WO2006112327A1 - イネの粒長を制御するLk3遺伝子およびその利用 - Google Patents
イネの粒長を制御するLk3遺伝子およびその利用 Download PDFInfo
- Publication number
- WO2006112327A1 WO2006112327A1 PCT/JP2006/307745 JP2006307745W WO2006112327A1 WO 2006112327 A1 WO2006112327 A1 WO 2006112327A1 JP 2006307745 W JP2006307745 W JP 2006307745W WO 2006112327 A1 WO2006112327 A1 WO 2006112327A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- polynucleotide
- plant
- gene
- seq
- grain length
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Definitions
- the present invention relates to a novel gene of a plant. More specifically, the present invention relates to genes that control the grain length of plant seeds and their use.
- seed shape (grain shape, sometimes called "rice"), which depends on the grain length, grain width, and grain thickness. It is prescribed. Genetic analysis of this grain shape has been carried out for a long time, and it has so far been involved in the grain shape of the rkl locus (chromosome 4), rk2 locus (chromosome 10), Rk3 locus (chromosome 5), Lk locus (chromosome 3), etc. Genes are found using mutations and mutations inherent in varieties. In recent years, DNA marker ability has been used for genetic analysis of S rice, and the genetic analysis of quantitative traits (QTL) mapping following complex inheritance such as grain shape has progressed.
- QTL quantitative traits
- the long grain locus lk3 (long kernel 3) is a quantitative trait locus found on rice chromosome 3 (Quantitative Trait Locus, QTL). As a single recessive locus, it was located between the RFLP markers C1677 and R19 (Fig. Do. Furthermore, in this locus, the allele lk3 of the Indian rice cultivar IR24 has the effect of increasing the grain length of rice. Asominori's wild-type allele Lk3 was found to be recessive (Non-patent Document 1), and the lk3 allele of IR24 was cross-transferred into the genetic background of Asominori. A chromosome fragment substitution line (AIS22) was obtained (Non-patent Document 2).
- AIS22 chromosome fragment substitution line
- Non-patent literature l Kubo et al., Rice Genetics Newsletter 18: 26-28, 2001
- Non-Patent Document 2 Kubo et al., Breeding Science 52: 319-325, 2002
- FIG. 1 is a diagram showing the position of the lk3 locus on the chromosome.
- FIG. 2 A photograph comparing the particle shape of Asominori with a chromosome fragment replacement line (AIS22) that was cross-introduced with the lk3 allele of IR24 on the genetic background of Asominori.
- AIS22 chromosome fragment replacement line
- FIG. 3 is a diagram showing a high-precision linkage map and a physical map of the lk3 locus.
- the above figure is a linkage map created using a segregated population of 1600 individuals and DNA markers. The symbol on the map indicates the DNA marker, and the numerical value on the map indicates the number of recombinant individuals detected between the markers.
- the figure below shows the SNP position, Lk3 predicted gene position, and genomic DNA fragment used for transformation on the BAC clone OSJNBa0002D18 (145662bp) containing the candidate gene genomic region.
- lk3 is located between SNP markers 13-469 and 13-13487, and there were 1 and 3 thread-replaceable individuals between lk3 and these SNP markers, respectively.
- the nucleotide sequences near SNP markers 13-469 and 13-13487 were contained in the BAC clone OSJBa0002D 18 (145662bp) derived from the rice cultivar Nipponbare.
- FIG. 4 is a diagram showing the structure of Lk3 candidate genes.
- the thin line indicates the genomic base sequence, and the white square indicates the exon part.
- ATG, TGC, and TGA shown above indicate the position of the start codon, the 55th cysteine codon, and the stop codon, respectively, at Asominori, and the lower TGA shows the 55th cysteine in IR24 as the stop codon in IR24. Shown that it is changing.
- FIG. B shows the position of the von Willebrand factor type C domain of the Lk3 gene product at the carboxyl terminus.
- Fig. C shows the cDNA sequence of Asominori Lk3 gene, showing the sequence from the predicted start codon to the end of transcription.
- FIG. 5 is a photograph showing the grain shape of a transformed modern individual.
- the 7kb Xmnl DNA fragment derived from Nipponbare had a shorter grain length (A).
- Vector (pPZP2 The grain length of the individual into which only H-lac) was introduced became long (B) as in AIS22.
- the present invention provides the Lk3 gene or a homolog thereof, for example, the following polynucleotide (a), (b), (c), (d), (e), (f) or (g).
- the base sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 7 or 8 comprises a base sequence in which one or more bases are replaced, deleted, inserted, and Z or added, and the grain length of the plant A polynucleotide having a function to control;
- amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or 9 encodes an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added, and controls the grain length of plants
- the present invention also provides an lk3 gene or a homolog thereof, such as the following (a '), (b'), (c '), (d'), (e '), (f) or (g') Provide a gene consisting of the following polynucleotides:
- nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 or 5 consisting of a nucleotide sequence in which one or more bases are substituted, deleted, inserted, and Z or added, and controls the grain length of plants
- (d ′) a polynucleotide having a sequence identity of at least 80% or more with the base sequence described in SEQ ID NO: 4 or 5, and a function of controlling the grain length of plants;
- (f) encodes a protein having an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and Z or added to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6, and controls the grain length of plants
- g ′ A polynucleotide that encodes a protein having at least 80% sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 in the Sequence Listing and has a function of controlling plant grain length.
- the present invention also includes an Lk3 protein having an amino acid sequence ability described in SEQ ID NO: 3 or 9, and a protein that is structurally similar to them and has a function of controlling the grain length of plants, such as the following: Provide a protein of (e, ( ⁇ ) or (g "):
- the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or 9 has an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added, and controls the grain length of plants.
- (g ) a protein having an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or 9 in the sequence listing and having a function of controlling the grain length of plants
- stringent conditions refers to conditions of 6M urea, 0.4% SDS, 0.5 ⁇ SSC or a hybridization condition equivalent thereto, except in special cases. If necessary, conditions having higher stringency, for example, 6M urea, 0.4% SDS, 0.1 X SSC or equivalent hybridization conditions may be applied to the present invention. Under each condition, the temperature can be about 40 ° C or higher, and if a higher stringency condition is required, for example, about 50 ° C or even about 65 ° C may be used.
- “one or more bases are substituted, deleted, inserted, and Z or added.
- the number of nucleotides to be substituted when referred to as the ⁇ base sequence '' is not particularly limited as long as the polynucleotide comprising the base sequence has a desired function, but the power is about 1 to 9 or 1 to 4 Substitutions that encode the same or similar amino acid sequences will not lose the desired function.
- the number of amino acids to be substituted when “amino acid sequence in which one or more bases are substituted, deleted, inserted, and Z or added” is the number of amino acids to be substituted.
- the nucleotide is not particularly limited as long as it has a desired function, but may be any one as long as it is a substitution that encodes an amino acid sequence having the same or similar properties, such as 1-9 or 1-4. Will not lose function.
- a polynucleotide according to such a base sequence or amino acid sequence it is possible to prepare a column “f”? J3 ⁇ 4, site-directed mutagenesis method (Kramer W & Fritz H—J: Methods Enzymol 154: 350, 1987).
- the present invention includes a polynucleotide having a high identity with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7 or 8 and a function of controlling the grain length of plants.
- high identity refers to sequence identity of at least 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more.
- the present invention includes a polynucleotide that encodes an amino acid sequence having high identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, 6, or 9 and that has a function of controlling the grain length of plants. .
- high identity refers to sequence identity of at least 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, even more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more.
- the identity of the base sequence or amino acid sequence is determined using the algorithm BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, 1990, Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993) by Carlin and Arthur. Can be determined. Based on the BLAST algorithm, programs called BLASTN and BLASTX have been developed! (Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990).
- the parameter 1 When using BLAST and Gapped BLAST programs, use the default parameters of each program. Specific methods of these analysis methods are known. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
- the polynucleotide of the present invention can also be prepared with natural plant tissue material strength.
- hybridization technology Southern EM: J Mol Biol 98: 503, 1975
- PCR polymerase chain reaction
- the genomic nucleotide sequence of the Lk3 or lk3 region (SEQ ID NO: 1, 4 or 7), the nucleotide sequence of Lk3 cDNA (SEQ ID NO: 2, 5 or 8), or a part thereof as a probe, or Lk3
- rice or other plant plants or other DNA that has a high identity with the Lk3 gene can be isolated using oligonucleotides that specifically hybridize to the genomic nucleotide sequence of the lk3 region or the nucleotide sequence of Lk3 cDNA. it can.
- the polynucleotide of the present invention includes genomic DNA, cDNA, and chemically synthesized DNA.
- the polynucleotides of the present invention can be single-stranded DNA and double-stranded DNA.
- Genomic DNA and cDNA can be prepared by one of ordinary skill in the art.
- Genomic DNA is, for example, the Lk3 gene (when the present invention is described in the present specification, the Lk3 gene is a force that may be described using the Lk3 gene as an example of the polynucleotide of the present invention, except in special cases) Also applies to rice varieties having homologues of, lk3 gene, and lk3 gene.
- Genomic libraries are also extracted and genomic libraries (eg, vectors, plasmids, phages, cosmids, BACs, PACs, etc. can be used) And developed, and colony hybridization or plaque using a probe prepared based on the polynucleotide of the present invention (for example, SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7 or 8). It can be prepared by carrying out hybridization. It is also possible to prepare a primer specific for the polynucleotide of the present invention (for example, SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, or 8) and perform PCR using this primer. .
- cDNA is synthesized based on mRNA extracted from a rice cultivar having the Lk3 gene, and inserted into a vector such as ⁇ ZAP to create a cDNA library. It can be prepared by conducting colony, hybridization or plaque hybridization, and PCR.
- the grain length means the length of the major axis of the seed, except in special cases.
- Seed shape As a measure for the shape, in addition to the major axis, there are grain width and grain thickness.
- control with respect to grain length refers to adjusting the length of the grain length, except in special cases, and this involves adjusting the grain length to be shorter. And adjusting to increase the grain length.
- other seed shape scales may be adjusted simultaneously.
- a polynucleotide having a function of shortening the grain length (for example, the Lk3 gene of the present invention) is introduced into a plant to exert its function, thereby achieving the grain length. It is included to make it shorter.
- the grain length is increased by reducing the function of a gene comprising a polynucleotide having a function of shortening the inherent grain length (for example, the Lk3 gene of the present invention). Included.
- a polynucleotide having a nucleotide sequence ability described in SEQ ID NO: 1, 2, 7 or 8 the gene produces a phenotype that increases or decreases the grain length.
- the polynucleotide having the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 4 or 5 Whether or not a polynucleotide has a force that increases or decreases the grain length can be determined, for example, according to the method described in Example 4 of the present specification.
- the degree of change is about 0.1% or more, about 0.5% or more, about 1% or more, about 5% or more, about 10% or more, about 15 when the grain length before introduction of the target polynucleotide is 100. % Or more, about 20% or more, or about 25% or more.
- the present invention also provides a recombinant vector comprising the polynucleotide of the present invention, a transformed plant transformed with such a vector, or a part thereof.
- the present invention further includes a step of transforming a plant operably comprising a gene comprising a polynucleotide having a function of shortening the grain length of the present invention so as to reduce the function of the gene (for example, the present invention
- a method for transforming a plant is also provided, including a step of transforming with a vector.
- the term "plant body” is used in the meaning of a plant individual except in special cases, and the term “part” of the plant body refers to seeds except in special cases. (Including germinating seeds, immature seeds), organs or parts thereof (including leaves, roots, stems, flowers, stamens, pistils, fragments thereof), plant culture cells, callus, protoplasts. Plants or parts of them also contain propagation material.
- the vector into which the polynucleotide of the present invention is inserted is not particularly limited as long as it can exhibit the function of the insert in plant cells.
- a vector having a promoter for constitutive expression of a gene in plant cells for example, cauliflower mosaic virus 35S promoter
- a vector having a promoter that is inducibly activated by an external stimulus can also be used.
- plant cells include various forms of plant cells such as seeds, suspension culture cells, protoplasts, leaf sections, callus and the like.
- Plant regeneration from transformed plant cells can be performed by methods known to those skilled in the art depending on the type of plant cells (Toki S, et al: Plant Physiol 100: 1503, 1995). ).
- a method for producing a transformed plant body in rice is a method of regenerating a plant body (suitable for Indian rice varieties) by introducing a gene into protoplasts using polyethylene glycol (Datta SK: In Gene Transfer To Plants (Potrykus I and Span genberg, Eds) pp.
- offspring can be obtained by sexual reproduction or asexual reproduction of the plant. It is also possible to obtain the plant, its progeny or clonal power propagation material (eg, seeds, fruits, cuttings, tubers, tuberous roots, strains, callus, protoplasts, etc.) and mass-produce the plant based on them. It is.
- progeny or clonal power propagation material eg, seeds, fruits, cuttings, tubers, tuberous roots, strains, callus, protoplasts, etc.
- transformation, product (body) in the present invention, except for special cases, obtains a recombinant plant cell by the method of the present invention and regenerates the plant cell into a plant body.
- Transformed plant (body) (T generation) obtained from this, as well as progenies (T generation etc.) obtained from the transformed plant
- Plants are included as long as the desired trait is maintained.
- the plant to be transformed according to the present invention is not particularly limited as long as the grain length can be controlled by the action of the polynucleotide of the present invention, but is preferably an angiosperm, and more preferably.
- the plants belonging to the family Gramineae it is preferably a plant belonging to the genus Gramineae, more preferably rice (Or yza sativa L.). From the viewpoint of increasing the grain length, a japo with a relatively short grain length. Two-power rice is preferred.
- the present invention also provides a method for modifying a plant comprising the following steps.
- Desired traits include long grain length (long grain length) and short grain length.
- the modification method of the present invention can also be applied to rice breeding (variety improvement).
- the present invention also includes a polynucleotide having a function of controlling the grain length of the present invention. Derived from rice varieties and transformed with a polynucleotide having the function of controlling grain length of the present invention, for example, rice varieties having the Lk3 gene of the present invention (or its homolog) operably.
- the Lk3 gene of the present invention derived from a long grain rice variety transformed to reduce the function of the gene or a long grain rice variety having the lk3 gene (or a homolog thereof) of the present invention.
- a rice variety with a short grain length transformed by (or a homologue of) is provided.
- the present invention also relates to a long grain rice cultivar derived from a rice cultivar having the Lk3 gene (or homolog thereof) of the present invention operably and transformed so as to reduce the function of the gene, Also provided are breeding materials for such rice varieties and harvests obtained by utilizing such rice varieties.
- “Rice varieties having the Lk3 gene (or homologue thereof) of the present invention capable of functioning” include japoyuka type varieties such as Nipponbare, Hinohikari, Koshihikari, Akitakomachi, Haenuki, Sasashiki and Hitomibori.
- “/ reproduction material” refers to materials that are used for reproduction in all or part of the plant body (except for special cases) (sometimes referred to as “seed seedlings”). Examples include seeds, seedlings, cells, callus, and young shoots.
- seed seedlings include seeds, seedlings, cells, callus, and young shoots.
- harvested product as used herein is used in a normal sense except in special cases, and all or part of the plant body is not used for breeding, for example, a plant belonging to the genus Rice. If so, the harvest includes fir, brown rice, and polished rice.
- the present invention also provides a method for controlling the grain length of a plant, which comprises using the Lk3 gene (or a homolog thereof) of the present invention.
- “using the Lk3 gene (or its homolog) of the present invention” includes reducing the function of the gene in a plant that has the function of the Lk3 gene, and that the gene functions.
- the present invention includes operably introducing the gene into a plant.
- the present invention also includes a polynucleotide of the polynucleotide of the present invention or a complement thereof, and a polynucleotide that, when introduced into a plant, produces a phenotype with a longer grain length or a phenotype with a shorter grain length, and A method for designing a polynucleotide capable of exhibiting such a function is provided.
- the polynucleotide of the present invention is DNA or RNA, and is an antisense nucleic acid, ribozyme, DNA encoding ribozyme, one that plays an important role in RNAi, or causes bridge suppression Including single-stranded or double-stranded.
- a polynucleotide that suppresses the expression of the Lk3 gene is inserted into an appropriate vector, and this is introduced into a plant cell by the method described later, whereby By regenerating the resulting transformed plant cells.
- “suppression of Lk3 gene expression” includes suppression of gene transcription, suppression of transcript splicing, and suppression of protein translation. It also includes a decrease in expression as well as complete cessation of gene expression. It also includes suppression of the translated protein exerting its original function in plant cells.
- antisense nucleic acids can be used for transcription and splicing. Inhibits various processes such as translation or suppresses the expression of target genes (Hirashima and Inoue: Shinsei Kagaku Kenkyu Kogyo 2 Nucleic acid IV gene replication and expression (Japan Biochemical Society, Tokyo Chemical Doujin) pp .319-347, 1993).
- the antisense sequence used in the present invention may suppress the expression of the target gene by the above-described action.
- an antisense sequence complementary to the untranslated region near the 5 ′ end of the mRNA of a gene is designed, it is considered effective for inhibiting the translation of the gene.
- a sequence complementary to the coding region or the 3 ′ untranslated region can also be used.
- DNA containing an antisense sequence of not only a translation region of a gene but also an untranslated region is also included in the antisense DNA used in the present invention.
- the antisense DNA to be used is linked downstream of a suitable promoter, and preferably a sequence containing a transcription termination signal is linked on the 3 'side.
- the DNA thus prepared can be introduced into a desired plant by using a known method.
- the sequence of the antisense DNA is preferably a sequence complementary to an endogenous gene or a part of the plant to be transformed, but is completely complementary as long as the gene expression can be effectively suppressed. It does n’t have to be.
- the transcribed RNA preferably has a complementarity of 90% or more, most preferably 95% or more, to the transcription product of the target gene.
- the length of the antisense DNA is at least 15 bases or more, preferably 100 bases or more, more preferably 500 bases or more.
- the length of antisense DNA usually used is shorter than 5 kb, preferably shorter than 2.5 kb.
- Ribozyme refers to an RNA molecule having catalytic activity.
- research focusing on ribozymes as enzymes that cleave RNA has made it possible to design ribozymes that cleave RNA site-specifically.
- Ribozymes may have a size of 400 nucleotides or more, such as group I intron type and Ml RNA contained in RNase P, and have an active domain of about 40 nucleotides called hammerhead type and hairpin type. There are also things (Makoto Koizumi and Eiko Otsuka: Protein Nucleic acid enzyme, 35: 2191, 1990).
- the self-cleaving domain of the hammerhead ribozyme has the ability to cleave the 3 'side of C15 in the sequence G13U14C15.
- base pairing between U14 and A9 is important. It has been shown that A15 or U15 can also be cleaved (Koizumi M, et al: FEBS Lett 228: 228, 1988).
- Hairpin ribozymes are also useful for the purposes of the present invention. This ribozyme is found, for example, in the minus strand of tobacco ring spot virus satellite RNA (Buzayan J M: Nature 323: 349, 1986). It has been shown that hairpin ribozymes can also generate target-specific RNA cleavage ribozymes (Kikuchi Y & Sasaki N: Nucl Acids Res 19: 6751, 1991, Hiroshi Kikuchi: Chemistry and Biology 30: 112, 1992) .
- the ribozyme designed to cleave the target is linked to a promoter such as the cauliflower mosaic virus 35S promoter and a transcription termination sequence so that it is transcribed in plant cells. At this time, if an extra sequence is added to the 5 'or 3' end of the transcribed RNA, the activity of the ribozyme may be lost.
- the RNA containing the transcribed ribozyme It is possible to place another trimming ribozyme that acts cis on the 5 'side or 3' side of the ribozyme part (T aira K, et al: Protein Eng 3: 733, 1990, Dzianott AM & Bujarski JJ: Proc Natl Aca d Sci USA 86: 4823, 1989, Grosshans CA & Cech TR: Nucl Acids Res 19: 3875, 1 991, Taira K, et al: Nucl Acids Res 19: 5125, 1991).
- the effect can be further enhanced (Yuyama N, et al: Biochem Biophys Res Commun 186: 1271). 1992) o
- the transcript of the target gene in the present invention is used. By specifically cleaving, the expression of the gene can be suppressed.
- RNAi RNA interferance
- RNAi refers to a phenomenon in which, when a double-stranded RNA having the same or similar sequence as a target gene sequence is introduced into a cell, the expression of the introduced foreign gene and target endogenous gene are both suppressed.
- the details of the RNAi mechanism are not clear, but it is thought that the first double-stranded RNA introduced is broken down into small pieces that can be used as an indicator of the target gene in some way to break down the target gene. .
- RNAi is known to be effective in plants (Chuang CF & Meyerowitz EM: Proc Natl Acad Sci USA 97: 49 85, 2000) o
- RNAi suppresses Lk3 gene expression in plants
- a small double-stranded RNA having a part of the sequence of Lk3 gene (SEQ ID NO: 1, 2, 7 or 8) or a sequence similar thereto is introduced into the target plant, and the resulting plant physical strength is obtained. What is necessary is just to select the plant which showed the long grain length property compared with the wild type plant body.
- sequence of the small double-stranded RNA used for RNAi need not be completely identical to the target gene, but is at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, most Preferably, it contains a portion having 95% or more sequence identity.
- sequence identity can be determined by the method described above.
- the length of such a small double-stranded RNA is, for example, 15 to 100 base pairs, preferably 300 base pairs, more preferably 400 to 700 base pairs, for example 500 base pairs.
- the length of such a small double-stranded RNA is, for example, 5-50 base pairs, preferably 10-50 base pairs, more preferably 15-30 base pairs, such as 20 base pairs. It is.
- pANDA Miki D and Shimamoto K: Plant Cell Physiol. 45: 490-495, 2004
- Suppression of endogenous gene expression can also be achieved by co-suppression caused by transformation with DNA having a sequence identical or similar to the target gene sequence.
- “Co-suppression” refers to a phenomenon in which when a gene having the same or similar sequence as a target endogenous gene is introduced into a plant by transformation, the expression of the introduced foreign gene and target endogenous gene are both suppressed. Point to. Details of the mechanism of co-suppression are not clear, but at least It is thought that part of the mechanism overlaps with that of RNAi.
- Co-suppression is also observed in plants (Smyth DR: Curr Biol 7: R793, 1997, Martienssen R: Curr Biol 6: 810, 1996) o
- the vector DNA prepared so that the Lk3 gene or DNA having a similar sequence can be expressed is transformed into the target plant, and the resulting plant strength is longer than the wild-type plant. Select plants that showed sex.
- the gene used for co-suppression need not be completely identical to the target gene, but at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more. Sequence identity. The sequence identity can be determined by the method described above.
- the length of DNA used for co-suppression is, for example, 50 bases, preferably 100 bases, and more preferably 500 bases.
- the length of DNA used for co-suppression is, for example, 50 to 6000 bases, preferably 100 to 5000 bases, for example 500 bases.
- the gene Lk3 which controls the grain length for which the nucleotide sequence of the gene has been clarified, can lengthen the grain of rice by reducing its function. Therefore, the grain length of rice can be increased by transforming a strain having a functional Lk3 gene with the antisense strand of Lk3. On the other hand, when the function of the Lk3 gene is reduced or lost, the grain length of rice can be reduced by introducing the gene into a cultivar such as IR24 in the sense direction.
- the time required for transformation is extremely short compared to gene transfer by mating, and it is possible to control the grain length without changing other traits.
- the isolated Lk3 gene it is possible to change the grain length of rice and contribute to the development of higher yielding rice and the development of rice varieties adapted to different people's preferences.
- lk3 early ⁇ ffl In this example, a chromosome fragment replacement line (AIS22) (Kubo et al., Breeding Science 52: 319-325, 2002) and Asominori that were cross-transfected with the lk3 allele of IR24 in the genetic background of Asominori Cultivated under normal field conditions.
- AIS22 chromosome fragment replacement line
- Asominori that were cross-transfected with the lk3 allele of IR24 in the genetic background of Asominori Cultivated under normal field conditions.
- Fig. 2 shows a comparative photograph of the grain shapes of AIS22 and Asominori. The measurement results of the grain length, grain width and grain thickness are shown in the table below.
- AIS22 showed a clear difference of 0.95mm (12.6%) grain length from Asominori.
- P 0.0022
- the lk3 locus is CAPS marker 13-469 (primer 5'-CAAGGCCCAAAATCC AAATCA-3 '(SEQ ID NO: 15) and 5'-GGCCGACGGGCCTAACTATT-3' (SEQ ID NO: 16), restriction enzyme Ndel) and SNP marker 13-13487 (primer 5'-CAGGGATCT CAGGCTCTCGT-3 '(SEQ ID NO: 17) and 5′-ACTGACGGCTACGTGTGTGG-3 ′ (SEQ ID NO: 18)), and each marker and one and three recombinant individuals could be identified.
- CAPS marker 13-469 primary 5'-CAAGGCCCAAAATCC AAATCA-3 '(SEQ ID NO: 15) and 5'-GGCCGACGGGCCTAACTATT-3' (SEQ ID NO: 16), restriction enzyme Ndel
- SNP marker 13-13487 primer 5'-CAGGGATCT CAGGCTCTCGT-3 '(SEQ ID NO: 17) and 5′-ACTGACG
- the Asominori allele of this candidate gene has 5 exons, 232 It encodes a protein having amino acid strength (FIGS. 4A and B), and has an amino acid sequence called a von Willebrand Factor type C (VWFC) domain near the carboxyl terminus. It was thought that the 55th amino acid was changed from cysteine to a stop codon due to mutations in IR24! / 13-13669 (Fig. 4C).
- VWFC von Willebrand Factor type C
- Lk3 candidate genes could be estimated, and functional proof by transformation was performed.
- the digested plasmid vector is dephosphorylated with alkaline phosphatase (Roche Phosphatase alkaline, shrimp) at 37 ° C for 1 hour, then treated at 65 ° C for 15 minutes to inactivate alkaline phosphatase. I let you.
- alkaline phosphatase Roche Phosphatase alkaline, shrimp
- the above BAC clone digestion product was mixed with a plasmid vector, and a 1 ligation reaction was performed at 16 ° C using Ligation high from TOYOBO.
- the resulting ligation solution was incorporated into E.
- the obtained bacterial solution was PCR-amplified in a cocoon-shaped primer pair 5'-GGGAATAGGGATTCCACACG-3, (SEQ ID NO: 23), 5 -AATGGTGATGCCCAGCTTTT-3 '(SEQ ID NO: 24).
- the bacterial solution from which the product was obtained by this PCR that is, the bacterial solution containing the target Lk3 gene sequence, was inoculated into LB liquid medium containing 20 mg / l of streptomycin, and cultured at 37 ° C for 1 mm.
- the plasmid was extracted using BIO RAD Quantum Prep Plasmid Miniprep Kit to obtain a vector containing 7kb genomic DNA (SEQ ID NO: 10) containing Lk3 gene.
- 2 ⁇ g of the resulting vector was introduced into Agrobacterium tumefaciens EHA101 using the freeze-thaw method, and 30 in an LB solid medium containing 50 mg / l kanamycin and 50 mg / l hygromycin. C, cultured for 3 days.
- the obtained colonies were PCR-amplified with primers 5'-GGGAAT AGGGATTCCACACG-3 '(SEQ ID NO: 23), 5'- AATGGTGATGCCCAGCTTTT-3' (SEQ ID NO: 24), and the confirmed colonies were kanamycin (50 mg).
- / l) was inoculated into LB solid medium containing hygromycin (50 mg / l) and cultured at 30 ° C for 1 cm.
- This agrobatterium was sprinkled with a mini spatula and suspended in 50 ml of AAM solution containing acetosyringone (20 mg / l).
- callus induction medium containing 2,4_D (2mg / l) (N6 D medium), seeded with AIS22 seeds, cultured in the light at 30 ° C, and after 4 weeks, callus-derived callus Obtained.
- the callus from which the shoot and endosperm part had been removed was placed in a 50 ml plastic test tube, 50 ml of the above-mentioned agrobacterium suspension was added, and gently mixed by inversion for 1 minute and 30 seconds to attach the agrobacterium to the callus.
- coagulation was carried out for 3 days in a dark place at 25 ° C on 2N6AS medium containing acetosyringone (10 mg / l) and 2,4-D (2 mg / l). Terium was infected with callus, and the DNA fragment on the vector was introduced into callus.
- the callus was washed with sterile water and carbesilin solution (500 mg / l) to remove agrobacterium, carbecillin (500 mg / l), hygromycin (50 mg / l) and 2,4-D ( Transformed callus was obtained by culturing on a selective medium (2N6DS medium) containing 2 mg / l) in a light place at 30 ° C for 4 weeks.
- the resulting transformed callus contains kinetin (2 mg / l) and naphthalene acetic acid (0.02 mg / l). Transfer to Regeneration medium III medium and light for 12 weeks at 30 ° C? After culturing for 16 weeks, re-seed shoots were obtained. This shoot was transferred to a regeneration medium (MS hormone-free medium) to obtain young plants. The regenerated plant was transferred to a greenhouse and grown at 25 ° C. ⁇ Analysis>
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本発明は、植物の種子の粒長を制御する遺伝子およびその利用に関する。大規模分離集団によるlk3座の詳細な連鎖解析により同定したlk3座について、塩基配列解析、遺伝子予測を行い、そして推定したLk3遺伝子について形質転換によりその機能を確認し、本発明を完成した。本発明は、植物の種子の粒長を制御するLk3遺伝子を提供する。本発明はまた、本発明の遺伝子の機能を低下させるように形質転換する工程を含む、植物の形質転換方法を提供する。本発明により、粒長の制御された形質転換植物を得ることができる。そのような植物の好ましい例はイネである。
Description
明 細 書
イネの粒長を制御する Lk3遺伝子およびその利用
技術分野
[0001] 本発明は、植物の新規遺伝子に関する。より詳細には、植物の種子の粒長を制御 する遺伝子およびその利用に関する。
背景技術
[0002] イネの収量に関与する要因の一つに種子 (子実粒。「もみ」ということもある。)の形( 粒形)があり、これは、粒長、粒幅、粒厚によって規定される。この粒形に関する遺伝 解析は古くから行われ、これまで rkl座 (染色体 4)、 rk2座 (染色体 10)、 Rk3座 (染色 体 5)、 Lk鹿座 (染色体 3)等の粒形に関与する遺伝子が突然変異や品種に内在する 変異を利用して見い出されている。近年、 DNAマーカー力 Sイネの遺伝解析に利用さ れるようになって、粒形のような複雑な遺伝に従う形質の遺伝解析 (量的形質遺伝子 座(QTL)のマッピング)が進展した。
[0003] 長粒遺伝子座 lk3 (long kernel 3)はイネ第 3染色体上に見 ヽだされた量的形質遺伝 子座(Quantitative Trait Locus, QTL)であり、これまでの遺伝学的な研究によって、 単一劣性遺伝子座として RFLPマーカー C1677と R19の間に位置づけられていた(図 Doさらに、同遺伝子座では、インド型イネ品種 IR24がもつ対立遺伝子 lk3がイネの粒 長を長くする作用をもち、あそみのりが有する野生型対立遺伝子 Lk3に対して劣性に 作用することが明らかになつていた (非特許文献 1)。また、あそみのりの遺伝的背景 に IR24の lk3対立遺伝子を交雑移入した染色体断片置換系統 (AIS22)が得られて ヽ た (非特許文献 2)。
非特許文献 l : Kubo et al.、 Rice Genetics Newsletter 18: 26—28、 2001
非特許文献 2 : Kubo et al.、 Breeding Science 52: 319-325、 2002
発明の開示
[0004] 本発明者らは、 AIS22とあそみのりを通常の圃場条件で栽培し、それらの粒長を調 查した。結果、 AIS22はあそみのりと比較して 0.95mm粒長が長くなつていることを見い だした (実施例 1)。さらに本発明者らは、大規模分離集団による lk3座の詳細な連鎖
解析により同定した lk3座について、塩基配列解析、遺伝子予測を行った。そして推 定した Lk3遺伝子について形質転換によりその機能を確認し、本発明を完成した。 図面の簡単な説明
[図 l]lk3遺伝子座の染色体上での位置を示す図である。
[図 2]あそみのりの遺伝的背景に IR24の lk3対立遺伝子を交雑移入した染色体断片 置換系統 (AIS22)とあそみのりの粒形を比較した写真である。
[図 3]lk3遺伝子座の高精度連鎖地図および物理地図を示す図である。上図は、 1600 個体の分離集団と DNAマーカーを用いて作成した連鎖地図である。地図上の記号 は DNAマーカー、地図下の数値は各マーカー間で検出された組換え個体数を示す 。下図は、候補遺伝子ゲノム領域を含む BACクローン OSJNBa0002D18 (145662bp) 上の SNPの位置、 Lk3予測遺伝子の位置、形質転換に用いたゲノム DNA断片を示す 。 lk3は SNPマーカー 13- 469と 13- 13487の間に位置づけられ、 lk3とこれらの SNPマー カーの間の糸且換え個体はそれぞれ 1、 3個体であった。 SNPマーカー 13-469と 13-134 87近傍の塩基配列はイネ品種日本晴由来の BACクローン OSJBa0002D 18 (145662bp )に含まれていた。
[図 4]図 Aは、 Lk3候補遺伝子の構造を示す図である。細線はゲノム塩基配列を、白 四角はェクソン部を示す。上に示した ATG、 TGC、および TGAはあそみのりにおける 開始コドン、 55番目のシスティンのコドン、および終止コドンの位置をそれぞれ示し、 下部の TGAは IR24における 55番目のシスティンが IR24において終止コドンに変化し ていることを示した。図 Bは、 Lk3の遺伝子産物がカルボキシル末端部にもつ von Will ebrand factor type Cドメインの位置を示す図である。図 Cは、あそみのりの Lk3遺伝子 の cDNA配列を示した図であり、予測される開始コドンから転写終了点までの配列を 示した。また、 cDNA配列の下に各コドンに対応するアミノ酸を示した。 *は終止コドン( TGA)である。矢印は、 IR24における塩基配列変異(C→A)の位置を示した。これによ りこのコドンがシスティン(C)から終止コドンとなり、 IR24がもつ lk3対立遺伝子は Lk3 遺伝子の有する機能を喪失していると考えられる。
[図 5]形質転換当代個体の粒形を示す写真である。長粒系統 AIS22に、日本晴由来 の 7kb Xmnl DNA断片を導入した個体では、粒長が短くなつた (A)。ベクター( pPZP2
H-lac )だけを導入した個体の粒長は AIS22と同様、長粒となった (B)。
発明の詳細な説明
[0006] 本発明は、 Lk3遺伝子またはそのホモログ、例えば下記の(a)、 (b)、 (c)、 (d)、 (e) 、(f)または (g)のポリヌクレオチドを提供する。
(a)配列番号: 1、 2、 7または 8に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号: 1、 2、 7または 8に記載の塩基配列力 なるポリヌクレオチドと相補的な 塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズし、かつ 植物の粒長を制御する機能を有するポリヌクレオチド;
(c)配列番号: 1、 2、 7または 8に記載の塩基配列において 1若しくは複数の塩基が置 換、欠失、挿入、および Zまたは付加された塩基配列からなり、かつ植物の粒長を制 御する機能を有するポリヌクレオチド;
(d)配列番号: 1、 2、 7または 8に記載の塩基配列と少なくとも 80%以上の同一性を有 し、かつ植物の粒長を制御する機能を有するポリヌクレオチド;
(e)配列番号: 3または 9に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド;
(f)配列番号: 3または 9に記載のアミノ酸配列にお 、て 1若しくは複数のアミノ酸が置 換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列をコードし、かつ植物の粒長を 制御する機能を有するポリヌクレオチド;
(g)配列表の配列番号 3または 9に記載のアミノ酸配列と少なくとも 80%以上の同一性 を有するアミノ酸配列をコードし、かつ植物の粒長を制御する機能を有するポリヌクレ ォチド。
[0007] 本発明はまた、 lk3遺伝子またはそのホモログ、例えば下記の(a')、 (b')、 (c')、 (d') 、(e')、(f)または(g')のポリヌクレオチドからなる遺伝子を提供する:
(a')配列番号: 4または 5に記載の塩基配列力 なるポリヌクレオチド;
(b')配列番号: 4または 5に記載の塩基配列力 なるポリヌクレオチドと相補的な塩基 配列からなるポリヌクレオチドとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズし、かつ植物 の粒長を制御する機能を有するポリヌクレオチド;
(c')配列番号: 4または 5に記載の塩基配列にお 、て 1若しくは複数の塩基が置換、 欠失、挿入、および Zまたは付加された塩基配列からなり、かつ植物の粒長を制御
する機能を有するポリヌクレオチド;
(d')配列番号: 4または 5に記載の塩基配列と少なくとも 80%以上の配列同一性を有 し、かつ植物の粒長を制御する機能を有するポリヌクレオチド;
(e')配列番号: 6に記載のアミノ酸配列力もなるタンパク質をコードするポリヌクレオチ ド、;
(f)配列番号: 6に記載のアミノ酸配列にお 、て 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠 失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、かつ 植物の粒長を制御する機能を有するポリヌクレオチド;
(g')配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列と少なくとも 80%以上の配列同一性を 有するタンパク質をコードし、かつ植物の粒長を制御する機能を有するポリヌクレオ チド。
[0008] 本発明はまた、配列番号: 3または 9に記載のアミノ酸配列力 なる Lk3タンパク質、 およびそれらと構造的に類似しており、植物の粒長を制御する機能を有するタンパク 質、例えば下記の (eつ、(Γ)または (g")のタンパク質を提供する:
(e")配列番号: 3または 9に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質;
(Γ)配列番号: 3または 9に記載のアミノ酸配列にお 、て 1若しくは複数のアミノ酸が置 換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を有し、かつ植物の粒長を制 御する機能を有するタンパク質;
(g")配列表の配列番号 3または 9に記載のアミノ酸配列と少なくとも 80%以上の同一 性を有するアミノ酸配列を有し、かつ植物の粒長を制御する機能を有するタンパク質
[0009] 本発明で 、う「ストリンジェントな条件」とは、特別な場合を除き、 6M尿素、 0.4% SDS 、 0.5 X SSCの条件またはこれと同等のハイブリダィゼーシヨン条件を指し、さらに必要 に応じ、本発明には、よりストリンジエンシーの高い条件、例えば、 6M尿素、 0.4% SD S、 0.1 X SSCまたはこれと同等のハイブリダィゼーシヨン条件を適用してもよい。それ ぞれの条件において、温度は約 40°C以上とすることができ、よりストリンジエンシーの 高い条件が必要であれば、例えば約 50°C、さらに約 65°Cとしてもよい。
[0010] また、本発明で「1若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加さ
れた塩基配列」というときの置換等されるヌクレオチドの個数は、その塩基配列からな るポリヌクレオチドが所望の機能を有する限り特に限定されないが、 1〜9個又は 1〜4 個程度である力 同一または性質の似たアミノ酸配列をコードするような置換等であ れば、所望の機能を消失しないであろう。また、本発明で「1若しくは複数の塩基が置 換、欠失、挿入、および Zまたは付加されたアミノ酸配列」というときの置換等されるァ ミノ酸の個数は、そのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが所望の機能を有す る限り特に限定されないが、 1〜9個又は 1〜4個程度であるか、同一または性質の似 たアミノ酸配列をコードするような置換等であれば、所望の機能を消失しな 、であろう 。そのような塩基配列またはアミノ酸配列に係るポリヌクレオチドを調製するための手 段に【ま、 f列? J¾、 site-directed mutagenesis法 (Kramer W & Fritz H— J: Methods Enz ymol 154: 350、 1987)がある。
本発明には、配列番号: 1、 2、 4、 5、 7または 8に記載の塩基配列と高い同一性を有 し、かつ植物の粒長を制御する機能を有するポリヌクレオチドが含まれる。塩基配列 に関し、高い同一性とは、少なくとも 50%以上、好ましくは 70%以上、より好ましくは 80 %以上、さらに好ましくは 90%以上、最も好ましくは 95%以上の配列の同一性を指す 。また、本発明には、配列番号: 3、 6または 9に記載のアミノ酸配列と高い同一性を有 するアミノ酸配列をコードし、かつ植物の粒長を制御する機能を有するポリヌクレオチ ドが含まれる。アミノ酸配列に関し、高い同一性とは、少なくとも 50%以上、好ましくは 70%以上、より好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上、最も好ましくは 95% 以上の配列の同一性を指す。塩基配列またはアミノ酸配列の同一性は、カーリンお よびアルチユールによるアルゴリズム BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-22 68、 1990、 Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873、 1993)を用いて決定できる。 BLASTの アルゴリズムに基づ 、た BLASTNや BLASTXと呼ばれるプログラムが開発されて!、る ( Altschul SF、 et al: J Mol Biol 215: 403, 1990)。 BLASTNを用いて塩基配列を解析 する場合は、パラメータ一は、例えば score= 100、 wordlength= 12とする。また、 BLA STXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメータ一は、例えば score = 50、 wo rdlength=3とする。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラム のデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
[0012] 本発明のポリヌクレオチドは、天然の植物組織材料力も調製することができる。本発 明のポリヌクレオチドを調製するためには、ハイブリダィゼーシヨン技術(Southern EM : J Mol Biol 98: 503、 1975)やポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術(Saiki RK、 et al: Sc ience 230: 1350、 1985、 Saiki RK、 et al: Science 239: 487、 1988)を利用することが できる。例えば、 Lk3または lk3領域のゲノム塩基配列(配列番号: 1、 4もしくは 7)、 Lk3 cDNAの塩基配列(配列番号: 2、 5もしくは 8)、または、その一部をプローブとして、ま た、 Lk3または lk3領域のゲノム塩基配列、 Lk3 cDNAの塩基配列に特異的にハイブリ ダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、イネや他の植物カゝら Lk3遺伝子と高 い同一性を有する DNAを単離することができる。
[0013] 本発明のポリヌクレオチドには、ゲノム DNA、 cDNAおよび化学合成 DNAが含まれる 。本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖 DNAおよび二本鎖 DNAであり得る。ゲノム DN Aおよび cDNAの調製は、当業者にとって常套手段により行うことが可能である。ゲノ ム DNAは、例えば、 Lk3遺伝子 (本明細書において本発明を説明するとき、本発明の ポリヌクレオチドのうち Lk3遺伝子を例に説明することがある力 特別な場合を除き、 その説明は Lk3遺伝子のホモログ、 lk3遺伝子、 lk3遺伝子のホモログにも当てはまる。 )を有するイネ品種力もゲノム DNAを抽出し、ゲノミックライブラリー(ベクターとしては 、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、 BAC、 PACなどが利用できる)を作製し、これ を展開して、本発明のポリヌクレオチド (例えば、配列番号: 1、 2、 4、 5、 7または 8)を基 に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダィゼーシヨンあるいはプラークハイブ リダィゼーシヨンを行うことで調製できる。また、本発明のポリヌクレオチド (例えば、配 列番号: 1、 2、 4、 5、 7または 8)に特異的なプライマーを作製し、これを利用した PCRを 行って調製することも可能である。 cDNAは、例えば、 Lk3遺伝子を有するイネ品種か ら抽出した mRNAを基に cDNAを合成し、これを λ ZAPなどのベクターに挿入して cDN Aライブラリーを作製し、これを展開して、上記と同様にコロニーノ、イブリダィゼーショ ンあるいはプラークハイブリダィゼーシヨンを行うことで、また PCRを行うことにより調製 できる。
[0014] 本明細書において粒長とは、特別な場合を除き、種子の長径の長さをいう。種子形
状に関する尺度としては、長径の他に、粒幅、粒厚がある。
[0015] 本明細書において粒長に関し「制御 (する)」というときは、特別な場合を除き、粒長 の長さを調節することを指し、これには粒長を短くするように調節することと粒長を長く するように調節することとが含まれる。粒長を調節する際に、他の種子形状に関する 尺度も同時に調節することがある。粒長を短くするように調節することには、粒長を短 くする機能を有するポリヌクレオチド (例えば、本発明の Lk3遺伝子)を、植物に導入し てその機能を発揮させることにより、粒長をより短くすることが含まれる。粒長を長くす るように調節することには、内在の粒長を短くする機能を有するポリヌクレオチドから なる遺伝子 (例えば、本発明の Lk3遺伝子)の機能を低下させることにより、粒長を長 くすることが含まれる。
[0016] 本明細書において「粒長を制御する機能を有するポリヌクレオチド」というときは、特 別な場合を除き、そのポリヌクレオチドが粒長を長くする力または短くする表現型を生 じさせるものであるとき(例えは、配列番号: 1、 2、 7または 8に記載の塩基配列力 な るポリヌクレオチド)と、そのポリヌクレオチドが、粒長を長くする力または短くする表現 型を生じさせる遺伝子の対立遺伝子となりうるものであるとき(例えは、配列番号: 4ま たは 5に記載の塩基配列力 なるポリヌクレオチド)とが含まれる。あるポリヌクレオチド が粒長を長くする力または短くする表現型を生じさせるものである力否かは、例えば 本明細書の実施例 4に記載した方法に従って、対象ポリヌクレオチドが導入された植 物の種子長が変化する力否かを観察することで検証することができる。変化の程度は 、対象ポリヌクレオチドが導入される前の粒長を 100としたとき、約 0.1%以上、約 0.5%以 上、約 1%以上、約 5%以上、約 10%以上、約 15%以上、約 20%以上、約 25%以上であり得 る。
[0017] 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含む組み換えベクター、そのようなベタ ターにより形質転換された形質転換植物体またはその一部を提供する。本発明はさ らに、本発明の粒長を短くする機能を有するポリヌクレオチドからなる遺伝子を機能 可能に有する植物を、該遺伝子の機能を低下させるように形質転換する工程 (例え ば、本発明のベクターにより形質転換する工程)を含む、植物の形質転換方法も提 供する。
[0018] 本明細書で「植物体」というときは、特別な場合を除き、植物個体の意味で用いて おり、また植物体に関して「その一部」というときは、特別な場合を除き、種子 (発芽種 子、未熟種子を含む)、器官又はその部分 (葉、根、茎、花、雄蕊、雌蘂、それらの片 を含む)、植物培養細胞、カルス、プロトプラストを含む。植物体またはその一部は、 繁殖材料も含む。
[0019] 本発明のポリヌクレオチドが挿入されるベクターは、植物細胞内で挿入物の機能を 発揮させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、植物細胞内で恒常 的に遺伝子を発現させるためのプロモーター(例えば、カリフラワーモザイクウィルス の 35Sプロモーター)を有するベクターや、外的な刺激により誘導的に活性ィ匕されるプ 口モーターを有するベクターを用いることもできる。ここでいう「植物細胞」には、種々 の形態の植物細胞、例えば、種子、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルス などが含まれる。
[0020] 植物細胞へのベクターの導入には、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法 (エレク トロポレーシヨン法)、ァグロバタテリゥムを介する方法、パーティクルガン法など、当業 者に公知の種々の方法を用いることができる。ァグロバタテリゥム(例えば、 EHA101) を介する方法においては、例えば、超迅速単子葉形質転換法 (特許第 3141084号) を用いることが可能である。また、パーティクルガン法においては、例えば、ノ ィオラッ ド社のものを用いることが可能である。
[0021] 形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公 知の方法で行うことが可能である(Toki S、 et al: Plant Physiol 100: 1503、 1995)。
[0022] 例えば、イネにおいて形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレング リコールを用いてプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体 (インド型イネ品種が適して いる)を再生させる方法(Datta SK: In Gene Transfer To Plants (Potrykus I and Span genberg、 Eds) pp.66-74、 1995)、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、 植物体(日本型イネ品種が適して 、る)を再生させる方法 (Toki S、 et al: Plant Physi ol 100: 1503、 1992)、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物 体を再生させる方法(Christou P、 et al: Biotechnology 9: 957、 1991)、およびァグ ロバクテリゥムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法 (Hiei Y、 et al: Pla
nt J 6: 271、 1994)など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野にお いて広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることがで きる。
[0023] ゲノム内に本発明のポリヌクレオチドが導入された形質転 ^¾物体がいったん得ら れれば、該植物体力 有性生殖または無性生殖により子孫を得ることができる。また 、該植物体やその子孫あるいはクローン力 繁殖材料 (例えば、種子、果実、切穂、 塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなど)を得て、それらを基に植物体を量産する ことも可能である。
[0024] なお、本発明で「形質転,物 (体)」というときは、特別な場合を除き、本発明の方 法により組換え植物細胞を得て、該植物細胞を植物体に再生させることにより得た形 質転換植物 (体) (T世代)のみならず、該形質転換植物より得られた後代 (T世代等
0 1
)の植物 (体)も、目的の形質が維持されている限り含む。
[0025] 本発明の形質転換の対象となる植物は、本発明のポリヌクレオチドの作用により、 粒長を制御することができるものであれば特に限定されないが、好ましくは被子植物 であり、より好ましくは単子葉植物網に属する植物であり、さらに好ましくはツユクサ亜 網に属する植物であり、最も好ましくはイネ科(Poaceae (Gramineae) )に属する植物、 例えばイネ(Oryza)、ォォムギ、ライムギ、パンコムギ、ィヌムギ、ノ、トムギ、サトウキビ、 トウモロコシ、モロコシ、ァヮ、キビ、ヒェいずれかの属に属する植物である。イネ科に 属する植物のうちでは、好ましくはイネ属に属する植物であり、より好ましくはイネ(Or yza sativa L.)であり、粒長を長くするという観点からは、粒長が比較的短いジャポ二 力型のイネが好ましい。
[0026] 本発明はまた、以下の行程を含む植物を改変する方法を提供する。
(1)請求項 4に記載のベクターを植物組織に導入し、形質転換体を得る工程;
(2)該形質転換体を再生し、形質転換植物体を得る工程;および
(3)該形質転換植物体を所望の形質につ!、て選抜する工程。ここで!/、う所望の形質 とは、粒長が長いこと (長粒長性)、粒長が短いことを含む。本発明の改変方法はまた 、イネの育種(品種改良)に適用することができる。
[0027] 本発明はまた、本発明の粒長を制御する機能を有するポリヌクレオチドを有するィ
ネ品種に由来し、本発明の粒長を制御する機能を有するポリヌクレオチドにより形質 転換されたイネ品種、例えば、本発明の Lk3遺伝子 (またはそのホモログ)を機能可 能に有するイネ品種に由来し、該遺伝子の機能を低下させるように形質転換された 長粒長性イネ品種、あるいは本発明の lk3遺伝子 (またはそのホモログ)を有する長粒 長性のイネ品種に由来し、本発明の Lk3遺伝子 (またはそのホモログ)によって形質 転換された粒長の短いイネ品種を提供する。さらに本発明はまた、本発明の Lk3遺伝 子 (またはそのホモログ)を機能可能に有するイネ品種に由来し、該遺伝子の機能を 低下させるように形質転換された、長粒長性イネ品種、そのようなイネ品種の繁殖材 料、およびそのようなイネ品種を利用することにより得られる、収穫物も提供する。「本 発明の Lk3遺伝子 (またはそのホモログ)を機能可能に有するイネ品種」には、ジャポ ユカ型の品種、例えば日本晴、ヒノヒカリ、コシヒカリ、あきたこまち、はえぬき、ササ- シキ、ひとめぼれが含まれる。
[0028] 本明細書で!/ヽぅ「繁殖材料」とは、特別な場合を除き、植物体の全部または一部で 繁殖の用に供されるもの(「種苗」ということもある。)をいい、例えば、種子、苗、細胞、 カルス、幼芽がある。本明細書でいう「収穫物」とは、特別な場合を除き、通常の意味 で用いており、植物体の全部または一部で繁殖の用に供されないもの、例えば、植 物がイネ属に属するものである場合、収穫物には、もみ、玄米、精米された米が含ま れる。
[0029] 本発明はまた、本発明の Lk3遺伝子 (またはそのホモログ)を利用することを特徴と する、植物の粒長の制御方法を提供する。ここでいう「本発明の Lk3遺伝子 (またはそ のホモログ)を利用すること」には、 Lk3遺伝子を機能可能に有する植物で該遺伝子 の機能を低下させるようにすること、および該遺伝子が機能して 、な 、植物に請求項 該遺伝子を機能可能に導入することが含まれる。
[0030] 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドまたはその断片の相補体を含み、植物に 導入することにより、粒長が長くなる表現型または粒長が短くなる表現型を生じるポリ ヌクレオチド、およびそのような機能を発揮しうるポリヌクレオチドの設計方法を提供 する。本発明のポリヌクレオチドは、 DNAまたは RNAであり、アンチセンス核酸、リボザ ィム、リボザィムをコードする DNA、 RNAiに重要や役割を果たすもの、橋抑制を生じる
ものを含み、また一本鎖のものまたは二本鎖のものを含む。
[0031] 粒長が長くなる表現型を生じるには、例えば Lk3遺伝子の発現を抑制するポリヌクレ ォチドを適当なベクターに挿入して、後述する方法で、これを植物細胞に導入し、こ れにより得られた形質転換植物細胞を再生させることによる。ここでいう「Lk3遺伝子 の発現の抑制」には、遺伝子の転写の抑制、転写物のスプライシングの抑制、および タンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、遺伝子の発現の完全な停止のみなら ず発現の減少も含まれる。また、翻訳されたタンパク質が植物細胞内で本来の機能 を発揮することの抑制も含まれる。
[0032] 植物における特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法としては、アンチセンス 技術を利用する方法が当業者によく利用されている。植物細胞におけるアンチセン ス効果は、電気穿孔法で導入したアンチセンス RNAが植物にお!、てアンチセンス効 果を発揮することをエッカーらが示したことで初めて実証された(Ecker JR & Davis R W: Proc Natl Acad Sci USA 83: 5372、 1986)。その後、タバコやペチュニアにおいて もアンチセンス RNAの発現により標的遺伝子の発現が低下した例が報告されており( van der Krol AR、 et al: Nature 333: 866、 1988)、現在では、アンチセンス技術は植 物における遺伝子発現を抑制させる手段として確立している。
[0033] アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数 の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、 RNAポリメラーゼに よって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害 、合成の進みつつある RNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエタソン との接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害、スプライソソーム形成 部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害; mRNAとのハイブリッド形成による 核から細胞質への移行阻害、キヤッビング部位やポリ (A)付加部位とのノ、イブリツド形 成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻 訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳 阻害、 mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖 の伸長阻害、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による 遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は、転写、スプライシングま
たは翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を抑制する(平島お よび井上:新生化学実験講座 2核酸 IV遺伝子の複製と発現(日本生化学会編、 東 京化学同人) pp.319- 347、 1993)。
[0034] 本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記の 、ずれの作用により標的遺伝子 の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子の mRNAの 5'端近傍の非翻訳 領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考 えられる。また、コード領域もしくは 3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用すること ができる。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセン ス配列を含む DNAも、本発明で利用されるアンチセンス DNAに含まれる。
[0035] 使用されるアンチセンス DNAは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましく は 3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された DNA は、公知の方法を用いることで、所望の植物へ導入できる。
[0036] アンチセンス DNAの配列は、形質転換される植物が持つ内在性遺伝子またはその 一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限り において、完全に相補的でなくてもよい。転写された RNAは、標的遺伝子の転写産 物に対して好ましくは 90%以上、最も好ましくは 95%以上の相補性を有する。アンチ センス配列を用いて標的遺伝子の発現を効果的に抑制するには、アンチセンス DNA の長さは少なくとも 15塩基以上であり、好ましくは 100塩基以上であり、さらに好ましく は 500塩基以上である。通常用いられるアンチセンス DNAの長さは 5kbよりも短ぐ好 ましくは 2.5kbよりも短い。
[0037] 内在性遺伝子の発現の抑制は、また、リボザィムをコードする DNAを利用して行うこ とも可能である。リボザィムとは触媒活性を有する RNA分子のことを指す。リボザィム には種々の活性を有するものが存在する力 中でも RNAを切断する酵素としてのリボ ザィムに焦点を当てた研究により、 RNAを部位特異的に切断するリボザィムの設計が 可能となった。
[0038] リボザィムには、グループ Iイントロン型や RNase Pに含まれる Ml RNAのように 400ヌ クレオチド以上の大きさのものもある力 ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる 40 ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある (小泉誠および大塚栄子:蛋白質
核酸酵素、 35: 2191、 1990)。
[0039] 例えば、ハンマーヘッド型リボザィムの自己切断ドメインは、 G13U14C15という配列 の C15の 3'側を切断する力 その活性には U14と A9との塩基対形成が重要とされ、 C1 5の代わりに A15または U15でも切断され得ることが示されている(Koizumi M、 et al: FEBS Lett 228: 228、 1988)。
[0040] 基質結合部位が標的部位近傍の RNA配列と相補的なリボザィムを設計すれば、標 的 RNA中の UC、 UUまたは UAと ヽぅ配列を認識する制限酵素的な RNA切断リボザィ ムを作出することができる(Koizumi M、 et al: FEBS Lett 239: 285、 1988、小泉誠お よび大塚栄子:蛋白質核酸酵素 35: 2191、 1990、 Koizumi M、 et al: Nucl Acids Re s 17: 7059、 1989) o例えば、 Lk3遺伝子(配列番号: 1、 2、 7または 8)中には、標的と なり得る部位が複数存在する。
[0041] また、ヘアピン型リボザィムも本発明の目的に有用である。このリボザィムは、例え ばタバコリングスポットウィルスのサテライト RNAのマイナス鎖に見出される(Buzayan J M: Nature 323: 349、 1986)。ヘアピン型リボザィムからも、標的特異的な RNA切断リ ボザィムを作出できることが示されている(Kikuchi Y & Sasaki N: Nucl Acids Res 19: 6751、 1991、菊池洋:化学と生物 30: 112、 1992)。
[0042] 標的を切断できるように設計されたリボザィムは、植物細胞中で転写されるように、 カリフラワーモザイクウィルスの 35Sプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結 配列に連結される。このとき、転写された RNAの 5'端や 3'端に余分な配列が付加され ていると、リボザィムの活性が失われることがある力 こういった場合は、転写されたリ ボザィムを含む RNAからリボザィム部分だけを正確に切り出すために、リボザィム部 分の 5'側や 3'側にシスに働く別のトリミングリボザィムを配置させることも可能である (T aira K、 et al: Protein Eng 3: 733、 1990、 Dzianott AM & Bujarski JJ: Proc Natl Aca d Sci USA 86: 4823、 1989、 Grosshans CA & Cech TR: Nucl Acids Res 19: 3875、 1 991、 Taira K、 et al: Nucl Acids Res 19: 5125、 1991)。また、このような構成単位を タンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにすることで、より効 果を高めることもできる(Yuyama N、 et al: Biochem Biophys Res Commun 186: 1271 、 1992) oこのように、リボザィムを用いて本発明における標的遺伝子の転写産物を
特異的に切断することで、該遺伝子の発現を抑制することができる。
[0043] 内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配 列を有する二本鎖 RNAを用いた RNA interferance (RNAi)によっても行うことができる 。 RNAiとは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖 RNAを細 胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれ も抑制される現象のことを指す。 RNAiの機構の詳細は明らかではないが、最初に導 入した二本鎖 RNAが小片に分解され、何らかの形で標的遺伝子の指標となることに より、標的遺伝子が分解されると考えられている。 RNAiは植物においても効果を奏す ることが知られている(Chuang CF & Meyerowitz EM: Proc Natl Acad Sci USA 97: 49 85、 2000) o例えば、植物体における Lk3遺伝子の発現を RNAiにより抑制するために は、 Lk3遺伝子 (配列番号: 1、 2、 7または 8)の配列の一部またはこれと類似した配列 を有する小分子の二本鎖 RNAを目的の植物へ導入し、得られた植物体力 野生型 植物体と比較して長粒長性を示した植物を選択すればよい。
[0044] RNAiに用いる小分子の二本鎖 RNAの配列は、標的遺伝子と完全に同一である必 要はないが、少なくとも 70%以上、好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上、 最も好ましくは 95%以上の配列の同一性を有する部分を含む。また、配列の同一性 は上述した手法により決定できる。このような小分子の二本鎖 RNAの長さは、例えば 1 5〜100塩基対であり、好ましくは 300塩基対であり、さらに好ましくは 400〜700塩基対 、例えば 500塩基対である。あるいは、このような小分子の二本鎖 RNAの長さは、例え ば 5〜50塩基対であり、好ましくは 10〜50塩基対であり、さらに好ましくは 15〜30塩基 対、例えば 20塩基対である。 RNAiには二本鎖 RNAを構築可能な公知の発現べクタ 一、例えば pANDA (Miki D and Shimamoto K: Plant Cell Physiol. 45: 490-495、 200 4)を利用することができる。
[0045] 内在性遺伝子の発現の抑制は、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有 する DNAによる形質転換によって起こる共抑制によっても達成できる。「共抑制」とは 、植物に標的内在性遺伝子と同一もしくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換 により導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも 抑制される現象のことを指す。共抑制の機構の詳細は明らかではないが、少なくとも
その機構の一部は RNAiの機構と重複して 、ると考えられて 、る。共抑制は植物にお いても観察される(Smyth DR: Curr Biol 7: R793、 1997、 Martienssen R: Curr Biol 6: 810、 1996) o例えば、 Lk3遺伝子が共抑制された植物体を得るためには、 Lk3遺伝 子またはこれと類似した配列を有する DNAを発現できるように作製したベクター DNA を目的の植物へ形質転換し、得られた植物体力ゝら野生型植物体と比較して長粒長 性を示した植物を選択すればょ ヽ。
[0046] 共抑制に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくと も 70%以上、好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上、最も好ましくは 95%以 上の配列の同一性を有する。また、配列の同一性は上述した手法により決定できる。 共抑制に用いる DNAの長さは、例えば 50塩基であり、好ましくは 100塩基であり、さら に好ましくは 500塩基である。あるいは、共抑制に用いる DNAの長さは、例えば 50〜6 000塩基であり、好ましくは 100〜5000塩基であり、例えば 500塩基である。
[0047] 従来、イネの品種改良は(1)交雑による有望系統の選抜、(2)放射線や化学物質 による突然変異誘起などによって行われてきた。これらの作業は長期間を要すること や変異の程度や方向性を制御できないことなどの問題があった。今回の発明により、 遺伝子の塩基配列が明らかとなった粒長を制御する遺伝子 Lk3は、その機能低下に よりイネの粒を長くしうる。そのため、機能のある Lk3遺伝子をもつ系統を Lk3のアンチ センス鎖で形質転換することにより、イネの粒長の増加を図ることができる。一方、 Lk3 遺伝子の機能が低下または喪失して 、る品種、例えば IR24にセンス方向に遺伝子を 導入することにより、イネの粒長を減少させることができる。形質転換に要する期間は 交配による遺伝子移入に比較して極めて短期間であり、他の形質の変化を伴わない で粒長の制御が可能となる。単離した Lk3遺伝子を利用することにより、イネの粒長を 変化させることができ、より多収のイネや、異なる人々の嗜好に適応したイネ品種育 成に貢献できると考えられる。
[0048] 以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが本発明はこれらの実施例 に制限されるものではな 、。
実施例 1
[0049] lk3 遣伝早の 乍 ffl:
本実施例では、あそみのりの遺伝的背景に IR24の lk3対立遺伝子を交雑移入した 染色体断片置換系統(AIS22) (Kubo et al.、 Breeding Science 52: 319-325、 2002)と あそみのりを通常の圃場条件で栽培した。
[0050] AIS22とあそみのりの粒形の比較写真を図 2に示した。また、それぞれの粒長、粒幅 、粒厚の測定結果を下表に示した。
[0051] [表 1] 粒長 (mm) 粒幅 (請) 粒厚 (圆)
A I S22 8. 51 ± 0. 13 3. 11 ± 0. 08 2. 08 ± 0. 07
あそみのり 7. 56 土 0. 19 3. 25 士 0. 09 2. 13 土 0. 06
[0052] AIS22はあそみのりより 0.95mm (12.6%)粒長が長ぐ明確な差が認められた。粒幅に 関しては 0.14mm (4.3%)減少しており、この差は有意であった (P=0.0022)。粒厚に関し ては有意差はな力つた。これらの結果から、 IR24由来の lk3対立遺伝子は粒幅をわず 力に減少させるものの、粒厚には関与せず、粒長を顕著に増大させることが明らかと なった。
実施例 2
[0053] 高精度車鎖解析:
本実施例においては、マップベースクローニングによる遺伝子単離に不可欠な大 規模分離集団による lk3座の詳細な連鎖解析を行なった。連鎖解析用の集団はあそ みのりと IR24との戻し交雑後代を用いた。 lk3座領域がヘテロ型となった個体の自殖 後代 1600個体から lk3座を挟み込む CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence )マーカー C1677 (プライマー 5'- TAAGTCTGCTCCCACCACTGG- 3' (配列番号: 11 )および 5'- GCCATCACAAACAATCCAAATTTG- 3' (配列番号: 12)、制限酵素 Eco RV)および RFLPマーカー R19の極近傍に位置する CAPSマーカー S13580 (プライマ 一 5し GACCTCAGATGAGAATAAACCAAG- 3' (配列番号: 13)および 5し TGCTTC AGCTTACCAATCCA-3' (配列番号: 14)、制限酵素 BsrBI)を利用して、 lk3座近傍 に組換えが生じた染色体をもつ個体を選抜した。 lk3座の遺伝子型決定は、当代およ
び後代検定によって行なった。 CAPS、 SSR (Simple Sequence Repeat),および SNP (S ingle Nucleotide Polymorphism)などの各種 DNAマーカーを作成しつつ連鎖解析を 進めた結果、 lk3座は CAPSマーカー 13-469 (プライマー 5'- CAAGGCCCAAAATCC AAATCA-3' (配列番号: 15)および 5'- GGCCGACGGGCCTAACTATT- 3' (配列番 号: 16)、制限酵素 Ndel)および SNPマーカー 13- 13487 (プライマー 5'- CAGGGATCT CAGGCTCTCGT- 3' (配列番号: 17)および 5'- ACTGACGGCTACGTGTGTGG- 3' ( 配列番号: 18))の間に位置づけられ、それぞれのマーカーと 1個体および 3個体の組 換え個体が同定できた。また、 CAPSマーカー 13-5669 (プライマー 5'- ACGACAGTA CTTGCTGTCTAGCTTT-3 ' (配列番号: 19)および 5'- AACGGTCAAAGTTCATGA TCAAA-3' (配列番号: 20)、制限酵素 Pstl)と lk3座は完全に連鎖していた(図 3)。 実施例 3
[0054] 候補遣伝早の 某西 R列解析および発現解析:
公開されたイネのゲノム塩基配列を利用し、 IR24とあそみのりにつ!/、て CAPSマーカ 一 13-469および 13-13487の間の領域のゲノム塩基配列解析を行!、、遺伝子予測お よび類似性検索を行なった。
[0055] ゲノム塩基配列解析の結果、 CAPSマーカー 13-469および 13-13487の間には CAP Sマーカー 13- 5669に相当する SNPの他に二力所だけ変異が存在した。そこで、これ らの塩基配列変異を含む遺伝子を RiceGAAS (http:〃 ricegaas.dna.alfrc.go.jp/)によ り予測したところ、 13-5669に相当する塩基配列変異が IR24において終止コドンに変 化して 、ることが示唆された。
[0056] そこで、この予測遺伝子の cDNA塩基配列を解析した。その際には、全長約 2cmの 幼穂をあそみのりおよび AIS22から採種し、バイオラッド社の Aurum Total RNA Miniキ ットを使用して抽出した全 RNAを铸型とし、 TOYOBO社の ReverTra Ace- αキットによ り逆転写して得られた cDNAを用いた。 cDNAを铸型とする PCR (RT-PCR)では、候補 遺伝子の cDNAを増幅するプライマーとして 5'-TGAGATCAAAACTAGCTACTACC AGCTAGA- 3' (配列番号: 21)および 5し CATGGCAATGGCGGCGGCGCCCCGGC CCAA-3' (配列番号: 22)を用いた。
[0057] その結果、この候補遺伝子のあそみのり対立遺伝子は 5つのェクソン力 なり、 232
アミノ酸力もなるタンパク質をコードしており(図 4A、 B)、カルボキシル末端付近に von Willebrand Factor type C (VWFC)ドメインと呼ばれるアミノ酸配列を有していた。とこ ろ力 IR24にお!/ヽては 13-5669における変異のため 55番目のアミノ酸がシスティンか ら終止コドンに変化し、遺伝子の機能が欠失していると考えられた (図 4C)。
実施例 4
T 3候 遣伝早の機能 明:
上記の解析から、 Lk3の候補遺伝子が推定できたため、形質転換による機能証明 を行なった。
<形質転換用ベクターの調製 >
形質転換には、機能のある Lk3対立遺伝子をもっと推定される日本型品種日本晴 のゲノム DNA断片を用いた。まず、 日本晴のゲノム DNAから作成された BAC (Bacteri al Artificial Chromosome)クローン OSJNBa0002D18 (Chen et al.、 The Plant Cell 14:
537-545、 2002) 1 μ gを制限酵素 Xmnlにより 37°Cで 1時間消化後、 65°Cで 15分間処 理し、制限酵素を失活させた。 Xmnlを用いたのは、ゲノム塩基配列情報および RT-P CRから得られた情報により、プロモーター領域を含む Lk3遺伝子の全長を有し、他の 遺伝子は含まな 、DNA断片を切り出すことができたためである。これとは別に Ti-ブラ スミドベクター PPZP2H— lac (Fuse et al.、 Plant Biotechnol. 18: 219—222、 2001) 1 μ g を制限酵素 Smalにより 37°Cで 1時間消化後、 65°Cで 15分間処理し、制限酵素を失活 させた。消化したプラスミドベクターは、アルカリフォスファターゼ(Roche社の Phosphat ase alkaline, shrimp)にて脱リン酸化処理を 37°Cで 1時間行った後、 65°Cで 15分間処 理し、アルカリフォスファターゼを失活させた。上記の BACクローン消化産物とプラスミ ドベクターを混合し、 TOYOBO社の Ligation highを使用して 16°Cで 1晚ライゲーシヨン 反応を行った。得られたライゲーシヨン液は TOYOBO社の COMPETENT high DH5 αを用いて大腸菌に組み込み、この菌液をストレプトマイシンを 20mg/l、 X-gal (5- Br omo- 4- chloro- 3- inaolyi- β - D- galactopyranoside)を 20mg/l、 IPTG (Isopropyl β - D- 1-thiogalactopyranoside)を 0.02%含む LB寒天培地にプレーティングし、 37°Cで 1晚培 養した。得られたコロニーのうち、白いものをストレプトマイシン(20mg/l)を含む LB液 体培地にピックアップ後、 37°Cで 1時間培養し、スクリーニングを行なった。すなわち、
得られた菌液を铸型にプライマー対 5'-GGGAATAGGGATTCCACACG-3,(配列番 号: 23)、 5 -AATGGTGATGCCCAGCTTTT-3' (配列番号: 24)にて PCR増幅した。 この PCRによって産物が得られた菌液、すなわち、ねらいとする Lk3遺伝子の配列を 含むベクターをもつ菌液をストレプトマイシンを 20mg/l含む LB液体培地に接種し、 37 °Cで 1晚培養して、 BIO RAD社 Quantum Prep Plasmid Miniprep Kitによりプラスミド を抽出し、 Lk3遺伝子を含む 7kbのゲノム DNA (配列番号: 10)を含むベクターを得た
<形質転換カルスの調製 >
得られたベクター 2 μ gを凍結融解法を用いてァグロバタテリゥム(Agrobacterium tu mefaciens EHA101)に導入し、カナマイシンを 50mg/l、ハイグロマイシンを 50mg/l含 む LB固形培地で 30。C、 3日間培養した。得られたコロニーをプライマー 5'-GGGAAT AGGGATTCCACACG- 3' (配列番号: 23)、 5'- AATGGTGATGCCCAGCTTTT- 3' ( 配列番号: 24)にて PCR増幅し、増幅が確認されたコロニーをカナマイシン(50mg/l) 、ハイグロマイシン(50mg/l)を含む LB固形培地に接種し、 30°Cで 1晚培養した。この ァグロバタテリゥムをミニスパーテルで 1さじ搔き取り、ァセトシリンゴン (20mg/l)を含む AAM溶液 50mlに懸濁した。これとは別に、 2,4_D (2mg/l)を含むカルス誘導培地 (N6 D培地)〖こ AIS22の種子を播種し、 30°Cの明所で培養し、 4週間後に胚盤由来カルス を得た。シュートと胚乳部分を除去したカルスを 50mlのプラスチック試験管に入れ、上 記のァグロバタテリゥム懸濁液 50mlを加え、 1分 30秒間ゆっくり転倒混和し、ァグロバ クテリゥムをカルスに付着させた。余分な菌液を除去した後、ァセトシリンゴン (10mg/l) および 2,4-D(2mg/l)を含む 2N6AS培地上で 25°Cの暗所にて 3日間共存培養すること によりァグロバタテリゥムをカルスに感染させ、ベクター上の DNA断片をカルスに導入 した。このカルスを滅菌水およびカルべ-シリン溶液(500mg/l)で洗浄してァグロバタ テリゥムを除去後、カルべ-シリン(500mg/l)、ハイグロマイシン(50mg/l)および 2,4- D (2mg/l)を含む除菌 '選抜培地 (2N6DS培地)上で 30°Cの明所にて 4週間培養する ことにより形質転換カルスを得た。
<植物体への再分化 >
得られた形質転換カルスはキネチン (2mg/l)およびナフタレン酢酸 (0.02mg/l)を含
む再分ィ匕培地 (Regeneration medium III培地)に移し、 30°Cの明所で 12週間? 16週 間培養することにより再分ィ匕シュートを得た。このシュートを再生培地 (MSホルモンフ リー培地)に移し、幼植物を得た。この再分化植物を温室に移して 25°Cで育成した。 <解析 >
日本型品種日本晴のゲノム DNA断片を形質転換に用いた再分ィ匕当代 (T )の植物 について粒長を調査した結果、 32個体中 16個体で粒長が短くなつていた (図 5)。この 16個体のうち、粒長が短くなつていた 2個体から自殖種子を得て 2系統の T系統を育 成し、粒長を調査した。また、 T各個体について、導入した DNA断片の有無を CAPS
1
マーカー 13- 5669(プライマー 5'- ACGACAGTACTTGCTGTCTAGCTTT- 3' (配列番 号: 19)および 5'-AACGGTCAAAGTTCATGATCAAA-3' (配列番号: 20)、制限酵素 Pstl)により判別し、導入遺伝子を持つ個体と持たな!、個体の粒長の平均値を F検定 により比較した。その結果、いずれの T系統においても、導入遺伝子を有する個体の 粒長は導入遺伝子を持たな ヽ個体の粒長より有意に小さくなつて ヽた (下表)。一方 、 pPZP2H-lacのみを形質転換に用いた個体では粒の長 、個体のみが観察された( 図 5)。以上の結果から、 VWFC様タンパク質をコードする候補遺伝子は Lk3であること が証明された。
[¾2] 粒長 (ran土棵準偏差)
系統 P
導入遺伝子有リ 導入遺伝子無し
T, 1 7. 2 ± 0. 11 8. 2 ± 0. 12 < 0. 01
T, 2 7. 2 ± 0. 20 8. 3 ± 0. 20 く 0. 01
Claims
[1] 下記の(a)、 (b)、 (c)、 (d)、 (e)、 (f)または (g)のポリヌクレオチド:
(a)配列番号: 1、 2、 7または 8に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号: 1、 2、 7または 8に記載の塩基配列力 なるポリヌクレオチドと相補的な 塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズし、かつ 植物の粒長を制御する機能を有するポリヌクレオチド;
(c)配列番号: 1、 2、 7または 8に記載の塩基配列において 1若しくは複数の塩基が置 換、欠失、挿入、および Zまたは付加された塩基配列からなり、かつ植物の粒長を制 御する機能を有するポリヌクレオチド;
(d)配列番号: 1、 2、 7または 8に記載の塩基配列と少なくとも 80%以上の同一性を有 し、かつ植物の粒長を制御する機能を有するポリヌクレオチド;
(e)配列番号: 3または 9に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド;
(f)配列番号: 3または 9に記載のアミノ酸配列にお 、て 1若しくは複数のアミノ酸が置 換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列をコードし、かつ植物の粒長を 制御する機能を有するポリヌクレオチド;
(g)配列表の配列番号 3または 9に記載のアミノ酸配列と少なくとも 80%以上の同一性 を有するアミノ酸配列をコードし、かつ植物の粒長を制御する機能を有するポリヌクレ ォチド。
[2] 下記の(a')、 (b')、 (c')、 (d')、 (e')、 (f)または(g')のポリヌクレオチド:
(a')配列番号: 4または 5に記載の塩基配列力 なるポリヌクレオチド;
(b')配列番号: 4または 5に記載の塩基配列力 なるポリヌクレオチドと相補的な塩基 配列からなるポリヌクレオチドとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズし、かつ植物 の粒長を制御する機能を有するポリヌクレオチド;
(c')配列番号: 4または 5に記載の塩基配列にお 、て 1若しくは複数の塩基が置換、 欠失、挿入、および Zまたは付加された塩基配列からなり、かつ植物の粒長を制御 する機能を有するポリヌクレオチド;
(d')配列番号: 4または 5に記載の塩基配列と少なくとも 80%以上の同一性を有し、か つ植物の粒長を制御する機能を有するポリヌクレオチド;
(e')配列番号: 6に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド; (f)配列番号: 6に記載のアミノ酸配列にお 、て 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠 失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列をコードし、かつ植物の粒長を制御 する機能を有するポリヌクレオチド;
(g')配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列と少なくとも 80%以上の同一性を有す るアミノ酸配列をコードし、かつ植物の粒長を制御する機能を有するポリヌクレオチド
[3] イネ属植物由来である、請求項 1または 2に記載のポリヌクレオチド。
[4] 請求項 1または 2に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
[5] 請求項 4に記載のベクターにより形質転換された、形質転 ^¾物体またはその一部。
[6] イネ属植物である、請求項 5に記載の形質転換植物体またはその一部。
[7] 請求項 1に記載のポリヌクレオチドからなる遺伝子を機能可能に有する植物を、該遺 伝子の機能を低下させるように形質転換する工程を含む、植物の形質転換方法。
[8] 植物を改変する方法であって:
請求項 4に記載のベクターを植物組織に導入し、形質転換体を得る工程; 該形質転換体を再生し、形質転換植物体を得る工程;および
該形質転換植物体を所望の形質につ!ヽて選抜する工程
を含む、前記方法。
[9] 所望の形質が、粒長が長くなること (長粒長性)である、請求項 8に記載の方法。
[10] 植物が、イネ品種である、請求項 8または 9に記載の方法。
[11] 請求項 1に記載のポリヌクレオチドからなる遺伝子を機能可能に有するイネ品種に由 来し、該遺伝子の機能を低下させるように形質転換された、長粒長性イネ品種。
[12] 請求項 9に記載の長粒長性イネ品種の繁殖材料。
[13] 請求項 10に記載の長粒長性イネ品種を利用することにより得られる、収穫物。
[14] 請求項 1に記載のポリヌクレオチドを利用することを特徴とする、植物の粒長の制御方 法。
[15] 請求項 1に記載のポリヌクレオチドを利用することが、請求項 1に記載のポリヌクレオチ ドからなる遺伝子を機能可能に有する植物で該遺伝子の機能を低下させることであ
る力、または請求項 1に記載のポリヌクレオチド力 なる遺伝子が機能して 、な 、植物 に請求項 1に記載のポリヌクレオチドを機能可能に導入することである、請求項 14に 記載の方法。
[16] 請求項 1もしくは 2に記載のポリヌクレオチドまたはその断片の相補体を含み、植物に 導入することにより、粒長が長くなる表現型または粒長が短くなる表現型を生じる、ポ リヌクレ才チド。
[17] 下記の (e")、(Γ)または (g")のタンパク質:
(e")配列番号: 3または 9に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質;
(Γ)配列番号: 3または 9に記載のアミノ酸配列にお 、て 1若しくは複数のアミノ酸が置 換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を有し、かつ植物の粒長を制 御する機能を有するタンパク質;
(g")配列表の配列番号 3または 9に記載のアミノ酸配列と少なくとも 80%以上の同一 性を有するアミノ酸配列を有し、かつ植物の粒長を制御する機能を有するタンパク質
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007521205A JP4997508B2 (ja) | 2005-04-14 | 2006-04-12 | イネの粒長を制御するLk3遺伝子およびその利用 |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2005116968 | 2005-04-14 | ||
JP2005-116968 | 2005-04-14 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
WO2006112327A1 true WO2006112327A1 (ja) | 2006-10-26 |
Family
ID=37115051
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PCT/JP2006/307745 WO2006112327A1 (ja) | 2005-04-14 | 2006-04-12 | イネの粒長を制御するLk3遺伝子およびその利用 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4997508B2 (ja) |
WO (1) | WO2006112327A1 (ja) |
-
2006
- 2006-04-12 WO PCT/JP2006/307745 patent/WO2006112327A1/ja active Application Filing
- 2006-04-12 JP JP2007521205A patent/JP4997508B2/ja active Active
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
DATABASE MEDLINE [online] WAN X.Y. ET AL.: "QTL analysis for rice grain length and fine mapping of an identified QTL with stable and major effects", XP003001636, Database accession no. (NLM16477428) * |
KUBO T. ET AL.: "Reciprocal chromosome segment substitution series derived from Japonica and Indica cross of rice(Oryza sativa L.)", BREEDING SCIENCE, vol. 52, 2002, pages 319 - 325, XP003001634 * |
KUBO T. ET AL.: "RFLP mapping of genes for long kernel and awn on chromosome 3 in rice", RICE GENETICS NEWSLETTER, vol. 18, 2001, pages 26 - 28, XP003001635 * |
THEOR. APPL. GENET., vol. 112, no. 7, May 2006 (2006-05-01), pages 1258 - 1270 * |
WAN X.Y. ET AL.: "Stable expression of QTL for grain shape of milled rice (Oryza sativa L.) using a CSSLs population", ACTA GENETICA SINICA, vol. 31, no. 11, November 2004 (2004-11-01), pages 1275 - 1283, XP003001633 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP4997508B2 (ja) | 2012-08-08 |
JPWO2006112327A1 (ja) | 2008-12-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Prakash et al. | PkMADS1 is a novel MADS box gene regulating adventitious shoot induction and vegetative shoot development in Paulownia kawakamii | |
US10087458B2 (en) | Manipulating BS1 for plant seed yield | |
CA3057759A1 (en) | Methods for increasing grain yield | |
KR20080075908A (ko) | 배아에 모계 게놈의 완전한 이배체 상보체를 갖는 종자를생산하기 위한 핵산 및 방법 | |
JP2002153283A (ja) | 植物の開花を誘導する遺伝子Hd3aおよびその利用 | |
AU2013210859B2 (en) | Methods of controlling seed size in plants | |
EP2451959B1 (en) | Disruption of ckx3 and at least one other ckx gene in a plant or plant cell leads to improved traits | |
JP4165881B2 (ja) | フィトクロムcの発現制御による植物の開花時期の調節 | |
WO2015010131A2 (en) | Expression of sep-like genes for identifying and controlling palm plant shell phenotypes | |
CA2970138A1 (en) | Modulation of yep6 gene expression to increase yield and other related traits in plants | |
JP4504049B2 (ja) | 植物の開花を制御する遺伝子Lhd4とその利用 | |
EP1761634B1 (en) | Cell number polynucleotides and polypeptides and methods of use thereof | |
JP3911202B2 (ja) | 植物の開花時期を促進するEhd1遺伝子およびその利用 | |
NL2011980C2 (en) | New effects of plant ahl proteins. | |
JP4997508B2 (ja) | イネの粒長を制御するLk3遺伝子およびその利用 | |
US20140380526A1 (en) | Disruption of CKX3 and at least one other CKX gene in a plant or plant cell leads to improved traits | |
US9422570B2 (en) | Disruption of AHP6 gene leads to plants with improved seed yield | |
JP5534137B2 (ja) | 植物の生長を制御する遺伝子Hd16およびその利用 | |
KR101592863B1 (ko) | 왜성 표현형을 나타내는 D-h 유전자 및 이의 용도 | |
JP5278658B2 (ja) | イネの感光性遺伝子Ehd3とその利用 | |
WO2004081210A1 (ja) | 植物の開花を制御する遺伝子Lhd4とその利用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application | ||
WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 2007521205 Country of ref document: JP |
|
NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: RU |
|
122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
Ref document number: 06745398 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |