WO2008029942A1 - Utilisation du gène de l'enzyme de biosynthèse de la cytokinine activée - Google Patents

Utilisation du gène de l'enzyme de biosynthèse de la cytokinine activée Download PDF

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cytokinin
gene
protein
seq
nucleotide
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Hitoshi Sakakibara
Nanae Ueda
Takeshi Kuroha
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Riken
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    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Definitions

  • the present invention relates to utilization of an active cytokinin synthase gene. More specifically, the present invention relates to a method for producing a transformed plant using an enzyme gene having an activity of catalyzing a synthesis reaction of active cytokinin from nucleotide-type cytokinin.
  • Cytokinin is a very important plant honolemon that has various physiological activities such as promotion of cell division, cell cycle node, prevention of aging, and activation of buds, and controls the quantitative productivity of crops.
  • the basic skeleton of cytokinin has a structure with a 5 carbon prenyl group at the 6-position nitrogen atom of adenine.
  • tZ transzeatin
  • iP isopentenyl adenine
  • base base
  • nucleotide-type cytokinins are produced by the condensation reaction of adenine nucleotides and dimethylallylphosphoric acid (DMAPP).
  • This nucleotide body has no activity as a cytokinin, but after that, in the second reaction, it becomes a nucleoside-type cytokinin by phosphatase, and ribose is removed by the action of nucleosidase, and the active cytokinin of the base is released. It is converted into a molecule-(Non-patent F Reference 1, Review: Sakakibara, H. (2006) Cytokinins: Activity, biosynthesis and translocation. Annu. Rev. Plant Biol. 57: 431-449.).
  • Non-patent Document 2 Werner T, Motyka V, Strnad M, Schmulling T. (2001) Regulation of plant growth by cytokinin. Proc Natl Acad Sci USA 98: 10487-10492.
  • Non-patent literature 3 Ashikari, M., Sakakibara, H., Lin, S.-Y., Yamaraoto, T., Takashi, T., Nishimura, A., Angeles, ER, Qian, Q., Kitano, H. and atsuoka, M. (2005) Cytokinin oxidase regulates rice grain production, Science, 309: 741- 745)), there is no technology to directly control the amount of active cytokinin synthesis.
  • Non-Patent Document 4 Zubko E, Adams CJ, Machaekova I, Malbeck J, Scol lan C, Meyer P. 2002.
  • Activation tagging identifies a gene from Petunia hybrida respons ible for the product ion of act ive cytokinins in plants. Plant J. 29: 797-808.
  • an object of the present invention is to elucidate an enzyme gene that can directly control the amount of active cytokinin synthesis, and to provide a transformed plant in which the amount of cytokinin is regulated using the gene.
  • the present inventors conducted a structural and functional analysis focusing on genes expressed in rice shoot apical meristems. Although it was an enzyme gene that was predicted to be involved in lysine decarboxylation in the database, it was not lysine decarboxylase activity, but a reaction that synthesizes active cytokinin from nucleotide-type cytokinin (cytokinin activation reaction). It has been newly found that it has an activity of catalyzing. Moreover, it is assumed that the process will proceed in two stages. It was also found that the enzyme gene is carried out in one step for the cytokinin activation reaction.
  • the present invention has been completed based on such findings.
  • the present invention includes the following inventions.
  • a recombinant vector comprising any of the following genes (a) to (d):
  • Amino represented by any one of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 1 0, 1 2, 14 and 16 It encodes a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the acid sequence, and having an activity of catalyzing the synthesis of an active cytokinin from a nucleotide type cytokinin Gene ''
  • Any one of the following genes (a) to (d) or the recombinant vector described in (4) is introduced into a plant cell, and the plant body is regenerated from the plant cell. How to create convertible plants.
  • SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 1 1, 1 3, or 15 A gene consisting of DNA that encodes a protein that is activated and catalyzes the synthesis reaction of active cytokinin from nucleotide-type cytokinin.
  • a method for regulating the amount of active cytokinin in a plant comprising controlling the expression level of any of the following genes (a) to (d) in the plant.
  • SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 1 1, 1 3, or 15 A gene consisting of DNA that encodes a protein that is hybridized and has an activity of catalyzing the synthesis of active cytokinin from nucleotide-type cytokinin
  • the transformant according to (1) is cultured in a medium supplemented with nucleotide-type cytokinin as a substrate, and active cytokinin is collected from the culture. Production method.
  • SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 1, 13, and .15 A gene consisting of DNA that encodes a protein that is activated and catalyzes the synthesis reaction of active cytokinin from nucleotide-type cytokinin.
  • Fig. 1 shows an electrophoretogram of the purified LOG protein preparation (lane 1: molecular size marker, lane 2: purified preparation of LOG protein (3 / z g protein).
  • Figure 2A shows the chromatogram of each substrate preparation mixture
  • Figure 2B shows iPRMP.
  • FIG. 2 C shows tZRMP
  • Fig. 2 D shows chromatograms of each reaction product when reacted with purified LOG protein using tZ as a substrate (upper: substrate only, lower: Reaction product).
  • Figure 3 shows the chromatogram of (A) cadaverine preparation, (B) reaction product chromatogram when reacted with purified LOG protein using L-lysine as substrate ((B) -1: Substrate only, (B) _2: reaction product).
  • FIG. 4 shows the substrate specificity of the LOG protein (the activity when each compound was reacted under the same conditions with the activity when iPRMP was used as a substrate as 1 was shown as a relative value).
  • Figure 5 shows the reaction formula for the synthesis of active cytokinin from nucleotide-type cytokinin by LOG protein.
  • Fig. 6 shows the results of SDS polyacrylamide electrophoresis of purified AtLOGl, 2, 3, 4, 5, 7, and 8 proteins (leftmost lane: molecular weight marker, each lane: molecular weight 31).
  • a band seen around kDa is a band derived from each AtLOG protein).
  • Figure 7 shows the substrate specificity of AtLOGl, 2, 3, 4, 5, 7, and 8 proteins (activity when each compound is reacted under the same conditions, with 100% activity when iPRMP is used as a substrate) (Error bars indicate standard deviations calculated based on the results of three reactions under the same conditions).
  • Fig. 8 shows the semiquantitative RT-PCR analysis results of AtL0G4 and 7 genes in 35S :: AtL0G4, 35S :: AtL0G7 transfectants.
  • Figure 9 shows the abnormalities of rosette leaves in the three :: AtL0G7 transformants.
  • 35S :: AtL0G7 strain # 6; T1 generation
  • transformant rosette leaves were observed with a stereomicroscope (scale: 1 mm).
  • FIG. 10 shows an abnormality of rosette leaves observed in 35S :: AtL0G4 transformants.
  • 35S :: AtL0G4 transformants One month and a half after germination and 35S :: AtL0G4 (strain # 26; T1 generation) Transformant rosette leaves were decolorized and fixed with 70% ethanol and then observed with a stereomicroscope (scale is 0.5 on the left side) cm, the right side is 2 cm).
  • Fig. 11 shows vascular morphological abnormalities observed in 35S :: AtL0G7 transformants.
  • 35S :: AtL0G7 strain # 26; T2 generation
  • Figure 12 shows the delayed leaf senescence seen in 35S :: AtL0G4 transformants. 70 days after germination with wild type and 35S:: AtL0G4 (strain # 6; T1 generation) 'transformant rosette leaves (1 cm).
  • Figure 13 shows the promotion of lateral bud formation seen in 35S :: AtL0G4 transformants. Wild-type and 35S:: AtL0G4 (strain # 13; T2 generation) 3 weeks after germination The above-ground part of the transformant was observed with a stereomicroscope (arrow: extracted flower stem, triangle: developed side bud, scale is 1 ⁇ ).
  • Fig. 14 shows the inflorescence abnormality observed in 35S :: AtL0G7 transformants. Inflorescence (scale: 1 cm) of wild type and 35S:: AtL0G7 (strain # 6; T1 generation) 3 weeks after germination.
  • FIG. 15 shows the increase in seed size seen in 35S :: AtL0G4 transformants. Wild-type and 35S:: AtL0G4 (strain # 26; T2 generation) seeds were observed with a stereomicroscope (scale is 1 cm on the left and 0.2 mm on the right).
  • Figure 16 shows the increase in seed weight seen in 35S :: AtL0G7 transformants.
  • 35S For wild type and 35S:: AtL0G7 (strain # 6; T2 generation), weighed 100 seeds and calculated the weight per grain. Error bars indicate standard deviations calculated based on results obtained from three different seed pools.
  • the present invention relates to the use of a gene encoding an enzyme protein having an activity of catalyzing a synthetic reaction of active cytokinin from nucleotide-type cytokinin.
  • the gene encoding an enzyme protein having an activity of catalyzing the synthesis reaction of active cytokinin from nucleotide-type cytokinin (hereinafter referred to as “L0G gene”) is a gene consisting of DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the sequence information of the LOG gene has already been reported in the international nucleotide sequence database (Accession number: AK071695) (nucleotide); BAD52880 (protein); Tigr locus: L0C_0s01g40630; RAP locus: 0s01g0588900).
  • the function of the protein consisting of mino acid was predicted to be lysine decarboxylase on the NCBI database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
  • the present inventors expressed the LOG gene in an undifferentiated cell group called stem cells at the tip of rice shoot apical meristem and its surrounding tissues, there is a possibility that the LOG gene may be involved in maintaining stem length meristem.
  • the functional analysis was advanced, and it was found that there is an activity that catalyzes the synthesis reaction of the active cytokinin from the nucleotide-type cytokinin, not the lysine decarboxylase activity.
  • the LOG gene used in the present invention lacks one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 as long as it retains the activity of catalyzing the synthesis reaction of active cytokinin from nucleotide-type cytokinin. It may be a gene encoding a protein comprising an amino acid sequence substituted or added.
  • the number of amino acids that may be deleted, substituted or added is preferably 1 to several.
  • 1 to 10, preferably 1 to 5 amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 may be deleted, and 1 to 10, preferably 1 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • ⁇ 5 amino acids may be added, or 1 to 10, preferably 1 to 5 amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 may be substituted with other amino acids, .
  • the LOG gene used in the present invention is a gene having 80% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and has an activity of catalyzing the synthesis reaction of active cytokinin from nucleotide-type cytokinin. It may be a gene that encodes a protein that it has.
  • the above-mentioned homology of 80% or more refers to homology of preferably 90% or more, more preferably 95% or more.
  • activity that catalyzes the synthesis reaction of active cytokinin from nucleotide-type cytokinin refers to a reaction that removes ribose 5 '-phosphate from nucleotide-type cytokinin and synthesizes active cytokinin of the base.
  • Catalytic activity La.
  • nucleotide-type cytokinin includes isopentenyl adenine difoside, 5 — “zinoic acid (i sorpenyladenine riboside o-monophosphate: iPRMP), trans-zeatin riboside 5 ′-phosphoric acid (trans-zeatin ribos ide 5 '-monophosphate: tZRMP), dihydrozeatin ribos ide t> -monophosphate:.
  • DZRMP cis-se, tin riboside 5' -monophosphate (Ci s-zeat in riboside 5'-monophosphate (cZRMP)) is included, and the active cytokinin is a dephosphorylated 5 '-phosphonic acid penicillin.
  • Adenine N 6- (delta-2-i sopentenyl) adenine (iP), ⁇ -lance-zeatin (tZ), dihydrozeatin (DZ), cis-zeatin (ci s-zeatin) : CZ
  • iP delta-2-i sopentenyl
  • tZ ⁇ -lance-zeatin
  • DZ dihydrozeatin
  • Ci s-zeatin cis-zeatin
  • “having an activity of catalyzing a synthesis reaction of an active cytokinin from a nucleotide-type cytokinin” means that the above activity is substantially equivalent to the activity of the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Say something.
  • the LOG gene according to the present invention hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and from the nucleotide type cytokinin to the active type cytokinin. It may be a gene consisting of DNA that encodes a protein having an activity that catalyzes a synthesis reaction.
  • the stringent end condition means a condition in which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed.
  • a nucleic acid having high homology that is, a complementary strand of DNA consisting of a base sequence having a homology of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 hybridizes.
  • a condition in which a complementary strand of a nucleic acid having a lower homology is not hyper-predated is mentioned.
  • the sodium salt concentration is 15 to 750 raM, preferably 50 to 750 mM, more preferably 300 to 750 mM, and the temperature is 25 to 70 ° C, preferably 50 to 70 ° C, more preferably 55 to 65 °. C, the formamide concentration is 0 to 50%, preferably 20 to 50%, more preferably 35 to 45%.
  • the filter wash conditions after hybridization are usually the sodium salt concentration. Is 15 to 600 mM, preferably 50 to 600 mM, more preferably 300 to 600 ra, and the temperature is 50 to 70 ° C, preferably 55 to 70 ° C, more preferably 60 to 65 ° C.
  • the LOG gene used in the present invention is obtained by performing PCR amplification using a primer designed based on the sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, using a nucleic acid derived from one cDNA library or one genomic DNA library as a cage, for example. It can be obtained as a nucleic acid fragment.
  • the LOG gene can be obtained as a nucleic acid fragment by performing hybridization using a nucleic acid derived from the above-mentioned library etc. as a cage and using a DNA fragment that is a part of the LOG gene as a probe.
  • the LOG gene may be synthesized as a nucleic acid fragment by various nucleic acid sequence synthesis methods known in the art such as chemical synthesis methods.
  • the amino acid deletion, addition, and substitution can be performed by modifying the gene encoding the protein by a technique known in the art. Mutation can be introduced into a gene by a known method such as the Kunkel method or the Gapped duplex method or a method equivalent thereto, for example, a mutation introduction kit (for example, Mutant_K ( Mutations are introduced using TAKARA) or Mutant-G (TAKARA)), or using the TAKARA LA PCR in vitro Mutagenesis series kit.
  • a mutation introduction kit for example, Mutant_K ( Mutations are introduced using TAKARA) or Mutant-G (TAKARA)
  • TAKARA LA TAKARA LA PCR in vitro Mutagenesis series kit.
  • Examples of the LOG gene that can be used in the present invention include the following gene groups that are expected to belong to the same gene family as the above-mentioned LOG gene (Accession number: AK071695).
  • At5g06300 and At5gl l950 Seven genes of At5g06300 and At5gl l950 are the Shiroinazuna LOG homologue genes (AtLOGl, 2, 3, 4, 5, 7, 8) that encode amino acid sequences having high homology to the amino acid sequence of the rice LOG protein. Respectively). As shown in the examples described later, these cynomolgus LOG homologue genes have the activity of catalyzing the synthesis of active cytokinin from nucleotide-type cytokinin in the same manner as the above-mentioned LOG protein, and In the overexpressing body, trait changes such as the promotion of lateral bud elongation based on an increase in the amount of active cytokinin synthesis were observed. AtLOGl, 2, 3, 4,
  • the base sequences of the 5, 7, and 8 genes are shown in SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 1, 1, 3, and 15 respectively.
  • SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, and 12 , 14 and 16 encode the amino acid sequences shown respectively.
  • these Arabidopsis LOG homologue genes are also synthesized from nucleotide-type cytokinins. As long as it has an activity that catalyzes, these mutant genes may be used, and the sequence homology range, amino acid deletion, substitution, and addition number range are as described above.
  • the recombinant vector of the present invention used for plant transformation can be constructed by introducing the above LOG gene into an appropriate vector.
  • a vector for example, pBI, pPZP, and pSMA vectors that can introduce a target gene into a plant via agrobacterium are preferably used.
  • pBI binary vectors or intermediate vector systems are preferably used, and examples thereof include pBI121, pBI101, ⁇ .2, ⁇ .3, and the like.
  • a binary vector is a shuttle vector that can replicate in Escherichia coli (Escheric hia col i) and agrobacterium, and when the plant is infected with agrobacterium, which holds the binary vector, the LB and RB sequences on the vector It is possible to incorporate the DNA surrounded by the border sequence consisting of the plant nucleus DNA.
  • a pUC vector can directly introduce a gene into a plant, and examples thereof include pUC18, pUC19, and pUC9.
  • plant virus vectors such as force reflower mo I virus (CaMV), kidney bean mosaic virus (BGMV), tobacco mosaic virus (TMV) and the like can be used.
  • the target gene is inserted between the boundary sequences (LB, RB) of the above binary vector, and this recombinant vector is amplified in E. coli.
  • the amplified recombinant vector is introduced into Agrobacterium cumefaciens C58, LBA4404, EHA101, EHA105, Agrobacterium rhizogenes L BA1334, etc. by electroporation, etc., and the Agrobacterium Is used for transduction of plants.
  • the purified DNA is cleaved with a suitable restriction enzyme, inserted into a suitable vector DNA restriction enzyme site or a multiple cloning site, and ligated to the vector.
  • a suitable restriction enzyme inserted into a suitable vector DNA restriction enzyme site or a multiple cloning site, and ligated to the vector.
  • the target gene must be incorporated into a vector so that the function of the gene is exhibited. Therefore, the vector contains a promoter, enhancer, terminator, binary vector upstream, inside, or downstream of the target gene.
  • Replication origins eg, replication origins derived from Ti or Ri plasmids
  • selection marker genes, etc. can be linked.
  • a “promoter” does not have to be derived from a plant as long as it functions in plant cells and can induce expression in a specific tissue of a plant or at a specific developmental stage.
  • Specific examples include rice LOG gene promoter, cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter, nopaline synthase gene promoter (Pnos), maize-derived ubiquitin promoter, rice-derived actin promoter, tobacco-derived PR Examples include protein promoters.
  • enhancer examples include an enhancer region that is used to increase the expression efficiency of the target gene and includes an upstream sequence in the CaMV35S promoter. '
  • the terminator can be any sequence that can terminate the transcription of the gene transcribed by the promoter.
  • the terminator of the nopaline synthase (N0S) gene the terminator of the octvin synthase (0CS) gene, CaMV Examples include the 35S RNA gene terminator.
  • selection marker gene examples include an ampicillin resistance gene, a neomycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, a bialaphos resistance gene, and a dihydrofolate reductase gene.
  • the selection marker gene may be ligated to the same plasmid together with the target gene as described above, or a recombinant vector may be prepared.
  • a recombination obtained by ligating the selection marker gene to the plasmid may be prepared separately. If prepared separately, cotransfect each vector with the host.
  • the transformed plant of the present invention can be produced by introducing the above gene or recombinant vector into the target plant.
  • gene introduction means that a target gene is released into the cells of the host plant by, for example, a known genetic engineering technique. It means introducing in a form that is possible.
  • the gene introduced here may be integrated into the genomic DNA of the host plant or may be present as it is contained in the foreign vector.
  • the agrobacterium method As a method for introducing the gene or the recombinant vector into a plant, various methods already reported and established can be used as appropriate.
  • the agrobacterium method, the PEG-calcium phosphate method, the electric mouth Examples include the position method, the liposome method, the particle gun method, and the microinjection method.
  • the agrobacterium method protoplasts are used, tissue pieces are used, and plants themselves are used (in planta method).
  • agrobacterium with Ti or Ri plasmid Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes, respectively
  • fusion with spheroplastized agrobacterium In the case of using a tissue piece, it can be carried out by infecting a sterile cultured leaf piece (leaf disc) of the target plant or infecting a callus (undifferentiated cultured cell).
  • agropacteria directly applied to water-absorbing seeds, seedlings (plant seedlings), potted plants, etc.
  • telomere length is a region of DNA that has been incorporated into a plant.
  • DNA is prepared from transformed plants and PCR is performed by designing LOG gene-specific primers. After PCR, the amplified product is subjected to agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis, or capillary electrophoresis, etc., stained with bromide zyme, SYBR Green solution, etc., and one amplified product. By detecting this as a band, transformation can be confirmed.
  • amplification products can be detected by PCR using primers previously labeled with a fluorescent dye or the like.
  • the amplification product may be bound to and the amplification product confirmed by fluorescence or enzymatic reaction.
  • protein extracted from the plant cell, fractionated by two-dimensional electrophoresis, and the LOG gene introduced into the plant cell is expressed by detecting the protein band encoded by the LOG gene. That is, it may be confirmed that the plant has been transformed. Subsequently, the N-terminal amino acid sequence of the detected protein is determined by Edman degradation and the like, and the plant cell transformation is further verified by confirming whether it matches the N-terminal sequence of SEQ ID NO: 2. can do.
  • target genes such as various reporter genes such as beta glucuronidase (GUS), luciferase (LUC) x Green fluorescent protein (GFP), chloramphenicol lucetyl transferase (CAT), beta galactosidase (LacZ), etc.
  • GUS beta glucuronidase
  • LOC luciferase
  • GFP Green fluorescent protein
  • CAT chloramphenicol lucetyl transferase
  • LacZ beta galactosidase
  • the plant used for transformation in the present invention may be either a monocotyledonous plant or a dicotyledonous plant, such as Brassicaceae (Arabidopsis thaliana, cabbage, rapeseed, etc.), Gramineae (rice, maize, barley, And so on), plants belonging to the solanaceous family (Tomato, eggplant, potato, tobacco, etc.), legumes (soybean, endou, green beans, etc.), etc., but are not limited to these plants.
  • Brassicaceae Arabidopsis thaliana, cabbage, rapeseed, etc.
  • Gramineae rice, maize, barley, And so on
  • plants belonging to the solanaceous family Tomato, eggplant, potato, tobacco, etc.
  • legumes sesybean, endou, green beans, etc.
  • plant materials to be transformed include plant organs such as stems, leaves, seeds, embryos, ovules, ovary, shoot tips, plant tissues such as cocoons and pollen, and sections thereof, undifferentiated force It may be any of plant cultured cells such as lupus and proplasts from which cell walls have been removed by enzyme treatment. In the case of applying the in planta method, water-absorbing seeds or the whole plant can be used. .
  • a transformed plant refers to the entire plant body, plant organs (eg leaves, petals, stems, roots, fruit seeds, seeds, etc.), plant tissues (eg epidermis, phloem, soft tissue, xylem, vascular bundles) Etc.), or plant cultured cells (for example, callus).
  • plant organs eg leaves, petals, stems, roots, fruit seeds, seeds, etc.
  • plant tissues eg epidermis, phloem, soft tissue, xylem, vascular bundles
  • Etc. plant cultured cells
  • an organ or an individual should be regenerated by a known tissue culture method. Yes.
  • a method for regenerating plant cells from plant cells Regeneration from a plant cell to a plant body can be performed, for example, as follows.
  • plant tissues or protoplasts are used as plant materials to be transformed, these are inorganic elements, vitamins, carbon sources, sugars as energy sources, plant growth regulators (auxin, cytokinin, gibberellins).
  • plant growth regulators auxin, cytokinin, gibberellins.
  • Plant hormones such as abscisic acid, ethylene, brassinosterolide, etc.
  • force-loss induction a sterilized callus-forming medium to form dedifferentiated callus that grows indefinitely
  • the callus thus formed is transferred to a new medium containing a plant growth regulator such as auxin and further propagated (passaged).
  • redifferentiation induction organ redifferentiation
  • induction of regeneration can be performed by appropriately setting the types and amounts of various components such as plant growth regulators such as auxin and carbon sources, light, temperature, etc. in the medium.
  • plant growth regulators such as auxin and carbon sources, light, temperature, etc. in the medium.
  • somatic embryos, adventitious roots, adventitious buds, adventitious foliage, etc. are formed and further grown into complete plants.
  • it may be stored in a state before it becomes a complete plant (for example, encapsulated artificial seed, dried embryo, freeze-dried cell, tissue, etc.).
  • the transformed plant of the present invention is a progeny plant obtained by sexual reproduction or asexual reproduction of a plant into which the gene has been introduced (including a plant regenerated from a transformed cell or a callus), and its It also includes some of the tissues and organs of the progeny plants (seed, protoplasts, etc.).
  • the transformed plant of the present invention can be mass-produced by obtaining propagation materials such as seeds and protoplasts from a plant transformed by introducing the LOG gene, and cultivating or culturing them.
  • the transformed plant is capable of, for example, promoting lateral bud elongation (inhibition of apical dominance), Promotion of germination, breaking of dormancy, promotion of cell division, promotion of chlorophyll synthesis, inhibition of senescence, promotion of fruit enlargement, increase in number of flower stems, formation of large seeds, formation of thick veins, delayed senescence of leaves, changes in inflorescence, etc. Will be accepted.
  • the LOG gene is expressed in a limited region of the shoot apical meristem from previous research findings, and the number of rice grains is significantly reduced in the disrupted strain of this gene, and in the shoot apical meristem during the flower bud differentiation stage It has been suggested that there is a correlation between the cytokinin content and the number of grains. Therefore, rice transformed with the LOG gene expressed specifically in the shoot apical meristem can be expected to increase the grain size.
  • the expression level of the LOG gene in plants can be controlled locally or globally, for example by the promoter used, the LOG promoter, the cytokininoxidase 2 (0sCKX2) promoter, the aging—inducible gene (SAG) promoter; (Promoting or suppressing) can regulate the amount of active cytokinin in the plant, and as a result, the growth and physiological actions of various plants involving cytokinin, such as the number of grains, side buds (buds) It is possible to regulate formation and elongation, aging, dormancy, falling fruit, cell cycle, photosynthesis, transpiration, etc.
  • SAG aging—inducible gene
  • the protein encoded by the LOG gene is obtained by transforming a host with a recombinant vector into which the gene has been introduced to obtain a transformant, culturing the transformant, and collecting the transformant from the culture.
  • the “culture” means not only the culture supernatant but also any cultured cells or cultured cells, or crushed cells or cells.
  • the recombinant vector may be any recombinant vector that can replicate in a host, such as plasmid DNA or phage DNA.
  • plasmid DNA includes plasmids derived from E. coli (eg, pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, pBluescript, etc.), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, etc.), and plasmids derived from yeast.
  • retrovirus or vaccinia virus Insect virus vectors such as animal viruses and baculoviruses can also be used.
  • the above vector contains a replication origin, a promoter, and a selection marker, and may contain an enhancer, a terminator, a ribosome binding site, a polyadenylation signal, and the like as necessary.
  • E. coli vectors are derived from, for example, ColEl, R-factor, and F-factor
  • yeast vectors are derived from, for example, 2 Aim DNA
  • ARS1 and animal cell vectors are SV40, those derived from adenovirus are used.
  • vectors for E. coli include trp promoter, lac promoter, PL promoter, PR promoter, cspA promoter, etc.
  • yeast vectors include gal l promoter, PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter.
  • a motor, ADH promoter, A0X1 promoter, etc., and animal cell vectors such as SRa promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, etc. are used.
  • vectors for E. coli include kanamycin resistance gene, ampicillin resistance gene, tetracytalin resistance gene, etc.
  • yeast vectors include Leu2, Trpl, Ura3 genes, etc.
  • animal cell vectors include Neomycin resistance gene, thymidine kinase gene, dihydrofolate reductase gene, etc. are used.
  • prokaryotic or eukaryotic organisms can be used as the host.
  • Prokaryotes include bacteria belonging to the genus Escherichia such as Escherichia coli, the genus Chanininos such as Bacillus subtilis, and the genus Pseudomonas such as Pseudomonas putida.
  • Eukaryotic organisms include yeasts such as Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharotnyces pombe; animal cells such as COS cells, CH0 cells, Vero and C123 cells, or Sf9 And insect cells such as SF12.
  • yeasts such as Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharotnyces pombe
  • animal cells such as COS cells, CH0 cells, Vero and C123 cells, or Sf9 And insect cells such as SF12.
  • a medium for cultivating transformants obtained using microorganisms such as E. coli and yeast as a host contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the microorganism, so that the transformant can be cultured efficiently. Any medium that can be used, natural medium, synthetic medium Any of these may be used.
  • Examples of the carbon source include carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, and starch, organic acids such as vinegar and propionic acid, and alcohols such as ethanol and propanol.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium salts of organic acids and other nitrogen-containing compounds, as well as peptone, meat extract, corn steep liquor, etc. Is mentioned.
  • Examples of inorganic substances include potassium phosphate, potassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, and calcium carbonate.
  • the culture is usually carried out under aerobic conditions such as shaking culture or aeration and agitation culture, for example, at 25 to 35 ° C. for about 12 to 48 hours.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid or an alkaline solution.
  • an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium as necessary.
  • the target protein When the target protein is produced in the cells or cells after culturing, the target protein is collected by crushing the cells or cells by ultrasonic treatment, repeated freezing and thawing, homogenizer treatment, etc. When the target protein is produced outside the cells or cells, use the culture solution as it is, or remove the cells or cells by centrifugation or the like. Then, by using general biochemical methods used for protein isolation and purification, such as ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. alone or in appropriate combination, The target protein can be isolated and purified from the culture.
  • a nucleotide-type cytokinin is added to the medium as a substrate so that it is active in the culture.
  • Type cytokinin can be synthesized.
  • the nucleotide-type cytokinin used as the substrate is as described above.
  • the transformation is first performed by preculture. It is preferable to carry out the culture by activating the recombinant and inoculating it into the main culture medium for production of active cytokinin.
  • the substrate content in the pre-culture medium and the main culture medium is about 0.1 to 1.0% in terms of solid content in the medium.
  • the amount of the transformant used in the medium is, for example, about 1 to 100 mg per 1 L of the culture medium when inoculated with bacterial cells, and may be appropriately increased or decreased depending on the substrate content.
  • the total amount of the substrate may be added at the start of the culture, or may be added continuously or intermittently during the culture.
  • the produced active cytokinin may be taken out after completion of the culture, or may be taken out continuously or intermittently during the culture.
  • Culturing is terminated when the desired amount of active cytokinin produced in the culture reaches a maximum.
  • the active cytokinin in the culture solution is purified from the culture solution by a conventional method after completion of the culture. Purification may be performed by appropriately combining well-known means usually used in the technical field, for example, filtration, centrifugation, ion exchange or adsorption chromatography, solvent extraction, and the like as necessary. Best Mode for Carrying Out the Invention
  • the LOG gene (Access ion number: AK071695 (nucleotide); BAD52880 (protein); Tigr locus: L0C_0s01g40630; RAP locus: 0s01g0588900) is predicted to encode a protein consisting of 242 amino acids. On the base (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), its function was predicted as lysine decarboxylase.
  • a gene with homology to the LOG gene is located on the Rhodococcus fasciens fas locus "Agrobacterium rhizogenes Ri puffs ⁇ (close to the isopentenyltransferase (IPT) that catalyzes the initial reaction of cytokinin biosynthesis. Therefore, the following experiment was conducted to examine the function of the LOG protein.
  • coli colony was cultured overnight at 37 ° C in Luria-Bertani medium containing 50 / ig / mL ampicillin and 20 / zg / mL chloramphenicol, and then 30mL of the overnight culture was added to 100 / g / mL ampicillin, 20 / Modified M9 medium containing xg / mL cucumber lamphenic acid and lng / mL tetracycline (M9 salt, 1M sorbitol, 1% casaraino acid, 2% sucrose, ImM MgS0 4 , 0.
  • M9 salt 1M sorbitol, 1% casaraino acid, 2% sucrose, ImM MgS0 4 , 0.
  • IraM CaCl 2 10 g / mL thiamine-
  • Protein extraction from E. coli and LOG protein purification with nickel NTA superflo resin were performed as follows. First, E. coli pellets were suspended in 6 mL of Lys is buffer [50raM NaHP0 4 , 300 mM NaCl, lOraM imidazole, ImM MgCl 2 , 0.5 mM dithiothreitol (DTT), pH 8.0], and protease inhibitor cocktai l (X100, Signia ⁇ OL and 6mg lysozyme chloride were added and left on ice for 30 minutes, and then E. coli cells were destroyed with an ultrasonic disrupter (Tytec), using microchips, 20 seconds x 8 times, Duty cycle 50%, output 5.
  • Lys is buffer 50raM NaHP0 4 , 300 mM NaCl, lOraM imidazole, ImM MgCl 2 , 0.5 mM dithiothreitol (DTT), pH
  • Recombinant LOG protein 3 / ig obtained in Example 1 was used as a substrate for various cytokinins. As a response.
  • the site cytokines used were N 6- (delta-2-isopentenyl) adenine (iP), trans-zeatin (tZ), cis-zeatin C), iP riboside (iPR), tZ riboside. (tiR), cZ riboside vcz, R), iPR 5'-monophosphate (iPRMP), tZR 5'-monophosphate (tZRMP).
  • the reaction conditions were 50ra Tris-HCl, lraM MgCl 2 , 50 / zM substrate, pH7, incubation at 30 ° C for 2 hours, and the reaction volume was 100 // L. 20 ° /.
  • the reaction was stopped by adding 10 // L of acetic acid, centrifuged at 15,000 rpm for 20 minutes at room temperature, and the supernatant 20 // L was analyzed by liquid chromatography using HPLC (Waters Alliance 2695 / PDA detector 2996).
  • the column used was Sy ⁇ etry C18, 3.5 ⁇ m, 2.1X100 mm cartridge (Waters). Elution was performed using solvent C (100% acetonitrile) and solvent D (2% acetic acid).
  • the elution conditions and solvent concentration gradient program are shown in Table 1 below.
  • LOG protein was previously expected to be lysine decarboxylase, we examined whether it was reactive with lysine.
  • Recombinant LOG protein 3 g was added at 40 ° C, 60 ° C in a reaction solution 100 / zL consisting of 500 mM sodium acetate buffer, H 6.0, 5 mL—lysine Incubated for minutes.
  • 34 // L of 20% trichloroacetate was added, centrifuged at 10,000g for 20 minutes, and then benzoylated using 100 // L of the supernatant.
  • the specific operation is as follows. 2N NaOH was added to 100 / L of the reaction solution, L of benzoyl chloride was further added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 20 minutes.
  • Substrate and reaction products were monitored by 226 nra absorption. Since the purified substance produced by lysine decarboxylase is expected to be cadaverine, the cadaverine preparation lrnnol was separately injected to determine the elution time of the reaction product. As shown in Figure 3, the LOG protein did not show any reactivity to lysine. Therefore, it was judged that it does not have the function as lysine decarboxylase expected in the database.
  • Example 4 Examination of presence or absence of substrate specificity for nucleotide-type cytokinin bodies The anti-specificity of LOG protein to nucleotide-type cytokinin bodies was examined. At the same time, the presence or absence of reactivity to AMP was also examined.
  • iPRMP, tZR P, dihydrozeatin riboside 5 '-monophosphate (DZRMP), cZR Seven types of 5'-monophosphate (cZRMP), iPR '5'-diphosphate (iPRDP), iPR 5'-triphosphate (iPRTP), and AMP were used as follows.
  • LOG protein uses cytokinin nucleoside 5, monophosphate such as tZRMP, DZRP, and cZRMP in addition to iPRMP. However, it did not show any reactivity to AMP, iPRDP, or iPRTP.
  • LOG protein is predicted to function as a lysine decarboxylase in the database, the LOG protein actually removes ribose 5 ′-phosphate from the nucleotide-type cytokinin, and the active protein of the base. It was found to be an enzyme that catalyzes a completely new reaction that produces tokainin. Figure 5 shows the reaction catalyzed by the LOG protein. From the above results, it is concluded that LOG protein is suitable as a name for cytokinin nucleoside 5'-monophosphate phosphoribohydrolase.
  • Example 6 Isolation of Arabidopsis LOG Homolog Gene (AtLOGs) cDNA
  • Arabidopsis thaliana has a cytokinin-activating enzyme with the same function as LOG protein.
  • a survey was conducted. First, search for homologous genes in Arabidopsis by performing a prote in BLAST search based on the amino acid sequence of the LOG protein in the NCBI database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). did.
  • Arabidopsis genes AtL0Gl-9 Arabidopsis thaliana LOG 1-9; Table 3
  • the enzyme activity of the purified AtLOG protein was evaluated under the same reaction conditions as in Example 2.
  • cytokinin nucleosides such as iPRMP, tZRMP, DZRMP, and cZRMP were used as the substrate. Became clear (Fig. 7). Similar to LOG protein, it showed little reactivity to AMP, iPRDP, and iPRTP.
  • the enzyme characteristics of each AtLOG protein for iPRMP were determined in the same manner as in Example 5 (Table 4).
  • the K m , V max , and k cat values were calculated based on the reaction at the optimum pH for each AtLOG protein. Soil indicates the standard deviation calculated based on the results of three runs under the same conditions. Table 4
  • the collected seeds were sown in MS medium containing 50 ng / ml kanamycin.
  • individuals exhibiting kanamycin resistance were selected.
  • 26 kanamycin-resistant lines (hereinafter referred to as 35S:: AtL0G4, 35S :: AtLOG7) that were successfully transfected were selected for each 26 lines.
  • the selected T1 generation 35S:: AtL0G4 and 35S :: AtL0G7 transformants showed similar phenotypes.
  • Tl generation 35S:: AtL0G4 (lines # 6, # 26), 35S:: AtL0G7 (lines # 3, # 26) extracted from rosette leaves Semi-quantitative RT-PCR analysis was performed using primers for amplification of the AtL0G4, 7 gene and Actin2 gene. As a control, cDNA (WT) derived from wild-type rosette leaves was used. The RT-PCR reaction was performed with 25 cycles of AtL0G4 and 35 cycles of Actin2 and AtL0G7. As a result, overexpression of AtL0G4 and AtL0G7 genes was confirmed in each of the two lines of plants (Fig. 8).
  • the 35S :: AtL0G4 and 35S:: AtL0G7 transformants showed similar phenotypes, and it was confirmed that the phenotype was inherited from the T1 generation to the T2 generation.
  • 35S :: AtL0G4, 35S:: AtL0G7 Transformants do not show any particular morphological abnormality with wild type until around 1 week after germination, but from around 2 weeks after germination where many rosette leaves are formed and developed. A remarkable form of abnormality was observed.
  • the 35S :: AtL0G4, 35S :: AtL0G7 transformants formed deep green rose leaves along the veins (FIG. 9).
  • a rice gene which has been previously encoded as a gene encoding lysine decarboxylase protein, is synthesized from a nucleotide-type cytokinin in the cytokinin biosynthetic pathway (an activation reaction of cytokinin). It was newly elucidated that it has a function of catalyzing the reaction. Therefore, the amount of active cytokinin (base) can be controlled directly by using this gene, which was previously only possible by modifying the degradation reaction of site power sinin. become.
  • trait changes such as an increase in the number of flower stems, formation of large seeds, formation of thick leaf veins, and changes in inflorescence were observed, resulting in increased yields of crops, cut flowers, ornamental plants, etc. Expected to improve product value by diversifying expression traits.

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Description

活性型サイ トカイニン合成酵素遺伝子の利用
技術分野
本発明は、 活性型サイ トカイニン合成酵素遺伝子の利用に関する。 より詳細に は、 ヌクレオチド型サイ トカイニンから活性型サイ トカイニンの合成反応を触媒 する活性を有する酵素遺伝子を用いて形質転換植物を作出する方法などに関する。
明 田
背景技術
サイ トカイニンは、 細胞***の促進、 細胞周期の 節、 老化防止、 腋芽の活性 化など多用な生理活性を有し、 作物の量的生産性を制御する極めて重要な植物ホ ノレモンである。
サイ トカイニンの基本骨格はアデニンの 6位の窒素原子に炭素 5つのプレニル 基をもつ構造であり、 側鎖構造の違いにより トランスゼァチン（tZ)、 イソペンテ ニルアデニン（iP)などがある。 従来のサイ トカイニン代謝系研究の知見から、 活 性型サイ トカイニン （塩基体） 合成は少なくとも以下の三段階の反応を経ると考 えられてきた。 まず、 サイ トカイニン合成の第一反応ではアデニンヌクレオチド とジメチルァリルニリン酸 （DMAPP) の縮合反応により、 ヌクレオチド型サイ トカ ィニンが生産される。 このヌクレオチド体はサイ トカイニンとしての活性を持た ないが、 その後、 第二反応において、 脱リン酸化酵素によりヌクレオシド型サイ トカイニンになり、 さらにヌクレオシダーゼの働きにより リボースが外れ、 塩基 体の活性型サイ トカイニン分子に変換される- (非特 F文献 1、 総説： Sakakibara, H. (2006) Cytokinins： Activity, biosynthesi s and translocation. Annu. Rev. Plant Biol. 57： 431-449. )。 実際に 1980年代の酵素レベルの研究において、 そ れぞれの反応を触媒する酵素の存在が示唆されており、 第一反応 （縮合反応)、 つ まりヌク レオチド型サイ トカイニンの合成反応を触媒する酵素遺伝子（IPT)は 2001 年に同定されている（特許文献 1 ： W02002/072818)。 しかレ、 残りの 2段階 からなる第二反応 （活性化反応） を触媒する酵素遺伝子の実体は未だわかってい ない。 また、 それらの遺伝子の実体がわかった場合においても、 塩基体のサイ ト カイニンの生成量を人為的に制御するためにはヌクレオチド型からヌクレオシド 型、さらに塩基型という 2段階のステップを同日寺に改変しなければならないため、 両反応を触媒する酵素遺伝子を同定した上、 それらの酵素遺伝子を同時に制御す る必要が り、 その操作は容易ではない。 一方、 サイ トカイニン分解反応を触媒 する酵素遺伝子（CKX)の制御によっても活性型サイ トカイニンの量的制御を行う ことは可能であるが （非特許文献.2 ： Werner T, Motyka V, Strnad M, Schmul l ing T. (2001) Regulation of plant growth by cytokinin. Proc Natl Acad Sci USA 98： 10487- 10492.、 非特許文献 3 ： Ashikari, M.， Sakakibara, H. , Lin, S. - Y. , Yamaraoto, T. , Takashi, T. , Ni shimura, A. , Angeles, E. R. , Qian, Q. , Kitano, H. and atsuoka, M. (2005) Cytokinin oxidase regulates rice grain production, Science, 309： 741-745. )、 活性型サイ トカイニン合成量を直接制御する技術は今 まで存在しない。 また、 IPT の過剰発現でも塩基体の量は増加するものの、 サイ トカイニシ総量も極端に増大し、 植物体としての形態が大きく変わってしまうと レヽぅ問題がある （非特許文献 4 ： Zubko E, Adams CJ, Machaekova I, Malbeck J, Scol lan C， Meyer P. 2002. Activation tagging identifies a gene from Petunia hybrida respons ible for the product ion of act ive cytokinins in plants. Plant J. 29： 797-808. ) 0 発明の開示
従って、 本発明の課題は、 活性型サイ トカイニン合成量を直接制御することの できる酵素遺伝子を解明し、 当該遺伝子を利用してサイ トカイニン量が調節され た形質転換植物を提供することにある。
本発明者らは、 上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、 イネ茎頂***組 織に発現している遺伝子に着目してその構造と機能解析を行ったところ、 当該遺 伝子はデータベース上ではリジンの脱炭酸に関わると予想されていた酵素遺伝子 であったが、 リジン脱炭酸酵素活性ではなく、 ヌクレオチド型サイ トカイニンか ら活性型サイ トカイニンを合成する反応 （サイ トカイニン活性化反応） を触媒す る活性を有することを新たに見出した。 しかも、 従来 2段階で進むことが想定さ れていたサイ トカイ二ン活性化反応を、 当該酵素遺伝子は 1段階で行うことをも 見出した。
本発明はかかる知見により完成されたものである。
すなわち、 本発明は以下の発明を包含する。
(1) 以下の（a)〜（d)の!/、ずれかの遺伝子が導入された形質転換体。 .
(a) 配列番号 1に示す塩基配列からなる DNAからなる遺伝子
(b) 配列番号 1に示す塩基配列からなる DNA と相補的な塩基配列からなる DNA とストリジジェントな条件下でハイプリダイズし、 かつヌクレオチド型サイ トカ ィニンから活性型サイ トカイニンの合成反応を触媒する活性を有するタンパク質 をコードする DNAからなる遺伝子
(c) 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6のいずれかに示すアミノ 酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
(d) 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6のいずれかに示すアミノ 酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミ ノ酸配列からなり、 かつヌクレオチド型サイ トカイニンから活性型サイ トカイ二 ンの合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
(2) 形質転換体が形質転換植物である、 （1)に記載の形質転換体。
(3) 植物が、 植物体、 植物器官、 植物組織、 又は植物培養細胞である（2)に記載の 形質転換体。
(4) 以下の（a)〜（d)のいずれかの遺伝子を含む組換えベクター。
(a) 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5のいずれかに示す塩基配列 からなる DNAからなる遺伝子
(b) 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5のいずれかに示す塩基配列 からなる DNAと相補的な塩基配列からなる DNAとス トリンジェントな条件下でハ イブリダィズし、 かつヌクレオチド型サイ トカイニンから活性型サイ トカイニン の合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする DNAからなる遺伝子
(c) 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6のいずれかに示すアミノ 酸配列かちなるタンパク質をコードする遺伝子
(d) 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6のいずれかに示すアミノ 酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミ ノ酸配列からなり、 かつヌクレオチド型サイ トカイニンから活性型サイ トカイ二 ンの合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子 '
(5) 以下の（a)〜（d)のいずれかの遺伝子又は（4)に記載の組換えベクターを植物 細胞に導入し、 該植物細胞から植物体を再生することを特徴とする、 形質転換植 物の作出方法。
(a) 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5のいずれかに示す塩基配列 からなる DNAからなる遺伝子
(b) 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5のいずれかに示す塩基配列 からなる DNAと相補的な塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件下でハ イブリダィズし、 かつヌクレオチド型サイ トカイニンから活性型サイ トカイニン の合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする DNAからなる遺伝子
(c) 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6のいずれかに示すアミノ 酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
(d) 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6のいずれかに示すアミノ 酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミ ノ酸配列からなり、 かつヌクレオチド型サイ トカイニンから活性型サイ トカイ二 ンの合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
(6) 以下の（a)〜（d) のいずれかの遺伝子の植物における発現量を制御すること を特徴とする、 植物における活性型サイ トカイニン量の調節方法。
(a) 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5のいずれかに示す塩基配列 からなる DNAからなる遺伝子
(b) 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5のいずれかに示す塩基配列 からなる DNAと相補的な塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件下でハ イブリダイズし、 かつヌクレオチド型サイ トカイニンから活性型サイ トカイニン の合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする DNAからなる遺伝子
(c) 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6のいずれかに示すアミノ 酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
(d) 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6のいずれかに示すアミノ 酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミ ノ酸配列からなり、 かつヌクレオチド型サイ トカイニンから活性型サイ トカイ二 ンの合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
(7) (1)に記載の形質転換体を、ヌクレオチド型サイ トカイニンを基質として添加 した培地にて培養し、 培養物から活性型サイ トカイニンを採取することを特徴と する、 活性型サイ トカイニンの製造方法。
(8) 以下の（a)〜（d)のいずれかの遺伝子を植物体内で過剰発現させることにより、 植物の形質を変化させる方法。
(a) 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5のいずれかに示す塩基配列 からなる DNAからなる遺伝子
(b) 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 .1 5のいずれかに示す塩基配列 からなる DNAと相補的な塩基配列からなる DNA とストリンジヱントな条件下でハ イブリダィズし、 かつヌクレオチド型サイ トカイニンから活性型サイ トカイニン の合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする DNAからなる遺伝子
(c) 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6のいずれかに示すアミノ 酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
(d) 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6のいずれかに示すアミノ 酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミ ノ酸配列からなり、 かつヌグレオチド型サイ トカイニンから活性型サイ トカイ二 ンの合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
(9) 植物の形質の変化が、 花茎数の増加、.大きな種子の形成、 太い葉脈の形成、 花序の変更である、 （8)に記載の方法。 図面の簡単な説明
図 1は、 LOG タンパク質の精製標品の電気泳動図を示す （レーン 1 ：分子サイ ズマーカー、 レーン 2 ： LOGタンパク質の精製標品（3 /z g protein)。
図 2 Aは、 各基質標品混合物のクロマトグラム、 ならびに図 2 Bは iPRMP、 図
2 Cは tZRMP、 図 2 D'は tZを基質としてそれぞれ用いて精製 LOGタンパク質と反 応させた場合の各反応生成物のクロマドグラムを示す （上側：基質のみ、 下側： 反応生成物）。
図 3は、 （A)カダベリン標品のクロマトグラム、 （B)L-リジンを基質として用い て精製 LOG タンパク質と反応させた場合の反応生成物 クロマトグラムを示 'す ((B)- 1:基質のみ、 （B)_2：反応生成物）。
図 4は、 LOGタンパク質の基質特異性を示す（iPRMPを基質としたときの活性を 1として各化合物を同じ条件で反応させた際の活性を相対値で示した）。
図 5は、 LOG タンパク質によるヌクレオチド型サイ トカイニンから活性型サイ トカイニンの合成反応式を示す。
図 6は、 AtLOGl, 2， 3, 4， 5， 7, 8タンパク質の精製標品の SDSポリアクリル アミ ド電気泳動結果を示す （一番左側のレーン ：分子量マーカー、 各レーン ：分 子量 31 kDa付近にみられるバンドが各 AtLOGタンパク質由来のバンド）。
図 7は、 AtLOGl, 2, 3, 4， 5， 7， 8タンパク質の基質特異性を示す （iPRMPを 基質にしたときの活性を 100%として、各化合物を同じ条件で反応させた際の活性 を相対値で示した。 エラーバーは、 同一条件で 3回反応を行った結果を元に計算 した標準偏差を示す)。
図 8は、 35S::AtL0G4， 35S:： AtL0G7 开質転換体における AtL0G4， 7 遺伝子の 半定量的 RT-PCR解析結果を示す。
図 9は、 3お：： AtL0G7 形質転換体にみられるロゼット葉の異常を示す。 発芽後 1ヶ月半の野生型と 35S::AtL0G7 (系統 #6; T1世代） 形質転換体のロゼット葉を 実体顕微鏡によって観察した （スケールは 1 mm)。
図 1 0は、 35S::AtL0G4 形質転換体にみられるロゼット葉の異常を示す。 発芽 後 1ヶ月半の野生型と 35S::AtL0G4 (系統 #26; T1世代） 形質転換体のロゼット葉 を 70%エタノールにより脱色固定したのちに実体顕微鏡によって観察した （スケ ールは左側が 0.5 cm、 右側が 2 瞧）。
図 1 1は、 35S::AtL0G7 形質転換体にみられる維管束の形態異常を示す。 発芽 後 1ヶ月の野生型と 35S::AtL0G7 (系統 #26; T2世代） 形質転換体のロゼット葉を
70%エタノールにより脱色固定、テクノビット樹脂固定後、 ミクロ トームにより切 断して横断切片を作成した。 横断切片をトルイジンブルー染色後、 光学顕微鏡に より観察を行った。 喑視野条件で白く映っている部分が導管を示す （スケールは 50/ m)0
図 1 2は、 35S::AtL0G4形質転換体にみられる葉の老化遅延を示す。 発芽後 70 日目の野生型と 35S: :AtL0G4 (系統 #6; T1世代)' 形質転換体のロゼット葉 （スケ 一ノレ ίま 1cm)。
図 1 3は、 35S: :AtL0G4 形質転換体にみられる側芽形成の促進を示す。 発芽後 3週間目の野生型と 35S: :AtL0G4 (系統 #13; T2世代） 形質転換体の地上部を実体 顕微鏡により観察した （矢印：抽苔した花茎、 三角印：発達した側芽、 スケール は 1 瞧)。
図 1 4は、 35S::AtL0G7 形質転換体にみられる花序の異常を示す。 発芽後 3週 間目の野生型と 35S: :AtL0G7 (系統 #6; T1世代） 形質転換体の花序 （スケールは 1 cm)。
図 1 5は、 35S::AtL0G4 形質転換体にみられる種子サイズの増加を示す。 野生 型と 35S: :AtL0G4 (系統 #26; T2世代）の種子を実体顕微鏡で観察した （スケール は左側が 1 cm、 右側が 0.2 mm)。
図 1 6は、 35S: :AtL0G7 形質転換体にみられる種子重量の増加を示す。 野生型 と 35S: :AtL0G7 (系統 #6; T2世代）について種子 100粒の重量を測定し、 一粒当た りの重量を計算した。 エラーバーは、 異なる 3つの種子プールをもとに得られた 結果を元に計算した標準偏差を示す。 本願は、 2006年 9月 4 日に出願ざれた日本国特許出願 2006-238691号の優先権 を主張するものであり、 該特許出願の明細書に記載される内容を包含する。. 以下に、 本発明について詳細に述べる。
( 1) 活性型サイ トカイニン合成酵素遺伝子
本発明は、 ヌクレオチド型サイ トカイニンから活性型サイ トカイニンの合成反 応を触媒する活性を有する酵素タンパク質をコードする遺伝子の利用に関する。 上記のヌクレオチド型サイ トカイニンから活性型サイ トカイニンの合成反応を 触媒する活性を有する酵素タンパク質をコードする遺伝子 （以下、 「L0G遺伝子」 という） は、 配列番号 1に示す塩基配列を有する DNAからなる遺伝子である力、 又は配列番号 2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であ る。 LOG 遺伝子の配列情報は、 国際塩基配列データベースにおいて既に報告され ており （Accession number： AK071695) (nucleotide)； BAD52880 (protein)； Tigr locus : L0C_0s01g40630 ; RAP locus : 0s01g0588900)、 本遺伝子がコードする 242 ア ミ ノ 酸か ら な る タ ンパ ク 質の機能は、 NCBI デー タ ベー ス 上 (http : //www. ncbi. nlm. nih. gov)ではリジン脱炭酸酵素と予測されていた。しかし ながら、 本発明者らは、 LOG 遺伝子がイネ茎頂***組織先端の幹細胞と呼ばれる 未分化の細胞群とその周辺組織に発現していることから、 茎長***組織維持に関 わる可能性があると考え、 その機能解析を進めたところ、 リジン脱炭酸酵素活性 ではなく、 新たにヌクレオチド型サイ トカイニンから活性型サイ トカイニンの合 成反応を触媒する活性があることを見出した。
本発明に使用する LOG遺伝子は、 ヌクレオチド型サイ トカイニンから活性型サ ィ トカイニンの合成反応を触媒する活性を保持する限り、 配列番号 2に示すアミ ノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたァ ミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
ここで、 欠失、 置換若しくは付加されてもよいアミノ酸の数としては、 好まし くは、 1個から数個である。例えば、配列番号 2に示すアミノ酸配列の 1〜10個、 好ましくは 1〜5個のァミノ酸が欠失してもよく、 配列番号 2に示すァミノ酸配 列に 1〜10個、 好ましくは 1〜 5個のアミノ酸が付加してもよく、 あるいは、 配 列番号 2に示すァミノ酸配列の 1〜10個、好ましくは 1〜 5個のァミノ酸が他の アミノ酸に置換してもよレ、。
また、 本発明に使用する LOG遺伝子は、 配列番号 2に示すアミノ酸配列と 80% 以上の相同性を有する遺伝子であって、 かつヌクレオチド型サイ トカイニンから 活性型サイ トカイニンの合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードす る遺伝子であってもよい。 上記 80%以上の相同性は、 好ましくは 90%以上、 より 好ましくは 95%以上の相同性をいう。
ここで、「ヌクレオチド型サイ トカイニンから活性型サイ トカイニンの合成反応 を触媒する活性」 とは、 ヌクレオチド型サイ トカイニンからリボース 5 ' -—リン 酸を外し、 塩基体の活性型サイ トカイニンを合成する反応を触媒する活性」 をい ラ。
本発明において、 「ヌクレオチド型サイ トカイニン」 には、 イソペンテニルアデ ニンジホシド、 5 — "ジン酸 (i sopentenyladenine ribos ide o -monophosphate ： iPRMP )、 トランス-ゼァチンリ ボシド 5' -—リ ン酸 ( trans-zeatin ribos ide 5' -monophosphate ： tZRMP ) 、 ジ ヒ ド ロ ゼァチ ン リ ボシ ド 5' -— リ ン酸 (dihydrozeatin ribos ide t> -monophosphate :. DZRMP)、 シス -セ,チンリボシド 5' -一リン酸 （ci s-zeat in riboside 5' - monophosphate： cZRMP)力 S含まれ、 活性型 サイ トカイニンは上記ヌクレオチド型サイ トカイニンがそれぞれ脱リボース 5 ' - — リ ン 酸 さ れ た ィ ソ ペ ン テ ニ ル ア デ ニ ン (N6- (delta-2-i sopentenyl) adenine： iP)、 卜ランス-ゼァチン（trans-zeatin : tZ)、 ジヒ ドロゼァチン （dihydrozeat in： DZ)、 シス-ゼァチン （ci s- zeatin： cZ)が含ま れる。
また、「ヌクレオチド型サイ トカイニンから活性型サイ トカイニンの合成反応を 触媒する活性を有する」 とは、 上記の活性が、 配列番号 2に記載のアミノ酸配列 を有するタンパク質が有する活性と実質的に同等であることをいう。
本発明に係る LOG遺伝子は、 配列番号 1に示す塩基配列からなる DNAと相補的 な塩基配列からなる DNAとス トリンジェントな条件下でハイブリダイズし、 かつ ヌクレオチド型サイ トカイニンから活性型サイ トカイニンの合成反応を触媒する 活性を有するタンパク質をコードする DNAからなる遺伝子であってもよレ、。
ここで、 ストリンジエンドな条件とは、 いわゆる特異的なハイブリッドが形成 され、 非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。 例えば、 相同性が高 い核酸、すなわち配列番号 1で表わされる塩基配列と 80%以上、好ましくは 90% 以上、 より好ましく 95%以上の相同性を有する塩基配列からなる DNAの相補鎖が ハイブリダィズし、 それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイプリダイズしない 条件が挙げられる。 より具体的には、 ナトリウム塩濃度が 15〜750raM、 好ましく は 50〜750mM、より好ましくは 300〜750mM、温度が 25〜70°C、好ましくは 50〜70°C、 より好ましくは 55〜65°C、 ホルムアミ ド濃度が 0〜50%、 好ましくは 20〜50%、 より好ましくは 35〜45%でめ条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、, ハイブリダィゼーション後のフィルターの洗浄条件が、 通常はナトリゥム塩濃度 が 15〜600mM、 好ましくは 50〜600mM、 より好ましくは 300〜600ra 、 温度が 50〜 70°C、 好ましくは 55〜70°C、 より好ましくは 60〜65°Cである。
本発明に用いる LOG遺伝子は、 例えば配列番号 1又は 2の配列に基づいて設計 したプライマーを用いて、 cDNAライブラリ一又はゲノム DNAライブラリ一等由来 の核酸を铸型とした PCR増幅を行うことにより、 核酸断片として得ることができ る。 また LOG遺伝子は、 上記ライブラリ一等由来の核酸を铸型とし、 当該 LOG遺 伝子の一部である DNA断片をプローブとしてハイブリダイゼーションを行うこと により、 核酸断片として得ることができる。 あるいは LOG遺伝子は、 化学合成法 等の当技術分野で公知の各種の核酸配列合成法によって、 核酸断片として合成し てもよい。
上記アミノ酸の欠失、 付加、 及び置換は、 上記タンパク質をコードする遺伝子 を、当該技術分野で公知の手法によつて改変するこ,とによって行うことができる。 遺伝子に変異を導入するには、 Kunkel法又は Gapped duplex法等の公知手法又は これに準ずる方法により行うことができ、 例えば部位特異的突然変異誘発法を利 用した変異導入用キット （例えば Mutant_K (TAKARA社製） や Mutant- G (TAKARA社 製） ）などを用いて、 あるいは、 TAKARA社の LA PCR in vitro Mutagenesis シリ ーズキッ トを用いて変異が導入される。
また、 本発明に使用できる LOG 遺伝子には、 上記の LOG 遺伝子 （Accession number : AK071695) と同じ遺伝子ファミリーに属すると予想される下記の遺伝子 群が挙げられ、 これらも本発明にレ
シロイヌナズナ
AGI code Nuc Accession
Atlg50575 NM_103939
At2g28305 僵—128389
At2g35990 ■」29158
At2g37210 NM_129277
At3g53450 NM_115205
At5g03270 NM一 120405
At5g06300 NM_120713 At5gl l950 NM.—203039
At4g35190 NM_ —119685
At5g26140 NM— —122515
イネ
tigr locus NUC access ion protein accessi
LOC_Os01g40630 AP003243 BAD52880
L0C_0s01g51210 AP003273 NP— 916572
L0C_0s02g41770 AP005000 XP—473199
LOC_Os03gO188O XM— 468563 XP—468563
LOC_Os03g49050 AC123974 XP_469379
L0C_0s03g64070 AC096690 XP_470489
L0C_0s04g43840 AL731629 XP—473199
L0C_0s05g51390 AC136216 XP_476015
L0C_0s05g46360 AC104713 XP_475809
LOC_Os09g37540 AP005862 BAD46468
L0C_0sl0g33900 AC037425 NP— 922006
LOC— 0s03g39010 AG133003 AAT76323
上記の遺伝子群のうち、 At2g28305、At2g35990、At2g37210、At3g53450、At4g35190、
At5g06300、 At5gl l950の 7遺伝子は、 前記イネの LOGタンパク質のアミノ酸配列 に対して高い相同性を有するアミノ酸配列をコードするシロィヌナズナ LOGホモ ログ遺伝子 （AtLOGl, 2, 3, 4, 5, 7, 8とそれぞれ称する） である。 これらのシ 口ィヌナズナ LOGホモ口グ遺伝子は、後記実施例に示されるように、前記ィネ LOG タンパク質と同様にヌクレオチド型サイ トカイニンから活性型サイ トカイニンの 合成反応を触媒する活性を有し、 かつ過剰発現体では活性型サイ トカイニン合成 量の増加に基づく側芽の伸長促進などの形質変化が認められた。 AtLOGl, 2, 3, 4,
5, 7, 8 遺伝子の塩基配列は、 配列番号 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5にそ れぞれ示され、 配列番号 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6にそれぞれ示され るアミノ酸配列をコードする。 また、 これらのシロイヌナズナ LOGホモログ遺伝 子もまた、 ヌクレオチド型サイ トカイニンから活性型サイ トカイニンの合成反応 を触媒する活性を有する限り、 それらの変異遺伝子であってもよく、 配列の相同 性の範囲、 アミノ酸の欠失、 置換、 付加数の範囲は、 前記のとおりである。
( 2 ) 植物形質転換用組換えベクター
植物形質転換に用いる本発明の組換えベクターは、 上記 LOG遺伝子を適当なベ クタ一に導入することにより構築することができる。ここで、ベクターとしては、 例えば、ァグロパクテリゥムを介して植物に目的遺伝子を導入することができる、 pBI系、 pPZP系、 pSMA系のベクターなどが好適に用いられる。 特に pBI系のバイ ナリ一ベクター又は中間ベクター系が好適に用いられ、例えば、 pBI121、 pBI 101、 ρΒΙΙΟΙ. 2, ρΒΙΙΟΙ. 3等が挙げられる。 バイナリーベクターとは大腸菌 （Escheric hia col i) 及びァグロパクテリゥムにおいて複製可能なシャ トルベクターで、 バ イナリーベクターを保持するァグロバクテリム'を植物に感染させると、 ベクター 上にある LB配列と RB配列より.成るボーダー配列で囲まれた部分の DNAを植物核 DNAに組み込むことが可能である。 一方、 pUC系のベクターは、植物に遺伝子を直 接導入することができ、 例えば、 pUC18、 pUC19、 pUC9等が挙げられる。 また、 力 リフラワーモ I イクウィルス （CaMV)、 インゲンマメモザイクウィルス （BGMV)、 タバコモザィクウィルス（TMV)等の植物ウィルスベクターも用いることができる。 バイナリーベクター系プラスミ ドを用いる場合、 上記のバイナリーベクターの 境界配列（LB, RB)間に、 目的遺伝子を挿入し、 この組換えベクターを大腸菌中で増 幅する。 次いで、 増幅した組換えベクターをァグロバクテリウム · ッメファシェ ンス C58、 LBA4404、 EHA101、 EHA105あるいはァグロパクテリゥム ' リゾゲネス L BA1334等に、 エレク トロポレーション法等により導入し、 該ァグロバクテリゥム を植物の形質導入に用いる。
ベクターに目的遺伝子を挿入するには、 まず、 精製された DNAを適当な制限酵 素で切断し、適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイ ト に挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
また、 目的遺伝子は、 その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込 まれることが必要である。 そこで、 ベクターには、 目的遺伝子の上流、 内部、 あ るいは下流に、 プロモーター、 ェンハンサー、 ターミネータ一、 バイナリーべク ター系を使用するための複製開始点 （Ti又は Ri プラスミ ド由来の複製開始点な ど）、 選抜マーカー遺伝子などを連結することができる。
「プロモーター」 としては、 植物細胞において機能し、 植物の特定の組織内あ るいは特定の発育段階において発現を導くことのできる DNAであれば、植物由来 のものでなくてもよレ、。具体例としては、イネの LOG遺伝子自身のプロモーター 、 カリフラワーモザイクウィルス（CaMV) 35Sプロモーター、 ノパリン合成酵素遺 伝子のプロモーター （Pnos)、 トウモロコシ由来ュビキチンプロモーター、 イネ 由来のァクチンプロモーター、 タバコ由来 PRタンパク質プロモーター等が挙げ られる。
ェンハンサ一としては、 例えば、 目的遺伝子の発現効率を高めるために用いら れ、 CaMV35S プロモーター内の上流側の配列を含むェンハンサー領域などが挙げ られる。 '
ターミネータ一としては、 プロモーターにより転写された遺伝子の転写を終結 できる配列であればよく、 例えば、 ノパリン合成酵素 （N0S)遺伝子のターミネ一 ター、 ォク トビン合成酵素（0CS)遺伝子のターミネータ一、 CaMV 35S RNA 遺伝子 のターミネータ一等が挙げられる。
選抜マーカー遺伝子としては、 例えば、 アンピシリン耐性遺伝子、 ネオマイシ ン耐性遺伝子、 ハイグロマイシン耐性遺伝子、 ビアラホス耐性遺伝子、 ジヒ ドロ 葉酸還元酵素遺伝子などが挙げられる。
また、 選抜マーカー遺伝子は、 上記のように目的遺伝子とともに同一のプラス ミ ドに連結させて組換えベクターを調製してもよいが、 あるいは、 選抜マーカー 遺伝子をプラスミ ドに連結して得られる組換えベクターと、 目的遺伝子をプラス ミ ドに連結して得られる組換えベクターとを別々に調製してもよい。 別々に調製 した場合は、 各ベクターを宿主にコトランスフエタ ト （共導入） する。
( 3 ) 形質転換植物およびその作出方法
本発明の形質転換植物は、 上記遺伝子又は組換えベクターを対象植物に導入す ることによって作出することができる。 本発明において 「遺伝子の導入」 とは、 例えば公知の遺伝子工学的手法により、 目的遺伝子を上記宿主植物の細胞内に発 現可能な形で導入することを意味する。 ここで導入された遺伝子は、 宿主植物の ゲノム DNA中に組み込まれてもよいし、 外来ベクターに含有されたままで存在し ていてもよい。
上記遺伝子又は組換えベクターを植物中に導入する方法としては、 既に報告さ れ、 確立されている種々の方法を適宜利用することができ、 例えば、 ァグロパク テリゥム法、 P E G—リン酸カルシウム法、 エレク ト口ポレーシヨン法、 リポソ ーム法、 パーティクルガン法、 マイクロインジェクション法等が挙げられる。 ァ グロパクテリゥム法を用いる場合は、 プロ トプラストを用いる場合、 組織片を用 いる場合、 及び植物体そのものを用いる場合 （in planta 法） がある。 プロ トプ ラストを用いる場合は、 Ti プラスミ ドないしは Riプラスミ ドをもつァグロパク テリゥム (それぞれ Agrobacterium tumefaciens又は Agrobacterium rhizogenes) と共存培養する方法、 スフエロプラスト化したァグロパクテリゥムと融合する方 法 （スフエロプラスト法）、 組織片を用いる場合は、 対象植物の無菌培養葉片 （リ —フディスク） に感染させる方法やカルス （未分化培養細胞） に感染させる等に より行うことができる。 また種子あるいは植物体を用いる in planta法を適用す る場合、 すなわち植物ホルモン添加の組織培養を介さない系では、 吸水種子、 幼 植物（幼苗）、鉢植え植物などへのァグロパクテリゥムの直接処理等にて実施可能 である。 これらの植物形質転換法は、 「島本功、 岡田清孝 監修、 新版 モデル植物 の実験プロ トコール 遺伝学的手法からゲノム解析まで （2001)、 秀潤社」 などの 一般的な教科書の記載に従って行うことができる。
遺伝子が植物体に組み込まれたか否かの確認は、 PCR 法、 サザンハイプリダイ ゼーシヨン法、 ノーザンハイブリダィゼーシヨン法、 ウェスタンブロッテイング 法等により行うことができる。 例えば、 形質転換植物から DNAを調製し、 LOG遺 伝子特異的プライマーを設計して PCRを行う。 PCRを行った後は、 増幅産物につ いてァガロースゲル電気泳動、 ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動又はキヤビラリ 一電気泳動等を行い、 臭化工チジゥム、 SYBR Green液等により染色し、 そして増 幅産物を 1本のバンドとして検出することにより、 形質転換されたことを確認す ることができる。 また、 予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いて PCR を行い、 増幅産物を検出することもできる。 さらに、 マイクロプレート等の固相 に増幅産物を結合させ、 蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法でも よい。 さらに、 その植物細胞からタンパク質を抽出し、 2次元電気泳動を行って 分画し、 LOG 遺伝子がコードするタンパク質のバンドを検出することにより、 植 物細胞に導入された LOG遺伝子が発現されていること、 すなわちその植物が形質 転換されていることを確認してもよい。 続いて、 検出されたタンパク質について エドマン分解等により N末端のアミノ酸配列を決定し、 配列番号 2の N末端の配 列と一致するかどうかを確認することにより、 その植物細胞の形質転換をさらに 実証することができる。
あるいは、 種々のレポーター遺伝子、 例えばベータグルクロニダーゼ （GUS)、 ルシフェラーゼ (LUC) x Green fluorescent protein (GFP)、 クロラムフエニコー ルァセチルトランスフェラーゼ （CAT)、 ベータガラク トシダーゼ （LacZ) 等の遺 伝子を目的遺伝子の下流域に連結したベクターを作製し、 該ベクター導入したァ グロバクテリムを用いて上記と同様にして植物を形質転換させ、 該レポーター遺 伝子の発現を測定することによつても確認できる。
本発明において形質転換に用いられる植物としては単子葉植物又ば双子葉植物 のいずれであってもよく、 例えば、 アブラナ科 （シロイヌナズナ、 キャベツ、 ナ タネ等）、 イネ科 （イネ、 トウモロコシ、 ォォムギ、 コムギ、 等）、 ナス科 （トマ ト、 ナス、 ジャガイモ、 タバコ等）、 マメ科 （ダイズ、 エンドゥ、 インゲン等） 等 に属する植物が挙げられるが、 これらの植物に限定されるものではない。
本発明において、形質転換の対象とする植物材料としては、茎、葉、種子、胚、 胚珠、 子房、 茎頂等の植物器官、 葯、 花粉等の植物組織やその切片、 未分化の力 ルス、 それを酵素処置して細胞壁を除いたプロプラスト等の植物培養細胞のいず れであってもよい。 また in planta法適用の場合、 吸水種子や植物体全体を利用 できる。 .
本発明において、 形質転換植物とは、 植物体全体、 植物器官（例えば葉、 花弁、 茎、根、榖実、種子等）、植物組織（例えば表皮、 師部、 柔組織、 木部、維管束等）、 又は植物培養細胞 （例えばカルス） のいずれをも意味するものである。
植物培養細胞を対象とする場合において、 得られた形質転換細胞から形質転換 体を再生させるためには既知の組織培養法により器官又は個体を再生させればよ い。 このような操作は、 植物細胞から植物体への再生方法として一般的に知られ ている方法により、 当業者であれば容易に行う.ことができる。 植物細胞から植物 体への再生については、 例えば、 以下のように行うことが'できる。
まず、 形質転換の対象とする植物材料して植物組織又はプロ トプラストを用い た場合、 これらを無機要素、 ビタミン、 炭素源、 エネルギー源としての糖類、 植 物生長調節物質 （オーキシン、 サイ トカイニン、 ジベレリン、 アブシジン酸、 ェ チレン、 ブラシノステロイ ド等の植物ホルモン） 等を加えて滅菌したカルス形成 用培地中で培養し、 不定形に増殖する脱分化したカルスを形成させる （以下 「力 ルス誘導」 という）。 このように形成されたカルスをオーキシン等の植物生長調節 物質を含む新しい培地に移しかえて更に増殖 （継代培養） させる。
カルス誘導は寒天等の固型培地で行い、 継代培養は例えば液体培養で行うと、 それぞれの培養を効率良くかつ大量に行うことができる。 次に、 上記の継代培養 により増殖したカルスを適当な条件下で培養することにより器官の再分化を誘導 し （以下、 「再分化誘導」 という）、 最終的に完全な植物体を再生させる。 再分化 誘導は、 培地におけるオーキシン等の植物生長調節物質、 炭素源等の各種成分の 種類や量、 光、 温度等を適切に設定することにより行うことができる。 かかる再 分化誘導により、 不定胚、 不定根、 不定芽、 不定茎葉等が形成され、 更に完全な 植物体へと育成させる。 あるいは、 完全な植物体になる前の状態 （例えばカプセ ル化された人工種子、 乾燥胚、 凍結乾燥細胞及び組織等） で貯蔵等を行ってもよ い。
本発明の形質転換植物は、 当該遺伝子を導入した植物体 （形質転換された細胞 やカルスから再生された植物体を含む） の有性生殖又は無性生殖により得られる 子孫の植物体、 及びその子孫植物体の組織や器官等の一部 （種子、 プロ トプラス トなど） も包含するものとする。 本発明の形質転換植物は、 LOG 遺伝子を導入し て形質転換した植物体から、 種子、 プロ トプラストなどの繁殖材料を取得し、 そ れを栽培又は培養することによって量産することができる。
上記のようにして得られる形質転換植物は、 LOG 遺伝子の発現により活性型サ イ トカイニン量が局所的に又は全体的に増加する。 その結果、 当該形質転換植物 は、 サイ トカイニンの作用により、 例えば側芽の伸長促進 （頂芽優勢の阻害）、 種 子発芽の促進、 休眠打破、 細胞***促進、 クロロフィル合成促進、 老化抑制、 果 実の肥大促進、 花茎数の増加、 大きな種子の形成、 太い葉脈の形成、 葉の老化遅 延、花序の変更などが認められるようになる。 また、 これまでの研究知見から LOG 遺伝子は茎頂***組織の限られた領域で発現し、 この遺伝子の破壊株ではィネ粒 数が著しく減少すること、 花芽分化期における茎頂***組織中のサイ トカイニン 含量と粒数の間には相関があることが示唆されている。 従って、 LOG 遺伝子を例 えば茎頂***組織に特異的に発現させるように形質転換したイネは、 子実粒数増 加が期待できる。
さらに、植物内における LOG遺伝子の発現量を、例えば使用するプロモーター、 LOG プロモーター、 サイ トカイニンォキシダーゼ 2 (0sCKX2)プロモーター、 老化 —誘導性遺伝子（SAG)プロモーター； などにより局所的に又は全体的に制御（促進又 は抑制）することによって、植物内における活性型サイ トカイニン量が調節でき、 その結果、 サイ トカイニンが関与する様々な植物の成長と生理作用、 例えば、 穀 粒数、 側芽 （腋芽） の形成と伸長、 老化、 休眠、 落果、 細胞周期、 光合成量、 蒸 散などを調節することが可能である
( 4 ) 酵素タンパク質の生産
上記の LOG遺伝子によりコードされるタンパグ質は、 該遺伝子を導入した組換 えベクターで宿主を形質転換して形質転換体を得、 該形質転換体を培養し、 その 培養物から採取することにより得ることができる。 ここで、 「培養物」 とは、 培養 上清のほか、 培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれ をも意味するものである。
ここで、 組換えベクターは、 プラスミ ド DNA、 ファージ DNA等の宿主中で複製 可能な組換えベクターであればいずれでもよい。 例えば、 プラスミ ド DNAとして は、 大腸菌由来のプラスミ ド （例えば pBR322、 pBR325、 pUC118、 pUC119、 pUC18、 pUC19、 pBluescript等）、 枯草菌由来のプラスミ ド （例えば pUB110、 pTP5等）、 酵母由来のプラスミ ド （例えば YEpl3、 YEp24、 YCp50等)などが挙げられ、 ファー ジ DNAとしてはえファージ（Charon4A、 Charon21A、 EMBL3、 EMBL4、 gtl0、 gtll ,
； L ZAP 等） が挙げられる。 さらに、 レトロウイルス又はワクシニアウィルスなど の動物ウィルス、 バキュ口ウィルスなどの昆虫ウィルスベクターを用いることも できる。
上記ベクターには複製開始点、 プロモーター、 選択マーカーを含み、 必要に応 じてェンハンサー、 ターミネータ一、 リボソーム結合部位、 ポリアデニル化シグ ナル等を含んでいてもよい。
複製開始点としては、 大腸菌用ベクターには、 例えば ColEl、 R因子、 F因子 由来のものが、 酵母用ベクターには、 例えば 2 Ai m DNA、 ARS1由来のものが、 動物 細胞用ベクターには、 SV40、 アデノウイルス由来のものが用いられる。
プロモーターとしては、 大腸菌用ベクターには、 trpプロモーター、 lacプロモ 一ター、 PLプロモーター、 PRプロモーター、 cspAプロモーター等が、 酵母用べ クタ一には、 gal lプロモーター、 PH05プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプ 口モーター、 ADHプロモーター、 A0X1プロモーター等が、 動物細胞用べクタ一に は、 SR aプロモーター、 SV40 プロモーター、 LTRプロモーター、 CMVプロモータ 一等が用いられる。
選択マーカーとしては、 大腸菌用ベクターには、 カナマイシン耐性遺伝子、 ァ ンピシリン耐性遺伝子、テトラサイタリン耐性遺伝子等が、酵母用ベクターには、 Leu2、 Trpl、 Ura3遺伝子等が、 動物細胞用ベクターには、 ネオマイシン耐性遺伝 子、 チミジンキナーゼ遺伝子、 ジヒ ドロ葉酸還元酵素遺伝子等が用いられる。 宿主と.しては原核生物又は真核生物のいずれも用いることができる。 原核生物 としては、 大腸菌（Escherichia col i) 等のエツシェリヒア属、 バチルス ·ズブチ リス（Baci llus subt i l i s)等のノくチノレス属、 シユードモナス ·プチダ（Pseudomonas putida)等のシユードモナス属等に属する細菌が挙げられる。 また、真核生物とし ては、 サッカロミセス 'セレビシェ（Saccharomyces cerevi s iae)、 シゾサッカロ ミセス ·ボンべ（Schi zosaccharotnyces pombe)等の酵母； COS細胞、 CH0細胞、 Vero、 C123細胞等の動物細胞、 あるいは Sf9、 SF12等の昆虫細胞などが挙げられる。 上記の形質転換細胞を培養する方法は、 宿主の培養に用いられる通常の方法に 従って行われる。 大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を 培養する培地は、 微生物が資化し得る炭素源、 窒素源、 無機塩類等を含有し、 形 質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、 天然培地、 合成培地 のいずれを用いてもよい。 炭素源としては、 グルコース、 フラク トース、 スクロ ース、 デンプン等の炭水化物、 酢酵、 プロピオン酸等の有機酸、 エタノール、 プ ロパノール等のアルコール類が挙げられる。 窒素源としては、 アンモニア、 塩化 アンモニゥム、 硫酸アンモニゥム、 酢酸アンモニゥム、 リン酸アンモニゥム等の 無機酸若しくは有機酸のアンモニゥム塩又はその他の含窒素化合物のほか、 ぺプ トン、 肉エキス、 コーンスティープリカ一等が挙げられる。 無機物としては、 リ ン酸第一カリウム、 リン酸第二カリウム、 リン酸マグネシウム、 硫酸マグネシゥ ム、 塩化ナトリウム、 硫酸第一鉄、 硫酸マンガン、 硫酸銅、 炭酸カルシウム等が 挙げられる。 培養は、 通常、 振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、 例 えば、 25〜35°Cで 12〜48時間程度行う。 pHの調整は、 無機又は有機酸、 アル力 リ溶液等を用いて行う。 培養中は必要に応じてアンピシリンゃテトラサイクリン 等の抗生物質を培地に添加してもよい。
培養後、 目的タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、 超音波処 理、 凍結融解の繰り返し、 ホモジナイザー処理などを施して菌体又は細胞を破砕 することにより目的のタンパク質採取する。 また、 目的タンパク質が菌体外又は 細胞外に生産される場合には、 培養液をそのまま使用するか、 遠心分離等により 菌体又は細胞を除去する。 その後、 タンパク質の単離精製に用いられる一般的な 生化学的方法、 例えば硫酸アンモニゥム沈殿、 ゲルクロマトグラフィー、 イオン 交換クロマトグラフィー、 ァフィ二ティークロマトグラフィ一等を単独で又は適 宜組み合わせて用いることにより、 前記培養物中から目的タンパク質を単離精製 することができる。
( 5 ) 活性型サイ トカイニン合成
本発明においては、 上記の LOG遺伝子を含む組換えベクターで形質転換した形 質転換体を培地に培養する際に、 該培地にヌクレオチド型サイ トカイニンを基質 として添加することにより、 培養物中に活性型サイ トカイニンを合成することが できる。基質として用いるヌクレオチド型サイ トカイニンは前述のとおりである。 また、 より増殖能の高い形質転換体を用いた方が、 単位培養液及び単位時間当 たりの活性型サイ トカイニン生産量が高くなるため、 まず前培養によって形質転 換体を活性化させ、 これを活性型サイ トカイニン生産用の本培養の培地に接種し て培養を行うことが好ましい。
前培養及び本培養用培地中の基質含有量は、'培地中の固形分換算で 0. 1〜1. 0% 程度である。 形質転換体の培地への使用量は、 例えば、 菌体を接種する場合、 培 地 1 Lあたり、 1〜100 mg 程度であればよく、 基質含有量により適宜増減すれば よい。
基質は培養開始時にその全量を添加しても、 培養中に連続的又は間欠的に添加 してもよい。 また、 生成した活性型サイ トカイニンを培養終了後に一括して取り 出しても、 培養中に連続的又は間欠的に取り出してもよい。
培養は、 培養液中の所望の活性型サイ トカイニン生成量が最高に達した時点で 終了させる。培養液中の活性型サイ トカイニンは、培養終了後、常法によって培養 液から精製する。精製は、当該技術分野において通常使用されている周知の手段、 例えば、 ろ過、 遠心分離、 イオン交換又は吸着クロマトグラフィー、 溶媒抽出等 の操作が必要に応じて、 適宜組み合わせて行えばよい。 発明を実施す.るための最良の形態
以下、 実施例により本発明をさらに具体的に説明する。 但し、 本発明はこれら に限定されるものではない。
(実施例 1 )組換え LOGタンパク質の大腸菌による大量発現と精製
LOG遺伝子 (Access ion number : AK071695 (nucleotide)； BAD52880 (protein)； Tigr locus : L0C_0s01g40630 ; RAP locus : 0s01g0588900) は 242アミノ酸からな る タ ンノ ク 質を コ ー ドす る と 予想 さ れ、 NCBI デー タ ベー ス 上 (http : //www. ncbi. nlm. nih. gov)ではリジン脱炭酸酵素としてその機能が予測さ れていた。 しかし、 LOG 遺伝子に相同性を示す遺伝子が、 Rhodococcus fasciens の fas locus " Agrobacterium rhizogenesの Riプフス ^ ト上 (こおレヽて、 サイ ト カイニン生合成の初発反応を触媒する isopentenyltransferase (IPT)の極近傍に 存在することから、 以下の実験を行って、 LOG タンパク質のもつ機能について検 討した。
まず、 LOG遺伝子 cDNAのタンパク質コード領域を大腸菌による Hi s-tagタンパ ク質発現ベクターである pCOLD-I (TaKaRa)に挿入したプラスミ ド （pCOLD-LOG) を 構築した。 これを大腸菌 BL21 (DE3) [pG_Tf2]に形質転換し、 50 / g/mLアンピシリ ン、 20 // g/mL ク口ラムフエニコーノレを含む Luria- Bertani寒天培地上にまくこと によって、形質転換大腸菌のコロニーを得た。この大腸菌コロニーを 50 /i g/mL ァ ンピシリン、 20 /z g/mL クロラムフエ二コールを含む Luria-Bertani培地で 37°C 終夜培養した後、 その終夜培養液 30mLを 100 / g/mL アンピシリン、 20 /x g/mL ク 口ラムフエニコ一ル、 lng/mL テトラサイクリンを含む改変 M9培地 （M9 salt, 1M sorbitol, 1% casaraino acid, 2% sucrose, ImM MgS04, 0. IraM CaCl2, 10 g/mL thiamine-HCl, 2. 5mM betaine) 270 mLに加え、 0D600=0. 5程度になるまで 37°C で振とう培養した。 この液体培地を 15°Cの水浴に移し 30分間静置後、終濃度 0. 5 mM になるように 1M IPTGを加え、 さらに 25時間 15°Cで振とう培養したのち、 遠 心により大腸菌細胞を回収した。
大腸菌からのタンパク質抽出とニッケル NTA superflo resinによる LOGタン パク質の精製は、 以下の方法で行った。 まず、 大腸菌ペレツ トを 6mL の Lys is buffer [50raM NaHP04, 300mM NaCl, lOraM imidazole, ImM MgCl2, 0. 5mM dithiothreitol (DTT) , pH 8. 0]に懸濁し、 protease inhibitor cocktai l (X100, Signia^O Lと 6mgの塩化リゾチームを加え、 氷上で 30分間静置した。 その後、 超音波破砕機（タイテック）で大腸菌細胞を破壊した。 破壊条件は、 マイクロチッ プ使用、 20秒 X 8回， duty cycle 50%, output 5とした。 この破砕液を 30, 000 g, 4°Cで 50 分間遠心し、 上清を予め Lys i s buffer で平衡化したニッケル NTA superflow resin (Qiagen) で作ったカラムに通した （カラム体積 lmL)。 洗浄バ ッファー [50mM NaHP04, 300mM NaCl, 20 mMimidazole, ImM MgCl2, 0. 5 mMDTT, 15% ( /v) glycerol, pH 8. 0] 20mL で 2回カラムを洗浄後、 溶出バッファー [50mM NaHP04, 300mM NaCl, 250mM imidazole, ImM MgCl2, 0. 5mM DTT, 15% (w/v) glycerol, pH 8. 0]で Hi s- tag LOGタンパク質を溶出した。 最終精製標品の純度を SDSポリア クリルアミ ド電気泳動によって確認し（図 1 )、 以後の実験に使用した。
(実施例 2 )組換え LOGタンパク質の酵素活性の検出
実施例 1で得られた組換え LOGタンパク質 3 /i gを、サイ トカイニン各種を基質 と し て 反 応 さ せ た 。 用 い た サ イ ト カ イ - ン 基 質 は 、 N6-(delta-2-isopentenyl) adenine (iP) , trans-zeatin (tZ)， cis-zeatin C ) , iP riboside (iPR) , tZ riboside {tiR) , cZ riboside vcz,R) , iPR 5' -monophosphate (iPRMP), tZR 5' -monophosphate (tZRMP)の 8種である。反応条件は、 50ra Tris-HCl, lraM MgCl2, 50/zM基質， pH7 で、 30°Cで 2時間インキュベートし、 反応液体積は 100 //L とした。 20°/。酢酸を 10//L加えることで反応を止め、 15,000 rpmにて 20 分間室温で遠心し、上清 20 // Lを HPLC (Waters Alliance 2695/PDA detector 2996) による液体クロマトグラフィーにより解析した。 カラムは Sy膽 etry C18, 3.5〃 m, 2.1X100 mm cartridge (Waters)を用いた。 溶出は溶媒 C(100% acetonitrile)， 溶媒 D (2% acetic acid)を用い、 溶出条件および溶媒の濃度勾配プログラムは下 記表 1の通りである。
表 1
Figure imgf000024_0001
基質及び反応生成物は 270mnの吸収でモニターレた。 解析の結果、 iP， tZ, cZ， iPR, tZR, cZRを基質にした場合には基質への反応性は全く認められなかったが、 iPRMP, tZRMPを基質にした場合には、 それぞれの基質が全て iPと tZに変換され ていた。 図 2に各基質標品混合物のクロマトグラムと、 tZ, iPRMP, tZRMPを基質 にした場合の反応生成物のクロマトグラムを示す。 iP， cZ, iPR, tZR, cZR を基 質にした場合の結果は、 tZの場合と同様であったため省赂した。
(実施例 3) LOGタンパク質のリジンに対する反応性
LOG タンパク質は従来、 リジン脱炭酸酵素と予想されていたので、 リジンに対 する反応性の有無について検討した。組換え LOGタンパク質 3 gを、 500mM sodium acetate buffer, H 6.0, 5m L— lysine から成る反応液 100 /zL 中で 40°C、 60 分間インキュベートした。 そこへ 20% trichloroacetateを 34// L加え、 10， 000g で 20分間遠心後、 上清 100//Lを用いてベンゾィル化した。 具体的操作は以下の 通りである。 反応液 100/ Lに 2N NaOHを ΙΟΟμί加え、 さらに benzoyl chloride を L加えた後、 室温で 20分間静置した。 そこへ飽和 NaCl溶液を 200juL、 diethyletherを 200/zL加え、 撹拌、 遠心後、 上層を回収した。 これを減圧乾燥 後、 100 /zL のメタノールに溶解し、 HPLC (Waters Alliance 2695/PDA detector 2996)による液体クロマトグラフィーにより解析した。 カラムは Symmetry C18, 3.5 Ai m, 2. IX 100mm cartridge (Waters)を用い、 溶出は溶媒 A (MilliQ水）， 溶 媒 B (100% methanol)を用い、 溶出条件および溶媒の濃度勾配プログラムは下記 表 2の通りである。
表 2
Figure imgf000025_0001
基質及び反応生成物は 226nraの吸収でモニターした。 リジン脱炭酸酵素により 生ずる精製物質はカダベリンと予想されるので、 カダベリン標品 lrnnolを別途ィ ンジヱク トし、 反応生成物の溶出時間を特定した。 図 3に示したように、 LOG タ ンパク質はリジンに対する反応性を示さなかった。 よってデータベース上で予想 されているリジン脱炭酸酵素としての機能は持たないものと判断した。
(実施例 4) ヌクレオチド型サイ トカイニン体に対する基質特異性の有無の検討 LOG タンパク質のヌクレオチド型サイ トカイニン体に対する反 特異性を検討 した。同時に AMPに対する反応性の有無についても検討した。基質として、 iPRMP, tZR P, dihydrozeatin riboside 5' -monophosphate (DZRMP) , cZR 5' -monophosphate (cZRMP) , iPR ' 5' -diphosphate (iPRDP), iPR 5' -triphosphate (iPRTP), AMP の 7種類を用いた。 反応条件は以下の通りであ る。 1反応につき 0· 02// gの LOGタンパク質を用い、 50mM Tris- HC1, ImM MgCl2, IraM DTT, pH6.5の反応液 200/^L中で、 基質濃度 100 μ Mで反応開始後 0分， 4分 で 600//Lの冷ァセトンを加えることで反応を停止し、 -80°Cで 30分間静置後、 15, 000 rpra, 20 分間遠心し、 上清を遠心濃縮機で乾固させた。 それらを 2%酢酸 100 //Lに溶解し、実施例 2の液体クロマトグラフィ一と同じ条件で反応生成物を 検出 '定量した。 インジェクション量のみ 50 ;zLに変更した。 なお、 iPRDP, iPRTP については反応液量 100/iLとし、 使用タンパク質量は 0.01 /xg、 反応時間は 2分 間とした。
図 4の結果から、 LOGタンパク質は iPRMPの他に、 tZRMP, DZR P, cZRMPなどの サイ トカイニンヌクレオシド 5， -一リン酸を基質にすることが明らかになった。 ただし、 AMPや iPRDP, iPRTPには全く反応性を示さなかった。
本結果から、 LOG タンパク質はデータベース上ではリジン脱炭酸酵素としてそ の機能が予測されているものの、 実際にはヌクレオチド型サイ トカイニンからリ ボース 5' -—リン酸を外し、 塩基体の活性型サイ トカイニンを生成する、 全く新 規の反応を触媒する酵素であることが判明した。 LOG タンパク質が触媒する反応 を図 5に示す。 以上の結果から、 LOG タンパク質は、 cytokinin nucleoside 5' -monophosphate phosphoribohydrolase力 |¾用名として適切であるとレヽ Lる。
(実施例 5 ) iPRMP及び tZRMPに対する Km値の測定
代表的な基質である iPRMPと tZRMPに対する Km値を求めるため、以下の実験を 行った。 1反応につき 0.02 gの LOGタンパク質を用い、 50mMTris- HC1, lmMMgCl2,
ImM DTT, pH6.5の反応液 200/xL中で、 基質濃度 5, 8， 15， 30， 100 /ζΜで反応さ せ、 反応開始後 0， 2， 4分で 600μίの冷アセトンを加えることで反応を停止し、
- 80°Cで 30分間静置後、 15,000rpm, 20分間遠心し、 上清を遠心濃縮機で乾固さ せた。 それを 100 しの 2%酢酸に溶解し、 実施例 2の液体クロマトグラフィーと 同じ条件で反応生成物を検出 '定量した。 なお、 インジヱクシヨン量のみ 50 し に変更した。 以上の実験を 3連 行い、 Km値を算出した。 その結果、 iPRMPに対 する Km値は 11.7 ±1.4 μ Μ、 比活十生は 5· 6 mol . min"1 · mg— 1 protein, tZRMPに 対する Kra値は 22.0±3.6 /zM、比活性は 4· 2 μ mol · min— 1 · mg_1 proteinであった。
(実施例 6 ) シロイヌナズナ LOGホモログ遺伝子 （AtLOGs) の cDNA単離 イネだけでなくシロイヌナズナ （Arabidopsis thaliana) においても、 LOG タ ンパク質と同様の機能を持つサイ トカイニン活性化酵素が存在しているかどうか に つ い て の 調 査 を 行 っ た 。 ま ず 、 NCBI デ ー タ ベ ー ス (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)において LOGタンパク質のアミノ酸配列をもと に prote in BLAST検索を行い、シロイヌナズナにおける相同性遺伝子を探索した。 その結果、 LOG タンパク質と高い相同性を持つタンパク質をコードすると予測さ れる 9つのシロイヌナズナ遺伝子 AtL0Gl〜9 (Arabidopsis thaliana LOG 1~9 ； 表 3 )を発見した。 これらの遺伝子が、 シロイヌナズナ植物体において TAIRデー タベース (http:// w. arabidopsis. org/) で予測されている遍 A配列として転 写されているかどうかについての調查を行った。 シロイヌナズナ植物体から mRNA を抽出し、逆転写反応により合成された cDNAを铸型として、推測されるタンパク 質コード領域を増幅させるように設計したプライマーを用いて RT-PCR 反応を行 つた。 その結果、 AtLOGl, 2, 3, 4， 5， 7, 8に関して TAIRデータベースにおい て予測された cDNA配列と同一の配列の増幅断片を得ることに成功した。これら 7 遺伝子の産物について、 イネ LOGタンパク質と同様のサイ トカイニン活性化酵素 としての機能を持っていることが予想された。 そこで、 これら 7遺伝子の cDNA 配列をィネ LOG cDNAと同様の方法で大腸菌によるタンパク質の発現誘導及び精製 を行った。 最終精製標品の純度を SDSポリアク リルアミ ド電気泳動によって確認 し（図 6)、 以後の実験に使用した。 表 3
LOGタンパク質と高い相同性を持つシロイヌナズナゲノム中の遺伝子
推定分子量 LOGとの
遺伝子名 AGI Code 推定アミノ酸長
(kDa) 相同性（％)
AtLOGI At2g28305 213 23.2 76.1
AtLOG2 At2g35990 213 25.3 70.6
Atし OG3 At2g37210 215 23.6 79.9
AtLOG4 At3g53450 215 23.5 81.0
Atし OG5 At4g35190 228 25.2 67.4
AtLOG6 At5g03270 229 25.0 67.6
Atし OG7 At5g06300 217 23.9 72.2
AtLOG8 At5g11950 216 23.8 65.6
AtLOG9 At5g26140 143 16.1 63.7
(実施例 7 ) シロイヌナズナ LOGホモログタンパク質 （AtLOGs) の LOG酵素活性 の確認
精製された AtLOGタンパク質について、 実施例 2と同じ反応条件において酵素 活性を評価したところ、 LOG タンパク質と同様に iPRMP、 tZRMP, DZRMP, cZRMP などのサイ トカイニンヌクレオシド 5' - —リン酸を基質にすることが明らかに なった （図 7 )。 LOGタンパク質と同様に AMPや iPRDP, iPRTPにはほとんど反応 性を示さなかった。 また、 実施例 5と同様にして各 AtLOGタンパク質の iPRMPに 対する酵素特性を決定した （表 4 )。 表 4中、 Km, Vmax, kcat 値は各 AtLOG タンパ ク質の至適 pHの条件における反応を元に計算した。 土は、 同一条件で 3回行った 結果を元に計算した標準偏差を示す。 表 4
AtLOGl, 2, 3, 4, 5， 7, 8タンパク質における
iPR Pを基質としたときの酵素特性
薛素 至適 pH
μΜ Mmol min'1 mg"1
min"1 min -1 pH
protein
AtLOGl 16 ±2 2.1 ±0.1 54 + 4 3.5x10* 6.5
AtLOG2 126 ±16 6.1 ±2.0 166 ±55 1.3 x105 6.5
AtLOG3 14 ±2 1.5 ±0.0 37+1 2.8 x 10s 6.5
AILOG4 8.6 ± 0.6 4.4 ± 0.2 113±6 1.3x10' 6.5
AtLOGS 11 ±1 0.73 ±0.03 20±1 1.8 10e 5.4
AILOG7 6.7± 0.8 3.8 ± 0.2 99 ±6 1.5 x107 6.5
AtLOG8 17±1 0.053土 0.009 1.4 ±0.2 8.3 10* 7.0
(実施例 8) シロイヌナズナ LOGホモログ遺伝子 （AtLOGs) の過剰発現形質転換 体の作成
シロイヌナズナにおいてサイ トカイニン活性化酵素遺伝子 AtLOGs を過剰に発 現させたときの植物体への影響を調査した。 転写産物の酵素活性の存在が確認さ れた遺伝子 AtLOGl, 2, 3, 4, 5， 7， 8のうち AtL0G4， 7について、 酵素活性にお いて単離された cDNAを、 GUS遺伝子が除かれたプラスミ ド pBI121(Clontech社） のタバコモザィクウィルス 35Sプロモーターの下流に挿入した。 合成されたプラ スミ ドをァグロノくクテリゥム (Agrobacterium tumefaciens) ίこ導入し、 PCR ίこよ りプラスミ ドの導入が確認されたァグロパクテリゥムを野生型シロイヌナズナに 感染させた。 採取した種子をカナマイシン 50 ng/mlを含む MS培地に播種した。 PBI121の T- DNA領域にはカナマイシン耐性遺伝子（ΝΡΤΠ)が存在していることを 利用し、 カナマイシン耐性を示す個体を選抜した。 遺伝子導入が成功したカナマ イシン耐性の系統 （以下 35S: :AtL0G4, 35S::AtLOG7と呼ぶ） を各 26系統選抜し た。 選抜された T1世代の 35S: :AtL0G4， 35S::AtL0G7 形質転換体は互いに類似し た表現型を示した。 ロゼット葉から抽出した Tl世代の 35S: :AtL0G4 (系統 #6， #26), 35S: :AtL0G7 (系統 #3， #26)形質転換体の mRNAを逆転写反応により合成した cDNAを铸型として、 AtL0G4, 7 遺伝子および Actin2 遺伝子の増幅用プライマーを用いて半定量的 RT-PCR解析を行った。 対照として野生型ロゼッ ト葉由来の cDNA (WT) を用いた。 RT- PCR反応は AtL0G4において 25サイクルで、 Actin2と AtL0G7において 35サイ クルで行った。 その結果、各 2系統の植物体について AtL0G4 および AtL0G7 遺伝 子の過剰な発現が確認された （図 8)。
(実施例 9) シロイヌナズナ LOGホモログ遺伝子 （AtLOGs) の過剰発現形質転換 体の表現型
35S::AtL0G4, 35S: :AtL0G7形質転換体は互いに類似した表現型を示し、 表現型 は T1 世代から T2 世代へ受け継がれていることが確認された。 35S::AtL0G4， 35S: :AtL0G7 形質転換体は発芽後 1週間目前後までは野生型と特に形態的に異常 がみられないが、 ロゼット葉が多く形成し発達する発芽後 2週間目前後から顕著 な形態の異常がみられた。 35S::AtL0G4, 35S：： AtL0G7形質転換体は葉脈に沿って 深い緑色のロゼッ ト葉を形成した（図 9 )。70%エタノールで固定し脱色させると、 野生型と比べて葉の維管束が顕著に発達していることが観察された （図 1 0)。 そこで葉の横断面を観察すると、 導管の異所的な形成など、 維管束系に顕著な形 態異常がみられた （図 1 1)。 また、 葉の老化が遅い現象もみられた （図 1 2)。 野生型では花茎が抽苔したあとしばらくは側芽が発達しないが、 35S::AtL0G4, 35S::AtL0G7 形質転換体においては抽苔後すぐに複数の側芽が発達し葉が展開し ていた （図 1 3)。 また、 シロイヌナズナは通常、 総状花序の形態を示すが、 35S: :AtL0G4， 35S:： AtL0G7形質転換体では花序の軸が直線にならずに互散花序に 近い形態を示した （図 14)。 さらに、 さやに付ける種のサイズと重量が野生型と 比較して顕著に大きくなつていることが観察された （図 1 5、 1 6)。 本明細書で引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願をそのまま参考として本 明細書に組み入れるものとする。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 これまでリジン脱炭酸酵素タンパク質をコードする遺伝子と されていたイネ遺伝子に、 サイ トカイニンの生合成経路におけるヌクレオチド型 サイ トカイニンから活性型サイ トカイニンの合成反応 （サイ トカイニンの活性化 反応） を触媒する機能があることが新たに解明された。 従って、 従来はサイ ト力 ィニンの分解反応を改変することででしか可能でなかった活性型サイ トカイニン (塩基体） 量の制御が、 本遺伝子を利用することにより直接的に行うことが可能 となる。 さらに、 本遺伝子を過剰発現させた植物体では、 花茎数の増加、 大きな 種子の形成、 太い葉脈の形成、 花序の変更などの形質変化が認められ、 農作物の 収量増産、 切花、 観葉植物などの表現形質の多様化による商品価値の向上が期待 できる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 以下の（a)〜（ のいずれかの遺伝子が導入された形質転換体。 '
(a) 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5のいずれかに示す塩基配列 からなる DNAからなる遺伝子
(b) 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5のいずれかに示す塩基配列 からなる DNAと相補的な塩基配列からなる DNAとス トリンジェントな条件下でハ イブリダィズし、 かつヌクレオチド型サイ トカイニンから活性型サイ トカイニン の合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする DNAからなる遺伝子
(c) 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6のいずれかに示すアミノ 酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
(d) 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6のいずれかに示すアミノ 酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミ ノ酸配列からなり、 かつヌクレオチド型サイ トカイニンから活性型サイ トカイ二 ンの合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
2 . 形質転換体が形質転換植物である、 請求項 1に記載の形質転換体。
3 . 植物が、 植物体、 植物器官、 植物組織、 又は植物培養細胞である請求項 2 に記載の形質転換体。
4 . 以下の（a)〜（d)のいずれかの遺伝子を含む組換えべクタ一。
(a) 配列番号 1に示す塩基配列からなる DNAからなる遺伝子
(b) 配列番号 1に示す塩基配列からなる DNA と相補的な塩基配列からなる DNA とストリンジヱントな条件下でハイプリダイズし、 かつヌクレオチド型サイ トカ ィニンから活性型サイ トカイニンの合成反応を触媒する活性を有するタンパク質 をコードする DNAからなる遺伝子 -
(c) 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6のいずれかに示すァミノ 酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
(d) 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6のいずれかに示すアミノ 酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミ ノ酸配列からなり、 かつヌクレオチド型サイ トカイニンから活性型サイ トカイ二 ンの合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
5 . 以下の（a)〜（d)のいずれかの遺伝子又は請求項 4に記載の組換えベクター を植物細胞に導入し、 該植物細胞から 物体を再生すること 特徴とする、 形質 転換植物の作出方法。
(a) 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5のいずれかに示す塩基配列 からなる DNAからなる遺伝子
(b) 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5のいずれかに示す塩基配列 からなる DNAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジヱントな条件下でハ イブリダィズし、 かつヌクレオチド型サイ トカイニンから活性型サイ トカイニン の合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする DNAからなる遺伝子
(c) 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6のいずれかに示ずァミノ 酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
(d) 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6のいずれかに示すアミノ 酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミ ノ酸配列からなり、 かつヌクレオチド型サイ トカイニンから活性型サイ トカイ二 ンの合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
6 . 以下の（a)〜（d)のいずれかの遺伝子の植物における発現量を制御すること を特徴とする、 植物における活性型サイ トカイニン量の調節方法。
(a) 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5のいずれかに示す塩基配列 からなる DNAからなる遺伝子
(b) 配列番号 1、 .3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5のいずれかに示す塩基配列 からなる DNAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハ ィプリダイズし、 かつヌクレオチド型サイ トカイニンから活性型サイ トカイニン の合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする DNAからなる遺伝子
(c) 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6のいずれかに示すアミノ 酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
(d) 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6のいずれかに示すアミノ 酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたァミ ノ酸配列からなり、 かつヌクレオチド型サイ トカイニンから活性型サイ トカイ二 ンの合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
7 . 請求項 1に記載の形質転換体を、 ヌクレオチド型サイ トカイニンを基質と して添加した培地にて培養し、 培養物から活性型サイ トカイニンを採取すること を特徴とする、 活性型サイ トカイニンの製造方法。
8 .以下の（a)〜（d)のいずれかの遺伝子を植物体内で過剰発現させることにより、 植物の形質を変化させる方法。
(a) 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5のいずれかに示す塩基配列 からなる DNAからなる遺伝子
(b) 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5のいずれかに示す塩基配列 からなる DNAと相補的な塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件下でハ イブリダイズし、 かつヌクレオチド型サイ トカイニンから活性型サイ トカイニン の合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする DNAからなる遺伝子
(c) 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6のいずれかに示すアミノ 酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
(d) 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6のいずれかに示すアミノ 酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しぐは付加されたアミ ノ酸配列からなり、 かつヌクレオチド型サイ トカイニンから活性型サイ トカイ二 ンの合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
9 . 植物の形質の変化が、 花茎数の増加、 大きな種子の形成、 太い葉脈の形成、 花序の変更である、 請求項 8に記載の方法。
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