WO2016060532A1 - 사이클로스포린 및 트레할로스를 포함하는 안과용 조성물 - Google Patents

사이클로스포린 및 트레할로스를 포함하는 안과용 조성물 Download PDF

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WO2016060532A1
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trehalose
ophthalmic composition
cyclosporin
dry eye
corneal
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임종환
홍성운
전호성
고대웅
남승관
안미선
김언
황덕규
김영목
엄기안
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주식회사 휴온스
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents

Definitions

  • the present invention relates to an ophthalmic composition, a preparation method thereof and a method for preventing or treating an ophthalmic disease.
  • Tears consist of an oily layer, an aqueous layer, and a mucus layer, and the tear film shows their three-layer structure. Dry eye to dry eye (hereinafter referred to as 'dry eye') concept is widespread, the cause of which is not known in many cases, dry eye is not a single disease, but rather the amount or quality of tears or fluctuations It is defined as an abnormal eye condition that occurs and the tear film disappears faster than normal.
  • dry eye category includes dry corneal conjunctivitis, corneal conjunctival epithelial disorders, lacrimal secretion reduction, Stevens-Johnson syndrome, dry eye syndrome, Shogran syndrome, tear deficiency, ocular hyperemia, tear film instability, or ocular edema. The same disease is included.
  • the category of dry eye also includes allergic conjunctivitis, viral conjunctivitis, or dry eye after cataract surgery.
  • the recent increase in contact lens users, increased time spent in an artificial air-conditioned environment, and widespread use of TVs and computers have increased the chance of seeing VDTs (visual display terminals), which promotes dry eye. Factors have increased significantly, and consequently, categories of dry eye include contact lens wear-related dry eye or VDT work-related dry eye.
  • corneal epithelial disorders include dry eye, corneal epithelial defect, conjunctival epithelial defect, corneal epithelial erosion, corneal thickness, and corneal thickness.
  • corneal perforation, or corneal epithelial detachment including corneal ulcers, keratitis, conjunctivitis, punctate keratitis, dry keratoconjunctivitis, superior keratoconjunctivitis, filamentous keratitis, infectious corneal ulcers and keratoconjunctival epithelium Eye diseases are caused.
  • Keratoconjunctival epithelial disorders may be caused by intraocular trauma, microsurgery, or wearing hard contact lenses.
  • Dry eye treatment focused on maintaining a certain amount of tears by conservative methods such as replenishing artificial teardrop eye drops or temporarily or permanently preventing tears.
  • mild dry eye the tendency is to use active treatments that promote lacrimal fluid secretion rather than palliative treatment.
  • immunosuppressants include cyclosporin, sirolimus, tacrolimus and derivatives thereof.
  • one of the commercially available drugs is cyclosporin A 0.05% emulsion formulation eye drops (Restasis ® ). It is known to be effective in treating dry eye syndrome and related conjunctival epithelial disorders, but at the same time, it is known to have many side effects.
  • immunosuppressive agents In addition to cyclosporin, excessive use of immunosuppressive agents has side effects such as anemia, leukopenia, thrombocytopenia, and hair loss.
  • immunosuppressive agents are actively used for the treatment of dry eye when the clinical symptoms are inconvenient, in addition to the severe dry eye treatment.
  • dry eye patients have a lot of drug types and frequency of use, and these factors are known to reduce drug compliance and reduce the therapeutic effect.
  • Trehalose is a disaccharide in which two glucose molecules are bonded together at their reducing moieties and has three optical isomers of ⁇ , ⁇ -trehalose, ⁇ , ⁇ -trehalose and ⁇ , ⁇ -trehalose.
  • trehalose is widely distributed in bacteria, plants and animals, and trehalose is widely used in the food field because of its excellent properties such as relatively low sweetness, anti-aging of starch and anti-denaturation of protein during freezing / drying.
  • Korean Patent Publication No. 10-2002-0021320 (published on March 20, 2002) discloses that a composition containing trehalose alone as an active ingredient is effective in treating Sjogren's syndrome.
  • the problem to be solved by the present invention is not only to reduce the amount of cyclosporin, but also to achieve the same or more effect, it can be caused by a variety of paths, rather than a single disease, which shows a combination of excellent effects on dry eye in various conditions or conditions It is to provide an ophthalmic composition.
  • the present invention provides an ophthalmic composition containing a combination of two components, cyclosporin and trehalose in a constant ratio or a certain weight percent range.
  • the present inventors have the same or more effect while reducing the amount of cyclosporin with such an ophthalmic composition, as well as effects that cannot be achieved in compositions containing cyclosporin alone or trehalose as the only active ingredient, such as dry air, ophthalmic inflammation or
  • the present invention has been completed by preparing cyclosporin and trehalose complexes, and confirming that the compound exhibits excellent effects on dry eye, which may be caused by various routes such as preservatives and placed under various conditions and conditions.
  • the present invention provides an ophthalmic composition
  • ophthalmic composition comprising cyclosporin and trehalose as an active ingredient, a method for preparing the same, and a method for preventing, ameliorating, or treating an ophthalmic disease (preferably, dry eyes) using the same.
  • the present invention provides an ophthalmic composition comprising cyclosporin and trehalose as an active ingredient, preferably an ophthalmic composition for preventing, improving or treating dry eye.
  • the present invention also provides a method of preventing, ameliorating or treating an ophthalmic disease (preferably dry eye) by administering an ophthalmic composition comprising a pharmaceutically effective amount of cyclosporin and trehalose to a mammal (preferably human). do.
  • an ophthalmic composition comprising a pharmaceutically effective amount of cyclosporin and trehalose to a mammal (preferably human). do.
  • the present invention also provides the use of cyclosporin and trehalose for preparing ophthalmic compositions (preferably ophthalmic compositions for the prevention, improvement or treatment of dry eye).
  • the synergistic effect is maximized and further maximized when the two active ingredients are combined in a constant ratio
  • the weight ratio of cyclosporin: trehalose is preferably 1: 20-200, 1: 20-190 , 1: 20-180, 1: 20-170, 1: 20-160, 1: 20-150, 1: 20-140, 1: 20-130, 1: 20-120, 1: 20-110, 1 : 20-100, 1: 20-90, 1: 20-80, 1: 20-70, 1: 20-60, 1: 20-50, 1: 20-40, 1: 20-30, 1: 20 , 1: 30-200, 1: 30-190, 1: 30-180, 1: 30-170, 1: 30-160, 1: 30-150, 1: 30-140, 1: 30-130, 1 : 30-120, 1: 30-110, 1: 30-100, 1: 30-90, 1: 30-80, 1: 30-70, 1: 30-60, 1: 30-50, 1: 30 -40
  • the weight ratio is less than 1: 20, the combined effect cannot be expected for dry eye under various conditions or conditions, and if the ratio is greater than 1: 200, the effective osmotic pressure of the eye drops (about 230 to 320 mOsmol / kg) cannot be maintained, and the transparent nano The disadvantage is that the emulsion cannot be maintained.
  • the synergistic effect is exerted and maximized when the two active ingredients are combined in a specific weight% range, and the cyclosporin may be included in an amount greater than 0.01 wt% based on the total weight of the ophthalmic composition. However, it is preferable to be included in less than 0.1% by weight, and when used in excess of 0.1% by weight of cyclosporine has a side effect such as burning sensation, blurred vision.
  • Cyclosporin is preferably more than 0.01% by weight 0.05% by weight, more than 0.01% by weight less than 0.05% by weight, 0.02% by weight or more 0.05% by weight, 0.02% by weight or less and 0.05% by weight, 0.02% by weight % Or more and 0.05% or less, 0.01% or more, 0.04% or less, 0.02% or more, 0.04% or less, 0.01% or more, 0.03% or less, 0.02% or more, 0.03% or less, or 0.02% by weight.
  • trehalose may be included in an amount of 0.5 wt% or more based on the total weight of the ophthalmic composition.
  • trehalose may be 0.5% by weight, 0.6% by weight, 0.7% by weight, 0.8% by weight, 0.9% by weight, 1% by weight, 1.1% by weight, 1.2% by weight based on the total weight of the ophthalmic composition.
  • trehalose When used at less than 0.5% by weight trehalose can not be expected to have a complex effect on dry eye under various conditions and conditions, when used at more than 7.5% by weight trehalose can not maintain the effective osmotic pressure (about 230 ⁇ 320 mOsmol / kg) of eye drops However, there is a disadvantage that the transparent nanoemulsion cannot be maintained.
  • the ophthalmic composition may comprise greater than 0.01% by weight of cyclosporin and less than 0.1% by weight and 0.5 to 7.5% by weight of trehalose, and may include more than 0.01% by weight of cyclosporin-less than 0.05% by weight and 0.5-5% by weight of trehalose.
  • the ophthalmic composition according to the present invention preferably comprises cyclosporin and trehalose in the above weight ratio or weight percent range, or in weight ratio and weight percent range, for synergy of cyclosporin and trehalose.
  • the term "synergy" is based on the premise that the ophthalmic composition contains the same amount of the active ingredient based on the total weight percent of the composition, compared to the ophthalmic composition containing cyclosporine alone or trehalose alone, Improve or improve the effect on the same indications exhibited in ophthalmic compositions containing cyclosporine alone or trehalose only active ingredients, or have an effect on indications not exhibited in cyclosporine alone or trehalose only effective ophthalmic compositions containing active ingredients, or cyclosporine alone Or if the side effects or disadvantages that are problematic in the ophthalmic composition containing trehalose alone active ingredient is resolved.
  • the treatment effect is significantly elevated compared to the administration of cyclosporine alone or trehalose alone, reduced corneal damage rate, normalized tear secretion, decreased ophthalmic inflammation, tear Improves quality, reduces eye irritation (such as conjunctival redness, swelling and increased discharge), maintains tear film, lubricates and moisturizes, and increases goblet cells responsible for mucin secretion. It may include the effect of increasing the amount of mucin (mucin) secretion showing activity.
  • cyclosporin or “trehalose” can be used irrespective of the production method and origin thereof, unless the object of the present invention is impaired.
  • the cyclosporin may include cyclosporin A, cyclosporin A derivatives, cyclosporin B, cyclosporin C, cyclosporin D and mixtures thereof as the active ingredient, and preferably include cyclosporin A.
  • the trehalose may include three optical isomers, ⁇ , ⁇ -trehalose, ⁇ , ⁇ -trehalose, ⁇ , ⁇ -trehalose, and mixtures thereof as active ingredients thereof.
  • cyclosporin or "trehalose” is defined to encompass pharmaceutically acceptable derivatives thereof, and the pharmaceutically acceptable derivatives have the same biological function and / or activity as cyclosporin or trehalose. It will be appreciated or provided, and prodrugs of cyclosporin or trehalose, solvates thereof, and co-crystals thereof may be included without impairing the object of the present invention.
  • prodrug refers to the formation of an amount of cyclosporin or trehalose that can be detected experimentally within a given time via metabolism after administration.
  • solvate means a compound that further comprises a stoichiometric or non-stoichiometric amount of solvent bound by non-covalent intermolecular forces. If the solvent is water, the solvate is a hydrate.
  • co-crystal means a crystalline form comprising one or more compounds in the crystal lattice.
  • Cocrystals comprise crystalline molecular complexes of two or more non-volatile compounds bonded together in a crystal lattice through non-ionic interactions.
  • the co-crystals include pharmaceutical co-crystals which are crystalline molecular complexes comprising cyclosporin to trehalose, and one or more additional non-volatile compounds (referred to as counter-molecules below).
  • Counter-molecules in pharmaceutical co-crystals may be non-toxic pharmaceutically acceptable molecules such as, for example, food additives, preservatives, pharmaceutical excipients, or other APIs.
  • the pharmaceutical co-crystals enhance some physical properties of the drug (eg, solubility, dissolution rate, bioavailability / stability, etc.) without compromising the chemical structural integrity of the API.
  • Cyclosporine including pharmaceutically acceptable derivatives thereof, and trehalose, including pharmaceutically acceptable derivatives thereof, may be prepared by various methods chemically or enzymatically known in the art, or may be obtained by using a commercially available product. It may be.
  • Ophthalmic composition according to the present invention can be prepared by mixing cyclosporin and trehalose as an active ingredient.
  • Ophthalmic composition according to the present invention can be prepared as pharmaceutical compositions, quasi-drug compositions, health food compositions and the like.
  • Ophthalmic compositions according to the present invention may include additives such as pharmaceutically (or pharmaceutically acceptable) carriers, excipients or diluents, and the properties to be considered in the additives include compatibility with cyclosporin and trehalose, biocompatibility, Processing temperatures and the like, but are not limited thereto.
  • Ophthalmic compositions according to the invention may be prepared in parenteral preparations such as ophthalmic solutions, eye ointments, injections, eyewashes, or the like oral preparations, such as tablets, capsules and granules, the preferred dosage form is an ophthalmic solution And the most preferred dosage form is eye drops.
  • parenteral preparations such as ophthalmic solutions, eye ointments, injections, eyewashes, or the like oral preparations, such as tablets, capsules and granules
  • the preferred dosage form is an ophthalmic solution
  • the most preferred dosage form is eye drops.
  • any dosage form used as an ophthalmic solution such as an aqueous ophthalmic solution, such as an aqueous ophthalmic solution, an aqueous emulsion ophthalmic solution, a viscous ophthalmic solution and a dissolved ophthalmic solution; Or nonaqueous ophthalmic solutions such as nonaqueous ophthalmic solutions and nonaqueous emulsion ophthalmic solutions.
  • the buffer may be selected from the group consisting of phosphate buffer, borate buffer, citrate buffer, tartrate buffer, acetate buffer (eg sodium acetate) tromethamine and amino acids, but is not limited thereto.
  • phosphate buffers can be used.
  • the tonicity agent may be selected from the group consisting of sugars such as sorbitol, glucose erythritol and mannitol, polyhydric alcohols such as glycerin, polyethylene glycol and polypropylene glycol, and salts such as sodium chloride, but are not limited thereto.
  • Preservatives include alkyl paraoxybenzoates such as benzalkonium chloride, benzetonium chloride, methyl paraoxybenzoate and ethyl paraoxybenzoate, benzyl alcohol, phenethyl alcohol, sorbic acid and salts thereof, thimerosal, polyquaternium , But may be selected from the group consisting of benzododecinium bromide, oxychloro complex and chlorobutanol, but is not limited thereto.
  • Stabilizers can be selected from the group consisting of cyclodextrins and derivatives thereof, water soluble polymers such as poly (vinylpyrrolidone), and surfactants such as polysorbate 80 (Twin 80 ® ), polysorbate 20, thyroxapol
  • the pH adjusting agent may be selected from the group consisting of hydrochloric acid, acetic acid, phosphoric acid, sulfuric acid, sodium hydroxide, potassium hydroxide, monoethanolamine, aqueous ammonia and ammonium hydroxide, but is not limited thereto.
  • the thickener may be selected from the group consisting of hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose, methylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose and carboxymethylcellulose, polyvinyl alcohol, carbomer, povidone, poloxamer, polycarbophil and salts thereof.
  • the chelating agent may be selected from the group consisting of sodium edetate, sodium citrate and condensed sodium phosphate, but is not limited thereto.
  • the solubilizer or solvent may be selected from, but is not limited to, glycerin, DMSO, DMA, N-methylpyrrolidone, ethanol, benzyl alcohol, isopropyl alcohol, polyethylene glycol of various molecular weights or propylene glycol.
  • glycerin DMSO, DMA, N-methylpyrrolidone
  • ethanol benzyl alcohol
  • isopropyl alcohol polyethylene glycol of various molecular weights or propylene glycol.
  • the solubilizer may be a surfactant in some variations. Combinations of surfactants, including various types of surfactants, may be used.
  • nonionic, anionic (ie soap, sulfonate), cationic (ie CTAB), zwitterionic, polymeric, amphoteric surfactants may be used.
  • surfactants that can be used include, but are not limited to, those having HLB of 10, 11, 12, 13, or 14 or more.
  • examples of surfactants include polyoxyethylene products of hydrogenated vegetable oils, polyethoxylated castor oil or polyethoxylated hydrogenated castor oil, polyoxyl castor oil or derivatives thereof, polyoxyethylene-sorbitan-fatty acid esters And polyoxyethylene castor oil derivatives. It is not limited to this.
  • the ophthalmic composition of the present invention is more than 0.01% by weight of cyclosporin less than 0.1% by weight, trehalose 0.5-7.5% by weight, 1-10% by weight solubilizer, 0.01-2% by weight based on the total weight of the composition , Residual amount of buffer and tonicity agent.
  • Aqueous emulsion ophthalmic liquids can be prepared preferably in the nanoemulsion type, in which case various additives known in the art can be included without impairing the object of the present invention, such as oils and surfactants can be included.
  • the oil is propylene glycol monocaprylate, propylene glycol laurate, medium chain triglycerides having 8 to 10 carbon atoms (C8 to C10) triglycerides, glyceryl-1, It may be selected from the group consisting of 3-dioleate (glyceryl-1,3-dioleate), glyceryl monooleate and glyceryl linoleate.
  • the surfactant is oleoyl macrogolglycerides, linoleoyl macrogolglycerides, caprylocaproyl polyoxylglycerides, polyoxyl 35 castor oil ), Polyoxyl 35 hydrogenated castor oil, polyoxyl 40 hydrogenated castor oil, polyoxyl 60 hydrogenated castor oil, It may be selected from the group consisting of condensation product of ethylene oxide with 12-hydroxystearic acid and polysorbate 80 (polysorbate 80, Croda, UK).
  • the aqueous emulsion ophthalmic solution may be prepared with a transparent nanoemulsion type eye drop, and for example, reference may be made to Korean Patent Registration No. 10-0938500, but is not limited thereto.
  • the ophthalmic composition according to the present invention can be used for improving, preventing or treating ophthalmic diseases, and preferably for improving, preventing or treating disorders caused by dry eye.
  • the "impairment due to dry eye” includes dry cornea conjunctivitis, corneal conjunctival epithelial disorders, lacrimal secretion reduction, Stevens-Johnson syndrome, dry eye syndrome, Sjogran syndrome, tear deficiency, ocular hyperemia, tear film instability, or ocular edema; Dry eye after allergic conjunctivitis, viral conjunctivitis, or cataract surgery; And contact lens wear-related dry eye or VDT work-related dry eye and the like.
  • the "keratoconjunctival epithelial disorder” includes dry eye, corneal epithelial defect, conjunctival epithelial defect, corneal epithelial erosion, corneal thickness reduction, corneal infiltration, corneal perforation or corneal epithelial detachment; Infectious eye diseases of corneal ulcer, keratitis, conjunctivitis, punctate keratitis, dry keratoconjunctivitis, superior limbal keratoconjunctivitis, filamentous keratitis, corneal ulcer and keratoconjunctival epithelium; Intraocular trauma, microsurgery or corneal epithelial disorders associated with wearing hard contact lenses may be included.
  • the dosage of the ophthalmic composition according to the present invention will typically be determined by a healthcare practitioner or a person skilled in the art.
  • a preferred dosage of an ophthalmic composition comprising cyclosporin and trehalose as an active ingredient is, for example, 0.02% cyclosporin and 1-3% trehalose by weight.
  • Including eye drops containing 1 to 4 drops (approximately 0.025 to 0.1 mL) per dose may be administered up to 1 to 10 times per day, but is not limited thereto.
  • the actual dosage that is best suited can be determined according to the circumstances to be treated.
  • the ophthalmic composition according to the present invention may be provided by filling in a sterile container, and may be provided including an instruction regarding its use, wherein the instruction may be a container filled with the ophthalmic composition or a second packaged container. May be physically attached to a container of or packaged together within a second container.
  • the ophthalmic composition according to the present invention containing cyclosporin and trehalose in combination at a predetermined ratio and / or in a predetermined amount may be caused by various routes such as dry air induction, inflammation, and preservative induction, and may be subjected to various conditions and conditions. It has a good combination effect on dry eye. More specifically, while reducing the amount of cyclosporin used, it has an equivalent or better effect. In addition, there is a markedly elevated therapeutic effect compared to cyclosporine alone or trehalose alone administration, reduced corneal damage rate, normalized tear secretion, decreased ophthalmic inflammation, improved tear quality, eye irritation (such as conjunctival redness, swelling and discharge).
  • Figure 1 shows the change in corneal injury inhibition rate resulting from the treatment of the combination in a dry air-induced dry eye model.
  • Figure 2 shows the change in the rate of tear secretion resulting from the treatment of the combination in the Concanavalin A-induced dry eye model.
  • Figure 3 shows the change in corneal inflammation improvement rate resulting from the treatment of the combination in a Concanavalin A-induced dry eye model.
  • Figure 4 shows the amount of Schirmer changes (top) and TBUT changes (bottom) resulting from the treatment of the combination in the Benzalkonium chloride-induced dry eye model.
  • Figure 5 shows the number of goblet cells resulting from the treatment of the combination in the Benzalkonium chloride-induced dry eye model.
  • Figure 6 shows the amount of inflammation changes (top) and the degree of eye irritation (bottom) resulting from the treatment of the combination in the Benzalkonium chloride-induced dry eye model.
  • Figure 7 shows the cell viability as a result of treating the combination in the dry eye model.
  • composition ratio of A to J in Table 1 composition comprising various concentrations of cyclosporin A and trehalose
  • the cyclosporin was solubilized by mixing in polyoxyl 35 castor oil which is a solubilizer.
  • An emulsion was prepared by mixing glycerin in each phosphate buffer with a pH of 7.2 and then dissolving the solubilized cyclosporin solution.
  • the osmotic pressure was adjusted to about 300 mOsmol / kg using trehalose and isotonic agents in the prepared cyclosporine emulsion solution.
  • compositions A, C, D, E, F, I, J prepared according to Example 1 described above were used in the experiments as test materials.
  • mice received 6-week-old male Sprague-Dawley (SD) rats from Daehan Biolink (negative Chungbuk) and housed 4 rats in a cage for rats. Animals were used for the experiment after a period of acclimation for about one week. The environment of the animal laboratory was adjusted to a temperature of 23 ⁇ 2 ° C, a relative humidity of 55 ⁇ 10%, a ventilation frequency of 12 times / hour, a lighting cycle of 12 hours, and an illuminance of 150 to 300 Lux.
  • Pellet-type solid feed for experimental animals was supplied from Purina Rat Chow ® Biopia (Gunpo, Gyeonggi-do, Korea).
  • test substance Thirty microliters of test substance were applied to both eyes 30 minutes prior to exposure of the experimental animals to the blower wind. After 30 minutes, 20 mg / kg of atropine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) is administered intraperitoneally to suppress tear secretion, and Zoletil ® is used to maintain a constant posture of animals and to prevent eye blinking. (Virbac Korea, Seoul, Korea) was anesthetized by intramuscular injection. The anesthetized animal was fixed in front of the blower so that both eyes were face-to-face in the wind, but the distance was adjusted such that the eyes were exposed to wind speed of 2 m / sec to 25-35% relative humidity.
  • atropine Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
  • test substance was repeatedly applied 10 times for 3 hours at 20 minutes intervals from the time of exposure to dry air (0 min), but after the eye drop, the eyelids were covered for about 10 seconds to distribute the substance evenly to the eye, and the eye was exposed to the air. .
  • the postures of the animals were observed to be disturbed or the eyes were not detected.
  • Green fluorescence penetrating area of fluorescein penetrated into the cornea was observed and photographed under the tungsten lamp. The photographs were analyzed by Image J 1.38x program to quantify the penetration area of fluorescein.
  • the corneas extracted were immersed in potassium buffered saline (1 ml) and eluted for 24 hours, followed by fluorescence spectrophotometry to measure fluorescence at excitation 485 nm and emission 538 nm. Luminance intensity was evaluated. If the fluorescein penetrates the cornea and the degree of luminescence is high, it means that the protective barrier function of the cornea is lost.
  • dry eye is induced by the principle similar to dry eye by air conditioner or dry indoor air.
  • a composition A treated group prepared according to Example 1 was used as a control.
  • the area of penetration (%) and intensity (%) of fluoresceined cornea were 100% of area (%) and intensity (%) of fluorescence stained cornea of control group, respectively.
  • the relative value was calculated as%.
  • Corneal damage inhibition rate was calculated by the following formula by calculating the sum of the corneal infiltration area (%) and the intensity of light intensity (%).
  • compositions C and D containing cyclosporin A alone as an active ingredient had little effect on the treatment of corneal damage, and in the case of composition D, the corneal damage was rather deteriorated.
  • compositions E, F containing trehalose alone as an active ingredient showed an effective effect on corneal damage, but showed a much lower corneal damage prevention effect than the composition J corresponding to the complex according to the present invention.
  • composition I including both cyclosporin A and trehalose, and containing cyclosporin A: trehalose in a weight ratio of 1: 300, showed a lower corneal damage prevention effect than the composition containing trehalose alone.
  • the number of goblet cells containing or releasing mucin-like glycoproteins increased significantly in the combination (composition J) treatment group of the present invention.
  • compositions A, B, C, D, E, F, G, H, J prepared according to Example 1 described above were used in the experiments as test materials.
  • the experimental animals received 1.8-2.0 kg of female New Zealand White (NZW) rabbits from Samtaco (Gyeongsan Osan) and housed one in a cage for rabbits. Animals were used for the experiment after a period of acclimation for about one week.
  • NZW New Zealand White
  • the environment of the animal laboratory was adjusted to a temperature of 23 ⁇ 2 ° C, a relative humidity of 55 ⁇ 10%, a ventilation frequency of 12 times / hour, a lighting cycle of 12 hours, and an illuminance of 150 to 300 Lux.
  • NIH # 32M a pellet-type solid feed for rabbits, was supplied from Samta Co., Ltd., and drinking water was freely consumed with sterile purified water. Both eyes of rabbits were examined 24 hours before the test and used only animals without corneal damage such as eye damage.
  • Con A Concanavalin A
  • 10 mg / ml in saline was used as the main tear gland of both upper eyelids. 50 ⁇ l of each was injected into the tear glands using an insulin syringe (31-gauge needle). After 24 hours of Con A injection, each test substance was instilled 4 times a day for 3 days, and after the eye drop, the eyelids were briefly covered for about 10 seconds so that the substance was spread evenly to the eye. The eye was examined and photographed once daily.
  • the cornea was stained with fluorescein, and the scores of the fluorescein staining were determined on the upper, middle and lower portions of the cornea according to the following criteria. The average value of the sum total of each said part was calculated
  • the dyeing is moderate, and a part of the dyeing portions on the spot are adjacent to each other.
  • composition A treated group prepared according to Example 1 was used as a control.
  • the corneal inflammation improvement rate (%) was computed by substituting the average value of the sum total of the score
  • test substance On the 10th day of administration of the test substance, dry eye evaluation and eye irritation evaluation were performed, followed by suffocation under carbon dioxide gas. Corneal and conjunctival tissues extracted at autopsy were fixed in 10% neutral formalin solution, and tissue sections were prepared. After PAS staining, the number of goblet cells containing or releasing mucin-like glycoproteins under X100 visual field was counted. It was.
  • Con A is an inflammation-inducing substance.
  • inflammation causes ocular inflammation such as decreased tear secretion, corneal damage, and inflammation in the lacrimal gland.
  • tear secretion inhibition rate (%) and corneal inflammation improvement rate (%) are shown in FIGS. 2 and 3, respectively.
  • composition G, H, J Compared with the cyclosporine alone and trehalose alone (composition B, C, D, E, F), it was confirmed that the tear secretion increased significantly in the combination administration group (composition G, H, J). Unlike the dry air-induced dry eye model, the trehalose-only group (compositions E and F) did not inhibit tear reduction due to ocular inflammation and had no effect on improving corneal inflammation. In addition, cyclosporine alone (composition B, C, D) in the corneal inflammation, but the effect of reducing the tear amount did not inhibit. On the contrary, as a result of the treatment of the complex (composition G, H, J) of the present invention, it was found that there is a synergistic effect also in the improvement of inflammation.
  • compositions A, D, and J prepared according to Example 1 described above were used in the experiments as test materials.
  • the experimental animals received 1.8-2.0 kg of female New Zealand White (NZW) rabbits from Samtaco (Gyeongsan Osan) and housed one in a cage for rabbits. Animals were used for the experiment after a period of acclimation for about one week.
  • NZW New Zealand White
  • the environment of the animal laboratory was controlled to a temperature of 23 ⁇ 2 °C, a relative humidity of 55 ⁇ 10%, the number of ventilation cycles 12 times / hour, the lighting cycle 12 hours, illuminance 150-300 Lux.
  • NIH # 32M a pellet-type solid feed for rabbits, was supplied from Samta Co., Ltd., and drinking water was freely consumed with sterile purified water. Both eyes of rabbits were examined 24 hours before the test and used only animals without corneal damage such as eye damage.
  • BAK Benzalkonium chloride
  • the eye was examined once a day for general symptoms and abnormal eye reactions.
  • TBUT was measured under a slit-lamp microscope after 5 ⁇ l of fluorescein prepared in 0.1% in the conjunctival sac and the fluorescein-induced fluorescent layer began to break. TBUT was averaged after 3 measurements.
  • the tear secretion was measured by dipping one end of the cobalt chloride paper (Schirmer paper) on the external eyelid for 30 seconds.
  • Fluorescence staining is used to determine the degree of corneal damage according to the following criteria for the degree of staining by fluorescein for each of the upper, middle and lower portions of the cornea, and the extent of corneal damage from the average of the sum of the scores of the respective parts. Calculated.
  • the dyeing is moderate, and a part of the dyeing portions on the spot are adjacent to each other.
  • Evaluation of ocular lesions by administration of the test substance was measured as follows, redness, edema and discharge of the conjunctiva, and was performed before the test substance (day 5, BAK administration), 5 and 10 days after the administration of the test substance. Eye irritation results (redness, conjunctival edema and discharge) were scored according to the following criteria and their average values were used to calculate eye irritation intensity (%). Eye irritation intensity (%) calculated the eye irritation intensity (%) by making the average eye irritation score of the composition A 100%.
  • Eye irritation rate (%) (irritation of composition A-irritation of test substance) / irritation of composition A * 100
  • BAK is widely used as a preservative and is used as a preservative for liquid eye drops, but it is a substance known to cause dry eye when treated with excessive eye drops. Dry eye is caused by different mechanism of action than Con A and dry air-induced eye dry model, and the lesion is developed for a relatively long time. Unlike other models, as the symptoms progress, tear instability and premature rupture may occur due to increased tearing or decreased secretion of mucin-like glycoproteins, and a combination of ocular surfaces may cause potential corneal surface damage. Promotes dry eye It was found that the combination treatment group (composition J) suppressed excessive tear secretion by BAK compared to the cyclosporin A alone treatment group (composition D) and suppressed the shortening of tear film breakage time.
  • composition J the composite treatment group
  • composition D the cyclosporin A alone treatment group
  • compositions A, D, E, F, G, H, I, J prepared according to Example 1 described above were used in the experiments as test materials.
  • a composition containing 0.05% of cyclosporin and 1% or 3% of trehalose was prepared according to Example 1 and used in an experiment.
  • Corneal epithelial cells were cultured in a 37 ° C incubator, and the cells were replaced with Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, GibcoBRL, USA) by adding a 10% fetal bovine serum, epidermal growth factor, and antibiotics every two to three days. When the confluent growth was completely removed the culture medium and washed once with phosphate buffered saline (PBS), and treated with 0.25% trypsin-EDTA was used to isolate the cells used in the test.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • PBS phosphate buffered saline

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Abstract

본 발명은 사이클로스포린 및 트레할로스를 유효성분으로 포함하는 안과용 조성물, 이의 제조방법, 이를 투여하여 안구건조에 따른 장애를 예방, 개선 또는 치료하는 방법, 및 이러한 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 안과용 조성물은 건조공기 유발, 염증 유발 및 방부제 유발 등 다양한 경로에 의해 발생할 수 있고 다양한 상태 내지 조건에 놓이는 안구건조에 복합적으로 우수한 효과를 갖는다.

Description

사이클로스포린 및 트레할로스를 포함하는 안과용 조성물
본 발명은 안과용 조성물, 이의 제조방법 및 안과 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 출원은 2014년 10월 17에 출원된 한국특허출원 제10-2014-0141089호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
눈물은 유성층, 수성층 및 점액질층으로 이뤄지며, 눈물막은 이들의 3층 구조를 나타낸다. 안구건조 내지 건조안구 (이하, '안구건조'라 칭함)의 개념은 광범위하고, 이의 원인은 많은 경우에 있어서 밝혀지지 않았기 때문에, 안구건조는 단일질병 이라기보다는 눈물의 양 내지 질이 감소하거나 변동이 생기고 눈물막이 정상보다 빠르게 소멸되어 눈물막이 불안정한 비정상적인 안구 상태로 정의된다.
상기 정의에 따르면, 안구건조의 범주에는 건조 각막 결막염, 각결막 상피 장애, 누액 분비 감소증, 스티븐스-죤슨 증후군, 안구건조 증후군, 쇼그랜 증후군, 눈물결핍증, 안구충혈, 눈물막 불안정, 또는 안구 부종 등과 같은 질병이 포함된다. 또한, 안구건조의 범주에는 알레르기성 결막염, 바이러스성 결막염, 또는 백내장 수술 후의 안구건조가 포함된다. 또한, 최근 콘택트 렌즈 사용자의 증가, 인공적인 공기-조절된 환경에서 보내는 시간의 증가, TV 및 컴퓨터 등의 폭넓은 사용으로 인해 VDT (시각 전시 단말기)를 볼 기회가 증가함에 따라 안구건조를 촉진하는 인자가 대폭 증가하였고, 결과적으로 안구건조의 범주에는 콘텍트 렌즈 착용-관련 안구건조 또는 VDT 작업-관련 안구건조가 포함된다.
또한, 안구건조를 앓는 경우, 많은 경우에 있어서, 각결막염성 장애를 유발한다. 특히, 점액질층에 눈물이 부족한 경우, 각막 손상이 심각한데, 이는 각결막 상피 장애를 일으키고, 각결막 상피 장애의 범주에는 건성안, 각막상피결손, 결막상피결손, 각막 상피 침식, 각막의 두께 감소, 각막 침윤, 각막 천공 또는 각막 상피 탈락 등이 포함되며, 각결막 상피 장애로부터 각막궤양, 각막염, 결막염, 점상표층 각막증, 건성 각결막염, 상윤부 각결막염, 사상 각막염, 각막 궤양 및 각결막 상피의 감염성 안질환 등이 유발된다. 각결막 상피 장애는 안구내 외상, 미세수술 또는 하드콘텍트렌즈 착용으로 인해 일어나기도 한다.
안구건조 치료는 인공눈물 점안액을 보충해주거나 눈물길을 일시적 혹은 영구적으로 막아 주는 등의 보존적인 방법으로 일정량 이상의 눈물을 유지시키는데 초점을 두었으나, 최근에는 치료 개념의 확대로 안구건조의 치료가 증상 완화 목적의 소극적 치료보다 경도의 안구건조에서도 누액 분비를 촉진하는 치료제를 사용하는 적극적 치료로 경향이 변화하고 있다. 이러한 변화의 일환으로, 안구건조 치료를 위해 면역억제제의 사용빈도가 증가하고 있다. 이러한 면역억제제에는 사이클로스포린, 시롤리무스, 타크롤리무스 및 이들의 유도체 등이 있다. 이들 중, 시판되고 있는 약물 중 하나가 사이클로스포린 A 0.05% 에멀젼제형 점안액 (Restasis®)이다. 이는 안구건조 증후군 및 이와 관련된 각결막 상피 장애를 치료하는데 효과적인 것으로 알려져 있으나, 동시에 많은 부작용이 있는 것으로 알려져 있으며, 가장 흔한 이상 반응은 눈의 작열감이고, 일부 환자에게서는 결막충혈, 분비물, 유루증, 눈의 동통, 이물감, 소양감, 자통, 시력 장애 (종종 시야혼탁) 등이 보고되고 있다. 이지은 등의 논문에 따르면 사이클로스포린 0.05%를 10분간 접촉시킨 결과 세포자멸사의 증가 및 세포의 생존율의 감소가 나타났으며, 각막상피세포의 독성효과 없이 사용하기 위해서는 0.05% 사이클로스포린을 10분 미만으로 노출시켜야 한다는 내용이 있으며(J Korean Ophthalmol Soc 48(10):1399-1409, 2007), 사이클로스포린 0.05% (5 μg/mL)이상에서는 cell viability가 현저하게 감소된다는 내용이 있다(Graefe's Arch Clin Exp Ophthalmol (2006) 244: 382-389).
사이클로스포린 외에도 면역억제제를 과량 사용하는 경우에는 빈혈, 백혈구 감소증, 혈소판 감소증, 탈모 등의 부작용이 있다. 그러나 최근의 변화에 따라 중증의 안구건조 치료 외에 이보다 경미한 경우도 임상 증상이 불편한 경우 안구건조 치료를 위해서 적극적으로 면역억제제가 사용되고 있다. 더욱이, 일반적으로 건성안 환자들은 약물의 종류 및 사용횟수가 많고 이러한 요인들은 약물의 순응도를 감소시키며, 치료효과도 감소시키는 것으로 알려져 문제가 있다.
한편, 트레할로스는 두개의 글루코오스 분자가 이들의 환원성 잔기에서 함께 결합된 이당이며, α, α-트레할로스, α, β-트레할로스 및 β, β-트레할로스의 세가지의 광학 이성체를 가지고 있다. 자연계에서는 트레할로스가 박테리아, 식물 및 동물에 널리 분포되어 있으며, 식품분야에 있어서 트레할로스는 비교적 낮은 감미도, 전분의 노화방지 및 동결/건조시의 단백질의 변성방지 등의 특성이 우수하기 때문에 널리 사용되고 있다. 또한, 한국특허 공개번호 제10-2002-0021320호(2002.03.20. 공개)에는 트레할로스를 단독 유효성분으로 하는 조성물이 쇠그렌 증후군 치료에 효과가 있다고 기재되어 있다.
그러나 이제까지 사이클로스포린 및 트레할로스 두 성분이 모두 함유된 안과용 조성물, 특히 광범위한 안구건조 예방, 개선, 나아가 치료에 대한 그 효과에 대해서는 알려진 바 없고, 더욱이 이들 두 성분의 배합에 따른 상승효과 및 이러한 상승효과를 나타내기 위한 중량비 내지 중량% 범위에 대해서는 검토된 바 없다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 사이클로스포린의 사용량을 줄이면서도 동등하거나 그 이상의 효과를 발휘할 뿐만 아니라, 다양한 경로에 의해 발생할 수 있고 단일질병 이라기 보다는 다양한 상태 내지 조건에 놓이는 안구건조에 복합적으로 우수한 효과를 보이는 안과용 조성물을 제공하는데 있다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 사이클로스포린과 트레할로스, 두 성분을 일정한 비율 또는 일정한 중량% 범위로 배합하여 함유한 안과용 조성물을 제공한다. 본 발명자들은 이러한 안과용 조성물로 사이클로스포린의 사용량을 줄이면서도 동등하거나 그 이상의 효과를 발휘하고, 뿐만 아니라 사이클로스포린 단독 또는 트레할로스를 단독 유효성분으로 하는 조성물에서는 발휘될 수 없는 효과, 예컨대 건조공기, 안염증 또는 방부제 등 다양한 경로에 의해 발생할 수 있고 다양한 상태 내지 조건에 놓이는 안구건조에 복합적으로 우수한 효과를 보임을 확인하고, 사이클로스포린 및 트레할로스 복합제로 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 사이클로스포린 및 트레할로스를 유효성분으로 포함하는 안과용 조성물, 이의 제조방법 및 이를 이용해 안과 질환(바람직하게, 안구건조)을 예방, 개선 또는 치료하는 방법을 제공한다.
보다 구체적으로, 본 발명은 사이클로스포린 및 트레할로스를 유효성분으로 포함하는 안과용 조성물, 바람직하게 안구건조 예방, 개선 또는 치료를 위한 안과용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 사이클로스포린 및 트레할로스를 포함하는 안과용 조성물을 포유류(바람직하게, 인간)에게 투여하여 안과 질환(바람직하게, 안구건조)를 예방, 개선 또는 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 안과용 조성물(바람직하게, 안구건조 예방, 개선 또는 치료를 위한 안과용 조성물)을 제조하기 위한 사이클로스포린 및 트레할로스의 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 안과용 조성물에 있어서, 상기 두 유효성분을 일정한 비율로 배합하였을 때 상승효과가 있고 나아가 극대화되는바, 상기 사이클로스포린 : 트레할로스의 중량비가 바람직하게 1: 20 - 200, 1: 20 - 190, 1: 20 - 180, 1: 20 - 170, 1: 20 - 160, 1: 20 - 150, 1: 20 - 140, 1: 20 - 130, 1: 20 - 120, 1: 20 - 110, 1: 20 - 100, 1: 20 - 90, 1: 20 - 80, 1: 20 - 70, 1: 20 - 60, 1: 20 - 50, 1: 20 - 40, 1: 20 - 30, 1: 20, 1: 30 - 200, 1: 30 - 190, 1: 30 - 180, 1: 30 - 170, 1: 30 - 160, 1: 30 - 150, 1: 30 - 140, 1: 30 - 130, 1: 30 - 120, 1: 30 - 110, 1: 30 - 100, 1: 30 - 90, 1: 30 - 80, 1: 30 - 70, 1: 30 - 60, 1: 30 - 50, 1: 30 - 40, 1: 30, 1: 40 - 200, 1: 40 - 190, 1: 40 - 180, 1: 40 - 170, 1: 40 - 160, 1: 40 - 150, 1: 40 - 140, 1: 40 - 130, 1: 40 - 120, 1: 40 - 110, 1: 40 - 100, 1: 40 - 90, 1: 40 - 80, 1: 40 - 70, 1: 40 - 60, 1: 40 - 50, 1: 40, 1: 50 - 200, 1: 50 - 190, 1: 50 - 180, 1: 50 - 170, 1: 50 - 160, 1: 50 - 150이다. 중량비가 1: 20 미만인 경우 다양한 상태 내지 조건에 놓이는 안구건조에 복합적인 효과를 기대할 수 없고, 1: 200 초과의 경우 점안제의 유효삼투압 (약 230~320 mOsmol/kg)을 유지할 수 없고, 투명 나노 에멀젼을 유지할 수 없다는 단점이 있다.
추가적으로, 상기 두 유효성분을 특정 중량% 범위에서 배합하였을 때 상승효과가 발휘되고 나아가 극대화되는바, 상기 안과용 조성물 총 중량 기준으로 사이클로스포린은 0.01 중량% 초과하여 포함될 수 있다. 그러나 0.1 중량% 미만으로 포함되는 것이 바람직하며, 사이클로스포린을 0.1 중량% 초과하여 사용하는 경우 작열감, 시야 혼탁 등의 부작용이 있다. 사이클로스포린은 상기 안과용 조성물 총 중량 기준으로 바람직하게 0.01 중량% 초과 0.05 중량% 이하, 0.01 중량% 초과 0.05 중량% 미만, 0.02 중량% 이상 0.05 중량% 이하, 0.02 중량% 이상 0.05 중량% 미만, 0.02 중량% 이상 0.05 중량% 이하, 0.01 중량% 초과 0.04 중량% 이하, 0.02 중량% 이상 0.04 중량% 이하, 0.01 중량% 초과 0.03 중량% 이하, 0.02 중량% 이상 0.03 중량% 이하, 또는 0.02 중량%이다.
또한, 상기 안과용 조성물 총 중량 기준으로 트레할로스는 0.5 중량% 이상으로 포함될 수 있다. 예컨대, 상기 안과용 조성물 총 중량 기준으로 트레할로스는0.5 중량% 이상, 0.6 중량% 이상, 0.7 중량% 이상, 0.8 중량% 이상, 0.9 중량% 이상, 1 중량% 이상, 1.1 중량% 이상, 1.2 중량% 이상, 1.3 중량% 이상, 1.4 중량% 이상, 1.5 중량% 이상, 1.6 중량% 이상, 1.7 중량% 이상, 1.8 중량% 이상, 1.9 중량% 이상, 2 중량% 이상, 2.1 중량% 이상, 2.2 중량% 이상, 2.3 중량% 이상, 2.4 중량% 이상, 2.5 중량% 이상, 2.6 중량% 이상, 2.7 중량% 이상, 2.8 중량% 이상, 2.9 중량% 이상, 3 중량% 이상, 3.1 중량% 이상, 3.2 중량% 이상, 3.3 중량% 이상, 3.4 중량% 이상, 3.5 중량% 이상, 3.6 중량% 이상, 3.7 중량% 이상, 3.8 중량% 이상, 3.9 중량% 이상, 4 중량% 이상, 4.1 중량% 이상, 4.2 중량% 이상, 4.3 중량% 이상, 4.4 중량% 이상, 4.5 중량% 이상, 4.6 중량% 이상, 4.7 중량% 이상, 4.8 중량% 이상, 4.8 중량% 이상, 4.9 중량% 이상, 5 중량% 이상, 7.5 중량% 이하, 0.5 - 7.5 중량%, 0.5 - 7 중량%, 0.5 - 6.5 중량%, 0.5 - 6 중량%, 0.5 - 5.5 중량%, 0.5 - 5 중량%, 0.5 - 4.5 중량%, 0.5 - 4 중량%, 0.5 - 3.5 중량%, 0.5 - 3 중량%, 0.6 - 7.5 중량%, 0.6 - 7 중량%, 0.6 - 6.5 중량%, 0.6 - 6 중량%, 0.6 - 5.5 중량%, 0.6 - 5 중량%, 0.6 - 4.5 중량%, 0.6 - 4 중량%, 0.6 - 3.5 중량%, 0.6 - 3 중량%, 0.7 - 7.5 중량%, 0.7 - 7 중량%, 0.7 - 6.5 중량%, 0.7 - 6 중량%, 0.7 - 5.5 중량%, 0.7 - 5 중량%, 0.7 - 4.5 중량%, 0.7 - 4 중량%, 0.7 - 3.5 중량%, 0.7 - 3 중량%, 0.8 - 7.5 중량%, 0.8 - 7 중량%, 0.8 - 6.5 중량%, 0.8 - 6 중량%, 0.8 - 5.5 중량%, 0.8 - 5 중량%, 0.8 - 4.5 중량%, 0.8 - 4 중량%, 0.8 - 3.5 중량%, 0.8 - 3 중량%, 0.9 - 7.5 중량%, 0.9 - 7 중량%, 0.9 - 6.5 중량%, 0.9 - 6 중량%, 0.9 - 5.5 중량%, 0.9 - 5 중량%, 0.9 - 4.5 중량%, 0.9 - 4 중량%, 0.9 - 3.5 중량%, 0.9 - 3 중량%, 1 - 7.5 중량%, 1 - 7 중량%, 1 - 6.5 중량%, 1 - 6 중량%, 1 - 5.5 중량%, 1 - 5 중량%, 1 - 4.5 중량%, 1 - 4 중량%, 1 - 3.5 중량%, 1 - 3 중량%로 포함될 수 있다. 트레할로스 0.5 중량% 미만으로 사용하면 다양한 상태 내지 조건에 놓이는 안구건조에 복합적인 효과를 기대할 수 없고, 트레할로스 7.5 중량% 초과로 사용하면 점안제의 유효삼투압(약 230~320 mOsmol/kg)을 유지할 수 없고, 투명 나노 에멀젼을 유지할 수 없다는 단점이 있다.
예컨대, 상기 안과용 조성물은 사이클로스포린 0.01 중량% 초과 0.1 중량% 미만 및 트레할로스 0.5 - 7.5 중량%를 포함할 수 있고, 사이클로스포린 0.01 중량% 초과 - 0.05 중량% 미만 및 트레할로스 0.5 - 5 중량%를 포함할 수 있으며, 사이클로스포린 0.01 중량% 초과 - 0.05 중량% 미만 및 트레할로스 0.5 - 3.5 중량%를 포함할 수 있으며, 사이클로스포린 0.02 중량% 이상 - 0.05 중량% 미만 및 트레할로스 0.5 - 5 중량%를 포함할 수 있으며, 사이클로스포린 0.02 중량% 이상 - 0.05 중량% 미만 및 트레할로스 0.5 - 3.5 중량%를 포함할 수 있으며, 사이클로스포린 0.02 중량% 이상 - 0.05 중량% 미만 및 트레할로스 1 - 3 중량%를 포함할 수 있으며, 사이클로스포린 0.02 중량% 및 트레할로스 1 - 3 중량%를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 안과용 조성물은 사이클로스포린 및 트레할로스의 상승작용을 위해 바람직하게 상술한 중량비 또는 중량% 범위, 혹은 중량비 및 중량% 범위 내로 사이클로스포린 및 트레할로스를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 용어 "상승작용"은 사이클로스포린 단독 또는 트레할로스 단독을 유효성분으로 하는 안과용 조성물과 비교해, 안과용 조성물에 조성물 전체 중량% 기준으로 동량%의 유효성분이 포함되어 있음을 전제로 하여, 사이클로스포린 단독 또는 트레할로스 단독 유효성분 함유 안과용 조성물에서 발휘되는 동일한 적응증에 대한 효과가 개선 또는 향상되거나, 사이클로스포린 단독 또는 트레할로스 단독 유효성분 함유 안과용 조성물에서 발휘되지 않는 적응증에 대해서 효과를 보이거나, 사이클로스포린 단독 또는 트레할로스 단독 유효성분 함유 안과용 조성물에서 문제되는 부작용 또는 단점이 해소되는 경우 등이 포함될 수 있다. 예컨대, 건조공기유발 안구건조 모델, 염증유발 안구건조 모델 및 방부제 유발 안구건조 모델에서 모두 사이클로스포린 단독 또는 트레할로스 단독 투여에 비해 현저히 상승되는 치료 효과, 각막손상율 감소, 눈물 분비량 정상화, 안염증 감소, 눈물의 질 향상, 안자극 (결막의 발적, 부종 및 배출물 증가 등)의 감소, 눈물막 유지, 윤활 및 보습 등의 효과 발휘, 뮤신(mucin) 분비를 담당하는 고블렛 세포(goblet cell)를 증가시키는 활성을 보여 뮤신(mucin) 분비량을 증가시키는 효과 등이 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, "사이클로스포린" 또는 "트레할로스"는 본 발명의 목적을 저해하지 않는 이상, 그 제조방법과 유래와는 관계없이 사용할 수 있다.
또한, 상기 사이클로스포린은 그 활성성분으로 사이클로스포린 A, 사이클로스포린 A 유도체, 사이클로스포린 B, 사이클로스포린 C, 사이클로스포린 D 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있으며, 바람직하게 사이클로스포린 A를 포함할 수 있다. 상기 트레할로스는 그 활성성분으로 세가지 광학 이성체, α, α-트레할로스, α, β-트레할로스, β, β-트레할로스 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 용어 "사이클로스포린" 또는 "트레할로스"는 이들의 약학적으로 허용 가능한 유도체를 포괄하여 정의되며, 약학적으로 허용 가능한 유도체는 사이클로스포린 또는 트레할로스와 동일한 생물학적 기능 및/또는 활성을 갖거나 제공하는 것으로 인식될 것이며, 본 발명의 목적을 저해하지 않는 이상, 사이클로스포린 또는 트레할로스의 프로드럭, 이들의 용매화물, 이들의 공결정 (co-crystal)이 포함될 수 있다.
상기 용어 "프로드럭"이란 투여 후 대사를 거쳐 소정 시간 내에 실험적으로 검출될 수 있는 양의 사이클로스포린 또는 트레할로스가 형성되는 것을 의미한다.
상기 용어 "용매화물"은 비공유 분자간 힘에 의해 결합된 화학 양론적 또는 비-화학 양론적 양의 용매를 추가로 포함하는 화합물을 의미한다. 용매가 물인 경우, 용매화물은 수화물이다.
상기 용어 "공결정"은 결정 격자 안에 하나 이상의 화합물을 포함하는 결정성 형태를 의미한다. 공결정은 비-이온성 상호 작용을 통하여 결정 격자 안에 함께 결합된 두 개 이상의 비-휘발성 화합물의 결정성 분자 복합체를 포함한다. 본 발명에 있어서, 공결정은 사이클로스포린 내지 트레할로스, 및 하나 이상의 추가적 비-휘발성 화합물 (하기 카운터-분자로 칭함)을 포함하는 결정성 분자 복합체인 약학적 공결정을 포함한다. 약학적 공결정에서 카운터-분자는 예컨대, 식품 첨가물, 방부제, 의약품 부형제, 또는 다른 APIs와 같은 비-독성 약학적으로 허용 가능한 분자일 수 있다. 일부 실시예들에서, 약학적 공결정은 API의 화학적 구조적 완전성을 저하시키지 않으면서, 의약품의 일부 물리학적 특성 (예컨대, 가용성, 용해속도, 생물학적 이용 가능성/안정성 등)을 향상시킨다.
이의 약학적으로 허용 가능한 유도체를 포함한 사이클로스포린 및 이의 약학적으로 허용 가능한 유도체를 포함한 트레할로스는 화학적 또는 효소적으로 당분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조할 수 있으며, 또는 시판되고 있는 상품을 구입하여 사용할 수도 있다.
본 발명에 따른 안과용 조성물은 유효성분으로 사이클로스포린 및 트레할로스를 혼합하여 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 안과용 조성물은 약학 조성물, 의약외품 조성물, 건강식품 조성물 등으로 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 안과용 조성물에는 약학적으로(또는 식품학적으로) 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제 등과 같은 첨가제가 포함될 수 있으며, 첨가제에서 고려해야 할 특성에는 사이클로스포린 및 트레할로스와의 상용성, 생체친화성, 가공온도 등이 포함되며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 안과용 조성물은 안과용 액제, 안연고, 주사액, 세안약 (eyewash) 등과 같은 비경구용 제제 또는 정제, 캡슐 및 과립 등과 같은 경구용 제제로 제조될 수 있고, 바람직한 투여형은 안과용 액제이고, 가장 바람직한 투여형은 점안액이다.
안과용 액제로 제조되는 경우, 안과용 액제로 사용되는 임의 투여 형태, 예컨대, 수성 안과용 액제, 수성 에멀젼 안과용 액제, 점성 안과용 액제 및 용해된 안과용 액제 등 같은 수성 안과용 액제; 또는 비수성 안과용 액제 및 비수성 에멀젼 안과용 액제와 같은 비수성 안과용 액제로 제공될 수 있다.
수성 에멀젼 안과용 액제로 제조되는 경우 본 발명의 목적을 해하지 않는 이상 당분야에 공지된 다양한 첨가제가 포함될 수 있으며, 예컨대 등장화제, 완충제, 안정화제, pH 조절제, 증점제, 방부제, 킬레이트제, 가용화제 및 용매 등이 포함될 수 있다. 완충제는 포스페이트 완충제, 보레이트 완충제, 시트레이트 완충제, 타르트레이트 완충제, 아세테이트 완충제 (예컨대, 아세트산 나트륨) 트로메타민 및 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 그에 한정되지 않는다. 바람직하게, 포스페이트 완충제를 사용할 수 있다. 등장화제는 소르비톨, 글루코스 에리스리톨 및 만니톨과 같은 당류, 글리세린, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜과 같은 다가 알콜, 및 염화나트륨과 같은 염으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 의해 한정되지 않는다. 방부제는 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 메틸 파라옥시벤조에이트 및 에틸 파라옥시벤조에이트와 같은 알킬 파라옥시벤조에이트, 벤질 알콜, 페네틸 알콜, 소르브산 및 그의 염, 티메로살, 폴리콰테르늄, 브롬화 벤조도데시늄, 옥시클로로복합체 및 클로로부탄올로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 안정화제는 시클로덱스트린 및 그의 유도체, 폴리 (비닐피롤리돈)와 같은 수용성 중합체, 및 폴리소르베이트 80 (트윈 80®), 폴리소르베이트 20, 티록사폴과 같은 계면활성제로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 이에 한정되지는 않는다. pH 조절제는 염산, 아세트산, 인산, 황산, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 모노에탄올아민, 암모니아수 및 수산화암모늄으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 증점제는 히드록시에틸셀룰로스, 히드록시프로필셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스 및 카르복시메틸셀룰로스, 폴리비닐알코올, 카보머, 포비돈, 폴록사머, 폴리카르보필 및 그의 염으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 킬레이팅제는 소듐 에데테이트, 시트르산나트륨 및 응축 인산나트륨으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 가용화제 또는 용매는 글리세린, DMSO, DMA, N-메틸피롤리돈, 에탄올, 벤질알콜, 이소프로필알콜, 다양한 분자량의 폴리에틸렌글리콜 또는 프로필렌 글리콜 등이 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 용매 내지 가용화제로 사용할 수 있는 성분들 간에는 일부 중복이 있을 수 있으며, 임의의 성분이 용매 또는 가용화제 중 하나로 사용될 수 있는 바, 임의의 성분이 제제 내에서 용매의 역할을 한다면 용매로 보고 용매의 역할을 하지 않는다면 가용화제로 볼 수 있다. 또는, 가용화제는 일부 변형에서 계면활성제일 수 있다. 다양한 종류의 계면활성제를 포함하는 계면활성제의 조합이 상용될 수 있다. 예컨대, 비이온성, 음이온성 (즉, 비누, 술포네이트), 양이온성 (즉, CTAB), 쯔위터이온성, 중합체성, 양쪽성 계면활성제가 사용될 수 있다. 예컨대, 사용될 수 있는 계면활성제는, 이하에 한정되는 것은 아니지만 10, 11, 12, 13, 또는 14 이상의 HLB를 가지는 것을 포함한다. 계면활성제의 예는, 수소화된 식물성 오일의 폴리옥시에틸렌 산물, 폴리에톡시레이티드 피마자유 또는 폴리에톡시레이티드 수소화 피마자유, 폴리옥실 피마자유 또는 이의 유도체, 폴리옥시에틸렌-소르비탄-지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 피마자유 유도체 등을 포함하나. 이에 한정되지 않는다. 구체적 실시예에 따르면, 본 발명의 안과용 조성물은 조성물의 총 중량 기준으로 사이클로스포린 0.01 중량% 초과 0.1 중량% 미만, 트레할로스 0.5 - 7.5 중량%, 가용화제 1 - 10 중량%, 용매 0.01 - 2 중량%, 잔량의 완충제 및 등장화제로 이루어질 수 있다.
수성 에멀젼 안과용 액제는 바람직하게 나노에멀젼 타입으로 제조할 수 있으며, 이 경우 본 발명의 목적을 해하지 않는 이상 당분야에 공지된 다양한 첨가제가 포함될 수 있으며, 예컨대 오일 및 계면활성제 등이 포함될 수 있다. 상기 오일은 프로필렌 글리콜 모노카프릴레이트 (propylene glycol monocaprylate), 프로필렌 글리콜 라우레이트 (propylene glycol laurate), 탄소수 8 내지 10의 미디움 체인 트리글리세라이드 (medium chain (C8～C10) triglycerides), 글리세릴-1,3-디올레이트 (glyceryl-1,3-dioleate), 글리세릴 모노올레이트 (glyceryl monooleate) 및 글리세릴 리놀레이트 (glyceryl linoleate)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있다. 상기 계면활성제는 올레오일 마크로골글리세라이드 (oleoyl macrogolglycerides), 리놀레오일 마크로골글리세라이드 (linoleoyl macrogolglycerides), 카프릴로카프로일 폴리옥시글리세라이드 (caprylocaproyl polyoxylglycerides), 폴리옥실 35 피마자유 (polyoxyl 35 castor oil), 폴리옥실 35 하이드로제네이트 피마자유 (polyoxyl 35 hydrogenated castor oil), 폴리옥실 40 하이드로제네이트 피마자유 (polyoxyl 40 hydrogenated castor oil), 폴리옥실 60 하이드로제네이트 피마자유 (polyoxyl 40 hydrogenated castor oil), 에틸렌 옥사이드와 12-히드록시스테린산의 축합 생성물 (condensation product of ethylene oxide with 12-hydroxystearic acid) 및 폴리소르베이트 80 (polysorbate 80, Croda사, 영국)으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있다.
가장 바람직하게, 수성 에멀젼 안과용 액제는 투명 나노에멀젼 타입 점안액으로 제조될 수 있으며, 이를 제조하기 위해, 예컨대 한국특허 등록번호 제10-0938500호를 참조할 수 있으나, 다만 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 따른 안과용 조성물은 안과 질환의 개선용, 예방용 내지 치료용으로 사용될 수 있으며, 바람직하게 안구건조에 따른 장애의 개선, 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
상기 "안구건조에 따른 장애"에는 건조 각막 결막염, 각결막 상피 장애, 누액 분비 감소증, 스티븐스-죤슨 증후군, 안구건조 증후군, 쇼그랜 증후군, 눈물결핍증, 안구충혈, 눈물막 불안정, 또는 안구 부종; 알레르기성 결막염, 바이러스성 결막염, 또는 백내장 수술 후의 안구건조; 및 콘텍트 렌즈 착용-관련 안구건조 또는 VDT 작업-관련 안구건조 등이 포함될 수 있다.
또한, 상기 "각결막 상피 장애"에는 건성안, 각막상피결손, 결막상피결손, 각막 상피 침식, 각막의 두께 감소, 각막 침윤, 각막 천공 또는 각막 상피 탈락; 각막궤양, 각막염, 결막염, 점상표층 각막증, 건성 각결막염, 상윤부 각결막염, 사상 각막염, 각막 궤양 및 각결막 상피의 감염성 안질환; 안구 내 외상, 미세수술 또는 하드콘텍트렌즈 착용 관련 각결막 상피 장애 등이 포함될 수 있다.
포유류, 특히 사람의 치료법 및/또는 예방법에 있어서, 본 발명에 따른 안과용 조성물의 투여량은 의료업 종사자나 관련 통상의 기술자에 의해 통상적으로 결정될 수 있을 것이다. 예컨대, 본 발명에 따른 조성물을 성인 안구건조 환자에게 점안액으로 사용하는 경우, 사이클로스포린 및 트레할로스를 유효성분으로 포함하는 안과용 조성물의 바람직한 투여량은, 예컨대 0.02중량% 사이클로스포린 및 1 - 3 중량% 트레할로스를 포함하는 점안액을 1회당 1~4 방울(약 0.025~0.1 mL)의 투여량으로 1일당 1~10회까지 투여할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 의료업 종사자나 관련 통상의 기술자는 치료할 환자의 나이, 무게, 성별 및 반응뿐만 아니라, 치료될 상황 등에 따라 가장 적합한 실제 투여량을 결정할 수 있다.
본 발명에 따른 안과용 조성물은 멸균용기 내 충진하여 제공할 수 있으며, 이의 사용에 관한 지시문을 포함하여 제공될 수 있으며, 상기 지시문은 상기 안과용 조성물이 충진된 용기 또는 상기 용기를 포장한 제2의 용기에 물리적으로 부착하거나 또는 제2의 용기 내부에 함께 포장될 수 있다.
사이클로스포린과 트레할로스, 두 성분을 일정한 비율 및/또는 일정한 함량으로 배합하여 함유한 본 발명에 따른 안과용 조성물은 건조공기 유발, 염증 유발 및 방부제 유발 등 다양한 경로에 의해 발생할 수 있고 다양한 상태 내지 조건에 놓이는 안구건조에 복합적으로 우수한 효과를 보인다. 보다 구체적으로, 사이클로스포린의 사용량을 줄이면서도 동등하거나 그 이상의 효과를 발휘한다. 뿐만 아니라, 사이클로스포린 단독 또는 트레할로스 단독 투여에 비해 현저히 상승된 치료 효과를 보이고, 각막손상율 감소, 눈물 분비량 정상화, 안염증 감소, 눈물의 질 향상, 안자극 (결막의 발적, 부종 및 배출물 증가 등)의 감소, 눈물막 유지, 윤활 및 보습 등의 효과를 가지며, 특히 뮤신(mucin) 분비를 담당하는 고블렛 세포(goblet cell)를 증가시키는 활성을 보여 뮤신(mucin) 분비량을 증가시키는 효과가 있다.
도 1은 건조공기유발 안구건조 모델에서 복합제를 처리한 결과 나타나는 각막손상 억제율 변화를 도시한 것이다.
도 2는 Concanavalin A 유발 안구건조 모델에 복합제를 처리한 결과 나타나는 눈물분비 억제율 변화를 도시한 것이다.
도 3은 Concanavalin A 유발 안구건조 모델에 복합제를 처리한 결과 나타나는 각막염증 개선율 변화를 도시한 것이다.
도 4는 Benzalkonium chloride 유발 안구건조 모델에서 복합제를 처리한 결과 나타나는 쉬르머 검사 변화량 (상단)과 TBUT 변화량 (하단)을 도시한 것이다.
도 5은 Benzalkonium chloride 유발 안구건조 모델에서 복합제를 처리한 결과 나타나는 goblet cell 수를 도시한 것이다.
도 6은 Benzalkonium chloride 유발 안구건조 모델에서 복합제를 처리한 결과 나타나는 염증 변화량 (상단)과 안자극 정도 (하단)를 도시한 것이다.
도 7은 안구건조 모델에서 복합제를 처리한 결과 나타나는 세포 생존율을 도시한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예의 기재 범위 내로 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
<실시예 1. 시험물질의 제조>
하기 표 1 (다양한 농도의 사이클로스포린 A 및 트레할로스를 포함하는 조성물)의 A 내지 J의 각 조성비율에 따라 사이클로스포린을 가용화제인 폴리옥실 35 피마자유에 혼합하여 가용화 시켰다. pH를 7.2로 맞춘 인산염 완충액에 글리세린을 각 조성에 따라 혼합한 후 이 가용화시킨 사이클로스포린 용액을 분산시켜 에멀젼을 제조하였다. 제조된 사이클로스포린 에멀젼 용액에 트레할로스 및 등장화제를 사용하여 삼투압을 약 300 mOsmol/kg로 조정하였다.
Figure PCTKR2015011048-appb-T000001
< 시험예 1. 건조공기 유발 안구건조 모델에서의 치료 효과>
시험물질
상기에 기술한 실시예 1에 따라 제조한 조성물 A, C, D, E, F, I, J를 시험물질로 실험에 사용하였다.
실험동물
실험동물은 대한바이오링크(충북 음성)로부터 6주령 수컷 Sprague-Dawley (SD) 랫트를 공급받아 랫트용 케이지에 4마리씩 수용하였다. 동물은 약 1주일간 순화기간을 거친 후 실험에 사용하였다. 동물실험실의 환경은 온도 23±2℃, 상대습도 55±10%, 환기횟수 12회/시간, 조명주기 12시간, 조도 150 - 300 Lux로 조절되었다. 실험동물용 펠렛형 고형사료인 Purina Rat Chow® 바이오피아(경기도 군포)로부터 공급받아 급여하였으며, 음수는 멸균정제수를 자유롭게 섭취하도록 하였다.
안구건조의 유발 및 시험물질의 처치
실험동물을 송풍기 바람에 노출시키기 30분 전에 20 ㎕의 시험물질을 양쪽 눈에 각각 점안하였다. 점안 30분 경과 후 눈물분비를 억제하기 위하여 20 mg/kg의 atropine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 복강 내로 투여하고, 동물의 일정한 자세유지 및 눈의 깜빡임 방지를 위해 Zoletil® (Virbac Korea, Seoul, Korea)을 근육 내로 주사하여 마취시켰다. 마취된 동물을 바람에 양쪽 안구가 정면으로 노출되도록 송풍기 앞에 고정시키되, 눈이 상대습도 25-35%의 공기에 풍속 2 m/sec로 노출되도록 거리를 조절하였다. 건조공기 노출시점(0분)부터 20분 간격으로 시험물질을 3시간 동안 총 10회 반복 점안하되, 점안 후 물질이 안구에 고르게 퍼지도록 눈꺼풀을 약 10초간 잠시 덮었다가 안구가 공기에 노출되도록 하였다. 실험시간 동안 실험동물의 자세가 흐트러지거나 눈을 감지 않도록 관찰하며 수시로 자세를 보정해 주었다.
각막 손상 정도의 측정
각막의 손상정도는 “Kim et al., (2010) Comparative effectiveness of distilled water and isotonic saline in a rat model of dry eye. Journal of Biomedical Research 11(4):211-218”의 방법에 따라 평가하였다. 안구건조 유발 및 시험물질을 점안한 동물의 결막낭에 평형 생리 식염수(balanced sodium solution)에 1%로 제조한 5 ㎕의 플루오레세인 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 점안하고 1시간 동안 반창고를 이용하여 눈을 감겨두었다. 투과하지 않은 여분의 염료(dye)를 식염수로 씻어낸 후 안구를 적출하였다. 적출한 안구에 대해 tungsten lamp 아래에서 각막에 침투된 플루오레세인의 녹색 형광 침투 영역 (area)을 관찰하고 사진촬영하였다. 촬영한 사진을 Image J 1.38x프로그램으로 분석하여 플루오레세인의 침투영역을 수치화하였다. 각막 안으로 투과된 플루오레세인을 정량하기 위해 적출한 각막을 potassium buffered saline (1 ml)에 침적하여 24시간 동안 용출시킨 후 형광광도계를 이용하여 excitation 485 nm, emission 538 nm에서 형광을 측정하여 녹색형광 발광 정도 (intensity)를 평가하였다. 플루오레세인의 각막침투 및 발광정도가 높을 경우 각막의 방어벽 기능이 소실되는 것을 의미하기 때문에 침투 및 발광정도가 낮을수록 시험물질의 효과가 높은 것으로 판정하였다.
병리조직학적 검사
시험종료 후 모든 실험동물은 이산화탄소 가스하에서 질식시켜 살처분하였다. 적출한 안구는 Davidson 용액에서 7~24시간 고정시킨 후 10% 중성 formalin으로 24시간 이상 고정하여 조직절편을 제작하여 hematoxylin-eosin염색한 후 x100 시야의 광학현미경하에서 각막의 상피손상 및 각막의 두께를 측정하였다. 부검시 적출한 결막조직은 10% 중성 formalin 용액에 고정한 후 조직절편을 제작하여, Periodic acid-Schiff 염색 (이하, PAS 염색)한 후 x100 시야의 광학현미경 하에서 mucin-like glycoproteins 함유 또는 방출한 goblet cell의 수를 세었다.
결과
본 실험 조건에 따르면, 에어컨이나 건조실내공기에 의한 안구건조와 유사한 원리에 의해 안구건조가 유발된다. 대조군으로는 실시예 1에 따라 제조한 조성물 A 처리군을 사용하였다. 형광염색된 각막의 침투 영역 (area) (%) 및 발광 정도 (intensity) (%)는 대조군의 형광 염색된 각막의 침투 영역 (area)(%) 및 발광 정도 (intensity)(%)를 각각 100%로 하여 상대적인 값을 산출하였다.
침투 영역 (area)(%) 또는 발광 정도 (intensity)(%)= [1-(대조군-시험군)/대조군]*100
각막손상 억제율(%)은 상기의 각막 침투 영역(area)(%) 및 발광 정도(intensity)(%) 평균치의 합을 산출하여 다음과 같은 계산식에 의하여 계산하였다.
각막손상 억제율 (%)=[(대조군-시험군)/대조군]*100
*3시간 동안의 건조공기에 의한 안구건조 유발은 각막 표면의 형광강도를 크게 증가시켰으며, 형광물질의 침투도 깊게 나타났다. 그 결과를 도 1에 도시하였으며, 본 발명에 따른 복합제에 해당하는 조성물 J의 각막손상 억제율 (%)은 약 40%에 달함을 확인할 수 있었다. 이에 반해, 유효성분으로 사이클로스포린 A를 단독 포함하는 조성물 (조성물 C 및 D)에서는 각막손상 치료에 효과가 거의 없었으며, 조성물 D의 경우 오히려 각막손상이 악화되는 효과가 나타남을 확인할 수 있었다. 또한, 유효성분으로 트레할로스를 단독 포함하는 조성물 (조성물 E, F)에서는 각막 손상에 유효한 효과를 나타내기는 하였으나, 본 발명에 따른 복합제에 해당하는 조성물 J에 비해서는 훨씬 낮은 각막손상 예방 효과를 나타냈다. 뿐만 아니라, 사이클로스포린 A와 트레할로스를 모두 포함하되, 사이클로스포린 A: 트레할로스를 1:300의 중량비로 포함하는 조성물 I의 경우 트레할로스 단독 포함 조성물에 비해서도 낮은 각막손상 예방 효과를 나타냈다. 또한, 건조공기에 의한 안구건조 에서 실시예 1에 따라 제조한 시험물질을 처리한 결과, 본 발명의 복합제 (조성물 J) 처리군에서 mucin-like glycoproteins 함유 또는 방출한 goblet cell의 수가 현저히 증가함을 알 수 있었다.
< 시험예 2. Concanavalin A 유발 안구건조 모델에서의 치료 효과>
시험물질
상기에 기술한 실시예 1에 따라 제조한 조성물 A, B, C, D, E, F, G, H, J를 시험물질로 실험에 사용하였다.
실험동물
실험동물은 ㈜샘타코 (경기 오산)로부터 1.8-2.0 kg의 암컷 New Zealand White (NZW) 토끼를 공급받아 토끼용 케이지에 1마리씩 수용하였다. 동물은 약 1주일간 순화기간을 거친 후 실험에 사용하였다.
동물실험실의 환경은 온도 23±2℃, 상대습도 55±10%, 환기횟수 12회/시간, 조명주기 12시간, 조도 150 - 300 Lux로 조절되었다. 토끼용 펠렛형 고형사료인 NIH#32M을 ㈜샘타코로부터 공급받아 급여하였으며, 음수는 멸균정제수를 자유롭게 섭취하도록 하였다. 토끼의 양쪽 안구는 시험개시 24시간 전에 미리 안검사를 실시하여 안구손상 등 각막의 손상이 없는 동물만을 사용하였다.
Concanavalin A 및 시험물질의 처치
실험 동물을 대상으로 Zoletil® 50 mg/kg과 xylazine 6 mg/kg을 근육 내로 주사하여 마취시킨 뒤, 생리식염수에 10 mg/ml 농도로 만든 Concanavalin A (이하, Con A)를 양쪽 상안검의 주눈물샘과 덧눈물샘에 인슐린주사기 (31-gauge needle)를 이용하여 각각 50 ㎕씩 주입하였다. Con A 주입 24시간 후에 각각의 시험물질을 하루 4회씩 3일간 점안하되, 점안 후 물질이 안구에 고르게 퍼지도록 눈꺼풀을 약 10초간 잠시 덮도록 하였다. 안구는 매일 1회씩 일반증상 관찰 및 촬영을 시행하였다.
눈물 분비량의 측정 ( Schirmer test)
*눈물 분비량 개선을 평가하기 위해 cobalt chloride paper (Schirmer paper)의 한 쪽 끝을 외안각 하안검에 대고 30초간 적셔져 내려오게 하였다. 눈물 분비량이 감소할 경우 안구건조가 촉진되기 때문에 분비량이 많을수록 시험물질의 효과가 큰 것으로 판정하였다. 실시예 1에 따라 제조한 조성물 A 처리군을 대조군으로 사용하였다.
눈물분비 억제율 (%)=[1-(시험군-대조군)/대조군]*100
각막염색 및 염증정도의 판정
각막염색 및 염증정도의 판정은 “Pauly et al.,(2007) New tools for the evaluation of toxic ocular surface changes in the rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science.”의 방법에 따라 실시하였다.
시험물질의 점안 개시 후 4일째에 각막의 장해 부분을 플루오레세인으로 염색하여 각막의 상부, 중간부 및 하부의 각각에 대해서 플루오레세인에 의한 염색의 정도를 하기의 기준에 따라 점수 판정하고, 상기 각부의 점수 합계의 평균치를 구하였다.
(판정 기준)
0 : 염색되어 있지 않다.
1 : 염색이 성기며, 각 점상의 염색 부분은 떨어져 있다.
2 : 염색이 중간 정도이며, 점상의 염색 부분의 일부가 인접되어 있다.
3 : 염색이 조밀하며, 각 점상의 염색 부분은 인접되어 있다.
실시예 1에 따라 제조한 조성물 A 처리군을 대조군으로 사용하였다. 상기 판정기준에 따라 구한 각부 (각막의 상부, 중간부 및 하부)의 점수 합계의 평균치를 하기 식에 대입하여 각막염증 개선율(%)을 산출하였다.
각막염증 개선율 (%)=(대조군-시험군)/대조군*100
병리조직학적 검사
시험물질의 투여 10일째에 안구건조의 평가 및 안자극성의 평가를 수행한 다음, 이산화탄소 가스하에서 질식시켜 살처분하였다. 부검시 적출한 각막 및 결막조직은 10% 중성 포르말린 (formalin) 용액에 고정한 후 조직절편을 제작하여, PAS 염색한 후 x100 시야의 광학현미경 하에서 mucin-like glycoproteins 함유 또는 방출한 goblet cell의 수를 세었다.
결과
Con A는 염증유발물질로, 토끼의 눈물샘에 Con A를 투여 하면, 염증에 의해 눈물분비량 감소, 각막손상, 눈물샘내의 염증 등의 안염증이 유발된다. Con A 유발 안염증에서 실시예 1에 따라 제조한 시험물질을 처리한 결과, 눈물분비 억제율 (%) 및 각막염증 개선율 (%)는 각각 도 2 및 도 3에 도시하였다.
사이클로스포린 단독 처리군 및 트레할로스 단독 처리군(조성물 B, C, D, E, F)에 비해 복합제 투여군 (조성물 G, H, J)에서 유의적으로 눈물분비가 증가함을 확인할 수 있었다. 건조공기 유발 안구건조 모델에서와는 달리 트레할로스 단독 처리군 (조성물 E, F)의 경우 안염증에 의한 눈물량 감소를 억제하지 못하였으며, 각막염증 개선에 전혀 효과가 없었다. 또한, 사이클로스포린 단독 처리군 (조성물 B, C, D)의 경우 각막염증 개선 효과는 있으나, 눈물량 감소는 억제하지 못했다. 이에 반해, 본 발명의 복합제 (조성물 G, H, J) 처리 결과, 염증 개선에 있어서도 상승효과가 있음을 알 수 있었다.
또한, Con A 유발 안염증에서 실시예 1에 따라 제조한 시험물질을 처리한 결과, 본 발명의 복합제 (조성물 G, H, J) 처리군에서 mucin-like glycoproteins 함유 또는 방출한 goblet cell의 수가 현저히 증가함을 알 수 있었다.
< 시험예 3. Benzalkonium chloride 유발 안구건조 모델에서의 치료 효과>
시험물질
상기에 기술한 실시예 1에 따라 제조한 조성물 A, D, J를 시험물질로 실험에 사용하였다.
실험동물
실험동물은 ㈜샘타코 (경기 오산)로부터 1.8-2.0 kg의 암컷 New Zealand White (NZW) 토끼를 공급받아 토끼용 케이지에 1마리씩 수용하였다. 동물은 약 1주일간 순화기간을 거친 후 실험에 사용하였다.
동물실험실의 환경은 온도 23±2 ℃, 상대습도 55±10%, 환기횟수 12회/시간, 조명주기 12시간, 조도 150 - 300 Lux로 조절되었다. 토끼용 펠렛형 고형사료인 NIH#32M을 ㈜샘타코로부터 공급받아 급여하였으며, 음수는 멸균정제수를 자유롭게 섭취하도록 하였다. 토끼의 양쪽 안구는 시험개시 24시간 전에 미리 안검사를 실시하여 안구손상 등 각막의 손상이 없는 동물만을 사용하였다.
Benzalkonium chloride 및 시험물질의 처치
안구건조를 유발시키기 위해 1일 2회씩 0.1% Benzalkonium chloride (이하, BAK) 100 ㎕을 결막낭내로 15일간 투여 (오전 9시 및 오후 9시)하였다.
BAK 투여 5일째에 Tear break-up time (이하, TBUT), 눈물 분비량, 형광염색, 자극도를 검사하여 안구건조의 유발여부를 확인하여, 안구건조가 유발된 토끼를 무작위 배정법에 의해 군분리 하였다. 시험물질은 BAK 투여 5일째부터 1일 2회 (오전 9시 및 오후 9시) 10일간 투여하였다.
안구는 매일 1회씩 일반증상 및 안구의 이상반응의 관찰을 실시하였다.
안구건조의 평가
안구건조의 평가 (TBUT, 눈물분비량, 형광염색)는 시험물질 투여 전 (BAK 투여 5일째), 시험물질 투여 후 5일 후 (BAK 투여 10일째에 해당함) 및 10일 후 (BAK 투여 15일째에 해당함)에 시행하였다.
TBUT는 0.1%로 제조한 5 ㎕의 플루오레세인을 결막낭에 점안한 뒤에 플루오레세인에 의한 형광층이 깨지기 시작하는 시간을 세극등현미경하에서 측정하였다. TBUT는 3회 측정 후 평균을 구하였다.
눈물 분비량은 cobalt chloride paper (Schirmer paper)의 한 쪽 끝을 외안각 하안검에 대고 30초간 적셔져 내려오게 한 다음 그 길이를 측정하였다.
형광염색은 각막의 손상 정도를 각막의 상부, 중간부 및 하부의 각각에 대해서 플루오레세인에 의한 염색의 정도를 하기의 기준에 따라 점수 판정하고, 상기 각부의 점수 합계의 평균치로부터 각막손상 정도를 산출하였다.
(판정 기준)
0 : 염색되어 있지 않다.
1 : 염색이 성기며, 각 점상의 염색 부분은 떨어져 있다.
2 : 염색이 중간 정도이며, 점상의 염색 부분의 일부가 인접되어 있다.
3 : 염색이 조밀하며, 각 점상의 염색 부분은 인접되어 있다.
안자극성의 평가
시험물질 투여에 의한 안구병변에 대한 평가는 다음과 같이 결막의 발적, 부종 및 배출물 정도를 측정하였으며, 시험물질 투여전 (BAK 투여 5일째), 시험물질 투여 5일 및 10일 후에 시행하였다. 하기 판정기준에 따라 안자극 결과 (발적, 결막 부종 및 배출물)를 점수화하고 이들의 평균치를 이용해 안자극도 (%)를 산출하였다. 안자극도 (%)는 조성물 A의 평균 안자극 점수를 100%로 하여 안자극도 (%)를 산출하였다.
안자극도 (%) = (조성물 A의 자극도-시험물질의 자극도)/조성물 A의 자극도*100
- 발적 (안검결막 및 안구결막에 한함)
0 : 혈관은 정상임
1 : 몇몇 혈관은 명확히 충혈소견을 보임
2 : 넓은 심홍색 색조, 각각의 혈관은 쉽게 관찰 안됨
3 : 엷은 선홍색임
- 결막 부종
0 : 부풀지 않음
1 : 정상보다 약간 종창 (순막 포함)됨
2 : 안검의 부분적 외전을 동반한 현저한 종창됨
3: 눈이 반쯤 감길 정도의 안검의 종창됨
4: 눈이 반 이상 감길 정도의 안검의 종창됨
- 배출물
0 : 배출물 없음
1 : 약간의 배출물 (내부 눈꼬리에서 관찰되는 작은 양 제외) 있음
2 : 속눈썹과 눈꺼풀을 적시는 배출물 있음
3 : 눈 주위의 상당 부위와 속눈썹과 눈꺼풀을 적시는 배출물 있음
병리조직학적 검사
시험물질의 투여 10일째에 안구건조의 평가 및 안자극성의 평가를 수행한 다음, 이산화탄소 가스하에서 질식시켜 살처분하였다. 부검 시 적출한 각막 및 결막조직은 10% 중성 formalin 용액에 고정한 후 조직절편을 제작하여, PAS염색한 후 x100 시야의 광학현미경 하에서 mucin-like glycoproteins 함유 또는 방출한 goblet cell을 관찰하였다.
결과
BAK은 방부제로 널리 사용되는 물질로, 액상점안제의 방부제로 사용되고 있으나, 과량으로 점안처리할 경우 안구건조를 유발하는 것으로 알려져 있는 물질이다. Con A 및 건조공기 유발 안구건조모델과는 다른 작용기전에 의해 안구건조가 유발되며, 상대적으로 오랜 시간 동안 병변이 발생 진행되는 특징이 있다. 다른 모델과는 달리 증상이 진행될수록 눈물량의 증가나 mucin-like glycoprotein의 분비감소에 의한 눈물막의 불안정 및 조기파열을 야기하고, 안구표면의 복합적인 요인에 의해 각막 표면의 잠재적인 손상을 동반하여 안구건조를 촉진시킨다. 복합제 처리군 (조성물 J)은 사이클로스포린 A 단독 처리군 (조성물 D)에 비해 BAK에 의한 과도한 눈물분비를 억제하고 (도 4의 상단), 눈물막의 파괴 시간의 단축을 억제함을 알 수 있었다. TBUT의 단축은 눈물 내 mucin 성분과 눈물분비량의 감소에 의한 것으로 잘 알려져 있다 (도 4의 하단). 즉, 본 시험에서 복합제의 처리는 눈물량의 과도한 증가 억제를 통한 눈물삼투압의 유지, 뮤신분비량 증가 (도 5)가 TBUT의 증가를 유도하고 (도 4의 하단), 결과적으로 눈물의 질을 증가시킨 것으로 예상된다.
또한, 형광염색에 의해 각막의 손상 정도를 살펴본 결과, 복합제 처리군 (조성물 J)은 사이클로스포린 A 단독 처리군 (조성물 D)에 비해 각막 손상 치유에도 월등히 효과적임을 알 수 있었다 (도 6의 상단).
또한, 복합제는 BAK 처리에 의한 염증을 감소시켰으며, BAK에 의해 나타나는 안자극 (결막의 충혈 및 부종, 배출물 증가)을 감소시키는 효과가 있었다 (도 6의 하단).
< 실시예 2 및 시험예 4. 안구건조 모델에서 각막상피세포에 대한 효과>
시험물질
상기에 기술한 실시예 1에 따라 제조한 조성물 A, D, E, F, G, H, I, J를 시험물질로 실험에 사용하였다. 이외에 사이클로스포린 0.05%와 트레할로스 1% 또는 3%가 포함된 조성물을 실시예 1에 따라 제조하여 실험에 사용하였다.
세포배양과 처치
각막상피세포는 37°C 배양기에서 배양하였으며, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, GibcoBRL, USA)에 10% fetal bovine serum, epidermal growth factor, antibiotics를 첨가한 세포배양액을 2~3일 간격으로 교체하여 세포가 confluent growth 되었을 때 배양액을 완전히 제거한 후 phosphate buffered saline (PBS)으로 1회 세척하고, 0.25% trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 분리하여 시험에 사용하였다.
세포 생존율 (cell viability) 측정
건조환경하에서의 각막상피세포의 세포생존율을 평가하기 위해 각막상피세포에 PBS로 1회 세척한 다음 10분간 시험물질을 접촉시킨 후 약물을 제거하여 건조환경하에 각막상피세포를 15분간 방치하였다. 약물처리 후 18~24시간 정도 배양한 다음 MTT법으로 세포의 생존율을 구하였다. 세포의 생존율(%)=각 well의 흡광도/대조군 well의 흡광도×100으로 나타내었으며, 각 농도별로 3회 실시하였다.
시험결과
모든 시험물질을 각각 각막상피세포에 10분간 노출시킨 후, 건조환경하에서 15분간 노출시켰다.
그 결과, 사이클로스포린과 트레할로스를 병용하여 처리한 경우 각막세포생존율은 트레할로스 단독 처리구 및 사이클로스포린 단독 처리구에 비해 생존율이 우수한 결과를 나타내었고, 사이클로스포린 농도에 따라 증가하는 일정한 경향성을 나타냈다. (p<0.05)

Claims (11)

  1. 사이클로스포린 및 트레할로스를 유효성분으로 포함하며, 상기 사이클로스포린 : 트레할로스의 중량비가 1: 20 - 200이고, 전체 조성물 대비 사이클로스포린 0.01 중량% 초과 - 1 중량% 미만 및 트레할로스 0.5 - 7.5 중량%로 포함된 것을 특징으로 하는 안과용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 사이클로스포린 0.02 - 0.05 중량% 및 트레할로스 1 - 3 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 안과용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 사이클로스포린 : 트레할로스의 중량비가 1: 50 - 150인 것을 특징으로 하는 안과용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 안과용 조성물은 안구건조에 따른 장애의 개선, 치료 또는 예방을 위한 것을 특징으로 하는 안과용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 안구건조에 따른 장애는 건조 각막 결막염, 각결막 상피 장애, 누액 분비 감소증, 스티븐스-죤슨 증후군, 안구건조 증후군, 쇼그랜 증후군, 눈물결핍증, 안구충혈, 눈물막 불안정, 또는 안구 부종; 알레르기성 결막염, 바이러스성 결막염, 또는 백내장 수술 후의 안구건조; 및 콘텍트 렌즈 착용-관련 안구건조 또는 VDT 작업-관련 안구건조로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 안과용 조성물
  6. 제5항에 있어서, 상기 각결막 상피 장애는 건성안, 각막상피결손, 결막상피결손, 각막 상피 침식, 각막의 두께 감소, 각막 침윤, 각막 천공 또는 각막 상피 탈락; 각막궤양, 각막염, 결막염, 점상표층 각막증, 건성 각결막염, 상윤부 각결막염, 사상 각막염, 각막 궤양 및 각결막 상피의 감염성 안질환; 안구내 외상, 미세수술 또는 하드콘텍트렌즈 착용 관련 각결막 상피 장애로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 안과용 조성물
  7. 제1항에 있어서, 상기 안과용 조성물의 제형은 점안액인 것을 특징으로 하는 안과용 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 안과용 조성물은 투명 나노에멀전 타입의 점안액인 것을 특징으로 하는 안과용 조성물.
  9. 사이클로스포린 및 트레할로스를 유효성분으로 포함하는 안구건조에 따른 장애 개선, 치료 또는 예방을 위한 안과용 조성물.
  10. 약학적으로 유효한 양의 사이클로스포린 및 트레할로스를 포함하는 안과용 조성물을 포유류에게 투여하여 안구건조에 따른 장애를 예방, 개선 또는 치료하는 방법.
  11. 안구건조에 따른 장애를 예방, 개선 또는 치료하기 위한 안과용 조성물을 제조하기 위한 사이클로스포린 및 트레할로스의 용도.
PCT/KR2015/011048 2014-10-17 2015-10-19 사이클로스포린 및 트레할로스를 포함하는 안과용 조성물 WO2016060532A1 (ko)

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