WO2006132406A1 - 下痢を伴う疾患の治療剤としてのnpy y2アゴニスト - Google Patents

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WO2006132406A1
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npy
agonist
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diarrhea
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Jun Suzuki
Ryuichi Moriya
Hiroyasu Hirose
Akio Kanatani
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Banyu Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • G01N2800/06—Gastro-intestinal diseases

Definitions

  • the present invention relates to a novel use of NPY Y2 agonist for the purpose of treating diseases associated with diarrhea.
  • the present invention also relates to a method for evaluating a compound that targets NPY Y2 and is effective in treating a disease associated with diarrhea.
  • NPY neuropept i deY
  • NPY is widely distributed in the central nervous system and peripheral nervous system, and is responsible for various functions in the living body as one of the most abundant peptides in the nervous system.
  • NPY acts as an appetite promoting substance in the center and significantly promotes fat accumulation through the secretion of various hormones or the action of the nervous system.
  • continuous intraventricular administration of NPY is known to induce obesity and insulin resistance based on these effects.
  • NPY is also known to have central effects such as depression, anxiety, schizophrenia, pain, dementia and circadian rhythm regulation.
  • NPY coexists with norepinephrine at the sympathetic endings in the periphery and is associated with sympathetic nervous system tension.
  • Peripheral administration of NPY is known to cause vasoconstriction and to enhance the effects of other vasoconstrictors such as norepinephrine.
  • NPY consists of its peptide YY (Petide-YY: hereinafter referred to as PYY) and Pancreatic Polypeptide (hereinafter referred to as PP). It has a wide variety of pharmacological actions through some common receptors. These NPY pharmacological actions are known to be triggered through the interaction of at least five types of receptors, such as NPY Y1 to Y5 (Trends in Neuroscience, 20, 294). 1997: Non-patent literature 2). The NPY Y2 receptor was cloned by Rose et al. In 1995 (J. Biol. Chenu 270, 22661, 1995: Non-Patent Document 3; J. Biol.
  • the NPY Y2 receptor has a seven-transmembrane structure and shows 31% homology with the Y1 receptor at the amino acid level.
  • Northern analysis shows that it is strongly expressed in the brain and weakly expressed in the small intestine, but not in a wide range of tissues such as the Y1 receptor. In the brain, it is particularly strongly expressed in the cerebral cortex and hippocampus, but is hardly expressed in the cerebellum and spinal cord.
  • NPY and related peptides The function of NPY and related peptides is expressed by binding to NPY receptors present in the central or peripheral nervous system. Therefore, expression of these pharmacological effects can be prevented by inhibiting the binding of NPY and related peptides to the NPY receptor.
  • substances that antagonize NPY receptor binding of PY and related peptides are various diseases involving NPY and related peptides such as angina pectoris, acute congestive heart failure, myocardial infarction, hypertension, kidney disease, electrolyte abnormality Circulatory system diseases such as vasospasm, such as bulimia, depression, anxiety, convulsions, epilepsy, dementia, pain, alcoholism, withdrawal symptoms associated with drug withdrawal, circadian rhythm modulation, schizophrenia Nervous system diseases such as hypertension, memory disorder, sleep disorder, cognitive disorder, etc., metabolic diseases such as hypertrophy, diabetes, abnormal hormone secretion, gout, fatty liver, reproductive system diseases such as infertility, premature birth, sexual dysfunction, Expected to be useful in the prevention or treatment of gastrointestinal diseases, respiratory diseases, inflammatory diseases or glaucoma.
  • Circulatory system diseases such as vasospasm, such as bulimia, depression, anxiety, convulsions, epilepsy, dementia, pain
  • Non-Patent Document 1 Nature, 296 ⁇ , 659, 1982
  • Non-Patent Document 2 Trends in Neuroscience, 20, 294, 1997
  • Non-Patent Document 3 J. Biol. Chenu 270, 22661, 1995
  • Non-Patent Document 4 J. Biol. Chenu 270, 26758, 1995
  • Non-Patent Document 5 Drug & Aging, 18, 201, 2001
  • the present invention has been made in view of the above-described problems of the prior art, and an object of the present invention is to provide a drug capable of suppressing diarrhea by a novel mechanism of action. It is another object of the present invention to provide a method for evaluating a compound including screening of the drug.
  • the present inventors have found that the NPY Y2 agonist acts to suppress intestinal movement and suppress diarrhea, thereby completing the present invention. That is, the NPY Y2 agonist of the present invention is a therapeutic agent for diseases associated with diarrhea.
  • the NPY Y2 agonist of the present invention is characterized in that the NPY Y2 agonist is an NPY analog.
  • the NPY Y2 agonist of the present invention is characterized in that the NPY Y2 agonist is a peptide comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1.
  • the NPY Y2 agonist of the present invention is characterized in that the NPY Y2 agonist is a peptide comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1.
  • the NPY Y2 agonist of the present invention is characterized in that the NPY Y2 agonist is a peptide having one or more amino acid substitutions, deletions, additions or insertions in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the NPY Y2 agonist of the present invention is characterized in that the disease is diarrhea or irritable bowel syndrome.
  • the therapeutic agent for diseases associated with diarrhea of the present invention is characterized by containing the above-mentioned NPY Y2 agonist.
  • the method for evaluating a compound of the present invention is a method for evaluating a compound used for the treatment of a disease associated with diarrhea, the step of introducing an NPY Y2 gene and preparing a cell expressing NPY Y2, and And a step of contacting the test compound and a step of detecting specific binding of the test compound to the NPY Y2.
  • the method for evaluating a compound of the present invention is a method for evaluating a compound used for the treatment of a disease associated with diarrhea, the step of introducing a NPY Y2 gene and preparing a cell expressing NPY Y2, and A step of contacting a test compound, a step of measuring the activity of an intracellular information transmitter produced by the contact, and a step of comparing the activity of the intracellular signal transmitter when the test compound is not contacted And including.
  • the method for evaluating a compound of the present invention is a method for evaluating a compound used for the treatment of a disease associated with diarrhea, the step of introducing an NPY Y2 gene and preparing a cell expressing NPY Y2, and Compared with the step of contacting the test compound, the level of expression of the intracellular signaling substance via the NPY Y2 or NPY Y2, and the NPY Y2 or NPY Y2 Selecting a test compound having an increased or decreased expression level of an intracellular signaling substance.
  • the method for evaluating a compound of the present invention is a method for evaluating a compound used for treating a disease associated with diarrhea, comprising a step of contacting a test compound with PY Y2, and a change in the activity of NPY Y2 due to the contact. And a detecting step.
  • the compound evaluation method of the present invention is characterized in that the compound is an NPY Y2 agonist.
  • NPY Y2 ligand of the present invention is characterized by being isolated by the method for evaluating a compound described above.
  • FIG. 1 is a diagram showing changes in digestibility caused by administration of NPY or PYY3-36.
  • FIG. 2 is a graph showing changes over time in the amount of excretion caused by the administration of PYY3-36.
  • FIG. 3 is a graph showing the total amount of excreted feces for 4 hours after administration of PYY3-36.
  • Fig. 4 shows changes in fecal excretion when diarrhea model animals are administered PYY3-36 and various drugs.
  • Figure 5 shows the total fecal excretion for 4 hours after administration of PYY3-36 and various drugs to diarrhea model animals.
  • NPYY2 refers to a seven-transmembrane molecule functioning as an NPY receptor.
  • the species to be derived is not particularly limited, and examples thereof include humans, monkeys, mice, rats, inu or rabbits.
  • human NPY Y2 is preferable because the subject of administration of the NPY Y2 agonist of the present invention and the subject of evaluation in the evaluation of compounds are humans.
  • the NPYY2 gene according to the present invention has one or more base substitutions, deletions, additions as long as it has a physiological function equivalent to that of the ⁇ 2 gene and encodes a protein that functions as an NPY receptor. Or a gene with an insertion is also included.
  • the sequence of the gene is not particularly limited as long as it is a gene encoding such a protein, but the homology is preferably 50% or more, and preferably 70% or more. More preferably, 80% or more is more preferable, 90% or more (for example, 9 1, 9 2, 9 3, 9.4, 9 5, 9 6, 9 7, 98, 9 9% or more) Is particularly preferred.
  • the NPY Y2 gene according to the present invention includes a nucleic acid that hybridizes with the NPY Y2 gene under stringent conditions.
  • “hybridizes under stringent conditions” means that two nucleic acid fragments are obtained from Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor (1989), 9.47-9.62 and 11.45-11.61. Means to hybridize with each other under the hybridization conditions described in. More specifically, for example, there may be mentioned conditions of performing hybridization with 6.0XSSC at about 45 t and then washing with 2.0 ⁇ SSC at 50 ° C.
  • the salt concentration in the washing process for example, low stringency About 2.0 x SSC, 5 (from TC, about 0.2 X SSC as high stringency, 50 can be selected.
  • the temperature of the washing step can be selected at room temperature under low stringency conditions, about 22
  • “disease associated with diarrhea” is an acute disease with no particular limitation as long as it is a disease / symptom associated with diarrhea. Regardless of whether or not the disease is a chronic disease, for example, diarrhea (parasitic, bacterial, viral, physical irritation, poor extinction, mental disorders, poor gastric acid secretion, digestion Such as those caused by inflammatory or allergic tracts), irritable bowel syndrome or ulcerative colitis.
  • the “NPY Y2 agonist” in the present invention refers to a substance that causes intracellular signal transmission through the NPY Y2 receptor, and is also referred to as an NPY Y2 agonist.
  • the NPY Y2 agonist according to the present invention is not particularly limited as long as it is a molecule that exhibits affinity for the NPY Y2 receptor and functions as an agonist. Examples of such molecules include low molecular weight compounds, proteins, and peptides.
  • the kind of the low-molecular compound is not particularly limited, and specific examples include natural compounds, organic compounds, and inorganic compounds.
  • the type of the peptide is not particularly limited, and specifically, for example, peptide YY (for example, PYY3-36), PY13-36, [Leu31, Pro34] which are analogs of PY NPY, Ac-NPY (24-36) [Leu28, Leu31].
  • peptide YY for example, PYY3-36
  • PY13-36 [Leu31, Pro34] which are analogs of PY NPY, Ac-NPY (24-36) [Leu28, Leu31].
  • PYY3-36 (SEQ ID NO: 1) is a peptide lacking 2 amino acids at the N-terminal in PYY (SEQ ID NO: 2) having 69% homology with NPY. It is known (Nature, 418 ⁇ , 650, 2002). PYY3-36 and PYY both have similar activity to NPY and have an affinity as an agonist for the NPY receptor.
  • PYY3-36 has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, but has a function as an NPY Y2 agonist and has one, two or more amino acid substitutions, deletions, additions or insertions in the amino acid sequence. Peptides are also included in the NPY Y2 agonist of the present invention.
  • the number of amino acids for such substitution, deletion, addition or insertion is not particularly limited as long as it has a function as an NPY Y2 agonist, but it is preferably 1 to 10 amino acids, preferably 1 to 8 amino acids. More preferably 1-5 amino acids. In particular, it is preferably 1 to 3 amino acids.
  • the NPY Y2 agonist of the present invention can be synthesized by a synthesis method known to those skilled in the art according to the species of compound. If the compound is derived from a natural product, it can be purified from the natural product by a predetermined extraction method. Further, if the agonist is a peptide, it can be synthesized by methods known to those skilled in the art.
  • NPY Y2 agonist of the present invention When used as a medicine for humans or other animals, in addition to administering these substances themselves to patients, they should be formulated by a known pharmaceutical method. Is also possible. For example, orally as a sugar-coated tablet, capsule, elixir, microcapsule as needed, or aseptic solution or suspension with water or other pharmaceutically acceptable liquid It can be used parenterally in the form of liquid injections.
  • a pharmacologically acceptable carrier or medium such as sterilized water or physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspending agent, surfactant, stabilizer, flavoring agent, excipient, vehicle, antiseptic It is conceivable to formulate the drug by combining it in a unit dosage form required for generally accepted pharmaceutical practice, in appropriate combination with drugs, binders, etc.
  • Additives that can be mixed into tablets and capsules include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth gum, gum arabic, excipients such as crystalline cell mouth, corn starch, gelatin, alginic acid Such swelling agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint lees, squid mono oil or cheri.
  • the above material can further contain a liquid carrier such as fats and oils.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice using a vehicle such as distilled water for injection.
  • aqueous solutions for injection include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants, such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, and sodium chloride, and suitable solubilizers such as Alcohols, specifically ethanol, polyalcohols such as propylene glycol, polyethylene glycol, nonionic surfactants such as polysorbate 80 (TM) and HC0-50 may be used in combination.
  • physiological saline isotonic solutions containing glucose and other adjuvants, such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, and sodium chloride
  • suitable solubilizers such as Alcohols, specifically ethanol, polyalcohols such as propylene glycol, polyethylene glycol, nonionic surfactants such as polysorbate 80 (TM) and HC0-50 may be used in combination.
  • oily liquid examples include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizing agent.
  • Buffers such as phosphate buffer, vinegar Sodium acid buffer solution, soothing agent, for example, hydrochloric acid pro-in, stabilizer, such as benzyl alcohol, phenol, antioxidant may be added.
  • the prepared injection is usually filled into a suitable ampoule.
  • intraarterial injection, intravenous injection, subcutaneous injection, etc., as well as intranasal, transbronchial, intramuscular, percutaneous, or oral administration to patients are performed by methods known to those skilled in the art. Yes.
  • the dosage varies depending on the weight and age of the patient, the administration method, etc., but it is possible for a person skilled in the art to appropriately select an appropriate dosage.
  • the agonist can be encoded by DNA, it may be possible to incorporate the DNA into a vector therapy vector and perform gene therapy.
  • the dose and method of administration vary depending on the patient's weight, age, symptoms, etc., but those skilled in the art can appropriately select them.
  • the dose of NPY Y2 agonist varies depending on the symptoms, but for oral administration (generally 60 kg), it is generally about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg per day. More preferred is considered to be about 1.0 to 20 mg.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptoms, and method of administration.
  • target organ usually in adults (weight 60 kg)
  • NPY Y2 gene or protein can be used to evaluate compounds that act on NPY Y2.
  • a method for detecting an action on NPY Y2 a method for detecting specific binding of a test compound to the receptor, a method for detecting the expression level of a gene changed by contact of the test compound, and a method produced by the contact
  • a method for detecting the activity of intracellular signal transduction via NPY Y2 can be mentioned. In the following, description will be given in order.
  • the method for evaluating a compound of the present invention comprises a step of introducing an NPY Y2 gene and preparing a cell that expresses NPY Y2, a step of bringing the test compound into contact with the cell, and a specificity of the test compound for the NPY Y2 And a step of detecting a mechanical bond.
  • the second method for evaluating a compound of the present invention comprises a step of introducing a NPY Y2 gene, preparing a cell expressing NPY Y2, a step of bringing a test compound into contact with the cell, and the contact.
  • the test compound is not particularly limited.
  • natural compounds, organic compounds, inorganic compounds, single compounds such as proteins, peptides, etc., compound libraries, gene library expression products, cell extracts examples include cell culture supernatants, fermented microorganism products, marine organism extracts, plant extracts, prokaryotic cell extracts, eukaryotic single cell extracts or animal cell extracts.
  • the test sample can be appropriately labeled and used as necessary. Examples of the label include a radiolabel and a fluorescent label. In addition to the above test sample, a mixture of a plurality of these test samples is also included.
  • a cell expressing the NPY Y2 gene may be prepared by a method known to those skilled in the art, and a specific method is not particularly limited.
  • the following method can be used. That is, it is prepared by cloning a nucleic acid comprising the NPY Y2 gene or a part thereof into an expression vector containing a suitable promoter and transcriptional regulatory elements, and introducing a vector having the cloned nucleic acid into a host cell.
  • the vector is not particularly limited as long as it can be used as an expression vector.
  • pCMV-Tag pcDNA3.
  • V5-HisB pCR2.1
  • pETIKAgtll or pCR3.1.
  • an expression vector into which a nucleic acid comprising the NPY Y2 gene or a part thereof has been introduced is introduced into a host cell.
  • host cells are not particularly limited as long as they are commonly used for gene expression, and may be animal cells, insect cells, plant cells, or microorganisms. Specifically, for example, COS K C0S7, CH0, ⁇ / 3T3, 293, Raju CV11, C127K MRC-5, CPAE, HeLa, 293T or Sf9.
  • the method for introducing the expression vector into the host cell is not particularly limited as long as it is a known method.
  • the electroporation method the calcium phosphate method, the DEAE-dextran method, the lipofection method Or a gene gun is mentioned.
  • the test compound is brought into contact with the cells expressing NPY Y2 prepared as described above.
  • the contacting method is not particularly limited.
  • NPY Y2 is in a purified state, it can be carried out by adding a test sample to the purified sample.
  • the test sample is added to the cell culture solution or the cell extract, respectively. It can be carried out.
  • a vector containing DNA encoding the protein is introduced into a cell expressing NPY Y2, or the vector is a cell expressing NPY Y2. It can also be carried out by adding to the extract.
  • the binding between the receptor expressed on the cell surface and the test compound can be achieved, for example, by detection using a label attached to the bound compound (for example, detection of the amount of binding by radioactivity or fluorescence intensity).
  • Signal transduction into the cell caused by binding to the receptor on the cell surface for example, G protein activation, cAMP, or Ca2 + concentration change (FLIPR (Fluorescent Imaging Reader))
  • Phospholipase C activation, pH change, receptor internalization can be detected as indicators.
  • the expression level and activity of a signal transducing molecule can also be used as an index.
  • the method for measuring the expression level is not particularly limited, and examples thereof include Northern blotting, Western plotting, and DNA chip.
  • the “expression level” in the present invention refers to the absolute or relative amount of a transcription product of a gene encoding a protein present on a signal transduction pathway via NPY Y2.
  • the gene includes either DNA or mRNA.
  • the target of expression detection is a protein
  • the “expression level” means the absolute or relative amount of the translation product of the protein present on the signal transduction pathway via NPY Y2.
  • the activity measurement method is not particularly limited, and a suitable method may be selected depending on the type of molecule to be measured.
  • the isolated NPY Y2 protein can also be used directly for compound evaluation. That is, this is a method of contacting a test compound with NPY Y2, and then detecting a change in the activity of the NPY Y2 protein caused by the contact. '
  • the contact method is not particularly limited, and specifically, for example, a buffer solution (phosphorus) Acid buffer, etc.) and the like, and the method of fixing the NPY Y2 protein on the membrane and bringing it into contact with the test compound on the membrane. '
  • the protein activity measurement method may be appropriately set depending on the properties of the protein to be used, and specifically includes, for example, a method using the binding activity of a ligand for NPY Y2 as an index.
  • the method using the ligand binding activity as an index is not particularly limited. Specifically, for example, the binding activity is measured by measuring the affinity of the test compound for the membrane on which NPY Y2 is immobilized. A method is mentioned.
  • the test compound used here may be labeled with a radioisotope or the like so as to be easily detected.
  • a method for detecting the binding activity there is a method for detecting a compound that binds to NPY Y2 in competition with a radioisotope-labeled ligand. When such a method is used, the label of the test compound is It is unnecessary.
  • the binding activity in the presence of the test compound is lower than the binding activity (control) in the absence of the test compound.
  • the test compound is determined to have an activity of inhibiting the binding between NPY Y2 according to the present invention and the ligand.
  • a compound includes a compound having an activity of binding to the receptor and inducing signal transduction into a cell (Ago: Eust), a compound not having the activity (antagonist), and the like.
  • the agonist has the same physiological activity as the ligand for the receptor and its analog, while the antagonist suppresses the physiological activity of the ligand for the receptor and its analog. For this reason, these agonists and antagonists are useful as pharmaceutical compositions for the treatment of diseases caused by abnormalities in the signal transduction system via NPY 2 according to the present invention.
  • a substance that promotes or inhibits intracellular signal transduction after binding of a test compound to NPY-2 can be screened. That is, by evaluating a plurality of test compounds by the above-described method, a compound that functions as an agonist or an antagonis can be selected. Of such choice, if the change is suppressed compared to the change in intracellular signal transduction when rigaside and its analogs are allowed to act in the absence of the test compound, the test compound is tested against NPY Y2. It is determined that the compound inhibits intracellular signal transduction after compound binding.
  • the compound is determined to be a compound that promotes intracellular signal transduction after binding of the test compound to NPY Y2.
  • Compounds selected by such screening methods are effective in treating or alleviating symptoms associated with diarrhea.
  • compounds that function as NPYY2 agonists are particularly effective in treating or alleviating symptoms associated with diarrhea. It is valid.
  • mice C57BL / 6 used for the test was prepared. Mice are individually housed in cages with flooring in a controlled animal room (temperature 23, relative humidity 55%, lighting time 7:00 to 19:00), and rodent food (CE-2, Nippon Claire) and drinking water were taken freely.
  • NPY 0.3 mg / kg and 3 mg / kg
  • PYY3-36 0.3 mg / kg and 3 mg / kg
  • Gastrointestinal motility was measured as follows. Specifically, thiacol powder was suspended in a 0.5% methylcellulose solution and orally administered to mice, and after 30 minutes, how far thiacol entered the stomach had moved was dissected and measured.
  • the total length of the small intestine from the stomach pylorus to the cecal origin was also measured, and the ratio (%) of the movement distance of thiacol to the total length of the small intestine was plotted as GI (gastrointestinal) motility.
  • mice administered with NPY or PYY3-36 had lower GI motility than control mice.
  • NPY Y2 agonist It was confirmed that gastrointestinal motility was suppressed by administration.
  • mice (C57BL / 6) were used for the test and were reared and fed under the same conditions as in Example 1.
  • PYY3-36 (3 mg / kg) was intraperitoneally administered to mice, and the amount of excretion was measured over time (1, 2, 3 and 4 hours). At the same time, the amount of excretion was also measured in control mice that received the solvent alone.
  • mice (C57BL / 6) were used for the test and were reared and fed under the same conditions as in Example 1.
  • mice PYY3-36 (3 mg / kg) and other test drugs (l operami de lmg / kg (Comparative Example 1) and at ropine lOmg / kg (Comparative Example 2) ) was intraperitoneally administered, and 15 minutes after the administration, castor oil (0.3 ml / animal) was orally administered. Over time (1, 2, and 4 hours), fecal volume and diarrhea score (normal 0, loose stool 2) were measured. At the same time, the same measurement was performed on mice that received only the solvent and no castor oil.
  • mice pre-treated with PYY3-36 already had a decrease in fecal excretion after 1 hour of castor oil treatment, and then compared with the control mice treated with solvent + castor oil. The amount of excretion was significantly less.
  • the maximum diarrhea score observed up to 4 hours after castor oil treatment was significantly suppressed in the mice pre-treated with PYY3-36 compared to the control mice treated with solvent + castor oil.
  • administration of PYY3-36 suppressed colonic intestinal motility and confirmed the suppression of diarrheal symptoms.
  • PYY3-36 was highly effective in suppressing diarrhea.
  • NPY Y2 agonist and the compound evaluation method of the present invention it is possible to provide a drug capable of suppressing diarrhea by a novel mechanism of action.
  • a method for evaluating a compound having an antidiarrheal activity including screening for such drugs.

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Abstract

下痢を伴う疾患の治療剤としてNPY Y2アゴニストを使用する。また、NPY Y2受容体を標的とした化合物の評価を行うことにより、前記疾患の治療を可能とする化合物の評価、スクリーニングが可能となる。すなわち、本発明により、新規な作用メカニズムにより下痢の抑制を可能とする薬剤を提供すること、及び、当該薬剤のスクリーニングをはじめとする化合物の評価方法を提供することが可能となる。

Description

明 細 書 下痢を伴う疾患の治療剤としての NPY Y2ァゴニスト 技 術 分 野
本発明は、 NPY Y2ァゴニストの、 下痢を伴う疾患の治療を目的とした新規用途に 関する。 また、 NPY Y2を標的とする、 下痢を伴う疾患に治療に有効な化合物の評価 方法に関する。 背 景 技 術
NPY (neuropept i deY) は 36アミノ酸からなるペプチドであり、 1982年、 立元ら により豚脳より単離された （Nature、 296巻、 659頁、 1982年：非特許文献 1 ) 。
NPY は中枢神経系及び末梢神経系に広く分布し、 神経系における最も多量に存在す るペプチドの一つとして、 生体において多様な機能を司っている。
すなわち、 NPY は中枢において食欲促進物質として働くとともに、 各種ホルモン の分泌又は神経系の作用を介して脂肪蓄積を顕著に促進する。 例えば、 NPY の脳室 内連続投与はこれらの作用に基づき、 肥満及びィンスリン抵抗性を誘発することが 知られている。 また、 NPY は、 うつ病、 不安、 精神***、 痛み、 痴呆及び概日リズ ムの調節などの中枢作用を持つことが知られている。 さらに、 NPY は、 末梢におい て、 交感神経終末にノルェピネフリンと共存し、 交感神経系の緊張性と関係してい る。 NPY の末梢投与は血管収縮を引き起こし、 またノルェピネフリンを初めとする 他の血管収縮物質の作用を増強することが知られている。
NPYは、 その類縁体であるぺプタイド YY (Pe t ide-YY：以下、 PYYと称する） 及 びパンクレアティック ·ポリぺプ夕イド （Pancreat i c Po lypept i de：以下、 PP と 称する） と一部共通の受容体を介して、 多種多様な薬理作用を有する。 これら NPY による薬理作用は NPY Y1から Y5といった、 少なくとも 5種類の受容体の単独ある いは相互作用を介して惹起されることが知られている（Trends in Neurosc i ence, 20巻、 294頁、 1997年：非特許文献 2 ) 。 NPY Y2受容体は、 1995年に Roseらによってクローニングされた（J. Biol . Chenu 270巻、 22661頁、 1995年：非特許文献 3 ； J. Biol . Chem, 270巻、 26758頁、 1995 年：非特許文献 4、 等） 。 NPY Y2受容体は 7回膜貫通構造を有し、 Y1受容体とアミ ノ酸レベルで 31 %の相同性を示す。 ノーザン解析の結果から、 脳に強く発現し、 小 腸で弱い発現が見られるが、 Y1 受容体のような広範な組織での発現は見られない。 脳においては、 特に大脳皮質、 海馬に強く発現する一方、 小脳や脊髄では殆ど発現 が見られない。
NPY及び関連べプチドの機能は、 中枢又は末梢神経系に存在する NPY受容体に結 合することにより発現される。 しこがって、 NPY及び関連ペプチドの NPY受容体と の結合を阻害すればこれらの薬理作用発現を阻止することができる。その結果、 PY 及び関連べプチドの NPY受容体結合に拮抗する物質は NPY及び関連べプチドが関与 する各種疾患、例えば狭心症、急性 ·うつ血性心不全、心筋梗塞、高血圧、 腎臓病、 電解質異常、 血管れん縮等の循環器系疾患、 例えば過食症、 うつ病、 不安、 痙攣、 てんかん、 痴呆、 痛み、 アルコール依存症、 薬物の断薬に伴う禁断症状、 概日リズ ムの変調、 統合失調症、 記憶障害、 睡眠障害、 認知障害等の神経系疾患、 例えば肥 満症、 糖尿病、 ホルモン分泌異常、 痛風、 脂肪肝等の代謝性疾患、 不妊、 早産、 性 機能障害等の生殖系疾患、 消化管系疾患、 呼吸器系疾患、 炎症性疾患又は緑内障等 の予防又は治療における有用性が期待できる。
このように、 NPY及び関連ペプチドとその受容体の生体内の機能の解明が前述の 各種疾患に対する治療薬や診断薬の開発に繋がることから、 NPYや NPY受容体を標 的とした創薬研究が急速に進められている。
一方、 下痢症、 過敏性腸症候群 （i rr i table bowel syndrome： IBS) のような下痢 を伴う疾患は、 消化器の疾患としてのみならず、 現代の生活習慣を反映した慢性病 として問題となっており、 その症状を抑えるために既に多くの医薬が利用されてい る。 このような医薬としては、 鎮痙薬、 乳酸菌製剤、 抗菌剤、 抗炎症薬、 消化管運 動調律薬などが知られており、 メカニズムの観点から、 ムスカリン拮抗薬、 セロト ニン拮抗薬、 ォピオイド作動薬などが知られている （Drug & Aging、 18巻、 201 頁、 2001年：'非特許文献 5 ) '
(非特許文献 1 ) Nature、 296卷、 659頁、 1982年 (非特許文献 2 ) Trends in Neurosc ience、 20巻、 294頁、 1997年
(非特許文献 3 ) J. Biol. Chenu 270巻、 22661頁、 1995年
(非特許文献 4 ) J. Biol . Chenu 270巻、 26758頁、 1995年
(非特許文献 5 ) Drug & Aging、 18巻、 201頁、 2001年 発 明 の 開 示
しかしながら、 下痢を抑える薬剤として、 より副作用が少なく、 新たなメカニズ ムの薬剤が望まれているのが現状であった。
本発明は、 上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、 新規な作用 メカニズムにより下痢の抑制を可能とする薬剤を提供することを目的とする。また、 当該薬剤のスクリーニングをはじめとする化合物の評価方法を提供することを目的 とする。
本発明者らは、 上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、 NPY Y2ァゴニスト が腸の運動を抑制し、 下痢を抑える働きをすることを見出し、 本発明を完成した。 すなわち、 本発明の NPY Y2ァゴニストは、 下痢を伴う疾患の治療剤であることを 特徴とする。
また、 本発明の NPY Y2ァゴニストは、 前記 NPY Y2ァゴニス卜が NPY類縁体であ ることを特徴とする。
また、 本発明の NPY Y2ァゴニストは、 前記 NPY Y2ァゴニストが配列番号 1に記 載のアミノ酸配列を含むペプチドであることを特徴とする。
また、 本発明の NPY Y2ァゴニストは、 前記 NPY Y2ァゴニス卜が配列番号 1に記 載のアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする。
さらに、 本発明の NPY Y2ァゴニストは、 前記 NPY Y2ァゴニス卜が、 配列番号 1 に記載のアミノ酸配列において 1又は 2以上のアミノ酸の置換、 欠失、 付加又は揷 入を有するペプチドであることを特徴とする。
また、 本発明の NPY Y2ァゴニストは、 前記疾患が下痢症又は過敏性腸症候群であ ることを特徴とする。
また、 本発明の下痢を伴う疾患の治療剤は、 上述の NPY Y2ァゴニストを含むこと を特徴とする。 また、 本発明の化合物の評価方法は、 下痢を伴う疾患の治療に用いる化合物の評 価方法であって、 NPY Y2遺伝子を導入し、 NPY Y2を発現する細胞を調製する工程と 、 当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、 当該 NPY Y2に対する該被検化合物の 特異的結合を検出する工程と、 を含むことを特徵とする。
さらに、 本発明の化合物の評価方法は、 下痢を伴う疾患の治療に用いる化合物の 評価方法であって、 NPY Y2遺伝子を導入し、 NPY Y2を発現する細胞を調製する工程 と、 当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、 当該接触により生じた細胞内情報 伝達物質の活性を測定する工程と、 当該活性と被検化合物を接触させない場合の該 細胞内情報伝達物質の活性とを比較する工程と、 を含むことを特徴とする。
また、 本発明の化合物の評価方法は、 下痢を伴う疾患の治療に用いる化合物の評 価方法であって、 NPY Y2遺伝子を導入し、 NPY Y2を発現する細胞を調製する工程と 、 当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、 当該 NPY Y2又は NPY Y2を介した細 胞内情報伝達物質の発現レベルを測定する工程と、 該接触前と比較して、 NPY Y2又 は NPY Y2を介した細胞内情報伝達物質の発現レベルを増加又は減少させた被検化合 物を選択する工程と、 を含むことを特徴とする。
さらに、 本発明の化合物の評価方法は、 下痢を伴う疾患の治療に用いる化合物の 評価方法であって、被検化合物を、 PY Y2に接触させる工程と、 当該接触による NPY Y2の活性の変化を検出する工程と、 を含むことを特徴とする。
また、 本発明の化合物の評価方法は、 前記化合物が NPY Y2ァゴニストであること を特徴とする。
さらに、 本発明の NPY Y2リガンドは、 上述の化合物の評価方法により単離された ことを特徴とする。
本発明によれば、 新規な作用メカニズムによる下痢の抑制を可能とする薬剤を提 供することが可能となる。また、このような薬剤のスクリーニングをはじめとする、 下痢抑制作用を有する化合物の評価方法を提供することが可能となる。 図面の簡単な説明
図 1は、 NPY又は PYY3-36投与によって生じた消化能の変化を示す図である。 図 2は、 PYY3-36投与によって生じた排糞量の経時的な変化を示す図である。 図 3は、 PYY3- 36投与後 4時間の総排糞量を示す図である。
図 4は、 下痢モデル動物に PYY3-36及び各種薬剤を投与した際の排糞量の変化を 示す図である。
図 5は、 下痢モデル動物に PYY3- 36及び各種薬剤を投与後 4時間の総排糞量を示 す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
本発明にかかる 「NPYY2」 とは、 上述したように、 NPYの受容体として機能する 7 回膜貫通構造の分子をいう。 また、 由来となる生物種は特に限定されず、 例えば、 ヒト、 サル、 マウス、 ラット、 ィヌ又はゥサギが挙げられる。 中でも、 本発明の NPY Y2ァゴニストの投与対象や、化合物の評価における評価対象がヒトであることから、 ヒト NPY Y2であることが好ましい。
また、 本発明に係る NPYY2遺伝子には、 ΝΡΥΎ2遺伝子と同等の生理機能を有し、 NPY受容体としての機能するタンパク質をコードするものであれば 1又は 2以上の 塩基の置換、 欠失、 付加又は挿入がある遺伝子も含まれる。 ここで、 当該遺伝子と ,しては、 かかるタンパク質をコードする遺伝子であればその配列は特に制限されな いが、 相同性が 50%以上であることが好ましく、 7 0%以上であることがより好 ましく、 8 0 %以上であることがさらに好ましく、 9 0 %以上 （例えば、 9 1、 9 2、 9 3、 9.4、 9 5、 9 6、 9 7、 98、 9 9 %以上） であることが特に好まし い。
また、 本発明に係る NPY Y2遺伝子には、 NPY Y2遺伝子とストリンジェントな条 伴下でハイブリダィズする核酸も含まれる。 ここで、 「ス卜リンジェントな条件で ハイブリダィズする」とは、二つの核酸断片が、 Molecular Cloning： A Laboratory Manual,第 2版、コールドスプリングハ一バー (1989)、 9.47-9.62及び 11.45-11.61 に記載されたハイブリダイゼーション条件下で、 相互にハイブリダイズすることを 意味する。より具体的には、例えば、約 45tにて 6.0XSSCでハイブリダィゼーショ ンを行った後に、 50°Cにて 2.0xSSCで洗浄する条件が挙げられる。 ストリンジェン シー選択のため、 洗浄工程における塩濃度を、 例えば低ストリンジエンシーとして の約 2. 0xSSC、 5(TCから、 高ストリンジエンシーとしての約 0. 2 X SSC、 50 まで選 択することができる。さらに、洗浄工程の温度を低ストリンジエンシー条件の室温、 約 22でから、 高ストリンジエンシー条件の約 65 まで上昇させることができる。 また、 本発明における 「下痢を伴う疾患」 とは、 下痢を伴う疾患 ·症状であれば 特に制限はなく、急性疾患であるか慢性疾患であるかは問わない。このような疾患 · 症状としては、 例えば、 下痢症 （寄生虫性、 細菌性、 ウィルス性、 物理的刺激、 消 化不良、 精神障害、 胃酸分泌不良、 消化管の炎症性又はアレルギーを原因とするも の等） 、 過敏性腸症候群又は潰瘍性大腸炎等が挙げられる。
( 1 ) PY Y2ァゴニスト
本発明における 「NPY Y2ァゴニスト」 とは、 NPY Y2受容体を介して細胞内シグナ ル伝達を引き起こす物質をいい、 NPY Y2作動剤ともいう。また、本発明にかかる NPY Y2ァゴニストは、 NPY Y2受容体に親和性を示し、 ァゴニストとして機能する分子で あればその分子種は特に制限されない。 このような分子としては、 例えば、 低分子 化合物、 タンパク質、 ペプチドを挙げることができる。 前記低分子化合物としても その種類は特に制限されず、 具体的には、 例えば、 天然化合物、 有機化合物又は無 機化合物が挙げられる。 また、 前記ペプチドとしてもその種類は特に制限されず、 具体的には、例えば、 PYの類縁体であるぺプ夕ィド YY (例えば、 PYY3-36)、 PY13-36、 [Leu31, Pro34] NPY、 Ac- NPY (24-36) [Leu28, Leu31]が挙げられる。
前記の PYY3-36 (配列番号 1 ) は、 NPYと 6 9 %の相同性を有する PYY (配列番号 2 ) において. N末端の 2アミノ酸が欠失したペプチドであり、 摂食を抑制する分子 として知られている （Nature、 418卷、 650頁、 2002年） 。 PYY3- 36及び PYYはいず れも NPYと類似の活性を有し、 NPY受容体に対してァゴニストとしての親和性を有 する。
PYY3-36は、 配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有するが、 NPY Y2ァゴニストと しての機能を有し且つ当該アミノ酸配列において 1又は 2以上のアミノ酸の置換、 欠失、 付加又は挿入を有するペプチドも本発明の NPY Y2ァゴニストに含まれる。 か かる置換、 欠失、 付加又は挿入のアミノ酸数としては、 NPY Y2ァゴ ストとしての 機能を有する限り特に制限はないが、 1〜 1 0アミノ酸であることが好ましく、 1 〜 8アミノ酸であることがより好ましく、 1〜 5アミノ酸であることがさらに好ま しく、 1〜3アミノ酸であることが特に好ましい。
本発明の NPY Y2ァゴニストは、 化合物であればィヒ合物種に応じた当業者に公知の 合成法により合成することができる。 また、 化合物が天然物由来であれば、 当該天 然物より所定の抽出方法により精製することができる。 さらに、 当該ァゴニストが ペプチドであれば、 当業者に公知の方法により合成することができる。
本発明の NPY Y2ァゴニストをヒトゃ他の動物の医薬として使用する場合には、 こ れらの物質自体を直接患者に投与する以外に、 公知の製剤学的方法により製剤化し て投与を行うことも可能である。 例えば、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセ ル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤として経口的に、 あるいは水もしくはそ れ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 又は懸濁液剤の注射剤の形で非経 口的に使用できる。 例えば、 薬理学上許容される担体若しくは媒体、 具体的には、 滅菌水や生理食塩水、 植物油、 乳化剤、 懸濁剤、 界面活性剤、 安定剤、 香味剤、 賦 形剤、 べヒクル、 防腐剤、 結合剤等と適宜組み合わせて、 一般に認められた製薬実 施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。 錠剤、 カプセル剤に混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラチン、 コーンスターチ、 トラガントガム、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル口一 スのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸のような膨化剤、 ステ アリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖又はサッカリンのような甘味 剤、 ペパーミン卜、 ァカモノ油又はチェリ一のような香味剤が用いられる。 調剤単 位形態がカプセルである場合には、 上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含 有することができる。 注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなべヒクルを 用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、 例えば生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む 等張液、 例えば D-ソルビトール、 D-マンノース、 D-マンニトール、 塩化ナトリウム が挙げられ、 適当な溶解補助剤、 例えばアルコール、 具体的にはエタノール、 ポリ アルコール、 例えばプロピレングリコール、 ポリエチレングリコール、 非イオン性 界面活性剤、 例えばポリソルべ一ト 80 (TM) 、 HC0-50と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールと併用してもよい。 また、 緩衝剤、 例えばリン酸塩緩衝液、 酢 酸ナトリウム緩衝液、 無痛化剤、 例えば、 塩酸プロ力イン、 安定剤、 例えばべンジ ルアルコール、 フエノール、 酸化防止剤と配合してもよい。 調製された注射液は通 常、 適当なアンプルに充填させる。
患者への投与は、 例えば、 動脈内注射、 静脈内注射、 皮下注射などのほか、 鼻腔 内的、 経気管支的、 筋内的、 経皮的、 または経口的に当業者に公知の方法により行 いうる。 投与量は、 患者の体重や年齢、 投与方法などにより変動するが、 当業者で. あれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、当該ァゴニストが DNA によりコードされうるものであれば、 当該 DNAを遺伝子治療用べクタ一に組込み、 遺伝子治療を行うことも考えられる。 投与量、 投与方法は、 患者の体重や年齢、 症 状などにより変動するが、 当業者であれば適宜選択することが可能である。
NPY Y2ァゴニストの投与量は、 症状により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般 的に成人 （体重 60kgとして） においては、 1 日あたり約 0. 1から 100mg、 好ましく は約 1. 0から 50mg、 より好ましくは約 1. 0から 20mgであると考えられる。
非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与 方法によっても異なるが、 例えば注射剤の形では通常成人 （体重 60kgとして） にお いては、 通常、 1 日当り約 0. 01から 30mg、 好ましくは約 0. 1から 20mg、 より好ま しくは約 0. 1から 10mg程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考えられ る。
( 2 ) 化合物の評価
NPY Y2遺伝子又はタンパク質を用いて、 NPY Y2に作用する化合物の評価をするこ とができる。 NPY Y2に対する作用を検出する方法として、 被検化合物の当該受容体 に対する特異的結合を検出する方法、 被検化合物の接触によって変化した遺伝子の 発現量を検出する方法、 及び、 当該接触によって生じた NPY Y2を介した細胞内情報 伝達の活性を検出する方法が挙げられる。 以下、 順に説明する。
先ず、 被検化合物の当該受容体に対する特異的結合を検出することにより、 被検 化合物を評価する方法について説明する。
本発明の化合物の評価方法は、 NPY Y2遺伝子を導入し、 NPY Y2を発現する細胞を 調製する工程と、 当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、 当該 NPY Y2に対する 当該被検化合物の特異的結合を検出する工程と、 を含むことを特徴とする。 また、 本発明の第 2の化合物の評価方法は、 NPY Y2遺伝子を導入し、 NPY Y2を発 現する細胞を調製する工程と、 当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、 当該接 触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程と、 当該活性と被検化合 物を接触させない場合の該細胞内情報伝達物質の活性とを比較する工程と、 を含む ことを特徴とする。
被検化合物としては、 特に制限はなく、 例えば、 天然化合物、 有機化合物、 無機 化合物、 タンパク質、 ペプチド等の単一化合物、 並びに、 化合物ライブラリー、 遺 伝子ライブラリーの発現産物、 細胞抽出物、 細胞培養上清、 発酵微生物産生物、 海 洋生物抽出物、 植物抽出物、 原核細胞抽出物、 真核単細胞抽出物若しくは動物細胞 抽出物等を挙げることができる。 上記被験試料は必要に応じて適宜標識して用いる ことができる。 標識としては、 例えば、 放射標識、 蛍光標識等を挙げることができ る。 また、 上記被験試料に加えて、 これらの被験試料を複数種混合した混合物も含 まれる。
また、 NPY Y2 遺伝子を発現する細胞は、 当業者が公知の方法で調製すればよく、 具体的な方法としては特に制限はないが、 例えば以下の方法によることができる。 すなわち、 NPY Y2遺伝子又はその 部からなる核酸を好適なプロモーター及び転写 調節エレメントを含む発現べクタ一にクローニングし、 クローニングされた核酸を 有するベクタ一を宿主細胞に導入することにより調製する。 ここで、 前記ベクター としては、 発現ベクターとして利用可能なものであれば特に限定されないが、 例え ば、 pCMV-Tag, pcDNA3. K pBl ueBacHi s2, pCI - neo、 pcDNAI , pMCl neo, pXTK pSG5、 PEF1/V5- Hi sB、 pCR2. 1、 pETI K A gt l l又は pCR3. 1が挙げられる。
次に、 NPY Y2遺伝子又はその一部からなる核酸が導入された発現べクタ一を宿主 細胞に導入する。 かかる宿主細胞としては、 遺伝子の発現に通常使用されるもので あれば特に限定されず、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞、 微生物のいずれであって もよく、具体的には、例えば、 COS K C0S7、 CH0、匪 /3T3、 293、 Raj u CV1 1、 C127K MRC- 5、 CPAE、 HeLa、 293T又は S f 9が挙げられる。 また、 発現ベクターを宿主細胞 に導入する方法としては、 公知の方法であれば特に限定されないが、 具体的には、 例えば、 エレグトロポレーシヨン、 リン酸カルシウム法、 DEAE-デキストラン法、 リ ポフエクシヨン法又は遺伝子銃が挙げられる。 次に、このようにして調製した NPY Y2を発現する細胞に被検化合物を接触させる。 接触させる方法としては特に制限はなく、 例えば、 NPY Y2が精製された状態であれ ば、精製標品に被験試料を添加することにより行うことができる。また、細胞内（細 胞膜上を含む） に発現した状態又は細胞抽出液内に発現した状態であれば、 それぞ れ、 細胞の培養液または当該細胞抽出液に被験試料を添加することにより行うこと ができる。 被験試料がタンパク質の場合には、 例えば、 当該タンパク質をコードす る DNAを含むベクターを、 NPY Y2が発現している細胞へ導入する、 または当該べク 夕一を NPY Y2が発現している細胞抽出液に添加することで行うことも可能である。 細胞表面に発現した受容体と被検化合物との結合は、 例えば、 結合した化合物に 付された標識による検出 （例えば、 結合量を放射活性や蛍光強度による検出） のほ 力、 被検化合物の細胞表面上の前記受容体への結合によって生じた細胞内へのシグ ナル伝達 （例えば、 G タンパク質の活性化、 cAMP、 または Ca2+の濃度変化（FLIPR (F luoromet r ic Imaging P l ate Reader) 等が使用できる）、 ホスホリパーゼ C の活性化、 pHの変化、 受容体のインターナリゼ一シヨン） を指標に検出することが できる。 また、 前記シグナル伝達によって生じたシグナル伝達上の分子 （NPY Y2も 含む） の発現レベルや活性を指標にすることもできる。 ここで、 当該発現レベルを 指標とする場合、 発現レベルの測定法は特に制限されないが、 例えば、 ノーザンブ ロッティング、ウエスタンプロッティング又は D N Aチップが挙げられる。ここで、 本発明における 「発現レベル」 とは、 NPY Y2を介した情報伝達経路上に存在する夕 ンパク質をコードする遺伝子の転写産物の絶対量又は相対量をいう。 この場合、 当 該遺伝子には D N A又は m R NAのいずれもが含まれる。 また、 発現の検出対象が タンパク質の場合、 その 「発現レベル」 とは、 NPY Y2を介した情報伝達経路上に存 在するタンパク質の翻訳産物の絶対量又は相対量をいう。 また、 シグナル伝達上の 分子の活性を指標にする場合、 活性測定方法は特に制限されず、 測定の対象となる 分子の種類によって好適な方法を選択すればよい。
一方、単離された NPY Y2タンパク質を化合物の評価に直接使用することもできる。 すなわち、 被検化合物を NPY Y2に接触させ、 次に、 接触によって生じた NPY Y2夕 ンパク質の活性の変化を検出する方法である。 '
かかる接触の方法としては特に制限はなく、 具体的には、 例えば、 緩衝液 （リン 酸緩衝液等） 等の溶液中で混合することにより接触させる方法や、 NPY Y2タンパク 質をメンブレン上に固定し、 メンブレン上で被検化合物と接触させる方法が挙げら れる。 '
次に、 接触によって生じた NPY Y2の活性の変化を検出する。
タンパク質の活性測定方法としては、 使用するタンパク質の性質により適宜設定 すればよく、 具体的には、 例えば、 NPY Y2に対するリガンドの結合活性を指標にす る方法が挙げられる。
前記のリガンドの結合活性を指標にする方法としては特に制限はないが、 具体的 には、 例えば、 NPY Y2が固定されたメンブレンに対する被検化合物の親和性を測定 することによって結合活性を測定する方法が挙げられる。 ここで用いられる被検化 合物は、 検出が容易なように放射性同位体等で標識されていてもよい。 また、 前記 結合活性の検出方法として、 放射性同位体で標識したリガンドと競合して NPY Y2 へ結合する化合物を検出する方法も挙げられ、 かかる方法を用いた場合には、 被検 化合物の標識は不要である。
以上のように、 本発明の化合物の評価方法により化合物を検出した結果、 被検化 合物の存在下における結合活性が、被検化合物の非存在下における結合活性（対照） より低い値を示した場合には、 当該被検化合物は、 本発明に係る NPY Y2とリガンド との結合を阻害する活性を有すると判定される。 このような化合物は、 前記受容体 に結合して細胞内へのシグナル伝達を誘導する活性を有する化合物 （ァゴ: ϋスト） 及び当該活性を有しない化合物 （アンタゴニスト） 等が含まれる。 ァゴニストは、 前記受容体に対するリガンド及びそのアナログと同様の生理活性を有しており、 一 方、 アンタゴニストは、 前記受容体に対するリガンド及びそのアナログが有する生 理活性を抑制する。 このため、 これらァゴニストやアン夕ゴニストは、 本発明に係 る NPY Υ2を介したシグナル伝達系の異常などに起因する疾患の治療などのための医 薬組成物として有用である。
また、 本発明の化合物の評価方法により、 NPY Υ2への被検化合物結合後の細胞内 シグナル伝達を促進又は阻害する物質のスクリーニングを行うことができる。 すな わち、 上述した方法によって複数の被検化合物を評価することにより、 ァゴニスト 又はァン夕ゴニス卜として機能する化合物を選択することができる。 かかる選択の 結果、 被検化合物非存在下においてリガシド及びそのアナログを作用させた場合の 細胞内シグナル伝達の変化と比較して、 その変化が抑制されれば、 当該被検化合物 は、 NPY Y2への被検化合物結合後の細胞内シグナル伝達を阻害する化合物であると 判定される。 逆に、 被検化合物が細胞内シグナル伝達を増強させれば、 当該化合物 は、 NPY Y2への被検化合物結合後の細胞内シグナル伝達を促進する化合物であると 判定される。 このようなスクリーニング方法によって選択された化合物は、 下痢を 伴う疾患の治療又は症状の緩和に有効であり、 中でも、 NPYY2ァゴニストとして機 能する化合物は、 特に下痢を伴う疾患の治療又は症状の緩和に有効である。
(実施例）
以下、 実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、 本発明は、 以下の実 施例に限定されるものではない。
(実施例 1)
(NPY Y2ァゴニスト投与による胃小腸運動能の検討）
NPYY2ァゴニス卜投与による胃小腸運動能の変化を調べるため、下記の試験を行つ た。
先ず、 試験に用いるマウス （C57BL/6) を準備した。 マウスは環境を制御した動物 室 （温度 23 、 相対湿度 55%、 照明時間 7:00から 19:00) にて床敷をいれた ケージに個別飼育し、 げっ歯類用餌 （CE-2、 日本クレア社） および飲料水は自由摂 取させた。
次に、 マウスに NPY(0.3mg/kg及び 3mg/kg)又は PYY3- 36(0.3mg/kg及び 3mg/kg) を腹腔内投与した後、 胃小腸運動能を測定した。 同時に、 溶媒のみを投与したコン トロールマウス（vehicle)を準備し、 これについても同様に試験を行った。 胃小腸運 動能は、 次のように測定した。 すなわち、 チヤコール粉末を 0.5%メチルセルロー ス溶液に懸濁してマウスに経口投与し、 30分経過後、 胃に入ったチヤコールが腸 管のどこまで移動したかを解剖して計測した。 同時に、 胃幽門部から盲腸起始部ま での小腸の全長も計測し、 チヤコールの移動距離の小腸全長に対する割合 （％) を GI (gastrointestinal) motilityとしてグラフにプロットした。
図 1に示すとおり、 NPY又は PYY3- 36を投与したマウスはコントロールマウスと 比較して GI motilityが低いことが明らかとなった。 すなわち、 NPY Y2ァゴニスト 投与により、 胃小腸運動能が抑制されたことが確認できた。
(実施例 2 )
(NPY Y2ァゴニスト投与による結腸運動の指標として、 排糞量の変化の検討） NPY Y2ァゴニスト投与による結腸運動の指標として、排糞量の変化を調べるため、 下記の試験を行った。
試験にはマウス （C57BL/6) を使用し、 実施例 1と同様の条件で飼育、 給餌を行つ た。
次に、 マウスに PYY3- 36 (3mg/kg)を腹腔内投与し、 経時的 （1、 2、 3及び 4時 間） に排糞量を測定した。 同時に、 溶媒のみを投与したコントロールマウスについ ても排糞量の測定を行った。
図 2に示すとおり、 投与後 1時間ですでに排糞量に差が生じはじめ、 その後もコ ントロールマウスと比較して PYY3- 36を投与したマウスの排糞量が有意に少なかつ た。 また、 図 3に示すとおり、 PYY3-36 投与後 4時間の総排糞量についてもコント ロールマウスと比較して顕著な差が見られた。 すなわち、 PYY3-36 投与によって結 腸腸管運動が抑制され、 排便が抑制されたことが確認できた。
(実施例 3及び比較例 1〜 2 )
. (NPY Y2ァゴニスト投与によるひまし油誘発排便及び下痢症状に対する検討）
NPY Y2ァゴニスト投与によるひまし油誘発排便及び下痢症状に対する抑制作用を 検討するため、 下記の試験を行った。
試験にはマウス （C57BL/6) を使用し、 実施例 1と同様の条件で飼育、 給餌を行つ た。
次に、 マウスに PYY3-36 (3mg/kg)及びその他の被験薬 （口ペラミド （l operami de) lmg/kg (比較例 1 ) 及びアト口ピン （at ropine) lOmg/kg (比較例 2 ) ) を腹腔内投 与し、 その投与 15分後にひまし油 （0. 3 ml/animal) を経口投与した。経時的（1、 2、及び 4時間） に排糞量及び下痢スコア（正常 0、軟便し水状便 2) を測定した。 同時に、 溶媒のみを投与しひまし油を投与しなかったマウスについても同様の測定 を行った。
図 4に示すとおり、 PYY3-36 前投与マウスはひまし油処置 1時'間後ですでに排糞 量に抑制が生じており、 その後も溶媒 +ひまし油処置コントロールマウスと比較し て排糞量が有意に少なかった。 また、 図 5に示すとおり、 ひまし油処置から 4時間 後までに観察された最大下痢スコアは、 溶媒 +ひまし油処置コントロールマウスと 比較して PYY3- 36前投与マウスで顕著に抑制された。 すなわち、 PYY3- 36投与によ つて結腸腸管運動が抑制され、 下痢症状の抑制が確認できた。 また、 既存の止瀉薬 である口ペラミド及びアト口ピンとの比較においても PYY3-36の下痢症状の高い抑 制効果が見られた。 産業上の利用可能性
以上説明したように、 本発明の NPY Y2ァゴニスト及び化合物の評価方法によれば 、 新規な作用メカニズムによる下痢の抑制を可能とする薬剤を提供することが可能 となる。 また、 このような薬剤のスクリーニングをはじめとする、 下痢抑制作用を 有する化合物の評価方法を提供することが可能となる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 下痢を伴う疾患の治療剤であることを特徴とする NPY Y2ァゴニスト。
2 . 前記 NPY Y2ァゴニストが NPY類縁体であることを特徴とする請求項 1に記載の NPY Y2ァゴニスト。
3 . 前記 NPY Y2ァゴニストが配列番号 1に記載のアミノ酸配列を含むぺプチドであ ることを特徴とする請求項 1又は 2に記載の NPY Y2ァゴニスト。
4 . 前記 NPY Y2ァゴニストが配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるぺプチドで あることを特徴とする請求項 1又は 2に記載の NPY Y2ァゴニスト。
5 . 前記 NPY Y2ァゴニス卜が、 配列番号 1に記載のアミノ酸配列において 1又は 2 以上のアミノ酸の置換、 欠失、 付加又は挿入を有するペプチドであることを特徴と する請求項 1又は 2に記載の NPY Y2ァゴニスト。
6 . 前記疾患が下痢症又は過敏性腸症候群であることを特徴とする請求項 1〜 5の いずれか一項に記載の NPY Y2ァゴニスト。
7 . 請求項 1〜6のいずれか一項に記載の NPY Y2ァゴニストを含むことを特徴とす る下痢を伴う疾患の治療剤。
8 . 下痢を伴う疾患の治療に用いる化合物の評価方法であって、
NPY Y2遺伝子を導入し、 NPY Y2を発現する細胞を調製する工程と、
該細胞に被検化合物を接触させる工程と、
該 NPY Y2に対する該被検化合物の特異的結合を検出する工程と、 を含むことを特 徴とする化合物の評価方法。
9 . 下痢を伴う疾患の治療に用いる化合物の評価方法であって、
NPY Y2遺伝子を導入し、 NPY Y2を発現する細胞を調製する工程と、
該細胞に被検化合物を接触させる工程と、
該接触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程と、
該活性と被検化合物を接触させない場合の該細胞内情報伝達物質の活性とを比較 する工程と、 を含むことを特徴とする化合物の評価方法。 '
1 0 . 下痢を伴う疾患の治療に用いる化合物の評価方法であって、 NPY Y2遺伝子を導入し、 NPY Y2を発現する細胞を調製する工程と、
該細胞に被検化合物を接触させる工程と、
該 NPY Υ2又は NPY Υ2を介した細胞内情報伝達物質の発現レベルを測定する工程 と、
該接触前と比較して、 NPY Υ2又は NPY Υ2を介した細胞内情報伝達物質の発現レ ベルを増加又は減少させた被検化合物を選択する工程と、 を含むことを特徴とする 化合物の評価方法。
1 1 . 下痢を伴う疾患の治療に用いる化合物の評価方法であって、
被検化合物を、 NPY Υ2に接触させる工程と、
該接触による ΝΡΥ Υ2の活性の変化を検出する工程と、 を含むことを特徴とする化 合物の評価方法。
1 2 . 前記化合物が ΝΡΥ Υ2ァゴニストであることを特徴とする請求項 8〜1 1のい ずれか一項に記載の化合物の評価方法。
1 3 . 請求項 8〜1 2のいずれか一項に記載の化合物の評価方法により単離された ことを特徴とする NPY Υ2リガンド。
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