WO2021220692A1 - 計数方法及び計数装置 - Google Patents
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- G01N2015/1486—Counting the particles
Definitions
- the present disclosure relates to a counting method and a counting device for counting particles contained in a sample.
- dielectric particles in a sample solution are collected by dielectrophoresis, and the dielectric particles contained in the sample solution are counted by analyzing an image obtained by capturing an image of the area where the dielectric particles are collected.
- a counting method is known (see Patent Document 1).
- the present disclosure provides a counting method and the like that can reduce the occurrence of false negatives and count particles more accurately.
- the counting method includes a coagulation step in which particles in a sample are aggregated by applying a dielectrophoretic force in the first direction, and a dielectrophoretic force in a second direction different from the dielectrophoretic force in the first direction.
- a diffusion step in which a dielectrophoretic force is applied to diffuse the aggregated particles, an imaging step in which a diffusion image containing the diffused particles is imaged, and a counting step in which the number of the particles is determined based on the diffusion image. And, including.
- the counting device includes an accommodating portion for accommodating a sample containing particles, an electric field gradient generating portion for generating an electric field gradient with respect to the sample accommodated in the accommodating portion, and the electric field gradient generating unit.
- the generated electric field gradient causes the particles to act on the dielectrophoretic force in the first direction to aggregate the particles, which is different from the dielectrophoretic force in the first direction on the aggregated particles.
- a control unit that diffuses the aggregated particles by applying a dielectrophoretic force in the second direction, an imaging unit that captures a diffused image containing the diffused particles, and the image based on the captured diffused image.
- a counting unit for determining the number of particles is provided.
- a recording medium such as a system, an apparatus, an integrated circuit, a computer program or a computer-readable CD-ROM, and the method, the apparatus, the system, the method, the integration. It may be realized by any combination of a circuit, a computer program and a recording medium.
- Computer-readable recording media include non-volatile recording media such as CD-ROMs (Compact Disc-Read Only Memory).
- FIG. 1 is a perspective view showing a schematic configuration of a counting device according to an embodiment.
- FIG. 2 is a cross-sectional view showing a schematic configuration of the counting device according to the embodiment.
- FIG. 3 is a plan view showing the configuration of the electrode set according to the embodiment.
- FIG. 4 is a diagram illustrating aggregation and diffusion of particles according to the embodiment.
- FIG. 5 is a diagram illustrating a change in dielectrophoretic force according to an embodiment.
- FIG. 6 is a second diagram illustrating a change in dielectrophoretic force according to the embodiment.
- FIG. 7 is a flowchart showing a counting method according to the embodiment.
- FIG. 8 is a flowchart showing a counting method according to a modified example of the embodiment.
- FIG. 9 is a diagram showing an aggregated image and a diffused image according to a modified example of the embodiment.
- FIG. 10 is a diagram showing tracking steps according to a modified example of the embodiment.
- FIG. 11 is a diagram showing a complex formation process according to a modified example of the embodiment.
- FIG. 12 is a circuit diagram including a first electrode set and a second electrode set according to a modified example of the embodiment.
- Patent Document 1 discloses a counting method for counting dielectric particles, which are particles to be counted, by dielectrophoresis. Specifically, in Patent Document 1, dielectric particles are collected in each of a plurality of slit regions by dielectrophoresis, and the number of slit regions saturated with the dielectric particles among the plurality of slit regions is counted. , The dielectric particles contained in the sample liquid are counted.
- dielectrophoresis is a technique for collecting (in other words, agglutinating) dielectric particles at a predetermined location as described above, and the dielectric particles can be moved toward the predetermined location. Therefore, when a large number of dielectric particles are present in the sample, the large number of dielectric particles are aggregated at a predetermined location and accumulated three-dimensionally. That is, in an image captured by an imaging device or the like from one direction, it is difficult to identify the overlap of dielectric particles due to accumulation, and only a smaller number than the actual number can be counted, so-called false negatives. It will occur.
- the particles aggregated by the action of the first dielectrophoresis that is, the dielectrophoresis force in the first direction
- the second dielectrophoresis that is, the dielectrophoresis force in the second direction
- the aggregation by dielectrophoresis in the first direction is diffused.
- the particles can be counted in a state where the influence of the overlapping of the particles is reduced, the occurrence of false negatives due to agglutination is reduced, and the particles are more accurately counted. Can be counted.
- the counting method includes a coagulation step in which particles in a sample are aggregated by applying a dielectrophoretic force in the first direction, and a dielectrophoretic force in a second direction different from the dielectrophoretic force in the first direction.
- a diffusion step in which a force is applied to diffuse the agglomerated particles
- an imaging step in which a diffused image containing the diffused particles is imaged
- a counting step in which the number of particles is determined based on the captured diffused image, and a counting step. including.
- the particles aggregated by the dielectrophoretic force in the first direction are diffused by the different dielectrophoretic forces in the second direction. That is, by overlapping the particles due to agglutination, it is possible to suppress the occurrence of false negatives such as two particles appearing to be one. Therefore, in the counting method of the present disclosure, the occurrence of false negatives due to agglutination is reduced, and particles can be counted more accurately.
- an AC voltage of the first frequency is applied between the electrode sets that generate an electric field gradient for applying a dielectrophoretic force
- a third frequency different from the first frequency is applied between the electrode sets.
- a two-frequency AC voltage may be applied.
- the direction of the dielectrophoretic force can be adjusted by the frequency of the AC voltage applied between the electrode sets. In this way, the direction of the dielectrophoretic force can be changed by adjusting the frequency, and the agglomerated particles can be diffused. Therefore, in the counting method of the present disclosure, the occurrence of false negatives due to agglutination is reduced, and particles can be counted more accurately.
- an AC voltage of the first frequency is applied between the first electrode sets that generate an electric field gradient for applying a dielectrophoretic force
- a first electrode set different from the first electrode set is applied.
- An AC voltage having a second frequency different from the first frequency may be applied between the two electrode sets.
- the direction of the dielectrophoretic force can be adjusted by the frequency of the AC voltage applied to each of the first electrode set and the second electrode set. In this way, the direction of the dielectrophoretic force can be changed by adjusting the frequency applied to the two electrode sets, and the particles can be aggregated and diffused. Therefore, in the counting method of the present disclosure, the occurrence of false negatives due to agglutination is reduced, and particles can be counted more accurately.
- a dielectrophoretic force in the second direction which is larger than the dielectrophoretic force in the first direction in the agglutination step, may be applied.
- a larger dielectrophoretic force can be applied in the diffusion step than in the aggregation step, and the aggregated particles can be diffused more reliably. Therefore, in the counting method of the present disclosure, the occurrence of false negatives due to agglutination is reduced, and particles can be counted more accurately.
- a positive dielectrophoretic force or a negative dielectrophoretic force acts on the particles
- the particles have a positive dielectrophoretic force and a negative dielectrophoretic force.
- the other of the dielectrophoretic forces of may be acted upon.
- an AC voltage is applied in the environment of the first conductivity between the electrode sets that generate the electric field gradient for applying the dielectricing force, and in the diffusion step, what is the first conductivity? AC voltage may be applied in environments with different second conductivity.
- the direction of the dielectrophoretic force can be adjusted by the conductivity in the environment around the particles. In this way, the direction of the dielectrophoretic force can be changed by adjusting the conductivity, and the agglomerated particles can be diffused. Therefore, in the counting method of the present disclosure, the occurrence of false negatives due to agglutination is reduced, and particles can be counted more accurately.
- the particles when an AC voltage is applied in an environment of first conductivity, either a positive dielectrophoretic force or a negative dielectrophoretic force acts on the particles, and when an AC voltage is applied in an environment of second conductivity.
- the particle may be subjected to either a positive dielectrophoretic force or a negative dielectrophoretic force.
- the pre-imaging step of capturing the aggregated image containing the aggregated particles, and the particles included in the aggregated image based on the captured aggregated image and the diffused image may include a tracking step to track the image.
- particles can be counted based on the aggregated image and the diffused image before and after the particles are diffused. For example, when particles that follow different orbits accidentally overlap each other in the process of diffusion, the particles can be individually counted based on the different orbits. Therefore, in the counting method of the present disclosure, the occurrence of false negatives due to agglutination is reduced, and particles can be counted more accurately.
- the particles diffused in the diffusion step are aggregated in the first position in the aggregation step or the particles aggregated in the second position different from the first position. May be good.
- particles aggregated at each of the first position and the second position can be individually counted for each position.
- the first position and the second position are the positions where the particles are aggregated by the positive dielectrophoresis and the negative dielectrophoresis
- the particles aggregated by the action of these different dielectrophoresis are simultaneously and accurately.
- the counting method of the present disclosure the occurrence of false negatives due to agglutination is reduced at each of the plurality of positions, and particles can be counted more accurately at the same time.
- the particles containing the substance to be detected may be selectively counted from the particles based on the aggregated image and the diffused image.
- specific particles can be selectively counted from a sample containing a plurality of types of particles.
- the counting device controls an accommodating portion for accommodating a sample containing particles, an electric field gradient generating portion for generating an electric field gradient with respect to the sample accommodated in the accommodating portion, and an electric field gradient generating unit.
- the generated electric field gradient causes the particles to be subjected to the dielectrophoretic force in the first direction to aggregate the particles, and the aggregated particles are subjected to the dielectrophoretic force in the second direction different from the dielectrophoretic force in the first direction.
- It includes a control unit that acts to diffuse the agglomerated particles, an imaging unit that captures a diffused image containing the diffused particles, and a counting unit that determines the number of particles based on the captured diffused image. ..
- a recording medium such as a system, an apparatus, an integrated circuit, a computer program, or a computer-readable CD-ROM, and the system, a method, an integrated circuit, or a computer. It may be realized by any combination of a program and a recording medium.
- counting particles means finding particles in a sample based on the determination of one or more particles or zero particles and confirming the existence of the particles, as well as the amount of particles (for example, number or number). Concentration, etc.) or its range is included.
- counting the substances to be detected means finding the substances to be detected in the sample based on the determination of whether the number of substances to be detected is 1 or more or 0, and confirming the presence of the substances to be detected. Includes measuring the amount of substance (eg, number or concentration, etc.) or its range.
- the particles to be counted may be all the particles contained in the sample, or may be a part of a plurality of particles contained in the sample.
- Diffusing particles by the dielectricing force in the second direction simply means that the particles are diffused in the radial second direction from the position where the particles are aggregated by the dielectricing force in the first direction, and the dielectricing force in the first direction. It is a concept that includes aggregating particles at a position different from the position where the particles are aggregated by force and diffusing them from the original position.
- the particles are aggregated by dielectrophoresis (DEP) in the liquid, and the aggregated particles are further diffused to suppress the overlap of the particles due to the aggregation and count the particles. ..
- DEP dielectrophoresis
- Dielectrophoresis is a phenomenon in which a force acts on dielectric particles exposed to a non-uniform electric field (hereinafter, also referred to as an electric field gradient). This force does not require the particles to be charged.
- FIG. 1 is a perspective view showing a schematic configuration of a counting device according to an embodiment.
- FIG. 2 is a cross-sectional view showing a schematic configuration of the counting device according to the embodiment.
- the housing unit 110 is shown in an approximate shape so that the inside of the housing unit 110 can be seen by passing through a portion other than the first substrate 111.
- FIG. 1 is used to explain the relationship with other components centering on the accommodating portion 110, and limits the arrangement position, arrangement direction, posture, etc. of each component when the counting device 100 is used. It's not something to do.
- FIG. 2 is a cross-sectional view of the accommodating portion 110 shown in FIG. 1 cut along a direction parallel to the paper surface. The thickness of a part of the accommodating portion 110 shown in FIG. 2 is shown in FIG. It has been omitted.
- the counting device 100 includes an accommodating unit 110, a power supply 120, a light source 130, an image sensor 140, and a counting unit 150.
- the accommodating portion 110 is a container for accommodating the sample 10 containing the particles 15, and has a space 1121 inside.
- Sample 10 is housed in the space 1121.
- the sample 10 housed in the space 1121 is subjected to dielectrophoresis in the space 1121, and when the sample 10 contains the particles 15, the particles 15 are moved by the action of the dielectrophoresis.
- the space 1121 provided in the accommodating portion 110 forms a field for dielectrophoresis in the counting device 100.
- the particle 15 is a grain-shaped substance exhibiting dielectric property as described above, and is a single material substance such as polystyrene beads and glass beads, as well as a composite substance in which a functional substance is added to these beads.
- living cells and the like that can be macroscopically regarded as dielectric particles.
- the particles 15 are appropriately determined according to the use of the counting device 100, and various conditions for dielectrophoresis are set according to the physical properties of the particles 15. In the following description, it is assumed that the particles 15 are polystyrene beads, but as described above, the composition and size of the particles 15 are not particularly limited.
- the counting device 100 can be applied to various particles 15 as counting targets.
- the accommodating portion 110 includes a first substrate 111, a spacer 112, and a second substrate 113.
- the first substrate 111 is, for example, a sheet made of glass or resin.
- the first substrate 111 has an upper surface that defines the bottom of the space 1121, and an electrode set 1111 to which an AC voltage is applied from the power supply 120 is formed on the upper surface.
- the electrode set 1111 is formed in contact with the space 1121 so that the sample 10 and the electrode set 1111 are in electrical contact when the sample 10 is housed in the space 1121.
- the electrode set 1111 includes a first electrode 1112 and a second electrode 1113.
- the AC voltage applied from the power source to the electrode set 1111 allows the electrode set 1111 to generate (generate or form) a non-uniform electric field (electric field gradient) on the first substrate 111.
- the electrode set 1111 is an example of the electric field gradient generating portion. The details of the electrode set 1111 will be described later with reference to FIG.
- the spacer 112 is arranged on the first substrate 111.
- the spacer 112 is formed with a through hole corresponding to the shape of the space 1121.
- the space 1121 is formed by through holes sandwiched between the first substrate 111 and the second substrate 113. That is, the spacer 112 is an outer wall that surrounds the through hole and has an inner surface that defines the space 1121.
- the spacer 112 is made of, for example, a material such as a resin having high adhesion to the first substrate 111 and the second substrate 113.
- the second substrate 113 is, for example, a transparent sheet made of glass or resin, and is arranged on the spacer 112.
- a polycarbonate substrate can be used as the second substrate 113.
- the second substrate 113 is formed with a supply hole 1131 and a discharge hole 1132 connected to the space 1121.
- the sample 10 is supplied to the space 1121 through the supply hole 1131 and discharged from the space 1121 through the discharge hole 1132.
- the accommodating portion 110 may be configured without the second substrate 113. That is, the second substrate 113 is not an essential component.
- the space 1121 for forming the accommodating portion 110 as a container is formed by the first substrate 111 and the spacer 112 that define the bottom and the inner side surface, respectively.
- the power supply 120 is an AC power supply, and an AC voltage is applied to the electrode set 1111 of the first substrate 111.
- the power supply 120 may be any power supply as long as it can supply an AC voltage, and is not limited to the specific power supply as described above.
- the AC voltage may be supplied from an external power source, in which case the power source 120 may not be included in the counting device 100.
- the internal configuration of the power supply 120 will be omitted and shown in a simplified manner.
- the light source 130 irradiates the sample 10 in the space 1121 with the irradiation light 131.
- the irradiation light 131 irradiates the particles 15 in the sample 10 via the second substrate 113.
- Detection light 132 corresponding to the irradiation light 131 is generated from the particles 15, and the particles 15 are detected by detecting the detection light 132.
- the irradiation light 131 may be irradiated with excitation light that excites a specific fluorescent substance.
- the fluorescent substance is dispersed in the polystyrene forming the particles 15, fluorescence is generated according to the irradiated excitation light, and the presence of the fluorescent substance, that is, the presence of the particles 15 is detected by detecting the fluorescence. Can be done.
- the light source 130 a known technique can be used without particular limitation.
- a laser such as a semiconductor laser or a gas laser can be used as the light source 130.
- a wavelength having a small interaction with the substance constituting the particles 15 for example, 400 nm to 2000 nm
- a wavelength that can be used by a semiconductor laser for example, 600 nm to 850 nm
- a semiconductor laser for example, 600 nm to 850 nm
- the light source 130 does not have to be included in the counting device 100.
- the particles 15 when the particles 15 are large, the particles 15 do not have to contain a fluorescent substance.
- the particles 15 since the particles 15 do not have to be irradiated with the excitation light, the external light emitted from the sun, a fluorescent lamp, or the like can be used as the irradiation light 131, and the counting device 100 can be realized without providing the light source 130.
- the image sensor 140 is a CMOS image sensor, a CCD image sensor, or the like built in the camera 141, and generates an image including the particles 15 by detecting the detection light 132 generated from the particles 15.
- the image pickup element 140 is arranged horizontally on the plate surface of the first substrate 111, and images a portion corresponding to the electrode set 1111 via an optical element (not shown) such as a lens included in the camera 141. If the particles 15 are present at the location, the detection light 132 generated by the irradiation light 131 is incident on the image sensor 140, and the particles 15 are detected.
- the counting unit 150 acquires an image output by the image pickup device 140, and determines the number of particles 15 contained in the sample 10 based on the image. For example, the counting unit 150 detects bright spots having different brightness values by comparing the acquired image with the control image using a control image that does not include the particles 15 captured in advance. Specifically, when light emission is detected as the detection light 132, a point having a high luminance value in the acquired image is set as a bright point, and when transmitted light and scattered light are detected as the detection light 132, the control is used. A point having a low brightness value in the acquired image with respect to the image may be detected as a bright point. In this way, the counting result of the particles 15 in the sample 10 can be obtained.
- the counting unit 150 is realized by executing the program for image analysis by using, for example, a circuit such as a processor and a storage device such as a memory, but it may be realized by a dedicated circuit.
- FIG. 3 is a plan view showing the configuration of the electrode set according to the embodiment.
- FIG. 3 shows the configuration of the electrode set 1111 when viewed in a plan view from the image sensor 140 side. Note that FIG. 3 shows a schematic configuration diagram showing a part of the electrode set 1111 for simplification.
- the electrode set 1111 has a first electrode 1112 and a second electrode 1113. Each of the first electrode 1112 and the second electrode 1113 is electrically connected to the power supply 120.
- the first electrode 1112 projects from the first base portion 1112a extending in the first direction (left-right direction on the paper surface in FIG. 3) and in the second direction (vertical direction on the paper surface in FIG. 3) intersecting the first direction. It has two first convex portions 1112b and. A first concave portion 1112c is formed between the two first convex portions 1112b.
- the length of each of the two first convex portions 1112b and the first concave portion 1112c in the first direction and the length in the second direction are, for example, about 5 micrometers.
- the sizes of the two first convex portions 1112b and the first concave portion 1112c are not limited to this.
- the shape and size of the second electrode 1113 are substantially the same as the shape and size of the first electrode 1112. That is, the second electrode 1113 also extends from the second base portion 1113a extending in the first direction (left-right direction on the paper surface in FIG. 3) and from the second base portion 1113a in the second direction (vertical direction on the paper surface in FIG. 3) intersecting the first direction. It includes two protruding second convex portions 1113b. A second concave portion 1113c is formed between the two second convex portions 1113b. The two second convex portions 1113b are arranged so as to face the two first convex portions 1112b of the first electrode 1112.
- the first electrode 1112 has a first convex portion 1112b that intersects in the first direction and projects from the first base portion 1112a in a direction that is convex toward the second electrode 1113.
- the second electrode 1113 has a second convex portion 1113b that intersects in the first direction and projects from the second base portion 1113a in a direction that is convex toward the first electrode 1112.
- the first convex portion 1112b and the second convex portion 1113b are formed so that the distance between the first electrode 1112 and the second electrode 1113 differs depending on the position in the first direction. Due to the different distances between the first electrode 1112 and the second electrode 1113, when an AC voltage is applied to the electrode set 1111, an electric field gradient having different electric field strengths depending on the position, that is, a non-uniform electric field is formed. NS. That is, the electrode set 1111 may be formed with at least one portion having a different distance between the electrodes.
- the electrode set 1111 may have a configuration in which a convex portion is formed on one of the first electrode 1112 and the second electrode 1113, and the convex portion is not formed on the other of the first electrode 1112 and the second electrode 1113. Since the above can be achieved if there is at least one convex portion, the electrode set 1111 can be realized by the first electrode 1112 or the second electrode 1113 having at least one convex portion.
- the position of the electrode set 1111 is not limited to the first substrate 111.
- the electrode set 1111 may be arranged in the vicinity of the space 1121 without contacting the sample 10.
- the vicinity of the space 1121 means a range in which an electric field gradient can be formed in the sample 10 by the AC voltage applied to the electrode set 1111.
- an electric field gradient is formed, and when the particles 15 in the sample 10 are exposed to the electric field, the particles 15 are aggregated at a predetermined location by dielectrophoresis.
- dielectrophoresis when an electric field gradient is formed, the predetermined location where the particles 15 are aggregated differs depending on whether the particles 15 are subjected to positive dielectrophoresis or negative dielectrophoresis.
- the particles 15 move to a region where the electric field strength is high and are aggregated.
- the region where the electric field strength is high is a region including the position where the distance between the first electrode 1112 and the second electrode 1113 is the shortest by the first convex portion 1112b and the second convex portion 1113b. It is the first electric field region A shown.
- negative dielectrophoresis is applied to the particles 15, the particles 15 move to a region where the electric field strength is low and are aggregated.
- the region where the electric field strength is low is a region including a position where the distance between the first electrode 1112 and the second electrode 1113 by the first convex portion 1112b and the second convex portion 1113b is the longest. More specifically, the region where the electric field strength is low is the region between the first recess 1112c and the second recess 1113c, and in particular, the electric field strength becomes lower as the distance from the first electric field region A increases. That is, in the figure, for example, the particles 15 subjected to negative dielectrophoresis are aggregated in the second electric field region B shown by the broken line circle.
- FIG. 4 is a diagram illustrating aggregation and diffusion of particles according to the embodiment.
- FIG. 4A is a diagram showing particles 15 aggregated by the first dielectrophoresis.
- FIG. 4B is a diagram showing particles 15 diffused by the second dielectrophoresis (in other words, aggregated by the dielectrophoretic force in the second direction).
- images of the first electrode 1112 and the second electrode 1113 viewed from the same direction as in FIG. 3 are shown, and particles 15 are shown as black dots in the figure.
- the first electrode 1112 in the drawing has a first convex portion 1112b protruding in both the upper and lower directions. In the second electrode 1113 in the figure, the first convex portion 1112b protrudes in both the upper and lower directions.
- the particles 15 are aggregated between the first convex portion 1112b and the second convex portion 1113b by dielectrophoresis. This is because the positive dielectrophoresis acted on the particles 15 and the particles 15 moved to the region where the electric field strength was high and aggregated.
- the particles 15 may overlap each other and may not be counted accurately.
- the particles 15 aggregated by the dielectrophoretic force in the first direction are aggregated by applying a dielectrophoretic force in the second direction different from the dielectrophoretic force in the first direction.
- the resulting particles 15 are diffused.
- the particles 15 are diffused from the initial agglutination position by the dielectrophoretic force in the second direction, so that the overlap at the initial agglutination position is suppressed, and more accurate counting can be performed. It can be carried out.
- the dielectrophoretic force in the first direction and the dielectrophoretic force in the second direction have different directions of the dielectrophoretic force.
- the overlap of the particles 15 is suppressed by changing from the positive dielectrophoretic force to the negative dielectrophoretic force.
- changing to a dielectrophoretic force with a different direction means that when the dielectrophoretic force changes from a positive dielectrophoretic force to another positive dielectrophoretic force with a different direction, the negative dielectrophoretic force changes to another negative dielectrophoretic force with a different direction.
- the particles 15 are agglomerated in a predetermined electric field region having a high or low electric field strength by the dielectrophoretic force in the first direction, and different aggregating forces are applied by the dielectrophoretic force in the second direction having different aggregation positions, and the predetermined electric field is applied. Diffuse the particles 15 from the region.
- the counting device 100 of the present embodiment can accurately count the particles 15 by such a method.
- FIG. 5 is a diagram illustrating a change in dielectrophoretic force according to the embodiment.
- FIG. 6 is a second diagram illustrating a change in dielectrophoretic force according to the embodiment.
- a method of switching the direction of the dielectrophoretic force a method of reversing the positive and negative of the dielectrophoretic force will be described.
- Whether the positive or negative dielectrophoretic force acts has a correlation between the particles 15 and the properties of the liquid in which the electric field is formed, and in particular, the real-part of the Clausius-Mossotti coefficient. Evaluated by Clausius-Mossotti factor). If the real part of the Clausius-Mossotti coefficient is positive, a positive dielectrophoretic force acts on the particle 15 and the particle 15 moves to a region where the electric field strength is higher. On the contrary, if the real part of the Clausius-Mossotti coefficient is negative, a negative dielectrophoretic force acts on the particles 15 and the particles 15 move to a region where the electric field strength is lower.
- 5 and 6 show graphs showing the relationship between the real part of the Clausius-Mossotti coefficient on the vertical axis and the frequency of the AC voltage applied between the electrode sets 1111 on the horizontal axis. There is.
- the real part of the Claudius mossotti coefficient becomes a positive value at the AC voltage in the low frequency region
- the real part of the Claudius mossotti coefficient becomes a positive value at the AC voltage in the high frequency region. It can be seen that the value is negative. Therefore, in order to reverse the positive and negative of the dielectrophoretic force, for example, there is a method of changing the frequency of the AC voltage applied during the electrode set 1111.
- an AC voltage in a low frequency region where the real part of the Clausius-Mossotti coefficient becomes a positive value is applied between the electrode sets 1111.
- the particles 15 are aggregated in a region having a high electric field strength by a positive dielectrophoretic force.
- an AC voltage in a high frequency region in which the real part of the Clausius-Mossotti coefficient becomes a negative value is applied between the electrode sets 1111.
- the particles 15 are diffused toward a region where the electric field strength is low by a negative dielectrophoretic force.
- an AC voltage of the first frequency F1 is applied between the electrode sets 1111 to agglomerate the particles 15.
- the particles 15 are diffused by applying an AC voltage of the second frequency F2 having a frequency higher than that of the first frequency F1 between the electrode sets 1111.
- the dielectrophoretic force in the first direction and the dielectrophoretic force in the second direction may be interchanged between positive and negative.
- the power supply 120 changes the applied AC voltage. That is, the power supply 120 is an example of the control unit.
- the control unit may be a device provided separately from the power supply, and may change the frequency of the AC voltage applied from the power supply 120 by transmitting a control signal to the power supply 120.
- An AC voltage of frequency F is applied.
- the particles 15 are aggregated in a region having a high electric field strength by a positive dielectrophoretic force.
- an AC voltage having a predetermined frequency F is applied between the electrode sets 1111 in the environment of the second conductivity S2.
- the particles 15 are diffused toward a region where the electric field strength is low by a negative dielectrophoretic force.
- an AC voltage of a predetermined frequency F is applied in the environment of the first conductivity S1
- the dielectrophoretic force in the second direction is applied.
- An AC voltage of a predetermined frequency F is applied in an environment of a second conductivity S2 smaller than the first conductivity S1.
- a chelating agent that forms a chelate precipitate is added to the ionic components constituting the solvent of the sample 10.
- the dielectrophoretic force in the first direction and the dielectrophoretic force in the second direction may be interchanged between positive and negative.
- a solution or salt containing ions may be added to the sample 10.
- the adding device (not shown) for adding the killing agent or the solution or salt containing ions changes the conductivity in the environment around the particles 15. That is, the addition device is an example of the control unit.
- the control unit may be a device provided separately from the addition device, and by transmitting a control signal to the addition device, a killing agent or a solution or salt containing ions is added from the addition device. You may.
- the dielectrophoretic force in the first direction and the dielectrophoretic force in the second direction may include a case where the directions are the same and the positions where the particles 15 are aggregated are different.
- the agglomerated particles 15 are diffused by changing the dielectrophoretic force in the first direction to the dielectrophoretic force in the second direction in which the direction of the dielectrophoretic force is different.
- the dielectrophoretic force in the first direction and the dielectrophoretic force in the second direction may have different magnitudes and directions of the dielectrophoretic force.
- FIG. 7 is a flowchart showing a counting method according to the embodiment.
- the particles 15 are aggregated at a predetermined position by applying a positive or negative dielectrophoretic force in the first direction to the sample 10 containing the particles 15 (aggregation step S110). Then, the aggregated particles 15 are diffused by applying a dielectrophoretic force in the second direction different from the dielectrophoretic force in the first direction (diffusion step S120). Specifically, as described above, the dielectrophoretic force in the second direction, which is different in the direction, is applied to the dielectrophoretic force in the first direction applied in the agglutination step S110. By changing the force acting for the aggregation of the particles 15, the aggregation due to the dielectrophoretic force in the first direction changes, and the overlapping of the particles 15 is suppressed.
- the image sensor 140 receives the detection light 132 and images an image (imaging step S130).
- the image captured in the imaging step S130 is a diffused image including the diffused particles 15.
- the counting unit 150 determines the number of particles 15 in the sample 10 by performing image analysis using the diffused image (counting step S140). As described above, it is possible to suppress the occurrence of false negatives due to the overlapping of the particles 15 in the sample 10 and to count the particles 15 more accurately.
- FIG. 8 is a flowchart showing a counting method according to a modified example of the embodiment.
- the counting method according to the modified example shown in FIG. 8 is different from the counting method of the above-described embodiment in that the pre-imaging step S115 and the tracking step S135 are performed.
- the image sensor 140 receives the detection light 132 and receives an image.
- the image captured in the pre-imaging step S115 is an aggregated image including the aggregated particles 15.
- FIG. 9 is a diagram showing an aggregated image and a diffused image according to a modified example of the embodiment. As shown in FIG. 9A, in the aggregated image in this modified example, the particles 15 are formed by the first convex portion 1112b of the first electrode 1112 by the action of positive dielectrophoresis as the dielectrophoretic force in the first direction.
- the particles 15 include the plurality of first convex portions 1112b and the plurality of first convex portions 1113b. It aggregates between the second convex portions 1113b to form a cluster.
- a first cluster CLa, a second cluster CLb, and a third cluster CLc are formed between the three first convex portions 1112b and the three second convex portions 1113b, respectively.
- the particles 15 are diffused by the dielectrophoretic force in the second direction, and the diffused image shown in FIG. 9B is imaged (diffusion step S120 and imaging step S130). Further, the counting unit 150 acquires the aggregated image and the diffused image output as described above, and tracks the particles 15 included in the aggregated image based on these (tracking step S135). In the tracking step S135, the particles 15 diffused in the diffusion step S120 are included in the particles 15 contained in the first cluster CLa aggregated in the first position and the particles contained in the second cluster CLb aggregated in the second position in the aggregation step S110. It is possible to specify whether the particles are 15 or the particles 15 contained in the third cluster CLc aggregated at the third position.
- FIG. 10 is a diagram showing a tracking step according to a modified example of the embodiment.
- a plan view of the electrode set 1111 viewed from the same viewpoint as in FIG. 3 and an enlarged view of the first cluster CLa on the plan view are shown.
- images acquired in chronological order from the left to the right of the paper are shown, the left image is an aggregated image, and the center and right images are diffuse images.
- the first cluster CLa will be described as an example, but the same applies to the second cluster CLb, the third cluster CLc, and other clusters.
- the counting unit 150 operates as follows in the tracking step S135.
- the bright spot of the particle 15 or the bright spot of the cluster containing the particle 15 is detected. These bright spots are detected by identifying pixels in which the difference in luminance value with respect to the control image is equal to or greater than the threshold value as described above.
- the particles 15 may overlap each other, it is not necessary to detect each particle 15 individually.
- the bright spot of the particle 15 is detected in the diffused image.
- Particles 15 can be detected substantially individually in the diffused image after diffusion with respect to the aggregated image.
- the detectability of the particles 15 is improved.
- the time from the start of diffusion to the acquisition of the diffusion image is set to be excessively long, the particles 15 from different clusters cannot be distinguished from each other, and the particles 15 may not be tracked.
- the diffusion rate of the particles 15 depends on the properties of the particles 15, an appropriate time from the start of diffusion to the acquisition of a diffused image may be set in advance by a preliminary experiment or the like.
- the image sensor 140 outputs a moving image in which the image is continuously acquired, and the counting unit 150 extracts a diffused image at the timing when the particles 15 are appropriately diffused, and tracks and counts the particles 15. You may.
- the counting unit 150 estimates the movement vector of the bright spots of the particles 15 detected in the diffused image by using an algorithm such as pattern matching, and identifies from which cluster each particle 15 is diffused. As a result, the number of particles 15 contained in each cluster can be counted for each cluster. In particular, as shown in the figure, in a situation where a cluster of particles 15a aggregated by negative dielectrophoresis and a cluster of particles 15a aggregated by positive dielectrophoresis coexist in a plurality of clusters, at the same time and respectively. Accurate counting can be performed individually.
- FIG. 11 is a diagram showing a complex formation process according to a modified example of the embodiment.
- each of the above particles 15 is a complex particle 13
- each of the above particles 15a is described as an unbound particle 12 or a contaminant 14.
- Each of the above particles 15 may be an unbound particle 12 or a contaminant 14, and each of the above particles 15a may be a complex particle 13.
- particles are counted using the counting device 100 for the purpose of counting the substance to be detected 11. That is, among the particles in the sample 10, the particles containing the substance to be detected, which is a predetermined detection target, are selectively counted.
- the composite particle 13 is a combination of the substance to be detected 11 and the dielectric particles 12a modified with a substance having a property of specifically binding to the substance to be detected 11 (hereinafter, referred to as a specific binding substance 12b). Is. That is, in the complex particle 13, the substance to be detected 11 and the dielectric particle 12a are bonded to each other via the specific binding substance 12b.
- the dielectric particles 12a have the same structure as the above-mentioned particles 15.
- the specific binding substance 12b is a substance that can specifically bind to the substance to be detected 11.
- combinations of the specific binding substance 12b to the substance to be detected 11 include an antibody against an antigen, an enzyme against a substrate or a coenzyme, a receptacle against a hormone, a protein A or protein G against an antibody, avidins against biotin, a carmodulin against calcium, and a sugar.
- tag-binding substances such as nickel-nitrillotriacetic acid and glutathione for peptide tags such as lectin, 6 ⁇ histidine and glutathione S transferase.
- the unbound particles 12 are dielectric particles 12a modified with a specific binding substance 12b that does not form the complex particles 13. That is, the unbound particles 12 are dielectric particles 12a modified with a specific binding substance 12b that is not bound to the substance to be detected 11.
- the unbound particles 12 are also referred to as free (F) components.
- the dielectric particles 12a contained in the complex particles 13 are also referred to as bind (B) components.
- the contaminants 14 are particles such as dust mixed in the detection system (here, in the sample 10), and broken pieces of the constituents constituting the counting device 100 and the like.
- a substance to be detected 11 such as a virus particle, a dielectric particle 12a (unbound particle 12) modified with an anti-virus antibody as a specific binding substance 12b, and a contaminant 14
- a substance to be detected 11 such as a virus particle, a dielectric particle 12a (unbound particle 12) modified with an anti-virus antibody as a specific binding substance 12b, and a contaminant 14
- the substance to be detected 11 and the unbound particles 12 form the complex particles 13 as shown in FIG. 11 (b) by diffusion and collision in the liquid.
- the unbound particles 12 are probably added so that the unbound substance 11 to be detected does not remain. Therefore, as shown in the figure, the unbound particles 12 are in a state of being excessively present.
- counting is performed so that one of the positive and negative dielectrophoresis acts on the composite particle 13 and the other of the positive and negative dielectrophoresis acts on the unbound particles 12 and the contaminants 14.
- the composite particles 13 and the other particles form different clusters and are aggregated.
- the operating conditions are set by the AC voltage applied to the electrode set, the conductivity of the sample 10 in the solvent, and the like.
- the complex particles 13 correspond to the particles 15, and the other particles correspond to the particles 15a.
- the operating conditions corresponding to are used.
- the composite particles 13 and the other particles are aggregated at different positions from each other, and then each is accurately counted by diffusion, so that the particles contained in the sample 10 are included.
- the substance to be detected 11 which is a predetermined detection target can be selectively and accurately counted.
- the electrode set on the first substrate is arranged so that the first convex portion and the second convex portion face each other and the first concave portion and the second concave portion face each other.
- the arrangement of the set is not limited to this.
- the first convex portion and the second concave portion may face each other, and the first concave portion and the second convex portion may face each other.
- the electrode set may be configured so as to form an electric field gradient suitable for various counts.
- the number of electrodes included in the electrode set is not limited to two, and may be three or more.
- the electrode set shown in FIG. 4 includes a second electrode arranged outside the drawing in both the vertical direction of the paper surface in addition to the first electrode in the drawing as described above.
- Such an electrode set includes three or more electrodes, and a phase difference is provided in the AC voltage applied to the adjacent electrodes.
- such an electrode set may be called a Castled electrode.
- the counting device 100 may further include a second electrode set 1811 in addition to the first electrode set 1111.
- FIG. 12 is a circuit diagram including a first electrode set and a second electrode set according to a modified example of the embodiment.
- the first electrode set 1111 includes the first electrode 1112 and the second electrode 1113.
- the second electrode set 1811 includes a third electrode 1812 and a fourth electrode 1813.
- the control unit instructs the switch 1901 to connect the voltage source 120 and the first electrode 1112, and instructs the switch 1902 to connect the voltage source 120 and the second electrode 1113, and connects the power supply 120 to the first electrode. Instructs to generate an AC voltage of frequency. As a result, the dielectrophoretic force in the first direction acts on the particles 15 in the agglutination step.
- the control unit instructs the switch 1901 to connect the voltage source 120 and the third electrode 1812, and instructs the switch 1902 to connect the voltage source 120 and the fourth electrode 1813, and connects the power supply 120 to the second electrode. Instructs to generate an AC voltage of frequency. As a result, the dielectrophoretic force in the second direction acts on the particles 15 in the diffusion step.
- It can be used as a counting device for counting dielectric particles.
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Abstract
第1方向の誘電泳動力を作用させて、試料(10)中の粒子(15)を凝集させる凝集ステップ(S110)と、第1方向の誘電泳動力とは異なる第2方向の誘電泳動力を作用させて、凝集された粒子(15)を拡散させる拡散ステップ(S120)と、拡散された粒子(15)を含む拡散画像を撮像する撮像ステップ(S130)と、撮像された拡散画像に基づいて粒子(15)の数を決定する計数ステップ(140)と、を含む計数方法。
Description
本開示は、試料中に含まれる粒子を計数するための計数方法及び計数装置に関する。
従来、試料液中の誘電体粒子を誘電泳動によって捕集して、当該誘電体粒子が捕集された箇所を撮像した画像を解析することにより、試料液中に含まれる誘電体粒子を計数する計数方法が知られている(特許文献1参照)。
しかしながら、特許文献1に開示された計数方法では、試料中に多数の誘電体粒子が存在する場合に偽陰性が生じて正確な計数ができない場合がある。
そこで、本開示は、偽陰性の発生を低減し、より正確に粒子の計数が可能な計数方法等を提供する。
本開示の一態様に係る計数方法は、第1方向の誘電泳動力を作用させて、試料中の粒子を凝集させる凝集ステップと、前記第1方向の誘電泳動力とは異なる第2方向の誘電泳動力を作用させて、凝集された前記粒子を拡散させる拡散ステップと、前記拡散された粒子を含む拡散画像を撮像する撮像ステップと、前記拡散画像に基づいて前記粒子の数を決定する計数ステップと、を含む。
本開示の一態様に係る計数装置は、粒子を含む試料を収容する収容部と、前記収容部に収容された前記試料に対して電場勾配を発生する電場勾配発生部と、前記電場勾配発生部を制御することで、発生する前記電場勾配により、前記粒子に第1方向の誘電泳動力を作用させて前記粒子を凝集させ、凝集された前記粒子に前記第1方向の誘電泳動力とは異なる第2方向の誘電泳動力を作用させて、凝集された前記粒子を拡散させる制御部と、拡散された前記粒子を含む拡散画像を撮像する撮像部と、撮像された前記拡散画像に基づいて前記粒子の数を決定する計数部と、を備える。
なお、これらの包括的又は具体的な態様は、システム、装置、集積回路、コンピュータプログラム又はコンピュータ読み取り可能なCD-ROMなどの記録媒体で実現されてもよく、方法、装置、システム、方法、集積回路、コンピュータプログラム及び記録媒体の任意な組み合わせで実現されてもよい。コンピュータ読み取り可能な記録媒体は、例えばCD-ROM(Compact Disc-Read Only Memory)などの不揮発性の記録媒体を含む。
本開示の計数方法等によれば、より正確な粒子の計数が可能となる。
(開示に至った経緯)
試料中(以下、試料液中ともいう)に含まれる粒子を計数するための計数方法として、誘電泳動を利用した技術が知られている。例えば、特許文献1には、計数対象の粒子である誘電体粒子を誘電泳動によって計数する計数方法が開示されている。具体的には、特許文献1では、誘電泳動によって、複数のスリット領域の各々に誘電体粒子を捕集させ、複数のスリット領域のうち誘電体粒子によって飽和したスリット領域の数をカウントすることで、試料液中に含まれる誘電体粒子を計数している。
試料中(以下、試料液中ともいう)に含まれる粒子を計数するための計数方法として、誘電泳動を利用した技術が知られている。例えば、特許文献1には、計数対象の粒子である誘電体粒子を誘電泳動によって計数する計数方法が開示されている。具体的には、特許文献1では、誘電泳動によって、複数のスリット領域の各々に誘電体粒子を捕集させ、複数のスリット領域のうち誘電体粒子によって飽和したスリット領域の数をカウントすることで、試料液中に含まれる誘電体粒子を計数している。
一般に、誘電泳動は、上記のように所定の箇所に誘電体粒子を捕集させる(言い換えると、凝集させる)技術であり、当該所定の箇所に向けて誘電体粒子を移動させることができる。したがって、試料中に多数の誘電体粒子が存在する場合、多数の誘電体粒子は、所定の箇所に凝集されて三次元的に集積される。つまり、一方向から撮像装置等によって撮像した画像では、集積に伴う誘電体粒子同士の重なり合いを識別することは困難であり、実際に含まれる数よりも少ない数しか計数できない、いわゆる、偽陰性が生じてしまう。
このような背景から、上記の特許文献1等で知られるような従来の計数方法では、誘電体粒子の正確な計数が困難であった。
そこで、本開示に係る計数方法等では、第1の誘電泳動(つまり第1方向の誘電泳動力)の作用によって凝集された粒子に、第2の誘電泳動(つまり第2方向の誘電泳動力)を作用させることで、第1方向の誘電泳動による凝集を拡散させる。これにより、本開示に係る計数方法等によれば、粒子同士の重なり合いの影響が低減した状態で粒子の計数を行うことができ、凝集に伴う偽陰性の発生が低減されて、より正確に粒子を計数することができる。
(開示の概要)
本開示の一態様に係る計数方法は、第1方向の誘電泳動力を作用させて、試料中の粒子を凝集させる凝集ステップと、第1方向の誘電泳動力とは異なる第2方向の誘電泳動力を作用させて、凝集された粒子を拡散させる拡散ステップと、拡散された粒子を含む拡散画像を撮像する撮像ステップと、撮像された拡散画像に基づいて粒子の数を決定する計数ステップと、を含む。
本開示の一態様に係る計数方法は、第1方向の誘電泳動力を作用させて、試料中の粒子を凝集させる凝集ステップと、第1方向の誘電泳動力とは異なる第2方向の誘電泳動力を作用させて、凝集された粒子を拡散させる拡散ステップと、拡散された粒子を含む拡散画像を撮像する撮像ステップと、撮像された拡散画像に基づいて粒子の数を決定する計数ステップと、を含む。
このような計数方法では、第1方向の誘電泳動力によって凝集された粒子を、異なる第2方向の誘電泳動力によって拡散させる。つまり、凝集によって粒子同士が重なり合うことで、2つの粒子が1つに見えるなどの偽陰性の発生を抑制できる。よって、本開示の計数方法では、凝集に伴う偽陰性の発生が低減されて、より正確に粒子を計数することができる。
例えば、凝集ステップでは、誘電泳動力を作用させるための電場勾配を発生する電極セットの間に第1周波数の交流電圧を印加し、拡散ステップでは、電極セットの間に第1周波数とは異なる第2周波数の交流電圧を印加してもよい。
これによれば、本開示の計数方法では、誘電泳動力の方向を、電極セットの間に印加される交流電圧の周波数によって調整できる。このように、周波数の調整で誘電泳動力の方向を変化させ、凝集された粒子を拡散させることができる。よって、本開示の計数方法では、凝集に伴う偽陰性の発生が低減されて、より正確に粒子を計数することができる。
例えば、凝集ステップでは、誘電泳動力を作用させるための電場勾配を発生する第1の電極セットの間に第1周波数の交流電圧を印加し、拡散ステップでは、第1の電極セットとは異なる第2の電極セットの間に第1周波数とは異なる第2周波数の交流電圧を印加してもよい。
これによれば、本開示の計数方法では、誘電泳動力の方向を、第1の電極セットおよび第2の電極セットのそれぞれに印加される交流電圧の周波数によって調整できる。このように、2つの電極セットに印加される周波数の調整で誘電泳動力の方向を変化させ、粒子を凝集および拡散させることができる。よって、本開示の計数方法では、凝集に伴う偽陰性の発生が低減されて、より正確に粒子を計数することができる。
例えば、拡散ステップでは、凝集ステップにおける第1方向の誘電泳動力よりも大きい第2方向の誘電泳動力を作用させてもよい。
これによれば、本開示の計数方法では、凝集ステップよりも拡散ステップにおいてより大きな誘電泳動力を作用させることができ、凝集した粒子をより確実に拡散させることができる。よって、本開示の計数方法では、凝集に伴う偽陰性の発生が低減されて、より正確に粒子を計数することができる。
例えば、第1周波数の交流電圧の印加では、粒子に正の誘電泳動力及び負の誘電泳動力の一方が作用され、第2周波数の交流電圧の印加では、粒子に正の誘電泳動力及び負の誘電泳動力の他方が作用されてもよい。
これによれば、正の誘電泳動力又は負の誘電泳動力のいずれが作用されるかを、電極セットの間に印加される交流電圧の周波数によって調整できる。このように、周波数の調整で誘電泳動力の方向を変化させ、凝集された粒子を拡散させることができる。よって、本開示の計数方法では、凝集に伴う偽陰性の発生が低減されて、より正確に粒子を計数することができる。
例えば、誘電泳動力を作用させるための電場勾配を発生する電極セットの間には、凝集ステップにおいて、第1導電率の環境中で交流電圧が印加され、拡散ステップにおいて、第1導電率とは異なる第2導電率の環境中で交流電圧が印加されてもよい。
これによれば、本開示の計数方法では、誘電泳動力の方向を、粒子の周囲の環境中における導電率によって調整できる。このように、導電率の調整で誘電泳動力の方向を変化させ、凝集された粒子を拡散させることができる。よって、本開示の計数方法では、凝集に伴う偽陰性の発生が低減されて、より正確に粒子を計数することができる。
例えば、第1導電率の環境中での交流電圧の印加では、粒子に正の誘電泳動力及び負の誘電泳動力の一方が作用され、第2導電率の環境中での交流電圧の印加では、粒子に正の誘電泳動力及び負の誘電泳動力の他方が作用されてもよい。
これによれば、正の誘電泳動力又は負の誘電泳動力のいずれが作用されるかを、粒子の周囲の環境中における導電率によって調整できる。このように、導電率の調整で誘電泳動力の方向を変化させ、凝集された粒子を拡散させることができる。よって、本開示の計数方法では、凝集に伴う偽陰性の発生が低減されて、より正確に粒子を計数することができる。
例えば、さらに、凝集ステップ以降、かつ、拡散ステップよりも前に、凝集された粒子を含む凝集画像を撮像する前撮像ステップと、撮像された凝集画像及び拡散画像に基づいて凝集画像に含まれる粒子を追跡する追跡ステップと、を含んでもよい。
これによれば、本開示の計数方法では、粒子が拡散する前後の凝集画像及び拡散画像に基づいて粒子の計数を行える。例えば、拡散の過程で別々の軌道をたどる粒子同士が偶発的に重なり合う場合に、別々の軌道に基づいて粒子同士を個別に計数することができる。よって、本開示の計数方法では、凝集に伴う偽陰性の発生が低減されて、より正確に粒子を計数することができる。
例えば、追跡ステップでは、拡散ステップにおいて拡散された粒子を、凝集ステップにおいて第1位置に凝集した粒子、又は、第1位置とは異なる第2位置に凝集した粒子のいずれであるかを特定してもよい。
これによれば、本開示の計数方法では、第1位置及び第2位置のそれぞれに凝集された粒子を位置ごとに個別に計数することができる。例えば、第1位置及び第2位置が正の誘電泳動及び負の誘電泳動のそれぞれによって凝集される位置である場合に、これらの異なる誘電泳動の作用によって凝集された粒子を同時に、かつ、正確に計数することができる。よって、本開示の計数方法では、複数の位置のそれぞれについて、凝集に伴う偽陰性の発生が低減されて、同時に、かつ、より正確に粒子を計数することができる。
例えば、計数ステップでは、凝集画像及び拡散画像に基づいて、粒子のうち、所定の検出対象である被検出物質を含む粒子を選択的に計数してもよい。
これによれば、複数種類の粒子を含む試料から、特定の粒子を選択的に計数することができる。
本開示の一態様に係る計数装置は、粒子を含む試料を収容する収容部と、収容部に収容された試料に対して電場勾配を発生する電場勾配発生部と、電場勾配発生部を制御することで、発生する電場勾配により、粒子に第1方向の誘電泳動力を作用させて粒子を凝集させ、凝集された粒子に第1方向の誘電泳動力とは異なる第2方向の誘電泳動力を作用させて、凝集された粒子を拡散させる制御部と、拡散された粒子を含む拡散画像を撮像する撮像部と、撮像された拡散画像に基づいて粒子の数を決定する計数部と、を備える。
これによれば、上記の計数方法と同様の効果を奏する計数装置が実現される。
なお、これらの包括的又は具体的な態様は、システム、装置、集積回路、コンピュータプログラム又はコンピュータで読み取り可能なCD-ROMなどの記録媒体で実現されてもよく、システム、方法、集積回路、コンピュータプログラム及び記録媒体の任意な組み合わせで実現されてもよい。
以下、実施の形態について、図面を参照しながら具体的に説明する。
なお、以下で説明する実施の形態は、いずれも包括的または具体的な例を示すものである。以下の実施の形態で示される数値、形状、材料、構成要素、構成要素の配置位置及び接続形態、ステップ、ステップの順序などは、一例であり、請求の範囲を限定する主旨ではない。各図は、必ずしも厳密に図示したものではない。各図において、実質的に同一の構成については同一の符号を付し、重複する説明は省略又は簡略化する場合がある。
以下において、平行及び垂直などの要素間の関係性を示す用語、及び、矩形状などの要素の形状を示す用語、並びに、数値範囲は、厳格な意味のみを表すのではなく、実質的に同等な範囲、例えば数%程度の差異をも含むことを意味する。
以下において、粒子を計数するとは、1個以上であるか又は0個であるかの判定に基づき試料中の粒子を見つけ出して粒子の存在を確認することに加えて、粒子の量(例えば数又は濃度等)又はその範囲を測定することを含む。同様に被検出物質を計数するとは、1個以上であるか又は0個であるかの判定に基づき試料中の被検出物質を見つけ出して被検出物質の存在を確認することに加えて、被検出物質の量(例えば数又は濃度等)又はその範囲を測定することを含む。計数の対象となる粒子は、試料中に含まれる全ての粒子であってもよいし、試料中に含まれる複数の粒子のうちの一部であってもよい。
第2方向の誘電泳動力により粒子が拡散されるとは、単に、第1方向の誘電泳動力によって粒子が凝集された位置から放射状の第2方向に拡散させることと、第1方向の誘電泳動力によって粒子が凝集された位置とは異なる位置に粒子を凝集させて、元の位置から拡散させることとを含む概念である。
(実施の形態)
本実施の形態では、液体中で粒子が誘電泳動(DEP:Dielectrophoresis)によって凝集され、さらに凝集された粒子を拡散させることで、凝集に伴う粒子同士の重なり合いを抑制して当該粒子の計数を行う。
本実施の形態では、液体中で粒子が誘電泳動(DEP:Dielectrophoresis)によって凝集され、さらに凝集された粒子を拡散させることで、凝集に伴う粒子同士の重なり合いを抑制して当該粒子の計数を行う。
誘電泳動とは、不均一な電場(以下、電場勾配ともいう)にさらされた誘電体粒子に力が働く現象である。この力は、粒子の帯電を要求しない。
以下に、誘電泳動を用いた被検出物質粒子の計数を実現する計数装置及び計数方法の実施の形態について、図面を参照しながら具体的に説明する。
[計数装置の構成]
まず、計数装置の構成について図1及び図2を参照しながら説明する。図1は、実施の形態に係る計数装置の概略構成を示す斜視図である。図2は、実施の形態に係る計数装置の概略構成を示す断面図である。図1では、特に、収容部110は、第1基板111を除く部分を透過することで、収容部110の内部が見えるよう、概形を示している。図1は、収容部110を中心にその他の構成要素との関係性を説明するために用いられ、計数装置100が使用される際の各々の構成要素の配置位置、配置方向、姿勢等を限定するものではない。図2は、図1に示す収容部110を紙面と平行な方向に沿って切断した断面図である、なお、図2に示す収容部110の一部の構成の厚みは、図1において図示が省略されている。
まず、計数装置の構成について図1及び図2を参照しながら説明する。図1は、実施の形態に係る計数装置の概略構成を示す斜視図である。図2は、実施の形態に係る計数装置の概略構成を示す断面図である。図1では、特に、収容部110は、第1基板111を除く部分を透過することで、収容部110の内部が見えるよう、概形を示している。図1は、収容部110を中心にその他の構成要素との関係性を説明するために用いられ、計数装置100が使用される際の各々の構成要素の配置位置、配置方向、姿勢等を限定するものではない。図2は、図1に示す収容部110を紙面と平行な方向に沿って切断した断面図である、なお、図2に示す収容部110の一部の構成の厚みは、図1において図示が省略されている。
図1及び図2に示すように、計数装置100は、収容部110と、電源120と、光源130と、撮像素子140と、計数部150とを備える。
収容部110は、粒子15を含む試料10を収容する容器であり、空間1121を内部に有する。試料10は、当該空間1121に収容される。空間1121に収容された試料10は、空間1121内で誘電泳動が作用され、試料10に粒子15が含まれていた場合、粒子15は、誘電泳動の作用によって移動される。このように、収容部110内に設けられた空間1121は、計数装置100における誘電泳動の場を成す。
ここで、粒子15とは、上記したように誘電性を示す粒形の物質であり、ポリスチレンビーズ及びガラスビーズなどの単素材物質の他、これらのビーズに機能性物質が付加された複合物質、ならびに、巨視的に誘電体粒子とみなすことができる生細胞等である。粒子15は、計数装置100の用途に応じて適宜決定され、粒子15の物性等に応じて、誘電泳動の際の諸条件が設定される。以下の説明では、粒子15がポリスチレンビーズであるものとして説明するが、上記のように、粒子15の構成及びサイズに特に限定はない。様々な粒子15を計数対象として、計数装置100を適用することができる。
ここで、収容部110の内部構成について説明する。図2に示すように、収容部110は、第1基板111と、スペーサ112と、第2基板113と、を備える。
第1基板111は、例えばガラス又は樹脂製のシートである。第1基板111は、空間1121の底を規定する上面を有し、当該上面には、電源120から交流電圧が印加される電極セット1111が形成される。空間1121に試料10が収容された際に、試料10と電極セット1111とが電気的に接触するよう、電極セット1111は、空間1121に接して形成されている。
電極セット1111は、具体的に、第1電極1112及び第2電極1113を含む。電極セット1111に対して電源から印加された交流電圧によって、電極セット1111は、第1基板111上に不均一な電場(電場勾配)を生成する(発生する又は形成する)ことができる。このように、電極セット1111は、電場勾配発生部の一例である。なお、電極セット1111の詳細については、図3を用いて後述する。
スペーサ112は、第1基板111上に配置される。スペーサ112には、空間1121の形状に対応する貫通孔が形成されている。空間1121は、第1基板111及び第2基板113に挟まれた貫通孔によって形成される。つまり、スペーサ112は、貫通孔を囲む外壁であり、空間1121を規定する内側面を有する。スペーサ112は、例えば、第1基板111及び第2基板113との密着性が高い樹脂等の材料で構成される。
第2基板113は、例えばガラス又は樹脂製の透明なシートであり、スペーサ112上に配置される。例えば、第2基板113としては、ポリカーボネート基板を用いることができる。第2基板113には、空間1121に繋がる供給孔1131及び排出孔1132が形成されている。試料10は、供給孔1131を介して空間1121に供給され、排出孔1132を介して空間1121から排出される。なお、第2基板113を備えずに収容部110を構成してもよい。つまり、第2基板113は、必須の構成要素ではない。この場合、収容部110が容器として成立するための空間1121は、底及び内側面をそれぞれ規定する第1基板111及びスペーサ112で形成される。
電源120は、交流電源であり、第1基板111の電極セット1111に交流電圧を印加する。
なお、電源120は、交流電圧を供給できればどのような電源であってもよく、上記に述べたような特定の電源に限定されない。交流電圧は外部電源から供給されてもよく、この場合、電源120は、計数装置100に含まれなくてもよい。以下では、電源120の内部構成を省略して簡略化して図示する。
光源130は、空間1121内の試料10に照射光131を照射する。照射光131は、第2基板113を介して試料10中の粒子15に照射される。粒子15からは、照射光131に応じた検出光132が生じ、当該検出光132を検出することで、粒子15の検出が行われる。例えば、照射光131として、特定の蛍光物質を励起する励起光を照射してもよい。粒子15を形成するポリスチレンに蛍光物質が分散されていれば、照射された励起光に応じて蛍光が生じ、当該蛍光を検出することで、蛍光物質の存在、すなわち粒子15の存在を検出することができる。
光源130としては、公知の技術を特に限定することなく利用することができる。例えば半導体レーザ、ガスレーザ等のレーザを光源130として用いることができる。光源130から照射される照射光131の波長としては、粒子15を構成する物質と相互作用が小さい波長(例えば400nm~2000nm)が用いられてもよい。さらには、照射光131の波長としては、半導体レーザが利用できる波長(例えば600nm~850nm)が用いられてもよい。
なお、光源130は、計数装置100に含まれなくてもよい。例えば、粒子15が大きい場合には、粒子15に蛍光物質が含まれなくてもよい。この場合、粒子15に励起光が照射されなくてもよいため、照射光131として、太陽及び蛍光灯などから照射される外光が利用でき、光源130を備えることなく計数装置100を実現できる。
撮像素子140は、カメラ141に内蔵されたCMOSイメージセンサ及びCCDイメージセンサ等であり、粒子15から生じた検出光132を検出することで、粒子15を含む画像を生成する。撮像素子140は、第1基板111の板面に水平に配置されて、カメラ141に含まれるレンズ等の光学素子(不図示)を介して、電極セット1111に対応する箇所を撮像する。当該箇所に粒子15が存在すれば、照射光131によって生じた検出光132が撮像素子140に入射し、粒子15が検出される。
計数部150は、撮像素子140によって出力された画像を取得し、当該画像に基づき、試料10中に含まれる粒子15の数を決定する。例えば、計数部150は、予め撮像された粒子15を含まない対照画像を用いて、取得された画像と対照画像との比較により、輝度値の異なる輝点を検出する。具体的に、検出光132として発光を検出する場合、対照画像に対して取得された画像中の輝度値の高い点を輝点とし、検出光132として透過光及び散乱光を検出する場合、対照画像に対して取得された画像中の輝度値の低い点を輝点として検出すればよい。このようにして、試料10中の粒子15の計数結果を得ることができる。
計数部150は、例えば、プロセッサ等の回路とメモリ等の記憶装置とを用いて、上記画像解析のためのプログラムが実行されることで実現されるが、専用の回路によって実現されてもよい。
[電極セットの形状及び配置]
次に、第1基板111上の電極セット1111の形状及び配置について、図3を参照しながら説明する。図3は、実施の形態に係る電極セットの構成を示す平面図である。図3では、撮像素子140側から平面視した場合の電極セット1111の構成が示されている。なお、図3では、簡略化のため、電極セット1111の一部分を示す概略構成図が示されている。
次に、第1基板111上の電極セット1111の形状及び配置について、図3を参照しながら説明する。図3は、実施の形態に係る電極セットの構成を示す平面図である。図3では、撮像素子140側から平面視した場合の電極セット1111の構成が示されている。なお、図3では、簡略化のため、電極セット1111の一部分を示す概略構成図が示されている。
図3に示すように、電極セット1111は、第1電極1112と第2電極1113とを有する。第1電極1112及び第2電極1113の各々は、電源120と電気的に接続されている。
第1電極1112は、第1方向(図3の紙面左右方向)に延びる第1基部1112aと、第1方向と交差する第2方向(図3の紙面上下方向)に第1基部1112aから突出する2つの第1凸部1112bと、を有する。2つの第1凸部1112bの間には、第1凹部1112cが形成される。2つの第1凸部1112b及び第1凹部1112cの各々の第1方向の長さ及び第2方向の長さは、例えば、いずれも約5マイクロメートルである。なお、2つの第1凸部1112b及び第1凹部1112cのサイズは、これに限定されない。
第2電極1113の形状及びサイズは、第1電極1112の形状及びサイズと実質的に同一である。つまり、第2電極1113も、第1方向(図3の紙面左右方向)に延びる第2基部1113aと、第1方向と交差する第2方向(図3の紙面上下方向)に第2基部1113aから突出する2つの第2凸部1113bと、を備える。2つの第2凸部1113bの間には、第2凹部1113cが形成される。2つの第2凸部1113bは、第1電極1112の2つの第1凸部1112bに対向して配置されている。
つまり、第1電極1112は、第1方向に交差し、第2電極1113に向けて凸となる方向に第1基部1112aから突出する第1凸部1112bを有する。第2電極1113は、第1方向に交差し、第1電極1112に向けて凸となる方向に第2基部1113aから突出する第2凸部1113bを有する。
第1凸部1112b及び第2凸部1113bは、第1方向の位置に応じて第1電極1112及び第2電極1113の間の距離が異なるように形成される。第1電極1112及び第2電極1113の間の距離が異なることで、電極セット1111に交流電圧が印加された際に、位置に応じて電界強度の異なる電場勾配、すなわち不均一な電場が形成される。つまり、電極セット1111には、少なくとも1か所の電極間距離が異なる箇所が形成されていればよい。例えば、電極セット1111は、第1電極1112及び第2電極1113の一方に凸部が形成され、第1電極1112及び第2電極1113の他方に凸部が形成されない構成であってもよい。凸部が1つでも存在すれば上記が達成できるため、少なくとも1つの凸部を有する第1電極1112又は第2電極1113によって電極セット1111が実現できる。
なお、電極セット1111の位置は、第1基板111上に限定されない。電極セット1111は、試料10に接触せずに、空間1121の近傍に配置されてもよい。ここで、空間1121の近傍とは、電極セット1111に印加された交流電圧によって試料10内に電場勾配を形成することができる範囲を意味する。
上記電極セット1111の構成により、電場勾配が形成され、試料10中の粒子15が当該電場にさらされると誘電泳動によって粒子15は、所定の箇所に凝集される。誘電泳動では、電場勾配が形成された際に、粒子15に正の誘電泳動が作用されるか、負の誘電泳動が作用されるかによって粒子15が凝集される所定の箇所が異なる。
より具体的には、粒子15に正の誘電泳動が作用される場合、粒子15は電界強度の高い領域に移動して凝集される。電界強度が高い領域は、第1凸部1112b及び第2凸部1113bによって第1電極1112及び第2電極1113の間の距離が最も短い位置を含む領域であり、図中では例えば、破線円に示される第1電場領域Aである。一方で、粒子15に負の誘電泳動が作用される場合、粒子15は電界強度の低い領域に移動して凝集される。電界強度が低い領域は、第1凸部1112b及び第2凸部1113bによって第1電極1112及び第2電極1113の間の距離が最も遠い位置を含む領域である。さらに詳しくは、電界強度が低い領域は、第1凹部1112c及び第2凹部1113cの間の領域であり、特に、第1電場領域Aから離れるほど電界強度が低くなる。つまり、図中では例えば、破線円に示される第2電場領域Bに、負の誘電泳動が作用された粒子15が凝集される。
図4は、実施の形態に係る粒子の凝集及び拡散を説明する図である。図4の(a)は、第1の誘電泳動によって凝集した粒子15を示す図である。図4の(b)は、第2の誘電泳動によって拡散(言い換えると、第2方向の誘電泳動力によって凝集)した粒子15を示す図である。図4では、図3と同じ方向から見た第1電極1112及び第2電極1113の画像が示されており、さらに図中に黒点として粒子15が示されている。なお、図中の第1電極1112は、上下両方向に第1凸部1112bが突出している。図中の第2電極1113は、上下両方向に第1凸部1112bが突出している。
図4の(a)に示すように、粒子15の大半は、誘電泳動によって第1凸部1112b及び第2凸部1113bの間に凝集される。これは、粒子15に対して、正の誘電泳動が作用したことで、電界強度の高い領域に粒子15が移動して凝集されたことによる。試料10中に粒子15が多数存在する場合、図示するように、一つの方向の誘電泳動を作用させると、粒子15同士が重なり合い、正確に計数できないことが起こりうる。
本実施の形態では、上記したように、第1方向の誘電泳動力によって凝集された粒子15に対して、第1方向の誘電泳動力と異なる第2方向の誘電泳動力を作用させて、凝集された粒子15を拡散させる。図4の(b)に示すように、粒子15は、第2方向の誘電泳動力によってはじめの凝集位置から拡散することによってはじめの凝集位置における重なり合いが抑制された状態となり、より正確な計数を行うことができる。第1方向の誘電泳動力及び第2方向の誘電泳動力は、誘電泳動力の方向が異なっている。特に図4に示す例では、正の誘電泳動力から負の誘電泳動力に変化することで、粒子15同士の重なり合いが抑制されている。
つまり、方向が異なる誘電泳動力に変化するとは、正の誘電泳動力から方向の異なる別の正の誘電泳動力に変化する場合、負の誘電泳動力から方向の異なる別の負の誘電泳動力に変化する場合、及び、正の誘電泳動力又は負の誘電泳動力の一方から他方に逆転する場合とを含む。はじめに第1方向の誘電泳動力によって、電界強度の高い又は低い所定の電場領域に粒子15を凝集させ、凝集位置の異なる第2方向の誘電泳動力によって異なる凝集の力を作用させ、所定の電場領域から粒子15を拡散させる。本実施の形態の計数装置100は、このような手法により粒子15の正確な計数を行うことができる。
[第1方向の誘電泳動力から第2方向の誘電泳動力への変化]
第1方向の誘電泳動力と第2方向の誘電泳動力とは、上記のように誘電泳動力の方向が異なる。したがって、第1方向の誘電泳動力から第2方向の誘電泳動力へ変化させるためには、誘電泳動力の方向を切り替える必要がある。このように誘電泳動力の方向を切り替える方法について、図5及び図6を用いて説明する。
第1方向の誘電泳動力と第2方向の誘電泳動力とは、上記のように誘電泳動力の方向が異なる。したがって、第1方向の誘電泳動力から第2方向の誘電泳動力へ変化させるためには、誘電泳動力の方向を切り替える必要がある。このように誘電泳動力の方向を切り替える方法について、図5及び図6を用いて説明する。
図5は、実施の形態に係る誘電泳動力の変化を説明する第1図である。図6は、実施の形態に係る誘電泳動力の変化を説明する第2図である。ここでは特に、誘電泳動力の方向を切り換える方法として、誘電泳動力の正負を逆転させる方法について説明する。
正の誘電泳動力又は負の誘電泳動力のいずれが作用するかは、粒子15と、電界が形成される液体の性質に相関があり、特に、クラウジウス・モソッティ係数の実部(Real-part of Clausius-Mossotti factor)によって評価される。クラウジウス・モソッティ係数の実部が正であれば、粒子15には正の誘電泳動力が作用し、電界強度のより高い領域に粒子15が移動する。逆に、クラウジウス・モソッティ係数の実部が負であれば、粒子15には負の誘電泳動力が作用し、電界強度のより低い領域に粒子15が移動する。
図5及び図6には、クラウジウス・モソッティ係数の実部を縦軸とし、電極セット1111の間に印加される交流電圧の周波数を横軸とした場合の各々の関係を表すグラフが示されている。
図5に示すように、例えば、粒子15は、低い周波数領域の交流電圧において、クラウジウス・モソッティ係数の実部が正の値となり、高い周波数領域の交流電圧において、クラウジウス・モソッティ係数の実部が負の値となることがわかる。したがって、誘電泳動力の正負を逆転させるためには、例えば、電極セット1111の間に印加される交流電圧の周波数を変化させる方法がある。
はじめに、第1方向の誘電泳動力として正の誘電泳動力を作用させるため、電極セット1111の間にクラウジウス・モソッティ係数の実部を正の値となる低い周波数領域の交流電圧を印加する。粒子15は、正の誘電泳動力によって電界強度の高い領域に凝集される。その後、第2方向の誘電泳動力として負の誘電泳動力を作用させるため、電極セット1111の間にクラウジウス・モソッティ係数の実部が負の値となる高い周波数領域の交流電圧を印加する。粒子15は、負の誘電泳動力によって電界強度の低い領域に向けて拡散される。
具体的に、例えば、第1方向の誘電泳動力を作用させる際に、電極セット1111の間に、第1周波数F1の交流電圧を印加して粒子15を凝集させる。その後、第2方向の誘電泳動力を作用させる際に、電極セット1111の間に第1周波数F1よりも周波数が大きい第2周波数F2の交流電圧を印加することで粒子15を拡散させる。第1方向の誘電泳動力と第2方向の誘電泳動力とは、正と負が入れ替わってもよい。
このように周波数を変化させるために、電源120は、印加する交流電圧を変化させる。つまり、電源120は、制御部の一例である。制御部は、電源とは別に設けられた装置であってもよく、電源120に対して制御信号を送信することで、電源120から印加される交流電圧の周波数を変化させてもよい。
図6に示すように、誘電泳動力の正負を逆転させるためには、例えば、粒子15の周囲の環境における導電率を変化させる方法がある。
はじめに、第1方向の誘電泳動力として正の誘電泳動力を作用させるため、第1導電率S1の環境中において、電極セット1111の間にクラウジウス・モソッティ係数の実部を正の値となる所定周波数Fの交流電圧を印加する。粒子15は、正の誘電泳動力によって電界強度の高い領域に凝集される。その後、第2方向の誘電泳動力として負の誘電泳動力を作用させるため、第2導電率S2の環境中において、電極セット1111の間に所定周波数Fの交流電圧を印加する。粒子15は、負の誘電泳動力によって電界強度の低い領域に向けて拡散される。
具体的に、例えば、第1方向の誘電泳動力を作用させる際に、第1導電率S1の環境中で所定周波数Fの交流電圧が印加され、第2方向の誘電泳動力を作用させる際に、第1導電率S1よりも小さい第2導電率S2の環境中で所定周波数Fの交流電圧が印加される。このように導電率を変化させるために、電導度を低下させるため、試料10の溶媒を構成するイオン成分に対して、キレート沈殿を形成するキレーティング剤が添加される。第1方向の誘電泳動力と第2方向の誘電泳動力とは、正と負が入れ替わってもよい。このとき、電導度を上昇するため、試料10中にイオンを含む溶液又は塩が添加されればよい。
このように、キレーティング剤、又は、イオンを含む溶液もしくは塩を添加する添加装置(不図示)は、粒子15の周囲の環境における導電率を変化させる。つまり、添加装置は、制御部の一例である。制御部は、添加装置とは別に設けられた装置であってもよく、添加装置に対して制御信号を送信することで、添加装置からキレーティング剤、又は、イオンを含む溶液もしくは塩を添加させてもよい。
正の誘電泳動力から方向の異なる別の正の誘電泳動力に変化する場合、及び、負の誘電泳動力から方向の異なる別の負の誘電泳動力に変化する場合には、例えば、単に互いに異なる位置に設けられた電極セット間で、交流電圧の印加のオン/オフを切り替えてもよい。さらに、この場合、第1方向の誘電泳動力と第2方向の誘電泳動力とは、方向が一致し、かつ、粒子15が凝集される位置が異なる場合が含まれてもよい。
以上に説明したように、第1方向の誘電泳動力に対して、誘電泳動力の方向が異なる第2方向の誘電泳動力に変化させることで、凝集された粒子15が拡散される。第1方向の誘電泳動力と、第2方向の誘電泳動力とは、誘電泳動力の大きさ及び方向が異なっていてもよい。
[計数装置を用いた計数方法]
以上のように構成された計数装置100を用いた粒子15の計数方法について、図7を参照しながら説明する。図7は、実施の形態に係る計数方法を示すフローチャートである。
以上のように構成された計数装置100を用いた粒子15の計数方法について、図7を参照しながら説明する。図7は、実施の形態に係る計数方法を示すフローチャートである。
まず、粒子15を含む試料10に対して、正又は負の第1方向の誘電泳動力を作用させることで、所定の位置に粒子15が凝集される(凝集ステップS110)。その後、第1方向の誘電泳動力とは異なる第2方向の誘電泳動力を作用させることで、凝集された粒子15を拡散させる(拡散ステップS120)。具体的には、上記に説明したように、凝集ステップS110において作用された第1方向の誘電泳動力に対して、方向が異なる第2方向の誘電泳動力を作用させる。粒子15の凝集のために作用していた力が変化することにより、第1方向の誘電泳動力による凝集が変化し、粒子15同士の重なり合いが抑制される。
次に、撮像素子140は、検出光132を受光して、画像を撮像する(撮像ステップS130)。なお、撮像ステップS130において撮像される画像は、拡散された粒子15を含む拡散画像である。計数部150は、当該拡散画像を用いて、画像解析することにより試料10中の粒子15の数を決定する(計数ステップS140)。以上のようにして、試料10中の粒子15同士の重なり合いによる偽陰性の発生を抑制して、より正確に粒子15の計数を行うことができる。
[変形例]
以下さらに、本実施の形態の変形例について、図8~図11を参照して説明する。なお、以下の説明では、上記した実施の形態の説明と異なる点を中心に述べ、重複する点を省略又は簡略化する。図8は、実施の形態の変形例に係る計数方法を示すフローチャートである。図8に示す変形例に係る計数方法は、上記実施の形態の計数方法に比べ、前撮像ステップS115及び追跡ステップS135を実施する点で異なっている。
以下さらに、本実施の形態の変形例について、図8~図11を参照して説明する。なお、以下の説明では、上記した実施の形態の説明と異なる点を中心に述べ、重複する点を省略又は簡略化する。図8は、実施の形態の変形例に係る計数方法を示すフローチャートである。図8に示す変形例に係る計数方法は、上記実施の形態の計数方法に比べ、前撮像ステップS115及び追跡ステップS135を実施する点で異なっている。
具体的には、凝集ステップS110において、試料10中の粒子15が凝集された以降、かつ、拡散ステップS120が実施されるよりも前に、撮像素子140は、検出光132を受光して、画像を撮像する(前撮像ステップS115)。なお、前撮像ステップS115において撮像される画像は、凝集された粒子15を含む凝集画像である。図9は、実施の形態の変形例に係る凝集画像及び拡散画像を示す図である。図9の(a)に示すように、本変形例における凝集画像では、第1方向の誘電泳動力として正の誘電泳動が作用されることによって粒子15が第1電極1112の第1凸部1112b及び第2電極1113の第2凸部1113bの間に凝集されている。このとき、第1電極1112及び第2電極1113が第1凸部1112b及び第2凸部1113bを複数形成している場合、図中のように、粒子15は、複数の第1凸部1112b及び第2凸部1113bの間のそれぞれに凝集してクラスタを形成する。例えば、図中では3つの第1凸部1112b及び3つの第2凸部1113bの間に、第1クラスタCLa、第2クラスタCLb、及び、第3クラスタCLcをそれぞれ形成している。
このようにクラスタに分かれて粒子15が凝集されることで、1箇所に粒子15が凝集される場合に比べて粒子15同士の重なり合いを低減させることができる。つまり、偽陰性の発生を抑制し、より正確な粒子の計数を行うことができる。以上の説明は、第1方向の誘電泳動力として正の誘電泳動が作用される場合も同様である。
本変形例では、第2方向の誘電泳動力によって粒子15を拡散させ、図9の(b)に示す拡散画像を撮像する(拡散ステップS120及び撮像ステップS130)。さらに、計数部150は、以上のようにして出力された凝集画像及び拡散画像を取得し、これらに基づいて凝集画像に含まれる粒子15を追跡する(追跡ステップS135)。追跡ステップS135では、拡散ステップS120において拡散された粒子15を、凝集ステップS110において第1位置に凝集した第1クラスタCLaに含まれる粒子15、第2位置に凝集した第2クラスタCLbに含まれる粒子15、又は、第3位置に凝集した第3クラスタCLcに含まれる粒子15のいずれであるかを特定する事ができる。
図10は、実施の形態の変形例に係る追跡ステップを示す図である。図中では、図3と同じ視点から見た電極セット1111の平面図と、当該平面図上で第1クラスタCLaを拡大した拡大図とを示している。図中では、紙面左から右にかけて時系列に沿って取得された画像を示しており、左側の画像が凝集画像であり、中央及び右側の画像が拡散画像である。ここでは、第1クラスタCLaを一例として説明するが第2クラスタCLb、第3クラスタCLc、及びその他のクラスタについても同様である。計数部150は、追跡ステップS135において、以下のように動作する。
はじめに、凝集画像において、粒子15の輝点又は粒子15が含まれるクラスタの輝点を検出する。これらの輝点は、上記したように対照画像に対する輝度値の差が閾値以上となる画素を特定することで検出される。ここでは、粒子15が重なり合っている場合があるため、各々の粒子15を個別に検出できなくてもよい。
次いで、拡散画像において、粒子15の輝点を検出する。凝集画像に対して拡散後の拡散画像においては、粒子15を略個別に検出することができる。特に、拡散開始から拡散画像が取得されるまでの時間を十分長く設定することで、粒子15の検出性が向上される。ただし、拡散開始から拡散画像が取得されるまでの時間が過剰に長く設定されると、異なるクラスタからの粒子15同士を識別できず粒子15の追跡が不可能になる場合がある。粒子15の拡散の速度は、粒子15の性質に依存するため、拡散開始から拡散画像が取得されるまでの適切な時間を予備実験等によりあらかじめ設定してもよい。なお、撮像素子140が、連続的に画像を取得した動画像を出力することで、計数部150は、粒子15が適切に拡散したタイミングの拡散画像を抽出して粒子15の追跡及び計数を行ってもよい。
計数部150は、拡散画像において検出された粒子15の輝点をパターンマッチング等のアルゴリズムを用いて、移動ベクトルを推定し、各々の粒子15がどのクラスタから拡散されたかを特定する。これにより、各クラスタに含まれていた粒子15の数をクラスタごとに計数することができる。特に、図中に示すように、複数のクラスタに負の誘電泳動によって凝集された粒子15aのクラスタと、正の誘電泳動によって凝集された粒子15クラスタとが混在している状況で、同時かつそれぞれ個別に正確な計数が行える。
以上に説明した変形例に係る計数方法の応用の一例として、図11を参照して説明する。図11は、実施の形態の変形例に係る複合体の形成プロセスを示す図である。本例では、上記の粒子15のそれぞれは複合体粒子13であり、上記の粒子15aのそれぞれは未結合粒子12または夾雑物14として説明する。上記の粒子15のそれぞれは未結合粒子12または夾雑物14であり、上記の粒子15aのそれぞれは複合体粒子13であってもよい。
本例では、被検出物質11の計数を目的として上記計数装置100を用いた粒子の計数を行う。つまり、試料10中の粒子のうち、所定の検出対象である被検出物質を含む粒子を選択的に計数する。
複合体粒子13とは、被検出物質11と、被検出物質11に特異的に結合する性質を有する物質(以下、特異的結合物質12bと呼ぶ)で修飾された誘電体粒子12aとの結合体である。つまり、複合体粒子13では、特異的結合物質12bを介して、被検出物質11と誘電体粒子12aとが結合されている。誘電体粒子12aは、上記の粒子15と同様の構成である。
特異的結合物質12bとは、被検出物質11と特異的に結合可能な物質である。被検出物質11に対する特異的結合物質12bの組み合わせの例としては、抗原に対する抗体、基質又は補酵素に対する酵素、ホルモンに対するレセプタ、抗体に対するプロテインA又はプロテインG、ビオチンに対するアビジン類、カルシウムに対するカルモジュリン、糖に対するレクチン、6×ヒスチジン及びグルタチオンSトランスフェラーゼなどのペプチドタグに対するニッケル-ニトリロ三酢酸及びグルタチオンなどのタグ結合物質等が挙げられる。
なお、未結合粒子12とは、複合体粒子13を形成していない特異的結合物質12bで修飾された誘電体粒子12aである。つまり、未結合粒子12は、被検出物質11に結合していない特異的結合物質12bで修飾された誘電体粒子12aである。未結合粒子12は、フリー(F)成分とも呼ばれる。一方、複合体粒子13に含まれる誘電体粒子12aは、バインド(B)成分とも呼ばれる。
夾雑物14とは、検出系内(ここでは試料10内)に混入された塵埃等の粒子、及び計数装置100を構成する構成物の破損片粒子等である。
図11の(a)に示すように、例えばウイルス粒子などの被検出物質11と、特異的結合物質12bとして抗ウイルス抗体が修飾された誘電体粒子12a(未結合粒子12)と、夾雑物14とが含まれた試料10中を準備する。試料10中では液体中での拡散及び衝突によって、図11の(b)に示すように、被検出物質11と未結合粒子12とが複合体粒子13を形成する。このとき、未結合の被検出物質11が残留しないよう、未結合粒子12を多分に添加しておく。このため、図中に示すように、未結合粒子12が余剰に存在する状態となる。
ここで、複合体粒子13に正の誘電泳動及び負の誘電泳動の一方が作用し、未結合粒子12及び夾雑物14に正の誘電泳動及び負の誘電泳動の他方が作用するように、計数装置100の動作条件が設定されると、複合体粒子13とその他の粒子とが異なるクラスタを形成して凝集される。動作条件は、電極セットに印加される交流電圧及び試料10の溶媒における導電率等によって設定され、例えば、上記の複合体粒子13が上記の粒子15に対応し、その他の粒子が上記の粒子15aに対応する動作条件が用いられる。このようにして、本例では、複合体粒子13と、その他の粒子とを、互いに異なる位置に凝集させた後、拡散によって各々を正確に計数することで、試料10に含まれる粒子のうちの所定の検出対象である被検出物質11を選択的かつ正確に計数することができる。
(その他の実施の形態)
以上、本開示の1つまたは複数の態様に係る計数装置及び計数方法について、実施の形態に基づいて説明したが、本開示は、この実施の形態に限定されるものではない。本開示の趣旨を逸脱しない限り、当業者が思いつく各種変形を本実施の形態に施したものも、本開示の1つまたは複数の態様の範囲内に含まれてもよい。
以上、本開示の1つまたは複数の態様に係る計数装置及び計数方法について、実施の形態に基づいて説明したが、本開示は、この実施の形態に限定されるものではない。本開示の趣旨を逸脱しない限り、当業者が思いつく各種変形を本実施の形態に施したものも、本開示の1つまたは複数の態様の範囲内に含まれてもよい。
例えば、上記実施の形態において、第1基板上の電極セットの配置を、第1凸部と第2凸部とが対向し、第1凹部と第2凹部とが対向する配置としたが、電極セットの配置はこれに限定されない。例えば、第1凸部と第2凹部とが対向し、第1凹部と第2凸部とが対向する配置としてもよい。電極セットの配置、ならびに、第1電極及び第2電極の形状の設計により、各種の計数に適した電場勾配を形成するように電極セットを構成してもよい。
電極セットに含まれる電極の数は、2つに限定されず、3つ以上であってもよい。例えば、図4に示した電極セットは、上記したように図中の第1電極の他に、紙面上下方向の両方において図の外側に配置された第2電極を含む。このような電極セットは、3つ以上の電極を含み、隣り合う電極に印加される交流電圧に位相差が設けられている。なお、このような電極セットは、Castellated電極と呼ばれる場合がある。
なお、上記に説明した第1方向の誘電泳動力から第2方向の誘電泳動力に変化させるための方法を複数組み合わせて、より効果的に凝集された粒子を拡散させてもよい。
計数装置100は、第1の電極セット1111に加えて、さらに、第2の電極セット1811を備えてもよい。図12は、実施の形態の変形例に係る第1の電極セットと第2の電極セットを含む回路図である。
第1電極セット1111は第1電極1112と第2電極1113を含む。第2電極セット1811は第3電極1812と第4電極1813を含む。
凝集ステップで、制御部は、スイッチ1901に電圧源120と第1電極1112を接続すること、及び、スイッチ1902に電圧源120と第2電極1113を接続することを指示し、電源120に第1周波数の交流電圧を発生せることを指示する。これにより、凝集ステップで、粒子15に第1方向の誘電泳動力が作用する。
拡散ステップで、制御部は、スイッチ1901に電圧源120と第3電極1812を接続すること、及び、スイッチ1902に電圧源120と第4電極1813を接続することを指示し、電源120に第2周波数の交流電圧を発生せることを指示する。これにより、拡散ステップで、粒子15に第2方向の誘電泳動力が作用する。
誘電体粒子を計数する計数装置として利用することができる。
10 試料
11 被検出物質
12 未結合粒子
12a 誘電体粒子
12b 特異的結合物質
13 複合体粒子
14 夾雑物
15、15a 粒子
100 計数装置
110 収容部
111 第1基板
112 スペーサ
113 第2基板
120 電源
130 光源
131 照射光
132 検出光
140 撮像素子
141 カメラ
150 計数部
1111 電極セット
1112 第1電極
1112a 第1基部
1112b 第1凸部
1112c 第1凹部
1113 第2電極
1113a 第2基部
1113b 第2凸部
1113c 第2凹部
1121 空間
1131 供給孔
1132 排出孔
CLa 第1クラスタ
CLb 第2クラスタ
CLc 第3クラスタ
11 被検出物質
12 未結合粒子
12a 誘電体粒子
12b 特異的結合物質
13 複合体粒子
14 夾雑物
15、15a 粒子
100 計数装置
110 収容部
111 第1基板
112 スペーサ
113 第2基板
120 電源
130 光源
131 照射光
132 検出光
140 撮像素子
141 カメラ
150 計数部
1111 電極セット
1112 第1電極
1112a 第1基部
1112b 第1凸部
1112c 第1凹部
1113 第2電極
1113a 第2基部
1113b 第2凸部
1113c 第2凹部
1121 空間
1131 供給孔
1132 排出孔
CLa 第1クラスタ
CLb 第2クラスタ
CLc 第3クラスタ
Claims (11)
- 第1方向の誘電泳動力を作用させて、試料中の粒子を凝集させる凝集ステップと、
前記第1方向の誘電泳動力とは異なる第2方向の誘電泳動力を作用させて、凝集された前記粒子を拡散させる拡散ステップと、
前記拡散された粒子を含む拡散画像を撮像する撮像ステップと、
前記拡散画像に基づいて前記粒子の数を決定する計数ステップと、を含む
計数方法。 - 前記凝集ステップでは、誘電泳動力を作用させるための電場勾配を発生する電極セットの間に第1周波数の交流電圧を印加し、
前記拡散ステップでは、前記電極セットの間に前記第1周波数とは異なる第2周波数の交流電圧を印加する
請求項1に記載の計数方法。 - 前記凝集ステップでは、誘電泳動力を作用させるための電場勾配を発生する第1の電極セットの間に第1周波数の交流電圧を印加し、
前記拡散ステップでは、前記第1の電極セットとは異なる第2の電極セットの間に前記第1周波数とは異なる第2周波数の交流電圧を印加する
請求項1に記載の計数方法。 - 前記拡散ステップでは、前記凝集ステップにおける第1方向の誘電泳動力よりも大きい第2方向の誘電泳動力を作用させる
請求項3に記載の計数方法。 - 前記第1周波数の交流電圧の印加では、前記粒子に正の誘電泳動力及び負の誘電泳動力の一方が作用され、
前記第2周波数の交流電圧の印加では、前記粒子に正の誘電泳動力及び負の誘電泳動力の他方が作用される
請求項2または3に記載の計数方法。 - 誘電泳動力を作用させるための電場勾配を発生する電極セットの間には、
前記凝集ステップにおいて、第1導電率の環境中で交流電圧が印加され、
前記拡散ステップにおいて、前記第1導電率とは異なる第2導電率の環境中で交流電圧が印加される
請求項1~5のいずれか一項に記載の計数方法。 - 前記第1導電率の環境中での交流電圧の印加では、前記粒子に正の誘電泳動力及び負の誘電泳動力の一方が作用され、
前記第2導電率の環境中での交流電圧の印加では、前記粒子に正の誘電泳動力及び負の誘電泳動力の他方が作用される
請求項6に記載の計数方法。 - さらに、
前記凝集ステップ以降、かつ、前記拡散ステップよりも前に、凝集された前記粒子を含む凝集画像を撮像する前撮像ステップと、
撮像された前記凝集画像及び前記拡散画像に基づいて前記凝集画像に含まれる前記粒子を追跡する追跡ステップと、を含む
請求項1~7のいずれか一項に記載の計数方法。 - 前記追跡ステップでは、前記拡散ステップにおいて拡散された前記粒子を、前記凝集ステップにおいて第1位置に凝集した前記粒子、又は、前記第1位置とは異なる第2位置に凝集した前記粒子のいずれであるかを特定する
請求項8に記載の計数方法。 - 前記計数ステップでは、前記凝集画像及び前記拡散画像に基づいて、前記粒子のうち、所定の検出対象である被検出物質を含む粒子を選択的に計数する
請求項8又は9に記載の計数方法。 - 粒子を含む試料を収容する収容部と、
前記収容部に収容された前記試料に対して電場勾配を発生する電場勾配発生部と、
前記電場勾配発生部を制御することで、発生する前記電場勾配により、前記粒子に第1方向の誘電泳動力を作用させて前記粒子を凝集させ、凝集された前記粒子に前記第1方向の誘電泳動力とは異なる第2方向の誘電泳動力を作用させて、凝集された前記粒子を拡散させる制御部と、
拡散された前記粒子を含む拡散画像を撮像する撮像部と、
撮像された前記拡散画像に基づいて前記粒子の数を決定する計数部と、を備える
計数装置。
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