WO2007142320A1 - アミロイドβオリゴマー並びにその製造方法及び使用方法 - Google Patents

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WO2007142320A1
WO2007142320A1 PCT/JP2007/061593 JP2007061593W WO2007142320A1 WO 2007142320 A1 WO2007142320 A1 WO 2007142320A1 JP 2007061593 W JP2007061593 W JP 2007061593W WO 2007142320 A1 WO2007142320 A1 WO 2007142320A1
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amyloid
assembly
cells
soluble
arctic
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PCT/JP2007/061593
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Katsuhiko Yanagisawa
Naoki Yamamoto
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Japan Health Sciences Foundation
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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer

Definitions

  • the present invention relates to a soluble toxic assembly (oligomer) of amyloid
  • Amyloid (hereinafter also referred to as “ ⁇
  • Non-Patent Document 1 soluble A assemblies (also called “A-oligomers”) (Non-Patent Document 1), protofibrils (Non-Patent Documents 2 and 3), or A3-derived diffusible ligands (“ADDL”) (Non-patent Document 4, Patent Document 1) has been attracting attention due to the strength of damage to neuronal function or the inductive strength of neurodegeneration (Non-Patent Documents 4 to 10).
  • Non-Patent Documents 1 to 1 3 In addition to increased soluble A levels in the brain and cerebrospinal fluid of AD patients (Non-Patent Documents 1 to 1 3), natural A oligomers inhibit cognitive function in vivo and inhibit long-term synergy (Non-Patent Documents 6 and 14) suggest the pathological relevance of these soluble A ⁇ assemblies. It is unclear how soluble ⁇ assembly damages euron, but it disrupts specific binding to target molecules on neuronal membranes (Non-Patent Document 15) and ionic homeostasis. Ubiquitous rupture of plasma membranes related to Several possibilities have been proposed.
  • AD DL can be obtained by incubating a ⁇ -solution diluted in medium at about 4 ° C for about 2 hours to about 48 hours, centrifuging at about 4 000 g at about 4 ° C, (Patent Document 1).
  • ADD L has a molecular weight of about 26 to about 28 kD for non-denaturing gel electrophoresis, about 22 to about 24 kD or about 18 to about 19 kD for 15% polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). It is described that it has a size of about 4.7 to about 6.2 nra in observation with an atomic force microscope (Patent Document 1).
  • a ⁇ is peroxidized in a borate buffer. 3 with hydrogen and peroxidase
  • Patent Document 2 It has been described that a tyrosine-crosslinked neurotoxic oligomer can be obtained by incubating at 7 ° C for 5 days (Patent Document 2).
  • Arctic type A / 3 a hereditary variant, is soluble in neurotoxicity
  • Non-Patent Documents 10, 17 and 18 have a tendency to form 8 assemblies.
  • the present inventors have recently observed that arctic A / 3 forms a precipitable assembly in the presence of GM1 ganglioside as well as wild type A / 3 (Non-patent Documents 19, 2). 0).
  • Nerve growth factor plays an important role in the differentiation and function of a wide range of cell types, and the low-affinity NGF receptor (p75NTR ) plays a dual role in cell survival and death There is accumulated evidence about this. And the insoluble A
  • Patent Document 1 Special Table 2 0 0 1— 5 0 1 9 7 2 (WO 9 8/3 3 8 1 5)
  • Patent Literature 2 Special Table 2004-50 1 204 (WO 2002/000245)
  • Non-Patent Document 2 J. D. Harper, S. S. Wong, C. M. Lieber, P. T. Lansbury, Chem. Biol. 4, 119 (1997).
  • Non-Patent Document 3 D. M. Walsh, et al., J. Biol. Chem. 272, 22364 (1997).
  • Non-Patent Document 4 M. P. Lambert, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 6448 (1998).
  • Non-Patent Document 5 D. M. Hartley, et al., J. Neurosci. 19, 8876 (1999).
  • Non-Patent Document 6 D. M. Walsh, et al., Nature. 416, 535 (2002).
  • Non-patent document 7 K. N. Dahlgren, et al., J. Biol. Chem. 277, 32046 (2002).
  • Non-patent document 8 B. A. Chromy, et al., Biochemistry. 42, 12749 (2003).
  • Non-Patent Document 9 M. Hoshi, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 6370 (2003).
  • Non-Patent Document 10 B. M. Whalen, D. J. Selkoe, D. M. Hartley, Neurobiol. Dis. 20, 254 (2005).
  • Non-Patent Document 11 A. E. Roher, et al., J. Biol. Chem. 271, 20631 (1996).
  • Non-Patent Document 12 M. Pitschke, et al., Nat. Med. 4, 832 (1998).
  • Non-Patent Document 13 Y. Gong, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 10417
  • Non-Patent Document 14 J ". P. Cleary, et al., Nat. Neurosci. 8, 79 (2005).
  • Non-Patent Document 15 P. N. Lacor, et al., J. Neurosci. 24, 10191 (2004).
  • Non-Patent Document 16 A. Demuro, et al., J. Biol. Chem. 280, 17294 (2005).
  • Non-Patent Document 17 Nilsberth, et al., Nat. Neurosci. 4, 887 (2001).
  • Non-Patent Document 18 H, A. Lashuel, et al., Nature. 418, 291 (2002).
  • Non-patent document 19 K. Yanagisawa, A. Odaka, N. Suzuki, Y. Ihara, Nat. Med. 1, 1062 (1995).
  • Non-patent document 20 N. Yamaraoto, et al., J Neurochem. 90, 62 (2004).
  • Non-Patent Document 21 C. S. At ood, et al., J. Neurochem. 75, 1219 (2000).
  • Non-Patent Document 22 G. Bitan, A. Lomakin, D. B. Teplow, J. Biol. Chem. 276, 35176 (2001).
  • Non-Patent Document 23 R. Kayed, et al., Science. 300, 486 (2003).
  • Non-Patent Document 24 D. M. Walsh, et al., J. Neurosci. 25, 2455 (2005).
  • Non-Patent Document 25 H. Hayashi, et al., J. Neurosci. 24, 4894 (2004).
  • Non-Patent Document 26 P. Brocca, P. Berthault, S. Sonnino, Biophys. J. 74, 309 (1998).
  • Non-Patent Document 27 ⁇ Yaraamoto, et al., FEBS Lett. 569, 135 (2004).
  • Non-Patent Document 28 S. Rabizadeh, et al., Pro Natl. Acad. SCI. USA. 91,
  • Non-Patent Document 29 M. Yaar, et al., J. Clin. Invest. 100, 2333 (1997).
  • Non-Patent Document 30 S. P. Lad, K. E. Neet, E. J. Mufson, Current Drug Targets-CNS & Neurological Disrders. 2, 315 (2003).
  • Non-Patent Document 31 N. J. Woolf, R. W. Jacobs, L. L. Butcher, Neurosci. Lett. 96, 277 (1989).
  • Non-Patent Document 32 N. J. Woolf, E. Gould, L. L. Butcher, Neuroscience. 30, 143-152 (1989).
  • Non-Patent Document 33 S. Maeda et al., Neurosci Res (in press).
  • Non-Patent Document 34 H. G. Hansma et al., Biophys J 68, 1672-7 (1995).
  • Non-Patent Document 35 F. Schroeder, WJ Morrison, C. Gorka, WG Woog, Biochira. Biophys. Acta 946, 85 (1988). Disclosure of the Invention
  • An object of the present invention is to provide a novel A assembly useful for the study, prevention and treatment of amyloid-related diseases such as AD, and a method for producing the same. Furthermore, an object of the present invention is to provide a method, a compound, and the like for the research, prevention and treatment of amyloid-related diseases using such a kite assembly. Means for solving the problem
  • the present invention is a.
  • amyloid / 3 is a wild-type peptide or a peptide having an arctic mutation
  • a method for producing a soluble toxic amyloid 3 assembly wherein monomer amyloid / 3 is added together with a ribosome containing about 10 to about 15% GM 1 ganglioside in a molar ratio of lipid components. Incubating at about 5 to about 40 ° C. for about 1 to about 30 hours;
  • a method for screening a substance that modulates the neurotoxicity of soluble toxic amyloid / 3, comprising the following steps:
  • step (c) A step of comparing the result obtained in the step (b) with the result obtained when the step (a) is carried out without containing the test substance.
  • a method comprising:
  • the soluble toxicity A assembly according to the present invention has a remarkably strong toxicity as compared with ADD L, insoluble assembly (fibril) and the like. Therefore, it is very sensitive in detecting compounds that affect toxicity.
  • 3 of the present invention is known to induce apoptosis-like cell death in various euron or non-neuronal cells through binding to the NGF receptor and is well characterized. It is very useful in the study of diseases such as these and apoptosis. Brief Description of Drawings
  • FIG. 1 shows the toxicity of soluble ⁇ assembly formed in the presence of GM 1 gandarioside.
  • FIG. 6 is a diagram showing the number of primary cultures-euron. Neurons were stained with force Lucein AM / etetium homodimer and propidiura iodine. Each column represents the mean (soil SD) of the three values of the percentage relative to the control culture without A; 3 or GM1 ganglioside. ⁇ ⁇ 0. 000 1
  • Figure 2 shows that the soluble assembly is the one that shows toxicity in the incubation mixture containing GM1 gandarioside and A.
  • Fig. 3 shows the characteristics of TA / 3 (reactivity with antibodies).
  • Panel (A) obtained by ultracentrifugation of arctic type A / 3 only, GM1 ganglioside (10%) only, or incubation mixture (whole) containing arctic type A j3 + GM1 gandarioside (10%) The results of dot blot analysis of the supernatant (sup) are shown. Blots were reacted with anti_01igo antibody (Biosource Inc., Camarillo, Calif.) Or HRP-conjugated cholera toxin subunit B (CTX (Sigma, St. Louis, Mo.)).
  • Panore (B) This is a graph showing suppression of TA 3 -induced LDH release from PC12N cells by co-incubation with anti-Oligo. Each column shows the average of the three values (Sat SD). * Represents p ⁇ 0. 000 1
  • FIG. 4 shows the biophysical and structural analysis of T A j3.
  • the bar is 1 00 ⁇ m.
  • the supernatant obtained by ultracentrifugation of the incubation mixture containing TAj3 was analyzed by AFM.
  • the incubation mixture contained arctic A] 3 only (Aj3), only GM1 ganglioside (10%) (GM1), or both (Ai3 + GM1).
  • the bar is 200 nm.
  • Panole (C) This is a diagram showing the results of size-exclusion chromatography of TA] 3-containing fractions using Superose 12.
  • FIG. 35 fractions of elution sample were doted on a nitrocellulose membrane. This plot was reacted with anti_01igo antibody. Five typical fractions are shown.
  • Fractions 2 and 4 correspond to fractions containing TA and monomer, respectively. Immunoreactivity was collected as a single peak (2) with an apparent molecular weight of about 200 to about 30 OkDa. .
  • FIG. 5 shows the inability to suppress T A formation by the 4396C antibody.
  • FIG. 6 shows the formation of T A 3 by arctic A incubation in the presence of synaptosomes.
  • FIG. 7 is a diagram showing the characteristics of the toxicity of TA] 3 to PC12 or PC12N cells.
  • a and b are phase contrast microscope images, and c and d are Hoechst 33258 nuclear staining images. Arrows indicate nuclear condensation and fragmentation, cell body contraction and neurite retraction. The bar is 50 ⁇ .
  • Panel ( ⁇ ) A graph showing the toxicity of various types of cultured cells. Cell viability was assessed by LDH release assay in these cultures.
  • ⁇ C 1 2 N NG F-treated P 1 2 cells
  • PC 1 2 native PC 1 2 cells
  • 3 ⁇ 1—3 ⁇ 5 ⁇ 3 ⁇ 1_3 ⁇ 5 ⁇ neuroblastoma
  • hBME human brain Microvascular endothelial cells
  • HEK 29 3 HEK 29 3 cells
  • h AST human astrocytes
  • r AST rat astrocytes
  • RAW264. 7 mouse monocytes
  • fibroblast-large T antigen Immortalized mouse fibroblasts Each column shows the average of the three values (Sat S D). * P ⁇ 0. 000 1, vs A when treated with an incubation mixture containing only ⁇ .
  • Figure 8 shows that ⁇ induces cell death via the NGF receptor.
  • Panel ( ⁇ ) This figure shows suppression of ⁇
  • TA] 3 toxicity was assessed by LDH release assay in these cell cultures.
  • Each force Lamb represents the average of the three values (Sat SD). * P ⁇ 0. 000 1
  • ⁇ 3 of the present invention is produced by incubating ⁇ in the presence of liposomes containing a concentration of GM 1 ganglioside suitable for its genotype.
  • Monomer used in the production of 3 ⁇ may be wild type or mutant type, but from the viewpoint of toxicity, etc., mutant type, especially A) 3 domain A type in which a mutation is present (for example, Italian type, Arctic type, Flemish type, etc.) is preferable, and an arctic type is most preferable.
  • Arctic mutations are substitutions of amino acids located in codon 693 of human amyloid precursor protein (APP) (glutamate is replaced by glycine; E693G).
  • the mutation corresponds to the substitution of the 22nd amino acid in A / 3.
  • the arctic type includes those having mutations corresponding to the above mutations in sequences derived from animals other than humans. Other variants The same applies to, and also includes mutations in other animals corresponding to each mutation in humans.
  • the A used in the present invention can be preliminarily removed from an insoluble peptide that can become a seed of A ⁇ polymerization by subjecting it to ultracentrifugation after dissolution.
  • the ribosome containing GM 1 ganglioside used in the present invention has a lower molar ratio in total lipid components of about 10/100 to about 15/100 (lower than required for amyloid fibril formation).
  • the GM 1 ganglioside in a ratio of about 10 to about 15 mol /.) May be contained and can be prepared by a known general method.
  • GM1 ganglioside may regulate the conformation of GM1 gandarioside and provide a favorable microenvironment for TA / 3 formation.
  • Components other than GM1 gandarioside in the lipid mixture may be cholesterol or phospholipid, and phospholipids present in the brain are preferable as the phospholipid.
  • GM1 ganglioside examples include cholesterol, sphingomyelin, and phosphatidylcholine, and cholesterol and sphingomyelin are preferred.
  • One phospholipid may be used alone, or two or more phospholipids may be used in combination.
  • Components other than GM1 ganglioside in the lipid mixture most preferably include cholesterol and sphingomyelin.
  • the molar ratio of cholesterol: sphingomyelin is preferably 0.5: 1.5 to 1.5: 0.5.
  • the molar ratio of cholesterol and sphingomyelin is about 0.5: 1 to 1: 0.5, or about 0.8: 1.2-2 to 1.2 to 0.8.
  • GM 1 ganglioside is a fine conformation to be a preferred conformation for TA ⁇ formation
  • a mixture with a 1: 1 molar ratio is most preferred, since it is likely to give an environment and is considered preferable.
  • suitable ribosomes containing GM 1 gandarioside include, for example, a cholesterol: sphingomyelin: GM 1 gandalioside molar ratio of 4 5: 45: 1 0 to 42.5: 42.5 : Prepare a lipid mixture such that the ratio of GM 1 ganglioside in the lipid mixture is 10 to 15 ° / 0 in molar ratio, and use this in a suitable buffer (eg Tris It can be prepared by suspending in buffered saline (TB S).
  • a suitable buffer eg Tris It can be prepared by suspending in buffered saline (TB S).
  • Incubation of liposomes containing GM 1 ganglioside and A] 3 can be initiated by bringing each together in solution at an appropriate concentration.
  • the final concentration in such an incubation mixture is Aj3 of 10 to 200 ⁇ , preferably about 25 to 100 ⁇ .
  • GM1 gandarioside is 30-50 ⁇ , preferably about 62-375 ⁇ , particularly preferably about 100-200 ⁇ , and the total ribosome-constituting lipid is 0.3-5 mM, preferably 0. 6 2 to 3.75 mM, particularly preferably about 1 to 2 mM.
  • Incubation for TA formation is generally performed at about 20 to about 40 ° C (preferably about 37 ° C, that is, about 35 to about 40 ° C) for about 1 to about 30 hours.
  • optimal conditions can be selected as appropriate according to the Ai3 used. For example, when using wild type peptides, about 35 to about 40 ° C (especially about 37 ° C) for about 20 to 30 hours; using Arctic A j3, about 35 to about 40 ° C Incubation for about 1 to about 5 hours (especially about 1 to about 3 hours) at about 37 ° C is especially optimal.
  • TA / 3 is an incubation Tend to appear early in the course of the time and disappear through subsequent incubations. This suggests that TA may also be an intermediate in the process of forming larger A
  • 3 oligomer formation (Non-patent Document 24) suggests that soluble ⁇ ] 3 assemblies and protofibrils are formed as intermediates in amyloid fibril formation. is doing.
  • TAi3 of the present invention is generally formed in the presence of GM1 ganglioside at a concentration lower than the GM1 ganglioside concentration generally required for the formation of amyloid fibrils, and TA as described below.
  • TAi3 does not inhibit amyloid fibril formation linearly because it is not inhibited by antibodies specific to amyloid fibril-forming species (one GM 1 gandarioside and A
  • the TA of the present invention is suitably formed after incubation under the conditions as described above and is included in the incubation mixture. Although it is believed that little or no fibrils (insoluble assemblies) are formed under conditions favorable for the formation of ⁇
  • the supernatant of the present invention can be concentrated or partially purified by centrifuging for 5 minutes or under equivalent conditions and collecting the supernatant.
  • “equivalent conditions” refer to conditions that bring about substantially the same separation as centrifugation under specified conditions.
  • the recovered supernatant can be further subjected to size exclusion chromatography, and the fraction containing TA / 3 can be recovered to further purify TA. it can.
  • TA] 3 of the present invention comprises at least rat subcultured euron; PC 12 cells natively or differentiated by NGF treatment, human brain microvascular endothelial (h BME) cells, Human brain astrocytes (hAST), human neuroblastoma SH—SY 5 Y (SY 5 Y) cells, human embryonic kidney 29 3 (HEK 29 3) cells, mouse monocytes RAW264. 7 (R AW264) It is possible to induce cell death exhibiting apoptosis-like characteristics in cultured cells (including non-neuronal cells).
  • h BME human brain microvascular endothelial
  • hAST Human brain astrocytes
  • SH—SY 5 Y (SY 5 Y) cells human embryonic kidney 29 3 (HEK 29 3) cells
  • mouse monocytes RAW264. 7 RAW264
  • the presence of the TA of the present invention can be determined, for example, by adding such an incubation mixture or its centrifugal supernatant or fraction to these TA-sensitive cultured cells to induce cell death. It can be confirmed by examining it. Whether a cell is alive or not can be easily determined by a known method, for example, staining with a known dye or lactate dehydrogenase (LDH) release assay as described later.
  • LDH lactate dehydrogenase
  • TAi3 of the present invention has the greatest feature in the strength of its toxicity.
  • the LDH release rate ie, cells are lysed with Triton-XI00.
  • the percentage of LDH released when treated with a specimen relative to the amount of LDH released when LDH is released in all cells) is at least 30%, preferably 50% or more, more preferably 60 % LDH release rate and almost completely let the cells die.
  • the amount of LDH released from the inside of the cell due to the cell membrane being broken is used as an index. Some do not release LDH because they do not spread (eg cell atrophy). Therefore, if the LDH release rate is about 70% or more, almost all cells die.
  • the LDH release rate by the TA of the present invention as described above is very high.
  • TA 3 A ⁇ concentration 25 ⁇
  • cell viability is determined by dye staining.
  • the number of eurons is 75% or less, preferably 60% or less, more preferably 40% or less, and most preferably 20 ° / 0 or less compared to the subject culture without TA 3 of the present invention. It becomes.
  • anti-oligo antibody anti-Oligo
  • All antibody is an antibody specific for oligomers of amyloidogenic protein, for example, it reacts with soluble A / 340 oligomers but is soluble monomer A ⁇ 40 or A j34 0 Does not react with fibrils.
  • the TA of the present invention has a completely different form from amyloid fibrils that are insoluble or other known soluble assemblies.
  • ⁇ ; 3 of the present invention includes structures that are not observed with a normal electron microscope, but appear as spherical particles with a diameter of about 10 to about 20 ⁇ ⁇ ⁇ with an atomic force microscope.
  • the diameter here is the length based on the height difference obtained from the sample in accordance with the principle of atomic force microscopy (AFM), and is measured by the cross-sectional analysis method.
  • AFM atomic force microscopy
  • TA jS of the present invention does not form a band by SDS polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), and has a peak at about 20 to about 30 OkDa by molecular weight measurement by size exclusion chromatography. Furthermore, no GM 1 ganglioside is detected in T A] 3.
  • An antibody against a phlegm fibril-forming species (4 3 96 C, Non-patent Document 25) inhibits phlegm fibril formation, but the production of T A / 3 of the present invention is not inhibited by this antibody.
  • TA / 3 of the present invention is a known oligomer such as ADD L or a known It is clearly different from ibril.
  • TA / 3 is also formed in in vivo and is thought to have a pathological role.
  • TA 3 of the present invention is significantly formed in the presence of synaptosomes, particularly synaptosomes derived from the hippocampus of aging mouse brain. This is in conjunction with our recent observation that the density of GM1 gangliosides in synaptosomes increases with age and expression of apolipoprotein E4 (27), in vivo, especially in the onset of AD. It suggests that TA 3 can be formed in certain areas of the brain, such as the hippocampus, associated with risk factors. In addition, soluble A / 3 assemblies such as TAj3 are thought to cause NGF-dependent loss of euron in cholinergic basal forebrain in AD in vivo.
  • T A; 3 substances that reduce or prevent the toxicity of T A; 3 are important in the prevention or treatment of amyloid-related diseases such as AD.
  • TA] 3 of the present invention can be used to screen for substances that affect its properties (eg, toxicity).
  • a cultured cell sensitive to TA of the present invention is incubated in the presence of TA / 3 of the present invention and a test substance, and then the viability of the cultured cell is measured, so that the test substance is TA 3 It is possible to determine whether or not it has affected the characteristics of the cells, and to identify substances that have the desired effect.
  • the cultured cells used here may be those that are sensitive to TA 3, It may be a primary culture or an established cell line. Examples include, but are not limited to, cells in which cell death is induced by TA as described above.
  • test substance there are no particular limitations on the test substance, and generally low molecular weight compounds, peptides, proteins (including antibodies and their modifications), nucleic acids (single-stranded or double-stranded products)
  • Cell viability can be measured by known methods as described above. If cell death is increased when the test substance is included compared to the result of incubation without the test substance, the test substance enhances the toxicity of TA / 3 If the cell death is reduced, it can be determined that the test substance has an action of suppressing the toxicity of TA 3. In the former case, whether or not the test substance has intrinsic toxicity can be examined by conducting the same test separately in the presence of the test substance and in the absence of T A.
  • a substance determined to have an action of suppressing the toxicity of TA j3 by the above screening can be selected as a drug candidate substance.
  • the TA / 3 of the present invention binds competitively with NGF to the NGF receptor. That is, cell death induced by TA
  • knockdown of either NGF receptor: 75 NTR or T rk A significantly suppresses cell death induced by TA / 3. This can be used to screen for compounds that suppress the toxicity of TA] 3.
  • cultured cells sensitive to the TA of the present invention are incubated in the presence of the TA of the present invention and a test substance, and then the viability of the cultured cells is measured. It is possible to identify compounds that suppress the toxicity of ⁇
  • Tris-buffered saline TBS: 15 OmM NaC1 and 10 mM Tris_HCl, H7.4.
  • ribosomes For the preparation of ribosomes, cholesterol (Sigma, catalog number: C 8 66 7), Sphingomyelin (Sigma, Kataguchi number: S 7004), and GM 1 ganglioside (Matrea, Kataguchi) Number: 1 06 1), 50: 5 0: 0, 4 5: 45: 1 0, 42.5: 42. 5: 1 5 or 40: 40: 20 molar ratio, total lipid concentration is 1 Dissolved in a solution of black mouthforma methanol (1: 1, volume ratio) to 5 mM (ie, GM1 glandioside concentration was OmM, 1.5 ⁇ , 2.25 mM, or 3. OmM, respectively).
  • the proportion of GM1 gandalioside in the total lipid molecules constituting the ribosome was 0%, 10%, 15% and 20%, respectively. 86 parts of this lipid mixture solution was dispensed into glass tubes, and nitrogen gas (40 ° C) was blown for 1 hour to evaporate the solvent. This fat mixture was stored at 180 ° C until use.
  • cerebral cortical euron was prepared from Sprague-Dawley rat 17 7 embryonic force, Dulbeccos modified Eagle medium nutrient mixture (trade name; Invitrogen, Kataguchi number: 1 2 8 0 0— 0 1 7) and N 2 sub-elements ("N2- supplementj (trade name; Invitrogen, Kataguchi No .: 1 7 50 2-0 4 8))" (5% C 0 2 , 3 7 ° C, humidified
  • Neurons were stained with force Lucein AM (calcein AM, Invitrogen, Carlsbad, Calif.) Ethidium homodimer. This stains live cells in green and dead cells in red.
  • Panel (A) shows GM1 ganglioside content 0% (top), 10 ° /. (Middle), 20% (bottom) ribosomes, A] 3 free (left column) or wild type ("wildj) A ⁇ (middle column) or arctic type (" Arctic ")
  • a / 3 Represents a photomicrograph of cells treated with the incubation mixture (37 ° C, 2 hours) containing (right column). The lower right bar is 50 / im.
  • Panel (B) shows wild-type or arctic plates incubated for 2 hours at 37 ° C at 50 M (final concentration in the incubation mixture) in the presence or absence of GM 1 ganglioside under the indicated conditions. Shows the number of surviving primary cultures treated with type A / 3. Each column is the mean (soil SD) of the three percentages relative to the control culture (GM1 0%, ⁇ (one)) containing neither A nor GM1 gandarioside, * is Represents.
  • PC 12 cells were coated with poly_L-lysine (10 ragZmL) in 2 cm 2 dishes at a density of 20 0, 0 0 cells / cm 2 and 10 OngZraL nerve growth factor (NG F; Alomone Labs , Jerusalem, Israel) for 6 days and differentiated (hereinafter also referred to as “PC 1 2 N” cells).
  • poly_L-lysine 10 ragZmL
  • NG F OngZraL nerve growth factor
  • the cells were treated with the incubation mixture in the same manner as described above using the primary culture instead of Euron, and the cells were observed.
  • Fig. 1, Panel (C) The results are shown in Fig. 1, Panel (C).
  • the right end (A ⁇ (+) / GM l (+)) shows the arctic form preincubated for 2 hours at 37 ° C in the presence of ribosomes containing GM 1 gandarioside (10%). Cells treated with an incubation mixture containing.
  • the center left ( ⁇ ) 3 (+) ZGM 1 (one)) is ⁇ only
  • the center right (A 3 (—) / GM 1 (+)) is only GM 1 gandario side
  • the left end (A ⁇ (one) ) / GM 1 (_)) are cells treated with an incubation mixture containing only TBS.
  • NGF-treated PC12 cells were also confirmed to be sensitive to toxic ⁇ assemblies formed from the arterial ⁇ in the presence of GM1 ganglioside.
  • P C 12 sputum cells were used.
  • Thioflavin T specifically recognizes the aminoid fibril structure.
  • RF-5300PC spectrofluorometer
  • the optimal fluorescence intensity of amyloid fibrils is determined by the excitation and emission wavelengths of 4 46 nm and 4 90 nm, respectively. Then, the measurement was carried out using a 1. OmL reaction mixture (containing 10 ⁇ 1 of the incubation mixture) containing 5 ⁇ chome and 5 01 ⁇ glycine monoa OH ( ⁇ ⁇ 8.5). The fluorescence intensity was measured immediately after preparing the reaction mixture.
  • Fig. 2 Panel ( ⁇ ). This figure shows a GM1 ganglioside content of 0. 0 None (“ ⁇ ⁇
  • PC 1 2 N cells were prepared in the same manner as in the above experiment 2.
  • LDH assay toxicity kitj (trade name, Promega, Madison, WI) was used.
  • the degree of LDH release in each sample was determined according to “Emax precision (trade name, (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, Calif.) Evaluated by measuring absorbance at 490 nm using a microplate reader Background absorbance was measured using a cell-free well and each test was performed. Subtract from the absorbance of the sample According to the instructions attached to the kit, average the absorbance measured in the three cells and release the intracellular LDH. The LDH release rate (%) was calculated by dividing by the measured value for each test sample treated with 1% Triton X-100 to induce release.
  • Fig. 2 Panel ( ⁇ ). Each column shows the average of the three values (Sat S D), and * indicates ⁇ 0 0.0 0 0 1 (one-way ANOVA combined with Scheffe's test).
  • the column contains Aj3 without GM1 ganglioside content 0%, 10%, 20% ribosome (“Aj3 (—)”, ie TBS only control; white), wild type A / 3 (“ "wild”; hatched), arctic ("Arctic”; black).
  • Arctic Form A was toxic to cell death in the presence of ribosomes containing 10% or 15% GM1 in the 2 hour incubation.
  • wild-type A 3 showed almost no toxicity after 2 hours of incubation, and the presence of higher concentrations (15% or 20%) of GM1 gandarioside after 24 hours of incubation.
  • Incubation mixture containing arctic ⁇ ; 3, which was incubated for 2 hours at 37 ° C in the presence of ribosomes containing GM 1 gandarioside (10%) was centrifuged at 5 40, 0 00 X g, 15 minutes, 4 ° C, and the supernatant and the precipitate were collected. Using each of these supernatant, precipitate, and incubation mixture before centrifugation, an LDH release assay was performed in the same manner as described above.
  • Fig. 2 Panel (C).
  • Each column shows the average of the three values (Sat SD), and * represents ⁇ 0. 0 0 0 1.
  • a j3 incubation mixture (“whole”) pre-centrifugated in the presence of GM 1 ganglioside Toxicity was recovered only in the supernatant obtained by ultracentrifugation (“su P ”) and the precipitate (“ppt”) showed little toxicity.
  • Non-Patent Documents 2 and 2 2 soluble A assemblies are disaggregated by denaturing gel electrophoresis when they are not cross-linked (Non-Patent Documents 2 and 2 2) except for certain oligomers in cell culture (Non-Patent Document 1). This agrees with the conventional knowledge of (Non-patent Document 3).
  • CT X is a natural ligand that specifically reacts with GM1 gandarioside.
  • 3 and GM 1 ganglioside (10%) ribosomes was easily recognized by anti_01igo, but the reactivity with CTX was recovered in the supernatant. There wasn't. Therefore, TAj3 is not considered to contain GM1 gandarioside.
  • the incubation mixture (10% GM1 Gandarioside (1 2 5 ⁇ ) + 5 ⁇ ⁇ arctic type was prepared in the same manner as I. above. ⁇ ) was used to pre-incubate with 0.3 / ⁇ anti-Oligo antibody at 37 for 120 minutes, followed by LDH release assay on PC 12 N cells.
  • Ig G was used instead of anti_01igo.
  • TAjS toxicity ie, TA 3 induced LDH release from PC12N cells, was significantly suppressed by preincubating the incubation mixture with anti-Oligo.
  • Panel (A) the left side (“AJ”) is the incubation mixture containing Arctic type A incubated by the method of Non-Patent Document 17 to enable protofibril formation, and the right side (“B”) is TA.
  • Non-patent Document 17 A typical structure of protofibrils was observed in “ ⁇ ”. On the other hand, a certain structure was not observed in “ ⁇ ” (it is the ribosome that looks round). Therefore, the cocoons of the present invention were not observed with an electron microscope under conditions in which a protofibril prepared as reported previously (Non-patent Document 17) can be easily detected.
  • Non-Patent Document 1 Incubation mixture containing only GM1 ganglioside or only A / 3, or both 540,000 Xg, 15 minutes, ultracentrifugation at 4 ° C (“ ⁇ + GM1”; GM1 (10%), Arctic, 37 ° C, 2 hours) was dropped onto the newly cut mica. After standing for 3 minutes, wash with water and set the sample to the tapping mode ⁇ Nanoscope IllaJ (product name, (Digital Instruments, Santa Barbara, CA, USA) (Non-patent Document 2) In solution. “0MCL-TR400PSA” (trade name, Olympus, Japan) was used as the cantilever. The resonant frequency was about 9 kHz. The amplitude range was 0. IV.
  • the lower right bar is 200nm.
  • spherical particles with a diameter of about 10 to about 20 nra are obtained by ultracentrifugation of an incubation mixture containing TA] 3 with a rod-like structure.
  • a 3 + GMl the supernatant
  • the diameter of the spherical particles was measured using “Nan OSCO pe Illaj” and the software incorporated therein.
  • the size of TA molecules was determined by dot-lot analysis using size exclusion chromatography (SEC) and anti-Oligo.
  • SEC size exclusion chromatography
  • 3 + G Ml” sample (10% GM 1 ganglioside and 50 ⁇ M Arctic ⁇ / 3 incubated at 37 ° C for 2 hours, then 540, 000 X g, 15
  • the supernatant obtained by ultracentrifugation at 4 ° C was equilibrated with PBS (pH 7.4) at a flow rate of 0.5raL / min.
  • the immunoreactivity with anti-Oligo was recovered as “a single peak with a relative molecular weight of about 200 to about 30 OkDa in the Ai3 + GMl j sample. This is formed from arctic type A] 3. It was similar to a certain soluble A] 3 assembly called amyloid dopor (Non-patent Document 18), but the amyloid dopor has a hole-like structure in the center. The pores were not observed in TA; 3 while it looked like a donut.
  • 3 could be formed in the presence of natural neuronal membranes.
  • Synaptosomes were prepared as previously reported (Non-patent Document 3). Whole brain excluding the hippocampus or hippocampus of mice from three different age groups (1 month, 1 year, 2 years) in 0.32 M sucrose buffer containing 0.25 mM EDTA. Homogenized. The homogenate was centrifuged at 580 X g for 8 minutes. The supernatant was centrifuged at 14,000 xg for 20 minutes. The obtained pellet was suspended in 0.32M sucrose buffer containing no EDTA, and layered on Ficoll (trade name, Sigma) in sucrose buffer. After centrifugation at 87,000 Xg for 30 minutes, the interface enriched with synaptosomes was collected and centrifuged again to remove the remaining Ficoll.
  • Arctic Form A was incubated in the presence of synaptosomes prepared from mouse brain.
  • Arctic Form A 3 at 50 ⁇ (final concentration in the incubation mixture) at 37 ° C for 2 hours, in the presence or absence of each synaptosome prepared (100 / g / mL protein) Pre-incubated (37 ° C., 2 hours) with or without antibody specific for GM 1 gandalioside (“anti-GM1”) or anti-Oligo antibody (0.3 ⁇ M).
  • Ig G was used as a control.
  • TA formation was assessed by a similar LDH release assay in PC 1 2 N cell cultures treated with these incubation mixtures.
  • the result is shown in FIG. “Wh” is the whole brain excluding the hippocampus, and “Hp” is the hippocampal synaptosome.
  • Each column shows the average of four values (Sat SD). * Indicates p ⁇ 0.001 and ** indicates ⁇ ⁇ 0.005. ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ The level of formation was in the incubation mixture containing synaptosomes prepared from the hippocampus of aged (2 years old) mice, all other incubation mixtures (younger (1 month and 1 year old) mouse hippocampus Or those containing synaptosomes from the whole brain excluding the hippocampus).
  • a surprising feature of TA is its strong toxicity.
  • FIG. 7 A photograph of PC12N cells after treatment is shown in Figure 7, panel (A) (bar is 50 m).
  • a and b are phase contrast microscope images, and c and d are nuclear staining images.
  • h BME Human Cerebral microvascular endothelium
  • hAST human brain astrocytes
  • the cells were cultured in a medium (Dainippon Pharmaceutical Inc.).
  • Rat astrocytes (rAST) were cultured in DMEM medium containing 10% urine fetal serum.
  • Human neuroblastoma SH-SY5 Y (SY 5 Y) cells were cultured in DMEM / Ham's F — 12 medium supplemented with 10% FBS.
  • Human embryonic kidney 29 3 (HEK 29 3) cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS.
  • Mouse monocytes RAW 264. 7 (RAW 264) cells were purchased from Dainippon Pharmaceutical Inc. RAW264 cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS.
  • Mouse fibroblasts immortalized with large T antigen (“fibroblast”) were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS. All cells were cultured in a humidified 5% C_ ⁇ 2, 3 7 ° C.
  • PC 12 N cells and native PC 12 cells were treated with ⁇ in the presence of exogenous NGF.
  • PC 1 2 sputum cells and PC 1 2 cells (number of cells 1.5 X 10 4 )
  • Incubation mixture containing TA] 3 in the same manner as above (50 ⁇ Arctic A / 3 and 10% GM1 Gundarioside, 37 ° C, 2 hours) Each cell was treated with and LDH release assembly was performed.
  • T r kA and p 75 NTR were knocked down using specific small interfering RNA (siRNA).
  • siRNA small interfering RNA
  • siRNA small interfering RNA double-stranded oligonucleotide for PC 12 cells T rk A (GenBank no. NM_021589) and p 7 5 (GenBank no. NM_012610) (Carlsbad, CA).
  • the siRNA sequences were as follows:
  • siRNA oligonucleotides RNA amount 2 Omol
  • LipofectAMINE 2000 trade name, Invitrogen
  • these PC 12 cells are incubated with TA in the same manner as described above (50 ⁇ erotic type ⁇ / 3 and 10 ° / o GM1 Treatment with Gandarioside (37 ° C, 2 hours), and LDH release assembly was performed.
  • T r kA in each cell and! ) 75 NTR expression level was reduced by Western blot analysis of cell lysates using anti-Trk A (Santa Cruz) and anti-p75 NTR (NeoMarker) antibodies (7.5% and 4-20), respectively.
  • % Polyatalylamide gel (Daiichi Kagaku minigel), migrated at 4 OmA for 1 hour, and then blotted at 120 mA for 2 hours).
  • ⁇ ] 3 disrupts the function of the heteromeric T r kA / p 75 NTR complex by binding to ⁇ 75 NTR or T rk ⁇ , resulting in the cytoplasmic portion of the p 7 5 NTR molecule. It was suggested that apoptosis is brought about through the activation of the domain involved in death.

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Abstract

ＡＤのようなアミロイド関連疾患の研究並びに予防及び治療に有用な新規のＡβアセンブリー及びその製造方法を提供する。さらに、そのようなＡβアセンブリーを用いたアミロイド関連疾患の研究並びに予防及び治療のための方法及び化合物等を提供する。ＧＭ１ガングリオシドの存在下でインビトロで形成される可溶性毒性アミロイドβアセンブリーであって、（ａ）サイズ排除クロマトグラフィによる見かけの分子量が約２００～約３００kDaであること；（ｂ）原子力間顕微鏡観察による直径が約１０～約２０nmである球状粒子を含むこと；（ｃ）検出可能なＧＭ１ガングリオシドを含まないこと；及び（ｄ）培養細胞に対してアポトーシス様細胞死を誘導すること、を特徴とするアセンブリー。

Description

明 細 書 アミロイド オリゴマー並びにその製造方法及び使用方法 技術分野
本発明は、 アミロイ ド |3の可溶性毒性アセンブリー （オリゴマー） 、 及ぴそ の製造方法及び使用方法に関する。 背景技術
アミロイド （以下 「Α|3」 ともいう） は、 アルツハイマー病 （以下 「AD 」 ともいう） 患者において観察されるプラークの主要タンパク質成分であり、 ダ ゥン症候群におけるプラーク成分でもあることがわかっている。
最近、 可溶性 A アセンブリー （ 「A オリ ゴマー」 とも呼ばれる） （非特許 文献 1)、 プロ トフイブリル （非特許文献 2、 3) 又は A3由来拡散性リガンド (A|3 -derived diffusible ligands； 「ADDL」 とも呼ばれる） （非特許文献 4、 特許文献 1)は、 ニューロン機能に対する傷害性の強さ又は神経変性の誘導 性の強さによって注目されている （非特許文献 4〜1 0) 。
AD患者の脳及ぴ脳脊髄液中の可溶性 A レベルの増大 （非特許文献 1 1〜 1 3) に加えて、 天然の A オリゴマーによるインビポでの認知機能の破壌及び 長期にわたる相乗作用の阻害 （非特許文献 6、 14) により、 これらの可溶性 A βアセンブリーの病理学的関連性が示唆されている。 可溶性 Α アセンブリーが どのようにして-ユーロンを損傷するかは未解明であるが、 ニューロン膜上での 標的分子への特異的結合 （非特許文献 1 5 ) 及びイオン恒常性 （ionic homeostasis) の撹乱と関連した原形質膜のュビキタスな破壌 （非特許文献 1 6 ) などのいくつかの可能性が提案されている。
可溶性 A ι3アセンブリーがインビトロで形成されることが報告されている。 例えば、 AD D Lは、 培地で希釈した Α β溶液を約 4 °Cで約 2時間〜約 4 8時間 インキュベートし、 約 4°Cで約 1 4， 00 0 gで遠心分離した後、 上清中に含ま れる （特許文献 1) 。 ADD Lは、 非変性ゲル電気泳動において約 2 6〜約 2 8 kD、 1 5 %ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動 （PAGE) において約 2 2〜約 2 4kD 又は約 1 8〜約 1 9kD の分子量を有し、 原子間力顕微鏡による観察におい て約 4. 7〜約 6. 2nra の大きさであることが記載されている （特許文献 1 ) また、 A βを、 ホウ酸緩衝液中で過酸化水素及びペルォキシダーゼと共に 3
7°Cで 5日間インキュベートすることにより、 チロシン架橋された神経毒性オリ ゴマーが得られることが記載されている （特許文献 2) 。
遺伝性変異型であるアークティック （Arctic) 型 A /3は、 神経毒性の可溶性
A；8アセンブリーを形成する傾向を有している （非特許文献 1 0、 1 7、 1 8) 。 本発明者らは、 最近、 アークティック型 A/3は野生型 A /3と同様に GM1ガン グリオシドの存在下で好適に沈澱性アセンブリーを形成することを観察した （非 特許文献 1 9、 2 0) 。
神経成長因子 （NGF) は広範な細胞タイプの分化及び機能において重要な 役割を果たすこと、 及び低親和性の NGFレセプター （p 7 5NTR) が細胞の生 存及び死において二重の役割を果たすことについて、 証拠が蓄積されている。 そ して、 不溶性 A |3アセンブリーの毒性は！ 7 5 NTRとの関連を通じて現れること (非特許文献 2 8、 2 9)、 及び A DD Lは培養細胞における N G F媒介性シグ ナル伝達を変え得ること (非特許文献 8 ) が示唆されている。
特許文献 1:特表 2 0 0 1— 5 0 1 9 7 2 (WO 9 8/3 3 8 1 5) 特許文献 2:特表 2004- 50 1 204 (WO 2002/000245) 非特許文献 1'·Μ. B. Podlisny, et al. , J Biol. Chem. 270, 9564 (1995).
非特許文献 2： J. D. Harper, S. S. Wong, C. M. Lieber, P. T. Lansbury, Chem. Biol. 4, 119 (1997).
非特許文献 3: D. M. Walsh, et al. , J. Biol. Chem. 272, 22364 (1997).
非特許文献 4:M. P. Lambert, et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 6448 (1998).
非特許文献 5:D. M. Hartley, et al. , J. Neurosci. 19， 8876 (1999).
非特許文献 6:D. M. Walsh, et al.， Nature. 416, 535 (2002).
非特許文献 7: K. N. Dahlgren, et al. , J. Biol. Chem. 277, 32046 (2002). 非特許文献 8: B. A. Chromy, et al.， Biochemistry. 42, 12749 (2003).
非特許文献 9:M. Hoshi, et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100， 6370 (2003).
非特許文献 10 :B. M. Whalen, D. J. Selkoe, D. M. Hartley, Neurobiol. Dis. 20， 254 (2005).
非特許文献 11:A. E. Roher, et al.， J. Biol. Chem. 271， 20631 (1996).
非特許文献 12:M. Pitschke, et al. , Nat. Med. 4, 832 (1998).
非特許文献 13 :Y. Gong, et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 10417
(2003).
非特許文献 14:J". P. Cleary, et al. , Nat. Neurosci. 8， 79 (2005).
非特許文献 15:P. N. Lacor, et al. , J. Neurosci. 24， 10191 (2004).
非特許文献 16:A. Demuro, et al. , J. Biol. Chem. 280, 17294 (2005).
非特許文献 17: Nilsberth, et al. , Nat. Neurosci. 4， 887 (2001).
非特許文献 18:H, A. Lashuel, et al. , Nature. 418， 291 (2002). 非特許文献 19 :K. Yanagisawa, A. Odaka, N. Suzuki, Y. Ihara, Nat. Med. 1， 1062 (1995).
非特許文献 20:N. Yamaraoto, et al. , J Neurochem. 90， 62 (2004).
非特許文献 21: C. S. At ood, et al. , J. Neurochem. 75, 1219 (2000).
非特許文献 22 :G. Bitan, A. Lomakin, D. B. Teplow, J. Biol. Chem. 276, 35176 (2001).
非特許文献 23: R. Kayed, et al.， Science. 300， 486 (2003).
非特許文献 24:D. M. Walsh, et al. , J. Neurosci. 25， 2455 (2005).
非特許文献 25:H. Hayashi, et al. , J. Neurosci. 24, 4894 (2004).
非特許文献 26 :P. Brocca, P. Berthault, S. Sonnino, Biophys. J. 74, 309 (1998).
非特許文献 27:Ν· Yaraamoto, et al. , FEBS Lett. 569, 135 (2004).
非特許文献 28 :S. Rabizadeh, et al. , Pro Natl. Acad. SCI. USA. 91，
10703 (1994)
非特許文献 29:M. Yaar, et al.， J. Clin. Invest. 100， 2333 (1997).
非特許文献 30 :S. P. Lad, K. E. Neet, E. J. Mufson, Current Drug Targets-CNS & Neurological Disrders. 2, 315 (2003).
非特許文献 31 :N. J. Woolf, R. W. Jacobs, L. L. Butcher, Neurosci. Lett. 96, 277 (1989).
非特許文献 32 :N. J. Woolf, E. Gould, L. L. Butcher, Neuroscience. 30， 143-152 (1989).
非特許文献 33: S. Maeda et al.， Neurosci Res (in press) .
非特許文献 34:H. G. Hansma et al. , Biophys J 68, 1672-7 (1995).
非特許文献 35 :F. Schroeder, W. J. Morrison, C. Gorka, W. G. Woog, Biochira. Biophys. Acta 946， 85 (1988). 発明の開示
発明が解決しようとする課題
本発明は、 ADのようなアミロイ ド関連疾患の研究並びに予防及び治療に有 用な新規の A ァセンブリ一及びその製造方法を提供することを目的とする。 さ らに、 本発明は、 そのような Α アセンブリーを用いたアミロイド関連疾患の研 究並びに予防及び治療のための方法及び化合物等を提供することを目的とする。 課題を解決するための手段
本発明者らは、 特定の濃度の GM 1ガングリオシドの存在下で、 野生型又は 遺伝性変異型 A ]3、 特にアークティック型 A /3から、 より迅速に、 より毒性の強 い新規の可溶性毒性 A j3アセンブリー （soluble toxic amyloid β ；以下におい て 「ΤΑ/3」 ともいう） が形成されることを見出し、 本発明を完成した。
本発明は、
〔 1〕 GM1ガングリオシドの存在下でインビト口で形成される可溶性毒性ァ ミロイ ド /3アセンブリーであって、
(a ) サイズ排除クロマトグラフィによる見かけの分子量が約 200〜約 300 kDaであること ；
(b) 原子力間顕微鏡観察による直径が約 1 0〜約 2 Onm である球状粒子を含 むこと ；
(c) 検出可能な GM1ガングリオシドを含まないこと ；及び
( d) 培養細胞に対してアポトーシス様細胞死を誘導すること、
を特徴とするアセンブリー； 〔2〕 アミロイド /3が、 野生型ペプチド又はアークティック型変異を有するぺ プチドである、 前記 〔1〕 記載のアセンブリー；
〔3〕 可溶性毒性アミロイ ド 3アセンブリーの製造方法であって、 単量体アミ ロイド /3を、 脂質成分のモル比で約 1 0〜約 1 5 %の GM 1ガングリオシドを含 むリボソームと共に約 3 5〜約 4 0 °〇で約1〜約3 0時間インキュベートするェ 程を含むことを特徴とする方法；
〔4〕 単量体アミロイド ;3が野生型ペプチドであり、 インキュベーション時間 が 2 0〜3 0時間である、 前記 〔3〕 記載の方法；
〔5〕 単量体アミロイド がアークティック型変異を有するペプチドであり、 インキュベーション時間が 1〜3時間である、 前記 〔3〕 記載の方法；
〔6〕 前記 〔3〕 〜 〔5〕 のいずれか 1項記載の製造方法によって製造された 可溶性毒性ァミロイド アセンブリー ；
〔7〕 前記 〔1〕 、 〔2〕 又は 〔6〕 記載の可溶性毒性アミロイド /3ァセンブ リ一を含む液体を、 5 4 0， O O O X gで 1 5分間又は同等の条件で遠心分離し て、 上清を回収することを特徴とする、 可溶性毒性アミロイド アセンブリーの 精製方法；
〔8〕 前記回収された上清を、 さらにサイズ排除クロマトグラフィに供するこ とを特徴とする、 前記 〔7〕 記載の方法；
〔9〕 前記 〔7〕 又は 〔8〕 記載の精製方法によって精製された可溶性毒性ァ ミロイ ド j3アセンブリー ；
〔1 0〕 可溶性毒性アミロイド /3の神経毒性を調節する物質のスクリーニング 方法であって、 以下の工程：
( a ) 培養細胞を、 前記 〔1〕 、 〔2〕 、 〔6〕 又は 〔9〕 のいずれか 1項記 載の可溶性毒性アミロイド アセンブリー及び被検物質の存在下でインキュベー トする工程、
(b) 前記工程 （a) の後、 前記培養細胞の生死を測定する工程、
(c) 前記工程 （b) で得られた結果を、 被検物質を含まない状態で工程 （a ) を行なった場合の結果と比較する工程
を含むことを特徴とする方法、
を提供する。 発明の効果
本発明の可溶性毒性 A アセンブリ一は、 ADD Lや不溶性アセンブリー （ フィブリル） 等と比較して顕著に強力な毒性を有する。 したがって、 毒性に影響 する化合物等の検出において非常に高感度である。
また、 本発明の ΤΑ|3は NGFレセプターへの結合を介して各種のェユーロ ン又は非ニューロン細胞にアポトーシス様の細胞死を誘導することがわかってお り、 よく特徴づけられているので、 AD等の疾患及びアポトーシスの研究におい て非常に有用である。 図面の簡単な説明
図 1は、 GM 1ガンダリオシドの存在下で形成された可溶性 Α βアセンブリ 一の毒性を示す図である。
パネル (Α) ： 無血清 Ν 2サブレメント培地 （Ν2- supplemented meddium) 中で培養された一次大脳皮質ニューロンを、 リポソーム中の GM1ガンダリオシ ド （0、 1 0又は20モル％) の存在下又は不存在下で 3 7°Cで 2時間プレイン キュペートされた、 最終濃度 25 / M の種無含有の野生型又はアークティック型 A β (A j3 1 -40) を含むインキュベーション混合物で処理した。 ニューロン を、 カノレセイン AM (Invitrogen, Carlsbad, CA) .ェチジゥムホモダイマーで 染色した写真である。 緑色が生細胞、 赤色が死細胞をそれぞれ表す。 バーは 50 μ m。
パネル （B) ： 示した条件下で G M 1ガンダリオシドの存在下又は不存在下 で 37°C、 2時間プレインキュベートされた野生型又はアークティック型の A ;8 で処理された、 生存している一次培養-ユーロンの数を示す図である。 ニューロ ンは、 力ルセイン AM/ェチジゥムホモダイマー及びヨウ化プロビジゥム ( propidiura iodine) で染色した。 各カラムは、 A ;3も GM 1ガングリオシドも含 まない対照培養物に対するパーセンテージの 3つの値の平均値 （土 SD) を示す 。 ΦΡ< 0. 000 1
パネル (C) ： GM 1ガングリオシド （1 0 %) の存在下又は不存在下で 3 7°Cで 2時間プレインキュベートされたアークティック型 Ai3を含むィンキュベ ーション混合物で処理された PC 1 2 N細胞の代表的な像である。 バーは 50 μ ra0
図 2は、 GM1ガンダリオシドと A を含むインキュベーション混合物中で 毒性を示すものが可溶性アセンブリーであることを示す図である。
パネル （Α) ： 示した条件下で GM1ガンダリオシドの存在下又は不存在下 で 3 7 °Cでプレインキュベートされた野生型又はアークティック型 A を含むィ ンキュベーション混合物で処理された一次培養ニューロンの培地中の T h T蛍光 強度を示す図である。 カラムは、 白 = TB S (対照） 、 斜線 =野生型、 黒 =ァ一 タティック型である。
パネル （B) ： 示した条件下で GM1ガングリオシドの存在下又は不存在下 でプレインキュペートされた野生型又はアークティック型 A ;3を含むインキュべ ーション混合物で処理された P C 1 2 N細胞からの LDH放出率を示す図である 。 各カラムは、 インキュベーション混合物での処理後の LDH放出量 T r i t o n— X 1 00での処理後の LDH放出量の （％) を表す。 各カラムは、 3つの 値の平均値 （土 S D ) を示す。 *は、 ρく 0. 0 0 0 1 ( one-way AN0VA combined with Scheffe' s test) を表す。 カラムは、 白 TB S (対照） 、 斜線 =野生型、 黒 =アークティック型である。
パネノレ (C) ： GM 1ガングリオシド ( 10 %) の存在下でプレインキュベ ートされたアークティック型 A を含むインキュベーション混合物 （whole) の 超遠心によって得られた上清 （sup) 及び沈澱物 （ppt) で処理された PC I 2N 細胞からの LDH放出率を示す図である。 各カラムは、 3つの値の平均値 （土 S D) を示す。 *は、 p < 0. 000 1を表す。
図 3は、 TA/3の特性 （抗体との反応性） を示す図である。
パネル （A) ： アークティック型 A /3のみ、 GM1ガングリオシド （1 0% ) のみ、 又はアークティック型 A j3 +GM1ガンダリオシド （1 0%) を含むィ ンキュベーシヨン混合物 （whole) の超遠心によって得られた上清 （sup) のドッ トブロット解析の結果を示す。 ブロットは、 anti_01igo 抗体 （Biosource Inc. , Camarillo, CA) 又は H R P結合コ レラ トキシンサブユニッ ト B ( C T X ( Sigma, St. Louis, MO) と反応させた。
パネノレ (B) ： anti-Oligo との共インキュベーションによる、 P C 1 2N 細胞からの TA 3誘導 LDH放出の抑制を示す図である。 各カラムは、 3つの値 の平均値 （土 SD) を示す。 *は、 p < 0. 000 1を表す。
図 4は、 T A j3の生物物理学的及ぴ構造的解析を示す図である。
パネル （A) ： プロ トフイブリル形成可能なようにプレインキュペートされ たアークティック型 A ]3を含むインキュベーション混合物 （A) 又は T A を含 有するインキュベーション混合物 （B) の電子顕微鏡写真である。 バーは 1 00 μ m。
パネル （B) ： TA /3を含むフラクションの AFM像である。 TAj3を含む ィンキュベーシヨン混合物を超遠心して得られた上清を A FM解析した。 ィンキ ュベーシヨン混合物はアークティック型 A ]3のみ （Aj3) 、 GM1ガングリオシ ド （1 0%) のみ （GM1) 、 又は両者 （Ai3 +GM1) を含んでいた。 バーは 200 nm。
パネノレ （C) ： Superose 12 を用いた T A ]3含有フラクションのサイズ排 除クロマトグラフィの結果を示す図である。 35のフラクションの溶出サンプル をニ トロセルロース膜上にドットした。 このプロットを、 anti_01igo 抗体と反 応させた。 代表的な 5つのフラクションを示す。 フラクション 2及び 4は、 それ ぞれ TA 及びモノマー を含むフラクションに相当する。 免疫反応性は、 約 200〜約 30 OkDa の見かけの分子量を有する単一のピーク （2) として回収 された。 .
図 5は、 4 39 6 C抗体による T A 形成の抑制不能を示す図である。
パネル （A) ： 43 96 C又は抗 A j3モノクローナル抗体 （4 G 8 ) と共に GM 1ガングリオシドの存在下で 37°Cでィンキュベートされたアーク,ティック 型 A を含むインキュベーション混合物の ThT蛍光強度。
パネル （B) ： 43 96 C抗体の存在下又は不存在下で、 GM 1ガンダリオ シド （1 0%) の存在下でプレインキュペートされたアークティック型 A ;8で処 理された P C 1 2N細胞からの LDH放出率。 各カラムは、 3つの値の平均値 （ 土 SD) を示す。 *P< 0. 000 1、 n s ：非有意。
図 6は、 シナプトソームの存在下でのアークティック型 A のインキュベー ションによる T A 3の形成を示す図である。
TAj3形成は、 アークティック型 A j3で処理された P C 1 2 N細胞培養物にお ける LDH放出アツセィによって評価した。 Wh=海馬を除いた全脳、 Hp =海 馬。 下にマウスの年齢を示す （lmo= l力月、 lyr= l年、 2yrs= 2年） 。 各 カラムは、 4つの値の平均ィ直 （士 SD) を示す。 *は、 ： く 0. 000 1、 **は p < 0. 00 5を表す。
図 7は、 P C 1 2又は P C 1 2 N細胞に対する T A ]3の毒性の特徴を示す図 である。
パネル （A) ： TA 3を含むインキュベーション混合物で 1 2時間処理され た P C 1 2 N細胞。 a及び bは位相差顕微鏡像、 c及び dは Hoechst 33258核染 色像。 矢印は、 核の凝縮 （condensation) 及び断片化 （fragmentation) 、 細胞 体の収縮及び神経突起の退縮を示す。 バーは 50 μιη。
パネル （Β) ： 種々のタイプの培養細胞に対する ΤΑ 毒性を示す図である 。 細胞生存率は、 これらの培養物中で LDH放出アツセィによって評価した。 Ρ C 1 2 N = NG F処理された P 1 2細胞、 P C 1 2 =ネイティブ P C 1 2細胞、 3^1—3¥ 5¥=3^1_3¥ 5¥神経芽細胞腫、 hBME ヒ ト脳微小血管内皮 細胞、 HEK 2 9 3 =HEK 29 3細胞、 h A S T =ヒ ト星状膠細胞、 r AST =ラット星状膠細胞、 RAW264. 7 =マウス単球、 及び fibroblast-ラー ジ T抗原で不死化されたマウス線維芽細胞。 各カラムは、 3つの値の平均値 （土 S D) を示す。 *P < 0. 000 1、 対 A βのみを含むィンキュベーション混合 物で処理した場合の値。
図 8は、 ΤΑ が NGFレセプターを介して細胞死を誘導することを示す図
"、ある
パネル （Α) ：外来性 NGF (100 ng/mL) の添加によるネイティブ P C 1 2細胞及び PC 1 2 N細胞に対する ΤΑ|3毒性の抑制を示す図である。 T A ]3毒 性は、 これらの細胞培養物において LDH放出アツセィによって評価した。 各力 ラムは、 3つの値の平均値 （土 SD) を示す。 *P< 0. 000 1
パネル （B) ： NGFレセプター、 T r k A又は ρ 7 5NTRの s i RNA媒 介性ノックダウンによるネイティブな PC 1 2細胞に対する T A /3毒性の抑制を 示す図である。
PC 1 2細胞は、 T r k A又は p 75NTRに対する s i RNAで処理した後、 ΤΑβを含むィンキュベーション混合物に暴露した。 グラフは LDH放出ァッセ ィの結果を示す。 各カラムは、 3つの値の平均値 （土 SD) を示す。 *は、 ρ < 0. 000 1を表す。 グラフの下の図は、 T r k Α及び ρ 75NTR発現レベルの 低減を確認した抗 T r kA及び抗！） 75NTR 抗体を用いた細胞ライセートのゥ エスタン 'プロット解析の結果を示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明の ΤΑ ι3は、 Α βを、 その遺伝型に適した濃度の GM 1ガングリオシ ドを含むリポソームの存在下でィンキュベートすることにより生成される。 ΤΑ ；3の製造に使用する単量体 Α としては、 野生型であっても変異型であってもよ いが、 毒性の強さ等の点から、 変異型のもの、 特に A )3 ドメインの内部に変異が 存在する型 （例えば、 イタリアン （Italian) 型、 アークティック （Arctic) 型 、 フレミッシュ （Flemish) 型など） のものが好ましく、 アークティック型のも のが最も好ましい。
アークティック型変異は、 ヒ トのアミロイ ド前駆体タンパク （AP P) のコ ドン 6 9 3に位置するアミノ酸の置換 （グルタミン酸がグリシンで置換されてい る ； E 6 9 3 G) であり、 この変異は A /3において 22番目のアミノ酸の置換に 相当する。 本発明に関して、 アークティック型という場合、 ヒ ト以外の動物に由 来する配列において上記の変異に相当する変異を有するものも含む。 他の変異型 についても同様であり、 ヒトにおける各変異に相当する他の動物における変異を も包含する。
本発明において使用する A は、 溶解後に超遠心に供することによって A β 重合の種 （seed) となり うる不溶性ペプチドを予め除去しておくことができる。 本発明において使用される、 GM 1ガングリオシドを含むリボソームは、 ァ ミロイドフイブリル形成に必要とされるよりも低い、 全脂質成分中のモル比が約 1 0/1 00〜約 1 5/100 (約 10〜約 1 5モル。/。） の割合の GM 1ガング リオシドを含有していればよく、 公知の一般的な方法で調製することができる。 この特定の濃度の GM1ガングリオシドの存在下で T A j3が好適に形成される理 由は解明されていないが、 GM1ガンダリオシドの横方向の分布が分子のオリゴ 糖鎖の空間的配置に影響することが示唆されており （非特許文献 26) 、 特定の 濃度の G M 1ガングリオシドは、 GM1ガンダリオシドのコンフオメーションを 調節し、 TA/3形成に好ましい微細環境を提供する可能性があると考えられる。 脂質混合物中の GM1ガンダリオシド以外の成分は、 コレステロール又はリ ン脂質であればよく、 リ ン脂質としては脳内に存在するリン脂質が好ましい。 こ のようなものと しては、 例えば、 コレステロール、 スフインゴミエリン、 ホスフ ァチジルコリン等が挙げられ、 コレステロール、 スフインゴミエリンが好ましレ、 。 リン脂質は 1種を単独で用いてもよく、 2種以上を組み合わせて用いてもよい 。 脂質混合物中の GM1ガングリオシド以外の成分は、 最も好適には、 コレステ ロール及ぴスフインゴミエリ ンを含む。 特にコレステロール： スフインゴミエリ ンのモル比が 0. 5 : 1. 5〜1. 5 : 0. 5の割合であることが望ましい。 そ の中でもコレステロ一ノレ： スフインゴミエリンのモル比が 0. 5 ： 1〜 1 ： 0. 5程度、 さらには 0. 8 : 1. 2〜1. 2〜0. 8程度の割合の混合物が、 GM 1ガングリオシドが TA β形成に好ましいコンフオメーシヨンとなるための微細 環境を与える可能性が高く、 好ましいと考えられ、 1 ： 1のモル比の混合物が最 も好ましい。
具体的には、 GM 1ガンダリオシドを含む好適なリボソームは、 例えば、 後 述するように、 コレステロール： スフィンゴミエリン ： GM 1ガンダリオシドの モル比が 4 5 : 45 : 1 0〜 42. 5 : 42. 5 : 1 5 (即ち、 脂質混合物中の GM 1ガングリオシドの割合がモル比で 1 0〜 1 5 °/0) となるように脂質混合物 を調製し、 これを使用直前に適当な緩衝液 （例えばトリス緩衝生理食塩水 （TB S) ) に懸濁させることにより調製することができる。
GM 1ガングリオシドを含むリポソームと A ]3とのィンキュベーションは、 溶液中で各々を適当な濃度で一緒にすることによって開始することができる。 例 えば、 このようなィンキュベーション混合物 (GM 1ガングリオシドを含むリポ ソームと A βとを含む溶液） 中の終濃度として、 Aj3が 10〜200 μΜ、 好ま しくは 2 5〜1 00 μΜ程度である場合に、 GM1ガンダリオシドが 3 0〜50 Ο μΜ、 好ましくは 62〜375 ζΜ程度、 特に好ましくは 100〜 200 μ Μ程 度、 リボソーム構成脂質全体としては 0. 3〜5mM、 好ましくは 0. 6 2〜3. 75mM、 特に好ましくは l〜2mM程度で、 両者を溶液中で共存させる。
T A 形成のためのインキュベーションは、 一般的には約 20〜約 40°C (好 ましくは約 3 7 °C、 即ち約 3 5〜約 40 °C程度） で、 約 1〜約 30時間行なうこ とができるが、 用いる Ai3に応じて適宜最適な条件を選択することができる。 例 えば野生型ぺプチドを用いる場合、 約 3 5〜約 40 °C (特に約 3 7 °C) で約 20 〜30時間；アークティック型 A j3を用いる場合、 約 3 5〜約 40°C (特に約 3 7 °C) で約 1〜約 5時間 （特に約 1〜約 3時間） のィンキュベーションがそれぞ れ最適である。
インキュベーション時間の選択は重要である。 TA/3は、 インキュベーショ ン時間中の初期に出現し、 その後のィンキュベーションを通じて消失する傾向が ある。 このことは、 T A がより大きい A |3アセンブリーを形成する過程での中 間体でもある可能性を示唆する。 また、 従来からの証拠、 特にインビトロにおい てインキュベーション期間の初期に可溶性 A ;3 アセンブリーが形成され、 その 後しばしば成熟したフィブリルが出現すること （非特許文献 2、 1 0) やある種 の A β フィプリル生成の阻害剤が A |3 オリゴマー生成を強力にプロックするこ と （非特許文献 24) は、 可溶性 Α]3 アセンブリー及びプロ トフイブリルが、 アミロイドフイブリル形成の中間体として形成されることを示唆している。
しかし、 上記のように、 本発明の TAi3 は一般にアミ口イドフイブリル形成 に必要とされる GM1ガングリオシド濃度よりも低い濃度の GM1ガンダリオシ ドの存在下で好適に形成されること、 及び後述するように T A 形成はアミロイ ドフイブリル形成の種 （ GM 1ガンダリオシドと A |3とが 1分子ずつ結合したも の） に対して特異的な抗体によって阻害されないこと等から、 TAi3が、 アミ口 ィドフイブリル形成を直線的にもたらす経路とは異なる経路を介して形成される ことが示されている。
本発明の T A は、 上記のような条件下でのィンキュベーション後に好適に 形成され、 インキュベーション混合物中に含まれる。 本発明の ΤΑ|3が形成され るのに好ましい条件下ではフイブリル （不溶性アセンブリー） はほとんど又は全 く形成されないと考えられるが、 必要であれば、 このインキュベーション混合物 を例えば 540, O O O X g、 1 5分間又は同等の条件で遠心分離して上清を回 収することにより、 本発明の を濃縮又は部分精製することができる。 ここ で 「同等の条件」 とは、 指定された条件での遠心分離と実質的に同じ分離をもた らす条件を指す。 また、 回収された上清をさらにサイズ排除クロマトグラフィに 供し、 TA/3を含む画分を回収することにより、 TA をさらに精製することが できる。
後述するように、 本発明の T A ]3は、 少なくとも、 ラットー次培養ェユーロ ン；ネイティブな又は NGF処理により分化させた P C 1 2細胞、 ヒト脳微小血 管 （microvascular) 内皮 （h BME) 細胞、 ヒ ト脳星状膠細胞 （hAS T) 、 ヒ ト神経芽細胞腫 SH—S Y 5 Y (S Y 5 Y) 細胞、 ヒ ト胚腎臓 29 3 (HEK 2 9 3) 細胞、 マウス単球 RAW264. 7 (R AW264) 細胞を含む培養細 胞 （非ニューロン細胞を含む） に対して、 アポトーシス様の特徴を呈する細胞死 を誘導することができる。 したがって、 本発明の TA の存在は、 例えばこのよ うなィンキュベーション混合物又はその遠心上清もしくは画分をこれらの TA 感受性の培養細胞に添加して、 細胞死が誘導されるか否かを調べることにより、 確認することができる。 細胞の生死の判定は、 公知の方法、 例えば後述するよう な公知の色素による染色や乳酸デヒ ドロゲナーゼ （LDH) 放出アツセィ等によ り、 容易に行なうことができる。
本発明の TAi3は、 その毒性の強さに最大の特徴を有する。 一例として、 後 述する P C 1 2N細胞を本発明の TAi3 (A 濃度 2 5 M) とともに 3 7°Cで 48時間インキュベートした場合、 LDH放出率 （即ち、 細胞を T r i t o n— X I 00で溶解させ、 全細胞中の LDHを放出させた場合の LDH放出量に対す る、 検体で処理した場合の LDH放出量の百分率） で判定して、 少なくとも 30 %、 好ましくは 50 %以上、 さらに好ましくは 60%以上の LDH放出率を示し 、 ほぼ完全に細胞を死に至らせることができる。 なお、 LDH放出率による細胞 毒性の試験においては、 細胞膜が壊れて細胞内から放出された L D H量を指標と しているが、 アポトーシスによる細胞死の場合は細胞が死んでいてもしばらくは 細胞膜が壌れない （例えば細胞の萎縮） ために LDHが放出されないものがある 。 したがって、 LDH放出率で約 70%程度以上であれば細胞がほぼ全て死んで いる状態であり、 上記のような本発明の T A による LDH放出率は非常に高い ものである。
また、 後述する方法でラットー次培養ニューロンを本発明の T A 3 (A β濃 度 2 5 μΜ) とともに 3 7°Cで 4 8時間ィンキュベートし、 色素染色により細胞 の生死を判定した場合、 生存-ユーロンの数は、 本発明の TA ;3を含まない対象 培養物と比較して 7 5 %以下、 好ましくは 6 0 %以下、 より好ましくは 40 %以 下、 最も好ましくは 2 0 °/0以下となる。
本発明の T A のこの毒性は、 A l l抗オリゴマー抗体 （anti- Oligo) によ つて抑制される。 A l l抗体は、 アミロイド形成性タンパクのオリゴマーに対し て特異的な抗体であり、 例えば可溶性の A /3 4 0オリゴマーとは反応するが、 可 溶性の単量体 A β 4 0又は A j3 4 0フイブリルとは反応しない。
本発明の T A は、 不溶性であるアミロイ ドフイブリル又は公知の他の可溶 性アセンブリーとは全く異なる形態を有する。 例えば、 本発明の ΤΑ;3は通常の 電子顕微鏡によって観察されない一方、 原子力間顕微鏡により、 直径約 1 0〜約 2 0膽 の球状粒子として見える構造を含む。 ここでいう直径は、 原子力間顕微 鏡 （AFM) の原理に従い、 試料から得られる高低差をもって長さとするもので あり、 断面解析法によって測定されたものである。
また、 本発明の TA jSは、 S D Sポリアクリルアミ ドゲル電気泳動 （PAG E) ではバンドを形成せず、 サイズ排除クロマトグラフィによる分子量測定では 約 2 0 0〜約 3 0 OkDa にピークを有する。 さらに、 T A ]3中に GM 1ガングリ オシドは検出されない。 アミ口イドフイブリル形成の種に対する抗体 （4 3 9 6 C、 非特許文献 2 5) は、 アミ口イドフイブリル形成を阻害するが、 本発明の T A /3の生成はこの抗体によって阻害されない。
したがって、 本発明の TA /3は、 ADD L等の公知のオリゴマーや公知のフ イブリルとは明らかに異なるものである。
TA/3は、 インビポにおいても形成され、 病理学的な役割を有していると考 えられる。 本発明の TA 3は、 シナプトソーム、 特に老化したマウス脳の海馬由 来のシナプトソームの存在下で有意に形成される。 このことは、 シナプトソーム 中の GM1ガングリオシドの密度は年齢及びアポリポタンパク質 E 4の発現に伴 つて増大するという本発明者らの最近の観察 （非特許文献 27) とともに、 イン ビボで、 特に AD発症のリスク因子と関連した海馬のような脳の特定の領域にお いて、 TA 3 が形成され得ることを示唆している。 また、 TAj3 のような可溶 性 A/3 アセンブリ一は、 インビポにおいて ADにおけるコリン作用性基底前脳 における NGF依存性-ユーロンの喪失の原因となると考えられる。
したがって、 T A ;3の毒性を低減又は阻止する物質は、 ADのようなアミロイ ド関連疾患の予防又は治療において重要である。
本発明の T A ]3は、 その特性 （例えば毒性） に影響を与える物質をスクリー ユングするために使用することができる。 例えば、 本発明の T A に対して感受 性の培養細胞を、 本発明の T A /3及び被検物質の存在下でインキュベートした後 、 培養細胞の生死を測定することにより、 被検物質が T A 3の特性に影響を与え たか否かを調べることができ、 所望の影響を与える物質を同定することができる ここで使用される培養細胞としては、 TA 3に対して感受性のものであれば よく、 一次培養であっても樹立された株細胞であってもよい。 例としては、 上述 したような T A によつて細胞死を誘導される細胞が挙げられるが、 これらに限 らない。
被検物質としては、 特に制限はなく、 一般的には低分子化合物、 ペプチド、 タンパク質 （抗体及びそれらの改変物を含む） 、 核酸 （一本鎖又は二本鎖の高分 子又は低分子 DNA又は RNA等） 、 植物 '動物等の抽出物等の混合物、 ウィル ス ·細菌等の微生物等が挙げられる。
細胞の生死は上述のように公知の方法で測定することができる。 被検物質を 含まない状態でインキュベーションを行なった場合の結果と比較して、 被検物質 を含む場合に細胞死が増大しているのであれば、 その被検物質は T A /3の毒性を 増強する可能性があり、 細胞死が低減しているのであれば、 その被検物質は T A 3の毒性を抑制する作用を有すると判定することができる。 なお、 前者の場合に その被検物質が固有の毒性を有するかどうかは、 別途その被検物質の存在下で T A の不存在下で同様の試験を行なうことにより調べることができる。
上記のようなスクリーニングによって、 T A j3の毒性を抑制する作用を有す ると判定された物質は、 医薬候補物質として選択することができる。
本発明の T A /3は、 NG Fレセプターに対して NG Fと競合的に結合する。 即ち、 本発明の T A |3により誘導される細胞死は、 NGFの存在下では有意に抑 制される。 また、 NGFレセプター: 75 NTR及ぴ T r k Aのいずれかのノック ダウンによっても、 TA/3により誘導される細胞死が顕著に抑制される。 これを 利用して、 T A ]3の毒性を抑制する化合物をスクリーニングすることができる。
この方法においては、 上記と同様に、 本発明の TA に対して感受性の培養 細胞を、 本発明の T A 及ぴ被検物質の存在下でインキュベートした後、 培養細 胞の生死を測定することにより、 ΤΑ|3の毒性を抑制する化合物を同定すること ができる。 この場合、 被検物質を含まない状態でインキュベーションを行なった 場合の結果と比較して、 被検物質を含む場合に細胞死が低減しているのであれば 、 その被検物質は NGFレセプターへの T A の結合を抑制する可能性があると 判定することができる。 実施例
I , 可溶性毒性 A βアセンブリー （ΤΑ ） の製造
1. Α β溶液
合成 (AjS 1 _40) (野生型、 アークティック型ともペプチド研究所にて 合成、 大阪、 日本） を、 5◦ 0 μΜ の濃度となるように 0. 0 2%アンモニア溶 液に溶解した。 この溶液を、 「0ptima TLJ (商品名、 Beckman, USA) 超遠心機 を用いて 540， 000 X gで 3時間遠心分離して、 種として作用し得る不溶性 のペプチドを除去した。 得られた上清 （以下 「種無含有 A 溶液」 ともいう） を 集め、 ァリコートに小分けして使用時まで一 80°Cで保存した。
使用の直前に、 ァリコートを融解し、 トリス緩衝生理食塩水（T B S： 1 5 OmM N a C 1及び 1 0 mM T r i s _HC l、 H 7. 4)で希釈した。
2. リボソームの調製
リボソームの調製のためには、 コレステロール （シグマ社、 カタログ番号： C 8 66 7) 、 スフインゴミエリン （シグマ社、 カタ口グ番号： S 7004 ) 、 及 び GM 1ガングリオシド （マトレア社、 カタ口グ番号： 1 06 1) を、 50 : 5 0 : 0、 4 5 : 45 : 1 0、 42. 5 : 42. 5 : 1 5、 又は 40 : 40 : 20 のモル比で、 合計脂質濃度が 1 5mM になるように （即ち、 GM1ガンダリオシ ド濃度はそれぞれ OmM、 1. 5ιπΜ、 2. 2 5 mM, 又は 3. OmM) クロ口ホルムダ メタノール （1 ： 1、 容量比） 溶液中に溶解した。 したがって、 リボソームを構 成する全脂質分子の中での GM1ガンダリオシドの割合は、 それぞれ 0%、 1 0 %、 1 5%、 20%であった。 この脂質混合物溶液を 86 し ずつガラスチュー ブに分注し、 窒素ガス （40°C) を 1時間吹き付けて溶媒を蒸発させた。 この脂 質混合物を使用時まで一 80°Cで保存した。
使用直前に、 各ガラスチューブに 1 00 L の T B S (p H 7. 4) を加えて 脂質混合物を T B S中に再懸濁させ、 この懸濁液を、 凍結融解を 1 0回繰り返し た後、 ソニケ一ター（TOMY UD- 201、 output=2N continuous mode)で 5分間、 3回 超音波処理に供した。 この操作により、 脂質混合物が直径約 5 0 0 m 以下程度 の均一な球状のリボソームとなった。
3. A とリボソームとのインキュベーション （TA の調製）
上記 1. で調製した種無含有 A 溶液を希釈し、 上記 2. の各リボソーム含有 T B S溶液を 1 0倍希釈になるように添加して、 3 7°Cで 2時間 （比較のために 2 4時間でも行なった） インキュベートした。 このインキュベーション混合物に おける終濃度は、 ]3が5 0 、 リボソーム濃度 （合計脂質濃度） が 1 2 5 0 μΜ (そのうち、 GM 1ガンダリオシド濃度は 0 Μ、 1 2 5 ΖΜ、 1 8 7. 5 μ Μ 、 又は 2 5 0 μΜ) であった。
II. T A の特徴づけ
上記で調製した種無含有 A (Α ]3 1 - 4 0) 溶液 （野生型又はアークテイツ ク型） と GM 1ガングリオシド含有リボソームとの種々のインキュベーション混 合物を用いて、 TA i3の神経毒性、 形態等の特徴づけを行なった。
1. 一次培養ニューロンに対する神経毒性試験
一次培養ニューロンとして、 大脳皮質ェユーロンを、 Sprague- Dawley ラット 1 7曰胚力 ら調製し、 Dulbecco s modified Eagle medium nutrient 混合物 ( 商品名 ； Invitrogen 社、 カタ口グ番号： 1 2 8 0 0— 0 1 7 ) 及び N 2サブレ メント （ 「N2- supplementj (商品名 ； Invitrogen社、 カタ口グ番号： 1 7 5 0 2 - 0 4 8 ) からなる無血清培地中で培養した （5 %C 02、 3 7°C、 加湿下） この一次培養ニューロン （細胞数 1. 5 X 1 04個 Zwell) を、 上記の各イン キュベ一ション混合物で処理した (インキュベーション混合物：培地 = 1 ： 1、 A 0濃度 2 5 μΜ、 処理時間は 4 8時間） 。 ニューロンを、 力ルセイン AM ( calcein AM, Invitrogen, Carlsbad, CA) 'ェチジゥムホモダイマーで染色した 。 これにより生細胞は緑色、 死細胞は赤色にそれぞれ染色される。
結果を、 図 1、 パネル （A) 及び （B) に示す。
パネル （A) は、 GM1ガングリオシド含量 0 % (上段） 、 1 0 °/。 （中段） 、 2 0 % (下段） のリボソームを含む、 A ]3を含まない (左列) 又は野生型 （ 「 wildj ) A β (中央列） もしくはアークティック型 （ 「Arctic」 ） A /3 (右列） を含むインキュベーション混合物 （3 7°C、 2時間） で処理した細胞の光学顕微 鏡写真を表す。 右下のバーは 5 0 /imである。
パネル （B) は、 示した条件下で GM 1ガングリオシドの存在下又は不存在 下で 5 0 M (インキュベーション混合物中の終濃度） で 3 7°C、 2時間プレイ ンキュペートされた野生型又はアークティック型の A /3で処理された、 生存して いる一次培養ェユーロンの数を示す。 各カラムは、 A も GM 1ガンダリオシド も含まない対照培養物 （GM1 0%、 Αβ (一） ） に対するパーセンテージの 3つの値の平均値 （土 SD) であり、 *は Ρく 0. 00 0 1を表す。
これらの結果から、 1 0 %の GM 1ガングリオシドを含むリボソームの存在 下で 3 7 °Cで 2時間プレインキュベートされたアークティック型 A |3で処理され た培養において、 非常に顕著な-ユーロン死が観察された。 したがって、 以降の 実験においては、 この条件下で形成された T A /3を基本的に用いた （即ち、 特に それと異なる条件を示していない限り、 この条件下で形成された TA である）
2. 神経成長因子 （NGF) で分化させた P C 1 2細胞に対する毒性試験 ラットのクロム親和性細胞腫 （pheochromocytoma) P C 1 2細胞を、 1 0 °/0熱 非働化ゥマ血清（Invitrogen)及び 5 %ゥシ胎児血清 （F B S) (Invitrogen)を添 カロ した Dulbecco' s modified Eagle' s medium ( D M E M ) (商品名、 Invitrogen, Carlsbad, CA) 中で培養した。
P C 1 2細胞を、 ポリ _ Lーリジンでコーテイングした （1 0 ragZmL) 2 cm2 ディッシュに 2 0 , 0 0 0細胞/ cm2の密度で播き、 1 0 OngZraL神経成長因子 (NG F； Alomone Labs, Jerusalem, Israel)を添加した DMEM中で 6日間培 養し、 分化させた（以下 「P C 1 2 N」 細胞ともいう）。
この細胞を一次培養-ユーロンの代わりに用いて、 上記と同様に、 インキュ ベーシヨン混合物で処理し、 細胞を観察した。
結果を図 1、 パネル （C) に示す。 この図において、 右端 (A β ( + ) /G M l (+ ) ) は、 GM 1ガンダリオシド （1 0 %) を含むリボソームの存在下で 3 7°Cで 2時間プレインキュベートされたアークティック型 を含むインキュ ベーシヨン混合物で処理した細胞である。 同様に、 中央左 （Α ]3 ( + ) ZGM 1 (一） ) は Α のみ、 中央右 （A 3 (—） /GM 1 (+ ) ) は GM 1ガンダリオ シドのみ、 左端 (A β (一） /GM 1 (_) ) は T B Sのみをそれぞれ含むィン キュベーシヨン混合物で処理した細胞である。
NG F処理した P C 1 2細胞もまた、 GM 1ガングリオシドの存在下でァー タティック型 Α β から形成された毒性の Α βアセンブリーに対して感受性であ ることが確認された。 以下の実験においては、 主に P C 1 2 Ν細胞を用いた。
3. T h Tアツセィ
チオフラビン T (T h T) は、 アミ口イ ドフイブリル構造を特異的に認識する 。 インキュベーション混合物中のアミロイドフィプリル構造の有無又は量を調べ るために、 上記の各インキュベーション混合物の T h T蛍光強度を、 分光蛍光光 度計 （RF- 5300PC) (島津、 京都、 日本） を用いて測定した。 アミ口イ ドフイブ リルの至適蛍光強度は、 励起及ぴ発光波長をそれぞれ 4 4 6nm及び 4 9 0 nm と して、 5 μΜ 丁 丁及び5 01^ グリシン一 Ν a OH (ρ Η 8. 5) を含む 1 . OmLの反応混合物 （インキュベーション混合物 10 μ 1を含む） を用いて測定 した。 蛍光強度は、 反応混合物を調製した直後に測定した。
結果を図 2、 パネル （Α) に示す。 この図は、 GM1ガングリオシド含量 0 。に 1 0%、 20%のリボソームを含む Α なし （ 「Α|3 (—） 」 ； 白抜き） 、 野生型 Α ( rwildj ；斜線） 、 アークティック型 （ 「Arctic」 ；黒塗り） のィ ンキュベーション混合物についての結果である。
T h Tの蛍光強度は、 神経毒性の強さと一致せず、 強い神経毒性を示したァ 一タティック型 A /3及び GM1ガングリオシド ( 10 %) を含むィンキュベーシ' ヨン混合物において低いレベルのままであった。 したがって、 この結果から、 高 い神経毒性を示す A j3アセンブリーがアミロイドフィプリルではないことが示さ れた。
4. 乳酸デヒドロゲナーゼ （LDH) 放出アツセィ
上記 2. の実験におけるのと同様にして PC 1 2 N細胞を用意した。
P C 1 2 N細胞を、 上記 I . と同様にして調製した各インキュベーション混合 物で処理した （細胞数 1. 5 X 1 04個/ well、 3 7°C、 処理時間 48時間、 ィ ンキュベーシヨン混合物：培地 = 1 ： 1) 。
これらの細胞の培地をサンプルとして、 「LDH assay toxicity kitj (商品名 、 Promega, Madison, WI)を用いて L D Hアツセィを行なった。 各サンプル中の LDH放出の程度は、 「Emax precision (商品名、 Molecular Devices Corp.， Sunnyvale, CA) マイクロプレートリーダーを用いて 4 90 nm での吸収を測定す ることによって評価した。 バックグラウンドの吸光度は、 細胞を含まないゥエル を用いて測定し、 各テス トサンプルの吸光度から引き算した。 キットに添付の指 示書にしたがって、 3つのゥ: ルで測定した吸光度を平均し、 細胞内の LDH放 出を誘発するために 1 %Triton X- 1 0 0で処理した各テストサンプルについ ての測定値で割って、 LDH放出率 （％) を算出した。
その結果を、 図 2、 パネル （Β) に示す。 各カラムは、 3つの値の平均値 （土 S D ) を示し、 *は、 ρ く 0 . 0 0 0 1 ( one-way ANOVA combined with Scheffe' s test) を表す。 カラムは、 GM 1ガングリオシド含量 0 %、 1 0 % 、 2 0 %のリボソームを含む A j3なし （ 「Aj3 (—） 」 、 即ち TB Sのみの対照 ； 白抜き） 、 野生型 A/3 ( 「wild」 ；斜線） 、 アークティック型 （ 「Arctic」 ； 黒塗り） である。 アークティック型 A については、 2時間のインキュベーシ ヨンの場合、 1 0%又は 1 5 %の GM1を含むリボソームの存在下で細胞死を起 こす毒性が見られた。 一方、 野生型 A 3 については、 2時間のインキュベーシ ョンではほとんど毒性が示されず、 2 4時間のィンキュベーションの場合により 高濃度 （1 5 %又は 2 0%) の GM1ガンダリオシドの存在下で毒性が見られた 最も強い毒性を示した、 GM 1ガンダリオシド （1 0 %) を含むリボソーム の存在下で 3 7°Cで 2時間インキュベートされたアークティック型 Α;3を含むィ ンキュベーシヨン混合物を、 5 4 0, 0 0 0 X g、 1 5分、 4°Cで超遠心して上 清及び沈殿物をそれぞれ回収した。 これらの上清、 沈殿物及び遠心前のインキュ ベーシヨン混合物の各々を用いて、 上記と同様に LDH放出アツセィを行なった 。 比較のため、 Ai3のみ （A /3 +ZGM1—) 、 GM 1ガングリオシドのみ （A β -/GM 1 +) 、 TB Sのみ （Aj8— ZGM1—） についても同様にインキュ ベーション混合物を調製して LDHアツセィを行なった。
結果を図 2、 パネル （C) に示す。 各カラムは、 3つの値の平均値 （土 SD) を示し、 *は、 < 0. 0 0 0 1を表す。 GM 1ガングリオシド存在下でィンキ ュベートされた遠心前の A j3インキュベーション混合物 （ 「whole」 ) が示した 毒性は、 超遠心によって得られた上清 （ 「suP」 ) 中のみに回収され、 沈澱物 （ 「ppt」 ） は毒性をほとんど示さなかった。
これらの結果から、 アークティック型及び野生型 A /3 から、 それぞれ好適な 濃度の GM 1ガンダリオシドの存在下で形成されたアセンブリーが、 毒性の可溶 性 A 3 アセンブリーであることが示された。
5. SDSゲル電気泳動 （SDS— PAGE)
T A ]3の生物物理学的及び構造的特徴を決定するために、 TA/3を含むイン キュベーション混合物の S D S— PAG Eを行なった。 Schagger et al.， Analytical Biochemistry Vol. 166， 368-379， 1987 に記載の方法に基づいて、 陽極バッファーを 0. 2M トリス （p H8. 9) 、 陰極バッファーを 0. 1M ト リスー 0. 1M トリシン一 0. 1 % SD S緩衝液として、 ：〜 20 %ポリ アクリルアミ ドゲル（第一化学ミニゲル）を使用し、 40mA (定流） で 30分間泳 動した。 このゲノレをニトロセルロース紙に 60 mA で 1時間プロットし、 A βを 認識するモノクローナル抗体 （6 E 1 0、 Signet Laboratories (Dedham, MA)) を検出用に用いてウェスタン■ブロットを行なった。
しかし、 バンドは全く検出されなかった。 これは、 可溶性 A アセンブリー は、 細胞培養中のある種のオリゴマー （非特許文献 1) を除き、 架橋されていな い （非特許文献 2 1、 2 2) 場合、 変性ゲル電気泳動で解離 （disaggregated) する （非特許文献 3) という従来の知見と一致した。
6. ドット .プロット解析
次に、 アークティック型 A /3のみ、 GM1ガンダリオシド （1 0%) を含むリ ポソームのみ、 又はアークティック型 A 及び GM1ガンダリオシド （1 0%) を含むリボソームをそれぞれ含むィンキュベーシヨン混合物の上記と同様の条件 での超遠心によって得られた上清 （ 「sup」 ) を用いて、 非特許文献 2 3の方法 により ドット ·ブロット解析を行なった。 比較のため、 遠心前のインキュベーシ ヨン混合物 （ 「whole」 ) も同様に用いた。
各サンプルをドットした-トロセルロース紙 （ブロット） を、 抗オリ ゴマー 抗体 「an"ti - OligoJ (Biosource Inc. , Camarillo, CA) 又は HRP結合コレラ トキシンサブユエット B 「CTX」 （Sigma, St. Louis, MO) と反応させた。 反 応条件は 4°Cで一晩、 検出方法として ECL (化学発光） を用いた。 なお、 CT Xは GM1ガンダリオシドと特異的に反応する天然のリガンドである。
結果を図 3、 パネル （A) に示す。 アークティック型 A |3及び GM 1ガング リオシド （1 0%) 含有リボソームを含むインキュベーション混合物中の T A j3 は、 anti_01igo によって容易に認識されたが、 C T Xとの反応性は上清中に回 収されなかった。 したがって、 TAj3は GM1ガンダリオシドを含まないと考え られる。
7. 抗ォリゴマー抗体による T A 毒性の抑制
TA 毒性に対する抗体の影響を調べるために、 上記 4. の実験と同様に、 上 記 I . と同様に調製したインキュベーション混合物 （10% GM1ガンダリオ シド （1 2 5 μΜ) + 5 θ ίΜ アークティック型 Α β ) を用いて、 0. 3 / Μ濃 度の anti - Oligo抗体とともに 3 7でで 1 20分間プレインキュベーションした 後、 P C 1 2 N細胞で LDH放出アツセィを行なった。 対照として、 anti_01igo の代わりに I g Gを用いた。
結果を図 3、 パネル （B) に示す。 各カラムは、 3つの値の平均値 （土 SD) を示し、 *は、 pく 0. 000 1を表す。 TAjS の毒性、 即ち、 P C 1 2N細胞 からの T A 3誘導 LDH放出は、 インキュベーション混合物を anti- Oligo とプ レインキュベーションすることによって有意に抑制された。
8. 電子顕微鏡による形態観察 電子顕微鏡での観察は以下のようにして行なった。 サンプルを水で希釈し、 力 一ボンコーティングしたダリッド上に拡げた。 このダリッドを、 2%ゥラニルァ セテートでネガティブ染色し、 加速電圧 1 00 kV で透過型電子顕微鏡 （JEM - 2000EX, JE0L、 東京、 日本） で観察した （倍率： 50， 000倍） 。 比較のため 、 非特許文献 1 7に記載された方法にしたがってプロトフイブリルを調製して同 様に観察した。
結果を、 図 4、 パネル （A) に示す。 パネル （A) において、 左側 （ 「AJ ) は、 プロトフイブリル形成可能なように非特許文献 1 7の方法でインキュベー トされたアークティック型 A を含むインキュベーション混合物、 右側 （ 「B」 ) は、 TA を含有するインキュベーション混合物 （GM1 (10%) 、 アーク ティック、 3 7°C、 2時間） の電子顕微鏡写真 （右下のバーは 1 00 μιη) であ る。
「Α」 においてプロ トフイブリルの典型的な構造が観察された。 これに対し 、 「Β」 においては確実な構造は観察されなかった （丸く見えるのはリボソーム である） 。 したがって、 本発明の Τ Α は、 以前に報告されたとおりに調製され たプロ トフイブリル (非特許文献 1 7)が容易に検出可能な条件下で、 電子顕微鏡 によつて観察されなかつた。
9. 原子力間顕微鏡 （AFM) による形態観察
AFMでの評価は、 非特許文献 1に記載されたとおりに行なった。 GM1ガン グリオシドのみ又は A /3のみを含むインキュベーション混合物、 又は両者を含む インキュベーション混合物を 540, 000 X g、 1 5分、 4 °Cで超遠心した後 の上清 （ 「Α +GM1」 ； GM1 (10%) 、 アークティック、 3 7°C、 2時 間） の各サンプルを新たに切断した雲母の上に滴下した。 3分間放置した後、 水 で洗浄し、 サンプルを、 tapping mode に設定した 「Nanoscope IllaJ (商品名、 Digital Instruments, Santa Barbara, CA， USA)を用いて （非特許文献 2 ) 溶液 中で評価した。 カンチレバーと して 「 0MCL- TR400PSA」 （商品名、 Olympus, Japan)を使用した。 共鳴周波数 (resonant frequency) は約 9 kHz であった。 振 幅 （amplitude) 範囲は 0. I Vであった。
結果を図 4、 パネル （B) に示す。 右下のバーは 200nm である。 電子顕微 鏡を用いた場合と異なり、 A FMを用いた場合には、 直径約 1 0〜約 20nra の 球状粒子が、 棒状構造物と共に、 T A ]3を含むインキュベーション混合物の超遠 心によって得られた上清 （ 「A 3 +GMl」 ） 中に観察された。 アークティック 型 A ]3のみ （左上） 又は GM1ガンダリオシド （10%) のみ （左下） を含むィ ンキュベーシヨン混合物の上清には、 確実な構造は何も観察されなかった。
なお、 球状粒子の直径の測定は、 上記 「NanOSCOpe Illaj 及びそれに内臓され ているソフトウエアを用いて行なった。
10. サイズ排除クロマトグラフィによる TA の分子量の測定
サイズ排除クロマトグラフィ （SEC) 及び anti- Oligo を用いたドット 'づ ロット解析によって TA の分子の大きさを決定した。 AjSのみ又は 「A|3 +G Ml」 サンプル (1 0% GM 1ガングリオシド及び 5 0 μ M アークティック 型 Α /3を 3 7°Cで 2時間インキュベートした後、 540， 000 X g、 1 5分、 4°Cの超遠心を行なって得た上清を、 流速 0. 5raL/min で PB S (p H 7. 4 ) で平衡化した 「Superose 12J (商品名） サイズ排除カラム（ 1 cmX 3 0 cm、 Pharmacia Biotech. , Uppsala, Sweden)に適用した。 lmL ずつの 3 5個のフラ クシヨンを集めて、 前記 6. と同様にして anti- Oligo を用いたドット 'ブロッ トにより解析した。 3 5のフラクションの溶出サンプルを-トロセルロース膜上 にドットした。 このプロットを、 anti- Oligo抗体と反応させた。
結果を図 4、 パネル （C) に示す。 左側がサンプルとして A j3のみ、 右側が 「Ai3 +GMl」 の遠心後上清を用いた結果である。 フラクション 2及び 4は、 それぞれ T A 0及びモノマー A ;3を含むフラクションに相当する。
anti-Oligo との免疫反応性は、 「Ai3 +GMl j サンプルにおいて、 相対分 子量約 200〜約 30 OkDa の単一ピークとして回収された。 これは、 アークテ イツク型 A ]3 から形成される、 アミロイ ドポア（非特許文献 1 8)と呼ばれるあ る種の可溶性 A ]3 アセンブリーと同様であった。 しかし、 アミロイ ドポアは中 央部にできた穴のような構造を有し、 写真上はドーナツのように見えるのに対し 、 T A ;3にはポアは観察されなかった。
1 1. アミロイドフイブリル形成の種に対する抗体による T A /3形成の阻害 アミ口イ ドフイブリル形成のための種に対して特異的なモノクローナル抗体 （ 4 3 9 6 C) (非特許文献 2 5) によって T 形成が阻害されるかどうかを調 ベた
◦、 0. 3、 1又は 3 μΜ の 43 96 C又は抗 A i3モノクローナル抗体 （4 G 8) と共に GM1ガンダリオシド （1 0%) を含むリボソームの存在下で 50 M (インキュベーション混合物中の終濃度） で 3 7°Cで 2時間インキュベー トさ れたアークティック型 A βを含むインキュベーション混合物の T h T蛍光強度を 、 上記と同様にして調べた。
結果を図 5、 パネル （A) に示す。 抗 A モノクローナル抗体 （4 G 8) は 、 ThT蛍光強度に影響しなかったが、 43 96 C抗体が共存すると濃度依存的 に T h T蛍光強度が低減し、 43 96 C抗体はアミ口イドフイブリル形成を阻害 することが確認された。
また、 0. 3 の 43 96 C抗体の存在下又は不存在下で、 GM1ガングリ オシド ( 1 0%) を含むリボソームの存在下でプレインキュベートされた ( 3 7 °C、 2時間） アークティック型 A 3で処理された PC 1 2N細胞を用いて、 上記 と同様に LDH放出アツセィを行なった。 対照として I g G 2 a (シグマ社、 カタログ番号： M9 144) を用いた。
結果を図 5、 パネル （B) に示す。 4 3 9 6 C抗体は、 TA 生成を阻害し なかった。
1 2. シナプトソーム存在下での T A の形成
天然のニューロン膜の存在下で T A |3が形成され得るかどうかをテストした。 シナブトソームは、 以前報告されたとおりに調製した （非特許文献 3) 。 3つ の異なる年齢群 （1力月、 1年、 2年） のマウス脳の海馬又は海馬を除いた脳全 体を、 0. 2 5mM EDTAを含有する 0. 32 Mショ糖緩衝液中でホモジナイ ズした。 このホモジネートを、 580 X gで 8分間遠心分離した。 その上清を、 145， 000 X gで 20分間遠心分離した。 得られたペレットを、 EDTA無 含有の 0. 3 2Mショ糖緩衝液中に懸濁させ、 ショ糖緩衝液中の Ficoll (商品 名、 シグマ社） 上に重層した。 8 7, 000 X gで 30分間遠心分離した後、 シ ナプトソームが濃縮された界面を採取し、 これを再度遠心分離して残存する Ficollを除いた。
アークティック型 A を、 マウス脳から調製したシナプトソームの存在下で インキュベートした。 アークティック型 A 3を、 50 μΜ (インキュベーショ ン 混合物中の終濃度） で 3 7°Cで 2時間、 調製された各シナブトソーム （1 00 / g/mL protein) の存在下又は不存在下で、 GM 1ガンダリオシドに対して特異 的な抗体 （ 「anti- GM1」 ) 又は anti- Oligo抗体 （0. 3 μ M) と共に又はそれら なしに、 プレインキュペートした （3 7°C、 2時間） 。 対照として I g Gを用い た。
TA 形成を、 これらのィンキュベーション混合物で処理された P C 1 2 N 細胞培養物における上記と同様の L D H放出アツセィによって評価した。 結果を図 6に示す。 「Wh」 は海馬を除いた全脳、 「Hp」 は海馬由来のシ ナプトソームである。 各カラムは、 4つの値の平均値 （土 SD) を示す。 *は、 p < 0. 000 1、 **は ρ < 0. 00 5を表す。 Τ Α 形成のレベルは、 老化 した （2歳） マウスの海馬から調製されたシナプトソームを含むインキュベーシ ヨン混合物において、 他のすべてのインキュベーション混合物 （より若い （1ケ 月及び 1歳） マウス脳の海馬又は海馬を除いた全脳からのシナブトソームを含む ものなど） よりも有意に高かった。
1 3. 核染色による観察
TA の驚くべき特徴は、 その強い毒性である。 TA によつて誘導された細 胞死を特徴づけするために、 核透過性色素である Hoechst 33258 (商品名） を用 いて TA を含むインキュベーション混合物 （5 θ ίΜ アークティック型 Aj3 及び 1 0 % GM 1ガンダリオシド、 3 7 °C、 2時間） で 1 2時間処理された （ 細胞数 1. 5 X 1 04個 Zwell、 インキュベーション混合物：培地 = 1 ： 1) P C 1 2 N細胞の核染色を行なった。
処理後の P C 1 2 N細胞の写真を図 7、 パネル （A) に示す （バーは 5 0 m ) 。 a及び bは位相差顕微鏡像、 c及び dは核染色像である。 上記 TA/3を含む インキュベーション混合物で 1 2時間処理された PC 1 2N細胞 （b及び d) は 、 退縮した （retracted) 神経突起、 萎縮した細胞体、 核の凝縮 （condensation ) 及び断片化 （fragmentation) などを含むアポトーシス様の変化の特徴 （図中 に矢印で示す） を示した。
14. 種々のタイプの培養細胞に対する T A3毒性
種々のタイプの培養細胞を TAjSで処理し、 TA に対する細胞の感受性を調 ベた。
上記の PC 1 2細胞及ぴ P C 1 2 N細胞のほか、 以下の細胞を使用した。 ヒト 脳微小血管内皮 （h BME) 細胞及びヒト脳星状膠細胞 （hAST) (いずれも Dainippon Pharmaceutical Inc. N 大阪、 曰本） は、 コラーゲンでコーティング したフラスコ中で C S—。培地 (Dainippon Pharmaceutical Inc. ) で培養した 。 ラット星状膠細胞 （r AST) は、 10%ゥシ胎児血清を含む DMEM培地で 培養した。 ヒ ト神経芽細胞腫 SH—SY5 Y (SY 5 Y) 細胞は、 10%FB S を添加した DMEM/H a m' s F _ 1 2培地中で培養した。 ヒ ト胚腎臓 29 3 (HEK 29 3) 細胞は、 10%FB Sを添カ卩した DMEM中で培養した。 マ ウス単球 RAW 264. 7 (RAW 264) 細胞は、 Dainippon Pharmaceutical Inc.から購入した。 RAW264細胞は、 10 % F B Sを添加した DMEM中で 培養した。 ラージ T抗原で不死化されたマウス線維芽細胞 （ 「fibroblast」 ) は 、 1 0 %F B Sを添加した DMEM中で培養した。 すべての細胞は、 5%C〇2 、 3 7° Cで加湿して培養した。
TA ]3を含むインキュベーション混合物 （50 ^Μ アークティック型 Ai3及 び 1 0% GM1ガンダリオシド、 3 7°C、 2時間） で各細胞を上記と同様に処 理 （細胞数 1. 5 X 1 04個 Zwell、 3 7°C、 48時間、 インキュベーション混 合物：培地 = 1 ： 1) し、 LDH放出アツセィを行なった。
結果を図 7、 パネル （B) に示す。 各カラムは、 3つの値の平均値 （土 SD) を示し、 *は、 A ]3のみを含むインキュベーション混合物で処理した場合の値に 対して Pく 0. 0001を表す。 ネイティブな P C 1 2細胞を含む非-ユーロン 細胞もまた、 T A /3に対して感受性であった。
1 5. NG Fレセプタ一に対する TA /3の結合
ΤΑβが NGFレセプターを介してアポトーシスを誘導するか否かを調べるた めに、 外来性 NGFの存在下で P C 1 2N細胞及びネイティブな P C 1 2細胞を ΤΑβで処理した。 P C 1 2 Ν細胞及び P C 1 2細胞 （細胞数 1. 5 X 1 04個 /well) に 1 0 OngZmL の NGFを添加し、 上記と同様に T A ]3を含むインキ ュベーシヨン混合物 （ 50 Μ アークティック型 A/3及び 1 0 % GM1ガン ダリオシド、 3 7°C、 2時間） で各細胞を処理し、 LDH放出アツセィを行なつ た。
結果を図 8、 パネル （A) に示す。 両方の培養物において、 NGFが存在す る場合に、 細胞死の程度は有意に抑制された。 したがって、 TA；3はNGFレセ プターに対して競合的に結合することが示された。
1 6. T r kA又は T3 75 NTRの s i RNA媒介性ノックダウンによる TA ;3 毒性の抑制
特異的スモールインターフェアリング RNA ( s i RNA) を用いて T r kA 及び p 75NTRをノックダウンした。
P C 1 2細胞 T r k A (GenBank no. NM_021589) 及ぴ p 7 5 (GenBank no. NM_012610) に対する 「Stealth」 （登録商標） スモールインターフェアリング R NA ( s i RNA) 二本鎖オリゴヌクレオチドを、 Invitrogen 社 （Carlsbad, CA) で合成した。 s i RNA配列は、 以下のとおりであった：
r T r k A- s i RNA (ポジション 1 3 70)
センス = 5 ' -GC C CUC CUC CUAGUGCUC AAC AAAU- 3 '
一 3 ' ;
r T r k A- s i RNA—コント口—ノレ
センス = 5 ' — GCCCUCCGAUCUCGUCAACAUCAAU— 3 ' 一 3
r p 7 5 - s i RNA (ポジション 1 21 2)
センス = 5 ' -C AG C CUGAACAUAUAGACUC CUUUA- 3 アンチセンス = 5 '
G- 3 ' ；
r p 7 5— s i RNA—コント口一ノレ
センス = 5 '一 C AGGUAAAC AUAUAGUC C CUC CUU A— 3 '
- 3
これらの s i RNAオリゴヌクレオチド （RNA量 2 O mol) を、 製品添付 のプロ トコ一ノレにしたがって 「LipofectAMINE 2000」 （商品名、 Invitrogen)を用 いて P C 1 2細胞 （細胞数 1. 5 X 104個/ eil) にトランスフエタ トした。
T r k A又は p 7 5NTRに対する s i RNAで処理した後、 これらの PC 1 2 細胞を、 上記と同様に T A を含むインキュベーション混合物 （50 μΜ ァー タティック型 Α /3及び 1 0 °/o GM1ガンダリオシド、 3 7°C、 2時間） で処理 し、 LDH放出アツセィを行なった。
各細胞における T r kA及び！） 75 NTR発現レベルの低減は、 それぞれ抗 T r k A (Santa Cruz社）及び抗 p 75 NTR (NeoMarker社）抗体を用いた細胞ライセー トのウェスタン 'ブロッ ト解析 (7. 5 %及び 4〜 20 %ポリアタリルァミ ドゲ ル（第一化学ミニゲル）を使用、 4 OmA で 1時間泳動し、 その後、 1 20mA、 2 時間ブロッ トした） によつて確認した。
結果を図 8、 パネル （B) に示す。 各カラムは、 3つの値の平均値 （土 SD) を示し、 *は、 pく 0. 000 1を表す。 p 75NTRだけでなく、 T r k Aのノ ックダウンも、 T A により誘導される細胞死を顕著に抑制した。
これらの結果から、 ΤΑ]3は、 ρ 75NTR又は T r k Αに結合することにより ヘテロメリック T r kA/p 75NTR複合体の機能を混乱させ、 その結果、 p 7 5 NTR分子の細胞質部分の死に関与するドメインの活性化を通じてアポトーシス がもたらされることが示唆された。
この出願は、 平成 18年 6月 5日出願の日本特許出願、 特願 2006 - 1 5 5 6 3 2に基づくものであり、 特願 2006— 1 5 56 3 2の明細書及ぴ特許請求 の範囲に記載された内容は、 すべてこの出願明細書に包含される。

Claims

1. GM 1ガンダリオシドの存在下でィンビトロで形成される可溶性毒性ァミ口 ィ ド /3アセンブリーであって、 (a) サイズ排除クロマトグラフィによる見かけの分子量が約 200〜約 300 百
kDaであること ；
(b) 原子力間顕微鏡観察による直径が約 1 0〜約 2 Onm である球状粒子を含 の
むこと ；
(c) 検出可能な GM1ガンダリオシドを含まないこと ；及び (d) 培養細胞に対してアポトーシス様細胞死を誘囲導すること、
を特徴とするアセンブリー。
2. アミロイド 3が、 野生型ペプチド又はアークティック型変異を有するぺプチ ドである、 請求の範囲 1記載のアセンブリー。
3. 可溶性毒性アミロイド アセンブリーの製造方法であって、 単量体アミロイ ド 3を、 脂質成分のモル比で約 1 0〜約 1 5%の GM1ガングリオシドを含むリ ポソームと共に約 3 5〜約 40°Cで約 1〜約 30時間インキュベートする工程を 含むことを特徴とする方法。
4. 単量体アミロイド ]3が野生型ペプチドであり、 インキュベーション時間が 2 0〜 30時間である、 請求の範囲 3記載の方法。
5. 単量体アミロイ ド ]3がアークティック型変異を有するペプチドであり、 イン キュベーション時間が 1〜 3時間である、 請求の範囲 3記載の方法。
6. 請求の範囲 3〜 5のいずれか 1項記載の製造方法によって製造された可溶性 毒性ァミロイド アセンブリー。
7. 請求の範囲 1、 2又は 6記載の可溶性毒性アミロイド ]3アセンブリーを含む 液体を、 5 4 0， 0 0 0 X gで 1 5分間又は同等の条件で遠心分離して、 上清を 回収することを特徴とする、 可溶性毒性アミロイド j8アセンブリーの精製方法。
8. 前記回収された上清を、 さらにサイズ排除クロマトグラフィに供することを 特徴とする、 請求の範囲 7記載の方法。
9. 請求の範囲 7又は 8記載の精製方法によって精製された可溶性毒性アミロイ ド 3アセンブリー。
1 0. 可溶性毒性アミロイド 3の毒性を調節する物質のスクリーニング方法であ つて、 以下の工程：
(a ) 培養細胞を、 請求の範囲 1、 2、 6又は 9のいずれか 1項記載の可溶性 毒性アミロイド アセンブリー及び被検物質の存在下でインキュベートする工程
(b) 前記工程 （a) の後、 前記培養細胞の生死を測定する工程、
(c ) 前記工程 （b) で得られた結果を、 被検物質を含まない状態で工程 （a ) を行なった場合の結果と比較する工程
を含むことを特徴とする方法。
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