WO2013172628A1 - 가수분해된 발효 폐기물을 이용한 바이오 산물의 생산 방법 - Google Patents

가수분해된 발효 폐기물을 이용한 바이오 산물의 생산 방법 Download PDF

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이율리아
최기욱
문세권
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지에스칼텍스(주)
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a bioproduct using hydrolyzed fermentation waste.
  • the medium is generally a synthetic medium containing only chemically identified ingredients such as inorganic salts, amino acids, vitamins, etc., and all ingredients necessary for microbial growth although the ingredients are not clearly identified. It is divided into a complex medium containing known peptone, corn steep liquor, yeast extract and the like.
  • Complex nutrients include peptone, corn steep liquor and yeast extract, which produce various substances required for the food industry such as organic acids, amino acids and nucleic acids through microbial fermentation. Some are used in commercial processes.
  • peptone In the case of peptone, there is an excessive amount of nutrients necessary for microbial growth through microbial fermentation and production of the target metabolite, but it is relatively expensive to use peptone for biofuel and bioproduct production through microbial fermentation.
  • corn steep liquor (CSL, corn steep liquor) has the advantage of low price, but the sulfur sulphate is used in the processing and dipping process of corn, so that the sulfur sulphate is included.
  • sulfurous acid can inhibit the growth of microorganisms and the production of the desired metabolites through microbial fermentation.
  • corn steep liquor should be added to the medium in greater amounts than peptone or yeast extract because of the relatively lack of nutrients available to microorganisms compared to peptone or yeast extract.
  • yeast extract is generally made by using Saccharomyces cerevisiae, a kind of yeast used in the manufacture of beverage ethanol and bakery, including soju, beer, not only to promote microbial growth but also to increase the productivity of the target metabolite. Useful for However, yeast extract is also expensive because it is made by extracting the yeast itself.
  • the inventors of the present invention while researching a method for producing bio products at high efficiency and low cost, when producing biofuels using microbial fermentation and using the remaining fermentation wastes, not only can a large amount of fermentation wastes be recycled.
  • the productivity of the product was also found to be high.
  • the present inventors further hydrolyzed the microorganisms in the fermentation product after producing the biofuel and before separating and obtaining the biofuel, the nutrients in the fermentation waste remaining after producing the biofuel further increased the productivity of the bioproduct. It was found to be much higher and completed the present invention.
  • the present invention provides a method for producing a bioproduct using a hydrolyzed fermentation waste.
  • bio products can be produced with high productivity and low cost.
  • Figure 1 is a schematic of the bioproduct production method of the present invention using a hydrolyzed fermentation waste compared to the production method without a hydrolysis process.
  • Figure 2 shows the degree of hydrolysis of the fermentation waste according to the hydrolysis temperature
  • Figure 3 shows the degree of hydrolysis of the fermentation waste according to hydrolysis pH
  • Figure 4 shows the degree of hydrolysis of the fermentation waste with hydrolysis time
  • FIG. 5 is a graph showing fermentation profiles of glucose consumption and 2,3-butanediol production when using hydrolyzed fermentation wastes or non-hydrolyzed fermentation wastes.
  • FIG. 6 shows 2,3-butanediol productivity when using hydrolyzed fermentation wastes or non-hydrolyzed fermentation wastes.
  • FIG. 7 is a graph showing the fermentation profile of glucose consumption and lactic acid production when using hydrolyzed fermentation wastes or non-hydrolyzed fermentation wastes.
  • It relates to a method of producing a bio-product comprising inoculating a second microorganism in the fermentation waste (FIG. 1).
  • the first microorganism of the present invention is a microorganism that produces bioalcohol from biomass.
  • the first microorganism of the present invention may be wild type or may be a mutant or recombinant microorganism.
  • the first microorganism is the same or different microorganism as the second microorganism.
  • the first microorganism of the present invention only needs to be able to produce bioalcohol from biomass, and the kind is not particularly limited, but it is preferable to use yeast, that is, Saccharomyces cerevisiae.
  • the first microorganism may also use two or more microorganisms simultaneously or sequentially.
  • Hydrolysis of the first microorganism is to hydrolyze, ie, lyse, the first microorganism to release nutrients such as proteins and amino acids in the microorganism into an aqueous solution, that is, a medium.
  • aqueous solution that is, a medium.
  • the protein in the microorganism is decomposed into amino acids, thereby increasing the amino acid content in the fermentation waste, and these amino acids are used to grow the second microorganism in a later process and produce a bio product. It is used as an important nutritional ingredient.
  • the hydrolysis may be performed by adding a hydrolase to the medium, or may be performed by autohydrolysis of the first microorganism. However, it is much more cost effective to autohydrolyze the first microorganism than to add hydrolases, and the process itself is simple.
  • the hydrolysis of the first microorganism of the present invention is preferably autohydrolysis.
  • the self-hydrolysis is preferably carried out under the conditions that the medium containing the first microorganism is 40 ⁇ 65 °C, pH 4.5 ⁇ 7.0. More preferably, the self-hydrolysis of the present invention is carried out under 40-50 ° C., pH 5.0-6.5, and even more preferably the self-hydrolysis of the present invention is carried out under 42.5-47.5 ° C., pH 5.25-6.25.
  • the autohydrolysis may be performed for 1 to 42 hours, preferably 1 to 24 hours, more preferably 6 to 18 hours, even more preferably 8 to 16 hours.
  • the first microorganism produces enzymes for autohydrolysis, and the hydrolysis of the first microorganism, that is, lysis occurs, by the autohydrolase enzymes.
  • the autohydrolase enzymes As a result, most proteins in the first microorganism are decomposed into amino acids and eluted into the aqueous solution, that is, the medium.
  • the bioalcohol may be separated by a general method performed in the art, and is not particularly limited. However, it is advantageous in terms of cost and efficiency to separate and recover bioalcohol through distillation. For example, when the autohydrolyzed ethanol fermentation waste is sent to a distillation column and distilled by raising the temperature to 80-90 ° C., ethanol having a purity of 95% or more can be recovered.
  • the fermentation waste of the present invention is a fermentation waste remaining after separating and recovering the bioalcohol.
  • the fermentation waste is already hydrolyzed, and the fermentation waste contains the first microorganisms, proteins, amino acids, proteins or amino acids eluted from the first microorganisms, and nutrients. Therefore, the fermentation waste of the present invention contains abundant nutrients necessary for the growth of the second microorganism and produce the bioproduct than the fermentation waste without hydrolysis.
  • the second microorganism of the present invention may be a microorganism capable of producing the bioproduct of the present invention, and is not particularly limited.
  • the second microorganism of the present invention may be wild type or may be a mutant or recombinant microorganism.
  • the second microorganism of the present invention may be a culture of two or more kinds of microorganisms simultaneously or sequentially.
  • the second microorganism of the present invention may be the same as or different from the first microorganism.
  • the second microorganism of the present invention is yeast, Clostridium, Escherichia coli, Bacillus, Anaeromyxobacter, Alcaligenes, Bacteroides, S Escherichia, Lactobacillus, Lactococcus, Pichia, Pseudomonas, Ralstonia, Rhodococcus, Saccharomyces, Saccharomyces, Streptomyces, Thermos, Thermorgaga, Thermoanaerobacter, Klebsiella, Streptomycetaceae, Actinomycetaceae, Corinthians It may be a bacterium (Colinebacterium) or Zymomonas (Zymomonas) and the like, but is not limited thereto, those skilled in the art can select and use a suitable second microorganism according to the type of the desired bioproduct.
  • bacterium Colinebacterium
  • Zymomonas Zymomonas
  • Cultivation of the second microorganism may also be appropriately cultivated for bioproduct production as with the first microorganism, and the culture method is not particularly limited.
  • the second microorganism may be fermented in a batch, continuous or fed-batch, and the conditions for culturing the second microorganism may include the type of the second microorganism and the bioproducts produced.
  • the person skilled in the art can select appropriately according to the kind, kind of carbon source, etc.
  • the bio products of the present invention are materials that can be used as raw materials or additives added to raw materials in the manufacture of chemicals, and include alcohols, organic acids, amino acids, enzymes, and biodegradable polymers that can be produced through microbial fermentation. .
  • the alcohol may be an alcohol having 6 or less carbon atoms, and may include one or two or more hydroxyl groups.
  • the alcohol of the bioproduct of the present invention includes ethanol, propanol, propanediol, dihydroxyacetone phosphate, butanol, butanediol, and the like.
  • the alcohol may be the same as or different from the bioalcohol produced by the first microorganism. However, considering the production efficiency, it is more efficient that the alcohol is different from the bio alcohol produced by the first microorganism.
  • the organic acid may be an organic acid having 6 or less carbon atoms, and may include one or two or more carboxyl groups.
  • the organic acid of the present invention includes lactic acid, butyric acid, succinic acid, hydroxypropionic acid, and the like.
  • biodegradable polymers of the present invention are industrially useful polymers such as, but not limited to, bio polyesters.
  • the production method of the bioproduct of the present invention may further include the step of culturing the second microorganism to produce the bioproduct, and separating and purifying the bioproduct.
  • Yeast extract (yeast extract) was used to purchase a commercial product (Difco Labs., Detroit, USA).
  • Ethanol was separated and recovered by directly distilling the ethanol fermentation broth without going through a hydrolysis process.
  • the remaining ethanol fermentation waste was then referred to as "non-hydrolysis fermentation waste" and used in Experimental Examples 2 and 3 below.
  • the ethanol fermentation broth was autohydrolyzed at 45 ° C. for 12 hours under pH 6.0. After distilling the autohydrolyzed ethanol fermentation broth to separate and recover ethanol, the remaining waste was represented as a hydrolysis fermentation waste and used in Experimental Examples 2 and 3 below.
  • Total protein, total nitrogen, and 16 amino acids were used as indicators of nutrients in ethanol fermentation waste and yeast extract. After centrifugation at 12,000 rpm for 10 minutes, the components of the indicators present in the supernatant were analyzed.
  • Total protein was analyzed using Bovine Serum Albumin as standard and protein analysis kit (TP0200, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, USA).
  • Total nitrogen was analyzed using Kiltal nitrogen analysis (Tecator Kjeltec Auto 1030 Analyzer, Foss Tecator AB, Hoganas, Sweden). 16 amino acids were analyzed using an amino acid analyzer (Amino acid analyzer, Waters 2690, Waters Inc., Milford, MA, USA).
  • autohydrolysis was performed by varying the pH, temperature and time in a shaking incubator.
  • Autohydrolysis was carried out by varying the temperature in the range of 40 ⁇ 65 °C for 48 hours under pH 4.5 conditions, ethanol was recovered from the hydrolyzed ethanol fermentation broth through a distillation process at 85 °C. After ethanol was recovered, the nutritional components of autohydrolyzed ethanol fermentation wastes were analyzed.
  • Hydrolysis was performed for 48 hours by adjusting the pH to 4.5-7.0 at 45 ° C., which had the best hydrolysis effect in ⁇ 1-1>. Thereafter, ethanol was recovered from the hydrolyzed ethanol fermentation broth through a distillation process at 85 ° C., and the nutrient components of the autohydrolyzed ethanol fermentation wastes were analyzed after ethanol was recovered.
  • autohydrolysis efficiency was evaluated according to autohydrolysis time.
  • the autohydrolysis was carried out at a pH of 6.0 and 45 ° C. for 6 hours up to 6 to 42 hours, and ethanol was recovered from the hydrolyzed ethanol fermentation broth at 85 ° C. through distillation. After ethanol was recovered, the nutritional components of autohydrolyzed ethanol fermentation wastes were analyzed.
  • the autohydrolysis of the ethanol fermentation broth is preferably carried out for 12 hours or more under 40-55 ° C., pH 5.0-7.0 conditions, especially 45 ° C., pH 6.0. 12 hours was found to be the most efficient.
  • the hydrolyzed fermentation waste contains 3.201 g / L total protein and 0.532 g / L total nitrogen, which is an increase of about 10% and 13%, respectively, compared to the existing ethanol fermentation waste. / L), which is about 9 times and 4.5 times higher values, respectively.
  • amino acids there was 48.51 mg / L in the hydrolyzed fermentation waste, which was increased by more than 100% compared to the non-hydrolyzed fermentation waste. This means that by the autohydrolysis process of the ethanol fermentation broth, many components that can be used as nutrients for microbial growth and the production of the desired metabolites through microbial fermentation are eluted in aqueous solution.
  • the 48.51 mg / L amino acid present in the hydrolyzed fermentation waste was also 80% higher than the 27.05 mg / L amino acid present in the yeast extract (1 g / L) (Table 1).
  • the fermentation conditions were the initial concentration of glucose 300 mM (54 g / L), fermentation temperature 37 °C, stirring speed 150 rpm, air was continuously supplied at a flow rate of 1 vvm (3 L / min), The pH during fermentation was adjusted to 6.0 using 5N NaOH solution.
  • the K. oxytoca ATCC43863 ldhA is a Klebsiella oxytoca wild type strain ( Klebsiella oxytoca ATCC43863) . oxytoca ATCC43863 ldhA), which was used as a 2,3-butanediol producing strain in this experiment.
  • the K. oxytoca ATCC43863 ldhA completely consumed 300 mM glucose added to the medium as a carbon source after 30 hours of fermentation, but the same amount when non-hydrolyzed fermentation waste was used as the medium. Glucose was consumed completely after 24 hours fermentation.
  • the 2,3-butanediol produced after the complete consumption of 300 mM glucose showed 16 g / L for the control group but 18 g / L for the non-hydrolyzed fermentation waste medium.
  • the productivity of 2,3-butanediol that is, the hourly yield of 2,3-butanediol
  • the productivity of the hydrolyzed fermentation waste was 0.89 g / L / h. It was found to be high compared to the productivity (0.78 g / L / h) and the control (0.53 g / L / h). This was thought to be due to the fact that nutrients, especially amino acids, eluted in aqueous solution through the autohydrolysis of ethanol fermentation broth increased 2,3-butanediol productivity by increasing glucose consumption and 2,3-butanediol production rate (Fig. 6).
  • the experiment of lactic acid production ability was performed using Lactobacillus paracasei strain ( L. paracasei KCTC 11710BP). Specifically, a batch fermentation was performed by inoculating a culture solution of L. paracasei KCTC 11710BP cultured in a 300 mL flask into a 6.6 liter bioreactor containing a hydrolysis fermentation waste and a non-hydrolysis fermentation waste. The conditions were the initial concentration of glucose 300 mM (54 g / L), fermentation temperature 37 °C, stirring speed 150 rpm. The pH during fermentation was adjusted to 6.0 using 10N NaOH solution.
  • Lactobacillus Growth Medium (LGM) medium which is generally used for Lactobacillus fermentation, was used, and its composition is shown in Table 3.
  • the lactic acid was produced by fermentation in the same manner as the fermentation waste except that the LGM medium was placed in a bioreactor instead of the hydrolysis / non-hydrolysis fermentation waste.
  • the productivity of lactic acid that is, the yield per hour of lactic acid
  • the lactic acid productivity of the hydrolyzed fermentation waste was 1.58 g / L / h
  • the productivity of the non-hydrolyzed release waste (1.24 g / L / h)
  • the productivity of the control group It was found to be high compared to (0.88 g / L / h). This was thought to be because nutrients, especially amino acids, eluted in aqueous solution through the autohydrolysis process of the ethanol fermentation broth to increase glucose consumption and lactic acid production rate to improve lactic acid productivity (Fig. 8).
  • the present invention can produce bio products at high efficiency and low cost.

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Abstract

본 발명은 제 1 미생물을 배양하여 바이오 알코올을 생산하는 단계, 상기 제 1 미생물을 가수분해시키는 단계, 상기 바이오 알코올을 분리하는 단계, 가수분해된 바이오 알코올 발효 폐기물을 수득하는 단계, 상기 바이오 알코올 발효 폐기물에 제 2 미생물을 접종하는 단계를 포함하는 바이오 산물의 생산 방법에 대한 것이다.

Description

가수분해된 발효 폐기물을 이용한 바이오 산물의 생산 방법
본 발명은 가수분해된 발효 폐기물을 이용한 바이오 산물의 생산 방법에 대한 것이다.
미생물을 이용한 발효 공정을 통하여 바이오 산물을 생산하기 위해서는 미생물 성장에 필요한 다양한 종류의 영양 성분들을 배지에 첨가하여야 한다. 배지는 일반적으로 무기염류, 아미노산, 비타민 등과 같이 화학적으로 성분이 명확하게 규명된 성분만을 포함하는 합성배지(synthetic medium)와 비록 성분은 명확하게 규명되지 않았지만 미생물 성장에 필요한 모든 성분을 포함하고 있는 것으로 알려진 펩톤(peptone), 옥수수 추출물(corn steep liquor), 효모 추출물(yeast extract) 등을 포함하는 복합배지(complex medium)로 나누어진다.
그러나 합성배지의 경우, 현재까지 알려진 영양성분들을 모두 함유하는 합성배지에서도 성장할 수 없는 미생물들이 상당수 존재하는 문제가 있다. 특히 합성배지에 첨가되는 아미노산 및 비타민의 가격이 매우 비싸기 때문에 바이오 연료 및 바이오 산물과 같은 저가의 물질들을 대량 생산하는 미생물 발효 공정에 이들을 배지 영양성분으로 사용하는 것에는 한계가 있다.
그러므로 미생물 발효를 통한 미생물 성장과 목적한 대사산물 생산에 필요한 영양성분들을 모두 함유하면서도 가격이 저렴한 복합 영양성분원(nutrient source)를 발굴하기 위한 노력이 전 세계적으로 활발히 진행되고 있다. 복합 영양성분원으로는 펩톤(peptone), 옥수수 침지액(corn steep liquor), 효모 추출물(yeast extract) 등이 있으며, 이들은 유기산, 아미노산, 핵산 등 식품산업에 필요한 다양한 물질들을 미생물 발효를 통하여 생산하는 상업 공정에서 일부 사용되고 있다.
펩톤의 경우 미생물 발효를 통한 미생물 성장 및 목적 대사산물 생산에 필요한 영양성분들이 과량 존재하나, 펩톤을 미생물 발효를 통한 바이오 연료 및 바이오 산물 생산에 사용하기에는 상대적으로 가격이 비싸다.
또한 옥수수 침지액(CSL, corn steep liquor)은 가격이 저렴한 장점은 있으나, 옥수수의 가공, 침지 공정에는 아황산이 사용되므로 옥수수 침지액에는 아황산이 포함되게 된다. 이러한 아황산은 미생물 발효를 통한 미생물 성장 및 목적 대사산물 생산을 저해할 수 있다. 또한 옥수수 침지액은 미생물이 활용할 수 있는 영양성분들이 펩톤이나 효모 추출물과 비교하여 상대적으로 부족하기 때문에 펩톤이나 효모 추출물보다 많은 양이 배지에 첨가되어야 한다. 실제로 미생물 발효를 통한 미생물 성장 및 목적 대사산물 생산을 위한 영양성분으로 옥수수 침지액을 포함하는 배지를 사용하는 경우, 미생물 성장 속도 및 목적 대사산물의 생산성이 감소하는 것으로 보고되고 있다 (Amartey et al., Bullet. Chem. Technol., Macedonia, 19:65, 2000 Silveira et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 55:442, 2001).
한편, 효모 추출물은 일반적으로 소주, 맥주를 포함한 음료용 에탄올 및 제빵 제조에 사용되는 효모의 일종인 사카로마이세스 세레비지에를 이용하여 만드는데, 미생물 성장을 촉진할 뿐만 아니라 목적 대사산물의 생산성 증진에 유용하다. 그러나 효모 추출물은 효모 자체를 추출하여 만들기 때문에 역시 비용이 많이 드는 단점이 있다.
이에 본 발명자들은 고효율, 저비용으로 바이오 산물을 생산할 수 있는 방법을 연구하던 중, 미생물 발효를 이용하여 바이오 연료를 생산하고 남은 발효 폐기물을 이용 시, 대량의 발효 폐기물 자체를 재활용할 수 있을 뿐 아니라 바이오 산물의 생산성도 높은 것을 발견하였다. 더 나아가 본 발명자들은 바이오 연료를 생산한 후, 바이오 연료를 분리, 수득하기 전에 발효물 내 미생물을 가수분해시키는 경우, 바이오 연료를 생산하고 남은 발효 폐기물 내 영양성분이 더욱 증가하여 바이오 산물의 생산성이 훨씬 높아지는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 바이오 산물을 고효율 저비용으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 가수분해된 발효 폐기물을 이용하여 바이오 산물을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 생산 방법에 따르면, 바이오 산물을 높은 생산성 및 적은 비용으로 생산할 수 있다.
도 1은 가수분해한 발효 폐기물을 이용하는 본 발명의 바이오 산물 생산 방법을 가수분해 공정을 거치지 않는 생산 방법과 비교하여 도식화한 것이다.
도 2는 가수분해 온도에 따른 발효 폐기물의 가수분해 정도를 나타낸다
도 3은 가수분해 pH에 따른 발효 폐기물의 가수분해 정도를 나타낸다
도 4는 가수분해 시간에 따른 발효 폐기물의 가수분해 정도를 나타낸다
도 5는 가수분해 발효 폐기물 또는 비가수분해 발효 폐기물을 이용 시 포도당 소모 및 2,3-부탄디올 생산의 발효 프로파일을 나타내는 그래프이다.
도 6은 가수분해 발효 폐기물 또는 비가수분해 발효 폐기물을 이용 시 2,3-부탄디올 생산성을 나타낸다.
도 7은 가수분해 발효 폐기물 또는 비가수분해 발효 폐기물을 이용 시 포도당 소모 및 젖산 생산의 발효 프로파일을 나타내는 그래프이다.
도 8은 가수분해 발효 폐기물 또는 비가수분해 발효 폐기물을 이용 시 젖산 생산성을 나타낸다.
본 발명은,
제 1 미생물을 배양하여 바이오 알코올을 생산하는 단계;
상기 제 1 미생물을 가수분해시키는 단계;
상기 바이오 알코올을 분리하는 단계;
발효 폐기물을 수득하는 단계;및
상기 발효 폐기물에 제 2 미생물을 접종하는 단계를 포함하는 바이오 산물의 생산 방법에 대한 것이다(도 1).
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
제 1 미생물
본 발명의 제 1 미생물은 바이오 매스로부터 바이오 알코올을 생산하는 미생물이다. 본 발명의 제 1 미생물은 야생형일 수 있으며 돌연변이 또는 재조합 미생물일 수도 있다. 상기 제 1 미생물은 상기 제 2 미생물과 동일하거나 상이한 미생물이다. 본 발명의 제 1 미생물은 바이오 매스로부터 바이오 알코올을 생산할 수 있으면 되고, 그 종류가 특별히 제한되지는 않으나, 효모, 즉, 사카로마이세스 세레비지에를 사용하는 것이 바람직하다. 또한 제 1 미생물은 두 종 이상의 미생물을 동시에 또는 순차적으로 사용할 수도 있다.
바이오 매스
본 발명의 제 1 미생물은 탄소원을 이용하여 바이오 알코올을 생산하며, 상기 탄소원은 바이오 매스인 것이 바람직하다. 상기 바이오 매스는 바이오 알코올의 생산에 사용되는 일반적인 바이오 매스면 되고 특별히 제한되지 않는다. 예컨대, 본 발명의 바이오 매스는 목질, 옥수수, 타피오카, 사탕수수, 글리세롤 등이 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자는 바이오 매스의 수급 조건, 제 1 미생물의 종류 등에 따라 적절한 바이오 매스를 선택할 수 있다.
바이오 알코올
본 발명의 바이오 알코올은 제 1 미생물이 바이오 매스로부터 배양을 통하여 생산하는 것이다. 예컨대, 본 발명의 바이오 알코올은 에탄올, 프로판올, 프로판디올, 다이하이드록시아세톤 포스페이트, 부탄올, 부탄디올 등이 될 수 있고, 바람직하게는 에탄올이다.
제 1 미생물의 배양
제 1 미생물은 바이오 알코올 생산에 적합하게 배양되면 되고, 배양 방법이 특별히 제한되지 않는다. 예컨대, 제 1 미생물은 회분식(batch), 연속식(continuous) 또는 유가식(fed-batch)으로 발효 배양될 수 있으며, 제 1 미생물의 배양 조건 등은 제 1 미생물의 종류, 생산되는 바이오 알코올의 종류, 탄소원의 종류 등에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있다.
가수분해
상기 제 1 미생물의 가수분해는 제 1 미생물을 가수분해, 즉, 용균시켜 미생물 내 단백질, 아미노산 등 영양 성분들을 수용액, 즉 배지 상으로 방출시키는 것이다. 특히, 제 1 미생물이 가수분해됨으로써, 미생물 내 단백질 등이 아미노산으로 분해되는데, 이로써 발효 폐기물 내 아미노산 함량이 증가하게 되며, 이들 아미노산들은 후공정에서 제 2 미생물이 성장을 하고, 바이오 산물을 생산하는데 있어, 중요한 영양 성분으로 사용하게 된다.
상기 가수분해는 배지에 가수분해효소를 첨가하여 수행할 수도 있고, 제 1 미생물을 자가가수분해시켜 수행할 수도 있다. 그러나 가수분해효소를 첨가하는 것보다 제 1 미생물을 자가가수분해시키는 것이 비용 면에서 훨씬 유리하고, 공정 자체도 간단하다.
자가가수분해
전술한 바와 같이, 본 발명의 제 1 미생물의 가수분해는 자가가수분해인 것이 바람직하다. 상기 자가가수분해는 제 1 미생물이 포함된 배지가 40~65 ℃, pH 4.5~7.0인 조건에서 수행되는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 자가가수분해는 40~50 ℃, pH 5.0~6.5 조건 하에서 수행되며, 더더욱 바람직하게는 본 발명의 자가가수분해는 42.5~47.5 ℃, pH 5.25~6.25 조건 하에서 수행된다. 상기 자가가수분해는 1~42시간 동안 수행될 수 있으며, 바람직하게는 1~24시간 동안 수행되고, 더욱 바람직하게는 6~18시간 동안 수행되고, 더더욱 바람직하게는 8~16시간 수행된다. 상기 온도 및 pH 조건에서 제 1 미생물은 자가가수분해를 위한 효소들을 생산하게 되며, 상기 자가가수분해효소들에 의하여 제 1 미생물의 자가가수분해, 즉, 용균이 일어나게 된다. 이로써, 제 1 미생물 내 대부분의 단백질들이 아미노산으로 분해되어 수용액, 즉 배지 내로 용출되게 된다.
상기 자가가수분해는 제 1 미생물을 배양하여 바이오 알코올을 생산한 후, 상기 생산된 바이오 알코올을 분리, 회수하기 전에 수행하는 것이 바람직하다. 일반적으로 바이오 알코올은 증류를 통하여 분리, 회수하는데, 증류 공정에서의 고온에 의하여 제 1 미생물이 자가가수분해 효소를 생산하여 단백질을 미생물이 영양성분으로 직접 이용할 수 있는 아미노산으로 분해하기 이전에 사멸하기 때문이다. 즉, 증류를 통하여 바이오 알코올을 분리, 회수한 이후에는 발효 폐기물의 온도 및 pH를 조정하여도 제 1 미생물이 이미 사멸한 이후이기 때문에 자가가수분해가 일어나지 않게 되는 것이다.
바이오 알코올의 분리
상기 바이오 알코올은 당업계에서 수행되는 일반적인 방법으로 분리하면 되고, 특별히 제한되는 것은 아니다. 그러나 바이오 알코올은 증류를 통하여 분리, 회수하는 것이 비용 및 효율 면에서 유리하다. 예컨대, 자가가수분해된 에탄올 발효 폐기물을 증류탑으로 보내, 80~90 ℃로 온도를 상승시켜 증류하는 경우, 95% 이상의 순도를 가진 에탄올을 회수할 수 있다.
발효 폐기물
본 발명의 발효 폐기물은 바이오 알코올을 분리, 회수하고 남은 발효 폐기물이다. 상기 발효 폐기물은 이미 가수분해가 된 상태로, 상기 발효 폐기물 내에는 사멸한 제 1 미생물, 단백질, 아미노산, 제 1 미생물로부터 용출된 단백질 또는 아미노산, 영양 성분 등이 포함되어 있다. 그러므로 본 발명의 발효 폐기물에는 제 2 미생물이 성장하고 바이오 산물을 생산하는데 필요한 영양 성분들이 가수분해를 거치지 않은 발효 폐기물보다 풍부하게 포함되어 있다.
제 2 미생물
본 발명의 제 2 미생물은 본 발명의 바이오 산물을 생산할 수 있는 미생물이면 되고, 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 제 2 미생물은 야생형일 수도 있고, 돌연변이 또는 재조합 미생물일 수도 있다. 또한 본 발명의 제 2 미생물은 2 종 이상의 미생물을 동시에 또는 순차적으로 배양한 것일 수도 있다. 또한 본 발명의 제 2 미생물은 제 1 미생물과 동일하거나 상이할 수 있다.
예컨대, 본 발명의 제 2 미생물은 효모, 클로스트리디움(Clostridium), 대장균, 바실러스(Bacillus), 아나에로믹소박터(Anaeromyxobacter), 알칼리게네스(Alcaligenes), 박테로이데스(Bacteroides), 에스케리키아(Escherichia), 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 피키아(Pichia), 슈도모나스(Pseudomonas), 랄스토니아(Ralstonia), 로도코커스(Rhodococcus), 사카로마이세스(Saccharomyces), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 써머스(Thermus), 써머토가(Thermotoga), 써모아나에로박터(Thermoanaerobacter), 클렙시엘라(Klebsiella), 스트렙토미세스과(Streptomycetaceae), 악티노미세스과(Actinomycetaceae), 코리네박테리움(Colinebacterium) 또는 자이모모나스(Zymomonas) 등이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 당업자는 목적하는 바이오 산물의 종류에 따라 적절한 제 2 미생물을 선택하여 이용할 수 있다.
제 2 미생물의 배양 역시, 제 1 미생물과 마찬가지로 바이오 산물 생산에 적합하게 배양되면 되고, 배양 방법이 특별히 제한되지 않는다. 예컨대, 제 2 미생물은 회분식(batch), 연속식(contiunuous) 또는 유가식(fed-batch)으로 발효 배양될 수 있으며, 제 2 미생물의 배양 조건 등은 제 2 미생물의 종류, 생산되는 바이오 산물의 종류, 탄소원의 종류 등에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있다.
첨가물
제 2 미생물의 배양 시 물, 포도당, 맥아당, 설탕, 전분, 글리세롤, 질산염, 암모늄, 아미노산, 요소, 펩타이드, 단백질, 탄소원 등을 첨가할 수도 있다. 이 때, 생산하고자 하는 바이오 산물의 종류, 제 2 미생물의 종류, 배양 조건 등을 고려하여 당업자가 적절히 첨가물의 종류 및 첨가량을 결정할 수 있다는 것은 자명하다.
바이오 산물
본 발명의 바이오 산물은 화학물질의 제조과정에 있어서의 원료물질 혹은 원료물질에 첨가되는 첨가제로 사용 가능한 물질로서, 미생물 발효를 통하여 생산 가능한 알코올, 유기산, 아미노산, 효소 및 생분해성 고분자 등이 포함된다.
상기 알코올은 탄소 수 6 이하의 알코올일 수 있으며, 하이드록시기를 하나 또는 둘 이상 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 바이오 산물인 알코올에는 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 프로판디올(propanediol), 다이하이드록시아세톤 포스페이트(Dihydroxyacetone phosphate), 부탄올(butanol), 부탄디올(butanediol) 등이 포함되며, 상기 알코올은 제 1 미생물이 생산하는 바이오 알코올과 동일할 수도 있고 상이할 수도 있다. 그러나 생산 효율을 고려할 때, 상기 알코올은 제 1 미생물이 생산하는 바이오 알코올과 상이한 것이 더욱 효율적이다.
상기 유기산은 탄소 수 6 이하의 유기산일 수 있으며, 카르복실기를 하나 또는 둘 이상 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 유기산에는 젖산(lactic acid), 부틸릭산(butyric acid), 숙신산(succinic acid), 하이드록시프로피온산(hydroxypropionic acid) 등이 포함된다.
본 발명의 아미노산은 산업상 유용한 아미노산이면 되고, 특별히 제한되지 않는다. 예컨대, 본 발명의 아미노산에는 라이신(lysine), 메티오닌(methionine), 트레오닌(threonine) 등이 포함된다.
본 발명의 생분해성 고분자는 산업상 유용한 고분자로, 예컨대, 바이오 폴리에스터이나 이에 제한되는 것은 아니다.
바이오 산물의 분리
본 발명의 바이오 산물의 생산 방법은 제 2 미생물을 배양하여 바이오 산물을 생산하는 단계 및 상기 바이오 산물을 분리, 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
<재료 및 방법>
에탄올 발효액
에탄올 발효액은 산업적인 규모로 에탄올을 생산하는 (주)창해에탄올의 미생물 발효를 통한 상업용 에탄올 생산공장으로부터 직접 수득하였다. (주)창해에탄올은 에탄올 생산 균주인 사카로마이세스 세레비지에 균주를 발효하여 사탕수수, 타피오카 등 바이오 매스로부터 약 90 g/L의 에탄올을 생산한 후, 상기 발효액을 80~90 ℃에서 일차로 증류하고 최종적으로 95% 이상의 순도를 가지는 산업용 에탄올을 수득하여 판매하고 있다. 상기 미생물 발효를 통한 에탄올 생산 공정의 에탄올 증류 이전 단계의 에탄올 발효액을 수득하여 하기 실험들을 수행하였다.
효모 추출물
효모 추출물(yeast extract)는 시판되는 제품(Difco Labs., Detroit, USA)을 구입하여 사용하였다.
비가수분해 발효 폐기물
상기 에탄올 발효액을 가수분해 공정을 거치지 않고 직접 증류 단계를 거쳐 에탄올을 분리, 회수하였다. 그리고, 그 후 잔존하는 에탄올 발효 폐기물을 “비가수분해 발효 폐기물“로 나타내어, 하기 실험예 2 및 3에서 사용하였다.
가수분해 발효 폐기물
상기 에탄올 발효액을 45 ℃, pH 6.0 조건 하 12 시간 동안 자가가수분해하였다. 그리고 자가가수분해된 에탄올 발효액을 증류하여 에탄올을 분리, 회수한 후, 잔존하는 폐기물을 가수분해 발효 폐기물로 나타내어 하기 실험예 2 및 3에서 사용하였다.
영양성분의 측정
에탄올 발효 폐기물 및 효모 추출물에 존재하는 영양성분을 나타내는 지표로는 총단백질(Total-Protein), 총질소(Total-Nitrogen), 그리고 16 종의 아미노산(amino acids)을 채택하였으며, 에탄올 발효 폐기물을 4 ℃, 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후 상층액에 존재하는 상기 지표들의 성분들을 분석하였다. 총단백질은 소 혈청 알부민(Bovine Serum Albumin)을 표준물질(standard)로 이용하고 단백질 분석 키트(TP0200, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, USA)를 사용하여 분석하였다. 총질소는 킬탈질소분석법(Tecator Kjeltec Auto 1030 Analyzer, Foss Tecator AB, Hoganas, Sweden)을 이용하여 분석하였다. 16 종의 아미노산은 아미노산 분석기(Amino acid analyzer, Waters 2690, Waters Inc., Milford, MA, USA)를 이용하여 분석하였다.
<실험예 1>
에탄올 발효액의 자가가수분해의 최적 조건을 확인하기 위하여, 진탕배양기(shaking incubator)에서 pH, 온도 및 시간을 달리하여 자가가수분해를 수행하였다.
<1-1> 온도에 따른 에탄올 발효액의 자가가수분해 효율
pH 4.5 조건 하 48시간 동안 40 ~ 65 ℃의 범위에서 온도를 달리하여 자가가수분해를 수행하고, 85 ℃에서 증류 공정을 거쳐 가수분해된 에탄올 발효액으로부터 에탄올을 회수하였다. 에탄올이 회수된 후 자가가수분해된 에탄올 발효 폐기물들의 영양 성분들을 분석하였다.
그 결과, 40~55 ℃에서 가장 많은 양의 총단백질, 총질소 및 아미노산이 수용액상으로 용출되는 것이 확인되었으며, 특히 45 ℃에서 수용액 내 총 아미노산의 합이 가장 높은 것으로 나타났다(도 2).
<1-2> pH에 따른 에탄올 발효액의 자가가수분해 효율
상기 <1-1>에서 가장 가수분해 효과가 좋았던 45 ℃에서 pH를 4.5~7.0으로 조정하여 48시간 동안 가수분해를 수행하였다. 그 후 85 ℃에서 증류 공정을 거쳐 가수분해된 에탄올 발효액으로부터 에탄올을 회수하고, 에탄올이 회수된 후 자가가수분해된 에탄올 발효 폐기물들의 영양 성분들을 분석하였다.
그 결과, pH 5.0~7.0, 특히 pH 5.5~7.0 조건에서 가장 많은 양의 총단백질, 총질소 및 아미노산이 수용액상으로 용출되었으며, 그 중에서도 pH 6.0에서 자가가수분해 시 수용액 내 총 아미노산의 합이 가장 높은 것으로 나타났다(도 3).
<1-3> 시간에 따른 에탄올 발효액의 자가가수분해 효율
상기 <1-1> 및 <1-2>에서 가장 자가가수분해 효율이 높았던 pH 6.0 및 45 ℃의 조건에서, 자가가수분해 시간에 따른 자가가수분해 효율을 평가하였다. 자가가수분해 시간을 6~42시간까지 6시간 단위로 하여 pH 6.0, 45 ℃ 조건에서 자가가수분해를 수행하고, 85 ℃에서 증류 공정을 거쳐 가수분해된 에탄올 발효액으로부터 에탄올을 회수하였다. 에탄올이 회수된 후 자가가수분해된 에탄올 발효 폐기물들의 영양 성분들을 분석하였다.
그 결과, 에탄올 발효액의 자가가수분해 정도는 12시간까지 선형적으로 증가하였으나, 그 이상의 시간에서는 자가가수분해가 더 이상 진행되지 않았다. 그러므로 에탄올 발효액의 자가가수분해는 12시간 이상 수행하는 것이 바람직하며, 특히 12시간 동안 수행하는 것이 가장 효율적인 것으로 판단되었다(도 4).
상기 <1-1> 내지 <1-3>을 종합할 때, 에탄올 발효액의 자가가수분해는 40~55 ℃, pH 5.0~7.0 조건 하에서 12시간 이상 수행하는 것이 바람직하며, 특히 45 ℃, pH 6.0에서 12시간 동안 수행하는 것이 가장 효율적인 것으로 확인되었다.
<실험예 2>
에탄올 발효액의 자가가수분해 과정에서 수용액상으로 용출되는 영양성분들을 정량적으로 평가하기 위하여, 효모 추출물(1g/L), 비가수분해 발효 폐기물, 및 가수분해 발효 폐기물 내 영양 성분들을 분석하였다.
결과
효모 추출물 1 g/L에는 총단백질 0.356 g/L와 총질소 0.119 g/L가 존재하였으며, 16 종의 아미노산 합은 27.05 mg/L이었다. 비가수분해 발효 폐기물에는 2.906 g/L의 총단백질과 0.471 g/L의 총질소가 존재하였는데, 이는 효모 추출물(1 g/L)과 비교하여 총단백질은 8.2배, 총질소는 4.0배 이상 높은 값이었다. 이에 반하여 비가수분해 발효 폐기물 내 16 종의 아미노산 합은 24.11 mg/L으로 효모 추출물(1 g/L)의 약 90%에 해당하는 양이 포함되어 있었다. 그러므로 미생물 발효를 통한 미생물 성장 및 목적 대사산물 생산을 위하여 단백질과 질소원 측면에서는 비가수분해 발효 폐기물이 유리하나, 아미노산 측면에서는 효모 추출물(1 g/L)이 좀더 유리할 것으로 생각되었다.
반면 가수분해 발효 폐기물에는 3.201 g/L의 총단백질과 0.532 g/L의 총질소가 존재하는데, 이는 기존 에탄올 발효 폐기물과 비교하여 약 10% 및 13%가 각각 증가한 값이며, 효모 추출물(1 g/L)과 비교하여 약 9배와 4.5배에 각각 해당하는 매우 높은 값이다. 특히 아미노산의 경우에는 비가수분해 발효 폐기물과 비교하여 가수분해 발효 폐기물에는 약 100% 이상 증가한 48.51 mg/L가 존재하였다. 이는, 에탄올 발효액의 자가가수분해 과정에 의하여, 미생물 발효를 통한 미생물 성장 및 목적 대사산물 생산을 위한 영양성분으로 사용될 수 있는 많은 성분들이 수용액상으로 용출된다는 것을 의미한다. 가수분해 발효 폐기물에 존재하는 48.51 mg/L의 아미노산은 역시 효모 추출물(1g/L)에 존재하는 아미노산의 27.05 mg/L 보다 80% 증가한 값이었다(표 1).
표 1
Figure PCTKR2013004256-appb-T000001
<실험예 3> 바이오 산물 생성능
<3-1> 2,3-부탄디올 생산능
가수분해 발효 폐기물 또는 비가수분해 발효 폐기물을 각각 포함하는 6.6 리터 생물 반응기에 300 mL 플라스크의 클레비시엘라 옥시토카 재조합 균주(K. oxytoca ATCC43863 ldhA) 배양액을 접종하여 회분식으로 발효시켜, 2,3-부탄디올을 생산하였다. 이 때 발효 조건은 포도당 초기농도 300 mM (54 g/L), 발효온도 37 ℃, 교반속도 150 rpm이었으며, 배양 중 공기(air)를 1 vvm (3 L/min)의 유속으로 연속 공급하였고, 발효 중 pH는 5N NaOH 용액을 사용하여 6.0로 조정하였다.
상기 클레비시엘라 옥시토카 재조합 균주(K. oxytoca ATCC43863 ldhA)는 클레비시엘라 옥시토카 야생형 균주(Klebsiella oxytoca ATCC43863)에서 젖산 생합성에 관련된 효소(lactate dehydrogenase)를 코딩하는 ldhA 유전자를 제거한 재조합 균주(K. oxytoca ATCC43863 ldhA)로, 본 실험에서는 2,3-부탄디올 생산 균주로 이용하였다.
이 때, 대조군으로는 클레비시엘라 옥시토카 균주 배양에 일반적으로 사용하는 합성배지를 사용하였으며, 그 조성은 표 2와 같다. 상기 가수분해/비가수분해 발효 폐기물 대신 상기 합성배지를 생물 반응기에 넣는 것을 제외하고는 발효 폐기물과 동일한 방법으로 발효, 배양하여 2,3-부탄디올을 생산하였다.
표 2
Figure PCTKR2013004256-appb-T000002
결과
대조군의 경우, 클레비시엘라 옥시토카 재조합 균주(K. oxytoca ATCC43863 ldhA)는 30시간 발효 후에 탄소원으로 배지에 첨가된 300 mM 포도당을 완전히 소모하였으나, 비가수분해 발효 폐기물을 배지로 사용한 경우에는 동일한 양의 포도당을 24시간 발효 후에 완전히 소모하였다. 300 mM 포도당을 완전히 소모한 후 생산된 2,3-부탄디올은 대조군의 경우 16 g/L를 나타내었으나, 비가수분해 발효 폐기물을 배지로 사용한 경우에는 18 g/L를 나타내었다. 한편, 가수분해 발효 폐기물을 배지로 사용한 경우에는 300 mM의 포도당을 21시간 발효 후에 완전히 소모하였으며, 생산된 2,3-부탄디올의 양은 비가수분해 발효 폐기물과 마찬가지로 18 g/L였다(도 5).
또한 2,3-부탄디올의 생산성, 즉, 2,3-부탄디올의 시간 당 생산량을 계산한 결과, 가수분해 발효 폐기물의 2,3-부탄디올 생산성은 0.89 g/L/h로 비가수분해 발표 폐기물의 생산성(0.78 g/L/h) 및 대조군의 생산성(0.53 g/L/h)에 비하여 높은 것으로 확인되었다. 이는 에탄올 발효액의 자가가수분해 과정을 통하여 수용액상으로 용출된 영양 성분들, 특히 아미노산들이 포도당 소모 및 2,3-부탄디올 생산 속도를 증가시켜 2,3-부탄디올 생산성을 향상시킨 때문으로 생각되었다(도 6).
<3-2> 젖산 생산능
젖산 생성능의 실험은 락토바실러스 파라카세이 균주(L. paracasei KCTC 11710BP)를 이용하여 수행하였다. 구체적으로는 가수분해 발효 폐기물, 비가수분해 발효 폐기물를 각각 포함하는 6.6 리터 생물 반응기에 300 mL 플라스크에서 배양한 락토바실러스 파라카세이 균주(L. paracasei KCTC 11710BP) 배양액을 접종하여 회분식 발효를 수행하였으며, 발효 조건은 포도당 초기농도 300 mM (54 g/L), 발효온도 37 ℃, 교반속도 150 rpm이었다. 발효 중 pH는 10N NaOH 용액을 사용하여 6.0으로 조정하였다.
이 때, 대조군으로는 일반적으로 락토바실러스 발효에 사용되는 Lactobacillus Growth Medium(LGM) 배지를 사용하였으며, 그 조성은 표 3과 같다. 상기 가수분해/비가수분해 발효 폐기물 대신 상기 LGM 배지를 생물 반응기에 넣는 것을 제외하고는 발효 폐기물과 동일한 방법으로 발효하여, 젖산을 생산하였다.
표 3
Figure PCTKR2013004256-appb-T000003
결과
대조군의 경우 락토바실러스 파라카세이 균주(L. paracasei KCTC 11710BP)는 48 시간 발효 후에 탄소원으로 배지에 첨가된 300 mM 포도당을 완전히 소모하였으나, 비가수분해 발효 폐기물군의 경우, 포도당을 40 시간 발효 후에 완전히 소모하였다. 300 mM 포도당을 완전히 소모한 후 생산된 젖산은 대조군의 경우 42 g/L를 나타내었으나, 비가수분해 발효 폐기물의 경우 약 17% 증가된 49 g/L를 나타내었다. 한편, 가수분해 발효 폐기물을 배지로 사용한 경우, 300 mM의 포도당을 32 시간 발효 후에 완전히 소모하여 비가수분해 발효 폐기물을 배지로 사용하여 생산한 젖산보다 많은 50 g/L를 생산하였다(도 7).
한편, 젖산의 생산성, 즉, 젖산의 시간 당 생산량의 경우, 가수분해 발효 폐기물의 젖산 생산성은 1.58 g/L/h로 비가수분해 발표 폐기물의 생산성(1.24 g/L/h) 및 대조군의 생산성(0.88 g/L/h)에 비하여 높은 것으로 확인되었다. 이는 에탄올 발효액의 자가가수분해 과정을 통하여 수용액상으로 용출된 영양성분들, 특히 아미노산들이 포도당 소모 및 젖산 생산 속도를 증가시켜 젖산 생산성을 향상시킨 때문으로 생각되었다(도 8).
본 발명은 바이오 산물을 고효율 저비용으로 생산할 수 있다.

Claims (14)

  1. 제 1 미생물을 배양하여 바이오 알코올을 생산하는 단계;
    상기 제 1 미생물을 가수분해시키는 단계;
    상기 바이오 알코올을 분리하는 단계;
    발효 폐기물을 수득하는 단계;및
    상기 발효 폐기물에 제 2 미생물을 접종하는 단계를 포함하는 바이오 산물의 생산 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 제 1 미생물은 제 2 미생물과 동일하거나 상이한 것을 특징으로 하는 생산 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 바이오 산물은 상기 바이오 알코올과 동일하거나 상이한 것을 특징으로 하는 생산 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 제 1 미생물은 바이오 매스로부터 바이오 알코올을 생산하는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 가수분해는 제 1 미생물이 포함된 배양 배지가 40~65 ℃인 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 가수분해는 제 1 미생물이 포함된 배양 배지가 pH 4.5~7.0인 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 가수분해는 상기 제 1 미생물의 자가가수분해인 것을 특징으로 하는 생산 방법.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 가수분해로 인하여, 발효 폐기물 내 아미노산 함량이 증가하는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 바이오 알코올은 바이오 에탄올인 것을 특징으로 하는 생산 방법.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 제 1 미생물은 효모인 것을 특징으로 하는 생산 방법.
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 제 2 미생물은 바이오 산물의 생산능을 갖는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
  12. 제 1항에 있어서,
    상기 바이오 산물은 알코올 또는 유기산인 것을 특징으로 하는 생산 방법.
  13. 제 1항에 있어서,
    상기 바이오 산물은 탄소 수 6 이하의 알코올 또는 탄소수 6 이하의 유기산인 것을 특징으로 하는 생산 방법.
  14. 제 1항에 있어서,
    상기 제 2 미생물을 배양하여 바이오 산물을 생산하는 단계;및
    상기 바이오 산물을 분리, 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
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