WO2012008809A2 - Ｌ-오르니틴 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 ｌ-오르니틴 생산방법 - Google Patents

Ｌ-오르니틴 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 ｌ-오르니틴 생산방법 Download PDF

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    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases

Definitions

  • the present invention relates to L-ornithine producing microorganisms in which gluconate kinase (GntK) activity is attenuated compared to endogenous activity.
  • the present invention also relates to a method for producing L-ornithine comprising culturing the L-ornithine producing microorganism to obtain a culture and recovering L-ornithine from the culture or microorganism.
  • Ornithine is one of the amino acids present on the urea cycle in vivo. High levels of ammonia in the blood cause liver damage. Ornithine and citrulline combine with ammonia in the blood to form citrulline and arginine, respectively, to reduce the level of ammonia in the blood. L-ornithine has a detoxifying function against ammonia, such as citrulline and proline, and is used not only as a therapeutic agent for liver disease but also as a food material for preventing obesity. have.
  • Corynebacterium strain in particular Corynebacterium glutamicum ( Corynebacterium glutamicum ) is a Gram-positive microorganism that is widely used for L-amino acid production.
  • Corynebacterium strain is important, many attempts have been made to improve the production method thereof.
  • microorganisms used for the production of ornithine include micrococcus glutamicus , which is a citrulline or arginine nutritionally demanding mutant strain by ultraviolet light treatment, etc., Kyowahako Kogyo Co., Japan, US Patent No. 2,988,489.
  • Brevibacterium lactofermentum (Brevibacterium lactofermentum), Brevibacterium Kawasaki (. B kawasaki), Brevibacterium Plastic boom (B flavum;. Ajinomoto, Japan Patent Publication No. 68-8712, No. 68-8714 .) and (No. 69-26910), Brevibacterium keto glutamicum (B ketoglutamicum), bakteo para pinewooseu by AAS (Arthrobacter paraffineus), Corynebacterium hydrocarbyl carbonyl class tooth (Corynebacterium hydrocarboclastus; T Waha twisted industry ( Note), Japan, US Patent No. 3,574,061) and the like are known.
  • bakteo sheet Reus to the Ars-arginine and citrulline auxotrophy strain A citreus.
  • Brevibacterium lactofermentum B Lactofermentum.
  • Corynebacterium glutamicum C glutamicum;
  • Ajinomoto European Patent No. 0393708
  • US Patent No. 3,574,061 discloses a method for producing L-ornithine by culturing the nutritionally demanding mutant Brevibacterium ketoglutacum ATCC 21092 in a medium containing hydrocarbons, for example, paraffin as the main carbon source.
  • L-ornithine is biosynthesized from L-glutamic acid via cyclic pathway in Corynebacterium glutamicum (Cunin et al., Microbiol Rev 50: 314-352, 1986), and during the biosynthesis process
  • the third step is catalyzed by NADPH dependent reductase encoded by the argC gene.
  • a direct link between the regeneration of NADPH and the biosynthesis of certain metabolites was revealed through the biosynthesis of L-lysine in Corynebacterium glutamicum (Wittmann and Heinzle, Microbiol 68: 5843-5849, 2002; Marx et al.
  • NADPH is an enzyme that catalyzes the pentose phosphate pathway during the production of lysine in Corynebacterium glutamicum (glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) and 6- It is mainly produced during oxidation by 6-phosphogluconate dehydrogenase (6PGD) (Marx et al., J Biotechnol 104: 185-197, 2003; Wittmann and Heinzle, Microbiol 68: 5843-5849 , 2002).
  • G6PDH Corynebacterium glutamicum
  • 6- It is mainly produced during oxidation by 6-phosphogluconate dehydrogenase (6PGD) (Marx et al., J Biotechnol 104: 185-197, 2003; Wittmann and Heinzle, Microbiol 68: 5843-5849 , 2002).
  • the inventors have made diligent efforts to find a method for obtaining L-ornithine with high efficiency and high yield.
  • the present inventors have genetically modified the metabolic activity of the oxidative pentane phosphorylation pathway to produce NADPH production through the pentane phosphorylation pathway.
  • the L-ornithine production could be increased, thereby completing the present invention.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing L-ornithine comprising culturing the microorganism to obtain a culture, and recovering L-ornithine from the culture or microorganism.
  • the present invention is capable of producing L-ornithine with high yield and high efficiency as the gluconate kinase activity provides L-ornithine producing microorganisms inferior to the intrinsic activity, and thus the L-ornithine is produced in medicine and pharmaceuticals. It can be usefully used in industry, food industry, feed industry and chemical industry.
  • 1 is a schematic diagram of the metabolism of the pentose phosphorylation pathway of Corynebacterium glutamicum.
  • FIG. 2 is a diagram showing a cleavage map of the marker-free deletion vector pSJ1034 of the NCgl2399 gene in the Corynebacterium chromosome.
  • FIG. 3 is a diagram showing a cleavage map of the marker-free deletion vector pSJ1035 of the NCgl2905 gene in the Corynebacterium chromosome.
  • the present invention provides an L-ornithine producing microorganism in which the gluconate kinase (GntK) activity is weakened compared to the intrinsic activity.
  • L-ornithine is a basic amino acid present in the urea circuit of a higher animal, and serves to protect the liver by converting ammonia, which is highly toxic to the liver, into a non-toxic urea and releasing it with urine. Refers to amino acids. L-ornithine increases muscle synthesis by secreting growth hormone, promotes basal metabolism, and is widely used as a food material for preventing obesity. Recently, it has been found that there are new functions such as skin beauty action such as wrinkle improvement.
  • L-ornithine is in the form of L-ornithine alpha ketoglutarate (OKG: L-ornithine and alpha ketoglutaric acid in a 2: 1 ratio) for muscle enhancement, prevention of obesity and immunity. It is widely used as a material. L-ornithine is used as a medicine for improving liver disorders in Europe, in the form of L-ornithine salt in Japan, and as a food supplement in the United States.
  • glucose kinase As used herein, the term “gluconate kinase (GntK)” refers to an enzyme involved in the GntK pathway for biosynthesis of 6-phosphogluconic acid, which is an intermediate of the oxidation process of the pentose phosphorylation pathway of microorganisms.
  • GntK glycose kinase
  • Microorganisms of Corynebacterium have two metabolic pathways, 6 G6PDH pathway and GntK pathway, for the biosynthesis of 6-phosphogluconic acid, an intermediate of the oxidation of the pentose phosphorylation pathway (Fig. 1). It means that it can metabolize at least part of glucose.
  • the present inventors further block the carbon flow to 6-phosphogluconic acid through the blocking of the GntK pathway, and thus more carbon flow proceeds through oxidation of the pentose phosphorylation pathway, resulting in 6-phosphogluconate dehydrogena. It was predicted that NADPH regeneration was increased due to the specific increase in the activity of (6PGD), and as a result, a mechanism for increasing the production of L-ornithine was proposed. Thus, it was intended to weaken the activity of enzymes that are believed to have gluconate kinase (GntK) activity in microorganisms.
  • GntK gluconate kinase
  • the enzyme having gluconate kinase (GntK) activity in the present invention may be NCgl2399 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or NCgl2905 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • intrinsic activity refers to an active state of an enzyme possessed by a microorganism in a natural state, and in the present invention, refers to an active state of GntK naturally possessed by a microorganism.
  • "impairment of intrinsic activity” can be achieved by mutation, by deletion, substitution or insertion of all or part of the nucleotide sequence of a gene on a chromosome encoding a protein having gluconate kinase activity.
  • the gluconate kinase activity can be made by mutating by deletion, substitution or insertion of all or part of the expression control sequence of the gene on the chromosome encoding the protein.
  • the expression control sequence may be located above or below the chromosome, and may be a promoter, an enhancer, or the like.
  • GntK activity is weakened compared to the intrinsic activity means that GntK is not normally acted by the deletion or mutation of the gene on the chromosome encoding GntK, so that the GntK activity in which the microorganism has a natural state is weakened. do.
  • GntK activity is destroyed to improve L- ornithine production capacity.
  • the gene encoding NCgl2399 or NCgl2905, or all of the genes are mutated by deletion, substitution or insertion, or its expression control sequence is mutated by deletion, substitution or insertion, so that GntK does not function normally and thus is in a natural state.
  • GntK activity means a weakened state.
  • microorganisms with reduced GntK endogenous activity can be prepared by introducing a recombinant vector comprising a part of a gene encoding a gluconate kinase into a microorganism and deleting or mutating the endogenous gluconate kinase gene. Insertion of the gene into the chromosome can be by any method known in the art, for example homologous recombination.
  • the term "recombinant vector” refers to a vector that cannot be replicated separately from a chromosome of a host cell, and that the gene construct comprises an essential component capable of homologous recombination with a specific gene on the chromosome of the host cell.
  • it may include a selection gene such as an antibiotic resistance gene and levansucrase (levansucrase, sacB) gene.
  • a recombinant vector represented by the cleavage map of FIG. 2 or 3 may be used.
  • any microorganism capable of producing L-ornithine may be used without limitation, and preferably, a microorganism of the genus Corynebacterium or Brevibacterium may be used.
  • Corynebacterium hydrocarbyl carbonyl class tooth Corynebacterium hydrocarboclastus
  • Corynebacterium glutamicum C.
  • Corynebacterium glutamicum ATCC13032 Corynebacterium thermoaminogenes amino to Ness (thermoaminogenes) FERM BP-1539, Brevibacterium flavum ATCC 14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, and L-amino acid producing mutants or strains prepared therefrom such as Corey Nebacterium glutamicum KFCC10881, Corynebacterium glutamicum KFCC11001, Corynebacterium glutamicum KCCM10770P, and preferably, Corynebacterium glutamicum SJC8039 ( C. glutamicum ATCC13032, argF ⁇ , argR ⁇ ).
  • Corynebacterium glutamicum SJC8039 C. glutamicum ATCC13032, argF ⁇ , argR ⁇
  • Corynebacterium glutamicum SJC8039 C. glutamicum ATCC13032, argF ⁇ , argR ⁇
  • gene deletion was performed by using a pK18mobsacB vector that does not replicate in Corynebacterium glutamicum but has the function of performing marker-free deletion of the target gene. That is, a recombinant vector is prepared to include a portion of a gene encoding NCgl2399 or NCgl2905 in the pK18mobsacB vector and an antibiotic marker and a Levansucrease gene ( SacB ), and then the recombinant vector is transferred to a microorganism by any method known in the art. By transformation and homologous recombination in chromosomes, Corynebacterium microorganisms for L-ornithine production with reduced GntK activity were produced.
  • a pK18mobsacB derivative including a part of the gene encoding NCgl2399 in the pK18mobsacB vector was prepared and named pSJ1034, and transformed to produce a recombinant strain in which the gene encoding NCgl2399 was destroyed, which was named SJC8245.
  • a pK18mobsacB derivative including a part of the gene encoding NCgl2905 in the pK18mobsacB vector was prepared and named as pSJ1035, which was transformed into the SJC8245 strain to prepare a recombinant strain in which the gene encoding NCgl2905 was further destroyed. Named SJC8399.
  • culture of SJC8245 a Corynebacterium glutamicum strain lacking the NCgl2399 gene, resulted in a 41% specific activity of GntK and a 23.5% increase in NADPH concentration. -The production of ornithine was found to increase by 24.8%.
  • a Corynebacterium glutamicum strain that additionally destroyed the NCgl2905 gene which is assumed to be another gene of the enzyme having gluconate kinase activity in the SJC8245 strain, the activity of the GntK pathway compared to SJC8245.
  • the microorganism of the present invention attenuates the activity of GntK, thereby increasing the activity of the pentose phosphorylation pathway by specifically increasing the activity of 6PGD, and significantly increased the concentration of NADPH in the cells (Table 4). ). Since the biosynthetic pathway of L-ornithine in the microorganism of the genus Corynebacterium is catalyzed by NADPH dependent reductase, it was found that the microorganism of the present invention increased L-ornithine production.
  • the activity of known enzymes related to the biosynthesis of L-ornithine can be further controlled.
  • the present invention may further increase the L-ornithine production by overexpressing the argCJBD gene by regulating argCJBD operon activity (Hwang et al., J Microbiol Biotechnol 18: 704-710, 2008).
  • the present invention provides a method for obtaining L-ornithine, comprising the steps of: 1) culturing a microorganism according to the present invention, and 2) recovering L-ornithine from the culture or microorganism. It provides a production method of
  • culture in the present invention means to grow microorganisms under environmental conditions that are appropriately artificially controlled.
  • the method of culturing L-ornithine using Corynebacteria may be performed using a method well known in the art. Specifically, the culture may be continuously cultured in a batch process, an injection batch or a repeated fed batch process, but is not limited thereto.
  • the medium used for cultivation must meet the requirements of the particular strain in an appropriate manner.
  • Culture media for Corynebacteria strains are known (eg, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology.Washington D.C., USA, 1981).
  • Sugar sources that can be used include sugars and carbohydrates such as glucose, saccharose, lactose, fructose, maltose, starch, cellulose, oils and fats such as soybean oil, sunflower oil, castor oil, coconut oil, palmitic acid, stearic acid Fatty acids such as linoleic acid, alcohols such as glycerol, ethanol, and organic acids such as acetic acid. These materials can be used individually or as a mixture.
  • Nitrogen sources that can be used include peptone, yeast extract, gravy, malt extract, corn steep liquor, soybean wheat and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate. Nitrogen sources can also be used individually or as a mixture. Personnel that may be used include potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts.
  • the culture medium should contain metal salts such as magnesium sulfate or iron sulfate required for growth.
  • essential growth substances such as amino acids and vitamins can be used.
  • suitable precursors to the culture medium may be used. The above-mentioned raw materials may be added batchwise or continuously in a manner appropriate to the culture during the culturing process.
  • Basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or acid compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid can be used in an appropriate manner to adjust the pH of the culture.
  • antifoaming agents such as fatty acid polyglycol esters can be used to inhibit bubble generation.
  • the temperature of the culture is usually 20 ° C to 45 ° C, preferably 25 ° C to 40 ° C. Incubation is continued until the maximum amount of L-ornithine production is obtained. For this purpose it is usually achieved in 10 to 160 hours.
  • L-ornithine may be excreted in culture medium or contained in cells.
  • the method for producing L-ornithine of the present invention includes recovering ornithine from cells or culture medium. Methods of recovering L-ornithine from cells or culture media are well known in the art. Filtration, anion exchange chromatography, crystallization and HPLC may be used for the L-ornithine recovery method, but is not limited to these examples.
  • the parent strain Corynebacterium glutamicum SJC8039 ( C. glutamicum ATCC13032, argF ⁇ , argR ⁇ ; Hwang et al., J Microbiol Biotechnol 18: 704-710, 2008) was used. Primers were prepared to prepare recombinant strains SJC8399 and SJC8245 of the present invention from the parent strain.
  • 2905R2 was produced (Table 1). Underlined sequences indicate restriction positions for restriction enzymes as shown in parentheses, and uppercase letters indicate sequences of microbial genes.
  • PK18mobsacB vector (Schafer et al.) With the ability to perform marker-free deletion of the target gene without replication in Corynebacterium glutamicum for site specific gene disruption al., Gene 145: 69-73, 1994), in which the open reading frames of NCgl2399 and NCgl2905 were internally deleted to create gene-disrupted mutant strains.
  • pK18mobsacB derivatives were made.
  • the pK18mobsacB derivatives were named pSJ1034 and pSJ1035, respectively.
  • pSJ1034 is a pK18mobsacB derivative containing the Xba I terminus of 2,267 bp NCgl2399, which includes the internal gene loss of NCgl2399.
  • the NCgl2399 internal gene loss was generated by cross-PCR using 2399F1-2399R1 primer and 2399F2-2399R2 primer pair as a template of Corynebacterium glutamicum SJC8039 genomic DNA.
  • pSJ1035 is a pK18mobsacB derivative with the Xba I terminus of 2,819 bp NCgl2905, which includes the internal gene loss of NCgl2905.
  • the NCgl2905 internal gene loss was generated by cross PCR with 2905F1-2905R1 primer pair and 2905F2-2905R2 primer pair as a template of Corynebacterium glutamicum SJC8039 genomic DNA.
  • the recombinant plasmid was transformed into wild Corynebacterium glutamicum by electroporation, and the plasmid was introduced into the chromosome by primary recombination (crossover). The plasmid was then excised from the chromosome via secondary recombination (crossing) in a solid plate medium containing 10% sucrose.
  • NCgl2905 and NCgl2399 genes were confirmed.
  • Genbank accession numbers of the open reading frame DNA sequences of NCgl2905 and NCgl2399 are NC_003450.
  • Example 2 Culture of Corynebacterium glutamicum with deletion of NCgl2905 and / or NCgl2399 gene
  • Corynebacterium glutamicum SJC8399 both NCgl2399 and NCgl2905 inactivated strains
  • Corynebacterium SJC8245 NCgl2399 inactivated strains
  • L-ornithine producing strains were prepared using the following method for L-ornithine production. Incubated with. The seed medium was incubated for 24 hours using Recovery Glucose medium (80 g BHI, 20 g glucose, 60 g sorbitol / L).
  • the production medium was MMY medium [0.8 g KH 2 PO 4 , 10 g (NH 4 ) 2 SO 4, 1 g MgSO 4 ⁇ 7H 2 O, 1.2 g Na 2 HPO 4 , 20 mg MnSO 4 ⁇ H 2 O, 20 mg FeSO 4 7H 2 O, 10 mg, ZnSO 4 7H 2 O, 10 g yeast extract, and 60 g glucose / L, pH 7.0] were used.
  • a 100 ml baffle flask containing a seed medium was inoculated with Corynebacterium glutamicum parent strain SJC8039 and the recombinant strain Corynebacterium glutamicum SJC8399 and Corynebacterium glutamicum SJC8245, respectively, and incubated with shaking ( 200 rpm).
  • the glutamicum cultured in the seed medium was separated and harvested, and then resuspended in a 100 ml baffle flask containing 10 ml of the production medium until the absorbance was 0.4-0.5 at 600 nm.
  • kanamycin was added to a final concentration of 50 ⁇ g / ml if necessary.
  • the culture was carried out in a 200 rpm rotary stirrer at 30 °C.
  • Corynebacterium glutamicum incubated in the production medium was harvested by centrifugation during the expontial phase and resuspended in 100 mM Tris / HCl buffer (pH 7.5). The cell wall was broken using glass beads and centrifuged to obtain cell extracts. All these treatments were performed at 4 ° C., and the supernatants were harvested for specific enzyme activity analysis. The amount of protein for enzymatic analysis was determined by the Bradford method (Bradford 1976). The activity of G6PDH and 6PGD was measured by NADPH spectroscopic formation at 340 nm (Frunzke et al., Mol Microbiol 67: 305-322, 2008).
  • Gluconate kinase (GntK) activity was determined by coupled enzymatic assay of 6PGD (Frunzke et al., Mol Microbiol 67: 305-322, 2008). Cell growth rate was determined spectroscopically at 600 nm, and L-ornithine concentration was determined by colorimetric method with ninhydrin (Chinard et al., J Biol Chem 199: 91-95, 1952). Dry cell mass was measured based on the absorbance value 1 at 600 nm corresponds to 0.3 g dry weight per 1 L. The concentration of NADPH was determined by an enzymatic cycling reaction using the EnzyChrom TM NADP + / NADPH Assay Kit (BioAssay Systems, CA, USA).
  • Tables 2 and 3 show the growth rate of Corynebacterium glutamicum and the accumulation concentrations of NADPH and L-ornithine, respectively, and Table 4 shows the specific activities of the core enzymes of the core carbon metabolism process.
  • SJC8245 strain with NCgl2399 inactivated
  • SJC8399 strains with both NCgl2399 and NCgl2905 inactivated
  • SJC8039 parent strain
  • intracellular NADPH concentration and L -The production of ornithine has increased significantly (Tables 2 and 3).
  • SJC8245 a Corynebacterium glutamicum strain lacking the gene encoding NCgl2399 of the present invention, retained about 41% of GntK specific activity (0.51 vs 0.21 U mg / protein), and in the SJC8245 strain.

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Abstract

본 발명은 글루코네이트 키나아제(GntK) 활성이 내재적 활성에 비하여 약화된 L-오르니틴 생산 미생물 및 상기 L-오르니틴 생산 미생물로부터 L-오르니틴을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 고수율, 고효율로 L-오르니틴을 생산할 수 있으며, 이와 같이 생성된 L-오르니틴은 의약 및 약학산업, 식품산업, 사료산업 및 화학산업 등에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

Ｌ-오르니틴 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 Ｌ-오르니틴 생산방법
본 발명은 글루코네이트 키나아제(GntK) 활성이 내재적 활성에 비하여 약화된 L-오르니틴 생산 미생물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 L-오르니틴 생산 미생물을 배양하여 배양물을 수득하는 단계 및 상기 배양물 또는 미생물로부터 L-오르니틴을 회수하는 단계를 포함하는 L-오르니틴의 생산방법에 관한 것이다.
오르니틴은 생체 내의 요소 회로 상에 존재하는 아미노산 중의 하나이다. 혈중의 암모니아 농도가 높으면 간 손상을 일으키는데 오르니틴과 시트룰린은 혈중의 암모니아와 결합하여 각각 시트룰린과 아르기닌이 되어 혈중의 암모니아 농도를 감소시켜준다. L-오르니틴은 시트룰린, 프롤린과 같이 암모니아에 대한 해독 기능을 갖고 있어 간장 질환의 치료제로서 사용될 뿐만 아니라, 비만을 예방하는 식품소재로서도 이용되고 있으며, 주름살 개선과 같은 피부미용에의 효과도 밝혀지고 있다.
한편, 코리네박테리움 균주(Corynebacterium), 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)은 L-아미노산 생산에 많이 이용되고 있는 그람 양성의 미생물이다. 이와 같이 코리네박테리움 균주를 이용한 L-아미노산의 제법은 중요하기 때문에 그 제조방법을 개선하기 위해 많은 시도가 행해지고 있다. 구체적으로, 오르니틴 생산에 이용되는 미생물로는 자외선 처리 등에 의한 시트룰린 또는 아르기닌 영양 요구성 돌연변이주인 마이크로코커스 글루타미쿠스(Micrococcus glutamicus; 교와하꼬공업(주), 일본, 미국등록특허 제2,988,489호), 브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 카와사키(B. kawasaki), 브레비박테리움 플라붐(B. flavum; 아지노모토, 일본공고특허 제68-8712호, 제68-8714호 및 제69-26,910호), 브레비박테리움 케토글루타미쿰(B. ketoglutamicum), 아스로박터 파라피네우스(Arthrobacter paraffineus), 코리네박테리움 히드로카보클라스투스(Corynebacterium hydrocarboclastus; 교와하꼬공업(주), 일본, 미국등록특허 제3,574,061호) 등이 알려져 있다. 또한, 아르기닌이나 시트룰린 영양 요구성 균주인 아스로박터 시트레우스(A. citreus), 브레비박테리움 락토페르멘툼(B. Lactofermentum), 또는 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum; 아지노모토(주), 유럽공개특허 제0393708호)은 마이코페놀산(mycophenolic acid) 또는 오르니티놀(ornithinol)에 저항성을 갖는 영양 요구성 돌연변이주를 선별하여 오르니틴을 생산하는데 사용한다. 미국등록특허 제3,574,061호에서는 영양 요구성 돌연변이주인 브레비박테리움 케토글루타미쿰 ATCC 21092를 탄화수소, 예를 들어, 파라핀을 주요 탄소원으로 하는 배지에서 배양하여 L-오르니틴을 제조하는 방법을 개시하고 있으나, 이 방법에 의하면 오르니틴의 생산성은 4일간의 배양에서 8.6 mg/ml로 그다지 높지 않았다. 이처럼 L-오르니틴을 생산하는 방법에 관한 연구들이 보고되고 있으나, 생산수율이 높지 않다는 문제점이 있었다. 그러나, L-오르니틴의 산업적 대량생산은 여전히 요구되고 있기 때문에 L-오르니틴의 고효율, 고수율적인 생산 방법의 개발이 절실히 요구되고 있다.
한편, L-오르니틴은 코리네박테리움 글루타미쿰에서 L-글루탐산으로부터 순환경로(cyclic pathway)를 통해 생합성 되고(Cunin et al., Microbiol Rev 50: 314-352, 1986), 상기 생합성 과정 중 세번째 단계는 argC 유전자에 의해 코딩된 NADPH 의존성 환원효소에 의해 촉매화된다. NADPH의 재생과 특정 대사체의 생합성 간의 직접적인 연관관계는 코리네박테리움 글루타미쿰에서의 L-라이신의 생합성을 통해 밝혀졌다(Wittmann and Heinzle, Microbiol 68:5843-5849, 2002; Marx et al., J Biotechnol 104:185-197, 2003; Ohnishi et al., Microbiol Lett 242:265-274, 2005). NADPH는 코리네박테리움 글루타미쿰에서 라이신을 생산하는 동안 오탄당 인산화 경로(pentose phosphate pathway)를 촉매하는 효소인 글루코오스-6-포스페이트 디하이드로게나제(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH) 및 6-포스포글루코네이트 디하이드로게나제(6-phosphogluconate dehydrogenase, 6PGD)에 의한 산화과정에서 주로 생산된다(Marx et al., J Biotechnol 104:185-197, 2003; Wittmann and Heinzle, Microbiol 68:5843-5849, 2002). 일련의 연구들은 오탄당 인산화 경로로의 탄소 흐름의 전환이, NADPH 공급이 필요한 특정 대사물질의 생합성을 증대하기 위한 대사공학적 타겟이 될 수 있다는 점을 제시하였다. (Mascarenhas et al., Appl Environ Microbiol 57:2995-2999, 1991; Sauer et al., Appl Environ Microbiol 62:3687-3696, 1996; Marx et al., J Biotechnol 104:185-197, 2003; Ohnishi et al., Microbiol Lett 242:265-274, 2005).
본 발명자들은 이전의 연구에서, 시트룰린과 프롤린 생합성 유전자가 결손되고 아르기닌 억제자(ArgR)에 의한 피드백 제어가 차단된 돌연변이 균주에서 argCJBD의 상동적 발현(homologous expression)으로 L-오르니틴의 생산량이 증가하였음을 보여주었다(Hwang et al., J Microbiol Biotechnol 18:704-710, 2008). 그러나, L-오르니틴의 생합성 경로로 최대의 카본 플럭스를 유지하기 위해서는 argCJBD의 과발현뿐만 아니라, 오탄당 인산화 경로로의 탄소 흐름의 전환에 따른 NADPH가 충분하게 공급되어야 한다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 L-오르니틴을 고효율, 고수율로 수득하기 위한 방법을 찾기 위해 예의 노력한 결과, 산화적 오탄당 인산화 경로의 대사적 활성을 유전적으로 변형시켜 오탄당 인산화 경로를 통해 NADPH 생산을 증가시킴으로써 결과적으로 L-오르니틴 생산량을 증가시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 글루코네이트 키나아제 활성이 내재적 활성에 비하여 약화된 L-오르니틴 생산 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 미생물을 배양하여 배양물을 수득하는 단계: 및 상기 배양물 또는 미생물로부터 L-오르니틴을 회수하는 단계를 포함하는 L-오르니틴의 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 글루코네이트 키나아제 활성이 내재적 활성에 비하여 약화된 L-오르니틴 생산 미생물을 제공함에 따라 고수율, 고효율로 L-오르니틴을 생산할 수 있으며, 이와 같이 생성된 L-오르니틴은 의약 및 약학산업, 식품산업, 사료산업 및 화학산업 등에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 코리네박테리움 글루타미쿰의 오탄당 인산화 경로 대사과정의 개략도이다.
도 2는 코리네박테리움 염색체 내 NCgl2399 유전자의 마커-프리 결손용 벡터 pSJ1034의 개열지도를 나타내는 도이다.
도 3은 코리네박테리움 염색체 내 NCgl2905 유전자의 마커-프리 결손용 벡터 pSJ1035의 개열지도를 나타내는 도이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 글루코네이트 키나아제(gluconate kinase; GntK) 활성이 내재적 활성에 비하여 약화된 L-오르니틴 생산 미생물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "L-오르니틴"은 고등동물의 생체 내 요소 회로 상에 존재하는 염기성 아미노산으로서, 간에 대해 독성이 강한 암모니아를 무독성의 요소로 변환, 오줌으로 배출함으로써 간을 보호하는 역할을 하는 아미노산을 말한다. L-오르니틴은 성장호르몬을 분비시킴으로써 근육합성을 증가시키고, 기초대사를 촉진시켜 비만을 예방하는 식품소재로서 많이 이용되고 있다. 최근에는 주름살 개선과 같은 피부미용 작용 등의 새로운 기능이 있는 것으로 밝혀졌다. L-오르니틴은 L-오르니틴알파케토글루타릴산염(OKG: L-오르니틴과 알파케토글루타릴산이 2:1의 비율로 함유되어 있음)의 형태로 근육증강, 비만예방 및 면역증강소재로서도 폭넓게 이용되고 있다. L-오르니틴은 유럽에서는 간장장애를 개선하는 의약품으로서 이용되고 있고, 일본에서는 L-오르니틴산염의 형태로 식품소재로서 사용되고 있으며, 미국에서는 식품보조제로서 사용되고 있다.
본 발명에서 용어, "글루코네이트 키나아제(gluconate kinase; GntK)"란 미생물의 오탄당 인산화 경로의 산화과정 중간체인 6-포스포글루콘산의 생합성을 위한 GntK 경로에 관여하는 효소를 의미한다. 코리네박테리움 속 미생물은 오탄당 인산화 경로의 산화과정의 중간체인 6-포스포글루콘산의 생합성에 있어 2가지 대사경로, 즉 G6PDH 경로 및 GntK 경로를 지니고 있으며(도 1), 이것은 GntK 경로를 통해 적어도 글루코스의 일부를 대사할 수 있다는 것을 의미한다. 이에, 본 발명자들은 상기 GntK 경로의 차단을 통하여 6-포스포글루콘산으로의 탄소흐름을 차단함으로써 오탄당 인산화 경로의 산화과정으로 더 많은 탄소흐름이 진행되어, 6-포스포글루코네이트 디하드로게나제(6PGD)의 활성이 특이적으로 증가하여 NADPH 재생량이 증가할 것으로 예측하고, 이를 통하여 결과적으로 L-오르니틴의 생산량이 증가할 수 있는 메커니즘을 제안하였다. 이에, 미생물 내에서 글루코네이트 키나아제(GntK) 활성을 갖는 것으로 추정되는 효소의 활성을 약화시키고자 하였다.
바람직하게, 본 발명에서 글루코네이트 키나아제(GntK) 활성을 갖는 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 NCgl2399 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 NCgl2905일 수 있다.
본 발명에서 용어, "내재적 활성"이란 미생물이 천연의 상태로 가지고 있는 효소의 활성 상태를 의미하는 것으로, 본 발명에서는 미생물이 천연적으로 가지고 있는 GntK의 활성 상태을 의미한다.
본 발명에서, "내재적 활성의 약화"는 글루코네이트 키나아제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자의 염기서열의 전체 또는 일부의 결실, 치환 또는 삽입에 의하여 돌연변이시킴으로써 이루어질 수 있다. 또한, 상기 글루코네이트 키나아제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자의 발현조절서열의 전체 또는 일부의 결실, 치환 또는 삽입에 의하여 돌연변이시킴으로써 이루어질 수 있다. 상기 발현조절서열은 염색체상의 상부 또는 하부에 위치할 수 있으며, 프로모터, 인핸서 등일 수 있다.
본 발명에서 "GntK 활성이 내재적 활성에 비해 약화" 되었다는 것은, GntK를 코딩하는 염색체상의 유전자의 결손 또는 돌연변이에 의해 GntK가 정상적으로 작용하지 않아 미생물이 천연의 상태로 가지고 있는 GntK 활성이 약해진 상태를 의미한다. 본 발명의 일 실시예에서는 도 2 및/또는 도 3의 개열지도를 갖는 재조합 벡터를 도입시킴으로써 GntK 활성이 파괴되어 L-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.
바람직하게는, NCgl2399 또는 NCgl2905를 암호화하는 유전자, 또는 상기 유전자 모두가 결실, 치환 또는 삽입에 의하여 돌연변이 되거나, 이의 발현조절서열이 결실, 치환 또는 삽입에 의하여 돌연변이 되어, GntK가 정상적으로 작용하지 않아 천연 상태의 GntK 활성이 약해진 상태를 의미한다.
본 발명에서는 글루코네이트 키나아제를 코딩하는 유전자의 일부를 포함하는 재조합 벡터를 미생물에 도입하여 내재적 글루코네이트 키나아제 유전자를 결손 또는 돌연변이시킴으로써 GntK 내재적 활성이 약화된 미생물을 제조할 수 있다. 상기 유전자의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면 상동 재조합에 의하여 이루어질 수 있다.
본 발명에서 용어, "재조합 벡터"란 숙주세포의 염색체와 따로 복제될 수 없는 벡터로서, 유전자 삽입물이 상기 숙주세포의 염색체상의 특정 유전자와 상동 재조합될 수 있는 필수적인 구성요소를 포함하는 유전자 작제물을 말하며, 구체적으로 항생제 내성 유전자와 레반수크라아제(levansucrase, sacB) 유전자와 같은 선발유전자를 포함할 수 있다. 바람직하게, 본 발명에서는 도 2 또는 도 3의 개열지도로 표시되는 재조합 벡터를 사용할 수 있다.
상기 재조합 벡터를 도입하는 모균주로는 L-오르니틴을 생산할 수 있는 미생물이라면 제한없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 코리네박테리움 속 또는 브레비박테리움 속 미생물을 사용할 수 있다. 예를 들면, 코리네박테리움 히드로카보클라스투스(Corynebacterium hydrocarboclastus), 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum), 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032, 코리네박테리움 써모아미노게네스(thermoaminogenes) FERM BP-1539, 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC 14067, 브레비박테리움 락토페르멘툼(lactofermentum)　 ATCC 13869, 및 이들로부터 제조된 L-아미노산 생산 돌연변이체 또는 균주, 예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881, 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC11001, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10770P가 포함될 수 있으며, 바람직하게는, 코리네박테리움 글루타미쿰 SJC8039(C. glutamicum ATCC13032, argF△, argR△)일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 코리네박테리움 글루타미쿰 SJC8039(C. glutamicum ATCC13032, argF△, argR△)가 사용되었으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적인 일 구현예에 따르면, 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제되지 않고 표적 유전자의 마커-프리 결실(marker-free deletion)을 수행하는 기능이 있는 pK18mobsacB 벡터를 이용함으로써 유전자 결실을 수행하였다. 즉, 상기 pK18mobsacB 벡터에 NCgl2399 또는 NCgl2905를 암호화하는 유전자의 일부분과 항생제 마커 및 레반수크레아제 유전자(SacB)를 포함하도록 재조합 벡터를 제작한 후, 당업계에 알려진 임의의 방법으로 상기 재조합 벡터를 미생물에 형질전환 및 염색체 내 상동 재조합시킴으로써, GntK 활성이 약화된 L-오르니틴 생산용 코리네박테리움 미생물을 제작하였다.
본 발명에서는 pK18mobsacB 벡터에서 NCgl2399를 암호화하는 유전자의 일부를 포함하는 pK18mobsacB 유도체를 제조하여 pSJ1034로 명명하였으며, 이를 형질전환시켜 NCgl2399를 암호화하는 유전자가 파괴된 재조합 균주를 제작하고, 이를 SJC8245로 명명하였다. 또한, pK18mobsacB 벡터에서 NCgl2905를 암호화하는 유전자의 일부를 포함하는 pK18mobsacB 유도체를 제조하여 pSJ1035로 명명하였으며, 이를 상기 SJC8245 균주 내에 형질전환시켜 NCgl2905를 암호화하는 유전자가 추가로 파괴된 재조합 균주를 제작하고, 이를 SJC8399로 명명하였다.
나아가, 구체적인 일 구현예에서는, NCgl2399 유전자가 결손된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주인 SJC8245를 배양한 결과, GntK의 특이적 활성이 41% 정도 남아있었고, NADPH의 농도는 23.5% 증가하였으며, L-오르니틴의 생산량은 24.8% 증가함을 확인하였다. 또한, 상기 SJC8245 균주 내에서 글루코네이트 키나아제 활성을 갖는 효소의 또 다른 유전자로 추정되는 NCgl2905 유전자를 추가적으로 파괴한 코리네박테리움 글루타미쿰 균주인 SJC8399를 배양한 결과, SJC8245에 비하여 상기 GntK 경로의 활성이 더욱 감소되는 것을 확인하였고, NADPH의 농도는 51.8% 증가하였으며, L-오르니틴의 생산량은 63.8% 증가함을 확인하였다(표 3 및 4). 이러한 결과는 본 발명의 미생물에 의해 L-오르니틴 생산량이 현저히 증가되었음을 보여주며, 과량의 NADPH가 L-오르니틴 생산량의 증가에 영향을 주는 요인임을 보여주었다.
결과적으로, 본 발명의 미생물은 GntK의 활성이 약화되고, 이에 따라 6PGD의 활성이 특이적으로 증가함으로써 오탄당 인산화 경로의 산화과정이 증대되었으며, 세포 내 NADPH의 농도가 유의적으로 증가되었다(표 4). 코리네박테리움 속 미생물에서의 L-오르니틴의 생합성 경로는 NADPH 의존성 환원효소에 의해 촉매화되므로, 결과적으로 본 발명의 미생물이 L-오르니틴 생산량을 증가시킴을 알 수 있었다.
바람직하게, 본 발명에서는 L-오르니틴 제조량을 더욱 증가시키기 위해, L-오르니틴의 생합성에 관련된 공지의 효소들의 활성을 추가로 조절할 수 있다. 바람직하게, 본 발명에서는 추가로 argCJBD 오페론 활성을 조절하여 argCJBD 유전자를 과발현시켜 L-오르니틴 생산량을 증대시킬 수 있다(Hwang et al., J Microbiol Biotechnol 18:704-710, 2008).
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 1) 본 발명에 따른 미생물을 배양하여 배양물을 수득하는 단계: 및 2) 상기 배양물 또는 미생물로부터 L-오르니틴을 회수하는 단계를 포함하는 L-오르니틴의 생산방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명에서 코리네박테리아를 이용하여 L-오르니틴을 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 배치 공정, 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 코리네박테리아 균주에 대한 배양 배지는 공지되어 있다(예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981). 사용될 수 있는 당원으로는 글루코즈, 사카로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유해야 한다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃일 있다. 배양은 L-오르니틴의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 160 시간에서 달성된다. L-오르니틴은 배양 배지 중으로 배출되거나, 세포 중에 포함되어 있을 수 있다.
본 발명의 L-오르니틴을 생산하는 방법은, 세포 또는 배양 배지로부터 오르니틴을 회수하는 단계를 포함한다. 세포 또는 배양 배지로부터 L-오르니틴을 회수하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있다. 상기 L-오르니틴 회수 방법에는, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
이하 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 부위-특이적 유전자가 결실된 변이주의 제조
본 발명에서는 모균주로 코리네박테리움 글루타미쿰 SJC8039(C. glutamicum ATCC13032, argF△, argR△; Hwang et al., J Microbiol Biotechnol 18:704-710, 2008)를 사용하였다. 상기 모균주로부터 본 발명의 재조합 균주 SJC8399와 SJC8245를 제조하기 위하여 프라이머를 제작하였다. 우선, NCgl2905 또는 NCgl2399를 암호화하는 유전자의 불활성화 단편을 제작하기 위해 NCgl2399(서열번호 1) 및 NCgl2905(서열번호 2)의 서열을 근거로 각각 프라이머 2399F1, 2399F2, 2399R1, 2399R2, 2905F1, 2905F2, 2905R1, 2905R2를 제작하였다(표 1). 밑줄 친 서열은 괄호 안에 나타낸 바와 같은 제한효소에 대한 제한위치를 나타내며, 대문자는 미생물 유전자의 서열을 의미한다.
표 1
Figure PCTKR2011005251-appb-T000001
부위-특이적 유전자 결실(site specific gene disruption)을 위하여 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제되지 않고 표적 유전자의 마커-프리 결실(marker-free deletion)을 수행하는 기능이 있는 pK18mobsacB 벡터(Schafer et al., Gene 145: 69-73, 1994)를 사용하여 수행하였으며, 유전자가 파괴된 변이주(gene-disrupted mutant strain)를 만들기 위하여 NCgl2399와 NCgl2905의 개방해독틀(open reading frame)이 내부적으로 결실된 pK18mobsacB 유도체를 만들었다. 상기 pK18mobsacB 유도체는 각각 pSJ1034와 pSJ1035로 명명하였다.
pSJ1034는 2,267 bp짜리 NCgl2399의 XbaI 말단을 포함하는 pK18mobsacB 유도체로 NCgl2399의 내부적 유전자 소실을 포함한다. 상기 NCgl2399 내부적 유전자 소실은 코리네박테리움 글루타미쿰 SJC8039 게놈 DNA를 주형으로 2399F1-2399R1 프라이머와 2399F2-2399R2 프라이머 쌍으로 교차 PCR을 하여 생성된 것이다.
pSJ1035는 2,819 bp짜리 NCgl2905의 XbaI 말단이 있는 pK18mobsacB 유도체로 NCgl2905의 내부적 유전자 소실을 포함한다. 상기 NCgl2905 내부적 유전자 소실은 코리네박테리움 글루타미쿰 SJC8039 게놈 DNA를 주형으로 2905F1-2905R1 프라이머와 2905F2-2905R2 프라이머 쌍으로 교차 PCR을 하여 생성된 것이다.
상기의 재조합 플라스미드를 야생의 코리네박테리움 글루타미쿰에 전기천공법으로 형질전환시키고, 상기 플라스미드는 1차 재조합(교차)에 의해 염색체에 도입하였다. 그 후, 10%의 수크로오스를 포함하는 고체평판배지에서 2차 재조합(교차)을 통해 염색체로부터 플라스미드를 절제(excision)하였다.
상기 2차 재조합이 완료된 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환주들을 대상으로 각 유전자 특이적 프라이머(gene-specific primer) 쌍인 2905F1-2905R2 및 2399F1-2399R2를 사용한 다이아그너스틱 PCR(diagnostic PCR)을 통해 각각 NCgl2905 및 NCgl2399 유전자의 결실을 확인하였다. 상기 NCgl2905, NCgl2399의 개방해독틀 DNA서열의 Genbank accession number는 NC_003450이다.
실시예 2: NCgl2905 및/또는 NCgl2399 유전자가 결실된 코리네박테리움 글루타미쿰의 배양
L-오르니틴 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 SJC8399(NCgl2399 및 NCgl2905 모두 불활성화된 균주) 및 코리네박테리움 SJC8245(NCgl2399가 불활성화된 균주)를 L-오르니틴 생산을 위해 아래와 같은 방법으로 배양하였다. 종배지로 Recovery Glucose 배지(80 g BHI, 20 g 글루코오스, 60 g 소르비톨/L)을 사용하여 24시간 동안 배양하였다. 생산배지는 MMY 배지[0.8 g KH2PO4, 10 g (NH4)2SO4, 1 g MgSO4ㆍ7H2O, 1.2 g Na2HPO4, 20 mg MnSO4ㆍH2O, 20 mg FeSO4ㆍ7H2O, 10 mg,ZnSO4ㆍ7H2O, 10 g yeast extract, 및 60 g 글루코오스/L, pH 7.0]를 사용하였다. 종배지를 함유하는 100 ㎖ 배플 플라스크에 코리네박테리움 글루타미쿰 모균주 SJC8039와 본 발명의 재조합 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 SJC8399 및 코리네박테리움 글루타미쿰 SJC8245를 각각 접종하고 진탕배양(200 rpm) 하였다. 종배지에서 배양된 상기 글루타미쿰을 분리하여 수확한 후 600 nm에서 흡광도가 0.4~0.5일 때까지 상기 생산배지 10 ㎖을 함유하는 100 ㎖ 배플 플라스크에서 재현탁하였다. 그 후, 10 ㎖ 당 0.2 g의 멸균된 CaCO3를 첨가하고, 필요한 경우 카나마이신(kanamycin)은 50 μg/㎖의 최종농도까지 첨가하였다. 상기의 배양은 30℃의 200 rpm 회전식 교반기에서 수행하였다.
실시예 3: 효소 활성 및 이에 따른 L-오르니틴 생산량 측정
상기 생산배지에서 배양된 코리네박테리움 글루타미쿰은 지수 성장기(exponetial phase)동안 원심분리법을 사용하여 의해 수확하였고 100 mM Tris/HCl buffer(pH 7.5)으로 재현탁하였다. 세포벽은 유리 비드(glass bead)를 사용하여 파괴하였고 세포 추출물을 얻기 위해 원심분리하였다. 이 모든 처리는 4℃에서 이루어졌으며, 상층액은 특이적 효소 활성 분석을 위하여 채취하였다. 효소분석을 위한 단백질의 양은 브래드포드법에 의해 결정하였다(Bradford 1976). G6PDH와 6PGD의 활성은 340 nm에서 NADPH 분광학적 형성을 통해 측정하였다(Frunzke et al., Mol Microbiol 67:305-322, 2008). 글루코네이트 키나아제(GntK) 활성은 6PGD의 coupled enzymatic assay으로 측정하였다(Frunzke et al., Mol Microbiol 67:305-322, 2008). 600 nm에서 분광법으로 셀 성장률을 측정하였고, L-오르니틴 농도는 닌하이드린을 사용한 비색법으로 결정하였다(Chinard et al., J Biol Chem 199: 91-95, 1952). 건조균체량은 600 nm에서의 흡광도 값 1은 1 L당 건조중량 0.3g에 해당한다는 점을 기초로하여 측정하였다. NADPH의 농도는 EnzyChromTMNADP+/NADPH 분석 키트를 사용한 enzymatic cycling reaction으로 결정하였다(BioAssay Systems, CA, USA).
표 2와 3은 각각 코리네박테리움 글루타미쿰의 성장률 및 NADPH, L-오르니틴의 축적농도를 나타내며, 표 4는 중심탄소대사과정의 핵심 효소의 특이적 활성도를 나타낸다.
표 2
Figure PCTKR2011005251-appb-T000002
표 3
Figure PCTKR2011005251-appb-T000003
표 4
Figure PCTKR2011005251-appb-T000004
표 2 및 3에서 나타난 바와　같이, SJC8245(NCgl2399가 불활성화된 균주)와 SJC8399(NCgl2399 및 NCgl2905 모두 불활성화된 균주)는 SJC8039(모균주)에 비하여 성장률은 거의 비슷하였으나, 세포 내 NADPH 농도 및 L-오르니틴의 생산량은 현격히 증가하였다(표 2 및 3). 구체적으로, 본 발명의 NCgl2399를 암호화하는 유전자가 결손된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주인 SJC8245는 GntK의 특이적 활성이 41% 정도 남아있었고(0.51 vs 0.21 U mg/protein), 상기 SJC8245 균주 내에서 역시 글루코네이트 키나아제(EC:2.7.1.12) 활성을 갖는 효소의 또 다른 유전자로 추정되는 NCgl2905를 추가적으로 파괴된 SJC8399의 경우, SJC8245에 비하여 GntK 경로의 활성이 더욱 감소하였다(0.51 vs 0.11 U mg/protein; 표 4).
NADPH의 농도에 있어서, NCgl2399의 불활성화의 경우에 NADPH의 농도가 23.5% 증가하였고, L-오르니틴의 생산량은 24.8% 증가하였다. 또한, NCgl2399 및 NCgl2905를 모두 불활성화시킨 경우에는 NADPH의 농도가 51.8% 증가하였고, L-오르니틴의 생산량은 63.8% 증가하였다(표 3). 또한, G6PDH와 6PGD의 특이적 활성을 비교하면, 표 4에서 보는 것과 같이 6PGD의 특이적 활성은 SJC8039에 비해 SJC8245 및 SJC8399 내에서 현격히 증가하였다.　 그러나, G6PDH 활성은 거의 변화가 없다는 것이 관측되었다(표 4). 상기의 값은 적어도 3개의 독립적인 배양에서 얻어진 결과를 기초로 한 평균값을 나타내며 모든 경우에 있어서 표준편차가 10% 이하였다.
상기의 결과는 글루코네이트 키나아제 활성을 내재적 활성에 비하여 약화시킴으로써 6PGD의 활성을 증가시킬 수 있으며, 6PGD의 활성 증가에 의하여 NADPH 생산을 증가시킴으로써, 결과적으로 L-오르니틴을 고효율, 고수율로 생산할 수 있음을 의미한다.

Claims (10)

  1. 글루코네이트 키나아제(gluconate kinase; GntK) 활성이 내재적 활성에 비하여 약화된, L-오르니틴 생산 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 글루코네이트 키나아제 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 글루코네이트 키나아제 중 하나 이상의 활성이 내재적 활성에 비하여 약화된 것인 미생물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 속인 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 글루코네이트 키나아제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자의 결실, 치환 또는 삽입에 의하여 상기 단백질의 내재적 활성이 약화된 것인 미생물.
  5. 제1항에 있어서, 글루코네이트 키나아제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자의 발현조절서열의 결실, 치환 또는 삽입에 의하여 돌연변이 되어 상기 단백질의 내재적 활성이 약화된 것인 미생물.
  6. 제1항에 있어서, 글루코네이트 키나아제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자의 일부를 포함하는 재조합 벡터가 도입되어 내재적 활성이 약화된 것인 미생물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 미생물은 도 2의 재조합 벡터 및 도 3의 재조합 벡터 중 하나 이상이 도입되어 글루코네이트 키나아제의 활성이 내재적 활성에 비하여 약화된 것인 미생물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 추가로 argCJBD 오페론의 활성이 증가된 것인 미생물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032를 모균주로 하는 것인 미생물.
  10. 1) 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 배양하여 배양물을 수득하는 단계: 및
    2) 상기 배양물 또는 미생물로부터 L-오르니틴을 회수하는 단계를 포함하는 L-오르니틴의 생산방법.
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