WO2021060506A1 - パーフルオロアルキル基含有核酸及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

細胞膜透過性に優れた核酸及びその製造方法の提供。　炭素原子間に１～５個のエーテル結合性の酸素原子を有している、炭素数２～１０個のパーフルオロアルキル基を含有する核酸、前記パーフルオロアルキル基が、直接又は間接的に核酸の５'末端又は３'末端に結合している、又は前記パーフルオロアルキル基が、間接的に、２個のヌクレオチドの間に導入されている、前記記載の核酸、又は、炭素原子間に１～５個のエーテル結合性の酸素原子を有していてもよい、炭素数２～１０個のパーフルオロアルキル基を含有する核酸を有効成分とする、核酸医薬。

Description

パーフルオロアルキル基含有核酸及びその製造方法

　本発明は、パーフルオロアルキル基が導入された核酸及びその製造方法に関する。

　抗体医薬は、低分子医薬では標的にできないタンパク質に対しても、免疫システムを利用して抗体を作成できれば医薬に出来るので、がんや難病に対する治療薬として優れている。また、抗体医薬は標的分子に対する特異性が高く、副作用が少ないという優れた点がある。しかし、抗体医薬は、細胞膜を通過して細胞内に入ることが困難であり、このため、細胞表面の分子以外を標的分子とすることが難しい。

　抗体医薬の次の世代の創薬として、オリゴヌクレオチドを用いる核酸医薬の研究が進められている。核酸医薬は、標的分子に対する特異性が高く、副作用が少ないという優れた点がある。しかし、核酸医薬も、抗体医薬と同様に、細胞膜透過性が低く、細胞内に存在する標的分子に到達させることが困難である。特に、ｓｉＲＮＡは二本鎖であるため、アンチセンスＲＮＡよりも、分子量と負電荷が共に大きくなり、細胞膜透過性はアンチセンスＲＮＡよりも低く、キャリアによるドラッグデリバリーが必要となる。ドラッグデリバリー剤として、脂質ナノ粒子を用いるもの（特許文献１）や、カチオン性ポリマーナノ粒子を用いるもの（特許文献２）が知られている。しかし、細胞膜透過性の効率や毒性懸念の点で改善すべきことが多い。

　一方、ポリフルオロ構造を有する化合物は、生体内で安定かつ毒性が低く、細胞内への取り込みとエンドソームからの脱出に優れていることが知られている（非特許文献１）。この性質を利用して、構成アミノ酸として側鎖のアミノ基をペルフルオロアシル化したリシンを用いたペプチドデンドリマーを遺伝子のデリバリーに用いることができることが報告されている（非特許文献２）。また、オリゴヌクレオチドやペプチド核酸に、細胞膜透過能を有する部分としてポリフルオロ構造を導入する検討も行われている（特許文献３、及び非特許文献３～６）。

国際公開第２０１１／０３６５５７号 国際公開第２０１７／２１２００６号 国際公開第２０１２／１３０９４１号 特開２００６－３２１７９７号公報 国際公開第２０００／０５６６９４号

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　本発明は、細胞膜透過性に優れた核酸及びその製造方法を提供することを目的とする。

　本発明者らは、パーフルオロアルキル基、特にエーテル結合性の酸素原子を有しているパーフルオロアルキル基を導入することにより、核酸の細胞膜透過性が向上することを見出し、本発明を完成させた。

　すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］　炭素原子間に１～５個のエーテル結合性の酸素原子を有している、炭素数２～１０個のパーフルオロアルキル基を含有する、核酸。
［２］　前記パーフルオロアルキル基が、直接又は間接的に、核酸の５’末端又は３’末端に結合している、前記［１］の核酸。
［３］　前記パーフルオロアルキル基が、間接的に、２個のヌクレオチドの間に導入されている、前記［１］の核酸。
［４］　下記一般式（Ａ１））で表される構造を有する、前記［１］～［３］のいずれかの核酸。

ただし、式中の基は下記を意味する。
Ｒ^ＦＥは、炭素原子間に１～５個のエーテル結合性の酸素原子を有している、炭素数２～１０個のパーフルオロアルキル基であり、ｎａは、１～１０の整数であり、黒丸は結合手を示す。
［５］　細胞膜透過性核酸である、前記［１］～［４］のいずれかの核酸。
［６］　下記一般式（Ａ２）で表される化合物を原料とし、ホスホロアミダイト法により、前記［１］～［５］のいずれかのパーフルオロアルキル基を含有する核酸を合成する、パーフルオロアルキル基を含有する核酸の製造方法。

　ただし、式中の基は下記を意味する。
Ｒ^ＦＥは、炭素原子間に１～５個のエーテル結合性の酸素原子を有している、炭素数２～１０個のパーフルオロアルキル基であり、ｎａは、１～１０の整数であり、ＤＭＴｒは４，４’－ジメトキシトリフェニルメチル基であり、ｉ－Ｐｒはイソプロピル基である。
［７］　炭素原子間に１～５個のエーテル結合性の酸素原子を有していてもよい、炭素数２～１０個のパーフルオロアルキル基を含有する核酸を有効成分とする、核酸医薬。
［８］　核酸に、炭素原子間に１～５個のエーテル結合性の酸素原子を有していてもよい、炭素数２～１０個のパーフルオロアルキル基を導入し、細胞膜透過性を向上させる、核酸の細胞膜透過性向上方法。
［９］　前記パーフルオロアルキル基が、炭素原子間に１～５個のエーテル結合性の酸素原子を有する基である、前記［８］の核酸の細胞膜透過性向上方法。
［１０］　前記パーフルオロアルキル基が、炭素原子間にエーテル結合性の酸素原子を有していない基である、前記［８］の核酸の細胞膜透過性向上方法。
［１１］　前記パーフルオロアルキル基を、直接又は間接的に、前記核酸の５’末端又は３’末端に結合させる、前記［８］～［１０］のいずれかの核酸の細胞膜透過性向上方法。

　また、本発明に係る核酸は、パーフルオロアルキル基が導入されているため、細胞膜透過性に優れている。このため、当該核酸は、生理活性物質として、医薬分野での利用が期待される。
　本発明に係る製造方法によれば、パーフルオロアルキル基が導入された核酸を製造できる。

試験例１において、５’末端にＮ［Ｃ_８－ＰＦＣ］修飾をしたフルオレセイン修飾核酸を取り込ませた細胞のフローサイトメトリーの結果を示した図である。 試験例１において、３’末端にＮ［Ｃ_８－ＰＦＣ］修飾をしたフルオレセイン修飾核酸を取り込ませた細胞のフローサイトメトリーの結果を示した図である。 試験例１において、各組合せでアニールさせたフルオレセイン修飾２本鎖核酸を、４時間インキュベートして取り込ませた細胞のフローサイトメトリーの結果を示した図である。 試験例１において、各組合せでアニールさせたフルオレセイン修飾２本鎖核酸を、２４時間インキュベートして取り込ませた細胞のフローサイトメトリーの結果を示した図である。 試験例２において、５’末端にＮ［Ｃ_５－ＰＦＰＥ］修飾をしたフルオレセイン修飾核酸を取り込ませた細胞のフローサイトメトリーの結果を示した図である。 試験例２において、ｃｏｎｔ－ＤＮＡ、ＦＥ５、及びＦＥ１０のフルオレセイン修飾核酸を取り込ませた細胞のフローサイトメトリーの結果を示した図である。 実験例３において、ｃｏｎｔ－ＤＮＡ、ＦＥ（２）１、ＦＥ（２）２及びＦＥ（２）５のフルオレセイン修飾核酸を取り込ませた細胞のフローサイトメトリーの結果を示した図である。

　本発明及び本願明細書において、「核酸」とは、ヌクレオチドがリン酸ジエステル結合した分子を意味する。該ヌクレオチドには、ＤＮＡやＲＮＡのような天然型ヌクレオチド（天然に存在するヌクレオチド）のみならず、天然型ヌクレオチドを改変し、天然型ヌクレオチドとリン酸ジエステル結合可能な人工ヌクレオチドも含む。人工ヌクレオチドには、天然型ヌクレオチドの側鎖等がアミノ基等の官能基により修飾されたもの、リボース骨格の２’位のヒドロキシル基がメトキシ基、フルオロ基、メトキシエチル基等により置換されたもの、ホスホロチオエート型ヌクレオチド（リン酸基の酸素原子が硫黄原子に置換されたもの）、モルフォリノ（Morpholino）型ヌクレオチド（リボース、デオキシリボースがモルフォリン環に置換されたもの）、ＢＮＡ（Bridged nucleic acid）、ＨＮＡ（Hexitol NucleicAcid）、ＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）、ＰＮＡ（Peptide Nucleic Acid）、ＴＮＡ（Threose nucleic acid）、ＧＮＡ（Glycerol nucleic acid）、ＣｅＮＡ（Cyclohexenyl nucleic acid）等が挙げられる。また、「核酸」には、ＤＮＡやＲＮＡのように１種以上の天然型ヌクレオチドのみがリン酸ジエステル結合した分子と、１種以上の天然型ヌクレオチドと１種以上の人工ヌクレオチドがリン酸ジエステル結合した分子と、１種以上の人工ヌクレオチドのみがリン酸ジエステル結合した分子のいずれも含まれる。

　本発明及び本願明細書において、「Ｃ_{ｐ１－ｐ２}」（ｐ１及びｐ２は、ｐ１＜ｐ２を満たす正の整数である）は、炭素数がｐ１～ｐ２の基であることを意味する。

　本発明及び本願明細書において、「Ｃ_１－１０アルキル基」は、炭素数１～１０のアルキル基であり、直鎖であっても分岐鎖であってもよい。「Ｃ_２－１０アルキル基」は、炭素数２～１０のアルキル基であり、直鎖であっても分岐鎖であってもよい。Ｃ_１－１０アルキル基の例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基等が挙げられる。

　本発明及び本願明細書において、「Ｃ_１－６アルキル基」は、炭素数１～６のアルキル基であり、直鎖であっても分岐鎖であってもよい。Ｃ_１－６アルキル基の例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、ヘキシル基等が挙げられる。

　本発明及び本願明細書において、「アルキレン基」は、飽和炭化水素から２個の水素原子を除いた２価の基であり、直鎖であっても分岐鎖であってもよい。アルキレン基の例としては、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基、ヘプタメチレン基、オクタメチレン基、ノナメチレン基、メチルメチレン基、エチルメチレン基、メチルエチレン基、メチルプロピレン基、エチルエチレン基、ジメチルメチレン基、１，２－ジメチルエチレン基、１，１－ジメチルエチレン基、１－エチルプロピレン基、２－エチルプロピレン基、１，２－ジメチルプロピレン基、２，２－ジメチルプロピレン基、１－プロピルプロピレン基、２－プロピルプロピレン基、１－メチル－１－エチルプロピレン基、１－メチル－２－エチル－プロピレン基、１－エチル－２－メチル－プロピレン基、２－メチル－２－エチル－プロピレン基、１－メチルブチレン基、２－メチルブチレン基、３－メチルブチレン基、２－エチルブチレン基、１－メチルペンチレン基、２－エチルペンチレン基、１－メチルヘキシレン基等が挙げられる。

　本発明及び本願明細書において、「Ｃ_１－１０パーフルオロアルキル基」は、炭素数１～１０のアルキル基の全ての水素原子がフッ素原子に置換された基である。Ｃ_１－１０パーフルオロアルキル基の例としては、パーフルオロメチル基、パーフルオロエチル基、パーフルオロプロピル基、パーフルオロイソプロピル基、パーフルオロブチル基、パーフルオロイソブチル基、パーフルオロｓｅｃ－ブチル基、パーフルオロｔｅｒｔ－ブチル基、パーフルオロペンチル基、パーフルオロイソペンチル基、パーフルオロネオペンチル基、パーフルオロｔｅｒｔ－ペンチル基、パーフルオロヘキシル基、パーフルオロヘプチル基、パーフルオロオクチル基、パーフルオロノニル基、パーフルオロデシル基等が挙げられる。

　本発明及び本願明細書において、「パーフルオロアルキレン基」は、アルキレン基の全ての水素原子がフッ素原子に置換された基である。パーフルオロアルキレン基の例としては、前記で挙げられたアルキレン基の全ての水素原子がフッ素原子に置換された基が挙げられる。

　本発明及び本願明細書において、「エーテル結合性の酸素原子」とは、炭素原子間を連結する酸素原子であり、酸素原子同士が直列に連結された酸素原子は含まれない。炭素数Ｎｃ（Ｎｃは２以上の整数）のアルキル基が有し得るエーテル結合性の酸素原子は、最大Ｎｃ－１個である。また、「炭素原子間にエーテル結合性の酸素原子を有している、Ｃ_２－１０アルキル基」とは、Ｃ_２－１０アルキル基の炭素原子間に、少なくとも１個のエーテル結合性の酸素原子を有する基である。以下、「エーテル結合含有アルキル基」ということがある。

　本発明及び本願明細書において、「炭素原子間にエーテル結合性の酸素原子を有している、Ｃ_２－１０パーフルオロアルキル基」は、Ｃ_２－１０アルキル基の炭素原子間に少なくとも１個のエーテル結合性の酸素原子を有するエーテル結合含有Ｃ_２－１０アルキル基の全ての水素原子がフッ素原子に置換されている基である。以下、「炭素原子間にエーテル結合性の酸素原子を有しているパーフルオロアルキル基」は、「エーテル結合含有パーフルオロアルキル基」ということがある。

　また、以降において、「化合物ｎ」は式（ｎ）で表される化合物を意味する。

＜エーテル結合含有パーフルオロアルキル基を含有する核酸＞
　本発明に係る核酸は、炭素原子間に１～５個のエーテル結合性の酸素原子を有している、炭素数２～１０個のパーフルオロアルキル基を含有する、核酸である。該核酸は、パーフルオロアルキル基を含有するため、他の含フッ素化合物と同様に、生理活性物質として、医薬分野での利用が期待される。

　該パーフルオロアルキル基としては、炭素数２～１０個であり、炭素原子間に１～５個のエーテル結合性の酸素原子を有しているパーフルオロアルキル基であれば特に限定されるものではない。本発明に係る核酸が有するパーフルオロアルキル基としては、例えば、下記一般式（Ｆ１）～（Ｆ３）のいずれかで表される基が好ましい。

　一般式（Ｆ１）中、Ｒ^Ｆ１は、炭素数ｑ１のパーフルオロアルキレン基であり、Ｒ^Ｆ２は、炭素数ｑ２のパーフルオロアルキル基である。ｑ１及びｑ２は、両者の和が２以上１０以下となる自然数である。
　一般式（Ｆ２）中、Ｒ^Ｆ３は、炭素数ｑ３のパーフルオロアルキレン基であり、Ｒ^Ｆ４は、炭素数ｑ４のパーフルオロアルキル基である。ｎ１、ｑ３及びｑ４は、２×ｎ１＋ｑ３＋ｑ４が４以上１０以下となる自然数である。
　一般式（Ｆ３）中、Ｒ^Ｆ５は、炭素数ｑ５のパーフルオロアルキレン基であり、Ｒ^Ｆ６は、炭素数ｑ６のパーフルオロアルキル基である。ｎ２、ｑ５及びｑ６は、３×ｎ２＋ｑ５＋ｑ６が５以上１０以下となる自然数である。

　一般式（Ｆ１）中のＲ^Ｆ１、一般式（Ｆ２）中のＲ^Ｆ３、及び一般式（Ｆ３）中のＲ^Ｆ５としては、直鎖状のパーフルオロアルキレン基であってもよく、分岐鎖状のパーフルオロアルキレン基であってもよい。Ｒ^Ｆ１、Ｒ^Ｆ３、及びＲ^Ｆ５としては、Ｃ_１－３パーフルオロアルキレン基が好ましく、メチレン基、エチレン基、メチルメチレン基、エチルメチレン基、ジメチルメチレン基、及びメチルエチレン基の全ての水素原子がフッ素原子に置換された基がより好ましく、メチレン基、メチルメチレン基、エチルメチレン基、及びジメチルメチレン基の全ての水素原子がフッ素原子に置換された基がさらに好ましく、メチレン基及びメチルメチレン基の全ての水素原子がフッ素原子に置換された基がよりさらに好ましい。

　一般式（Ｆ１）中のＲ^Ｆ２、一般式（Ｆ２）中のＲ^Ｆ４、及び一般式（Ｆ３）中のＲ^Ｆ６としては、直鎖状のパーフルオロアルキル基であってもよく、分岐鎖状のパーフルオロアルキル基であってもよい。Ｒ^Ｆ２、Ｒ^Ｆ４、及びＲ^Ｆ６としては、直鎖状又は分岐鎖状のＣ_１－５パーフルオロアルキル基が好ましく、直鎖状のＣ_１－５パーフルオロアルキル基がより好ましく、直鎖状のＣ_２－４パーフルオロアルキル基がさらに好ましい。

　本発明に係る核酸が有するパーフルオロアルキル基としては、一般式（Ｆ１）中のＲ^Ｆ１が、メチレン基又はメチルメチレン基の全ての水素原子がフッ素原子に置換された基であり、Ｒ^Ｆ２が、直鎖状のＣ_１－５パーフルオロアルキル基である化合物；一般式（Ｆ２）中のＲ^Ｆ３が、メチレン基又はメチルメチレン基の全ての水素原子がフッ素原子に置換された基であり、ｎ１が１、２、又は３であり、Ｒ^Ｆ４が、直鎖状のＣ_１－７パーフルオロアルキル基である化合物；一般式（Ｆ３）中のＲ^Ｆ５が、メチレン基又はメチルメチレン基の全ての水素原子がフッ素原子に置換された基であり、ｎ２が１又は２であり、Ｒ^Ｆ６が、直鎖状のＣ_１－６パーフルオロアルキル基である化合物；が好ましく、一般式（Ｆ１）中のＲ^Ｆ１が、メチレン基又はメチルメチレン基の全ての水素原子がフッ素原子に置換された基であり、Ｒ^Ｆ２が、直鎖状のＣ_１－５パーフルオロアルキル基である化合物；一般式（Ｆ２）中のＲ^Ｆ３が、メチレン基又はメチルメチレン基の全ての水素原子がフッ素原子に置換された基であり、ｎ１が１であり、Ｒ^Ｆ４が、直鎖状のＣ_１－６パーフルオロアルキル基である化合物；一般式（Ｆ２）中のＲ^Ｆ３が、メチレン基又はメチルメチレン基の全ての水素原子がフッ素原子に置換された基であり、ｎ１が２であり、Ｒ^Ｆ４が、直鎖状のＣ_１－４パーフルオロアルキル基である化合物；一般式（Ｆ２）中のＲ^Ｆ３が、メチレン基又はメチルメチレン基の全ての水素原子がフッ素原子に置換された基であり、ｎ１が３であり、Ｒ^Ｆ４が、直鎖状のＣ_１－３パーフルオロアルキル基である化合物；一般式（Ｆ３）中のＲ^Ｆ５が、メチレン基又はメチルメチレン基の全ての水素原子がフッ素原子に置換された基であり、ｎ２が１であり、Ｒ^Ｆ６が、直鎖状のＣ_１－６パーフルオロアルキル基である化合物；がより好ましい。

　本発明において、核酸に導入されるエーテル結合含有パーフルオロアルキル基は、例えば、特許文献４又は５にその合成方法と共に記載されているフッ素化合物が備えるエーテル結合含有パーフルオロアルキル基を用いることができる。

　本発明に係る核酸において、エーテル結合含有パーフルオロアルキル基が導入される位置は特に限定されるものではなく、該核酸の機能を損なわない範囲でいずれの部位に導入してもよい。例えば、エーテル結合含有パーフルオロアルキル基は、直接又は間接的に、核酸の５’末端又は３’末端に結合していてもよく、２個のヌクレオチドの間に導入されていてもよい。エーテル結合含有パーフルオロアルキル基が連結基を介して間接的に核酸に導入される場合、該連結基としては、本発明の効果を損なわないものであれば特に限定されるものではなく、任意の２価又は３価の有機基を用いることができる。該連結基としては、例えば、アルキレン基、アルケニレン基、カルボニル基、アミノ基、エーテル結合、チオエーテル結合、エステル結合、アミド結合、ポリエチレングリコール基（ＰＥＧ：－（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）ｎ－）、シロキサン結合、シリルエーテル結合、糖、ペプチド、が挙げられる。また、ピロール環、ピラゾール環、イミダゾール環、トリアゾール環、ピリジン環、ピリミジン環、ピラジン環、オキサゾール環、チアゾール環、フラン環、チオフェン環、ベンゼン環等の環から２又は３個の水素原子を除いた基も、連結基として使用できる。さらに、これらを適宜組み合わせて用いることもできる。

　本発明に係る核酸において、エーテル結合含有パーフルオロアルキル基が導入される核酸は、特に限定されるものではなく、含有しているヌクレオチドが全て天然型ヌクレオチドである核酸であってもよく、一部又は全部が人工ヌクレオチドである核酸であってもよい。また、１本鎖核酸であってもよく、２本鎖核酸であってもよい。該核酸としては、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、核酸アプタマー、デコイ核酸、ＣｐＧ（シトシン－リン酸－グアニン）オリゴヌクレオチド等が挙げられる。また、細胞内で標的の遺伝子やｓｉＲＮＡを発現させる発現ベクターであってもよい。

　本発明に係る核酸において、エーテル結合含有パーフルオロアルキル基は、該基を導入する対象の核酸に対し、各種のカップリング反応により導入できる。例えば、エーテル結合含有パーフルオロアルキル基を含むホスホロアミダイトを原料としてホスホロアミダイト法を行うことにより、エーテル結合含有パーフルオロアルキル基を容易に核酸に導入することができる。汎用されている核酸自動合成装置はホスホロアミダイト法を利用している。このため、エーテル結合含有パーフルオロアルキル基を含むホスホロアミダイトを原料とすることで、様々な塩基配列の核酸に対し、所望の位置にエーテル結合含有パーフルオロアルキル基が導入された核酸を、自動合成装置で容易に合成することができる。

　エーテル結合含有パーフルオロアルキル基を含むホスホロアミダイトとしては、例えば、一般的に核酸合成に使用されるホスホロアミダイトのうち、ヌクレオシド部分を、エーテル結合含有パーフルオロアルキル基を含む有機基に置換した化合物が挙げられる。該化合物としては、例えば、下記一般式（Ａ２）で表される化合物が挙げられる。

　一般式（Ａ２）中、Ｒ^ＦＥは、前記のエーテル結合含有パーフルオロアルキル基である。また、ｎａは、１～１０の整数である。ｉ－Ｐｒはイソプロピル基を表し、ＤＭＴｒは４，４’－ジメトキシトリフェニルメチル基を表す。

　化合物（Ａ２）を用いてホスホロアミダイト法により合成された核酸は、下記一般式（Ａ１）の構造を備える。一般式（Ａ１）中、Ｒ^ＦＥは、前記のエーテル結合含有パーフルオロアルキル基である。また、ｎａは、１～１０の整数である。黒丸は結合手を示す。

　合成された目的の核酸は、例えば、イオンクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー等、種々の方法により単離、精製を行うことができる。

　本発明に係る核酸は、エーテル結合含有パーフルオロアルキル基が導入される核酸の機能を損なわず、かつ本発明の効果を損なわない限りにおいて、各種の修飾がなされていてもよい。該修飾としては、糖鎖修飾、脂質修飾、ペプチド修飾等が挙げられる。

　パーフルオロ構造は、細胞膜への親和性が高い。このため、エーテル結合含有パーフルオロアルキル基が導入されている本発明に係る核酸は、該基が導入されていない核酸よりも、細胞膜透過性に優れている。この性質を利用して、本発明に係る核酸は、特に、核酸医薬の有効成分として好ましい。例えば、生体内の標的細胞内に取り込まれることにより何等かの生理活性を示す機能性核酸に、その機能を損なわないようにエーテル結合含有パーフルオロアルキル基を導入することにより、該機能性核酸の標的細胞への取り込み効率を改善できる。

＜核酸の細胞膜透過性向上方法＞
　核酸に、炭素原子間に１～５個のエーテル結合性の酸素原子を有していてもよい、Ｃ_２－１０パーフルオロアルキル基を導入することにより、該核酸の細胞膜透過性を向上させることができる。「炭素原子間に１～５個のエーテル結合性の酸素原子を有していてもよい、Ｃ_２－１０パーフルオロアルキル基」は、「炭素原子間に１～５個のエーテル結合性の酸素原子を有している、Ｃ_２－１０パーフルオロアルキル基」と、「エーテル結合性の酸素原子を有していない、Ｃ_２－１０パーフルオロアルキル基」と、からなる。

　「炭素原子間に１～５個のエーテル結合性の酸素原子を有している、Ｃ_２－１０パーフルオロアルキル基」は、前記のエーテル結合含有パーフルオロアルキル基である。前記のエーテル結合含有パーフルオロアルキル基の核酸への導入は、前記の通り、エーテル結合含有パーフルオロアルキル基を含むホスホロアミダイトを用いて、ホスホロアミダイト法により行うことができる。

　エーテル結合性の酸素原子を有していない、Ｃ_２－１０パーフルオロアルキル基の核酸への導入も、同様にして、エーテル結合性の酸素原子を有していない、Ｃ_２－１０パーフルオロアルキル基を含むホスホロアミダイトを用いて、ホスホロアミダイト法により行うことができる。その他、非特許文献３～６に記載の方法によっても、核酸にエーテル結合性の酸素原子を有していない、Ｃ_２－１０パーフルオロアルキル基を導入できる。

　核酸にパーフルオロ構造が導入されていればよく、炭素原子間に１～５個のエーテル結合性の酸素原子を有していてもよい、Ｃ_２－１０パーフルオロアルキル基は、核酸のいずれの位置に導入されていてもよい。Ｃ_２－１０パーフルオロアルキル基を導入する核酸の位置は、該核酸の機能を損なわない限度において任意に決定できる。

　エーテル結合性の酸素原子を有していない、Ｃ_２－１０パーフルオロアルキル基が導入されることによって細胞膜透過性が向上した核酸も、エーテル結合含有パーフルオロアルキル基が導入された核酸と同様に、核酸医薬の有効成分として好ましい。

　薬理活性はあるものの細胞内に到達できない核酸に対して、本発明に係る核酸の細胞膜透過性向上方法を行うことにより、該核酸の標的細胞への取り込み効率を改善できる。すなわち、本発明に係る核酸の細胞膜透過性向上方法により、核酸医薬を細胞内に届けるドラッグデリバリーシステムを簡便に構築できる。

　以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。

　実施例、比較例の分析に使用したＮＭＲ装置は日本電子製ＪＮＭ－ＥＣＺ４００Ｓ（４００ＭＨｚ）であり、^１Ｈ ＮＭＲではテトラメチルシランを０ＰＰＭ、^１９Ｆ ＮＭＲではＣ_６Ｆ_６を－１６２ＰＰＭの基準値とした。

＜Ｔｍ測定＞
　以降の実験において、核酸の溶融温度（Ｔｍ）は、ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計（ＵＶ－２５５０、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を使用して、温度の関数として２６０ｎｍの吸光度の変化を測定することにより決定した。融解したサンプルは１００℃で変性し、ゆっくりと室温まで下げてアニールした。 ２６０ｎｍの吸光度を測定し、２０℃から９０℃まで０．５℃刻みで検出した。２本鎖ＤＮＡの濃度は、バッファー（１０ｍＭ　リン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、１００ｍＭ　ＮａＣｌ）で４μＭであった。Ｔｍは、正中法で算出した。

＜細胞培養＞
　以降の実験において、細胞培養は以下の通りにして行った。
　ＨｅＬａ細胞は、１０％ＦＢＳと０．５％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で、３７℃の加湿雰囲気（５容量％　ＣＯ_２）で培養した。画像解析のための細胞は、３５ｍｍのガラス底ディッシュ（ＩＷＡＫＩ社製）で培養した。

＜共焦点顕微鏡観察＞
　以降の実験において、細胞の共焦点顕微鏡観察は以下の通りにして行った。
　フルオレセインを結合させたＮ［ＰＦＣ］又はＮ［ＰＦＰＥ］（５００μＭ、５μＬ）を、ＨｅＬａ細胞に添加し、３７℃で３時間インキュベートした。次いで、当該細胞に、核染色剤であるｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（２μｇ／ｍＬ、０．５ｍＬ）を加え、さらに１時間インキュベートした。インキュベート後の各ディッシュから、溶液を除去し、ＰＢＳ（－）で洗浄した後、ＤＭＥＭ（１ｍＬ）を添加した。次いで、各ディッシュを共焦点レーザー走査顕微鏡に設置し、４８８ｎｍの励起波長と５０５ｎｍ超の発光フィルターにより蛍光画像を取得した。

＜フローサイトメトリー＞
　以降の実験において、フローサイトメトリーは以下の通りにして行った。
　ＨｅＬａ細胞を１２ウェルプレートに１０^５個／ウェルとなるように播種し、培養した。播種の翌日に、各ウェルの培地を、フルオレセインを結合させたＮ［ＰＦＣ］又はＮ［ＰＦＰＥ］で修飾したＤＮＡ（２．５μＭ）を含有するＤＭＥＭ培地（１ｍＬ）に交換し、４時間又は２４時間インキュベートした。 その後、ウェル中の細胞層をＰＢＳで２回洗浄した後、０．０５％（ｗ／ｖ）トリプシン（２００μＬ）で３７℃、５分間処理して細胞を剥離した。回収した細胞は、ＤＭＥＭ（６００μＬ）に懸濁した。この細胞懸濁液を遠心分離処理（４００Ｇ、３分間）で分離し、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ（５００μＬ）を加えた。 この細胞懸濁液の蛍光細胞の割合と平均蛍光強度を、フローサイトメーター（「ｇｕａｖａ　ｅａｓｙＣｙｔｅ８」、Ｌｕｍｉｎｅｘ社製）で分析した。
　２本鎖ＤＮＡの場合、サンプルを１００℃で変性させ、ゆっくりと室温まで低下させてアニールした。

［実施例１］
　２個のエーテル結合性の酸素原子を有している、炭素数５個のパーフルオロアルキル基（ＣＦ_３ＣＦ_２Ｏ（ＣＦ_２）_２Ｏ（ＣＦ_２）－：以下、Ｃ_５－ＰＦＰＥ基）を含むホスホロアミダイトを合成し、これを用いてアミダイト法によりＣ_５－ＰＦＰＥ基を含有する核酸を製造した。

（１）Ｃ_５－ＰＦＰＥカルボン酸の合成
　Ｃ_５－ＰＦＰＥ基を含むカルボン酸塩は、特許文献４に記載の方法にて合成した。
　ハステロイＣ製の２Ｌ容のオートクレーブにＣＨ_３ＣＨ_２Ｏ（ＣＨ_２）_２Ｏ（ＣＨ_２）_２ＯＨ（３００ｇ）を入れ、反応器を冷却し、密閉撹拌下、内温が３０℃以下に保たれるようにゆっくりとＣＦ_３ＣＦ_２ＣＦ_２ＯＣＦ（ＣＦ_３）ＣＦ_２ＯＣＦ（ＣＦ_３）ＣＯＦ（１３３９ｇ）を導入した。全量を導入後、さらに３０℃で３時間の撹拌を行った後、反応で生じたＨＦを窒素ガスのバブリングによって系外に追い出して生成物を得た。生成物をＧＣ（ガスクロマトグラフ）分析した結果、ＣＨ_３ＣＨ_２Ｏ（ＣＨ_２）_２Ｏ（ＣＨ_２）_２ＯＣＯＣＦ（ＣＦ_３）ＯＣＦ_２ＣＦ（ＣＦ_３）ＯＣＦ_２ＣＦ_２ＣＦ_３が９９．６％生成しており、未反応のＣＨ_３ＣＨ_２Ｏ（ＣＨ_２）_２Ｏ（ＣＨ_２）_２ＯＨは検出されなかった。この生成物は精製することなく、次の工程に使用した。

　５００ｍＬ容のニッケル製オートクレーブに、Ｒ－１１３（３１２ｇ）を加えた後に撹拌して２５℃に保った。オートクレーブガス出口には、２０℃に保持した冷却器、ＮａＦペレット充填層、及び－１０℃に保持した冷却器を直列に設置した。また、－１０℃に保持した冷却器からは、凝集した液をオートクレーブに戻すための液体返送ラインを設置した。オートクレーブに窒素ガスを室温で１時間吹き込んだ後、窒素ガスで２０％に希釈したフッ素ガス（以下、２０％希釈フッ素ガスと記す。）を室温で流速１７．０４Ｌ／ｈで１時間吹き込んだ。次に、２０％希釈フッ素ガスを同じ流速で吹き込みながら、前記で得た生成物（１０ｇ）をＲ－１１３（１５０ｇ）に溶解した溶液を、４．１時間かけて注入した。

　続いて、２０％希釈フッ素ガスを同じ流速で吹き込みながらオートクレーブ内圧力を０．１５ＭＰａＧまで昇圧した。ベンゼン濃度が０．０１ｇ／ｍＬであるＲ－１１３溶液を２５℃から４０℃にまで昇温しながら９ｍＬ注入し、オートクレーブのベンゼン溶液注入口を閉め、０．３時間撹拌を続けた。次に、反応器内圧力を０．１５ＭＰａＧに、反応器内温度を４０℃に保ちながら、前記ベンゼン溶液を６ｍＬ注入し、オートクレーブのベンゼン溶液注入口を閉め、０．３時間撹拌を続けた。さらに同様の操作を１回繰り返した。ベンゼンの注入総量は０．２２ｇ、Ｒ－１１３の注入総量は２１ｍＬであった。その後、さらに２０％希釈フッ素ガスを同じ流速で吹き込みながら、１時間撹拌を続けた。次に、反応器内圧力を常圧にして、窒素ガスを１時間吹き込んだ。生成物を^１９Ｆ　ＮＭＲで分析した結果、目的の化合物（ＣＦ_３ＣＦ_２Ｏ（ＣＦ_２）_２Ｏ（ＣＦ_２）_２ＯＣＯＣＦ（ＣＦ_３）ＯＣＦ_２ＣＦ（ＣＦ_３）ＯＣＦ_２ＣＦ_２ＣＦ_３）が収率９９％で含まれていた。また、^１Ｈ　ＮＭＲ及びＧＣ－ＭＳで分析した結果、Ｃ－Ｈ結合を有する化合物は、確認されなかった。

　１０℃の還流器を備えた蒸留塔の釜（２Ｌ容）に、前記で得たＣＦ_３ＣＦ_２Ｏ（ＣＦ_２）_２Ｏ（ＣＦ_２）_２ＯＣＯＣＦ（ＣＦ_３）ＯＣＦ_２ＣＦ（ＣＦ_３）ＯＣＦ_２ＣＦ_２ＣＦ_３（４２７３ｇ）を仕込み、フッ化カリウム（１２．６ｇ）を加えて加熱撹拌を行い（熱媒温度： １００～１３０℃）、反応蒸留形式で留分を回収した。主留として純度９９％以上の留分１２７３ｇを回収した。沸点６６．５℃、収率８４．５％であった。留分を^１ＨＮＭＲ及びＧＣ－ＭＳで分析した結果、Ｃ－Ｈ結合を有する化合物は、確認されなかった。

　２００ｍＬ容ハステロイ製オートクレーブに得られたＣＦ_３ＣＦ_２Ｏ（ＣＦ_２）_２ＯＣＦ_２ＣＯＦ（１０７ｇ）を仕込み、氷冷下、激しく撹拌しながら水（６ｇ）をゆっくり滴下し加水分解を行った。滴下後、徐々に室温まで昇温しさらに５時間撹拌を続けた。その後、反応で生じたＨＦを窒素ガスのバブリングによって系外に追い出し、引き続き単蒸留を行い、沸点７４℃／（３０×１３３．３２２Ｐａ）の留分８４ｇを得た。純度９９．４％、収率７９％であった。

（２）Ｃ_５－ＰＦＰＥアルコールの合成
　前記（１）で得られたＣ_５－ＰＦＰＥカルボン酸を還元して、Ｃ_５－ＰＦＰＥ基を含むアルコールを得た。
　Ｃ_５－ＰＦＰＥ基を含むカルボン酸塩（１７．３ｇ、５０ｍｍｏｌ）及び無水テトラヒドロフラン（５０ｍＬ）を、マグネチックスターラー、温度計、及び冷却器を備えた三つ口フラスコに添加した。次いで、当該フラスコに、水素化ホウ素ナトリウム（２．８４ｇ、７５ｍｍｏｌ）を１５℃未満の氷浴中で添加し、その後さらに三フッ化ホウ素エーテル錯体（９．４２ｍＬ、７５ｍｍｏｌ）を滴下した。該反応混合物を、２４時間還流した後、５℃にまで冷却し、ガスが発生しなくなるまで蒸留水を加えた。次いで、該反応混合物をジクロロメタンで３回抽出した。全ての有機相を合わせ、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過した後、溶媒を留去して、目的化合物であるアルコールを得た（収率６７％）。

（３）トリフルオロメタンスルホナートの合成
　Ｃ_５－ＰＦＰＥ基を含むトリフルオロメタンスルホナートを合成した。

　フッ素化アルコール（４．９８ｇ、１５．０ｍｍｏｌ）を乾燥ジクロロメタン（７５ｍＬ）に溶解し、続いて乾燥トリエチルアミン（１５ｍＬ）を添加し、－７８℃に冷却した。この反応液に、トリフルオロメタンスルホン酸無水物（６．３４ｇ、２２．５ｍｍｏｌ）を３０分間かけて滴下したところ、反応混合物は暗色になった。該反応混合物を、０℃で１時間撹拌した後、室温まで加温し、さらに３時間撹拌した。その後、飽和ＮａＨＣＯ_３を添加して反応を停止させた。該反応生成物にＮａＨＣＯ_３（５０ｍＬ）を添加した後、ジクロロメタン（５０ｍＬ）で３回抽出した。全ての有機相を合わせ、ブラインで洗浄した後、ＭｇＳＯ_４で乾燥し、溶媒を真空下で除去して、目的の化合物を濃い黒色の油状物質として得た（収率２７．３％）。得られた粗生成物を、^１Ｈ　ＮＭＲで分析し、さらに精製することなく次のステップで使用した。

^１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）　δ４．７０（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ）.^１９Ｆ　ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）　δ－７４．１（ｓ，３Ｆ），δ－７７．６（ｓ，２Ｆ），δ－８６．６（ｓ，３Ｆ），δ－８８．２－－８８．７（ｍ，６Ｆ）．

（４）ジエタノールアミン化
　前記（３）で得られたトリフルオロメタンスルホナートをジエタノールアミン化した。

　前記（３）で得られたトリフルオロメタンスルホナート（１．６ｇ、３．５ｍｍｏｌ）とジエタノールアミン（０．７４ｇ、７．０ミリモル）の溶液を、乾燥ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド）（５ｍＬ）に加えた。得られた反応混合物を、１００℃の油浴に入れ、２１時間撹拌した。次いで、当該反応物を冷却し、水（２０ｍＬ）に溶解し、生成物をジクロロメタン（２０ｍＬ）で３回抽出した。全ての有機相を合わせ、ブラインで洗浄した後、ＭｇＳＯ_４で乾燥し、溶媒を真空下で除去して、目的の化合物を得た。得られた粗生成物を、^１Ｈ　ＮＭＲで分析し、さらに精製することなく次のステップで使用した。

^１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）　δ３．５８（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，４Ｈ），δ３．２４（ｔ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，２Ｈ），δ２．８６（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，４Ｈ）.

（５）ＤＭＴｒ保護
　前記（４）で得られたジエタノールアミンの２個の水酸基のうちの１個を、ＤＭＴｒ（４，４’－ジメトキシトリフェニルメチル基）で保護した。

　前記（４）で得られたジエタノールアミン（０．９２ｇ、２．２ｍｍｏｌ）を、乾燥ジクロロメタン（７．５ｍＬ）及びトリエチルアミン（１ｍＬ）に溶解させた。この反応混合物に、ＤＭＴｒＣｌ（０．７５ｇ、２．２ｍｍｏｌ）を少しずつ加えた後、室温で２時間撹拌した。次いで、当該反応物から溶媒を真空下で除去して、暗褐色の油状物質を得た。この油状物質を、トリエチルアミンで前処理したシリカカラムとＥｔＯＡｃ／ヘキサン（容量比１：４）混合物を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的の化合物を黄色の油状物質として得た（収量２３８ｍｇ、収率１５．２％）。

 ^１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）　δ７．４０（ｔ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ）， δ７．３３－７．２０（ｍ，７Ｈ），δ ６．８２（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，４Ｈ），δ３．７８（ｓ，６Ｈ），δ３．５０（ｄｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，５．０Ｈｚ，２Ｈ），δ３．２６－３．２０（ｍ，４Ｈ），δ２．９３（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ），δ ２．８１（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，２Ｈ），δ２．４４（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ）. ^１９Ｆ　ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）　δ－７３．６（ｓ，２Ｆ），δ－８６．５（ｓ，３Ｆ），δ－８８．３－－８８．４（ｍ，４Ｆ），δ－８８．６－－８８．７（ｍ，２Ｆ）.

（６）アミダイト化
　前記（５）で得られたジエタノールアミンのうち、ＤＭＴｒ基で保護されていない水酸基をアミダイト化した。

　３－（（ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスファニル）オキシ）プロパンニトリルを乾燥アセトニトリルに溶解した。この反応液に、５－（エチルチオテトラゾール）（ＥＴＴ）（６５ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）をアルゴン下で添加し、次いで、前記（５）で得られたＤＭＴｒ保護ジエタノールアミン（０．２４ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１ｍＬ）及びアセトニトリル（１ｍＬ）に溶解させた溶液を少しずつ加えた。次いで、この反応混合物を、アルゴン下で室温で４時間撹拌した後、溶媒を減圧下で蒸発させた。得られた粗生成物を、アルゴン下で、脱気したヘキサン／酢酸エチル（容量比１：４））を移動相としたカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的の化合物（Ｎ［Ｃ_５－ＰＦＰＥ］アミダイト）を無色の油状物質として単離した（収量１３０ｍｇ、収率４３％）。

^１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ａｃｅｔｏｎｅ－ｄ_６）　δ７．４５（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），δ７．３３－７．１７（ｍ，７Ｈ），δ６．８５（ｔｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，９．１Ｈｚ，４Ｈ），δ３．８４－３．５６（ｍ，６Ｈ），δ３．７６（ｓ，６Ｈ），δ３．５０（ｔ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ，２Ｈ），δ３．２０（ｔ，６．０Ｈｚ，２Ｈ），δ３．００（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ），δ２．９５（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，２Ｈ），δ２．６７（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），δ１．１６（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，６Ｈ），δ１．１２（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，６Ｈ）.^１９Ｆ　ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，Ａｃｅｔｏｎｅ－ｄ_６） 　δ－７５．５（ｍ，２Ｆ），δ－８７．４（ｓ，３Ｆ），δ－８８．９（ｍ，２Ｆ），δ－８９．１（ｍ，２Ｆ），δ－８９．３（ｍ，２Ｆ）.^３１Ｐ　ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，Ａｃｅｔｏｎｅ－ｄ_６）　δ－１４８．０（ｍ）.

（７）ＤＮＡ合成
　ＤＮＡ合成は、市販の試薬、各種ホスホロアミダイト（アセトニトリル溶液、０．１Ｍ）及びアクティベーターとして５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（アセトニトリル溶液、０．２５Ｍ）を用いて、ＮＴＳ Ｈ－８ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（日本テクノサービス社製）により行った。

　配列番号１（５’－ＴＴＴＴＴＣＡＧＴＴＧＡＣＣＡＴＡＴＡ－３’）からなるオリゴヌクレオチドの５’末端にＮ［Ｃ_５－ＰＦＰＥ］基を結合させた５’－Ｎ［Ｃ_５－ＰＦＰＥ］修飾ＤＮＡの合成は、以下の通りにして行った。まず、１０００ÅのＣＰＧ固体支持カラム（１μｍｏｌｅスケール）でのＤＮＡ合成（トリチルオフ）を行った。次いで、窒素雰囲気下で、シリンジを使用して、前記（６）で合成したＮ［Ｃ_５－ＰＦＰＥ］アミダイト（０．１Ｍのアセトニトリル溶液、３００μＬ）とアクティベーター溶液（３００μＬ）を、ＣＰＧの存在下で混合した。混合して５分後に、溶液をカラムから除去し、ＤＮＡシンセサイザーで鎖のキャッピング、酸化、及びブロック解除を行った（収率１１．０％）。

５’－Ｎ［Ｃ_５－ＰＦＰＥ］修飾ＤＮＡ
配列：５’－（Ｎ［Ｃ_５－ＰＦＰＥ］）ＴＴＴＴＴＣＡＧＴＴＧＡＣＣＡＴＡＴＡ－３’ＬＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ）［Ｍ－Ｈ］^－：６２４５．０（calcd）、６２４４．２（found）

　配列番号１の相補的な塩基配列である配列番号２（５’－ＴＡＴＡＴＧＧＴＣＡＡＣＴＧＡＡＡＡＡ－３’）からなるオリゴヌクレオチドの３’末端にＮ［Ｃ_５－ＰＦＰＥ］基を結合させた３’－Ｎ［Ｃ_５－ＰＦＰＥ］修飾ＤＮＡの合成は、以下の通りにして行った。まず、窒素雰囲気下で、シリンジを使用して、前記（４）で合成したＮ［Ｃ_５－ＰＦＰＥ］アミダイト（０．１Ｍのアセトニトリル溶液、３００μＬ）とアクティベーター溶液（３００μＬ）を、１０００ÅのＧｌｅｎ　ＵｎｙＳｕｐｐｏｒｔ（登録商標）（１μｍｏｌｅスケール）の存在下で混合した。混合して５分後に、溶液をカラムから除去し、ＤＮＡシンセサイザーによって、鎖のキャッピング、酸化、及びブロック解除を行った。次に、ＤＮＡシンセサイザーを用いた通常のホスホロアミダイト法により、ＤＮＡオリゴマーを合成した（収率７．９％）。

３’－Ｎ［Ｃ_５－ＰＦＰＥ］修飾ＤＮＡ
配列：５’－ＴＡＴＡＴＧＧＴＣＡＡＣＴＧＡＡＡＡＡ（Ｎ［Ｃ_５－ＰＦＰＥ］）－３’ＬＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ）［Ｍ－Ｈ］^－：６３２１．１（calcd）、６３２１．３（found）

　ＤＮＡシンセサイザーにより合成した核酸の脱保護は、以下の通りにして行った。まず、ＣＰＧ固体に支持されたＤＮＡ（トリチルオフ）を、水酸化アンモニウム水溶液（２８％）で、５０℃で１２時間処理した。次いで、この粗生成物溶液を、固体支持体から分離し、減圧下、３０℃で濃縮した。次に、得られた濃縮物を、０．４５μｍ遠心フィルターによる濾過を行った後、ＨＰＬＣ精製した。得られた溶液を、２６０ｎｍの吸光度で定量した。

　ＨＰＬＣ精製は、以下の条件で行った。
溶媒（０．４５μｍ遠心フィルター濾過済）：１００ｍＭ　酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）バッファー（ｐＨ７．０）及びＨＰＬＣグレードのアセトニトリル、溶出勾配：３－９５％アセトニトリル（４０分間）、カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ充填カラム「５Ｃ１８－ＭＳ－ＩＩ」（４．６ＩＤ×１５０ｎｍ、ナカライテスク社製）、供試粗ＤＮＡ：２０～５０μＬの超純水に溶解させた溶液を、インジェクトした、検出：ダイオードアレイ検出器で２６０ｎｍの吸光度を測定した。

　合成した核酸のＴｍ値を測定した。Ｔｍ値の測定には、Ｎ［Ｃ_５－ＰＦＰＥ］修飾前のＤＮＡと対応する塩基配列のＲＮＡを用いた。測定に使用した核酸を表１に示し、Ｔｍ値の測定結果を表２に示す。

　Ｎ［Ｃ_５－ＰＦＰＥ］修飾ＤＮＡは、修飾前のＤＮＡとＴｍ値はほぼ同程度であった。ＲＮＡとアニールさせた場合には、若干Ｔｍ値は上昇した。

［実施例２］
　エーテル結合性の酸素原子を有していない炭素数８個のパーフルオロアルキル基（－Ｃ_８Ｆ_１７：以下、Ｃ_８－ＰＦＣ基）を含むホスホロアミダイトを合成し、これを用いてアミダイト法によりＣ_８－ＰＦＣ基を含有する核酸を製造した。

　下記式で表される、Ｃ_８－ＰＦＣ基を含むホスホロアミダイトは、非特許文献５に記載の方法により合成した。

　得られたＣ_８－ＰＦＣ基を含むホスホロアミダイトを用いた以外は、実施例１と同様にして、配列番号１からなるオリゴヌクレオチドの５’末端にＮ［Ｃ_８－ＰＦＣ］基を結合させた５’－Ｎ［Ｃ_８－ＰＦＣ］修飾ＤＮＡと、配列番号２からなるオリゴヌクレオチドの３’末端にＮ［Ｃ_８－ＰＦＣ］基を結合させた３’－Ｎ［Ｃ_８－ＰＦＣ］修飾ＤＮＡと、を合成した。

　合成した核酸のＴｍ値を測定した。Ｔｍ値の測定には、実施例１と同様に、Ｎ［Ｃ_８－ＰＦＣ］修飾前のＤＮＡと対応する塩基配列のＲＮＡを用いた。測定に使用した核酸を表３に示し、Ｔｍ値の測定結果を表４に示す。

　Ｎ［Ｃ_８－ＰＦＣ］修飾ＤＮＡ同士でアニールさせた場合には、導入するＮ［Ｃ_８－ＰＦＣ］の数が多くなるほど、Ｔｍ値は高くなる傾向が観察された。Ｎ［Ｃ_８－ＰＦＣ］修飾ＤＮＡをＤＮＡ又はＲＮＡとアニールさせた場合には、導入するＮ［Ｃ_８－ＰＦＣ］の数が１個よりも２個のほうが、Ｔｍ値は高くなる傾向が観察されたが、Ｎ［Ｃ_８－ＰＦＣ］を５個導入した場合には、修飾前ＤＮＡや修飾前ＲＮＡよりもＴｍ値は低下した。

［試験例１］
　実施例２で合成したＮ［Ｃ_８－ＰＦＣ］修飾ＤＮＡの３’端にフルオレセインを結合させた核酸を１本鎖のまま又は２本鎖として、ＨｅＬａ細胞の培養培地に添加してインキュベートし、フローサイトメトリーにより細胞内への取り込み効率を調べた。

　図１Ａに、ｃｏｎｔ－ＤＮＡ、Ｆ１、Ｆ２、及びＦ５のフルオレセイン修飾核酸を取り込ませた細胞のフローサイトメトリーの結果を示し、図１Ｂに、ｃｏｎｔ－ｒＤＮＡ、ｒＦ１、ｒＦ２、及びｒＦ５のフルオレセイン修飾核酸を取り込ませた細胞のフローサイトメトリーの結果を示す。３’末端にＮ［Ｃ_８－ＰＦＣ］修飾をした１本鎖核酸では、Ｎ［Ｃ_８－ＰＦＣ］修飾した核酸はいずれも未修飾の核酸（ｃｏｎｔ－ｒＤＮＡ）よりも細胞内への取り込み量が多かった（図１Ｂ）。５’末端にＮ［Ｃ_８－ＰＦＣ］修飾をした１本鎖核酸では、Ｎ［Ｃ_８－ＰＦＣ］を１個導入したＦ１は、ｃｏｎｔ－ＤＮＡのフルオレセイン修飾核酸と差がなかったものの、Ｎ［Ｃ_８－ＰＦＣ］を２個又は５個導入したＦ２及びＦ５のフルオレセイン修飾核酸は、ｃｏｎｔ－ＤＮＡのフルオレセイン修飾核酸よりも細胞内への取り込み量が多かった（図１Ａ）。

　図２に、各組合せでアニールさせたフルオレセイン修飾２本鎖核酸を取り込ませた細胞のフローサイトメトリーの結果を示す。図２Ａは、４時間インキュベートした細胞の結果であり、図２Ｂは、２４時間インキュベートした細胞の結果である。Ｆ２とｒＦ２からなる２本鎖核酸が最も細胞内への取り込み量が多く、ｃｏｎｔ－ＤＮＡとｒＦ２からなる２本鎖核酸は、ｃｏｎｔ－ＤＮＡとｃｏｎｔ－ｒＤＮＡからなる２本鎖核酸よりも細胞内への取り込み量が多かった。

　これらの結果から、核酸をＮ［Ｃ_８－ＰＦＣ］で修飾することにより、細胞内への取り込み量が多くなり、取り込み効率が向上することがわかった。この細胞内への取り込み効率の向上は、Ｎ［Ｃ_８－ＰＦＣ］修飾により核酸の細胞膜透過性が向上したためである。

［試験例２］
　実施例１で合成したＮ［Ｃ_５－ＰＦＰＥ］修飾ＤＮＡの３’端にフルオレセインを結合させた核酸を１本鎖のまま、ＨｅＬａ細胞の培養培地に添加してインキュベートし、フローサイトメトリーにより細胞内への取り込み効率を調べた。

　図３に、ｃｏｎｔ－ＤＮＡ、ＦＥ１、及びＦＥ２のフルオレセイン修飾核酸を取り込ませた細胞のフローサイトメトリーの結果を示す。５’末端にＮ［Ｃ_５－ＰＦＰＥ］修飾をした１本鎖核酸では、いずれも未修飾の核酸（ｃｏｎｔ－ｒＤＮＡ）よりも細胞内への取り込み量が多かった。

　前記と同様に、配列番号１からなるオリゴヌクレオチドの５’末端にＮ［Ｃ_５－ＰＦＰＥ］基を結合させた５’－Ｎ［Ｃ_５－ＰＦＰＥ］修飾ＤＮＡを合成した。合成した核酸を表５に示す。

　図４に、ｃｏｎｔ－ＤＮＡ、ＦＥ５、及びＦＥ１０のフルオレセイン修飾核酸を取り込ませた細胞のフローサイトメトリーの結果を示す。５’末端にＮ［Ｃ_５－ＰＦＰＥ］修飾をした１本鎖核酸では、いずれも未修飾の核酸（ｃｏｎｔ－ｒＤＮＡ）よりも細胞内への取り込み量が多かった。

［実施例３］
　３個のエーテル結合性の酸素原子を有している、炭素数７個のパーフルオロアルキル基（ＣＦ_３ＣＦ_２Ｏ（ＣＦ_２）_２Ｏ（ＣＦ_２）_２Ｏ（ＣＦ_２）－：以下、Ｃ_７－ＰＦＰＥ基）を含むホスホロアミダイトを合成し、これを用いてアミダイト法によりＣ_７－ＰＦＰＥ基を含有する核酸を製造した。

（１）Ｃ_７－ＰＦＰＥカルボン酸の合成
　ＣＨ_３ＣＨ_２（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_３ＯＨとＦ（ＣＦ_２）_３ＯＣＦ（ＣＦ_３）ＣＦ_２ＯＣＦ（ＣＦ_３）ＣＯＦとを出発物質として用い、国際公開公報ＷＯ２０００／０５６６９４に記載の液相フッ素化法とＫＦ熱分解法とによって、ＣＦ_３ＣＦ_２（ＯＣＦ_２ＣＦ_２）_２ＯＣＦ_２ＣＯＦを得た。
　得られたＣＦ_３ＣＦ_２（ＯＣＦ_２ＣＦ_２）_２ＯＣＦ_２ＣＯＦを、前記Ｃ_５－ＰＦＰＥカルボン酸の合成と同様にして、ＣＦ_３ＣＦ_２（ＯＣＦ_２ＣＦ_２）_２ＯＣＦ_２ＣＯＯＨ（Ｃ_７－ＰＦＰＥカルボン酸）を得た。
（２）Ｃ_７－ＰＦＰＥアルコールの合成
　前記Ｃ_５－ＰＦＰＥアルコールの合成と同様にして、Ｃ_７－ＰＦＰＥカルボン酸からＣＦ_３ＣＦ_２（ＯＣＦ_２ＣＦ_２）_２ＯＣＦ_２ＣＨ_２ＯＨ（Ｃ_７－ＰＦＰＥアルコール）を得た。
（３）トリフルオロメタンスルホナートの合成
　Ｃ_７－ＰＦＰＥ基を含むトリフルオロメタンスルホナートを合成した。

　前記Ｃ_７－ＰＦＰＥアルコール（１１．２ｇ、２５．０ｍｍｏｌ）を水（５ｍＬ）に溶解し、続いてトリエチルアミン（５ｍＬ）を添加し、０℃に冷却した。この反応液に、トリフルオロメタンスルホン酸塩化物（４．４２ｇ、２６．３ｍｍｏｌ）を３０分間かけて滴下した。該反応混合物を、室温で１．５時間撹拌した。生成物をジクロロメタン（１０ｍＬ）で３回抽出した。全ての有機相を合わせ、ブラインで洗浄した後、ＭｇＳＯ_４で乾燥し、溶媒を真空下で除去して、目的の化合物を油状物質として得た。得られた粗生成物を、^１Ｈ　ＮＭＲで分析し、さらに精製することなく次のステップで使用した。（収率６４％）

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 4.67 (t, J = 8.2 Hz, 2H), ¹⁹F NMR (376 MHz, CDCl₃) δ -74.1 (s, 3F), δ -77.7 (s, 2F), δ -86.6 (s, 3F), δ -88.4 - -88.7 (m, 10F)

（４）ジエタノールアミン化
　前記（３）で得られたＣ_７－ＰＦＰＥ基を含むトリフルオロメタンスルホナートをジエタノールアミン化した。

　前記（３）で得られたＣ_７－ＰＦＰＥ基を含むトリフルオロメタンスルホナート（９．３ｇ、１６ｍｍｏｌ）とジエタノールアミン（３．３６ｇ、３２ｍｍｏｌ）の溶液を、乾燥ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド）（１２ｍＬ）に加えた。得られた反応混合物を、１００℃の油浴に入れ、１５時間撹拌した。次いで、当該反応物を冷却し、水（２０ｍＬ）に溶解し、生成物をジクロロメタン（２０ｍＬ）で３回抽出した。全ての有機相を合わせ、ブラインで洗浄した後、ＭｇＳＯ_４で乾燥し、溶媒を真空下で除去して、目的の化合物を得た。得られた粗生成物を、^１Ｈ　ＮＭＲで分析し、さらに精製することなく次のステップで使用した。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 3.34 (m, 4H), δ 3.09 (dt, J = 2.3, 11.0 Hz, 2H), δ 2.68 (m, 4H),  ¹⁹F NMR (376 MHz, CDCl₃) δ -74.0 (s, 2F), δ -87.4 (s, 3F), δ -89.0 - -89.6 (m, 10F)

（５）ＤＭＴｒ保護
　前記（４）で得られたＣ_７－ＰＦＰＥ基を含むジエタノールアミンの２個の水酸基のうちの１個を、ＤＭＴｒ（４，４’－ジメトキシトリフェニルメチル基）で保護した。

　前記（４）で得られたＣ_７－ＰＦＰＥ基を含むジエタノールアミン（６．５８ｇ、１２．３ｍｍｏｌ）を、乾燥ジクロロメタン（２０ｍＬ）及びトリエチルアミン（６ｍＬ）に溶解させた。この反応混合物に、ＤＭＴｒＣｌ（４．５８ｇ、１３．５ｍｍｏｌ）を少しずつ加えた後、室温で２時間撹拌した。次いで、当該反応物から溶媒を真空下で除去して、暗褐色の油状物質を得た。この油状物質を、トリエチルアミンで前処理したシリカカラムとＥｔＯＡｃ／ヘキサン（容量比１：４）混合物を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的の化合物を黄色の油状物質として得た（収率３７％）。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.41 (d, J = 7.3 Hz, 2H), δ 7.33-7.15 (m, 7H), δ 6.81 (dt, J = 9.1, 3.7 Hz, 4H), δ 3.78 (s, 6H), δ 3.50 (dd, J = 6.0 Hz, 10.8 Hz, 2H), δ 3.24-3.19 (m, 4H), δ 2.91 (t, J = 5.5 Hz, 2H), δ 2.79 (t, J = 5.0 Hz, 2H), δ 2.43 (t, J = 6.0 Hz, 1H) ¹⁹F NMR (376 MHz, CDCl₃) δ -74.4 (m, 2F), δ -86.7 (s, 3F), δ -88.1 - -88.6 (m, 10F)

（６）アミダイト化
　前記（５）で得られたＣ_７－ＰＦＰＥ基を含むジエタノールアミンのうち、ＤＭＴｒ基で保護されていない水酸基をアミダイト化した。

　３－（（ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスファニル）オキシ）プロパンニトリル（１．７６ｇ、５．９ｍｍｏｌ）を乾燥アセトニトリルに溶解した。この反応液に、５－（エチルチオテトラゾール）（ＥＴＴ）（７．６１ｇ、５．９ｍｍｏｌ）をアルゴン下で添加し、次いで、前記（５）で得られたＣ_７－ＰＦＰＥ基を含むＤＭＴｒ保護ジエタノールアミン（３．２６ｇ、３．９ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５ｍＬ）及びアセトニトリル（５ｍＬ）に溶解させた溶液を少しずつ加えた。次いで、この反応混合物を、アルゴン下で室温で４時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させた。得られた粗生成物を、アルゴン下で、脱気したヘキサン／酢酸エチル（容量比１：４））を移動相としたカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的の化合物（ Ｎ［Ｃ_７－ＰＦＰＥ］アミダイト）を無色の油状物質として単離した（収率７８％）。

¹H NMR (400 MHz, Acetone-d₆) δ 8 7.41 (d, J = 8.7 Hz, 2H), δ 7.32-7.14(m, 7H), δ 6.83-6.79 (m, 4H), δ 3.80-3.51 (m, 6H) δ 3.77 (s, 6H) δ 3.50 (t, J = 11.4 Hz, 2H), δ 3.25 (t, 11.4 Hz, 2H), δ 3.15 (t, J = 6.0 Hz, 2H), δ 2.94-2.89 (m, 4H), 2.54 (t, J = 6.4 Hz, 2H), δ 1.16 (d, J = 6.9 Hz, 6H), δ 1.12 (d, J = 6.9 Hz, 6H), ¹⁹F NMR (376 MHz, Acetone-d₆) δ -75.0 (m, 2F), δ -86.6 (s, 3F), δ -88.3 - -88.8 (m, 10F), ³¹P NMR (162 MHz, Acetone-d₆), δ -148.4 (s)

　配列番号１からなるオリゴヌクレオチドの５’末端にＮ［Ｃ_７－ＰＦＰＥ］基を結合させた５’－Ｎ［Ｃ_７－ＰＦＰＥ］修飾ＤＮＡを合成した。
　配列番号１からなるオリゴヌクレオチドの５’末端にＮ［Ｃ_７－ＰＦＰＥ］基を結合させた５’－Ｎ［Ｃ_７－ＰＦＰＥ］修飾ＤＮＡの合成は、以下の通りにして行った。まず、１０００ÅのＣＰＧ固体支持カラム（１μｍｏｌｅスケール）でのＤＮＡ合成（トリチルオフ）を行った。次いで、窒素雰囲気下で、シリンジを使用して、前記（６）で合成したＮ［Ｃ_７－ＰＦＰＥ］アミダイト（０．１Ｍのアセトニトリル溶液、３００μＬ）とアクティベーター溶液（３００μＬ）を、ＣＰＧの存在下で混合した。混合して５分後に、溶液をカラムから除去し、ＤＮＡシンセサイザーで鎖のキャッピング、酸化、及びブロック解除を行った。
　核酸の脱保護、ＨＰＬＣ精製は前記と同様にして行った。合成した核酸を表６に示す。

　図５に、ｃｏｎｔ－ＤＮＡ、ＦＥ（２）１、ＦＥ（２）２及びＦＥ（２）５のフルオレセイン修飾核酸を取り込ませた細胞のフローサイトメトリーの結果を示す。５’末端にＮ［Ｃ_７－ＰＦＰＥ］修飾をした１本鎖核酸では、いずれも未修飾の核酸（ｃｏｎｔ－ｒＤＮＡ）よりも細胞内への取り込み量が多かった。

［実施例４］
　エーテル結合性の酸素原子を有していない炭素数４個のパーフルオロアルキル基（－Ｃ_４Ｆ_９：以下、Ｃ_４－ＰＦＣ基）を含むホスホロアミダイトを合成し、これを用いてアミダイト法によりＣ_４－ＰＦＣ基を含有する核酸を製造した。

（１）トリフルオロメタンスルホナートの合成
　Ｃ_４－ＰＦＣ基を含むトリフルオロメタンスルホナートを合成した。

　フッ素化アルコール（Ｃ_４Ｆ_９ＣＨ_２ＯＨ）（５００ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を乾燥ジクロロメタン（１ｍＬ）に溶解し、続いて乾燥トリエチルアミン（１ｍＬ）を添加し、－７８℃に冷却した。この反応液に、トリフルオロメタンスルホン酸無水物（８．４６ｇ、３ｍｍｏｌ）を３０分間かけて滴下したところ、反応混合物は暗色になった。該反応混合物を、０℃で１時間撹拌した後、室温まで加温し、さらに１８時間撹拌した。その後、飽和ＮａＨＣＯ_３（１０ｍＬ）を添加して反応を停止させ、ジクロロメタン（５０ｍＬ）で３回抽出した。全ての有機相を合わせ、ブラインで洗浄した後、ＭｇＳＯ_４で乾燥し、溶媒を真空下で除去して、目的の化合物を濃い黒色の油状物質として得た。得られた粗生成物を、^１Ｈ　ＮＭＲで分析し、さらに精製することなく次のステップで使用した。（収率６１％）。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 4.91 (t, J = 12.3 Hz, 2H), ¹⁹F NMR (376 MHz, CDCl₃) δ -74.3 (s, 3F), δ -81.2 (s, 3F), δ -120.1 (s, 2F), δ -124.0 (s, 2F), δ -126.4 (s, 2F)

（２）ジエタノールアミン化
　前記（１）で得られたＣ_４－ＰＦＣ基を含むトリフルオロメタンスルホナートをジエタノールアミン化した。

　前記（１）で得られたＣ_４－ＰＦＣ基を含むトリフルオロメタンスルホナート（４５９ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）とジエタノールアミン（２５４ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）の溶液を、乾燥ＤＭＦ（５ｍＬ）に加えた。得られた反応混合物を、１００℃の油浴に入れ、１８時間撹拌した。次いで、当該反応物を冷却し、水（１０ｍＬ）に溶解し、生成物をジクロロメタン（２０ｍＬ）で３回抽出した。全ての有機相を合わせ、ブラインで洗浄した後、ＭｇＳＯ_４で乾燥し、溶媒を真空下で除去して、目的の化合物を得た。得られた粗生成物を、^１Ｈ　ＮＭＲで分析し、さらに精製することなく次のステップで使用した。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 3.61 (t, J = 5.0 Hz, 4H), δ 3.21 (t, J = 17.4 Hz, 2H), δ 2.89 (t, J = 5.5 Hz, 4H),  ¹⁹F NMR (376 MHz, CDCl₃) δ -81.2 (s, 3F), δ -117.0 (s, 2F), δ -124.7 (s, 2F), δ -126.2 (s, 2F)

（３）ＤＭＴｒ保護
　前記（２）で得られたＣ_４－ＰＦＣ基を含むジエタノールアミンの２個の水酸基のうちの１個を、ＤＭＴｒ（４，４’－ジメトキシトリフェニルメチル基）で保護した。

　前記（２）で得られたＣ_４－ＰＦＣ基を含むジエタノールアミン（３．２０ｇ、９．５ｍｍｏｌ）を、乾燥ジクロロメタン（２０ｍＬ）及びトリエチルアミン（５ｍＬ）に溶解させた。この反応混合物に、ＤＭＴｒＣｌ（３．２１ｇ、９．５ｍｍｏｌ）を少しずつ加えた後、室温で２．５時間撹拌した。次いで、当該反応物から溶媒を真空下で除去して、暗褐色の油状物質を得た。この油状物質を、トリエチルアミンで前処理したシリカカラムとＥｔＯＡｃ／ヘキサン（容量比１：４）混合物を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的の化合物を黄色の油状物質として得た（収率５４％）。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.41 (d, J = 7.3 Hz, 2H), δ 7.33-7.18 (m, 7H), δ 6.82 (d, J = 9.2 Hz, 4H), δ 3.78 (s, 6H), δ 3.52 (dd, J = 5.5 Hz, 10.5 Hz, 2H), δ 3.31 (t, J = 16.9 Hz, 2H), δ 3.23 (t, J = 5.5 Hz, 2H) δ 2.94 (t, J = 5.5 Hz, 2H), δ 2.81 (t, J = 5.0 Hz, 2H), δ 2.44 (t, J = 6.2 Hz, 1H) ¹⁹F NMR (376 MHz, CDCl₃) δ -79.9 (s, 3F), δ -117.1 (s, 2F), δ -125.0 (s, 2F), δ -125.9 (s, 2F)

（４）アミダイト化
　前記（３）で得られたＣ_４－ＰＦＣ基を含むジエタノールアミンのうち、ＤＭＴｒ基で保護されていない水酸基をアミダイト化した。

　３－（（ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスファニル）オキシ）プロパンニトリル（１．８４ｇ、６．１ｍｍｏｌ）を乾燥アセトニトリルに溶解した。この反応液に、５－（エチルチオテトラゾール）（ＥＴＴ）（１．０５ｇ、７．７ｍｍｏｌ）をアルゴン下で添加し、次いで、前記（３）で得られたＣ_４－ＰＦＣ基を含むＤＭＴｒ保護ジエタノールアミン（３．２６ｇ、５．１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５ｍＬ）及びアセトニトリル（５ｍＬ）に溶解させた溶液を少しずつ加えた。次いで、この反応混合物を、アルゴン下で室温で４時間撹拌した後、溶媒を減圧下で蒸発させた。得られた粗生成物を、アルゴン下で、脱気したヘキサン／酢酸エチル（容量比１：４））を移動相としたカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的の化合物（Ｎ［Ｃ_４－ＰＦＣ］アミダイト）を無色の油状物質として単離した（収率４５％）。

¹H NMR (400 MHz, Acetone-d₆) δ 7.41 (t, J = 8.7 Hz, 2H), δ 7.33-7.17 (m, 7H), δ 6.85 (td, J = 2.3 Hz, 8.7 Hz, 4H), δ 3.84-3.56 (m, 6H) δ 3.76 (s, 6H) δ 3.37 (t, J = 16.5 Hz, 2H), δ 3.20 (t, 6.0 Hz, 2H), δ 2.94 (t, J = 5.5 Hz, 2H), δ 2.90 (t, J = 6.4 Hz, 2H), δ 2.56 (t, J = 6.4 Hz, 2H), δ 1.16 (dd, J = 6.9 Hz, 6H), δ 1.12 (d, J = 6.9 Hz, 6H), ¹⁹F NMR (376 MHz, Acetone-d₆) δ -80.9 (m, 2F), δ -117.7 (s, 2F), δ -124.3 (s, 2F), δ -126.0 (s, 2F), ³¹P NMR (162 MHz, Acetone-d₆), δ -148.4 (s)

　本発明は、パーフルオロアルキル基を含有する核酸及びその製造方法を提供する。本発明に係る核酸は、細胞膜透過性に優れているため、例えば、薬効成分を標的細胞へ導入するためのキャリア等、生理活性物質として、医薬分野での利用が期待される。

　なお、２０１９年９月２７日に出願された日本特許出願２０１９－１７７６２２号の明細書、特許請求の範囲、図面および要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。

Claims (11)

1. 　炭素原子間に１～５個のエーテル結合性の酸素原子を有している、炭素数２～１０個のパーフルオロアルキル基を含有する、核酸。
2. 　前記パーフルオロアルキル基が、直接又は間接的に、核酸の５’末端又は３’末端に結合している、請求項１に記載の核酸。
3. 　前記パーフルオロアルキル基が、間接的に、２個のヌクレオチドの間に導入されている、請求項１に記載の核酸。
4. 　下記一般式（Ａ１）で表される構造を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸。
   

   

   ただし、式中の基は下記を意味する。
   Ｒ^ＦＥは、炭素原子間に１～５個のエーテル結合性の酸素原子を有している、炭素数２～１０個のパーフルオロアルキル基であり、ｎａは、１～１０の整数であり、黒丸は結合手を示す。
5. 　細胞膜透過性核酸である、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸。
6. 　下記一般式（Ａ２）で表される化合物を原料とし、ホスホロアミダイト法により、請求項１～５のいずれか一項に記載のパーフルオロアルキル基を含有する核酸を合成する、パーフルオロアルキル基を含有する核酸の製造方法。
   

   

   ただし、式中の基は下記を意味する。
   Ｒ^ＦＥは、炭素原子間に１～５個のエーテル結合性の酸素原子を有している、炭素数２～１０個のパーフルオロアルキル基であり、ｎａは、１～１０の整数であり、ＤＭＴｒは４，４’－ジメトキシトリフェニルメチル基であり、ｉ－Ｐｒはイソプロピル基である。
7. 　炭素原子間に１～５個のエーテル結合性の酸素原子を有していてもよい、炭素数２～１０個のパーフルオロアルキル基を含有する核酸を有効成分とする、核酸医薬。
8. 　核酸に、炭素原子間に１～５個のエーテル結合性の酸素原子を有していてもよい、炭素数２～１０個のパーフルオロアルキル基を導入し、細胞膜透過性を向上させる、核酸の細胞膜透過性向上方法。
9. 　前記パーフルオロアルキル基が、炭素原子間に１～５個のエーテル結合性の酸素原子を有する基である、請求項８に記載の核酸の細胞膜透過性向上方法。
10. 　前記パーフルオロアルキル基が、炭素原子間にエーテル結合性の酸素原子を有していない基である、請求項８に記載の核酸の細胞膜透過性向上方法。
11. 　前記パーフルオロアルキル基を、直接又は間接的に、前記核酸の５’末端又は３’末端に結合させる、請求項８～１０のいずれか一項に記載の核酸の細胞膜透過性向上方法。

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