WO2006092882A1

WO2006092882A1 - イネのアントラニル酸合成酵素遺伝子ｏａｓａ２の新規改変遺伝子およびその利用

Info

Publication number: WO2006092882A1
Application number: PCT/JP2005/018708
Authority: WO
Inventors: Yuzuru Tozawa; Takuya Kanno; Kyo Wakasa
Original assignee: National University Corporation Ehime University; Japan Science And Technology Agency; Incorporated Administrative Agency National Agriculture And Food Research Organization
Priority date: 2005-02-28
Filing date: 2005-10-11
Publication date: 2006-09-08
Also published as: EP1870469A1; BRPI0520119A2; EP1870469A4; US20080134370A1; AU2005328634B2; CN101128584A; CA2595529A1; AU2005328634A1

Abstract

　イネアントラニル酸合成酵素遺伝子ＯＡＳＡ２の塩基配列に変異を導入し、特定の複数のアミノ酸に置換が生じたイネアントラニル酸合成酵素は、トリプトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を獲得すると共に野生型イネアントラニル酸合成酵素と同程度以上の酵素活性を維持している。

Description

明細書

イネのアントラニル酸合成酵素遺伝子 OASA2の新規改変遺伝子およびその利用

技術分野

[0001] 本発明は、イネのアントラ-ル酸合成酵素遺伝子 OASA2の新規改変遺伝子およびその利用に関するものであり、特に野生型イネアントラニル酸合成酵素と同程度以上の酵素活性を有し、トリブトファンによるフィードバック阻害に対して抵抗性を有する改変イネアントラニル酸合成酵素をコードする新規改変遺伝子およびその利用に関するものである。

背景技術

[0002] トリプトファンはタンパク質を構成するアミノ酸の 1つであり、生物が生きていくうえで不可欠なものである。動物はトリブトファンを体内で合成できないため、食物から摂取しなければならない。イネ、トウモロコシ、コムギなどの穀物は、トリプトファンの含有量が非常に少ないため、通常穀物飼料には工業的に製造されたトリブトファンを添加する必要がある。

[0003] トリブトファンの生合成経路において、コリスミン酸力もアントラニル酸が生合成される力アントラ-ル酸の生成はアントラ-ル酸合成酵素の触媒作用が関与しており、これによってアントラニル酸が生成し、さらにアントラニル酸から 6段階の酵素反応によりインドールを経てトリブトファンが生成することが知られて、る（非特許文献 1参照)。

[0004] 発明者らは、既にイネアントラ-ル酸合成酵素アルファサブユニット遺伝子として O ASA1および OASA2が存在することを見出し、これらを単離した (特許文献 1参照）

。そして、これらの特徴を詳細に検討した結果、遺伝子発現量が多ぐイネにおいてアントラニル酸合成酵素アルファサブユニットとして主に機能するタンパク質をコードする遺伝子は OASA2であると考えられることを報告して、る（非特許文献 2参照)。さらに、発明者らは、 OASA2タンパク質は、極めてトリブトファン濃度に感受性が高く、細胞内のトリブトファン濃度が上昇するに伴い活性を低下させてしまうことを報告している (非特許文献 3参照)。 [0005] そこで、 OASA2タンパク質の機能を改変することができれば、高濃度のトリブトファンが蓄積される新しい品種の植物を作出することができると考えられる。イネアントラ -ル酸合成酵素遺伝子の改変に関しては、例えばイネアントラニル酸合成酵素第 1 アイソザィムアルファサブユニット OASA1タンパク質の 323番目のァスパラギン酸残基をァスパラギン残基に置換 (D323N)することで得られたトリブトファンフィードバック阻害抵抗性変異体 OASA1Dを形質転換すると、野生型よりもカルスで 180倍、組換体イネで 35倍、遊離のトリブトファン量が増加することが、発明者らにより報告されている (非特許文献 2参照)。

[0006] 一方、遺伝子にランダムに変異を導入し、その変異遺伝子の産物である変異タンノ^質の機能をスクリーニングすることは多大な時間と労力を必要とする。さらに、目的の位置に複数の変異を同時に導入することは、ランダムに変異を導入する方法では極めて困難であり、ほとんど不可能に近、と考えられて、る。

〔特許文献 1〕

国際公開第 WO99Z11800号

〔非特許文献 1〕

生化学実験講座、第 11卷、東京化学同人、 1976年、 652頁〜 653頁

〔非特許文献 2〕

1 ozawa Y, Hasegawa ri， ierakawa T and Wakasa K (2001) Characterization of nc e anthranilate synthase alfa subunit genes OSASAl and OSAbA2: tryptophan accum ulation in transgenic rice expressing a feedback-insensitive mutant of OAbAl. Plan t Physiology 126: 1493-1506

〔非特許文献 3〕

Takuya Kanno, Koji Kasai, Yasuko Ikejiri-Kanno, Kyo Wakasa and Yuzuru Tozawa (2004) In vitro reconstitution of rice anthranilate synthase: distinct functional prope rties of the alpha subunits OASA1 and OASA2. Plant Molecular Biology 54: 11-22 発明の開示

[0007] 上述のように、穀物飼料には工業的に製造されたトリブトファンを添加している力トリブトフアンは他のアミノ酸に比べて高価であるため、トリブトファン含有量の高い穀物の作出が期待されている。そこで、イネアントラ-ル酸合成酵素遺伝子 OASA2に変異を導入することにより、細胞内のトリブトファン濃度が上昇しても酵素活性が低下しな、ように OASA2タンパク質の機能を改変することができれば、高濃度のトリプトフアンが蓄積された新しい品種の植物を作出することが可能になる。

[0008] 本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、細胞内のトリブトファン濃度が上昇しても酵素活性が低下しなヽように機能改変されたイネアントラニル酸合成酵素および当該酵素をコードする新規改変遺伝子を提供し、高濃度のトリブトフアンを含有する新しい品種の植物を実現することにある。

[0009] 本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、イネアントラ-ル酸合成酵素遺伝子 OASA2に変異を導入することにより、トリブトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有するタンパク質^ ilj出した。さらに、発明者らは上記野生型イネアントラニル酸合成酵素遺伝子 OAS A2におヽて複数の変異を導入し、これらを組み合わせることにより、トリブトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有すると共に、野生型イネアントラ-ル酸合成酵素と同程度以上の酵素活性を有するタンパク質^ |lj出することに成功し、本発明を完成させるに至った。

[0010] すなわち、本発明に係るポリペプチドは、配列番号 1に示されるアミノ酸配列の第 1 26位、第 367位または第 369位の少なくとも 1つに変異を有するポリペプチドであつて、トリブトファン生合成経路においてトリブトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有することを特徴としている。さらに、上記変異に加えて配列番号 1に示されるアミノ酸配列の第 351位、第 522位または第 530位の少なくとも 1つに変異を有するポリペプチドであって、野生型イネアントラ-ル酸合成酵素と比較して少なくとも 0. 7倍以上の酵素活性を有することが好ま、。トリブトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有し、さらに野生型イネアントラ-ル酸合成酵素と比較して少なくとも 0. 7倍以上の酵素活性を有するポリペプチドは、細胞内のトリブトファン濃度が上昇してもトリブトファンを合成することができ、当該ポリペプチドを発現している植物は高濃度のトリブトファンを含有する栄養価の高い植物として有用となる。

[0011] 上記配列番号 1に示されるアミノ酸配列の第 126位の変異は、セリンをフ二ルァラニンに置換する変異であり、上記配列番号 1に示されるアミノ酸配列の第 367位の変異は、チロシンをァラニンまたはイソロイシンに置換する変異であり、上記配列番号 1 に示されるアミノ酸配列の第 369位の変異は、ァラニンをロイシンに置換する変異であることが好ましい。また、上記配列番号 1に示されるアミノ酸配列の第 351位の変異は、ァスパラギンをァスパラギン酸に置換する変異であり、上記配列番号 1に示されるアミノ酸配列の第 522位の変異は、グリシンをチロシンに置換する変異であり、上記配列番号 1に示されるアミノ酸配列の第 530位の変異は、ロイシンをァラニンまたはァスパラギン酸に置換する変異であることが好ましい。上記に挙げたアミノ酸置換により、トリブトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有する変異型イネアントラ -ル酸合成酵素、またはトリブトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性と野生型イネアントラニル酸合成酵素と比較して少なくとも 0. 7倍以上の酵素活性とを有する変異型イネアントラニル酸合成酵素が実現できる。

[0012] 上記変異型イネアントラ-ル酸合成酵素としては、配列番号 2ないし 7および配列番号 29な、し 32の、ずれかに示されるアミノ酸配列力もなるポリペプチド、または配列番号 2な、し 7および配列番号 29な、し 32の、ずれかに示されるアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。これらのアミノ酸配列を有することにより、トリブトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有する変異型イネアントラ-ル酸合成酵素、またはトリブトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性と野生型イネアントラニル酸合成酵素と比較して少なくとも 0. 7倍以上の酵素活性とを有する変異型イネアントラニル酸合成酵素が実現できる。

[0013] また、本発明に係るポリペプチドは、アントラ-ル酸合成酵素のトリブトファン結合領域に変異を有するポリペプチドであって、配列番号 26に示されるアミノ酸配列の第 5 位に変異を有し、トリブトファン生合成経路においてトリブトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有することを特徴としている。上記配列番号 26に示されるアミノ酸配列の第 5位の変異は、チロシンをァラニンまたはイソロイシンに置換する変異であることが好ま、。トリブトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有するポリペプチドは、細胞内のトリブトファン濃度が上昇してもトリブトファンを合成することができ、当該ポリペプチドを発現している植物は高濃度のトリブトファンを含有する栄養価の高、植物として有用となる。

[0014] 本発明に係るポリヌクレオチドは、上記本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。また、本発明に係るポリヌクレオチドは配列番号 9ないし 14および配列番号 33な、し 36の、ずれかに示される塩基配列力もなるポリヌクレオチド、または配列番号 9な!、し 14および配列番号 33な!、し 36の!、ずれかに示される塩基配列力もなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズするポリヌクレオチドであることが好まし、。当該ポリヌクレォチドを細胞に導入することにより、細胞内で上記本発明に係るポリペプチドを発現できる形質転換体を作製することが可能となる。

[0015] 本発明に係る形質転換体選抜用マーカー遺伝子は、上記本発明に係るポリヌクレォチド力もなるものである。本発明に係るポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、それが発現している細胞にトリブトファン類縁ィ匕合物に対する耐性を付与するので、当該トリブトファン類縁ィ匕合物に対する耐性を発現している形質転換細胞を選抜するためのマーカー遺伝子として利用することができる。

[0016] 本発明に係る組換え発現ベクターは、上記本発明に係るポリヌクレオチドからなるものである。当該組換え発現ベクターは、本発明に係るポリヌクレオチドを細胞に導入するための組換え発現ベクターとして利用できるだけでなぐ本発明に係るポリヌクレォチドを選抜マーカ一として用、た場合には、他の遺伝子を細胞に導入するための組換え発現ベクターとしても利用できる。

[0017] 本発明に係る形質転換体は、上記本発明に係るポリヌクレオチドまたは上記本発明に係る組換え発現ベクターが導入されており、かつ、トリブトファン生合成経路においてトリブトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有するポリペプチドが発現している形質転換体である。形質転換体は、植物細胞または植物体であることが好ましい。トリブトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有するポリべプチドが発現している形質転換植物は、高濃度のトリブトファンを含有する栄養価の高い植物として有用となる。また、本発明には上記形質転 ^¾物から得られる種子も含まれる。

[0018] 本発明に係る形質転換細胞の選抜方法は、本発明に係るマーカー遺伝子または本発明に係る組換え発現ベクターを細胞に導入することにより、細胞の増殖を阻害するトリブトファン類縁ィ匕合物に対する耐性を細胞に付与し、さらに当該トリブトファン類縁ィ匕合物に対する耐性を発現している細胞を選抜することからなる選抜方法である。当該遺伝子を選択マーカーとして用いることで、イネ等の単子葉植物で利用できるマーカーの種類が限られるといった問題が解消される。また、これまで複数遺伝子を細胞に導入する際に使用できる選択マーカーの種類が制限されるといった問題に対しても、当該遺伝子を使用することで解決される。すなわち、通常選択マーカーとして使用されているハイグロマイシン等の抗生物質に対する耐性等の他に、トリプトフアン類縁化合物、例えば 5—メチルトリブトファンに対する抵抗性によって複数の目的 DNAが導入された細胞の選抜が可能となる。さらに、当該マーカー遺伝子はイネ由来の遺伝子であるため、イネの形質転換体にぉヽて本遺伝子がコードするタンパク質は低抗原性であることが期待される。

[0019] 本発明に係る形質転換キットは少なくとも本発明に係るポリヌクレオチド、ある！/、は本発明に係る組換え発現ベクターの!/ヽずれかを含むことを特徴として!、る。当該形質転換キットを用いれば、本発明に係るポリペプチドを発現する形質転換体を簡便かつ効率的に得ることができる。

[0020] 本発明に係るスクリーニング法は、本発明に係るポリペプチドおよび野生型ィネアントラ-ル酸合成酵素のいずれか一方のみと結合する物質をスクリーニングする方法であって、本発明に係るポリペプチドと結合する物質をスクリーニングする工程と、野生型イネアントラニル酸合成酵素と結合する物質をスクリーニングする工程と、上記両工程の結果を比較する工程とを含むことを特徴として、る。当該スクリーニング方法により、トリブトファン生合成経路におけるトリブトファンによるフィードバック阻害に関与する物質をスクリーニングすることができ、フィードバック阻害に対する抵抗性がより強力な変異型イネアントラ-ル酸合成酵素の作出に繋がる可能性がある。

[0021] 本発明に係るスクリーニングキットは上記本発明に係るスクリーニング方法を実現するためのキットであって、少なくとも本発明に係るポリペプチドの 1つと野生型イネアントラ-ル酸合成酵素とを含むことを特徴として、る。当該スタリ一-ングキットを用ヽれば、本発明に係るスクリーニング方法を簡便かつ効率的に実施することができる。 [0022] 以上のように、本発明に係るポリペプチドは、トリブトファン合成経路においてトリブトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有すると共に、野生型イネアントラニル酸合成酵素と同程度以上の酵素活性を有している。したがって、高濃度のトリプトフアン存在下にお、てもトリブトファンを合成することができると、う効果を奏する。

[0023] 本発明に係るポリヌクレオチドは上記本発明に係るポリペプチドをコードして、る。

したがって、当該ポリヌクレオチドを植物細胞に導入することにより、高濃度のトリブトファン存在下においてもトリブトファンを合成することができる形質転 ^¾物を作出することができると!/、う効果を奏する。

[0024] さらに、本発明に係る形質転換植物はトリブトファン含量が高く栄養価に優れた食品や飼料として利用できるという効果を奏する。さらに、トリブトファン含量の高い飼料用イネを作出することにより、家畜用飼料のコストを低下できるという効果を奏すると共に、水田を有効利用し、我国の飼料の自給率を高めることができるという効果を奏する。

[0025] 本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わ力るであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。

図面の簡単な説明

[0026] [図 1]アミド基供与基質として lOOmM NH C1を用いる測定系においてアントラ-ル酸

4

合成活性を測定した結果を示すグラフであり、変異型 OASA2タンパク質のうち、酵素活性が向上した変異体の結果を示すグラフである。

[図 2]アミド基供与基質として lOOmM NH CIを用いる測定系においてアントラ-ル酸

4

合成活性を測定した結果を示すグラフであり、変異型 0ASA2タンパク質のうち、トリプトフアンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有する変異体の結果を示すグラフである。

[図 3]トリブトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有する変異体および野生型のフィードバック阻害の程度を示すグラフである。

[図 4(A)]野生型 OASA2タンパク質の模式図である。

[図 4(B)]トリブトファン合成系を有する生物のトリブトファン結合領域のアミノ酸配列を比較した図である。

[図 5]ァグロバタテリゥム法によるイネカルスの形質転換に用いた変異型 OASA2遺伝子（Y367A、 Y367A/L530D, S126F/L530D)または野生型（wt) OASA2遺伝子を含有する外来遺伝子導入用組換えベクターの模式図である。

発明を実施するための最良の形態

[0027] 本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これに限定されるものではない。

[0028] (1)本発明に係るポリペプチド

本発明に係るポリペプチドは、アントラ-ル酸合成酵素のトリブトファン結合領域に変異を有するポリペプチドであって、配列番号 26に示されるアミノ酸配列の第 5位に変異を有し、トリブトファン生合成経路においてトリブトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有するポリペプチドであればょ、。上記配列番号 26に示されるァミノ酸配列の第 5位の変異は、チロシンをァラニンまたはイソロイシンに置換する変異であることが好ましい。

[0029] 図 4 (A)にイネアントラ-ル酸合成酵素遺伝子 OASA2 (以下、適宜「OASA2遺伝子」と称する。）がコードするイネアントラニル酸合成酵素（以下、適宜「OASA2タンノ^質」または「野生型 OASA2タンパク質」と称する。）の模式図を示した。図 4 (A) 中の数字はアミノ酸の位置を表す。 cTPは葉緑体移行シグナル、 I、 IIおよび IIIはトリプトフアン結合領域に位置するアミノ酸残基が存在するドメインを表す。また、図 4 (B)に種々のトリプトファン合成系を有する生物のトリプトファン結合領域 I、 IIおよび IIIのアミノ酸配列の比較を示した。図 4 (B)中の Oslはイネ OASA1 (Accession no. AB022602) 、 Os2はイネ OASA2 (Accession no. AB022603)、 Atlはシロイヌナズナ（Arabidopsis) ASA1 (Accession no. M92353)、 At2はシロイヌナズナ（Arabidopsis) ASA2 (Accession no. M92354)、 Ssは好熱性古細菌（Sulfolobus solfataricus) TrpE (Accession no. 1QD L— A)、 Stiまサノレモネフ菌 (Salmonella tryphimurium) TrpE (Accession no. 1I1Q— A)、 Sm はセフチア菌 (Serratia marcescens) TrpE (Accession no. 1I7Q— A)を表す。

[0030] 図 4 (A)および図 4 (B)から明らかなように、配列番号 26に示されるアミノ酸配列（N PSPYM)は、トリプトファン結合領域 IIにおいて、例示した全ての生物に保存されている。したがって、トリブトファン結合領域の中でも非常に重要な役割を果たしていると考えられている。このような保存されたアミノ酸配列を有する生物種としては、図 4 (B) に例示した生物種以外にも-チ-チソゥ（Catharanthus roseus) a subunit (Accessio n no. CAC29060)、ヘンルーダ（Ruta graveolens) AS α 1 (Accession no. L34343)、へンノレーダ (Ruta graveolens) AS α 2 (Accession no. L34344),タノコ (tobacco) ASA2 ( Accession no. T01990)、酵母 (Saccharomyces cerevisiae) TRP2 (Accession no. X683 27)、大月昜菌 (Escherichia coli) TrpE (Accession no. V00368)、枯草菌 (Bacillus subtili s) TrpE (Accession no. P03963)を挙げることができる力これらに限定されるものではない。

[0031] 上記配列番号 26に示されるアミノ酸配列は、例えば配列番号 1に示されるイネアントラ-ル酸合成酵素遺伝子 OASA2がコードする野生型 OASA2タンパク質のァミノ酸配列では第 363位〜第 367位に該当する。そして、当該配列番号 26に示される保存されたアミノ酸配列中のチロシンが他のアミノ酸、好ましくはァラニンまたはイソ口イシンに置換されることにより、トリブトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性が獲得される。

[0032] 本発明に係るポリペプチドは、配列番号 1に示されるアミノ酸配列の第 126位、第 3 67位または第 369位の少なくとも 1つに変異を有するポリペプチドであって、トリプトフアン生合成経路においてトリブトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有するポリペプチドであればよ!、。上記配列番号 1に示されるアミノ酸配列力なるポリペプチドは、イネアントラ-ル酸合成酵素遺伝子 OASA2がコードする野生型ィネアントラ-ル酸合成酵素である。すなわち、イネアントラ-ル酸合成酵素遺伝子 OASA 2 (OASA2遺伝子）がコードする野生型イネアントラ-ル酸合成酵素（野生型 OASA 2タンパク質)の第 126位、第 367位または第 369位の少なくとも 1つに変異を有し、かつ、トリブトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有するポリペプチドであればよい。変異としては特に限定されるものではなぐ例えばアミノ酸の置換、欠失、付加等を挙げることができる。なお、説明の便宜上、変異を有する OASA2タンパク質を、変異の位置、種類、数等を問わず、「変異型 OASA2タンパク質」と称する。

[0033] 植物体中のトリプトファンの生合成経路においては、コリスミン酸力もアントラ-ル酸が生成し、さらにアントラニル酸から 6段階の酵素反応によりインドールを経てトリブトファンが生成する (非特許文献 1参照)。アントラ-ル酸合成酵素は、上記経路中、コリスミン酸力アントラニル酸の生成を触媒する。また、アントラ-ル酸合成酵素は最終生成物であるトリプトファンによりフィードバック阻害を受け、細胞中のトリプトファン濃度が上昇するに伴い、酵素活性が低下する。したがって、トリブトファンがある一定量細胞に蓄積すると、それ以上トリブトファンが合成されなくなる。本発明に係るポリペプチドは、上述のようにトリブトファンによるフィードバック阻害に対して抵抗性を有するため、細胞中のトリブトファン濃度が上昇してもトリブトファンを合成することができ、トリブトファン含量の高、植物体を作出することが可能となる。

[0034] トリブトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性は、例えば in vitro酵素活性測定系において、野生型 OASA2タンパク質の酵素活性を測定した場合に、トリブトファン無添加の場合の酵素活性を 100%としたとき、トリブトファンを添加した場合の酵素活性の比率 (パーセンテージ）を基準として判断することができる。より具体的には、例えば図 3に示すように、野生型 OASA2タンパク質および変異型 OASA2タンパク質のそれぞれのトリブトファン無添カ卩時の酵素活性を 100%とし、トリブトファン添カロ時の酵素活性の比率 (パーセンテージ)を比較した場合に、野生型 OASA2タンパク質のトリブトファン添カ卩時の酵素活性の比率 (パーセンテージ)を超えていれば、トリブトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有すると、える。野生型 OASA 2タンパク質のトリブトファン添カ卩時の酵素活性の比率 (パーセンテージ)をどの程度超えて、るかにつ!、ては特に限定されるものではな、が、少なくとも 2倍以上であることが好ましぐ少なくとも 3倍以上であることがより好ましぐ少なくとも 4倍以上であることが特に好ましぐ少なくとも 5倍以上であることが最も好ましい。

[0035] より具体的には、例えば、後述の実施例 3 (2) <酵素活性測定 1 >に示す活性測定系を用いて酵素活性を測定した場合において、トリブトファン無添加時の酵素活性 (アントラニル酸合成量）を 100%としたとき、 100 Mのトリプトファンを添カロした場合の酵素活性 (アントラニル酸合成量）が 20%以上残存するものが好ましぐ 30%以上残存するものがより好ましぐ 40%以上残存するものが特に好ましぐ 50%以上残存するものが最も好ましい。 [0036] OAS A2タンパク質の第 126位のセリンと置換されるアミノ酸は、上記フィードバック阻害に対する抵抗性の条件を満たすものであれば、特に限定されるものではな、が

、フエ-ルァラニンが好ましい。具体的には、配列番号 29に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド (第 126位のセリンをフエ二ルァラニンに置換）、または配列番号 2

9に示されるアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列力もなるポリペプチドであって、トリプトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有するポリペプチドであることが好ましい。

[0037] OASA2タンパク質の第 367位のチロシンと置換されるアミノ酸は、上記フィードバック阻害に対する抵抗性の条件を満たすものであれば、特に限定されるものではないが、ァラニン、イソロイシン、フエ-ルァラニン、パリンが好ましぐァラニン、イソロイシンがより好ましい。具体的には、配列番号 2に示されるアミノ酸配列力なるポリべプチド (第 367位のチロシンをァラニンに置換)、および配列番号 3に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド (第 367位のチロシンをイソロイシンに置換）、または配列番号 2もしくは 3に示されるアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、トリブトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有するポリペプチドであることが好ましい。

[0038] OASA2タンパク質の第 369位のァラニンと置換されるアミノ酸は、上記フィードバック阻害に対する抵抗性の条件を満たすものであれば、特に限定されるものではない力ロイシンが好ましい。具体的には、配列番号 30に示されるアミノ酸配列力もなるポリペプチド (第 369位のァラニンをロイシンに置換)、または配列番号 30に示されるァミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたァミノ酸配列からなるポリペプチドであって、トリブトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有するポリペプチドであることが好ましい。

[0039] 本発明に係るポリペプチドとしては、上記 OASA2タンパク質の第 126位、第 367 位または第 369位の少なくとも 1つの変異に加えて、第 351位、第 522位または第 53 0位の少なくとも 1つに変異を有するポリペプチドであることが好ましい。上記第 351 位、第 522位、第 530位のいずれ力 1つ、または 2つ以上を組み合わせた変異を有する変異型 OASA2タンパク質は、野生型 OASA2タンパク質と比較して酵素活性が向上することが発明者らにより確認されている（図 1参照)。これらの酵素活性が上昇する変異と上記トリブトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を獲得する変異を組み合わせることにより、トリブトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有し、かつ、酵素活性が野生型 OASA2タンパク質と同程度以上である変異型 OASA2タンパク質を得ることができる。ここでいう酵素活性とは、例えば、後述の実施例 3 (2) <酵素活性測定 1 >に示す活性測定系を用いて測定したアントラ-ル酸合成量を挙げることができる。ただし、酵素活性を測定するための方法はこれに限定されるものではなぐアントラニル酸合成酵素活性を測定可能公知の酵素活性測定方法または、これらの改変方法であればよい。

[0040] また、酵素活性が同程度以上とは、例えば in vitro酵素活性測定系（トリブトファン無添加）において、変異型 OASA2タンパク質の酵素活性が野生型 OASA2タンパク質の酵素活性の少なくとも 0. 7倍以上であることが好ましぐ少なくとも 0. 8倍以上であることがより好ましぐ少なくとも 0. 9倍以上であることが特に好ましぐ少なくとも 1倍以上であることが最も好ましい。より具体的には、例えば、後述の実施例 3 (2)く酵素活性測定 1 >に示す活性測定系（トリブトファン無添加）を用いて酵素活性を測定した場合に、変異型 OASA2タンパク質のアントラ-ル酸合成量が野生型 OASA2タンノク質のアントラニル酸合成量の少なくとも 0. 7倍以上であることが好ましぐ少なくとも 0. 8倍以上であることがより好ましぐ少なくとも 0. 9倍以上であることが特に好ましく、少なくとも 1倍以上であることが最も好ま U、。

[0041] OASA2タンパク質の第 351位はァスパラギンであり、第 522位はグリシンであり、第 530位はロイシンである。これらのアミノ酸とそれぞれ置換されるアミノ酸としては、それぞれの変異、またはこれらを組み合わせた変異と、さらに第 126位、第 367位または第 369位の少なくとも 1つの変異を組み合わせたときに、トリブトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有すると共に野生型 OASA2タンパク質の 0. 7倍以上の酵素活性を有するものであればよぐ特に限定されるものではない。第 351位のァスパラギンと置換されるアミノ酸としてはァスパラギン酸が好ましぐ第 522位のグリシンと置換されるアミノ酸としてはチロシンが好ましい。また、第 530位のロイシンと置換されるアミノ酸としてはァラニン、ァスパラギン酸が好ましぐァスパラギン酸がより好ましい。

[0042] 具体的には、以下に示す変異の組み合わせを有するポリペプチドが好ましい。

i)第 367位のチロシンをァラニンに置換し、第 530位のロイシンをァスパラギン酸に置換したポリペプチド (配列番号 4)。

ii)第 351位のァスパラギンをァスパラギン酸に置換し、第 367位のチロシンをァラ- ンに置換し、第 530位のロイシンをァスパラギン酸に置換したポリペプチド (配列番号 5)。

iii)第 367位のチロシンをァラニンに置換し、第 522位のグリシンをチロシンに置換し、第 530位のロイシンをァスパラギン酸に置換したポリペプチド (配列番号 6)。

iv)第 367位のチロシンをイソロイシンに置換し、第 522位のグリシンをチロシンに置換し、第 530位のロイシンをァスパラギン酸に置換したポリペプチド (配列番号 7)。 V)第 369位のァラニンをロイシンに置換したポリペプチド（配列番号 30)。

vi)第 126位のセリンをフエ-ルァラニンに置換し、第 530位のロイシンをァスパラギン酸に置換したポリペプチド (配列番号 31)。

vii)第 369位のァラニンをロイシンに置換し、第 530位のロイシンをァスパラギン酸に置換したポリペプチド (配列番号 32)。

[0043] 上記のなかでも、 vi)に示す変異の組み合わせを有するポリペプチドが最も好ましい。これは、後述する実施例に示すように、上記ポリペプチドをコードする遺伝子をイネカルスに導入したところ、遊離トリブトファン含有量力 00倍程度にまで増加することが確認できたためである。

[0044] すなわち、本発明に係るポリペプチドは配列番号 4な!、し 7および配列番号 30な!、し 32の、ずれかに示されるアミノ酸配列力もなるポリペプチド、または配列番号 4なヽし 7および配列番号 30な!、し 32の!、ずれかに示されるアミノ酸配列にお!、て、 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列力もなるポリべプチドであって、トリブトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有すると共に野生型 OASA2タンパク質の 0. 7倍以上の酵素活性を有するポリペプチドであることが好ましい。

[0045] 上記「1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により欠失、置換、もしくは付加ができる程度の数 (例えば 20個以下、好ましくは 10個以下、より好ましくは 7個以下、さらに好ましくは 5個以下、特に好ましくは 3個以下）のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されることを意味する。このような変異ポリペプチドは、公知の変異ポリぺプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなぐ天然に存在する同様の変異ポリペプチドを単離精製したものであってもよい

[0046] なお、本発明に係るポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合してなるポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなぐポリペプチド以外の構造を含むものであってもよい。ここでいうポリペプチド以外の構造としては、糖鎖やイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。

[0047] また、本発明に係るポリペプチドは、付カ卩的なポリペプチドを含むものであってもよい。このようなポリペプチドが付加される場合としては、例えば、 Hisや Myc、 Flag等によってェピトープ標識されるような場合が挙げられる。

[0048] また、本発明に係るポリペプチドは、後述する本発明に係るポリヌクレオチド (本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を宿主細胞に導入して、それがコードするポリペプチドを細胞内発現させた状態であってもよいし、細胞、組織などから単離精製された状態であってもよい。また、上記宿主細胞での発現条件によっては、本発明に係るポリペプチドは、他のポリペプチドとつながった融合タンパク質であってもよい。さらに本発明に係るポリペプチドは、化学合成されたものであってもよい。

[0049] 本発明に係るポリペプチドの取得方法 (生産方法）は特に限定されるものではな、力本発明に係るポリペプチドは野生型 OASA2タンパク質に 1つ以上の変異を導入したものであるため、 OASA2遺伝子の塩基配列に人工的に変異を導入した変異遺伝子を作製し、当該変異遺伝子にコードされたポリペプチドを発現させる方法により取得することが最適である。塩基配列に変異を導入する公知の方法としては、後述の実施例にぉ、て発明者らが用いて、る Kunkel法や PCRを利用して塩基配列に変異を導入する方法等を挙げることができる。また市販のキット（例えば、 Mutan-K、 Mut an— Super Express Km、 LA— PCR in vitro mutagenesis Kit (いずれもタカラノィォ社製 )等）を用いることもできる。このようにして人工的に変異を導入した OASA2遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、適当な宿主細胞に導入して宿主内で翻訳されて得られる産物（ポリペプチド）を生成することにより、本発明に係るポリペプチドを取得することができる。また、後述の実施例において発明者らが用いているようにコムギ胚芽無細胞システム等の公知の無細胞タンパク質合成系を用いて上記変異を導入した O ASA2遺伝子の産物（ポリペプチド)を取得することもできる。本発明に係るポリぺプチドの取得方法の 1例は、後述の実施例において詳細に説明する。

[0050] (2)本発明に係るポリヌクレオチド

本発明に係るポリヌクレオチドは、上記本発明に係るポリペプチドをコードするものであればよ!、。本発明に係るポリペプチドにつ、ては上記（1)で詳細に説明したので、ここでの説明は省略する力例えば、具体的には、以下の〔1〕および〔2〕に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであればよい。

〔1〕配列番号 1に示されるアミノ酸配列の第 126位、第 367位または第 369位の少なくとも 1つに変異を有するポリペプチドであって、トリブトファン生合成経路においてトリブトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有するポリペプチド。

〔2〕上記〔1〕の変異に加えて、配列番号 1に示されるアミノ酸配列の第 351位、第 52 2位または第 530位の少なくとも 1つに変異を有するポリペプチドであって、トリプトフアン生合成経路においてトリブトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有すると共に、野生型イネアントラ-ル酸合成酵素と比較して少なくとも 0. 7倍以上の酵素活性を有するポリペプチド。

[0051] 例えば、配列番号 2に示されるアミノ酸配列、すなわち OASA2タンパク質のァミノ酸配列の第 367位チロシンがァラニンに置換されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号 8に示される塩基配列（OASA2遺伝子のオープンリーデイングフレーム領域の塩基配列）からなるポリヌクレオチドの 1099、 1100および 1101 位の塩基配列（ta チロシン）がァラニンに対応するコドン、すなわち gct、 gcc、 gcaまたは gcgのいずれかに変異したポリヌクレオチドであればよい。また、 1099〜1101位の塩基以外の塩基配列は配列番号 8に示される塩基配列と同一でなくてもよぐ例えばコードするアミノ酸が変異しな、塩基置換を有するポリヌクレオチドでもよ、。 [0052] 上記に例示した以外のアミノ酸変異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドについても同様であり、配列番号 8に示される塩基配列のうち変異するアミノ酸に対応する位置の 3つの塩基が、置換されるアミノ酸に対応するコドンの塩基に置換されたポリヌクレオチド、または当該塩基の変異とそれ以外の塩基配列におけるァミノ酸が変異しな、塩基置換とを有するポリヌクレオチドであればょ、。

[0053] 本発明に係るポリヌクレオチドとしては、以下の〔3〕および〔4〕に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。

〔3〕配列番号 2、 3、 29または 30に示されるアミノ酸配列力もなるポリペプチド、または配列番号 2、 3、 29または 30に示されるアミノ酸配列において、 1もしくは数個のァミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列力もなるポリペプチドであって、トリブトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有するポリペプチド。

〔4〕配列番号 4な、し 7および配列番号 30な、し 32の、ずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または配列番号 4な!、し 7および配列番号 30な!、し 32の!、ずれかに示されるアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、トリブトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有すると共に野生型 OASA2タンパク質の 0. 7倍以上の酵素活性を有するポリペプチド。

[0054] すなわち、配列番号 2〜7および配列番号 29〜32に示されるアミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドであればよぐ具体的な塩基配列は特に限定されるものではない。ただし、配列番号 8に示される塩基配列、すなわち OASA2遺伝子のオープンリーディングフレーム領域の塩基配列からなるポリヌクレォチドと相同性の高、ポリヌクレオチドであることが好まし、ことは、うまでもな、。相同性としては、例えば、少なくとも 90%の同一性、好ましくは少なくとも 95%の同一性、最も好ましくは少なくとも 97%の同一性を有して、ればよ、。

[0055] 本発明に係るポリヌクレオチドとしては、配列番号 9な、し 14および配列番号 33ないし 36のいずれかに示される塩基配列力もなるポリヌクレオチド、または配列番号 9 な！、し 14および配列番号 33な!、し 36の!、ずれかに示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダィズするポリヌクレオチドを挙げることができる。ただし、これらに限定されるものではな!/、。配列番号 9な!、し 14および配列番号 33な!、し 36に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、それぞれ配列番号 2な、し 7および配列番号 29な、し 32に示されるアミノ酸配列力なるポリペプチドをコードする塩基配列力なるポリヌクレオチドである。配列番号 9ないし 14および配列番号 33ないし 36に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、発明者らが、後述の実施例に記載の方法を用いて作製したポリヌクレオチドである。

[0056] 上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも 90%の同一性、好ましくは少なくとも 95 %の同一性、最も好ましくは少なくとも 97%の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダィゼーシヨンが起こることを意味し、例えば、 60°Cで 2 X SSC洗浄条件下で結合することを意味する。上記ハイブリダィゼーシヨンは、「Molecular Cloning (Third Edition)」 (J. bambrook & D. W. Russell, し old Spring Harbor Laboratory Press, 2001 )に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジエンシーは高くなる。

[0057] 本発明に係るポリヌクレオチドには DNAおよび RNAが含まれ、一本鎖でも二本鎖でもよ、。また、非翻訳領域 (UTR)の配列やベクター配列 (発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよ！/、。

[0058] 本発明に係るポリヌクレオチドの取得方法 (生産方法）は特に限定されるものではないが、例えば、 OASA2遺伝子の塩基配列に人工的に変異を導入する方法を挙げることができる。塩基配列に変異を導入する公知の方法としては、 Kunkel法や PCRを利用して塩基配列に変異を導入する方法等を挙げることができる。また市販のキット（ ί列ば、 Mutan— K、 Mutan— ¾uper Express Km、 LA— Pし R in vitro mutagenesis Kit (いずれもタカラバイオ社製)等）を用いることもできる。本発明に係るポリヌクレオチドの取得方法の 1例は、後述の実施例において詳細に説明する。

[0059] (3)形質転換用マーカー遺伝子および形質転換細胞の選抜方法

本発明に係るポリヌクレオチドは、形質転換用マーカー遺伝子として利用することができる。すなわち、本発明に係る形質転換体選抜用マーカー遺伝子は、上記（2)に記載した本発明に係るポリヌクレオチドからなるものであればよ!、。本発明に係るポリヌクレオチドを導入された細胞はトリブトファン耐性となるため、トリブトファン類縁ィ匕合物を培地に添加することにより、当該ポリヌクレオチドが導入された細胞のみを選抜することが可能となる。選抜用薬剤として用いることができる細胞の増殖を阻害するトリプトフアン類縁ィ匕合物としては、例えば、 5—メチルトリプトファン（5MT)、 4—メチルトリプトファン（4MT)、 6—メチルトリプトファン（6MT)、 7—メチルトリプトファン（7MT )、 6—メチルアントラ-ル酸（6MA)、 5—メチルアントラ-ル酸（5MA)、 3—メチルァントラ-ル酸（3MA)、 5—フルォロアントラ-ル酸（5FA)、 6—フルォロアントラ-ル酸 (6FA)等を挙げることができる。

[0060] 具体的に、本発明に係るポリヌクレオチドを形質転換用マーカー遺伝子として利用するには、例えば、当該ポリヌクレオチドを組み込んだ発現ベクターを構築し、当該発現ベクターを目的の細胞に導入する。当該発現ベクターが導入され、本発明に係るポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドが発現している細胞はトリブトファン耐性を獲得するため、上記例示した選抜用薬剤が添加された培地においても増殖ができ、一方、当該発現ベクターが導入されていない細胞や本発明に係るポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドが発現していない細胞は増殖が阻害される。したがって、当該発現ベクターが導入され、本発明に係るポリヌクレオチドにコードされるポリべプチドが発現している形質転換細胞のみを選抜することが可能となる。

[0061] 上述の例では本発明に係るポリヌクレオチドを形質転換細胞に発現させる遺伝子とマーカー遺伝子との両方の目的で用いているが、本発明に係るポリヌクレオチドをマ一力一遺伝子としてのみ用いることも可能である。また、例えば、植物のカルス細胞に特異的な転写プロモーターを使用することにより、本発明に係るポリヌクレオチドの選択マーカーとしての発現時期の制御も可能である。この場合は、さらに目的の細胞内で発現させたいタンパク質をコードする遺伝子を挿入した発現ベクターを構築し、当該発現ベクターを用いて形質転換すればよい。また、本発明に係るポリヌクレオチドを組み込んだ発現ベクターを構築せずに、本発明に係るポリヌクレオチドを単独で目的の細胞に導入することも可能である。

[0062] 本発明に係るポリヌクレオチドを選択マーカーとして用いることで、イネ等の単子葉植物で利用できるマーカーの種類が限られるといった問題が解消される。また、これまで複数遺伝子を細胞に導入する際に使用できる選択マーカーの種類が制限されるといった問題に対しても、当該遺伝子を使用することで解決される。すなわち、通常選択マーカーとして使用されているハイグロマイシン等の抗生物質に対する耐性等の他に、トリブトファン類縁ィ匕合物、例えば 5—メチルトリブトファンに対する抵抗性によって複数の目的 DNAが導入された細胞の選抜が可能となる。さらに、当該マーカ一遺伝子はイネ由来の遺伝子であるため、イネの形質転換体にぉ、て本遺伝子がコードするタンパク質は低抗原性であることが期待される。

[0063] なお、本発明には上記本発明に係るマーカー遺伝子または以下に説明する組換え発現ベクターを細胞に導入することにより、細胞の増殖を阻害するトリブトファン類縁ィ匕合物に対する耐性を細胞に付与し、さらに当該トリブトファン類縁ィ匕合物に対する耐性を発現している細胞を選抜する形質転換細胞の選抜方法も含まれる。

[0064] (4)組換え発現ベクターおよび形質転換キット

本発明に係る組換え発現ベクターは、上記（2)に記載した本発明に係るポリヌクレォチドを含むものであれば、特に限定されるものではない。例えば、 cDNAが挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。また、作製方法も公知の方法を用いて行えばよい。

[0065] ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなぐホスト細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、ホスト細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係るポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればょ、。

[0066] 本組換え発現ベクターは、本発明に係るポリペプチドを発現させるために用いることができることは、うまでもな、が、本発明に係るポリヌクレオチドをマーカー遺伝子として利用し、他の遺伝子を組み込んで当該他の遺伝子がコードするタンパク質を発現させるための組換え発現ベクターとしても利用できる。

[0067] 本発明に係るポリヌクレオチドがホスト細胞に導入されたカゝ否カゝ、さらにはホスト細胞中で確実に発現して、るか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよ!ヽ。例えば、ハイグロマイシンのような抗生物質に抵抗性を与える薬剤耐性遺伝子をマ一力一として用い、このマーカーと本発明に係るポリヌクレオチドとを含むプラスミド等を発現ベクターとしてホスト細胞に導入する。これによつてマーカー遺伝子の発現から本発明の遺伝子の導入を確認することができる。

[0068] 上記ホスト細胞は、トリブトファン合成系を有する細胞、生物であれば、特に限定されるものではなぐ従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Escherichia coli)等の細菌、酵母（出芽酵母 Saccharomyces cerevisi ae、***酵母 Schizosaccharomyces pombe)等を挙げることができる力特に限定されるものではない。

[0069] 上記発現ベクターをホスト細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなぐ電気穿孔法 (エレクト口ポレーシヨン法）、リン酸カルシウム法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。

[0070] 本発明に係る形質転換キットは、上記（2)に記載した本発明に係るポリヌクレオチドまたは当該本発明に係る組換え発現ベクターの少なくとも、ずれかを含むものであればよい。その他の具体的な構成については特に限定されるものではなぐ必要な試薬や器具等を適宜選択してキットの構成とすればょヽ。当該形質転換期キットを用いることにより、簡便かつ効率的に形質転換細胞を得ることができる。

[0071] (5)形質転換体

本発明に係る形質転換体は、上記（2)に記載した本発明に係るポリヌクレオチドまたは上記 (4)に記載の組換え発現ベクターが導入されており、かつ、トリブトファン生合成経路においてトリブトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有するポリペプチドが発現している形質転換体であれば、特に限定されるものではない。ここで「形質転換体」とは、細胞 ·組織 '器官のみならず、生物個体を含む意味である。

[0072] 形質転換体の作製方法 (生産方法）は特に限定されるものではないが、例えば、上述した組換え発現ベクターをホスト細胞に導入して形質転換する方法を挙げることができる。また、トリブトファン合成系を有する細胞、生物であれば、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなぐ上記 (4)においてホスト細胞として例示した各種微生物等を挙げることができる。

[0073] 本発明に係る形質転換体は、植物細胞または植物体であることが好ま、。このような形質転換植物は、トリブトファンの含有量が高ぐ栄養価の高い食品原料や飼料として高!ヽ利用価値を有する。

[0074] 植物体の形質転換に用いられる組換え発現ベクターは、当該植物細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に限定しない。特に、植物体へのベクターの導入法がァグロバクテリゥムを用いる方法である場合には、 pBi系等のバイナリーベクターを用いることが好ましい。バイナリーベクターとしては、具体的には、例えば、 pBIG、 ρΒΙΝ19、 ρΒΠ01、 ρΒΠ21、 ρΒΙ221等を挙げることができる。また

、植物体内で遺伝子を発現させることが可能なプロモーターを有するベクターであることが好ましい。プロモーターとしては公知のプロモーターを好適に用いることができ

、具体的には、例えば、カリフラワーモザイクウィルス 35Sプロモーター（CaMV35S) 、ュビキチンプロモーターゃァクチンプロモーターを挙げることができる。なお、植物細胞には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カノレスなどが含まれる。

[0075] 植物細胞への組み換え発現ベクターの導入には、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法 (エレクト口ポレーシヨン法）、ァグロバタテリゥムを介する方法、パーテイクルガン法など、公知の種々の方法を用いることができる。また、形質転換細胞から植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて公知の方法で行うことが可能である。

[0076] ゲノム内に本発明に係るポリヌクレオチドが導入された形質転 ^¾物体がいったん得られれば、当該植物体力得られる種子にも当該ポリヌクレオチドが導入されて、る。例えば、本発明に係るポリヌクレオチドで形質転換されたイネ等の穀物においては、トリブトファン含量の高い穀物を得ることができる。本発明には、形質転 ^¾物から得られる種子も含まれる。

[0077] (6)スクリーニング方法およびスクリーニングキット

本発明に係るスクリーニング方法は、（1)に記載した本発明に係るポリペプチド (変異型 OAS A2タンパク質）および野生型イネアントラ-ル酸合成酵素（OASA2タンパク質)のいずれか一方のみと結合する物質をスクリーニングする方法であって、変異型 OASA2タンパク質と結合する物質をスクリーニングする工程と、野生型 OASA 2タンパク質結合する物質をスクリーニングする工程と、上記両工程の結果を比較する工程とを含むものであればよい。

[0078] 上記本発明に係るポリペプチド、すなわち変異型 OASA2タンパク質はトリプトファン生合成経路においてトリブトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有するものであるため、上記変異型 OASA2タンパク質および野生型 OASA2タンパク質の!、ずれか一方のみと結合する物質は、トリブトファン生合成経路におけるフィードバック阻害に関与するシグナル物質である可能性が高いと考えられる。このような物質力当該スクリーニング方法により見出されれば、フィードバック阻害のメカニズムの解明が進み、フィードバック阻害に対する抵抗性が一層強力な変異型 OASA2タンノク質の開発に貢献できることが期待される。

[0079] また、本発明に係るスクリーニングキットは、上記スクリーニング方法を実施するためのキットであって、少なくとも本発明に係るポリペプチドの 1つと野生型イネアントラ- ル酸合成酵素とを含むものであればよい。その他の具体的な構成については特に限定されるものではなぐ必要な試薬や器具等を適宜選択してキットの構成とすればよい。当該形質転換期キットを用いることにより、簡便かつ効率的に上記本発明に係るスクリーニング方法を実施することができる。

[0080] 本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなぐ請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。〔実施例〕

〔実施例 1：イネアントラ-ル酸合成酵素遺伝子 OAS A2への変異導入〕 <標的遺伝子のクロー-ングベクターへの挿入 >

イネアントラニル酸合成酵素遺伝子 OASA2 (ACCESSION NO. AB022603)をクロ一-ングベクター pBluescript SK+ (Stratagene社製）のマノレチクロ一-ングサイトの Ec oRIサイトに挿入し、 pBS-OASA2を構築した。なお、挿入した遺伝子は、マルチクローユングサイトの制限酵素サイト Kpnl力も Sadの向きに挿入されて!、る。

[0081] <変異導入用プライマー >

Kunkel法によって目的タンパク質をコードする遺伝子に変異を導入する場合、変異を導入したい位置にセンス (あるいはアンチセンス）の変異導入用オリゴヌクレオチドを設定して用いる。目的タンパク質をコードする遺伝子に PCRを用いて変異を導入する場合、変異を導入したい位置に 2つのプライマー、すなわちセンスおよびアンチセンスのオリゴヌクレオチドを設定して用いる。従って、当該変異導入用プライマーの一方は、上記 Kunkel法に用いた変異導入用オリゴヌクレオチと同一のものを使用することができる。この際、遺伝子がコードするアミノ酸が変化しない適当な位置に制限酵素サイトを導入することで変異導入の有無の確認作業ができる。下記 i)〜vi)の変異は Kunkel法を用いて導入し、下記 vii)および viii)の変異は PCRを用いて導入した。

<変異導入用プライマー >

i) 351番目のァスパラギン残基をァスパラギン酸残基に置換 (N351D)

351番目のァスパラギン残基をァスパラギン酸残基にアミノ酸置換し、かつ、コードするアミノ酸が変化しな、位置に制限酵素サイト (BsiWI)を導入するように変異導入用プライマーをデザインした。変異導入用プライマーの塩基配列は下記の通りである。なお、下線は制限酵素サイトを示し、小文字は変異導入コドンを示す。

N351D-F： 5'— GTTTGAGAGGCGAACGTACGCCgatCCATTTGAAGTCT— 3' (配列番号 15)

プライマー N351D- Fの 23番目から 25番目の gat (ァスパラギン酸、 D)および 15番目から 20番目の CGTACG (BsiWIサイト）は、それぞれ野生型 OASA2の AAT (ァスパラギン、 N)および CATACGの塩基配列よりデザインした。 AATを GATにすることにより 351 番目のァスパラギン残基がァスパラギン酸残基へ置換される。また、 CATACGを CGT ACGとすることによりアミノ酸置換を伴わずに (ACA、 ACGは共にスレオニン)制限酵素サイト (BsiWI: CGTACG)が導入され、変異導入後の選抜が容易となる。

ii) 367番目のチロシン残基をァラニン残基に置換 (Y367A)

上記 i)と同様に、 367番目のチロシン残基をァラニン残基にアミノ酸置換し、かつ、コードするアミノ酸が変化しない位置に制限酵素サイト (SnaBI:TACGTA)を導入するように変異導入プライマーをデザインした。変異導入用プライマーの塩基配列は下記の通りである。なお、下線は制限酵素サイトを示し、小文字は変異導入コドンを示す。

Y367A-F： 5'— GTGAACCCAAGTCCAgccATGGCATACGTACAGGCAAGAGGC— 3' (配列番号 16) iii) 367番目のチロシン残基をイソロイシン残基に置換 (Y367I) 上記 i)と同様に、 367番目のチロシン残基をイソロイシン残基にアミノ酸置換し、かつ、コードするアミノ酸が変化しな、位置に制限酵素サイト（SnaBI:TACGTA)を導入するように変異導入プライマーをデザインした。変異導入用プライマーの塩基配列は下記の通りである。なお、下線は制限酵素サイトを示し、小文字は変異導入コドンを示す。配列番号 17)

iv) 530番目のロイシン残基をァラニン残基に置換 (L530A)

上記 i)と同様に、 530番目のロイシン残基をァラニン残基にアミノ酸置換し、かつ、コードするアミノ酸が変化しな、位置に制限酵素サイト (NheI:GCTAGC)を導入するように変異導入プライマーをデザインした。変異導入用プライマーの塩基配列は下記の通りである。なお、下線は制限酵素サイトを示し、小文字は変異導入コドンを示す。 L530A- F:5，- ACGGAGACATGgctATCGCGCTAGCACTCCGCACCATT- 3' (配列番号 18)

V) 530番目のロイシン残基をァスパラギン酸残基に置換 (L530D)

上記 i)と同様に、 530番目のロイシン残基をァスパラギン酸残基にアミノ酸置換し、かつ、コードするアミノ酸が変化しない位置に制限酵素サイト (NheI:GCTAGC)を導入するように変異導入プライマーをデザインした。変異導入用プライマーの塩基配列は下記の通りである。なお、下線は制限酵素サイトを示し、小文字は変異導入コドンを示す。

L530D- F:5し ACGGAGACATGgacATCGCGCTAGCACTCCGCACCATT- 3' (配列番号 19)

vi) 522番目のグリシン残基をチロシン残基に、 530番目のロイシン残基をァスパラギン酸残基に置換 (G522Y+L530D)

上記 i)と同様に、 522番目のグリシン残基をチロシン残基に、 530番目のロイシン残基をァスパラギン酸残基にアミノ酸置換し、かつ、コードするアミノ酸が変化しない位置に制限酵素サイト (BciVI:GTATCC/GGATAC)を導入するように変異導入プライマ一をデザインした。変異導入用プライマーの塩基配列は下記の通りである。なお、下線は制限酵素サイトを示し、小文字は変異導入コドンを示す。

G522Y+L530D- F:5，- AGTGGCGGCCTTGGAtacATATCATTTGACGGAGACATG gatATCGCTCTTGCACT-3 ' (配列番号 20)

vii) 126番目のセリン残基をフエ-ルァラニン残基に置換 (S126F)

126番目のセリン残基をフエ-ルァラニン残基にアミノ酸置換するように変異導入用プライマーをデザインした。変異導入法に PCRを用いた手法で変異を導入したのでセンスおよびアンチセンスのオリゴヌクレオチドを作成した。変異導入用プライマーの塩基配列は下記の通りである。なお、小文字は変異導入コドンを示す。

S126F- F: 5，- GCTTCCTCTTCGAGttcGTCGAGCAGGGGCC- 3' (配列番号 37) S126F- R: 5，- GGCCCCTGCTCGACgaaCTCGAAGAGGAAGC- 3' (配列番号 38) プライマー S126F-Fの 15番目から 17番目の ttc (フエ-ルァラニン、 F)は、野生型 OAS A2の TCC (セリン、 S)よりデザインした。 TCCを TTCにすることにより 126番目のセリン残基がフエ-ルァラニン残基へ置換される。プライマー S126F-Rはプライマー S126F- Fの相補鎖である。

viii) 369番目のァラニン残基をロイシン残基に置換 (A369L)

上記 0と同様に、 369番目のァラニン残基をロイシン残基にアミノ酸置換するように変異導入用プライマーをデザインした。変異導入法に PCRを用いた手法で変異を導入したのでセンスおよびアンチセンスのオリゴヌクレオチドを作成した。変異導入用ブライマ一の塩基配列は下記の通りである。なお、小文字は変異導入コドンを示す。 A369L-F： 5 '-CAAGTCCATACATGctaTATGTACAGGCAA-3 ' (配列番号 39) A369L- R: 5'- TTGCCTGTACATAtagCATGTATGGACTTG- 3' (配列番号 40) プライマー A369L- Rはプライマー A369L- Fの相補鎖である。

[0083] < Kunkel法による変異導入 DNAの調製 >

Kunkel法は、下記の参考文献 1 3に記載の方法にしたがって行った。

[0084] 参考文献 1： Kunkel, T. A. (198b; Rapid and efticient site-specific mutagenesis with out phenotypic selection. Proceedings of the National Academy of Science of the US A, 82: 488-492. 参考文献 2 : Kunkel, T. A., Bebenek, K. and McClary, J. (1991) Efficient site-dire cted mutagenesis using uracU— containing DNA. Methods in Enzymology, 204: 125—1 39.

参考文献 3 :「Molecular Cloning (Third Edition)」（J. Sambrook & D. W. Russell, C old Spring Harbor Laboratory Press, (2001) Chapter 13.

例えば、 351番目のァスパラギン残基をァスパラギン酸残基に置換する場合、前述の PBS-OASA2ベクターを铸型とし、上記 i)に記載した変異導入用プライマーを用いて Kunkel法を行うことで変異を導入した。上記 ii)、 iv) , v) , vi)に記載の変異導入用プライマーを用いる場合も上記と同一の铸型を用いて Kunkel法を行った。以上の操作により N351D、 Y367A、 L530A、 L530D、 G522Y+L530D変異 DNAを調製した。

[0085] N351D + L530Aの二重変異 DNAは、変異導入工程を 2回繰り返すことにより調製した。すなわち、最初に前述の pBS-OASA2ベクターを铸型とし、上記 i)に記載した変異導入用プライマーを用いて N351D変異 DNAを調製した。次に、 N351Dの変異が導入されたプラスミド DNA(pBS-OASA2 (N351D)ベクター）を铸型として、上記 iv)に記載した変異導入用プライマーを用いて 2つの変異が導入された変異 DNA(N351D + L 530A)を得た。同様に、 N351Dの変異が導入されたプラスミド DNA(pBS- OASA2 (N35 ID)ベクター）を铸型として、上記 V)に記載した変異導入用プライマーを用いて 2つの変異が導入された変異 DNA(N351D + L530D)を得、 Y367Aの変異が導入されたプラスミド DNA(pBS-OASA2 (Y367A)ベクター）を铸型として、上記 v)に記載した変異導入用プライマーを用いて 2つの変異が導入された変異 DNA(Y367A+L530D)を得た

[0086] 三重変異 DNAは、上記二重変異 DNAを含むプラスミド DNAを铸型として Kunkel法を行うことにより調製した。すなわち、 N351D+Y367A+L530Aは、予め N351D + L53 0Aの変異が導入されたプラスミド DNA (pBS- OASA2 (N351D + L530A)ベクター）を铸型として、上記 ii)に記載した変異導入用プライマーを用いて 3つの変異が導入された変異 DNA(N351D+Y367A+L530A)を得た。同様に、 G522Y+L530Dの変異が導入されたプラスミド DNA(pBS- OASA2 (G522Y+L530D)ベクター）を铸型として、上記 ii)に記載した変異導入用プライマーを用いて 3つの変異が導入された変異 DNA(Y367A + G522Y+L530A)を得た。同様に、 G522Y+L530Dの変異が導入されたプラスミド D NA(pBS-OASA2 (G522Y+L530D)ベクター）を铸型として、上記 iii)に記載した変異導入用プライマーを用いて 3つの変異が導入された変異 DNA(Y367I + G522Y+L53 OA)を得た。

[0087] < RCR法による変異導入用 DNAの調製 >

PCR法による変異導入法は下記の参考文献に記載の方法に従って行った。

[0088] Higuchi R, Krummel B, baiki RK (1988) A general method of in vitro preparation a nd specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucleic Acids Res 16: 7351-7367

OASA2遺伝子が変異導入用のプライマー領域でオーバーラップするように 5，側領域と 3'側領域に分けて PCRを行った。例えば、上記 vii)に記載した 126番目のセリンをフエ二ルァラニンに置換するため変異導入用プライマーを用いる場合には、 5'側領域は PBS-OASA2ベクターを铸型とし、クローユング用センスプライマー（5'-AAAA CTAGTATGGAGTCCATCGCCGCCGCCACG- 3'：配列番号 41、下線は制限酵素 Spelサイトを示す）およびプライマー S126F-Rの組み合わせで PCRを行、、 3 '領域は pBS- OASA2ベクターを铸型とし、プライマー S126F- Fおよびクローユング用アンチセンスプライマー（5し AAAGTCGACTGAGAGAGACTCTATTCCTTGTC- 3'：配列番号 42、下線は制限酵素 Sailサイトを示す）との組み合わせで PCRを行った。上記 _Vm) に記載の変異導入用プライマーを用いる場合でも上記と同一の铸型を用い、同様のプライマーの組み合わせにより PCRを行った。

[0089] S126F+L530Dの二重変異 DNAを調製する場合は、铸型として pBS-OASA2ベクターに前述の Kunkel法で OASA2の 530番目のロイシン残基をァスパラギン酸残基にァミノ酸置換する変異を既に導入したプラスミド DNAを用いた。従って、上記 vii)に記載の変異導入用プライマー（S126F-Fおよび S126F-R)を用いて PCRを行うことにより、 OA SA2の 126番目のセリン残基をフエ-ルァラニン残基に置換し、 530番目のロイシン残基をァスパラギン酸残基にアミノ酸置換する 2つの変異が導入された変異遺伝子が得られることになる。なお、プライマーの組み合わせは上記と同様である。 A369L+L5 30Dの二重変異 DNAの調製も上記と同様の铸型と上記 viii)に記載の変異導入用プライマー（A369L- Fおよび A369L- R)を用いて PCRを行うことにより、 OASA2の 369番目のァラニン残基をロイシン残基に置換し、 530番目のロイシン残基をァスパラギン酸残基にアミノ酸置換する 2つの変異が導入された変異遺伝子が得られる。

[0090] PCR反応の組成は、 1 X Pyrobest buffer II (TaKaRa社）、 0.2mM dNTP、 0.5 Mセンスおよびアンチセンスプライマー、 0.025 units/ μ 1 Pyrobest DNA polymerase (TaK aRa社）、 lOng铸型 DNAとし、 PCR反応装置（宝酒造社製、 TaKaRa PCR Thermal Cy cler MP TP3000型）を用いて、 95°Cで 2分間保持した後、 98°Cで 20秒間、 60°Cで 35 秒間、 72°Cで 3分間の反応を 25サイクル繰り返し、 72°Cで 10分間保持した後 4°Cに冷却した。

[0091] 増幅した PCR産物 (5 '領域断片および 3 '領域断片）を 20倍希釈し、 PCR反応液 [1

X Pyrobest buffer II (TaKaRa社）、 0.2mM dNTP、 0.025 units/ μ 1 Pyrobest DNA poly merase (TaKaRa社)]に 1 /z lずつ添カ卩し、上記 PCR反応装置を用いて、 95°Cで 2分間保持した後、 98°Cで 20秒間、 60°Cで 35秒間、 72°Cで 3分間の反応を 5サイクル繰り返し、伸長反応を行った。この反応によりクローユング用センスプライマーからクロー- ング用アンチセンスプライマーまで連結された DNA断片が合成された。

[0092] 上記反応終了後すぐに、プライマーの濃度がそれぞれ 0.2 μ Μになるようにクロー二ング用センスプライマーおよびクローユング用アンチセンスプライマーを添カ卩し、上記 PCR装置を用いて、 95°Cで 2分間保持した後、 98°Cで 20秒間、 60°Cで 35秒間、 72°C で 3分間の反応を 20サイクル繰り返し、 72°Cで 10分間保持した後 4°Cに冷却した。以上の反応により、上記クローニング用センスプライマーカクローニング用アンチセンスプライマーまで連結された DNA断片が増幅され、これをクロー-ングベクター pBlue script KS+ (Stratagene社）のマルチクロー-ングサイトの Spelおよび Sailに挿入し、 pB S- OASA2(S126F)、 pBS- OASA2(A369L) 、 pBS- OASA2(S126F/L530D)、 pBS- OASA 2(A369L/L530D)を構築した。

[0093] 〔実施例 2：コムギ胚芽無細胞システムによるタンパク質合成〕

(1) Split- PCR法による転写铸型 DNAの合成

< Split- PCR用铸型の調製 >

OASA2遺伝子はイネの核ゲノム上にコードされて、る遺伝子である力合成されたタンパク質は葉緑体に移行して葉緑体内で機能して、ることが判って、る。合成されたタンパク質の N末端領域には葉緑体へ移行するためのシグナル配列が存在し、その配列が除去されることで成熟型酵素となり、酵素活性を発揮する。したがって、 OA SA2タンパク質を成熟型酵素としてコムギ胚芽無細胞合成系で合成するため、 N末端領域に存在する 49残基力なるシグナル配列を除去した形で合成されるようにプライマーをデザインした。すなわち、コムギ胚芽無細胞合成システムで Split- PCRを可能とするリンカ一配列の下流に ATG開始コドンを配し、 OASA2遺伝子の 148から 164番目の塩基配列力なる全長 36merのプライマーをデザインした。また、 OASA2遺伝子が挿入されているベクター（pBluescript SK+)上に上記センス Split- PCR用プライマーの相補鎖側の位置に Split-PCR用アンチセンスプライマーを 2種類設定した。挿入 DNA の位置から遠い順にアンチセンス Split-PCR用プライマー 1およびアンチセンス Split- PCR用プライマー 2とした。 Split-PCR用のプライマーの塩基配列は下記の通りである。なお、 Split-PCRについては後述する。

センス Split— PCR用プライマー: 5'— CCTCTTCCAGGGCCCAATGTGCTCCGCGGG GAAGCC-3' (配列番号 21、下線部分がリンカ一配列）

アンチセンス Split- PCR用プライマー 1:5'- GGAGAAAGGCGGACAGGTAT- 3' (配列番号 22)

アンチセンス Split- PCR用プライマー 2:5'- GGGGAAACGCCTGGTATCTT- 3' (配列番号 23)

上記 Kunkel法により変異が導入された OASA2遺伝子を含む pBluescript SK+ベクターを铸型として、上記センス Split-PCR用プライマーおよびアンチセンス Split-PCR用プライマー 1を用いて PCR等の増幅反応を行い、増幅された DNA断片を次に行う Split -PCRの铸型とすることができる。

PCR反応液の組成は、 1 X Pyrobest buffer II (TaKaRa社)、 0.2mM dNTP、 0.5 μ M センス Split- PCR用プライマーおよびアンチセンス Split- PCR用プライマー 1、 0.025 un its/ μ 1 Pyrobest DNA polymerase (TaKaRa社)、 lOng铸型 DNA (各変異を導入した p BS- OASA2ベクター）とし、 PCR反応装置（宝酒造社製、 TaKaRa PCR Thermal Cycle r MP TP3000型）を用いて、 95°Cで 2分間保持した後、 98°Cで 20秒間、 60°Cで 35秒間、 72°Cで 3分間の反応を 25サイクル繰り返し、 72°Cで 10分保持した後 4°Cに冷却した。以上の反応により、上記センス Split-PCR用プライマーカアンチセンス Split-PCR用プライマー 1まで連結された DNA断片が増幅され、これを次に行う Split-PCRの铸型とした。

[0095] <転写铸型 DNAの合成 >

上記 Split- PCR用铸型 DNAを転写铸型 DNAとするためには、断片の 5'末端上流に SP6 RNAポリメラーゼのプロモーターとタバコモザイクウィルス (TMV)由来の翻訳増強配列 (オメガ配列)を付カ卩する必要がある。そのため、 Sawasakiらの方法（Sawasaki et a 1. (2002) Proc Natl Acad Sci U S A 99, 14652-14657)に従い、 Split— PCRを行った。すなわち、上記 Split-PCR用铸型 DNAを 50倍希釈し、 PCR反応液 [1 X EX Taq buffer (TaKaRa社)、 0.2mM dNTP、 0.025 units/ μ 1 TaKaRa EX Taq (TaKaRa社)、 0.2 μ M SP6 promoterプライマー、 InM TMV- Omegaプライマー、 0.2 μ Mアンチセンス Split- PCR用プライマー 2]に 1 1添カ卩し、上記 PCR反応装置を用いて、 95°Cで 2分間保持した後、 98°Cで 20秒間、 60°Cで 35秒間、 72°Cで 3分間の反応を 35サイクル繰り返し、 72 °Cで 10分保持した後 4°Cに冷却した。 SP6 promoterプライマーおよび TMV- Omegaプライマーの塩基配列は下記の通りである。なお、下線は SP6プロモーター配列を示し、小文字は両プライマーの重複部分を示す。

SP6 promoterプライマー： 5'- GCGTAGCATTTAggtgacact- 3' (配列番号 24)

TMV— Omegaプライマー： 5し ggtgacactATAGAAGTATTTTTACAACAATTACCAAC

CCAGGGCCCAATG-3' (配列番号 25)

ここで、上記 SP6 promoterプライマーと TMV- Omegaプライマーのように、プライマーを上流側プライマーと下流側プライマーとに分割し、上流側プライマーの 3 '末端と下流側プライマーの 5 '末端との配列が一部重複するように設計されたプライマーを Spli t primerと称する。また、このようなプライマーを用いて行う PCR反応を Split-PCRと称する。

[0096] (2)コムギ胚芽無細胞システム用の mRNAの合成

上記（1)で得られた PCR産物を直接铸型として用いて mRNAを合成 (転写)した。すなわち、上記（1)で得られた PCR産物を、転写反応液 [80mM HEPES-KOH (pH7.8)、 16mM Mg(OAc)2、 lOmM spermidineゝ lOmM DTTゝ 3mM NTPゝ 1 unit/ μ 1 RNasin RN ase inhibitor (Promega社)、 1 unit/ μ 1 SP6 RNA polymerase (Promega社)]に 1/10量添カ卩した。 37°Cで 2時間反応後、エタノール沈殿、 70%エタノール洗浄を行い、適当量の滅菌水に溶解した。 260應の吸光度を測定して RNA量を算出した。

[0097] (3)コムギ胚芽無細胞システムによるタンパク質合成

Sawasakiらの方法（Sawasaki et al. (2002) Proc Natl Acad Sci U S A 99, 14652—146 57)に従って上記（3)で合成した mRNAを铸型としてタンパク質を合成した。すなわち、 50 1のコムギ胚芽無細胞タンパク質合成液を入れた透析カップに上記 mRNA (約 3 0-35 μ g)を添加し、 1ゥエルあたり 1mlの基質液を入れた 24穴プレートに上記透析力ップを浸漬し、 26°Cで 24時間インキュベートした。

[0098] 〔実施例 3：変異型 OASA2タンパク質の活性測定〕

( 1)ウェスタンブロット法による OASA2タンパク質の定量

OASA2タンパク質のアミノ酸配列（配列番号 1)の第 161位〜第 175位の配列（MDH EKGKVTEQWDD)のペプチド断片に基づ、て作製したゥサギ抗 OASA2抗体と OAS A2タンパク質精製標品を用いてコムギ胚芽無細胞システムにより合成された OASA2 タンパク質を定量した。ウェスタンブロット解析は Towbinらの方法（Towbin, H., Staehe lin, T. and Gordon, J. 1979. Electrophoretic transfer of proteins from poiyacrylamid e gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci USA 76: 4350-4354.)に従い行った。上記方法で見積もった OASA2タンパク質量で後述の酵素活性を補正した。

[0099] (2) OASA2タンパク質の活性測定

イネアントラ-ル酸合成酵素の aサブユニットである OASA2タンパク質は、 13サブュニットが供給するグルタミンのアミド基由来のアンモニアを利用してコリスミン酸カもァントラ-ル酸を生成する。生体内で OASA2タンパク質は、 βサブユニットが供給するアンモニアを利用してアントラ-ル酸合成活性 (以下、適宜「AS活性」と略記する。）を発揮するが、外部よりアンモニア、例えば NH C1を添加することでも酵素活性を示す。

4

[0100] OASA2タンパク質の活性は、周知の通りトリプトファンによってフィードバック抑制がかかるので、上記タンパク質合成反応液中からトリブトファンの除去は必須であり、また発現させたタンパク質の環境を AS活性測定用の緩衝液成分に変える必要がある。したがって、タンパク質合成反応液の成分を Microspin G- 25 columns (Amersham Bio sciences社製）を用いて buffer A(50mM Tris— HCl, pH7.6; 0.05mM EDTA; 2mM MgC 1； 0.05mM DTT; 5%グリセロール）に置換した。

2

[0101] <酵素活性測定 1 >

90 1の反応液（20mM Tris- HCl, pH8.3; lOOmM NH CI; 0.5mMコリスミン酸； 10m

4

M MgCl )に buffer置換した粗抽出液を 2.5 1添カ卩して、 32°Cで 1時間反応させた。

2

反応は 10 μ 1の IN HClを添カ卩することで停止させ、 300 μ 1の酢酸ェチルを添カ卩して合成したアントラ-ル酸を抽出した。アントラ-ル酸の合成量は、 Wallac 1420 ARVOsx- FL (パーキンエルマ一ライフサイエンスジャパン社製）を用いて励起波長 355 nm/蛍光（emmision) 460 nmで測定した。トリプトファンに対するフィードバック阻害活性を解析する場合、反応系に終濃度 10 μ Μまたは 100 μ Μになるようにトリブトファンを添カロした。

[0102] 結果を図 1および図 2に示した。図 1から明らかなように、 6種類の変異型 OASA2タンパク質（N351D、 L530A、 L530D、 N351D/L530A、 N351D/L530Dおよび G522Y/L5 30D)は、野生型 (wt)と比較して酵素活性が向上していた。また、図 2から明らかなように、 7種類の変異型 OASA2タンパク質 (A369L、 S126F/L530D、 Y367A/L530D、 A36 9L/L530D、 N351D/Y367A/L530D、 Y367A/G522Y/L530Dおよび Y367I/G522Y/L5 30D)は、トリブトファンを添加していない場合の酵素活性が野生型と同程度以上であり、かつ、トリブトファンフィードバック阻害に対する抵抗性を獲得していた。

[0103] <酵素活性測定 2 >

上記トリブトファンフィードバック阻害に対する抵抗性を獲得していた 5種類の変異型 OASA2タンパク質について、より詳細に酵素学的性質を検討するため、イネアントラニル酸合成酵素 βサブユニットを用いた反応系において酵素活性およびトリプトフアンフィードバック阻害を解析した。

[0104] イネアントラ-ル酸合成酵素 βサブユニットを過剰量添加した 90 μ 1の反応液 (20m M Tris— HCl, pH8.3; 5mMグルタミン； 0.2〜0.8mMコリスミン酸； lOmM MgCl；)に buf fer置換した粗抽出液を 2.5 μ 1添加して、 32°Cで 1時間反応させた。なお、イネアントラニル酸合成酵素 j8サブユニットの調製およびウェスタンブロット法による合成量の定量は、 Kannoらの方法（Kanno et al.(2004) Plant Molecular Biology 54,11-22)に従つて行った。反応は 10 μ 1の IN HC1を添加することで停止させ、 300 μ 1の酢酸ェチルを添加して合成したアントラエル酸を抽出した。アントラ-ル酸の合成量は、 Wallac 1 420 ARVOsx-FL (パーキンエルマ一ライフサイエンスジャパン社製）を用いて励起波長 355 nm/蛍光（emmision) 460 nmで測定した。トリプトファンに対するフィードバック阻害活性を解析する場合、反応系に終濃度 10 M、 Mまたは Mになるようにトリブトファンを添加した。

[0105] 結果を表 1および図 3に示した。表 1から明らかなように、 9種類の変異型 OASA2タンパク質（S126F、 Y367A、 A369L、 S126F/L530D、 Y367A/L530D, A369L/L530D、 N 351D/Y367A/L530D、 Y367A/G522Y/L530Dおよび Y367I/G522Y/L530D)は、 S126 F、 Y367Aを除き、野生型 (wt)と比較して同程度以上の酵素活性を有していた。より詳細には、野生型 (wt)と比較して A369Lが約 1倍、 S126F/L530Dが約 2.5倍、 Y367A/L5 300が約2.2倍、 A369L/L530Dが約 1.8倍、 Y367A/G522Y/L530Dが約 1.3倍、 N351D /Y367A/L530Dが約 1.2倍、 Y367I/G522Y/L530Dが約 0.8倍の酵素活性であった。

[0106] [表 1]

また、図 3はトリプトファン無添カ卩時における野生型および各変異型 OASA2タンパク質酵素活性を 100%とし、各濃度のトリブトファンを添加した場合の酵素活性をトリブトファン無添加時の酵素活性と比較したものである。図 3から明らかなように、野生型はトリプトファンを 50 μ Μ以上添加すると酵素活性が無添カ卩時の 10%を下回っているが、 9種類の変異型 OASA2タンパク質（S126F、 Y367A、 A369L、 S126F/L530D、 Y367A /L530D、 A369L/L530D、 N351D/Y367A/L530D、 Y367A/G522Y/L530Dおよび Y36 7I/G522Y/L530D)は、トリプトファンを 50 μ Μ添カ卩した場合においても無添カ卩時の 30 %以上の酵素活性を有して、た。

[0108] 〔実施例 4：変異型 OASA2遺伝子を発現させた酵母 TRP2遺伝子欠損変異株 (MAT alpha his3 Δ 1 leu2 Δ 0 metl5 Δ 0 ura3 Δ 0 trp2::KANMX)の遊離トリプトファン含量解析〕

OASA2遺伝子に相当する TRP2遺伝子が欠損した酵母は生育のためにトリプトファンを要求する。従って、この欠損株に OASA2遺伝子を導入しトリブトファン非存在下で生育できれば導入した OASA2遺伝子は TRP2の機能を相補できることになる。また、トリブトファンフィードバック阻害に抵抗性を有する変異型 OASA2遺伝子をこの酵母で発現させ、生体内に蓄積する遊離トリブトファン含量を測定することで当該遺伝子の効果検定を行うことができる。

[0109] 発現ベクターを構築するために、トリブトファンフィードバック阻害に対する抵抗性を有する変異型 OASA2遺伝子（S126F、 Y367A、 A369L、 S126F/L530D、 Y367A/L530 D、 A369L/L530D、 N351D/Y367A/L530D、 Y367A/G522Y/L530D, Y367I/G522Y/ L530D)および野生型（Wt) OASA2遺伝子が挿入された pBluescriptベクターを铸型として、下記のプライマーを用いて PCRを行った。前述の通り OASA2タンパク質の N末端領域には葉緑体移行シグナルが存在するので、上記（2)に記載の「Split- PCR用プライマー」のデザインと同様にシグナル配列を除去した形で発現するようにプライマ一をデザインした。なお、酵母発現ベクター pYES2(I_nvitr₀g_en社製)の制限酵素サイト Kpnl/EcoRIに組み込めるようにセンスプライマーには制限酵素サイト Kpnl(GGTACC) 、アンチセンスプライマーには制限酵素サイト EcoRI(GAATTC)を導入した。これら制限酵素サイトは下線で示す。なお、 pYES2ベクターは URA3遺伝子を有し、ガラクトースによってタンパク質の発現誘導が制御できる。

センスプライマー： 5， -AAAGGTACCATGTGCTCCGCGGGGAAGCC-3，（配列番号 27) アンチセンスプライマー： 5 ' -AAAGAATTCTGAGAGAGACTCTATTCCTTGTC-3 ' (配列番号 28)

PCR反応液の組成は、 1 X Pyrobest buffer II (TaKaRa社)、 0.2mM dNTP、 0.5 Mセンス及びアンチセンスプライマー、 0.025 units/ μ 1 Pyrobest DNA polymerase (TaKa Ra社)、 lOng铸型 DNA (pBS- OASA2ベクター)とし、 PCR反応装置（宝酒造社製、 TaK aRa PCR Thermal Cycler MP TP3000型）を用いて、 95°Cで 2分間保持した後、 98°C で 20秒間、 60°Cで 35秒間、 72°Cで 3分間の反応を 25サイクル繰り返し、 72°Cで 10分保持した後 4°Cに冷却した。

[0110] ベクターへの DNA断片のクロー-ングは Sambrookらの方法（「Molecular Cloning (T hird Edition)」 (J. ¾ambrook & D. W. Russell, し old Spring Harbor Laboratory Press, 2001))に従って行った。構築したベクターの酵母 TRP2遺伝子欠損変異株への形質転換など基礎的手法は Kaiserらの方法（Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual (Chris Kaiser, Susan Michaelis, Aaron Mitchell, Cold Spring Harbor Laboratory, 1994))に従って行った。

[0111] 酵母形質転換体は、 2%グルコースを含む合成完全寒天培地 (0.67%アミノ酸を含まな！ヽバタトイーストナイトロジェンベース、ゥラシルを除、た 0.2%ドロップアウト混合物、 2%バタトァガー）でシングルコロニーを単離し、次!、で菌体を 2%ガラクトースを含む合成完全寒天培地（0.67%アミノ酸を含まな!/、バタトイーストナイトロジェンベース、ゥラシルとトリプトファンを除いた 0.2%ドロップアウト混合物、 2%バタトァガー）上に塗り、 30°C で二日間培養した。寒天培地上から搔き取った菌体 20mgを 105 μ 1の蒸留水で懸濁し、 100°Cで 20分間処理した。次いで 595 1のクロ口ホルム:メタノール混合液（5 : 12、 v/v)を加え、よく混合した後、 20,000 X gの遠心加速度で 10分間遠心分離した。得られた上清を新しいチューブに移し、 175 μ 1の蒸留水と 263 μ 1のクロ口ホルムをカロえ、激しく混合した後、 20,000 X gの遠心加速度で 10分間遠心分離した。このようにして抽出された水層を新しいチューブに移し、減圧下で乾固させた後、 200 μ 1の 10mM N aOHに溶解して、トリブトファン抽出液とした。これを高速液体クロマトグラフィー（HPL C)装置（Waters社製、 Waters Alliance HPLC FLD System 2695)に供して遊離トリプトフアン含量を測定した。この HPLCに用いたカラムは、 Xterra RP18 column (4.6 X 1 50 mm) (Waters社製）であり、トリプトファンは励起波長 278nm/蛍光波長 348nmで検出した。

[0112] 結果を表 2に示した。表 2から明らかなように、トリブトファンフィードバック阻害に抵抗性を有する変異型 OASA2遺伝子（S126F、 Y367A、 A369L、 S126F/L530D, Y367A /L530D、 A369L/L530D、 N351D/Y367A/L530D、 Y367A/G522Y/L530D, Y367I/G5 22Y/L530D)を発現させた酵母中で生成される遊離トリブトファン含量は、野生型 (Wt ) OASA2遺伝子を発現させた酵母のものより高濃度蓄積していることが確認された（野生型の 1.9〜2.3倍）。

[0113] [表 2]

[0114] 〔実施例 5：変異型 OASA2遺伝子発現を発現させたイネカルス形質転換体の作製および当該形質転換カルスの遊離トリブトファン含量解析〕

く外来遺伝子導入用組換えベクターの構築 >

外来遺伝子導入用組換えベクターの構築は、下記の参考文献に記載の方法に従つて行った。

考文献 1 : Urushibara S, Tozawa Y， Kawagishi— Kobayashi M and Wakasa K (2001) Efficient transformation of suspension-cultured rice cells mediated by Agrobacteriu m tumefaciens. Breeding Science 51: 33—38

参文献 2 : Tozawa Y， Hasegawa H， Terakawa T and Wakasa K (2001) Characteriz ation of rice anthranilate synthase alfa subunit genes OSASAl and OSASA2: tryptop han accumulation in transgenic rice expressing a feedback-insensitive mutant of OA SA1. Plant Physiology 126: 1493-1506

参考文献 3 : Hiei Y, Ohta S, Komari T and Kumashiro T (1994) Efficient transformati on of rice (Oryza sativa) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of bound aries of the T- DNA. Plant Journal 6: 271-282

外来遺伝子導入用組換えベクター pUB- Hm (UrusWbara et al.， Breeding Science 5 1: 33-38 (2001))は、トウモロコシのュビキチンプロモーターと、第一イントロンと、制限酵素 Sse8387Iサイトと、 NOSターミネータ一と、ハイグロマイシン耐性遺伝子を有し、 Sse8387Iサイト〖こ目的外来遺伝子を挿入することでイネ形質転換用の組換えべクタ一を構築することができる。

[0115] 全長からなる野生型 (Wt) OASA2遺伝子は、〔実施例 1〕に記載の pBS-OASA2を铸型とし、また下記に示すセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを用いて PCR で増幅した。センスプライマーには制限酵素サイト SpeI(ACTAGT)、アンチセンスプライマ一には制限酵素サイト Sall(GTCGAC)を導入した。これら制限酵素サイトは下線で示す。

センスプライマー： 5し AAAACTAGTATGGAGTCCATCGCCGCCGCCACG— 3' (配列番号 43)

アンチセンスプライマー： 5し AAAGTCGACTGAGAGAGACTCTATTCCTTGTC— 3' ( 配列番号 44)

また、全長からなる変異型 OASA2遺伝子（Y367A、 Y367A/L530D, S126F/L530D) は、 pBS-OASA2を铸型とし、上記センスプライマー (配列番号 43)およびアンチセンスプライマー (配列番号 44)を用いて〔実施例 1〕 < RCR法による変異導入用 DNAの調製〉に記載の方法で DNA断片を調製した。以上の PCRにより増幅した DNA断片を制限酵素 Spelおよび Sailで消化して得られた DNA断片 (1)は、 Sawasakiらが構築した（Sa wasaki et al. (2002) Proc Natl Acad Sci U S A 99, 14652- 14657)コムギ胚芽無細胞合成システム用発現ベクター pEU3bを改良し、マルチクロー-ングサイト Spel/Sallサイトの両端に Sse8387Iサイトを導入したコムギ胚芽無細胞合成システム用発現べクタ一 pEU3sの Spel/Sallサイトに挿入した。

[0116] 別途、上述の変異型 OASA2遺伝子（Y367A、 Y367A/L530D, S126F/L530D)または野生型 (Wt) OASA2遺伝子を含有する pEU3sプラスミドベクターを制限酵素 Sse838 71で消化し、 1.8kbサイズの DNA断片 (2)を得た。

[0117] 上記の制限酵素 Sse8387Iで消化した pUB-Hmプラスミドベクターと DNA断片 (2)を D NAライゲーシヨン'キット ver.2 (タカラバイオ社製)で処理して、 DNA連結反応を行つた。これにより、環状の組換えベクターを構築した。この組換えベクターは、ュビキチンプロモーター領域の下流に第一イントロン領域を有し、第一イントロン領域と NOSターミネーター領域との間に変異型 OASA2遺伝子（Y367A、 Y367A/L530D, S126F/L5 30D)または野生型 (Wt) OASA2遺伝子が挿入、連結されてあり、かつ植物中で発現するハイグロマイシン耐性遺伝子を含有する構造を有した。得られた外来遺伝子導入用組換えベクターを、それぞれ pUB-OASA2(wt)-Hm (野生型 OASA2遺伝子を有する）、 pUB- OASA2(Y367A)- Hm (変異型 OASA2遺伝子 (Y367A)を有する）、 pUB- 0 ASA2(Y367A/L530D)-Hm (変異型 OASA2遺伝子 (Y367A/L530D)を有する）および p UB-OASA2(S126F/L530D)-Hm (変異型 OASA2遺伝子 (S126F/L530D)を有する）と称する。

[0118] 図 5に pUB- OASA2(wt)- Hm、 pUB- OASA2(Y367A)- Hm、 pUB- OASA2(Y367A/L53 0D)- Hmおよび pUB- OASA2(S126F/L530D)- Hmの模式図を示した。図中 PUbiはュビキチンプロモーター領域を表し、 P35Sはカリフラワーモザイクウィルス 35Sプロモータ一領域を表し、 nos3'は NOSターミネータ一領域を表し、 hptはハイグロマイシン耐性遺伝子領域を表し、 Sse8387Iは制限酵素サイトを表し、 RBは右側境界配列 (Right Bo rder)を表し、 LBは左側境界配列 (Left Border)を表す。

[0119] <ァグロバタテリゥムの調製 >

YEB培地（バタトペプトン 5g/l、バタトビーフエタストラタト 5g/l、バクトイーストエタストラクト lg/l、シュクロース 5g/l、 2mM MgCl

2、 pH7)の液体培地 50mlに、ァグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens EHA101)を移植し、 30°Cで 16時間振とう培養した後、培溶液を 4°Cで遠心分離により細菌の沈殿を得た。細菌の沈殿物を氷冷した 10mM Tris-HCl pH7.5で懸濁し、遠心分離で沈殿を得た。沈殿物を 0.5mlの YEB培地に懸濁した。この菌懸濁液 0.2mlに上記 3種類の外来遺伝子導入用組換えベクターの溶解液 (5 g)をそれぞれ添加し、よく混合した。これらを即座に凍結し、 37°Cで融解、再度凍結融解を計 3回行った。 16mlの YEB培地にこの懸濁液をカ卩え、 30°Cで 2時間振とう培養した。この培養液を L培地 (バタトトリプトン 10g/l、バクトイーストエタストラクト 5 g/l、 NaCl 5g/l、バタトァガー 15g/l、 pH7.5)にカナマイシン lOOmg/1およびハイグロマイシン 50mg/lを添カ卩してなる寒天培地に塗布し、 30°Cで 36時間培養して、生育してきたコロニーを組換えベクターが導入された形質転換ァグロバタテリゥムとして得た。

[0120] くイネカルスの調製 >

イネ（品種：日本晴)の完熟種子カゝら籾穀を脱穀した。得られた外皮付きの種子を 7 0%エタノール溶液に 60秒間、っ、で有効塩素約 4%の次亜塩素酸ナトリウム溶液に 6 分間浸漬して種子を殺菌処理した。さらに種子を滅菌水で洗浄した。

[0121] N6培地の無機塩組成にショ糖 30g/l、 2,4- D 2mg/l、カザミノ酸 lg/1およびゲルライト 2g/l、および N6ビタミンを添カ卩してなる 2N6固体培地（UrusWbara et al., Breeding Sci ence 51: 33-38 (2001))に、上記で殺菌したイネ種子を置床した。 28°Cで 3週間インキュペートすることでカルスが形成された。それらカルスを胚乳部分力も切り出し、そのカルスを上記と同じ組成の培地に移植して、 7日間培養を行った。

[0122] <イネカルスの形質転換 >

上記のようにして得られた、遺伝子導入用の形質転換ァグロパクテリゥムを AA培地の組成（Hiei et al., Plant Journal 6: 271-282 (1994))にショ糖 20g/l、 2,4- D 2mg/l、力イネチン 0.2mg/lおよびァセトシリンゴン 10mg/lを添カ卩してなる液体培地 30mlに懸濁し菌液を得た。この懸濁液を 9cmのシャーレに入れ、上記により得られたイネのカルスを 100個入れた後、 5分間浸せきした。浸せき後、ペーパータオルで余分な菌液を除去した後、 N6培地の無機塩組成にショ糖 30g/l、グルコース 10g/l、 2,4-D 2mg/l、カザミノ酸 lg/l、ゲルライト 2g/lおよびァセトシリンゴン 10mg/lを添カ卩してなる 2N6CO固体培地に、上記の浸せきしたカルスを各シャーレ当たり 20個ずつ置床した。 24°Cで 3日間、暗黒下で培養し、イネのカルスへのァグロバタテリゥムの感染を行った。

[0123] <カノレスの選抜 >

組換えベクターが導入された形質転換カルスを、 500mg/lカルべ-シリンを添カロしてなる滅菌水で洗浄してァグロバタテリゥム細菌を除去した。カルスから余分な水分を除いた後、カルスを N6培地の無機塩組成にショ糖 30g/l、 2,4-D 2mg/l、カルべ-シリン 500mg/l、ハイグロマイシン 30mg/l、カザミノ酸 lg/l、ゲルライト 2mg/lを添カ卩してなる 2N6SE固体培地上に各シャーレ当たり 20個ずつ移植した。 28°Cで 3週間、暗黒下で培養して、ノ、イダロマイシン耐性の形質転換カルスを得た。さらに同じ組成の個体培地上へ増殖カルスを移植し、ハイグロマイシン耐性の形質転換カルスの培養を 28 °Cで 3週間行った。

[0124] 3週間後、増殖したカルスの一部力も DNAを抽出し、下記に示すセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを用いた PCRにより形質転換カルスと同定した。

センスプライマー： 5'- GGATGGCACCCGCAGCAGATCG- 3' (配列番号 45) アンチセンスプライマー： 5'- GTACTCATCACTTGTCATGGTTG- 3' (配列番号 46) 402塩基対に相当する形質転換用ベクター遺伝子に由来する断片の増幅により、形質転換体における OASA2変異遺伝子を確認した。元々含まれるゲノム上の OASA 2遺伝子にはイントロン配列が含まれる、形質転換遺伝子にはイントロンが含まれな!/ヽため、 402塩基対の DNA増幅産物は、形質転換用遺伝子にのみ由来する。

[0125] PCR反応液の組成は、 1 X Pyrobest buffer II (TaKaRa社)、 0.2mM dNTP、 0.5 μ M センスプライマー（配列番号 45)及びアンチセンスプライマー（配列番号 46)、 0.025 units/ μ 1 Pyrobest DNA polymerase (TaKaRa社)、 lOng铸型 DNA (カルス DNA)とし、 PCR反応装置（宝酒造社製、 TaKaRa PCR Thermal Cycler MP TP3000型）を用いて、 95°Cで 2分間保持した後、 98°Cで 20秒間、 60°Cで 35秒間、 72°Cで 3分間の反応を 25 サイクル繰り返し、 72°Cで 10分保持した後 4°Cに冷却した。

[0126] さらに、参考文献（Tozawa et al.， Plant Physiology 126: 1493-1506 (2001))に記載された方法に従って形質転換カルスより RNAを抽出し、同文献（Tozawa et al.， Plant Physiology 126: 1493-1506 (2001))に記載されたジゴキシゲニン標識した OASA2の R NAプローブを用いる方法に従って RNAブロットハイブリダィゼーシヨンを行、、上記形質転換により導入した OASA2野生型遺伝子または OASA2変異型遺伝子 ((Y367A) あるいは (Y367A/L530D))が選抜したカルスに RNAとして発現して!/、ることを確認した

[0127] く形質転換カルスの遊離トリブトファン含量解析— 1 >

変異型 OASA2遺伝子（Y367A、 Y367A/L530D)または野生型 (Wt) OASA2遺伝子を発現するイネカルスそれぞれ 2系統について、各イネカルスの lOOmgを液体窒素中で粉砕した。粉砕物を 1.5ml容のチューブに移し替え、次いで 500 1のクロ口ホルム：メタノール：水混合液（5 : 12 : 3の容積比）をカ卩え、よく混合した後、 5,000 Xrpmの遠心加速度で 10分間遠心分離した。得られた上清を新しいチューブに移し、 375 1の蒸留水と 250 1のクロ口ホルムをカ卩え、激しく混合した後、 5,000 Xrpmの遠心加速度で 10分間遠心分離した。このようにして抽出された水層を新しいチューブに移し、減圧下で乾固させた後、 2mlの 10mM NaOHに溶解して、トリプトファン抽出液とした。これを高速液体クロマトグラフィー (HPLC)装置（Waters社製、 Waters Alliance HPLC FLD System 2695)に供して遊離トリプトファン含量を測定した。この HPLCに用いた力ラムは、 Xterra RP18 column (4.6 X 150 mm) (Waters社製）であり、展開溶媒はァセトリトリル—0.1M H3P04水溶液 (pH4.0)をァセトニトリルの 5%〜45%濃度勾配で用い、流量は lml/分として、励起波長 278nmにおける蛍光波長 348nmの測定を行、トリプトファン含量を評価した。

[0128] 対照として、形質転換されていない通常のイネ（品種：日本晴)のカルスを用いた。

得られた測定結果を表 3に示す。表 3から明らかなように、トリブトファンフィードバック阻害に抵抗性を有する変異型 OASA2遺伝子 (Y367A、 Y367A/L530D)を発現させたイネカルス中に生成される遊離トリブトファン含量は、対照のイネカルスより高濃度蓄積して、ることが確認された (野生型の 5.5〜38.8倍)。

[0129] [表 3]

[0130] <形質転換カルスの遊離トリブトファン含量解析— 2 >

続、て、変異型 OASA2遺伝子（S126F/L530D)を発現するイネカルス 6系統につ!ヽても、上記く形質転換カルスの遊離トリブトファン含量解析 1 >欄と同様の手法により遊離トリブトファンの含量を評価した。

[0131] 対照として、形質転換されていない通常のイネ（品種：日本晴)のカルスを用いた。

得られた測定結果を表 4に示す。表 4から明らかなように、トリブトファンフィードバック阻害に抵抗性を有する変異型 OASA2遺伝子 (S126F/L530D)を発現させたイネカルス中に生成される遊離トリブトファン含量は、対照のイネカルスより高濃度蓄積していることが確認された。具体的には、野生型の 123〜467倍であった。

[0132] [表 4]

[0133] なお、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなぐ本発明の精神と次に記載する特許請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである産業上の利用の可能性

[0134] 本発明により、高トリブトファン蓄積植物の作出が可能となる。したがって、本発明は広く農業に利用することができ、また高トリブトファン蓄積植物は家畜の飼料や食品原料に適しているため、本発明は畜産業や食品産業にも利用することができる。

Claims

請求の範囲

[1] 配列番号 1に示されるアミノ酸配列の第 126位、第 367位または第 369位の少なくとも 1つに変異を有するポリペプチドであって、トリブトファン生合成経路にお、てトリブトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有することを特徴とするポリぺプチド。

[2] さらに、配列番号 1に示されるアミノ酸配列の第 351位、第 522位または第 530位の少なくとも 1つに変異を有するポリペプチドであって、野生型イネアントラニル酸合成酵素と比較して少なくとも 0. 7倍以上の酵素活性を有することを特徴とする請求項 1 に記載のポリペプチド。

[3] 上記配列番号 1に示されるアミノ酸配列の第 126位の変異は、セリンをフエ二ルァラニンに置換する変異であり、

上記配列番号 1に示されるアミノ酸配列の第 367位の変異は、チロシンをァラニンまたはイソロイシンに置換する変異であり、

上記配列番号 1に示されるアミノ酸配列の第 369位の変異は、ァラニンをロイシンに置換する変異であることを特徴とする請求項 1または 2に記載のポリペプチド。

[4] 上記配列番号 1に示されるアミノ酸配列の第 351位の変異は、ァスパラギンをァスノラギン酸に置換する変異であり、

上記配列番号 1に示されるアミノ酸配列の第 522位の変異は、グリシンをチロシンに置換する変異であり、

上記配列番号 1に示されるアミノ酸配列の第 530位の変異は、ロイシンをァラニンまたはァスパラギン酸に置換する変異であることを特徴とする請求項 1な、し 3の、ずれか 1項に記載のポリペプチド。

[5] 請求項 1な!、し 4の!、ずれ力 1項に記載のポリペプチドであって、

配列番号 2なヽし 7および配列番号 29なヽし 32のヽずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または配列番号 2な!、し 7および配列番号 29な!、し 32の!ヽずれかに示されるアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列力もなるポリペプチド。

[6] アントラ-ル酸合成酵素のトリブトファン結合領域に変異を有するポリペプチドであつて、配列番号 26に示されるアミノ酸配列の第 5位に変異を有し、トリブトファン生合成経路においてトリブトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有することを特徴とするポリペプチド。

[7] 上記配列番号 26に示されるアミノ酸配列の第 5位の変異は、チロシンをァラニンまたはイソロイシンに置換する変異であることを特徴とする請求項 6に記載のポリべプチド、。

[8] 請求項 1ないし 7のいずれ力 1項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド

[9] 請求項 8に記載のポリヌクレオチドであって、

配列番号 9な!、し 14および配列番号 33な!、し 36の!、ずれかに示される塩基配列力もなるポリヌクレオチド、または配列番号 9な!、し 14および配列番号 33な!、し 36のいずれかに示される塩基配列力なるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列力なるポリヌクレオチドとストリンジヱントな条件下でノヽイブリダィズするポリヌクレオチド。

[10] 請求項 8または 9に記載のポリヌクレオチドからなる形質転換体選抜用マーカー遺伝子。

[11] 請求項 8または 9に記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。

[12] 請求項 8または 9に記載のポリヌクレオチドまたは請求項 11に記載の組換え発現べクタ一が導入されており、かつ、トリブトファン生合成経路においてトリブトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有するポリペプチドが発現している形質転換体

[13] 上記形質転換体は、植物細胞または植物体であることを特徴とする請求項 12に記載の形質転換体。

[14] 請求項 13に記載の植物体から得られる種子。

[15] 請求項 10に記載のマーカー遺伝子または請求項 11に記載の組換え発現ベクターを細胞に導入することにより、細胞の増殖を阻害するトリブトファン類縁ィ匕合物に対する耐性を細胞に付与し、さらに当該トリブトファン類縁ィ匕合物に対する耐性を発現してヽる細胞を選抜することからなる、形質転換細胞の選抜方法。

[16] 少なくとも請求項 8または 9に記載のポリヌクレオチド、あるいは請求項 11に記載の組換え発現ベクターのいずれかを含むことを特徴とする形質転換キット。

[17] 請求項 1ないし 5のいずれか 1項に記載のポリペプチドおよび野生型イネアントラ- ル酸合成酵素の、いずれか一方のみと結合する物質をスクリーニングする方法であつて、

請求項 1ないし 5のいずれか 1項に記載のポリペプチドと結合する物質をスクリー- ングする工程と、

野生型イネアントラ-ル酸合成酵素と結合する物質をスクリーニングする工程と、上記両工程の結果を比較する工程とを含むことを特徴とするスクリーニング方法。

[18] 請求項 17に記載のスクリーニング方法を実施するためのキットであって、

少なくとも請求項 1ないし 5のいずれか 1項に記載のポリペプチドの 1つと野生型ィネアントラ-ル酸合成酵素とを含むことを特徴とするスクリーニングキット。