammen mit dem Gen für reifes LelF F, so daß die damit transformierten Bakterien auf Grund ihrer Tetracyclin-Resistenz selektioniert werden können. Ein auf diese Weise erhaltener repräsentativer Klon ist E. coli K-12 Stamm 294 pLelF F trp 1. -15-Fragments (c), (d) and (e) are linked together in the presence of T4 ligase. The cohesive ends of the corresponding fragments are such that the resulting plasmid is formed in the correct manner, the gene for tetracycline resistance being brought under the control of the trp promoter operator, together with the gene for mature LelF F, so that the bacteria transformed with it can be selected on the basis of their tetracycline resistance. A representative clone obtained in this way is E. coli K-12 strain 294 pLelF F trp 1. -15-

AT 394 208 BAT 394 208 B

LelFHLelFH

Das für die Expression von reifem LelF H geeignete Gen kann folgendermaßen hergestellt werden: 1. Plasmid pLelF H wird der Behandlung mit Haell und Rsal unterworfen und ein 816 Basenpaareenthaltendes Fragment wird isoliert, welches den Bereich von der Aminosäure 10 des Signalpeptids bis zur 3' nicht codierenden Region kodiert 2. Das Fragment wird denaturiert und der Reparatursynthese mit dem Klenow-Fragment der DNA Polymerase I (Klenow et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. £5., 168 [1970]) unterworfen, bei der der synthetische Deoxyribooligonucleotid-Starter 5'-dATG TGT AAT CTG TCT verwendet wird. 3. Das erhaltene Produkt wird mit Sau3a gespalten und ein 452 Basenpaare-enthaltendes Fragment, das die Aminosäuren 1-150 kodiert wird isoliert. 4. Die Behandlung von pLelF H mit Sau3a und Pstl und die Isolierung eines 500 Basenpaare-enthaltenden Fragments führt zu einem Gen, das die Aminosäuren 150 bis zum Ende der Sequenz kodiert 5. Die in (3) und (4) isolierten Fragmente werden verbunden zu dem folgenden FragmentThe gene suitable for the expression of mature LelF H can be produced as follows: 1. Plasmid pLelF H is subjected to the treatment with Haell and Rsal and an 816 base pair fragment is isolated which does not cover the range from amino acid 10 of the signal peptide to 3 ' coding region encodes 2. The fragment is denatured and subjected to repair synthesis with the Klenow fragment of DNA polymerase I (Klenow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA £ 5., 168 [1970]), in which the synthetic deoxyribooligonucleotide starter 5'-dATG TGT AAT CTG TCT is used. 3. The product obtained is cleaved with Sau3a and a fragment containing 452 base pairs, which encodes amino acids 1-150, is isolated. 4. Treatment of pLelF H with Sau3a and Pstl and isolation of a 500 base pair-containing fragment leads to a gene which encodes amino acids 150 to the end of the sequence. 5. The fragments isolated in (3) and (4) are linked to the following fragment

166 Asp Stop GATTGA166 Asp Stop GATTGA

Pstl , 1Pstl, 1st

Met Cys ATG TGT..With Cys ATG TGT ..

Sau3a das die 166 Aminosäuren des LelF H kodiert 6. pLelF A trp 25 wird zunächst mit Xbal, dann mit DNA Polymerase I und schließlich mit Pst I behandelt. Das resultierende große Fragment kann isoliert und mit dem Produkt aus (5) verbunden werden zu einem Plasmid, mit dem E. coli K-12 Stamm 294 oder ein anderes Bakterium transformiert werden kann, das dann in der Lage ist, reifes LelF H zu exprimieren.Sau3a encoding the 166 amino acids of LelF H 6. pLelF A trp 25 is first treated with Xbal, then with DNA polymerase I and finally with Pst I. The resulting large fragment can be isolated and linked to the product of (5) to a plasmid that can be used to transform E. coli K-12 strain 294 or another bacterium, which is then able to express mature LelF H .

LelFILelFI

Die von Lawn et al., (Cell 15, 1157 [1978]) konstruierte Genbibliothek des menschlichen Genoms im Phagen R Charon 4A wurde nach Leukozyten-Interferon-Genen untersucht, wobei die von Lawn et al. (siehe oben) und Maniatis et al. (Cell 15,687 [1978]) angegebenen Verfahren verwendet wurden. Eine von der cDNS des LelF A-Klons abgeleitete radioaktive LelF-Sonde wurde verwendet, um etwa 5000,000 Plaques zu testen. Sechs LelF-Klone wurden bei diesem Screening erhalten. Nach nochmaligem Screening und Plaque-Reinigung wurde einer dieser Klone, HLeIF2, für die weitere Analyse ausgewählt.The gene library of the human genome in the phage R Charon 4A constructed by Lawn et al., (Cell 15, 1157 [1978]) was investigated for leukocyte interferon genes, the method described by Lawn et al. (see above) and Maniatis et al. (Cell 15,687 [1978]) were used. A radioactive LelF probe derived from the cDNA of the LelF A clone was used to test approximately 5000,000 plaques. Six LelF clones were obtained in this screening. After repeated screening and plaque cleaning, one of these clones, HLeIF2, was selected for further analysis.

Unter Verwendung der oben beschriebenen Methode können andere Sonden verwendet werden, um weitere pLeEF-Klone aus dem menschlichen Genom zu isolieren. Diese wiederum können verwendet werden, um weitere Leukozyten-Interferon-Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung herzustellen. 1. Das 2000 Basenpaare-enthaltende EcoRI-Fragment des Klons HLeIF2 wurde an der EcoRI-Spaltstelle in pBR325 kloniert. Das resultierende Plasmid LelF E wurde mit EcoRI gespalten und das 2000 Basenpaare-enthaltende Fragment isoliert. Das Deoxyoligonukleotid dAATTCTGCAG (ein EcoRI-Pstl-Konverter) wurde an das 2000 Basenpaare-enthaltende EcoRI-Fragment gebunden und das resultierende Fragment mit Pstl gespalten, so daß man ein 2000 Basenpaare-enthaltendes Fragment mit Pstl-Enden erhielt. Dieses wurde mit Sau96 gespalten und ein Fragment aus 1100 Basenpaaren wurde isoliert, welches ein Pstl- und ein Sau96-Ende besaß. 2. Das Plasmid pLelF C trp 35 wurde mit Pstl und Xbal behandelt. Das große Fragment wurde isoliert. 3. Das kleine Xbal-Pstl-Fragment aus pLelF C trp 35 wurde mit Xbal und Sau96 behandelt. Ein 40 Basenpaare-enthaltendes Xbal-Sau96-Fragment wurde isoliert. 4. Die unter (1), (2) und (3) isolierten Fragmente wurden verbunden zu dem Plasmid pLelF I trp 1.Using the method described above, other probes can be used to isolate additional pLeEF clones from the human genome. These in turn can be used to produce further leukocyte interferon proteins according to the present invention. 1. The 2000 base pair EcoRI fragment of clone HLeIF2 was cloned into pBR325 at the EcoRI site. The resulting plasmid LelF E was digested with EcoRI and the fragment containing 2000 base pairs isolated. The deoxyoligonucleotide dAATTCTGCAG (an EcoRI-Pstl converter) was bound to the 2000 base pair-containing EcoRI fragment and the resulting fragment was cleaved with PstI to give a 2000 base pair-containing fragment with PstI ends. This was digested with Sau96 and a fragment of 1100 base pairs was isolated, which had a Pstl and a Sau96 end. 2. The plasmid pLelF C trp 35 was treated with Pstl and Xbal. The large fragment was isolated. 3. The small Xbal-Pstl fragment from pLelF C trp 35 was treated with Xbal and Sau96. An Xbal-Sau96 fragment containing 40 base pairs was isolated. 4. The fragments isolated under (1), (2) and (3) were combined to form the plasmid pLelF I trp 1.

LelF J 1. Das Plasmid pLelF J enthält ein aus 3800 Basen bestehendes Hindlll-Fragment des menschlichen Genoms, welches die LelF J Gensequenz umfaßt. Ein 760 Basenpaare-enthaltendes Ddel-Rsal-Fragment wurde aus diesem Plasmid isoliert 2. Das Plasmid pLelF B trp 7 wurde mit Hindlll und Ddel gespalten und ein 340 Basenpaare-enthaltendes Hindlll-Ddel-Fragment isoliert -16-LelF J 1. The plasmid pLelF J contains a HindIII fragment of the human genome consisting of 3800 bases, which comprises the LelF J gene sequence. A 760 base pair-containing Ddel-Rsal fragment was isolated from this plasmid 2. The plasmid pLelF B trp 7 was cleaved with Hindlll and Ddel and a 340 base pair-containing Hindlll-Ddel fragment was isolated -16-

AT 394 208 B 3. Das Plasmid pBR322 wurde mit Pstl gespalten, die Enden wurden abgespalten durch Inkubation mit DNA-Polymerase I (Klenow Fragment) und schließlich wurde mit Hindlll behandelt. Das große, etwa 3600 Basenpaare-enthaltende Fragment wurde isoliert 4. Die Fragmente aus (1), (2) und (3) wurden miteinander verbunden zu dem Plasmid pLelF J trp 1. M. ReinigungAT 394 208 B 3. The plasmid pBR322 was cleaved with Pstl, the ends were cleaved off by incubation with DNA polymerase I (Klenow fragment) and finally treated with HindIII. The large, approximately 3600 base pair fragment was isolated 4. The fragments from (1), (2) and (3) were linked together to form the plasmid pLelF J trp 1. M. Purification

Der Leukozyten-Interferon-Gehalt von Bakterienextrakten kann durch die folgenden Maßnahmen in der angegebenen Reihenfolge erhöht werden: 1. Polyethyleniminfällung, bei der der größte Teil der cellularen Proteine, einschließlich des Interferons, im Überstand verbleibt 2. Amoniumsulfatfraktionierung, wobei das Interferon bei einer Sättigung von 55 % mit Ammoniumsulfat aus der Lösung ausfällt 3. Suspendierung des Ammoniumsulfatkuchens in 0,06 M Kaliumphosphat, 10 mM Tris-HCl (pH 7,2) und Dialyse gegen 25 mM Tris-HCl (pH 7,9), wobei die Interferonaktivität in der Lösung bleibt 4. Chromatographie des Überstandes, auf ein pH von 8,5 eingestellt, an einer DEAE-Cellulose-Säule (Elution mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,2 M NaCl in 25 mM Tris-HCl, pH 8,5). 5. Adsorption an Cibachrom Blau-Agarose bzw. Hydroxylapatit und Elution mit 1,5 M KCl bzw. 0,2 M Phosphatlösung (fakultativ). 6. Fraktionierung an einer Sephadex® G-75 Säule. 7. Kationenaustauschchromatographie an CM-Cellulose in 25 mM Ammoniumacetat bei pH 5,0 mit einem Ammoniumacetatgradienten (bis zu 0,2 M Ammoniumacetat).The leukocyte interferon content of bacterial extracts can be increased by the following measures in the order given: 1. Polyethyleneimine precipitation, in which most of the cellular proteins, including the interferon, remain in the supernatant. 2. Ammonium sulfate fractionation, the interferon being saturated of 55% with ammonium sulfate fails from the solution 3. Suspension of the ammonium sulfate cake in 0.06 M potassium phosphate, 10 mM Tris-HCl (pH 7.2) and dialysis against 25 mM Tris-HCl (pH 7.9), the interferon activity 4. Chromatography of the supernatant, adjusted to a pH of 8.5, remains in the solution on a DEAE cellulose column (elution with a linear gradient from 0 to 0.2 M NaCl in 25 mM Tris-HCl, pH 8, 5). 5. Adsorption on cibachrome blue agarose or hydroxylapatite and elution with 1.5 M KCl or 0.2 M phosphate solution (optional). 6. Fractionation on a Sephadex® G-75 column. 7. Cation exchange chromatography on CM cellulose in 25 mM ammonium acetate at pH 5.0 with an ammonium acetate gradient (up to 0.2 M ammonium acetate).

Nach dem vorstehend angegebenen Verfahren erhält man ein Material von einer Reinheit mit über 95 %.According to the above-mentioned process, a material with a purity of over 95% is obtained.

Das Material kann auch gereinigt werden durch Größenausschluß-Chromatographie, HPLC an umgekehrten Phasen (RP-8) oder Affinitätschromatographie an immobilisierten Antiinterferon-Antiköipem.The material can also be purified by size exclusion chromatography, reverse phase HPLC (RP-8) or affinity chromatography on immobilized antiinterferon antibodies.

Ferner kann das nach Absatz 4 oben erhaltene Material auf eine Säule monoklonaler Antikörper gebracht werden, die, wie von Milstein in Scientific American 243. 66 (1980) beschrieben, hergestellt wird und mit 0,2 M Essigsäure, 0,1 % Triton und 0,15 M NaCl eluiert werden.Furthermore, the material obtained according to paragraph 4 above can be applied to a column of monoclonal antibodies, which is produced as described by Milstein in Scientific American 243.66 (1980) and with 0.2 M acetic acid, 0.1% Triton and 0 , 15 M NaCl can be eluted.

In einem anderen, bevorzugten Verfahren kann das erfindungsgemäß erhaltene Interferon folgendermaßen gereinigt werden: 1. Gefrorenes Zellmaterial wird mechanisch zerkleinert. Die teilweise aufgetauten Zellen werden in dem vierfachen Volumen des Puffers A, enthaltend 0,1 M Tris (pH 7,5-8,0), 10 % (w/v) Saccharose, 0,2 M NaCl, 5 mM EDTA, 0,1 mM PMSF und 10-100 mM MgC^, suspendiert. Die Suspension wird dann 2 x bei 4 °C unter einem Druck von etwa 400 und weniger als 70 Atmosphären durch einen Homogenisator gegeben und schließlich in einem Eisbad gekühlt. 2. Dem Homogenisat wird langsam Polyethylenimin bis zu einer Konzentration von etwa 0,35 % zugesetzL Das Gemisch wird stehengelassen und die Feststoffe werden durch Zentrifugieren und Filtration getrennt. Bei diesem Schritt wird die Temperatur unter 10 °C gehalten. Der Überstand (bzw. das Filtrat) wird durch Ultrafiltration auf etwa ein Zehntel des ursprünglichen Volumens konzentriert. Die Lösung wird notfalls noch einmal durch eine mikroporöse Membran filtriert. 3. Die klare Lösung wird direkt auf eine Säule monoklonaler Antikörper bei einer Durchflußrate von 5-8 cm/Stunde (z. B. 25-40 ml pro Stunde bei einem Säulendurchmesser von 2,6 cm) gegeben. Es wird mit dem etwa zehnfachen Säulenvolumen einer Lösung, die 25 mM Tris-HCl (pH 7,5-8,5), 0,5 M NaCl und 0,2 % eines Detergenzes, wie Triton X-100 enthält, gewaschen. Anschließend wird mit dem etwa zehnfachen Säulenvolumen einer Lösung, die 0,15 M NaCl und 0,1 % eines Detergenzes, wie Triton® X-100, enthält gespült. Die Säule wird dann mit 0,2 M Essigsäure, enthaltend 0,1 % eines Detergenzes, wie Triton® X-100, eluiert Die proteinhaltigen Fraktionen werden zusammengefaßt und mit 1N NaOH oder 1,0 M Tris-Base auf einen pH von etwa 4,5 gebracht. 4. Diese Fraktion wird dann auf einen Kationenaustauscher, beispielsweise Whatmann CM52-Cellulose, der vorher mit einem geeigneten Puffer, beispielsweise Ammoniumacetat, pH 4,5 (50 mM), äquilibriert wurde, gebracht Es wurde dann mit dem Puffer so lange gewaschen, bis die UV-Absorption im Eluat konstant war. Die Säule wurde dann mit 25 mM Ammoniumacetat/0,12 M Natriumchlorid eluiert und das Eluat wurde in üblicher Weise aufgearbeitetIn another preferred method, the interferon obtained according to the invention can be purified as follows: 1. Frozen cell material is mechanically comminuted. The partially thawed cells are in four times the volume of buffer A, containing 0.1 M Tris (pH 7.5-8.0), 10% (w / v) sucrose, 0.2 M NaCl, 5 mM EDTA, 0 , 1 mM PMSF and 10-100 mM MgC ^, suspended. The suspension is then passed through a homogenizer twice at 4 ° C. under a pressure of about 400 and less than 70 atmospheres and finally cooled in an ice bath. 2. Polyethyleneimine is slowly added to the homogenate to a concentration of about 0.35%. The mixture is left to stand and the solids are separated by centrifugation and filtration. In this step the temperature is kept below 10 ° C. The supernatant (or the filtrate) is concentrated by ultrafiltration to about a tenth of the original volume. If necessary, the solution is filtered again through a microporous membrane. 3. The clear solution is applied directly to a column of monoclonal antibodies at a flow rate of 5-8 cm / hour (e.g. 25-40 ml per hour with a column diameter of 2.6 cm). It is washed with about ten times the column volume of a solution containing 25 mM Tris-HCl (pH 7.5-8.5), 0.5 M NaCl and 0.2% of a detergent such as Triton X-100. It is then rinsed with about ten times the column volume of a solution which contains 0.15 M NaCl and 0.1% of a detergent, such as Triton® X-100. The column is then eluted with 0.2 M acetic acid containing 0.1% of a detergent such as Triton® X-100. The protein-containing fractions are pooled and adjusted to a pH of about 4 with 1N NaOH or 1.0 M Tris base , 5 brought. 4. This fraction is then placed on a cation exchanger, for example Whatmann CM52 cellulose, which has previously been equilibrated with a suitable buffer, for example ammonium acetate, pH 4.5 (50 mM). It was then washed with the buffer until the UV absorption in the eluate was constant. The column was then eluted with 25 mM ammonium acetate / 0.12 M sodium chloride and the eluate was worked up in the usual manner

Die in der bevorzugten Ausführungsform verwendeten monoklonalen Antikörper können nach dem von Staehelin et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 2S, 1848-52 (1981) beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Die Reinigung und Bindung der monoklonalen Antikörper an Affigel-10 wird im folgenden beschrieben. -17-The monoclonal antibodies used in the preferred embodiment can be prepared according to the method described by Staehelin et al., Proc. Natl. Acad. Be. U.S.A. 2S, 1848-52 (1981). The purification and binding of the monoclonal antibodies to Affigel-10 is described below. -17-

AT 394 208 BAT 394 208 B

Gewinnung und Reinigung monoklonaler Antikörper aus Aszites-Flüssigkeit Fünf weibliche Balb/c Mäuse wurden jeweils mit 5-10 x 10^ Hybridomzellen aus der Mitte der lo- garithmischen Wachstumsphase inokuliert. Weitere Mäuse (10 oder mehr) wurden jeweils mit 5 x 10^ lebensfähigen Zellen, die aus der von inokulierten Mäusen hergestellten Flüssigkeit gewonnen wurden, intraperitoneal inokuliert.Obtaining and Purifying Monoclonal Antibodies from Ascites Fluid Five female Balb / c mice were each inoculated with 5-10 x 10 ^ hybridoma cells from the middle of the logithmic growth phase. Additional mice (10 or more) were in each case intraperitoneally inoculated with 5 x 10 ^ viable cells, which were obtained from the liquid produced by inoculated mice.

Die Aszites-Flüssigkeit jeder Maus wurde gesammelt. Die Flüssigkeit wurde zunächst 15 Minuten mit 500-1000 x g und dann 90 Minuten mit 18000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Der Überstand wurde gefroren und bei -20 °C aufbewahrt. Nach dem Auftauen wurde weiteres festes Material durch 90 minütiges Zentrifugieren mit 35000 Umdrehungen pro Minute entfernt. Die von jeder Maus erhaltenen einzelnen Batches wurden auf spezifische Antikörperaktivität nach einem Festphasenantikörperbindungstest (Staehelin et al., siehe oben) getestet und, wenn möglich, zusammengefaßt.The ascites fluid from each mouse was collected. The liquid was centrifuged at 500-1000 x g for 15 minutes and then at 18000 rpm for 90 minutes. The supernatant was frozen and stored at -20 ° C. After thawing, further solid material was removed by centrifugation at 35,000 revolutions per minute for 90 minutes. The individual batches obtained from each mouse were tested for specific antibody activity after a solid-phase antibody binding test (Staehelin et al., See above) and, if possible, summarized.

Die Proteinkonzentrationen der Lösungen wurden annäherungsweise bestimmt, wobei man davon ausging, daß in einer 1 cm-Küvette 1 mg Protein eine Absorption von 1,2 bei 280 nm lieferte. Aszites-Flüssigkeiten mit einem hohen Antikörpergehalt enthielten 30-35 mg Protein/ml. Dies entspricht etwa 4-7 mg spezifischem Antikörper/ml. Die Flüssigkeit wurde verdünnt mit PBS (0,01 M Natriumphosphat, pH 7,3,0,15 M NaCI) auf eine Proteinkonzentration von 10-12 mg/ml.The protein concentrations of the solutions were approximately determined, assuming that 1 mg of protein in an 1 cm cell gave an absorption of 1.2 at 280 nm. Ascites fluids with a high antibody content contained 30-35 mg protein / ml. This corresponds to approximately 4-7 mg specific antibody / ml. The liquid was diluted with PBS (0.01 M sodium phosphate, pH 7.3.0.15 M NaCl) to a protein concentration of 10-12 mg / ml.

Zu je 100 ml der verdünnten Lösungen wurden bei 0 °C unter starkem Rühren langsam 90 ml von bei Zimmertemperatur gesättigter Ammoniumsulfatlösung gegeben. Die Suspension wurde während 40-70 Minuten in Eis aufbewahrt, dann während 15 Minuten bei 4 °C mit 10,000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert. Der Proteinkuchen wurde in 0,02 M Tris-HCl (pH 7,9)/0,04 M NaCI (Puffer I) gelöst und die Proteinlösung während 16-18 Stunden bei Raumtemperatur gegen 100 Volumina des Puffers I dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde 10 Minuten mit 15,000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Etwa 30-35 % des ursprünglichen Gesamtproteingehalts der Aszites-Flüssigkeit wurde wiedergefunden mittels Messung der Absorption bei 280 nm.90 ml of ammonium sulfate solution saturated at room temperature were slowly added to each 100 ml of the diluted solutions at 0 ° C. with vigorous stirring. The suspension was kept in ice for 40-70 minutes, then centrifuged for 15 minutes at 4 ° C at 10,000 rpm. The supernatant was decanted. The protein cake was dissolved in 0.02 M Tris-HCl (pH 7.9) / 0.04 M NaCl (buffer I) and the protein solution dialyzed against 100 volumes of buffer I at room temperature for 16-18 hours. The dialyzed solution was centrifuged at 15,000 revolutions per minute for 10 minutes. About 30-35% of the original total protein content of the ascites fluid was recovered by measuring the absorbance at 280 nm.

Eine Lösung, enthaltend 30-40 mg Protein/ml wurde dann auf eine DEAE-Cellulosesäule, die mit Puffer I äquilibriert war, gegeben, wobei für jeweils 1 g Protein mindestens ein Säulenvolumen von 100 ml verwendet wurde. Der Antikörper wurde von der Säule mit einem linearen NaCl-Gradienten (0,04 M-0,5 M) in 0,02 M Tris-HCl (pH 7,9) eluiert. Die Fraktionen mit einem NaCl-Gehalt von 0,06-0,1 M wurden zusammengefaßt, konzentriert und mit bei Zimmertemperatur gesättigter Ammoniumsulfatlösung versetzt. Es wurde zentrifugiert, der Proteinkuchen wurde in 0,2 M NaHCOj (pH etwa 8,0)/0,3 M NaCI (Puffer II) gelöst und bei Raumtemperatur gegen diesen Puffer dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde 15 Minuten lang mit 20,000 x g zentrifugiert und der Proteingehalt wurde auf 20-25 mg/ml mit Puffer II eingestelltA solution containing 30-40 mg protein / ml was then placed on a DEAE cellulose column equilibrated with buffer I, using at least a column volume of 100 ml for every 1 g protein. The antibody was eluted from the column with a linear NaCl gradient (0.04 M-0.5 M) in 0.02 M Tris-HCl (pH 7.9). The fractions with an NaCl content of 0.06-0.1 M were pooled, concentrated and mixed with ammonium sulfate solution saturated at room temperature. It was centrifuged, the protein cake was dissolved in 0.2 M NaHCOj (pH about 8.0) / 0.3 M NaCl (buffer II) and dialyzed against this buffer at room temperature. The dialyzed solution was centrifuged at 20,000 x g for 15 minutes and the protein content was adjusted to 20-25 mg / ml with buffer II

Herstellung von ImmunadsorbentienManufacture of immunoadsorbents

Affigel-10 (BioRad Laboratories, Richmond, Kalifornien) wurde auf einem gesinterten Glasfilter dreimal mit eiskaltem Isopropanol und dreimal mit eiskaltem destilliertem Wasser gewaschen. Das Gel, das noch etwa 50 % Wasser enthielt, wurde in Plastikröhrchen übergeführt und durch kurzes Zentrifugieren sedimentiert. Der Überstand wurde verdunstet Das gepackte Gel wurde mit einem gleichen Volumen gereinigter Antikörperlösung gemischt und während 5 Stunden bei 4 °C Ende-über-Ende rotieren gelassen. Nach der Reaktion wurde das Gel zentrifugiert und zweimal mit Puffer III (0,1 M NaHCOj/O.lS M NaCI) gewaschen, um nicht-gebundene Antikörper zu entfernen. Die Proteinbestimmung zeigte, daß mehr als 90 % des Anükörpers an das Gel gebunden worden war.Affigel-10 (BioRad Laboratories, Richmond, California) was washed on a sintered glass filter three times with ice cold isopropanol and three times with ice cold distilled water. The gel, which still contained about 50% water, was transferred to plastic tubes and sedimented by briefly centrifuging. The supernatant was evaporated. The packed gel was mixed with an equal volume of purified antibody solution and rotated end-to-end at 4 ° C for 5 hours. After the reaction, the gel was centrifuged and washed twice with buffer III (0.1 M NaHCOj / O. IS M NaCl) to remove unbound antibodies. Protein determination showed that more than 90% of the body had been bound to the gel.

Um noch freie, reaktive Bindungsstellen abzusättigen, wurde das Gel mit einem gleichen Volumen 0,1 M Ethanolamin-HCl (pH 8) gemischt und während 60 Minuten bei Raumtemperatur Ende-über-Ende rotieren gelassen. Schließlich wurde das Gel mit PBS gewaschen und bei 4 °C in PBS in Gegenwart von 0,02 % (w/v) Natriumazid aufbewahrt. N. Parenterale ApplikationIn order to saturate free, reactive binding sites, the gel was mixed with an equal volume of 0.1 M ethanolamine-HCl (pH 8) and rotated end-to-end for 60 minutes at room temperature. Finally, the gel was washed with PBS and stored at 4 ° C in PBS in the presence of 0.02% (w / v) sodium azide. N. Parenteral application

LelF kann parenteral verabreicht werden an Individuen, die eine Antitumor- oder antivirale Behandlung benötigen und an solche, die immunsuppresive Zustände aufweisen. Die Dosierung der erfindungsgemäßen Interferone kann sich an die des zur Zeit in klinischer Prüfung befindlichen Materials, das aus menschlichen Leukozyten gewonnen wurde, anlehnen und kann z. B. etwa 1-10 x 10^ Einheiten pro Tag, im Fall von Material mit einer Reinheit, die größer ist als 1 %, bis zu etwa 5 x 10^ Einheiten pro Tag betragen.LelF can be administered parenterally to individuals who need antitumor or antiviral treatment and to those who have immunosuppressive conditions. The dosage of the interferons according to the invention can be based on that of the material currently in clinical investigation, which was obtained from human leukocytes, and can e.g. B. about 1-10 x 10 ^ units per day, in the case of material with a purity that is greater than 1%, up to about 5 x 10 ^ units per day.

Ein für die parenterale Applikation geeignetes Präparat kann beispielsweise dadurch hergestellt werden, daß man 3 mg bakteriell hergestelltes LelF mit einer spezifischen Aktivität von etwa 2x10^ Einheiten pro mg in 25 ml 5 N humanem Serumalbumin löst, die Lösung durch ein bakteriologisches Filter gibt und die filtrierte Lösung aseptisch in 100 Ampullen abfüllt, von denen jede 6 x 10^ Einheiten reines Interferon enthält. Die Ampullen werden vorzugsweise in der Kälte (-20 °C) aufbewahrt. -18-A preparation suitable for parenteral administration can be prepared, for example, by dissolving 3 mg of bacterially produced LelF with a specific activity of about 2x10 ^ units per mg in 25 ml of 5 N human serum albumin, passing the solution through a bacteriological filter and filtering it Fill the solution aseptically into 100 ampoules, each containing 6 x 10 ^ units of pure interferon. The ampoules are preferably stored in the cold (-20 ° C). -18-

Claims (16)

AT 394 208 B Die Herstellung pharmazeutischer Präparate, die erfindungsgemäße Verbindungen enthalten, kann nach den allgemein bekannten Methoden der Galenik unter Verwendung der üblichen Hilfs- und Trägermaterialien, wie sie in der einschlägigen Literatur beschrieben sind, erfolgen. PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung eines replikablen, in einem Mikroorganismus die Expression eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz eines reifen Human-Leukozyten-Interferons bewirkenden Vektors, dadurch gekennzeichnet, daß man eine dieses Polypeptid codierende erste DNS-Sequenz operabel mit einer zweiten DNS-Sequenz, die die für die Expression notwendigen Codons enthält, verbindet.AT 394 208 B Pharmaceutical preparations containing compounds according to the invention can be prepared by the generally known methods of galenics using the customary auxiliary and carrier materials as described in the relevant literature. 1. A method for producing a replicable vector which in a microorganism causes the expression of a polypeptide with the amino acid sequence of a mature human leukocyte interferon, characterized in that a first DNA sequence coding for this polypeptide is operable with a second DNA sequence, which contains the codons necessary for expression. 2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite DNS-Sequenz die Expression in einem Bakterium bewirkt.2. The method according to claim 1, characterized in that the second DNA sequence causes expression in a bacterium. 3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Bakterium E. coli ist.3. The method according to claim 2, characterized in that the bacterium is E. coli. 4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid die Aminosäuresequenz eines aminoendständig um Methionin verlängerten reifen Human-Leukozyten-Interferons besitzt.4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the polypeptide has the amino acid sequence of an amino terminal extended by methionine mature human leukocyte interferon. 5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid die Aminosäuresequenz eines aminoendständig um ein abspaltbares Konjugat oder ein mikrobielles Signalprotein verlängertes reifes Human-Leukozyten-Interferon besitzt.5. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the polypeptide has the amino acid sequence of an amino terminal extended by a cleavable conjugate or a microbial signal protein mature human leukocyte interferon. 6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid die Aminosäurepartialsequenz Cys-Ala-Trp-Glu-Val-Val-Arg-Ala-Glu-Ile-Met-Arg-Ser enthält.6. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the polypeptide contains the amino acid partial sequence Cys-Ala-Trp-Glu-Val-Val-Arg-Ala-Glu-Ile-Met-Arg-Ser. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid die in Figur 4 in Zeile &quot;All&quot; angegebenen Aminosäuren an den angebenen Stellen der Aminosäuresequenz enthält.7. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the polypeptide which in Figure 4 in line &quot; All &quot; contains specified amino acids at the specified positions in the amino acid sequence. 8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid Human-Leukozyten-Interferon (LelF) A, B, C, D, F, Η, I oder J ist.8. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the polypeptide is human leukocyte interferon (LelF) A, B, C, D, F, Η, I or J. 9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Human-Leukozyten-Interferon A (LelF A) exprimiert wird.9. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that human leukocyte interferon A (LelF A) is expressed. 10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Human-Leukozyten-Interferon B (LelF B) exprimiert wird.10. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that human leukocyte interferon B (LelF B) is expressed. 11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Human-Leukozyten-Interferon C (LelF C) exprimiert wird.11. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that human leukocyte interferon C (LelF C) is expressed. 12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Human-Leukozyten-Interferon D (LelF D) exprimiert wird.12. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that human leukocyte interferon D (LelF D) is expressed. 13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Human-Leukozyten-Interferon F (LelF F) exprimiert wird.13. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that human leukocyte interferon F (LelF F) is expressed. 14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Human-Leukozyten-Interferon H (LelF H) exprimiert wird.14. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that human leukocyte interferon H (LelF H) is expressed. 15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Human-Leukozyten-Interferon I (LelF I) exprimiert wird. -19- 5 AT 394 208 B15. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that human leukocyte interferon I (LelF I) is expressed. -19- 5 AT 394 208 B 16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Human-Leukozyten-Interferon J (LelF J) exprimiert wird. Hiezu 10 Blatt Zeichnungen -20-16. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that human leukocyte interferon J (LelF J) is expressed. Add 10 sheets of drawings -20-