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Superoxyddismutasen, beispielsweise die von Markovitz (J. Biol. Chem. 234, S. 40, 1959) aus Rindererythroeyten und die von Keele und Fridovich (J. Biol. Chem. 245, S. 6176,1970), aus Escherichia coli gewonnenen Superoxyddismutasen, hemmen die nach der Gleichung 20-+ 2H+-H +02 ablaufende Dismutation von Superoxydionen, welche bei unter dem Einfluss von molekularem Sauerstoff ablau- fenden Oxydationsreaktionen entstehen und vor allem in Nahrungsmitteln zu einem raschen Abbau der Nucleisäuren und der Proteine führen, wobei in den Proteinen vorwiegend das Tryptophan oxydiert wird. Die Pa-
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jeglichenlipidische, proteinische oder lipoproteinische Nahrungsmittel sowie andere oxydierbare Stoffe oder Stoffge- mische wirken.
Dementsprechend bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zum Behindern der Autoxydation von einem Abbau durch Oxydation unter dem Einfluss von Superoxydionen ausgesetzten Substanzen und dieses Ver- fahren ist gemäss der Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass man mit den Substanzen, beispielsweise Nah- rungsmitteln, insbesondere lipidischen, proteinischen oder lipoproteinischen Nahrungsmitteln, Bakterien oder Viren, oder für das Wachstum von Zellen benutzten Kulturmedien, 1 bis 200 Einheiten mindestens einer
Superoxyddismutase je Gramm oder Milliliter Substanz vereinigt. Im Rahmen des erfindungsgemässen Ver- fahrens können als einemAbbau durch Oxydation ausgesetzte Substanzen Lipide und/oder Verbindungen, die
Insbesondere in der Lebensmittelindustrie als Antioxydantien dienen oder Antioxydantien aus Pyrogallol oder
Ascorbinsäure eingesetzt werden.
Solche üblicherweise in der Nahrungsmittelindustrie verwendetenAnti- oxydantien können statt erwartungsgemäss eine Oxydation der Nahrungsmittel zu verhindern, diese Oxydation von Nahrungsmitteln gegen jede Erwartung, sei es im Zusammenwirken mit Enzymen oder sei es unter dem
Einfluss von Metallionen, sogar begünstigen, werden jedoch in Anwesenheit einer Superoxyddismutase daran gehindert.
Eine besonders gute Behinderung der Autooxydationvon einem Abbau durch Oxydation unter dem Einfluss von Superoxydionen ausgesetzten Substanzen ergibt sich dann, wenn gemäss der Erfindung die Superoxyddis- mutase in die einem Abbau durch Oxydation ausgesetzte Substanz im Verhältnis von 1 bis 100 Einheiten
Superoxyddismutaseenzym je Milliliter oder Gramm Substanz eingebracht wird.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird eine aus Seebakte- rienstämmen, Escherichia coli, Pilzen oder Blutextrakten, insbesondere Erythrocupreinen, extrahierte Su- peroxyddismutase eingesetzt, da sich derartige Superoxyddismutasen als besonders wirksam erwiesen ha- ben. Von diesen Superoxyddismutasen sind vor allem die aus Seebakterienstämmen extrahierten Superoxyd- dismutasen besonders brauchbar, von welchen wieder die aus den Seebakterienstämmen Photobacterium leiognathi, Photobacteriumphosphoreum oder Photobacterium sepia, insbesondere Photobacterium leiognathi Nr. ATCC25521, PhotobacteriumphosphoreumNr. ATCC11040oderPhotobacteriumsepia Nr. ATCC 15 709 extrahierten Superoxyddismutasen besonders wirksam sind.
Superoxyddismutasen aus Seebakterien können entsprechend der AT-PS Nr. 339242 der Patentinhaberin hergestellt werden.
Die Superoxyddismutase-Wirkung der erfindungsgemäss eingesetzten Superoxyddismutasen wurde dadurch ermittelt, dass die Chemolumineszenz in einem Sauerstoff, Hypoxanthin, Xanthinoxydase und Luminol (auch als 5-Amino-2, 3-dihydro-phthalazin-1, 4-dionoder 5-Amino-phthalsäurehydrazid bezeichnet) enthaltenen wässerigem Reaktionsgemisch durch Zusetzen der zu prüfenden Superoxyddismutase zum Reaktionsgemisch abgeschwächt wurde und als eine Superoxyddismutase-Einheit willkürlich jene Menge an Superoxyddismutase definiert wurde, welche die Chemolumineszenz um 50% abschwächte.
Im einzelnen wurde hiebei so vorge- gangen, dass einem aus
0, 3 ml wässeriger, 10-3 -molarer Luminollösung,
0, 3 ml wässerigem, 10-3 -molarem Phosphatpuffer von pH = 7, 8, 0, 3 ml wässeriger, 10's-molarer Lösung von Äthylendiamintetraessigsäure,
1, 0 ml Wasser und
0,050 ml einer wässerigen Lösung von Xanthinoxydase (1 mg/ml),
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in einer versilberten Küvette hergestellten Gemisch bei Durchführung des Blindversuches lediglich 1 ml einer 3.
10-4-molaren wässerigen Lösung von Hypoxanthin und bei Bestimmung der Superoxyddismutasewir- kung einer Superoxyddismutase dem Gemisch zunächst 5 gl einer wässerigen Lösung der zu prüfenden Super- oxyddlsmutase und dann 1 ml der erwähnten wässerigen Lösung von Hypoxanthin zugesetzt wurde, worauf die
Küvette vor das Objektiv eines Photovervielfachers gesetzt, der sich beim Blindversuch und der sich beim
Istversuch einstellende Strom, welcher In der Grössenordnung von 10-7 bis 10-8 A liegt, registriert und aus den erhaltenen Messwerten die in der Lösung der zu prüfenden Superoxyddismutase enthaltenen Einheiten an
Superoxyddismutase unter Berücksichtigung des Umstandes errechnet wurden,
dass bis zu einer Verringerung der Chemolumineszenz um 50% die erzielte Verringerung der Chemolumineszenz proportional der Konzen- tration an Superoxyddismutase in der zu prüfenden Lösung ist und, wie erwähnt, als Superoxyddismutaseein- heit willkürlich jene Menge an Superoxyddismutase definiert ist, welche unter den angegebenen Versuchsbe- dingungen die Chemolumineszenz um 50% verringert.
Das erfindungsgemässe Verfahren wird im folgenden durch Ausführungsbeispiele näher erläutert.
Beispiel l : 5 g frische Champignons ("Champignons de Paris") wurden in feine Scheiben zerschnit- ten und von den bei der späteren colorimetrischen Prüfung störenden farbigen Lamellen befreit, worauf die
Pilzscheiben auf mehrere Bechergläser von 100 ml Fassungsraum verteilt und in jedes der Bechergläser
50ml eines 0, 02 Gew.-% Ascorbinsäure enthaltenden 0, 01 molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 7, 8 einge- bracht wurden. In eines der Bechergläser wurden zusätzlich 50 Einheiten Superoxyddismutase aus Photobac- terium leiognathi Nr. ATCC 25 521 eingebracht. Die Bechergläser wurden sodann mit einem gefalteten Pa- pierblatt bedeckt und 40 h bei Raumtemperatur stehengelassen, worauf die optische Dichte der überstehen- den Flüssigkeitin einem jeden Becherglas mit Licht der Wellenlänge 600 nm bestimmt wurde.
Hiebei zeigte sich, dass die optische Dichte der Flüssigkeit in den Vergleichszwecken dienenden Bechergläsern, also in den keine Superoxyddismutase enthaltenden Lösungen, im Mittel um 0, 13 angestiegen war, wogegen die optische
Dichte der Superoxyddismutase enthaltenden Flüssigkeit um 0, 092 angestiegen war. Das Ausmass der Oxydation konnte somit durch die zugesetzte Superoxyddismutase um 47% verringert werden.
Beispiel 2 : ApfelscheibenwurdenineineneinenPH-Wertvon7, 8besitzendenundpromillillterdrei
Einheiten Superoxyddismutase aus Photobacterium leiognathi Nr. ATCC 25 521 enthaltenden Phosphatpuffer einige Minuten eingelegt, dann dem Puffer entnommen und In Petrischalen gelegt, wo sie einige Tage belassen wurden. ImAnschluss daran wurde das Aussehen der In erfindungsgemässer Weise behandelten Apfelscheiben mit dem Aussehen von in gleicher Weise, jedoch ohne Verwendung einer Superoxyddismutase zubereiteten Apfelscheiben verglichen, wobei die nicht in erfindungsgemässer Weise behandelten Apfelscheibenstärker braun verfärbt werden als die in erfindungsgemässer Weise behandelten Apfelscheiben.
Beispiel 3 : Runde Kartoffelscheiben wurden in Bechergläser eingelegt, in welche zuvor ein einen pH-Wert von 7, 8 besitzender und pro Milliliter 3 Einheiten Superoxyddismutase aus Photobacterium leiognathi Nr. ATCC 25 521 eingebracht worden war, worauf die Kartoffelscheiben nach einigen Minuten den Bechergläsern entnommen und in Petrischalen eingelegt wurden, wo sie 4 Tage belassen wurden. Die so in erfindungsgemässer Weise behandelten Kartoffelscheiben wurden mit an sichin gleicher Weise, jedoch in Abwesenheit einer Superoxyddismutase behandelten Kartoffelscheiben verglichen und erwiesen sich als weniger oxydiert als die letztgenannten.
Beispiel 4 : In diesem Beispiel wurde die Behinderung der Autoxydation von lipoproteinischen Nahrungsmitteln am Modellfall von t-RNS-Hefeligasen untersucht, welche Lipoproteine darstellen, deren Enzymwirkung durch Oxydation, wobei vor allem der Lipidantell angegriffen wird, beeinträchtigt wird, womit es möglich wird, durch Vergleich der Enzymwirkung nicht oxydierter t-RNS-Hefeligasen mit der Enzymwirkung oxydierter t-RNS-Hefeligasen, die durch eine Superoxyddismutase erzielte Behinderung der Autoxydation quantitativ zu bewerten.
Die hiebei verwendeten t-RNS-Hefeligasen wurden aus Saccharomycetes cerevisiae in folgender Weise gewonnen. Saccharomycetes cerevisiae Nr. ATCC 9841 wurde in einem 30 g Glucose und 5 g Hefeextrakt enthal- tenden Nährmedium während der Halbwertszeit des logarithmisch ansteigenden Wachstums gezüchtet, worauf die Hefezellen aus dem Nährmedium abzentrifugiert und 67 g der erhaltenen Hefezellen in 67 ml eines an Tris [Tris (hydroxymethyl) aminomethan] 0,01 molaren, an MgCl2 0, 01 molaren, an EDTA (Äthylendiamintetraessigsäure) 0,001 molaren, an Phenylmethylsulfoniumfluorid 0,002 molaren und 10 Gew.-% Glycerin
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gebracht worden war, aufgegeben,
worauf zunächst die Kolonnenfüllung mit 370 ml des genannten Puffers gewaschen und anschliessend aus der Kolonne die Ligasen mittels eines an Kaliumphosphat 0,25 molaren, an MercaptoäthanolO,02molarenundanMgCl 0, 001molarenund 10Gew.-% Glycerlnenthaltenen Puffers eluiert wurden.
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Die Enzymwirkung der Hefeligase enthaltenden Fraktion, also deren Fähigkeit, in Anwesenheit eines Nukleosidtriphosphats aus AminosäurenPeptidketten aufzubauen, wurde in 0, lml einer 0,05 Mol 3-Morpholino-propyl-schwefelsäure, 0,01 Mol Mg12, 0, 02 Mol ATP (Adenosintriphosphorsäure) und 0,0004 Mol mit 14 C markierten Lysins enthaltenden und einen pH-Wert von 6,5 besitzenden Lösung bestimmt, welche, nachdem sie mit einer bestimmten Menge einer Lösung von 0,37 mg der erhaltenen Hefeligase in 1 ml 0,5 molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 7,5 versetzt worden war, eine bestimmte Zeit bei 40C stehengelassen wurde. Anschliessend wurden 0,05 ml des Reaktionsgemisches auf ein Filterpapier aufgetropft, worauf das aufgetropfte Gemisch 1, 5 h mit 8, 7%iger Essigsäure und mit 2, 5% luger Ameisensäure gewaschen wurde.
Die Menge des in dem auf dem Filterpapier verbliebenen Fleck enthaltenen Polypeptids wurde mittels eines auf die von 4C ausgesandte Strahlung ansprechenden Szintillationszählers bestimmt. Inder gleichen Weise wurde die Enzymwirkung der Hefeligase enthaltenden Fraktion nach 2-, 4-, 7-und 9tägigem Stehenlassen bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I angegeben.
Um die Behinderung der Oxydation der t-RNS-Hefeligase durch eine Superoxyddismutase zu beurteilen, wurden der pro Milliliter Phosphatpuffer 0, 37 mg Hefeligase enthaltenden Lösung 90 Einheiten einer aus Photobacteriumleiognathi Nr. ATCC 25 521 gewonnenenSuperoxyddismutase zugesetzt, worauf die Enzymwirkung der erhaltenen Lösung sofort und ebenfalls nach 2-, 4-, 7-und 9tägigem Stehenlassen bei 40C in der oben angegebenen Weise bestimmt wurde. Zu Vergleichszwecken wurde die erwähnte Lösung der Hefeligase mit 0, 1 Gew. -% Ascorbin- säure versetzt, worauf die Prüfung der Enzymwirkung in der eben angegebenen Weise vorgenommen wurde.
Die erhaltenen Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle I zusammengefasst.
Tabelle I
EMI3.1
<tb>
<tb> Tage <SEP> Enzymwirkung <SEP> in <SEP> %
<tb> ohne <SEP> mit <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> Gew.-% <SEP> mit <SEP> 90 <SEP> Einheiten <SEP> SuperoxydSchutzmittel <SEP> Ascorbinsäure <SEP> dismutase <SEP> von <SEP> Photobacterium <SEP> leiognathi <SEP> ATCC <SEP> 25521
<tb> 0 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 2 <SEP> 81 <SEP> 31 <SEP> 97
<tb> 4 <SEP> 62 <SEP> 19 <SEP> 96
<tb> 7 <SEP> 35 <SEP> 2, <SEP> 8 <SEP> 72
<tb> 9 <SEP> 27 <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> 67
<tb>
Man erhält ähnliche Ergebnisse unter Verwendung der gleichen Anzahl von Einheiten einer Superoxyddismutase aus Pleurotus olearius Gillet, Escherichia coli Nr. ATCC 15 224 oder Eryhtrocuprein.
Beispiel 5 : Zwecks Bestimmung des Schutzes von Bakterien gegen Oxydation durch eine Superoxyddismutase benutzte man Leuchtbakterien von Photobacterium leiognathi Nr. ATCC 25 521, deren Oxydation man künstlich durch Photoreduktion des Flavinmononucleotids (FMN) beschleunigte, um die Schutzwirkung innerhalb eines kürzeren Zeitraumes erkennbar zu machen. Die Bakterien wurden bei 28 C auf einem auf 1000 ml 8 g Nährbouillon, 10 g NaCI, 14 g Na2HP04 und 2 g KH2P04 enthaltenden und auf einen pH-Wert von 7 eingestellten Nährboden gerichtet.
EMI3.2
10 ml verdünnt und die verdünnte Suspension bei 250C mit Licht der Wellenlänge 365 nm unter ständigem Rühren bestrahltwurde.
Nachfestgelegten Bestrahlungszeiten unter der Bestrahlungslampe wurden der Bakteriensuspension gleiche Anteile entnommen und darin die Zahl der lebenden Zellen bestimmt.
Der oben beschriebene Versuch wurde mit der Abänderung wiederholt, dass der auf 10 ml verdünnten Bakteriensuspension pro Milliliter noch 13, 5 Einheiten einer aus Pleurotes olearius Gillet gewonnenen Superoxyddismutase zugesetzt wurden.
Während man vor der Bestrahlung 1. 101 lebende Zellen/ml zählt, zählte man nach festgelegten Bestrahlungszeiten die in der nachstehenden Tabelle n angegebene Anzahl von lebenden Zellen/ml.
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Tabelle II
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<tb>
<tb> Anzahl <SEP> der <SEP> lebenden <SEP> Zellen/ml
<tb> Expositionsdauer <SEP> Vergleich <SEP> in <SEP> Anwesenheit <SEP> von <SEP> 13,5 <SEP> Einheiten
<tb> in <SEP> min <SEP> Superoxyddismutase <SEP> aus <SEP> Pleuratus
<tb> olearius <SEP> pro <SEP> ml
<tb> 30 <SEP> 4. <SEP> 106 <SEP> 7. <SEP> 106 <SEP>
<tb> 60 <SEP> 5. <SEP> 105 <SEP> 3, <SEP> 9. <SEP> 106 <SEP>
<tb> 120 <SEP> 8.103 <SEP> 6. <SEP> 104
<tb>
Beispiel 6 : Man arbeitete wie In Beispiel 5, indem man Bakterien von Photobacterium leiognathi Nr. ATCC 25 521 in 10 ml einer physiologischen Kochsalzlösung suspendiert, die erhaltene Suspension mittels einer Lampe B 100 A 16 h mit Licht der Wellenlänge 365 nm bestrahlte (einfallende Energie 0,55 mW/ cm2) und anschliessend in Petri-Schalen die Anzahl der lebenden Bakterien ermittelte.
Bei einem in an sich der gleichen Weise, jedoch in Anwesenheit von 53 Einheiten pro ml einer aus Pleurotus olearius Gillet gewonnenen Superoxyddismutase durchgeführten Versuch zeigte sich, dass trotz der sehr langenBestrahlungsdauer von 16 hin Anwesenheit der Superoxyddismutase 3, 3mal mehr Bakterien überlebten als beim ohne Superoxyddismutase durchgeführten Versuch.
Die erhaltenen Ergebnisse waren folgende :
EMI4.2
<tb>
<tb> nichtbestrahlte <SEP> Bakterien <SEP> 9, <SEP> 7. <SEP> 104 <SEP> Zellen/ml
<tb> bestrahlte <SEP> Bakterien
<tb> (Vergleich) <SEP> 1, <SEP> 5. <SEP> 102 <SEP> Zellen/ml <SEP>
<tb> bestrahlte <SEP> Bakterien
<tb> (versetzt <SEP> mit <SEP> 53 <SEP> Einheiten/ml
<tb> Superoxyddismutase <SEP> aus
<tb> Pleurotus <SEP> olearius <SEP> Gillet) <SEP> 5, <SEP> 0. <SEP> 102 <SEP> Zellen/ml <SEP>
<tb>
EMI4.3
s pie 1 7 : Es wurde ein Versuch zum Konservieren eines Bacteriophags durchgeführt, der ein Nu-0, 2 ml einer Lösung von Escherichia coli des Stammes Nr.
ATCC 15 224,10 g Typticase, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl und 1000 ml Wasser brüten, u. zw. bei einer optischen Dichte von 0,5 bei 650 nm und mit 3 ml weicher Gelosesuspension (bestehend aus 8 g Agar, 10 g Trypticase, 1 g Hefeextrakt, 8 g NaCl, 1000 ml Wasser, 2 ml 1 molare CaCl-Lösung und 5 ml 20%iger Glukose), die man auf 450C hält. Das ganze giesst
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von Flavinen, wobei man die Bacteriophaglösung mit einer Lösung von 10-4 Mol FMN, 10-3 Mol EDTA und 10-2 Mol Phosphatpuffer von PH 7 verdünnt und die Photoreduktion am Fluorlmeter bei einem Endvolumen der Lösung von 0,8 ml und in Anwesenheit von 13,5 Einheiten pro Milliliter Superoxyddismutase aus Pleurotus olearius durchführt.
Mit einer Lösung enthaltend anfänglich 4, 1. 108 Teilchen/ml im Augenblick t = 0, erhält man die in der nachstehenden Tabelle in angegebenen Resultate :
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Tabelle III
Teilchen/ml
EMI5.1
<tb>
<tb> Anzahl <SEP> der <SEP> aufeinander- <SEP> Vergleichsversuch <SEP> mit <SEP> 13,5 <SEP> Einheiten/ml <SEP> Schutz
<tb> folgenden <SEP> Photoreduk- <SEP> (enthaltend <SEP> 0, <SEP> 05mg <SEP> Dismutase <SEP> aus <SEP> Pleuro- <SEP> (Verhältnis <SEP> (B))
<tb> tionsvorgänge <SEP> bei <SEP> pq <SEP> 3 <SEP> inaktivier- <SEP> tus <SEP> olearius <SEP> (A) <SEP>
<tb> te <SEP> Dismutase)
<tb> (A) <SEP> (B)
<tb> 0 <SEP> 4, <SEP> 1. <SEP> 108 <SEP> 4, <SEP> 1. <SEP> 108 <SEP>
<tb> 3 <SEP> 4. <SEP> 9. <SEP> 107 <SEP> 7. <SEP> 5. <SEP> 107 <SEP> 1,53
<tb> 6 <SEP> 5. <SEP> 106 <SEP> 1. <SEP> 5.
<SEP> 107 <SEP> 3,00
<tb> 9 <SEP> 5. <SEP> 105 <SEP> 2. <SEP> 106 <SEP> 4,00
<tb> I
<tb>
EMI5.2
Beispiel 8 : Man arbeitet wieim Beispiel 7mitdem Unterschied,. dassmanzurBeschleunigungderOxy- dation des Bacteriophags R 17 0,3 ml einer Suspension desselben mit Sauerstoff in Anwesenheit von Hypoxanthin und Xanthinoxydase bei einem Gesamtvolumen von 3 ml behandelt. Nach 15 min behandelt man das System nochmals durch Zugabe von 0, 05ml Xanthinoxydase und 0, 3 mll0-S molarer Hypoxanthinlösung. Mit 0, 5. 108 Teilchen/ml im Zeitpunkt terhält man die Ergebnisse der nachstehenden Tabelle IV in Abwesenheit und in Gegenwart von 200 Einheiten/ml Superoxyddismutase aus Photobacterium sepia des Stammes Nr. ATCC 15 709. Die erhaltenen Ergebnisse sind vergleichbar mit den mit Superoxyddismutasen von Pleurotus olearius Gillet oder Eryhtrocuprein erzielten Ergebnissen.
Tabelle IV Teilchen/ml
EMI5.3
<tb>
<tb> Anzahl <SEP> der <SEP> aufeinander- <SEP> ohne <SEP> Superoxyd- <SEP> mit <SEP> Superoxyd- <SEP> Sterblichkeit <SEP> Sterblichkeit
<tb> folgenden <SEP> enzymati- <SEP> dismutase <SEP> dismutase <SEP> in <SEP> % <SEP> in <SEP> %
<tb> schen <SEP> Vorgänge <SEP> (Vergleich) <SEP> (200 <SEP> Einheiten) <SEP> (Vergleich) <SEP> (mit <SEP> Superoxyddismutase)
<tb> 0 <SEP> 5, <SEP> 0.108 <SEP> 5, <SEP> 0. <SEP> 108 <SEP>
<tb> 1 <SEP> 3,5. <SEP> 108 <SEP> 5, <SEP> 0. <SEP> 108 <SEP> 30 <SEP> 0
<tb> 2 <SEP> 2,0.108 <SEP> 3,0.108 <SEP> 60 <SEP> 40
<tb>
Beispiel9 :
ManprüftdieSchutzwirkungdurchdieSuperoxyddismutasengegenOxydasederpancreatischen Ribonucléase mittels einer Oxydation, indem man eine Photoreduktion von FMN einsetzt, um die Er-
EMI5.4
molarem Phosphatpuffer von PH 7, wobei das Endvolumen 0,8 ml beträgt. Man unterzieht so das pancreati- sche Ribonucleaseprotein mehreren Photoreduktionszyklenin Abwesenheit und in Gegenwart von 67,5 Einheiten/ml Superoxyddismutase aus Pleurotus olearius Gillet oder in Gegenwart derselben, bei pH 3 denaturierten und inaktiven Dismutase.
Man bestimmt die Aktivität des Ribonucleaseenzyms mittels eines Spektrophotometers, indem man die Zunahme der optischen Dichte bei 280 nm einer Ribonucleinsäurelösung, wie sie vorstehend beschrieben wurde, verfolgt. Die erhaltenen Ergebnisse finden sich in der nachstehenden Tabelle :
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Tabelle V % Restaktivität
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<tb>
<tb> Anzahl <SEP> der <SEP> Vergleich <SEP> Vergleich <SEP> mit <SEP> bei <SEP> Superoxyddismutase
<tb> Zyklen <SEP> (ohne <SEP> Dismutase) <SEP> pH <SEP> 3 <SEP> inaktivierte <SEP> 67,5 <SEP> Einheiten/ml
<tb> Superoxyddismutase <SEP> (0, <SEP> 05 <SEP> mg) <SEP>
<tb> 0 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 3 <SEP> 67 <SEP> 56 <SEP> 89
<tb> 6 <SEP> 45 <SEP> 45 <SEP> 89
<tb> 9 <SEP> 22 <SEP> 22 <SEP> 67
<tb>
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EMI6.3
<tb>
<tb> Wochen <SEP> a) <SEP> Natriumtetra-Vergleiche <SEP> (Natriumtetrathionat)
<tb> thionat
<tb> + <SEP> Enzym <SEP> erster <SEP> zweiter <SEP> dritter
<tb> 1 <SEP> + <SEP> +
<tb> 2 <SEP> + <SEP> +
<tb> 3 <SEP> + <SEP> + <SEP>
<tb>
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Tabelle VI (Fortsetzung)
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<tb>
<tb> Wochen <SEP> a) <SEP> Natriumtetra- <SEP> Vergleiche <SEP> (Natriumtetrathionat)
<tb> thionat
<tb> + <SEP> Enzym <SEP> erster <SEP> zweiter <SEP> dritter
<tb> 4 <SEP> + <SEP> +-
<tb> 5 <SEP> + <SEP> +-
<tb> 6 <SEP> + <SEP> + <SEP> +-
<tb> 7 <SEP> +---
<tb> . <SEP> 9 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> 11 <SEP> + <SEP> + <SEP> 0 <SEP> - <SEP>
<tb> 13 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> 0
<tb> mittelmässig
<tb>
Ergebnis befriedigend : reine Salmonellenkultur - = schlechtes Ergebnis : Kultur E.
Coli
0 = schlechtes Ergebnis : überhaupt keine Kultur a) = es wurde jedesmal Enzym und Substrat zugesetzt
Aus dieser Tabelle ist unmittelbar ersichtlich, dass die Inhalte der Rohre, in denen Superoxyddismutaseenzyme eingeführt sind, alle ihre Eigenschaften bewahrt haben. Was das Vergleichs röhrchen selbst betrifft, so war es nur während der drei ersten Versuche befriedigend, was der bisher als normal angesehenen Gültigkeitsdauer für die handelsüblichen Quanten von Milieus mit Natriumtetrathionat entspricht. Auf Grund der folgenden Versuche wurde festgestellt, dass die Ergebnisse für die Vergleichsröhrchen sehr unregelmässig sind, was es ausschliesst, das Produkt als handelsfähig anzusehen. Man stellt also fest, dass dieser Zusatz von 2 ml einer Lösung von Superoxyddismutaseenzym des Stammes Photobacterium leiognathi Nr.
ATCC 25 521 je Röhrchen von 20 ml Natriumtetrathionat die Widerstandsfähigkeit des letzteren gegen Oxydation um mindestens 10 Wochen und sogar noch mehr verlängert.
Beispiel 11 : Konservierung von Kartoffeln
A. 250 g geschälte Kartoffeln werden 30min in Wasser bei 1000C gekocht. Man gibt 60 ml Wasser hin- zu und passiert durch einen Mischer bis zur Erzielung einer homogenen Masse. Drei Teilmengen von
50 g werden in Becher gegeben, und in jeden Becher werden 20 ml Wasser zugefügtund mitdem Brei gut vermischt.
Becher P 1 Vergleich
P 2 500 Einheiten Superoxyddismutase (10 Einheiten/g (P. leiognathi) werden zugesetzt und vermischt.
P 3 Vergleich plus 0, 5 ml 2,0% Ascorbinsäure (Endkonzentration 0, 02% Ascorbinsäure).
P 4 wie P 3 aber es sind auch 500 Einheiten Superoxyddismutase zugefügt.
Alle Muster werden dann durch Gefrieren getrocknet (lyophilisiert) und bei Umgebungstemperatur belassen.
B. Man verwendet Kartoffelflocken, die 25 mg/kg BHT (Ditertiärbutyl-paracresol) und BHA (butyl-hy- droxyanisol) und Glycerinmonostearat (1%) enthalten.
In 250 ml siedendes Wasser gibt man 45 g dieser Flocken, belässt sie 2 min und rührt mit einem
Glasstab. Zwei Teilmengen von 50 g dieses Kartoffelbreies werden aufgenommen und mit 50 ml Was- ser vermischt.
M1 Vergleich
M2 500 Einheiten Superoxyddismutase (10 Einheiten/g Brei) werden zugesetzt und gut durchge- mischt.
Die beiden Muster werden anschliessend durch Gefrieren getrocknet und das Pulver bei Umgebungs- temperatur belassen.
Nach zwei Monaten wird der Geruch der Muster A) und B) von sechs Personen verglichen. Bei Gegen-
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wart von Superoxyddismutase ist der Geruchunterschiedlich von dem der Vergleichsmuster, u. zw. weniger sauer und angenehmer.
Beispiel 12 : Konservierung von Karotten
Es wird genau dieselbe Arbeitsweise wie vorstehend für Kartoffeln beschrieben angewandt, aber für mit Wasser gekochte Karotten und mit derselben Menge Superoxyddismutase/g. Nach zwei Monaten wird der Ge- ruch der Muster von sechs Personen verglichen. Bei Vorhandensein von Superoxyddismutase ist der Geruch anders als der der Vergleichsmuster, er ist weniger sauer und angenehmer.
Die gemäss einigen der obigen Beispiele verwendete Superoxyddismutase von Photobacterium leiognathi des Stammes Nr. ATCC 25 521 wurde entsprechend dem erwähnten gleichaltrigen Vorschlag der Patentinhaberin in folgender Weise hergestellt.
Bakterien von Photobacterium leiognathi des Stammes Nr. ATCC 25 521 wurden auf einem künstlichen Nährboden gezüchtet, der in g/l enthielt :
EMI8.1
<tb>
<tb> NaCl <SEP> 30
<tb> Na2HP0, <SEP> 12 <SEP> HO <SEP> 18,7
<tb> KR <SEP> 2 <SEP> P04 <SEP> 2
<tb> MgS04'7 <SEP> H20 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP>
<tb> (NH4)2HPO4 <SEP> 0,5
<tb> Glukose <SEP> 1,5
<tb> Glycerin <SEP> 1, <SEP> 5
<tb> Trypticase <SEP> 5
<tb> Hefeextrakt <SEP> 5
<tb>
EMI8.2
EMI8.3
<tb>
<tb> über <SEP> NachtLuminol <SEP> 10-3Mol <SEP> 0, <SEP> 3mi
<tb> Phosphatpuffer <SEP> 10-6 <SEP> Mol <SEP> PH <SEP> 7,8 <SEP> 0,3 <SEP> ml
<tb> EDTA <SEP> 10-3 <SEP> Mol <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> ml <SEP>
<tb> Wasser <SEP> l, <SEP> 0 <SEP> mil <SEP>
<tb> Xanthinoxydase <SEP> (1 <SEP> mg/ml) <SEP> 0, <SEP> 050 <SEP> ml <SEP>
<tb>
Man initiiert die Reaktion, indem man in die Küvette 1 ml Hypoxanthin von 3 x 10-4 gibt.
Dann wird ein Photonenfluss emittiert, der unter der Wirkung des Photomultiplikators einen Strom entstehen lässt, dessen Intensität sowie Intensitätsschwankungen am Picoampéremeter gemessen und aufgezeichnet werden.
Wenn man in die Reaktionsmischung vor der Auslösung der Reaktion 5 jul einer Superoxyddismutaselösung einführt, die in vorstehender Weise hergestellt wurde, erhält man eine Beeinträchtigung der Lichtemission, und es wird willkürlich angenommen, dass eine Einheit Superoxyddismutaseenzym die Enzymmenge sein würde, die eine Verhinderung von 50% der Lichtemission hervorruft. Bei der UV-Spektroskopie liefert die extrahierte Superoxyddismutase das bekannte Spektrum von nichthämatinischen Proteinenmit einer Trypto-
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phanschulter bei 290 mu.
Zur Bestimmung ihres Molekulargewichtes benutzt man zwei bekannte Methoden : die eine besteht in der Bestimmung eines Zentrifugiergradientenan Saccharose, und im andern Fall setzt man ein Sephadexgel G 200 ein. Um dies zu bewirken, benutzt man folgende Markierungsmittel von bekannten Molekulargewichten :
EMI9.1
<tb>
<tb> Hefe-ADH <SEP> Molgewicht
<tb> Rinderalbumin <SEP> 150000
<tb> Peroxydase <SEP> 66000
<tb>
Es wird auf ein Molekulargewicht von 40000 z 2500 geschlossen.
Um die Bausteine der Proteinstruktur des Enzyms zu bestimmen, wird eine Elektrophorese in Polyacrylamidgel, versetzt mit SDS (Natriumdedecylsulfat) von 10%, durchgeführt. Man beobachtet eine einzige Bausteinart vom Molekulargewicht etwa 21000. Das Molekulargewicht der erhaltenen Superoxyddismutase kann also zu 21000 x 2, d. h. 42000, geschätzt werden. Ebenfalls auf dem Polyacrylamidgel erhält man ein rotes Band in Gegenwart von Bathophenantrolin und Hydrazin genau auf dem Niveau des durch Coomassieblau entwickelten Superoxyddismutasebandes.
Bei einer colorimetrischen Analyse einer Proteinlösung erhält man für das Eisen einen Wert, der bei Schätzung des Molekulargewichtes des Enzyms zu 42000 etwa 2 Atome Eisen je Molekül ergibt. Eine Atomabsorptionssepektrometrie einer Proteinlösung von 0, 2 mg/ml bestätigt diesen Wert. Man kann also verhältnismässig auf 2 die Atomanzahl Eisenje Mol Superoxyddismutase schätzen. Anderseits hat das gemäss diesem Beispiel extrahierte Enzym gezeigt, dass es keinem merklichen Aktivitätsverlust nach 5 min bei einer Temperatur von 700C unterliegt. Eine Elektrofocalisation der Superoxyddismutase gestattet, den pHi-Wert oder isoelektrischen Punkt dieses Enzyms zu 4, 4 zu bewerten.
Das Enzym besitzt eine Höchstaktivität bei pH et-
EMI9.2
Man erhält ein identisches Enzym mit ähnlichen Eigenschaften aus einem Bakteriumstamm von Photobacterium leiognathi Nr. ATCC 25 587.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zum Behindern der Autoxydation von einem Abbau durch Oxydation unter dem Einfluss von Superoxydionen ausgesetzten Substanzen, dadurch gekennzeichnet, dass man mit den Substanzen, beispielsweise Nahrungsmitteln, insbesondere lipidischen, proteinischen oder lipoproteinischen Nahrungmitteln, Bakterien oder Viren, oderfür das Wachstum von Zellenbenutzten Kulturmedien, 1 bis 200 Einheiten mindestens einer Superoxyddismutase je g oder ml Substanz vereinigt.