WO2006082685A1 - 一塩基多型の検出方法 - Google Patents

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WO2006082685A1
WO2006082685A1 PCT/JP2005/022985 JP2005022985W WO2006082685A1 WO 2006082685 A1 WO2006082685 A1 WO 2006082685A1 JP 2005022985 W JP2005022985 W JP 2005022985W WO 2006082685 A1 WO2006082685 A1 WO 2006082685A1
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WO
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nucleic acid
nucleotide polymorphism
single nucleotide
residue
evaluated
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/022985
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English (en)
French (fr)
Inventor
Kazuhiko Nakatani
Hitoshi Suda
Akio Kobori
Original Assignee
Kyoto University
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Publication date
Application filed by Kyoto University filed Critical Kyoto University
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
    • G01N21/80—Indicating pH value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a single nucleotide polymorphism in a target nucleic acid and a kit thereof. More specifically, the present invention relates to a method for detecting a single nucleotide polymorphism in a target nucleic acid with high sensitivity and a kit thereof.
  • SNPs Single nucleotide polymorphisms
  • the detection of the SNPs is based on, for example, differences in mobility in electrophoresis, primer extension, hybridization using a probe labeled with a labeling substance such as a fluorescent substance, radioactive substance, amplification by PCR, etc. This is done by a detection method such as typing.
  • the separation of fragments in electrophoresis is largely performed using an increase in the difference in secondary structure due to polymorphism as an index for a DNA fragment to be analyzed and a reference DNA fragment.
  • the heterozygous reference DNA fragment and the DNA fragment to be analyzed are electrophoretically separated simultaneously with the same chirality under the following temperature conditions, and the peak is corrected with the reference DNA fragment 1 ⁇ ,
  • Detection method that examines the presence or absence of loss of heterozygosity of the DNA fragment to be analyzed (Patent Document 1); a chromosome containing a specific single nucleotide polymorphic site contained in a sample or a fragment thereof, and a wild-type primer and A detection method in which one or two types of mutant primers are allowed to act simultaneously or separately with DNA polymerase to examine the presence or absence of primer-based extension (Patent Document 2); multiple pairs of primers to be analyzed with genomic DNA And Detection method that amplifies a
  • Permissible literature 4 When the target nucleic acid region is not changed, the biological sample is contacted with a plurality of single-stranded peptide nucleic acids that continuously hybridize to the region, and then mismatched nucleic acid (single-stranded nucleic acid) Examples include a detection method (Patent Document 5) in which an agent that degrades (nucleic acid) is added and then the presence of degradation products is examined.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2002-78500
  • Patent Document 2 Pamphlet of International Publication No. 01Z042498
  • Patent Document 3 JP 2002-300894
  • Patent Document 4 JP 2003-52372
  • Patent Document 5 Special Table 2004— 521630
  • the gist of the present invention is as follows:
  • a signal based on the compound of (B) that recognizes cytosine bulge or thymine bulge formed when the nucleic acid probe and the nucleic acid to be evaluated are hybridized is detected, and the single nucleotide polymorphism is evaluated. Detection method of nucleotide polymorphism,
  • nucleic acid to be evaluated containing at least one single nucleotide polymorphism, and a cytosine residue at a position adjacent to the 5 ′ or 3 ′ end of the position where the single nucleotide polymorphism is paired
  • a cytosine residue or thymine residue is added at a position adjacent to the terminal side, and at least one of the guanine residues present adjacent to the cytosine residue or thymine residue is further substituted with an inosine residue
  • [8] ⁇ ) comprising at least one single nucleotide polymorphism and capable of hybridizing complementarily to a nucleic acid to be evaluated containing a wild-type nucleotide at the position where the nucleotide polymorphism is present;
  • a nucleic acid probe having a base sequence to which a cytosine residue or a thymine residue is added at a position adjacent to the 5 ′ or 3 ′ end of the binding position, and Z or
  • ⁇ ) Comprising at least one single nucleotide polymorphism and complementary to the antisense strand of the nucleic acid to be evaluated containing the wild type nucleotide at the position where the nucleotide polymorphism is present.
  • a nucleic acid probe having a base sequence to which a cytosine residue or a thymine residue is added at a position adjacent to the 5 ′ or 3 ′ terminal side of the position that matches the single nucleotide polymorphism on the antisense strand;
  • ⁇ ′ contains at least one single nucleotide polymorphism, and is capable of hybridizing complementarily to the nucleic acid to be evaluated containing the mutant nucleotide at the base polymorphism location, and matches the single nucleotide polymorphism.
  • a kit for use in the method for detecting a single nucleotide polymorphism in a nucleic acid according to any one of [1] to [7] V above,
  • i ′ comprising at least one single nucleotide polymorphism and capable of hybridizing complementarily to a nucleic acid to be evaluated containing a wild-type nucleotide at the position of the nucleotide polymorphism, wherein the single nucleotide polymorphism
  • a cytosine residue or thymine residue is added at a position adjacent to the 5 ′ or 3 ′ terminal side of the paired position, and the guanine residue present adjacent to the cytosine residue or thymine residue.
  • a nucleic acid probe having a base sequence in which at least one is replaced with an inosine residue;
  • a nucleic acid probe having a substituted base sequence comprising at least one single nucleotide polymorphism, and capable of complementary and antisense to the antisense strand of the nucleic acid to be evaluated containing the wild-type nucleotide at the position where the nucleotide polymorphism is present;
  • a cytosine residue or thymine residue is added at a position adjacent to the 5 'or 3' terminal side of the position where it is paired with a single nucleotide polymorphism on the chain, and is adjacent to the cytosine residue or thymine residue.
  • At least one of the guanine residues Furthermore, a nucleic acid probe having a substituted base sequence,
  • a cytosine residue or thymine residue is added at a position adjacent to the 5 ′ or 3 ′ terminal side, and at least one of the guanine residues present adjacent to the cytosine residue or thymine residue is replaced with an inosine residue.
  • the antisense strand comprising at least one single nucleotide polymorphism, which can be complemented and hybridized to the antisense strand of the nucleic acid to be evaluated containing the mutant nucleotide at the position where the nucleotide polymorphism exists.
  • a cytosine residue or thymine residue is added at a position adjacent to the 5 ′ or 3 ′ terminal side of the position where the single nucleotide polymorphism above is paired, and is present adjacent to the cytosine residue or thymine residue.
  • a nucleic acid probe having a base sequence in which at least one of guanine residues is further substituted with an inosine residue;
  • the detection method of the present invention single nucleotide polymorphism in a nucleic acid can be detected easily at a low cost and with high sensitivity without performing a complicated process such as labeling with a labeling substance. There is an excellent effect of being able to. Moreover, according to the kit of the present invention, there is an excellent effect that the detection method can be performed efficiently and simply at low cost.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of the use of a nucleic acid probe for a target nucleic acid.
  • the underlined bold letters indicate the positions of single nucleotide polymorphisms to be evaluated.
  • the black circle indicates 2,7-diamino-1,8-naphthyridine.
  • FIG. 2 is a diagram showing the absorption spectrum and fluorescence spectrum of 10 / z M 2,7-diamino-1,8-naphthyridine under various conditions.
  • the left panel shows an absorption spectrum at 300 nm to 450 nm.
  • the right panel shows the fluorescence spectrum of 10 M 2,7-diamino-1,8-naphthyridine.
  • the excitation wavelength for fluorescence measurement has an absorption maximum in each absorption spectrum.
  • FIG. 3 is a diagram showing an absorption spectrum and a fluorescence spectrum of 10 / z M 2,7-diamino-1,8-naphthyridine bound to adenine bulge, thymine bulge, cytosine bulge and guanine bulge.
  • the left panel shows the absorption spectrum from 300 nm to 450 nm.
  • the right panel shows the fluorescence spectrum of 10 / z M 2,7-diamino-1,8-naphthyridine.
  • the excitation wavelength for fluorescence measurement is the absorption maximum in each absorption spectrum.
  • FIG. 4 shows a fluorescence spectrum based on the fluorescence of 2,7-diaminol 1,8-naphthyridine bound to a bulge in the presence of C or A allele.
  • a allele is a nucleic acid containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • T probe is a nucleic acid containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 2
  • G probe is shown in SEQ ID NO: 3.
  • Nucleic acid containing the base sequence shown below, C allele is the nucleic acid containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 4
  • Iprobe is the nucleic acid containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • the present invention relates to a method for detecting a single nucleotide polymorphism in a nucleic acid.
  • the detection method of the present invention specifically comprises: (A) I) a position capable of complementary hybridization to a nucleic acid to be evaluated containing at least one single nucleotide polymorphism and paired with the single nucleotide polymorphism.
  • a nucleic acid probe having a base sequence to which a cytosine residue or thymine residue is added at a position adjacent to the 5 ′ or 3 ′ end of
  • nucleic acid probe having a base sequence to which a cytosine residue or thymine residue is added at a position adjacent to the terminal side;
  • a method comprising: detecting a signal based on the compound (B) that recognizes cytosine or thymine bulge formed when the nucleic acid probe and a nucleic acid to be evaluated are hybridized, and evaluating the single nucleotide polymorphism. It is.
  • a compound containing a naphthyridine ring is formed by nucleotides adjacent to a bulge base that shifts the wavelength power of the absorption maximum before binding by specifically binding to the noresi structure. This is based on the inventors' surprising knowledge that the fluorescence intensity varies depending on the type of base pair.
  • the present inventors can hybridize complementarily to a nucleic acid having a single nucleotide polymorphism, and have a probe containing a bulge base adjacent to the position where the single nucleotide polymorphism is paired with the single nucleotide polymorphism.
  • a duplex containing a bulge structure is formed by hybridizing with a nucleic acid, and the fluorescence of a compound containing a naphthyridine ring is bound to a bulge base in the next step, and the nucleotide at the position where the single nucleotide polymorphism exists is detected. It was found that single nucleotide polymorphisms can be detected from fluctuations in fluorescence intensity caused by differences.
  • base refers to deoxyribonucleotide unless otherwise specified. Therefore, in the present specification, “cytosine” (C), “thymine” (T), “adenine” ( ⁇ ) and “guanine” (G) are each deoxyribonucleotide, That is, it means “2′-deoxycytidine”, “2′-deoxythymidine”, “2′-deoxyadenosine” and “2′-deoxyguanosine”, respectively.
  • the nucleic acid to be evaluated containing at least one single nucleotide polymorphism means that at least one, more specifically, 1 to 5 single nucleotide polymorphisms exist.
  • the nucleotide present at the position of the single nucleotide polymorphism includes both wild-type nucleotides and mutant nucleotides.
  • wild-type nucleotide at the position of single nucleotide polymorphism is a nucleotide at a site where a single nucleotide polymorphism is confirmed, and is a strong portion in a so-called normal nucleotide sequence.
  • the nucleotide at the position of the single nucleotide polymorphism is the nucleotide at the site where the single nucleotide polymorphism has been confirmed, and in the so-called mutant nucleotide sequence. Nucleotides in the powerful parts! Uh.
  • bulge base means an unpaired base in double-stranded DNA
  • buldycytosine or “baldithymine” means that in double-stranded DNA, respectively.
  • a noble structure composed of a strong bulge base consists of a single-stranded DNA having a specific base sequence ability and a base sequence further including one extra nucleotide at an arbitrary position in the base sequence.
  • single-stranded DNA is subjected to hybridization, it can be generated as a duplex containing a bulge structure.
  • a cytosine residue or a thymine residue added at a position adjacent to the 5 ′ or 3 ′ terminal side of the position where the single nucleotide polymorphism is paired corresponds to the bulge base.
  • cytosine bulge or "thymine bulge” means a bulge that is generated by the surplus of one cytosine or thymine with respect to the corresponding single-stranded DNA.
  • the term “compound capable of recognizing a bulge base” refers to, for example, forming a hydrogen bond with a bulge base present in the duplex to thereby stabilize the duplex having the bulge base.
  • examples include compounds having a naphthyridine ring, 2,6-diaminopyridine, and xanthine.
  • a compound having a naphthyridine ring that emits fluorescence as a signal is preferable because of easy detection and evaluation.
  • the detection method of the present invention is capable of detecting a single nucleotide polymorphism without using a labeling substance such as a fluorescent substance by using a compound having a naphthyridine ring as a compound capable of recognizing a bulge base. Exhibits excellent effects. Therefore, in the detection method of the present invention, extension reaction, amplification reaction, enzyme reaction (e.g., extension reaction, amplification reaction, mismatched nucleic acid degradation reaction, etc.), examination of electrophoresis conditions, labeling with a labeling substance, etc. A single nucleotide polymorphism can be easily detected without performing a complicated process such as the above. Furthermore, since the compound containing the naphthyridine ring specifically binds to the noresi, the level of the knock ground signal is reduced, and single nucleotide polymorphisms can be detected with high sensitivity.
  • a labeling substance such as a fluorescent substance
  • the compound containing the naphthyridine ring shifts the wavelength at which the absorption maximum of the compound containing the naphthyridine ring shifts due to binding to the bulge and is adjacent to the bulge base.
  • the fluorescence intensity varies depending on the type of nucleotide residue paired with the leotide residue (ie, allele). Therefore, the binding to the bulge can be evaluated by the shift of the wavelength showing the strong absorption maximum, and the single nucleotide polymorphism can be evaluated by the fluctuation of the fluorescence intensity.
  • Examples of the compound containing a naphthyridine ring include the following (I):
  • R 1 and R 2 each independently represent a primary amin residue, a secondary ammine residue or a tertiary ammine residue
  • Examples of the primary amine residue include an —NH group.
  • Examples of the secondary amin residue include:
  • examples of the tertiary ammine residue include a —N (CH 3) (CH 2) NH group and the like.
  • both R 1 and R 2 are secondary. It is preferably an amino acid residue.
  • 2,7-diamino-1,8-naphthyridine is shown.
  • the 2,7-diamino-1,8-naphthyridine can be synthesized, for example, by the method described in JP-A-2004-262827.
  • the wavelength that shifts by 20 nm and shows the maximum value of fluorescence intensity shifts from 398 ⁇ m to 430 nm by about 32 nm.
  • the same properties as 2,7-diamino-1,8-naphthyridine, that is, for example, generate fluorescence have binding ability to bulge, and bind to bulge.
  • Any derivative compound of 2,7-diamino-1,8-naphthyridine may be used as long as the absorption maximum wavelength is shifted and the fluorescence intensity is changed by the allele.
  • R 3 and R 4 are each independently a hydrogen atom or an amino group, and 1, m and n are
  • R 3 and R 4 are each independently a hydrogen atom or an amino group, which produces fluorescence and has a binding ability to a bulge.
  • one of them is preferably an amino group.
  • the m and n are each independently a natural number of 1-6.
  • the above 1 is preferably 2 or more, more preferably 3 or more, preferably 6 or less, more preferably 5 or less, even more preferably 4 or less, specifically, preferably 2 to 6 More preferably, it is 3-5, and more preferably 3-4.
  • the m is preferably 2 or more, more preferably 3 or more, preferably 6 or less, more preferably 5 or less, and still more preferably 4 or less. Specifically, it is preferably 2 to 6, more preferably 3 to 5, and still more preferably 3 to 4.
  • n is preferably 2 or more, more preferably 3 or more, preferably 6 or less, more preferably 5 or less, and further preferably 4 or less. Specifically, it is preferably 2-6, more preferably 3-5, and still more preferably 3-4.
  • R 5 and R 6 are each independently a hydrogen atom or an amino group, generate fluorescence, and have an ability to bind to a bulge. It is desirable that at least one is an amino group from the viewpoint of sufficiently exhibiting the property that the absorption maximum wavelength shifts due to the binding to the bulge and the fluorescence intensity changes due to the allele.
  • the o and p are each independently a natural number of 1-6.
  • the above o is Preferably, it is 2 or more, more preferably 3 or more, preferably 6 or less, more preferably Specifically, it is preferably 5 or less, more preferably 4 or less, preferably 2 to 6, more preferably 3 to 5, and further preferably 3 to 4. It is desirable that From the same viewpoint, the p is preferably 2 or more, more preferably 3 or more, preferably 6 or less, more preferably 5 or less, and still more preferably 4 or less. Specifically, it is preferably 2 to 6, more preferably 3 to 5, and still more preferably 3 to 4.
  • Hybridization when the nucleic acid probe of the present invention hybridizes complementarily to the nucleic acid to be evaluated containing at least one single nucleotide polymorphism or to the antisense strand of the nucleic acid to be evaluated is ImM to: LM, preferably Is preferably performed in a buffer solution containing 10 to 100 mM sodium chloride, pH 5 to 8, preferably pH 6 to 7, preferably phosphate buffer.
  • nucleic acid probe of the above-mentioned I) of the present invention has a base sequence corresponding to the antisense strand of the nucleic acid to be evaluated containing a single nucleotide polymorphism, and the single nucleotide polymorphism in the nucleic acid to be evaluated
  • a nucleic acid probe to which a cytosine residue or a thymine residue is added at a position adjacent to a nucleotide that forms a base pair with a nucleotide present at the site of A nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence that is, a nucleotide sequence corresponding to the sense strand of the nucleic acid to be evaluated containing a single nucleotide polymorphism, and a cytosine residue at a position adjacent to the nucleotide present in the site of the single nucleotide polymorphism.
  • one embodiment of the probe of the above I) or ⁇ ) is: I) a nucleotide sequence corresponding to an antisense strand of a continuous nucleotide sequence containing nucleotides having a single nucleotide polymorphism, and the single nucleotide polymorphism
  • a nucleic acid probe comprising a nucleotide sequence to which a cytosine residue or a thymine residue is added adjacent to the 5 ′ or 3 ′ terminal side of the position on the antisense strand corresponding to the existing position; or
  • a nucleic acid probe containing a base sequence to which a group or a thymine residue is added is added.
  • the nucleic acid probe used in the present invention includes a wild-type nucleotide at the position where the single nucleotide polymorphism exists.
  • Examples thereof include a nucleic acid probe containing a leotide and a nucleic acid probe containing a mutated nucleotide at the position where the single nucleotide polymorphism exists.
  • the nucleic acid probe to be used has a cytosine residue or a thymine residue at a position adjacent to the terminal 5 or 3, and a position adjacent to the terminal nucleic acid. Another major feature is that it contains an added base sequence. Therefore, in the detection method of the present invention, the nucleic acid probe is hybridized with the nucleic acid to be evaluated for single nucleotide polymorphism, thereby generating a bulge structure that recognizes and binds to the compound containing the naphthyridine ring.
  • cytosine bulge or thymine bulge-specific binding of the compound containing the naphthyridine ring can be induced, the knock signal level can be reduced, and detection with high sensitivity becomes possible.
  • the cytosine residue or thymine residue added adjacent to the 5 ′ or 3 ′ end corresponds to the “bulge base”.
  • the knowledge structure is generated when a nucleic acid probe has a bulge base when a nucleic acid probe is hybridized with a single nucleotide polymorphism nucleic acid to be evaluated.
  • a compound containing a naphthyridine ring recognizes and binds to a bulge structure by forming a hydrogen bond with a bulge base.
  • the nucleic acid probe has a basic guanine adjacent to the bulge base, i) at least from the viewpoint of suppressing the quenching of the signal based on the compound capable of recognizing the bulge base.
  • nucleic acid probe comprising a nucleotide sequence to which a thymine residue is added and at least one of the guanine residues present adjacent to the cytosine residue or thymine residue is further substituted with an inosine residue, or
  • a cytosine residue or thymine residue is added at a position adjacent to the terminal side, and at least one of the guanine residues present adjacent to the cytosine residue or thymine residue is further substituted with an inosine residue
  • a nucleic acid probe having the base sequence described above is preferred.
  • nucleic acid probe of i) or ii) is: i) a nucleotide sequence corresponding to an antisense strand of a continuous nucleotide sequence containing a nucleotide having a single nucleotide polymorphism, and the single nucleotide A cytosine residue or thymine residue is added adjacent to the 5 ′ or 3 ′ end of the position on the antisense strand corresponding to the polymorphic position, and adjacent to the cytosine residue or thymine residue.
  • a nucleic acid probe containing a base sequence in which at least one of the guanine residues present is further substituted with an inosine residue, or
  • a nucleic acid probe comprising a base sequence to which a group or thymine residue is added and at least one of the guanine residues present adjacent to the cytosine residue or thymine residue is further substituted with an inosine residue;
  • nucleic acids i) and ii) are suitable when the base adjacent to the position where the single nucleotide polymorphism is present is cytosine.
  • the type of the nucleic acid probe is appropriately selected. Can be selected.
  • nucleic acid probe containing a wild-type nucleotide at the position where the single nucleotide polymorphism exists specifically includes ⁇ ) at least one single nucleotide polymorphism, and A cytosine residue or a thymine residue at a position adjacent to the 5 ′ or 3 ′ end of the position where the single nucleotide polymorphism is paired.
  • ⁇ comprising at least one single nucleotide polymorphism, and capable of complementary and antisense to the antisense strand of the nucleic acid to be evaluated containing the wild type nucleotide at the position where the nucleotide polymorphism exists, and said antisense strand
  • a nucleic acid probe having a base sequence to which a cytosine residue or a thymine residue is added at a position adjacent to the 5 ′ or 3 ′ terminal side of the position that matches the single nucleotide polymorphism above;
  • i ′ contains at least one single nucleotide polymorphism, and the wild type nucleo It can be hybridized in a complementary manner to the nucleic acid to be evaluated containing tides, and a cytosine residue or a thymine residue is added at a position adjacent to the 5 ′ or 3 ′ end of the position where the single nucleotide polymorphism is paired.
  • a nucleic acid probe having a base sequence in which at least one of the guanine residues present adjacent to the cytosine residue or thymine residue is substituted with an inosine residue
  • cytosine residue or thymine residue is added at a position adjacent to the 5 'or 3' terminal side of the position where it is paired with a single nucleotide polymorphism on the chain, and is adjacent to the cytosine residue or thymine residue.
  • a nucleic acid probe having a base sequence in which at least one of the guanine residues to be further substituted with an inosine residue;
  • nucleic acid probe containing a mutant nucleotide at the position where the single nucleotide polymorphism exists specifically includes ⁇ ′) at least one single nucleotide polymorphism, and the mutant nucleotide exists at the position where the nucleotide base polymorphism exists. And a cytosine residue or a thymine residue is added to a position adjacent to the 5 ′ or 3 ′ terminal side of the position where the single nucleotide polymorphism is paired.
  • nucleic acid to be evaluated which contains at least one single nucleotide polymorphism, and the mutant nucleotide is present at the position where the nucleotide polymorphism is present, and the antisense strand
  • a nucleic acid probe having a base sequence to which a cytosine residue or a thymine residue is added at a position adjacent to the 5 ′ or 3 ′ end of the single nucleotide polymorphism above,
  • a cytosine residue or thymine residue is added at a position adjacent to the 5 ′ or 3 ′ terminal side, and at least one of the guanine residues present adjacent to the cytosine residue or thymine residue is replaced with an inosine residue.
  • a nucleic acid probe having a defined base sequence i) The antisense strand comprising at least one single nucleotide polymorphism, which can be complemented and hybridized to the antisense strand of the nucleic acid to be evaluated containing the mutant nucleotide at the position where the nucleotide polymorphism exists.
  • a cytosine residue or thymine residue is added at a position adjacent to the 5 ′ or 3 ′ terminal side of the position where the single nucleotide polymorphism above is paired, and is present adjacent to the cytosine residue or thymine residue.
  • a single nucleotide polymorphism in the nucleic acid to be evaluated is identified based on the variation of the signal based on the compound containing the naphthyridine ring of (B) bound to each of the nucleic acids.
  • a schematic diagram showing an example of the use of the nucleic acid probe for the target nucleic acid is shown in FIG.
  • a guanine-cytosine (GC) base pair is formed with a nucleic acid probe at the position of the single nucleotide polymorphism of the nucleic acid to be evaluated
  • the evaluation is performed. Fluorescence based on the compound containing the naphthyridine ring (B) bound to the bulge formed between the target nucleic acid and the wild type probe or mutant probe is quenched to form an adenylate (AT) base pair.
  • AT adenylate
  • fluorescence based on the compound containing the naphthyridine ring (B) bound to the bulge formed between the nucleic acid to be evaluated and the wild type probe or the mutant type probe can be detected.
  • nucleotide having a single nucleotide polymorphism and Z or a nucleotide adjacent thereto are cytosine residues
  • the guanine residue at the corresponding position of the nucleic acid probe is used instead of the inosine residue.
  • CI cytosine inosine
  • the naphthyridine ring of (B) bound to the bulge formed between the nucleic acid to be evaluated and the wild type probe or the mutant type probe is used. Fluorescence based on the containing compound can be detected.
  • guanine When guanine is present at the position of the single nucleotide polymorphism, cytosine is adjacent to guanine, and ( ⁇ ') force (TA), cytosine bulge is replaced with guanine and YY' base at the position of single nucleotide polymorphism. Design the probe so that it is located between the pair and avoid fluorescence quenching by adjacent guanine bases.
  • guanine is present at the position of single nucleotide polymorphism, cytosine is adjacent to guanine, and ( ⁇ ') is (GC), cytosine bulge is placed 5' to the guanine at the position of single nucleotide polymorphism.
  • single nucleotide polymorphisms can be evaluated based on the behavior of fluorescence or quenching depending on the type of base pair at the site where these single nucleotide polymorphisms exist.
  • the length of the nucleic acid probe is 15 nucleotide residues or more, preferably 20 nucleotides, from the viewpoint of exerting sufficient stability and high stability and sequence specificity to bulge DNA. It is greater than or equal to a rhotide residue, less than or equal to 40 nucleotide residues, and preferably 30 nucleotide residues.
  • (Ii) and (C) are preferably (C) Z (A) [molar ratio] from 1Z5 to 1 from the viewpoint of sufficiently forming a double strand and obtaining sufficient fluorescence intensity.
  • Z (B) (molar ratio) is 1Z100 to 1Z20, more preferably (C) Z (A) (molar ratio) is 1Z12 to 1, and (C) Z (B) (molar ratio) ] Is 1/50 Desirable to mix, to be ⁇ 1Z30.
  • the pH conditions during the mixing include detection of a signal of a compound capable of recognizing a bulge base such as a compound containing a naphthyridine ring, shift of the absorption maximum wavelength based on the binding of the compound to the bulge, fluorescence intensity, etc.
  • the pH is preferably 5 or more, more preferably 6 or more, and even more preferably 6.5 or more, and a compound containing a naphthyridine ring and a bulge base
  • the pH is preferably 9 or less, more preferably 8 or less, and even more preferably 7.5 or less.
  • a phosphate buffer for example, a tris-HCl buffer, or the like can be used.
  • the mixture of the nucleic acid probe (A), the compound (B) containing a naphthyridine ring, and the nucleic acid to be evaluated for single nucleotide polymorphism (C) is as follows.
  • the nucleic acid probe of (A) and the nucleic acid to be evaluated for single nucleotide polymorphism of (C) are mixed to form a bulge structure, and then the compound containing the naphthyridine ring of (B) is further mixed.
  • the nucleic acid probe (A), the compound (B) containing a naphthyridine ring, and the nucleic acid to be evaluated for single nucleotide polymorphism (C) may be mixed at the same time.
  • Fluorescence intensity based on a compound containing a naphthyridine ring bonded to a nolesi base is sufficiently different from that derived from a compound derived from a compound containing a naphthyridine ring in (B) above.
  • the fluorescence intensity is preferably 400 to 480 nm, more preferably around 430 nm.
  • the present invention relates to a kit for use in the method for detecting a single nucleotide polymorphism in the nucleic acid of the present invention.
  • the kit of the present invention comprises the nucleic acid probe and the compound containing the naphthyridine ring. Since the kit of the present invention contains the nucleic acid probe and the compound containing the naphthyridine ring, the detection method of the present invention can be performed efficiently and simply at low cost, and a single base in the nucleic acid can be obtained. Demonstrates the excellent effect that polymorphisms can be detected with high sensitivity and efficiency by simple operation at low cost.
  • the kit of the present invention comprises nucleotides adjacent to the position of the single nucleotide polymorphism to be evaluated.
  • the type of nucleic acid probe can be appropriately selected according to the base sequence around the position where the single nucleotide polymorphism exists.
  • the nucleotide adjacent to the position of the single nucleotide polymorphism to be evaluated is a cytosine residue
  • the nucleotide adjacent to the position of the single nucleotide polymorphism to be evaluated is a nucleotide residue other than cytosine in combination with a nucleic acid probe
  • the nucleic acid probe of I) or ⁇ specifically, the nucleic acid probe of
  • the kit of the present invention appropriately contains a reagent for stably holding the nucleic acid probe, for example, a reagent for stably holding the compound containing the naphthyridine ring, such as a buffer solution. It may be.
  • the kit of the present invention provides a detection method of the present invention using all suitable reagents for performing a detection method such as an appropriate nucleic acid probe, a compound containing the naphthyridine ring, and other necessary reagents.
  • Nucleic acid probes, compounds containing a naphthyridine ring, other necessary reagents, etc. which may be provided in a single container containing a volume and container or form suitable for conducting, are provided in separate containers. It may be a form.
  • such a kit may contain instructions describing the procedures for performing the detection method of the present invention using the components contained in the kit.
  • 2,7-diamino-1,8-naphthyridine has an absorption maximum at pH 7.0 due to the binding with cytosine bulge.
  • the wavelength at which the fluorescence intensity reaches its maximum is shifted from 398 nm force by 430 nm to 32 nm.
  • nucleic acid forming bulge can be detected by 2,7-diamino-1,8-naphthyridine.
  • detection can be performed efficiently under neutral conditions.
  • 2,7-diamino-1,8-naphthyridine (10 / z M) represented by the above formula (I) is converted into a complete duplex (30 ⁇ ), adenine bulge, thymine bulge, cytosine bulge or guanine bulge.
  • duplex (30 mm)
  • it is mixed with 10 mM sodium phosphate buffer with pH 7.0, and the absorption intensity at wavelengths of 300 nm to 450 nm and the fluorescence intensity at wavelengths of 350 nm to 500 nm are measured under the trade name: RF— It was measured with 5300PC (manufactured by Shimadzu Corporation). The results are shown in Figure 3.
  • T—AZACT, T—AZACG, T—CZACI, T_C / A CT or T—C / ACG duplex was used.
  • Complementary T-probes (T probe) containing A allele and C allele (SEQ ID NO: 4) and one extra cytosine residue at the 3 'end of the single nucleotide polymorphism site ) Hybridization with (SEQ ID NO: 2) and G probe (Gprobe) (SEQ ID NO: 3) generates four duplexes containing cytosine bulges as shown in the left panel of FIG. I let you. Forces adjacent to cytosine bulgeka Watson Crick base pair (T—AZACT and T_C / ACG) in two of these four duplexes. (T-AZACG and T-CZA CT, respectively).
  • the relative fluorescence intensity of the A allele duplex at 424 nm determined by the peak height was about 5.5 times the relative fluorescence intensity of the C allele duplex.
  • the AG mismatch base pair in T—AZACG fluoresces the 2,7 diamino-1,8 naphthyridine bound to the adjacent cytosine bulge. It was not extinguished.
  • Absorbance measurements also revealed that 2,7-diamino-1,8-naphthyridine force T — did not bind to cytosine bulge adjacent to the CT mismatch in CZACT!
  • Each duplex comprising a combination of two single nucleotide polymorphism alleles and two probes that are complementary to the alleles and contain a noreji base adjacent to the position corresponding to the single nucleotide polymorphism site.
  • Add 2,7-diamino-1,8-naphthyridine to the rex bind it to the bulge structure, measure fluorescence by excitation at 394 nm, and change the fluorescence intensity between each duplex. It was suggested that the base can be determined.
  • N and N are independently any of T, A, C or G, and these four bases can be considered.
  • an oligonucleotide containing N is referred to as an N allele.
  • N is A
  • N is referred to as an A allele.
  • a leotide is called an N probe; for example, when N is A, it is called an A probe.
  • Each duplex is called an N probe; for example, when N is A, it is called an A probe.
  • Example 3 From Table 1, as in Example 3, the A allele duplex shows strong fluorescence overall. . In contrast, the G allele duplex detected only fluorescence below the background signal, and the differential fluorescence intensity was negative.
  • a single nucleotide polymorphism in a nucleic acid can be detected with low sensitivity and high sensitivity by a simple operation. Therefore, inexpensive, simple and highly sensitive gene diagnosis, gene analysis, and the like are possible.
  • SEQ ID NO: 1 is the sequence of a synthetic DNA (A allele).
  • SEQ ID NO: 2 is the sequence of a synthetic DNA (T probe).
  • SEQ ID NO: 3 is the sequence of a synthetic DNA (G probe).
  • SEQ ID NO: 4 is the sequence of a synthetic DNA (C allele).
  • SEQ ID NO: 5 is the sequence of a synthetic DNA (I probe). Base number: n in 5 is inosine.
  • SEQ ID NO: 6 is the sequence of a synthetic DNA (N allele).
  • N in the base number: 9 is adenine, cytosine, guanine, or thymine.
  • SEQ ID NO: 7 is the sequence of a synthetic DNA (N probe). Base number: 10 n, Ade

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Abstract

　本発明は、（Ａ）Ｉ）少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能であって、前記一塩基多型に対合する位置の５’若しくは３’末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加された塩基配列を有する核酸プローブ、又はＩＩ）少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能であって、前記アンチセンス鎖上の一塩基多型に対合する位置の５’若しくは３’末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加された塩基配列を有する核酸プローブ、と、（Ｂ）バルジ塩基認識可能な化合物と、（Ｃ）前記評価対象核酸と、を混合し、前記核酸プローブと評価対象核酸とがハイブリダイズした際に形成されるシトシンバルジ又はチミンバルジを認識する前記（Ｂ）の化合物に基づくシグナルを検出し、前記一塩基多型を評価することを特徴とする一塩基多型の検出方法、並びにそのキットを提供する。

Description

明 細 書
一塩基多型の検出方法
技術分野
[0001] 本発明は、標的となる核酸中の一塩基多型を検出する方法及びそのキットに関す る。さらに詳しくは、標的となる核酸中の一塩基多型を、簡便に、高感度に検出する 方法及びそのキットに関する。
背景技術
[0002] 一塩基多型（SNPs)は、ゲノム DNA上に存在する個体間の違いであり、ヒト等にお ける種々の疾患や種々の表現形質の違いを生じうる。したがって、力かる SNPsは、 遺伝子疾患の解析、個体間の識別等に利用されている。
[0003] 前記 SNPsの検出は、例えば、電気泳動における移動度の違い、プライマー伸長、 蛍光物質、放射性物質等の標識物質により標識されたプローブを用いたノ、イブリダ ィゼーシヨン、 PCRによる増幅等に基づくタイピング等による検出方法等により行なわ れている。
[0004] 前記検出方法としては、具体的には、例えば、分析対象 DNA断片と基準 DNA断 片とについて、多型による二次構造の差異の拡大を指標として電気泳動における断 片の分離が大きくなる温度条件下に、ヘテロ接合型の基準 DNA断片と、分析対象 D NA断片とを、同一のキヤビラリで同時に、電気泳動分離し、前記基準 DNA断片によ りピークの補正を行な 1ヽ、分析対象 DNA断片のへテロ接合性の消失の有無を調べ る、検出方法 (特許文献 1)；試料中に含まれる特定の一塩基多型部位を含む染色体 又はその断片に、野生型用プライマー及び 1種又は 2種の変異型用プライマーを同 時に又は別々に、 DNAポリメラーゼと共に作用させ、プライマーに基づく伸長の有無 を調べる、検出方法 (特許文献 2)；解析対象のゲノム DNAと複数対のプライマーとを 用いて、少なくとも 1つの一塩基多型部位を含む複数の塩基配列を増幅し、タイピン グを行なう、検出方法 (特許文献 3)；—塩基多型部位を含む基準配列用及び変異配 列用の 2種の特異的プライマーとユニバーサルプライマーとを用いて、目的配列部分 を増幅し、得られた反応液を電気泳動し、増幅産物の有無を調べる、検出方法 (特 許文献 4)；生物学的試料と、標的核酸の領域が変更のない場合に該領域に連続的 にハイブリダィズする複数の一本鎖ペプチド核酸とを接触させ、ついで、ミスマッチ核 酸 (一本鎖核酸)を分解する薬剤を添加し、その後、分解産物の存在を調べる、検出 方法 (特許文献 5)等が挙げられる。
[0005] し力しながら、前記特許文献に記載の手法によれば、電気泳動における温度条件 の検討、電気泳動、ピークの補正、 DNAポリメラーゼ反応の条件の検討、伸長の有 無の検出のための条件の設定、増幅反応条件の検討、タイピングのための条件の検 討、増幅反応条件の検討、増幅産物の有無の検出等の複数の複雑な手順を組み合 わせて行なわれるため、操作が煩雑であり、時間を要するという欠点がある。
特許文献 1：特開 2002— 78500号公報
特許文献 2：国際公開第 01Z042498号パンフレット
特許文献 3：特開 2002— 300894
特許文献 4:特開 2003— 52372
特許文献 5：特表 2004— 521630
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明の 1つの側面は、核酸中の一塩基多型を高感度に検出すること、標識物質 による標識の工程を行なうことなぐ簡便に核酸中の一塩基多型を検出すること、低 コストで核酸中の一塩基多型を検出すること等の少なくとも 1つを可能にする、核酸 中の一塩基多型の検出方法を提供することにある。また、本発明の他の側面は、前 記検出方法を効率よく簡便に低コストで行なうこと等を可能にする、キットを提供する ことにある。なお、本発明の他の課題は、本明細書の記載等力も導かれうる。
課題を解決するための手段
[0007] すなわち、本発明の要旨は、
〔1〕 （A) I)少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸に対し相補的にハイ ブリダィズ可能であって、前記一塩基多型に対合する位置の 5 '若しくは 3，末端側に 隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加された塩基配列を有する核酸 プローブ、又は II)少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補 的にハイブリダィズ可能であって、前記アンチセンス鎖上の一塩基多型に対合する 位置の 5 '若しくは 3 '末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付 加された塩基配列を有する核酸プローブ、
と、
(B)バルジ塩基認識可能な化合物と、
(C)前記評価対象核酸と、
を混合し、
前記核酸プローブと評価対象核酸とがハイブリダィズした際に形成されるシトシンパ ルジ又はチミンバルジを認識する前記 (B)の化合物に基づくシグナルを検出し、 前記一塩基多型を評価することを特徴とする一塩基多型の検出方法、
〔2〕 下記 1)〜4)：
1)前記一塩基多型存在位置に野生型ヌクレオチドを含む野生型評価対象核酸と、 該野生型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダィズ可能である核酸プローブとの 間に形成されたバルジ、
2)前記一塩基多型存在位置に変異型ヌクレオチドを含む変異型評価対象核酸と、 該変異型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダィズ可能である核酸プローブとの 間に形成されたバルジ、
3)前記野生型評価対象核酸と、前記変異型評価対象核酸に対し相補的にハイプリ ダイズ可能である核酸プローブとの間に形成されたバルジ、及び
4)前記変異型評価対象核酸と、前記野生型評価対象核酸に対し相補的にハイプリ ダイズ可能である核酸プローブとの間に形成されたバルジ、
のそれぞれに結合した前記 (B)のバルジ塩基を認識可能な化合物に基づくシグナ ルの変動に基づき、評価対象核酸における一塩基多型を同定する、前記〔1〕記載の 検出方法、
〔3〕 前記化合物が、ナフチリジン環を有する前記〔1〕又は〔2〕記載の検出方法、 〔4〕 前記シグナルが蛍光である前記〔1〕〜〔3〕 V、ずれか 1項に記載の検出方法、 [5] 前記化合物が、 2, 7—ジァミノナフチリジン誘導体ィ匕合物である、前記〔1〕〜〔 4〕いずれか 1項に記載の検出方法、
〔6〕 前記 2, 7—ジァミノナフチリジン誘導体ィ匕合物が、下記式 (Π)：
[化 1]
Η9Ν' 、Ν 'Ν Ν 'Ν' ΝΗ,
Η Η (I I)
に示される 2, 7—ジアミノー 1, 8—ナフチリジンである、前記〔5〕記載の検出方法、 〔7〕 前記 (Α)の核酸プローブが、
i)少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダィズ 可能であって、前記一塩基多型に対合する位置の 5 '若しくは 3 '末端側に隣接した 位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加され、かつ該シトシン残基若しくはチミ ン残基に隣接して存在するグァニン残基の少なくとも 1がイノシン残基にさらに置換さ れた塩基配列を含有した核酸プローブ、又は
ii)少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的 にハイブリダィズ可能であって、前記アンチセンス鎖上の一塩基多型に対合する位 置の 5 '若しくは 3，末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加さ れ、かつ該シトシン残基若しくはチミン残基に隣接して存在するグァニン残基の少な くとも 1がイノシン残基にさらに置換された塩基配列を有する核酸プローブ、 である、前記〔1〕〜〔6〕 V、ずれか 1項に記載の検出方法、
〔8〕 Γ )少なくとも一つの一塩基多型を含み、該ー塩基多型存在位置に野生型ヌク レオチドを含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダィズ可能であって、前記一 塩基多型に対合する位置の 5 '若しくは 3 '末端側に隣接した位置にシトシン残基若し くはチミン残基が付加された塩基配列を有する核酸プローブ、及び Z又は
ΙΓ )少なくとも一つの一塩基多型を含み、該ー塩基多型存在位置に野生型ヌクレオ チドを含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にノ、イブリダィズ可能であ つて、前記アンチセンス鎖上の一塩基多型に対合する位置の 5 '若しくは 3 '末端側 に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加された塩基配列を有する核 酸プローブ、
と、
Γ ' )少なくとも一つの一塩基多型を含み、該ー塩基多型存在位置に変異型ヌクレオ チドを含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダィズ可能であって、前記一塩基 多型に対合する位置の 5 '若しくは 3 '末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくは チミン残基が付加された塩基配列を有する核酸プローブ、及び Z又は
ΙΓ ' )少なくとも一つの一塩基多型を含み、該ー塩基多型存在位置に変異型ヌクレ ォチドを含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダィズ可能で あって、前記アンチセンス鎖上の一塩基多型に対合する位置の 5 '若しくは 3 '末端側 に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加された塩基配列を有する核 酸プローブ、
と、
バルジ塩基を認識可能な化合物と、
を含有してなる、前記〔1〕〜〔7〕 V、ずれか 1項に記載の核酸中の一塩基多型の検出 方法に用いるためのキット、並びに
〔9〕 i' )少なくとも一つの一塩基多型を含み、該ー塩基多型存在位置に野生型ヌク レオチドを含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダィズ可能であって、前記一 塩基多型に対合する位置の 5 '若しくは 3 '末端側に隣接した位置にシトシン残基若し くはチミン残基が付加され、かつ該シトシン残基若しくはチミン残基に隣接して存在 するグァニン残基の少なくとも 1がイノシン残基に置換された塩基配列を有する核酸 プローブ、
ii' )少なくとも一つの一塩基多型を含み、該ー塩基多型存在位置に野生型ヌクレオ チドを含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にノ、イブリダィズ可能であ つて、前記アンチセンス鎖上の一塩基多型に対合する位置の 5 '若しくは 3 '末端側 に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加され、かつ該シトシン残基 若しくはチミン残基に隣接して存在するグァニン残基の少なくとも 1がイノシン残基に さらに置換された塩基配列を有する核酸プローブ、
と、
）少なくとも一つの一塩基多型を含み、該ー塩基多型存在位置に変異型ヌクレオ チドを含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダィズ可能であって、前記一塩基 多型に対合する位置の 5 '若しくは 3 '末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくは チミン残基が付加され、かつ該シトシン残基若しくはチミン残基に隣接して存在する グァニン残基の少なくとも 1がイノシン残基に置換された塩基配列を有する核酸プロ ーブ、
i ）少なくとも一つの一塩基多型を含み、該ー塩基多型存在位置に変異型ヌクレオ チドを含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にノ、イブリダィズ可能であ つて、前記アンチセンス鎖上の一塩基多型に対合する位置の 5 '若しくは 3 '末端側 に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加され、かつ該シトシン残基 若しくはチミン残基に隣接して存在するグァニン残基の少なくとも 1がイノシン残基に さらに置換された塩基配列を有する核酸プローブ、
と、
バルジ塩基を認識可能な化合物と
を含有してなる、前記〔8〕記載の核酸中の一塩基多型の検出方法に用いるためのキ ッ卜、
に関する。
発明の効果
[0010] 本発明の検出方法によれば、核酸中の一塩基多型を、標識物質による標識等の複 雑な工程を組み合わせて行なうことなぐ低コストで、簡便に、高感度に検出すること ができるという優れた効果を奏する。また、本発明のキットによれば、前記検出方法を 効率よく簡便に低コストで行なうことができるという優れた効果を奏する。
図面の簡単な説明
[0011] [図 1]図 1は、標的対象核酸に対する核酸プローブの使用例の 1例を示す模式図で ある。図中、下線を付した太字は、評価対象となる一塩基多型の位置を示す。また、 黒丸は、 2, 7—ジアミノー 1, 8—ナフチリジンを示す。 [0012] [図 2]図 2は、種々の条件下における 10 /z M 2, 7—ジァミノ一 1, 8—ナフチリジンの 吸光スペクトル及び蛍光スペクトルを示す図である。図中、左パネルは、 300nm〜4 50nmにおける吸光スペクトルを示す。また、右パネルは、 10 M 2, 7—ジアミノー 1, 8—ナフチリジンの蛍光スペクトルを示す。蛍光測定のための励起波長は、各吸 収スペクトルにおける吸収極大である。
[0013] [図 3]図 3は、アデニンバルジ、チミンバルジ、シトシンバルジ及びグァニンバルジに 結合した 10 /z M 2, 7—ジアミノー 1, 8—ナフチリジンの吸光スペクトル及び蛍光ス ベクトルを示す図である。図中、左パネルは、 300nm〜450nmにおける吸光スぺク トルを示す。また、右パネルは、 10 /z M 2, 7—ジアミノー 1, 8—ナフチリジンの蛍光 スペクトルを示す。蛍光測定のための励起波長は、各吸収スペクトルにおける吸収極 大である。
[0014] [図 4]図 4は、 Cアレル又は Aアレルの存在下におけるバルジに結合した 2, 7—ジアミ ノー 1, 8—ナフチリジンの蛍光に基づく蛍光スペクトルを示す。図 4中、 A alleleは、 配列番号： 1に示される塩基配列を含有した核酸、 T probeは、配列番号： 2に示さ れる塩基配列を含有した核酸、 G probeは、配列番号： 3に示される塩基配列を含 有した核酸、 C alleleは、配列番号: 4に示される塩基配列を含有した核酸、 I prob eは、配列番号： 5に示される塩基配列を含有した核酸を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0015] 本発明は、 1つの側面では、核酸中の一塩基多型の検出方法に関する。本発明の 検出方法は、具体的には、（A) I)少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸 に対し相補的にハイブリダィズ可能であって、前記一塩基多型に対合する位置の 5' 若しくは 3 '末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加された塩 基配列を有する核酸プローブ、又は
II)少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補 的にハイブリダィズ可能であって、前記アンチセンス鎖上の一塩基多型に対合する 位置の 5 '若しくは 3 '末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付 加された塩基配列を有する核酸プローブ、
と、 (B)バルジ塩基認識可能な化合物と、
(C)前記評価対象核酸と、
を混合し、
前記核酸プローブと評価対象核酸とがハイブリダィズした際に形成されるシトシンパ ルジ又はチミンバルジを認識する前記 (B)の化合物に基づくシグナルを検出し、 前記一塩基多型を評価することを特徴とする方法である。
[0016] 本発明は、ナフチリジン環を含む化合物が、ノ レジ構造に特異的に結合することに より、結合前の吸収極大の波長力 シフトし、バルジ塩基に隣接するヌクレオチドによ り形成される塩基対の種類により蛍光強度が変動するという本発明者らの驚くべき知 見に基づく。本発明者らは、一塩基多型を有する核酸に対し相補的にハイブリダィズ 可能であり、一塩基多型に対合する位置に隣接してバルジ塩基を含むプローブと前 記一塩基多型を有する核酸とをハイブリダィズさせることによりバルジ構造を含むデ ュプレックスを形成させ、次!、でナフチリジン環を含む化合物をバルジ塩基と結合さ せて蛍光を測定し、一塩基多型が存在する位置のヌクレオチドが異なることに起因す る蛍光強度の変動から一塩基多型を検出できることを見出した。
[0017] 本明細書において、「塩基」とは、特に断りのない限り、デォキシリボヌクレオチドを いう。したがって、本明細書において、「シトシン」（C)、「チミン」（T)、「アデニン」 (Α) 及び「グァニン」 (G)は、特に断りのない限り、それぞれのデォキシリボヌクレオチド、 すなわち、それぞれ、「2'—デォキシシチジン」「2'—デォキシチミジン」、「2'—デォ キシアデノシン」及び「2 '—デォキシグアノシン」を意味する。
[0018] また、本明細書において、「少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸」と は、少なくとも一つ、より具体的には、 1〜5個の一塩基多型が存在することが確認さ れている核酸であって、特に断りのない限り、一塩基多型の位置に存在するヌクレオ チドは、野生型ヌクレオチド及び変異型ヌクレオチドのいずれをも含む。さらに、本明 細書において、「一塩基多型存在位置の野生型ヌクレオチド」とは、一塩基多型が確 認されている部位のヌクレオチドであって、いわゆる正常型の塩基配列中の力かる部 位のヌクレオチドをいい、「一塩基多型存在位置の変異型ヌクレオチド」とは、一塩基 多型が確認されて 、る部位のヌクレオチドであって、 、わゆる変異型の塩基配列中 の力かる部位のヌクレオチドを！、う。
[0019] さらに、本明細書において、「バルジ塩基」とは、二本鎖 DNA中の不対塩基を意味 し、例えば、「バルジシトシン」又は「バルジチミン」とは、それぞれ、二本鎖 DNA中の 一方の一本鎖 DNAに対して、余剰となるシトシン又はチミンであり、塩基対を形成し ないものをいう。力かるバルジ塩基によるノ レジ構造は、人為的には、例えば、特定 の塩基配列力 なる一本鎖 DNAと、該塩基配列において、任意の位置に 1つの余 剰ヌクレオチドをさらに含む塩基配列からなる一本鎖 DNAとをノ、イブリダィゼーショ ンさせたときに、バルジ構造を含むデュプレックスとして生じさせうる。本発明におい ては、一塩基多型に対合する位置の 5'若しくは 3'末端側に隣接した位置に付加さ れたシトシン残基若しくはチミン残基が、前記バルジ塩基に該当する。
[0020] また、「シトシンバルジ」又は「チミンバルジ」は、対応する一本鎖 DNAに対して、 1 つのシトシン又はチミンの余剰により生じるバルジを意味する。
[0021] 本明細書にお!、て、「バルジ塩基を認識可能な化合物」とは、例えばデュプレックス 中に存在するバルジ塩基と水素結合を形成することによって、バルジ塩基を有する デュプレックスを安定ィ匕させる化合物を意味し、具体的には、ナフチリジン環を有する 化合物、 2, 6—ジァミノピリジン、及びキサンチンなどが挙げられる。中でも、検出及 び評価の容易さから、シグナルとして蛍光を発するナフチリジン環を有する化合物が 好ましい。
[0022] 本発明の検出方法は、バルジ塩基を認識可能な化合物としてナフチリジン環を有 する化合物を用いることにより、蛍光物質等の標識物質を用いることなぐ一塩基多 型を検出することができるという優れた効果を発揮する。そのため、本発明の検出方 法では、伸長反応、増幅反応、酵素反応 (例えば、前記伸長反応、増幅反応、ミスマ ツチ核酸の分解反応等)条件の検討、電気泳動条件の検討、標識物質による標識等 の複雑な工程を行なうことなぐ簡便に、一塩基多型を検出することができる。さらに、 前記ナフチリジン環を含む化合物は、ノ レジに特異的に結合するため、ノ ックグラウ ンドシグナルレベルを低減させ、高感度での一塩基多型の検出が可能になる。
[0023] 前記ナフチリジン環を含む化合物は、バルジへの結合により、該ナフチリジン環を 含む化合物の吸収極大を示す波長が、シフトし、かつ該バルジ塩基に隣接するヌク レオチド残基と対をなすヌクレオチド残基の種類 (すなわち、アレル）に応じて、蛍光 強度が変動する。したがって、力かる吸収極大を示す波長のシフトにより、バルジへ の結合を評価でき、蛍光強度の変動により、一塩基多型を評価できる。
[0024] 前記ナフチリジン環を含む化合物としては、下記 (I)：
[0025] [化 2]
Figure imgf000011_0001
[0026] (式中、 R1及び R2は、それぞれ独立して、第 1級ァミン残基、第 2級ァミン残基又は第 3級ァミン残基を示す）
に示される 2, 7—ジァミノナフチリジン誘導体ィ匕合物等が挙げられる。前記第 1級アミ ン残基としては、 -NH基が挙げられる。また、前記第 2級ァミン残基としては、例えば
2
、— NH(CH ) NH基、— NH(CH ) NH基、— NH(CH ) NH(CH )基等が挙げられる。さら
2 3 2 2 2 2 2 2 3
に、前記第 3級ァミン残基としては、例えば、 -N(CH )(CH ) NH基等が挙げられる。
3 2 2 2
本発明においては、バルジ塩基との水素結合形成の観点から、好ましくは、第 2級ァ ミン残基であることが望ましぐより好ましくは、前記 R1及び R2の両方が、第 2級ァミン 残基であることが望ましい。
[0027] 前記 2, 7—ジァミノナフチリジン誘導体ィ匕合物としては、具体的には、例えば、下 記式 (Π)：
[0028] [化 3]
Figure imgf000011_0002
(I D [0029] に示される 2, 7—ジアミノー 1, 8—ナフチリジンが挙げられる。前記 2, 7—ジアミノー 1, 8—ナフチリジンは、例えば、特開 2004— 262827号公報に記載の方法により合 成されうる。前記 2, 7—ジァミノ— 1, 8—ナフチリジンは、 10mM リン酸ナトリウム緩 衝液（pH7. 0)の条件下、単独では、吸収極大が、 376nmで見られ、シトシンバルジ との結合〖こより、 396nm〖こ 20nmシフトし、蛍光強度の極大値を示す波長が、 398η mから 430nmに約 32nmシフトする。
[0030] なお、本発明においては、前記 2, 7—ジアミノー 1, 8—ナフチリジンと同等の性質 、すなわち、例えば、蛍光を生じ、バルジへの結合能を有し、かつバルジとの結合に より吸収極大波長がシフトするとともに、アレルにより蛍光強度が変化する性質を示す ものであれば、前記 2, 7—ジアミノー 1, 8—ナフチリジンの誘導体ィ匕合物であっても よい。力かる誘導体ィ匕合物の例としては、下記式 (ΠΙ)：
[0031] [化 4]
Figure imgf000012_0001
[0032] 〔式中、 R3及び R4は、それぞれ独立して、水素原子又はアミノ基であり、 1、 m及び nは
、それぞれ独立して 1〜6の自然数を示す〕に示される化合物、下記式 (IV) :
[0033] [化 5]
Figure imgf000012_0002
(IV) [0034] 〔式中、 R5及び R6は、それぞれ独立して、水素原子又はアミノ基であり、 o及び pは、 それぞれ独立して 1〜6の自然数を示す〕
に示される化合物等が挙げられる。
[0035] 前記式 (III)に示される化合物にぉ 、て、前記 R3及び R4は、それぞれ独立して、水 素原子又はアミノ基であり、蛍光を生じ、バルジへの結合能を有し、かつバルジとの 結合により吸収極大波長がシフトするとともに、アレルにより蛍光強度が変化する性 質を十分に発揮させる観点から、好ましくは、一方がアミノ基であることが望ましい。ま た、前記 m及び nは、それぞれ独立して 1〜6の自然数である。蛍光を生じ、バルジ への結合能を有し、かつバルジとの結合により吸収極大波長がシフトするとともに、ァ レルにより蛍光強度が変化する性質を十分に発揮させる観点から、前記 1が、好ましく は、 2以上、より好ましくは、 3以上であり、好ましくは、 6以下、より好ましくは、 5以下、 さらに好ましくは、 4以下であることが望ましぐ具体的には、好ましくは、 2〜6であり、 より好ましくは、 3〜5であり、さらに好ましくは、 3〜4であることが望ましい。また、前記 と同様の観点から、前記 mが、好ましくは、 2以上、より好ましくは、 3以上であり、好ま しくは、 6以下、より好ましくは、 5以下、さらに好ましくは、 4以下であることが望ましぐ 具体的には、好ましくは、 2〜6であり、より好ましくは、 3〜5であり、さらに好ましくは、 3〜4であることが望ましい。さらに、前記と同様の観点から、前記 nが、好ましくは、 2 以上、より好ましくは、 3以上であり、好ましくは、 6以下、より好ましくは、 5以下、さらに 好ましくは、 4以下であることが望ましぐ具体的には、好ましくは、 2〜6であり、より好 ましくは、 3〜5であり、さらに好ましくは、 3〜4であることが望ましい。
[0036] また、前記式 (IV)に示される化合物にぉ 、て、前記 R5及び R6は、それぞれ独立し て、水素原子又はアミノ基であり、蛍光を生じ、バルジへの結合能を有し、かつバル ジとの結合により吸収極大波長がシフトするとともに、アレルにより蛍光強度が変化す る性質を十分に発揮させる観点から、好ましくは、少なくとも一方がアミノ基であること が望ましい。また、前記 o及び pは、それぞれ独立して 1〜6の自然数である。蛍光を 生じ、ノ レジへの結合能を有し、かつバルジとの結合により吸収極大波長がシフトす るとともに、アレルにより蛍光強度が変化する性質を十分に発揮させる観点から、前 記 oが、好ましくは、 2以上、より好ましくは、 3以上であり、好ましくは、 6以下、より好ま しくは、 5以下、さらに好ましくは、 4以下であることが望ましぐ具体的には、好ましく は、 2〜6であり、より好ましくは、 3〜5であり、さらに好ましくは、 3〜4であることが望 ましい。また、前記同様の観点から、前記 pが、好ましくは、 2以上、より好ましくは、 3 以上であり、好ましくは、 6以下、より好ましくは、 5以下、さらに好ましくは、 4以下であ ることが望ましぐ具体的には、好ましくは、 2〜6であり、より好ましくは、 3〜5であり、 さらに好ましくは、 3〜4であることが望ましい。
[0037] 本発明の核酸プローブが、少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸又は 該評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダィズする際のハイブリダ ィゼーシヨンは、 ImM〜： LM、好ましくは 10〜100mMの塩化ナトリウムを含む pH5 〜8、好ましくは pH6〜7の緩衝溶液、好ましくはリン酸緩衝液中で行うことが望まし い。
[0038] 本発明の前記 I)の核酸プローブの一つの態様は、一塩基多型を含む評価対象核 酸のアンチセンス鎖に相当する塩基配列を有し、評価対象核酸中の一塩基多型の 部位に存在するヌクレオチドと塩基対形成するヌクレオチドに隣接した位置にシトシ ン残基またはチミン残基が付加された核酸であり、前記 Π)の核酸プローブの一つの 態様は、 I)の核酸プローブに対して相補的な塩基配列、すなわち、一塩基多型を含 む評価対象核酸のセンス鎖に相当する塩基配列を有し、一塩基多型の部位に存在 するヌクレオチドに隣接した位置にシトシン残基またはチミン残基が付加された核酸 である。従って、前記 I)又は Π)のプローブの一つの態様は、 I)一塩基多型の存在す るヌクレオチドを含む連続した塩基配列のアンチセンス鎖に相当する塩基配列であり 、前記一塩基多型存在位置に対応する該アンチセンス鎖上の位置の 5 '若しくは 3 ' 末端側に隣接してシトシン残基若しくはチミン残基が付加された塩基配列を含有した 核酸プローブ、又は
II)一塩基多型の存在するヌクレオチドを含む連続した塩基配列に相当する塩基配 列であり、前記一塩基多型存在位置に対応する位置の 5，若しくは 3，末端側に隣接 してシトシン残基若しくはチミン残基が付加された塩基配列を含有した核酸プローブ 、と言い換えることもできる。
[0039] 本発明に用いられる核酸プローブとしては、一塩基多型の存在位置に野生型ヌク レオチドを含む核酸プローブ及び一塩基多型の存在位置に変異型ヌクレオチドを含 む核酸プローブが挙げられる。
[0040] 本発明の検出方法は、用いられる核酸プローブが、標的核酸中の一塩基多型に対 合する位置の 5，若しくは 3，末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残 基が付加された塩基配列を含有している点にも 1つの大きな特徴がある。したがって 、本発明の検出方法においては、前記核酸プローブが、一塩基多型の評価対象核 酸とハイブリダィゼーシヨンすることにより、前記ナフチリジン環を含む化合物が認識 し、結合するバルジ構造を生じるため、前記ナフチリジン環を含む化合物のシトシン バルジ又はチミンバルジ特異的な結合を導くことができ、ノ ックグラウンドシグナルレ ベルを低減させ、高感度での検出が可能になる。ここで、 5'若しくは 3'末端側に隣 接して付加されたシトシン残基若しくはチミン残基は、前記「バルジ塩基」に該当する 。ノ レジ構造は、一塩基多型の評価対象核酸と核酸プローブとをハイブリダィゼーシ ヨンさせたときに、核酸プローブがバルジ塩基を有することにより生じる。ナフチリジン 環を含む化合物は、バルジ塩基と水素結合を形成することよって、バルジ構造を認 識し、結合する。
[0041] なお、前記核酸プローブにお!/、て、バルジ塩基に隣接する塩基力 グァニンである 場合、前記バルジ塩基を認識可能な化合物に基づくシグナルの消光を抑制する観 点から、 i)少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸に対し相補的にハイプリ ダイズ可能であって、前記一塩基多型に対合する位置の 5'若しくは 3'末端側に隣 接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加され、かつ該シトシン残基若しく はチミン残基に隣接して存在するグァニン残基の少なくとも 1がイノシン残基にさらに 置換された塩基配列を含有した核酸プローブ、又は
ii)少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的 にハイブリダィズ可能であって、前記アンチセンス鎖上の一塩基多型に対合する位 置の 5 '若しくは 3，末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加さ れ、かつ該シトシン残基若しくはチミン残基に隣接して存在するグァニン残基の少な くとも 1がイノシン残基にさらに置換された塩基配列を有する核酸プローブ、 が好ましい。 [0042] 前記 i)又は ii)の核酸プローブの一つの態様は、 i)一塩基多型の存在するヌクレオ チドを含む連続した塩基配列のアンチセンス鎖に相当する塩基配列であり、前記一 塩基多型存在位置に対応する該アンチセンス鎖上の位置の 5 '若しくは 3 '末端側に 隣接してシトシン残基若しくはチミン残基が付加され、かつ該シトシン残基若しくはチ ミン残基に隣接して存在するグァニン残基の少なくとも 1がイノシン残基にさらに置換 された塩基配列を含有した核酸プローブ、又は
ii)一塩基多型の存在するヌクレオチドを含む連続した塩基配列に相当する塩基配 列であり、前記一塩基多型存在位置に対応する位置の 5，若しくは 3，末端側に隣接 してシトシン残基若しくはチミン残基が付加され、かつ該シトシン残基若しくはチミン 残基に隣接して存在するグァニン残基の少なくとも 1がイノシン残基にさらに置換され た塩基配列を含有した核酸プローブ、
である。
[0043] すなわち、前記 i)及び ii)の核酸は、一塩基多型の存在位置に隣接する塩基が、シ トシンである場合に好適である。
[0044] したがって、本発明の検出方法では、評価対象となる一塩基多型の存在位置に隣 接するヌクレオチド、前記一塩基多型存在位置の周辺の塩基配列に応じて、適宜核 酸プローブの種類を選択することができる。
[0045] 前記「一塩基多型の存在位置に野生型ヌクレオチドを含む核酸プローブ」としては 、具体的には、 Γ)少なくとも一つの一塩基多型を含み、該ー塩基多型存在位置に 野生型ヌクレオチドを含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダィズ可能であつ て、前記一塩基多型に対合する位置の 5 '若しくは 3 '末端側に隣接した位置にシトシ ン残基若しくはチミン残基が付加された塩基配列を有する核酸プローブ、
ΙΓ )少なくとも一つの一塩基多型を含み、該ー塩基多型存在位置に野生型ヌクレオ チドを含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にノ、イブリダィズ可能であ つて、前記アンチセンス鎖上の一塩基多型に対合する位置の 5 '若しくは 3 '末端側 に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加された塩基配列を有する核 酸プローブ、
i')少なくとも一つの一塩基多型を含み、該ー塩基多型存在位置に野生型ヌクレオ チドを含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダィズ可能であって、前記一塩基 多型に対合する位置の 5 '若しくは 3 '末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくは チミン残基が付加され、かつ該シトシン残基若しくはチミン残基に隣接して存在する グァニン残基の少なくとも 1がイノシン残基に置換された塩基配列を有する核酸プロ ーブ、
ii' )少なくとも一つの一塩基多型を含み、該ー塩基多型存在位置に野生型ヌクレオ チドを含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にノ、イブリダィズ可能であ つて、前記アンチセンス鎖上の一塩基多型に対合する位置の 5 '若しくは 3 '末端側 に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加され、かつ該シトシン残基 若しくはチミン残基に隣接して存在するグァニン残基の少なくとも 1がイノシン残基に さらに置換された塩基配列を有する核酸プローブ、
等が挙げられる。
前記「一塩基多型の存在位置に変異型ヌクレオチドを含む核酸プローブ」としては 、具体的には、 Γ ' )少なくとも一つの一塩基多型を含み、該ー塩基多型存在位置に 変異型ヌクレオチドを含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダィズ可能であつ て、前記一塩基多型に対合する位置の 5 '若しくは 3 '末端側に隣接した位置にシトシ ン残基若しくはチミン残基が付加された塩基配列を有する核酸プローブ、
Π' ' )少なくとも一つの一塩基多型を含み、該ー塩基多型存在位置に変異型ヌクレ ォチドを含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダィズ可能で あって、前記アンチセンス鎖上の一塩基多型に対合する 5'若しくは 3'末端側に隣接 した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加された塩基配列を有する核酸プロ ーブ、
）少なくとも一つの一塩基多型を含み、該ー塩基多型存在位置に変異型ヌクレオ チドを含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダィズ可能であって、前記一塩基 多型に対合する位置の 5 '若しくは 3 '末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくは チミン残基が付加され、かつ該シトシン残基若しくはチミン残基に隣接して存在する グァニン残基の少なくとも 1がイノシン残基に置換された塩基配列を有する核酸プロ ーブ、 i ）少なくとも一つの一塩基多型を含み、該ー塩基多型存在位置に変異型ヌクレオ チドを含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にノ、イブリダィズ可能であ つて、前記アンチセンス鎖上の一塩基多型に対合する位置の 5 '若しくは 3 '末端側 に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加され、かつ該シトシン残基 若しくはチミン残基に隣接して存在するグァニン残基の少なくとも 1がイノシン残基に さらに置換された塩基配列を有する核酸プローブ、
等が挙げられる。
[0047] 本発明の検出方法においては、より具体的には、
1)前記一塩基多型存在位置に野生型ヌクレオチドを含む野生型評価対象核酸と、 該野生型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダィズ可能である核酸プローブとの 間に形成されたバルジ、
2)前記一塩基多型存在位置に変異型ヌクレオチドを含む変異型評価対象核酸と、 該変異型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダィズ可能である核酸プローブとの 間に形成されたバルジ、
3)前記野生型評価対象核酸と、前記変異型評価対象核酸に対し相補的にハイプリ ダイズ可能である核酸プローブとの間に形成されたバルジ、及び
4)前記変異型評価対象核酸と、前記野生型評価対象核酸に対し相補的にハイプリ ダイズ可能である核酸プローブとの間に形成されたバルジ、
のそれぞれに結合した前記 (B)のナフチリジン環を含む化合物に基づく前記シグナ ルの変動に基づき、評価対象核酸における一塩基多型を同定する。標的対象核酸 に対する前記核酸プローブの使用例の 1例を示す模式図を、図 1に示す。
[0048] 具体的には、例えば、評価対象核酸の一塩基多型の存在位置にお!、て、核酸プロ ーブとのグァニンーシトシン (GC)塩基対を形成している場合、評価対象核酸と、野 生型プローブ又は変異型プローブとの間に形成されたバルジに結合した前記 (B)の ナフチリジン環を含む化合物に基づく蛍光は消光し、アデ-ンーチミン (AT)塩基対 を形成している場合、評価対象核酸と、野生型プローブ又は変異型プローブとの間 に形成されたバルジに結合した前記 (B)のナフチリジン環を含む化合物に基づく蛍 光が検出されうる。ここで、一塩基多型の存在位置にアデニンが存在している場合に は、アデニン?チミン (AT)塩基対で強く蛍光が観測され、アデニン?アデニン (AA)ミ スマッチ塩基対では蛍光強度は半減する。一方、一塩基多型の存在位置にチミンが 存在している場合、チミン?アデニン (TA)塩基対で蛍光が観測され、チミン?チミン（ TT)塩基対では、蛍光は大幅に減少する。なお、一塩基多型の存在するヌクレオチ ド及び Z又はそれに隣接するヌクレオチドがシトシン残基である場合には、核酸プロ ーブの対応位置のグァニン残基をイノシン残基にかえて用いられる。ここで、シトシン イノシン (CI)塩基対を形成している場合には、評価対象核酸と、野生型プローブ 又は変異型プローブとの間に形成されたバルジに結合した前記 (B)のナフチリジン 環を含む化合物に基づく蛍光が検出されうる。一塩基多型の存在位置にグァニンが 存在し、グァニンにシトシンが隣接し、かつ (ΥΥ' )力 (TA)である場合には、シトシン バルジを一塩基多型の位置のグァニンと YY'塩基対の間に位置するようにプローブ を設計し、隣接するグァニン塩基による蛍光消光を避ける。一塩基多型の存在位置 にグァニンが存在し、グァニンにシトシンが隣接し、かつ (ΥΥ' )が（GC)である場合 には、シトシンバルジを一塩基多型の位置のグァニンの 5 '側もしくは 3，側に位置さ せても、グァニンが隣接するために蛍光消光を避けることが出来ない。この場合には 、反対側のストランドの一塩基多型位置に存在するシトシンを含むストランドのタイピ ングを検討する。したがって、本発明の検出方法によれば、これらの一塩基多型の存 在部位の塩基対の種類による蛍光又は消光の挙動を基に、一塩基多型の評価を行 なうことができる。
[0049] 前記核酸プローブの長さは、バルジ DNAにつ!/、て、十分な安定性及び高!、配列 特異性を十分に発揮させる観点から、 15ヌクレオチド残基以上、好ましくは、 20ヌク レオチド残基以上であり、 40ヌクレオチド残基以下であり、好ましくは、 30ヌクレオチ ド残基であることが望ましい。
[0050] 本発明の検出方法において、（Α)核酸プローブと、（Β)ナフチリジン環を含む化合 物と、（C)一塩基多型の評価対象核酸との混合に際して、前記 (Α)、 （Β)及び (C)は 、二本鎖形成を十分に行ない、十分な蛍光強度を得る観点から、好ましくは、（C)Z (A)〔モル比〕が、 1Z5〜1であり、（C)Z(B)〔モル比〕が、 1Z100〜1Z20、より好 ましくは、（C)Z(A)〔モル比〕が、 1Z12〜1であり、（C)Z(B)〔モル比〕が、 1/50 〜1Z30となるように混合することが望ま 、。
[0051] 前記混合の際の pH条件は、ナフチリジン環を含む化合物等のバルジ塩基を認識 可能な化合物のシグナル、バルジへの該化合物の結合に基づく吸収極大波長のシ フト、蛍光強度等の検出を効率よく行なう観点、核酸の安定性の観点から、好ましく は、 pHが、 5以上、より好ましくは、 6以上、さらに好ましくは、 6. 5以上であり、ナフチ リジン環を含む化合物とバルジ塩基との結合を十分に行なう観点及び十分な蛍光強 度を発揮させる観点から、好ましくは、 pHが、 9以下、より好ましくは、 8以下、さらに 好ましくは、 7. 5以下であることが望ましい。
[0052] また、前記混合の際には、例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等が用いられう る。
[0053] なお、本発明の検出方法においては、前記 (A)の核酸プローブと、（B)のナフチリ ジン環を含む化合物と、（C)の一塩基多型の評価対象核酸との混合は、前記 (A)の 核酸プローブと (C)の一塩基多型の評価対象核酸とを混合して、バルジ構造を形成 させた後、前記 (B)のナフチリジン環を含む化合物をさらに混合してもよぐ前記 (A) の核酸プローブと、（B)のナフチリジン環を含む化合物と、（C)の一塩基多型の評価 対象核酸とを同時に混合してもよい。
[0054] ノ レジ塩基に結合したナフチリジン環を含む化合物に基づく蛍光強度は、バルジ 塩基に結合して 、な 、前記 (B)のナフチリジン環を含む化合物に由来する蛍光との 区別化を十分に行なう観点から、シトシンバルジの場合には、好ましくは、 400〜480 nm、より好ましくは、 430nm付近における蛍光強度であることが望ましい。
[0055] 本発明は、別の側面では、本発明の核酸中の一塩基多型の検出方法に用いるた めのキットに関する。本発明のキットは、前記核酸プローブと、前記ナフチリジン環を 含む化合物とを含有することを特徴とする。本発明のキットは、前記核酸プローブと、 前記ナフチリジン環を含む化合物とを含有しているため、本発明の検出方法を、効 率よく簡便に低コストで行なうことができ、核酸中の一塩基多型を、低コストで、簡便 な操作により、効率よぐ高感度で検出することができるという優れた効果を発揮する
[0056] 本発明のキットは、評価対象となる一塩基多型の存在位置に隣接するヌクレオチド 、一塩基多型の存在位置の周辺の塩基配列に応じて、核酸プローブの種類を適宜 選択することができる。具体的には、例えば、評価対象となる一塩基多型の存在位置 に隣接するヌクレオチドがシトシン残基である場合、一塩基多型の存在位置の周辺 の塩基配列中におけるシトシン残基の含有量が高い場合等には、前記 i)及び Z又は ii)の核酸プローブ、具体的には、前記 i' )及び Z又は ϋ' )の核酸プローブと i' ' )及び Z又は ii' ' )の核酸プローブとの組み合わせであればよぐ評価対象となる一塩基多 型の存在位置に隣接するヌクレオチドがシトシン以外のヌクレオチド残基である場合 、一塩基多型の存在位置の周辺の塩基配列中におけるシトシン残基の含有量が低 いか、あるいはシトシン残基を含まない場合等には、前記 I)又は Π)の核酸プローブ、 具体的には、前記 Γ)及び Z又は Π' )の核酸プローブと Γ ' )及び Z又は Π' ' )の核酸 プローブとの糸且み合わせであればよ!、。
[0057] 本発明のキットには、前記核酸プローブを安定的に保持するための試薬、例えば、 緩衝液等、前記ナフチリジン環を含む化合物を安定的に保持するための試薬、等を 適宜含有していてもよい。
[0058] また、本発明のキットの提供形態は、適切な核酸プローブ、前記ナフチリジン環を 含む化合物、その他の必要な試薬等の検出方法を行なうに適した試薬全てを、本発 明の検出方法を行なうに適した容量及び Ζ又は形態で含有した 1つの容器として提 供される形態であってもよぐ核酸プローブ、ナフチリジン環を含む化合物、その他の 必要な試薬等をそれぞれ別の容器により提供される形態であってもよい。また、かか るキットには、キットに含まれる成分を用いて、本発明の検出方法を行なうための手順 等を記載した説明書を含有して 、てもよ 、。
[0059] 以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定 されるものではない。
実施例 1
[0060] 前記式（I)に示される 2, 7—ジアミノー 1, 8—ナフチリジン（10 /ζ Μ)を、 ρΗ8. 5、 ρ Η7. 0若しくは ρΗ5. 0それぞれの 10mM リン酸ナトリウム緩衝液又は下記式 (V)： [0061] [化 6] 5'—— T ~ C—— C—— A ~~ T ~ A ~ C—— A ~ A ~ C—— 3' (配列番号： 1 ) 3'—— A ~ G—— G—— T ~ A T ~ G T ~ T ~ G—— 5' (配列番号： 2 )
[0062] に示される、シトシンバルジを有するデュプレックス（30 M)を含む pH7. 0の 10m M リン酸ナトリウム緩衝液と混合し、 300nm〜450nmの波長における吸収及び 35 Οηπ！〜 500nmの波長における蛍光強度を、商品名： RF— 5300PC (株式会社島津 製作所社製)で測定した。結果を図 2に示す。
[0063] その結果、図 2に示されるように、 2, 7—ジアミノー 1 , 8—ナフチリジンは、シトシン バルジとの結合により、 pH7. 0で、吸収極大値を示す波長が、 364nm力ら 394nm に 30nmシフトとし、蛍光強度の極大値を示す波長が、 398nm力ら 430nm〖こ 32nm シフトする。：
[0064] したがって、 2, 7—ジアミノー 1 , 8—ナフチリジンにより、バルジを形成する核酸が 検出できることが示唆された。また、前記図 2の結果より、中性条件で効率よく検出が 行なえることがわかった。
実施例 2
[0065] 前記式 (I)に示される 2, 7—ジアミノー 1 , 8—ナフチリジン（10 /z M)を、完全なデ ュプレックス（30 μ Μ)、アデニンバルジ、チミンバルジ、シトシンバルジ又はグァニン バルジを有するデュプレックス（30 Μ)の存在下に、 ρΗ7. 0の 10mM リン酸ナトリ ゥム緩衝液と混合し、 300nm〜450nmの波長における吸収及び 350nm〜500nm の波長における蛍光強度を、商品名： RF— 5300PC (株式会社島津製作所社製)で 測定した。結果を図 3に示す。
[0066] 図 3に示されるように、 2, 7—ジアミノー 1 , 8—ナフチリジン（10 /z M)は、シトシンパ ルジ又はチミンバルジと結合した場合に、完全なデュプレックスと結合した場合と比 ベて顕著に長波長側にシフトすることがわかる。さらに、前記図 3の結果より、核酸プ ローブは、シトシンバルジ又はチミンバルジを形成するように設計することにより、一 塩基多型の検出を効率よく行なうことができることが示唆された。
実施例 3 [0067] 下記式 (VI)
[0068] [化 7]
5'—— T ^ C—— C—— A—— X—— Y—— C—— A—— A ~ C
3'—— A ~~ G― G一 T ~~ Z W一 G― T ~ T ~ G
(VI)
N
[0069] に示されるデュプレックス中、 5， X-Y 3，（評価対称核酸）と 3，— · ·
•-Z-N-W 5，（核酸プローブ）とから形成されるバルジ構造 (以下、「X—
Y/ZNWJと表記する）力 T— AZACT、 T— AZACG、 T— CZACI、 T_C/A CT又は T— C/ACGであるデュプレックスを用いた。 Aアレル (A allele)及び Cァ レル (C allele) (配列番号： 4)と、一塩基多型部位の 3 '末端側の 1つの余剰シトシ ン残基を含む相補的な Tプローブ (T probe) (配列番号： 2)及び Gプローブ (G pr obe) (配列番号： 3)とのハイブリダィゼーシヨンにより、図 4の左パネルに示されるよう に、シトシンバルジを含む 4つのデュプレックスを生成させた。これらの 4つのデュプレ ッタスの 2つにおけるシトシンバルジカ ワトソン クリック塩基対 (T— AZACT及び T_C/ACG)に隣接する力 他の 2つのデュプレックスにおけるシトシンバルジは、 ミスマッチ A— G塩基対及び C T塩基対（それぞれ、 T— AZACG及び T— CZA CT)に隣接する。
[0070] 前記 2, 7 ジアミノー 1, 8 ナフチリジンとシトシンバルジとの結合に基づく蛍光強 度を、商品名： RF— 5300PC (株式会社島津製作所社製)で測定した。結果を図 4 の右ノ ネノレに示す。
[0071] 図 4の右パネルに示されるように、シトシンバルジに隣接する塩基対にかかわらず、 Aアレルデュプレックスに強!、蛍光が観察され、 Cアレルデュプレックスにごく微弱な 発光が検出された。
[0072] 一方、ピーク高さにより決定された 424nmにおける Aアレルデュプレックスの相対 蛍光強度は、 Cアレルデュプレックスの相対蛍光強度の約 5. 5倍であった。 T_C/ ACGにおける C- G塩基対と対照的に、 T— AZACG中における AGミスマッチ塩基 対は、隣のシトシンバルジに結合した 2, 7 ジアミノー 1, 8 ナフチリジンの蛍光を 消光しなかった。また、吸光度測定により、 2, 7—ジアミノー 1, 8—ナフチリジン力 T — CZACT中における CTミスマッチに隣接したシトシンバルジに結合しな!、ことがわ かった。
[0073] 2つの一塩基多型のアレルと、該アレルに相補的であり、かつ一塩基多型部位に対 応する位置に隣接してノ レジ塩基を含む 2つのプローブとを組み合わせた各デュプ レックスに 2, 7—ジァミノ— 1, 8—ナフチリジンを添カ卩し、バルジ構造と結合させ、 39 4nmにおける励起による蛍光測定を行い、各デュプレックス間の蛍光強度の変動に より多型部位におけるヌクレオチド塩基を決定することができることが示唆された。
[0074] これらの解析において、 424nmにおける 2, 7—ジアミノー 1, 8—ナフチリジンの蛍 光が、 1) 2, 7—ジアミノー 1, 8—ナフチリジン力 シトシンバルジに結合した場合、及 び
2)シトシンバルジに隣接した塩基対力 CG塩基対でな 、場合
にのみ観察できた。したがって、 Cアレルは、 2, 7—ジァミノ— 1, 8—ナフチリジンの 蛍光のネガティブシグナルとして検出された。
[0075] そこで、 Cアレルは、 Gプローブ中における一塩基多型の存在位置に対応して配置 されたグァニン残基を、 Iプローブ (配列番号： 5)中におけるイノシン残基に置換した 。その結果、前記 Cァレノレは、ポジティブシグナノレとして良好に検出できた。イノシン は、 2, 7—ジァミノ— 1, 8—ナフチリジンの蛍光を消光しないので、 CI塩基対 (T— C ZACI)に隣接したシトシンバルジに結合した 2, 7—ジアミノー 1, 8—ナフチリジンの 蛍光強度は、 T—CZACGにおける CG塩基対に隣接したシトシンバルジに結合し たものに比べ、約 10倍強くなつた。
[0076] 以上の結果、 2, 7—ジアミノー 1, 8—ナフチリジンと、異なる塩基対に隣接するシト シンバルジを生じる核酸プローブとを組み合わせて用いることにより、均一系での一 塩基多型タイピングを行なうことができることが示唆された。
実施例 4
[0077] 下記式 (VII) :
[0078] [化 8] S'-A-C-A-T-C-C-A-A-^-C-A-A-C-C-A-C-S' (配列番号： 6) 3'-T-G-T-A-G-G-T-T N2-G-T-T-G-G-T-G-5' (酉己列番号： 7)
C (VII) に示されるデュプレックス中、 5' A-N 3' (評価対称核酸）と 3'— ·
••-T-C-N 5，（核酸プローブ）と力ら形成されるバルジ構造 (以下、「A
2
N /TCN」と表記する）を用いて、シトシンノ レジデュプレックスを生成させ、実 1 2
施例 3と同様にして 2, 7 ジァミノ一 1, 8 ナフチリジンとシトシンバルジとの結合に 基づく蛍光強度を 410nmにおける励起波長で測定した。なお、式 (VII)中、 N及び N は、独立して、 T、 A、 C又は Gのいずれかであり、これらの 4つの塩基の考えられうる
2
全ての組み合わせを使用した。また、式 (VII)中、 Nを含むオリゴヌクレオチドを Nァ レルといい、例えば、 Nが Aである場合、 Aアレルという。同様に、 Nを含むオリゴヌク
1 2
レオチドを Nプローブといい、例えば、 Nが Aである場合、 Aプローブという。各デュ
2 2
プレックス力 得られた蛍光強度のピークの読み取り値力も検出器のバックグラウンド シグナルの読み取り値を減算することにより差分蛍光強度を得た。結果を表 1に示す [表 1]
Figure imgf000025_0001
表 1より、実施例 3と同様に Aアレルデュプレックスに総体的に強い蛍光が見られる 。対照的に Gアレルデュプレックスではバックグラウンドシグナル以下の蛍光しか検出 されず、差分蛍光強度としてはマイナスの値になった。
[0082] 次 、で、表 1の結果に基づ 、て、塩基ごとの一塩基多型の検出能力につ 、て本発 明の方法を評価した。具体的には、表 1中の 2つの異なるアレルと、それぞれの多型 部位に相補的な塩基を有する 2つのプローブとを組み合わせた 4つのデュプレックス により得られた蛍光強度を比較した。結果を表 2〜7に示す。
[0083] [表 2]
Figure imgf000026_0001
[0084] [表 3]
Figure imgf000026_0002
[0085] [表 4]
Figure imgf000027_0001
Figure imgf000027_0002
[9挲] 800]
Figure imgf000027_0003
[S挲] [9800]
Figure imgf000027_0004
S86ZZ0/S00Zdf/X3d 93 S89Z80/900Z OAV A一 C A_G
TCG 28 -9
TCC 2 -7
[0089] 表 2〜7より、 Tから A、 Tから G、 T力らじ、 A力らじ、及び Aから Gの変異については 蛍光強度の変動が有意に大きいため、一方を野生型アレルとし、他方を変異型ァレ ルとした場合、それぞれの多型部位に相補的な塩基を有する本発明のプローブと組 み合わせた 4つのデュプレックスを生成させ、 2, 7—ジアミノー 1, 8—ナフチリジンを 添加して 4つのデュプレックスの蛍光強度を測定し、その蛍光強度の変動に基づい て、変異型アレルを同定することができることが示唆される。
[0090] そこで、式 (VII)の Nをイノシンにした Iプローブを Gプローブの代わりに用いて各ァ
2
レルとデュプレックスを生成させ、蛍光強度を測定した。結果を表 8に示す。
[0091] [表 8]
Figure imgf000028_0001
表 8より、 G以外のアレルで Gプローブと比べて Iプローブにより顕著に高い蛍光が 得られた。次いで、表 8の結果に基づいて、 Cから G、 Tから C及び Aから Cの変異に おける蛍光を比較した。結果を表 9、表 10、及び表 11に示す。
[0093] [表 9]
Figure imgf000029_0001
[0094] [表 10]
Figure imgf000029_0002
[0095] [表 11]
Figure imgf000029_0003
表 9より、 Iプローブを使用することにより、 C力 Gの変異を検出できることがわかつ た。また、表 10及び表 11より、 Tから C及び Aから Cの変異についても Iプローブを使 用することにより、 Gプローブを用いた場合よりも蛍光強度の変動が大きぐ本発明の 一塩基多型検出の検出方法ではより良好が結果を得られることがわ力つた。
産業上の利用可能性
[0097] 本発明によれば、核酸中の一塩基多型を、簡便な操作で、低コストで、高感度に検 出することができる。したがって、安価で、簡便で高感度な遺伝子診断、遺伝子解析 等が可能になる。
配列表フリーテキスト
[0098] 配列番号: : 1は、合成 DNA (Aアレル）の配列である。
[0099] 配列番号: : 2は、合成 DNA (Tプローブ）の配列である。
[0100] 配列番号: : 3は、合成 DNA (Gプローブ）の配列である。
[0101] 配列番号: :4は、合成 DNA (Cアレル）の配列である。
[0102] 配列番号: : 5は、合成 DNA(Iプローブ）の配列である。塩基番号： 5の nは、イノシン である。
[0103] 配列番号： 6は、合成 DNA(Nアレル）の配列である。塩基番号： 9の nは、アデ- ン、シトシン、グァニン、又はチミンである。
[0104] 配列番号： 7は、合成 DNA(Nプローブ）の配列である。塩基番号： 10の nは、アデ
2
ニン、シトシン、グァニン、チミン、又はイノシンである。

Claims

請求の範囲
[1] (A) I)少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸に対し相補的にハイプリ ダイズ可能であって、前記一塩基多型に対合する位置の 5'若しくは 3'末端側に隣 接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加された塩基配列を有する核酸プ ローブ、又は
II)少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補 的にハイブリダィズ可能であって、前記アンチセンス鎖上の一塩基多型に対合する 位置の 5 '若しくは 3 '末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付 加された塩基配列を有する核酸プローブ、
と、
(B)バルジ塩基認識可能な化合物と、
(C)前記評価対象核酸と、
を混合し、
前記核酸プローブと評価対象核酸とがハイブリダィズした際に形成されるシトシンパ ルジ又はチミンバルジを認識する前記 (B)の化合物に基づくシグナルを検出し、 前記一塩基多型を評価することを特徴とする一塩基多型の検出方法。
[2] 下記 1)〜4)：
1)前記一塩基多型存在位置に野生型ヌクレオチドを含む野生型評価対象核酸と、 該野生型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダィズ可能である核酸プローブとの 間に形成されたバルジ、
2)前記一塩基多型存在位置に変異型ヌクレオチドを含む変異型評価対象核酸と、 該変異型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダィズ可能である核酸プローブとの 間に形成されたバルジ、
3)前記野生型評価対象核酸と、前記変異型評価対象核酸に対し相補的にハイプリ ダイズ可能である核酸プローブとの間に形成されたバルジ、及び
4)前記変異型評価対象核酸と、前記野生型評価対象核酸に対し相補的にハイプリ ダイズ可能である核酸プローブとの間に形成されたバルジ、
のそれぞれに結合した前記 (B)のバルジ塩基を認識可能な化合物に基づくシグナ ルの変動に基づき、評価対象核酸における一塩基多型を同定する、請求項 1記載の 検出方法。
[3] 前記化合物が、ナフチリジン環を有する請求項 1又は 2記載の検出方法。
[4] 前記シグナルが蛍光である請求項 1〜3 、ずれか 1項に記載の検出方法。
[5] 前記化合物が、 2, 7—ジァミノナフチリジン誘導体ィ匕合物である、請求項 1〜4いず れカ 1項に記載の検出方法。
[6] 前記 2, 7—ジァミノナフチリジン誘導体ィ匕合物が、下記式 (Π)：
[化 1]
Figure imgf000032_0001
に示される 2, 7—ジアミノー 1, 8—ナフチリジンである、請求項 5記載の検出方法。
[7] 前記 (A)の核酸プローブが、
i)少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダィズ 可能であって、前記一塩基多型に対合する位置の 5 '若しくは 3 '末端側に隣接した 位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加され、かつ該シトシン残基若しくはチミ ン残基に隣接して存在するグァニン残基の少なくとも 1がイノシン残基にさらに置換さ れた塩基配列を含有した核酸プローブ、又は
ii)少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的 にハイブリダィズ可能であって、前記アンチセンス鎖上の一塩基多型に対合する位 置の 5 '若しくは 3，末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加さ れ、かつ該シトシン残基若しくはチミン残基に隣接して存在するグァニン残基の少な くとも 1がイノシン残基にさらに置換された塩基配列を有する核酸プローブ、 である、請求項 1〜6いずれか 1項に記載の検出方法。
[8] Γ )少なくとも一つの一塩基多型を含み、該ー塩基多型存在位置に野生型ヌクレオ チドを含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダィズ可能であって、前記一塩基 多型に対合する位置の 5 '若しくは 3 '末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくは チミン残基が付加された塩基配列を有する核酸プローブ、及び Z又は
ΙΓ )少なくとも一つの一塩基多型を含み、該ー塩基多型存在位置に野生型ヌクレオ チドを含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にノ、イブリダィズ可能であ つて、前記アンチセンス鎖上の一塩基多型に対合する位置の 5 '若しくは 3 '末端側 に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加された塩基配列を有する核 酸プローブ、
と、
Γ ' )少なくとも一つの一塩基多型を含み、該ー塩基多型存在位置に変異型ヌクレオ チドを含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダィズ可能であって、前記一塩基 多型に対合する位置の 5 '若しくは 3 '末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくは チミン残基が付加された塩基配列を有する核酸プローブ、及び Z又は
Π' ' )少なくとも一つの一塩基多型を含み、該ー塩基多型存在位置に変異型ヌクレ ォチドを含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダィズ可能で あって、前記アンチセンス鎖上の一塩基多型に対合する位置の 5 '若しくは 3 '末端側 に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加された塩基配列を有する核 酸プローブ、
と、
バルジ塩基を認識可能な化合物と、
を含有してなる、請求項 1〜7いずれか 1項に記載の核酸中の一塩基多型の検出方 法に用いるためのキット。
[9] i' )少なくとも一つの一塩基多型を含み、該ー塩基多型存在位置に野生型ヌクレオ チドを含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダィズ可能であって、前記一塩基 多型に対合する位置の 5 '若しくは 3 '末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくは チミン残基が付加され、かつ該シトシン残基若しくはチミン残基に隣接して存在する グァニン残基の少なくとも 1がイノシン残基に置換された塩基配列を有する核酸プロ ーブ ii' )少なくとも一つの一塩基多型を含み、該ー塩基多型存在位置に野生型ヌクレオ チドを含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にノ、イブリダィズ可能であ つて、前記アンチセンス鎖上の一塩基多型に対合する位置の 5 '若しくは 3 '末端側 に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加され、かつ該シトシン残基 若しくはチミン残基に隣接して存在するグァニン残基の少なくとも 1がイノシン残基に さらに置換された塩基配列を有する核酸プローブ、
と、
）少なくとも一つの一塩基多型を含み、該ー塩基多型存在位置に変異型ヌクレオ チドを含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダィズ可能であって、前記一塩基 多型に対合する位置の 5 '若しくは 3 '末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくは チミン残基が付加され、かつ該シトシン残基若しくはチミン残基に隣接して存在する グァニン残基の少なくとも 1がイノシン残基に置換された塩基配列を有する核酸プロ ーブ、
π ' )少なくとも一つの一塩基多型を含み、該ー塩基多型存在位置に変異型ヌクレオ チドを含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にノ、イブリダィズ可能であ つて、前記アンチセンス鎖上の一塩基多型に対合する位置の 5 '若しくは 3 '末端側 に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加され、かつ該シトシン残基 若しくはチミン残基に隣接して存在するグァニン残基の少なくとも 1がイノシン残基に さらに置換された塩基配列を有する核酸プローブ、
と、
バルジ塩基を認識可能な化合物と
を含有してなる、請求項 8記載の核酸中の一塩基多型の検出方法に用いるためのキ ッ卜。
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