WO2010026965A1 - 新規hcvレプリコン複製細胞および全長hcv rna複製細胞、ならびにこれらの利用 - Google Patents

新規hcvレプリコン複製細胞および全長hcv rna複製細胞、ならびにこれらの利用 Download PDF

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WO2010026965A1
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加藤　宣之
正徳 池田
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    • G01N2333/186—Hepatitis C; Hepatitis NANB

Definitions

  • the present invention relates to a novel HCV replicon-replicating cell and a full-length HCV RNA-replicating cell, and uses thereof, and more specifically, a novel HCV RNA replication system using a novel HCV replicon-replicating cell and a full-length HCV RNA-replicating cell, and The present invention relates to a new HCV particle production system.
  • Hepatitis C virus (hereinafter referred to as “HCV”) is an RNA virus belonging to the Flaviviridae family that was discovered and identified in 1989 as a causative virus for non-A non-B hepatitis. Since HCV is a virus that establishes persistent infection, hepatitis caused by HCV infection (hepatitis C) shifts to chronic hepatitis at a high rate. Since then, it has been revealed that cirrhosis and eventually hepatocellular carcinoma develop in the course of more than 20 years.
  • HCV infection It is estimated that there are about 2 million people with HCV infection in Japan and about 200 million people worldwide. There are many so-called asymptomatic carriers who are not aware of being infected with HCV, as can be seen from the situation of HCV infection with fibrinogen preparations, which has become a recent social problem. Currently, there are about 35,000 victims of hepatocellular carcinoma annually in Japan, 80% of which are due to HCV infection. In addition, about 20,000 people are sacrificed annually in the previous stage of cirrhosis. Therefore, it can be said that HCV is a virus that causes serious infections.
  • the HCV replicon is an HCV gene (non-structural proteins NS3 to NS5B) excluding the gene encoding the structural protein of HCV.
  • HCV gene non-structural proteins NS3 to NS5B
  • the NS3 to NS5B region essential for HCV genome replication and the HCV subgenome consisting of both ends of the genome are replicated in the cell, and the number of copies of the HCV subgenome per cell is several thousand.
  • subgenomic HCV replicon cells derived from several different HCV strains have been established (see, for example, Non-Patent Document 2).
  • HCV replicon-replicating cells full-length HCV RNA-replicating cells, HCV particle-producing cells using JFH1 strain HCV
  • HCV particle-producing cells using JFH1 strain HCV are being used worldwide to develop specific antiviral agents against HCV. .
  • Japanese Patent Publication Japanese Patent Laid-Open No. 2006-325582 (Publication Date: December 7, 2006)”
  • HuH-7 human liver cancer cell line
  • the present invention has been made in view of the above problems, and its purpose is to provide a cell line other than the HuH-7 cell line having an ability comparable to the HCV life cycle reproduction system derived from the HuH-7 cell line.
  • the purpose is to construct an HCV life cycle reproduction system.
  • the method for producing an HCV replicon-replicating cell includes a step of introducing RNA containing an HCV replicon sequence and a selectable marker gene sequence into a Li23 cell or a healing cell derived from Li23 cell.
  • the sequence is characterized in that it includes a base sequence encoding an amino acid sequence causing an amino acid substitution of Q1112R, K1609E and S2200R, or Q1112R, P1115L and S2200R in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the method for producing a full-length HCV RNA replicating cell according to the present invention is characterized by including a step of introducing RNA containing a full-length HCV genomic sequence and a selectable marker gene sequence into a healing cell derived from Li23 cells.
  • the full-length HCV genome sequence may be a base sequence encoding an amino acid sequence causing an amino acid substitution of Q1112R, K1609E and S2200R, or Q1112R, P1115L and S2200R in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, in this case
  • the base sequence is preferably the sequence shown in SEQ ID NO: 7 or 9.
  • the full-length HCV genomic sequence may be the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 or 13.
  • the RNA preferably further includes a reporter gene sequence, and further includes an exogenous internal ribosomal entry site (IRES) sequence. It is preferable.
  • the screening method according to the present invention includes a step of incubating a cell produced by any of the above methods with a candidate factor in order to screen a substance having an anti-HCV action, and measures the level of the HCV gene product.
  • the method further includes the step of measuring the level of the reporter gene product.
  • the method for producing a healing cell according to the present invention is characterized by including a step of culturing the cell produced by the above method in a medium containing a drug having an antiviral action.
  • the method for producing infectious HCV particles according to the present invention is characterized by including a step of incubating the above-mentioned healing cells with infectious HCV RNA.
  • a cell capable of replicating an HCV replicon or a full-length HCV genome can be produced. Furthermore, if this invention is used, the cell which can accept
  • the composition of the HCV genome of the HCV-O strain (1b genotype) is shown.
  • the HCV replicon RNA (ON / 3-5B / QR, KE, SR) derived from the HCV-O strain, in which two adaptive mutations (Q1112R and K1609E) in the NS3 region and the S2200R adaptive mutation in the NS5A region were introduced Show.
  • RNA ORN / C-5B / QR, KE, SR
  • JFH1 infectious HCV RNA
  • JFH-1 strain (2a genotype) derived from a patient with fulminant hepatitis having the structure of the original HCV genome
  • JFH1 infectious HCV RNA
  • JFH-1 strain (2a genotype) derived from a patient with fulminant hepatitis having the structure of the original HCV genome is shown. It is a figure which shows the procedure which produces an HCV replicon replication cell and a full-length HCV RNA replication cell. It is a figure which shows the expression of HCV protein in a HCV replicon replication cell.
  • FIG. 3 is a graph showing the effect of IFN- ⁇ on full-length HCV RNA replication in Li23 cell-derived full-length HCV RNA replication cells. It is a figure which shows the result of the gene analysis of HCV replicating in the full length HCV RNA replication cell derived from Li23 cell. It is a figure which shows the preparation procedure and result of Li23 cell origin HCV replicon replication cell and full length HCV RNA replication cell which have a reporter gene. It is a figure which shows the result of having quantified full length HCV RNA in the cloned ORL8 cell. It is a figure which shows the result of having quantified full length HCV RNA in the cloned ORL11 cell.
  • ORF8c cells, JFH-1 strain HCV-infected RSc cells as a positive control, and Mock infection ORL8c cells as a negative control were subjected to double-stranded RNA (HCVRNARNA replication intermediate) by immunofluorescence using an anti-dsRNA antibody ( It is a figure which shows the result of having detected dsRNA). It is a figure which shows the result of having measured the secretion amount of the HCV core protein released in the culture supernatant of ORL8c cell and RSc cell which infected JFH-1 strain HCV by ELISA method.
  • HCV replicon-replicating cells The present invention provides HCV replicon-replicating cells.
  • the HCV replicon-replicating cell according to the present invention is characterized in that HCV replicon RNA having a specific adaptive mutation is introduced into a specific cell.
  • HCV replicon is used interchangeably with “subgenomic HCV replicon” and is composed of NS3 to NS5B regions of the HCV genomic sequence (“HCV replicon sequence”). Structural genes are intended.
  • HCV ORF may have a mutation, which may improve the replication efficiency of the HCV genome in the cell.
  • a mutation that provides such an effect is known as an “adaptive mutation”.
  • Many adaptive mutations are known for HCV, but it is not known what adaptive mutation is suitable for what conditions.
  • the present inventors have already completed an HCV life cycle reproduction system derived from the HuH-7 cell line (see Patent Document 1, etc.).
  • HuH-7 cell line In order to construct an HCV life cycle reproduction system derived from a cell line other than HuH-7 cell line, various cell lines other than HuH-7 cell line (for example, human hepatoma cell line, human immortalized hepatocyte cell line, human Although an attempt was made to introduce HCV replicon RNA into a bile duct cancer cell line or the like, a desired transformant could not be obtained.
  • HuH-7 cell line for example, human hepatoma cell line, human immortalized hepatocyte cell line, human
  • RNA of interest can be introduced into Li23 cells, a human hepatoma cell line, using an HCV replicon sequence having the adaptive mutation (S2200R).
  • the adaptive mutations that can be used in the present invention are a combination of “Q1112R, K1609E and S2200R” or a combination of “Q1112R, P1115L and S2200R”.
  • the present invention is successfully realized when only two types of mutations are used in these combinations, or in different combinations (eg, “P1115L, K1609E and S2200R”, “Q1112R, E1202G and S2200R”, “E1202G, K1609E and S2200R”, etc.) could not be.
  • the target RNA could not be introduced into cells other than Li23 cells.
  • the HCV replicon-replicating cell according to the present invention is a human hepatoma cell line, Li23 cell, which is a parent cell, and the HCV replicon sequence (Q1112R, K1609E and S2200R, or Q1112R) is the parent cell. , Having an adaptive mutation of P1115L and S2200R) and a RNA containing a selectable marker gene sequence.
  • the RNA introduced into the cell according to the present invention only needs to contain a selection marker gene sequence and an HCV replicon sequence.
  • a drug resistance gene is preferable from a viewpoint of simplicity.
  • the drug resistance gene is not particularly limited, and may be appropriately selected from known drug resistance genes that can be used for selection of transformed cells. Specific examples include a neomycin resistance gene (neomycin phosphotransferase gene), a puromycin resistance gene, a blasticidin resistance gene, a hygromycin resistance gene, and the like.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 5 is preferable as the HCV replicon sequence, but it may have a further mutation, and the mutation in this case is not limited to the adaptive mutation.
  • each sequence in the RNA introduced into the cell according to the present invention is not particularly limited as long as the protein encoded by the selectable marker gene product and the HCV replicon sequence can be expressed.
  • this RNA preferably contains two IRESs, an IRES for translating the selectable marker gene and an IRES for translating the HCV ORF. Thereby, the effect that the protein to be translated can be maintained at a high level is obtained.
  • Both of the two IRESs may be HCV-derived IRES, but at least one is preferably an exogenous IRES. By using exogenous IRES, the effect of maintaining the replication pattern of the HCV genome can be obtained.
  • the exogenous IRES is not particularly limited, and examples include IRES derived from encephalomyocarditis virus (EMCV), bovine viral diarrhea virus (Bovine viral diarrhea virus: BVDV), poliovirus IRES, and the like. EMCV-derived IRES is preferred because of its high activity and frequent use.
  • EMCV encephalomyocarditis virus
  • BVDV bovine viral diarrhea virus
  • poliovirus IRES poliovirus IRES
  • EMCV-derived IRES is preferred because of its high activity and frequent use.
  • an HCV IRES sequence As an example of the order of each sequence contained in RNA introduced into the cell according to the present invention, from the 5 ′ end, an HCV IRES sequence, a selectable marker gene sequence, an exogenous IRES sequence, an HCV ORF sequence, HCV 3 ′ non-
  • the order of translation sequences can be mentioned, but is not limited thereto.
  • the IRES of HCV is RNA composed of a 5 'untranslated region and a part of the 5' side of the core.
  • the 1st to 377th positions (the 1st to 341th positions are 5 ′ untranslated regions) of the base sequence of the HCV-O strain shown in SEQ ID NO: 1 are used. It is not limited to.
  • the HCV genome sequence contained in the RNA introduced into the cell according to the present invention may be any one derived from HCV.
  • HCV includes attenuated strains and mutant strains as well as pathogenic strains that can cause hepatitis C.
  • genotypes exist in HCV, they may be derived from any genotype of HCV, and about 70% of hepatitis C patients in Japan are infected with type 1b HCV. From the point of view that it is, it is preferably 1b.
  • HCV-O, N, Con-1 and JT strains are known as HCV strains with genotype 1b.
  • the present inventors have produced cells according to the present invention using genomic RNA of the HCV-O strain, but the present invention is not limited to this.
  • the base sequence of the HCV-O strain is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • a healing cell of a full-length HCV RNA-replicating cell (described later) derived from Li23 cell is a parent cell, and for such a cell line, an HCV replicon sequence RNA having Q1112R, K1609E and S2200R (or Q1112R, P1115L and S2200R adaptive mutations) and a selection marker gene sequence is introduced.
  • a cell line “derived from Li23 cells” is used interchangeably with a cell line “derived from Li23”, an HCV replicon replicating cell derived from Li23 cells or a full-length HCV RNA replicating cell, or These healing cells are contemplated.
  • the parent cell used in the present embodiment is preferably an OLc cell (see FIG. 2) described later, more preferably an OL8c cell, an OL11c cell, or an OL14c cell.
  • a “healing cell” is a cell obtained by culturing a cell that replicates a subgenomic HCV replicon or a cell that replicates a full-length HCV genome in the presence of an antiviral agent. Yes, cells in which the subgenomic HCV replicon is completely eliminated or cells in which the full-length HCV genome is completely eliminated are contemplated. “Completely eliminated” is intended to mean that no HCV RNA and / or HCV protein is expressed in the cell. Those skilled in the art can easily confirm whether HCV-derived RNA is contained in the cells by RT-PCR, Northern blotting, etc., and whether the HCV protein is expressed by Western blotting. This can be easily confirmed.
  • healing cells are shown as “sOLc”, “OLc” and “ORLc” in FIG. 2 and are referred to herein as “healing cells derived from Li23 cells”, in particular “OLc” and “ORLc”. Is also referred to as “healing cell of full-length HCV RNA replicating cells derived from Li23 cells”.
  • the drug having an antiviral action is not particularly limited as long as it can obtain healing cells by adding it to a medium, but a drug having an anti-HCV action is preferable. More preferred are IFN, cyclosporin A (CsA) and the like, and particularly preferred is IFN. Examples of IFN include IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , and IFN- ⁇ .
  • An example of a method for treating cells using IFN is a method of culturing cells in a medium containing IFN- ⁇ at a concentration of 500 IU / ml for 2 weeks. However, the treatment concentration and the treatment period may be appropriately changed while confirming whether or not desired healing cells have been obtained.
  • the present invention also provides a method for producing HCV replicon-replicating cells.
  • the production method according to the present invention comprises an RNA comprising an HCV replicon sequence (having adaptive mutations of Q1112R, K1609E and S2200R, or Q1112R, P1115L and S2200R) and a selectable marker gene sequence. And a step of introducing into Li23 cells.
  • the production method according to the present invention comprises an RNA comprising an HCV replicon sequence (having adaptive mutations of Q1112R, K1609E and S2200R, or Q1112R, P1115L and S2200R) and a selectable marker gene sequence
  • the method is characterized in that it comprises a step of introducing into a healing cell derived from Li23 cells.
  • the cells produced by the present inventors have been deposited at the Okayama University Intellectual Property Headquarters (1-1 1-1 Tsushima-naka, Okayama City), which is the depositary organization of Okayama University. It is as follows.
  • full-length HCV RNA replicating cells The present invention provides full-length HCV RNA replicating cells.
  • the full-length HCV RNA replicating cell according to the present invention is characterized in that the full-length HCV genome is introduced into a specific cell.
  • “full-length HCV genome” is intended to mean RNA containing the entire region of the HCV genome (C region to NS5B region) shown in FIG. Used interchangeably with “RNA”.
  • the RNA introduced into the full-length HCV RNA replicating cells according to the present invention may be any RNA that contains a selection marker gene sequence and a full-length HCV RNA sequence, but preferably further includes a reporter gene. Thereby, a reporter assay can be performed simply and with high sensitivity.
  • a drug resistance gene is preferable from a viewpoint of simplicity.
  • the drug resistance gene is not particularly limited, and may be appropriately selected from known drug resistance genes that can be used for selection of transformed cells. Specific examples include a neomycin resistance gene (neomycin phosphotransferase gene), a puromycin resistance gene, a blasticidin resistance gene, a hygromycin resistance gene, and the like.
  • the full-length HCV RNA sequence the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 7, 9, 11 or 13 is preferable, but it may have a further mutation, and the mutation in this case is not limited to the adaptive mutation.
  • the reporter gene contained as necessary in the RNA introduced into the full-length HCV RNA replicating cell according to the present invention is not particularly limited, and is a luciferase gene, alkaline phosphatase gene, ⁇ -lactamase gene, chloramphenicol acetyltransferase Gene, etc., and a luciferase gene is preferable.
  • a luciferase gene a firefly-derived luciferase gene or a Renilla luciferase gene is generally used, but either may be used, and the Renilla-derived luciferase gene is preferable in that the length of the gene is shorter.
  • the RNA introduced into the full-length HCV RNA replicating cell according to the present invention preferably contains two IRESs, an IRES for translating the selectable marker gene and an IRES for translating the HCV ORF.
  • the two IRESs may be HCV-derived IRES, but at least one is preferably an exogenous IRES.
  • exogenous IRES By using exogenous IRES, the effect of maintaining the replication pattern of the full-length genome can be obtained.
  • the foreign IRES is not particularly limited, and examples include IRES derived from encephalomyocarditisyovirus (EMCV), bovine viral diarrhea virus (Bovine viral diarrhea virus: BVDV), poliovirus IRES, and the like.
  • EMCV-derived IRES is preferred because of its high activity and frequent use.
  • the HCV IRES sequence As an example of the order of each sequence contained in the RNA introduced into the full-length HCV RNA replicating cell according to the present invention, from the 5 ′ end, the HCV IRES sequence, (if necessary) the reporter gene sequence, the selectable marker gene Examples include, but are not limited to, sequences, exogenous IRES sequences, HCVFORF sequences, and HCV 3 ′ untranslated sequences.
  • the full-length HCV RNA replicating cell according to the present invention has a full-length HCV genome introduced into sOLc cells.
  • sOLc cells are HCV replicon-replicating cells (sOL) produced by introducing RNA containing the HCV replicon sequence (having adaptive mutations of Q1112R, K1609E and S2200R) and a selectable marker gene sequence into Li23 cells.
  • Cell is a cell obtained by culturing in the presence of a drug having an antiviral effect (see FIG. 2).
  • the full-length HCV RNA-replicating cells according to this embodiment are OL cells shown in FIG. 2, preferably OL1 cells to OL14 cells, more preferably OL8 cells, OL11 cells, and OL14 cells.
  • the full-length HCV RNA replicating cell according to the present invention has a full-length HCV genome introduced into an OLc cell.
  • OLc cells are cells obtained by culturing OL cells in the presence of a drug having an antiviral effect (see FIG. 2).
  • RNA containing a full-length HCV genomic sequence and a selectable marker gene sequence is introduced, and the adaptive mutation of ORL cells (Q1112R, K1609E and S2200R shown in FIG.
  • ORL8-1 cells to ORL8-9 cells and ORL11-1 cells to ORL11-16 cells more preferably ORL8-9 cells (hereinafter referred to as ORL8 cells) and ORL11-5 cells ( Hereinafter referred to as ORL11 cells).
  • the full-length HCV RNA replicating cell according to the present invention has a full-length HCV genome introduced into an ORLc cell.
  • ORLc cells are cells obtained by culturing ORL cells in the presence of a drug having an antiviral effect (see FIG. 2).
  • RNA containing a full-length HCV genomic sequence and a selectable marker gene sequence is introduced.
  • the full-length HCV RNA replicating cell according to this embodiment is a cell that can tolerate not only infectious JFH1 strain HCV but also HCV RNA replication of new HCV strain (particularly replication of long RNA (12 kb) having a luciferase gene). is there.
  • the full-length HCV genomic sequence used in this embodiment may be derived from any strain of HCV.
  • the HCV strain used is preferably the HCV-O strain, 1B-4 strain, or KAH5 strain, and the full-length HCV RNA replicating cells according to this embodiment are preferably 1B-4RL8 cells and KAH5RL8 cells.
  • the base sequence (SEQ ID NO: 11) and amino acid sequence (SEQ ID NO: 12) of HCV strain 1B-4, and the base sequence (SEQ ID NO: 13) and amino acid sequence (SEQ ID NO: 14) of KAH5 strain are respectively stored in GenBank as ACCESSION AB442219. And is registered as AB442220.
  • the full-length HCV RNA replicating cell according to the present invention can replicate the full-length HCV genome and express a reporter gene product as necessary.
  • the full-length HCV ⁇ RNA replicating cell according to the present invention is a cell into which RNA containing a selectable marker gene sequence and a full-length HCV genome sequence (and optionally a reporter gene sequence) is introduced, and is capable of replicating the full-length HCV genome. What is necessary is just to be able to express a reporter gene product.
  • the RNA includes a reporter gene sequence, the expression level of the reporter gene product and the replication level of HCV RNA are very well correlated in the full-length HCV RNA replicating cells according to the present invention.
  • the replication level of the full-length HCV genome can be easily monitored.
  • it is very useful for functional analysis of HCV including effects of structural proteins, which is impossible with subgenomic HCV replicons. That is, by using the full-length HCV RNA-replicating cells according to the present invention, it becomes possible to easily and quickly perform functional analysis of HCV, screening for substances having anti-HCV action, and the like.
  • the present invention also provides a method for producing full-length HCV RNA replicating cells.
  • the production method according to the present invention is characterized by including a step of introducing RNA containing a full-length HCV genomic sequence and a selectable marker gene sequence into sOLc cells.
  • the RNA may further contain a reporter gene sequence.
  • the production method according to the present invention includes a step of introducing RNA containing a full-length HCV genomic sequence and a selectable marker gene sequence into OLc cells.
  • the RNA may further contain a reporter gene sequence.
  • the production method according to the present invention is characterized by including a step of introducing RNA containing a full-length HCV genomic sequence and a selectable marker gene sequence into ORLc cells.
  • the RNA may further contain a reporter gene sequence.
  • the present invention provides a method for screening a substance having an anti-HCV action.
  • the screening method according to the present invention only needs to include a step of incubating the above-described cells according to the present invention with a candidate factor.
  • the RNA introduced into the cell may further include a step of measuring the level of the reporter gene product, and when the RNA introduced into the cell does not contain a reporter gene sequence May further comprise a step of measuring the level of the HCV gene product.
  • the measured level may be compared with a predetermined reference value, but it is preferable to measure the level of the reporter gene product or the level of the HCV gene product when the cells are not incubated with the candidate factor and compare it with the corresponding level. .
  • the anti-HCV action is an action that suppresses replication of the full-length HCV genome. That is, the screening method according to the present invention can be said to be a method for screening a substance having an action of suppressing replication of the full-length HCV genome.
  • viruses closely related to HCV include viruses belonging to the genus Flavivirus and pestivirus in the Flaviviridae family.
  • viruses belonging to the genus Flavivirus include Japanese encephalitis virus, yellow fever virus, dengue virus, West Nile virus and the like, and pestiviruses include pig cholera virus, bovine viral diarrhea virus and the like.
  • the screening method according to the present invention it is possible to screen for a substance that suppresses the replication of a virus having the same replication format as HCV.
  • a characteristic of HCV replication is that all replication takes place in the cytoplasm and the viral genome is not present in the nucleus. Therefore, by the screening method according to the present invention, a substance that suppresses the replication of a virus having such a replication format can be screened.
  • test substance may be any substance that can be dissolved or suspended in the medium.
  • the level measurement of the reporter gene product may be selected from known methods according to the reporter gene used. For example, when a luciferase gene is used as a reporter gene, the amount of luminescence may be measured using a cell lysate obtained by lysing cells with a buffer containing a surfactant or the like, using a device such as a luminometer. At this time, commercially available luciferase measurement reagents and luciferase measurement kits can be suitably used.
  • this test substance has an anti-HCV action by comparing the level of the reporter gene product measured as described above with the level of the reporter gene product of a cell not contacted with the test substance. it can. It should be noted that if the concentration of the test substance that does not decrease the cell proliferation ability is lower than the level of the reporter gene product of the cell not contacted with the test substance, it can be determined that it has an anti-HCV action, preferably at least 50% or less When it is preferably 10% or less, it is determined to have an anti-HCV action.
  • IFN- ⁇ which is the current standard method for treating chronic hepatitis C
  • the level when applied to the screening method according to the invention is used as a criterion. If the level of HCV replication is lower than that used in current standard hepatitis C treatments, a very useful treatment for hepatitis C can be found.
  • the screening method according to the present invention makes it possible to select at least a candidate substance for an active ingredient of a therapeutic agent for hepatitis C.
  • the screening method according to the present invention can be used to evaluate the efficacy of developing therapeutic agents for hepatitis C. It is expected to become an indispensable method.
  • the present invention provides a screening kit for screening a substance having an anti-HCV action.
  • the screening kit according to the present invention only needs to include the cells according to the present invention described above.
  • the RNA introduced into the cell contains a reporter gene sequence
  • the RNA introduced into the cell contains the reporter gene sequence. If not, it is sufficient that a reagent for measuring the level of the HCV gene product is further provided.
  • the screening method according to the present invention can be carried out simply and efficiently.
  • kit is intended to include packaging with containers (eg, bottles, plates, tubes, dishes, etc.) containing specific materials.
  • containers eg, bottles, plates, tubes, dishes, etc.
  • instructions for using a specific material are provided.
  • the instructions for use may be written or printed on paper or other media, or may be affixed to electronic media such as magnetic tape, computer readable disks or tapes, CD-ROMs, and the like.
  • the screening kit according to the present invention may be provided with a cell other than the above-described cell according to the present invention.
  • the specific configuration other than such cells is not particularly limited, and necessary reagents and instruments can be appropriately selected to form a kit.
  • the present invention provides a method for producing infectious HCV particles.
  • the method for producing infectious HCV particles according to the present invention includes a cell obtained by culturing the above-described cell according to the present invention in a medium containing a drug having an antiviral action ("healing cell derived from Li23 cell" ) May include a step of introducing infectious HCV RNA or a step of incubating with infectious HCV.
  • the cells used in this method are preferably ORL8c cells and ORL11c cells, but are not limited thereto.
  • Fluvastatin was purchased from Calbiochem and LKT Laboratories. IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , and IFN- ⁇ were purchased from Sigma. Cyclosporine A (CsA), myriocin, and acetylsalicylic acid were purchased from Sigma. Pravastatin, simvastatin, lovastatin, and geldanamycin were purchased from Wako chemical. Pitavastatin was purchased from Tronto Research. Ribavirin was provided by Yamasa. Mizoribine was provided by Asahi Kasei.
  • Li23 cells For the culture of Li23 cells, a human liver cancer cell line, F-12 medium (Invitrogen 11765-054) 500 ml D-MEM medium (Sigma D5796) 500 ml
  • EGF Toyobo EGF-201
  • EGF Toyobo EGF-201
  • EGF Toyobo EGF-201
  • EGF Toyobo EGF-201
  • EGF Toyobo EGF-201
  • H-0888 Hydrocortison
  • H-0888 0.36 ⁇ g / ml Transferrin (Sigma T-2252) 5 ⁇ g / ml Linoleic acid (Sigma L-1012) 5 ⁇ g / ml Selenium (Sigma S-9133)
  • 20 ng / ml Prolactin Sigma L6520
  • 10 ng / ml FBS Biological Industries 04-001-1A
  • 1% v / v
  • Gentamycin Gentamycin
  • Li23 cells show EGF-dependent growth, and are difficult to grow under the medium conditions of HuH-7 cells (10% Fetal Bovine Serum (FBS)), which are widely used in HCV replication models.
  • HuH-7 cells Fetal Bovine Serum (FBS)
  • HuH-7 cells Fetal Bovine Serum
  • Li23 cell line containing HCV subgenomic replicon or full length HCV genome was maintained in medium containing G418 (Invitrogen) at a concentration of 0.3 mg / ml.
  • G418 Invitrogen
  • the same culture solution was used except that the healing cells described later did not contain G418.
  • Li23 cells have the characteristics of hepatocytes as well as HuH-7 cells.
  • 11 genes (Aly ⁇ HH et al., J. Hepatology, 46: 26-36, 2007) that are specifically expressed in hepatocytes or reported to be highly expressed in hepatocytes. ) Expression was examined by standard RT-PCR and compared to human hepatoma cell lines HuH-7 cells, human cervical cancer cells (HeLa cells) or human embryonic kidneys (HEK293 cells). As a result, the expression level of each gene in Li23 cells was almost the same as that of HuH-7 cells, and each gene could not be detected in HeLa cells and HEK293 cells (results not shown).
  • RNA was extracted from the target cells using RNeasy Mini Kit (Qiagen) according to the attached experimental instructions. The extracted RNA was quantified by measuring the absorbance at a wavelength of 260 nm. HCV RNA and ⁇ -actin RNA were detected using 4 ⁇ g of RNA. That is, specific detection of RNA was performed using Northern Max Kit (Ambion) according to the attached experimental instructions. The RNA sample was electrophoresed and the gel was blotted onto Hybond-N + nylon membrane (Amersham-Pharmacia Biotech). UV cross-linking (Stratagene) was performed to immobilize RNA on the membrane, and the 28S rRNA portion on the membrane was stained with ethidium bromide.
  • the membrane was cut approximately 1 cm below the 28S rRNA band.
  • the upper part of the cut membrane contains HCV RNA and the lower part contains ⁇ -actin mRNA.
  • a minus-strand riboprobe complementary to the HCV NS5B region labeled with digoxigenine was synthesized and used using a digoxigenine labeing kit (Roche) according to the attached experimental instructions. Detection of a riboprobe specifically bound to HCV RNA was performed using an alkaline phosphatase-labeled anti-digoxigenine antibody. After reacting with CSPD (Roche), X-ray film was exposed to light and specific HCV RNA was detected. ⁇ -actin RNA was detected in the same manner.
  • the antibodies used in this experiment are anti-Core antibody (Institute of Immunology), anti-E1 antibody (provided by Tokyo Clinical Research Institute, Dr. Ohara), anti-E2 antibody (reference: Microbiol. Immunol. 42,875-877, 1998), anti-NS3 antibody (Novocastera Laboratories), anti-NS4A antibody (provided by Dr. Takamizawa, Osaka University), anti-NS5A antibody (provided by Dr. Takamizawa, Osaka University), anti-NS5B antibody (Tokyo Clinical Research Institute, This is an anti- ⁇ -actin antibody (Sigma).
  • Plasmid pON / C-5B contains sequences encoding the neomycin phosphotransferase (Neo) downstream of the IRES (Internal ribosomal entry site) of HCV and the full-length HCV-O protein downstream of the IRES of Encephalomyocarditis virus (EMCV) .
  • a plasmid pHCV-O containing HCV-O full-length cDNA of genotype 1b was constructed from two HCV positive sera using two fragments.
  • the two fragments are EcoR I-Mlu I fragments (45% of HCV genome) derived from pBR322 / 16-6 described in the reference (Kato et al. J.Gen.Virol.79: 1859-1869 (1998)).
  • the Mlu I-Spe I fragment (corresponding to positions 2528-3420 of the HCV genome) derived from the PCR product of serum 1-2. These were ligated to the EcoR I-Spe I site of pNSS1RZ2RU (see Non-Patent Document 2) having the 1 ⁇ -2R1 sequence to construct pHCV-O.
  • the overlapping IVS of EMCV and the sequence encoding the core protein were fused using overlapping PCR.
  • the resulting DNA was digested with Rsr II and Cla I and ligated to the Cla I-Xba I site of pHCV-O together with the Xba I-Rsr II fragment of pNSS1RZ2RU to construct pON / C-5B .
  • Non-Patent Document 2 RNA extracted from sO cells was amplified by RT-PCR in the region corresponding to positions 3474-9185 of the HCV-O gene, and this was amplified by Spe I- of pNSS1RZ2RU. Ligated to Bsiw I site and constructed pON / 3-5B.
  • QChanges of Q1112R, K1609E and S2200R or mutations of Q1112R, P1115L and S2200R were introduced into pON / 3-5B using QuickChange mutagenesis (Stratagene), pON / 3-5B / QR, KE, SR or pON / 3-5B / QR, PL, SR were constructed.
  • Plasmid pORN / C-5B / QR, KE, SR is the PCR product of Renilla en luciferase gene (Promega), and the Asc I site upstream of the Neo gene in pON / C-5B / QR, KE, SR Built by introducing to.
  • Each of the above plasmids contains a T7 promoter sequence on the 5 'side of the inserted gene.
  • RNA synthesis Plasmid DNA was linearized by cutting with Xba I, and RNA was synthesized using T7 MEGAscript Kit (Ambion) according to the attached experimental instructions. After precipitation with lithium chloride, RNA was washed with 75% ethanol and dissolved in RNase-free water.
  • RNA was extracted from HCV RNA replicating cells using RNeasy Mini Kit (Qiagen) according to the attached experimental instructions.
  • a reverse transcription reaction RT was performed using SuperScript TM II reverse transcriptase (Invitrogen) and the following primer 319R according to the attached experimental instructions.
  • HCV RNA was quantified by real-time LightCycler PCR using the obtained cDNA as a template. Real-time LightCycler PCR was performed based on the method previously reported by the present inventors (Reference: Acta Med. Okayama 56, 107-110, 2002) using the following primers 104 and 197R.
  • FIG. 1 shows the structure of an HCV genome, the structure of RNA introduced into a subgenomic HCV replicon cell, the structure of RNA introduced into a full-length HCV genome replicating cell, and a full-length HCV genome replicating cell expressing a luciferase gene product. It is a schematic diagram which shows the structure of RNA.
  • FIG. 1 (a) shows the HCV-O strain (1b genotype).
  • the HCV genome is a single-stranded RNA (SEQ ID NO: 1) consisting of approximately 9.6 kb, 90% of which has one large ORF, and a polyprotein consisting of approximately 3,000 amino acids (SEQ ID NO: 2) It has a structure that produces This polyprotein is processed by the host protease in the first half up to p7, and the remaining part is processed by the two proteases encoded by NS2 and NS3, resulting in the final production of at least 10 viral proteins. Is done.
  • the region up to E2 is called a structural region that forms a virus particle, and NS2 to NS5B are called nonstructural regions.
  • HCV IRES 5 'untranslated region
  • the HCV-O strain is an HCV strain belonging to the 1b genotype that accounts for about 70% of patients in Japan, and has been isolated from a healthy carrier (infected with HCV but normal liver function).
  • FIGS. 1 (b) to 1 (e) The RNA used in the present invention is shown in FIGS. 1 (b) to 1 (e).
  • FIG. 1 (b) two types of adaptive mutations (Q1112R and K1609E) in the NS3 region and the S2200R adaptive mutation in the NS5A region are introduced, and the HCV replicon RNA derived from the HCV-O strain (ON / 3-5B / QR, KE, SR).
  • HCV-reprincon RNA (ON / 3-5B / QR, PL, SR) derived from HCV-O strain into which an adaptive mutation of P1115L has been introduced instead of K1609E has this structure.
  • HCV RNA (ON / C-5B / QR, KE, SR) shown in FIG. 1 (c) is the Encephalomyocarditis virus (hereinafter referred to as the replicon (ON / 3-5B / QR, KE, SR) (FIG. 1 (b)).
  • IRES Internal ribosomal entry site
  • NS3 Internal ribosomal entry site
  • IRES Internal ribosomal entry site
  • NS3 Internal ribosomal entry site
  • NS3 Internal ribosomal entry site and NS3 are inserted from C (core) to NS2 derived from HCV-O strain, 1.4 kb longer than the original HCV genome (11 kb in length)
  • RNA ORN / C-5B / QR, KE, SR
  • HCV RNA (ON / C-5B / QR, KE, SR (Fig. 1 ( c))
  • the Renilla (Renilla) luciferase gene (RL gene) is inserted between the HCV IRES and Neo R gene, and modified so that it is produced as a fusion protein.
  • the structure is 2.4 kb longer than the original HCV genome.
  • the level of HCV RNA replication can be quantified by measuring the RL activity (this measurement is referred to as a reporter assay).
  • the HCV RNA (JFH1) shown in Fig. 1 (e) has the original structure of the HCV genome, and is an infectious HCV RNA derived from the JFH-1 strain (2a genotype) derived from a patient with fulminant hepatitis. is there.
  • RNA sequences pON / 3-5B / QR, KE, SR; pON / 3-5B / QR, PL, SR; pON / C-5B / QR, KE, SR PORN / C-5B / QR, KE, SR; (pJFH1) was cleaved with the restriction enzyme XbaI to obtain a linear form, and then obtained by in vitro synthesis using T7 MEGAscript (Ambion).
  • a plasmid containing the full-length JFH1 cDNA a plasmid provided by the Tokyo Metropolitan Medical Research Organization under a research material provision contract was used.
  • [3: HCV replicon replicating cell line] [3-1] Preparation of cell line 10 ⁇ g of RNA synthesized in vitro from pON / 3-5B / QR, KE, SR or pON / 3-5B / QR, PL, SR is described in Non-Patent Document 2. According to the method, Li23 cells (8 ⁇ 10 6 cells) were introduced. Two days after the introduction, the medium was replaced with a medium containing G418 (0.3 mg / ml) and NaHCO 3 (0.15%). Thereafter, the medium was changed every 4 days, and after culturing for 3 weeks, cells showing a high level of replicon RNA replication were obtained as G418-resistant colonies.
  • G418 0.3 mg / ml
  • NaHCO 3 0.15%
  • HCV protein in the obtained G418 resistant cells was analyzed by Western blotting.
  • NS5A and NS5B proteins were detected according to a conventional method using NS5A antibody and NS5B antibody, respectively.
  • the sO cells HuH-7 cell-derived cells in which the replicon RNA derived from the HCV-O strain is efficiently replicated reported by the present inventors in Non-Patent Document 2 were used for comparison.
  • ⁇ -actin was also detected in parallel with the ⁇ -actin antibody.
  • FIG. 3 (a) shows the cells obtained by introducing ON / 3-5B / QR, KE, SR RNA into the cells obtained by introducing ON / 3-5B / QR, PL, SR RNA.
  • ON / 3-5B / QR, KE, SR it was found that the expression level of the pooled colony cells was higher than that of the cloned cells. Since the goal is to establish a full-length HCV RNA replicating cell line, cell clones are not selected at this stage, and pooled cells (ON / 3-5B / QR, KE, SR (pool)) are used as sOL cells. As used in the next step.
  • HCV replicons in sOL cells are sensitive to drugs reported to have anti-HCV activity when using cells derived from HuH-7 cells Examined.
  • healed cells of sOL cells (cells that are expected to have an intracellular environment suitable for HCV RNA replication) that are considered necessary for the production of full-length HCV RNA replicating cells by treatment with these agents.
  • sO cells derived from HuH-7 cells were used in experiments in order to compare the effects with sOL cells.
  • IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , and IFN- ⁇ were added to a final concentration of 20 IU / ml, fluvastatin (FLV) at 5 ⁇ M, and cyclosporin A (CsA) at 0.5 ⁇ g / ml, respectively.
  • FLV fluvastatin
  • CsA cyclosporin A
  • RNA synthesized in vitro from pON / C-5B / QR, KE, SR was introduced into sOLc cells (8 ⁇ 10 6 cells). Two days after the introduction, the medium was replaced with a medium containing G418 (0.3 mg / ⁇ l) and NaHCO 3 (0.15%). Thereafter, the medium was changed every 4 days and cultured for 3 weeks. G418-resistant colonies were obtained with any amount of RNA (results not shown). A part of the obtained colonies (one plate) was stained with CBB.
  • OL8 cells were observed by immunofluorescence using an anti-dsRNA antibody in order to detect double-stranded RNA (dsRNA) which is a replication intermediate of HCV RNA in OL8 cells replicating full-length HCV RNA.
  • dsRNA double-stranded RNA
  • the coverslip was placed on a glass slide using a PermaFluor Aqueous Mountant (ThermoFisher), observed under a confocal laser scanning microscope (LSM510; Carl Zeiss) and photographed. The results are shown in FIG. 6 (in the figure, the length of the bar is 20 ⁇ m).
  • the RT primer used for amplification in the latter half was 386R, and NS2XOK and 9388RX primer sets were used for PCR.
  • Primscript (Takara) was used for RT, and KOD-plus DNA polymerase (Toyobo) was used for PCR.
  • the amplified product was inserted into a plasmid vector (pBR322MC), the base sequence of the inserted portion was determined, and compared with the base sequence of ON / C-5B / QR, KE, SR initially introduced into the cells (FIG. 8).
  • the number of mutations per clone in the core to NS2 region was 5.3 in OL8 cells, 4 in OL11 cells, and 4 in OL14 cells, which was higher than in NS3 to NS5B regions. Therefore, it was suggested that this region is not essential for HCV RNA replication.
  • a cell line capable of replicating HCV RNA (replicon or full length) having a reporter gene was prepared using OL8c cells or OL11c cells.
  • RNA synthesized in vitro from pORN / 3-5B / QR, KE, SR and pORN / C-5B / QR, KE, SR (ORN / 3-5B / QR, KE, SR) or 20 ⁇ g ( ORN / C-5B / QR, KE, SR) was introduced into OL8c cells or OL11c cells (each 8 ⁇ 10 6 cells) according to the method described in Non-Patent Document 2.
  • Two days after the introduction the medium was replaced with a medium containing G418 (0.3 mg / ml) and NaHCO 3 (0.15%). Thereafter, the medium was changed every 4 days and cultured for 2 to 3 weeks.
  • the doubling time of the cells when using a normal passage medium was calculated as 53 hours and 40 hours. Furthermore, it was confirmed that the replicon RNA present in these cells was not integrated into the host DNA (results not shown).
  • the RT primer used for amplification in the latter half was 386R, and NS2XOK and 9388RX primer sets were used for PCR.
  • Primscript (Takara) was used for RT, and KOD-plus DNA polymerase (Toyobo) was used for PCR.
  • the amplified product was incorporated into a plasmid vector (pBR322MC), the base sequence of the insert was determined, and compared with the sequence of ORN / C-5B / QR, KE, SR initially introduced into the cells (FIG. 11). As a result, the following points became clear. (1) The Q1112R, K1609E and S2200R mutations introduced from the beginning were conserved in the analyzed 3 clones.
  • the cells were seeded under the same conditions as in the above assay system for measuring luciferase activity, and the number of cells after 24, 48, 72 and 96 hours was measured by trypan blue staining. Each point was measured for 3 wells, the average value was calculated, and the doubling time in the logarithmic growth phase was measured.
  • the number of cells in OR6 cells was also examined in the same way, and as a result, the doubling time of cells was 23 hours for ORL8 cells, 26 hours for ORL11 cells, and 34 hours for OR6 cells (results) Is not shown).
  • ORL8 and ORL11 cells are cell lines that can easily evaluate the effects of drugs, as with OR6 cells (see Patent Document 1).
  • the OR6 cell is a cell line in which the cell-derived luciferase activity value correlates with the amount of HCV RNA, and the effect of the drug can be easily evaluated.
  • OR6 cells A viral effect over time has been confirmed in OR6 cells (Naka et al., BBRC, 330: 871-879, 2005). Whether ORL8 cells and ORL11 cells were confirmed to have similar virus effects was examined (FIG. 15). 2 x 10 4 cells are seeded in a 24-well plate and 24 hours later, a predetermined amount of IFN- ⁇ (0, 1, 10, 100 IU / ml) is added, 24 hours, 48 hours and 72 hours for each. Later, luciferase activity was measured. For dilution of IFN- ⁇ , a separately prepared medium for Li23 cells containing 10% FBS was used. Moreover, SD value was computed based on the result from 3 samples about each point.
  • ORL11 cells as well as ORL8 cells, 750,000 without IFN- ⁇ , 300,000 with 1 IU / ml IFN- ⁇ , 76,000 with 10 IU / ml IFN- ⁇ , When 100 IU / ml of IFN- ⁇ was added, a value of 27,000 was obtained. In this case as well, the luciferase activity 72 hours after addition of 1 IU / ml of IFN- ⁇ was less than 50% of the case without addition. Therefore, the EC 50 (effective drug concentration to be 50%) is estimated to be 1 IU / ml or less.
  • ORL8 and ORL11 cells can be a simple assay system that can monitor HCV RNA replication levels just by measuring luciferase activity 72 hours after drug addition, as with OR6 cells. It has been suggested.
  • the cells were cultured under the same conditions as in the luciferase assay. The number of cells was measured by trypan blue staining. The effect of adding IFN- ⁇ at a concentration corresponding to the EC 50 value obtained in each cell was examined. As a result, in any cell, it was 95% or more compared with the control cell, and cytotoxicity by IFN- ⁇ was hardly observed.
  • IFN- ⁇ IFN- ⁇ (0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 10 IU / ml: provided by Toray Industries, Inc.) was added to each cell, and luciferase activity 72 hours later was measured.
  • EC 50 in ORL8, ORL11 and OR6 cells was calculated to be 0.10 IU / ml, O.18 IU / ml and 0.35 IU / ml, respectively.
  • a typical result is shown in FIG. IFN- ⁇ also had the same tendency as IFN- ⁇ , and was most sensitive in ORL8 cells.
  • IFN- ⁇ IFN- ⁇ (0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 10 IU / ml: Sigma I1520) was added to each cell, and luciferase activity 72 hours later was measured.
  • EC 50 in ORL8 cells, ORL11 cells and OR6 cells was calculated to be 0.077 IU / ml, O.13 IU / ml and 0.21 IU / ml, respectively.
  • a typical result is shown in FIG. IFN- ⁇ also showed the same tendency as IFN- ⁇ and IFN- ⁇ , and was most sensitive in ORL8 cells.
  • CsA Cyclosporine A
  • Fluvastatin (FLV) FLV (0, 0.063, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 3 ⁇ M: Calbiochem 344095) was added to each cell, and luciferase activity 72 hours later was measured.
  • EC 50 in ORL8, ORL11 and OR6 cells was calculated to be 0.28 ⁇ M, 0.32 ⁇ M and 1.22 ⁇ M. A typical result is shown in FIG.
  • ORL8 cells showed almost the same value, but in ORL11 cells, the latter was more effective, and in OR6 cells, the former was slightly more effective.
  • ORL8 cells showed almost the same value, but in ORL11 cells, the latter was more effective, and in OR6 cells, the former was slightly more effective.
  • an EC 50 value of 0.11 ⁇ M in ORL11 cells indicating that the FLV effect is maximized in this assay system.
  • an EC 50 value of 0.14 ⁇ M was obtained, and the reproducibility could be confirmed (results not shown).
  • EC 50 in ORL8 cells, ORL11 cells and OR6 cells was calculated to be 0.28 ⁇ M, 0.15 ⁇ M and 1.42 ⁇ M, respectively.
  • a typical result is shown in FIG.
  • OR6 cells When OR6 cells were used, anti-HCV activity was in the order of FLV and SMV, whereas when ORL11 cells were used, anti-HCV activity was in the order of SMV and FLV. This suggests the necessity of comprehensive determination using not only OR6 cells but also ORL8 cells or ORL11 cells, and supports the usefulness of cell assay systems using ORL8 and ORL11 cells. .
  • Lovastatin (LOV) LOV (0, 0.063, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4 ⁇ M: Wako chemical 125-04581) was added to each cell, and luciferase activity 72 hours later was measured.
  • EC 50 in ORL8, ORL11 and OR6 cells was calculated to be 1.49 ⁇ M, 1.04 ⁇ M and 3.0 ⁇ M, respectively.
  • a typical result is shown in FIG.
  • Ribavirin is currently used in combination with PEG-IFN, and is used as a standard treatment because it has a better therapeutic effect than PEG-IFN alone, despite having side effects such as anemia.
  • PEG-IFN a standard treatment
  • anti-HCV effect of ribavirin has not been clarified so far.
  • OR6 cell assay system prepared by the present inventors although ribavirin has an anti-HCV effect, its EC 50 value is high (76 ⁇ M) (Naka et al., BBRC, 330; 871-879, 2005).
  • Ribavirin has RNA mutagenesis activity and mutates the HCV genome (if it exceeds 100 ⁇ M, it causes error catastrophe) (2) Effect of inhibiting HCV RNA-dependent RNA polymerase (NS5B); (3) Effect of enhancing cellular immunity. Effect by promoting production of IFN- ⁇ ; (4) Inhibitory effect of inosinate dehydrogenase (IMPDH).
  • IMPDH inosinate dehydrogenase
  • the cells were cultured under the same conditions as the luciferase assay, and trypan blue staining was performed. The number of cells was measured by the method. The effect of adding ribavirin at a concentration corresponding to the EC 50 value obtained in each cell was examined. As a result, in any cell, it was 98% or more compared with the control cell, and cytotoxicity by ribavirin was hardly observed. In addition, cytotoxicity due to ribavirin was not observed at a concentration of 12.5 ⁇ M (results not shown).
  • the blood concentration of patients receiving ribavirin treatment is about 10-14 ⁇ M, and this concentration is sufficient when combined with PEG-IFN The concentration was found to enhance the anti-HCV effect.
  • the blood concentration of ribavirin in the administered patient does not suppress HCV RNA replication, but this result shows that ribavirin inhibits HCV RNA replication. It was found to have activity as an agent.
  • ORL8 and ORL11 cells were calculated to be 5.16 nM and 3.62 nM, respectively. This is almost the same as the value obtained by the HCV replicon assay of the Con-1 strain, but in the assay using OR6 cells derived from HuH-7 cells, it is slightly less than 60% even at 5 nM to 40 nM. The EC 50 value could not be calculated because the activity of the sucrose was maintained and did not fall below 50%. The reason why these results were obtained is not clear, but ORL8 and ORL11 cells of the Li23 cell line, which do not show the phenomenon observed in the HuH-7 cell line, evaluate myriocin-related drugs. It can be said that this is a suitable cell assay system. A representative result is shown in FIG.
  • the cells were cultured under the same conditions as in the luciferase assay, and trypan blue staining was performed. The number of cells was measured by the method. The effect of adding myriocin at a concentration corresponding to the EC 50 value obtained in each cell was examined. As a result, the number of ORL8 cells was slightly lower than that of the control cells, 83.5%, but other cells were 91% or more. From these results, it was considered that the decrease in luciferase activity was due to the anti-HCV activity of myriocin.
  • ASA Acetylsalicylic acid
  • FIG. 33 shows the assay results in ORL8 and OR6 cells.
  • IFN- ⁇ was added to final concentrations of 0, 0.1, 0.2 and 0.4 IU / ml
  • FLV was added to final concentrations of 0, 0.3, 0.6 and 1.2 ⁇ M. Luciferase activity was measured 72 hours after the addition. As a result, a result close to what was expected from the result when each was added as a single agent was obtained. From this result, it is considered that the combined effect of IFN- ⁇ and FLV is an additive effect, but the ORL8 cell assay system is considered to have better sensitivity than the OR6 cell assay system.
  • FIG. 34 shows the assay results in ORL11 cells and OR6 cells.
  • the obtained results were close to those expected from the results of single agent treatment, and the luciferase activity had a concentration-dependent attenuation pattern similar to that of ORL11 cells. From this result, it is considered that the ORL11 cell assay system is superior in sensitivity to the OR6 cell assay system.
  • FIG. 35 shows the assay results for ORL8 cells and ORL11 cells.
  • luciferase activity after IFN- ⁇ single agent treatment was 26% (ORL8), 48% (ORL11), 75% (OR6), and ribavirin was 35% (ORL8), 49% (ORL11), 97% (OR6), and luciferase activity after drug combination was reduced to 11% (ORL8), 28% (ORL11), and 80% (OR6).
  • the predicted values for the additive effect of the combined use were 9% (ORL8), 24% (ORL11), and 73% (OR6).
  • the measured values in these cell assay systems were slightly higher (9-18%) than expected, but were considered additive.
  • HuH-7 cells When cells derived from HuH-7 cells are used, only the HCV 2a-derived JFH1 strain HCV can reproduce the life cycle of HCV.
  • RSc cells were infected with JFH1 strain HCV, and the supernatant after 145 days was used as a virus solution.
  • This viral fluid is expected to contain 10 5.3 TCID 50 of infectious HCV particles per ml.
  • This is a cloned cell derived from RSc cell HuH-7 cell, and efficiently and continuously produces infectious HCV particles by introducing JFH1 strain HCV RNA into the cell (Ariumi et al., JVI 81: 13922 -13926,2007).
  • the virus solution was added to Li23 cells (2 ⁇ 10 4 cells / 24 wells) and OL8c cells (2 ⁇ 10 4 cells / 24 wells), and the medium was changed after 2 hours.
  • the expression level of the core protein in each cell was examined by Western blotting.
  • a Mock experiment using the culture solution was also performed in parallel. The assay was equivalent to 2 x 10 4 cells.
  • JFH1 strain HCV for healing cells other than OL8c cells.
  • Infection experiments with JFH1 strain HCV were performed using Li23 and healing cells (OL1c cells, OL2c cells, OL3c cells, OL4c cells, OL8c cells, OL11c cells and OL14c cells) prepared from various cloned OL cells.
  • the expression level of the core protein in each cell on the 16th day after infection was examined by Western blotting. When Li23 cells were used, no core protein was detected, but when OL8c cells were used, strong expression of the core protein was observed even on the 16th day after infection (FIG. 40). This suggests that persistent HCV RNA replication occurs in the cells after infection.
  • OL8c cells Except for OL8c cells, OL2c cells, OL3c cells and OL11c cells showed the same level of core protein expression as OL8c cells, while weak expression was confirmed in OL14c cells. However, no core protein was detected in OL1c and OL4c cells. This difference between cell clones is not correlated with the amount of full-length HCV RNA in the cell (HCV-O strain HCV RNA replication level). This may be due to differences in replication efficiency based on differences in HCV strains.
  • culture supernatant 100 ⁇ l each: IF1 in the figure
  • OL8c cells and OL11c cells each 2 x 10 4 cells / 24 wells 7 days after infection was infected to RSc cells (2 x 10 4 cells / 24 wells) I let you.
  • the culture supernatant 100 ⁇ l: IF2 in the figure
  • OL8c cells and OL11c cells each 2 ⁇ 10 4 cells / 24 wells.
  • the expression level of the core protein in the cell was analyzed by Western blotting. The results are shown in lanes 5-8. Core protein was detected in OL8c and OL11c cells. From these results, it was suggested that infectious HCV particles were produced from OL8c cells and OL11c cells, and production of infectious HCV particles was amplified via RSc cells.
  • ORL8c cells were shown to be capable of causing the reproduction of the life cycle of HCV, but their ability is very weak compared to RSc cells and the like. In addition, there is a drawback that it takes time for experiments in practical use. Therefore, ORL8c cells or ORL11c cells, which are considered superior to OL8c cells or OL11c cells in terms of the replication environment of HCV RNA, were compared with ORL8 cells and ORL11 cells in the absence of G418 by IFN- ⁇ (10 3 IU / [mu] l) was added to prepare.
  • RSc cells 100 ⁇ l each of RSc cells, ORL8c cells and ORL11c cells (each 2 ⁇ 10 4 cells (ORL11c cells only 3 ⁇ 10 4 cells) / 24 wells) were prepared separately. 2 ⁇ 10 4 cells / 24 wells).
  • a Mock experiment using the culture solution was also performed at the same time.
  • the expression level of intracellular core protein was analyzed by Western blotting (lanes 1 to 4 in FIG. 44). The expression level of the core protein was found to be approximately the same in lanes 2, 3 and 4.
  • ORL8c cells and ORL11c cells are more capable of producing infectious HCV than OL8c cells and OL11c cells. It was found to be high and comparable to RSc cells derived from HuH-7 cells.
  • the amount of core protein produced in ORL8c cells infected with HCV produced from RSc cells is maximal on the seventh day after infection and is maintained to some extent until the 21st day, but decreases on the 30th day. (Lane 6).
  • the amount of core protein produced in ORL8c cells infected with HCV produced from ORL8c cells was significantly expressed on the seventh day after infection, and this expression level increased with time. It was found that even at the 30th day, it was maintained at a higher level than the 7th day (lane 7). From these results, it is suggested that HCV produced in ORL8c cells is reinfected with ORL8c cells and HCV production is maintained for at least one month.
  • the ORL8c cell is clearly superior in infectious HCV particle production ability, and the ORL8c cell is also compared with the RSc cell derived from HuH-7 cell. It was found to have inferior HCV production ability.
  • ORL11c cells infected with HCV produced from RSc cells The amount of core protein produced in ORL11c cells infected with HCV produced from RSc cells is maximal on day 7 after infection, and to some extent until day 21, as in the case of ORL8c cells. It was maintained, but it was found that it decreased after 30 days (lane 9). On the other hand, no core protein was produced in ORL11c cells infected with HCV produced from ORL11c cells (lane 10).
  • HCV replication levels in ORL8c cells and RSc cells were compared. Released into the culture supernatants of ORL8c cells and RSc cells at the same time as in FIG. 44 (Days 7, 14, 21, and 30 (IF2d7, IF2d14, IF2d21, and IF2d30 in the figure), respectively)
  • the amount of HCV core protein secreted in culture supernatants (IF2d7, IF2d14, IF2d22) of ORL8c cells and RSc cells infected with JFH-1 strain HCV was measured by ELISA. (Measured with Mitsubishi BLC). Each experiment was performed three times, and 1 ml of the supernatant was used for the measurement (FIG. 46 (a)).
  • the amount of HCV particles released into the culture supernatant reached 10 5 fmol / L or more on the 7th day of infection in the case of RSc cells, and thereafter, there was no change or a slight decrease.
  • ORL8c cells it was as low as 10 2 fmol / L on the 7th day of infection, but became 10 4 fmol / L on the 14th day of infection, and maintained that level until 22nd day after infection.
  • the ability to produce HCV particles in ORL8c cells was an order of magnitude lower than that in RSc cells, but it was found to be at a sufficient level to be used for characterization of various viruses.
  • HCV RNA was quantified for these cells according to the above-described real-time LightCycler PCR procedure. Each experiment was performed three times (FIG. 46 (b)). In the case of RSc cells, similar to the level of core protein released into the culture supernatant, it reached 10 8 copies / ⁇ g total RNA on the 7th day of infection, and was maintained at almost the same level until 22nd day thereafter. . On the other hand, in ORL8c cells, it was about 5 ⁇ 10 5 copies / ⁇ g total RNA on the 7th day of infection, but reached about 5 ⁇ 10 7 copies / ⁇ g total RNA on the 14th day of infection. It was maintained. These results showed that high replication levels of HCV RNA were maintained in both cells.
  • HuH-7 cells, RSc cells, Li23 cells, ORL8c cells and ORL11c cells were cultured in 10 cm plates (10 ml of medium).
  • Total RNA was extracted from these cells using the RNeasy Mini Kit (Qiagen) according to the attached experimental instructions.
  • RT reverse transcription reaction
  • PCR was performed using the obtained cDNA as a template and the primer set shown in Table 3, and a PCR amplification product was detected by ethidium bromide staining after 3% agarose gel electrophoresis.
  • HCV RNA was quantified using the above cDNA according to the above-described real-time LightCycler PCR procedure.
  • HCV receptor expression was observed in any cell, and the expression level was lower only in the ORL8c cell than in the RSc cell. It was found that there is no HCV receptor present, and that CLDN1 and OCLN have higher expression levels in ORL8c cells than in RSc cells (FIG. 47 (b)).
  • ORL8c cells are cells that can replicate HCV-O strain-derived full-length HCV RNA having a luciferase gene. This is a cured cell that has been treated with HCV RNA to eliminate it. Therefore, if ORL8c cells are used, there is a possibility that a cell line capable of replicating full-length HCV RNA derived from HCV strains other than HCV-O strains can be established.
  • Plasmids prepared from HCV carrier strain 1B-4 (1b genotype) and HCV strain KAH5 (1b genotype) derived from patients with acute hepatitis
  • Each full-length HCV RNA (10 ⁇ g) having a luciferase gene synthesized in vitro as a template was introduced into 2 ⁇ 10 6 ORL8c cells by electroporation.
  • p1B-4RN / C-5B has two mutations (Q1067R and S2200R)
  • pKAH5RN / C-5B has four mutations (Ins2040K (with lysine inserted at position 2040 of the HCV polyprotein).
  • HCV protein was most expressed in clone # 2 for the 1B-4 strain. This cell clone # 2 was grown and established (referred to as 1B-4RL8 cells). As shown in FIG. 48 (b), the HCV protein was most expressed in clone # 11 for the KAH5 strain. This cell clone # 11 was grown and established (referred to as KAH5RL8 cells).
  • 1B-4RL8 cells and KAH5RL8 cells are useful cells that can quantify HCV RNA replication levels using a simple luciferase assay, and the activity of anti-HCV agents against 1B-4 strain HCV and KAH5 strain HCV, respectively. It has been shown that it can be a good assay system for performing the evaluation.
  • ORL8c cells have not only the ability to produce infectious JFH1 strain HCV, but also HCV RNA replication of new HCV strains (especially RNA replication longer than the original HCV RNA 9.6 kb) It can be said that it is an acceptable cell.
  • an HCV life cycle reproduction system derived from a cell line other than the HuH-7 cell line can be constructed.
  • it has not only been verified as a substance having an anti-HCV action so far, but also has an anti-HCV action. It is possible to find the anti-HCV action of a substance that was thought to be not.
  • it is possible to provide a screening method for a substance having an anti-HCV action and a therapeutic agent for hepatitis C, which can contribute to the development of the reagent industry, the pharmaceutical industry, and the like.

Abstract

　本発明に従って、HCVレプリコン配列および選択マーカー遺伝子配列を含んでいるRNAを、Li23細胞またはLi23細胞に由来する治癒細胞に導入する工程を包含する作製方法を用いて、HCVレプリコン複製細胞を作製する。さらに、全長HCVゲノム配列および選択マーカー遺伝子配列を含んでいるRNAを、Li23細胞またはLi23細胞に由来する治癒細胞によって示される細胞に導入する工程を包含する作製方法を用いて、全長HCV RNA複製細胞を作製する。これにより、HuH-7細胞株由来のHCV生活環再現システムに匹敵する能力を有する、HuH-7細胞株以外の細胞株に由来するHCV生活環再現システムを構築することができる。

Description

新規HCVレプリコン複製細胞および全長HCV RNA複製細胞、ならびにこれらの利用
　本発明は、新規HCVレプリコン複製細胞および全長HCV RNA複製細胞、ならびにこれらの利用に関するものであり、より詳細には、新規HCVレプリコン複製細胞および全長HCV RNA複製細胞を用いた新規HCV RNA複製システムおよび新規HCV粒子産生システムに関するものである。
　Ｃ型肝炎ウイルス（以下「HCV」と記載する）は非Ａ非Ｂ型肝炎の原因ウイルスとして１９８９年に発見同定されたフラビウイルス科に属するRNAウイルスである。HCVは持続感染を成立させるウイルスであることから、HCV感染により引き起こされる肝炎（Ｃ型肝炎）は高率に慢性肝炎に移行する。その後、二十数年の経過のなかで肝硬変、そして最終的に肝細胞癌発症に至ることが明らかになっている。
　HCV感染者は日本国内で約２００万人、世界で約２億人いると推定されている。最近の社会的問題にもなっているフィブリノゲン製剤によるHCV感染という事態からもわかるように、HCVに感染していることを自覚していないいわゆる無症候性キャリアーも多数存在している。現在、日本国内における肝細胞癌による犠牲者は年間約３．５万人となっており、その８割はHCV感染によるものである。また、その前段階である肝硬変においても年間約２万人が犠牲となっている。したがって、HCVは深刻な感染症を引き起こすウイルスであると言える。
　HCVが増殖し、その感染、複製、粒子産生、再感染が繰り返される状態（すなわちHCVの生活環）が再現されるシステムを得ることは、抗HCV技術の開発に非常に有用である。HCVの発見以後、多くの培養細胞や動物を用いて人工増殖システムの開発が試みられたが、実用的なものは得られなかった。また、HCV感染のモデル動物はチンパンジーのみであり、これに代わる動物は未だ見つかっていない。チンパンジーを薬剤のスクリーニングに用いることは希少性および経済性の観点から現実的でない。
　１９９９年に、上記の問題点をある程度クリアする新しい実験システムとしてHCVレプリコンシステムが登場した（非特許文献１参照）。HCVレプリコンはHCVの構造タンパク質をコードする遺伝子を除いたHCV遺伝子（非構造タンパク質ＮＳ３～ＮＳ５Ｂまで）である。このシステムでは、HCVゲノムの複製に必須のＮＳ３～ＮＳ５Ｂ領域とゲノムの両末端からなるHCVサブゲノムが細胞内で複製するようになっており、１細胞あたりのHCVサブゲノムのコピー数は数千というレベルに達する。その後、いくつかの異なるHCV株由来のサブゲノミックHCVレプリコン細胞が樹立されている（例えば、非特許文献２参照）。Ｃ型肝炎治療薬の開発においては、多数のモデル動物（チンパンジー）を用いた薬理試験を実施することができないため、上記サブゲノミックHCVレプリコンシステムを用いた薬効評価が必須となっている。
　上記サブゲノミックHCVレプリコンシステムでは、HCV構造タンパク質の影響を評価し得ない。このような問題を解決するために、全長HCVゲノムの複製システムが開発され、これまでに、３種類のHCV株（Ｎ株、Ｃｏｎ－１株およびＨ７７株）の全長ゲノムを複製できる細胞（全長HCV RNA複製システム）の樹立が報告されている（非特許文献３～５を参照）。また、レポーター遺伝子を含む、HCVゲノムの複製レベルをモニタリングし得るアッセイ系（非特許文献６、特許文献１）が開発された。さらに、２ａ遺伝子型に属するJFH１株HCVを用いた感染性HCV粒子産生細胞（HuH-7細胞由来のクローン化細胞）も樹立された（非特許文献７）。
　以上の技術（HCVレプリコン複製細胞、全長HCV RNA複製細胞、JFH１株HCVを用いたHCV粒子産生細胞）を用いてHCVに対する特異的抗ウイルス剤の開発に向けた取り組みが世界的に行われている。
日本国公開特許公報「特開２００６－３２５５８２号公報（公開日：平成１８年１２月７日）」
Lohmann et al., Science 285: 110-113 (1999) Kato et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 306: 756-766 (2003) Blight et al., J. Virol. 77: 3181-3190 (2003) Ikeda et al., J. Virol. 76: 2997-3006 (2002) Pietschmann et al., J. Virol. 76: 4008-4021 (2002) Ikeda et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 329: 1350-1359 (2005) Wakita et al., Nat. Med. 11: 791-796 (2005)
　HCVの生活環が再現される細胞としてこれまでに使用されているのは、HuH-7と呼ばれるヒト肝癌細胞株由来の特殊なクローン化細胞のみである。HuH-7細胞の中でも、HCVゲノムの複製を許容できるのはごくわずかな細胞クローンであることも判明している。HuH-7由来の細胞をベースにしてこれまでに得られている成果を検証するためにも、様々な細胞株でのHCV生活環再現システムの開発が必要である。しかし、HuH-7細胞以外に由来する細胞では、HCVレプリコンや全長HCV RNAの複製レベルがHuH-7細胞由来のものと比較して非常に低く、実用レベルではない。
　本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、HuH-7細胞株由来のHCV生活環再現システムに匹敵する能力を有する、HuH-7細胞株以外の細胞株に由来するHCV生活環再現システムを構築することにある。
　本発明者らは、特許文献１にて開示したHuH-7細胞ベースの技術を構築する際に用いたものとは異なる特定のHCVレプリコンRNAを使用することにより、HuH-7細胞とは異なる特定の細胞においてRNAの複製が首尾よく生じることを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明に係るHCVレプリコン複製細胞を作製する方法は、HCVレプリコン配列および選択マーカー遺伝子配列を含んでいるRNAを、Li23細胞またはLi23細胞に由来する治癒細胞に導入する工程を包含し、該HCVレプリコン配列は、配列番号２に示されるアミノ酸配列におけるQ1112R、K1609EおよびS2200R、またはQ1112R、P1115LおよびS2200Rのアミノ酸置換を生じているアミノ酸配列をコードする塩基配列を含んでいることを特徴としている。
　本発明に係る全長HCV RNA複製細胞を作製する方法は、全長HCVゲノム配列および選択マーカー遺伝子配列を含んでいるRNAを、Li23細胞に由来する治癒細胞に導入する工程を包含することを特徴としている。上記全長HCVゲノム配列は、配列番号２に示されるアミノ酸配列におけるQ1112R、K1609EおよびS2200R、またはQ1112R、P1115LおよびS2200Rのアミノ酸置換を生じているアミノ酸配列をコードする塩基配列であってもよく、この場合、該塩基配列は、配列番号７または９に示される配列であることが好ましい。また、上記全長HCVゲノム配列は、配列番号１１または１３に示される塩基配列であってもよい。
　本発明に係る全長HCV RNA複製細胞を作製する方法において、上記RNAは、レポーター遺伝子配列をさらに含んでいることが好ましく、外因性のインターナルリボソーマルエントリーサイト（ＩＲＥＳ）配列をさらに含んでいることが好ましい。
　本発明に係るスクリーニング方法は、抗HCV作用を有する物質をスクリーニングするために、上記のいずれかの方法によって作製された細胞を候補因子とともにインキュベートする工程を包含し、HCV遺伝子産物のレベルを測定する工程、またはレポーター遺伝子産物のレベルを測定する工程をさらに包含することを特徴としている。
　本発明に係る治癒細胞の作製方法は、上記の方法によって作製された細胞を、抗ウイルス作用を有する薬剤を含む培地中で培養する工程を包含することを特徴としている。
　本発明に係る感染性HCV粒子の生産方法は、上記の治癒細胞を、感染性HCV RNAとともにインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
　本発明を用いれば、HCVレプリコンまたは全長HCVゲノムを複製し得る細胞を作製し得る。さらに、本発明を用いれば、HCVの感染も許容し得る細胞を得ることができる。
HCV-O株（1b遺伝子型）のＨＣＶゲノムの構成を示す。 NS3領域の２種類の適応変異（Q1112RおよびK1609E）とNS5A領域のS2200R適応変異が導入された、HCV-O株由来のHCVレプリコンRNA（ON/3-5B/QR,KE,SR）の構成を示す。 図１（ｂ）のEMCVのIRESとNS3の間に、HCV-O株由来のC（コア）～NS2を挿入した、全長HCV RNA（ON/C-5B/QR,KE,SR）の構成を示す。 図１（ｃ）のHCV IRESとNeoR遺伝子の間にRL遺伝子を挿入し、融合タンパク質として産生されるように改変したRNA（ORN/C-5B/QR,KE,SR）の構成を示す。 本来のHCVゲノムの構造を有している、劇症肝炎患者由来のJFH-1株(2a遺伝子型)由来の感染性HCV RNA（JFH1）の構成を示す。 HCVレプリコン複製細胞および全長HCV RNA複製細胞を作製する手順を示す図である。 HCVレプリコン複製細胞におけるHCVタンパク質の発現を示す図である。 HCVレプリコン複製細胞におけるHCV-0株レプリコンの複製に対する抗HCV剤の効果を示す図である。 Li23細胞由来の全長HCV RNA複製細胞における全長HCV RNAを定量した結果を示す図である。 Li23細胞由来の全長HCV RNA複製細胞におけるHCVタンパク質の発現を示す図である。 OL8細胞、陽性コントロールとしてのO細胞、陰性コントロールとしてのLi23細胞について、抗dsRNA抗体を用いた免疫蛍光法によって、HCV RNAの複製中間体である二本鎖RNA（dsRNA）を検出した結果を示す図である。 Li23細胞由来の全長HCV RNA複製細胞における全長HCV RNAの複製に対するIFN－αの効果を示す図である。 Li23細胞由来の全長HCV RNA複製細胞内で複製しているHCVの遺伝子解析の結果を示す図である。 レポーター遺伝子を有する、Li23細胞由来のHCVレプリコン複製細胞および全長HCV RNA複製細胞の作製手順および結果を示す図である。 クローン化したORL８細胞における全長HCV RNAを定量した結果を示す図である。 クローン化したORL11細胞における全長HCV RNAを定量した結果を示す図である。 ORL8細胞内で複製しているHCVの遺伝子解析の結果を示す図である。 ORL11細胞内で複製しているHCVの遺伝子解析の結果を示す図である。 ORL8細胞およびORL11細胞におけるHCVタンパク質の発現を示す図である。 ORL8細胞およびORL11細胞におけるルシフェラーゼ活性とHCV RNA量との相関を示す図である。 ORL8細胞およびORL11細胞を用いた、IFN－αの経時的な抗HCV活性を示す図である。 ORL8細胞およびORL11細胞、ならびにOR6細胞を用いた、IFN－αの抗HCV活性の比較を示す図である。 sORL8(pool)細胞およびsORL11(pool)細胞を用いた、IFN－αの抗HCV活性の比較を示す図である。 ORL8細胞およびORL11細胞、ならびにOR6細胞を用いた、IFN－βの抗HCV活性の比較を示す図である。 ORL8細胞およびORL11細胞、ならびにOR6細胞を用いた、IFN－γの抗HCV活性の比較を示す図である。 ORL8細胞およびORL11細胞、ならびにOR6細胞を用いた、シクロスポリンＡ（CsA）の抗HCV活性の比較を示す図である。 ORL8細胞およびORL11細胞、ならびにOR6細胞を用いた、フルバスタチン（FLV）の抗HCV活性の比較を示す図である。 ORL8細胞およびORL11細胞、ならびにOR6細胞を用いた、フルバスタチン（FLV）の抗HCV活性の比較を示す図である。 ORL8細胞およびORL11細胞、ならびにOR6細胞を用いた、シンバスタチン（SMV）の抗HCV活性の比較を示す図である。 ORL8細胞およびORL11細胞、ならびにOR6細胞を用いた、ローバスタチン（LOV）の抗HCV活性の比較を示す図である。 ORL8細胞およびORL11細胞、ならびにOR6細胞を用いた、ピタバスタチン（PTV）の抗HCV活性の比較を示す図である。 ORL8細胞およびORL11細胞、ならびにOR6細胞を用いた、リバビリン（RBV）の抗HCV活性の比較を示す図である。 ORL8細胞およびORL11細胞、ならびにOR6細胞を用いた、ミゾリビンの抗HCV活性の比較を示す図である。 ORL8細胞およびORL11細胞、ならびにOR6細胞を用いた、ゲルダナマイシンの抗HCV活性の比較を示す図である。 ORL8細胞およびORL11細胞、ならびにOR6細胞を用いた、ミリオシンの抗HCV活性の比較を示す図である。 ORL8細胞およびORL11細胞、ならびにOR6細胞を用いた、アセチルサリチル酸（ASA）の抗HCV活性の比較を示す図である。 ORL8細胞およびORL11細胞、ならびにOR6細胞を用いた、IFN－αとCsAとの併用による抗HCV活性の比較を示す図である。 ORL8細胞およびORL11細胞、ならびにOR6細胞を用いた、IFN－αとFLVとの併用による抗HCV活性の比較を示す図である。 ORL8細胞およびOR6細胞を用いた、IFN－αとFLVとの併用による抗HCV活性の比較を示す図である。 ORL11細胞およびOR6細胞を用いた、IFN－αとFLVとの併用による抗HCV活性の比較を示す図である。 ORL8細胞およびORL11細胞を用いた、IFN－αとFLVとの併用による抗HCV活性の比較を示す図である。 ORL8細胞およびORL11細胞、ならびにOR6細胞を用いた、IFN－αとFLVとの併用による抗HCV活性の比較を示す図である。 ORL8細胞およびORL11細胞、ならびにOR6細胞を用いた、IFN－αとリバビリン（RBV）との併用による抗HCV活性の比較を示す図である。 JFH1株HCV RNAを導入したLi23細胞、OL8c細胞およびOL11c細胞内でのHCVコアタンパク質の発現を調べた結果を示す図である。 Li23細胞およびOL8c細胞に対するJFH1株HCVの感染実験の結果を示す図である。 クローン化した各種OL治癒細胞に対するJFH1株HCVの感染実験の結果を示す図である。 JFH1株HCVを感染させたOL8c細胞およびOL11c細胞からの、感染性HCV粒子の産生を調べた結果を示す図である。 JFH1株HCVを感染させたOL8c細胞からの、感染性HCV粒子の産生を調べた結果を示す図である。 OL8c細胞およびOL11c細胞に対するIFN－γ処理による治癒細胞の作製手順および結果を示す図である。 JFH1株HCVを感染させたORL8c細胞およびORL11c細胞からの、感染性HCV粒子の産生を調べた結果を示す図である。 ORL8c細胞、陽性コントロールとしてのJFH-1株HCV感染RSc細胞、陰性コントロールとしてのMock infection ORL8c細胞について、抗dsRNA抗体を用いた免疫蛍光法によって、HCV RNAの複製中間体である二本鎖RNA（dsRNA）を検出した結果を示す図である。 JFH-1株HCVを感染させたORL8c細胞およびRSc細胞の培養上清中に放出されるHCVコアタンパク質の分泌量をELISA法により測定した結果を示す図である。 JFH-1株HCVを感染させたORL8c細胞およびRSc細胞におけるHCV RNA量をリアルタイムLightCycler PCRによって定量した結果を示す図である。 HuH-7細胞、RSc細胞、Li23細胞、ORL8c細胞およびORL11c細胞におけるHCV受容体のmRNAの発現レベルを定性的に比較した結果を示す図である。 HuH-7細胞、RSc細胞、Li23細胞、ORL8c細胞およびORL11c細胞におけるHCV受容体のmRNAの発現レベルを定量的に比較した結果を示す図である。 HCV-O株以外のHCV株に由来する全長HCV RNAを複製し得る細胞株の樹立を確認した結果を示す図であり、1B-4株のコアタンパク質およびNS5Aタンパク質の発現レベルをウエスタンブロット法により解析した結果である。 HCV-O株以外のHCV株に由来する全長HCV RNAを複製し得る細胞株の樹立を確認した結果を示す図であり、KAH5株のコアタンパク質およびNS5Aタンパク質の発現レベルをウエスタンブロット法により解析した結果である。 HCV-O株以外のHCV株に由来する全長HCV RNAを複製し得る細胞株における、ルシフェラーゼ活性とHCV RNA量との相関を示す図である。
　〔１〕HCVレプリコン複製細胞
　本発明は、HCVレプリコン複製細胞を提供する。本発明に係るHCVレプリコン複製細胞は、特定の適応変異を有するHCVレプリコンRNAが特定の細胞に導入されていることを特徴としている。なお、本明細書中で使用される場合、「HCVレプリコン」は、「サブゲノミックHCVレプリコン」と交換可能に用いられ、HCVゲノム配列のNS3～NS5Bの領域（「HCVレプリコン配列」）から構成される構造遺伝子が意図される。
　HCV ORF中に変異を有することにより、細胞内でのHCVゲノムの複製効率が向上する場合があり、このような効果が得られる変異は「適応変異」として知られている。HCVについて多くの適応変異が知られているが、どのような適応変異がどのような条件に適しているのかは知られていない。本発明者らは、HuH-7細胞株に由来するHCV生活環再現システムを既に完成させている（特許文献１等参照）。HuH-7細胞株以外の細胞株に由来するHCV生活環再現システムを構築するために、HuH-7細胞株以外の種々の細胞株（例えば、ヒト肝癌細胞株、ヒト不死化肝細胞株、ヒト胆管癌細胞株など）にHCVレプリコンRNAの導入を試みたが、所望の形質転換体を得ることができなかった。しかし、本発明者らは、独自の観点と試行錯誤の結果、HCVゲノムにおけるNS3～NS5B領域を含み、かつNS3領域における特定の適応変異（Q1112RおよびK1609E、またはQ1112RおよびP1115L）およびNS5A領域における特定の適応変異（S2200R）を有しているHCVレプリコン配列を用いれば、ヒト肝癌細胞株であるLi23細胞に目的のRNAを導入し得ることを見出した。本発明に利用され得る適応変異は、「Q1112R、K1609EおよびS2200R」の組合せ、または「Q1112R、P1115LおよびS2200R」の組合せである。これらの組合せにおける２種類の変異だけを用いた場合や、異なる組合せ（例えば「P1115L、K1609EおよびS2200R」、「Q1112R、E1202GおよびS2200R」、「E1202G、K1609EおよびS2200R」など）では本発明はうまく実現され得なかった。また、このような特定の組合せの適応変異を有したHCVレプリコン配列を用いても、Li23細胞以外の細胞に目的のRNAを導入することはできなかった。
　一実施形態において、本発明に係るHCVレプリコン複製細胞は、ヒト肝癌細胞株であるLi23細胞が親細胞であり、このような細胞株に対して、HCVレプリコン配列（Q1112R、K1609EおよびS2200R、またはQ1112R、P1115LおよびS2200Rの適応変異を有している）と選択マーカー遺伝子配列とを含んでいるRNAが導入されていることを特徴としている。
　本発明に係る細胞に導入されているRNAは、選択マーカー遺伝子配列およびHCVレプリコン配列を含むものであればよい。選択マーカー遺伝子としては、特に限定されないが、簡便性の観点から薬剤耐性遺伝子が好ましい。薬剤耐性遺伝子としては、特に限定されず、形質転換細胞の選択に使用可能な公知の薬剤耐性遺伝子から適宜選択すればよい。具体的には、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子）、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などを挙げることができる。HCVレプリコン配列としては、配列番号３または５に示される塩基配列が好ましいが、さらなる変異を有していてもよく、この場合の変異は適応変異に限定されない。
　本発明に係る細胞に導入されているRNAにおける各配列の順序は、選択マーカー遺伝子産物およびHCVレプリコン配列がコードするタンパク質が発現し得る順序であれば特に限定されない。また、このRNAには、選択マーカー遺伝子を翻訳するためのIRESと、HCVのORFを翻訳するためのIRESとの２つのIRESが含まれることが好ましい。これにより、翻訳されるタンパク質を高レベルに維持できるという効果が得られる。２つのIRESは、いずれもHCV由来のIRESであってもよいが、少なくとも１つは外来性のIRESであることが好ましい。外来性のIRESを用いることにより、HCVゲノムの複製様式が維持されるという効果が得られる。外来性のIRESとしては、特に限定されず、例えばencephalomyocarditis virus（EMCV）由来のIRES、牛ウイルス性下痢ウイルス（Bovine viral diarrhea virus：BVDV）のIRES、ポリオウイルスのIRESなどを挙げることができるが、活性が高く頻用されているという理由で、EMCV由来のIRESが好ましい。
　本発明に係る細胞に導入されているRNAに含まれる各配列の順序の一例としては、５’末端から、HCVのIRES配列、選択マーカー遺伝子配列、外来性IRES配列、HCV ORF配列、HCV３’非翻訳配列の順序を挙げることができるが、これに限定されない。なお、HCVのIRESは５’非翻訳領域およびコアの５’側の一部とからなるRNAである。例えば、実施例において、配列番号１に示されるHCV-O株の塩基配列の第１位～第３７７位（第１位～第３４１位が５’非翻訳領域）が用いられているが、これに限定されない。
　本発明に係る細胞に導入されているRNAに含まれるHCVゲノム配列は、HCVに由来するものであればよい。HCVには、Ｃ型肝炎を引き起こすことができる病原株のみでなく、弱毒株および変異株も含まれる。また、HCVには多数の遺伝子型が存在しているが、いずれの遺伝子型のHCVに由来するものであってもよく、日本国内のＣ型肝炎患者の約７０％が１ｂ型のHCVに感染しているという観点から、１ｂであることが好ましい。
　遺伝子型１ｂのHCV株としては、HCV-O株、Ｎ株、Ｃｏｎ－１株、ＪＴ株などが知られている。本発明者らは、HCV-O株のゲノムRNAを用いて本発明に係る細胞を作製しているが、これに限定されない。なお、HCV-O株の塩基配列を配列番号１、アミノ酸配列を配列番号２に示す。
　他の実施形態において、本発明に係るHCVレプリコン複製細胞は、Li23細胞に由来する全長HCV RNA複製細胞（後述）の治癒細胞が親細胞であり、このような細胞株に対して、HCVレプリコン配列（Q1112R、K1609EおよびS2200R、またはQ1112R、P1115LおよびS2200Rの適応変異を有している）と選択マーカー遺伝子配列とを含んでいるRNAが導入されていることを特徴としている。本明細書中で使用される場合、「Li23細胞に由来する」細胞株は「Li23由来」細胞株と交換可能に用いられ、Li23細胞に由来するHCVレプリコン複製細胞または全長HCV RNA複製細胞、あるいはこれらの治癒細胞が意図される。本実施形態において用いられる親細胞としては、後述するOLc細胞（図２参照）が好ましく、OL8c細胞、OL11c細胞またはOL14c細胞がより好ましい。
　本明細書において使用される場合、「治癒細胞」は、サブゲノミックHCVレプリコンを複製する細胞または全長HCVゲノムを複製する細胞を、抗ウイルス作用を有する薬剤の存在下で培養して得られる細胞であり、サブゲノミックHCVレプリコンが完全に排除された細胞または全長HCVゲノムが完全に排除された細胞が意図される。「完全に排除された」は、細胞中にHCV RNAおよび／またはHCVタンパク質が発現していないことが意図される。当業者は、細胞中にHCV由来のRNAが含まれているか否かを、RT-PCR法、ノーザンブロット法などによって容易に確認し得、HCVタンパク質が発現しているか否かを、ウエスタンブロット法などによって容易に確認し得る。このような治癒細胞は、図２において「sOLc」、「OLc」および「ORLc」として示され、本明細書中において「Li23細胞に由来する治癒細胞」といわれ、特に「OLc」および「ORLc」は「Li23細胞に由来する全長HCV RNA複製細胞の治癒細胞」ともいわれる。
　抗ウイルス作用を有する薬剤としては、培地に添加することで治癒細胞を得られるものであれば特に限定されないが、抗HCV作用を有する薬剤が好ましい。より好ましくは、IFN、シクロスポリンＡ（CsA）などであり得、特に好ましくはIFNである。IFNとしては、IFN－α、IFN－β、IFN－γなどが挙げられる。IFNを用いた細胞の処理方法の一例としては、IFN－αを500 IU/mlの濃度で含む培地中で細胞を２週間培養する方法を挙げることができる。ただし、処理濃度、処理期間は、所望の治癒細胞が得られたか否かを確認しながら、適宜変更すればよい。
　本発明はまた、HCVレプリコン複製細胞の製造方法を提供する。一実施形態において、本発明に係る製造方法は、HCVレプリコン配列（Q1112R、K1609EおよびS2200R、またはQ1112R、P1115LおよびS2200Rの適応変異を有している）と選択マーカー遺伝子配列とを含んでいるRNAを、Li23細胞に導入する工程を包含することを特徴としている。他の実施形態において、本発明に係る製造方法は、HCVレプリコン配列（Q1112R、K1609EおよびS2200R、またはQ1112R、P1115LおよびS2200Rの適応変異を有している）と選択マーカー遺伝子配列とを含んでいるRNAを、Li23細胞に由来する治癒細胞に導入する工程を包含することを特徴としている。
　なお、本発明者らが作製した細胞は、岡山大学寄託機関である国立大学法人岡山大学知的財産本部（岡山市津島中一丁目１番１号）に寄託されており、その寄託番号は以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　また、これらの細胞は、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（305-8566　茨城県つくば市東１－１－１　つくばセンター中央第６）に平成２０年７月３１日に受託され、かつ平成２１年７月３０日に国際移管の申請が受領されており、その受領番号は以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　〔２〕全長HCV RNA複製細胞
　本発明は、全長HCV RNA複製細胞を提供する。本発明に係る全長HCV RNA複製細胞は、全長HCVゲノムが特定の細胞に導入されていることを特徴としている。本明細書中で使用される場合、「全長HCVゲノム」は、図１（ａ）に示されるHCVゲノムの全領域（C領域～NS5B領域）が含まれているRNAが意図され、「全長HCV RNA」と交換可能に用いられる。
　本発明に係る全長HCV RNA複製細胞に導入されているRNAは、選択マーカー遺伝子配列および全長HCV RNA配列を含むものであればよいが、レポーター遺伝子をさらに含むことが好ましい。これにより、簡便かつ高感度にレポーターアッセイを行うことができる。選択マーカー遺伝子としては、特に限定されないが、簡便性の観点から薬剤耐性遺伝子が好ましい。薬剤耐性遺伝子としては、特に限定されず、形質転換細胞の選択に使用可能な公知の薬剤耐性遺伝子から適宜選択すればよい。具体的には、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子）、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などを挙げることができる。全長HCV RNA配列としては、配列番号１、７、９、１１または１３に示される塩基配列が好ましいが、さらなる変異を有していてもよく、この場合の変異は適応変異に限定されない。
　本発明に係る全長HCV RNA複製細胞に導入されているRNAに必要に応じて含まれるレポーター遺伝子としては、特に限定されず、ルシフェラーゼ遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、β－ラクタマーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子などが挙げられ、ルシフェラーゼ遺伝子が好ましい。ルシフェラーゼ遺伝子としては、一般にホタル由来ルシフェラーゼ遺伝子またはウミシイタケ由来ルシフェラーゼ遺伝子が使用されているが、いずれが用いられてもよく、遺伝子の長さがより短いという点で、ウミシイタケ由来ルシフェラーゼ遺伝子が好ましい。
　本発明に係る全長HCV RNA複製細胞に導入されているRNAには、選択マーカー遺伝子を翻訳するためのIRESと、HCVのORFを翻訳するためのIRESとの２つのIRESが含まれることが好ましい。これにより、翻訳されるタンパク質を高レベルに維持できるという効果が得られる。２つのIRESは、いずれもHCV由来のIRESであってもよいが、少なくとも１つは外来性のIRESであることが好ましい。外来性のIRESを用いることにより、全長ゲノムの複製様式が維持されるという効果が得られる。外来性のIRESとしては、特に限定されず、例えばencephalomyocarditis virus（EMCV）由来のIRES、牛ウイルス性下痢ウイルス（Bovine viral diarrhea virus：BVDV）のIRES、ポリオウイルスのIRESなどを挙げることができるが、活性が高く頻用されているという理由で、EMCV由来のIRESが好ましい。
　本発明に係る全長HCV RNA複製細胞に導入されているRNAに含まれる各配列の順序の一例としては、５’末端から、HCVのIRES配列、（必要に応じて）レポーター遺伝子配列、選択マーカー遺伝子配列、外来性IRES配列、HCV ORF配列、HCV３’非翻訳配列の順序を挙げることができるが、これに限定されない。
　一実施形態において、本発明に係る全長HCV RNA複製細胞は、全長HCVゲノムがsOLc細胞に導入されている。sOLc細胞は、HCVレプリコン配列（Q1112R、K1609EおよびS2200Rの適応変異を有している）と選択マーカー遺伝子配列とを含んでいるRNAが、Li23細胞に導入されて作製されたHCVレプリコン複製細胞（sOL細胞）を、抗ウイルス作用を有する薬剤の存在下で培養して得られた細胞である（図２参照）。本実施形態に係る全長HCV RNA複製細胞は図２に示されるOL細胞であり、OL1細胞～OL14細胞が好ましく、OL8細胞、OL11細胞およびOL14細胞がより好ましい。
　他の実施形態において、本発明に係る全長HCV RNA複製細胞は、全長HCVゲノムがOLc細胞に導入されている。OLc細胞は、OL細胞を、抗ウイルス作用を有する薬剤の存在下で培養して得られた細胞である（図２参照）。本実施形態に係る全長HCV RNA複製細胞は、全長HCVゲノム配列と選択マーカー遺伝子配列とを含んでいるRNAが導入されており、図２に示されるORL細胞（Q1112R、K1609EおよびS2200Rの適応変異を有している）が好ましく、ORL8-1細胞～ORL8-9細胞およびORL11-1細胞～ORL11-16細胞がより好ましく、ORL8-9細胞（以下、ORL8細胞と称する。）およびORL11-5細胞（以下、ORL11細胞と称する。）がさらに好ましい。
　別の実施形態において、本発明に係る全長HCV RNA複製細胞は、全長HCVゲノムがORLc細胞に導入されている。ORLc細胞は、ORL細胞を、抗ウイルス作用を有する薬剤の存在下で培養して得られた細胞である（図２参照）。本実施形態に係る全長HCV RNA複製細胞は、全長HCVゲノム配列と選択マーカー遺伝子配列とを含んでいるRNAが導入されている。本実施形態に係る全長HCV RNA複製細胞は、感染性JFH１株HCVだけでなく新しいHCV株のHCV RNA複製（特にルシフェラーゼ遺伝子を有するような長いRNA（12 kb）の複製）を許容し得る細胞である。すなわち、本実施形態において用いられる全長HCVゲノム配列は、HCVのあらゆる株に由来してもよい。用いられるHCV株は、HCV-O株、1B-4株、KAH5株が好ましく、本実施形態に係る全長HCV RNA複製細胞は、1B-4RL8細胞およびKAH5RL8細胞が好ましい。なお、HCVの1B-4株の塩基配列（配列番号１１）およびアミノ酸配列（配列番号１２）、ならびにKAH5株の塩基配列（配列番号１３）およびアミノ酸配列（配列番号１４）、それぞれGenBankにACCESSION AB442219およびAB442220として登録されている。
　本発明に係る全長HCV RNA複製細胞は、全長HCVゲノムを複製し、必要に応じてレポーター遺伝子産物を発現することができる。本発明に係る全長HCV RNA複製細胞は、選択マーカー遺伝子配列および全長HCVゲノム配列（必要に応じて、さらにレポーター遺伝子配列）を含むRNAが導入された細胞で、全長HCVゲノムを複製し得るものであればよく、好ましくはレポーター遺伝子産物を発現し得るものであればよい。上記RNAがレポーター遺伝子配列を含む場合、本発明に係る全長HCV RNA複製細胞においては、レポーター遺伝子産物の発現量とHCV RNAの複製量は非常によく相関するので、レポーター遺伝子産物を定量することにより、全長HCVゲノムの複製レベルを簡便にモニタリングすることができる。また、サブゲノミックHCVレプリコンでは不可能である、構造タンパク質の影響を含めたHCVの機能解析に非常に有用である。すなわち、本発明に係る全長HCV RNA複製細胞を用いることにより、HCVの機能解析、抗HCV作用を有する物質のスクリーニングなどを簡便かつ迅速に行うことが可能となる。
　本発明はまた、全長HCV RNA複製細胞の製造方法を提供する。一実施形態において、本発明に係る製造方法は、sOLc細胞に、全長HCVゲノム配列と選択マーカー遺伝子配列とを含んでいるRNAを導入する工程を包含することを特徴としている。上記RNAはレポーター遺伝子配列をさらに含んでいてもよい。他の実施形態において、本発明に係る製造方法は、OLc細胞に、全長HCVゲノム配列と選択マーカー遺伝子配列とを含んでいるRNAを導入する工程を包含することを特徴としている。上記RNAはレポーター遺伝子配列をさらに含んでいてもよい。別の実施形態において、本発明に係る製造方法は、ORLc細胞に、全長HCVゲノム配列と選択マーカー遺伝子配列とを含んでいるRNAを導入する工程を包含することを特徴としている。上記RNAはレポーター遺伝子配列をさらに含んでいてもよい。
　〔３〕スクリーニング方法
　本発明は、抗HCV作用を有する物質をスクリーニングする方法を提供する。本発明に係るスクリーニング方法は、上述した本発明に係る細胞を候補因子とともにインキュベートする工程を包含するものであればよい。上記細胞に導入されたRNAがレポーター遺伝子配列を含んでいる場合は、レポーター遺伝子産物のレベルを測定する工程をさらに包含すればよく、上記細胞に導入されたRNAがレポーター遺伝子配列を含んでいない場合は、HCV遺伝子産物のレベルを測定する工程をさらに包含すればよい。測定したレベルは予め設けた基準値と比較されてもよいが、細胞を候補因子とともにインキュベートしない場合のレポーター遺伝子産物のレベルまたはHCV遺伝子産物のレベルを測定し、対応するレベルと比較することが好ましい。このようなスクリーニング方法を用いることにより、多数の被検物質を、簡便かつ迅速にスクリーニングすることができる。
　本発明に係るスクリーニング方法においては、抗HCV作用は、全長HCVゲノムの複製を抑制する作用である。すなわち、本発明に係るスクリーニング方法は、全長HCVゲノムの複製を抑制する作用を有している物質をスクリーニングする方法ともいえる。
　また、本発明に係るスクリーニング方法を用いれば、HCVに近縁のウイルスやHCVと同様の複製形式をとるウイルスの複製を抑制する物質のスクリーニングが可能である。HCVに近縁のウイルスとしては、フラビウイルス科のフラビウイルス属およびペスチウイルス属に属するウイルスを挙げることができる。フラビウイルス属に属するウイルスには日本脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルスなどが属し、ペスチウイルス属にはブタコレラウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルスなどが属する。
　さらに、本発明に係るスクリーニング方法を用いれば、HCVと同様の複製形式をとるウイルスの複製を抑制する物質のスクリーニングが可能である。HCVの複製の特徴は、細胞質内で複製が全て行われ、ウイルスゲノムが核内に存在することはないことである。したがって、本発明に係るスクリーニング方法により、このような複製形式をとるウイルスの複製を抑制する物質をスクリーニングすることができる。
　被検物質と細胞との接触は、被検物質を培地に溶解または懸濁することで行うことができる。したがって、被検物質は、培地に溶解または懸濁可能なものであればよい。
　レポーター遺伝子産物のレベル測定は、用いるレポーター遺伝子に応じて公知の方法から選択すればよい。例えば、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いる場合には、細胞を界面活性剤を含む緩衝液等で溶解した細胞溶解液を試料として、ルミノメーター等の機器を用いて発光量を測定すればよい。また、この際、市販のルシフェラーゼ測定用試薬やルシフェラーゼ測定用キットを好適に用いることができる。
　上記により測定したレポーター遺伝子産物のレベルを、被検物質を接触させていない細胞のレポーター遺伝子産物のレベルと比較することにより、この被検物質が抗HCV作用を有するか否かを判定することができる。なお、細胞増殖能を低下させない被検物質濃度において、被検物質を接触させていない細胞のレポーター遺伝子産物のレベルより低ければ抗HCV作用を有すると判定でき、好ましくは、少なくとも５０％以下、より好ましくは１０％以下であるときに抗HCV作用を有すると判定する。
　さらに好ましい判定基準としては、現在のＣ型慢性肝炎治療の標準的な方法であるIFN－αを本発明に係るスクリーニング方法に適用したときのレベル、またはIFN－αとリバビリンとを併用して本発明に係るスクリーニング方法に適用したときのレベルを判定基準とすることである。現在の標準的なＣ型肝炎治療法に用いられている薬剤よりHCVの複製レベルが低ければ、非常に有用なＣ型肝炎治療薬を見出すことができる。
　本発明に係るスクリーニング方法により、少なくともＣ型肝炎治療薬の有効成分の候補物質を選択することができる。また、HCV感染モデル動物はチンパンジーのみであるため、現在の状況では多数の動物を用いた薬理試験の実施は不可能であり、本発明に係るスクリーニング方法がＣ型肝炎治療薬の開発における薬効評価に必須な方法になることが期待される。
　〔４〕スクリーニングキット
　本発明は、抗HCV作用を有する物質をスクリーニングするためのスクリーニングキットを提供する。本発明に係るスクリーニングキットは、上述した本発明に係る細胞を備えていればよい。上記細胞に導入されたRNAがレポーター遺伝子配列を含んでいる場合は、レポーター遺伝子産物のレベルを測定するための試薬をさらに備えていればよく、上記細胞に導入されたRNAがレポーター遺伝子配列を含んでいない場合は、HCV遺伝子産物のレベルを測定するための試薬がさらに備えられていればよい。このようなスクリーニングキットを用いることにより、簡便かつ効率的に上記本発明に係るスクリーニング方法を実施することができる。
　本明細書中において使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。好ましくは特定の材料を使用するための使用説明書を備える。使用説明書は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、CD-ROMなどのような電子媒体に付されてもよい。
　本発明に係るスクリーニングキットには、上述した本発明に係る細胞以外のものが備えられていてもよい。このような細胞以外の具体的な構成については特に限定されず、必要な試薬や器具等が適宜選択されてキットの構成となり得る。
　本発明に係るスクリーニングキットの使用方法は、上述した本発明に係るスクリーニング方法の使用形態に準じればよいことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。
　〔５〕感染性HCV粒子の生産方法
　本発明は、感染性HCV粒子の生産方法を提供する。本発明に係る感染性HCV粒子の生産方法は、上述した本発明に係る細胞を、抗ウイルス作用を有する薬剤を含む培地中で培養して得られた細胞（「Li23細胞に由来する治癒細胞」）に感染性HCV RNAを導入する工程、または感染性HCVとともにインキュベートする工程を包含していればよい。本方法において用いられる細胞は、ORL8c細胞およびORL11c細胞が好ましいがこれらに限定されない。
　〔１：試薬および手順〕
　〔使用試薬〕
　フルバスタチンはCalbiochem社およびLKT Laboratories社より購入した。IFN－α、IFN－β、IFN－γはSigma社より購入した。シクロスポリンＡ（CsA）、ミリオシン、アセチルサリチル酸はSigma社より購入した。プラバスタチン、シンバスタチン、ローバスタチン、ゲルダナマイシンはWako chemical社より購入した。ピタバスタチンはTronto Research 社より購入した。リバビリンはYamasa 社から供与された。ミゾリビンは旭化成 社から供与された。
　〔Li23細胞〕
　ヒト肝癌細胞株であるLi23細胞の培養には、
F-12 medium (Invitrogen 11765-054)　　　500 ml
D-MEM medium (Sigma D5796)　　　　　　　500 ml 
の合計１Ｌに対して
[添加物質（Ａ群）]　　　　　　　　　　[最終濃度]
EGF (Toyobo EGF-201)　　　　　　　　　 50 ng/ml　
Insulin (Sigma I-6634)　　　　　　　　 10 μg/ml　 
Hydrocortison (Sigma H-0888)　　　　　 0.36 μg/ml　
Transferrin (Sigma T-2252)　　　　　　　5 μg/ml　
Linoleic acid (Sigma L-1012)　　　　　　5 μg/ml　 
Selenium (Sigma S-9133)　　　　　　　　20 ng/ml　
Prolactin (Sigma L6520)　　　　　　　　10 ng/ml　
FBS (Biological Industries 04-001-1A)　　1% (v/v)　
[添加物質（Ｂ群）]　　　　　　　　　　[最終濃度]
Gentamycin (Invitrogen 15750-060)　　　10 μg/ml　
Kanamycun-monosulfate (Sigma K-4000)　 0.2 mg/ml
Fungizone (IBL 33605)　　　　　　　　　0.5 μg/ml
を添加して用いた。なお、FBSは５６℃で３０分間インキュベートしたものを使用した。Li23細胞はEGF依存性の増殖を示し、HCV複製モデルに汎用されているHuH-7細胞の培地条件(10% Fetal Bovine Serum(FBS))での増殖は難しい細胞株である。HCVのサブゲノミックレプリコンまたは全長HCVゲノムを含むLi23細胞株を、0.3 mg/mlの濃度のG418(Invitrogen社)を含む培地で維持した。また、後述する治癒細胞は、G418を含まないことを除いて、同じ培養液を用いた。
　なお、Li23細胞がHuH-7細胞と同じく肝細胞の特徴を有していることを以下のように確認した。Li23細胞において、肝細胞に特異的に発現しているかまたは肝細胞にて発現量が多いと報告されている１１個の遺伝子（Aly HH et al., J. Hepatology, 46:26-36,2007）の発現を標準的なRT-PCR法によって調べ、ヒト肝癌細胞株であるHuH-7細胞、あるいはヒト子宮頸癌細胞（HeLa細胞）またはヒト胚腎臓（HEK293細胞）と比較した。その結果、Li23細胞における各遺伝子の発現レベルはHuH-7細胞とほぼ同程度であり、HeLa細胞およびHEK293細胞では各遺伝子を検出することができなかった（結果は示さず）。
　〔ノーザンブロット分析〕
　RNeasy Mini Kit (Qiagen社)を用いて、添付の実験説明書に従い、対象の細胞からトータルRNAを抽出した。波長260nmの吸光度測定により抽出したRNAを定量した。4μgのRNAを用いてHCV RNAおよびβ-actin RNAの検出を行った。すなわち、Northern Max Kit (Ambion社)を用いて、添付の実験説明書に従いRNAの特異的検出を行った。RNAサンプルを電気泳動し、ゲルをHybond-N+ ナイロンメンブレン (Amersham-Pharmacia Biotech社)にブロティングした。UVクロスリンク (Stratagene社)を行ってRNAをメンブレンに固定化し、メンブレン上の28S rRNA部分をエチジウムブロマイドで染色した。28S rRNA バンドの約1cm下でメンブレンをカットした。カットしたメンブレンの上部にはHCV RNAが含まれ、下部にはβ-actin mRNA が含まれる。HCV RNAの特異的検出のために、digoxigenine labeing kit (Roche社)を用いて、添付の実験説明書に従い、digoxigenineで標識したHCV NS5B領域に相補的なマイナス鎖リボプローブを合成して用いた。HCV RNAに特異的に結合したリボプローブの検出はアルカリホスファターゼ標識抗digoxigenine抗体を用いた。CSPD（Roche社）で反応させた後、Ｘ線フィルムに感光し、特異的なHCV RNAの検出を行った。β-actin RNAの検出も同様に行った。
　〔ウエスタンブロット分析〕
　６ウエルの細胞培養プレートで培養した細胞に、SDSを含むサンプルバッファー100μlを加えて、細胞溶解液を回収した。10分間超音波破砕機にてソニケイションを行った後、各サンプルに10μlの2-メルカプトエタノールを加え100℃で３分間処理した。10～20μlのサンプルを10％のSDS-PAGEに供し、これをメンブレン（PVDF膜）に転写した。５％のスキムミルクを含む0.1% トリス緩衝液(10mM Tris (pH7.5), 150mM NaCl, 0.1% Tween20)で６０分間、タンパク質を転写したメンブレンをブロッキングした。その後、各HCVタンパク質に対する抗体およびβ-actinタンパク質に対する抗体を0.1% トリス緩衝液で１０００倍希釈した溶液と前記のメンブレンとを接触させ、６０分間反応を行った。メンブレンを0.1% トリス緩衝液にて５分×３回洗浄後、１０００倍希釈したHRP標識マウス二次抗体を加えた0.1% トリス緩衝液と接触させ、６０分間反応を行った。メンブレンを0.1% トリス緩衝液にて２０分×３回洗浄した。ルネッサンスTMルミノールウエスタンブロット化学発光検出試薬プラス（NEN Life Science）にて化学発光させ、Ｘ線フィルム（KODAK BioMax）で感光した。
　今回の実験で用いた抗体は、抗Core抗体（Institute of Immunology社）、抗E1抗体(東京都臨床研究所、小原博士より供与)、抗E2抗体（参考文献：Microbiol.Immunolo. 42,875-877,1998を参照）、抗NS3抗体（Novocastera Laboratories社）、抗NS4A抗体（大阪大学、高見沢博士より供与）、抗NS5A抗体（大阪大学、高見沢博士より供与）、抗NS5B抗体(東京都臨床研究所、小原博士より供与)、抗β-actin抗体(Sigma社)である。
　〔プラスミドの構築〕
　プラスミドpON/C-5B は、HCVのIRES（Internal ribosomal entry site）の下流にネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ（Neo）、およびEncephalomyocarditis virus（EMCV）のIRESの下流に全長HCV-Oタンパク質をコードする配列を含む。
　最初に、HCV陽性血清より遺伝子型１b型のHCV-O全長cDNAを含むプラスミドpHCV-Oを、２つのフラグメントを用いて構築した。２つのフラグメントとは、参考文献（Kato et al. J.Gen.Virol.79: 1859-1869(1998)）に記載のpBR322/16-6に由来するEcoR I－Mlu Iフラグメント（HCVゲノムの45位－2528位に相当）および血清1Β－2のPCR産物由来のMlu I－Spe Iフラグメント（HCVゲノムの2528位－3420位に相当）である。これらを、1Β－2R1配列を有するpNSS1RZ2RU（非特許文献２を参照）のEcoR I－Spe I サイトにライゲートし、pHCV-Oを構築した。
　pON/C-5Bを構築するためのフラグメントを得るために、オーバーラッピングPCRを用いて、EMCVのIRESとコアタンパク質をコードする配列とを融合した。得られたDNAをRsr IIおよびCla I で消化し、これをpNSS1RZ2RUのXba I－Rsr IIフラグメントと共に、pHCV-OのCla I－Xba I サイトにライゲートすることで、pON/C-5Bを構築した。
　プラスミドpON/3-5Bの構築は、非特許文献２に詳細に記載されている。すなわち、sO細胞より抽出したRNAを非特許文献２に記載されているように、HCV-O遺伝子の3474位-9185位に相当する領域をRT-PCR法で増幅しこれをpNSS1RZ2RUのSpe I-Bsiw Iサイトにライゲートして、pON/3-5Bを構築した。
　さらに、Ikedaらの方法（非特許文献４を参照）に従い、QuickChange mutagenesis（Stratagene）を用いて、pON/3-5BにQ1112R、K1609EおよびS2200Rの変異またはQ1112R、P1115LおよびS2200Rの変異を導入し、pON/3-5B/QR,KE,SRまたはpON/3-5B/QR,PL,SRを構築した。さらに、pON/C-5B にそれぞれQ1112R、K1609EおよびS2200Rの変異またはQ1112R、P1115LおよびS2200Rの変異を導入し、pON/C-5B/QR,KE,SRまたはpON/C-5B/QR,PL,SRを構築した。また、プラスミドpORN/C-5B/ QR,KE,SRは、Renilla （ウミシイタケ）luciferase遺伝子 (Promega)のPCR産物を、pON/C-5B/ QR,KE,SRにおけるNeo遺伝子の上流のAsc Iサイトに導入することにより構築した。なお、上記各プラスミドは、挿入遺伝子の5’側にT7プロモーター配列を含んでいる。
　〔RNA合成〕
　プラスミドDNAをXba I で切断して線状化し、T7 MEGAscript Kit (Ambion社)を用いて、添付の実験説明書に従い、RNAの合成を行った。塩化リチウムで沈澱させた後、RNAを75％エタノールで洗浄し、RNaseフリー水で溶解した。
　〔HCV RNAの定量〕
　HCV RNA複製細胞から、RNeasy Mini Kit (Qiagen社)を用いて、添付の実験説明書に従い、トータルRNAを抽出した。はじめに、２μgのRNAを鋳型として、SuperScriptTMII 逆転写酵素 (Invitrogen社)および下記のプライマー319Rを用いて添付の実験説明書に従い、逆転写反応（RT）を行った。得られたcDNAを鋳型としてリアルタイムLightCycler PCRによるHCV RNAの定量を行った。リアルタイムLightCycler PCRは、下記のプライマー104および197Rを用いて、本発明者らが以前に報告した方法（参考文献：Acta Med. Okayama 56,107-110,2002）に基づいて実施した。
319R: 5'-TGCTCATGGTGCACGGTCTA-3'（配列番号１５）
104:　5'-AGAGCCATAGTGGTCTGCGG-3'（配列番号１６）
197R: 5'-CTTTCGCGACCCAACACTAC-3'（配列番号１７）。
　〔ルシフェラーゼレポーターアッセイ〕
　Renilla Luciferase Assay System (Promega社)を用い、添付の実験説明書に従って細胞を回収し、ウミシイタケルシフェラーゼの定量を行った。
　〔２：HCVゲノム〕
　図１は、ＨＣＶゲノムの構成、サブゲノミックＨＣＶレプリコン細胞に導入されるＲＮＡの構成、全長ＨＣＶゲノム複製細胞に導入されるＲＮＡの構成、およびルシフェラーゼ遺伝子産物を発現する全長ＨＣＶゲノム複製細胞に導入されるＲＮＡの構成を示す模式図である。
　図１（ａ）に、HCV-O株（1b遺伝子型）を示す。HCVゲノムは約9.6kbからなる＋鎖の一本鎖RNA（配列番号１）であり、全体の90%は１つの大きなORFを有しており、約3,000アミノ酸からなるポリプロテイン（配列番号２）を産生する構造になっている。このポリプロテインは宿主のプロテアーゼによりp7までの前半部がプロセッシングを受け、残りの部分はNS2とNS3にコードされている２種類のプロテアーゼによりプロセッシングを受け、少なくとも10種類のウイルスタンパク質が最終的に産生される。E2までの領域はウイルス粒子を形成する構造領域、NS2～NS5Bについては非構造領域と呼ばれている。HCV RNAの複製に必須の領域はコアの最初の12アミノ酸をコードする領域を含んだ5’非翻訳領域（HCV IRES）とNS3～NS5Bまでの領域および3’末端領域であることがわかっている。HCV-O株は国内の患者の７０％程度を占める1b遺伝子型に属するHCV株であり、ヘルシーキャリアー（HCVに感染しているが、肝機能が正常）から単離されたものである。
　本発明において使用したRNAを図１（ｂ）～図１（ｅ）に示す。図１（ｂ）に、NS3領域の２種類の適応変異（Q1112RおよびK1609E）とNS5A領域のS2200R適応変異が導入された、HCV-O株由来のHCVレプリコンRNA（ON/3-5B/QR,KE,SR）を示す。また、K1609Eの代わりにP1115Lの適応変異を導入されたHCV-O株由来のHCVレプリンコンRNA（ON/3-5B/QR,PL,SR）もこの構造を有している。図１（ｃ）に示す全長HCV RNA（ON/C-5B/QR,KE,SR）は、レプリコン（ON/3-5B/QR,KE,SR（図１（ｂ））のEncephalomyocarditis virus(以下EMCV) のInternal ribosomal entry site (以下IRES)とNS3の間に、HCV-O株由来のC（コア）～NS2までを挿入したものであり、本来のHCVゲノムより1.4 kb長い構造（全長11kb）を有している。また、図１（ｄ）に示すRNA（ORN/C-5B/QR,KE,SR）は、全長HCV RNA（ON/C-5B/QR,KE,SR（図１（ｃ））のHCV IRESとNeoR遺伝子の間にRenilla（ウミシイタケ）ルシフェラーゼ遺伝子（RL遺伝子）を挿入し、融合タンパク質として産生されるように改変したものであり、本来のHCVゲノムより2.4 kb長い構造（全長12kb）を有している。RL遺伝子を有していることにより、RL活性を測定することによってHCV RNAの複製レベルを定量することができる（この測定をレポーターアッセイと称する。）。図１（ｅ）に示すHCV RNA（JFH1）は，本来のHCVゲノムの構造を有しており、劇症肝炎患者由来のJFH-1株(2a遺伝子型)由来の感染性HCV RNAである。
　以上の５種類のRNAを、これらRNA配列を含むプラスミド(pON/3-5B/QR,KE,SR; pON/3-5B/QR,PL,SR; pON/C-5B/QR,KE,SR; pORN/C-5B/QR,KE,SR; pJFH1)を制限酵素XbaIで切断して直鎖状にした後、T7 MEGAscript (Ambion)を用いたin vitro合成によって得た。なお、全長JFH1のcDNAを含むプラスミドとして、財団法人東京都医学研究機構より研究材料提供契約書に基づいて供与されたものを用いた。
　〔３：HCVレプリコン複製細胞株〕
　〔３－１〕細胞株の作製
　pON/3-5B/QR,KE,SRまたはpON/3-5B/QR,PL,SRからin vitroにて合成したRNA 10μgを、非特許文献２に記載の方法に従ってLi23細胞（8 x 106 個）に導入した。導入２日後に、G418(0.3mg/ml)およびNaHCO3(0.15%)を含む培地に交換した。その後、４日ごとに培地交換を行い、３週間培養した後に、レプリコンRNAの複製が持続的に高いレベルを示す細胞をG418耐性コロニーとして得た。得られたコロニーの一部（プレート１枚）を Coomassie brilliant blue (CBB)にて染色した。なお、同様のレプリコンRNA導入実験を、他のヒト肝癌細胞株（HuH-6, Li21, Li24）、ヒト不死化肝細胞株（PH5CH, OUMS29, IHH10.3, IHH12）、ヒト胆管癌細胞株（HuH28）などを用いて行ったが、G418耐性の細胞コロニーを全く得ることができなかった（結果は示さず）。また、RNAを導入しない場合のLi23細胞は培地に含まれるG418により完全に死滅した（結果は示さず）。
　得られたG418耐性細胞内におけるHCVタンパク質の発現レベルをウエスタンブロット法により解析した。NS5A抗体とNS5B抗体を用いて、それぞれNS5AとNS5Bタンパク質を常法に従って、検出した。非特許文献２にて本発明者らが報告したsO細胞（HCV-O株由来のレプリコンRNAが効率よく複製している、HuH-7細胞由来細胞）を比較のため用いた。解析に用いたタンパク質量を知るために、β－アクチン抗体によりβ－アクチンの検出も並行して行った。図３（ａ）は、ON/3-5B/QR,KE,SRのRNAを導入して得られた細胞がON/3-5B/QR,PL,SRのRNAを導入して得られた細胞より圧倒的にNS5AやNS5Bタンパク質の発現レベルが高いことを示す。また、ON/3-5B/QR,KE,SRの場合、クローン化した細胞よりもコロニーをプールした細胞の方の発現量が高いことが分った。全長HCV RNA複製細胞株を樹立することが目的であることから、この段階では細胞クローンの選択は行わず、プールした細胞（ON/3-5B/QR,KE,SR(pool)）をsOL細胞として次のステップに使用した。
　〔３－２〕細胞株の薬剤感受性
　HuH-7細胞由来の細胞を用いた場合に抗HCV活性があると報告されている薬剤に対して、sOL細胞内のHCVレプリコンが感受性を示すかどうかを調べた。また、これらの薬剤で処理することにより全長HCV RNA複製細胞を作製する際に必要と考えられるsOL細胞の治癒細胞（HCV RNAの複製に適した細胞内環境を有する事が期待される細胞）を作製することが可能かどうかを合わせて検討した。なお、HuH-7細胞由来のsO細胞を、sOL細胞における効果と比較するために実験に用いた。
　６ウエルプレートに1 x 105個の細胞を播種し、24時間後に各種薬剤を添加した。IFN－α, IFN－β,およびIFN－γについてはそれぞれ20 IU/ml、フルバスタチン（ＦＬＶ）は5μM、シクロスポリンＡ（CsA）は0.5μg/mlの終濃度になるように添加した。添加５日後にそれぞれの細胞内のNS5Bタンパク質の発現レベルをウエスタンブロット法により解析した。図３（ｂ）に示すように、sOL細胞は各種抗HCV剤に対してsO細胞とほぼ同程度の感受性を示すことが分った。従って、これらの薬剤で処理することによりsOL細胞の治癒細胞が得られるものと考えられた。
　〔４：全長HCV RNA複製細胞株〕
　〔４－１〕細胞株の作製
　G418非存在下でsOL細胞にIFN－γ(103 IU/ml)を4日ごとに５回添加し、細胞内からHCV-O株レプリコンRNAを排除した治癒細胞sOLcを得た。なお、HCV RNAが存在していないこと、およびHCV ゲノムがコードするタンパク質が発現していないことによって、治癒細胞であることを確認した。
　pON/C-5B/QR,KE,SRからin vitroにて合成したRNA 2 μgまたは4 μgを、非特許文献２に記載の方法に従ってsOLc細胞（8 x 106 個）に導入した。導入２日後に、G418(0.3mg/μl)およびNaHCO3(0.15%)を含む培地に交換した。その後、４日ごとに培地交換を行い、３週間培養した。いずれのRNA量の場合もG418耐性コロニーが得られた（結果は示さず）。得られたコロニーの一部（プレート１枚）をCBBにて染色した。染色されたコロニーの数を測定して1μg RNAあたりのコロニー形成率を算出した結果、約100コロニー/μg RNAと計算された。G418による薬剤選択が完全でない可能性とわずかな量のHCV-O株レプリコンが残存している細胞が存在している可能性があるため、クローン化のために大きなコロニーを選択し、全長HCV RNAの複製が持続的に高いレベルを示す細胞をG418耐性コロニーとして得た（OL1～OL14）。LightCycler PCRによる細胞内HCV RNAの定量比較により、上位３クローン（OL8細胞、OL11細胞およびOL14細胞）を選択し、これらのクローンを用いてHCVタンパク質の検出やHCVの遺伝子解析を行った（図４）。残りのコロニーは200個ほどであったので、これらのコロニーは混ぜて、OL(pool)細胞として以後の解析に使用した。なお、OL細胞内で11 kbの全長HCV RNAが複製しており、8 kbのレプリコンRNAが残存していないことを、全てのOL細胞クローンおよびOL(pool)細胞にて確認した（結果は示さず）。また、各種HCVタンパク質に対するウエスタンブロットの結果より、OL8, OL11およびOL14細胞では、O細胞より低いものの、種々な実験に使用するのは十分と思われる程度のタンパク質を発現していることを確認した（図５）。なお、OL14細胞では、OL8細胞またはOL11細胞よりもHCVタンパク質の発現レベルが低かった。また、HCV 5’UTRについてのＰＣＲを行うことによって、OL8細胞、OL11細胞およびOL14細胞にはHCVゲノムが宿主DNAに組み込まれていないことも確認した（結果は示さず）。
　続いて、全長HCV RNAを複製するOL8細胞においてHCV RNAの複製中間体である二本鎖RNA（dsRNA）を検出するために、抗dsRNA抗体を用いた免疫蛍光法によってOL8細胞を観察した。陽性コントロールとしてO細胞、陰性コントロールとしてLi23細胞を用いた。
　コラーゲンコートしたカバースリップ上に播種した後４日間培養した細胞を、3%パラホルムアルデヒドを含むPBS溶液にて室温で固定し、さらに0.1% Triton X-100で処理して透過性を有する細胞を作製した。1% (v/v)牛血清アルブミン（BSA）で処理した後、細胞を抗dsRNA抗体（K1:English and Scientific Consulting社；１次抗体）、引き続いてCy2-conjugated 抗マウス抗体（Jackson Immuno Research, West Grove社；２次抗体）で処理した。細胞の核を、4’,6-diamidino-2-phenylindole（シグマ社）で染色した。カバースリップをPermaFluor Aqueous Mountant（ThermoFisher社）を用いてグラススライド上に配置し、共焦点レーザー走査顕微鏡（LSM510;Carl Zeiss社）下で観察し、そして撮影した。結果を図６に示す（図中、バーの長さは20μmである。）。
　観察の結果、図に示すように、OL8細胞とO細胞において、細胞質全体に散在する小さなドット状の蛍光が観察されたが、Li23細胞ではこのような蛍光は全く観察されなかった。OL8細胞において、O細胞と同様に、複製中間体である二本鎖RNAが検出されたことは、OL8細胞内でHCV RNAが効率良く複製している証拠であると考えられる。
　〔４－２〕細胞株の薬剤感受性
　OL8細胞、OL11細胞およびOL14細胞における全長HCV RNAの複製がIFN－αにより抑制されるかどうかをコロニーアッセイ法により調べた。外径10 cm のディッシュに1 x 104個の細胞を播種し、IFN－α (0, 50, 100または200 IU/ml)を４日ごとに添加しながら、２５日間G418 (0.3 mg/ml)存在下で培養した。G418抵抗性として出現したコロニーをCBB溶液にて染色した（図７）。OL8細胞やOL11細胞ではいくらかG418耐性を示す細胞コロニーが得られたが、コントロールとして用いたO細胞の場合と同じくらいであった。OL14細胞からはG418耐性の細胞コロニーは得られなかった。以上の結果、OL8細胞、OL11細胞およびOL14細胞内での全長HCV RNAの複製はO細胞の場合と同様にIFN－αに高感受性を示すことが示された。
　〔４－３〕細胞株におけるHCVの遺伝子解析
　さらに、OL8細胞、OL11細胞およびOL14細胞内で複製している全長HCV RNAは導入した３種類の適応変異（Q1112R, K1609EおよびS2200R）以外に新たな適応変異が生じているかどうかを調べた。各細胞からTotal RNAを調製して、非特許文献７に記載のRT-PCR法に従って、全長HCV RNAを増幅した（5’UTR～NS2までの前半部5.1 kbとNS3～NS5Bまでの後半部6 kb）。前半部の増幅におけるRT primerは290ROKを、PCRには21XとNS3RXOKのprimer setを使用した。後半部の増幅におけるRT primerは386Rを、PCRにはNS2XOKと9388RXのprimer set を使用した。RTにはPrimscript (Takara)、PCRにはKOD-plus DNA polymerase (Toyobo)を用いた。増幅産物をプラスミドベクター(pBR322MC)に挿入し、挿入部分の塩基配列を決定して、最初に細胞に導入したON/C-5B/QR,KE,SRの塩基配列と比較した（図８）。
　その結果、以下の点が明らかとなった。なお、図には示していないが、解析した９クローンの5’UTR(341塩基)の塩基配列には変異は認められなかった。
（１）最初に導入されていたQ1112R、K1609EおよびS2200Rの変異は解析した計９クローン（各細胞３クローンずつ）内に保存されていた。
（２）HCV RNAの複製に必須なNS3～NS5B領域に各細胞由来の３クローンに保存されたアミノ酸置換を伴う新たな変異は１カ所もなかった。すべてクローン特異的に生じた変異であった。NS3～NS5B領域の１クローンあたりの変異数はOL8細胞で１カ所、OL11細胞で1.3カ所、OL14細胞で2.6カ所と低値であった。NS3～NS5B領域で検出されたクローン特異的変異(Q1067R, K1397R, I1612M, V1864A, V1929L, E1937D, C1968W, T1989S, T2169A, L2171P, P2322L, T2332A, S2380PおよびW2404R)はこれまで報告されている適応変異には該当しなかったが、OL14細胞のclone3において検出されたQ2933Rは弱い適応変異（1.6倍複製レベルが上昇）であることが以前の報告(Lohmann et al., JVI, 77:3007-3019,2003)で示されている。従って、OL細胞における全長HCV RNAの複製にはQ1112R、K1609EおよびS2200Rの変異が必要であり、新たな適応変異は必要ないと考えられた。
（３）一方、コア～NS2領域においては、比較的多くの変異が観察された。OL11細胞では３クローンに共通のアミノ酸置換を伴う変異(V333A)がE1領域に検出された。OL8細胞では３クローンに共通の変異は検出されなかったが、３クローン中２クローンで検出された変異が４カ所（E1領域のA351PとS362P、E2領域の462VとV709A）認められた。コア～NS2領域の１クローンあたりの変異数はOL8細胞で5.3カ所、OL11細胞で4カ所、OL14細胞で4カ所とNS3～NS5B領域と比較すると高値であった。従って、この領域はHCV RNAの複製に必須ではないことが示唆された。
　さらに、OL8細胞、OL11細胞およびOL14細胞由来のそれぞれ３クローンについてHCV polyprotein内の塩基配列およびアミノ酸配列を使用してGENETYX-MAC (Software Development)にてNeighbour-joining解析を行い、親クローンであるON/C-5B/QR,KE,SRを基にした遺伝的系統樹を作成した（結果は示さず）。塩基配列およびアミノ酸配列のどちらのレベルにおいても似たような系統樹となったが、OL14細胞は、遺伝的にも独立したクラスターを形成しなかった。上述したように、OL14細胞では、HCVタンパク質の発現レベルが他の２種類の細胞よりかなり低かったので、以後の解析にはOL8細胞とOL11細胞を使用した。
　〔５：レポーター遺伝子を有するHCVレプリコンRNAまたは全長HCV RNAを複製し得る細胞株〕
　〔５－１〕細胞株の作製
　JFH-1株HCV感染実験に使用するために必要な治癒細胞を、OL細胞の上記３クローン（OL8細胞、OL11細胞およびOL14細胞）とともに、３クローン以外のいくつかのクローン（OL細胞）に対して、G418非存在下でIFN－γ(103IU/ml)を4日ごとに５回添加して治癒細胞OLcを作製した。4-5x105個程度のOL8細胞およびOL11細胞を外径10 cmのディッシュに播種し、IFN－γ(103IU/ml)を４日ごとに４回添加した。細胞がディッシュに一杯になった場合には適時継代した。４回目のIFN－γ添加後の継代時に細胞を２群のディッシュに分け、１群には培地にG418 (0.3 mg/ml)およびNaHCO3(0.15%)を添加した。もう一群には培地のみで培養を継続した。その後、両群にIFN－γを一回添加し、４日以上培養を続けた後CBB染色を行った。その結果、G418を添加しない培地で培養を続けた細胞はディッシュ一杯に増殖した。しかし、G418を添加した培地で培養を続けた場合は、細胞が完全に死滅した（結果は示さず）。
　さらに、OL8c細胞またはOL11c細胞を用いて、レポーター遺伝子を有するHCV RNA（レプリコンまたは全長）を複製し得る細胞株を作製した。pORN/3-5B/QR,KE,SRおよびpORN/C-5B/QR,KE,SRからin vitroにて合成したRNA 10 μg (ORN/3-5B/QR,KE,SR)または20 μg (ORN/C-5B/QR,KE,SR) を、非特許文献２に記載の方法に従ってOL8c細胞またはOL11c細胞（それぞれ8 x 106 個）に導入した。導入２日後に、G418 (0.3 mg/ml)およびNaHCO3(0.15%)を含む培地に交換した。その後、４日ごとに培地交換を行い、２～３週間培養した。
　ORN/3-5B/QR,KE,SR（レプリコンRNA）を導入した場合、OL8cおよびOL11c細胞ではG418耐性細胞によってディッシュが２週間で一杯になった（図９）。全体では数万種類のコロニーからなるものと推定されたため、クローン化することなくG418耐性細胞をそれぞれ混合して、レポーター遺伝子を有するレプリコン複製細胞（それぞれsORL8(pool)細胞およびsORL11(pool)細胞）とした。これらの細胞におけるルシフェラーゼ活性を測定すると、2 x 105個あたりの実測値として8 x 105と15 x 105の値が得られた（Promega社のアッセイキット）。これにより、いずれの細胞も抗HCV剤の活性評価に十分使えるレベルであることが分った。また、通常の継代用培地（G418存在下）を用いた場合の細胞の倍加時間は53時間と40時間と算定された。さらに、これらの細胞に存在するレプリコンRNAの宿主DNAへの組み込みはないことを確認した（結果は示さず）。
　ORN/C-5B/QR,KE,SR（全長HCV RNA）を導入した場合、導入後３週間程度たってもG418耐性コロニーの出現数は少なく、OL8c細胞からは約30個程度、OL11c細胞では約400個程度のコロニーが得られた。OL8c細胞からは９個の細胞コロニーをクローン化（ORL8-1～ORL8-9）し、OL11c細胞からは16個の細胞コロニーをクローン化(ORL11-1～ORL11-16)した（図９）。OL11c細胞におけるクローン化していない残りの細胞コロニーを混合してORL11(pool)細胞とした。ORL11(pool)細胞におけるルシフェラーゼ活性を測定すると、7 x 105という値が得られた（Promega社のアッセイキット）。これにより、この細胞も抗HCV剤の活性評価に十分使えるレベルであることが分った。また、通常の継代用培地（G418存在下）を用いた場合の細胞の倍加時間は44時間と算定された。さらに、この細胞に存在するHCVゲノムの宿主DNAへの組み込みはないことを確認した（結果は示さず）。
　さらに、ウエスタンブロットによって、ORL11(pool)細胞におけるHCVのコアタンパク質の発現レベルを調べたところ、ORL11(pool)細胞におけるコアタンパク質はOR6細胞と比較するとその発現レベルはかなり低いということが示唆された。この結果から、発現量の高いクローン細胞の選択が必要であると考えられた。
　RL遺伝子を有する全長HCV RNAの複製が持続的に高いレベルを示す細胞をG418耐性コロニーとして得た（図１０（ａ）および図１０（ｂ））。具体的には、LightCycler PCRによる細胞内HCV RNAの定量比較により、上位クローン（ORL8-9細胞およびORL11-5細胞）を選択した（それぞれ、ORL8細胞およびORL11細胞と称する。）。このような両細胞のルシフェラーゼレポーターアッセイは各種抗HCV剤の探索評価に有用と考えられる。
　〔５－２〕細胞株におけるHCVの遺伝子解析
　先ず、ORL8細胞内で複製しているレポーター遺伝子を含む全長HCV RNAに最初から導入されている３種類の適応変異（Q1112R, K1609EおよびS2200R）以外に新たな適応変異が生じているかどうかを調べた。ORL8細胞からTotal RNAを調製して、非特許文献７に記載のRT-PCR法に従って、全長HCV RNAを増幅した（5’UTR～NS2までの前半部6.2kbとNS3～NS5Bまでの後半部6.1 kb）。前半部の増幅におけるRT primerは290ROKを、PCRには21XとNS3RXOKのprimer setを使用した。後半部の増幅におけるRT primerは386Rを、PCRにはNS2XOKと9388RXのprimer set を使用した。RTにはPrimscript(Takara)、PCRにはKOD-plus DNA polymerase(Toyobo)を用いた。増幅産物をプラスミドベクター(pBR322MC)に組み込み、挿入部分の塩基配列を決定し、最初に細胞に導入したORN/C-5B/QR,KE,SRの配列との比較した（図１１）。その結果、以下の点が明らかとなった。
（１）最初から導入されていたQ1112R、K1609EおよびS2200Rの変異は、解析した３クローン内に保存されていた。
（２）塩基配列を決定した5’UTRからNS5B領域までにおいて、３クローンに保存されたアミノ酸置換を伴う新たな変異は検出されなかった。アミノ酸置換を伴う新たな変異（clone 1で４カ所；clone 2で８カ所；clone 3で４カ所）はすべて解析したクローン特異的なものであった。従って、ORL8細胞におけるレポーター遺伝子を有する全長HCV RNAの複製にはQ1112R、K1609EおよびS2200Rの変異が必要であり、新たな適応変異は必要ないものと考えられた。
（３）アミノ酸置換を伴う変異はNS3～NS5B領域と比較してコア～NS2領域において多くなっていた。この現象は、全長HCV RNA複製細胞であるOL8細胞、OL11細胞およびOL14細胞の結果と同じ傾向であった。
（４）NS3～NS5B領域で検出されたクローン特異的変異のW1558RとL2335Mはこれまで報告されている適応変異には該当しなかった。
　次に、ORL11細胞内で複製しているレポーター遺伝子を含む全長HCV RNAに最初から導入されている３種類の適応変異（Q1112R, K1609EおよびS2200R）以外に新たな適応変異が生じているかどうかを、ORL8細胞の場合と同様に調べた（図１２）。その結果、以下の点が明らかとなった。
（１）ORL8細胞の場合と同じく。最初から導入されていたQ1112R、K1609EおよびS2200Rの変異は、解析した３クローン内に保存されていた。
（２）塩基配列を決定した5’UTR～NS5B領域までにおいて、３クローンに保存されたアミノ酸置換を伴う新たな変異は検出されなかった。アミノ酸置換を伴う新たな変異（clone 1で４カ所；clone 2で６カ所；clone 3で４カ所）はすべて解析したクローン特異的なものであった。従って、ORL11細胞におけるレポーター遺伝子を有する全長HCV RNAの複製にもQ1112R、K1609EおよびS2200Rの変異が必要であり、新たな適応変異は必要ないものと考えられた。
（３）アミノ酸置換を伴う変異はNS3～NS5B領域と比較してコア～NS2領域において多くなっていた。この現象は、ORL8細胞や全長HCVRNA複製細胞であるOL8細胞、OL11細胞およびOL14細胞の結果と同じ傾向であった。
（４）NS3～NS5B領域で検出されたクローン特異的変異のG1041S、I1842MおよびL2347Iはこれまで報告されている適応変異には該当しなかった。
　〔５－３〕細胞株の性状解析
　ORL8細胞、ORL11細胞およびOR6細胞を24ウエルプレートのそれぞれ３ウエルに2 x 104個ずつ播種し（培地1ml：G418、FungizoneおよびNaHCO3を加えていないアッセイ用培地）、４日間培養した後、ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、ORL8細胞では平均1 x 106、ORL11細胞では平均 2 x 106、OR6細胞では平均 2 x 106の実測値が得られた（結果は示さず）。このレベルの値が得られたことから、抗HCV剤添加後の効果を調べる実験に十分な値と考えられた。コントロールとして用いたOL8c細胞およびOL11c細胞では100程度の数値であった。
　細胞の倍加時間を調べるために、ルシフェラーゼ活性を測定する上記アッセイ系と同じ条件下で細胞を播種し、24、48、72および96時間後の細胞数をトリパンブルー染色法にて測定した。各点、３ウエルずつ測定してその平均値を算出し、対数増殖期における倍加時間を測定した。比較対照のため、OR6細胞についても同様の方法により細胞数を調べ、その結果、細胞の倍加時間としてORL8細胞では23時間、ORL11細胞では26時間、OR6細胞では34時間という結果を得た（結果は示さず）。
　ウエスタンブロット解析によって、ORL8細胞およびORL11細胞における各種HCVタンパク質（コア、E1、E2、NS3、NS4A、NS5AおよびNS5B）の発現レベルをOR6細胞のものと比較した（図１３）。コントロールとして、治癒細胞であるOL8c細胞、OL11c細胞、ORL8c細胞およびORL11c細胞についても同時に解析した。解析に用いたタンパク質量を確認するために、β－アクチン抗体によりβ－アクチンの検出も行った。ORL8細胞およびORL11細胞では、各種HCVタンパク質の発現レベルがOR6よりもかなり低いレベルであったが、各種解析に用いるには十分の発現量であると判断された。OR6細胞より発現レベルが低いという結果は、ORL8やORL11細胞内のHCV RNA量もOR6細胞（＞1x 107 copies/mg total RNA）より低い値であったこと（図１０の（ａ）および（ｂ））と一致する結果であった。
　〔５－４〕細胞株の薬剤感受性
　ORL8およびORL11細胞が、OR6細胞（特許文献１参照）と同様に、薬剤の効果を簡便に評価できる細胞系であるかどうかを解析した。OR6細胞は、特許文献１に示したように、細胞由来のルシフェラーゼ活性値がHCV RNA量と相関していて、薬剤の効果を簡便に評価できる細胞系である。
　結果を図１４に示す。左は、ORL8細胞およびORL11細胞（それぞれ2 x 104個の細胞を24ウエルプレートに播種して１日間培養）にIFN－α 0, 1, 10, 100 IU/mlを添加して24時間後にルシフェラーゼ活性を測定したものである。各点に関して少なくとも３ウエル実施し、SD値を図に付加した。100%の実測値として、ORL8細胞では40万、ORL11細胞では50 万という値を得た。右は、ORL8細胞およびORL11細胞（それぞれ2 x 105個の細胞を6ウエルプレートに播種し２日間培養）にIFN－α 0, 1, 10, 100 IU/mlを添加して24時間後にHCV RNAをLightCyclerPCRにより定量的に測定したものである。各点に関して少なくとも３ウエル実施し、SD値を図に付加した。図に示すように、ルシフェラーゼ活性とHCV RNA量とはIFN－αの濃度に依存して減少し、両測定法による結果は、OR6細胞で得られた結果と同様に良好な相関性を示していた。このように、ORL8細胞およびORL11細胞は、簡便なルシフェラーゼアッセイを用いてHCV RNAの複製レベルを定量できる有用な細胞であることが示された。
　OR6細胞において、経時的なウイルス効果が確認されている（Naka et al., BBRC,330:871-879,2005）。ORL8細胞およびORL11細胞についても同様のウイルス効果が確認される否かを検討した（図１５）。2 x 104個の細胞を24 ウエルプレートに播種し、24時間後に所定量のIFN－α（0, 1, 10, 100 IU/ml）を添加し、それぞれについて24時間、48時間および72時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。IFN－αの希釈には、別途調製した10% FBSを含むLi23細胞用培地を用いた。また、各点について３サンプルからの結果に基づいてSD値を算出した。
　IFN－αを添加してから24時間後のルシフェラーゼの値をそれぞれ100とすると、1 IU/mlのIFN－αを添加した場合は、48時間後までは変動がなく72時間後ではORL8細胞ではやや上昇、ORL11細胞では明らかな再上昇が認められた。この結果は、これらの細胞内でのHCV RNAの複製レベルが高いことを示している。しかし、10 IU/mlや100 IU/mlのIFN－αで処理した場合、72時間後も明らかな再上昇は認められなかった。また、図には示していないが、IFN－α添加24時間後においても、すでにルシフェラーゼ活性が低下しており、IFN－αの強い抗HCV効果が認められた。ルシフェラーゼ活性の実測値としてORL8細胞では380,000（IFN－α無添加の場合）、113,000（1 IU/mlのIFN－α添加）、36,000（10 IU/mlのIFN－α添加）、19,000（100 IU/mlのIFN－α添加）の値が得られた。1 IU/mlのIFN－αを添加した72時間後のルシフェラーゼ活性は無添加の場合の50%以下となっているので、EC50（50%になる有効薬剤濃度）は1 IU/ml以下と推定される。ORL11細胞の場合もORL8細胞と同じように、IFN－α無添加の場合は750,000、1 IU/mlのIFN－α添加の場合は300,000、10 IU/mlのIFN－α添加の場合は76,000、100 IU/mlのIFN－α添加の場合は27,000という値が得られ、この場合も1 IU/mlのIFN－αを添加した72時間後のルシフェラーゼ活性は無添加の場合の50 %以下となっているので、EC50（50%になる有効薬剤濃度）は1 IU/ml以下と推定される。
　このように、少なくともIFN－αに関して、ORL8細胞およびORL11細胞はOR6細胞と同様に、薬剤添加72時間後のルシフェラーゼ活性を測定するだけでHCV RNA複製レベルをモニタリングし得る簡便なアッセイ系になり得ることが示唆された。
　〔５－５〕各種薬剤による抗HCV効果
　これまでに抗HCV活性が報告されている薬剤について、ORL8細胞またはORL11細胞のアッセイ系を用いた評価を行った。コントロールとしてOR6細胞のアッセイ系を用いた。なお、化合物によっては溶剤としてDMSOまたはエタノールを用いる必要があるが、DMSOは０．５％以下、エタノールは０．２～０．２５％の濃度であれば上記アッセイ系に影響が出ないことを予め確認した（データは示さず）。
　(A) IFN－α
　各細胞にIFN－α（0, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 10 IU/ml：Sigma社,I2396）を添加し、72時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。解析の結果、ORL8細胞、ORL11細胞およびOR6細胞におけるEC50はそれぞれ0.13 IU/ml、O.30 IU/mlおよび0.40 IU/mlと算定された。同様の実験をさらに３回行ったが、ほぼ同じような値が得られ再現性は良好であった。IFN－αについては、ORL8細胞の感受性が高く、ORL11細胞、OR6細胞の順であった。代表的な結果を図１６に示す。
　なお、IFN－αの添加により生じるルシフェラーゼ活性の減少が、IFN－αによる細胞の増殖抑制、または細胞毒性によるものではないことを確認するために、ルシフェラーゼアッセイと同じ条件にて細胞を培養して、トリパンブルー染色法にて細胞数を測定した。それぞれの細胞で得られたEC50値に相当する濃度のIFN－αの添加効果を調べた。その結果、いずれの細胞においても、コントロール細胞と比較して95%以上であり、IFN－αによる細胞毒性もほとんど認められなかった。
　sORL8(pool)細胞およびsORL11(pool)細胞を用いて同様の実験を行った。解析の結果、sORL8(pool)細胞およびsORL11(pool)細胞におけるEC50はそれぞれ0.14 IU/mlおよび0.25 IU/mlと算定され、これはORL8細胞およびORL11細胞における結果（それぞれ0.13 IU/mlおよび0.30 IU/ml）とほぼ同程度の値であった。このことは、IFN－αがHCVレプリコンRNAと全長HCV RNAの複製に与える影響にほとんど差がないことを示唆する。代表的な結果を図１７に示す。
　(B) IFN－β
　各細胞にIFN－β（0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 10 IU/ml：東レ社より供与）を添加し、72時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。解析の結果、ORL8細胞、ORL11細胞およびOR6細胞におけるEC50はそれぞれ0.10 IU/ml、O.18 IU/mlおよび0.35 IU/mlと算定された。代表的な結果を図１８に示す。IFN－βについても、IFN－αの場合と同じような傾向となりORL8細胞で最も感受性が高かった。
　(C) IFN－γ
　各細胞にIFN－γ（0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 10 IU/ml ：Sigma社 I1520）を添加し、72時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。解析の結果、ORL8細胞、ORL11細胞およびOR6細胞におけるEC50はそれぞれ0.077 IU/ml、O.13 IU/mlおよび0.21 IU/mlと算定された。代表的な結果を図１９に示す。IFN－γについても、IFN－αやIFN－βの場合と同じような傾向となりORL8細胞で最も感受性が高かった。
　なお、IFN－γの添加により生じるルシフェラーゼ活性の減少が、IFN－γによる細胞の増殖抑制、または細胞毒性によるものではないことを確認するために、ルシフェラーゼアッセイと同じ条件にて細胞を培養して、トリパンブルー染色法にて細胞数を測定した。それぞれの細胞で得られたEC50値に相当する濃度のIFN－γの添加効果を調べた。その結果、いずれの細胞においても、コントロール細胞と比較して90%以上であり、IFN－γによる細胞毒性もほとんど認められなかった。
　(D) シクロスポリンＡ (CsA) 
　各細胞にCsA（0, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 1 μg/ml：Sigma社 C3662）を添加し、72時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。解析の結果、ORL8細胞、ORL11細胞およびOR6細胞におけるEC50はそれぞれ0.15μg/ml、O.12μg/mlおよび0.17μg/mlと算定された。代表的な結果を図２０に示す。CsAについてはIFN－α、IFN－βまたはIFN－γとは異なり、ORL11細胞が他の細胞より若干感受性がよい結果となったが、３者における差はIFNで観察された差より小さいものであった。
　なお、CsAの添加により生じるルシフェラーゼ活性の減少が、CsAによる細胞の増殖抑制、または細胞毒性によるものではないことを確認するために、ルシフェラーゼアッセイと同じ条件にて細胞を培養して、トリパンブルー染色法にて細胞数を測定した。それぞれの細胞で得られたEC50値に相当する濃度のCsAの添加効果を調べた。その結果、いずれの細胞においても、コントロール細胞と比較して87%以上であり、CsAによる細胞毒性もほとんど認められなかった。
　(E) フルバスタチン (FLV)
　各細胞にFLV（0, 0.063, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 3 μM ：Calbiochem社 344095）を添加し、72時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。解析の結果、ORL8細胞、ORL11細胞およびOR6細胞におけるEC50は0.28 μM、0.32 μMおよび1.22 μMと算定された。代表的な結果を図２１に示す。
　FLVの抗HCV効果はOR6細胞を用いたアッセイにより見出された（特許文献１参照）。ORL8細胞およびORL11細胞において示されたEC50値（0.28 μMおよびO.32 μM）は、OR6細胞において示されたEC50値（1.22 μM）と比較してはるかに低い。現在、PEG-IFN＋リバビリン併用療法にFLVをさらに追加する臨床試験が拡大の傾向にあり、よい結果も得られてきている（瀬崎 et al. 肝臓, 49:22-24, 2008）。臨床試験におけるFLVの有効性は、ORL8細胞およびORL11細胞を用いた細胞アッセイ系で得られたFLVのEC50値の信憑性を裏付け、ORL8細胞およびORL11細胞を用いた細胞アッセイ系の有用性を支持する。
　なお、FLVの添加により生じるルシフェラーゼ活性の減少が、FLVによる細胞の増殖抑制、または細胞毒性によるものではないことを確認するために、ルシフェラーゼアッセイと同じ条件にて細胞を培養して、トリパンブルー染色法にて細胞数を測定した。それぞれの細胞で得られたEC50値に相当する濃度のFLVの添加効果を調べた。その結果、いずれの細胞においても、コントロール細胞と比較して97%以上であり、FLVによる細胞毒性もほとんど認められなかった。
　さらに、異なる製造元のFLV（LKT laboratories Inc.,F4482、純度99.5%）を用いて、同様の実験を行い、EC50を算出した。その結果、ORL8細胞、ORL11細胞およびOR6細胞におけるEC50はそれぞれ0.31μM、0.11μMおよび1.44μMと算定された（図２２）。先に得られた結果と比較すると、ORL8細胞ではほぼ同じ値を示したが、ORL11細胞では、後者の方が効果が強く、OR6細胞では前者の方の効果が少し強かった。特に、注目されるのは、ORL11細胞でのEC50値が0.11μMという値であり、このアッセイ系においては、FLVの効果が最大限発揮されることを示している。別途行った実験においても、0.14μMというEC50値を得たことから、その再現性も確認することができた（結果は示さず）。
　(F) プラバスタチン
　各細胞にプラバスタチン（0, 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 5, 10μM）を添加し、72時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。OR6細胞を用いた細胞アッセイ系では、プラバスタチンによる抗HCV効果は確認できなかったことを以前に報告している。今回もまた、ORL8細胞およびORL11細胞において、OR6細胞と同様にプラバスタチンによる抗HCV効果は確認できなかった。この点においては、HuH-7細胞系及びLi23細胞系において大きな差は認められなかったといえる（結果は示さず）。
　(G) シンバスタチン (SMV)
　各細胞にSMV（0, 0.063, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 3 μM ：Wako chemical社 193-12051）を添加し、72時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。解析の結果、ORL8細胞、ORL11細胞およびOR6細胞におけるEC50はそれぞれ0.28 μM、0.15 μMおよび1.42 μMと算定された。代表的な結果を図２３に示す。
　SMVの抗HCV効果はOR6細胞を用いたアッセイにより見出された（Ikeda et al., Hepatology 44:117-125 (2006)参照）。ORL8細胞およびORL11細胞において示されたEC50値（0.28 μMおよび0.15 μM）は、OR6細胞において示されたEC50値（1.42 μM）と比較してはるかに低い。このことは、SMVもC型肝炎患者の治療に使用できる可能性を示唆する。ORL8細胞ではSMVがFLVと同等の活性が得られ、ORL11細胞ではSMVがFLVより強い抗HCV活性を示した点に注目すべきである。OR6細胞を用いた場合、抗HCV活性はFLV、SMVの順であったが、ORL11細胞を用いた場合、抗HCV活性はSMV、FLVの順である。このことは、OR6細胞だけでなく、ORL8細胞またはORL11細胞も使用して総合的に判定する必要性が示唆されるとともに、ORL8細胞およびORL11細胞を用いた細胞アッセイ系の有用性が支持される。
　(H) ローバスタチン (LOV) 
　各細胞にLOV（0, 0.063, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4 μM ：Wako chemical社 125-04581）を添加し、72時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。解析の結果、ORL8細胞、ORL11細胞およびOR6細胞におけるEC50はそれぞれ1.49 μM、1.04 μMおよび3.0 μMと算定された。代表的な結果を図２４に示す。
　LOVは、他の報告でもレプリコンアッセイでのEC50値が高く（すなわち抗HCV活性が弱く）、臨床治療には適さないと指摘されている。しかし、これらの報告は全てHuH-7細胞由来の細胞アッセイ系を使用したものである。今回の結果は、Li23細胞系由来の細胞アッセイ系を用いることにより、従来の細胞アッセイ系では抗HCV活性が認められないまたは抗HCV活性が弱いとされていた薬剤に抗HCV活性があることを見出し得る可能性を示す。
　(I)ピタバスタチン（PTV）
　各細胞にPTV（0, 0.032, 0.063, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2 μM ：Tronto Research Inc社 P531005のPTV lactone (prodrug)を使用）を添加し、72時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。解析の結果、ORL8細胞、ORL11細胞およびOR6細胞におけるEC50はそれぞれ0.45 μM、0.16 μMおよび0.46 μMと算定された。代表的な結果を図２５に示す。
　なお、PTVの添加により生じるルシフェラーゼ活性の減少が、PTVによる細胞の増殖抑制、または細胞毒性によるものではないことを確認するために、ルシフェラーゼアッセイと同じ条件にて細胞を培養して、トリパンブルー染色法にて細胞数を測定した。それぞれの細胞で得られたEC50値に相当する濃度のPTVの添加効果を調べた。その結果、いずれの細胞においても、コントロール細胞と比較して80%以上であり、PTVによる細胞毒性もほとんど認められなかった。
　(J) リバビリン
　各細胞にリバビリン（0, 3.13, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 μM ：Yamasaより供与、純度＞99.0%）を添加し、72時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。解析の結果、ORL8細胞、ORL11細胞およびOR6細胞におけるEC50はそれぞれ10.1μM、15.9 μMおよび119 μMと算定された。代表的な結果を図２６に示す。
　リバビリンは、現在PEG-IFNと併用して用いられており、貧血などの副作用があるのもかかわらず、PEG-IFN単独より治療効果が良いことから、標準的治療法として使用されている。しかし、リバビリンの抗HCV効果が何に起因するのかは、これまで明らかになっていない。本発明者らが作製したOR6細胞アッセイ系で測定すると、リバビリンに抗HCV効果が認められるもののそのEC50値は高値（76 μM）である（Naka et al., BBRC, 330; 871-879, 2005）。リバビリンの抗HCV効果について、主に４つの可能性が提唱されている：（１）リバビリンがRNA変異誘導活性を有していてHCVゲノムに変異を入れる（100 μM以上だとエラーカタストロフィーを引き起こす）；（２）HCVのRNA依存性RNAポリメラーゼ(NS5B)の阻害による効果；（３）細胞免疫を増強させる効果。IFN－γの産生促進による効果；（４）イノシン酸デヒドロゲナーゼ(IMPDH)の阻害効果。
　ORL8細胞またはORL11細胞を用いたアッセイの結果、予想外の結果が得られた。OR6細胞を用いたアッセイでのEC50（119 μM）と比較して、ORL8細胞またはORL11細胞を用いたアッセイでは、驚くことにEC50がそれぞれ10.1 μMと 15.9 μMという非常に低かった。
　なお、リバビリンの添加により生じるルシフェラーゼ活性の減少が、リバビリンによる細胞の増殖抑制、または細胞毒性によるものではないことを確認するために、ルシフェラーゼアッセイと同じ条件にて細胞を培養して、トリパンブルー染色法にて細胞数を測定した。それぞれの細胞で得られたEC50値に相当する濃度のリバビリンの添加効果を調べた。その結果、いずれの細胞においても、コントロール細胞と比較して98%以上であり、リバビリンによる細胞毒性もほとんど認められなかった。また、リバビリンによる細胞毒性も12.5 μMの濃度では認められなかった（結果は示さず）。
　10 μMというEC50値からは抗HCV効果が強いとは言えないが、リバビリン治療を受けている患者の血中濃度は10～14 μM程度であり、この濃度が、PEG-IFNと併用すると十分抗HCV効果を増強する濃度であることが判明した。従来のHuH-7細胞系を用いた実験結果から、投与された患者におけるリバビリンの血中濃度ではHCV RNAの複製を抑えないと信じられてきたが、今回の結果から、リバビリンはHCV RNA複製阻害剤としての活性を有することがわかった。なお、ORL8細胞およびORL11細胞については、リバビリンによるルシフェラーゼ活性の低下に相関して、HCVタンパク質の量も低下していることをウエスタンブロット法によって確認している（データは示さず）。従来の細胞アッセイ系では抗HCV活性が認められないか、あるいは抗体HCV活性が弱いとみなされていた薬剤が、実際は抗HCV活性を有しているということを見出すことができることを示している。このような範疇に入る抗HCV剤を見出し得るという点においても、本アッセイ系は有用なアッセイシステムになると言える。
　(K) ミゾリビン
　各細胞にミゾリビン（0, 3.13, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 μM）を添加し、72時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。解析の結果、ORL8細胞およびORL11細胞におけるEC50はそれぞれ58.8μMおよび76.5μMと算定された。また、OR6細胞を用いたアッセイ系では200 μMでも50%以下にならなかった。代表的な結果を図２７に示す。
　(L) ゲルダナマイシン
　各細胞にゲルダナマイシン（0, 0.63, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40 nM ：Wako chemical社 077-04571）を添加し、72時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。ゲルダナマイシン（heat shock protein (Hsp90) inhibitor）については、HCV レプリコンアッセイ(HuH-7細胞由来の細胞使用)を用いた他の研究室からの論文（Nakagawa et al., BBRC 353;882-888,2007）が報告されており、EC50値（薬剤添加72時間後に解析）はCon1株では5.5 nM、N株では7.8 nMと算定されているので、今回の実験では、これらの値が薬剤濃度範囲の中央部に来るようにしてアッセイを行った。解析の結果、ORL8細胞、ORL11細胞およびOR6細胞におけるEC50はそれぞれ2.57 nM、3.31 nMおよび2.10 nMと算定された。代表的な結果を図２８に示す。
　このように、今回のアッセイ系でもゲルダナマイシンの抗HCV活性が確認された。HCV-O株の全長HCV RNAの複製に関しては、報告されている値より低い値が得られたが、細胞の種類による違いはほとんどなかった。
　(M) ミリオシン
　各細胞にミリオシン（0, 0.63, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40 nM ：Sigma社 M1177）を添加し、72時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。ミリオシン（セリンパルミトイルトランスフェラーゼインヒビター）については、HCV レプリコンアッセイ (HuH-7細胞由来の細胞使用)を用いた他の研究室からの論文（Umehara et al., BBRC 346;67-73,2006）が報告されており、EC50値（薬剤添加72時間後に解析）はCon1株では5.8 nMと算定されているので、今回の実験では、これらの値が薬剤濃度範囲の中央部に来るようにしてアッセイを行った。解析の結果、ORL8細胞およびORL11細胞におけるEC50はそれぞれ5.16 nMおよび3.62 nMと算定された。これは、Con-1株のHCV レプリコンアッセイにより得られた値とほぼ同様の結果が得られたが、HuH-7細胞由来のOR6細胞を用いたアッセイでは、5 nM～40 nMでも60 % 弱の活性が維持され、50 % 以下にならなかったため、EC50値を算出することができなかった。このような結果が得られた理由は明らかではないが、HuH-7細胞系の細胞で認められた現象を示さないLi23細胞系のORL8細胞およびORL11細胞は、ミリオシン関連の薬剤の評価をするのに適した細胞アッセイ系であると言える。代表的な結果を図２９に示す。
　なお、ミリオシンの添加により生じるルシフェラーゼ活性の減少が、ミリオシンによる細胞の増殖抑制、または細胞毒性によるものではないことを確認するために、ルシフェラーゼアッセイと同じ条件にて細胞を培養して、トリパンブルー染色法にて細胞数を測定した。それぞれの細胞で得られたEC50値に相当する濃度のミリオシンの添加効果を調べた。その結果、ORL8細胞の細胞数は、コントロール細胞と比較すると若干低い83.5%であったが、他の細胞では91%以上であった。これらの結果から、ルシフェラーゼの活性低下はミリオシンの抗HCV活性によるものであると考えられた。
　(N) アセチルサリチル酸（ASA）
　最近、Con1株HCV レプリコンを用いた実験によりASAに抗HCV活性があるという報告がなされた（Trujillo-Murillo K et al., Hepatology 47:1462-1472 (2008)）。そこで、ASAの抗HCV活性を本アッセイシステムで検討し、EC50を算出した。
　各細胞にミリオシン（0, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 mM）を添加し、72時間後のルシフェラーゼ活性を測定した（上記報告ではASAのEC50値は4 mMとされている。）。解析の結果、ORL8細胞、ORL11細胞およびOR6細胞におけるEC50はそれぞれ1.33 mM、1.17 mMおよび2.16 mMと算定された。これらの値はCon-1株のHCV レプリコンアッセイにより得られた値より少し低い濃度であり、みかけ上はASAの抗HCV活性が確認されたような結果となった。しかし、２mMの濃度で処理した場合の細胞数の減少が明らかであったことから、細胞増殖に与える影響を調べたところ、ORL8細胞、ORL11細胞およびOR6細胞を上記濃度のASAで処理すると、コントロール細胞と比較して、細胞数が53%、72%および51%に低下していた。代表的な結果を図３０に示す。これらの結果は、少なくともORL8細胞とOR6細胞におけるルシフェラーゼ活性の減少分はほぼすべて細胞増殖抑制分であることを示唆する。上記報告では、ASAの細胞増殖抑制効果が全く調べてられていないが、ASA本体に抗HCV活性があるという結論は得られないと考えられる。このように、アッセイに用いた薬剤濃度範囲で明らかな細胞数の減少が認められた場合には、細胞数を測定して比較して、ルシフェラーゼ活性の低下が細胞数の低下によるものであるかどうかの検定を行う必要がある。
　〔５－６〕各種薬剤の併用による抗HCV効果
　OR6細胞（特許文献１参照）を用いたアッセイ系では薬剤とIFN－αとの併用効果も測定可能である。よって、ORL8細胞およびORL11細胞を用いた本アッセイ系において、併用効果を測定し得るかどうかを検証した。なお、用いた薬剤の濃度は、上記EC50値に基づいた。
　(i) IFN－αとCsAとの併用
　結果を図３１に示す。IFN－α単剤処理後のルシフェラーゼ活性は50% (ORL8)、41% (ORL11)、67% (OR6)、CsAについては、35% (ORL8)、48% (ORL11)、73% (OR6)であった。OR6細胞で予想(50%)より若干活性が低いが、併用効果の測定には支障がない。薬剤併用後のルシフェラーゼ活性は14% (ORL8)、13% (ORL11)、33% (OR6)に低下していた。単剤処理の結果から併用による相加効果の場合の予想値は18% (ORL8)、20% (ORL11)、49% (OR6)であった。各細胞アッセイ系において得られた実測値は予想値よりも、22% (ORL8)、35% (ORL11)、33% (OR6)低い値を示したことから、IFN－αとCsAとの併用は若干の相乗効果を示すことがわかった。IFN－αとCsAとの併用における相乗効果（OR6細胞アッセイ系）については、特許文献１に示している。このように、ORL8細胞およびORL11細胞のアッセイ系もまた、OR6細胞のアッセイ系と同様にIFN－αとCsAとの併用効果を調べるアッセイに使用可能である。
　(ii) IFN－αとFLVとの併用
　FLV（Calbiochem社 344095）を用いた。結果を図３２に示す。IFN－α単剤処理後のルシフェラーゼ活性は50% (ORL8)、41% (ORL11)、67% (OR6)、FLVについては、59% (ORL8)、51% (ORL11)、55% (OR6)であった。薬剤併用後のルシフェラーゼ活性は29% (ORL8)、20% (ORL11)、37% (OR6)に低下していた。単剤処理の結果から併用による相加効果の場合の予想値は30% (ORL8)、21% (ORL11)、37% (OR6)であり、実測値とよく一致していることから相加効果であると考えられる。ただし、細胞数における確認から、薬剤単剤ではほとんど細胞増殖抑制を示さなかったが、併用により細胞増殖が抑制されるという傾向が認められた。
　IFN－αとFLVとの併用効果について各薬剤の濃度を変化させてアッセイを行った。図３３にはORL8細胞およびOR6細胞におけるアッセイ結果を示した。IFN－αは0, 0.1, 0.2および0.4 IU/mlの終濃度になるように添加し、FLVは0, 0.3, 0.6および1.2 μMの終濃度になるように添加した。添加72時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、それぞれ単剤で添加した場合の結果から予想されていたものに近い結果が得られた。この結果からは、IFN－αとFLVとの併用効果は相加効果と考えられるが、ORL8細胞アッセイ系はOR6細胞アッセイ系に比べて感度が優れていると考えられる。
　図３４にはORL11細胞とOR6細胞におけるアッセイ結果を示した。得られた結果は、それぞれ単剤処理の結果から予想されていたものに近く、ルシフェラーゼ活性は、ORL11細胞とほぼ同じような濃度依存的減弱パターンとなった。この結果からも、ORL11細胞アッセイ系はOR6細胞アッセイ系に比べて感度が優れていると考えられる。
　図３５にはORL8細胞とORL11細胞におけるアッセイ結果を示した。両アッセイ系におけるルシフェラーゼ活性の減弱曲線はオーバーラップしており、IFN－αに関しては、若干ORL8細胞系の方の感受性が高いようであるが、併用効果における感度の面において両アッセイ系の感受性はほぼ同等であることがわかった。
　(iii) IFN－αとPTVとの併用
　PTV（PTV lactone (prodrug)を使用）を用いた。結果を図３６に示す。IFN－α単剤処理後のルシフェラーゼ活性は50% (ORL8)、41% (ORL11)、67% (OR6)、PTVについては、43% (ORL8)、49% (ORL11)、56% (OR6)であり、薬剤併用後のルシフェラーゼ活性は24% (ORL8)、19% (ORL11)、31% (OR6)に低下していた。単剤処理の結果から併用による相加効果の場合の予想値は22% (ORL8)、20% (ORL11)、38% (OR6)であった。OR6細胞アッセイ系では予想値より20%弱低い値であったが、他の細胞アッセイ系の結果を合わせて考えると相加効果であると考えられた。
　(iv) IFN－αとリバビリンとの併用
　結果を図３７に示す。ただし、IFN－αについては0.25 IU/ml (ORL8細胞では35%、ORL11細胞では55%、OR6細胞では70%に低下すると予想される濃度)、リバビリンについては12.5 μM (ORL8細胞では40%、ORL11細胞では60%に低下し、OR6細胞では低下しないと予想される濃度)と固定した条件下にて併用効果を検討した。その結果、IFN－α単剤処理後のルシフェラーゼ活性は26% (ORL8)、48% (ORL11)、75% (OR6)、リバビリンについては、35% (ORL8)、49% (ORL11)、97% (OR6)であり、薬剤併用後のルシフェラーゼ活性は11% (ORL8)、28% (ORL11)、80% (OR6)に低下していた。単剤処理の結果から併用による相加効果の場合の予想値は9% (ORL8)、24% (ORL11)、73% (OR6)であった。これらの細胞アッセイ系での測定値は予想値より若干（9～18%）高い値であったが、相加効果であると考えられた。
　〔６：感染性HCV粒子産生細胞株〕
　〔６－１〕OL治癒細胞へのHCV感染
　HuH-7細胞由来の細胞を用いた場合において、HCVの生活環を再現し得るのはHCV 2a型由来のJFH1株HCVのみである。今回得られたLi23細胞由来の細胞にHCV生活環の再現を引き起こす能力があるかどうかを検討した。まず、全長HCV RNA複製細胞として得られたOL8細胞およびOL11細胞から作製した治癒細胞において、JFH1株HCV RNAの複製が起こるかどうかを調べた。
　2x106個のLi23細胞（親株）、OL8c細胞および OL11c細胞に、JFH1株 HCV RNA 20μgをエレクトロポレーション法にて導入した。導入後、細胞を6 ウエルプレートに移し（それぞれ約４x105個）、24, 48, 72および96時間後に、各細胞内（それぞれのウエル内の細胞の1/20を解析に使用）でのコアタンパク質の発現レベルをWestern blot法により解析した（図３８）。Li23細胞にてコアタンパク質は全く認められなかったが、OL8c細胞にてコアタンパク質は導入24時間後に認められ、48時間後にはさらに発現レベルの増強が観察された。OL11c細胞では導入24時間後には検出されなかったが、48時間以降にコアタンパク質の発現が認められた。このことより、OL8c細胞およびOL11c細胞において、JFH1株のHCV RNAが複製増殖したために起こったことが示唆されており、OL8c細胞およびOL11c細胞はHCV-O株だけでなくJFH1株のHCV RNAの複製を許容し得る細胞であることが示された。
　RSc細胞にJFH1株HCVを感染させ、145日間経過した後の上清をウイルス液として用いた。このウイルス液は、1mlあたり105.3TCID50の感染性HCV粒子を含むと予想される。RSc細胞HuH-7細胞由来のクローン化細胞であり、JFH1株HCV RNAを細胞内に導入することにより、効率よくかつ持続的に感染性HCV粒子を産生する（Ariumi et al., JVI 81:13922-13926,2007）。
　ウイルス液を、Li23細胞（2 x 104細胞/24ウエル）およびOL8c細胞（2 x 104細胞/24ウエル）に添加し、２時間後に培地を交換した。感染後８日目にそれぞれの細胞内でのコアタンパク質の発現レベルをウエスタンブロット法により調べた。培養液を用いたMock実験も並行して行った。アッセイには2 x 104細胞相当を用いた。Li23細胞を用いた場合、コアタンパク質は全く検出されなかったが、OL8c細胞を用いた場合、コアタンパク質の強い発現が認められた（図３９）。このことより、OL8c細胞はJFH1株HCV RNAの複製だけでなくJFH1株HCVの感染も許容し得る細胞であることが示された。
　OL8c細胞以外の治癒細胞についてもJFH1株HCVの感染性および増殖性を検討した。Li23、ならびに各種クローン化OL細胞から作製した治癒細胞（OL1c細胞, OL2c細胞, OL3c細胞, OL4c細胞, OL8c細胞, OL11c細胞およびOL14c細胞）を用いて、JFH1株HCVの感染実験を行った。感染後１６日目の各細胞内におけるコアタンパク質の発現レベルをウエスタンブロット法により調べた。Li23細胞を用いた場合、コアタンパク質は全く検出されなかったが、OL8c細胞を用いた場合、感染後１６日目においてもコアタンパク質の強い発現が認められた（図４０）。このことは、感染後の細胞内で持続的なHCV RNAの複製が起こっていることを示唆する。OL8c細胞以外では、OL2c細胞、OL3c細胞およびOL11c細胞でOL8c細胞と同程度のコアタンパク質の発現が認められ、OL14c細胞では弱い発現が確認された。しかしながら、OL1c細胞およびOL4c細胞ではコアタンパク質はまったく検出されなかった。このような細胞クローンによる違いは、細胞内の全長HCV RNAの量（HCV-O株のHCV RNAの複製レベル）との相関がないことから、HCVの感染のstepにおける許容性の違いか、またはHCV株の違いに基づく複製効率の違いかによる可能性がある。
　〔６－２〕OL治癒細胞からの感染性HCV粒子の産生
　JFH1株HCVを感染させたOL8c細胞およびOL11c細胞から感染性HCV粒子が産生されているかどうかを検討した。なお、細胞へのウイルス液の添加２時間後に培地交換することによって感染を行った（図４１）。
　感染７日後のOL8c細胞およびOL11c細胞（それぞれ2 x 104細胞／24ウエル）の培養上清（それぞれ 100 μl：図のIF1）をOL8c細胞およびOL11c細胞（それぞれ2 x 104細胞／24ウエル）に感染させた。感染後８日目の各細胞（図のIF2d8）について、細胞内のコアタンパク質の発現レベルをウエスタンブロット法により解析した。結果をレーン１～４に示す。OL8c細胞およびOL11c細胞内にコアタンパク質は検出されず、OL8c細胞およびOL11c細胞からの感染性HCV粒子の産生は確認されなかった。
　さらに、感染７日後のOL8c細胞およびOL11c細胞（それぞれ2 x 104細胞／24ウエル）の培養上清（それぞれ 100 μl：図のIF1）をRSc細胞（2 x 104細胞／24ウエル）に感染させた。感染後７日目の培養上清（100 μl：図のIF2）を別途調製したOL8c細胞およびOL11c細胞(それぞれ2 x 104細胞／24ウエル) に感染させた。感染後８日目の各細胞（図のIF3d8）について、細胞内のコアタンパク質の発現レベルをウエスタンブロット法により解析した。結果をレーン５～８に示した。OL8c細胞およびOL11c細胞内にコアタンパク質が検出された。この結果から、わずかではあるがOL8c細胞およびOL11c細胞から感染性HCV粒子が産生され、RSc細胞を介して、感染性HCV粒子の産生増幅が起こったことが示唆された。
　わずかではあるがOL8c細胞およびOL11c細胞から感染性HCV粒子が産生されていることが示唆されたことから、HCV感染させた後２７日間培養を継続させた後にウエスタンブロット解析を行った。
　感染７日後のOL8c細胞およびOL11c細胞（それぞれ2 x 104細胞／24ウエル）の培養上清（それぞれ 100 μl：図のIF1）をOL8c細胞およびOL11c細胞（それぞれ2 x 104細胞／24ウエル）に感染させた。HCV産生細胞のコントロールとしてLi23細胞上清または培養液を用いたMock実験も同時に行った（図４２）。感染後２７日目の各細胞（図のIF2d27）について、細胞内のコアタンパク質の発現レベルをウエスタンブロット法により解析した。JFH1株HCVを感染させたOL8c細胞およびOL11c細胞の培養上清をRSc細胞に感染させた場合、細胞内のコアタンパク質の発現レベルは非常に多くなることがわかった。このことから、RSc細胞を介して感染性HCV粒子が増殖していると考えられる。
　また、JFH1株HCVを感染させたORL8c細胞由来の培養上清をOL8c細胞に再度感染させた場合にのみ、感染２７日後にコアタンパク質がウエスタンブロット解析で検出されるレベルに蓄積した。この事実は、JFH1株HCVがOL8c細胞に感染して複製増殖後に感染性粒子として再び産生され、その感染性粒子が再びOL8c細胞に感染して細胞内で複製増殖を起こすという、いわゆるHCVの生活環がOL8c細胞で達成されたことを示す。
　〔６－３〕ORL治癒細胞株の作製
　OL8c細胞はHCVの生活環の再現を引き起こす能力のある細胞であることが示されたが、RSc細胞などと比較するとその能力は非常に弱い。また、実用面において、実験に時間を要するという難点がある。そこで、HCV RNAの複製環境という点でOL8c細胞またはOL11c細胞より優れていると考えられるORL8c細胞またはORL11c細胞を、ORL8細胞およびORL11細胞に対してG418非存在下でIFN－γ(103IU/μl)を添加して作製した。
　5x105個程度のORL8細胞およびORL11細胞を外径10 cmのディッシュに播種し、IFN－γ (1000 IU/ml)を４日ごとに３回添加した。細胞がディッシュに一杯になった場合には適時継代した。３回目のIFN－γ添加後の継代時に細胞を２群のディッシュに分け、１群には培地にG418 (0.3 mg/ml)およびNaHCO3(0.15%)を添加した。もう１群のシャーレには培地のみで培養を継続した。その後、必要に応じて継代しながら、両群にIFN－γをさらに３回添加した後、CBB染色を行った。その結果、G418を添加しない培地で培養した細胞はディッシュ一杯に増殖した（治癒細胞）。しかし、G418を加えた培地で培養を続けた場合は、細胞が完全に死滅した（図４３）。
　〔６－４〕ORL治癒細胞からの感染性HCV粒子の産生
　作製した治癒細胞（ORL8c細胞またはORL11c細胞）をJFH1株HCVの感染実験に使用し、HCV粒子産生能力を検討した。上述したように、コントロールに用いたRSc細胞は、HuH-7細胞由来のクローン化細胞であり、JFH1株HCV RNAを細胞内に導入することにより、効率よくかつ持続的に感染性HCV粒子を産生する（Ariumi et al., JVI 81:13922-13926,2007）。
　感染７日後のRSc細胞、ORL8c細胞およびORL11c細胞（それぞれ2 x 104細胞（ORL11c細胞のみ3 x 104細胞）／24ウエル）の培養上清（それぞれ 100 μl）を、別途調製したRSc細胞（2 x 104細胞／24ウエル）に感染させた。培養液を用いたMock実験も同時に行った。感染７日目および１４日目の細胞（それぞれ、図のIF2d7およびIF2d14）について、細胞内のコアタンパク質の発現レベルをウエスタンブロット法により解析した（図４４のレーン１～４）。コアタンパク質の発現レベルは、レーン２、３および４でほぼ同程度であることがわかった。このように、JFH1株HCVを感染させたRSc、ORL8cおよびORL11c細胞から産生される感染性HCV量はほぼ同じであり、ORL8c細胞およびORL11c細胞はOL8c細胞およびOL11c細胞よりも感染性HCVの産生能力が高く、HuH-7細胞由来のRSc細胞に匹敵することがわかった。
　感染７日後のRSc細胞およびORL8c細胞（それぞれ2 x 104細胞／24ウエル）の培養上清（それぞれ 100 μl）を、別途調製したORL8c細胞（2 x 104細胞／24ウエル）に感染させた。培養液を用いたMock実験も同時に行った。感染７日目、１４日目、２１日目および３０日目の細胞（それぞれ、図のIF2d7、IF2d14、IF2d21およびIF2d30）について、細胞内のコアタンパク質の発現レベルをウエスタンブロット法により解析した（図４４のレーン５～７）。RSc細胞から産生されたHCVを感染させたORL8c細胞にて生成されるコアタンパク質量は、感染後７日目で最大となり、２１日目まではある程度維持されるが、３０日目で低下してしまうことがわかった（レーン６）。一方、ORL8c細胞から産生されたHCVを感染させたORL8c細胞にて生成されるコアタンパク質量は、感染後７日目でかなりのレベルの発現が認められ、この発現レベルは経時的に上昇し、３０日目においても７日目よりも高いレベルで維持されていることがわかった（レーン７）。これらの結果から、ORL8c細胞で産生されたHCVは、ORL8c細胞に再感染して少なくとも１ヶ月間はHCVの産生が維持されていることが示唆される。ORL8c細胞の親細胞にあたるOL8c細胞と比較して、ORL8c細胞は、感染性HCV粒子産生能において格段に優れていることが明らかとなり、ORL8c細胞はHuH-7細胞由来のRSc細胞と比較しても遜色ないHCV産生能を有することがわかった。
　感染７日後のRSc細胞およびORL11c細胞（それぞれ2 x 104細胞または3 x 104細胞／24ウエル）の培養上清（それぞれ 100 μl）を、別途調製したORL11c細胞（3 x 104細胞／24ウエル）に感染させた。培養液を用いたMock実験も同時に行った。感染７日目、１４日目、２１日目および３０日目の細胞（それぞれ、図のIF2d7、IF2d14、IF2d21およびIF2d30）について、細胞内のコアタンパク質の発現レベルをウエスタンブロット法により解析した（図４４のレーン８～１０）。RSc細胞から産生されたHCVを感染させたORL11c細胞にて生成されるコアタンパク質量は、ORL8c細胞にて生成させた場合と同様に、感染後７日目で最大となり、２１日目まではある程度維持されるが、３０日目で低下してしまうことがわかった（レーン９）。一方、ORL11c細胞から産生されたHCVを感染させたORL11c細胞において、コアタンパク質は生成されなかった（レーン１０）。これらの結果から、ORL11c細胞はORL8c細胞と異なり、RSc細胞から産生されるHCVの感染および増殖は許容するものの、ORL11c細胞から産生されるHCVのORL11c細胞への再感染および増殖を許容し得ないことがわかった。
　〔６－５〕ORL治癒細胞におけるHCV RNAの複製レベル
　続いて、JFH-1株HCVが感染したORL8c細胞（IF2d7）においてHCV RNAの複製中間体である二本鎖RNA（dsRNA）を検出するために、上述した手順に従って、抗dsRNA抗体を用いた免疫蛍光法によってORL8c細胞を観察した。陽性コントロールとしてJFH-1株HCV感染RSc細胞、陰性コントロールとして模擬感染（Mock infection）させたORL8c細胞を用いた。共焦点レーザー走査顕微鏡を用いた観察結果を図４５に示す（図中、バーの長さは20μmである。）。
　図に示すようにHCV感染したORL8c細胞とRSc細胞の細胞質にドット状の蛍光が散在していることがわかった。このような蛍光は、模擬感染させたORL8c細胞内には全く観察されなかった。これらのことより、ORL8c細胞においてdsRNA（HCV RNAの複製中間体）が特異的に検出されたと考えられる。なお、ORL8c細胞内で観察された蛍光強度はRSc細胞のものに匹敵することから、図４６（ｂ）にて示すようにORL8c細胞内におけるHCV RNAの複製レベルはRSc細胞とほとんど変わらないことが示唆された。
　さらに、ORL8c細胞およびRSc細胞におけるHCV複製レベルを比較した。図４４と同時期（感染７日目、１４日目、２１日目および３０日目（それぞれ、図のIF2d7、IF2d14、IF2d21およびIF2d30））におけるORL8c細胞およびRSc細胞の培養上清中に放出されるHCV粒子を検出／定量するために、JFH-1株HCVを感染させたORL8c細胞とRSc細胞の培養上清中（IF2d7、IF2d14、IF2d22）のHCVコアタンパク質の分泌量をELISA法により測定した（三菱ビーシーエルにて測定）。実験はそれぞれ３回行い、上清１mlを測定に用いた（図４６（ａ））。
　図に示すように、培養上清中に放出されるHCV粒子の量は、RSc細胞の場合、感染７日目で105fmol/L以上に達し、それ以降は変化なしまたはやや減少であった。一方、ORL8c細胞の場合、感染７日目では102 fmol/Lと低かったが、感染１４日目には104fmol/Lとなり、その後感染２２日目までそのレベルを維持した。全体としては、ORL8c細胞におけるHCV粒子産生能力はRSc細胞よりも１桁低いことが判明したが、種々のウイルスの性状解析に用いるには充分なレベルであることがわかった。
　さらに、これらの細胞について、上述したリアルタイムLightCycler PCRの手順に従ってHCV RNAの定量を行った。実験をそれぞれ３回行った（図４６（ｂ））。RSc細胞の場合は、培養上清中へのコアタンパク質の放出レベルと同様に、感染７日目で１０８コピー／μｇ総RNAに達し、それ以降感染２２日目までほぼ同レベルに維持された。一方、ORL8c細胞では感染７日目では５×１０５コピー／μｇ総RNA程度であったが、感染１４日目では５×１０７コピー／μｇ総RNA程度に達し、２２日目までそのレベルは維持されていた。これらの結果から、両方の細胞内においてHCV RNAの高い複製レベルが維持されていることがわかった。
　〔６－６〕HCV受容体の発現レベルとHCV粒子産生能力との相関性
　続いて、種々の細胞におけるHCV受容体の発現レベルを比較するために、mRNAの発現レベルをRT-PCR法および定量的RT-PCR法を行った。
　HuH-7細胞、RSc細胞、Li23細胞、ORL8c細胞およびORL11c細胞を10cmプレート（培地10ml）にて培養した。これらの細胞から、RNeasy Mini Kit（Qiagen社）を用いて、添付の実験説明書に従って総RNAを抽出した。２μｇのRNAを鋳型として、SuperScriptTMII逆転写酵素（Invitrogen社）およびオリゴdT（Invitrogen社）を用いて、添付の実験説明書に従って逆転写反応（RT）を行った。得られたcDNAを鋳型として、表３に示すプライマーセットを用いてPCRを行い、3%アガロースゲル電気泳動後のエチジウムブロマイド染色によりPCR増幅産物を検出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　その結果、検出したバンドには多少の濃淡があるものの、HCV受容体と報告されているCD81、SR-B1、CLDN1(Claudin-1) およびOCLN（Occludin）が、内部コントロールとしてのGAPDHとともに、いずれの細胞にも発現されていることが確認された（図４７（ａ））。なお、これらのHCV受容体については、Burlone M.E. and Budkowska A. Hepatitis C virus cell entry: role of lipoproteins and cellular receptor. Journal of General Virology 90, 1055-1070 (2009)を参照のこと。
　また、上記cDNAを用いて、上述したリアルタイムLightCycler PCRの手順に従ってHCV RNAの定量を行った。その結果、図４７（ａ）に示した定性実験の結果と同様に、いずれの細胞においてもHCV受容体の発現が認められ、RSc細胞と比較してもORL8c細胞でのみ発現レベルが低くなっているHCV受容体は存在しないこと、さらには、CLDN1やOCLNではORL8c細胞での発現レベルがRSc細胞と比較して高くなっていることがわかった（図４７（ｂ））。
　〔６－７〕HCV-0株以外のHCV株に由来する全長HCV RNA複製細胞株の樹立
　ORL8c細胞は、ルシフェラーゼ遺伝子を有するHCV-O株由来全長HCV RNAを複製し得る細胞を、IFN－γで処理してHCV RNAを排除した治癒細胞である。よって、ORL8c細胞を用いれば、HCV-O株以外のHCV株に由来する全長HCV RNAを複製し得る細胞株を樹立し得る可能性がある。
　HCVキャリアー株である1B-4（1b遺伝子型）および急性肝炎患者由来のHCV株であるKAH5（1b遺伝子型）から作製したplasmid (それぞれp1B-4RN/C-5BおよびpKAH5RN/C-5B)をそれぞれ鋳型としてin vitroで合成した、ルシフェラーゼ遺伝子を有する全長HCV RNA（10 μg）を、2 x 106個のORL8c細胞にエレクロトポレーション法により導入した。p1B-4RN/C-5Bには２カ所の変異（Q1067RおよびS2200R）が導入されており、pKAH5RN/C-5Bには４カ所の変異（Ins2040K（HCVポリプロテインの2040番目にリジンが挿入されている）、R2328Q、E2401G、V2416A）が導入されている。S2200RおよびIns2040Kは適応変異として知られている。RNA導入２日後から、4日ごとにG418(0.3 mg/ml)を含む培地と交換して、３週間程度培養した。ルシフェラーゼ遺伝子を有する全長HCV RNAの複製が持続的に高いレベルにあると考えられる細胞をG418耐性コロニー（クローン）として得た。これらのクローンからHCV RNAの複製レベルが高い細胞クローンを選択する目的で、コアタンパク質およびNS5Aタンパク質の発現レベルをウエスタンブロット法により解析した（図４８）。陽性コントロール（図中のPC）としてHCV-O株由来の全長HCV RNA（４種類の適応変異を有する）が効率よく複製しているOR6c細胞由来の細胞を用いた。
　図４８（ａ）に示すように、1B-4株については、クローン＃２においてHCVタンパク質が最も多く発現していた。この細胞クローン＃２を増殖させかつ株化した（1B-4RL8細胞と称する。）。図４８（ｂ）に示すように、KAH5株については、クローン＃１１においてHCVタンパク質が最も多く発現していた。この細胞クローン＃１１を増殖させかつ株化した（KAH5RL8細胞と称する。）。
　得られた1B-4RL8細胞およびKAH5RL8細胞において、ルシフェラーゼ活性とHCV RNA量との間に相関関係があるかどうかを検討した（図４９）。左は、1B-4RL8細胞およびKAH5RL8細胞（それぞれ2 x 104個の細胞を24ウエルプレートに播種して２日間培養）にIFN－α 0, 1, 10, 100 IU/mlを添加して24時間後にルシフェラーゼ活性を測定したものである。各点に関して少なくとも３ウエル実施し、SD値を図に付加した。100%の実測値として、1B-4RL8細胞およびKAH5RL8細胞の両方で30 万という値を得た。ORL8細胞およびORL11細胞（図１４）と比較すると若干低い値ではあるが、薬剤の抗HCV効果を解析するに十分な値である。右は、1B-4RL8細胞およびKAH5RL8細胞（それぞれ2 x 105個の細胞を6ウエルプレートに播種し２日間培養）にIFN－α 0, 1, 10, 100 IU/mlを添加して24時間後にHCV RNAをLightCyclerPCRにより定量的に測定したものである。各点に関して少なくとも３ウエル実施し、SD値を図に付加した。図に示すように、ルシフェラーゼ活性とHCV RNA量とはIFN－αの濃度に依存して減少した。
　両測定法による結果は、OR6細胞で得られた結果と同様に良好な相関性を示していた。このように、1B-4RL8細胞およびKAH5RL8細胞は、簡便なルシフェラーゼアッセイを用いてHCV RNAの複製レベルを定量できる有用な細胞であり、それぞれ1B-4株HCVおよびKAH5株HCVに対する抗HCV剤の活性評価を行うための良いアッセイ系となり得ることが示された。すなわち、ORL8c細胞は感染性JFH１株HCVの産生能力ばかりでなく、新しいHCV株のHCV RNA複製（特にルシフェラーゼ遺伝子を有するような12 kb と本来のHCV RNA (9.6 kb)より長いRNAの複製）を許容し得る細胞といえる。
　本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
　また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
　本発明を用いれば、HuH-7細胞株以外の細胞株に由来するHCV生活環再現システムを構築することができる。また、既知のHuH-7細胞株に由来するHCV生活環再現システムと組み合わせて用いることにより、これまで抗HCV作用を有する物質として知られていたものを検証するだけでなく、抗HCV作用を有していないと考えられていた物質の抗HCV作用を見出すことができる。このように、本発明を用いれば、抗HCV作用を有する物質のスクリーニング方法、さらにＣ型肝炎治療薬を提供できるので、試薬産業、医薬品産業などの発展に貢献することができる。

Claims (14)

  1. 　HCVレプリコン複製細胞を作製する方法であって、
    　HCVレプリコン配列および選択マーカー遺伝子配列を含んでいるRNAを、Li23細胞またはLi23細胞に由来する治癒細胞に導入する工程を包含し、
    　該HCVレプリコン配列は、配列番号２に示されるアミノ酸配列においてQ1112R、K1609EおよびS2200R、またはQ1112R、P1115LおよびS2200Rのアミノ酸置換を生じているアミノ酸配列をコードする塩基配列を含んでいることを特徴とする作製方法。
  2. 　上記HCVレプリコン配列が、配列番号３または５に示されることを特徴とする請求項１に記載の作製方法。
  3. 　全長HCV RNA複製細胞を作製する方法であって、
    　全長HCVゲノム配列および選択マーカー遺伝子配列を含んでいるRNAを、Li23細胞に由来する治癒細胞に導入する工程を包含することを特徴とする作製方法。
  4. 　上記全長HCVゲノム配列は、配列番号２に示されるアミノ酸配列におけるQ1112R、K1609EおよびS2200R、またはQ1112R、P1115LおよびS2200Rのアミノ酸置換を生じているアミノ酸配列をコードする塩基配列を含んでいることを特徴とする請求項３に記載の作製方法。
  5. 　上記塩基配列が、配列番号７または９に示されることを特徴とする請求項４に記載の作製方法。
  6. 　上記全長HCVゲノム配列が、配列番号１１または１３に示される塩基配列を含んでいることを特徴とする請求項３に記載の作製方法。
  7. 　上記RNAがレポーター遺伝子配列をさらに含んでいることを特徴とする請求項３～６のいずれか１項に記載の作製方法。
  8. 　上記RNAが、外因性のインターナルリボソーマルエントリーサイト（ＩＲＥＳ）配列をさらに含んでいることを特徴とする請求項１～７のいずれか１項に記載の作製方法。
  9. 　抗HCV作用を有する物質をスクリーニングする方法であって、
    　請求項１～６のいずれか１項に記載の方法によって作製された細胞を候補因子とともにインキュベートする工程；および
    　HCV遺伝子産物のレベルを測定する工程
    を包含することを特徴とするスクリーニング方法。
  10. 　抗HCV作用を有する物質をスクリーニングするためのキットであって、
    　請求項１～６のいずれか１項に記載の方法によって作製された細胞；および
    　HCV遺伝子産物のレベルを測定するための試薬
    を備えていることを特徴とするキット。
  11. 　抗HCV作用を有する物質をスクリーニングする方法であって、
    　請求項７に記載の方法によって作製された細胞を候補因子とともにインキュベートする工程；および
    　レポーター遺伝子産物のレベルを測定する工程
    を包含することを特徴とするスクリーニング方法。
  12. 　抗HCV作用を有する物質をスクリーニングするためのキットであって、
    　請求項７に記載の方法によって作製された細胞；および
    　レポーター遺伝子産物のレベルを測定するための試薬
    を備えていることを特徴とするキット。
  13. 　請求項１～８のいずれか１項に記載の方法によって作製された細胞を、抗ウイルス作用を有する薬剤を含む培地中で培養する工程を包含することを特徴とするLi23細胞に由来する治癒細胞の作製方法。
  14. 　感染性HCV粒子を生産する方法であって、
    　請求項１３に記載の方法によって作製された治癒細胞を、感染性HCV RNAとともにインキュベートする工程を包含することを特徴とする産生方法。
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