WO2007043629A1 - エフリンｂ２を用いる血管新生の抑制方法 - Google Patents

エフリンｂ２を用いる血管新生の抑制方法 Download PDF

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WO2007043629A1
WO2007043629A1 PCT/JP2006/320423 JP2006320423W WO2007043629A1 WO 2007043629 A1 WO2007043629 A1 WO 2007043629A1 JP 2006320423 W JP2006320423 W JP 2006320423W WO 2007043629 A1 WO2007043629 A1 WO 2007043629A1
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WO
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ephrin
angiogenesis
neovascularization
diabetic
endothelial cells
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PCT/JP2006/320423
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English (en)
French (fr)
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Kimihiko Fujisawa
Tatsuro Ishibashi
Tadahisa Kagimoto
Yukio Sasa
Original Assignee
Aqumen Biopharmaceuticals K.K.
Kyushu University
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor

Definitions

  • the present invention relates to methods and compositions for inhibiting angiogenesis or angiogenesis, and more particularly to the use of ephrin B 2 in the methods and compositions.
  • Angiogenesis is a prominent feature of various ocular pathological conditions such as age-related macular degeneration, diabetic retinopathy, and retinopathy of prematurity.
  • the angiogenic cascade is caused by many mediators and chemokines.
  • endothelial cell receptor tyrosine kinase RTK
  • RTK endothelial cell receptor tyrosine kinase
  • an angiogenic site force-in is generated that includes vascular endothelial growth factor (VEG 'F), an event that applies well to the concept of capillary development.
  • angiopoietin ZT 1 e 2 system has been identified as a ligand-receptor system that mediates vascular assembly and maturation.
  • the VEGFZVEGF receptor opiopoietin ZT i e 2 family also belongs to RTK.
  • Eph receptor The Eph receptor, the ephrin receptor, consists of 8 Eph A receptors and 6 Eph B receptors, including the largest family of tyrosine kinase receptors.
  • This E rho receptor receptor synkinase family represents a new class of RT K. This family is originally identified as a neuronal pathway pioneer, but its role in angiogenesis is unknown.
  • E ph B receptors and ephrin B ligands have been identified as important regulators of vascular assembly that organize arteriovenous differentiation and border formation ( Non-patent documents 2, 3, 5).
  • Eph B4 the initial marker of vesicles, is a marker of venous endothelial cells in vertebrate embryos (Non-patent Documents 1, 2, 4, 6) .
  • endothelial cells in adults maintain their asymmetric arteriovenous expression pattern, which is responsible for the regulation of vascular homeostasis by the ephrin B / Eph B system, and pathological angiogenesis in adults It has been suggested that it has the possibility of controlling (Non-Patent Documents 3 and 5).
  • Eph receptor antagonist eg, antibody
  • an agonist stimulates angiogenesis
  • Patent Document 1 It is therefore desirable to determine the mode of action of ephrin and to be able to use these molecules to manipulate the vasculature, particularly in pathological conditions.
  • Diabetic retinopathy is a leading cause of blindness in people between the ages of 20 and 65 in the United States.
  • the essential pathology of diabetic retinopathy is retinal microangiopathy and subsequent ischemia. It is well known that hypoxia in retinopathy leads to retinal neovascularization. However, in the newly formed vasculature due to retinal neovascularization, the blood flow is not perfused and the retina is in an ischemic state. Because these vessels are immature and leaky. In addition, these vessels often penetrate the vitreous chamber.
  • the ideal treatment for diabetic retinopathy is to obtain a mature vessel that can inhibit the development of blood vessels with this misdirected orientation, and perfuse the ischemic retina and rescue from hypoxia It is.
  • Age-related macular degeneration is the leading cause of blindness in adults in Europe and the United States, and one of the three major causes in Japan. It is the essence of the pathological condition that the neovascularization enters the macula from the choroid, which leads to social blindness due to bleeding from the abnormal neovascularization and retinal detachment. Therefore, suppressing the occurrence of abnormal new blood vessels is an essential treatment for maintaining visual function. It is known that the growth of new blood vessels is suppressed by the pigment epithelium covering the new blood vessels, but the mechanism of action is not yet well known.
  • Patent Document 1 US Patent Application Publication No. 2004/0 1 36 983
  • Non-Patent Document 1 Adams, RH et al. (2001) Cell, 104 ⁇ , 1, 57-69
  • Non-Patent Document 2 Adams, RH et al. (1999) Genes Dev., 13 ⁇ , No. 3, pp. 295-306
  • Non-Patent Document 3 Gale, N.W. et al., (2001) Dev. Biol., 230 ⁇ , No.2, pp. 151-160
  • Non-Patent Document 4 Gerety, S.S. et al. (1999) ol. Cell, 4 ⁇ , No. 3, pp. 403-414 '.
  • Non-Patent Document 5 A Shm, D. et al. (2001) Dev. Biol., 230 ⁇ , No. 2, pp. 139-150,
  • Non-Patent Document 6 Wang, H.U., et al. (1998) Cell, 93 ⁇ , No. 5, pp. 741-753 DISCLOSURE OF THE INVENTION Problems to be solved by the invention.
  • An object of the present invention is to provide a method, a composition, and a preventive / therapeutic agent for suppressing angiogenesis or angiogenesis.
  • An object of the present invention is to provide a method, a composition, and a prophylactic / therapeutic agent useful for treating a disease or disorder associated with angiogenesis or angiogenesis.
  • the present invention provides a method for inhibiting DNA synthesis in arterial endothelial cells (or venous endothelial cells), which comprises contacting arterial endothelial cells (or venous endothelial cells) with an effective amount of ephrin B 2. including.
  • the DNA synthesis is induced by vascular endothelial growth factor (VEGF), basic fibroblast growth factor (b FGF), or platelet derived growth factor (PDG F).
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • b FGF basic fibroblast growth factor
  • PDG F platelet derived growth factor
  • the present invention also provides p 44 p 42 in arterial endothelial cells (or venous endothelial cells).
  • MAP kinase activation comprising arterial endothelial cells (Or venous endothelial cells) comprising contacting an effective amount of ephrin B2.
  • the p44p4 2 MA P kinase activation is induced by VEGF, bFGF, or PDGF.
  • the present invention also provides a method of inhibiting angiogenesis from arterial endothelial cells (or venous endothelium 'cells), which comprises an arterial endothelial cell (or venous endothelial cell) with an effective amount of ephrin B 2 And contacting with.
  • the angiogenesis is induced by VEGF, bFGF, or PDGF. '
  • the contacting step is performed by administering the ephrin B2 to a mammal having the arterial endothelial cells (or venous endothelial cells).
  • the present invention also provides a method of inhibiting angiogenesis from the retina, the method comprising the step of administering to the individual an effective amount of ephrin B2.
  • the individual is an individual who has or can have pathological angiogenesis or neovascularization outside the retina.
  • the present invention also provides a method of treating a disease or disorder associated with angiogenesis or angiogenesis, the method comprising administering an effective amount of ephrin B2 to an individual in need of such treatment.
  • the present invention also provides a composition for inhibiting DNA synthesis of arterial endothelial cells (or venous endothelial cells) comprising an effective amount of ephrin B2.
  • the present invention also provides a composition for inhibiting p44Zp42 MAP kinase activation of arterial endothelial cells (or venous endothelial cells) comprising an effective amount of ephrin B2.
  • the present invention also provides a composition for inhibiting angiogenesis from arterial endothelial cell (or venous endothelial cell) force comprising an effective amount of ephrin B2.
  • the present invention also provides a composition for inhibiting angiogenesis from the retina comprising an effective amount of ephrin B2.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for the treatment of a disease or disorder associated with angiogenesis or angiogenesis, comprising an effective amount of ephrin B2.
  • the present invention also provides a DNA synthesis inhibitor of arterial endothelial cells (or venous endothelial cells) comprising an effective amount of ephrin B2. '
  • the present invention also provides an arterial endothelial cell (or venous endothelial cell) p 4 4 Z p 4 2 MA P kinase activation inhibitor comprising an effective amount of ephrin B 2.
  • the present invention also provides an angiogenesis inhibitor from arterial endothelial cells (or venous endothelial cells) comprising an effective amount of ephrin B2.
  • the present invention also provides a retinal neovascularization inhibitor comprising an effective amount of ephrin B2.
  • the present invention also provides a therapeutic agent for a disease or disorder associated with angiogenesis or angiogenesis, comprising an effective amount of ephrin B2.
  • the ephrin B 2 comprises a natural ephrin B 2 extracellular domain, but the cytoplasmic domain. And does not contain a transmembrane domain.
  • the disease or disorder is age-related macular degeneration, ischemic retinopathy, intraocular neovascularization, cornea Angiogenesis, retinal neovascularization, choroidal neovascularization, diabetic macular edema, diabetic retinal ischemia, diabetic retinal edema, diabetic retinopathy, cancer, chronic arthritis, umati, endometriosis, and alopecia Selected from the group consisting of
  • the disease or disorder is age-related macular degeneration, ischemic retinopathy, intraocular neovascularization. Selected from the group consisting of: corneal neovascularization, retinal neovascularization, choroidal neovascularization, diabetic macular edema, diabetic retinal ischemia, diabetic retinal edema, and diabetic retinopathy.
  • the invention's effect According to the present invention, methods and compositions for inhibiting angiogenesis or angiogenesis are provided.
  • the compositions and methods of the present invention can inhibit pathological angiogenesis or angiogenesis without reducing physiological blood flow.
  • the compositions and methods of the present invention do not affect normal blood vessels and are therefore useful for the treatment of diseases or disorders associated with angiogenesis or angiogenesis.
  • FIG. 1A is a graph showing the effect of thymidine incorporation by ephrin B 2 treatment and Ep hB4 treatment on HAo E C treated with VEGF, 'b FGF, or PDGF-BB. '
  • FIG. 1B is a graph showing the effect of thymidine incorporation by ephrin B 2 treatment and E ph B 4 treatment in HUVEC treated with VEGF, bFGF, or PDGF_BB. ,
  • Figure 1C shows the control with either control (untreated), s ephrin B 2 or s E ph B 4, or both s ephrin B 2 and s E ph B 4 7 is a photograph showing the morphology of endothelial cells stimulated with VEGF after 7 days.
  • FIG. 2A is an electrophoretogram showing the effect of ephrin B 2 on ERK phosphorylation in HAo EC stimulated with VEGF or bFGF.
  • FIG. 2B is an electrophoretogram showing the effect of ephrin B 2 on VEGF receptor 2 (KDR) autophosphorylation in VEGF-stimulated HAo EC.
  • KDR VEGF receptor 2
  • FIG. 3 is a graph showing the results of quantitative analysis of angiogenesis in the cornea of mice co-administered with bFGF and ephrin B2.
  • Figure 4 is a fluorescence micrograph showing the morphology of a flat-mounted fluorescein-dextran perfused retina of a control (A) and sephrin-B treated model (B).
  • Figure 5 shows the control model (OIR) and the sephrin B 2 treatment model (O It is a graph which shows the perfusion area
  • Fig. 6 is a scanning electron micrograph showing the morphology of the retinal surface of a P17 neonatal mouse in the control model (OIR) (A) and the sephrin B2-treated model (011 + ephrin: 62) (B). . '
  • FIG. 7 is a graph showing the effect of thymidine incorporation by mouse ephrin B 2 treatment and human ephrin B 2 treatment in HUVEC by bFGF treatment.
  • FIG. 8 is a fluorescence photograph showing the state of the fundus oculi subjected to 10 ng / mL human ephrin B 2 treatment (A), PBS treatment (B), and 10 ng / mL mouse ephrin B 2 treatment (C). Best Mode for Carrying Out the Invention ''
  • the ephrin B2 / EphB4 system plays an important role in angiogenesis and angiogenesis.
  • the present invention is based on finding that it inhibits DNA synthesis of ephrin B2 force endothelial cells (EC) and p44 / p42 MAP kinase activation induced by both VE'GF and bFGF.
  • Ephrin B2 also inhibits angiogenesis by EC.
  • ephrin B 2 inhibits corneal angiogenesis induced by bFGF, according to the quantification of corneal micropocket corneal angiogenesis in mice. Therefore, angiogenesis-dependent diseases can be treated by targeting ephrin B2 / E ph B4 and its anti-angiogenic signaling pathway.
  • ephrin B 2 has (1) substantial sequence similarity to natural ephrin B 2 or its extracellular domain, preferably natural human ephrin B 2. And (2) refers to a polypeptide having biological activity involving natural ephrin B2 or the extracellular domain.
  • the term “Ephrin B 2” Natural ephrin B 2 (preferably natural human ephrin B 2) and its extracellular domain, and analogs and variants thereof having the biological activity of the natural ephrin B 2 or extracellular domain mentioned above included.
  • the sequence of ephrin B 2 is known in the art, and those skilled in the art can fully recognize the sequences and positions of the extracellular domain, transmembrane domain, and cytoplasmic domain.
  • Natural molecules like natural ephrin B 2 are naturally occurring molecules without artificial intervention.
  • native ephrin B2 may also be an extracellular domain of ephrin B2 that exists without artificial intervention.
  • Ephrin B 2 is ephrin B 2 containing both domains in extracellular cells.
  • Full-length ephrin B2 can be naturally occurring or can be an analog or variant of natural ephrin B2.
  • a polypeptide having “substantial sequence similarity” with a natural molecule is at least about 30% identical to the natural molecule at the amino acid level.
  • the polypeptide is preferably at least about 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, and even at the natural molecule and amino acid level. Preferably at least about 98% identical, more preferably about 99% identical, even more preferably 100% identical.
  • the term “percent identity” or “% identity” for an analog or variant with a natural molecule refers to the amino acid sequence of the natural molecule found in the analog or variant when the two sequences are aligned. A parcel. Percent homology can be determined by any method or algorithm established in the art, such as LALIGN, ClustalW, or BLAST.
  • the polypeptide can bind to the receptor for native ephrin B 2, or it can induce EC DNA synthesis, extracellular signal-regulated kinase (ERK) phosphorylation in EC, EC angiogenesis, angiogenesis, or angiogenesis If it can be inhibited, it has “biological activity” involving natural ephrin B2. Inhibits EC DNA synthesis, ERK phosphorylation in EC, EC angiogenesis, angiogenesis, or angiogenesis The activity can be determined by any method known to those skilled in the art, for example, as described herein.
  • ERK extracellular signal-regulated kinase
  • an “effective amount” is an amount of a substance sufficient to achieve a desired purpose.
  • an effective amount of ephrin B 2 to inhibit DNA synthesis is an amount sufficient to reduce the amount of DNA synthesis, depending on whether in vivo or in vitro.
  • An effective amount of ephrin B 2 for treating a disease or disorder is an amount of ephrin B 2 sufficient to reduce or eliminate symptoms of the disease or disorder or to prevent or delay the disease or disorder.
  • the effective amount of a given substance will vary depending on factors such as the nature of the substance, the route of administration, the size and species of the animal receiving the substance, and the purpose for which the substance is given. The effective amount in each case can be determined empirically by those skilled in the art according to methods established in the art.
  • mice refers to any animal, preferably mammals other than humans or humans, more preferably mice, rats, other rodents, rabbits, dogs, cats, pigs, Usi, horse, or primate, more preferably human.
  • “Pathologic angiogenesis or neovascularization” can be the formation or neoplasia of blood vessels that are not physiologically normal. Since such blood vessels are immature and leaky, they can become blood vessels that cannot perfuse blood. Also, “pathological angiogenesis or angiogenesis” can be angiogenesis or neoplasia in a manner different from a physiologically normal state. For example, it also means that a new blood vessel is formed by receiving a stimulus such as inflammation.
  • an “individual having or possibly having pathological angiogenesis or angiogenesis” refers to an individual who has already undergone angiogenesis or angiogenesis as described above, or such angiogenesis or An individual who can have a factor causing angiogenesis. The latter individuals are affected by a disease or disorder that may show signs of “pathological angiogenesis or neovascularization” but have not yet shown such signs, “pathological angiogenesis or It may be an individual who has been stimulated to cause “angiogenesis”. “Pathologic angioplasty or neovascularization” can occur “intraretinal” or “extraretinal”. “Outside the retina” means outside the tissue of the retina.
  • Such angiogenesis or neovascularization includes, for example, the formation or neovascularization of blood vessels from the retina through the inner limiting membrane into the vitreous and the formation or neovascularization of blood vessels from the retina to the choroid.
  • disease or angiogenesis-related disease or disorder results in the “pathological angiogenesis or angiogenesis” described above or to an individual due to “pathological angiogenesis or angiogenesis”.
  • diseases or disorders include age-related macular degeneration 'f * disease, ischemic retinopathy, intraocular neovascularization, corneal neovascularization, retinal neovascularization, choroidal neovascularization, diabetic macular edema, diabetic retina Blood, diabetic retinal edema, diabetic retinopathy, cancer, rheumatoid arthritis, endometriosis, and alopecia.
  • Treatment of a disease or disorder refers to reducing or completely eliminating the symptoms of the disease or disorder (also referred to as “treatment”), or preventing or delaying the onset of the disease or disorder.
  • in need of treatment means that the individual will benefit from treatment (eg, for humans, doctors, nurses, clinical nurses, etc .; animals; non-human mammals). (Including animals) refers to decisions made by veterinarians. This determination is based on a variety of factors that are within the domain of the treatment service's opinion, but that the individual is currently ill as a result of a condition that can be treated with any composition. Or the recognition that it may become ill in the future.
  • composition comprises at least one active ingredient and the cell, tissue, organ or animal of the subject to which the composition is applied or administered (preferably a mammal, more preferably a mouse, a rat, Substances intended to exert the effect of the active ingredient in other rodents, rabbits, dogs, cats, pigs, rabbits, horses, or primates, more preferably humans)
  • a mammal more preferably a mouse, a rat
  • a combination of A person skilled in the art will determine whether the active ingredient has the desired effective results based on the needs of the person skilled in the art. Understand and recognize the appropriate technology to determine.
  • a “pharmaceutical composition” comprises at least one active ingredient, and is an animal, preferably a mammal, more preferably a mouse, a rat, other rodents, a rabbit, a dog, a cat, It refers to a combination of substances intended to exert the pharmaceutical effect of the active ingredient in pigs, tusks, horses, or primates, and more preferably humans.
  • an animal preferably a mammal, more preferably a mouse, a rat, other rodents, a rabbit, a dog, a cat
  • It refers to a combination of substances intended to exert the pharmaceutical effect of the active ingredient in pigs, tusks, horses, or primates, and more preferably humans.
  • One skilled in the art understands and recognizes techniques suitable for determining whether an active ingredient has the desired effective results based on the needs of the artisan.
  • inhibitor inhibitor
  • inhibitor and “preventive / therapeutic agent” are those in which at least one active ingredient is prepared in a form suitable for application or administration to exert the effect of the active ingredient Say.
  • these are the cells, tissues, organs or animals of the subject to which this composition is applied or administered (preferably mammals, more preferably mice, rats, other rodents, rabbits, dogs, cats,
  • the effect of the active ingredient can be exerted in pigs, urchins, horses, or primates, and more preferably humans. '
  • Endothelial cells can be induced to proliferate in response to growth factors such as VEGF, bFGF, or PDGF-BB (? 00: 6 subunit dimer).
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • bFGF vascular endothelial growth factor
  • PDGF-BB PDGF-BB
  • ephrin B2 inhibits DNA synthesis induced by all stimulation of VEGF, bFGF, or PDGF-BB.
  • the increase in DNA synthesis induced by 10 ng / mL VEGF, b FGF, or PDGF-BB was 4 by 200 ng / mL ephrin B 2 respectively. ⁇ %, 30%, and 90% inhibited.
  • ephrin B 2 human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) (see Figure 1B). Inhibition of DNA synthesis by ephrin B 2 is not caused by apoptosis. Thus, ephrin B2 can inhibit EC DNA synthesis induced by a variety of stimuli, including VEGF, bFGF, and PDGF.
  • the receptor for Ephrin B 2 (E p hB4) is a marker for venous endothelial cells, but DNA synthesis is not related to venous endothelial cells, although this receptor is not known to be present in arterial endothelial cells. It is inhibited in both arterial endothelial cells.
  • VEGF-induced angiogenesis is not affected by E p hB 4 treatment.
  • Ephrin B 2 inhibits the growth factor-induced mitotic response. This is because ephrin B 2 suppresses ERK (p 42/44) phosphorylation induced by both VEGF and b FGF in both arterial and venous endothelial cells. However, ephrin B 2 does not inhibit VEGF receptor 2 autoligation, which does not interfere with signal transduction between VEGF and VEGF receptor 2, as is the mechanism for inhibiting VE GF function. Show. Thus, ephrin B 2 can be used to inhibit V EG F or b F GF induced ER K phosphorylation in inner cells, either arteries or veins.
  • b FGF is a powerful angiogenic factor.
  • Ephrin B2 can inhibit EC cell proliferation induced by this bFGF.
  • Administration of ephrin B 2 significantly blocks angiogenesis induced by bFGF.
  • E phB4 administration does not show significant effects. (Eflin B 2 effect in an in vivo model)
  • Corneal micropocket assembly is a representative in vivo model of angiogenesis.
  • administration of ephrin B2 can significantly block angiogenesis induced by bFGF.
  • EphB 4 administration does not show any effect.
  • the oxygen-induced retinopathy (OIR) model is an animal model of diabetic retinopathy.
  • ephrin B 2 is responsible for pathologic angiogenesis or out of the retina. It can inhibit vascular growth and enhance vascular network formation and vascular maturation in the membrane.
  • the laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model is positioned as an experimental disease model for age-related macular degeneration (AMD).
  • Ephrin B 2 can suppress this C N V. '
  • Ephrin B 2 suppresses the formation of pathological new blood vessels (eg, choroidal neovascularization, transendothelial neovascularization) going outside the retina without suppressing physiological blood flow in the retina. obtain. Therefore, ephrin B2 can be used to suppress pathological angiogenesis or angiogenesis without suppressing physiological blood flow.
  • pathological new blood vessels eg, choroidal neovascularization, transendothelial neovascularization
  • ephrin B 2 is age-related macular degeneration, ischemic retinopathy, intraocular neovascularization, corneal neovascularization, retinal neovascularization, choroidal neovascularization, diabetic macular edema, diabetic retinal ischemia, diabetic retinal edema Useful in the treatment of diabetic retinopathy, cancer, rheumatoid arthritis, endometriosis, and alopecia, and other diseases or disorders associated with angiogenesis or angiogenesis.
  • ephrin B 2 is useful for the treatment of diseases or disorders associated with angiogenesis or angiogenesis in the eye.
  • Ephrin B 2 is primarily responsible for retinal physiological blood flow, usually caused by treatment with currently used photodynamic therapy (PDT) and various anti-angiogenic agents (eg, anti-VEGF agents). Does not cause damage.
  • PDT photodynamic therapy
  • anti-VEGF agents eg, anti-VEGF agents
  • ephrin B 2 can be used to treat wet and early dry AMD, for example, by inhibiting pathological choroidal neovascularization without damaging the retinal physiological blood flow.
  • diabetic retinopathy can be treated by inhibiting pathological transmembrane endovascularization without damaging the retina's physiological blood flow.
  • Ephrin B 2 useful in the present invention can be any ephrin B 2 including analogs and variants and has the required activity.
  • Ephrin B 2 is an effect of the present invention.
  • the structure is not limited as long as the " ⁇ " is displayed.
  • Ephrin ⁇ 2 includes the extracellular domain, but may not include the cytoplasmic domain and the cell membrane domain, or may be the full length. Even a shorter fragment.
  • the ephrin-2 used in the present invention may be one obtained by isolating and purifying a protein present in nature, or one produced from a microorganism by genetic recombination.
  • a protein present in nature or one produced from a microorganism by genetic recombination.
  • US Pat. No. 6,303,769 or Mol Immunol. 1995 Nov; 32 (16) '1197-205 A full-length protein, a protein containing an extracellular domain, and the like can be prepared using conventional techniques with reference to the sequence of ⁇ N B 2 cDNA.
  • a person skilled in the art can also preferably modify natural ephrin B 2 by using techniques commonly used by those skilled in the art.
  • Ephrin B 2 may be any commercially available drug or reagent.
  • ephrin B2 when used in a pharmaceutical composition, it is more preferable that it is purified to a purity usually used for medical purposes.
  • it can be modified into any form suitable for administration to an individual by fusing to the Fc domain of an immunoglobulin (preferably, the Fc domain of human IgG) in consideration of immunological characteristics.
  • an immunoglobulin preferably, the Fc domain of human IgG
  • a protein in which soluble ephrin B 2 usually containing an extracellular domain but not containing a cytoplasmic domain or a transmembrane domain
  • a composition comprising ephrin B 2 can be used to administer the composition to an individual (eg, a subject animal) or a specimen (eg, a cell (eg, an endothelial cell, particularly an endothelial cell of an artery or vein), tissue, or It can be in various forms suitable for application to organs. Methods for preparing such forms are well known in the art. That is, the present invention also provides a formulation suitable for a predetermined use of ephrin B2.
  • Formulations suitable for a given application include, but are not limited to, “inhibitors to inhibit DNA synthesis in arterial endothelial cells (or venous endothelial cells)”, “arterial endothelial cells (or “Inhibitors” that inhibit activation of p'4 4 Z p 4 2 MA P kinase in intravascular cells) "Inhibitors that inhibit angiogenesis from arterial endothelial cells (or venous endothelial cells)” , “Inhibitors for inhibiting angiogenesis from the retina” and the like.
  • Such a formulation containing ephrin B 2 may contain other ingredients other than ephrin B 2 as long as they do not interfere with the action of ephrin B 2 and do not adversely affect the individual or specimen.
  • the pharmaceutical composition comprising ephrin B2 can be in various forms of formulations suitable for administration to an individual. Methods for preparing such forms are well known in the art. That is, the present invention also provides a formulation suitable for a predetermined use of ephrin B2.
  • the treatment suitable for a given application is not particularly limited, but “an inhibitor for inhibiting DNA synthesis in arterial endothelial cells (or venous endothelial cells)”, “arterial endothelial cells (or venous endothelial cells) Inhibitors to Inhibit P4 4 ZP 4 2 MA P Kinase Activation "," Inhibitors to Inhibit Angiogenesis from Arterial Endothelial Cells (or Venous Endothelial Cells) ",” Vessels from Retina " Inhibitors for inhibiting neoplasia ”,“ preventive / therapeutic agents for the treatment of diseases or disorders associated with angiogenesis or angiogenesis ”and the like.
  • a preferred embodiment of the present invention relates to arterial endothelial cells.
  • the present invention also includes ephrin B2, age-related macular degeneration, ischemic retinopathy, intraocular neovascularization, corneal neovascularization, retinal neovascularization, choroidal neovascularization, diabetic macular edema, diabetic retinal ischemia
  • a pharmaceutical composition for the treatment of a disease or disorder selected from the group consisting of: diabetic retinal edema, diabetic retinopathy, cancer, rheumatoid arthritis, endometriosis, and alopecia Provide the agent.
  • Ephrin B2 may treat or prevent at least one of the above diseases or disorders.
  • a composition comprising B2 / b is an effective amount of ephrin B2 and a pharmaceutically acceptable carrier
  • This composition may contain other pharmaceutically acceptable ingredients (including angiogenesis inhibitors other than ephrin B2) as long as they do not interfere with the action of ephrin B2.
  • a pharmaceutical composition or a prophylactic / therapeutic agent mainly containing ephrin B 2 is also provided.
  • Ephrin B2 can be administered systemically, eg, orally or by intramuscular or intravenous injection, mixed with a pharmaceutically acceptable carrier adapted to the route of administration.
  • a pharmaceutically acceptable carrier adapted to the route of administration.
  • physiologically acceptable carriers can be used to administer ephrin B 2 and its formulations are known to those skilled in the art, for example, Remington's Pharmaceutical Sciences (No. 18fe), A. Gennarofe Mack Publishing, ompany, Eastern, PA, and Pollock et al.
  • Ephrin B 2 is preferably administered parenterally (eg, intramuscularly, intraperitoneally, 'intravenously, intraocularly, intravitreally, or subcutaneously, or by implantation).
  • parenteral administration can be in the form of sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, or emulsions.
  • various aqueous carriers such as water, buffered water, and physiological saline can be used.
  • suitable vehicles include polypropylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils, gelatin, hardened naphthalenes, and injectable organic esters such as ethyl oleate.
  • Such formulations may also contain preservatives, wetting agents, buffering agents, emulsifying agents, and auxiliary substances such as Z or dispersing agents.
  • auxiliary substances such as Z or dispersing agents.
  • Biocompatible, biodegradable lactide polymers, lactide glycoside copolymers, or polyoxyethylene monopolyoxypropylene copolymers can be used to control the release of the active ingredient.
  • ephrin B 2 can be administered by oral ingestion.
  • Formulations intended for oral use can be prepared in solid or liquid form according to any method known in the art.
  • the composition can optionally include sweetening, flavoring, coloring, flavoring, and preservatives to provide more palatable preparations.
  • Solid dosage form formulations for oral administration include capsules, tablets, pills, powders, and granules. In general, these formulations contain the active ingredient in admixture with non-toxic pharmaceutically acceptable excipients.
  • Binders, buffering agents, and / or lubricants “ ⁇ ” may also be used.
  • Tablets and pills can additionally be prepared with enteric coatings.
  • Liquid dosage forms for oral administration include pharmaceutically acceptable emulsions, solutions, suspensions, syrups, and soft gelatin capsules. -These forms of formulations contain inert diluents commonly used in the art such as water or oil media, and also contain adjuvants such as wetting agents, emulsifying agents, suspending agents and the like. obtain.
  • Ephrin B2 can also be administered topically, for example, by means of a patch, by direct application to the eye, or by iontophoresis.
  • Ephrin B2 can be provided as a sustained release formulation, for example, as described in US Pat. Nos. 5,672,659 and 5,595,760.
  • immediate or sustained release compositions depends on the nature of the disorder being treated. If the disorder consists of an acute or hyperacute disorder, treatment in immediate release form is preferred over sustained release formulations. Alternatively, sustained release formulations may be appropriate for prevention or long-term treatment.
  • Ephrin B2 can also be delivered using an implant.
  • implants can be biodegradable and Z or biocompatible implants, or can be non-biodegradable implants.
  • the implant can be permeable or impermeable to the active ingredient.
  • the ocular implant can be inserted into an chamber, such as the anterior or posterior chamber, or it can be implanted into the sclera, the choroidal space, or the avascular region of the vitreous outer surface. Preferred embodiment In such a manner, the ocular implant can be placed in an avascular region such as the supremacy, thus allowing transscleral diffusion of the drug to the desired site of treatment, eg, the intraocular lumen and the macular of the eye. Furthermore, the site of transscleral diffusion is preferably near the macula.
  • implants for delivery of ephrin B 2 include: US Pat. Nos. 3,416,530; 3,82 8,777; 4,014,335; 4,300,557; 4,327,725; 4 , 853, 224; 4, 946, 450; 4, 997, 652; 5, 247, 647, 5, 164, 188; 5, 178, 635, 5, 300, 114; 5, 322, 691; 5, 403 , 901; 5, 443, 5 05; 5, 466, 466; 5, 476, 511; 5, 516, 522; — 5, 632, 984; 5, 679, 666; 5, 710, 165; 5, 7 5, 743, 274; 5, 766, 242; 5, 766, 619; 5, 770, 592; 5, 773, 019; 5, 824, 07 2; 5, 824, 073; 5, 830 , 173; 5, 836, 935; 5, 869, 079; 5, 902, 598; 5, 904, 144, 5, 91 6, 5
  • ephrin B 2 should be administered in an amount sufficient to reduce or eliminate signs of disease.
  • Dosage levels on the order of about 1 g / kg to 100 mg / kg body weight per dose are generally useful for the treatment of angiogenic disorders.
  • it is preferably administered so that the intraocular concentration is from about I ng / mL to about lOOng / mL.
  • the dose can be administered as a single dose or can be divided into multiple doses. In general, longer dosing periods of several months or more may be required, but the desired dosage should be administered over an extended period of time, usually at least a few weeks.
  • the exact individual dosage can be adjusted depending on, for example, a variety of factors: administration time; route of administration; nature of the formulation; The specific disorder being treated; severity of the disorder; and the age, weight, health status, and gender of the patient.
  • administration time for example, a variety of factors: administration time; route of administration; nature of the formulation; The specific disorder being treated; severity of the disorder; and the age, weight, health status, and gender of the patient.
  • the wide variation in dosage required should be predicted considering the different effectiveness of the various routes of administration. For example, oral administration is generally expected to require higher dosage levels than administration by intravenous or intravitreal injection.
  • These dosage level variations can be adjusted using standard empirical routines for optimization well known in the art.
  • the exact therapeutically effective dose level and pattern is preferably determined by the attending physician in view of the above factors.
  • ephrin B 2 can be administered prophylactically to prevent or delay the onset of these disorders.
  • ephrin B2 is administered to individuals who are prone to or at risk for certain angiogenic disorders. Also, the exact amount administered will depend on various factors such as the individual's health, weight, etc.
  • ⁇ g microphone mouth gram
  • DMEM Dulbecco's modified medium
  • I TS Insulin 1 Transferrin 1 Selenium
  • VEGF Vascular endothelial growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • HUVEC human umbilical vein endothelial cells
  • HAoEC t aortic endothelial cells
  • O I R oxygen-induced retinopathy
  • CNV choroidal neovascularization
  • AMD age-related macular degeneration.
  • ephrin B 2 and E ph B 4 are soluble proteins (hereinafter referred to as “5 ephrin: 82” and “sE pB4”, respectively) because of their availability; A protein that contains an outer domain but does not contain a cytoplasmic domain or a transmembrane domain).
  • Mouse sephrin B 2 and s E ph B 4 were obtained from R & D Systems, Inc. (614 McKinley Place NE, Mmneapolis 55413, USA) (both in a form fused to the human F c domain). is there) . Proteins prepared as described in Example 5 below B, 2— HitoFc component protein was also used as ephrin B2.
  • Example 1 Inhibition of growth and migration of EC stimulated by growth factors by ephrin B 2 and E ph B 4 on vascular endothelial cells stimulated by growth factors
  • [ 3 H] thymidine incorporation—HA o EC and HUV EC DNA synthesis optoendothelial angiogenesis assays were performed.
  • HA o EC and HU VEC in 5% CO, 95% air in endothelial cell growth medium (Clonetics Corp., San Diego, California, USA) on a dish coated with type 1 collagen (Iwalo, Japan)
  • the cells were cultured at 37 ° C and maintained by changing the medium every 2-3 days. Cells from passage 4 to 5 were used in the experiment.
  • Fig. 1A and Fig. 1B Treatment of human aortic endothelial cells (HAo EC) with VEGF, bFGF, or PDGF-BB increased DNA synthesis 3 to 10-fold compared to untreated controls.
  • HAo EC human aortic endothelial cells
  • FIGS. 1A and 1B show the effect of sephrin 2 on DNA synthesis induced by VEGF, bFGF, or PDGF-BB in HAo EC ( Figure 1A) and H UVEC ( Figure 1B), respectively. Symbols in the figure indicate C: control (untreated), B 2 ⁇ s ephrin B 2 treatment, and B 4: s E ph B 4 treatment, respectively.
  • a vessel was defined as an elongated structure composed of one or more endothelial cells exceeding a length of 100 ⁇ .
  • Five independent fields separated by the optical division of ⁇ were evaluated for each tool, and the average number of tubes per 20 mm field was measured. Cytotoxicity was assessed using Cell Proliferation Kit II purchased from ⁇ oehringer Mannheim.
  • 7 days after treatment with either control (untreated), 's ephrin B 2 or s E ph B 4 or both s ephrin B 2 and s E ph B4, V The morphology of endothelial cells stimulated by EGF was observed. '
  • Figure 1C shows V 'EGF-stimulated endothelium with control (untreated), treatment with either sephrin B2 or sEphB4, and treatment with both sephrin B2 and sEphB4 It is a photograph which shows the state of the 7th day of cell angiogenesis. VEGF-induced angiogenesis was reduced in the sephrin B2-treated group on day 7 compared to controls ( Figure 1C). Conversely, VEGF-induced angiogenesis was not affected by s Ep hB 4 treatment.
  • ephrin B 2 was found to be able to inhibit EC DNA synthesis induced by various stimuli including VEGF, b FGF, and PDGF.
  • the exact mechanism of ephrin B 2 is not clear, but the decrease in DNA synthesis was not caused by apoptosis because there was no significant apoptotic cell according to the assessment of cell toxicity. Seem. It is surprising that DNA synthesis is inhibited in both venous and arterial endothelial cells. This is because the receptor for Ephrin B 2 (E phB 4) is a marker for venous endothelial cells, but arterial endothelial cells are not known to have this receptor.
  • ephrin B 2 is also VE Can inhibit EC angiogenesis induced by GF
  • ERK (p 4 2/44) in endothelial cells stimulated with VEGF or b FGF on the mechanism by which ephrin B 2 inhibits the mitogenic response induced by VE F or b FGF against endothelial cells!
  • the effect of ephrin B 2 on acidification was examined by Western analysis.
  • EGM_DME EGM_DME
  • M containing 3% FBS
  • 10 ng / mL bFGF or 10 ng / mL VEGF Preparation of protein samples from endothelial cells and Western blotting were performed as follows. Whole cell lysates, cytosolic extracts, or nuclear extracts were isolated from endothelial cells. Western blotting was performed with and without immunoprecipitation.
  • Protein samples were separated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and then transferred to a 2-trosenorelose membrane by electroporation. After blocking with skim ⁇ / c, blots at 4 ° C with phosphotyrosine or KDR, f-body against (s c-504) (purchased from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, California, USA)) ⁇ Incubated (1: 500). After washing, the membrane was incubated with a horseradish peroxidase-labeled secondary antibody (Bio-Rad, Richmond, California, USA) (1: 3000) for 1 hour at room temperature. Visualization was performed using an Amersham enhanced chemiluminescence (ECL) detection system according to the manufacturer's instructions.
  • ECL Amersham enhanced chemiluminescence
  • Figure 2A is an electrophoretogram showing the effect of ephrin B2 on ERK phosphorylation in HAo EC stimulated with VEGF or bFGF (p44 / p42) Total EK: pp 44 / pp 42: phosphorylated ERK).
  • ERK phosphorylation was increased by treatment with 10 ⁇ g / mL VEGF or 25 ng / mL bFGF.
  • Ephrin B 2 inhibited both £ 0-induced £ 11: Phosphorylation and bFGF-induced ERK phosphorylation.
  • VEGF-induced ERK phosphorylation For example, 200 ng / mL 'sephrin B 2 inhibited VEGF-induced ERK phosphorylation by 70%.
  • ephrin B 2 inhibited ERK phosphorylation in HA o EC by VEGF stimulation and bF GF stimulation.
  • VEGF receptor 2 VEGF receptor 2
  • ECs were left for 1 hour in the presence or absence of 50 ng Zm L of s'furin B 2 in EGM-DMEM (containing 3% FCS) (Nac al tesque, Japan). Furthermore, it was treated with 10 ng / mL VEGF for 5 minutes (the control was not treated).
  • the receptor (KDR) was immunoprecipitated (IP) from the cell lysate and then plotted with an anti-phosphate tyrosine antibody (PY20).
  • IP immunoprecipitated
  • FIG. 2B is an electrophoretogram showing the effect of ephrin B 2 on VEGF receptor 2 (KDR) autophosphorylation in VEGF-stimulated HAo EC.
  • KDR VEGF receptor 2
  • FIG. 2B shows that ephrin B2 force has no significant effect on autophosphorylation of VEGF receptor 1-2 in VEGF-stimulated HAo EC.
  • VEGF receptor 2 autophosphorylation was increased 14-fold at 10 ng / mL VEGF.
  • sEphrin B 2 did not inhibit VE GF receptor 2 autophosphate.
  • Ephrin B 2 force inhibits ERK phosphorylation induced by VEGF or bFGF in endothelial cells (arteries and veins). This effect may probably explain, at least in part, the activity of ephrin B2 to inhibit the proliferation of these cells induced by VEGF or bFGF. But Ephrin B 2 does not inhibit autophosphorylation of VEGF receptor 2. Thus, ephrin B2 is considered to not interfere with signaling between VEGF and VEGF receptor 2 as a mechanism for inhibiting VEGF function. (Example 3: Inhibition of angiogenesis induced by bFGF by simultaneous administration of ephrin B 2 in the mouse cornea)
  • b FGF Basic FGF
  • Kenyon, BM, et al. (1996) Ophthalmol. Vis. Sbi., 37 ⁇ , No. 8, pp. 1625-1632, essentially quantifying corneal pocket assembly and corneal angiogenesis in mice. This was done with some modifications. Briefly, 90 ng of human bF GF: 0.3 ⁇ L of Hydron pellets (IFN Sciences, New Brunswick, New Jersey, USA) was prepared and transplanted into the cornea of male BALB mice. sEphrin B 2 or s E ph B 4 (lOOngZ pellet) was added directly to the bF GF / Hydron solution. The pellet was placed 1.0 awake from the limbus. After transplantation, ofloxacin Z ophthalmic solution was applied to each eye.
  • Hydron pellets IFN Sciences, New Brunswick, New Jersey, USA
  • FIG. 3 shows the results of quantitative analysis of angiogenesis in the cornea of mice co-administered with bFGF and ephrinB2.
  • the vertical axis in Fig. 3 is the value of the area of the area with angiogenesis.
  • Example 4 Effect of Ephrin B 2 on Oxygen-induced Retinal Angiogenesis
  • an oxygen-induced retinopathy (OIR) model was prepared as follows. Seven days after birth (P7) mice and their mothers were placed in a box with 75% hyperoxia for 5 days. On the 12th day after birth (P 12), 5 days after the hyperoxia, these mice were returned to normal 20% oxygen concentration and observed for subsequent retinal vascular responses. Mice treated with these treatments showed extensive development of retinal neovascularization. Retinal neovascularization occurred in 100% of animals by P 19. In P 19, the neovascular bundle is obvious, especially in the middle and peripheral parts, extending from the inner limiting membrane to the vitreous.
  • mice were deeply anesthetized and 0.03 mL of 50 mg ZmL solution per lg body weight of 2 ⁇ 10 6 molecular weight fluorescein dextran (Sigma) was perfused into the left ventricle.
  • the eyes were removed and fixed in 4% paraformaldehyde for at least 3 hours.
  • the cornea and lens were then removed, the surrounding retina was dissected and flat mounted on a microscope slide for examination under a fluorescence microscope.
  • Fig. 4 Fluorescence micrographs of flat-mounted fluorescein-dextran perfused retinas of control and sephrin-B treated model nore are shown in Fig. 4 (A: control mouth OIR model; B: s Ephrin B treatment model-). s Ephrin B treatment is clearly white from the center to the periphery of the flat-mounted retina (Fig. 4B). This indicates that there are normal blood vessels in the retina that can be perfused with fluorescein-dextran. In the ephrin-B treatment model, the presence of relatively normal blood vessels was observed in comparison with the OIR model (04A).
  • FIG. 5 is a graph showing the area ratio of the non-perfused area of the sephrin B2 treatment model (01 scale + ephrin; 62) versus the control model (OIR).
  • Fig. 6 is a SEM photograph showing the retinal surface of a P 1 7 newborn mouse in the control model (OIR) (A) and s ephrin B 2 treatment model (OI R + ephrin B 2) (B) (retina from the vitreous side). ) In the photograph of the control model in Fig.
  • sEphrin B 2 goes out of the retina (in this example, it expands against the vitreous). It not only suppresses pathological angiogenesis but also enhances the formation of vascular networks and vascular maturation in the retina. obtain. Such an effect may be optimal for the treatment of diabetic retinopathy.
  • Example 5 Antiangiogenic effect of human chemical furin B 2
  • a fusion protein of ephrin B2 derived from a human DNA library and human Fc- was prepared, and its angiogenesis inhibitory effect was evaluated.
  • the human ephrin B 2 cDNA fragment was fused to the 5 ′ end of cDNA encoding the Fc portion of human IgGl antibody.
  • the distribution IJ of this human ephrin B 2 cDNA was based on US Pat. No. 6,303,769 or Mol Immunol. 1995 Nov; 32 ′ (16): 1197-205.
  • Fc was cloned as follows.
  • a human spleen cDNA library (100 ng) is used as a saddle, forward primer: GAA GAT CTC CCA AAT CTT GTG ACA AAA C TC (SEQ ID NO: 1) and reverse primer: GCG GCC GCT CAT TTA CCC GGA GA (sequence) No. 2) and PCR was performed using KODplus (T0Y0B0).
  • the amplified DNA fragment of about 700 bp was purified, and the purified DNA fragment was subcloned into a Teasy vector (Promega) to confirm that it was human IgGlFc.
  • Human ephrin B 2 was cloned as follows. Human placenta cDNA library (100 ng) as a saddle type, forward primer: GCG AAG CTT ACC ATG GC T GTG AGA AGG GAC (SEQ ID NO: 3) and reverse primer: GCG AGA TCT GGC CA PCR was performed using C TTC GGA ACC GAG GAT '(SEQ ID NO: 4) and KODplus (T0Y0B0). The amplified DNA fragment of about 680 bp was purified.
  • the 5 'end of the cloned EFN-B2 DNA fragment was treated with HindIII, the 3' end with Bglll restriction enzyme, the 5 'end of the Fc DNA fragment with BglII, and the 3' end with Notl restriction enzyme. These fragments were subjected to three-party ligation using the mammalian expression vector pcDNA4-Myc-His A (Invitrogen) treated with Hindlll and Notl restriction enzymes and DNA Ligation kit ver. 2.1 (TAKARA). .
  • the vector obtained by ligation was transformed into E. coli XL21.
  • the plasmid was purified from the grown Escherichia coli colonies, and the nucleotide sequence was confirmed. As a result, it was human EFN-B2 (l-678bp) -Fc. '
  • This plasmid was introduced into HEK293 cells and cultured under the following culture conditions.
  • the medium used was DMEM (SIGMA) and 10% FBS (Biowest Fetal Bovine Serum) supplemented with an antibiotic (GIBC0 1% penicillin + 1% streptomycin). And cultured for 3 days at 37 ° C for at 5% C0 2 I Nkyubeta within one.
  • Ephrin B2 stable expression strains were obtained by gene transfer by phosphate method and drug selection by Zeocin 250 g / mL (invivogen). When collecting the culture supernatant from the stable expression strain, it was cultured in GIT medium (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.).
  • the expressed protein was purified from the ephrin B2_Fc stable expression strain as follows.
  • FIG. 7 shows the ratio (%) with respect to the case without bF GF and ephrin B 2 treatment (the leftmost column in the figure).
  • CNV laser-induced choroidal neovascularization
  • CNV choroidal neovascularization
  • Experimental C NV was induced by photocoagulation using a multicolor laser (Novus Omni Laser; Lumenis, Santa Clara, Calif) at the posterior pole of the fundus of the monkey eye.
  • the spot size was 100 / zm in diameter and the irradiation time was 0.1 seconds.
  • the output at the corneal surface was 700 mW.
  • the intravitreal administration of the human ephrin B 2-human Fc synthetic protein prepared in Example 5 was performed twice immediately after laser irradiation and five days after irradiation. Efre in the vitreous A PBS solution adjusted to have B2 concentrations of lng / mL, 10 ng / raL, and lOOng / mL was injected into the eye from the flat portion of the ciliary body using a 27G needle in an amount of 0.1 lmL each. As a negative control, 0.1 ml of PBS was injected. As a positive control, lOng / mL and lOOng / mL of the above mouse ephrin B2-human Fc chimeric protein were used.
  • a fluoroscopic angiography was performed to evaluate choroidal neovascularization.
  • 0. lmL / kg of 5% fluorescein Na was administered intravenously, and fluorescence fundus photography was performed with a fundus force mela (TRC-50EX, Topcon Co., Ltd.).
  • Increased permeability of choroidal neovascularization was evaluated for fluorescent fundus photographs 5 to 6 minutes after the start of injection.
  • the photographic evaluation was performed by a skilled ophthalmologist. Except for the three eyes that could not be evaluated due to the opacity of the intermediate translucent body, lesions with markedly increased permeability of the fluorescent dye were determined to be active for each laser spot.
  • Fig. 8 is a fluorescence photograph of the fundus oculi subjected to the following processes.
  • Fig. 8A shows the results of treatment with 10 ng / mL of hetefrin B 2
  • Fig. 8 B shows the results of negative control '(P B S treatment)
  • Fig. 8 C shows the results of treatment with lOng / mL of mouse ephrin B 2.
  • human ephrin B 2 -human Fc synthetic protein inhibits neovascularization in a laser-induced CNV model ⁇ .
  • concentration in the vitreous was effective at 10 ng / mL.
  • Ephrin B 2 is expressed in the pigment epithelium that has migrated in the laser model (data not shown). Therefore, it was speculated that vascularization of new blood vessels would be stopped by the expression of ephrin B 2 force S and pigment epithelium.
  • the results of this example demonstrated the effect of ephrin B 2 on inhibiting neovascularization.
  • compositions and methods of the present invention are useful for the treatment of diseases or disorders associated with angiogenesis or angiogenesis.
  • the composition and method of the present invention can suppress pathological angiogenesis and angiogenesis outside the retina without suppressing physiological blood flow in the retina.
  • the composition method of the present invention provides AMD and diabetic retinas as compared to current therapies as proposed by injection of PDT and various anti-angiogenic agents (eg, anti-VEGF agents). It can be used with particular advantage in the treatment of ophthalmic diseases associated with angiogenesis or angiogenesis such as infectious diseases.

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Abstract

血管形成または血管新生を抑制する方法および組成物、ならびに血管形成または血管新生に関連する疾患または障害の処置に有用である方法および組成物を提供する。本発明の組成物は、有効量のエフリンＢ２を含み、そして本発明の方法は、有効量のエフリンＢ２を投与する工程を含む。本発明の組成物および方法は、血管形成または血管新生に関連する疾患または障害の処置に有用である。本発明の組成物および方法はまた、網膜からの血管新生を抑制し得る。

Description

明細書
エフリン B 2を用いる血管新生の抑制方法
技術分野
本発明は、 血管形成または血管新生を抑制する方法および組成物に関し、 そし てより特定するとその方法および組成物におけるエフリン B 2の使用に関する。 背景技術
血管形成は、 加齢黄斑変性症、 糖尿病性網膜症、 および未熟児網膜症のような 種々の眼病理症状の顕著な特徴である。 血管形成カスケードは、 多くのメデイエ ータおよぴケモカインによって引き起こされる。 '例えば、 多段階血管形成プロセ スに関連する内皮細胞受容体チロシンキナーゼ （RTK) は、 血管形成の重要な メディエータとして認識されている。 最初に、 血管内皮細胞増殖因子 （VEG' F) を含む血管形成サイ ト力インが生成し、 これは、 毛細血管の発生の概念によ く当てはまる事象である。 近年、 アンジォポェチン ZT 1 e 2系が、 血管ァセン プリおよび成熟を媒介するリガンドーレセプター系として同定されている。 また、 VEGFZVEGFレセプターおょぴアンジォポェチン ZT i e 2ファミリーも RTKに属する。
エフリンのレセプターである E p hレセプターは、 8つの E p h Aレセプター および 6つの E p h Bレセプターからなり、 チロシンキナーゼレセプターの最大 のファミ リーを含む。 この E ρ hレセプターチ口シンキナーゼファミ リ一は RT Kの新しいクラスを表す。 このファミリ一は、 元来、 神経経路開拓分子として同 定されているが、 その血管形成における役割は不明である。 ノックアウトマウス および成熟エフリン B 2— 1 a c Z トランスジエニックマウス実験では、 E p h Bレセプターおよびエフリン Bリガンドが、 動静脈分化および境界形成を編成す る血管アセンブリの重要なレギュレーターとして同定されている （非特許文献 2、 3、 5) 。 一方、 遺伝子ターゲティング実験では、 エフリン B 2が、 動脈内皮細 胞の初期マーカ一であり'、 そのレセプターである E p h B 4が脊椎動物胚におい ては静脈内皮細胞のマーカーであることが明らかにされている （非特許文献 1、 2、 4、 6 ) 。 さらに、 成人における内皮細胞は、 その非対称的動静脈発現パタ ーンを維持し、 これは、 エフリン B / E p h B系が、 血管ホメォスタシスを制御 する役割をし、 そして成人において病理学的血管形成を制御する可能性を有する ことを示唆している （非特許文献 3、 5 ) 。 E p hレセプターのアンタゴニス ト (例えば、 抗体） の投与により主とし T癌の血管新生を阻害し、 一方ァゴニス ト の投与により血管新生を刺激することも報告されている （特許文献 1 ) 。 したが つて、 エフリンの作用の態様を決定すること、 ならびに特に病理学的状態におい て血管系を操作するためにこれらの分子を使用し得る手段が所望される。
糖尿病性網膜症は、 米国において 2 0〜6 5歳の人の失明の主要な原因である。 糖尿病性網膜症の必須の病態は、 網膜の微小血管症およびそれに続く虚血である。 網膜症における低酸素状態が網 血管新生を導くことは、 周知である。 しかし、 網膜血管新生により新規に形成された脈管では、 血流が灌流せず、 網膜は虚血状 態となる。 なぜなら、 これらの脈管は未熟でかつ漏出性であるからである。 さら に、 これらの脈管は、 しばしば、 硝子体眼房に貫通する。 糖尿病性網膜症の理想 の治療は、 このような伸展の方向性の間違った血管の新生を抑制し、 そして虚血 網膜を灌流し、 かつ低酸素症から救助し得る成熟した脈管を得ることである。 、 加齢黄斑変性症は、 欧米の成人失明原因の第一位で、 日本でも三大原因の一つ である。 黄斑に脈絡膜から新生血管の進入が起こることが病態の本質であり、 こ の異常な新生血管からの出血、 網膜剥離などにより、 社会的失明にいたる。 した がって、 この異常な新生血管の発生を抑制することは、 視機能の維持に本質的な 治療法である。 新生血管の伸展は、 色素上皮が新生血管を覆うことにより抑制さ れることが公知であるが、 その作用機構はまだよく知られていない。
参考文献
以下の文献は， 参考文献として本出願に取り込まれる。 特許文献 1 米国特許出願公開第 2004/0 1 36 983号明細書 非特許文献 1 Adams, R.H.ら， （2001) Cell, 104卷， 1号， 57 - 69頁 非特許文献 2 Adams, R.H.ら， （1999) Genes Dev., 13卷， 3号， 295 - 306 頁
非特許文献 3 Gale, N.W.ら， （2001) Dev. Biol.， 230卷， 2号， 151-160 頁
非特許文献 4 Gerety, S.S.ら （1999) ol. Cell, 4卷， 3号， 403-414 頁 ' .
非特許文献 5 A Shm, D.ら， （2001) Dev. Biol. , 230卷， 2号， 139 - 150 頁 ，
非特許文献 6 Wang, H.U.ら， （1998) Cell, 93卷， 5号， 741-753頁 発明の開示 ' 発明が解決しょうとする課題 .
本発明は、 血管形成または血管新生を抑制する方法， 組成物及び予防♦治療剤 を提供することを目的とする。 本発明は、 血管形成または血管新生に関連する疾 患または障害の処置に有用である方法， 組成物及び予防 ·治療剤を提供すること を目的とする。 ，
課題を解決するための手段
本発明は、 動脈内皮細胞 （または静脈内皮細胞） における DN A合成を阻害す る方法を提供し、 当該方法は、 動脈内皮細胞 （または静脈内皮細胞） を有効量の エフリン B 2と接触させる工程を含む。
一つの実施形態では、 上記 DN A合成は、 血管内皮細胞増殖因子 （VEGF) 、 塩基性繊維芽細胞増殖因子 （b FGF) 、 または血小板由来増殖因子 （PDG F) によって誘導される。
本発明はまた、 動脈内皮細胞 （または静脈内皮細胞） における p 44 p 42
MAPキナーゼ活性化を阻害する方法を提供し、 当該方法は、 動脈内皮細胞 (または静脈内皮細胞） -を有効量のエフリン B 2と接触させる工程を含む。
一つの実施形態では、 上記 p 44 p 4 2 MA Pキナーゼ活性化は、 V E G F、 b FGF、 または PDGFによって誘導される。
本発明はまた、 動脈内皮細胞 （または静脈内皮'細胞） からの脈管形成を阻害す る方法を提供し、 当該方毕は、 動脈内皮細胞 （または静脈内皮細胞） を有効量の エフリン B 2と接触させる工程を含む。
一つの実施形態では、 上記脈管形成ば、 VEGF、 b FGF、 または PDGF によって誘導される。 '
一つの実施形態では、 上記接触工程は、 上記エフリン B 2を、 上記動脈内皮細 胞 （または静脈内皮細胞） を有する哺乳動物に投与することにより行われる。
本発明はまた、 網膜からの血管新生を抑制する方法を提供し、 当該方法は、 有 効量のエフリン B 2を個体に投与する工程を含む。 ' 一つの実施形態では、 上記個体は、 網膜外に病的な血管形成または血管新生を 有するか、 または生じる可能性がある個体である。 '
本発明はまた、 血管形成または血管新生に関連する疾患または障害の処置方法 を提供し、 当該方法は、 該処置の必要のある個体に有効量のエフリン B 2を投与 する工程を含む。 ,
本発明はまた、 有効量のエフリン B 2を含む、 動脈内皮細胞 （または静脈内皮 細胞） の DNA合成を阻害するための組成物を提供する。
本発明はまた、 有効量のエフリン B 2を含む、 動脈内皮細胞 （または静脈内皮 細胞） の p 44Zp 42 MAPキナーゼ活性化を阻害するための組成物を提供 する。
本発明はまた、 有効量のエフリン B 2を含む、 動脈内皮細胞 （または静脈内皮 細胞） 力 らの脈管形成を阻害するための組成物を提供する。
本発明はまた、 有効量のエフリン B 2を含む、 網膜からの血管新生を抑制する ための組成物を提供する。 本発明はまた、 有効量'のエフリン B 2を含む、 血管形成または血管新生に関連 する疾患または障害の処置のための薬学的組成物を提供する。
本発明はまた、 有効量のエフリン B 2を含む、 動脈内皮細胞 （または静脈内皮 細胞） の D N A合成阻害剤を提供する。 '
本発明はまた、 有効量のエフリン B 2を含む、 動脈内皮細胞 （または静脈内皮 細胞） の p 4 4 Z p 4 2 MA Pキナーゼ活性化阻害剤を提供する。
本発明はまた、 有効量のエフリン B 2を含む、 動脈内皮細胞 （または静脈内皮 細胞） からの脈管形成阻害剤を提供する。
本発明はまた、 有効量のエフリン B 2を含む、 網膜血管新生抑制剤を提供する。 本発明はまた、 有効量のエフリン B 2を含む、 血管形成または血管新生に関連 する疾患または障害の治療剤を提供する。
一つの実施形態では、 上記方法、 組成物、 ならびに阻害剤、 抑制剤、 および予' 防 '治療剤において、 上記エフリン B 2は、 天然のエフリン B 2の細胞外ドメイ ンを含むが、 細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインを含まない。
別の実施形態では、 上記方法、 組成物、 ならびに阻害剤、 抑制剤、 および予 防 ·治療剤において、 上記疾患または障害は、 加齢黄斑変性症、 虚血性網膜症、 眼内血管新生、 角膜血管新生、 網膜血管新生、 脈絡膜血管新 、 糖尿病性黄斑浮 腫、 糖尿病性網膜虚血、 糖尿病性網膜浮腫、 糖尿病性網膜症、 癌、 慢性関節リ、ゥ マチ、 子宮内膜症、 および脱毛症からなる群から選択される。
さらに別の実施形態では、 上記方法、 組成物、 ならびに阻害剤、 抑制剤、 およ び予防 ·治療剤において、 上記疾患または障害は、 加齢黄斑変性症、 虚血性網膜 症、 眼内血管新生、 角膜血管新生、 網膜血管新生、 脈絡膜血管新生、 糖尿病性黄 斑浮腫、 糖尿病性網膜虚血、 糖尿病性網膜浮腫、 および糖尿病性網膜症からなる 群から選択される。 発明の効果 本発明によれば、 血管'形成または血管新生を抑制する方法および組成物が提供 される。 本発明の組成物および方法は、 生理的な血流を抑えることなく、 病的な 血管形成または血管新生を抑制し得る。 本発明の組成物および方法は、 正常な血 管に影響を及ぼすことがないため、 血管形成または血管新生に関連する疾患また は障害の処置に有用である。 図面の簡単な説明
図 1Aは、 VEGF、' b FGF、 または P D G F— B Bを処理した H A o E C におけるエフリン B 2処理および Ep hB4処理によるチミジン取り込みの影響 を表すグラフである。 '
図 1 Bは、 VEGF、 b FGF、 または P D G F _ B Bを処理した HU V E C におけるエフリン B 2処理および E p h B 4処理によるチミジン取り込みの影響 を表すグラフである。 、
図 1 Cは、 コントローノレ （未処理） 、 sエフリン B 2または s E p h B 4のい ずれかでの処理、 または sエフリン B 2と s E p h B 4との両方の処理を行って から 7日後の V EG F刺激した内皮細胞の形態を示す写真である。
図 2 Aは、 VEGFまたは b FGFで刺激した HAo ECにおける ERKリン 酸化に対するエフリン B 2の効果を示す電気泳動写真である。 、 図 2 Bは、 VEGF刺激した HAo ECにおける VEGFレセプター 2 (KD R) 自動リン酸化に对するエフリン B 2の効果を示す電気泳動写真である。
図 3は、 b FGFとエフリン B 2とを同時投与したマウス角膜における血管新 生の定量分析の結果を示すグラフである。
図 4は、 コントロール （A) および sエフリン B処理モデル （B) のフラット マウントしたフルォレセイン一デキストラン灌流網膜の形態を示す蛍光顕微鏡写 真である。
図 5は、 コントロールモデル （O I R) および sエフリン B 2処理モデル （O I R+エフリン B 2) の 灌流領域面積比を示すグラフである。
図 6は、 コントロールモデル （O I R) (A) および sエフリン B 2処理モデ ル （011 +ェフリン：62) (B) の P 17新生児マウスの網膜表面の形態を示 す走査型電子顕微鏡写真である。 '
図 7は、 b FGF処理による HUVECにおいて、 マウスエフリン B 2処理お よびヒ トェフリン B 2処理によるチミジン取り込みの影響を表すグラフである。 図 8は、 10ng/mLのヒ トエフリン B 2処理 （A) 、 PBS処理 （B) 、 および 10 ng/mLのマウスエフリン B 2処理 （C) を施した眼底の状態を示す蛍光写真である。 発明を実施するための最良の形態 '
エフリン B 2/Ep hB4系は、 脈管形成および血管形成に重要な役割を果た す。 本発明は、 エフリン B 2力 内皮細胞 （EC) の DNA合成、 ならびに VE' GFおよび b FGFの両方で誘導される p 44/p 42 MAPキナーゼ活性化 を抑制することを見い出したことに基づく。 エフリン B 2はまた、 ECによる脈 管形成も阻害する。 さらに、 マウスにおける角膜のマイクロポケットアツセィぉ ょぴ角膜血管新生の定量によれば、 エフリン B 2は、 b FGFで誘導された角膜 血管形成を抑制する。 そのため、 エフリン B 2/E p h B 4およびその抗血管形 成シグナリング経路をターゲティングすることにより、 血管形成依存的疾患を治 療し得る。
さらに詳細に本発明を説明する前に、 本明細書で使用される用語を、 他に指示 がない限り以下のように定義する。
(定義）
用語 「エフリン B 2」 とは、 他に指定がない限り、 （1) 天然のエフリン B 2 またはその細胞外ドメイン、 好ましくは天然のヒ トエフリン B 2と、 実質的な配 列類似性を有し；そして （2) 天然のエフリン B 2または細胞外ドメインが関与 する生物学的活性を有する、 ポリペプチドをいう。 用語 「エフリン B 2」 には、 天然のエフリン B 2 ( ましくは天然のヒ トエフリン B 2 ) およびその細胞外ド メイン、 ならびに上記天然のエフリン B 2または細胞外ドメインの生物学的活性 を有するそれらのアナログおよぴ改変体が含まれる。 なお、 エフリン B 2の配列 は、 当該分野で公知であり、 当業者は細胞外ドメイン、 膜貫通ドメイン、 および 細胞質ドメィンの配列および位置を十分に認識できる。
天然のエフリン B 2のような 「天然の」 分子は、 人工的な介入なく天然に存在 する分子である。 しかし、 天然のエフリン B 2はまた、 人工的な介入なく存在す るエフリン B 2の細胞外ドメインであり得る。
「全長」 エフリン B 2は、 細胞外おょぴ細胞内の両方のドメインを含むエフリ ン B 2である。 全長エフリン B 2は、 天然に存在し得、 あるいは天然のエフリン B 2のアナログまたは改変体であり得る。
天然の分子と 「実質的な配列類似性」 を有するポリペプチドは、 天然の分子と アミノ酸レベルで少なくとも約 3 0 %同一である。 ポリペプチドは、 好ましくは、 天然の分子とアミノ酸レベルで少なくとも約 4 0 %、 5 0 %、 6 0 %、 7 0 %、 8 0 %、 8 5 %、 9 0 %、 9 5 %、 およびなお好ましくは少なくとも約 9 8 %同 一、 さらに好ましくは約 9 9 %同一、 よりさらに好ましくは 1 0 0 %同一である。 天然の分子とのアナログまたは改変体の用語 「パーセント同一性」，または 「％ 同一性」 とは、 2つの配列をァラインした場合に、 アナログまたは改変体におい ても見られる天然分子におけるアミノ酸配列のパーセ,ントをいう。 パーセント同 —性は、 LALIGN、 ClustalW、 または BLASTのような当該技術分野で確立された任意 の方法またはアルゴリズムによって決定され得る。
ポリペプチドは、 天然のエフリン B 2に対するレセプターに結合し得る場合、 あるいは E Cの D N A合成、 E Cにおける細胞外シグナル制御キナ一ゼ （E R K) リン酸化、 E C脈管形成、 血管形成、 または血管新生を阻害し得る場合、 天 然のエフリン B 2が関与する 「生物学的活性」 を有する。 E CのD N A合成、 E Cにおける E R Kリン酸化、 E C脈管形成、 血管形成、 または血管新生を阻害す る活性は、 例えば、 本明'細書に記載のように、 当業者に公知の任意の方法によつ て決定され得る。
「有効量」 とは、 所望の目的を達成するに十分な物質の量である。 例えば、 D N A合成を阻害するためのエフリン B 2の有効量は、 インビボまたはインビトロ の場合に応じて、 D N A合成の量を減少させるに十分な量である。 疾患または障 害を処置するためのエフリン B 2の有効量は、 疾患または障害の徴候を低減また は除去するか、 または疾患または障害を予防または遅延させるに十分なエフリン B 2の量である。 所定の物質の有効量は、 物質の性質、 投与経路、 物質を受容す る動物のサイズおよび種、 ならびに物質を与える目的などの因子で変動する。 各 場合の有効量は、 当該技術分野で確立された方法に従って、 当業者によって経験 的に決定され得る。
用語 「個体」 とは、 任意の動物をいい、 好ましくはヒトまたはヒ ト以外の哺乳 動物であり、 より好ましくは、 マウス、 ラット、 他のげつ歯類、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 または霊長類、 さらに好ましくは、 ヒトをいう。
「病的な血管形成または血管新生」 は、 生理学的に正常な状態でない血管の形 成または新生であり得る。 このような血管は、 未熟であり、 漏出性であるため、 血液を灌流し得ないような血管となり得る。 また、 「病的な血管形成または血管 新生」 とは、 生理学的に正常な状態とは異なる様式での血管形成または新生であ り得る。 例えば、 炎症などの刺激を受けることにより、 新たに血管が形成される ことをも意味する。
「病的な血管形成または血管新生を有するか、 または生じる可能性がある個 体」 とは、 上記のような血管形成または血管新生が既に生じている個体、 あるい はそのような血管形成または血管新生を生じる要因を有し得る個体をいう。 後者 の個体は、 「病的な血管形成または血管新生」 を生じるという徴候を示し得る疾 患または障害に罹患しているがまだそのような徴候を示していない個体、 「病的 な血管形成または血管新生」 を生じるような刺激を受けた個体などであり得る。 「病的な血管形成また Ίま血管新生」 は 「網膜内」 または 「網膜外」 に生じ得る。 「網膜外」 とは、 網膜の組織外部をいう。 このような血管形成または血管新生に は、 例えば、 網膜から内境界膜を貫通して硝子体内に向かう血管の形成または新 生、 および網膜から脈絡膜へと向かう血管の形成または新生がある。
用語 「血管形成または血管新生に関連する疾患または障害」 は、 上記の 「病的 な血管形成または血管新生」 を生じるか、 または 「病的な血管形成または血管新 生」 に起因して個体に変調をきたす、 いかなる疾患または障害をも指す。 このよ うな疾患または障害としては、 加齢黄斑変 'f*症、 虚血性網膜症、 眼内血管新生、 角膜血管新生、 網膜血管新生、 脈絡膜血管新生、 糖尿病性黄斑浮腫、 糖尿病性網 膜虚血、 糖尿病性網膜浮腫、 糖尿病性網膜症、 癌、 慢性関節リウマチ、 子宮内膜 症、 および脱毛症が挙げられるが、 これらに限定されない。
疾患または障害の 「処置」 とは、 疾患または障害の徴候の低減または完全な除 去 （ 「治療」 ともいう） 、 または疾患または障害の発症を予防または遅延させる ことをいう。
用語 「処置の必要がある」 とは、 個体が処置の利益を得るとの、 治療奉仕者 (例えば、 ヒ トに対しては、 医師、 看護士、 臨床看護士など；動物 （非ヒ ト哺乳 動物を含む） のに対しては、 獣医） によりなされる判断をいう。 この判断は、 種々の要因に基づいてなされ、 これらの要因は、 治療奉仕者の意見の領域内にあ るが、 任意の組成物により処置可能である状態の結果として、 その個体が現在病 気であるかまたは将来的に病気になり得るとの認識を含む。
用語 「組成物」 は、 少なくとも 1つの活性成分を含み、 そしてこの組成物が適 用または投与される対象の細胞、 組織、 器官または動物 （好ましくは、 哺乳動物、 より好ましくは、 マウス、 ラット、 他のげつ歯類、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 または霊長類、 さらに好ましくは、 ヒ ト） において、 当該活性成分 の有する効果を発揮させることを目的とする物質の組み合わせをいう。 当業者は、 活性成分が、 当業者の必要性に基づいて所望とされる効果的な結果を有するか否 かを決定するために適切 技術を理解し認識する。
「薬学的組成物」 は、 少なくとも 1つの活性成分を含み、 そして動物、 好まし くは、 哺乳動物、 より好ましくは、 マウス、 'ラット、 他のげつ歯類、 ゥサギ、 ィ ヌ、 ネコ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 または霊長類、 さらに好ましくは、 ヒトにおいて、 当該活性成分の有する薬学的効果を発揮させることを目的とする物質の組み合わ せをいう。 当業者は、 活性成分が、 当業者の必要性に基づいて所望とされる効果 的な結果を有するか否かを決定するために適切な技術を理解し認識する。
用語 「阻害剤」 、 「抑制剤」 、 および 「予防 ·治療剤」 は、 少なくとも 1つの 活性成分が、 当該活性成分の有する効果を発揮するための適用または投与に適し た形態に調製されたものをいう。 これらは、 この組成物が適用または投与される 対象の細胞、 組織、 器官または動物 （好ましくは、 哺乳動物、 より好ましくは、 マウス、 ラット、 他のげつ歯類、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 また' は霊長類、 さらに好ましくは、 ヒト） において、 活性成分の有する効果を発揮し 得る。 '
(内皮細胞に対するエフリン B 2の効果）
内皮細胞は、 VEGF、 b FGF、 または PDGF— BB (?00 の：6サブ ユニット二量体） のような増殖因子に応じて、 増殖が誘導され得る。 動脈内皮細 胞 （または静脈内皮細胞） において、 エフリン B 2は、 VEGF、 b FGF、 ま たは PDGF— B Bのすベての刺激によって誘導された DNA合成を阻害する。 例えば、 図 1 Aに示すように、 1 0 n g/mLの VEGF、 b FGF、 または P DGF— BBによって誘導された DNA合成の増加量は、 20 0 n g/mLのェ フリン B 2によってそれぞれ 4◦%、 3 0%、 および 90%阻害される。 あるい は、 ヒト臍帯静脈内皮細胞 （HUVEC) においても、 ほとんど同一の結果が得 られる （図 1 B参照） 。 エフリン B 2による DNA合成の阻害は、 アポトーシス によって引き起こされるのではない。 このように、 エフリン B 2は、 VEGF、 b FGF、 および PDGFを含む 種々の刺激によって誘導される ECの DN A合成を阻害し得る。 エフリン B 2の レセプター （E p hB4) は、 静脈内皮細胞のマーカーであるが、 このレセプタ 一が動脈内皮細胞に存在することが知られていないにもかかわらず、 DNA合成 は静脈内皮細胞おょぴ動脈内皮細胞の両方で阻害される。
なお、 VEGF誘導脈管形成は、 E p hB 4処理によって影響を受けない。
エフリン B 2は、 増殖因子誘導有糸***応答を阻害する。 これは、 エフリン B 2が、 動脈および静脈の両方の内皮細胞において、 VEGFおよび b FGFの両 方で誘導した ERK (p 42/44) リン酸化を抑制することによる。 しかし、 エフリン B 2は、 VEGFレセプター 2自動リジ酸化を阻害せず、 これは、 VE GF機能を阻害するためのメカニズムのように、 VEGFと VEGFレセプター 2との間のシグナル伝達を妨害しないことを示す。 したがって、 エフリン B 2は、 動脈または静脈のいずれかの内 細胞において V E G Fまたは b F G F誘導 E R Kリン酸化を阻害するために使用され得る。
b FGFは、 強力な血管形成因子である。 エフリン B 2は、 この b FGFによ つて誘導される EC細胞増殖を阻害し得る。 エフリン B 2の投与は、 b FGFに よって誘導される血管形成を顕著にブロックする。 なお、 E p hB4の投与では 顕著な効果を示さない。 (インビボモデルにおけるエフリン B 2の効果）
角膜マイクロポケットアツセィは、 代表的な血管新生のインビボモデルである。 このモデルにおいて、 エフリン B 2を投与することにより、 b FGFによって誘 導された血管形成は、 顕著にブロックされ得る。 なお、 Ep hB 4の投与では効 果を示さない。
酸素誘導網膜症 （O I R) モデルは、 糖尿病性網膜症の動物モデルである。 こ の動物モデルにおいて、 エフリン B 2は、 網膜外に向かう病的な血管形成または 血管 生を抑制し、 かつ 膜中の血管網の形成および血管成熟を増強し得る。
レーザー誘導による脈絡膜血管新生 （C N V) モデルは、 加齢黄斑変性症 （A MD) の実験的疾患モデルと位置づけられている。 エフリン B 2は、 この C N V を抑制し得る。 '
このように、 エフリン B 2は、 網膜内の生理的な血流を抑えることなく、 網膜 外に向かう病的な新生血管 （例えば、 脈絡膜新生血管、 内境界膜貫通新生血管） の新生を抑制し得る。 そのため、 エフリン B 2は、 生理的な血流を抑えることな く、 病的な血管形成または血管新生を抑制するために使用され得る。 したがって、 エフリン B 2は、 加齢黄斑変性症、 虚血性網膜症、 眼内血管新生、 角膜血管新生、 網膜血管新生、 脈絡膜血管新生、 糖尿病性黄斑浮腫、 糖尿病性網膜虚血、 糖尿病 性網膜浮腫、 糖尿病性網膜症、 癌、 慢性関節リウマチ、 子宮内膜症、 および脱毛 症、 ならびに血管形成または血管新生に関連する他の疾患または障害の処置に有 用である。
一つの実施形態では、 エフリン B 2は、 眼における血管形成または血管新生に 関連する疾患または障害の処置に有用である。 エフリン B 2は、 主として現在使 用されている光線力学的療法 （P D T) および種々の抗血管形成薬剤 （例えば、 抗 V E G F剤） による治療によって通常引き起こされるような、 網膜の生理学的 血流へのダメージを生じない。 したがって、 エフリン B 2を用いることにより、 例えば、 網膜の生理学的血流にダメージを与えることなく、 病的な脈絡膜血管新 生を抑制することによって、 湿潤および初期乾燥の AMDを治療し得る。 また、 網膜の生理学的血流にダメージを与えることなく、 病的な内境界膜貫通血管新生 を抑制することによって、 糖尿病性網膜症を治療し得る。
(エフリン B 2の使用および投与）
本発明に有用であるエフリン B 2は、 アナログおよぴ改変体を含む任意のエフ リン B 2であり得、 必要とされる活性を有する。 エフリン B 2は、 本発明の効果 を^"する限り、 その構 は限定されない。 エフリン Β 2は、 細胞外ドメインを含 むが、 細胞質ドメインおよび細胞膜ドメインを含まないものであっても、 あるい は全長であってもよい。 また、 より短縮化した断片であってもよレ、。
本発明において使用されるエフリン Β 2は、 关然に存在するタンパク質を単離 精製したものであっても、 遺伝子組換えにより微生物などから生成されたもので あってもよい。 例えば、 米国特許第 6， 303， 769号もしくは Mol Immunol. 1995 Nov ; 32 (16) ' 1197-205に記載のヒ トエフ！Γン B 2 c D N Aの配列を参照して、 慣用 の技術を用いて、 全長タンパク質、 細胞外ドメインを含むタンパク質などを作製 し得る。 当業者はまた、 当業者が通常用いる技術を用いることにより、 天然のェ フリン B 2を好ましく改変することもできる。 また、 エフリン B 2は、 医薬品や 試薬として市販されているいずれを用いてもよい。 特に、 エフリン B 2を薬学的 組成物に用いる場合、 医療用に通常使用される純度にまで精製されたものほど好 適である。 例えば、 免疫特性を考慮して、 免疫グロブリンの F c ドメイン （好ま しくは、 ヒ ト I g Gの F c ドメイン） に融合することにより、 個体への投与に適 した任意の形態に改変し得る。 なお、 後述する実施例では、 その入手が容易であ るため可溶性エフリン B 2 (通常、 細胞外ドメインを含むが、 細胞質ドメインお よび膜貫通ドメインを含まない） をヒ ト F cに融合したタンパク質を用いている 力 これは、 本発明の効果が、 実施例で使用したエフリン B 2に限定されること を示すものではない。
エフリン B 2を含む組成物は、 その組成物を個体 （例えば、 被験動物） に投与 する力、 または標本 （例えば、 細胞 （例えば、 内皮細胞、 特に、 動脈または静脈 の内皮細胞） 、 組織、 もしくは器官） に適用するのに適した種々の形態であり得 る。 このような形態を調製する方法は、 当該技術分野で周知である。 すなわち、 本発明は、 エフリン B 2の所定の用途に適した処方物をも提供する。 所定の用途 に適した処方物とは、 特に限定されないが、 「動脈内皮細胞 （または静脈内皮細 胞） における D N A合成を阻害するための阻害剤」 、 「動脈内皮細胞 （または静 脈内 細胞） における p '4 4 Z p 4 2 MA Pキナーゼ活性化を阻害するた " 阻害剤」 、 「動脈内皮細胞 （または静脈内皮細胞） からの脈管形成を阻害するた めの阻害剤」 、 「網膜からの血管新生を抑制するための抑制剤」 などが挙げられ る。 このようなエフリン B 2を含む処方物は、 エフリン B 2の作用を妨害せず、 かつ上記個体または標本に有害な作用を与えない限り、 エフリン B 2以外の他の 成分を含み得る。 このような処方物の個体 （例えば、 被験動物） への投与または 標本 （例えば、 細胞 （例えば、 内皮細胞、 特に、 動脈または静脈の内皮細胞） 、' 組織、 もしくは器官） への適用は、 処方物中のエフリン B 2が、 上記個体または 標本に接触するような様式で行われる。 ，
また、 エフリン B 2を含む薬学的組成物は、 個体への投与に適した種々の形態 の処方物であり得る。 このような形態を調製する方法は、 当該技術分野で周知で ある。 すなわち、 本発明は、 エフリン B 2の所定の用途に適した処方物をも提供 する。 所定の用途に適した処^"物とは、 特に限定されないが、 「動脈内皮細胞 (または静脈内皮細胞） における D N A合成を阻害するための阻害剤」 、 「動脈 内皮細胞 （または静脈内皮細胞） における P 4 4 Z P 4 2 MA Pキナーゼ活性 化を阻害するための阻害剤」 、 「動脈内皮細胞 （または静脈内皮細胞） からの脈 管形成を阻害するための阻害剤」 、 「網膜からの血管新生を抑制するための抑制 剤」 、 「血管形成または血管新生に関連する疾患または障害の処置のための予 防 ·治療剤」 などが挙げられる。 本明細書では 「動脈内皮細胞 （または静脈内皮 細胞） 」 という文言が用いられているが， 本発明の好ましい態様は動脈内皮細胞 に関する。 本発明はまた、 エフリン B 2を含む、 加齢黄斑変性症、 虚血性網膜症、 眼内血管新生、 角膜血管新生、 網膜血管新生、 脈絡膜血管新生、 糖尿病性黄斑浮 腫、 糖尿病性網膜虚血、 糖尿病性網膜浮腫、 糖尿病性網膜症、 癌、 慢性関節リゥ マチ、 子宮内膜症、 および脱毛症からなる群から選択される疾患または障害の処 置のための薬学的組成物あるいは予防 ·治療剤を提供する。 エフリン B 2は、 上 記疾患または障害の少なくとも 1つを治療または予防し得る。 このようなエフリ ン B 2を含む組成物は/有効量のエフリン B 2と、 薬学的に受容可能なキャリア
(担体） とを含み得る。 この組成物は、 エフリン B 2の作用を妨害しない限り、 薬学的に受容可能な他の成分 （エフリン B 2以外の血管新生抑制剤を含む） を含 んでもよい。 エフリン B 2を主として含む薬学的組成物あるいは予防 ·治療剤も また、 提供される。
エフリン B 2は、 投与経路に適合した薬学的に受容可能なキャリアと混合して、 例えば、 経口であるいは筋肉内または静脈内注射によって、 全身投与され得る。 生理学的に受容可能な種々のキヤリァがエフリン B 2を投与するために使用され 得、 そしてその処方は、 当業者に公知であり、 例えば、 Remington' s Pharmaceuti cal Sciences (第 18fe) , A. Gennarofe, Mack Publishingし ompany, Eastern, PA、 および Pollockらに記載されている。
エフリン B 2は、 好ましくは、 非経口投与される （例えば、 筋肉内、 腹腔内、 ' 静脈内、 眼内、 硝子体内、 または皮下注射によって、 あるいは移植によって） 。 非経口投与のための処方物は、 滅菌の水性または非水性溶液、 懸濁液、 あるいは 乳化液の形態であり得る。 例えば、 水、 緩衝化水、 生理食塩液などの種々の水性 キャリアが使用され得る。 他の適切なべヒクルの例としては、 ポリプロピレング リコール、 ポリエチレングリコール、 植物油、 ゼラチン、 硬化ナフアレン、 およ びォレイン酸ェチルのような注射用有機エステルが挙げられる。 このような処方 物はまた、 保存剤、 湿潤剤、 緩衝化剤、 乳化剤、 および Zまたは分散剤のような 補助物質を含み得る。 生体適合性、 生分解性のラクチドボリマー、 ラクチド グ リコシドコポリマー、 またはポリオキシエチレン一ポリオキシプロピレンコポリ マーが、 活性成分の放出を制御するために使用され得る。
あるいは、 エフリン B 2は、 経口摂取によって投与され得る。 経口使用を意図 した処方物は、 当該技術分野で公知の任意の方法に従って、 固体または液体形態 に調製され得る。 この組成物は、 より嗜好性のよい調製物を提供するために、 必 要に応じて、 甘味剤、 香味剤、 着色剤、 着香剤、 および保存剤を含み得る。 経口投与用の固体投与形態の処方物としては、 カプセル剤、 錠剤、 丸剤、 粉剤、 および顆粒剤が挙げられる。 一般的に、 これらの処方物は、 非毒性の薬学的に受 容可能な賦形剤と混合された活性成分を含む。
これらとしては、 例えば、 炭酸カルシウム、 炭酸ナトリウム、 ラタ トース、 ス クロース、 グノレコース、 マンニトーノレ、 セノレロース、 デンプン、 リン酸カノレシゥ ム、 リン酸ナトリウム、 カオリンなどのような不活性希釈剤が挙げられ得る。 結 合剤、 緩衝化剤、 およぴ または滑沢剤"^ (例えば、 ステアリン酸マグネシウム） も使用され得る。 '
錠剤および丸剤は、 さらに、 腸溶コーティングとともに調製され得る。
経口投与用の液体投与形態の処方物としては、 窠学的に受容可能な乳剤、 溶液 剤、 懸濁剤、 シロップ剤、 および軟ゼラチンカプセノレ剤が挙げられる。 - これらの形態の処方物は、 水または油媒体のような当該技術分野で通常使用さ' れる不活性希釈剤を含み、 そしてまた、 湿潤剤、 乳化剤、 懸濁化剤などのアジュ バントを含み得る。
エフリン B 2はまた、 例えば、 貼付剤によって、 あるいは眼への直接適用によ つて、 あるいはイオン浸透法によって、 局所投与され得る。
エフリン B 2は、 例えば、 米国特許第 5, 672, 659号および第 5, 595, 760号に記載 されるように、 持続放出処方物として提供され得る。 即時または持続放出組成物 の使用は、 治療される障害の性質に依存する。 障害が急性または超急性障害から なる場合、 即時放出形態での治療が、 持続放出処方物よりも好適である。 あるい は、 予防または長期治療については、 持続放出処方物が適切であり得る。
エフリン B 2はまた、 移植物を用いて送達され得る。 このような移植物は、 生 分解性およぴ Zまたは生体適合性移植物であり得るか、 あるいは非生分解性移植 物であり得る。 移植物は、 活性成分に対して透過性または非透過性であり得る。 眼移植物は、 前眼房または後眼房のような眼房に挿入され得るか、 あるいは強膜、 脈絡膜横断腔、 または硝子体の外面の無血管領域に移植され得る。 好適な実施態 様では、 眼移植物は、 強 上のような無血管領域に配置され得、 そのため、 治療 の所望部位、 例えば、 眼内腔および眼の黄斑への薬物の経強膜拡散を可能にする。 さらに、 経強膜拡散の部位は、 好ましくは黄斑の近くである。
エフリン B 2の送達のための移植物の例としては、 米国特許第 3， 416, 530； 3, 82 8， 777； 4， 014, 335； 4, 300， 557； 4， 327, 725； 4, 853, 224； 4, 946, 450； 4, 997, 652； 5, 247, 647， 5, 164, 188； 5, 178， 635 , 5, 300, 114； 5, 322, 691； 5， 403, 901； 5, 443, 5 05； 5, 466, 466； 5, 476, 511； 5, 516， 522；— 5, 632, 984； 5， 679， 666； 5, 710, 165 ； 5, 7 25, 493； 5, 743, 274； 5, 766, 242； 5， 766, 619； 5, 770， 592； 5, 773, 019； 5, 824, 07 2； 5， 824, 073； 5, 830, 173； 5, 836, 935； 5, 869， 079 ； 5, 902, 598； 5， 904, 144， 5, 91 6， 584； 6, 001, 386； 6， 074, 661； 6, 110, 485； 6， 126, 687； 6, 146, 366 , 6, 251, 090； ぉょび6, 299，895号；ならびに\^001/30323ぉょび 01/28474 (これらのすべては、 参考として本明細書に援用される） に記載のデバイスが挙げられるが、 これらに 限定されない。 (投与量）
単回投与剤形を製造するためにキヤリァ材料と合わせる活性成分の量は、 処置 する個体および特定の投与態様に依存して変動する。 一般的には、 エフリン B 2 は、 疾患の徴候を低減または除去するに十分な量で投与されるべきである。
1回の投与あたりに約 1 g/kg〜100mg/kg体重のオーダーでの投与レベルは、 一般的に血管新生障害の治療に有用である。 眼に直接投与する場合は、 好適には、 眼内濃度が約 I ng/mL〜約 lOOng/mLになるように投与される。 投与量は、 単回投与 として投与され得るか、 あるいは多数回投与に分割され得る。 一般的に、 数ケ月 以上のより長い投与期間が必要とされ得るが、 所望の投与量は、 長期間、 通常は 少なくとも数週間に設定された間隔で投与されるべきである。
当業者は、 正確な個々の投与量は、 例えば、 以下の種々の因子に依存して調節 され得ることを理解する ：投与時間；投与経路；処方物の性質；***速度；治療 される特定の障害；障害の重篤度；ならびに患者の年齢、 体重、 健康状態、 およ び性別。 必要とされる投与量の広い変動は、 種々の投与経路の異なる有効性を考 慮して予測されるべきである。 例えば、 経口投与は、 一般的に、 静脈内または硝 子体内注射による投与よりも高い投与量レベルを必要とすることが予測される。 これらの投与量レベルの変動は、 当該技術分野で周知の最適化についての標準的 経験的ルーチンを用いて調節され得る。 正確な治療的に有効な投与量レベルおよ びパターンは、 好ましくは、 上記の因子-を考慮して主治医によって決定される。 ' 予め存在している血管新生疾患を治療する以外に、 エフリン B 2は、 これらの 障害の発症を予防または遅延させるために予防的に投与され得る。 予防的な適用 において、 エフリン B 2は、 特定の血管新生障害になりやすいあるいはその危険 性のある個体に投与される。 また、 投与される正確な量は、 個体の健康状態、 体 重などのような種々の因子に依存する。
以下、 実施例に基づいて本発、明を説明するが、 本発明はこの実施例に制限され ない。 実施例
以下の実施例において、 以下の略語は以下の意味を有する。 定義されていない 略語は、 一般的に受容されている意味を有する ·
°C =摂氏度
h r =時 ，
m l n =分
s e c =秒
μ Μ=マイクロモル濃度
mM=ミリモル濃度
M =モル濃度
μ L =マイクロリットル mL=ミ リ リッ トル
μ g =マイク口グラム
m g =ミリグラム
DMEM =ダルべッコの改変ィ一グル培地
I TS=インスリン一トランスフェリン一セレニウム
F B S =ゥシ胎児血清
MEM =改変ィ一グル培地
P B S =リン酸緩衝化生理食塩液
VEGF =血管内皮細胞増殖因子
FGF=繊維芽細胞増殖因子
PDGF=血小板由来増殖因子
S D S =ドデシル硫酸ナトリウム
PAGE-ポリアクリルァミ ドゲル電気泳動
EC=内皮細胞
HUVEC =ヒ ト臍帯静脈内皮細胞
HAoEC=t ト大動脈内皮細胞
O I R=酸素誘導性網膜症
CNV=脈絡膜血管新生
AMD =加齢黄斑変性症。
本実施例においては、 エフリン B 2および E p h B 4として、 それらの入手容 易性のために可溶性タンパク質 （以下、 それぞれ 「5ェフリン：82」 および 「 s E p hB4」 という ； これらは、 細胞外ドメインを含むが、 細胞質ドメインおよ び膜貫通ドメインを含まないタンパク質である） を用いた。 マウス sエフリン B 2および s E p h B 4は、 R&D Systems, Inc.社 (614 McKinley Place NE, Mmne apolis 55413, USA) より入手した （これらはともに、 ヒ ト F c ドメインと融合し た形態である） 。 タンパク質下記の実施例 5に記載のように作製したヒ トエフリ ン B,2—ヒ ト F c 成タンパク質もまた、 エフリン B 2として使用した。
以下に示す試験は、 特に言及しない限り 3回繰り返し、 そして代表的な実験か らのデータ （平均土 SD) を示す。 正常分布した集団においてスチューデントの t検定を用いて p <0.05の場合に、、統計学的有意とみなした。
(実施例 1 ：ェフリン B 2による、 增殖因子によって刺激された ECの増殖お よび移動の阻害） ― ■ 増殖因子によって刺激された血管内皮細胞に対するエフリン B 2および E p h B 4の効果を調べるために、 [3H] チミジン取り込み— HA o ECおよび HUV E Cの DN A合成おょぴ内皮脈管形成ァッセィを行った。
(1. [3H] チミジン取り込み一 HAo ECおよび HUVECの DNA合成） ヒ ト大動脈内皮細胞 （HAo EC) およびヒ ト臍帯静脈内皮細胞 （HUVE C) を、 Clonetics Corp. (San Diego, California, USA) 力 ら購入し、 そして 1 0%ゥシ胎児血清 （FB S) を補充した Clonetics EGM培地中で維持した。 内皮細 胞増殖補充物も、 Cloneticsにより提供された。 H A o E Cおよび HU V E Cを、 1型コラーゲンでコーティングされたディッシュ （Iwalo, Japan) 上の内皮細胞 増殖培地 （Clonetics Corp. , San Diego, California, USA) 中で、 5%CO 、 95%空気中 37°Cにて培養し、 培地を 2〜3日ごとに交換することにより維持し た。 4〜 5継代の細胞を実験に用いた。 ECを、 10%FC Sを含む DMEM (Nac alai tesque, Japan) 中、 200ng/mLの sエフリン B 2または s E p h B 4のいず れかの存在または不在下で、 lOng/mLの VEGF、 b FGF、 または PDGF— B Bで 18時間処理した。 次いで、 細胞を、 20 Ci/mLにて [メチルー3 H] チミジン (Araershara) に 6時間曝露した。 細胞を、 トリプシン処理し、 自動細胞採取機を 用いてガラス繊維フィルター上に回収し、 そして [メチルー3 H] チミジン取り込 みを、 直接 J3カウンターで測定した。 結果を図 1 Aおよぴ図 1 Bに示す。 ヒ ト大動脈内皮細胞 （HAo EC) を VEGF、 b FGF、 または PDGF— BBで処理することにより、 未処理コントロールと比較して、 DNA合成が 3〜 10倍に増加した。 エフリン B 2は、 これらのすべての刺激された DNA合成を 阻害したが、 s E p h B 4および sエフリン B 2 + s E p h B 4は、 いずれも阻 害しなかった。 図 1Aおよび図 1 Bは、 それぞれ HAo EC (図 1 A) および H UVEC (図 1 B) における VEGF、 b FGF、 または P D G F— B Bで誘導 された DNA合成に対する sエフリン 2の効果を示す。 図中の符号はそれぞれ、 C ： コントロール （未処理） 、 B 2 · sエフリン B 2処理、 B 4 ： s E p h B 4 処理を示す。 図中、 *は、 その結果が、 増殖因子で刺激しない未処理の場合に対 して有意差があることを示し、 * *は、 同じ增殖因子で刺激したが、 sエフリン B 2または s Ep hB4で処理していない場合と有意差があることを示す。 図 1 Aに示すように、 10ng/mLの VEGF、 b FGF、 または P D G F— B Bによって 誘導された DNA合成の増加量は、 200ng/mLの sエフリン B 2によって、 それぞ れ 40%、 30%、 および 90%阻害された。 ヒ ト臍帯静脈内皮細胞 （HUVEC) に おいてもほとんど同じ結果を得た （図 1 B) 。 このインキュベーション期間中に、 顕著なアポトーシス細胞は観察されなかった （データは示さず） 。
(2. 内皮脈管形成アツセィ） 、 コラーゲンゲルを、 氷冷ゼラチン溶液 （10XM199、 H20、 0.53M N a HCO 3、 200mM L—グルタミン、 I型コラーゲン、 0.1M Na OH、 100 : 27.2 : 5 0： 10： 750： 62.5 (容量比） ） と、 1 X基本培地 （以下を参照） 中の 3 X 106細 胞 /mLの濃度の細胞とを、 4容量のゼラチン溶液： 1容量の細胞の比で一緒に混合 することによって形成した。 37°Cで 30分間ゲルィヒした後、 ゲルを、 40ng/mLの bF GF、 40ng/mLの VEGF、 および 80nMの PMAを補充した 1 %F B S、 I X I TS、 2mM L一グルタミン、 50jug/mLァスコルビン酸、 26.5mM NaHC03、 100ュニット /mLぺニシリン、 および 110ュニット /mLストレプトマイシンからなる 1 X 本培地で覆つた。 sエフリン B 2および s Ep hB 4 (各 200ng/mL) は、 ゲル化の直後に 1 X基本培地に添加した。 脈管形成を定量するために、 高出力 （2 0X) 視野あたりの脈管の数を、 基本培地の添加の 48時間後に測定した。 脈管を、 100 μπιの長さを超える 1以上の内皮細胞で構成される延長した構造物として定義 した。 ΙΟΟμπιの光学的区切りによって分離された 5つの独立視野を、 各ゥヱルに ついて評価し、 そして 20Χ視野あたりの管の平均数を測定した。 細胞傷害性を、 Β oehringer Mannheimから購入した細胞増殖キット IIを用いて評価した。 また、 コ ントロール （未処理） 、' sエフリン B 2または s E p h B 4のいずれかでの処理 または sエフリン B 2と s E p hB4との両方の処理を行ってから 7日後に、 V EG F刺激した内皮細胞の形態を観察した。 '
図 1 Cは、 コントロール （未処理） 、 sエフリン B 2または s E p h B 4のい ずれかでの処理、 および sエフリン B 2と s E p hB4との両方の処理による V' EGF刺激内皮細胞の脈管形成の 7日目の状態を示す写真である。 VEGF誘導 した脈管形成は、 7日目には、 コントロールと比較して sエフリン B 2処理群で 減少していた （図 1 C) 。 逆に、 VEGF誘導した脈管形成は、 s Ep hB 4処 理によって影響を受けなかった。
したがって、 エフリン B 2は、 VEGF、 b FGF、 および PDGFを含む 種々の刺激によって誘導される ECの DN A合成を阻害し得ることが分かった。 エフリン B 2の正確なメカニズムは明らかではないが、 DNA合成の減少は、 細 胞傷害性の評価によれば、 顕著なアポトーシス細胞がなかったことから、 アポト 一シスによって引き起こされたのではないと思われる。 DNA合成が静脈内皮細 胞および動脈内皮細胞の両方で阻害されることは、 驚くべきことである。 なぜな ら、 エフリン B 2のレセプター （E p hB 4) は、 静脈内皮細胞のマーカーであ るが、 動脈内皮細胞は、 このレセプターを有することが知られていないからであ る。
このように、 DNA合成における効果と一致して、 エフリン B 2はまた、 VE G Fによって誘導される E C脈管形成を阻害し得る
(実施例 2 ：増殖因子で誘導された p 4 2 44 ERKリン酸化およぴレセ プター自動リン酸化に対するエフリン B 2の効果）
内皮細胞に対する VE Fまたは b FGFで誘導された有糸***応答をエフリ ン B 2が阻害するメカニズムについて、 VEGFまたは b FGFで刺激した内皮 細胞における ERK (p 4 2/44) ！；ン酸化に対するエフリン B 2の効果をゥ エスタン分析によつて検討した。
ECを、 EGM_DME、M (3%FB Sを含む） （Nacalai tesque, Japan) 中、 50ng/mLの sエフリン B 2の存在または不在下で Ϊ時間放置した。 さらに、 10ng/m Lの b FGFまたは 10ng/mLの VEGFで 5分間処理した （コントロールは未処理 とした） 。 内皮細胞からのタンパク質試料の調製およびウェスタンブロッテイン グは、 以下のようにして行った、。 全細胞ライセート、 サイトゾル抽出物、 または 核抽出物を、 内皮細胞から単離した。 ウェスタンブロッテイングを、 免疫沈降を 用いておよび用いずに行った。 タンパク質試料を、 ドデシル硫酸ナトリウムーポ リアクリルアミ ドゲル電気泳動 （SDS— PAGE) によって分離し、 次いで二 トロセノレロースメンブランにエレク トロポレーションでトランスファーした。 ス キムミ^/クでブロッキングした後、 ブロットを、 ホスホチロシンまたは KDR、（s c-504) に対する f几体 (Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, California, US A) から購入） とともに 4°Cにてー晚インキュベートした （1 : 500) 。 洗浄後、 メ ンブランを、 西洋ヮサビペルォキシダーゼ標識 2次抗体 （Bio-Rad, Richmond, Ca lifornia, USA) (1 ： 3000) とともに室温にて 1時間ィンキュベートした。 可視 化を、 製造業者の指示書に従って Amersham増強化学発光 （ECL) 検出システム を用いて行った。
図 2 Aは、 VEGFまたは b FGFで刺激した HAo ECにおける ERKリン 酸化に対するエフリン B 2の効果を示す電気泳動写真である （p 44/p 4 2 ： 総 E K：。 p p 44/p p 42 : リン酸化した ERK) 。 ERKリン酸化は、 10η g/mLの VEGFでの処理または 25ng/mLの b F G Fでの処理によって増加した。 s エフリン B 2は、 £0?誘導の£1 1：リン'酸化おょぴ b FGF誘導の ERKリ ン酸化の両方ともを抑制した。 例えば、 200ng/mL'の sエフリン B 2は、 VEGF 誘導した ERKリン酸化を 70%阻害した。 このように、 VEGF刺激および b F GF刺激による HA o ECにおける ERKリン酸化をエフリン B 2が阻害したこ とがわかる。 ―
次に、 VEGF刺激じた ECにおける VEGFレセプター 2 (KDR) 自動リ ン酸化について検討した。 ECを、 EGM—DMEM (3%FCSを含む） （Nac alai tesque, Japan) 中、 50 n g Zm Lの sェ'フリン B 2の存在または不在下 で 1時間放置した。 さらに、 10ng/mLの VEGFで 5分間処理した （コント-ロール は未処理とした） 。 上記と同様にして、 レセプター （KDR) を、，細胞ライセー トから免疫沈降 （I P) させ、 抗リン酸チロシン抗体 （PY20) でプロッティ ング,した。 '
図 2 Bは、 VEGF刺激した HAo ECにおける VEGFレセプター 2 (KD R) 自動リン酸化に対するエフリン B 2の効果を示す電気泳動写真である。 図 2 Bは、 エフリン B 2力 VEGF刺激した HAo ECにおける VEGFレセプタ 一 2の自動リン酸化に対して顕著な効果がないことを示す。 VEGFレセプター 2自動リン酸化は、 10ng/mLの VEGFで 14倍増加した。 sエフリン B 2は、 VE GFレセプター 2自動リン酸ィ匕を阻害しなかった。
上記の 2つのリン酸化アツセィにおいて、 HUVECを用いてもほとんど同じ 結果を得た （データは示さず） 。
したがって、 エフリン B 2力 内皮細胞 （動脈および静脈） において VEGF または b FGFで誘導された ERKリン酸化を阻害することがわかった。 この効 果は、 おそらく、 少なくとも一部は、 エフリン B 2がこれらの細胞の VEGFま たは b FGFで誘導した増殖を阻害する活性を説明し得る。 しかし、 エフリン B 2は、 VEGFレセプター 2の自動リン酸化を阻害しない。 したがって、 エフリ ン B 2は、 VEGF機能を阻害するメカニズムとして、 VEGFと VEGFレセ プター 2との間のシグナル伝達 妨害しない'と考えられる。 (実施例 3 ：マウス角膜におけるエフリン B 2の同時投与による b FGFで誘 導した血管形成の阻害）
塩基性 FGF (b FGF) は、 強力な血管形成因子であることが知られている。 エフリン B 2は、 b FGFによって誘導された EC細胞増殖を阻害し得るので、 エフリン B 2が同様に血管形成を抑制し得るかどうかを検討した。
Kenyon, B.M.ら， （1996) Ophthalmol. Vis. Sbi.， 37卷， 8号， 1625- 1632頁に 本質的に既述されるように、 マウスにおける角膜ポケットアツセィおよび角膜血 管新生の定量を、 いくらかの改変を加えて行った。 簡単に言えば、 90ngのヒ ト b F G F ¾：含む 0.3 μ Lの Hydronペレツ 卜 （IFN Sciences, New Brunswick, New Jers ey, USA) を調製し、 雄 BALBんマウスの角膜に移植した。 sエフリン B 2または s E p h B 4 (lOOngZペレット） を、 b F G F/Hydron溶液に直接添加した。 ペレ ットを、 角膜縁から 1.0醒に配置した。 移植後、 オフロキサシン Z点眼剤を各眼に 適用した。 6日後、 動物を屠殺し、 そして角膜血管を写真撮影した。 マウス角膜 における血管新生の定量分析を、 ソフトウェアパッケージ NIH Imageを用いて行つ た。 その結果、 ペレッ トの移植の 6日後、 新しい血管の発芽を検査した。 b FG Fは、 マウス角膜において血管形成を劇的に誘導した。
さらに、 b FGFで誘導した角膜血管新生に対する sエフリン B 2または s E p hB 4の効果を検討した。 sエフリン B 2の投与により、 b FGFによって誘 導された血管形成は顕著にプロックされたが、 s E p h B 4の投与では効果はな かった。 図 3に、 b FGFとエフリン B 2とを同時投与したマウス角膜における 血管新生の定量分析の結果を示す。 図 3の縦軸は、 血管新生を有する領域の面積 の値であり、 b FGFの存在下での血管新生を有する領域を 100 %とした場合 の割^を表す （％) 。 バーは、 各群におけるすべての動物についての SDである (1群につき n = 6) 。 定量分析によっても、 b FGFで誘導した角膜血管新生 が、 エフリン B 2によって完全に阻害されたことが示された （図 3) 。 (実施例 4 ·酸素誘導性網膜血管新生に対するエフリン B 2の効果）
C 57BLZ6 Jマウス （SLCジャパン社から入手） を用いて、 以下のようにし て酸素誘導性網膜症 （O I R) モデルを作製した。 生後 7日目 （P 7) のマウス とその母親を 75%高酸素状態にした箱の中に 5日間入れた。 高酸素状態にして から 5日後の生後 12日目 （P 1 2) に、 これらのマウスを通常の 20%酸素濃 度の状態に戻し、 その後の網膜血管反応について観察した。 このような処置を施 したマウスは、 広範囲の網膜血管新生の発達を示した。 網膜血管新生は、 P 1 9 までに 100%の動物で生じた。 P 1 9には新生血管束は明白であり、 特に中間. 周辺部において、 内境界膜から硝子体へ向かって伸びている。
網膜血管新生に対するエフリン B 2の効果を検討するために、 P 1'3および P 1 5の O I Rマウスに、 100 Lの P B S中 sエフリン B 2を 200 g (n =6匹） または対照として PB Sのみ 200 μ L (η = 6匹） を、 一日に一回、 腹腔内注射した。 Ρ 1 7で網膜血管新生を評価した。
以下に要約するプロ トコルに従って、 フルォレセインーデキストラン血管造影 法を用いてフラットマゥントした網膜を評価した （Lab Invest. 2004； 84(8) ： 97 3-80) 。 まず、 マウスを深麻酔し、 2 X 106分子量フルォレセインデキストラン (Sigma社） の体重 l g当たり 0. 03 m Lの 50 m g Zm L溶液を左心室に灌流 させた。 眼を摘出し、 少なくとも 3時間の間 4%パラホルムアルデヒ ド中に固定 した。 次いで、 角膜と水晶体とを取り除き、 周囲網膜を解剖し、 蛍光顕微鏡下で の試験のために顕微鏡スライド上にフラットマゥントした。 コントロールおよび sエフリン B処理モデノレのフラットマウントしたフルォレセィン一デキストラン 灌流網膜の蛍光顕微鏡写真を図 4に示す （A： コント口ール O I Rモデル； B ： sエフリン B処理モデル-) 。 sエフリン B処理では、 フラットマウント網膜の中 心部から周辺部にかけて明瞭に白い （図 4B) 。 これは、 網膜内にフルォレセィ ンーデキストランが灌流できる正常な血管が存在することを示す。 sエフリン B 処理モデルでは、 O I Rモデル （04A) に比べて、 正常血管の存在が比較的多 く観察された。
また、 フルォレセインーデキストランで灌流したフラットマウント網膜の蛍光 顕微鏡写真画像を NIHimageソフトゥェ T上に取り込み、 無灌流領域の面積を計測 した。 図 5は、 コント tiールモデル （O I R) に対する sエフリン B 2処理モデ ル （01尺+ェフリン；62) の無灌流領域の面積比をグラフに示したものである。 図 5の縦軸は、 無灌流領域面積比を示し、 これば、 O I Rモデルにおける無灌流 領域面積を 100%とした場合の割合を表す （％) 。 バーは、 各群におけるすべ ての動物についての SDである （1群につき n = 6) 。 図 5から、 sエフリン処 理モデルは、 コントロールモデルに比較して非灌流領域の面積が減少しているこ とが分かる。 sエフリン B 2処理モデルとコントロールモデルとの網膜無血管比 は、 統計学的に有意である （図面中 **で記載： p<0. 01) 。
さらに、 走査型電子顕微鏡 （SEM) によって、 新生血管の新生に対する sェ フリン B 2の効果を検討した。 Cell Tissue Res. (1992) 270 · 165- 17 に既述の通 りに血管系を分析するために最適化された条件下で、 透過型走査電子顕微鏡検査 を実施した。 日立 H-800透過形顕微鏡 S-800走査電子顕微鏡で写真撮影した。 図 6 は、 コントロールモデル （O I R) (A) および sエフリン B 2処理モデル （O I R+エフリン B 2) (B) の P 1 7新生児マウスの網膜表面を示す S EM写真 である （硝子体側から網膜を眺めたもの） 。 図 6 Aのコントロールモデルの写真 においては、 網膜から硝子体内に向かう異常な新生血管 （内境界膜貫通新生血 管） の新生が観察される （特に、 写真中の右側の部分における穴状部） 。 これに 対して、 図 6 Bの sエフリン B 2処理モデルの写真では、 そのような穴状部は見 られず、 硝子体中への新生血管の新生は抑制されていると思われる。 したがって、 O I Rマ-ウスを sエフリン B 2処理したことにより、 內境界膜に おいて、 該膜に対してほぼ平行方向に伸びる血管網が見られたが、 硝子体に向か つて形成される新生血管の新生は抑制されだ。 また、 sエフリン処理により、 網 膜の血流自体を減らすことはなかった。 これは、 血管発達における sエフリン B 2の重要な発達の役割である。 sエフリン B 2は、 網膜外に向かう （本実施例の 場合、 硝子体に対して伸長する） 病的な血管新生を抑制するだけでなく、 網膜中 の血管網の形成および血管成熟も増強じ得る。 このような効果は、 糖尿病性網膜 症の治療に最適であり得る。 (実施例 5 ： ヒ ト化工フリン B 2による血管新生抑制効果）
本実施例では、 ヒ トの D N Aライブラリー由来のエフリン B 2とヒ ト Fc-との融 合タンパク質を作製し、 その血管新生抑制効果の評価を行った。
( 1 . ヒ トエフリン B 2—ヒ ト Fc合成タンパク質の作製）
以下に説明するように、 ヒ トエフリン B 2 cDNA断片をヒ ト IgGl抗体の Fc部分を コードしている cDNAの 5'末端に融合させた。 このヒ トエフリン B 2 cDNAの配歹 IJは、 米国特許第 6, 303， 769号もしくは Mol Immunol. 1995 Nov ; 32'(16)： 1197- 205を参考 にした。
Fcのクローニングを以下のようにして行づた。 ヒ ト脾臓 cDNAライブラリー （100 ng) を铸型として、 順方向プライマー： GAA GAT CTC CCA AAT CTT GTG ACA AAA C TC (配列番号 1 ) および逆方向プライマー： GCG GCC GCT CAT TTA CCC GGA GA (配列番号 2 ) を用い、 KODplus (T0Y0B0) を用いて PCRを行った。 増幅された約 7 00bpの DNA断片を精製し、 精製した DNA断片を Teasyベクター （Promega) にサブク ローニングし、 ヒ ト IgGlFcであることを確認した。
ヒ トエフリン B 2のクローニングを以下のようにして行った。 ヒ ト胎盤 cDNAラ イブラリー （100ng) を铸型として、 順方向プライマー： GCG AAG CTT ACC ATG GC T GTG AGA AGG GAC (配列番号 3 ) および逆方向プライマー： GCG AGA TCT GGC CA C TTC GGA ACC GAG GAT ' (配列番号 4 ) を用い、 KODplus (T0Y0B0) を用いて PCR を行った。 増幅された約 680bpの D N A断片を精製した。 精製した D NA断片を Te asyベクター （Promega) にサブクローニングし、 塩基配列を確認したところ、 上 記ヒ トェフリン B 2 cDNAの塩基配列の 1〜678番目の塩基位置で示される 678bpの D N A断片であった。 このヒ トエフリン B 2 D N A断片によりコードされるタン パク質は、 ヒ トエフリン B 2タンパク質の細胞外ドメインを含むが、 細胞質ドメ インおよび膜貫通ドメインは含まないと推定される。
クローユングした EFN-B2 DNA断片の 5'末端を HindIII、 3'末端を Bglll制限酵素 で処理し、 Fcの D N A断片の 5'末端を BglII、 3'末端を Notl制限酵素で処理した。 これらの断片を、 哺乳動物系発現ベクター pcDNA4- Myc- His A (Invitrogen) を Hi ndlllおよび Notl制限酵素で処理したものと DNA Ligation kit ver. 2. 1 (TAKARA) を用い 3者ライゲーシヨンを行った。 ライゲーションにより得られたベクターを 大腸菌 XL21に形質転換した。 生育した大腸菌コロニーからプラスミ ドを精製し、 塩基配列を確認したところ、 ヒ ト EFN-B2 (l-678bp) - Fcであった。 '
このプラスミ ドを HEK293細胞に導入し、 以下の培養条件にて培養した。 培地は、 DMEM (SIGMA) と、 10%FBS (Biowest Fetal Bovine Serum) に、 抗生物質 （GIBC0 1 %ペニシリン + 1 %ス トレプトマイシン） を添; したものを用いた。 5% C02ィ ンキュベータ一内で 37°Cで 3日間培養した。 エフリン B2安定発現株を、 リン酸力 ルシゥム法による遺伝子導入および Zeocin 250 g/mL (invivogen) による薬剤選 択によって取得した。 安定発現株から培養上清を集める場合は、 GIT培地 （日本製 薬株式会社） にて培養した。
次いで、 エフリン B2_Fc安定発現株から、 以下のようにして発現タンパク質を精 製した。
約 lOOmL培養上清を回収し、 遠心分離 （1100rpm、 5分、 4°C) して死細胞などの ゴミを除いた。 そこにプロテイン A—セファロース 100 /i Lを加え、 4°Cで 2時間回 転させた。 その後、 遠心分離 （2000rpm、 5分、 4°C) して上清を除き、 沈殿 （セフ ァロース +エフリン B 2) に洗浄緩衝液 （lOraM Tris-HCl pH7.4、 150mM NaCl、 0. 1% NP40) を加えて非特異的吸着タンパクなどを除いた。 この洗浄操作を 3回行つ た。 3回洗浄後、 溶出緩衝液 (θ'.1M グリシン ρΗ3.0) を 70 しを加え、 10分間氷上 に静置し、 遠心分離 （2000rpm、 2分、 4°C) 後にこの上清を回収した。 この操作を 7回繰り返した。 集めた上清のタンパク濃度を 0D28。の吸光度にて測定した。 タン パク濃度が高かったものを回収し、 1M Tris- HC1 pH8.0を 1/10量加えて中和し、 リ ン緩衝生理食塩水に対して一晚透析を行った。 透析後サンプルを回収し、 タンパ ク定量を BCA法にて行つた。 同時に非還元化または還元化状態で SDS-PAGEを行い、 分子量によってヒ トェフリン B 2—ヒ ト F c合成タンパク質であることを確認し
(2. [3H] チミジン取り込み一 HUVECの DNA合成） . 実施例 1と同様にして、 上記ヒ トエフリン B 2—ヒ ト F c合成タンパク質につ いて、 HUVECの DNA合成における効果を検討した。 但し、 ECを、 10%F CSを含む DMEM (Nacalai tesque, Japan) 中、 1 ηΜ、 10 nM、 もしくは 1 00 nMのヒ トエフリン B 2— F cタンパク質の存在または不在下で、 0. 6 nMの b FGFで 18時間処理した。 ここで、 ポジティブコントロールとして、 1 00 nMのマウスエフリン B 2—ヒ ト F cキメラタンパク質 （R&D Systems, Inc. 社 （614 McKmley Place E, Minneapolis 55413， USA) を使用した。
HUVECによるチミジン取り込みの結果を図 7に示す。 図 7の縦軸は、 b F GFおよぴェフリン B 2処理なしの場合 （図中、 最も左のカラム） に対する割合 (%) を示す。 エフリン B 2処理を施さずに b FGF (0.6nM) で HUVECを刺 激した場合、 b FGF未処理のコントロールに比較して DNA合成を約 5倍増大 した。 ΙΟΟηΜのヒ トエフリン B 2—ヒト F c合成タンパク質は、 b FGFによる刺 激がなくても DNA合成を阻害した。 0.6nMの b FGFによって誘導された DNA 合成の増大は、 1 ηΜ、 10 nM、 および 100 nMのヒ トエフリン B 2—ヒ ト F c合成タンパク質によ'つ それぞれ 10%、 30%、 95%阻害された （図 7) 。 このインキュベーション期間中に、 顕著なアポトーシス細胞は観察されな かった （データは示さず） 。 (実施例 6 ： CNVモデルに対するエフリン B 2の評価）
AMDの生態モデルと考えられるレーザー誘導性脈絡膜血管新生 （CNV) モ デルを用いて、 ヒ トェフリン B 2—ヒ ド F c合成タンパク質の血管新生抑制効果 を評価した。 ' (実験動物）
6匹の力二クイザル （ォス 3.5〜7.5kg) 由来の 1 2眼を用いた。 これらの動物 は全て、 苦痛のないように扱い、 株式会社新日本科学において無 原状態で収容, した。 実験は、 塩酸ケタミンで全身麻酔以下に行った。 株式会社新日本科学の実 験動物倫理委員会により承認されている倫理基準 （承認番号 C189-001) に従って 行った。
(実験的脈絡膜血管新生 （CNV) の誘導）
上記サルの眼の眼底部の後部極において、 多色レーザー （波長 647nm) (Novus Omni Laser; Lumenis, Santa Clara, Calif) を用いた光凝固によって、 実験的 C NVを誘導した。 スポッ トの大きさは直径 100 /zmであり、 照射時間は 0.1秒であつ た。 角膜表面での出力は 700mWであった。 コンタク トレンズを用いることにより、 各眼において、 中心窩を除いた箇所に 8つの焼き焦げ （burns) を生じさせた。
(エフリン B 2投与方法と濃度）
レーザー照射直後と照射後 5日の合計 2回、 上記実施例 5で調製したヒ トエフ リン B 2—ヒ ト F c合成タンパク質の硝子体内投与を行った。 硝子体内のエフリ ン B 2濃度が lng/mL、 10ng/raL、 lOOng/mLになるように調整した P B S溶液を 0. lm Lずつ、 27G針を用いて毛様体扁平部から眼内に注射した。 ネガティブコントロー ルとして、 0. lmLの PBSを注射した。 ポジティブコントロールとして、 lOng/mLおよ び lOOng/mLの上記マウスエフリン B 2—ヒ ト F cキメラタンパク質を用いた。
( C N Vの評価）
レーザー照射後 10日目に蛍光眼底造影検査を行って、 脈絡膜新生血管を評価し た。 0. lmL/kgの 5 %フルォレセィン Naを静脈内投与し、 眼底力メラ （TRC- 50EX, 興株式会社トプコン） で蛍光眼底撮影を行った。 注射開始から 5〜6分後の蛍光 眼底写真について脈絡膜新生血管の透過性亢進を評価した。 写真上の評価は、 一 人の熟練した眼科専門医が行った。 中間透光体の混濁のために評価不能であった 3眼を除き、 レーザースポッ ト毎に蛍光色素の透過性亢進が著しい病変を活動性 ありと判定した。 図 8は、 以下の各処理を施した眼底の蛍光写真である。 図 8 Aは、 10ng/mLのヒ トェフリン B 2処理、 図 8 Bは、 ネガティブコントロール '（P B S処理） 、 そし て図 8 Cは、 lOng/mLのマウスエフリン B 2処理の結果である。
P B Sを注射したネガティブコントロールでは、 10/16が活動性のある C N Vで あった。 一方、 エフリン B 2投与群では、 C N Vの活動性病変の割合は、 Ing/mL では 5/16、 lOng/mLでは 0/8、 100ng/mLでは 3/8であった。 10ng/mLおよび 100ng/mL のマウスエフリン B 2—ヒ ト Fcキメラタンパク質を用いたポジティブコントロー ル群では、 5/8および 5/16が活動性のある C N Vであった。 以上のように、 ヒ トエフリン B 2—ヒ ト Fc合成タンパク質は、 HUVECを用いたィ ンビトロの系で濃度依存的に増殖能を抑制した。 特に ΙΟΟηΜの濃度ではその増殖抑 制能は 95%であった。 まだ、 ヒ トエフリン B 2—ヒ ト Fc合成タンパク質は、 レーザ 一誘導性 C N Vモデルにおいて新生血管の発生を抑制し^。 その硝子体中の濃度 は 10ng/mLで有効であった。 レーザモデルで遊走してきた色素上皮には、 エフリン B 2が発現している （デ ータは示さず） 。 したがって、 エフリン B 2力 S、 色素上皮に発現することにより、 新生血管の新生が止まることが推測された。 本実施例の結果は、 エフリン B 2の 新生血管の新生を抑制する効果を実証した。
産業上の利用可能性
本発明の組成物および方法は、 血管形成または血管新生に関連した疾患または 障害の処置に有用である。 特に、 本発明の組成物および方法は、 網膜内の生理的 な血流を抑えることなく、 網膜外の病的な血管形成および血管新生を抑制するこ, とが可能である。 したがって、 本発明の組成物おょぴ方法は、 P D Tおよび種々 の抗血管形成薬剤 （例えば、 抗 V E G F剤） の注射によって提案されるような現 在の治療法に比べて、 AMDおよび糖尿病性網膜症のような血管形成または血管 新生に関連した眼科疾患の処置において、 特に有利に使用ざれ得る。

Claims

請求の範囲
1. 動脈内皮細胞を有効量のエフリン B 2と接触させる工程を含む、 動脈 内皮細胞における DN A合成を pi害する方法。
2. 前記 DN A合成が、 血管内皮細胞増殖因子、 塩基性繊維芽細胞增殖因 子、 または血小板由来増殖因子によって誘導される、 請求の範囲 1に記載の方法。
3. 動脈内皮細胞を有効量のエフリン B 2と接触させる工程を含む、 動脈 内皮細胞における p 44//p 42 MAPキナーゼ活性化を阻害する方法。
4. 前記 p 44Zp 42 MAPキナーゼ活性化が、 血管内皮細胞増殖因 子、 塩基性繊維芽細胞増殖因子、 または血小板由来増殖因子によって誘導される、 請求の範囲 3に記載の方法。 '
5. 動脈内皮細胞を有効量のエフリン B 2と接触させる工程を含む、 動脈 内皮細胞からの脈管形成を阻害する方法。
6. 前記脈管形成が、 血管内皮細胞増殖因子、 塩基性繊維芽細胞増殖因子、 または血小板由来増殖因子によつて誘導される、 請求の範囲 5に記載の方法。
7. 前記エフリン B 2が、 天然のエフリン B 2の細胞外ドメインを含むが、 細胞質ドメインおよぴ膜貫通ドメインを含まない、 請求の範囲 1から 6のいずれ かに記載の方法。
8. 前記動脈内皮細胞を有する哺乳動物に前記エフリン B 2を投与するこ とにより行われる、 請求の範囲 1から 7のいずれかに記載の方法。
9. 網膜からの血管新生を抑制する方法であって、 有効量のエフリン B 2 を個体に投与する工程を含む、 方法。
10. 前記個体が、 網膜外に病的な血管形成または血管新生を有するか、 または生じる可能性がある個体である、 請求の範囲 9に記載の方法。
1 1. 血管形成または血管新生に関連する疾患または障害の処置方法であ つて、 該処置の必要のある個体に有効量のエフリン B 2を投与する工程を含む、 方法。
12. 疾患 たは障害 : 加 ,斑変性症、 虚血性網膜症、 眼内血管 新生、 角膜血管新生、 網膜血管新生、 脈絡膜血管新生、 糖尿病性黄斑浮腫、 糖尿 病性網膜虚血、 糖尿病性網膜浮'腫、 糖尿病性網膜症、 癌、 慢性関節リウマチ、 子 宮内膜症、 および脱毛症からなる群から選択される、 請求の範囲 1 1に記載の方 法。
13. 前記疾患または障害が、 加齢黄斑変性症、 虚血性網膜症、 眼内血管 新生、 角膜血管新生、 網膜血管新生、 脈絡膜血管新生、 糖尿病性黄斑浮腫、 糖尿 病性網膜虚血、 糖尿病性網膜浮腫、 および糖尿病性網膜症からなる群から選択さ れる、 請求の範囲 12に記載の方法。
14. 前記エフリン B 2力 天然のエフリン B 2の細胞外ドメインを含む が、 細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインを含まない、 請求の範囲 9から 13の いずれかに記載の方法。 .
15. 有効量のエフリン B 2を含む、 動脈内皮細胞の DNA合成を阻害す るための組成物。 '
16. 有効量のエフリン B 2を含む、 動脈内皮細胞の p 44Zp 42 M A Pキナーゼ活性化を阻害するための組成物。
17. 有効量のエフリン B 2を含む、 動脈内皮細胞からの脈管形成を阻害 するための組成物。
18. 有効量のエフリン B 2を含む、 網膜からの血管新生を抑制するため の組成物。
19. 有効量のエフリン B 2を含む、 血管形成または血管新生に関連する 疾患または障害の処置のための薬学的組成物。
20. 前記疾患または障害が、 加齢黄斑変性症、 虚血性網膜症、 眼内血管 新生、 角膜血管新生、 網膜血管新生、 脈絡膜血管新生： 糖尿病性黄斑浮腫、 糖尿 病性網膜虚血、 糖尿病性網膜浮腫、 糖尿病性網膜症、 癌、 慢性関節リウマチ、 子 宮内膜症、 および脱毛症からなる群から選択される、 請求の範囲 19に記載の組 成物。
2 1 . 前記疾患または障害が、 加齢黄斑変性症、 虚血性網膜症、 眼内血管 新生、 角膜血管新生、 網膜血管新生、 脈絡膜血管新生、 糖尿病性黄斑浮腫、 糖尿 病性網膜虚血、 糖尿病性網膜浮腫、 および糖尿病性網膜症からなる群から選択さ れる、 請求の範囲 2 0に記載の組成物。
2 2 . 前記エフリン B 2力 天然のエフリン B 2の細胞外ドメインを含む が、 細胞質ドメイン
およぴ膜貫通ドメインを含まない、 請求の範囲 1 5から 2 1のいずれかに記載の 組成物。
2 3 . 有効量のエフリン B 2を含む、 動脈内皮細胞の D N A合成阻害剤。
2 4 . 有効量のエフリン B 2を含む、 動脈内皮細胞の p 4 4 Z p 4 2 M
A Pキナーゼ活性化阻害剤。
2 5 . 有効量のエフリン B 2を含む、 動脈内皮細胞からの脈管形成阻害剤。 ,2 6 . 前記エフリン B 2力 S、 天然のエフリン B 2の細胞外ドメ'ィンを含む が、 細胞質ドメイン
およぴ膜貫通ドメインを含まない、 請求の範囲 2 3から 2 5のいずれかに記載の 阻害剤。 ，
2 7 . 有効量の^フリン B 2を含む、 網膜血管新生抑制剤。 、 2 8 . 前記エフリン B 2が、 天然のエフリン B 2の細胞外ドメインを含む が、 細胞質ドメイン
および膜貫通ドメインを含まない、 請求の範囲 2 7に記載の抑制剤。
2 9 . 有効量のエフリン B 2を含む、 血管形成または血管新生に関連する 疾患または障害の予防 ·治療剤。
3 0 . 前記疾患または障害が、 加齢黄斑変性症、 虚血性網膜症、 眼内血管 新生、 角膜血管新生、 網膜血管新生、 脈絡膜血管新生、 糖尿病性黄斑浮腫、 糖尿 病性網膜虚血、 糖尿病性網膜浮腫、 糖尿病性網膜症、 癌、 慢性関節リウマチ、 子 宫内膜症、 および脱毛症'からなる群から選択される、 請求の範囲 2 9に記載の予 防 ·治療剤。
3 1 . 前記疾患または障害が、 加齢黄斑変性症、 虚血性網膜症、 眼内血管 新生、 角膜血管新生、 網膜血管新生、 脈絡膜血管新生、 糖尿病性黄斑浮腫、 糖尿 病性網膜虚血、 糖尿病性網膜浮腫、 および糖尿病性網膜症からなる群から選択さ れる、 請求の範囲 3 0に記載の予防 ·治療剤。
3 2 . 前記エフリン B 2が、 天然のエフリン B 2の細胞外ドメインを含む が、 細胞質ドメイン '
およぴ膜貫通ドメインを含まない、 請求の範囲 2 9カゝら 3 1のいずれかに記載の 予防 ·治療剤。 '
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