<Desc/Clms Page number 1>
Verfahren zur Herstellung von as Methylphenoxymethylpenicillin durch Fermentation Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von ct-Methylphenoxymethylpenicillin der Formel
EMI1.1
EMI1.2
<Desc/Clms Page number 2>
dem Precursor, jedoch vorteilhaft an einer von der Stelle der Precursorzufuhr verschiedenen Stelle, zugesetzt werden. Die Zufuhr der neutralisierend wirkenden Stoffe erfolgt in der Regel in Abhängigkeit von der Zufuhr an Precursor.
Vorzugsweise wird während des Precursorzusatzes in der Fermentationslösung ein PH-Wert im physiologischen Bereich, insbesondere ein PH zwischen 6,5 und 7,5 eingeregelt. In einzelnen Fällen kommt es während der Fermentation zu einem Abbau der im Überschuss zugesetzten Precursorverbindung, was einen weiteren Vorteil bei der nachfolgenden Extraktion darstellt.
Die beim erfindungsgemässen Verfahren als Precursor verwendeten Säurehalogenide enthalten ein asymmetrisches C-Atom und können daher in verschiedenen isomeren Formen verwendet werden ; meist wird das Racemat zur Acylierugn verwendet, in welchem Falle man dann das entsprechende DL-Penicillin bzw. die beiden diastereoisomeren Penicilline, erhält. Als Puffersubstanzen haben sich Natriumbicarbonat oder Phosphatgemische besonders zweckmässig erwiesen, während als neutralisierend wirkende Stoffe unter anderem Lösungen von Alkalihydroxyden, insbesondere Natriumhydroxyd, in Frage kommen.
Die als Precursors im Sinne der Erfindung angewendeten Säurehalogenide führen zu günstigen Ausbeuten an Penicillin. Sie zeichnen sich ferner durch eine selektive Wirksamkeit gegen Bakterien aus ; eine Hemmung des Wachstums des Pilzes erfolgt bei den angewendeten Konzentrationen noch nicht. So unterdrückt z. B. ein im Laufe der Fermentation erfolgender Zusatz von. 0,3% α-Methyl-phenyoxyessigsäurechlorid das Wachstum der für die submerse Penicillinproduktion so gefährlichen Penicillinase bildenden Fremdkeime.
Das erfindungsgemäss erhaltene Penicillin zeichret sich durch seine Säurestabilität sowie durch seine Depotwirkung aus und ist insbesondere auch für die Oraltherapie geeignet.
EMI2.1
1 :0, 025% MnSO4. tLO 0,01 % CaCl 3,0 % Laktose 1, 0 % Glukose
EMI2.2
mitphenoxyessigsäurechlorid zugesetzt.
Beispiele 2-6 : Für dieFermentationgemäss den Beispielen 2-6 wurde eine Stammnährlösung folgender Zusammensetzung verwendet :
EMI2.3
0,01 % CaCL ;
4,0 % Laktose
1,0 % Glukose
Das PH der Nährlösung wurde mit NaOH auf 6,0 eingestellt. Vor der Beimpfung wurde der sterilen Nährlösung 1% einer 25%igen CaCO3-Suspension zugefügt.
Beispiel 2 :
90 ml Stammnährlösung,
10 ml Bierhefeautolysat (mit 20 g Stickstoff/l),
0, 1 vol.-% α-Phenoxypropionsäurechlorid (Gesamtmenge) ab der 72. h in 12 h
Intervallen zugesetzt,
1% Sporenimpfgut des Pen. chrys. -Stammes 351.
Gärgefäss : 2 l Erlenmeyerkolben auf Rundschüttelmaschine mit 240 Umdr/min und 30 mm Hub, Gärzeit : 168 h, Gärtemperatur : 24oC.
Erreichter Penicillingehalt (Plattentest gegen Staphylococcus aureus SG 511) : 3200 E/ml.
<Desc/Clms Page number 3>
Im Vergleichskolben wurde ohne Zusatz von α-Phenoxypropionsäurechlorid gearbeitet: nach Beendi- gung der Fermentation wurde ein aliquoter Teil nach Abtrennung vom Mycel in Gegenwart von Natrium- bicarbonat mit überschüssigem Phenoxypropionsäurechlorid acyliert, wobei nach der gleichen Testmetho- de nur 2 900 E/ml Penicillin festgestellt wurden. i Beispiel 3 : 4750 ml Stammnährlösung,
250 ml Cornsteepliquor (mit 40 g sTICKSTOFF/L), 0,15 Vol.-% α-Phenoxypropionsäurecholorid (Gesamtmenge) ab der 36. h in 4 h
EMI3.1
90 mm Scheibenrührer, Gärzeit : 108 h, Gärtemperatur : 240C ; i Erreichter Penicillingehalt (Jodometrischer Test) : 1750 E/ml.
Zur Aufarbeitung wurde die Fermentationsflüssigkeit filtriert, wobei ein FlUssigkeitsvolumen von
4, 2 l anfiel. Dieses Kulturfiltrat wurde mit 1, 5 l Butylacetat bei einem PH-Wert von 2,0 extrahiert und das Penicillin aus der Butylacetatphase mit Puffer PH 7,0 rückextrahiert. Nach erneutem Überführen in
50 ml Butylacetat erhielt man eine Lösung mit einem Penicillingehalt von 119 000 E/ml. Das Penicillin wurde durch Zusatz von in Methanol gelöstem Kaliumacetat ausgefällt.
Ausbeute : 3, 3 g < x-Phenoxyäthylpenicillin-Kaliumsalz a 1480 E/mg (Jodometrischer Test).
Das ausgeschiedene Kaliumsalz zeigte nach einstündigem Stehen bei PH 2 eine Aktivitätsabnahme von lolo.
Im Vergleichsfermenter wurde ohne Zugabe von ct-Phenoxypropionsäurechlorid fermentiert ; nach Be- endigung der Fermentation wurde ein aliquoter Teil nach Abtrennung vom Mycel in Gegenwart von Na- triumbicarbonat mit überschüssigem Phenoxypropionsäurechlorid acyliert, wobei nach der gleichen Test- methode nur 1500 E/ml Penicillin festgestellt wurden.
Beispiel 4 :
4250 ml Stammnährlösung,
EMI3.2
Fermentation an kontinuierlich zugesetzt, 7% Mycelimpfgut des Stammes Pen. chrysog. 1014.
Gärgefäss : 10 1 Nirostafermenter, Vortex System, 800 Umdr/min,
90 mm Scheibenrührer, Gärzeit : 96 h, Gärtemperatur : 24oC.
Erreichter Penicillingehalt (Jodometrischer Test) : 2 000 E/ml.
Zur Aufarbeitung wurde die Kulturlösung filtriert und das Filtrat zur Inaktivierung der natürlichen Penicilline auf PH 2,5 angesäuert und 1 h bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Nach dieser Zeit betrug der Penicillingehalt der Lösung 1700 E/ml. 4 l dieses so vorbehandelten Kulturfiltrates wurden nun mit 2 l Butylacetat extrahiert. Aus der Butylacetatphase wurde das Penicillin mit 500 ml Bicarbonatlösung in die wässerige Phase überführt. Diese Bicarbonatlösung wurde nach Ansäuerung auf PH 2 mit 70 ml Butylacetat extrahiert. Aus der Butylacetatphase wurde das Penicillin mit einer 0,5-molaren Lösung von Kaliumacetat inButanol ausgefällt. Es wurden 3,34g α-Phenoxyäthylpenicillin-Kaliumsalz a 1470 E/mg erhalten (Jodometrischer Test).
Zur Identifizierung des Penicillins wurde 1 g mit 5-molarer Salzsäure hydrolysiert. Die ausgeschiedene α-Phenoxypropionsäure wies einen Schmelzpunkt von 116 bis 1170C auf und zeigte im MischSchmelzpunkt mit synthetischem Material keine Depression.
Im Vergleichsfermenter wurde ohne Zugabe von α-Phenoxypropionsäurechlorid fermentiert; nach Beendigung der Fermentation wurde ein aliquoter Teil nach Abtrennung vom Mycel in Gegenwart von Natriumbicarbonat mit überschüssigem Phenoxypropionsäurechlorid acyliert, wobei nach der gleichen Testmethode nur 1500 E/ml Penicillin festgestellt wurden.
Beispiel 5 : 4950 ml Stammnährlösung,
150 g Erdnusspresskuchen (mit 7% Stickstoff),
<Desc/Clms Page number 4>
EMI4.1
letzten Einspritzungen je 0, 05 Vol.-% beträgt,
5% Mycelimpfgut des Pen. chrysog.-Stammes 347.
! Gärgefäss : 10 l Nirostafermenter, Vortex System, 650 Umdr/min,
90 mm Scheibenrührer, Gärzeit : 90 h,
Gärtemperatur : 24 C.
Erreichter Penicillingehalt (Jodometrischer Test) : 1650 E/ml.
Die Fermentationslösung wurde abfiltriert, wobei ein Flüssigkeitsvolumen von 4, 11 erhalten wurde.
Daraus wurde das Penicillin mit 11 Methylisobutylketon bei PH 2,0 extrahiert ; sodann wurde das Penicillin in eine Pufferlösung überführt. Aus der Pufferlösung wurde das Penicillin mit 40 ml Butylacetat rückextra- hiert, wobei eine Lösung mit 120 000 E/ml erhalten wurde, aus der das Penicillin mit einer 0, 7-moiaren
Kaliumacetatlösung in Äthanol als Kaliumsalz abgeschieden wurde. Es wurden 2, 86 g et-Phenoxyäthyl- penicillin-Kaliumsalz mit einer jodometrisch getesteten Milligrammaktivität von 1450 Einheiten isoliert.
ImVergleichsfermenter wurde ohne Zugabe von α-Phenoxypropionsäurechlorid fermentiert; nach Be- endigung der Fermentation wurde ein aliquoter Teil nach Abtrennung vom Mycel in Gegenwart von Na- triumbicarbonat mit überschüssigem Phenoxypropionsäurechlorid acyliert, wobei nach der gleichen Test- methode nur 1350 E/ml Penicillin festgestellt wurden.
Beispiel 6 :
900 1 Stammnährlösung.. "
100 l Hefeautolysat (mit 20 g Stickstoff/l), 0.1 Vol.-% α-Phenoxypropionsäurechlorid (Gesammenge) ab der 48. h in 12 h
Intervallen zugesetzt, 100/0 Mycelimpfgut des Pen. chrysog.-Stammes 1014, 0, 2% Spermöl.
EMI4.2
: 1500 l Nirostafermenter,Gärzeit : 96 h,
Gärtemperatur :24 C.
Erreichter Penicillingehalt (Jodometrischer Test) : 2200 E/ml.
Zur weiteren Verarbeitung wurde die Rohlösung filtriert und die erhaltenen 900 1 Flüssigkeit in 5 Stufen in üblicher Weise extrahiert. Nach der 5. Extraktionsstufe fielen 17, 6 1 Butylacetatphase mit 90000 E/ml an. Es wurde mit 2, 5-molarer Kaliumacetatlösung in Methanol gefällt, wobei 805 g Kalium- - α-phenoxyäthylenpenteillinsalz mit einer Aktivität (Jodometrischer Test) von 1470 E/mg erhalten wur- den. Das Kaliumsalz wies nach einstündiger Inkubation bei PH 2 und Zimmertemperatur noch 90% der ursprünglichen Aktivität auf.
ImVergleichsfermenter wurde ohne Zugabe von α-Phenoxypropionsäurechlorid fermentiert; nach Be- endigung der Fermentation wurde ein. aliquoter Teil nach Abtrennung vom Mycel in Gegenwart von Natriumbicarbonat mit überschüssigem Phenoxypropionsäurechlorid acyliert, wobei nach der gleichen Testmethode nur 1650 E/ml Penicillin festgestellt wurden..
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von α-Methylphenxymethylpenicillin durch Fermentation, dadurch gekennzeichnet, dass man während der Fermentation ein a-Methylphenoxyessigsäurehalogenid zusetzt und das gebildete säurestabile Penicillin in Form der freien Säure oder als Salz gewinnt.