WO2013118699A1 - 薄切片作製装置及び薄切片作製方法 - Google Patents

Abstract

　薄切片作製装置は、落射照明を照射して撮像を行い撮像データを取得する落射撮像データ取得部と、拡散照明を照射して撮像を行い撮像データを取得する拡散撮像データ取得部と、落射撮像データ取得部で取得した撮像データを基にして、包埋ブロックの表面から露出している生体試料の露出形態を抽出する露出形態抽出部と、拡散撮像データ取得部で取得した撮像データを基にして、包埋ブロックに埋設されている生体試料の埋設形態を抽出する埋設形態抽出部と、露出形態抽出部で抽出した露出形態と、埋設形態抽出部で抽出した埋設形態とを比較して、予備切削の終了を判定する制御部と、を備える。

Description

薄切片作製装置及び薄切片作製方法

　本発明は、薄切片作製装置及び薄切片作製方法に関する。
　本願は、２０１２年２月８日に、日本に出願された特願２０１２－０２５２８１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

　疾病にかかった動物及び人の組織等を病理検査する場合には、通常、組織を２μｍから５μｍの厚さに薄切りして各種の染色を施した後、顕微鏡観察して検査を行っている。
　この際、過去に取得された情報に基づいて診断が行われている。特に病理学は、疾病と組織の形態変化とに関する膨大な情報を基に成り立っている。そこで、過去に取得された情報を有効に利用するために、検査対象である試料を特定の断面で切断し、診断に必要な組織が表面に現れるように薄切する必要がある。

　一般的には、軟らかい組織及び細胞の形態を壊さないように薄切りするために、試料を予めパラフィンに包埋して包埋ブロックが作製される。そして、包埋ブロックを２μｍから５μｍの厚さに薄くスライス（薄切り）することで、薄切片を作製している。これにより、検査対象物が軟らかい組織等であっても、形態を破壊せずに極薄にスライスすることができる。薄切片をスライドガラス等の基板上に固定することで、薄切片標本を作製している。通常、作業者は、薄切片標本を顕微鏡観察することで、上述した病理検査を行っている。

　薄切片を作製する際には、予備切削工程（粗削り工程）と本切削工程という２つの工程を行って、包埋ブロックから薄切片を切り出している。予備切削では、包埋ブロックを徐々に薄切りして表面を平滑面にすると共に、パラフィンに包埋されている試料を表面に露出させる。また、本切削では、試料が確実に露出している包埋ブロックの表面に対し、所定厚みの薄切片の切り出しを行う。
　特に、上述した病理学の観点から、作製された薄切片は、試料が観察に好適な所望の露出状態であることが好ましい。そのため、予備切削が重要であり、慎重に行う必要がある。

　しかしながら試料を包埋しているパラフィンは、固化した際に結晶化して白濁するので、包埋ブロック作製後に、試料がどのような形態でパラフィン内に包埋されているか、包埋ブロックの外部から予め確認することができなかった。そのため、予備切削を行う際に、作業者がパラフィンから露出した試料の面を常に観察しながら、切削刃の切り込み量、及び、包埋ブロックを載置している支持台の角度等を適宜調節して、生体試料が所望の露出状態となるように調整する必要があった。上記作業は、やり直しができず、さらに、所望の面が露出するまで切削を数十回以上繰り返さなければならなかった。
　したがって、熟練と長時間に亘る注意力とが必要とされ、作業者への負担が大きくかった。

　そこで、包埋ブロック内の生体試料が確実に所望の露出状態となるように、包埋ブロックに対して効率良く予備切削を行える薄切片作製装置が提案されている（例えば、特許文献１参照）。

　特許文献１に記載の薄切片作製装置は、包埋ブロックに対して落射照明光を照射する落射照明系と、包埋ブロックに対して拡散照明光を照射する拡散照明系と、落射照明光下と拡散照明光下で包埋ブロックを撮像する撮像部とが設けられ、落射照明光下で撮像した包埋ブロックの撮像データと、拡散照明光下で撮像した包埋ブロックの撮像データを重ね合せた状態でモニターに表示することにより、作業者がモニターの表示を確認しながら、予備切削の際の包埋ブロックの切削量及び傾斜角度等を容易に設定できる。

　包埋ブロックに落射照明光を照射したときには、パラフィン等の包埋剤の部分と生体試料の露出している部分とで輝度の差が生じる。一方、包埋ブロックに拡散照明光を照射したときには、光が包埋ブロックの内部に入り込んで、切削面上に露出していない生体試料に当たって反射する。
　特許文献１に記載の薄切片作製装置は、上記特徴に着目し、落射照明光下で得た撮像データと拡散照明光下で得た撮像データとをモニター上で重ね合せて表示する。これより、作業者が包埋ブロックの表面の状態及び包埋ブロック内の生体試料の状態を正確に把握できる。

日本国特許第４７８４９３６号公報

　上記従来の薄切片作製装置においては、落射照明光下で得た撮像データと拡散照明光下で得た撮像データをモニター上で重ね合せて表示することにより、作業者は包埋ブロックの表面及び内部の状態を把握できる。しかし、その後に行われる生体試料が所望の露出状態であるか否かの判断と、所望の露出状態に近づけるための切削量等の指示とは、作業者が勘に頼ってその都度行わなければならない。

　本発明は、包埋ブロック内の生体試料を、予備切削の段階で自動的に、かつ確実に所望の露出状態にできる薄切片作製装置及び薄切片作製方法を提供する。

　本発明の第１の態様は、薄切片作製装置であって、落射照明を照射して生体試料が包埋された包埋ブロックの表面の撮像を行って、撮像データを取得する落射撮像データ取得部と、拡散照明を照射して包埋ブロックの表面の撮像を行って、撮像データを取得する拡散撮像データ取得部と、落射撮像データ取得部で取得した撮像データを基にして、包埋ブロックの表面から露出している生体試料の露出部の露出形態を抽出する露出形態抽出部と、拡散撮像データ取得部で取得した撮像データを基にして、包埋ブロックに埋設されている生体試料の埋設部の埋設形態を抽出する埋設形態抽出部と、露出形態抽出部で抽出した露出形態と、埋設形態抽出部で抽出した埋設形態とを比較して、予備切削の終了を判定する、予備切削の動作を制御する制御部と、を備える。
　この場合、生体試料の露出形態が埋設形態に対して所定の条件を満たしたとき、生体試料が所望の露出状態であると判断することができる。そこで、制御部が露出形態と埋設形態とを比較して予備切削の終了を判定することにより、包埋ブロック内の生体試料において、自動的かつ確実に所望の露出状態を得ることができる。

　本発明の第２の態様は、上記第１の態様の薄切片作製装置において、露出形態抽出部は、露出形態として、包埋ブロックの表面から露出している生体試料の露出面積を求め、埋設形態抽出部は、埋設形態として、包埋ブロックに埋設されている生体試料の投影面積を求め、制御部は、露出形態抽出部で求めた露出面積と埋設形態抽出部で求めた投影面積との比率が第１所定値よりも大きくなったときに、予備切削を終了させる。
　この場合、生体試料の露出面積と投影面積との比率が第１所定値よりも大きくなったとき、露出面積が最大値である投影面積に近づいたことになるので、生体試料が所望の露出状態であると判断することができる。この時点で制御部が予備切削を終了させることにより、包埋ブロック内の生体試料について自動的かつ確実に所望の露出状態を得ることができる。

　本発明の第３の態様は、上記第１または第２の態様の薄切片作製装置において、落射撮像データ取得部で取得した撮像データを基にして、生体試料の露出部の中心を求めるとともに、拡散撮像データ取得部で取得した撮像データを基にして、生体試料の埋設部の中心を求め、露出部の中心から埋設部の中心に向かうベクトルの向きと大きさを算出するベクトル算出部をさらに備え、制御部は、ベクトル算出部で算出したベクトルの大きさが第２所定値よりも大きいときに、ベクトルが小さくなるようにベクトルの向きに基づいて包埋ブロックと切削刃との相対姿勢を制御して、予備切削を行わせる。
　この場合、露出部の中心から埋設部の中心に向かうベクトルの大きさが大きい場合には、埋設部の中心から離れた位置に露出部が存在するので、生体試料が大きく傾いた状態で包埋ブロック内に埋設されていると考えられる。この状態で予備切削を進めても、生体試料を大きく露出させることができない。一方、ベクトルの大きさが小さい場合には、埋設部の中心と近い位置に露出部が存在するので、生体試料が傾きの少ない状態で埋設しているものと考えられる。この状態で予備切削を行えば、生体試料を大きく露出させて所望の露出状態を得ることができる。そこで、ベクトルが第２所定値より大きい場合には、制御部によりベクトルが小さくなるように予備切削を行わせることで、包埋ブロック内の生体試料において自動的かつ確実に所望の露出状態を得ることができる。さらに、ベクトルの向きに基づいて包埋ブロックと切削刃との相対姿勢を制御することで、ベクトルの大きさを迅速かつ確実に小さくすることができる。
　なお、「露出部の中心」とは、生体試料の露出部の重心位置であっても、露出部の最大幅部分の中心であっても良い。同様に、「埋設部の中心」とは、生体試料の埋設部の重心位置であっても、埋設部の最大幅部分の中心であっても良い。

　本発明の第４の態様は、上記第１～第３の態様の薄切片作製装置において、制御部は、露出形態抽出部で抽出した露出形態が、埋設形態抽出部で抽出した埋設形態に近づくにつれて、予備切削の切削量が小さくなるように、予備切削を行わせる。
　この場合、包埋ブロックの予備切削工程において、包埋ブロック上の生体試料の露出部が生体試料の埋設部の所望領域と大きく離れている間は、予備切削の一回当たりの切削量を大きくして包埋ブロックを効率良く切削することができる。また、包埋ブロック上の生体試料の露出部が生体試料の埋設部の所望領域に近づくと、予備切削の一回当たりの切削量を小さくすることにより、所望の露出状態を通り過ぎることなく、生体試料において確実に所望の露出状態を得ることができる。また、包埋ブロックの表面をより平滑化することができる。
　本発明の第５の態様は、上記第１～第４の態様の薄切片作製装置において、包埋ブロックの表面を予備切削して、生体試料を所望の露出状態とする切削刃をさらに備える。

　本発明の第６の態様は、生体試料が包埋された包埋ブロックの表面を切削刃で予備切削して生体試料を所望の露出形態とした後、包埋ブロックを本切削して薄切片を切り出す薄切片作製方法であって、落射照明を照射して包埋ブロックの表面の撮像を行って、撮像データを取得する落射撮像データ取得工程と、拡散照明を照射して包埋ブロックの表面の撮像を行って、撮像データを取得する拡散撮像データ取得工程と、落射撮像データ取得工程で取得した撮像データを基にして、包埋ブロックの表面から露出している生体試料の露出部の露出形態を抽出する露出形態抽出工程と、拡散撮像データ取得工程で取得した撮像データを基にして、包埋ブロックに埋設されている生体試料の埋設部の埋設形態を抽出する埋設形態抽出工程と、包埋ブロックの表面に対して切削刃による予備切削を実行する予備切削実行工程と、露出形態抽出工程で抽出した露出形態と、埋設形態抽出工程で抽出した埋設形態とを比較して、予備切削の終了を判定する予備切削終了判定工程と、を備えている。

　上記本発明の態様によれば、落射撮像データ取得部と拡散撮像データ取得部とで取得した撮像データに基づいて、包埋ブロックにおける生体試料の露出形態と埋設形態とを抽出した後に、抽出した露出形態と埋設形態とを比較して予備切削の終了を判断する。そのため、包埋ブロック内の生体試料において、予備切削の段階で自動的にかつ確実に、所望の露出状態を得ることができる。

本発明の一実施形態に係る薄切片作製装置を示す概略構成図である。 拡散照明光下で包埋ブロックを撮像したときの撮像データを示す図である。 落射照明光下で包埋ブロックを撮像したときの撮像データを示す図である。 撮像データからの輪郭抽出を説明する図である。 拡散照明光下で包埋ブロックを撮像して得られた撮像データの生体試料の投影面積を示す図である。 落射照明光下で包埋ブロックを撮像して得られた撮像データの生体試料の露出面積を示す図である。 生体試料の露出部の中心から埋設部の中心に向かうベクトルを示す図である。 包埋ブロックの傾斜角度を変化させて切削を行ったときの撮像データを示す図である。 包埋ブロックの傾斜角度を変化させて切削を行ったときの撮像データの、図６Ａからの変化を示す図である。 包埋ブロックの傾斜角度を変化させて切削を行ったときの撮像データのさらなる変化を示す図である。 包埋ブロックの傾斜角度を変化させて切削を行ったときの撮像データのさらなる変化を示す図である。 包埋ブロックの傾斜角度を変化させて切削を行ったときの撮像データのさらなる変化を示す図である。 本発明の一実施形態に係る薄切片作製装置における、制御の流れを示すフローチャートである。 本発明の一実施形態に係る薄切片作製装置における、制御の流れを示すフローチャートである。 本発明の一実施形態に係る薄切片作製装置における、制御で用いる面積の比率Ｒの到達度ｒに関する関数β＝ｆ（ｒ）を示すグラフである。

　以下、本発明の一実施形態を図面に基づいて説明する。
　薄切片作製装置１は、図１に示すように、生体試料Ｓがパラフィン（包埋剤）Ｐに包埋された包埋ブロックＢを予備切削した後に、包埋ブロックＢを本切削することで薄切片を作製する装置である。なお、生体試料Ｓとは、例えば、人体及び実験動物等から取り出した臓器等の組織であり、医療分野、製薬分野、食品分野、生物分野等で適時選択される組織である。

　本実施形態の薄切片作製装置１は、図１に示すように、包埋ブロックＢが固定される台部２と、一仮想平面Ｈに沿って移動する切削刃３と、包埋ブロックＢに対して落射照明光を照射する落射照明系４と、包埋ブロックＢに対して拡散照明光を照射する拡散照明系５と、落射照明系４または拡散照明系５による照明光下において台部２上の包埋ブロックＢを撮像する撮像部３０と、撮像部３０で撮像された画像及び撮像された画像に処理を施した処理画像を表示するモニター３３と、上記の各構成部材を総合的に制御する総合制御部８とを備えている。

　台部２は、包埋ブロックＢが載置される支持台１０と、一仮想平面Ｈ上で互いに直交するＸ軸及びＹ軸の２軸回りにそれぞれ支持台１０を回動させる回動機構１１と、一仮想平面Ｈに直交するＺ軸方向に支持台１０を移動させる移動機構１２とを有している。また、台部２は、落射照明系４の光軸Ｃ上に配置されている。

　回動機構１１は、支持台１０をＹ軸回りに回動させるＹ軸回動機構１１ａと、支持台１０をＸ軸回りに回動させるＸ軸回動機構１１ｂとから構成されており、総合制御部８からの指示に基づいて作動する。
　移動機構１２は、回動機構１１及び支持台１０をＺ軸方向に移動させ、回動機構１１と同様に総合制御部８からの指示に基づいて作動する。

　切削刃３は、Ｘ軸方向に移動する切削刃移動機構１５に接続されることにより、一仮想平面Ｈに沿って移動する。切削刃移動機構１５は、総合制御部８からの指示を受けて作動し、これにより切削刃３の移動速度（切削速度）及び切削タイミング等が制御される。
　また、総合制御部８は、台部２の移動機構１２を制御する高さ調整部４３と、台部２の回動機構１１を制御する角度調整部４４と、を含む制御部４５を備えている。
　制御部４５は、包埋ブロックＢの予備切削工程においては、包埋ブロックＢの表面に生体試料Ｓの断面の大きい特定領域が露出するように、高さ調整部４３を制御する。高さ調整部４３により、移動機構１２が包埋ブロックＢを適宜上昇させて切削量が調整される。また、制御部４５は、切削刃移動機構１５を制御して切削刃３による包埋ブロックＢの切削を実行させる。

　落射照明系４は、一仮想平面Ｈに直交し支持台１０上の包埋ブロックＢの表面（切削面）に向かう光軸Ｃを有している。落射照明系４は、複数のＬＥＤ２０が面状に配置された面光源２１と、面光源２１から照射された光を平行光にするための図示しない光学系と、平行光を支持台１０上の包埋ブロックＢの表面に向かうように反射させるとともに包埋ブロックＢからの反射光を透過させるハーフミラー２２と、を有している。なお、光源としては、面光源２１ではなく、点光源からの光をピンホール及びコリメートレンズを通過させて平行光にする構成であっても良い。また、本実施形態では、光源（面光源２１）から照射された光をハーフミラー２２で反射させて包埋ブロックＢの表面に向かう光軸Ｃを得るようにしている。しかし、ハーフミラー２２を設けずに、光源を包埋ブロックＢの表面と直接対向するように配置して光軸Ｃを得るようにしても良い。
　また、拡散照明系５は、拡散照明光を照射する光源２５を有している。

　撮像部３０は、図示しない撮像素子を備え、撮像軸が光軸Ｃと合致するように設定されている。また、撮像部３０は、落射照明系４の照明光下と、拡散照明系５の照明光下とにおいて、それぞれ包埋ブロックＢを鉛直上方から撮像する。撮像部３０で撮像された各撮像データは、図示しない画像記憶部に一度記憶され、後に詳述する総合制御部８に出力される。
　なお、以下では、落射照明系４の照明光下で撮像された包埋ブロックＢの撮像データを落射撮像データと呼び、拡散照明系５の照明光下で撮像された包埋ブロックＢの撮像データを拡散撮像データと呼ぶ。
　また、本実施形態においては、落射照明系４と撮像部３０とが落射撮像データ取得部を構成し、拡散照明系５と撮像部３０とが拡散撮像データ取得部を構成している。

　図２Ａは、台部２の回動機構１１を初期角度にして包埋ブロックＢの予備切削を開始した直後における、拡散照明光下での包埋ブロックＢの撮像データを示し、図２Ｂは、落射照明光下での包埋ブロックＢの撮像データを示す。
　拡散照明光は、図２Ａに示すように、包埋ブロックＢの内部にまで入り込んで、包埋ブロックＢの表面に露出していない生体試料Ｓ部分に当たって反射する。そのため、生体試料Ｓの光軸Ｃ方向の投影部分の全体の輝度が生体試料Ｓの周域部分とは異なる。
　これに対して、落射照明光は、パラフィンＰが存在する部分では鏡面反射する。しかし、落射照明光は、生体試料Ｓ部分では散乱する。そのため、図２Ｂに示すように、包埋ブロックＢの表面（切削面）に生体試料Ｓが露出している場合には、生体試料Ｓの部分とパラフィンＰの部分とで反射光の強度に差が生じる。つまり、包埋ブロックＢの露出している部分と周囲の部分とは、輝度が異なる。

　総合制御部８は、撮像部３０から入力された落射撮像データを基にして、包埋ブロックＢの表面から光軸Ｃ方向に露出している生体試料Ｓの露出面積Ｓ１（露出形態。図５参照。）を算出する露出面積算出部４０（露出形態抽出部）と、撮像部３０から入力された拡散撮像データを基にして、包埋ブロックＢに埋設されている生体試料Ｓの光軸Ｃ方向の投影面積Ｓ０（埋設形態。図５参照。）を算出する投影面積算出部４１（埋設形態抽出部）と、撮像部３０から入力された落射撮像データと拡散撮像データとを基にして、生体試料Ｓの露出面積Ｓ１部分（露出部）の中心Ｇ１（例えば、重心位置）から生体試料Ｓの投影面積Ｓ０部分（埋設部）の中心Ｇ０（例えば、重心位置）に向かうベクトルＶの向き及び大きさを算出するベクトル算出部４２（ベクトル算出部）と、を備えている。
　なお、上記の中心Ｇ１，Ｇ０は、露出面積Ｓ１部分（露出部）及び投影面積Ｓ０部分（埋設部）の各重心位置に限らず、露出面積Ｓ１部分及び投影面積Ｓ０部分のＸ方向の最大幅部分の中心線と、Ｙ方向の最大幅部分の中心線とが交わる点であっても良い。

　総合制御部８の露出面積算出部４０、投影面積算出部４１、及び、ベクトル算出部４２においては、撮像部３０から入力される落射撮像データと拡散撮像データとを基にして、生体試料Ｓの露出部分の輪郭と埋設部分の輪郭とを求める。
　図３は、生体試料Ｓの露出部及び埋設部の輪郭の求め方の一例を示す包埋ブロックＢの撮像データである。
　撮像データから生体試料Ｓの存在領域を抽出する場合には、輝度による二値化により生体試料Ｓの存在領域を抽出することもできる。あるいは、図３中の矢印で示すように、画像の外側から中心に向かって輝度の微分を行い、微分値が閾値を超える最初の点をエッジとして検出し、これらのエッジを結ぶことによって生体試料Ｓの輪郭を効率良く抽出することができる。なお、このようにして物体の輪郭を抽出する際は、必要に応じて画像のスムージング（ぼかし処理）を前処理として行っても良い。スムージングを行った場合には、微分による雑音を低減することができる。

　図４Ａは、包埋ブロックＢ内の生体試料Ｓの埋設部の投影面積Ｓ０を示し、図４Ｂは、包埋ブロックＢ上の生体試料Ｓの露出部の露出面積Ｓ１を示す。
　生体試料Ｓの埋設部の投影面積Ｓ０と露出部の露出面積Ｓ１とは、例えば、上述のようにして抽出した埋設部の輪郭と露出部の輪郭とを基にして、投影面積算出部４１と露出面積算出部４０とで算出することができる。

　図５は、図４Ａ，４Ｂの画像を重ね合わせて、包埋ブロックＢ内の生体試料Ｓの投影面積Ｓ０部分の中心Ｇ０から露出面積Ｓ１部分の中心Ｇ１に向かうベクトルＶを示した図である。ベクトルＶは、ベクトル算出部４２において、投影面積Ｓ０部分の中心Ｇ０の座標から、露出面積Ｓ１部分の中心Ｇ１の座標を減算することによって求めることができる。
　なお、ベクトルＶを求めるに際しては、落射照明光下の撮像データと拡散照明光下の撮像データとを直接重ね合せる必要はなく、数値データのみによって処理を行っても良い。

　また、総合制御部８の制御部４５は、露出面積算出部４０で算出した露出面積Ｓ１と投影面積算出部４１で算出した投影面積Ｓ０とを比較する。投影面積Ｓ０に対する露出面積Ｓ１の比率Ｒ（Ｓ１／Ｓ０）が第１所定値Ｒｅ（例えば、８０％）よりも大きくなったとき、つまり、生体試料Ｓの露出状態が所望の露出状態となったときに、移動機構１２，１５の作動を停止させる（すなわち、包埋ブロックＢの予備切削を完了する）。

　さらに、制御部４５は、包埋ブロックＢの予備切削中に、露出面積算出部４０で算出した露出面積Ｓ１が、投影面積算出部４１で算出した投影面積Ｓ０に近づくと、近づく程度に応じて支持台１０のＺ方向の移動量（切削刃３による切削量）が小さくなるように台部２の移動機構１２を制御する。

　また、制御部４５は、ベクトル算出部４２で算出したベクトルＶの大きさが第２所定値（例えば、包埋ブロックＢの各辺の平均長さの５％）よりも大きいときには、算出されるベクトルＶの絶対値が小さくなるように（すなわち、現在算出されたベクトルＶを打ち消すように）、ベクトルＶの向きに基づいて台部２の回動機構１１を制御する。これにより、切削刃３に対する包埋ブロックＢの相対姿勢が調整され、切削刃３による予備切削が実行される。

　また、図６Ａ～６Ｅは、ベクトル算出部４２で求めたベクトルＶを０に近づけるように（すなわち、包埋ブロックＢの切削面を一仮想平面Ｈに対して平行にするように）台部２の回動機構１１の傾斜角度を変化させて包埋ブロックＢの予備切削を行ったときの、重ね合せた撮像データの変化の様子を順次示す図である。
　図６Ａ～６Ｅに順次示すように、ベクトルＶを０に近づけるように回動機構１１の傾斜角度を変化させて包埋ブロックＢの切削を進めた場合、切削が進行すると一仮想平面Ｈから離間するように切削ラインＬが移動する。そして、この切削ラインＬの進行とともに切削面全体の傾斜角度が修正される。この結果、ベクトルＶは、図６Ａと比較して図６Ｅでは小さくなる。

　次に、薄切片作製装置１の総合制御部８による制御を、図７，図８に示すフローチャートに沿って説明する。
　図７に示すように、ステップＳ１０１において、包埋ブロックＢを台部２の支持台１０上にセットし、ステップＳ１０２において、回動機構１１を初期状態にして、支持台１０を水平にする。
　ステップＳ１０３においては、切削刃３による包埋ブロックＢの一回当たりの切削量（移動機構１２の上昇量）を初期値Ｔｓにセットして、切削刃３による包埋ブロックＢの予備切削を開始する。なお、初期値Ｔｓはユーザーが適宜設定する。
　ステップＳ１０４では、撮像部３０によって落射照明光下で包埋ブロックＢの撮像を行って落射撮像データを取得する。
　ステップＳ１０５においては、例えば、落射撮像データに基づいて生体試料Ｓの露出部の領域抽出を行い、抽出領域の面積が予め設定した値よりも大きいか否かによって包埋ブロックＢの外面から生体試料Ｓが露出したか否かを判定する。
　ステップＳ１０５において、Ｎｏの場合（露出しない場合）には、ステップＳ１０３に戻って再度切削を行い、Ｙｅｓになった（露出した）時点で、ステップＳ１０６へと進む。

　ステップＳ１０６においては、撮像部３０によって拡散照明光下で包埋ブロックＢの撮像を行い、拡散撮像データに基づいて生体試料Ｓの埋設部の領域抽出を行った後に、投影面積Ｓ０と、投影面積Ｓ０部分の中心Ｇ０とを算出する。
　ステップＳ１０７においては、撮像部３０によって落射照明光下で包埋ブロックＢの撮像を行い、落射撮像データに基づいて生体試料Ｓの露出部の領域抽出を行った後に、露出面積Ｓ１と、露出面積Ｓ１部分の中心Ｇ１とを算出する。
　ステップＳ１０８においては、投影面積Ｓ０と露出面積Ｓ１との比率Ｒ（Ｒ＝Ｓ１／Ｓ０）を算出する。

　ステップＳ１０９においては、面積の比率Ｒが、ユーザーが適宜設定する第１所定値Ｒｅ（例えば、８０％）よりも大きいか否かを判定する。Ｙｅｓの場合には、包埋ブロックＢの表面が所望の露出状態となっているとして予備切削を完了する。また、ステップＳ１０９での判定がＮｏの場合には、包埋ブロックＢの表面が所望の露出状態となっていないとしてステップＳ１１０に進む。なお、初めてステップＳ１０９に進んだ場合には、包埋ブロックＢの表面からの生体試料Ｓの露出は僅かであるため、ステップＳ１１０に進む。

　ステップＳ１１０では、露出面積Ｓ１部分の中心Ｇ１から投影面積Ｓ０部分の中心Ｇ０に向かうベクトルＶの向きと大きさを算出する。
　ステップＳ１１１では、ステップＳ１１０で求めたベクトルＶの絶対値が、ユーザーが適宜設定する第２所定値Ｖ０よりも大きいか否かを判定する。Ｙｅｓの場合（第２所定値Ｖ０よりも大きい場合）には、包埋ブロックＢの表面を効率良く所望の露出状態にするように切削するために、包埋ブロックＢの傾斜姿勢が適正でないとして後に詳述する角度補正切削処理Ｓ１１２へと進む。Ｎｏの場合（ベクトルＶ０以下の場合）には、包埋ブロックＢの傾斜姿勢が適正であるとしてステップＳ１１３に進む。

　ステップＳ１１３においては、ステップＳ１０８で求めた面積の比率Ｒに応じた切削刃３による切削厚みｔ（＝支持台１０の上昇量）を後に詳述する方法で算出する。
　ステップＳ１１４においては、ステップＳ１１３で算出した切削厚みｔ（＝支持台１０の上昇量）で、切削刃３による予備切削を継続する。ステップＳ１１４の次にはステップＳ１０６に戻り、ステップＳ１０９で面積の比率Ｒが第１所定値Ｒｅよりも大きくなるまで同様のループを繰り返す。

　ステップＳ１１３の切削厚みｔは、例えば、以下の式（１）に基づいて算出する。
　ｔ＝Ｔｅ＋β×Ｔｓ　　　　　　　　　…（１）
　Ｔｅ：最終切削厚み（本切削での切削厚み），β：加速係数，Ｔｓ：初期値（予備切削開始時の厚み）
　なお、Ｔｅ及びＴｓは、ユーザーが適宜設定する値である。
　また、加速係数βは、面積の比率Ｒの到達度を、ｒ（ｒ＝Ｒ／Ｒｅ）とすると、ｒの単調減少関数であるｆによって、β＝ｆ（ｒ）として求めることができる。ただし、関数ｆ（ｒ）は、ｒ＝０でβ＝１となり、ｒ＝１でβ＝０となる。
　したがって、ステップＳ１１３で算出される切削厚みｔは、面積の比率Ｒの到達度ｒ（＝Ｒ／Ｒｅ）が１に近づくにつれて次第に小さくなる。このとき当然のことながら、支持台１０の移動量も、面積の比率の到達度ｒ（＝Ｒ／Ｒｅ）が１に近づくにつれて次第に小さくなる。

　上記の単調減少関数β＝ｆ（ｒ）は、図９に示すように、ｒの増加に応じて上に凸の円弧を描いて値が減少する関数であることがさらに望ましい。この場合、到達度ｒが０から１に近づくにしたがって加速係数βがより速いペースで０に近づき、切削厚みｔも急激に小さくなる。したがって、より迅速に最終切削厚みＴｅに近づけることができる。

　図８は、角度補正切削処理Ｓ１１２の具体的な処理の流れを示すフローチャートである。
　ステップＳ２０１においては、直前にステップＳ１１０で求めたベクトルＶのＸ，Ｙ成分（Ｖｘ，Ｖｙ）を算出する。
　ステップＳ２０２においては、ベクトルＶを０に近づけるように、ベクトルＶの向きに基づいて台部２のＸ軸回動機構１１ｂとＹ軸回動機構１１ａとの傾斜角度を調整する。つまり、ステップＳ２０２においては、Ｘ軸回動機構１１ｂとＹ軸回動機構１１ａとに対して、Ｘ＝Ｖｘ×α，Ｙ＝Ｖｙ×αの指示値を出力する。なお、αは、実験によって求めた係数である。

　ステップＳ２０３では、ステップＳ２０２で回動機構１１（Ｘ軸回動機構１１ｂ及びＹ軸回動機構１１ａ）の傾斜角度を調整して予備切削を行った場合に、包埋ブロックＢの表面（切削面）の全域が平坦になるまでの総切削量（移動機構１２の上昇量）を算出して決定する。総切削量は、包埋ブロックＢの傾斜角度及びサイズ等から算出することができる。

　ステップＳ２０４では、傾斜角度を調整した包埋ブロックＢに対して、予め設定した切削厚みで予備切削を行う。このように切削予備切削を進めると、図６Ａ～６Ｅに示すように、傾斜角度調整当初に切削刃３に近接していた領域から離間していた領域に切削ラインＬが次第に移動する。
　ステップＳ２０５では、総切削量がステップＳ２０３で決定した値に達したか否かを判定する。Ｙｅｓの場合には、角度補正切削処理Ｓ１１２を終了し、Ｎｏの場合には、ステップＳ２０４に戻って予備切削を継続する。
　角度補正切削処理Ｓ１１２を終了した後には、図７のステップＳ１０６に戻り、ステップＳ１０９で面積の比率Ｒが第１所定値Ｒｅよりも大きくなるまで、前述のループを繰り返す。

　以上で制御の流れを説明したように、本実施形態の薄切片作製装置１は、薄切片の本切削の前段階の予備切削において、以下の工程から成る方法を採用している。
　（ａ）落射撮像データ取得工程（ステップＳ１０７）
　落射照明光を包埋ブロックＢの表面に対して直角に照射し、照射した状態で包埋ブロックＢの表面の撮像を行い、落射撮像データを取得する工程。
　（ｂ）拡散撮像データ取得工程（ステップＳ１０６）
　拡散照明光を包埋ブロックＢに照射し、照射した状態で包埋ブロックＢの表面の撮像を行い、拡散撮像データを取得する工程。
　（ｃ）露出形態抽出工程（ステップＳ１０７）
　落射撮像データ取得工程で取得した落射撮像データを基にして、包埋ブロックＢの表面から露出している生体試料Ｓの露出部の露出面積（露出形態）を算出（抽出）する工程。
　（ｄ）埋設形態抽出工程（ステップＳ１０６）
　拡散撮像データ取得工程で取得した拡散撮像データを基にして、包埋ブロックＢに埋設されている生体試料Ｓの埋設部の投影面積（埋設形態）を算出（抽出）する工程。
　（ｅ）予備切削実行工程（ステップＳ１１４）
　包埋ブロックＢの表面に対して切削刃３による予備切削を実行する工程。
　（ｆ）予備切削終了判定工程（ステップＳ１０９）
　露出形態抽出工程で算出（抽出）した露出面積（露出形態）と、埋設形態抽出工程で算出（抽出）した投影面積（埋設形態）とを比較して、包埋ブロックＢに対する予備切削の終了を判定する工程。

　以上のように、本実施形態の薄切片作製装置１においては、包埋ブロックＢの予備切削の工程において、包埋ブロックＢに対して落射照明光下と拡散照明光下とで、それぞれ撮像部３０により撮像を行う（撮像データを取得する）。ここで取得した撮像データ（落射撮像データ及び拡散撮像データ）を基にして生体試料Ｓの露出面積Ｓ１と投影面積Ｓ０とを算出し、投影面積Ｓ０に対する露出面積Ｓ１の比率Ｒが第１所定値Ｒｅよりも大きくなった場合に、包埋ブロックＢの切削を自動的に停止する。そのため、包埋ブロックＢ内の生体試料Ｓの断面積の大きい所望領域を自動的に、かつ確実に表面に露出させることができる。
　したがって、薄切片作製装置１を用いる場合には、包埋ブロックＢの予備切削の工程において、包埋ブロックＢの切削量の判断及び指示を作業者が勘に頼ってその都度行う必要がないため、作業者の負担を大幅に軽減することができる。

　また、本実施形態の薄切片作製装置１は、包埋ブロックＢの予備切削において、包埋ブロックＢ上の生体試料Ｓの露出面積Ｓ１が包埋ブロックＢ内の生体試料Ｓの投影面積Ｓ０に近づくにつれて、包埋ブロックＢに対する切削量が小さくなるように移動機構１２が制御される。そのため、包埋ブロックＢの表面（切削面）が生体試料Ｓの所望領域に近づくまでは、一回当たりの切削量を大きくして包埋ブロックＢを効率良く切削することができ、さらに、生体試料Ｓの所望領域に近づくにつれて一回当たりの切削量を次第に小さくして、包埋ブロックＢの切削面の表面の荒れを少なくすることができる。
　したがって、薄切片作製装置１を用いることにより、包埋ブロックＢの予備切削において、切削効率の向上（作業の迅速化）と包埋ブロックＢの最終切削面の平滑化とを図ることができる。

　さらに、本実施形態の薄切片作製装置１においては、包埋ブロックＢの落射撮像データと拡散撮像データとを取得するとともに、これらの撮像データに基づいてベクトル算出部４２によって生体試料Ｓの露出面積Ｓ１部分の中心Ｇ１から投影面積Ｓ０部分の中心Ｇ０に向かうベクトルＶの大きさ及び向きを算出する。ベクトル算出部４２で算出したベクトルＶの絶対値が第２所定値Ｖ０よりも大きいときに、ベクトルＶが０に近づくように回動機構１１を制御して切削刃３による予備切削を行うため、包埋ブロックＢの現在の表面（切削面）の傾斜角度が生体試料Ｓの所望領域を通る面に対して大きくずれているときに、包埋ブロックＢの角度を適正に補正して包埋ブロックＢの予備切削を行うことができる。
　したがって、薄切片作製装置１を用いることにより、包埋ブロックＢの表面の傾斜角度が生体試料Ｓの所望領域を通る面に対して大きくずれている場合に、生体試料Ｓの所望領域を適正な角度で効率良く削り出すことができる。

　なお、本発明は上記の実施形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で種々の設計変更が可能である。
　上記の実施形態においては、取得した落射撮像データと拡散撮像データとを基にして、生体試料の露出部の面積と埋設部の面積とをそれぞれ算出するとともに、その算出結果を比較して予備切削の終了を判定するようにしている。しかし、例えば、取得した落射撮像データと拡散撮像データとを基にして、生体試料の露出部の輪郭と埋設部の輪郭とを抽出し、抽出した露出部と埋設部との輪郭が相似形状であるか、または両者の周長差が所定値以下であるときに、予備切削を終了するようにしても良い。
　つまり、露出形態抽出部及び埋設形態抽出部では、生体試料の露出部と埋設部の面積を算出して求めるばかりではなく、露出部及び埋設部の輪郭形状または輪郭長さ等、その他の形態の特性を抽出しても良い。

　本発明は、理化学実験及び顕微鏡観察等に用いられる薄切片標本を作製する前段階として、生体試料が包埋された包埋ブロックを薄切して薄切片を作製する薄切片作製装置及び薄切片作製方法に適用可能である。

　１　　薄切片作製装置
　２　　台部
　３　　切削刃
　４　　落射照明系（落射撮像データ取得部）
　５　　拡散照明系（拡散撮像データ取得部）
　３０　　撮像部（落射撮像データ取得部，拡散撮像データ取得部）
　４０　　露出面積算出部（露出形態抽出部）
　４１　　投影面積算出部（埋設形態抽出部）
　４２　　ベクトル算出部（ベクトル算出部）
　４５　　制御部（制御部）
　Ｂ　　包埋ブロック
　Ｃ　　光軸
　Ｐ　　パラフィン（包埋剤）
　Ｒｅ　　第１所定値
　Ｓ　　生体試料
　Ｖ　　ベクトル
　Ｖ０　　第２所定値

Claims (6)

1. 　落射照明を照射して、生体試料が包埋された包埋ブロックの表面の撮像を行って、撮像データを取得する落射撮像データ取得部と、
   　拡散照明を照射して前記包埋ブロックの表面の撮像を行って、撮像データを取得する拡散撮像データ取得部と、
   　前記落射撮像データ取得部で取得した撮像データを基にして、前記包埋ブロックの表面から露出している前記生体試料の露出部の露出形態を抽出する露出形態抽出部と、
   　前記拡散撮像データ取得部で取得した撮像データを基にして、前記包埋ブロックに埋設されている前記生体試料の埋設部の埋設形態を抽出する埋設形態抽出部と、
   　前記露出形態抽出部で抽出した前記露出形態と、前記埋設形態抽出部で抽出した前記埋設形態とを比較して、前記予備切削の終了を判定する、前記予備切削の動作を制御する制御部と、
   を備える、薄切片作製装置。
2. 　前記露出形態抽出部は、前記露出形態として、前記包埋ブロックの表面から露出している前記生体試料の露出面積を求め、
   　前記埋設形態抽出部は、前記埋設形態として、前記包埋ブロックに埋設されている前記生体試料の投影面積を求め、
   　前記制御部は、前記露出形態抽出部で求めた前記露出面積と前記埋設形態抽出部で求めた投影面積との比率が第１所定値よりも大きくなったときに、前記予備切削を終了させる、請求項１に記載の薄切片作製装置。
3. 　前記落射撮像データ取得部で取得した撮像データを基にして、前記生体試料の露出部の中心を求めるとともに、前記拡散撮像データ取得部で取得した撮像データを基にして、前記生体試料の埋設部の中心を求め、前記露出部の中心から前記埋設部の中心に向かうベクトルの向き及び大きさを算出するベクトル算出部をさらに備え、
   　前記制御部は、前記ベクトル算出部で算出したベクトルの大きさが第２所定値よりも大きいときに、前記ベクトルが小さくなるように前記ベクトルの向きに基づいて前記包埋ブロックと前記切削刃との相対姿勢を制御して、前記予備切削を行わせる、請求項１または２に記載の薄切片作製装置。
4. 　前記制御部は、前記露出形態抽出部で抽出した前記露出形態が、前記埋設形態抽出部で抽出した前記埋設形態に近づくにつれて、前記予備切削の切削量が小さくなるように、前記予備切削を行わせる、請求項１～３のいずれか１項に記載の薄切片作製装置。
5. 　前記包埋ブロックの表面を予備切削して、前記生体試料を所望の露出状態とする切削刃をさらに備える、請求項１～４のいずれか１項に薄切片作製装置。
6. 　生体試料が包埋された包埋ブロックの表面を切削刃で予備切削して前記生体試料を所望の露出状態とした後、前記包埋ブロックを本切削して薄切片を切り出す薄切片作製方法であって、
   　落射照明を照射して前記包埋ブロックの表面の撮像を行い、撮像データを取得する落射撮像データ取得工程と、
   　拡散照明を照射して前記包埋ブロックの表面の撮像を行い、撮像データを取得する拡散撮像データ取得工程と、
   　前記落射撮像データ取得工程で取得した撮像データを基にして、前記包埋ブロックの表面から露出している前記生体試料の露出部の露出形態を抽出する露出形態抽出工程と、
   　前記拡散撮像データ取得工程で取得した撮像データを基にして、前記包埋ブロックに埋設されている前記生体試料の埋設部の埋設形態を抽出する埋設形態抽出工程と、
   　前記包埋ブロックの表面に対して切削刃による予備切削を実行する予備切削実行工程と、
   　前記露出形態抽出工程で抽出した前記露出形態と、前記埋設形態抽出工程で抽出した前記埋設形態とを比較して、前記予備切削の終了を判定する予備切削終了判定工程と、
   を備えている、薄切片作製方法。

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