WO2012166005A1 - Белково-полипептидный комплекс специфического действия на кожную ткань, способ его получения и фармкомпозиция на его основе - Google Patents

Белково-полипептидный комплекс специфического действия на кожную ткань, способ его получения и фармкомпозиция на его основе Download PDF

Info

Publication number
WO2012166005A1
WO2012166005A1 PCT/RU2012/000140 RU2012000140W WO2012166005A1 WO 2012166005 A1 WO2012166005 A1 WO 2012166005A1 RU 2012000140 W RU2012000140 W RU 2012000140W WO 2012166005 A1 WO2012166005 A1 WO 2012166005A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
tissue
skin
kda
pharmaceutical composition
Prior art date
Application number
PCT/RU2012/000140
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Анна Борисовна НАЗАРЕНКО
Михаил Анатольевич СОКОЛОВ
Original Assignee
Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" filed Critical Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез"
Priority to EP12793726.6A priority Critical patent/EP2730586B1/en
Publication of WO2012166005A1 publication Critical patent/WO2012166005A1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/02—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/36—Skin; Hair; Nails; Sebaceous glands; Cerumen; Epidermis; Epithelial cells; Keratinocytes; Langerhans cells; Ectodermal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/005—Preparations for sensitive skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/02—Preparations for care of the skin for chemically bleaching or whitening the skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2/00—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/74—Biological properties of particular ingredients
    • A61K2800/78—Enzyme modulators, e.g. Enzyme agonists
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/74—Biological properties of particular ingredients
    • A61K2800/78—Enzyme modulators, e.g. Enzyme agonists
    • A61K2800/782—Enzyme inhibitors; Enzyme antagonists
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types

Definitions

  • the invention relates to a biologically active substance - a protein-polypeptide complex (BOD), obtained from the tissues of the skin, brain and spinal cord of ungulates of farm animals and is intended as an active substance for the production of drugs that stimulate physiological and reparative regeneration, in the treatment of diseases and traumatic skin lesions, as well as for use in the manufacture of drugs in aesthetic medicine, cosmetology and the method of its production.
  • BOD protein-polypeptide complex
  • I is the ionic strength of the solution
  • composition is a pharmaceutical composition.
  • a biologically active substance is a BOD with a molecular weight of its protein-polypeptide components ranging from 5 to 200 kDa and a molecular weight fraction ranging from 20 to 160 kDa of at least 70%, a total protein concentration of 0.1 - 4.2 mg / ml, with a maximum absorption of the ultraviolet spectrum of the solution at a wavelength of 215 ⁇ 5 nm in the UV-visible region with a wavelength range of 200 - 500 nm (Fig.
  • BOD was obtained by ion exchange chromatography of the filtrate of the extracted homogenate of the nervous and skin tissues of ungulates of agricultural animals, gestational period from the middle of the first third to the middle of the latter in the presence of a buffer solution, detergents and solubilizers.
  • a number of peptide preparations are known from raw materials of animal origin with regenerative activity, which are used to treat skin diseases. The closest, according to the achieved effect, are:
  • peptide extract of the placenta and its method [1] which consists in the salt extraction of the placenta homogenate with 10 mm Na-phosphate buffer pH - 7.0 in the presence of 0.1 mm EDTA and Triton-100 after 3 hours at a temperature of + 4 ° C followed by a phase for removing hormones from the eluent after centrifugation in the presence of polyglucin and activated carbon, bringing the temperature of the mixture to + 40 ° - + 45 ° C and leaving for 4 hours at room temperature.
  • the resulting eluent from a centrifuged mixture contains 5–35 mg / ml protein, 2–5 mg / ml glycoproteins, and 0.5–1 mg / ml Triton X100.
  • a rather high yield in terms of the amount of obtained proteins should be noted.
  • the proteins obtained in the extract are not characterized by standard physicochemical methods (mass, optical density, phoresis, etc.) of the proteins, and the presence of a significant amount of glycoproteins suggests that the extract is highly immunogenic and allergenic;
  • the resulting target product contains altered, denatured hydrolysis products with impaired quaternary and tertiary structures, as well as decay products of many active molecules, which determines its low biological activity; - a method of biological skin rejuvenation [4], this method Offers the intradermal and subcutaneous administration of dispersed Alloplant biomaterial [5], which has the ability to attract macrophage cells with stimulation of their maturation, restoration
  • the embryo extract is obtained by homogenization and extraction in saline, ultracentrifugation, followed by filtration of the supernatant.
  • the extract obtained contains various molecular fractions not characterized by standard physicochemical methods, water-soluble denatured proteins, peptides, peptidoglycans, lipoproteins that are not amenable to standardization, the external use of which is quite immunogenic with a low biological effect;
  • a regenerating cosmetic cream for skin care which contains, along with growth factors, including 5 interleukin-2, erythropoietin, epidermal growth factor and leukocyte growth hormone, metabolic products of human and / or animal white blood cells in the following quantitative components cream (May.%): culture medium with growth factors and products of leukocyte cell metabolism - 0.7 - 8.5; biologically active substances of natural and chemical origin - 7.0 - 27.0, obtained from a nutrient medium in which human and / or animal cells (for example, white blood cells) were incubated in the presence of osmatotropin.
  • This composition does not contain cytoplasmic, nuclear and membrane proteins and polypeptides that play an important role.
  • the concentration of growth factors and hormones secreted by leukocytes is not optimal, but is a product of their vital activity and metabolism, which significantly reduces the biological activity of the composition, stimulating physiological regeneration and
  • composition for skin care containing the following components: a retinoid selected from the group consisting of an alcohol form of vitamin A, an aldehyde form of vitamin A, retinyl acetate,
  • retinyl palmitate and mixtures thereof an oil phase having a low level of unsaturation
  • a stabilizing system selected from the group consisting of at least one oil-soluble antioxidant, a chelating agent, licorice extract, hydroquinone, koi acid, gotulin A, micromerol, glutathione, 1_-ascorbyl-2 magnesium phosphate, arbutin, placenta extract and mixtures thereof [8].
  • the known composition with prolonged application can cause hypertension syndrome, does not have sufficient regenerating and anti-aging effect.
  • a cosmetic product for skin care based on developing mammalian embryos containing a gel base and components based on an extract of developing mammalian embryos (embryos), for example cattle [9].
  • embryos developing mammalian embryos
  • the composition contains (10-30)% extract of the animal embryo and (90-70)% of the base in the form of a gel.
  • the drug is applied to the skin of the face and body to rejuvenate skin cells, protect against wrinkles, increase skin resistance and slow down tissue aging.
  • this cosmetic product has a systemic hormonal activity affecting the entire body, which has contraindications for use, as well as insufficient regenerative effect on the skin, without tissue-specific growth factors and factors associated with the prevention of withering and aging of the skin, preservation and increase its elasticity and maintaining good condition for a long time;
  • RNA proteins from the nuclei and cytoplasm of cells of any embryonic tissues (taken as an example of tissue of the brain, liver, thymus and spleen of piglets in various ratios)
  • This method of obtaining the target product allows to obtain denatured low molecular weight fractions of peptides due to exposure to acid extraction and boiling during isolation, which absolutely changes the quaternary, tertiary structure not characterized by standard physicochemical peptide methods and, as a result, reduces the biological and physiological activity of the resulting products;
  • Closest to the claimed group of inventions is a method for producing a biologically active complex with a neuroregerative and neuroprotective effect [1 1].
  • This method allows to obtain a mixture of proteins and polypeptides from the brain of farm animal embryos taken at a certain stage of gestation (from the beginning of the middle third to the middle of the last third) by anion exchange chromatography, using a pre-filtered tissue homogenate supernatant with pH buffer solution to apply to a balanced column 7.2-8.4, the desired fractions are obtained by separating carrier-bound proteins and polypeptides using 0.05M TRIS-glycine buffer as a mobile phase, containing 0.1 mM EDTA and 1 M NaCI, increasing the concentration in a stepwise gradient in 5% increments.
  • the complex obtained by the above method is ultrafiltered on a 5 kDa membrane and desalted.
  • the characteristics of the target protein-polypeptide fraction are checked by the methods of ultraviolet spectrometry, gel chromatography, denaturing polyacrylamide gel electrophoresis and amino acid analysis.
  • the biologically active complex obtained by the above method has a maximum absorption of the ultraviolet spectrum at a wavelength of 280 + 5nm and a protein content of 5 to 10 kDa comprising at least 95% of the total protein content.
  • the use of 1 M NaCI in the preparation of this complex at the stage of anion exchange chromatography as a part of the mobile phase creates too high ionic strength of the mobile phase equal to 1 mol / L, and the inclusion of EDTA and TRIS in it further increases it.
  • the obtained target fraction contains a large number of acidic highly charged proteins and polypeptides that have mainly membrane localization in the brain tissue cells, which mainly perform structural functions and only in a small regulatory degrees, not having not only tissue-specific, but also pronounced biological activity.
  • a further stepwise increase in salt concentration in increments of 5% further increases the presence of these proteins, increasing the biological inertness of the mixture, thereby reducing its activity.
  • embryonic brain in the preparation of this complex as a raw material determines the presence of tissue-specific proteins that regulate the physiological and reparative processes of mainly nervous tissue, exerting an unexpressed systemic effect, therefore, the spectrum of biological activity is aimed at correcting and treating impaired functions and diseases of the nervous system.
  • the main objective of the invention is the creation of an effective natural protein-polypeptide complex that meets modern international safety requirements for pharmaceutical preparations.
  • the main task set for the authors was to obtain a biologically active complex that stimulates the physiological and reparative regeneration of skin tissue for the treatment of diseases and traumatic skin lesions, as well as for use in the manufacture of drugs in aesthetic medicine and cosmetology and pharmaceutical compositions based on the obtained BOD.
  • the claimed group of inventions includes a protein-polypeptide complex, a method for its production from embryonic nervous and skin tissues of ungulate farm animals at certain gestational dates, and a pharmaceutical composition based on this protein-polypeptide complex.
  • BOD protein-polypeptide complex
  • the task is achieved by a new protein-polypeptide complex (BOD), which has a tissue-specific reparative effect on the skin tissue and mucous membranes with a rejuvenating effect, obtained from the embryonic nervous and 5 skin tissues of agricultural ungulates of gestation from the middle of the first to the middle of the last third of pregnancy, including tissue-specific negatively charged weakly acidic, neutral proteins and polypeptides related to growth factors, differentiation, signal molecular molecules that determine its biological and pharmacological activity, with molecular weights from 5 to 200 kDa, and at least 70% of the total protein mass has a molecular weight in the range from 20 to 160 kDa, having a characteristic specific set of bands in denaturing gel electrophore
  • the task is also achieved by a new method of obtaining
  • the filtrate is subjected to anion exchange chromatography on a column with an anion exchange carrier and separating bound to the carrier proteins and polypeptides, using as a mobile phase a buffer solution, initially having an ionic strength (I) of not higher than 0.1 mmol / L, increasing it smoothly or stepwise in increments of 0.025 mmol / L and starting to collect target fractions with an ionic strength of eluent from 0.125 up to 0.15 mmol / l at pH from 5.2 to 8.5;
  • I ionic strength
  • Another invention of the claimed group is a pharmaceutical composition based on BOD, which has an antihypoxic, immunomodulating, tissue-specific reparative effect on skin tissue and mucous membranes, with a rejuvenating effect, made in the form of a solution containing the biologically active protein-polypeptide complex of claim 1 as an active ingredient. 1 at a concentration of 0.05 to 2.0 mg / ml obtained by the method of claim 2 and a pharmaceutically acceptable diluent.
  • the pharmaceutical composition may contain a pharmacopoeial buffer solution and, optionally, excipients, including high molecular weight compounds, stabilizers, preservatives and solubilizers.
  • the specified pharmaceutical composition is intended for the pharmaceutical and cosmetic industries, for example, for use parenterally (intradermally, subcutaneously), intranasally or application to the mucous membranes and skin.
  • the protein-polypeptide complex is obtained as follows (some operations are described with details that do not limit the method):
  • the homogenate is separated from the ballast substances by filtration through a dense tissue, followed by centrifugation with a g value in the range of 10,000 - 28,000 for 90 to 30 minutes,
  • the supernatant is filtered through a membrane filter with a pore diameter of 0.45 ⁇ m;
  • the filtrate is applied to a balanced chromatographic column with an anion exchange medium, for example Toyopearl DEAE-650M;
  • - separation of the proteins bound to the carrier is carried out by a stepwise gradient of the ionic strength of the solution, using a buffer solution having an ionic strength of not higher than 0.1 mmol / L as a mobile phase, increasing it in increments of 0.025 mmol / L and starting collecting the target fraction using a buffer solution with ionic strength from 0.125 to 0.15 mmol / l, in the pH range from 5.2 to 8.5;
  • - target fractions are combined and diluted with a buffer solution, for example, 0.05 M glycine-NaOH in the range from pH 5.2 to 8.5 and a total protein concentration of 1.0, 2.0 mg / ml;
  • a buffer solution for example, 0.05 M glycine-NaOH in the range from pH 5.2 to 8.5 and a total protein concentration of 1.0, 2.0 mg / ml;
  • the resulting solution is subjected to sterilizing filtration through a membrane filter with a pore diameter of not more than 0.22 ⁇ m and determine the total concentration of proteins.
  • All preliminary processes and processes for producing a protein-polypeptide fraction are preferably performed at a temperature of + 2 ° to + 8 ° C.
  • the ultraviolet spectrum of the drug solution is recorded in the range of wavelengths from 200 to 500 nm: the absorption maximum is observed at a wavelength of 215 ⁇ 5 nm (Fig.).
  • the molecular weight of the proteins included in the preparation is determined by the method of denaturing gel electrophoresis ("SDS-Rade”) in a 5% polyacrylamide gel in comparison with a standard set of marker proteins with a molecular weight range from 10 "Yes to 250 kDa (figure 2 .).
  • the value of the isoelectric point of the complex is from 4.2 to 8.4.
  • the composition of the drug includes proteins with a molecular weight of 5 kDa to 200 kDa, of which at least 70% have a molecular weight in the range of 20 to 160 kDa.
  • BOD is diluted with a pharmaceutically acceptable buffer solution, for example 50 mM glycine phosphate, containing, if necessary, auxiliary substances, for example, with concentrations of 0.5% mannitol, 0.0005% polysorbate-80 and sodium disodium phosphate to a pH of at least 5, 2 and not higher than 8.5, with the calculation of the final concentration of total protein (according to the Lowry method) in the resulting solution in the range of 0.05 - 2.0 mg / ml. Re-identification of the mixture and filter sterilization are carried out.
  • a pharmaceutically acceptable buffer solution for example 50 mM glycine phosphate
  • auxiliary substances for example, with concentrations of 0.5% mannitol, 0.0005% polysorbate-80 and sodium disodium phosphate to a pH of at least 5, 2 and not higher than 8.5
  • the ultraviolet spectrum of the drug solution is recorded in the wavelength range from 200 to 500 nm: the absorption maximum is observed at a wavelength of 215 ⁇ 5 nm (Fig. 1).
  • the molecular weight of the proteins included in the preparation is determined by the method of denaturing gel electrophoresis ("SDS-Page") in a 5% polyacrylamide gel in comparison with a standard set of marker proteins with a molecular weight range from 10 kDa to 250 kDa (Fig.Z. )
  • the composition of the drug includes proteins with a molecular mass of 5 kDa to 200 kDa, of which at least 70% have a molecular weight in the range from 20 to 160 kDa.
  • the raw materials used were the embryonic nervous and skin tissue of ungulate farm animals with gestational age from the end of the first third to the middle of the last third of pregnancy;
  • the pH of the buffer media was in the range of 5.2 - 8.5;
  • the ionic strength of the solution (I) of the eluent during separation of the proteins and polypeptides bound to the carrier was not lower than 0 mmol / l, and the target fractions were collected with the eluent having an ionic strength not higher than 0.15 mmol / l;
  • the protein content with molecular weights from 20 kDa to 160 kDa was at least 70% of the total protein content
  • the inventive biologically active protein-polypeptide complex is fundamentally different from all known biologically active substances obtained from raw materials of animal origin by:
  • tissue-specific activity as a certain fraction of tissue (membrane, cell, cytoplasmic, nuclear) hydrophilic, weakly charged negative proteins and polypeptides, with the concentration ratio of growth factors, differentiation factors and signal molecules with a molecular weight of 5 kDa to 200 kDa evolutionarily fixed in ontogenesis;
  • the claimed pharmaceutical composition in the form of BOD with a pharmaceutically acceptable diluent can improve the stability of the BOD solution and increase its shelf life and storage.
  • Example 1 The method of obtaining BOD.
  • the molecular weight of the proteins included in the preparation is determined by the method of denaturing gel electrophoresis ("SDS-Rade”) in a 5% polyacrylamide gel in comparison with a standard set of marker proteins with a molecular weight range from 10 kDa to 250 kDa in the fraction includes proteins with a molecular weight of 5 "Yes to 200 kDa, of which 76% have a molecular weight in the range from 20 to 160 kDa ( Figure 2.);
  • Example 2 The method of obtaining BOD.
  • ZOOg of embryonic nervous and skin tissue of a pigment with a gestational age of 16-18 weeks is thawed and homogenized in a pH 5.2 buffer solution containing 50 mM Tris-maleate, 1 mM (EDTA) and 0.1% mannitol, for 5 minutes at + 2 ° FROM.
  • the homogenate is separated from the ballast substances by filtration through a dense tissue, followed by centrifugation at a g value of 28,000 for 30 minutes.
  • the supernatant is filtered through a membrane filter with a pore diameter of 0.45 ⁇ m and applied to balanced with 4 volumes of maleate buffer solution
  • pH 5.2 chromatographic column with a volume of 250 ml with anion exchange medium DEAE-Sepharose.
  • the ultraviolet spectrum of the solution is recorded in the wavelength range from 200 to 500 nm - the absorption maximum is observed at a wavelength of 215 ⁇ 5 nm (Fig.Z.).
  • the molecular weight of the proteins and polypeptides that make up the complex is determined by denaturing gel electrophoresis ("SDS-Rade”) in 5% polyacrylamide gel in comparison with a standard set of marker proteins with a molecular weight range from 10 kDa to 250 kDa (Fig. four.).
  • the composition of the drug includes proteins with a molecular weight of 5 kDa to 200 kDa, of which 72% have a molecular weight in the range from 20 to 160 kDa. Quantitative determination of protein in the obtained MIC by the Lowry method (without preliminary precipitation) is 2.4 mg / ml.
  • Example 3 A method of obtaining a pharmaceutical composition.
  • the resulting pharmaceutical composition is subjected to sterilizing filtration, through a membrane filter with a pore diameter of not more than 0.1 ⁇ m, it is poured into sterile glass bottles and sealed.
  • the composition of the drug includes proteins with a molecular weight of 5 kDa to 200 kDa, of which 72% have a molecular weight in the range from 20 to 160 kDa. Quantitative determination of protein in the obtained BOD by the Lowry method (without preliminary precipitation) is 1.55 mg / ml.
  • Example 4 A method of obtaining a pharmaceutical composition.
  • the resulting pharmaceutical composition is subjected to sterilizing filtration, through a membrane filter with a pore diameter of not more than 0.1 ⁇ m, poured into sterile glass bottles and sealed.
  • the ultraviolet spectrum of the solution is recorded in the wavelength range from 200 to 500 nm - the absorption maximum is observed at a wavelength of 2 5 ⁇ 5 nm (Fig.Z.).
  • the molecular weight of the proteins and polypeptides that make up the complex is determined by the method of denaturing gel electrophoresis zo ("SDS-Rade") in 5% polyacrylamide gel in comparison with a standard set of marker proteins with a molecular weight range from 10 kDa to 250 kDa (Fig .four.).
  • the composition of the drug includes proteins with molecular weight from 5 kDa to 200 kDa, of which 72% have a molecular weight in the range from 20 to 160 kDa. Quantitative determination of protein in the obtained MIC by the Lowry method (without preliminary precipitation) is 2 mg / ml.
  • the aim of the study was to determine tolerable, toxic and lethal doses of the original pharmaceutical composition.
  • the study was conducted on mice of both sexes of the BALB / C line weighing 18-20 g at
  • mice The mass of animals ranged from 18 to 20 g.
  • Group 4 the original pharmaceutical composition intraperitoneal administration (iv) etc .; Group 5 - original pharmaceutical composition in / in x10.
  • Duration of observation 1 month of administration, 1 month observation of resorptive action.
  • Toxicity was evaluated according to the points on the observation checklist: - by survival and general appearance: (coat, eyes, ears, limbs, teeth);
  • peripheral blood the number of red blood cells, white blood cells, platelets, hemoglobin level
  • biochemical parameters level of protein, urea, creatinine, glucose
  • serum enzymes aspartate and alanine aminotransferases, alkaline phosphatase, lactate dehydrogenase
  • Blood was taken for hematological studies from the tail vein. Blood cells were counted on an automatic Picoskel blood meter (Hungary). The hemoglobin level was determined by the hemiglobin cyanide method. The level of biochemical parameters was determined using an automated system. FP-901, “l_absystems” Finland.
  • the animals were killed using an overdose of anesthesia for pathomorphological studies of organs and tissues.
  • the autopsy of the animals was carried out immediately after their death according to the complete pathoanatomical scheme.
  • tissue samples were gelled and cryostatized to obtain sections with a thickness of up to 5 ⁇ m. Then the tissues were fixed and stained with hematoxylin-eosin. Microscopy was performed on microscope of the company ⁇ (Germany). The obtained experimental data were compared with the control data and calculated using a computer statistical program.
  • D ematological parameters hemoglobin content, the number of red blood cells, white blood cells, platelets in all groups within the physiological norm.
  • Pathomorphological data Macroscopic examination.
  • the language is clean. Mucous membranes of the mouth and esophagus without defects. Stomach and intestines without signs of irritation. The liver is not enlarged. The capsule of the kidneys separates easily, the cerebral and cortical substance in the section are clearly distinguishable. Spleen with a smooth capsule, on a grayish-brown incision, pulp without scraping. Testes and ovaries without features. Thymus grayish, without hemorrhage. The thyroid gland is dense with symmetrical lobes. Shells of the brain of moderate blood supply, moist, shiny. The brain substance has a symmetrical cross-sectional pattern. The weight indices of the organs of the tested animals had no significant differences from the control groups.
  • mice In all the studied groups: in the internal organs (liver, kidneys, lungs, heart, spleen, stomach, large and small intestines), endocrine glands (thyroid gland, thymus, adrenal glands, pancreas), reproductive organs (uterus, ovaries), lymph nodes, brain, skin, mucous membranes of the nose and throat - no pathomorphological changes were detected.
  • the groups are divided as follows: 1 group (therapeutic dose) - pharmaceutical composition 0.1 mg / ml 0.5 ml, administered daily 1 time per day; Group 2 - pharmaceutical composition 0.1 mg / ml 0.5 ml, administered daily 2 times a day; Group 3 - intact animals.
  • the term of introduction is 2 weeks.
  • Toxicity was evaluated according to the points on the observation checklist: survival, general appearance, condition and behavior of animals, change in body weight (weighing was carried out at the beginning and at the end of the experiment). The local irritant effect during the experiment was judged by the changes in visual and histological examination in the skin, at the injection sites.
  • the experimental animals studied the morphological composition of peripheral blood (the number of red blood cells, white blood cells, platelets, hemoglobin level), biochemical parameters (protein, urea, creatine, glucose, total cholesterol and triglycerides), the activity of certain serum enzymes (aspartate) before and at the end of the experiment. - and alanine aminotransferases, alkaline phosphatase, lactate dehydrogenase).
  • blood was taken from the ear vein in a volume of 1, 5-2, 0 ml. Blood cells were counted on an automatic Picoskel blood meter (Hungary). The hemoglobin level was determined by the hemiglobin cyanide method.
  • the level of biochemical parameters was determined using an automated system. FP-901, "Labsystems" Finland. After the end of the chronic experiment, the animals were euthanized by an overdose of anesthesia. The autopsy of the animals was carried out immediately after their death according to the complete pathologist.
  • samples of fresh tissue were subjected to gelation and cryostation to obtain sections with a thickness of up to 5 ⁇ m. Then the tissues were fixed and stained with hematoxylin eosin. Microscopy was carried out on a microscope of the company ⁇ (Germany).
  • the obtained experimental data were compared with the control and calculated using a computer statistical program.
  • the skin at the injection site is pale pink, without edema and hyperemia, the coat is of usual density, has a healthy shine without hyperhidrosis and increased greasiness.
  • flaws in the epidermis were not detected. Reflexes corresponded to the physiological norm.
  • the skin at the injection site is pale pink, without swelling and hyperemia, the coat is of usual density, it has a healthy shine without hyperhidrosis and increased greasiness.
  • flaws in the epidermis were not detected.
  • Reflexes corresponded to the physiological norm.
  • confocal microscopy the epidermal layer and the dermis itself had a tightly packed structure of clearly differentiated cells. Cells are connected by gap junctions. In any case, pathological changes were not detected.
  • Blood test hemoglobin content, the number of red blood cells, white blood cells, platelets in all groups within the physiological norm. The indices obtained in the experimental groups did not significantly differ from the control groups of intact animals and the comparison drug.
  • Example 6 Mutagenicity of the pharmaceutical composition.
  • a sample of a protein-polypeptide pharmaceutical composition was tested, which is a transparent liquid sterilely packed in a bottle of dark glass in an amount of 20 ml containing a substance in a concentration of 0.1 mg / ml.
  • the mutation test for Salmonella typhimurium is a bacterial test system for taking into account gene mutations to histidine prototrophy under the action of chemical compounds and (or) their metabolites that induce mutations such as base changes or reading frame shifts in the genome of this organism.
  • Base pair mutagen inducers are agents that cause base pair mutations in a DNA molecule.
  • Mutagens that induce mutations in the reading shift of the genetic code are agents that cause the addition or lack of single or multiple base pairs in a DNA molecule.
  • This method is designed to detect the ability of pharmacological substances or their metabolites to induce gene mutations in indicator strains of Salmonella typhimurium.
  • Bacteria are treated with the test compound with a metabolic activation system (CM +) or without metabolic activation (CM-). After incubation for a certain period of time, the number of revertant colonies of different test strains is calculated in comparison with the number of spontaneous revertants in negative control variants (untreated cultures or cultures treated with solvent). If the test compound and / or its metabolites have mutagenic activity, they will induce reverse mutations from auxotrophy to histidine prototrophy in histidine-dependent Salmonella typhimurium strains.
  • Protein-polypeptide pharmaceutical composition in the form of a sterile solution with a protein content of 0.1 mg / ml was studied 1, 0 and 0.3 ml of the initial solution per cup and three 10-fold dilutions in physiological solution (0.1 ml / h).
  • the tested doses of the substance were 300; one hundred; 10; 1 and 0.1 mcg per cup.
  • the experiment was accompanied by positive controls, which were used as substances inducing mutations in the corresponding tester strains in the presence or absence of activation conditions.
  • sodium azide was used in the amount of 10 ⁇ g per cup for strain TA 100 at CM-; 2,7-diamino-4,9-dioxio-5, 10-dioxo-4,5,9, 10-tetrahydro-4,9-diazopyrene (DIAM) - 10 ⁇ g per cup for strain TA 98 at CM-; 9-aminoacridine (9AA) - 50 ⁇ g / cup for strain TA 97 at CM-.
  • 0.1 ml of the sample was added to the test tubes with agar in the required dilutions, then 0.1 ml of the suspension of bacteria and 0.5 ml of the microsomal activating mixture (for the variant with metabolic activation). Then the contents of the tube were quickly mixed and poured onto a layer of lower minimal agar in Petri dishes. The duration of the introduction of the microsomal activating mixture and the pouring of semi-liquid agar onto the plate did not exceed 10-15 seconds. The cups were left at room temperature for 30-40 minutes and after complete solidification of the agar was transferred to a thermostat at + 37 ° C. Analysis was carried out after 48 hours of incubation.
  • CM- metabolic activation system
  • CM + metabolic activation system
  • the mutagenic effect was considered significant if the average number of colonies of revertants per cup in the experimental variant exceeded that in the control version 2 or more times.
  • the results of the experiment were taken into account in the presence of a standard response in all variants of positive and negative control.
  • the number of colonies of revertants in the control with solvent in the SM- and CM + variants was within the spontaneous level fluctuations for these strains.
  • the response of the strains to standard mutagens was within normal levels.
  • the studied protein-sex and peptide pharmaceutical composition in all tested concentrations did not show a mutagenic effect on the strains TA 100, TA 98 and TA 97 in variants without and in the presence of a metabolic activation system.
  • the protein-polypeptide pharmaceutical composition does not have the ability to induce gene mutations on Salmonella typhimurium tester strains in the entire range of tested concentrations.
  • Cytogenetic activity the ability of a substance to cause structural and numerical chromosomal abnormalities in somatic and germ cells.
  • Micronuclei are small DNA-containing formations consisting of acentric fragments of chromosomes or lagging at the stage of the annelophase of chromosomes. At the telophase stage, these fragments can be incorporated into the nuclei of daughter cells or form single or multiple micronuclei in the cytoplasm.
  • the purpose of the study was to identify and quantify the cytogenetic (mutagenic) activity of pharmacological agents in polychromatophilic erythrocytes (PCE) of mammalian bone marrow.
  • the method is based on microscopic registration of cells with micronuclei.
  • the possible proposed method of using the protein-polypeptide pharmaceutical composition in the clinic is intravenous or endolumbar
  • the dose of the protein-polypeptide complex for the assessment of mutagenic activity was calculated based on the highest recommended daily therapeutic dose (TD) for humans.
  • the intravenous administration of a protein-polypeptide pharmaceutical composition in an amount of 2 ml at a concentration of 0.1 mg / ml is recommended.
  • the therapeutic dose (TD) for a person, including a child can be 0.05 mg / kg / day.
  • the maximum possible dose of Humg / kg under the conditions of this experiment was used as subtoxic, since the substance was provided at a concentration of 0.1 g / ml, and the generally accepted amount of the substance administered to mice was 0.1 ml per 10 g of weight. Accordingly, in terms of humans, the maximum tested dose is 1, 7 mg / kg.
  • the protein-polypeptide complex was administered once to males at doses of 0.2 mg / kg and 0.5 mg / kg.
  • a negative control used a solvent - saline. It was administered intraperitoneally to males and females of two control groups at the same time and in the same volumes as the animals of the experimental series.
  • cyclophosphamide at a dose of 20 mg / kg, dissolved ex tempore in saline with a single intraperitoneal injection 24 hours before slaughter was used.
  • Bone marrow cell preparations for micronuclei counting were prepared by the generally accepted method in accordance with the methodological recommendations “Assessment of the mutagenic activity of environmental factors in the cells of various mammalian organs using the micronucleus method”. 5 animals were killed by cervical dislocation 6 hours after the last injection.
  • Both femurs were isolated and muscles were cleared.
  • fetal calf serum NPE PanE-KO
  • Bone marrow from both femurs was washed with a syringe into a microtube. The suspension was centrifuged at 1000 rpm, for 5 minutes, the supernatant was removed, and the precipitate was carefully resuspended. A smear was prepared from a drop of suspension, and it was dried in air. Fixed with methanol for 3 minutes. Stained by the method of Romanovsky-Giemsa. Analyzed on encrypted preparations for 2000 poly-chromatophilic red blood cells
  • a criterion for a positive result is a reproducible and statistically significant increase in the number of polychromatophilic
  • the percentage of PCEs from the total number of bone marrow erythrocytes was approximately at the same level in the groups of the experimental and control series, which indicates the absence of the toxic effect of the composition in the tested doses on blood formation.
  • the positive control cyclophosphamide
  • a shift in the ratio of polychromatophilic and normochromic red blood cells towards the latter was noted (when compared with the control, P ⁇ 0.005).
  • the mutagenic activity of the protein-polypeptide pharmaceutical composition was not detected in the test for the induction of micronuclei in polychromatophilic erythrocytes of the bone marrow of mice, provided that males and females were intraperitoneally administered to males and females at a dose of 0.42 mg / kg body weight, which in terms of daily therapy dose for humans. No mutagenic activity was also detected under conditions of a single administration of a protein-polypeptide pharmaceutical composition to males at the maximum possible dose of 10 mg / kg. The protein-polypeptide complex did not show toxic effects in terms of the “proportion of polychromatophilic red blood cells”.
  • Protein-polypeptide pharmaceutical composition does not have mutagenic activity in the Ames Salmonella test / microsome and in the test for the induction of micronuclei in mouse bone marrow cells under the conditions of experiments conducted in accordance with the Guidelines for the experimental (preclinical) study of new pharmacological substances.
  • Adaptogenic action This type of action in the process of creating new medicines acquires one of the most relevant areas of search, because this can make it possible to influence physiological processes during physical, thermal, chemical overloads, especially to prevent poisoning, burns, increase body endurance, etc.
  • pre-treatment of animals (mice) for 7 days in a conditionally therapeutic dose (0, 1 ml / kg) prevents the death of animals from a toxic dose of toxic substances (strychnine), lethal exposure, Pseudomonas aeruginosa infection.
  • the anti-stress effect of the claimed drug was studied on the basis of multidimensional methods for assessing the state of various components of resistance to emotional stress in rats (behavioral and visceral components). As a result of these studies, it was found that the claimed drug has the ability to increase resistance to emotional stress, i.e. to prevent the development of functional disorders of higher nervous activity, general immunity and metabolic disorders of cardiac activity. The most effective dose was 20 ⁇ l per 100 g of rat mass, which corresponds to a dose of 2 ml per 1 injection in humans. Anticoagulant effect.
  • the degree of burn was dosed by the exposure time of the electrode, which ranged from 3 to 15 seconds.
  • the lesion surface is completely epithelized.
  • the epidermis somewhat thickened from correctly located edges, gave outgrowths in the form of ridges to the underlying tissue.
  • the papillary layer of the dermis in the pharmaceutical composition group differed from the control group in a more dense fiber arrangement and increased cellularity.
  • the immunomodulating properties of the VPA obtained in the same way as in examples 1 and 2 were determined by the activation of macrophages of the peritoneal exudate of Wister rats in vitro experiments on enhancing the enzymatic activity in restoring nitro-blue tetrazolium to formformazan (HCT test) and on enhancing phagocytic activity to E. coli.
  • the content of macrophages in tissue exudate of all cells was 25-35%.
  • the enzymatic activity of macrophages of rat peritoneal exudate was determined spectrophotometrically to restore nitro-blue tetrazolium to formazan.
  • the precipitate of rat peritoneal exudate cells was diluted with a colorless Hanks solution to a concentration of 80 x 0 6 cells / ml.
  • To 50 ⁇ l of the cell suspension was added 50 ⁇ l of a sample with a pH of 7.4 and a concentration of 0.1 mg / ml protein-polypeptide complex.
  • the mixture was incubated at a temperature of + 37 ° C in a water bath with constant shaking for 30 min, after which 50 ⁇ l was added a solution of nitro-blue tetrazolium of Reanal firm (Hungary) saturated at a temperature of +20 C and incubated for another 30 min. Then 3 ml of acetone was added and centrifuged at an acceleration of 2000 g for 20 minutes. The supernatant acetone extract was photometric at a wavelength of 515 nm. As a control of comparison of enzymatic activity, a test with a preservative in physiological saline was used. The phagocytic activity of rat peritoneal exudate cells was determined by their ability to capture E. coli.
  • the resulting suspension in an amount of 0.2 ml was applied to glass 18 x 18 mm in size and incubated at + 37 ° C for 3 min in an atmosphere containing 5% carbon dioxide (CO2) to attach macrophages to the glass. After incubation, the glass was rinsed 3 times in beakers with Hanks medium to remove non-adherent cells. 0.2 ml of E.Coli suspension was added to the remaining cells on the glass at a concentration of 20 x 10 6 cells / ml and incubated under the same conditions for 45 min. Subsequently, the glass was again rinsed three times, fixed with methanol and stained according to Romanovsky Giemsa.
  • the phagocytosis index (IF) was determined by the formula: IF (0 + 2.5n + 6T + 9p + 10P) / number of cells, where 0 is the number of cells that are not phagocytic E. Coli; p is the number of cells that have absorbed 1-4 cells; T is the number of cells that have absorbed 5-7 cells; p is the number of cells that have absorbed 8-9 cells; R is the number of cells that have absorbed 10 or more E.Coli cells. Macrophage was identified by staining of nonspecific esterase.
  • the level of macrophage activation of the peritoneal exudate of Wister rats in in vitro experiments in the drug group was significantly p ⁇ 0.05 (12 times) higher than the control group when studying the enhancement of enzymatic activity in the restoration of nitro-blue tetrazolium to formazan (NBT test) and in 8 times (p ⁇ 0.01) - to enhance the phagocytic activity of E. Coli.
  • Example 10 Regenerative activity and anti-aging effect.
  • the intradermal administration of the drug was carried out symmetrically, directly in the wrinkle line, 10 points on each side, 0.2 ml per point.
  • the injections were carried out symmetrically in a checkerboard pattern, at the same distance from each other.
  • the facial skin acquired a natural fresh look, its tone and elasticity were restored.
  • the wrinkles at the outer corners of the eyes almost disappeared, on the skin of the forehead and nose, they were significantly smoothed out.
  • a decrease in gray hair was noted. The result is stable over the next months, the patient is pleased with the treatment, noting a significant decrease in gray hair with an increase in hair density.
  • the proposed pharmaceutical composition can improve the effectiveness of the treatment of skin aging due to the rapid restoration of its fibroarchitectonics and systemic immunoregulatory effects on the body as a whole.
  • FIG. 1 - FIG. 4 presents the results of tests and studies of the complex according to the invention.
  • FIG. 1 shows the spectral characteristic of the protein-polypeptide complex in the UV-visible region of the spectrum obtained according to example 1.
  • the protein-polypeptide complex obtained by the claimed method according to example 1 is characterized by a peak at a wavelength of 215 + 5 nm in the UV-visible region of the spectrum .
  • FIG. Figure 2 shows the denaturing electrophoresis of the protein-polypeptide complex obtained in Example 1. (2), in a 5% polyacrylamide gel stained with Coomassie brilliant blue in comparison with the standard set of marker proteins (1) with a molecular weight range from 10 to 250 kDa.
  • FIG. 3 shows the ultraviolet spectrum of the protein-polypeptide complex obtained in example 2. According to this figure, in the wavelength range from 200 to 500 nm, the absorption maximum at a wavelength of ⁇ (215 ⁇ 5) nm is noted.
  • FIG. Figure 4 shows the denaturing electrophoresis of the protein-polypeptide complex obtained in Example 2. (2), in a 5% polyacrylamide gel stained with Coomassie's brilliant blue reagent in comparison with the standard set of marker proteins (1) with a molecular weight range from 10 to 250 kDa.
  • the invention allows to create a biologically active substance, with advanced properties and high biological activity, with tissue-specific reparative-regenerative and anti-aging effect on skin tissue and to develop a method for its production by isolating a biologically active protein-polypeptide complex from the nervous and skin tissue of ungulates of farm animals, which It is decided by the selected set of actions and modes. It was especially important to determine the optimal gestational timing of embryonic skin and nerve tissue, as well as a set of reagents, their doses, extraction modes, buffering to maintain effective concentration ratios of proteins, polypeptides and nucleotides fixed evolutionarily and determining the biological activity of the complex, providing a reparative-regenerative tissue-specific and anti-aging effect.
  • the invention is intended for use in the chemical pharmaceutical industry, medicine and cosmetology, relates to a biologically active substance - a protein-polypeptide complex obtained from embryonic nervous and skin tissue of ungulate farm animals, which has antihypoxic, anti-aging effect, stimulating the physiological and reparative regeneration of skin tissue, applications in the manufacture of medicines and cosmetics for skin diseases, aesthetic medicine and cosmetology.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Gerontology & Geriatric Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Белково-полипептидный комплекс, обладающий тканеспецифическим репаративным действием и омолаживающим действием на кожную ткань получают из нервной и кожной тканей эмбрионов копытных с-х животных сроком гестации от середины первой трети до середины последней трети беременности путем гомогенизации в буферном растворе с одновременной экстракцией в присутствии неионных детергентов при рН 5,2-8,5. Полученный гомогенат центрифугируют и фильтруют. Белки отделяют на хроматографической колонке с анионообменным носителем. Полученные фракции объединяют и подвергают стерилизующей фильтрации. Комплекс включает отрицательно заряженные слабо кислые, нейтральные белки и полипептиды с молекулярными массами от 5 до 200 кДа. При этом не менее 70% от общей массы белка имеет молекулярную массу в диапазоне от 20 до 160 кДа. Фармакологическая композиция содержит в качестве активного ингредиента комплекс в концентрации 0,05-2,0 мг/мл и фармацевтически приемлемый разбавитель.

Description

БЕЛКОВО-ПОЛИПЕПТИДНЫЙ КОМПЛЕКС
СПЕЦИФИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ НА КОЖНУЮ ТКАНЬ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ФАРМКОМПОЗИЦИЯ НА ЕГО
ОСНОВЕ
Область техники
Изобретение относится к биологически активной субстанции - белково-полипептидного комплекса (БПК), получаемой из тканей кожи, головного и спинного мозга эмбрионов копытных сельскохозяйственных животных и предназначена в качестве активного вещества для производства лекарственных препаратов, стимулирующих физиологическую и репаративную регенерацию, в лечении заболеваний и травматических поражениях кожи, а так же для применения в производстве лекарственных препаратов в эстетической медицине, косметологии и способу её получения.
Принятые сокращения и условные обозначения:
БПК- белково-полипептидный комплекс;
I - ионная сила раствора;
Фармкомпозиция - фармацевтическая композиция.
В настоящее время,, на фоне неуклонного роста кожных заболеваний аутоиммунного, сосудистого, токсического, инфекционного, травматического генеза, а также ятрогенных осложнений после применения «омолаживающих» препаратов, косметических средств и процедур, не существует препаратов группы прямых репарантов, специфичных для кожной ткани. Целью данного изобретения явилось создание биологически активной субстанции - прямого репаранта, обладающего тканеспецифическим регенеративным действием на кожную ткань.
Биологически активная субстанция представляет собой БПК с молекулярной массой входящих в него белково-полипептидных компонентов в пределах от 5 до 200 кДа и содержанием среднемолекулярной фракции в пределах от 20 до 160 кДа не менее 70%, общей концентрацией белка 0,1 - 4,2 мг/мл, с максимумом поглощения ультрафиолетового спектра раствора при длине волны 215 ± 5 нм в УФ-видимой области с интервалом длин волн 200 - 500 нм (фиг.1 ) и наличием специфических полос при денатурирующем гель-электрофорезе в 5%-ном полиакриламидном геле (фиг.2), а так же фармацевтически приемлемый разбавитель, включающий буферный раствор и вспомогательные вещества - высокомолекулярные соединения, относящиеся к классу консервантов, детергентов и солюбилизаторов в достаточных концентрациях. БПК получен, путем ионообменной хроматографии фильтрата экстрагированного гомогената нервной и кожной тканей эмбрионов копытных сельскохозяйственных животных сроком гестации от середины первой трети, до середины последней в присутствии буферного раствора, детергентов и солюбилизаторов.
Предшествующий уровень техники
Известен целый ряд препаратов пептидной природы из сырья животного происхождения, обладающие регенеративной активностью, которые используются для лечения заболеваний кожи. Наиболее близкими, по достигаемому эффекту, являются:
- пептидный экстракт плаценты и способ его [1], заключающийся в солевой экстракции гомогената плаценты с 10 мМ Na-фосфатным буфером рН - 7,0 в присутствии 0,1 мМ ЭДТА и Тритона-100 предварительно выдержав 3 часа при температуре +4°С, с последующей фазой удаления гормонов из элюента после центрифугирования в присутствии полиглюкина и активированного угля доведя температуру смеси до +40° - +45°С и оставив на 4 часа при комнатной температуре. Полученный элюент из отцентрифугированной смеси содержит 5 - 35 мг/мл белка, 2 - 5 мг/мл гликопротеидов и 0,5 - 1 мг/мл Тритона Х100. Следует отметить достаточно высокий выход по количеству полученных белков. Однако полученные в экстракте белки не охарактеризованных стандартными физико-химическими методами (масса, оптическая плотность, форез и т.д.) белков, а наличие значительного количества гликопротеидов, позволяют предполагать высокую иммуногенность и аллергенность экстракта;
- группа изобретений «Лекарственные средства на основе зародыша и способ их получения» [2], данный способ предполагает измельчение и гомогенизацию мягких тканей эмбрионов животных в смеси с физиологическим раствором. Данный способ не позволяет стандартизировать полученную смесь, а отсутствие четких физико- химических характеристик получаемого продукта - применение данного препарата парентерально, из-за присутствия компонентов клеточных стенок и мембран клеточных структур, что определяет его высокую иммуногенность;
- способ изготовления биологически активных препаратов на основе эмбриональных тканей [3], который предусматривает гидролиз гомогената от 2-х до 42 дней при температуре +4 - +45°С с дальнейшей термообработкой при температуре +60 - +120°С, отделением денатурированных веществ и выделение из гидролизата термостабильного целевого продукта неопределенного состава, со средней молекулярной массой менее 10 «Да с содержанием пептидов 1 - 3 мг/мл и сухим остатком 14 - 20 мг/мл. При данном способе изготовления получаемый целевой продукт содержит измененные, денатурированные продукты гидролиза с нарушенной четвертичной и третичной структурой, а так же продукты распада многих активных молекул, что определяет его невысокую биологическую активность; - способ биологического омоложения кожи [4], данный способ Предлагает внутрикожное и подкожное введение диспергированного биоматериала «Аллоплант» [5], у которого выявлена способность привлечения клеток макрофагального ряда со стимуляцией их созревания, восстанавления
5 кислотно-щелочного баланса кожного покрова за счет нормализации работы потовых и сальных желез, со сдвигом обменных процессов в ткани кожи в сторону преобладания процессов, свойственных ткани физиологически более молодого возраста. За счет этого появляется возможность коррекции фиброзных и дегенеративно-дистрофических ю изменений в тканях (возможность селективного роста тканей на месте имплантированного биоматериала) с усилением обменных процессов, направленных на восстановление фиброархитектоники кожи. Однако отсутствие в препарате сбалансированных факторов роста и дифференцировки, специфичных для кожной ткани не позволяет получить
15 выраженный омолаживающий эффект, а так же стимулировать физиологическую и репаративную регенерацию.
- косметическое средство для ухода за кожей «Гармония» [6], содержащее экстракт из эмбрионов млекопитающих (человека) и биологически активные добавки природного и химического происхождения (масло
20 герани, масло кориандра, настойку подорожника, экстракт майских листьев березы, экстракт майских листьев черемухи, соки алоэ и чистотела, масло кукурузное, экстракт прополиса, пальмовое масло, облепиховое масло и желток куриного яйца, глицерин, неорганические соли, например, соли Хенкса, двузамещенный фосфат натрия, лимонную кислоту, причем
25 соотношение основы и биологически активных добавок природного и химического происхождения составляет (0,59 - 5,3):1 ,0. Экстракт из эмбрионов получают путем гомогенизации и экстракции в солевом растворе, ультрацентрифугированием с последующей фильтрацией надосадочной жидкости. Получаемый экстракт содержит зо разномолекулярные фракции, не охарактеризованных стандартными физико-химическими методами, водорастворимых денатурированных белков, пептидов, пептидгликанов, липопротеинов не поддающихся стандартизации, наружное применение которых достаточно иммуногенно с невысоким биологическим эффектом;
- способ получения регенерирующего косметического крема для ухода за кожей [7], содержащего наряду с ростовыми факторами, включающими 5 интерлейкин-2, эритропоэтин, эпидермальный фактор роста и лейкоцитарный гормон роста, продукты метаболизма клеток лейкоцитов человека и/или животных при следующем количественном содержании компонентов крема (мае. %): питательная среда с ростовыми факторами и продуктами метаболизма клеток лейкоцитов - 0,7 - 8,5; биологически ю активные вещества природного и химического происхождения - 7,0 - 27,0, полученные из питательной среды в которой инкубировались клетки человека и/или животных (например, лейкоциты), в присутствии осматотропина. Данная композиция не содержит цитоплазматических, ядерных и мембранных белков и полипептидов, играющих важную
15 сигнальную роль в механизмах регенерации и репарации клеток, концентрация выделенных лейкоцитами факторов роста и гормонов является не оптимальной, а является продуктом их жизнедеятельности и метаболизма, что значительно снижает биологическую активность композиции, вторично стимулируя физиологическую регенерацию и
20 незначительно репарацию тканей, не имея в составе тканеспецифических факторов для кожи;
- известна композиция по уходу за кожей, содержащая следующие компоненты: ретиноид, выбранный из группы, состоящей из спиртовой формы витамина А, альдегидной формы витамина А, ретинилацетата,
25 ретинилпальмитата и их смесей, масляную фазу, имеющую низкий уровень ненасыщенности, и стабилизирующую систему, выбранную из группы, состоящей по крайней мере из по меньшей мере одного антиоксиданта, растворимого в масле, хилатообразователя, экстракта солодки, гидрохинона, коиэвой кислоты, готулина А, микромерола, зо глютатиона, 1_-аскорбил-2 фосфата магния, арбутина, экстракта плаценты и их смесей [8]. Однако известная композиция при длительном применении может вызывать гипертензионнный синдром, не обладает достаточным регенерирующим и омолаживающим эффектом.
- косметическое средство для ухода за кожей на основе развивающихся эмбрионов млекопитающих, содержащее основу в виде геля и компоненты на основе экстракта развивающихся эмбрионов (зародышей) млекопитающих, например крупного рогатого скота [9]. Для экстрагирования используют не весь эмбрион животного, а только его зобную железу. Состав содержит (10-30)% экстракта эмбриона животного и (90-70)% основы в виде геля. Препарат наносят на кожу лица и тела для омоложения клеток кожи, защиты от морщин, повышения сопротивляемости кожи и замедления старения тканей. Однако данное косметическое средство оказывает системную гормональную активность воздействием на весь организм, что имеет противопоказания к применению, а так же недостаточную эффективность регенерирующего действия на кожу, не имея в составе тканеспецифических факторов роста и факторов, связанных с предотвращением увядания и старения кожи, сохранением и увеличением ее эластичности и поддержанием хорошего состояния в течение длительного времени;
- средство, нормализующее обмен веществ в тканях кожи [10], включающее в себя помимо фракции низкомолекулярных, ассоциированной с белками РНК из ядер и цитоплазмы клеток любых эмбриональных тканей (взяты в качестве примера ткани мозга, печени, тимуса и селезенки поросят в различных соотношениях), пептидную фракцию из гомогената фетальных органов поросят, выделяемую кислым экстрагированием 0, 15М HCI с нагреванием на кипящей водяной бане в течение 30 мин., с последующей нейтрализацией щелочью до рН 7,0 и отделением осадка центрифугированием в результате чего концентрация пептидов достигает 8 мг/мл. Данный способ получения целевого продукта позволяет получать денатурированные низкомолекулярные фракции пептидов в связи с воздействием в процессе выделения кислотной экстракции и кипячения, что абсолютно меняет четвертичную, третичную структуру не охарактеризованных стандартными физико-химическими методами пептидов и, как следствие, снижает биологическую и физиологическую активность полученных продуктов;
Наиболее близким к заявленной группе изобретений в том числе и по способу получения БПК - является способ получения биологически активного комплекса, обладающего нейрорегеративным и нейропротективным действием [1 1]. Данный способ позволяет получить смесь белков и полипептидов из головного мозга эмбрионов сельскохозяйственных животных, взятого на определенной стадии гестации (от начала средней трети до середины последней трети), методом анионообменной хроматографии, используя для нанесения на уравновешенную колонку предварительно отфильтрованный супернатант гомогената ткани с буферным раствором рН 7,2 - 8,4, целевые фракции получают, разделяя связавшиеся с носителем белки и полипептиды, используя в качестве подвижной фазы 0,05М ТРИС-глициновый буфер, содержащий 0,1 мМ ЭДТА и 1 М NaCI, повышая концентрацию ступенчатым градиентом с шагом 5%. Полученный вышеуказанным способом комплекс подвергают ультрафильтрации на мембране 5 кДа и обессоливают. Характеристику целевой белково-полипептидной фракции проверяют методами ультрафиолетовой спектрометрии, гель-хроматографии, денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле и аминокислотного анализа. Полученный вышеуказанным способом биологически активный комплекс имеет максимум поглощения ультрафиолетового спектра при длине волны 280 + 5нм и содержанием входящих в него белков от 5 до 10 кДа не менее 95% от общего содержания белков. Использование при получении данного комплекса на этапе анионообменной хроматографии в составе подвижной фазы 1 М NaCI создает слишком высокую ионную силу подвижной фазы, равную 1 моль/л, а включение в состав ЭДТА и ТРИС еще больше ее увеличивает. В связи с этим, полученная целевая фракция содержит большое количество кислых высоко заряженных белков и полипептидов, имеющих в клетках мозговой ткани преимущественно мембранную локализацию в основном выполняющие структурные функции и только в незначительной степени регуляторные, не имеющие, не только тканеспецифической, но и выраженной биологической активности. Дальнейшее ступенчатое повышение концентрации соли с шагом 5% еще больше увеличивает присутствие данных белков, увеличивая биологическую инертность смеси, тем самым снижая ее активность. Использование при получении данного комплекса в качестве сырья эмбриональных головной мозг обуславливает наличие тканеспецифических белков, регулирующие физиологические и репаративные процессы преимущественно нервной ткани, оказывая невыраженное системное действие, поэтому спектр биологической активности направлен на коррекцию и лечение нарушенных функций и заболевания нервной системы.
Раскрытие изобретения
Основной целью изобретения является создание эффективного природного белково-полипептидного комплекса, отвечающего современным международным требованиям безопасности, предъявляемые к фармацевтическим препаратам.
Основной, поставленной перед авторами задачей было получение биологически активного комплекса, стимулирующего физиологическую и репаративную регенерацию кожной ткани для лечения заболеваний и травматических поражений кожи, а так же для применения в производстве лекарственных препаратов в эстетической медицине и косметологии и фармкомпозиции на основе полученного БПК.
Поставленная задача достигается заявленной группой изобретений при соблюдении всех условий получения БПК и фармкомпозиции.
В заявленную группу изобретений входит белково-полипептидный комплекс, способ его получения из эмбриональных нервной и кожной тканей копытных сельскохозяйственных животных на определенных сроках гестации и фармкомпозиция на основе этого белково- полипептидного комплекса. Таким образом, поставленная задача достигается, новым белково- полипептидным комплексом (БПК), обладающий тканеспецифическим репаративным действием на кожную ткань и слизистые оболочки с омолаживающим эффектом, получаемый из эмбриональных нервной и 5 кожной тканей сельскохозяйственных копытных животных сроком гестации от середины первой, до середины последней трети беременности, включающий тканеспецифические отрицательно заряженные слабо кислые, нейтральные белки и полипептиды, относящиеся к факторам роста, дифференцировки, сигнальным молекулам, определяющим его ю биологическую и фармакологическую активность, с молекулярными массами от 5 до 200 кДа, причем не менее 70% от общей массы белка имеет молекулярную массу в диапазоне от 20 до 160 кДа, имеющих характерный специфический набор полос при денатурирующем гель- электрофорезе («SDS-Раде») в 5%-ном полиакриламидном геле по
15 сравнению со стандартным набором маркерных белков с диапазоном молекулярных масс от 10 кДа до 250 кДа и максимумом поглощения при длине волны 215±5 нм, при снятии ультрафиолетового спектра в области длин волн от 200 до 500 нм.
Поставленная задача достигается также новым способом получения
20 выше охарактеризованного белково-полипептидного комплекса, обладающего антигипоксическим, тканеспецифическим репаративным и омолаживающим действием на кожную ткань, заключающегося в том, что эмбриональные нервная и кожная ткани копытных сельскохозяйственных животных сроком гестации от середины первой трети, до середины
25 последней трети беременности поэтапно:
- гомогенизируют в буферном растворе, с одновременной экстракцией в присутствии неионных детергентов при рН не менее 5,2 и не выше 8,5 с последующим центрифугированием при значении g интервале 0 000 - 28 000 в течение 90 - 30 мин.;
зо - полученный супернатант фильтруют;
- фильтрат подвергают анионообменной хроматографии на колонке с анионообменным носителем и разделяя связавшиеся с носителем белки и полипептиды, используя в качестве подвижной фазы буферный раствор, первоначально имеющий ионную силу (I) не выше 0,1 ммоль/л, повышая ее плавно или ступенчато с шагом 0,025 ммоль/л и начиная сбор целевых фракций с ионной силой элюента от 0,125 до 0,15 ммоль/л при рН от 5,2 до 8,5;
- полученные фракции объединяют и подвергают стерилизующей фильтрации.
Еще одним изобретением заявленной группы является фармацевтическая композиция на основе БПК, обладающая антигипоксическим, иммуномодулирующим, тканеспецифическим репаративным действием на кожную ткань и слизистые оболочки, с омолаживающим эффектом, выполненная в виде раствора, содержащего в качестве активного инградиента биологически активный белково- полипептидный комплекс по п.1 в концентрации 0,05 - 2,0 мг/мл, полученный способом по п. 2 и фармацевтически приемлемый разбавитель.
В качестве фармацевтически приемлемого разбавителя фармацевтическая композиция может содержать фармакопейный буферный раствор и, возможно, вспомогательные вещества, включающие высокомолекулярные соединения, стабилизаторы, консерванты и солюбилизаторы.
Указанная фармацевтическая композиция предназначена для фармацевтической и косметической промышленности, например, для применения парентерально (внутрикожно, подкожно), интраназально или апликационно на слизистые оболочки и кожу.
Ниже приводится краткое описание способа получения БПК и сам БПК.
Лучший вариант осуществления изобретения Итак, белково-полипептидный комплекс получают следующим образом (некоторые операции описаны с указанием детализаций, которые не ограничивают способ):
- нервную и кожную ткани эмбрионов копытных сельскохозяйственных животных, сроком гестации от середины первой трети, до середины последней трети беременности, размораживают;
гомогенизируют в буферном растворе, с одновременной экстракцией в присутствии неионных детергентов при рН не менее 5,2 и не выше 8,5, в соотношениях не менее 1 :0,5;
- гомогенат отделяют от балластных веществ фильтрованием через плотную ткань с последующим центрифугированием при значении g интервале 10 000 - 28 000 в течение 90 - 30 мин.,
- надосадочную жидкость фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм;
- фильтрат наносят на уравновешенную хроматографическую колонку с анионообменным носителем, например - Toyopearl DEAE-650M;
- разделение связавшихся с носителем белков производят ступенчатым градиентом ионной силы раствора, используя в качестве подвижной фазы буферный раствор, имеющий ионную силу не выше 0,1 ммоль/л, повышая ее с шагом 0,025 ммоль/л и начиная сбор целевых фракции с помощью буферного раствора с ионной силой от 0,125 до 0,15ммоль/л, в интервале рН от 5,2 до 8,5;
- целевые фракции объединяют и разводят буферным раствором, например 0,05М глицин-NaOH в интервале от рН 5,2 до 8,5 и общей концентрации белка 1 ,0 - 2,0 мг/мл;
- полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации, через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,22 мкм и определяют суммарную концентрацию белков.
Все предварительные процессы и процессы получения белково- полипептидной фракции желательно производить при температуре от +2° до +8°С. Для идентификации полученного БПК используют методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гель-хроматографии и электрофореза в полиакриламидном геле. Ультрафиолетовый спектр раствора препарата снимают в области длин волн от 200 до 500 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 215±5 нм (фиг. ). Молекулярную массу белков, входящих в препарат, определяют методом денатурирующего гель-электрофореза («SDS-Раде») в 5%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков с диапазоном молекулярных масс от 10 «Да до 250 кДа (фиг.2.). Значение изоэлектрической точки комплекса - от 4,2 до 8,4. В состав препарата входят белки с молекулярной массой от 5 кДа до 200 кДа, из которых не менее 70% имеют молекулярную массу в диапазоне от 20 до 160 кДа.
Для получения фармкомпозиции, БПК разводят фармацевтически приемлемым буферным раствором, например 50мМ глицин-фосфатным, содержащим при необходимости вспомогательные вещества, например, с концентрациями 0,5% маннитола, 0,0005% полисорбата-80 и двузамещенного фосфорнокислого натрия до рН не ниже 5,2 и не выше 8,5, с расчетом конечной концентрации общего белка (по методу Лоури) в полученном растворе в пределах 0,05 - 2,0 мг/мл. Проводят повторную идентификацию смеси и фильтрующую стерилизацию.
Для идентификации полученного белково-полипептидного комплекса используют методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гель- хроматографии и электрофореза в полиакриламидном геле. Ультрафиолетовый спектр раствора препарата снимают в области длин волн от 200 до 500 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 215±5 нм (фиг.1.). Молекулярную массу белков, входящих в препарат, определяют методом денатурирующего гель-электрофореза («SDS-Page») в 5%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков с диапазоном молекулярных масс от 10 кДа до 250 кДа (фиг.З.). В состав препарата входят белки с молекулярной -массой от 5 кДа до 200 кДа, из которых не менее 70% имеют молекулярную массу в диапазоне от 20 до 160 кДа.
Таким образом, при выделении ВПК важно, чтобы:
- в качестве сырья использовалась эмбриональная нервная и кожная ткань копытных сельскохозяйственных животных со сроком гестации от конца первой трети до середины последней трети беременности;
- присутствие в буферном растворе консервантов, детергентов и солюбилизаторов в достаточных концентрациях;
- на стадиях гомогенизации и анионообменной хроматографии рН буферных сред находился в диапазоне 5,2 - 8,5;
- при проведении анионообменной хроматографии ионная сила раствора (I) элюента при разделение связавшихся с носителем белков и полипептидов была не ниже 0, ммоль/л, а сбор целевых фракции производился элюентом, имеющим ионную силу не выше 0,15ммоль/л;
- в описываемом ВПК содержание белка с молекулярными массами от 20 кДа до 160 кДа было не менее 70% от общего содержания белка;
при индентификации заявленного ВПК и проведении денатурирующего гель-электрофореза («SDS-Раде») в 5%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков отмечалось наличие характерных полос, подтверждающих и характеризующих спектр белково-полипептидных составляющих комплекса. При других параметрах получения, состав белково- полипептидного компонента и концентрационные соотношения входящих в него компонентов будут иными.
Заявляемый биологически активный белково-полипептидный комплекс принципиально отличается от всех известных биологически активных субстанций получаемых из сырья животного происхождения по:
- сырьевой основе - используется нервная и кожная эмбриональная ткань сельскохозяйственных животных на определенной стадии гестации от середины первой трети, до середины последней;
- методике получения - присутствие в экстрагирующем буферного раствора, детергентов и солюбилизантов и отсутствие денатурирующих и деградирующих соединений - спиртов, щелочей, кислот и ферментов, позволяет получить мембранные, межклеточные, цитоплазматические, ядерные белки и полипептиды с сохраненной третичной структурой;
- использование в составе подвижной фазы миллимолярных концентраций катиона для создания умеренной ионной силы, позволяя тем самым получить большое количество специфических для нервной ткани слабо заряженных белков и полипептидов, выполняющих регуляторные, сигнальные и ферментативные функции, определяющие выраженную регенеративно-репаративную биологическую
тканеспецифическую активность; качественному составу, как определенной фракции тканевых (мембранных, клеточных, цитоплазматических, ядерных) гидрофильных, слабо заряженных отрицательных белков и полипептидов, с эволюционно закрепленным в онтогенезе концентрационным соотношением факторов роста, факторов дифференцировки и сигнальных молекул с молекулярной массой от 5 кДа до 200 кДа;
- по идентификации и стандартизации полученной целевой фракции - наличие специфических, характерных для данного комплекса полос при электрофорезе в 5%-ном полиакриламидном геле; - по чистоте - полученный белково-полипептидный комплекс не содержит примесей в виде липидов, пептидгликанов, липополипротеидов, углеводов, полисахаридов и других соединений;
- по способу применения - парентерально (внутрикожно, подкожно), на слизистые оболочки (интраназально, субконъюктивально) и кожу;
- по безопасности применения (отсутствие токсических, мутагенных, канцерогенных и аллергизирующих свойств);
- по биологической и фармакологической активности (репаративно- регенеративная) и ее специфичности (ткане- и органоспецифичная). Заявленная фармкомпозиция в виде БПК с фармацевтически приемлемым разбавителем позволяет повысить стабильность раствора БПК и увеличить сроки его действия и хранения.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами, не 5 ограничивающими его объем.
Пример 1. Способ получения БПК.
Получение белково-полипептидного комплекса из эмбриональной нервной и кожной ткани овец.
440г эмбриональную нервную и кожную ткани ягнят сроком гестации 16 - ю 18 недель размораживают и гомогенизируют в 1200 мл 0,05М ТРИС- глициново-фосфатного буфера рН 8,0, содержащего 1мМ ЭДТА и 0,1 % маннит, в течение 5 минут при +4°С, гомогенат отделяют от балластных веществ фильтрованием через плотную ткань с последующим центрифугированием при значении g 10 000 в течение 90 мин., отделяя
15 фугат. Надосадочную жидкость фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45мкм, фильтрат наносят на уравновешенную 4 объемами 0.05М глициново-фосфатного буфера с рН 7,0 хроматографическую колонку объемом 200 мл с анионообменным носителем Toyopearl DEAE-650M, разделение связавшихся с носителем
20 белков производят ступенчатым градиентом тем же буферным раствором, содержащим 0,05 М KCI (I = 0,1 ммоль/л), повышая концентрацию соли с шагом 0,025М (I = 0,025 ммоль/л) и начиная сбор целевых фракции с концентрациями соли от 0,075 М (I = 0,125 ммоль/л) до 0,1 М (I = 0,15 ммоль/л), целевые фракции объединяют, подвергают ультрафильтрации
25 на установке при противодавлении не более 8,0 кгс/см2 через материалы с задерживающей способностью выше 200 кДа и разводят 0,05 М раствором глицин-NaOH рН 8,5 до общей концентрации белка 1 ,4мг/мл, полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации, через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,22мкм и определяют зо суммарную концентрацию белков.
Все предварительные процессы и процессы получения белково- пептидной фракции производятся при температурах от +2° до +8°С. Характеристика полученной белково-полипептидного комплекса:
- ультрафиолетовый спектр раствора препарата снимают в области длин волн от 200 до 500 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 215±5 нм (Фиг.1.);
- молекулярную массу белков, входящих в препарат, определяют методом денатурирующего гель-электрофореза («SDS-Раде») в 5%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков с диапазоном молекулярных масс от 10 кДа до 250 кДа, в состав фракции входят белки с молекулярной массой от 5 «Да до 200кДа, из которых 76% имеют молекулярную массу в диапазоне от 20 до 160 кДа (Фиг.2.);
количественное определение белка методом Лоури (без предварительного осаждения) - ,48 мг/мл. Пример 2. Способ получения БПК.
Получение белково-полипептидного комплекса из эмбриональной нервной и кожной ткани свиней.
ЗООг эмбриональной нервной и кожной ткани поросят сроком гестации 16 - 18 недель размораживают и гомогенизируют в буферном растворе рН 5,2, содержащего 50мМ Трис-малеата, 1 мМ (ЭДТА) и 0,1% маннита, в течение 5 минут при +2°С. гомогенат отделяют от балластных веществ фильтрованием через плотную ткань с последующим центрифугированием при значении g 28 000 в течение 30 мин. Супернатант фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и наносят на уравновешенную 4 объемами малеатного буферного раствора
рН 5,2 хроматографическую колонку объемом 250мл с анионообменным носителем DEAE-Сефароза. Разделение связавшихся с носителем белков производят градиентом малеатного буферного раствора рН 5,2 содержащего 0,05М NaCI (I = 0,1 ммоль/л), плавно повышая концентрацию соли до 0,1 М (I = 0,15 ммоль/л), начиная сбор целевой фракции с концентрации соли 0,075 М (I = 0,125 ммоль/л) до 0,1 М (I = 0,15 ммоль/л), целевую фракцию подвергают ультрафильтрации на установке при противодавлении не более 8,0 кгс/см2 через материалы с задерживающей способностью выше 200 кДа и подвергают стерилизующей фильтрации, через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,22 мкм.
Для характеристики полученной белково-полипептидного комплекса используют методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гель- хроматографии, электрофореза в полиакриламидном геле и аминокислотного анализа. Ультрафиолетовый спектр раствора снимают в области длин волн от 200 до 500 нм - максимум поглощения отмечается при длине волны 215±5 нм (Фиг.З.). Молекулярную массу белков и полипептидов, входящих в комплекс, определяют методом денатурирующего гель-электрофореза («SDS-Раде») в 5%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков с диапазоном молекулярных масс от 10 кДа до 250 кДа (Фиг.4.). В состав препарата входят белки с молекулярной массой от 5 кДа до 200 кДа, из которых 72% имеют молекулярную массу в диапазоне от 20 до 160 кДа. Количественное определение белка в полученном ВПК методом Лоури (без предварительного осаждения) - 2,4 мг/мл. Пример 3. Способ получения фармкомпозиции.
Берут, полученный по примеру 1. раствор ВПК и разводят 50мМ глициново-фосфатным буферным раствором и добавляют вспомогательные вещества: детергенты, солюбилизаторы, консерванты и высокомолекулярные соединения до конечных концентрации ВПК - 0,05 мг/мл, маннитол - 0,5%, полисорбат-80 - 0,0005%, двузамещенный фосфорнокислый натрий до рН 8,5 и нипагин - 0,03%. Полученную фармкомпозицию подвергают стерилизующей фильтрации, через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0, 1 мкм, разливают в стерильные стеклянные флаконы и закупоривают.
Для характеристики полученной фармкомпозиции с ВПК используют методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гель-хроматографии, электрофореза в полиакриламидном геле и аминокислотного анализа. Ультрафиолетовый спектр раствора снимают в области длин волн от 200 до 500 нм - максимум поглощения отмечается при длине волны 215±5 нм (Фиг.1.). Молекулярную массу белков и полипептидов, входящих в комплекс, определяют методом денатурирующего гель-электрофореза 5 («SDS-Раде») в 5%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков с диапазоном молекулярных масс от 10 кДа до 250 кДа (Фиг.2.). В состав препарата входят белки с молекулярной массой от 5 кДа до 200 кДа, из которых 72% имеют молекулярную массу в диапазоне от 20 до 160 кДа. Количественное Ю определение белка в полученном БПК методом Лоури (без предварительного осаждения) - 1,55мг/мл.
Пример 4. Способ получения фармкомпозиции.
Берут, полученный по примеру 2. раствор БПК и разводят 50мМ
15 глициново-фосфатным буферным раствором и добавляют вспомогательные вещества: детергенты, солюбилизаторы, консерванты и высокомолекулярные соединения до конечных концентрации БПК - 2 мг/мл, манит - 0,5%, полисорбат-80 - 0,0005%, бензалкония хлорид - 0,005% и однозамещенный фосфорнокислый натрий до рН 5,2.
20 Полученную фармкомпозицию подвергают стерилизующей фильтрации, через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,1 мкм, разливают в стерильные стеклянные флаконы и закупоривают.
Для характеристики полученной фармкомпозиции с БПК используют методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гель-хроматографии,
25 электрофореза в полиакриламидном геле и аминокислотного анализа.
Ультрафиолетовый спектр раствора снимают в области длин волн от 200 до 500 нм - максимум поглощения отмечается при длине волны 2 5±5 нм (Фиг.З.). Молекулярную массу белков и полипептидов, входящих в комплекс, определяют методом денатурирующего гель-электрофореза зо («SDS-Раде») в 5%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков с диапазоном молекулярных масс от 10 кДа до 250 кДа (Фиг.4.). В состав препарата входят белки с молекулярной массой от 5 кДа до 200 кДа, из которых 72% имеют молекулярную массу в диапазоне от 20 до 160 кДа. Количественное определение белка в полученном ВПК методом Лоури (без предварительного осаждения) - 2 мг/мл.
5
Пример 5. Исследование токсичности
Свойства полученной фармкомпозиции были изучены с помощью общепринятых методик по экспериментальному (доклиническому) изучению фармакологических веществ [1 1].
ю Проведены исследования токсичности в остром и субхроническом эксперименте оригинальной фармкомпозиции. Лекарственная форма: раствор для инъекций: 5 ампул по 1мл (0,1 мг/мл), 5 ампул по 2мл (0,1 мг/мл), 1 ампула по 2мл (0,2мг/мл). Максимальная рекомендуемая суточная доза 0,4 мг при эндолюмбальном введении и 0,1 мг при
15 внутривенном введении.
Условия проведения эксперимента и методы исследований
Целью исследования явилось определение переносимых, токсических и летальных доз оригинальной фармкомпозиции. Исследование проводили на мышах обоего пола линии BALB/C массой 18-20г при
20 внутрибрюшинном, подкожном и внутрикожном способах введения. Срок наблюдения составил 14 дней. Животные получены из питомника, паспортизированы. Животных содержали в стандартных условиях, в пластмассовых клетках по 10 особей, количество в группе - 10. Для кормления использовали комбинированный корм, свежие овощи, творог.
25 Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное.
Температура воздуха +18° - +20°С [14]. Максимально возможная для введения мышам доза готовой лекарственной формы 0,2мл и составила 10мг/кг, что превысило суточную терапевтическую дозу в 600 раз. Из эксперимента животных выводили эфирным наркозом, подвергали зо вскрытию и анализу состояния внутренних органов.
Результаты исследования острой токсичности. Мыши. Масса животных составила от 18 до 20г. Вводимая доза 0,2мл, что составило 10мг/кг. Количество животных в группе 10 голов. Всего две группы: внутрижелудочное и внутрибрюшинное введение. Срок наблюдения 14 суток.
Внешний вид. К концу эксперимента все животные выглядели здоровыми. Шерстяной покров густой, белого цвета. По внешнему виду животные между группами не отличались.
Поведение. Не отличалось между группами и от нормы.
Смертность. Во всех трех группах летальных исходов зафиксировано не было.
Масса животных. В течение всего срока наблюдения произведено шесть контрольных взвешиваний. Резкой потери или увеличения не выявлено. Внутренние органы. По состоянию внутренних органов группы не отличались между собой. Изменения или увеличения внутренних органов не наблюдалось.
Исследование подострой (субхронической) токсичности
Условия проведения эксперимента и методы исследований
Исследования токсичности оригинальной фармкомпозиции в субхроническом эксперименте проводили на самцах и самках крыс линии Вистар массой от 200 до 250г. Животные получены из питомника. Крыс содержали в стандартных условиях, в пластмассовых клетках по 5 особей. Для кормления использовали брикетированный корм, свежие овощи, творог. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное. Температура воздуха +18 - +20°С. До начала эксперимента животных выдерживали в карантине в течение 10 дней. В группе 10 животных (5 самцов и 5 самок). Группы разделены следующим образом: 1 группа (контроль) интактные животные
2 группа- оригинальная фармкомпозиция т.д. внутрикожное введение (п/к)
3 группа - оригинальная фармкомпозиция х 10 п/к
4 группа - оригинальная фармкомпозиция внутрибрюшинное введение (в/в) т.д.; 5 группа - оригинальная фармкомпозиция в/в х10.
Срок наблюдения: 1 месяц введения, 1 месяц наблюдение резорбтивного действия.
Токсичность оценивали согласно пунктам контрольного листа наблюдения: - по выживаемости и общему виду: (шерстяной покров, глаза, уши, конечности, зубы);
- состоянию и поведению животных (активность, походка, темперамент, питание);
- изменению массы тела (взвешивание крыс проводили до начала и в конце эксперимента);
- физиологическим функциям (дыхание, слюноотделение, мочеиспускание, экскрет).
Экспериментальным животным до начала и в конце эксперимента исследовали кровь:
морфологический состав периферической крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, уровень гемоглобина); биохимические показатели (уровень белка, мочевины, креатинина, глюкозы), активность некоторых ферментов сыворотки крови (аспартат- и аланинаминотрансферазы, щелочная фосфатаза, лактат дегидрогеназа). Забор крови для гематологических исследований производили из хвостовой вены. Подсчет форменных элементов крови производили на автоматическом счетчике крови «Пикоскель» (Венгрия). Уровень гемоглобина определяли гемиглобинцианидным методом. Уровень биохимических показателей определяли с помощью автоматизированной системы. ФП-901 , «l_absystems» Финляндия. После окончания хронического эксперимента животных умерщвляли с помощью передозировки наркоза для патоморфологических исследований органов и тканей. Вскрытие животных производили сразу после их гибели по полной патологоанатомической схеме. Для патоморфологических исследований образцы ткани подвергали желатинированию и криостатированию с получением срезов толщиной до 5мкм. Затем ткани фиксировали и окрашивали гематоксилин-эозином. Микроскопию проводили на микроскопе фирмы «Ορίοη» (Германия). Полученные экспериментальные данные сравнивали с контрольными данными и обсчитывали с помощью компьютерной статистической программы.
Результаты исследования. Макроскопические исследования
Выживаемость: Все подопытные животные перенесли все способы введения. Г ибели не наблюдалось ни в экспериментальных, ни в контрольных группах животных.
Поведение: Каких-либо существенных отклонений в поведении (повышенной или пониженной активности) и состоянии подопытных животных по сравнению с контрольными группами не отмечено. Мышечный тонус не отличался повышенной возбудимостью.
Внешний вид: все животные были средней упитанности, истощением или ожирением не страдали. Шерстяной покров ровный и блестящий; выпадения или ломкости шерсти не выявлено. Помутнения роговицы, слезотечения или каких-либо патологических признаков не отмечено. Ушные раковины розового цвета без корок, не воспалены, подергиваний не замечено. Зубы обычного цвета у всех животных, поломок не наблюдалось.
Функции: дыхание у подопытных животных, как и у контрольных, было спокойное обычного ритма, незатрудненное; слюноотделение без патологии; частота, количество и цвет мочи был в пределах физиологической нормы.
Клинические исследования: Динамика массы тела: во всех подопытных группах положительная. Достоверных различий между опытными и контрольными животными нет.
Г эматологические показатели: содержание гемоглобина, количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов во всех группах в пределах физиологической нормы.
Биохимические исследования: пептидный комплекс в испытуемой дозе не влиял на уровень содержания общего белка сыворотки крови подопытных животных, что свидетельствует об отсутствии повреждающего действия изучаемого препарата на белок-образующую функцию печени. Для выявления возможного повреждающего воздействия на печень в сыворотке крови животных во время хронического эксперимента определяли активность щелочной фосфатазы, аспартат и аланинаминотрансферазы.
Анализ полученных данных показал отсутствие достоверных изменений активности указанных ферментов сыворотки крови.
Патомор ологические данные: Макроскопическое исследование.
У животных во всех группах при вскрытии кожа чистая, подкожно- жировой слой развит умеренно. Расположение внутренних органов правильное, свободной жидкости ни в плевральной и ни в брюшной полостях нет. Просвет трахеи и бронхов свободен, слизистая их чистая, влажная блестящая. Ткань легких опытных групп более интенсивно окрашена, чем у животных интактного контроля, однако без признаков отека. Миокард на разрезе без патологических изменений.
Язык чистый. Слизистая полости рта и пищевода без дефектов. Желудок и кишечник без следов раздражения. Печень не увеличена. Капсула почек отделяется легко, мозговое и корковое вещество на разрезе хорошо различимы. Селезенка с гладкой капсулой, на разрезе серовато-бурого цвета, пульпа без соскоба. Семенники и яичники без особенностей. Тимус сероватого цвета, без кровоизлияний. Щитовидная железа плотная с симметричными долями. Оболочки головного мозга умеренного кровенаполнения, влажные, блестящие. Мозговое вещество имеет симметричный рисунок на разрезе. Весовые индексы органов испытуемых животных не имели достоверных отличий от контрольных групп.
Микроскопическое исследование: Во всех исследуемых группах: во внутренних органах (печень, почки, легкие, сердце, селезенка, желудок, толстый и тонкий кишечник), железах внутренней секреции (щитовидная железа, тимус, надпочечники, поджелудочная железа), репродктивных органах (матка, яичники), лимфатических узлах, головном мозге, коже, слизистых носа и горла - патоморфологических изменений не выявлено. Исследование субхронической токсичности на неполовозрелых животных при внутрикожном введении на неполовозрелых животных. Исследования проводили на 3 недельных крольчатах породы Шиншилла весом от 300 до 500г. Введение препарата производили подкожно ежедневно 1 и 2 раза в день по 0,5мл (0,05мг) в течение 2 недель. Животные получены из питомника. Кроликов содержали в стандартных металлических клетках по 1 особи. Для кормления использовали брикетированный корм, свежие овощи. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное. Температура воздуха +18 - +20° С. В группе 5 животных, количество групп 3. Группы разделены следующим образом: 1 группа (терапевтическая доза) - фармкомпозиция 0,1 мг/мл 0,5мл, вводимая ежедневно 1 раз в день; 2 группа - фармкомпозиция 0,1 мг/мл 0,5мл, вводимая ежедневно 2 раз в день; 3 группа - интактные животные. Срок введения 2 недели.
Токсичность оценивали согласно пунктам контрольного листа наблюдения: по выживаемости, общему виду, состоянию и поведению животных, изменению массы тела (взвешивание проводили в начале и в конце эксперимента). О местном раздражающем действии в ходе эксперимента судили по изменениям при визуальном и гистологическом исследовании в коже, в местах инъекций.
Экспериментальным животным до начала и в конце эксперимента исследовали морфологический состав периферической крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, уровень гемоглобина), биохимические показатели (уровень белка, мочевины, креатина, глюкозы, общего холестерина и триглицеридов), активность некоторых ферментов сыворотки крови (аспартат- и аланинаминотрансферазы, щелочная фосфатаза, лактат дегидрогеназа). Для определения указанных показателей кровь брали из ушной вены в объеме 1 ,5-2, 0мл. Подсчет форменных элементов крови производили на автоматическом счетчике крови «Пикоскель» (Венгрия). Уровень гемоглобина определяли гемиглобинцианидным методом. Уровень биохимических показателей определяли с помощью автоматизированной системы. ФП-901 , «Labsystems» Финляндия. После окончания хронического эксперимента животных умерщвляли с помощью передозировки наркоза. Вскрытие животных производили сразу после их гибели по полной патологоанатом ической схеме.
Морфометрическую оценку параметров органов животных проводили с 5 помощью весов фирмы «Sartorius» (Германия) с последующим вычислением массы органов и их стандартных отклонений.
Для патоморфологических исследований образцы свежей ткани подвергали желатинированию и криостатированию с получением срезов толщиной до 5мкм. Затем ткани фиксировали и окрашивали гематоксилин- ю эозином. Микроскопию проводили на микроскопе фирмы «Ορίοη» (Германия).
Полученные экспериментальные данные сравнивали с контрольными и обсчитывали с помощью компьютерной статистической программы.
Результаты исследования
15 Оценка местнораздражающего действия.
Прижизненные биомикроскопические исследования
На протяжении всего срока наблюдения у животных сохранялось
нормальное поведение, гиперемии, отека и других изменений в местах инъекций не выявлялось. Контрольная
20 интактная группа. Кожные покровы в местах инъекций бледно-розового цвета, без отеков и гиперемии, шерсть обычной густоты, имеет здоровый блеск без гипергидроза и повышенной сальности. Во время наблюдения изъянов на эпидермисе не обнаруживались. Рефлексы соответствовали физиологической норме.
25 При конфокальной микроскопии: эпидермальный слой и непосредственно дерма имели плотно упакованную структуру, четко дифференцированных клеток. Клетки связаны щелевыми контактами.
В группе терапевтической дозы. Кожные покровы в местах инъекций бледно-розового цвета, без отеков и гиперемии, шерсть обычной густоты, зо имеет здоровый блеск без гипергидроза и повышенной сальности. Во время наблюдения изъянов на эпидермисе не обнаруживались. Рефлексы соответствовали физиологической норме. При конфокальной микроскопии: эпидермальный слой и непосредственно дерма имели плотно упакованную структуру, четко дифференцированных клеток. Клетки связаны щелевыми контактами. Ни в одном случае патологических изменений не выявлено.
В группе х10. Ни в одном случае патологических изменений кожи не выявлено.
Клинические и биохимические исследования
Анализ крови: содержание гемоглобина, количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов во всех группах в пределах физиологической нормы. Показатели, полученные в опытных группах, достоверно не отличались от контрольных групп интактных животных и препарата сравнения.
Биохимические исследования: глюкоза крови, активность аланиновой и аспарагиновой аминотрансфераз во всех группах в пределах номы.
Заключение. Проведены исследования токсичности в субхроническом эксперименте на неполовозрелых животных оригинальной фармкомпозиции.
Введение препарата внутрикожно как в терапевтической дозе, так и в десяти кратно превышающей в течение 2 недель не вызывало изменений внутренних органов, не оказывало токсического действия на систему крови, не оказывало местнораздражающего действия.
Пример 6. Мутагенность фармкомпозиции.
Для оценки мутагенных свойств заявляемого бел ково-пол и пептидной фармкомпозиции применили набор следующих тестов [12]:
- учет генных мутаций в тесте Эймса Salmonella /микросомы с использованием в качестве тест-объектов штаммов Salmonella typhimurium ТА 97, ТА 98 и ТА 100;
- учет микроядер в клетках костного мозга мышей.
Испытан образец белково-полипептидной фармкомпозиции, представляющий собой прозрачную жидкость, стерильно упакованную во флакон темного стекла в количестве 20 мл, содержащую субстанцию в концентрации 0,1 мг/мл.
Оценка мутагенных свойств белково-полипептидной фармкомпозиции в тесте Эймса.
Мутационный тест на Salmonella typhimurium является бактери- альной тест-системой для учета генных мутаций к прототрофности по гистидину при действии химических соединений и (или) их метаболитов, индуцирующих мутации типа замены оснований или сдвига рамки считы- вания в геноме этого организма. Мутагены, индуцирующие замены пар оснований - агенты, вызывающие мутации замены пар оснований в молекуле ДНК. Мутагены, индуцирующие мутации сдвига считывания генетического кода (фреймшифт мутации), - агенты, вызывающие добавление или нехватку одиночных или множественных пар оснований в молекуле ДНК.
Данный метод предназначен для выявления способности фарма- кологических веществ или их метаболитов индуцировать генные мутации у индикаторных штаммов Salmonella typhimurium. Бактерии обрабатываются тестируемым соединением с системой метаболической активации (СМ+) или без метаболической активации (СМ-). После инкубации в течение определенного периода времени подсчитывается количество ревертантных колоний у разных тестерных штаммов в сравнении с количеством спонтанных ревертантов в вариантах негативного контроля (необработанные культуры или культуры, обработанные растворителем). Если тестируемое соединение и (или) его метаболиты обладают мутагенной активностью, то они будут индуцировать обратные мутации от ауксотрофности к прототрофности по гистидину у гистидин-зависимых штаммов Salmonella typhimurium.
Для тестирования использовали набор индикаторных штаммов Salmonella typhimurium, позволяющий регистрировать мутации типа сдвига рамки считывания генетического кода (ТА 98 и ТА 97) и замены пар оснований (ТА 100). Штаммы получены из Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосН И И Генетика.
Регламент работы с бактериальными культурами, проверка геноти- пов штаммов, правила их музейного хранения, необходимые для прове- дения экспериментов оборудование, посуда, реактивы и питательные среды и растворы, проведение работ по получению гомогената печени крыс и составление активирующей смеси, а также методы статистического анализа полученных результатов соответствовали стандартным, подробно описанным в соответствующей литературе.
Для метаболической активации использовали фракцию S9 печени самцов крыс Wistar, которым за 5 дней до забоя вводили индуктор микросомальных ферментов - совол (ЗООмг/кг, однократно, внутрибрюшинно). Для контроля активности системы метаболической активации использовали бромид этидия (Юмкг/чашку) на штамме ТА 98 при СМ+.
Белково-полипептидная фармкомпозиция в виде стерильного раствора с содержанием белка 0,1 мг/мл исследовали 1 ,0 и 0,3мл исходного раствора на чашку и три 10-кратных разведения в физиологическом растворе (по 0,1 мл/ч). Тестируемые дозы субстанции составили 300; 100; 10; 1 и 0,1 мкг на чашку.
Эксперимент сопровождали положительными контролями, в качестве которых использовали вещества, индуцирующие мутации у со- ответствующих штаммов-тестеров при наличии или отсутствии условий активации. Для вариантов без активации использовали азид натрия в ко- личестве 10 мкг на чашку для штамма ТА 100 при СМ-; 2,7-диамино-4,9- диокси-5, 10-диоксо-4,5,9, 10-тетрагидро-4,9-диазопирен (ДИАМ) - 10 мкг на чашку для штамма ТА 98 при СМ-; 9-аминоакридин (9АА) - 50 мкг/чашку для штамма ТА 97 при СМ-. Для контроля активности системы метаболической активации использовали этидиум бромид - Юмкг на чашку на штамме ТА 98 при СМ+. В качестве негативного контроля использовали физиологический раствор (0,1 мл на чашку). Селективный полуобогащенный агар (0,7%) в пробирках плавили в водяной бане при 100° С и помещали в термостатируемую водяную баню с температурой +45 - +46° С.
Сначала в пробирки с агаром вносили 0, 1 мл образца в необходимых разведениях, затем - 0, 1 мл суспензии бактерий и 0,5мл микросо-мальной активирующей смеси (для варианта с метаболической активацией). Затем содержимое пробирки быстро перемешивали и выливали на слой нижнего минимального агара в чашки Петри. Продолжительность времени внесения микросомальной активирующей смеси и розлива полужидкого агара на чашку не превышала 10-15 секунд. Чашки оставляли при комнатной температуре на 30-40 минут и после полного застывания агара переносили в термостат при +37°С. Учет результатов проводили через 48 часов инкубации.
Параллельно в опыт включали варианты без системы метаболической активации (СМ-) и в присутствии системы метаболической активации (СМ+). В варианте СМ- может быть зарегистрировано действие прямых мутагенов, то есть препаратов, проявляющих мутагенный эффект за счет активности исходной структуры вещества. Действие же промутагенов, то есть соединений, эффект которых связан с образованием мутагенных метаболитов, может быть учтено при сравнении результатов, полученных при анализе данных испытаний вещества в вариантах СМ- и СМ+. В каждом контрольном и опытном вариантах использовали по 2 чашки. Мутагенный эффект считали значимым, если среднее количество колоний ревертантов на чашку в опытном варианте превышало таковое в контрольном варианте в 2 и более раз. Результаты эксперимента учитывали при наличии стандартного ответа во всех вариантах позитивного и негативного контроля. Количество колоний ревертантов в контроле с растворителем в вариантах СМ- и СМ+ было в пределах колебаний спонтанного уровня для данных штаммов. Ответ штаммов на стандартные мутагены был в пределах обычных уровней.
Исследованный бел ково-пол и пептидная фармкомпозиция во всех тестируемых концентрациях не показал мутагенного эффекта на штаммах ТА 100, ТА 98 и ТА 97 в вариантах без- и в присутствии системы метаболической активации.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ: белково-полипептидная фармкомпозиция не обладает способностью индуцировать генные мутации на тестерных штаммах Salmonella typhimurium во всем диапазоне испытанных концентраций.
Оценка мутагенных свойств белково-полипептидной композиции микроядерным методом в клетках млекопитающих.
Цитогенетическая активность - способность вещества вызывать структурные и численные хромосомные нарушения в соматических и зародышевых клетках.
Микроядра - небольшие ДНК-содержащие образования, состоящие из ацентрических фрагментов хромосом или отставших на стадии анна- телофазы хромосом. На стадии телофазы эти фрагменты могут включаться в ядра дочерних клеток или образовывать одиночные или множественные микроядра в цитоплазме.
Цель исследования - выявление и количественная оценка цитогенетической (мутагенной) активности фармакологических средств в полихроматофильных эритроцитах (ПХЭ) костного мозга млекопитающих. Метод основан на микроскопической регистрации клеток с микроядрами.
Эксперименты проводили на самцах и самках мышей-гибридов
F1(CBAx C57BI6/J) двухмесячного возраста массой 18-20 г. В состав каждой группы входило по 6 особей. Животных содержали при 12-часовом световом режиме в условиях свободного доступа к воде и пище. Эксперименты на животных по оценке мутагенных свойств белково- полипептидного комплекса при однократном и пятикратном введении осуществляли в соответствии с официальными протоколами. Проведено 3 серии экспериментов с соответствующими контролями: терапевтическая доза испытана на самцах при однократном введении; субтоксическая доза испытана на самцах при однократном введении; терапевтическая доза ис- пытана на самцах и самках при пятикратном введении.
Учитывая, что возможным предполагаемым способом применения белково-полипептидной фармкомпозиции в клинике - внутривенный или эндолюмбальный, в данном исследовании использовали внутрибрюшинное введение субстанции мышам. Дозу белково- полипептидного комплекса для оценки мутагенной активности рассчитывали, исходя из наибольшей рекомендованной суточной терапевтической дозы (ТД) для человека. Рекомендовано внутривенное введение белково-полипептидной фармкомпозиции в количестве 2 мл при концентрации 0, 1 мг/мл. При этом терапевтическая доза (ТД) для человека, в том числе для ребенка может составить 0,05мг/кг/сутки. Для расчета дозы в экспериментах на мышах рекомендуется использовать коэффициент пересчета, учитывающий соотношение площади поверхности тела и массы тела человека и мыши. В нашем исследовании он составил 8,33. Поэтому в качестве ТД для мышей использовали дозу, приблизительно равную 8,33 ТД для человека (0,42мг/кг).
В качестве субтоксической использовали максимально возможную в условиях данного эксперимента дозу Юмг/кг, поскольку вещество было предоставлено в концентрации 0,1 г/мл, а общепринятое количество вещества, вводимое мышам, составляет 0, 1 мл на 10 г веса. Соответственно в пересчете для человека максимальная испытанная доза составляет 1 ,7мг/кг.
Было сформировано 7 групп животных: четыре опытных и три соответствующих контрольных. Субстанцию в дозе 0, 1 г/кг вводили пятикратно с интервалом 24 часа самцам и самкам. Забой во всех группах проводили через 6 часов после последнего введения белково- полипептидного комплекса.
В двух других опытных группах белково-полипептидный комплекс вводили однократно самцам в дозах 0,2мг/кг и 0,5мг/кг.
В качестве негативного контроля использовали растворитель - физраствор. Его вводили внутрибрюшинно самцам и самкам двух контрольных групп в те же сроки и в тех же объемах, что и животным опытных серий. В качестве позитивного контроля использовали циклофос- фамид в дозе 20мг/кг, растворенный ex tempore в физрастворе при однократном внутрибрюшинном введении за 24 часа до забоя. Препараты клеток костного мозга для учета микроядер готовили общепринятым способом в соответствии с методическими рекоменда- циями «Оценка мутагенной активности факторов окружающей среды в клетках разных органов млекопитающих микроядерным методом». 5 Животных умерщвляли методом цервикальной дислокации через 6 часов после последнего введения препарата. Выделяли обе бедренные кости и очищали их от мышц. Для вымывания костного мозга использовали эмбриональную телячью сыворотку (НПП ПанЭ-КО). Костный мозг из обеих бедренных костей вымывали шприцем в микропробирку. Суспензию ю центрифугировали при 1000 об/мин, в течение 5 минут, супернатант удаляли, осадок осторожно ресуспенди-ровали. Из капли суспензии готовили мазок, высушивали его на воздухе. Фиксировали метанолом 3 минуты. Окрашивали по методу Рома-новского-Гимза. Анализировали на зашифрованных препаратах по 2000 поли-хроматофильных эритроцитов
15 от каждого животного. При подсчете 500 эритроцитов определяли соотношение полихроматофильных и нормохромных эритроцитов. Препараты расшифровывали по окончании анализа.
Критерием позитивного результата является воспроизводимое и статистически значимое увеличение числа полихроматофильных
20 эритроцитов с микроядрами по крайней мере в одной из опытных групп по сравнению с контрольной. Полученный положительный результат свидетельствует, что вещество индуцирует хромосомные повреждения и/или нарушения митотического аппарата клеток у экспериментальных животных.
25 Статистическую обработку результатов по учету микроядер про- водили путем сравнения опытных серий с контрольными по критерию Х2; межгрупповое сравнение доли полихроматофильных эритроцитов проводили с помощью критерия Манна-Уитни.
Результаты учета микроядер в полихроматофильных эритроцитах зо костного мозга мышей: во всех вариантах опыта белково-полипептидная фармкомпозиция не вызывала увеличения частоты клеток с микроядрами в костном мозге мышей при сравнении опытных и соответствующих кон- трольных серий. Циклофосфамид (позитивный контроль) при внутри- брюшинном введении самцам мышей в дозе 20 мг/кг вызывал повышение частоты клеток с микроядрами в 19,6 раза (62,1 %о против 3,16%о в контроле, Р<0,001). Доля ПХЭ от общего числа эритроцитов костного мозга была приблизительно на одном уровне в группах опытных и контрольных серий, что свидетельствует об отсутствии токсического действия композиции в испытанных дозах на кроветворение. При действии позитивного контроля (циклофосфамида) отмечен сдвиг соотношения полихроматофильных и нормохромных эритроцитов в сторону последних (при сравнении с контролем Р<0,005).
Таким образом, мутагенная активность белково-полипептидной фармкомпозиции не выявлена в тесте на индукцию микроядер в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей при условии однократного и пятикратного введения самцам и самкам внутрибрюшинно в дозе 0,42мг/кг массы тела, что в пересчете соответствует суточной те- рапевтической дозе для человека. Мутагенная активность не выявлена также в условиях однократного введения белково-полипептидной фармкомпозиции самцам в максимально возможной дозе - 10мг/кг. Белково-полипептидный комплекс не проявил токсического действия по показателю «доля полихроматофильных эритроцитов».
Заключение по оценки мутагенных свойств белково-полипептидной фармкомпозиции.
Белково-полипептидная фармкомпозиция не обладает мутагенной активностью в тесте Эймса Salmonella /микросомы и в тесте на индукцию микроядер в клетках костного мозга мышей в условиях экспериментов, проведенных в соответствии с Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ.
Пример 7. Исследование биологической активности
Репаративное действие. Данный вид фармакологического действия установлен на стандартной модели с полнослойным дефектом кожи на мышах, которым вводили заявляемый БПК в дозах 0,2 - 1 ,0мг/кг. Под влиянием препарата срок заживления по сравнению с контролем сокращается с 17 дней до 10. Аналогичный эффект оказывает препарат из плаценты амниоцен только в дозе 75мг/кг. При этом существенным преимуществом применения заявляемого препарата является отсутствие рубцов в процессе заживления.
Адаптогенное действие. Данный вид действия в процессе создания новых лекарственных средств приобретает одно из самых актуальных направлений поиска, т.к. это может дать возможность влиять на физиологические процессы при физических, термических, химических перегрузках, особенно для предотвращения отравлений, ожогов, повышения выносливости организма и т.д. В процессе исследования заявляемого препарата установлено, что предварительная обработка животных (мыши) в течение 7 суток в условно-терапевтической дозе (0, 1 мл/кг) предотвращает гибель животных от токсической дозы ядовитых веществ (стрихнин), летального облучения, инфицирования синегнойной палочкой.
Антистрессовое действие. Антистрессовое действие заявляемого препарата исследовано на основе многомерных методов оценки состояния различных компонентов устойчивости к эмоциональному стрессу у крыс (поведенческий и висцеральный компоненты). В результате данных исследований установлено, что заявляемый препарат обладает способностью повышать устойчивость к эмоциональному стрессу, т.е. предупреждать развитие функциональных расстройств высшей нервной деятельности, общего иммунитета и метаболических нарушений сердечной деятельности. Наиболее эффективной оказалась доза 20мкл на 100 г массы крысы, что соответствует дозе 2мл на 1 инъекцию у человека. Антикоагулянтное действие. В процессе исследования степени влияния заявляемого препарата на свертываемость крови установлено, что в дозе 0,2мг/кг при месячном введении проявляется антикоагулянтное действие, которое исчезает через 30 дней после окончания введения препарата. Данный факт может иметь существенное практическое значение при лечении состояний сопровождающихся симптоматической гиперкоагуляцией.
Пример 8. Противоожоговое и репаративное действие.
5 20 крыс линии F-\ (AMCY х Wistar), массой тела 250 270г, наркотизировали внутрибрюшинным введением тиопентала в дозе бОмг/кг. Для получения ожога на эпилированный участок кожи лопаточной области, размерами 3x3см, накладывали четырехслойную медицинскую марлю, размером 1 см2 предварительно смоченную дистиллированной водой, и прижимали ю нагретый термоэлектрод площадью 1см2 с температурой нагрева 200°С.
Степень ожога дозировали временем экспозиции электрода, которое составляло от 3 до 15с.
Крыс забивали на 3, 7, 14, 23, 30 и 60 сутки после нанесения ожога и осуществляли гистологическое исследование ожоговых тканей.
15 Макроскопическое наблюдение показало, что сразу после нанесения ожога на коже образуется сухой, плотный, беловато-серый, местами багрово- синюшный струп с четко определяющими границами. Кожа вокруг зоны термического воздействия становится пастозной. По краю струпа образуется розовый венчик.
20 10 крыс, составивших группу фармкомпозиции с БПК, получали внутрикожные инъекции в 8 точек по периферии ожога в суммарной дозе 0,2мг/кг, что по объему составило 2мл раствора. 10 оставшихся крыс составили контрольную группу, получавшую в то же количество точек, внутрикожно 2 мл физиологического раствора.
25 На третьи сутки после нанесения ожога появляется выраженная клеточная реакция на повреждение в виде лимфомоноцитарной инфильтрации по границе поврежденных и неповрежденных тканей.
На 7 сутки в обеих группах, под струпом определяется грануляционная ткань, умеренно инфильтрированная моноцитами и зо лимфоцитами, но опытная группа отличалась от группы контроля тем, что на фоне обычной грануляционной ткани, возникающей на месте повреждения, регенерирующие коллагеновые волокна, еще тонкие и нежные, уже располагаются в соответствии с гистроархитектоникой сетчатого слоя дермы, а поврежденные ткани подкожной клетчатки и мышечного слоя замещались рыхлой волокнистой соединительной тканью с небольшим избытком фибробластов. С краев под струп врастал эпидермис, под которым структура всех слоев кожи не отличалась от контроля. Капилляры субэпидермального слоя были расширены и полнокровны во всех группах.
К 14 суткам, в группе фармкомпозиции, за тонким плотным струпом и следующей за ним узкой зоной клеточного детрита располагалась молодая соединительная ткань, пучки коллагеновых волокон которой, тонкие и слабо фуксинофильные, четко воспроизводили структуру и архитектонику коллагеновых пучков сетчатого слоя дермы. За регенерирующей дермой располагается ткань, состоящая из нежной сети ретикулиновых волокон, между которыми встречаются жировые клетки. Это позволяет говорить о восстановлении структуры подкожной жировой клетчатки. В группе контроля отмечалась некоторая хаотичность организации пучков коллагеновых волокон без четкой архитектоники, за которой располагаемая сеть ретикулиновых волокон с вплетением пучков коллагена.
На 23 сутки, во всех группах поверхность поражения полностью эпителизирована. Эпидермис, несколько утолщенной с правильно расположенных краев, давал в подлежащие ткани выросты в виде гребней. Сосочковый слой дермы, в группе фармкомпозиции отличался от группы контроля более плотным расположением волокон и повышенной клеточностью.
На 30 сутки опыта во всех группах отмечали дальнейшее созревание коллагеновых волокон дермы, причем в группе фармкомпозиции отмечалась их выраженная структуризация с несколько меньшим размером волокон. В контрольной группе отмечалось достоверное утолщение эпидермиса у всех животных.
На 60 сутки при осмотре область термического ожога в группе фармкомпозиции визуально не отличается от окружающей ткани, по морфологическому строению никаких качественных отличий от нормальной кожной ткани не обнаружено. В контрольной группе отмечается образование гипертрофического рубца с возвышением над поверхностью окружающих кожных покровов. При морфологическом исследовании во всех слоях кожи отмечалось повышенное содержание деструктурированного коллагена.
Пример 9. Иммуномодулирующая активность.
Иммуномодулирующие свойства ВПК, полученного так же, как и в примерах 1 и 2, определяли по активации макрофагов перитонеального экссудата крыс линии Wister в опытах in vitro по усилению ферментативной активности в восстановлении нитро-синего тетразолия в диформазан (НСТ-тест) и по усилению фагоцитарной активности к E.Coli.
В брюшную полость декапитированных животных с помощью иглы со шприцом вводили 20 мл бесцветного раствора Хенкса, содержащего 20 ед/мл гепарина. После 2-3 минутного массажа живота делали надрез й тем же шприцом отсасывали из полости введенную жидкость, которую после фильтрации через нейлоновый фильтр центрифугировали при ускорении 150-200 g в течение 15 мин. Полученный осадок суспендировали в половинном объеме свежей порции раствора Хенкса и вновь центрифугировали при тех же условиях. Промывку выделенных клеток осуществляли 3 - 4 раза, после чего концентрацию клеток в суспензии доводили до 80 х 106клеток/мл. Содержание макрофагов в тканевом экссудате всех клеток составляло 25-35%. Определение ферментативной активности макрофагов перитонеального экссудата крыс проводили спектрофотометрически по восстановлению нитро-синего тетразолия в диформазан. Осадок клеток перитонеального экссудата крыс разводили бесцветным раствором Хенкса до концентрации 80 х 06 клеток/мл. К 50мкл клеточной суспензии добавляли 50мкл пробы с рН 7,4 и концентрацией белково-полипептидного комплекса 0,1 мг/мл. Смесь ставили на инкубирование при температуре +37°С в водяную баню при постоянном встряхивании в течение 30 мин, после чего добавляли 50 мкл насыщенного при температуре +20 С раствора нитро-синего тетразолия фирмы Reanal (Венгрия) и продолжали инкубировать еще 30 мин. Затем вносили 3 мл ацетона и центрифугировали при ускорении 2000 g в течение 20 мин. Надосадочную ацетоновую вытяжку фотометрировали при длине волны 515нм. В качестве контроля сравнения ферментативной активности использовали пробу с консервантом на физиологическом растворе. Фагоцитарную активность клеток перитонеального экссудата крыс определяли по их способности захватывать E.Coli. К 50мкл клеточной суспензии добавляли 50мкл пробы с рН 7,4 и препарата с общей концентрацией белков 0,05мг/мл. Смесь ставили на инкубирование при температуре +37°С в водяную баню при постоянном встряхивании в течение 30 мин. По окончании инкубации смесь суспендировали в 10+ мл бесцветного раствора Хенкса при температуре +4°С и центрифугировали при ускорении 150-200 g в течение 15мин. Осадок клеток перитонеального экссудата крыс разводили раствором Хенкса до концентрации 2,5 х 106 клеток/мл. Полученную суспензию в количестве 0,2мл наносили на стекло размером 18 х 18мм и инкубировали при температуре +37°С в течение ЗОмин в атмосфере, содержащей 5%-ный углекислый газ (СО2) для прикрепления к стеклу макрофагов. После инкубации для удаления неприкрепившихся клеток стекло ополаскивали 3 раза в стаканах со средой Хенкса. К оставшимся на стекле клеткам добавляли 0,2мл суспензии E.Coli при концентрации 20 х 106клеток/мл и инкубировали в тех же условиях 45мин. В дальнейшем стекло вновь трижды ополаскивали, фиксировали метанолом и окрашивали по Романовскому Гимзе. Индекс фагоцитоза (ИФ) определяли по формуле: ИФ (0 + 2,5n + 6Т + 9р + 10Р)/количество клеток, где 0 - количество клеток, не фагоцитирующих E.Coli; п - количество клеток, поглотивших 1-4 клетки; Т - количество клеток, поглотивших 5-7 клеток; р - количество клеток, поглотивших 8-9 клеток; R - количество клеток, поглотивших 10 и более клеток E.Coli. Идентификацию макрофагов проводили по окраске неспецифической эстеразы. Уровень активация макрофагов перитонеального экссудата крыс линии Wister в опытах in vitro в группе препарата достоверно, р<0,05 ( в 12 раз) превосходил контрольную группу при исследовании усиления ферментативной активности в восстановлении нитро-синего тетразолия в диформазан (НСТ-тест) и в 8 раз (р< 0,01) - по усилению фагоцитарной активности к E.Coli.
Пример 10. Регенеративная активность и омолаживающее действие.
Пациентка Л, 41 год. Обратилась осенью с жалобами на значительную выраженность старых и появление новых морщин после отдыха на юге. При осмотре выявлены поверхностные морщины «гусиная лапка» в латеральных углах глаз, переносице, коже лба, резкая выраженность носогубных складок. Кожа лица сухая и истонченная, тургор ее снижен. Обращает на себя внимание выраженная седина и разреженность волос. Проведено 5 сеансов, в течение трех недель с промежутками в 3 дня в виде внутрикожных инъекций заявленного белково-полипептидного комплекса по примеру 1. и фармкомпозиции с БПК полученной по примеру 3. в концентрации 0,1 г/мл и дозе 0,4мг на сеанс. Внутрикожное введение препарата осуществляя лось симметрично, непосредственно в линии морщин по 10 точек с каждой стороны, по 0,2мл на точку. Инъекции проводились симметрично в шахматном порядке, на одинаковом расстоянии друг от друга. Уже к концу первой недели отмечались следующие результаты: кожа лица приобрела естественный свежий вид, восстановился ее тонус и упругость. Морщинки у наружных углов глаз практически исчезли, на коже лба и переносицы значительно разгладились. К концу третьей недели отмечалось уменьшение седины. Результат на протяжении последующих месяцев стойкий, пациентка лечением довольна, отмечая значительное уменьшение седины с повышением густоты волос. Таким образом, предложенная фармкомпозиция позволяет повысить эффективность лечения старения кожи за счет быстрого восстановления ее фиброархитектоники и системного иммунорегулирующего воздействия на организм в целом. На прилагаемых фиг. 1 - фиг. 4 представлены результаты испытаний и исследований комплекса по изобретению.
На фиг. 1 представлена спектральная характеристика белково- полипептидного комплекса в УФ-видимой области спектра, полученного по примеру 1. Согласно данной фигуре, полученный заявленным способом по примеру 1 белково-полипептидный комплекс характеризуется наличием пика при длине волны 215+5 нм в УФ-видимой области спектра.
На фиг. 2 представлен денатурирующий электрофорез белково- полипептидного комплекса полученного по примеру 1. (2), в 5%-ном полиакриламидном геле при окрашивании реактивом Кумасси бриллиантовым голубым в сравнении со стандартным набором маркерных белков (1) с диапазоном молекулярных масс от 10 до 250кДа.
На фиг. 3 представлен ультрафиолетовый спектр белково- полипептидного комплекса, полученного по примеру 2. Согласно данной фигуре в области длин волн от 200 до 500 нм отмечается максимум поглощения при длине волны ~(215±5) нм.
На фиг. 4 представлен денатурирующий электрофорез белково- полипептидного комплекса полученного по примеру 2. (2), в 5%-ном полиакриламидном геле при окрашивании реактивом Кумасси бриллиантовым голубым в сравнении со стандартным набором маркерных белков (1) с диапазоном молекулярных масс от 10 до 250кДа.
Изобретение позволяет создать биологически активную субстанцию, с расширенными свойствами и высокой биологической активностью, обладающую тканеспецифическим репаративно-регенеративным и омолаживающим действием на кожную ткань и разработать способ ее получения путем выделения биологически активного белково- полипептидно комплекса из нервной и кожной ткани эмбрионов копытных сельскохозяйственных животных, которая решается за счет выбранной совокупности действий и режимов. Особенно важным оказалось определение оптимальных сроков гестации эмбриональной кожной и нервной тканей, а так же набора реагентов, их доз, режимов экстракции, буферизации для сохранения эффективных концентрационных соотношений белков, полипептидов и нуклеотидов закрепленных эволюционно и определяющих биологическую активность комплекса, обеспечивая репаративно-регенеративное тканеспецифическое и омолаживающее действие.
Промышленная применимость
Изобретение предназначено для использования в химико- фармацевтической промышленности, медицине и косметологии, касается биологически активной субстанции - белково-полипептидного комплекса, получаемого из эмбриональной нервной и кожной ткани копытных сельскохозяйственных животных, обладающей антигипоксическим, омолаживающим действием, стимулирующим физиологическую и репаративную регенерацию кожной ткани, для применения в производстве лекарственных препаратов и косметических средств при заболеваниях кожи, эстетической медицине и косметологии.
Источники информации, принятые во внимание при оформлении заявки:
1. Патент РФ NQ 2355405, МПК А61 К39/17, А61 К35/50
2. Заявка Франции Ν° 2413912
3. Патент РФ NQ 2132688 МПК А61 К35/48
4. Патент N2 RU 2289417 С1
5. патент РФ NQ 2189257, МПК А 61 L 27/00, А 01 N 1/00)
6. Патент РФ NQ 2142784 МПК А61 К7/48, А61 К35/78)
7. Патент РФ 2144815, С1(51) А61 К7/00, А61 К7/48, А61 Р17/16
8. патент US NQ 9703169
9. Заявка Франции N 2530466, МКИ А 61 К 7/48, 27.01.2084 г.
10. Патент РФ NQ 2229886 С1
11. Международная заявка WO 2009/088314 А1
12. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под общей редакцией чл.-кор.
РАМН, проф. Р. У. Хабриева.- 2 изд., перераб. и доп. -М, ОАО Издательство «Медицина» - 2005., с.131-170.
13. Методические указания по оценке мутагенных свойств фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под общей редакцией чл.-кор. РАМН, проф. Р. У. Хабриева.- 2 изд., перераб. и доп. -М, ОАО Издательство «Медицина» - 2005., с.100- 122.
14. Методические указания по оценке канцерогенности свойств фармакологических
средств и вспомогательных веществ в краткосрочных тестах.// Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под общей редакцией чл.-кор. РАМН, проф. Р.У. Хабриева.- 2 изд., перераб. и доп. -М, ОАО Издательство «Медицина» - 2005., с.131-170.
15. Программа по уходу и содержанию лабораторных животных НПП «Питомник лабораторных животных» ФИБХ РАН от ноября 2005 г.

Claims

Формула изобретения
Белково-полипептидный комплекс (ВПК), обладающий тканеспецифическим репаративным и омолаживающим действием на кожную ткань, получаемый из экстрагированного гомогената нервной и кожной тканей эмбрионов копытных сельскохозяйственных животных сроком гестации от середины первой, до середины последней трети беременности, включающий отрицательно заряженные слабо кислые, нейтральные белки и полипептиды с молекулярной массой от 5 до 200 кДа, причем не менее 70% от общей массы белка имеет молекулярную массу в диапазоне от 20 до 160 кДа, характеризующийся максимумом поглощения ультрафиолетового спектра раствора при длине волны 215±5нм, наличием пика при длине волны 200 - 500нм в УФ-видимой области спектра и наличием специфических полос при денатурирующем гель-электрофорезе («SDS-Раде») в 5%-ном полиакриламидном геле по сравнению со стандартным набором маркерных белков с диапазоном молекулярных масс от 10 кДа до 250 кДа и максимумом поглощения при длине волны 215±5 нм при снятии ультрафиолетового спектра в области длин волн от 200 до 500 нм.
Способ получения белково-полипептидного комплекса, обладающего тканеспецифическим репаративным и омолаживающим действием на кожную ткань, заключающийся в том, что нервную и кожную ткани эмбрионов копытных сельскохозяйственных животных сроком гестации от середины первой трети, до середины последней трети беременности поэтапно:
- гомогенизируют в буферном растворе, с одновременной экстракцией в присутствии неионных детергентов при рН не менее 5,2 и не выше 8,5 с последующим центрифугированием при значении g интервале 10 000 - 28 000 в течение 90 - 30 мин.; - полученный супернатант фильтруют;
- фильтрат подвергают анионообменной хроматографии на колонке с анионообменным носителем и разделяя связавшиеся с носителем белки и полипептиды, используя в качестве подвижной фазы буферный раствор, первоначально имеющий ионную силу (I) не выше 0, 1 ммоль/л, повышая ее плавно или ступенчато с шагом 0,025 ммоль/л и начиная сбор целевых фракций с ионной силой элюента от 0,125 до 0, 15 ммоль/л при рН от 5,
2 до 8,5;
- полученные фракции объединяют и подвергают стерилизующей фильтрации.
3. Фармацевтическая композиция на основе ВПК, обладающая антигипоксическим, иммуномодулирующим, тканеспецифическим репаративным действием на кожную ткань и слизистые оболочки, с омолаживающим эффектом, выполненная в виде раствора, содержащего в качестве активного инградиента биологически активный белково-полипептидный комплекс по п.1 в концентрации 0,05 - 2,0 мг/мл, полученный способом по п. 2 и фармацевтически приемлемый разбавитель.
4. Фармацевтическая композиция по п.З, отличающаяся тем, что в качестве, фармацевтически приемлемого разбавителя содержит фармакопейный буферный раствор и, возможно, вспомогательные вещества, включающие высокомолекулярные соединения, стабилизаторы, консерванты и солюбилизаторы.
5. Фармацевтическая композиция по п.З, отличающаяся тем, что она предназначена для применения парентерально - внутрикожно или подкожно, интраназально или апликационно на слизистые оболочки и кожу.
зо
PCT/RU2012/000140 2011-05-30 2012-02-28 Белково-полипептидный комплекс специфического действия на кожную ткань, способ его получения и фармкомпозиция на его основе WO2012166005A1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP12793726.6A EP2730586B1 (en) 2011-05-30 2012-02-28 Protein-polypeptide complex obtained from tissues of hoofed livestock embryos, process for preparing same and pharmaceutical composition

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2011121685/10A RU2460736C1 (ru) 2011-05-30 2011-05-30 Белково-полипептидный комплекс (бпк), обладающий тканеспецифическим репаративным и омолаживающим действием на кожную ткань, способ получения белково-полипептидного комплекса, обладающего тканеспецифическим репаративным и омолаживающим действием на кожную ткань, и фармацевтическая композиция на основе бпк, обладающая антигипоксическим, иммуномодулирующим, тканеспецифическим репаративным действием на кожную ткань и слизистые оболочки, с омолаживающим эффектом
RU2011121685 2011-05-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012166005A1 true WO2012166005A1 (ru) 2012-12-06

Family

ID=46938905

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2012/000140 WO2012166005A1 (ru) 2011-05-30 2012-02-28 Белково-полипептидный комплекс специфического действия на кожную ткань, способ его получения и фармкомпозиция на его основе

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP2730586B1 (ru)
RU (1) RU2460736C1 (ru)
WO (1) WO2012166005A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113603762A (zh) * 2021-08-20 2021-11-05 吉林农业大学 一种花马杂交鹿鹿角盘活性肽及其制备方法和应用

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2577135C2 (ru) * 2014-07-01 2016-03-10 Диамондзлите Лимитед Способ лечения пациентов с онкологическими заболеваниями кожи при развитии неопластических процессов кожной ткани, таких как меланома, базально-клеточный, плоскоклеточный рак (варианты)
RU2586286C2 (ru) * 2014-10-16 2016-06-10 ДИАМОНДЗЛИТЕ ЛИМИТЕД Тридент Чамберс Применение для лечения и профилактики атеросклероза белково-пептидного комплекса (далее-бпк), полученного из эмбриональной нервной ткани или из быстрозамороженного эмбрионального мозга сельскохозяйственных копытных животных, влияющего на обратный транспорт холестерина из сосудистой стенки и профиль активации моноцитов у пациентов с выраженным атеросклерозом магистральных сосудов или с предрасположенностью к сердечно-сосудистым заболеваниям и способ профилактики и лечения пациентов с атеросклерозом артериальных сосудов и с заболеваниями, вызванными атеросклерозом магистральных и периферических сосудов головного мозга, сердца, сосудов нижних конечностей и аорты (два варианта)
RU2619208C2 (ru) * 2015-10-08 2017-05-12 ДИАМОНДЗЛИТЕ ЛИМИТЕД Тридент Чамберс Способ профилактического лечения при развитии неопластических процессов кожной ткани, таких как меланома, базально-клеточный рак, плоскоклеточный рак

Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2413912A1 (fr) 1978-01-10 1979-08-03 Bontemps Raymond Medicaments a base de substances d'origine foetale et leur procede preparation
FR2530466A1 (fr) 1982-07-21 1984-01-27 Hecmati Michel Gel anti-ride, produit et procede
RU2132688C1 (ru) 1996-07-25 1999-07-10 Дмитрий Бориславович Шорох Способ изготовления биологически активных препаратов из эмбриональных тканей
RU2142785C1 (ru) * 1997-04-03 1999-12-20 Закрытое акционерное общество Научно-производственный центр "Сибирская природная косметика" Косметическое средство для ухода за кожей "гармония-n" или "гармония-r"
RU2142784C1 (ru) 1997-04-03 1999-12-20 Закрытое акционерное общество Научно-производственный центр "Сибирская природная косметика" Косметическое средство для ухода за кожей "гармония"
RU2144815C1 (ru) 1996-12-24 2000-01-27 Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственный центр "Сибирская природная косметика" Способ получения регенерирующего косметического крема для ухода за кожей
EA200000634A1 (ru) * 2000-04-28 2001-10-22 Научно-Производственное Республиканское Унитарное Предприятие "Диалек" Способ получения лекарственного средства из ткани мозга эмбрионов животного и фармакологическая композиция на его основе
RU2189257C1 (ru) 2001-10-10 2002-09-20 Хуснутдинов Анис Хатыпович Биоматериал аллоплант для регенеративной хирургии
RU2229886C1 (ru) 2002-11-13 2004-06-10 Открытое Акционерное Общество "Фаберлик" Средство, нормализующее обмен веществ в тканях кожи
RU2289417C1 (ru) 2005-04-15 2006-12-20 Равиль Шамилевич Мирхайдаров Способ биологического омоложения кожи
RU2355405C2 (ru) 2007-05-17 2009-05-20 Михаил Аркадьевич Шурдов Пептидный экстракт плаценты и способ его изготовления
WO2009088314A1 (ru) 2007-12-29 2009-07-16 Zakritoe Aktcionernoe Obschestvo "Pharm-Sintez" Способ получения биологически активного комплекса, обладающего нейрорегенеративным и нейропротекторным действием
WO2010007620A1 (en) * 2008-07-13 2010-01-21 Delapharm Ltd. Pharmaceutical composition comprising porcine brain extract
US9703169B2 (en) 2013-01-31 2017-07-11 Sumitomo Osaka Cement Co., Ltd. Optical modulator

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060058238A1 (en) * 2004-09-15 2006-03-16 Lee Laurent-Applegate Fetal skin cell protein compositions for the treatment of skin conditions, disorders or diseases and methods of making and using the same

Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2413912A1 (fr) 1978-01-10 1979-08-03 Bontemps Raymond Medicaments a base de substances d'origine foetale et leur procede preparation
FR2530466A1 (fr) 1982-07-21 1984-01-27 Hecmati Michel Gel anti-ride, produit et procede
RU2132688C1 (ru) 1996-07-25 1999-07-10 Дмитрий Бориславович Шорох Способ изготовления биологически активных препаратов из эмбриональных тканей
RU2144815C1 (ru) 1996-12-24 2000-01-27 Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственный центр "Сибирская природная косметика" Способ получения регенерирующего косметического крема для ухода за кожей
RU2142785C1 (ru) * 1997-04-03 1999-12-20 Закрытое акционерное общество Научно-производственный центр "Сибирская природная косметика" Косметическое средство для ухода за кожей "гармония-n" или "гармония-r"
RU2142784C1 (ru) 1997-04-03 1999-12-20 Закрытое акционерное общество Научно-производственный центр "Сибирская природная косметика" Косметическое средство для ухода за кожей "гармония"
EA200000634A1 (ru) * 2000-04-28 2001-10-22 Научно-Производственное Республиканское Унитарное Предприятие "Диалек" Способ получения лекарственного средства из ткани мозга эмбрионов животного и фармакологическая композиция на его основе
RU2189257C1 (ru) 2001-10-10 2002-09-20 Хуснутдинов Анис Хатыпович Биоматериал аллоплант для регенеративной хирургии
RU2229886C1 (ru) 2002-11-13 2004-06-10 Открытое Акционерное Общество "Фаберлик" Средство, нормализующее обмен веществ в тканях кожи
RU2289417C1 (ru) 2005-04-15 2006-12-20 Равиль Шамилевич Мирхайдаров Способ биологического омоложения кожи
RU2355405C2 (ru) 2007-05-17 2009-05-20 Михаил Аркадьевич Шурдов Пептидный экстракт плаценты и способ его изготовления
WO2009088314A1 (ru) 2007-12-29 2009-07-16 Zakritoe Aktcionernoe Obschestvo "Pharm-Sintez" Способ получения биологически активного комплекса, обладающего нейрорегенеративным и нейропротекторным действием
WO2010007620A1 (en) * 2008-07-13 2010-01-21 Delapharm Ltd. Pharmaceutical composition comprising porcine brain extract
US9703169B2 (en) 2013-01-31 2017-07-11 Sumitomo Osaka Cement Co., Ltd. Optical modulator

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A PROGRAM FOR CARE AND MANAGEMENT OF LABORATORY ANIMALS OF THE NURSERY FOR LABORATORY ANIMALS OF THE INSTITUTE OF BIOORGANIC CHEMISTRY OF THE RUSSIAN ACADEMY OF SCIENCES, November 2005 (2005-11-01)
R.U.KHABRIYEV: "M., OAO Izdatelstvo Meditsyna - 2nd edition,", 2005, pages: 131 - 170
R.U.KHABRIYEV: "M., OAO Izdatelstvo Meditsyna - 2nd edition,", pages: 100 - 122

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113603762A (zh) * 2021-08-20 2021-11-05 吉林农业大学 一种花马杂交鹿鹿角盘活性肽及其制备方法和应用
CN113603762B (zh) * 2021-08-20 2023-06-27 吉林农业大学 一种花马杂交鹿鹿角盘活性肽及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP2730586A1 (en) 2014-05-14
RU2460736C1 (ru) 2012-09-10
EP2730586B1 (en) 2018-04-11
EP2730586A4 (en) 2014-12-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TW201343195A (zh) 以非人類幹細胞之培養上清液為起始材料之化妝品或皮膚再生促進劑、及蛋白質之離子導入法
RU2485133C2 (ru) Белково-полипептидный комплекс, обладающий тканеспецифическим регенеративно-репаративным и омолаживающим действием на кожную ткань, способ его получения и фармацевтическая композиция на его основе
EP2589390B1 (en) Pharmaceutical composition for treating central and peripheral nervous system diseases of vascular, traumatic, toxic, hypoxic and autoimmune origin
RU2460736C1 (ru) Белково-полипептидный комплекс (бпк), обладающий тканеспецифическим репаративным и омолаживающим действием на кожную ткань, способ получения белково-полипептидного комплекса, обладающего тканеспецифическим репаративным и омолаживающим действием на кожную ткань, и фармацевтическая композиция на основе бпк, обладающая антигипоксическим, иммуномодулирующим, тканеспецифическим репаративным действием на кожную ткань и слизистые оболочки, с омолаживающим эффектом
CN109265531A (zh) 鸡胸软骨肽及其制备方法和应用
ES2671246T3 (es) Procedimiento de producción de un complejo biológicamente activo. Complejo proteico-polipeptídico biológicamente activo
WO2009088314A1 (ru) Способ получения биологически активного комплекса, обладающего нейрорегенеративным и нейропротекторным действием
Li et al. Serum-derived exosomes accelerate scald wound healing in mice by optimizing cellular functions and promoting Akt phosphorylation
JPS62236499A (ja) 生物学的に活性なポリペプチド、それらの製造方法ならびにそれらを含有する組成物
RU2477637C2 (ru) Способ лечения острого нарушения мозгового кровообращения ишемического и геморрагического характера
RU2275924C2 (ru) Способ получения комплекса биологически активных полипептидов для нормализации функций головного мозга и фармацевтическое средство на его основе
RU2485132C2 (ru) Белково-полипептидный комплекс, обладающий антигипоксическим, тканеспецифическим репаративным действием на центральную и периферическую нервную систему, способ его получения и фармацевтическая композиция на его основе
US11324780B2 (en) Amniotic fluid composition and method of using
JPH0450293B2 (ru)
RU2700081C1 (ru) Препарат &#34;беркана&#34; для профилактики и лечения эндометрита у коров и способ его получения
RU2771678C1 (ru) Биологически активная субстанция и фармацевтическая композиция в виде стерильной водной дисперсии для конъюнктивального в виде капель и субъюнктивального, пара-, ретробульбарного инъекционного введения при проведении терапии сосудистых и дисметаболических офтальмологических заболеваний
JP2533376B2 (ja) 皮膚化粧料
UA63015C2 (en) Composition for stimulating synthesis of melanic pigment, method for its production and method for treating vitiligo
RU2807113C1 (ru) Косметическая композиция, способствующая активации восстановительных и регенеративных процессов в коже различных типов и в ее производных &#34; волосах и ногтях
AT392003B (de) Verfahren zur herstellung eines insbesondere zur wundheilung oder zur behandlung in der geriatrie verwendbaren wirkstoffes aus saeugetierblut durch papainhydrolyse und ein einen solchen wirkstoff enthaltendes praeparat
RU2803093C2 (ru) Средство для коррекции возрастных изменений кожи
RU2133615C1 (ru) Средство для лечения неврологических заболеваний
Perveen et al. Evaluation of therapeutic efficacy of aloe
CN117547499A (zh) 胚胎提取物的制备方法、胚胎提取物及应用
KR20220154477A (ko) 피부 세포로부터 얻은 엑소좀을 포함하는 것을 특징으로하는 화장품 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12793726

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2012793726

Country of ref document: EP