WO2021166713A1 - 生体試料分析方法 - Google Patents

生体試料分析方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2021166713A1
WO2021166713A1 PCT/JP2021/004553 JP2021004553W WO2021166713A1 WO 2021166713 A1 WO2021166713 A1 WO 2021166713A1 JP 2021004553 W JP2021004553 W JP 2021004553W WO 2021166713 A1 WO2021166713 A1 WO 2021166713A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
exosomes
bead
nanobeads
exosome
Prior art date
Application number
PCT/JP2021/004553
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
辻田　公二
糸長　誠
Original Assignee
株式会社Ｊｖｃケンウッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社Ｊｖｃケンウッド filed Critical 株式会社Ｊｖｃケンウッド
Priority to EP21756197.6A priority Critical patent/EP4109096A4/en
Publication of WO2021166713A1 publication Critical patent/WO2021166713A1/ja
Priority to US17/886,044 priority patent/US20220381776A1/en

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G01N33/54333—Modification of conditions of immunological binding reaction, e.g. use of more than one type of particle, use of chemical agents to improve binding, choice of incubation time or application of magnetic field during binding reaction
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2470/00—Immunochemical assays or immunoassays characterised by the reaction format or reaction type
    • G01N2470/04—Sandwich assay format

Definitions

  • the present disclosure relates to a biological sample analysis method for analyzing the inclusions of exosomes contained in a biological sample and measuring the number of exosomes.
  • Exosomes are tiny membrane vesicles covered with a lipid bilayer, and various membrane proteins such as CD9 and CD63 are present in the lipid bilayer. It is known that when a person suffers from a specific disease, the amount of exosomes in which disease-related membrane proteins are expressed on the surface of the lipid bilayer membrane increases. By using a disease-related membrane protein expressed on the surface of exosomes as an antigen and measuring the number of exosomes having a disease-related antigen, it is possible to discover whether or not a person has a specific disease. There is sex.
  • Exosome inclusions are also expected as biomarkers for discovering specific diseases (see Patent Document 1).
  • One or more embodiments aim to provide a biological sample analysis method capable of analyzing inclusions of exosomes and measuring the number of exosomes with one biological sample.
  • a first comprising a plurality of first beads having a surface immobilized with a first antibody that specifically binds to a first antigen associated with the first disease.
  • a plurality of second beads in which a second antibody that specifically binds to a second antigen associated with the second disease is immobilized on the surface of a reaction vessel into which the buffer solution of the above is injected, and the first antigen.
  • a second buffer containing the exosome to be analyzed in which the first bead and the second bead are bound by injecting a biological sample containing the exosome to be analyzed having the second antigen on the surface.
  • a liquid was generated, and from the second buffer solution, the exosome to be analyzed in which the first bead and the second bead were bound was recovered, and the recovered first bead and the second bead were recovered.
  • the first bead is cut off from the exosome to be analyzed to which the second bead is bound, the exosome to be analyzed to which the second bead is bound is collected, and the exosome to be analyzed to which the collected second bead is bound.
  • a biological sample analysis method for measuring the number of beads is provided.
  • the inclusions of exosomes can be analyzed and the number of exosomes can be measured with one biological sample.
  • FIG. 1A is a flowchart partially showing the biological sample analysis method of one or more embodiments.
  • FIG. 1B is a flowchart partially showing a biological sample analysis method of one or more embodiments following FIG. 1A.
  • FIG. 2 is a conceptual diagram showing magnetic microbeads used in the biological sample analysis method of one or more embodiments.
  • FIG. 3 is a conceptual diagram showing a reaction vessel infused with a buffer solution containing magnetic microbeads.
  • FIG. 4 is a conceptual diagram showing a sample of a biological sample containing a single positive exosome and a double positive exosome.
  • FIG. 5A is a conceptual diagram showing the structure of a single positive exosome.
  • FIG. 5B is a conceptual diagram showing the structure of a double positive exosome.
  • FIG. 5A is a conceptual diagram showing the structure of a single positive exosome.
  • FIG. 5B is a conceptual diagram showing the structure of a double positive exosome.
  • FIG. 1A is
  • FIG. 6 is a conceptual diagram showing antibody nanobeads used in the biological sample analysis method of one or more embodiments.
  • FIG. 7 shows a state in which a sample containing double positive exosomes and antibody nanobeads were injected into a reaction vessel in which a buffer solution containing magnetic microbeads was injected, and the double positive exosomes were sandwiched and captured by magnetic microbeads and antibody nanobeads. It is a conceptual diagram which shows.
  • FIG. 8 is a conceptual diagram showing a state in which unnecessary substances other than magnetic microbeads and antibody nanobeads in which double-positive exosomes are sandwiched and captured are removed from the reaction vessel shown in FIG. FIG.
  • FIG. 9 is a diagram showing a method of separating unnecessary substances from the reaction vessel shown in FIG. 7.
  • FIG. 10 is a conceptual diagram showing a state in which exosomes are separated from magnetic microbeads in magnetic microbeads and antibody nanobeads in which double positive exosomes are sandwiched and captured.
  • FIG. 11 is a diagram showing a method of separating exosomes from magnetic microbeads using a hapten.
  • FIG. 12 is a diagram showing a method of separating exosomes from magnetic microbeads using a linker.
  • FIG. 13 is a conceptual diagram showing magnetic microbeads obtained by separating magnetic microbeads, antibody nanobeads that capture double-positive exosomes, and single-positive exosomes.
  • FIG. 14 is a concept showing antibody nanobeads capturing double-positive exosomes and single-positive exosomes obtained by separating magnetic microbeads, antibody nanobeads capturing double-positive exosomes, and single-positive exosomes. It is a figure.
  • FIG. 15A is a diagram showing a step halfway through the method of separating magnetic microbeads and antibody nanobeads.
  • FIG. 15B is a diagram showing a step following FIG.
  • FIG. 15A is a conceptual diagram showing antibody nanobeads that capture double-positive exosomes and antibody nanobeads that capture double-positive exosomes, which are obtained by separating single-positive exosomes from antibody nanobeads that capture double-positive exosomes.
  • FIG. 17 is a conceptual diagram showing a single positive exosome obtained by separating an antibody nanobead that captures a double positive exosome and a single positive exosome.
  • FIG. 18 is a conceptual diagram showing a state in which antibody nanobeads are separated from double-positive exosomes.
  • FIG. 19 is a conceptual diagram showing antibody nanobeads separated from each other and obtained by separating antibody nanobeads and double positive exosomes.
  • FIG. 20 is a conceptual diagram showing double-positive exosomes obtained by separating antibody nanobeads and double-positive exosomes separated from each other.
  • FIG. 21 is a flowchart showing a specific method for measuring the number of antibody nanobeads in step S22 of FIG. 1B.
  • FIG. 22 is a diagram showing a method for measuring the number of antibody nanobeads.
  • FIG. 23 is a conceptual diagram showing a state in which a polar functional group for adhering antibody nanobeads is formed on a disk substrate.
  • double-positive exosomes expressing two specific membrane proteins on the surface of one exosome are captured, inclusions analyzed, and the number of the exosomes is counted.
  • An example is a biological sample analysis method that can be used.
  • step S11 the operator immobilizes a plurality of antibodies 11 that specifically bind to the antigen associated with the first disease on the surface of the magnetic microbeads 10.
  • step S12 the operator injects a buffer solution 21 (first buffer solution) containing a large number of magnetic microbeads 10 on which the antibody 11 is immobilized into the reaction vessel 20.
  • the diameter of the magnetic microbeads 10 is about 3 ⁇ m, and the diameter may be on the order of micrometers.
  • Specimen 31 contains single-positive exosomes 32s and double-positive exosomes 32w, which will be described later.
  • Specimen 31 is an arbitrary body fluid such as blood, and contains impurities 33 and 34, which are unnecessary substances, in addition to exosomes 32s and 32w.
  • Single-positive exosomes 32s and double-positive exosomes 32w are collectively referred to as exosomes 32.
  • the single positive exosomes 32s are covered with a lipid bilayer 320, and the lipid bilayer 320 contains membrane proteins 321 to 323.
  • the membrane protein 321 is CD9
  • the membrane protein 322 is CD63
  • the membrane protein 323 is CD147.
  • CD9 and CD63 are normally present membrane proteins
  • CD147 is an example of a membrane protein associated with a first disease.
  • single-positive exosomes 32s refer to exosomes 32 in which one disease-related membrane protein (CD147 in one or more embodiments) is present on the surface of one exosome 32.
  • the double positive exosome 32w is covered with a lipid bilayer membrane 320, and the lipid bilayer membrane 320 contains membrane proteins 321 to 324.
  • the membrane protein 324 is HER2 (CD340).
  • HER2 (CD340) is an example of a membrane protein associated with a second disease.
  • the double-positive exosome 32w has two disease-related membrane proteins (CD147 and HER2 (CD340) in one or more embodiments) present on the surface of one exosome 32. Refers to the exosome 32 that is present.
  • HER2 (CD340) will be referred to as HER2, which is a common name.
  • a double positive exosome 32w in which both CD147 and HER2 are present on the surface is used as the exosome to be analyzed.
  • CD147 is the first antigen associated with the first disease and HER2 is the second antigen associated with the second disease, but is not limited thereto.
  • the antibody 11 immobilized on the surface of the magnetic microbeads 10 is the first antibody that specifically binds to CD147.
  • nucleic acids such as miRNA325 and DNA326, and inclusions such as proteins (not shown) are present.
  • the operator prepares a buffer solution 41 containing antibody nanobeads 50 having a plurality of antibodies 51 immobilized on the surface in a container 40.
  • the antibody nanobeads 50 have a much smaller diameter than the magnetic microbeads 10 and have a diameter of about 200 nm.
  • the diameter of the antibody nanobeads 50 may be less than 1 ⁇ m, preferably 100 nm to 500 nm.
  • the antibody 51 immobilized on the surface of the antibody nanobeads 50 is an antibody (second antibody) that specifically binds to HER2, which is a second antigen associated with the second disease.
  • step S13 the operator injects the sample 31 containing the exosome 32 and the buffer solution 41 containing the antibody nanobeads 50 into the reaction vessel 20 in order (or at the same time).
  • the buffer solution 21 is a mixture of the buffer solution 21 and the buffer solution 41
  • the buffer solution 21 contains a double positive exosome 32w sandwiched between the magnetic microbeads 10 and the antibody nanobeads 50 in the reaction vessel 20.
  • 21 (second buffer) is produced.
  • sandwich capture means that the two beads bind to one exosome
  • a second buffer solution containing the exosome 32w to which the magnetic microbeads 10 and the antibody nanobeads 50 are bound is generated. It can be said that.
  • the operator shakes the reaction vessel 20 as necessary and waits for a predetermined time.
  • double positive exosomes 32w in which both CD147 and HER2 are present on the surface are sandwiched and captured by magnetic microbeads 10 and antibody nanobeads 50.
  • Single-positive exosomes 32s in the absence of HER2 bind to antibody 11 of magnetic microbeads 10.
  • the antibody nanobeads 50 do not bind to the single-positive exosomes 32s, the single-positive exosomes 32s are not sandwiched and captured by the magnetic microbeads 10 and the antibody nanobeads 50.
  • FIG. 7 a large number of magnetic microbeads 10 are present in the reaction vessel 20, but for ease of understanding, only one enlarged magnetic microbead 10 is shown.
  • step S14 the operator separates the magnetic microbeads 10 to which the antibody nanobeads 50 are linked via the exosome 32 and unnecessary substances by magnetic collection, weak centrifugation, or the like.
  • the operator cleans the separated magnetic microbeads 10.
  • the antibody nanobeads 50, which are not linked to the magnetic microbeads 10, and the impurities 33 and 34 are unnecessary substances. Since the antibody nanobeads 50 are excessively injected in step S13, the unnecessary substance is mainly the antibody nanobeads 50 which are not linked to the magnetic microbeads 10.
  • the magnetic microbeads 10 to which the antibody nanobeads 50 are linked via the exosome 32 shown in FIG. 8 can be recovered.
  • Exosomes 32s to which the antibody nanobeads 50 are not bound are also bound to the recovered magnetic microbeads 10.
  • the magnetic microbeads 10 and the antibody nanobeads 50 not connected to the magnetic microbeads 10 can be easily separated by magnetically collecting the magnetic microbeads 10. can.
  • the antibody nanobeads 50 are preferably magnetic nanobeads. Even if the antibody nanobeads 50 are magnetic nanobeads, it is possible to separate the magnetic microbeads 10 and the unlinked antibody nanobeads 50.
  • FIG. 9A shows a state in which a buffer solution 21 containing magnetic microbeads 10 to which antibody nanobeads 50 are linked and antibody nanobeads 50 which are not linked is injected into a container 60.
  • FIG. 9A corresponds to the state of FIG. 7.
  • the magnetic microbeads 10 and the unconnected antibody nanobeads 50 can be largely separated by magnetic collection or weak centrifugation in which a magnet is placed at the bottom of the container 60.
  • the volumes of the magnetic microbeads 10 and the antibody nanobeads 50 are different by about 1000 times, so that the magnetic microbeads 10 are magnetically collected in a short time, whereas the antibody nanobeads 50 are magnetically collected unless it takes a long time. Because it is not done. By utilizing this time difference in magnetic collection, the magnetic microbeads 10 and the unlinked antibody nanobeads 50 can be largely separated.
  • the unlinked antibody nanobeads 50 can be significantly reduced. If magnetically collected in the state shown in FIG. 9 (c), it becomes FIG. 9 (d), and if the precipitate is collected, the supernatant is removed, and the buffer solution 21 is added, it is shown in FIG. 9 (e). As such, the unlinked antibody nanobeads 50 can be further significantly reduced.
  • FIG. 9 (g) corresponds to the state of FIG.
  • the number of times the precipitate is collected and the supernatant is removed is not limited to the number shown in FIG.
  • the operator executes a process of separating the exosome 32 from the magnetic microbeads 10 in step S15. Then, the double positive exosome 32w to which the antibody nanobeads 50 are bound and the single positive exosome 32s to which the antibody nanobeads 50 are not bound are separated from the magnetic microbeads 10.
  • any of the following methods can be adopted.
  • the first method there is a method using the hapten shown in FIG.
  • a hapten is a substance that binds to an antibody but does not exhibit the activity (immunogenicity) of inducing antibody production by itself because of its small molecular weight. When combined with the appropriate protein, the hapten becomes a complete immunogenic antigen.
  • the anti-DNP antibody 52 is immobilized on the magnetic microbeads 10 instead of the antibody 51.
  • DNP is 2,4-dinitrophenol, which is an example of a hapten. Double-positive exosomes 32w or single-positive exosomes 32s are bound to the anti-DNP antibody 52 via the antibody 54 to which DNP53 is bound (hereinafter referred to as DNP antibody 54).
  • DNP antibody 54 is an antibody that specifically binds to CD147.
  • the binding between the anti-DNP antibody 52 and the DNP antibody 54 is an equilibrium reaction.
  • DNP53 hapten
  • buffer solution 21 third buffer solution
  • exosomes 32w sandwiched between magnetic microbeads 10 and antibody nanobeads 50 DNP bound to anti-DNP antibody 52.
  • the antibody 54 is replaced by DNP 53, and the magnetic microbeads 10 are cleaved from the double-positive exosomes 32w and the single-positive exosomes 32s that are bound to the antibody nanobeads 50.
  • a Whole antibody may be used for the magnetic microbeads 10 and a Fab antibody may be used for the antibody nanobeads 50.
  • Exosomes 32 can be cleaved from the magnetic microbeads 10 by enzymatically degrading and digesting the Whole antibody.
  • step S16 the operator separates the magnetic microbeads 10, the antibody nanobeads 50 bound to the double positive exosomes 32w, and the single positive exosomes 32s.
  • the magnetic microbeads 10 shown in FIG. 13 can be recovered.
  • the buffer solution 21 containing only the magnetic microbeads 10 is injected into the reaction vessel 20.
  • the antibody nanobeads 50 and exosomes 32s bound to the separated exosomes 32w By washing the antibody nanobeads 50 and exosomes 32s bound to the separated exosomes 32w, the antibody nanobeads 50 and exosomes 32s bound to the exosomes 32w shown in FIG. 14 can be recovered.
  • the buffer solution 21 containing the antibody nanobeads 50 bound to the exosomes 32w and the exosomes 32s is injected into the container 22.
  • Separation of the magnetic microbeads 10 in step S16 from the antibody nanobeads 50 bound to the exosomes 32w and the exosomes 32s can be performed in the same manner as in FIG. However, in the separation in step S16, it is necessary to recover the antibody nanobeads 50 and the exosomes 32s bound to the exosomes 32w contained in the supernatant without discarding the supernatant.
  • the magnetic microbeads 10 and the antibody nanobeads 50 bound to the exosome 32w can be separated.
  • the illustration of exosomes 32s is omitted.
  • FIG. 15A shows a state in which a buffer solution 21 containing magnetic microbeads 10 and antibody nanobeads 50 separated from each other is injected into a container 61.
  • FIG. 16A (a) corresponds to the state of FIG.
  • the magnetic microbeads 10 and the antibody nanobeads 50 can be largely separated by magnetic collection or weak centrifugation in which a magnet is placed at the bottom of the container 61.
  • the precipitate which is mainly the magnetic microbeads 10 in FIG. 15A (b)
  • the buffer solution 21 is added
  • the antibody nanobeads 50 can be significantly reduced as shown in FIG. 15A (c).
  • FIG. 15A (d) if the supernatant is collected in the container 62, a buffer solution 21 containing a large amount of antibody nanobeads 50 can be obtained. If magnetic collection is performed in the state shown in FIG. 15A (c), the result is FIG. 15A (e).
  • the precipitate which is mainly the magnetic microbeads 10 in FIG. 15A (e)
  • the buffer solution 21 is added
  • the antibody nanobeads 50 can be further reduced as shown in FIG. 15B (f).
  • FIG. 15B if the supernatant is collected in the container 63, a buffer solution 21 containing the antibody nanobeads 50 can be obtained. If magnetic collection is performed in the state shown in FIG. 15B (f), the result is FIG. 15B (h).
  • FIG. 15B (i) corresponds to the state of FIG. As shown in FIG. 15B (j), if the supernatant is collected in the container 64, a buffer solution 21 containing a small amount of antibody nanobeads 50 can be obtained.
  • FIG. 15B (k) if all the antibody nanobeads 50 of the containers 62 to 64 are combined, all the antibody nanobeads 50 bound to the exosome 32w, which were bound to the magnetic microbeads 10, can be recovered. .. At this time, exosomes 32s can also be recovered.
  • FIG. 15B (k) corresponds to the state of FIG.
  • the number of times of precipitation collection and supernatant collection is not limited to the number of times shown in FIGS. 15A and 15B.
  • the operator separates the antibody nanobeads 50 bound to the exosome 32w and the exosome 32s in step S17.
  • the antibody nanobeads 50 bound to exosomes 32w and exosomes 32s can be separated and individually recovered by the same method as in FIGS. 15A and 15B.
  • the antibody nanobeads 50 bound to the exosomes 32w shown in FIG. 16 can be recovered.
  • the buffer solution 21 containing only the antibody nanobeads 50 bound to the exosome 32w is injected into the container 23.
  • the exosomes 32s shown in FIG. 17 can be recovered.
  • the buffer solution 21 containing only exosomes 32s is injected into the container 24.
  • step S18 the operator dissolves the exosomes 32s and analyzes the inclusions of the exosomes 32s.
  • a surfactant is added to the buffer solution 21 containing the exosomes 32s, the lipid bilayer film 320 of the exosomes 32s is dissolved and destroyed.
  • step S18 may be omitted as the primary purpose is to analyze the double positive exosomes 32w.
  • the operator executes a process of separating the antibody nanobeads 50 and the exosome 32w in step S19.
  • a surfactant is a 2% nonionic surfactant Triton X-100 solution. Since the lipid bilayer 320 of the exosome 32w is lysed by the surfactant, the antibody nanobeads 50 and the exosome 32w are separated by the destruction of the exosome 32w, and the inclusions of the exosome 32w are contained in the buffer solution 21. Is released to. In FIG. 18, each exosome 32w is actually divided into a plurality of inclusions by breaking the lipid bilayer membrane 320.
  • step S20 the operator separates the antibody nanobeads 50 and the inclusions of the exosome 32w and collects them individually.
  • the antibody nanobeads 50 and the inclusions of exosomes 32w can be separated by the same method as in FIGS. 15A and 15B.
  • the antibody nanobeads 50 shown in FIG. 19 can be recovered.
  • the buffer solution 21 containing only the antibody nanobeads 50 is injected into the container 24.
  • the inclusions of exosome 32w shown in FIG. 20 can be recovered.
  • each exosome 32w is actually divided into a plurality of inclusions.
  • the buffer solution 21 containing only the inclusions of exosome 32w is injected into the container 25.
  • step S21 the operator takes out the inclusions of exosome 32w in the container 25 and analyzes the inclusions.
  • the DNA or protein in the inclusions can be analyzed by an analysis method such as RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) analysis or LC-MS (Liquid Chromatography-Mass Spectrometry) analysis.
  • the operator measures the number of antibody nanobeads 50 in step S22.
  • the operator may perform step S21 and step S22 in any order, and may be performed by a plurality of operators at the same time.
  • the order of step S18, step S21, and step S22 is also arbitrary.
  • step S22 Since the antibody nanobeads 50 whose number is measured in step S22 are bound to the double positive exosomes 32w, the number of exosomes 32w in which both CD147 and HER2 are present is measured in step S22. ..
  • the only exosomes 32 whose inclusions are analyzed in step S21 are the double positive exosomes 32w from which the single positive exosomes 32s have been removed, and the exosomes 32w whose number is measured in step S22.
  • the double-positive exosome 32w whose inclusions are analyzed and the double-positive exosome 32w whose number is measured are the same.
  • the inclusions of double-positive exosomes 32w in which both the disease-related membrane proteins CD147 and HER2 are present can be analyzed, and the number of the exosomes 32w can be measured. can.
  • step S22 of FIG. 1B A specific method for measuring the number of antibody nanobeads 50 in step S22 of FIG. 1B will be described with reference to FIGS. 21 to 23.
  • the operator fixed the antibody 82 (third antibody) that binds to the antibody 51 immobilized on the antibody nanobeads 50.
  • the antibody 82 is, for example, a Goat anti-Mouse IgG antibody.
  • the disk substrate 81 is preferably disk-shaped, and the concave portions 81G and the convex portions 81L are preferably arranged alternately in the radial direction.
  • the concave portion 81G and the convex portion 81L are formed in a spiral shape or a concentric shape.
  • the operator mounts a cartridge 83 having a plurality of, for example, cylindrical through holes, on the disk substrate 81. Then, the well 83W is formed by the disk substrate 81 and the cartridge 83. As shown in FIG. 22 (c), the operator dispenses the buffer solution 21 containing the recovered antibody nanobeads 50 into each well 83W in step S222.
  • the cartridge 83 can adopt the configuration described in Patent Document 2.
  • step S223 the operator binds the antibody 51 of the antibody nanobeads 50 and the antibody 82 immobilized on the disk substrate 81 by shaking or magnetic adsorption. If the antibody nanobeads 50 are used as magnetic nanobeads and a magnet is arranged on the back surface side of the disk substrate 81, the antibody nanobeads 50 are attracted to the surface of the disk substrate 81. This facilitates the binding of the antibody 51 of the antibody nanobeads 50 to the antibody 82 immobilized on the disk substrate 81.
  • step S224 The operator discharges the supernatant in the well 83W in step S224, and dries the disk substrate 81 in step S225.
  • step S226 the operator attaches the dried disk substrate 81 to the analyzer and measures the number of antibody nanobeads 50 fixed to the disk substrate 81 by the analyzer. do.
  • the analyzer irradiates the disk substrate 81 with a laser beam focused by the condenser lens 101 to measure the number of antibody nanobeads 50.
  • the analyzer can adopt the configuration described in Patent Document 3.
  • the surface of the disk substrate 81 may be treated with oxygen plasma to form a polar functional group such as a carboxyl group (COOH).
  • a polar functional group such as a carboxyl group (COOH).
  • the antibody 51 of the antibody nanobeads 50 is adsorbed on the polar functional group.
  • one biological sample contains double-positive exosomes 32w containing two types of disease-related antigens (membrane proteins).
  • the inclusions of exosomes 32w can be analyzed and the number of exosomes 32w can be measured.
  • the present invention is not limited to one or more embodiments described above, and various modifications can be made without departing from the gist of the present invention.
  • the first bead is a magnetic microbead 10 and the second bead is an antibody nanobead 50, but the first bead and the second bead are large enough to be separated from each other. It should be different.
  • the first bead is a microbead and the second bead is a nanobead, they can be easily separated from each other. Therefore, it is preferable that the first bead is a microbead and the second bead is a nanobead.
  • the first bead is preferably a magnetic bead, but it can also be a non-magnetic bead. If the first beads are magnetic beads and the second beads are non-magnetic beads, they can be separated from each other extremely easily. If the second bead is a magnetic bead, the second bead can be easily fixed to the disk substrate 81.
  • the first bead may be a non-magnetic bead and the second bead may be a magnetic bead.
  • the first bead and the second bead may be magnetic beads.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

第１のビーズと第２のビーズとが結合したエクソソームを含む緩衝液から、第１のビーズと第２のビーズとが結合したエクソソームが回収される。第１のビーズの表面には、第１の疾患に関連した第１の抗原と特異的に結合する第１の抗体が固定されている。第２のビーズの表面には、第２の疾患に関連した第２の抗原と特異的に結合する第２の抗体が固定されている。エクソソームから第１のビーズが切り離され、第２のビーズが結合したエクソソームが回収される。第２のビーズが結合したエクソソームが溶解処理されて、第２のビーズとエクソソームの内包物とが回収される（Ｓ１９及びＳ２０）。エクソソームの内包物が分析され（Ｓ２１）、第２のビーズの個数が計測される（Ｓ２２）。

Description

生体試料分析方法
　本開示は、生体試料に含まれているエクソソームの内包物を分析し、エクソソームの個数を計測する生体試料分析方法に関する。
　特定の疾患と関連付けられている抗原をバイオマーカとして検出して分析することで、特定の疾患を発見したり、特定の疾患の治療の効果を検証したりすることが行われている。細胞から分泌され、血液等の各種の体液に含まれているエクソソームは、特定の疾患を発見するためのバイオマーカとして期待されている。
　エクソソームは脂質二重膜で覆われた微小な膜小胞であり、脂質二重膜には、ＣＤ９、ＣＤ６３等の各種の膜たんぱく質が存在する。人が特定の疾患に罹患すると、疾患に関連した膜たんぱく質が脂質二重膜の表面に発現しているエクソソームの量が増加することが知られている。エクソソームの表面に発現している疾患に関連した膜たんぱく質を抗原とし、疾患に関連した抗原を有するエクソソームの個数を計測することによって、人が特定の疾患に罹患しているか否かを発見できる可能性がある。
　エクソソームの内部には、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）及びＤＮＡ等の核酸、たんぱく質等の内包物が存在する。エクソソームの内包物も特定の疾患を発見するためのバイオマーカとして期待されている（特許文献１参照）。
特開２０１８－１６３０４３号公報 特開２０１７－４０５９５号公報 特開２０１９－２１１３６６号公報
　従来においては、エクソソームを含む生体試料の検体を２つ用意し、一方の検体でエクソソームの内包物を分析し、他方の検体でエクソソームの個数を計測する。即ち、内包物を分析したエクソソームと、個数を計測したエクソソームとは同一のものではない。１つの検体で、エクソソームの内包物を分析し、エクソソームの個数を計測することが望まれる。
　１またはそれ以上の実施形態は、１つの生体試料で、エクソソームの内包物を分析し、かつ、エクソソームの個数を計測することができる生体試料分析方法を提供することを目的とする。
　１またはそれ以上の実施形態の一態様によれば、第１の疾患に関連した第１の抗原と特異的に結合する第１の抗体を表面に固定した複数の第１のビーズを含む第１の緩衝液が注入された反応容器に、第２の疾患に関連した第２の抗原と特異的に結合する第２の抗体を表面に固定した複数の第２のビーズと、前記第１の抗原及び前記第２の抗原を表面に有する分析対象のエクソソームを含む生体試料とを注入して、前記第１のビーズと前記第２のビーズとが結合した前記分析対象のエクソソームを含む第２の緩衝液を生成し、前記第２の緩衝液から、前記第１のビーズと前記第２のビーズとが結合した前記分析対象のエクソソームを回収し、回収した前記第１のビーズと前記第２のビーズとが結合した前記分析対象のエクソソームから前記第１のビーズを切り離し、前記第２のビーズが結合した前記分析対象のエクソソームを回収し、回収した前記第２のビーズが結合した前記分析対象のエクソソームを溶解処理して、前記第２のビーズと前記分析対象のエクソソームの内包物とに分離してそれぞれを回収し、回収した前記分析対象のエクソソームの内包物を分析し、回収した前記第２のビーズの個数を計測する生体試料分析方法が提供される。
　１またはそれ以上の実施形態の生体試料分析方法によれば、１つの生体試料で、エクソソームの内包物を分析し、かつ、エクソソームの個数を計測することができる。
図１Ａは、１またはそれ以上の実施形態の生体試料分析方法を部分的に示すフローチャートである。 図１Ｂは、図１Ａに続く、１またはそれ以上の実施形態の生体試料分析方法を部分的に示すフローチャートである。 図２は、１またはそれ以上の実施形態の生体試料分析方法で用いる磁性マイクロビーズを示す概念図である。 図３は、磁性マイクロビーズを含む緩衝液を注入した反応容器を示す概念図である。 図４は、シングルポジティブのエクソソーム及びダブルポジティブのエクソソームを含む生体試料の検体を示す概念図である。 図５Ａは、シングルポジティブのエクソソームの構造を示す概念図である。 図５Ｂは、ダブルポジティブのエクソソームの構造を示す概念図である。 図６は、１またはそれ以上の実施形態の生体試料分析方法で用いる抗体ナノビーズを示す概念図である。 図７は、磁性マイクロビーズを含む緩衝液を注入した反応容器にダブルポジティブのエクソソームを含む検体及び抗体ナノビーズを注入して、ダブルポジティブのエクソソームを磁性マイクロビーズと抗体ナノビーズとでサンドイッチ捕捉した状態を示す概念図である。 図８は、図７に示す反応容器からダブルポジティブのエクソソームをサンドイッチ捕捉した磁性マイクロビーズ及び抗体ナノビーズ以外の不要物を除去した状態を示す概念図である。 図９は、図７に示す反応容器から不要物を分離する方法を示す図である。 図１０は、ダブルポジティブのエクソソームをサンドイッチ捕捉した磁性マイクロビーズ及び抗体ナノビーズにおけるエクソソームを磁性マイクロビーズから切り離した状態を示す概念図である。 図１１は、ハプテンを用いてエクソソームを磁性マイクロビーズから切り離す方法を示す図である。 図１２は、リンカーを用いてエクソソームを磁性マイクロビーズから切り離す方法を示す図である。 図１３は、磁性マイクロビーズと、ダブルポジティブのエクソソームを捕捉した抗体ナノビーズと、シングルポジティブのエクソソームとを分離して得られた磁性マイクロビーズを示す概念図である。 図１４は、磁性マイクロビーズと、ダブルポジティブのエクソソームを捕捉した抗体ナノビーズと、シングルポジティブのエクソソームとを分離して得られた、ダブルポジティブのエクソソームを捕捉した抗体ナノビーズ及びシングルポジティブのエクソソームを示す概念図である。 図１５Ａは、磁性マイクロビーズと抗体ナノビーズとを分離する方法の途中までの工程を示す図である。 図１５Ｂは、磁性マイクロビーズと抗体ナノビーズとを分離する方法の図１５Ａに続く工程を示す図である。 図１６は、ダブルポジティブのエクソソームを捕捉した抗体ナノビーズと、シングルポジティブのエクソソームとを分離して得られた、ダブルポジティブのエクソソームを捕捉した抗体ナノビーズを示す概念図である。 図１７は、ダブルポジティブのエクソソームを捕捉した抗体ナノビーズと、シングルポジティブのエクソソームとを分離して得られた、シングルポジティブのエクソソームを示す概念図である。 図１８は、ダブルポジティブのエクソソームから抗体ナノビーズを切り離した状態を示す概念図である。 図１９は、互いに切り離された、抗体ナノビーズとダブルポジティブのエクソソームとを分離して得られた抗体ナノビーズを示す概念図である。 図２０は、互いに切り離された、抗体ナノビーズとダブルポジティブのエクソソームとを分離して得られたダブルポジティブのエクソソームを示す概念図である。 図２１は、図１ＢのステップＳ２２の具体的な抗体ナノビーズの個数の計測方法を示すフローチャートである。 図２２は、抗体ナノビーズの個数の計測方法を示す図である。 図２３は、ディスク基板に抗体ナノビーズを付着させるための極性官能基を形成した状態を示す概念図である。
　以下、１またはそれ以上の実施形態の生体試料分析方法について、添付図面を参照して説明する。１またはそれ以上の実施形態においては、１つのエクソソームの表面に２種類の特定の膜たんぱく質が発現しているダブルポジティブのエクソソームを捕捉して内包物を分析し、かつ、そのエクソソームの個数を計測することができる生体試料分析方法を例とする。
　図１Ａにおいて、オペレータは、ステップＳ１１にて、図２に示すように、磁性マイクロビーズ１０の表面に第１の疾患に関連した抗原と特異的に結合する複数の抗体１１を固定させる。図３に示すように、オペレータは、ステップＳ１２にて、反応容器２０に抗体１１が固定された多数の磁性マイクロビーズ１０を含む緩衝液２１（第１の緩衝液）を注入する。磁性マイクロビーズ１０の直径は３μｍ程度であり、直径はマイクロメートルオーダーであればよい。
　図４に示すように、オペレータは、容器３０に生体試料の検体３１を準備する。検体３１は、後述するシングルポジティブのエクソソーム３２ｓ及びダブルポジティブのエクソソーム３２ｗを含む。検体３１は血液等の任意の体液であって、エクソソーム３２ｓ及び３２ｗの他に、不要物である夾雑物３３及び３４を含む。シングルポジティブのエクソソーム３２ｓ及びダブルポジティブのエクソソーム３２ｗをエクソソーム３２と総称する。
　図５Ａに概念的に示すように、シングルポジティブのエクソソーム３２ｓは脂質二重膜３２０で覆われており、脂質二重膜３２０には、膜たんぱく質３２１～３２３が存在している。膜たんぱく質３２１はＣＤ９、膜たんぱく質３２２はＣＤ６３、膜たんぱく質３２３はＣＤ１４７である。ＣＤ９及びＣＤ６３は通常存在する膜たんぱく質であり、ＣＤ１４７は第１の疾患に関連した膜たんぱく質の一例である。このようにシングルポジティブのエクソソーム３２ｓは、１つのエクソソーム３２の表面に１種類の疾患に関連した膜たんぱく質（１またはそれ以上の実施形態においてはＣＤ１４７）が存在しているエクソソーム３２を指す。
　図５Ｂに概念的に示すように、ダブルポジティブのエクソソーム３２ｗは脂質二重膜３２０で覆われており、脂質二重膜３２０には、膜たんぱく質３２１～３２４が存在している。膜たんぱく質３２４はＨＥＲ２（ＣＤ３４０）である。ＨＥＲ２（ＣＤ３４０）は第２の疾患に関連した膜たんぱく質の一例である。このようにダブルポジティブのエクソソーム３２ｗは、１つのエクソソーム３２の表面に２種類の疾患に関連した膜たんぱく質（１またはそれ以上の実施形態においてはＣＤ１４７及びＨＥＲ２（ＣＤ３４０）の２つ）が存在しているエクソソーム３２を指す。以下、ＨＥＲ２（ＣＤ３４０）を通称名であるＨＥＲ２と称する。
　１またはそれ以上の実施形態においては、一例として、ＣＤ１４７及びＨＥＲ２の双方が表面に存在するダブルポジティブのエクソソーム３２ｗを分析対象のエクソソームとする。１またはそれ以上の実施形態においては、ＣＤ１４７を第１の疾患に関連した第１の抗原とし、ＨＥＲ２を第２の疾患に関連した第２の抗原としているが、これに限定されない。磁性マイクロビーズ１０の表面に固定されている抗体１１は、ＣＤ１４７と特異的に結合する第１の抗体である。
　エクソソーム３２の内部には、ｍｉＲＮＡ３２５及びＤＮＡ３２６等の核酸、及び図示していないたんぱく質等の内包物が存在する。
　図６に示すように、オペレータは、容器４０に、表面に複数の抗体５１が固定された抗体ナノビーズ５０を含む緩衝液４１を準備する。抗体ナノビーズ５０は磁性マイクロビーズ１０よりも格段に小径であって、直径は２００ｎｍ程度である。抗体ナノビーズ５０の直径は１μｍ未満であればよく、好ましくは１００ｎｍ～５００ｎｍである。抗体ナノビーズ５０の表面に固定されている抗体５１は、第２の疾患に関連した第２の抗原であるＨＥＲ２と特異的に結合する抗体（第２の抗体）である。
　図７に示すように、オペレータは、ステップＳ１３にて、エクソソーム３２を含む検体３１と、抗体ナノビーズ５０を含む緩衝液４１を順に（または同時に）反応容器２０に注入する。緩衝液２１と緩衝液４１とを混合した緩衝液を緩衝液２１とすると、反応容器２０内には、磁性マイクロビーズ１０と抗体ナノビーズ５０とでサンドイッチ捕捉されたダブルポジティブのエクソソーム３２ｗを含む緩衝液２１（第２の緩衝液）が生成される。この場合、サンドイッチ捕捉とは２つのビーズが１つのエクソソームに結合することを意味していることから、磁性マイクロビーズ１０と抗体ナノビーズ５０とが結合したエクソソーム３２ｗを含む第２の緩衝液が生成される、ということができる。このとき、オペレータは、反応容器２０を必要に応じて振盪し、所定時間待機する。
　図７において、ＣＤ１４７及びＨＥＲ２の双方が表面に存在しているダブルポジティブのエクソソーム３２ｗが磁性マイクロビーズ１０と抗体ナノビーズ５０とでサンドイッチ捕捉されている。ＨＥＲ２が存在していないシングルポジティブのエクソソーム３２ｓは磁性マイクロビーズ１０の抗体１１と結合する。しかしながら、シングルポジティブのエクソソーム３２ｓには抗体ナノビーズ５０は結合しないため、シングルポジティブのエクソソーム３２ｓは磁性マイクロビーズ１０と抗体ナノビーズ５０とでサンドイッチ捕捉されない。
　図７において、反応容器２０内には多数の磁性マイクロビーズ１０が存在しているが、理解を容易にするため、拡大した１つの磁性マイクロビーズ１０のみを示している。
　オペレータは、ステップＳ１４にて、エクソソーム３２を介して抗体ナノビーズ５０が連結された磁性マイクロビーズ１０と不要物とを磁気捕集または弱遠心分離等によって分離する。オペレータは、分離された磁性マイクロビーズ１０を洗浄する。磁性マイクロビーズ１０と連結していない抗体ナノビーズ５０、夾雑物３３及び３４は不要物である。なお、ステップＳ１３にて抗体ナノビーズ５０は過剰に注入されるから、不要物は主として磁性マイクロビーズ１０と連結していない抗体ナノビーズ５０である。ステップＳ１４の結果、図８に示す、エクソソーム３２を介して抗体ナノビーズ５０が連結された磁性マイクロビーズ１０を回収することができる。
　回収された磁性マイクロビーズ１０には抗体ナノビーズ５０が結合していないエクソソーム３２ｓも結合している。勿論、複数ある磁性マイクロビーズ１０の中には、抗体ナノビーズ５０が結合したエクソソーム３２ｗのみが結合している磁性マイクロビーズ１０もあれば、抗体ナノビーズ５０が結合していないエクソソーム３２ｓのみが結合している磁性マイクロビーズ１０もある。
　ところで、抗体ナノビーズ５０が磁性ナノビーズでなければ、磁性マイクロビーズ１０を磁気捕集することによって、磁性マイクロビーズ１０と、磁性マイクロビーズ１０と連結していない抗体ナノビーズ５０とを容易に分離することができる。後述するステップＳ２２にて磁性マイクロビーズ１０と連結している抗体ナノビーズ５０の個数を計測する際に、抗体ナノビーズ５０は磁性ナノビーズであることが好ましい。抗体ナノビーズ５０が磁性ナノビーズであったとしても、磁性マイクロビーズ１０と、非連結の抗体ナノビーズ５０とを分離することが可能である。
　具体的には、図９に示すようにして、磁性マイクロビーズ１０と非連結の抗体ナノビーズ５０とを分離することができる。図９において、（ａ）は、容器６０内に抗体ナノビーズ５０が連結された磁性マイクロビーズ１０と非連結の抗体ナノビーズ５０とを含む緩衝液２１を注入した状態である。図９の（ａ）は図７の状態に相当する。容器６０の底部に磁石を配置する磁気捕集または弱遠心分離によって、図９の（ｂ）に示すように、磁性マイクロビーズ１０と非連結の抗体ナノビーズ５０とを大方分離することができる。
　これは、磁性マイクロビーズ１０と抗体ナノビーズ５０との体積が約１０００倍異なるため、磁性マイクロビーズ１０は短時間で磁気捕集されるのに対し、抗体ナノビーズ５０は長時間かけないと磁気捕集されないからである。この磁気捕集の時間差を利用することによって、磁性マイクロビーズ１０と非連結の抗体ナノビーズ５０とを大方分離することができる。
　磁性マイクロビーズ１０を洗浄する工程において、図９の（ｂ）の主として磁性マイクロビーズ１０である沈殿物を回収して上清を除去して緩衝液２１を加えれば、図９の（ｃ）に示すように非連結の抗体ナノビーズ５０を大幅に減らすことができる。図９の（ｃ）に示す状態で磁気捕集すれば図９の（ｄ）となり、沈殿物を回収して上清を除去して緩衝液２１を加えれば、図９の（ｅ）に示すように非連結の抗体ナノビーズ５０をさらに大幅に減らすことができる。
　図９の（ｅ）に示す状態で磁気捕集すれば図９の（ｆ）となり、沈殿物を回収して上清を除去して緩衝液２１を加えれば、図９の（ｇ）に示すように抗体ナノビーズ５０が連結された磁性マイクロビーズ１０のみを分離することができる。図９の（ｇ）は図８の状態に相当する。沈殿物回収及び上清除去の回数は図９に示す回数に限定されない。
　図１０に示すように、オペレータは、ステップＳ１５にて、エクソソーム３２を磁性マイクロビーズ１０から切り離す処理を実行する。すると、抗体ナノビーズ５０が結合したダブルポジティブのエクソソーム３２ｗと、抗体ナノビーズ５０が結合していないシングルポジティブのエクソソーム３２ｓとが、磁性マイクロビーズ１０から切り離される。
　ステップＳ１５のエクソソーム３２を磁性マイクロビーズ１０から切り離す処理としては、以下のいずれかの方法を採用することができる。第１の方法として、図１１に示すハプテンを用いる方法がある。ハプテンとは、抗体と結合するが、分子量が小さいため単独で抗体産生を誘起する活性（免疫原性）を示さない物質である。ハプテンは、適当なたんぱく質と結合すると、免疫原性を有する完全抗原となる。
　図１１に示すように、磁性マイクロビーズ１０には抗体５１の代わりに抗ＤＮＰ抗体５２が固定されている。ＤＮＰとは2, 4-ジニトロフェノールであって、ハプテンの一例である。抗ＤＮＰ抗体５２には、ＤＮＰ５３が結合した抗体５４（以下、ＤＮＰ抗体５４）を介して、ダブルポジティブのエクソソーム３２ｗまたはシングルポジティブのエクソソーム３２ｓが結合されている。ＤＮＰ抗体５４はＣＤ１４７と特異的に結合する抗体である。
　この状態で抗ＤＮＰ抗体５２とＤＮＰ抗体５４との結合は平衡反応である。磁性マイクロビーズ１０と抗体ナノビーズ５０とでサンドイッチ捕捉されたエクソソーム３２ｗを含む緩衝液２１（第３の緩衝液）にＤＮＰ５３（ハプテン）を大過剰に添加すると、抗ＤＮＰ抗体５２と結合していたＤＮＰ抗体５４がＤＮＰ５３に入れ替わって、磁性マイクロビーズ１０と、抗体ナノビーズ５０と結合しているダブルポジティブのエクソソーム３２ｗ及びシングルポジティブのエクソソーム３２ｓとが切り離される。
　エクソソーム３２を磁性マイクロビーズ１０から切り離す第２の方法として、図１２に示す開裂可能なリンカー５５を用いる方法がある。磁性マイクロビーズ１０には、リンカー５５を介して抗体１１が固定されている。第２の方法を用いる場合、図８に示す磁性マイクロビーズ１０にはリンカー５５を介して抗体１１が固定され、抗体１１がエクソソーム３２と結合している。
　反応容器２０内の緩衝液２１（第３の緩衝液）にリンカー開裂試薬を添加すると、図１２に示すように、リンカー５５が開裂して、磁性マイクロビーズ１０と抗体１１とが切り離される。
　エクソソーム３２を磁性マイクロビーズ１０から切り離す第３の方法として、磁性マイクロビーズ１０にＷｈｏｌｅ抗体を用い、抗体ナノビーズ５０にＦａｂ抗体を用いてもよい。Ｗｈｏｌｅ抗体を酵素で分解及び消化すれば、エクソソーム３２を磁性マイクロビーズ１０から切り離すことができる。
　図１Ｂにおいて、オペレータは、ステップＳ１６にて、磁性マイクロビーズ１０と、ダブルポジティブのエクソソーム３２ｗと結合した抗体ナノビーズ５０及びシングルポジティブのエクソソーム３２ｓとを分離する。分離された磁性マイクロビーズ１０を洗浄すれば、図１３に示す磁性マイクロビーズ１０を回収することができる。図１３において、磁性マイクロビーズ１０のみを含む緩衝液２１は反応容器２０に注入されている。
　分離されたエクソソーム３２ｗと結合した抗体ナノビーズ５０及びエクソソーム３２ｓを洗浄すれば、図１４に示すエクソソーム３２ｗと結合した抗体ナノビーズ５０及びエクソソーム３２ｓを回収することができる。図１４において、エクソソーム３２ｗと結合した抗体ナノビーズ５０及びエクソソーム３２ｓを含む緩衝液２１は容器２２に注入されている。
　ステップＳ１６における磁性マイクロビーズ１０と、エクソソーム３２ｗと結合した抗体ナノビーズ５０及びエクソソーム３２ｓとの分離は、図９と同様に実行することができる。但し、ステップＳ１６の分離においては、上清を廃棄せず、上清に含まれるエクソソーム３２ｗと結合した抗体ナノビーズ５０及びエクソソーム３２ｓを回収する必要がある。
　具体的には、図１５Ａ及び図１５Ｂに示すようにして、磁性マイクロビーズ１０とエクソソーム３２ｗと結合した抗体ナノビーズ５０とを分離することができる。図１５Ａ及び図１５Ｂにおいてはエクソソーム３２ｓの図示を省略している。
　図１５Ａにおいて、（ａ）は、容器６１内に互いに分離した磁性マイクロビーズ１０と抗体ナノビーズ５０とを含む緩衝液２１を注入した状態である。図１６Ａの（ａ）は図１０の状態に相当する。容器６１の底部に磁石を配置する磁気捕集または弱遠心分離によって、図１５Ａの（ｂ）に示すように、磁性マイクロビーズ１０と抗体ナノビーズ５０とを大方分離することができる。
　図１５Ａの（ｂ）の主として磁性マイクロビーズ１０である沈殿物を回収して緩衝液２１を加えれば、図１５Ａの（ｃ）に示すように抗体ナノビーズ５０を大幅に減らすことができる。図１５Ａの（ｄ）に示すように、上清を容器６２に回収すれば、抗体ナノビーズ５０を多く含む緩衝液２１を得ることができる。図１５Ａの（ｃ）に示す状態で磁気捕集すれば図１５Ａの（ｅ）となる。
　図１５Ａの（ｅ）の主として磁性マイクロビーズ１０である沈殿物を回収して緩衝液２１を加えれば、図１５Ｂの（ｆ）に示すように抗体ナノビーズ５０をさらに減らすことができる。図１５Ｂの（ｇ）に示すように、上清を容器６３に回収すれば、抗体ナノビーズ５０を含む緩衝液２１を得ることができる。図１５Ｂの（ｆ）に示す状態で磁気捕集すれば図１５Ｂの（ｈ）となる。
　図１５Ｂの（ｈ）の磁性マイクロビーズ１０のみとなった沈殿物を回収して緩衝液２１を加えれば、図１５Ｂの（ｉ）に示すように抗体ナノビーズ５０を含まない磁性マイクロビーズ１０のみを含む緩衝液２１を得ることができる。図１５Ｂの（ｉ）は図１３の状態に相当する。図１５Ｂの（ｊ）に示すように、上清を容器６４に回収すれば、抗体ナノビーズ５０をわずかに含む緩衝液２１を得ることができる。
　図１５Ｂの（ｋ）に示すように、容器６２～６４全ての抗体ナノビーズ５０を合わせれば、磁性マイクロビーズ１０に結合していた、エクソソーム３２ｗと結合した全ての抗体ナノビーズ５０を回収することができる。このとき、エクソソーム３２ｓも回収することができる。図１５Ｂの（ｋ）は図１４の状態に相当する。沈殿物回収及び上清回収の回数は図１５Ａ及び図１５Ｂに示す回数に限定されない。
　図１Ｂにおいて、オペレータは、ステップＳ１７にて、エクソソーム３２ｗと結合した抗体ナノビーズ５０とエクソソーム３２ｓとを分離する。エクソソーム３２ｗと結合した抗体ナノビーズ５０とエクソソーム３２ｓとは、図１５Ａ及び図１５Ｂと同様の方法によって分離して個別に回収することができる。
　分離されたエクソソーム３２ｗと結合した抗体ナノビーズ５０を洗浄すれば、図１６に示すエクソソーム３２ｗと結合した抗体ナノビーズ５０を回収することができる。図１６において、エクソソーム３２ｗと結合した抗体ナノビーズ５０のみを含む緩衝液２１は容器２３に注入されている。分離されたエクソソーム３２ｓを洗浄すれば、図１７に示すエクソソーム３２ｓを回収することができる。図１７において、エクソソーム３２ｓのみを含む緩衝液２１は容器２４に注入されている。
　オペレータは、ステップＳ１８にて、エクソソーム３２ｓを溶解処理してエクソソーム３２ｓの内包物を分析する。エクソソーム３２ｓを含む緩衝液２１に界面活性剤を添加すると、エクソソーム３２ｓの脂質二重膜３２０が溶解処理されて破壊される。１またはそれ以上の実施形態においては、ダブルポジティブのエクソソーム３２ｗを分析することを主目的としているので、ステップＳ１８は省略されてもよい。
　オペレータは、ステップＳ１９にて、抗体ナノビーズ５０とエクソソーム３２ｗとを切り離す処理を実行する。一例として、図１６に示す緩衝液２１に界面活性剤を添加することによって、図１８に示すように、抗体ナノビーズ５０とエクソソーム３２ｗとを切り離すことができる。例えば、界面活性剤は２％の非イオン性界面活性剤であるTritonX-100溶液である。界面活性剤によってエクソソーム３２ｗの脂質二重膜３２０が溶解処理されるので、エクソソーム３２ｗが破壊されることによって抗体ナノビーズ５０とエクソソーム３２ｗとが切り離され、かつ、エクソソーム３２ｗの内包物が緩衝液２１中に放出される。図１８において、実際には各エクソソーム３２ｗは脂質二重膜３２０が破壊されて複数の内包物に分断される。
　オペレータは、ステップＳ２０にて、抗体ナノビーズ５０とエクソソーム３２ｗの内包物とを分離して個別に回収する。抗体ナノビーズ５０とエクソソーム３２ｗの内包物とは、図１５Ａ及び図１５Ｂと同様の方法によって分離することができる。
　分離された抗体ナノビーズ５０を洗浄すれば、図１９に示す抗体ナノビーズ５０を回収することができる。図１９において、抗体ナノビーズ５０のみを含む緩衝液２１は容器２４に注入されている。分離されたエクソソーム３２ｗの内包物を洗浄すれば、図２０に示すエクソソーム３２ｗの内包物を回収することができる。図２０においても、実際には各エクソソーム３２ｗは複数の内包物に分断されている。図２０において、エクソソーム３２ｗの内包物のみを含む緩衝液２１は容器２５に注入されている。
　オペレータは、ステップＳ２１にて、容器２５内のエクソソーム３２ｗの内包物を取り出して内包物を分析する。このとき、RT-PCR（Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction）分析、LC-MS（Liquid Chromatography - Mass Spectrometry）分析等の分析方法によって、内包物中のＤＮＡまたはタンパク質を解析することができる。また、オペレータは、ステップＳ２２にて、抗体ナノビーズ５０の個数を計測する。オペレータは、ステップＳ２１とステップＳ２２とを任意の順番で行えばよく、複数のオペレータによって同時に行ってもよい。ステップＳ１８とステップＳ２１とステップＳ２２との順番も任意である。オペレータがステップＳ２１及びＳ２２（または、ステップＳ１８、Ｓ２１及びＳ２２）を実行すれば、生体試料分析の処理が終了する。
　ステップＳ２２で個数が計測される抗体ナノビーズ５０はダブルポジティブのエクソソーム３２ｗと結合していたものであるから、ステップＳ２２では、ＣＤ１４７及びＨＥＲ２の双方が存在するエクソソーム３２ｗの個数が計測されることになる。ステップＳ２１で内包物が分析されるエクソソーム３２は、シングルポジティブのエクソソーム３２ｓを取り除いたダブルポジティブのエクソソーム３２ｗのみであり、ステップＳ２２で個数が計測されるエクソソーム３２ｗである。
　よって、内包物を分析したダブルポジティブのエクソソーム３２ｗと、個数を計測したダブルポジティブのエクソソーム３２ｗとは同一のものである。図４に示す１つの検体３１で、疾患に関連した膜たんぱく質であるＣＤ１４７及びＨＥＲ２の双方が存在するダブルポジティブのエクソソーム３２ｗの内包物を分析し、かつ、そのエクソソーム３２ｗの個数を計測することができる。
　図２１～図２３を用いて、図１ＢのステップＳ２２の具体的な抗体ナノビーズ５０の個数の計測方法を説明する。図２１において、オペレータは、ステップＳ２２１にて、図２２の（ａ）に示すように、抗体ナノビーズ５０に固定されている抗体５１と結合する抗体８２（第３の抗体）を固定させたディスク基板８１を準備する。抗体８２は一例としてGoat anti Mouse IgG抗体である。
　ディスク基板８１は円盤状であるのがよく、径方向に凹部８１Ｇと凸部８１Ｌとが交互に配置されているのがよい。凹部８１Ｇ及び凸部８１Ｌはスパイラル状または同心円状に形成されている。
　図２２の（ｂ）に示すように、オペレータは、複数の例えば円筒状の貫通穴が形成されたカートリッジ８３をディスク基板８１に装着する。すると、ディスク基板８１とカートリッジ８３とでウェル８３Ｗが形成される。図２２の（ｃ）に示すように、オペレータは、ステップＳ２２２にて、回収した抗体ナノビーズ５０を含む緩衝液２１を各ウェル８３Ｗに分注する。なお、カートリッジ８３は特許文献２に記載の構成を採用することができる。
　図２２の（ｄ）に示すように、オペレータは、ステップＳ２２３にて、振盪または磁気吸着によって、抗体ナノビーズ５０の抗体５１とディスク基板８１に固定された抗体８２とを結合させる。抗体ナノビーズ５０を磁性ナノビーズとして、ディスク基板８１の裏面側に磁石を配置すれば、抗体ナノビーズ５０がディスク基板８１の表面に引き寄せられる。これにより、ディスク基板８１に固定された抗体８２に抗体ナノビーズ５０の抗体５１が結合しやすくなる。
　オペレータは、ステップＳ２２４にて、ウェル８３Ｗ中の上清を排出し、ステップＳ２２５にて、ディスク基板８１を乾燥させる。図２２の（ｅ）に示すように、オペレータは、ステップＳ２２６にて、乾燥させたディスク基板８１を分析装置に装着して、分析装置でディスク基板８１に固定された抗体ナノビーズ５０の個数を計測する。分析装置は、ディスク基板８１に集光レンズ１０１によって集光したレーザビームを照射して抗体ナノビーズ５０の個数を計測する。なお、分析装置は特許文献３に記載の構成を採用することができる。
　図２３に示すように、ディスク基板８１に抗体８２を固定する代わりに、ディスク基板８１の表面を酸素プラズマ処理してカルボキシル基（COOH）等の極性官能基を形成してもよい。抗体ナノビーズ５０の抗体５１は極性官能基に吸着する。
　以上のように、１またはそれ以上の実施形態の生体試料分析方法によれば、１つの生体試料（検体３１）で、疾患に関連した２種類の抗原（膜たんぱく質）を含むダブルポジティブのエクソソーム３２ｗの内包物を分析し、かつ、そのエクソソーム３２ｗの個数を計測することができる。
　本発明は以上説明した１またはそれ以上の実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変更可能である。１またはそれ以上の実施形態においては、第１のビーズを磁性マイクロビーズ１０、第２のビーズを抗体ナノビーズ５０としているが、第１のビーズと第２のビーズとは互いに分離可能な程度に大きさが異なればよい。第１のビーズをマイクロビーズ、第２のビーズをナノビーズとすると互いに容易に分離可能となるので、第１のビーズをマイクロビーズ、第２のビーズをナノビーズとすることが好ましい。
　第１のビーズは磁性ビーズであることが好ましいが、非磁性ビーズとすることも可能である。第１のビーズを磁性ビーズ、第２のビーズが非磁性ビーズとすれば、互いの分離が極めて容易となる。第２のビーズを磁性ビーズとすれば、第２のビーズをディスク基板８１に固定させやすくなる。第１のビーズを非磁性ビーズ、第２のビーズを磁性ビーズとしてもよい。第１のビーズ及び第２のビーズを磁性ビーズとしてもよい。
　本願は、２０２０年２月１７日に日本国特許庁に出願された特願２０２０－０２４５１１号に基づく優先権を主張するものであり、その全ての開示内容は引用によりここに援用される。

Claims (5)

  1. 　第１の疾患に関連した第１の抗原と特異的に結合する第１の抗体を表面に固定した複数の第１のビーズを含む第１の緩衝液が注入された反応容器に、第２の疾患に関連した第２の抗原と特異的に結合する第２の抗体を表面に固定した複数の第２のビーズと、前記第１の抗原及び前記第２の抗原を表面に有する分析対象のエクソソームを含む生体試料とを注入して、前記第１のビーズと前記第２のビーズとが結合した前記分析対象のエクソソームを含む第２の緩衝液を生成し、
    　前記第２の緩衝液から、前記第１のビーズと前記第２のビーズとが結合した前記分析対象のエクソソームを回収し、
    　回収した前記第１のビーズと前記第２のビーズとが結合した前記分析対象のエクソソームから前記第１のビーズを切り離し、前記第２のビーズが結合した前記分析対象のエクソソームを回収し、
    　回収した前記第２のビーズが結合した前記分析対象のエクソソームを溶解処理して、前記第２のビーズと前記分析対象のエクソソームの内包物とに分離してそれぞれを回収し、
    　回収した前記分析対象のエクソソームの内包物を分析し、回収した前記第２のビーズの個数を計測する
    　生体試料分析方法。
  2. 　前記第１の抗体は、ハプテンを用いて前記第１のビーズに固定されており、
    　前記第１のビーズと前記第２のビーズとが結合した前記分析対象のエクソソームを含む第３の緩衝液にハプテンを添加することによって、前記第１のビーズを切り離す
    　請求項１に記載の生体試料分析方法。
  3. 　前記第１の抗体は、開裂可能なリンカーを用いて前記第１のビーズに固定されており、
    　前記第１のビーズと前記第２のビーズとが結合した前記分析対象のエクソソームを含む第３の緩衝液に前記リンカーの開裂試薬を添加することによって、前記第１のビーズを切り離す
    　請求項１に記載の生体試料分析方法。
  4. 　前記溶解処理に界面活性剤を用いる請求項１～３のいずれか１項に記載の生体試料分析方法。
  5. 　前記第１のビーズが磁性ビーズである請求項１～４のいずれか１項に記載の生体試料分析方法。
PCT/JP2021/004553 2020-02-17 2021-02-08 生体試料分析方法 WO2021166713A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP21756197.6A EP4109096A4 (en) 2020-02-17 2021-02-08 BIOLOGICAL SAMPLE ANALYSIS PROCEDURE
US17/886,044 US20220381776A1 (en) 2020-02-17 2022-08-11 Biological sample analysis method

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020-024511 2020-02-17
JP2020024511A JP7425403B2 (ja) 2020-02-17 2020-02-17 生体試料分析方法

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US17/886,044 Continuation US20220381776A1 (en) 2020-02-17 2022-08-11 Biological sample analysis method

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021166713A1 true WO2021166713A1 (ja) 2021-08-26

Family

ID=77391148

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2021/004553 WO2021166713A1 (ja) 2020-02-17 2021-02-08 生体試料分析方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20220381776A1 (ja)
EP (1) EP4109096A4 (ja)
JP (1) JP7425403B2 (ja)
WO (1) WO2021166713A1 (ja)

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013094307A1 (ja) * 2011-12-22 2013-06-27 Ochiya Takahiro エクソソームの分析方法、エクソソーム分析用試薬およびエクソソーム分析装置
WO2015068772A1 (ja) * 2013-11-06 2015-05-14 Jsr株式会社 分離方法、検出方法、シグナル測定方法、疾患の判定方法、疾患治療薬の薬効評価方法、キット及び液状組成物
JP2016502862A (ja) * 2013-01-03 2016-02-01 エクソサム ダイアグノスティクス，インコーポレイティド 微細小胞の単離方法
US20170001197A1 (en) * 2014-03-14 2017-01-05 Mei He Non-invasive monitoring cancer using integrated microfluidic profiling of circulating microvesicles
JP2017040595A (ja) 2015-08-21 2017-02-23 株式会社Ｊｖｃケンウッド エクソソームの捕捉方法
JP2017138112A (ja) * 2016-02-01 2017-08-10 株式会社Ｊｖｃケンウッド 検体検出用装置及び検体検出方法
JP2018163043A (ja) 2017-03-27 2018-10-18 シスメックス株式会社 細胞外小胞の濃縮方法及び細胞外小胞濃縮用試薬
WO2019039179A1 (ja) * 2017-08-22 2019-02-28 国立大学法人広島大学 エクソソームの単離方法およびエクソソームの単離キット
WO2019068269A1 (en) * 2017-10-05 2019-04-11 The Hong Kong University Of Science And Technology ANALYSIS OF EXOSOMES AND DIAGNOSTIC METHODS FOR CANCER
CN110540961A (zh) * 2019-08-21 2019-12-06 郑州大学 Annexin V-FITC外泌体捕获亲和磁珠、其制备方法及利用其提取外泌体的方法
JP2019211366A (ja) 2018-06-06 2019-12-12 株式会社Ｊｖｃケンウッド 分析用閾値生成装置及び分析用閾値生成方法
JP2020024511A (ja) 2018-08-06 2020-02-13 富士通株式会社 情報提供装置、情報提供方法、及び情報提供プログラム

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017124000A1 (en) 2016-01-14 2017-07-20 The Regents Of The University Of California 3d-exoquant method for the analysis of surface molecules and quantification of tissue-specific exosomes in biological fluids

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013094307A1 (ja) * 2011-12-22 2013-06-27 Ochiya Takahiro エクソソームの分析方法、エクソソーム分析用試薬およびエクソソーム分析装置
JP2016502862A (ja) * 2013-01-03 2016-02-01 エクソサム ダイアグノスティクス，インコーポレイティド 微細小胞の単離方法
WO2015068772A1 (ja) * 2013-11-06 2015-05-14 Jsr株式会社 分離方法、検出方法、シグナル測定方法、疾患の判定方法、疾患治療薬の薬効評価方法、キット及び液状組成物
US20170001197A1 (en) * 2014-03-14 2017-01-05 Mei He Non-invasive monitoring cancer using integrated microfluidic profiling of circulating microvesicles
JP2017040595A (ja) 2015-08-21 2017-02-23 株式会社Ｊｖｃケンウッド エクソソームの捕捉方法
JP2017138112A (ja) * 2016-02-01 2017-08-10 株式会社Ｊｖｃケンウッド 検体検出用装置及び検体検出方法
JP2018163043A (ja) 2017-03-27 2018-10-18 シスメックス株式会社 細胞外小胞の濃縮方法及び細胞外小胞濃縮用試薬
WO2019039179A1 (ja) * 2017-08-22 2019-02-28 国立大学法人広島大学 エクソソームの単離方法およびエクソソームの単離キット
WO2019068269A1 (en) * 2017-10-05 2019-04-11 The Hong Kong University Of Science And Technology ANALYSIS OF EXOSOMES AND DIAGNOSTIC METHODS FOR CANCER
JP2019211366A (ja) 2018-06-06 2019-12-12 株式会社Ｊｖｃケンウッド 分析用閾値生成装置及び分析用閾値生成方法
JP2020024511A (ja) 2018-08-06 2020-02-13 富士通株式会社 情報提供装置、情報提供方法、及び情報提供プログラム
CN110540961A (zh) * 2019-08-21 2019-12-06 郑州大学 Annexin V-FITC外泌体捕获亲和磁珠、其制备方法及利用其提取外泌体的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HE FANG, WANG JING, YIN BIN-CHENG, YE BANG-CE: "Quantification of Exosome Based on a Copper-Mediated Signal Amplification Strategy", ANALYTICAL CHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, US, vol. 90, no. 13, 3 July 2018 (2018-07-03), US, pages 8072 - 8079, XP055849788, ISSN: 0003-2700, DOI: 10.1021/acs.analchem.8b01187 *
See also references of EP4109096A4
ZONG SHENFEI, WANG LE, CHEN CHEN, LU JU, ZHU DAN, ZHANG YIZHI, WANG ZHUYUAN, CUI YIPING: "Facile detection of tumor-derived exosomes using magnetic nanobeads and SERS nanoprobes", ANALYTICAL METHODS, ROYAL SOCIETY OF CHEMISTRY, GB, vol. 8, no. 25, 1 January 2016 (2016-01-01), GB, pages 5001 - 5008, XP055849792, ISSN: 1759-9660, DOI: 10.1039/C6AY00406G *

Also Published As

Publication number Publication date
EP4109096A4 (en) 2023-08-09
EP4109096A1 (en) 2022-12-28
US20220381776A1 (en) 2022-12-01
JP2021128129A (ja) 2021-09-02
JP7425403B2 (ja) 2024-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wu et al. Ultrasensitive detection of attomolar protein concentrations by dropcast single molecule assays
JP5843085B2 (ja) バイオマーカーの収集のためのスマートヒドロゲル粒子
EP3460474B1 (en) Method and kit for target molecule detection
JP6606916B2 (ja) エクソソームの捕捉方法
WO2017134906A1 (ja) 検体検出用装置及び検体検出方法
JP7463486B2 (ja) シグナル発生型デジタルアッセイにおけるノイズを低減する方法
US20180052172A1 (en) Kit for preparing sample for detecting monoclonal antibody
CA2569197A1 (en) Method of quickly detecting and/or assaying antigen by fluorescence correlation spectrometry
US20090311800A1 (en) Ultrasound method
CN108732145B (zh) 受检物质的信息获取方法
Wells Sample preparation for mass spectrometry applications
JP6384929B2 (ja) ターゲット分析用具およびターゲット分析方法
JP2024050633A (ja) デジタルアッセイのために横からの照射を使用した光学イメージングシステム
WO2021166713A1 (ja) 生体試料分析方法
WO2021166715A1 (ja) 生体試料分析方法
CN105925670B (zh) 膜测定方法
JP2010107503A (ja) 定量分析方法及び検出用カートリッジ
US20230221319A1 (en) A Method, A System, An Article, A Kit And Use Thereof For Biomolecule, Bioorganelle, Bioparticle, Cell And Microorganism Detection
TWI472369B (zh) 分析套組及分析方法
JP2007147539A (ja) 免疫分析法、タンパク質分析装置及び免疫分析用マイクロフローセル
CA3000627A1 (en) Systems and methods for determining probative samples and isolation and quantitation of cells
KR102026521B1 (ko) 비대칭 입자를 이용한 표적 물질 검출 키트 및 방법
US20190227055A1 (en) Compositions and Methods for Photocleavage Based Concentration and/or Purification of Analytes
JPH02118451A (ja) 細胞性検体スクリーニング方法
JP2007309689A (ja) タンパク質結合部位同定技術

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21756197

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021756197

Country of ref document: EP

Effective date: 20220919